【課題】ペプチドの複雑な混合物から、修飾されたペプチドを単離する方法を提供すること。
【解決手段】（ａ）生物から蛋白質性調製物を得、ここで調製物は二つ又はそれ以上の異なる蛋白質に由来する修飾されたペプチドを含み、（ｂ）調製物を少なくとも一つの固定化された修飾特異的抗体と接触させ、及び（ｃ）工程（ｂ）に於いて固定化された修飾特異的抗体により特異的に結合された少なくとも一つの修飾されたペプチドを単離する、工程を含むものである。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドの複雑な混合物から修飾ペプチド（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ）を単離する方法であって、当該方法が、
（ａ）生物から蛋白質性調製物を得、当該蛋白質性調製物が二つ又はそれ以上の異なる蛋白質由来の修飾ペプチドを含み、
（ｂ）当該蛋白質性調製物を、固定化された修飾特異的抗体の少なくとも一つと接触させ、及び
（ｃ）工程（ｂ）に於いて固定化された修飾特異的抗体により特異的に結合された、少なくとも一つの修飾ペプチドを単離する、
工程を含むものである方法。
【請求項２】
方法が、（ｄ）工程（ｃ）で単離された修飾ペプチドを、マススペクトロメトリー（ＭＳ）、タンデムマススペクトロメトリー（ＭＳ−ＭＳ）、及び／又はＭＳ^３分析により特徴付ける工程を更に含むものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
マススペクトロメトリーがＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを含むものであり、タンデムマススペクトロメトリーがＬＣ−ＭＳ／ＭＳを含むものであり、そしてＭＳ^３分析がＬＣ−ＭＳ^３を含むものである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
方法が、（ｅ）工程（ｄ）の特徴付けの間に得られた修飾ペプチドのスペクトルを、検索プログラムを使用して公知のペプチド配列のスペクトルと実質的に適合させ、それによって修飾ペプチドの親蛋白質を同定する工程を更に含むものである、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
蛋白質性調製物が、消化された粗細胞抽出物、消化された組織サンプル、消化された血清サンプル、消化された尿サンプル、消化された髄液サンプル、及び消化された脊髄液サンプルからなる群より選択される消化された生物サンプルを含むものである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
消化された調製物が、少なくとも一つの蛋白質分解酵素又は化学的な開裂を使用することで得られるものである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
蛋白質分解酵素が固定化されている、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
蛋白質分解酵素が可溶性であり、消化された調製物が接触工程（ｂ）に先だって蛋白質分解阻害剤で処理されたものである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
工程（ａ）が、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって蛋白質性調製物を前精製することを更に含むものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ｂ）の固定化された抗体が、クロマトグラフィ−樹脂に共有結合したものである、又は蛋白質−Ａ若しくは蛋白質−Ｇ−アガロースに非共有結合したものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
樹脂がカラム又はマイクロピペットチップ内に含まれるものである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｂ）の固定化された抗体が、カラム内のクロマトグラフィ−樹脂に固定化されたものであり、当該カラムが工程（ｄ）の特徴付けのためのマススペクトロメーターに連結されているものである、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
修飾が、リン酸化を含むものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
修飾ペプチドが、ホスホペプチドを含むものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
修飾特異的抗体が、少なくとも一つのリン酸化されたアミノ酸を含むモチーフを認識するものである、モチーフ特異的及びコンテキスト非依存性（ｃｏｎｔｅｘｔ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）の抗体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
モチーフが単一のリン酸化されたアミノ酸からなるものである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
モチーフがキナーゼ共通基質モチーフ又は蛋白質−蛋白質結合モチーフの全部若しくは一部を含むものである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
キナーゼ共通基質モチーフが、ＭＡＰＫ共通基質モチーフ、ＣＤＫ共通基質モチーフ、ＰＫＡ共通基質モチーフ、ＡＫＴ共通基質モチーフ、ＰＫＣ共通基質モチーフ、ホスホスレオニン−Ｘ−アルギニン及びＡＴＭ共通基質モチーフからなる群より選択されるものであり、蛋白質−蛋白質結合が１４−３−３結合モチーフ又はＰＤＫ１ドッキングモチーフである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
修飾特異的抗体が、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
工程（ｃ）で単離された修飾ペプチドが、公知の疾患マーカーに対応するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
工程（ｄ）で特徴付けられた修飾ペプチドが、親蛋白質の未知の修飾部位を含むものである、請求項４に記載の方法。
【請求項２２】
方法が、（ｅ）工程（ｄ）で特徴付けられた修飾ペプチドの修飾状態を、参照サンプルに於ける対応するペプチドの修飾状態と比較し、蛋白質性調製物に於ける蛋白質の活性化を参照サンプルに於けるの蛋白質の活性化と比較する工程を更に含むものである、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項２３】
蛋白質性調製物が疾患生物に対応し、参照サンプルが正常生物に対応するものであり、蛋白質活性化の比較が疾患に由来する活性化変化の情報を提供するものである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
蛋白質性調製物が組織生検細胞又は臨床液サンプルから得られるものであり、参照サンプルが疾患生物に対応するものであり、蛋白質活性化の比較が疾患の診断のための有用な情報を提供するものである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
蛋白質調製物が少なくとも一つの試験化合物で処理された生物又は調製物に対応し、参照サンプルが処理されていない生物又は調製物に対応し、蛋白質活性化の比較が、試験化合物による処理によって起こる活性化変化についての情報を提供するものである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
蛋白質活性化の比較が、疾患に於いて修飾されていることが前もって報告されていない親蛋白質に対応するものとして、工程（ｄ）で特徴付けられた修飾ペプチドを同定するものである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
疾患が癌である、請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項２８】
試験化合物が癌治療薬を含むものである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
試験化合物がキナーゼ阻害剤を含むものである、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
ペプチドの複雑な混合物からホスホペプチドを単離する方法であって、当該方法が、
（ａ）生物から蛋白質性調製物を得、当該蛋白質性調製物が二つ又はそれ以上の異なる蛋白質由来の修飾ペプチドが含み、
（ｂ）分画化された蛋白質性調製物を産生するために、逆相クロマトグラフィーで当該蛋白質性調製物中のホスホペプチドを分画化し、
（ｃ）分画化された蛋白質性調製物を、少なくとも一つのリン酸化されたアミノ酸を含むモチーフに結合する、モチーフ特異的でコンテキスト非依存性（ｃｏｎｔｅｘｔ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）の固定化された抗体の少なくとも一つと接触させ、
（ｄ）工程（ｃ）の固定化された抗体が特異的に結合している、少なくとも一つのホスホペプチドを単離し、及び
（ｅ）マススペクトロメトリー（ＭＳ）、タンデムマススペクトロメトリー（ＭＳ−ＭＳ）、及び／又はＭＳ^３分析により、工程（ｄ）で単離された修飾ペプチドを特徴付ける、
工程を含むものである方法。
【請求項３１】
方法が、（ｆ）工程（ｅ）の特徴付けで得られた修飾ペプチドのマススペクトルを、検索プログラムを用いて公知のペプチド配列のマススペクトルと実質的に合致させ、それにより修飾ペプチドの親蛋白質を同定する工程を更に含むものである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
マススペクトロメトリーがＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを含むものであり、タンデムマススペクトロメトリーがＬＣ−ＭＳ／ＭＳを含むものであり、ＭＳ^３分析がＬＣ−ＭＳ^３を含むものである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３３】
工程（ａ）が、ペプチドの複雑な混合物を産生するために蛋白質性調製物を消化する工程を更に含むものである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
工程（ｃ）のモチーフ特異的でコンテキスト非依存性（ｃｏｎｔｅｘｔ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）の抗体が、一般的なホスホチロシン特異的抗体、一般的なホスホスレオニン特異的抗体、又は一般的なホスホセリン特異的抗体を含むものである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
工程（ｃ）のモチーフ特異的でコンテキスト非依存性（ｃｏｎｔｅｘｔ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）の抗体が、リン酸化されたキナーゼ共通基質モチーフ又は蛋白質−蛋白質結合モチーフに特異的である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
キナーゼ共通基質モチーフが、ＭＡＰＫ共通基質モチーフ、ＣＤＫ共通基質モチーフ、ＰＫＡ共通基質モチーフ、ＡＫＴ共通基質モチーフ、ＰＫＣ共通基質モチーフ、ホスホスレオニン−Ｘ−アルギニン及びＡＴＭ／ＡＴＲ共通基質モチーフ、ｐ８５Ｐ１３Ｋ結合モチーフ、ホスホスレオニンプロリンモチーフ、Ａｒｇ−Ｘ−Ｔｙｒ／Ｐｈｅ−Ｘ−ホスホセリンモチーフ、ホスホセリン／ホスホスレオニン−Ｐｈｅモチーフ、ＰＬＫ共通基質モチーフ、並びにＤＮＡ損傷誘導基質モチーフからなる群より選択されるものであって、蛋白質−蛋白質結合が、１４−３−３結合モチーフ又はＰＤＫ１ドッキングモチーフである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
工程（ｂ）の逆相クロマトグラフィーがＣ１８カラムを含むものである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３８】
方法が、工程（ｅ）の単離されたホスホペプチドを定量する工程（ｆ）を更に含むものである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３９】
工程（ｆ）が、細胞培養物中のアミノ酸による安定な放射性同位体標識（ＳＩＬＡＣ）を用いて、及び／又は、絶対的なペプチドの定量（ＡＱＵＡ）技術を用いて、単離されたホスホペプチドを定量することを含むものである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
硬質の、無孔又はマクロ細孔樹脂に固定化された、少なくとも一つの修飾特異的抗体を含有する支持体を含む、複雑な混合物から修飾ペプチドを単離するための免疫親和性単離装置。
【請求項４１】
支持体が、内径が約５０から３００マイクロメートルの細いキャピラリーカラム及びミクロピペットチップからなる群より選択されるものである、請求項４０に記載の装置。
【請求項４２】
修飾特異的抗体が、モチーフ特異的でコンテキスト非依存性（ｃｏｎｔｅｘｔ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）の抗体を含むものである、請求項４１に記載の装置。
【請求項４３】
カラムが、マススペクトロメーターの電気スプレー源に連結されているものである、請求項４１に記載の装置。
【請求項４４】
３３５位のセリンがリン酸化されているときのみ、ユビキチン融合崩壊蛋白質１（ＵＦＤ１）に結合するが、この残基がリン酸化されていないときにはＵＦＤ１に実質的に結合しない抗体。
【請求項４５】
５８８位のセリンがリン酸化されているときのみ、蛋白質チロシンホスファターゼ１ｃ（ＰＴＮ６）に結合するが、この残基がリン酸化されていないときにはＰＴＮ６に実質的に結合しない抗体。
【請求項４６】
表５のカラム５に示されるリン酸化可能な残基がリン酸化されているときのみ、表５のカラム５に挙げられる蛋白質リン酸化部位に結合するが、それらの残基がリン酸化されていないときには、リン酸化部位に実質的に結合しない、抗体。
【請求項４７】
表６のカラム５に示されるリン酸化可能な残基がリン酸化されているときのみ、表６のカラム５に挙げられる蛋白質リン酸化部位に結合するが、それらの残基がリン酸化されていないときには、リン酸化部位に実質的に結合しない、抗体。
【請求項４８】
表７のカラム４に示されるリン酸化可能な残基がリン酸化されているときのみ、表７のカラム４に挙げられる蛋白質リン酸化部位に結合するが、それらの残基がリン酸化されていないときには、リン酸化部位に実質的に結合しない、抗体。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９−Ａ】

【図１９−Ｂ】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

【図３０】

【図３１】

【図３２】

【図３３】

【図３４】

【公開番号】特開２００７−３０８５０６（Ｐ２００７−３０８５０６Ａ）
【公開日】平成１９年１１月２９日（２００７．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１６９１６１（Ｐ２００７−１６９１６１）
【出願日】平成１９年６月２７日（２００７．６．２７）
【分割の表示】特願２００４−２５９５７４（Ｐ２００４−２５９５７４）の分割
【原出願日】平成１６年９月７日（２００４．９．７）
【出願人】（５０１０８７４９０）セル・シグナリング・テクノロジー・インコーポレイテツド (11)
【Ｆターム（参考）】