親水性のα−ヒドロキシホスホン酸コンジュゲートによる水不溶性ナノ粒子の処理、こうして修飾されたナノ粒子、及び造影剤としてのそれの使用
本願は、水不溶性ナノ粒子、特にＭＲ及びＸ線イメージングのような診断イメージングで有用な金属及び金属化合物のナノ粒子を、親水性部分とのα−ヒドロキシホスホン酸コンジュゲートで処理することで、ナノ粒子に診断イメージングで有用とするのに十分な親水性を付与する方法を開示している。開示される修飾親水性ナノ粒子には、修飾用コンジュゲートの親水性部分がエチレンオキシド系ポリマー及びコポリマー並びに双性イオン（ｚｗｉｔｔｅｒｉｏｎｓ）であり、ナノ粒子が超常磁性酸化鉄及び酸化タンタルのような遷移金属酸化物からなるものがある。安定な水性コロイド懸濁液を形成するのに十分な親水性を有するナノ粒子が開示される。また、修飾親水性ナノ粒子を造影剤として用いるＭＲ及びＸ線イメージングのような診断イメージングも開示される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的には、ナノ粒子（特に遷移金属酸化物に基づくナノ粒子）を処理することで、安定な水性懸濁液を形成するのに十分な親水性をそれに付与し、したがってＭＲＩ及びＸ線イメージングのような診断イメージングにおける造影剤のような親水性を要求する用途で有用にするための方法、前記処理で得られる親水性ナノ粒子、前記安定な水性懸濁液、並びに前記イメージングにおける造影剤としての前記親水性ナノ粒子の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ナノ粒子、即ち適切にはナノメートル単位で測定される直径を有する粒子は、多種多様の最終用途に関して検討されてきた。これらの用途の一部はある程度の親水性を要求するが、ある種のナノ粒子の基材となる材料はこの属性に欠けることがある。例えば、ＭＲ及びＸ線イメージング用の造影剤として使用するのに適したイメージング特性を有するナノ粒子は、通例は適当な親水性に欠ける遷移金属酸化物に基づいている。したがって、これらのナノ粒子の表面特性を修飾して水性媒体との適合性を高め、これらのナノ粒子に安定な水性懸濁液を形成する能力を与えるための努力が行われてきた。しかし、造影剤としての使用のような若干の用途では、ナノ粒子は単分散の粒度分布を有することも好ましく、カルボキシレート基をもった炭水化物に基づく生物学的マトリックス中での錯体化による不均一な凝集のような多分散の粒度分布を生じる表面処理は問題がある。さらに、造影剤としてのインビボでの使用のような若干の用途では、表面処理は明確に定義された再現可能な構造を有すると共に、安全性試験にも適合することが望ましい。シラン系表面処理は、これらの目標を妨げる自己縮合を受けることがあるので問題を有し得る。
【０００３】
さらに、精製の結果として親水性の低下を生じないと共に、電解質を含む水性媒体中で懸濁安定性を示す親水性ナノ粒子に対するニーズが存在していた。例えば、ヒト被験体におけるインビボでの使用のための造影剤の製造に際しては、候補ナノ粒子は濾過に付されると共に、等張の水性媒体（即ち、約１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む媒体）中で懸濁安定性を示すことが期待されるのが通例である。単独のリン酸系物質（例えば、ポリリン酸）又は親水性部分（例えば、ポリエチレングリコール）に連結されたリン酸系物質を用いて、遷移金属酸化物にリン酸イオンを付着させることでこのタイプの親水性をナノ粒子に付与するための努力が存在していた。これに関して述べれば、ヒト被験体におけるインビボでの使用のためには、ヒト組織との望ましくない相互作用を避けるため本質的に中性のゼータ電位を有する親水性ナノ粒子が好ましい。しかし、かかる努力は、濾過後に１５０ｍＭ ＮａＣｌ水性媒体中でコロイド懸濁液として所望の安定性を示す親水的に修飾されたナノ粒子を生み出さなかった。例えば、かかる努力は、３０ｋＤａカットオフでの接線流濾過及びかかる水性媒体中で１週間以上の貯蔵後に動的光散乱（ＤＬＳ）で測定した場合に本質的に安定な粒度（増大しない流体力学的直径（ＤH））を示す懸濁液を生み出さなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
米国特許出願第２００３／２２９２８０号明細書
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、α−ヒドロキシ基を担持する炭素原子を介してα−ヒドロキシホスホン酸及び親水性部分を結合してなるコンジュゲートが、水不溶性ナノ粒子（特に遷移金属酸化物に基づくナノ粒子）の親水性を向上させるための作用物質として優れた性能を有するという発見を含んでいる。コンジュゲートの結合では、α−ヒドロキシホスホン酸の３つのヒドロキシル基のすべてが保存され、これがナノ粒子に対する優れた付着力をコンジュゲートに与えると考えられる。若干の実施形態では、コンジュゲートは次の構造Ｉを有している。
【０００６】
【化１】
式中、Ｓはスペーサーであり、ＬはＳとＲとの間の結合であり、Ｒは親水性部分であり、ｍ及びｐは１〜５であり、ｎ及びｏは０〜５である。若干の実施形態では、Ｓは直接結合、非置換又は置換脂肪族基又は脂環式基、非置換又は置換アリール基、ヘテロ脂肪族基或いはヘテロアリール基であり、若干の場合には１〜１０個の炭素原子からなる長さの直鎖アルキル基である。Ｌは、直接結合、カルボニル基、エーテル基、エステル基、第二級又は第三級アミン、第四級アミン基、アミド基、カルバメート基或いは尿素基である。好適なナノ粒子は、水中における糖又は食塩のように溶質の個々の分子が溶媒中に一様に分散するという古典的な意味では、水に不溶なものである。したがって、水中においてある程度の懸濁性を有するナノ粒子をα−ヒドロキシホスホン酸コンジュゲートで処理すること、及びこうして得られるコンジュゲートが付着したナノ粒子は、本発明に包含される。
【０００７】
コンジュゲートは、ヒトの組織と望ましくない反応を起こすことがある基又は部分を含まないことが特に有利である。したがって、コンジュゲートはナノ粒子に付着した場合に約−４０ｍＶ乃至４０ｍＶ、好ましくは約−１５ｍＶ乃至１５ｍＶのゼータ電位を示すのが好都合である。このように付着した場合、コンジュゲートは本質的に中性のゼータ電位を示すことが特に興味深い。これは、双性イオン又は非イオン性部分を親水性部分として使用することで簡便に達成される。
【０００８】
親水性部分はモノマー又はポリマーであり得るが、これらは本質的に中性の正味イオン電荷を有するのが好都合である。ポリマー親水性部分部分のうち、少なくとも部分的にエチレンオキシド単位に基づくポリエーテル（例えば、エチレンオキシド／プロピレンオキシドコポリマー及びポリエチレングリコール）が特に有利である。正味電荷を有しないモノマー親水性部分（特に双性イオン）は、安定性評価のための特性決定が非常に容易であるので、ヒト被験体に関してインビボで使用すべきナノ粒子を処理するために使用されるコンジュゲートにとって好都合である。これらのうち、４−ピペラジンカルボン酸に基づくものが特に有利である。
【０００９】
ヒト被験体に関してインビボで使用すべきナノ粒子を処理するために使用されるコンジュゲートにとってはまた、α−ヒドロキシホスホン酸と親水性部分との間の結合が炭化水素であること、即ち構造Ｉ中でＡが単結合であることも好都合である。これは、かかる処理ナノ粒子とヒトの組織との相互作用の可能性を最小にする。これに関して述べれば、次の構造II及び構造IIIのコンジュゲートが特に有利である。
【００１０】
【化２】
コンジュゲートは、好ましくは、ナノ粒子１個当たり約２個のコンジュゲートの比率でナノ粒子を処理するために使用した場合、ナノ粒子が水性媒体中にＤＬＳで測定して約５００ｎｍ以下のＤHを有する安定なコロイド懸濁液を形成し得るのに十分な親水性を有している。コンジュゲートは、このようにして処理されたナノ粒子に、等容のｎ−オクタノール及び０．１Ｍ ３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液（ｐＨ７．０）の間における分配係数の対数に関して１未満の値を示すのに十分な親水性を付与することが特に好都合である。
【００１１】
一層高い親水性を達成するようにコンジュゲートで処理されるナノ粒子は、好ましくは、遷移金属及び遷移金属化合物（例えば、酸化物、炭化物、硫化物、窒化物、リン化物、ホウ化物、ハロゲン化物、セレン化物、テルル化物及びこれらの組合せ）に基づいている。酸化物が特に有利である。酸化物構造はα−ヒドロキシホスホン酸の付着力に寄与すると考えられる。遷移金属化合物は、ＭＲ及びＸ線イメージング用の造影剤を製造するために有用である。元素周期表の第３周期の遷移金属は、常磁性（好都合には超常磁性）を示す化合物を形成するために有用であり、したがってＭＲＩ造影剤として有用である。特に好都合なのは、酸化鉄及び任意にはコバルト、銅、マンガン、ニッケル又はこれらの組合せに基づく超常磁性ナノ粒子である。これらのうち、最も好都合なのは、マグネタイト、マグヘマイト又はこれらの組合せに基づくナノ粒子であって、粒径が約１５ｎｍ以下でありかつ超常磁性を示すものである。これらは一般に超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）粒子といわれる。３４を超える原子番号の遷移金属及び亜鉛は、Ｘ線造影剤として有用な化合物を製造するために有用である。これらのうち、ハフニウム、モリブデン、銀、タンタル、タングステン及びジルコニウムが特に有利であり、タンタル（特に酸化タンタル）が最も好都合である。
【００１２】
親水的に修飾されたナノ粒子は、通例、ＤＬＳで測定して５００ｎｍ以下のＤHを有する。好都合には、そのＤHは５０ｎｍ以下であり、さらに好ましくは３０ｎｍ以下であり、最も好ましくはそのＤHは３〜３０ｎｍである。親水的に修飾されたナノ粒子がヒト被験体において例えばＭＲ又はＸ線造影剤としてインビボで使用する予定であれば、特に好都合なＤHは約８ｎｍ以下である。
【００１３】
親水的に修飾されたナノ粒子は、簡便にはナノ粒子をコンジュゲートと反応させることで製造される。好都合なアプローチは、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）のような有機溶媒中におけるナノ粒子のコロイド懸濁液を形成し、次いでそれを同一又は異なる有機溶媒中におけるコンジュゲートの有機溶液と混合することである。次いで、反応が本質的に完了するまで、混合物を高温に長時間保つ。通例、５０℃以上の温度で１６時間以上が好都合である。
【００１４】
親水的に修飾されたナノ粒子の安定な単分散水性コロイド懸濁液は容易に得られる。かかる懸濁液は、好ましくは、３０ｋＤａカットオフでの接線流濾過のような濾過、及び水性媒体を等張にするためのＮａＣｌ（即ち、約１５０ｎＭのＮａＣｌ）の添加のような電解質の添加に対して安定であるべきである。好ましくは、懸濁液は１週間以上の貯蔵に対して安定であり、さらに好ましくは、沈降ばかりでなく懸濁ナノ粒子のＤＬＳで測定されるＤＨの増大に対しても安定である。もし懸濁液をヒト被験体においてインビボで使用するのであれば、ＮａＣｌ、デキストロース又はこれらの組合せの添加によってそれを等張にするのが好都合である。
【００１５】
安定な単分散水性コロイド懸濁液は、簡便にはコロイド懸濁液を有機溶媒で希釈することで製造される。好都合なアプローチは、その中でナノ粒子をコンジュゲートと反応させた有機溶媒又は有機溶媒混合物を単に水の添加で希釈することである。別のアプローチは、有機溶媒中におけるナノ粒子のコロイド懸濁液を水中のコンジュゲートと反応させることである。いずれの場合にも、濾過又はヘキサンのような溶媒での有機抽出或いはこれらの組合せによって未反応の反応体を除去するのが好都合である。溶媒抽出後における水性相中の揮発分は、部分真空の適用によって除去できる。次いで、親水的に修飾されたナノ粒子は３０ｋＤａフィルターに対する接線流濾過によって精製できる。
【００１６】
親水的に修飾されたナノ粒子は、診断イメージングにおける造影剤として好都合に使用できる。通常のタイプのかかる診断イメージングはＭＲ及びＸ線イメージングである。いずれの場合にも、−１５ｍＶ乃至１５ｍＶのゼータ電位を有する親水的に修飾されたナノ粒子を使用するのが好都合である。ヒト被験体のインビボイメージングにおける好都合なアプローチは、ナノ粒子を好ましくは安定な等張水性懸濁液として静脈内に投与することである。イメージングがＭＲによる場合には、ナノ粒子は常磁性（好ましくは超常磁性）の化学種からなるべきであり、さらに好ましくはマグネタイト又はマグヘマイトのように酸化鉄に基づくものであるべきである。イメージングがＸ線による場合には、ナノ粒子は３４を超える原子番号の金属又は亜鉛（好ましくは、金、ハフニウム、モリブデン、銀、タンタル、タングステン又はジルコニウム）の遷移金属化合物からなるべきであり、最も好ましくは酸化タンタルに基づくものであるべきである。特に興味深い実施形態では、親水的に修飾されたナノ粒子は８ｎｍ以下のＤHを有し、腎臓を通して被験体の身体から排出される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
本発明の上記その他の特徴、態様及び利点は、添付の図面を参照しながら以下の詳細な説明を読んだ場合に一層よく理解されよう。添付の図面中では、図面全体を通じて類似の部分は同一の符号で示されている。
【図１】図１は、親水性ナノ粒子を製造するための好適なα−ヒドロキシホスホン酸の一般構造式である。
【図２】図２は、親水性ナノ粒子を製造するための特に有利なα−ヒドロキシホスホン酸の構造式（式中、Ｍｅはメチル基である。）である。
【図３】図３は、親水性部分Ｒが結合したα−ヒドロキシホスホン酸に至る合成経路である。
【図４】図４は、図２に示された特に有利なα−ヒドロキシホスホン酸に至る合成経路である。
【図５】図５は、図３に示すようにして合成されるタイプのα−ヒドロキシホスホン酸であって、親水性部分Ｒが超常磁性酸化鉄ＳＰＩＯナノ粒子に結合した場合を示す仮説模式図である。
【図６Ａ】図６Ａは、造影剤の不使用時における実施例１２に係る腫瘍のＴ1重み付き画像（ＴＥ＝４．１ｍｓ）である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、実施例４のナノ粒子造影剤の投与から３０分後における実施例１２に係る腫瘍のＴ1重み付き画像（ＴＥ＝４．１ｍｓ）である。
【図６Ｃ】図６Ｃは、図６Ａと図６Ｂとの間の差を示す差マップである。
【図６Ｄ】図６Ｄは、造影剤の不使用時における実施例１２に係る腫瘍のＴ2*重み付き画像（ＴＥ＝１８．４ｍｓ）である。
【図６Ｅ】図６Ｅは、実施例４のナノ粒子造影剤の投与から３０分後における実施例１２に係る腫瘍のＴ2*重み付き画像（ＴＥ＝１８．４ｍｓ）である。
【図６Ｆ】図６Ｆは、図６Ｄと図６Ｅとの間の差を示すＲ2*緩和差マップであって、腫瘍と筋肉組織との明確な区別を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明のコンジュゲートは、広義には多種多様の結合及び親水性部分を有するものとして定義される。重要な特徴は、化学的かつ立体的にアクセス可能なα−ヒドロキシホスホン酸の３つのヒドロキシル基を有することである。かかる構造はキラル中心を有するものの、個々の鏡像異性体及び可能なラセミ混合物のすべてが水不溶性ナノ粒子に親水性を付与するために適していると予想される。
【００１９】
これらのコンジュゲートは、α−ヒドロキシホスホン酸構造と親水性部分との間に、炭素、窒素、酸素及び硫黄に基づくものをはじめとする周知化学結合のいずれかを含み得る。特に有利な基は、炭化水素、カルボニル、エステル、エーテル、第二級又は第三級アミン、第四級アミン、尿素、カルバメート及びアミドである。コンジュゲートで処理すべきナノ粒子の所期の最終用途は、結合基の選択に影響を与えることがある。例えば、ナノ粒子を特にヒト被験体においてインビボで使用するのであれば、タンパク質のような組織成分との相互作用を生じることがある第四級基のような結合を避けるのが望ましい場合がある。不活性の観点から最も有利な結合基は炭化水素である。
【００２０】
親水性部分は、界面活性剤として知られているものを含め、水との良好な適合性を有することが知られている任意の部分であり得る。これらはアニオン性、カチオン性又は非イオン性であり得る。親水性部分は、単糖、二糖又はオリゴ糖のような炭水化物、非炭水化物系モノマーポリアルコール、エチレンオキシド基を有するポリエーテル、ポリビニルアルコールのようなペンダントヒドロキシル基を有する（エチレンオキシド基を有するポリエーテル以外の）非炭水化物系ポリマー、ポリ（エチレンイミン）、脂肪族又は脂環式アミン及びこれらの組合せであり得る。
【００２１】
若干の実施形態では、親水性部分はエチレンオキシドに基づいており、ポリ（エチレンオキシド）が特に有利である。特に約５０００ダルトン以下の分子量を有するもの、とりわけ約２０００ダルトン以下の分子量を有するものが有利である。約３５０ダルトンの分子量を有するポリ（エチレンオキシド）が特に有利である。
【００２２】
親水性部分はまた、１以上の正に帯電した部分、１以上の負に帯電した部分、及び帯電部分の間にあるスペーサー基を有する双性イオンであり得る。本願の目的のためには、正に帯電した部分及び負に帯電した部分の組合せは、生理学的ｐＨ値でそれが本質的に正味電荷を示さなければ双性イオンと見なされる。好適な正に帯電した部分には、プロトン化第一級アミン、プロトン化第二級アミン、プロトン化第三級アルキルアミン、第四級アルキルアミン、プロトン化アミジン、プロトン化グアニジン、プロトン化ピリジン、プロトン化ピリミジン、プロトン化ピラジン、プロトン化プリン、プロトン化イミダゾール、プロトン化ピロール又はこれらの組合せがあり、好適な負に帯電した部分には、脱プロトン化カルボン酸、脱プロトン化スルホン酸、脱プロトン化スルフィン酸、脱プロトン化ホスホン酸、脱プロトン化リン酸、脱プロトン化ホスフィン酸又はこれらの組合せがあり、好適なスペーサー基には、非置換及び置換の脂肪族基、脂環式基及びアリール基、ヘテロ脂肪族基、ヘテロアリール基、エーテル、アミド、エステル、カルバメート、尿素又はこれらの組合せがある。一実施形態では、スペーサー基は１〜１０個の炭素原子からなる長さの直鎖アルキル基を含んでいる。
【００２３】
ナノ粒子の所期の最終用途が正味イオン電荷を有するα−ヒドロキシホスホン酸コンジュゲートが付着した修飾親水性ナノ粒子に適合しているならば、親水性部分は双性イオンの形成に適するものとして上記に記載された正に帯電した部分のいずれか又は負に帯電した部分のいずれかであり得る。
【００２４】
コンジュゲートで処理すべきナノ粒子の所期の最終用途は、親水性部分の選択に影響を与えることがある。例えば、ナノ粒子を特にヒト被験体においてインビボで使用するのであれば、タンパク質のような組織成分との相互作用を生じることがあるイオン基のような親水性部分を避けるのが望ましい場合がある。インビボ用途のためには、本質的に正味電荷をもたない親水性部分（例えば、双性イオン及びエチレンオキシド単位を有するポリエーテル）が特に有利である。ヒト被験体で使用するためには、安全性評価のため容易かつ再現可能に特性決定される親水性部分（例えば、モノマー部分）が特に好都合である。特に好都合な親水性部分は４−ピペラジンカルボン酸に基づくものであって、これらはモノマーであると共に双性イオンとして正味電荷を有していない。細胞培養物のインビトロ接種のような、毒性があまり問題にならない用途のためには、ポリ（エチレン）イミンが適当な親水性部分であり得る。
【００２５】
特に好適な双性イオンは、２００８年１２月２９日に提出された米国特許出願第１２／３４４，６０４号（その開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす）に開示されている。これらには、カチオン性窒素と、カルボン酸、リン酸又はスルホン酸に基づくアニオン性基とを含む親水性部分、例えばＮ，Ｎ−ジメチル−−３−スルホ−Ｎ−（３−プロピル）プロパン−１−アミニウム、３−（メチル）プロピル）アミノ）プロパン−１−スルホン酸、３−（プロピルアミノ）プロパン−１−スルホン酸、２−（エトキシ（ヒドロキシ）ホスホリルオキシ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルエタンアミニウム、２−エチル（ヒドロキシ）ホスホリルオキシ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルエタンアミニウム、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−３−（Ｎ−プロピオニルスルファモイル）プロパン−１−アミニウム、Ｎ−（（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）メチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−プロパン−１−アミニウム、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−プロパン−１−アミニウム、３−（メチルプロピル）アミノ）プロパン酸、３−（プロピルアミノ）プロパン酸、Ｎ−（カルボキシメチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−プロパン−１−アミニウム、２−（メチルアミノ）酢酸、２−（プロピルアミノ）酢酸、２−（４−プロピルカルバモイル）ピペラジン−１−イル）酢酸、３−（４−プロピルカルバモイル）ピペラジン−１−イル）プロパン酸、２−（メチル（２−プロピルウレイド）エチル）アミノ）酢酸及び２−（２−（プロピルウレイド）エチル）アミノ酢酸がある。
【００２６】
好適な親水性ポリエーテルに基づく親水性部分は、１９９９年６月２９日に発行された米国特許第５，９１６，５３９号（その開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす）に開示されている。これらには、アミノ及びヒドロキシルを含む各種の末端基を有する様々な分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）並びにポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）とのコポリマーがある。
【００２７】
コンジュゲートは、好ましくは、金属ベースのナノ粒子１モルに対してコンジュゲート２モルの比率でナノ粒子と反応させた場合、ナノ粒子が安定な水性懸濁液を形成し得るのに十分な親水性を有している。これに関して述べれば、ナノ粒子は通例は遷移金属化合物（例えば、酸化物）又は遷移金属自体に基づいている。反応比率は、元素態金属のモル数を用いて規定するのが好都合である。これは、有機溶媒中におけるナノ粒子の出発懸濁液の元素分析で容易に求めることができる。ナノ粒子の化学構成及び処理前の平均粒度を知れば、ナノ粒子当たりのコンジュゲートの量を概算で求めることができる。コンジュゲートは、この比率で処理された１５ｎｍ未満の酸化鉄又は酸化タンタルナノ粒子に、等容のｎ−オクタノール及び０．１Ｍ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）の間における分配係数の対数に関して１未満の値を示すのに十分な親水性を与えるに足るだけの親水性を有することが特に好都合である。
【００２８】
α−ヒドロキシホスホン酸コンジュゲートが付着した修飾親水性ナノ粒子は、接線流濾過及び室温で１週間の貯蔵後に１５０ｍＭ ＮａＣｌ水中での動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した場合に流体力学的直径（ＤH）の実質的変化を示さない安定な水性コロイド懸濁液を形成するのに十分な親水性を有することが特に有利である。
【００２９】
コンジュゲートで処理すべきナノ粒子は、コンジュゲートのα−ヒドロキシホスホン酸部分が付着する５００ｎｍ以下の粒子に形成できる任意の水不溶性材料からなり得る。ＭＲ又はＸ線イメージングにおける造影剤として有用であるナノ粒子を使用することが有利である。しかし、遺伝子のトランスフェクション用細胞培養物のインフュージョンのような他の最終用途のためのナノ粒子もまた有利である。
【００３０】
ＭＲＩ造影剤として使用するためには、ナノ粒子の基材は常磁性の金属又はその化合物とすべきであり、超常磁性のものが特に有利である。これらの金属は、マンガンで始まって亜鉛で終わる元素周期表のIII周期の遷移金属から得るのが好都合である。特に興味深い材料群は酸化鉄に基づくものである。特に好都合な材料は、ＳＰＩＯとして知られるものである。これらの材料は、一般式［Ｆｅ2+Ｏ3］x［Ｆｅ2+Ｏ3（Ｍ2+Ｏ）］1-x（式中、１≧ｘ≧０）を有している。Ｍ2+は、鉄、マンガン、ニッケル、コバルト、マグネシウム、銅、亜鉛又はこれらの組合せのような二価金属イオンであり得る。金属イオン（Ｍ2+）が第一鉄イオン（Ｆｅ2+）であって、ｘ＝０の場合、材料はマグネタイト（Ｆｅ3Ｏ4）であり、ｘ＝１の場合、材料はマグヘマイト（γ−Ｆｅ2Ｏ3）である。
【００３１】
一般に超常磁性は、不対スピンの結晶含有領域が磁区といわれる熱力学的に独立した単一ドメイン粒子と見なし得る程度に大きい場合に生じる。これらの磁区は、それの個々の不対電子の和より大きい正味の磁気双極子を示す。磁場が印加されていなければ、すべての磁区がランダムに配向していて正味の磁化はない。外部磁場の印加はすべての磁区の双極子モーメントを再配向させ、その結果として正味の磁気モーメントが生じる。若干の実施形態では、これらの材料は透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）分析で示されるようにスピネル型結晶構造を示す。
【００３２】
Ｘ線造影剤として使用するためには、ナノ粒子の基材は、生物において通例見出される物質より実質的に大きい放射線不透過性の金属又はその化合物とすべきである。約５０ｎＭの濃度の場合、３４以上の有効原子番号を有する材料を使用するのが好都合である。かかる材料は、特に有利な最小の増強である約３０ハウンスフィールド単位（ＨＵ）以上の適切なコントラスト増強を生み出す可能性がある。このような特性を与え得る遷移金属元素の例には、タングステン、タンタル、ハフニウム、ジルコニウム、モリブデン、銀及び亜鉛がある。酸化タンタルは、Ｘ線イメージング用途で使用するのに適したコア組成物の１つの具体例であ。特に有利なのは、約１００〜約５０００ハウンスフィールド単位の範囲内のＣＴ信号を生み出す材料である。
【００３３】
α−ヒドロキシホスホン酸が付着した修飾親水性ナノ粒子は、診断イメージングにおける造影剤として使用できる。かかる用途では、これらのナノ粒子は被験体（若干の実施形態では、哺乳動物被験体）に投与され、次いで被験体はイメージングに付される。これらのナノ粒子はＭＲ及びＸ線イメージングにおいて特別の有用性を有するが、超音波又は放射性トレーサーイメージングにおいても造影剤として有用である。
【００３４】
特に哺乳動物被験体、さらにはヒト被験体の診断イメージングで使用する場合、α−ヒドロキシホスホン酸が付着した修飾親水性ナノ粒子は、通例は１種以上の賦形剤を含んでも含まなくてもよい薬学的に許容されるキャリヤー中に取り込まれる。投与が注射（特に非経口注射）による場合には、キャリヤーは通例、約１５０ｍＭのＮａＣｌ、５％デキストロース又はこれらの組合せの添加によって等張性にした水性媒体である。それはまた、通例、約７．３〜７．４の生理的ｐＨを有する。投与は、脈管内（ＩＭ）、皮下（ＳＱ）又は最も一般には静脈内（ＩＶ）に行うことができる。しかし、投与はまた、被験体の血液又は組織にナノ粒子をゆっくりと放出するデポの移植によって行うこともできる。
【００３５】
別法として、投与は胃腸管のイメージングのため経口摂取によって行うこともでき、或いは肺及び気道のイメージングのため吸入によって行うこともできる。
【００３６】
ヒト被験体への投与、特にＩＶ投与では、α−ヒドロキシホスホン酸が付着した修飾親水性ナノ粒子は使用する量で無毒であり、細菌やウイルスのようないかなる感染因子も含まず、またいかなる発熱原も含まないことが要求される。したがって、これらのナノ粒子は所要の精製操作に対して安定であり、親水性の低下を受けないことが必要である。
【００３７】
これらのナノ粒子は、適切な重量オスモル濃度及びｐＨを有する安定な水性コロイド懸濁液として、希釈のために適した濃縮水性コロイド懸濁液として、或いは再構成のために適した粉末（例えば、凍結乾燥によって得られる粉末）として、投与の現場に送達し得る。
【００３８】
実施例１
ＰＥＧ−３５０コンジュゲートの合成
ＰＥＧ−３５０モノ（メチルエーテル）アセトアルデヒドの合成。ＣＨ2Ｃｌ2（９８ｍＬ）に溶解したＰＥＧ−３５０モノ（メチルエーテル）（３．４３８ｇ、９．８２ｍｍｏｌ）を含む溶液にＤｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎ Ｐｅｒｉｏｄｉｎａｎｅ（５．００ｇ、１１．７９ｍｍｏｌ）を添加し、得られた溶液を室温で２０時間撹拌した。反応中に微細な白色沈殿が生じたが、反応終了時にこれをセライトパッドでの濾過によって除去した。真空中で濾液から溶媒を除去したところ、黄色の油状物中に懸濁された白色の固体が残った。固体をジエチルエーテルでトリチュレートし、固体をセライトパッドでの濾過によって除去した。真空中で濾液から溶媒を除去したところ、生成物ＰＥＧ−３５０モノ（メチルエーテル）アセトアルデヒド（３．４２ｇ、１００％）が黄色の油状物として残った。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ ９．７３（ｔ，Ｊ＝４Ｈｚ，１Ｈ），４．１６（ｄ，Ｊ＝４Ｈｚ，２Ｈ），７．６５（ｍ，２４Ｈ），３．３８（ｓ，３Ｈ）ｐｐｍ。ＩＲ（ｎｅａｔ）２８７３，１７３２，１４５５，１３５０，１１０９，１０４０，９４８，８５１，７４９ｃｍ-1。
【００３９】
ジエチルα−ヒドロキシＰＥＧ−３５０モノ（メチルエーテル）ホスホネートの合成。テトラヒドロフラン（５３ｍＬ）に溶解したＰＥＧ−３５０モノ（メチルエーテル）アセトアルデヒド（３．７１ｇ、１０．７ｍｍｏｌ）を含む溶液にジエチルホスフィット（１．７７ｇ、１２．８ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を０℃に冷却し、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデセ−７−エン（１．９４ｇ、１２．８ｍｍｏｌ）を添加した。０℃で１０分間撹拌した後、ｒｘｎを室温に加温し、さらに２４時間撹拌した。真空中で溶媒を除去し、残った暗黄色の油状物をカラムクロマトグラフィー（１００％ＣＨ2Ｃｌ2〜１５％ＭｅＯＨ／８５％ＣＨ2Ｃｌ2）によって精製することで、３．３０ｇ（６４％）の所望生成物ジエチルα−ヒドロキシＰＥＧ−３５０モノ（メチルエーテル）ホスホネートを黄色の油状物として得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ ４．１９（ｍ，６Ｈ），３．６５（ｍ，２４Ｈ），３．３８（ｓ，３Ｈ），１．３４（ｍ，６Ｈ）ｐｐｍ。31Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ ２３．１ｐｐｍ。ＩＲ（ｎｅａｔ）３３４３，２８７２，１７２５，１４５３，１２４８，１１０５，９６５，８５０，７９１ｃｍ-1。
【００４０】
α−ヒドロキシＰＥＧ−３５０モノ（メチルエーテル）ホスホン酸の合成。塩化メチレン（７４ｍＬ）に溶解したジエチルα−ヒドロキシＰＥＧ−３５０モノ（メチルエーテル）ホスホネート（３．６１ｇ、７．４３ｍｍｏｌ）を含む溶液にトリメチルシリルブロミド（３．４１ｇ、２２．３ｍｍｏｌ）を添加し、得られた溶液を室温で２時間撹拌した。真空中で溶媒を除去したところ、褐色の油状物が残った。得られた油状物をアセトン（７４ｍＬ）及び水（０．５ｍＬ）に溶解し、得られた溶液を室温で１．５時間撹拌した。次いで、真空中で溶媒を除去したところ、所望生成物α−ヒドロキシＰＥＧ−３５０モノ（メチルエーテル）ホスホン酸（２．６６ｇ、８４％）が金色の油状物として残った。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ ３．６５（ｍ，２４Ｈ），３．３８（ｓ，３Ｈ）。31Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ ２４．０ｐｐｍ。ＩＲ（ｎｅａｔ）３４６０，２８７０，１７２７，１４５６，１３５１，９４５，８４９ｃｍ-1。
【００４１】
実施例２
ＰＥＧ−１９００コンジュゲートの合成
ＰＥＧ−１９００モノ（メチルエーテル）アセトアルデヒドの合成。ＣＨ2Ｃｌ2（８６ｍＬ）に溶解したＰＥＧ−１９００モノ（メチルエーテル）（１６．３２ｇ、８．６０ｍｍｏｌ）を含む溶液にＤｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎ Ｐｅｒｉｏｄｉｎａｎｅ（４．００ｇ、９．４４ｍｍｏｌ）を添加し、得られた溶液を室温で２０時間撹拌した。反応中に微細な白色沈殿が生じたが、反応終了時にこれをセライトパッドでの濾過によって除去した。真空中で濾液から溶媒を除去したところ、白色の固体が残った。これをＴＨＦ／ヘキサンから再結晶することで、所望生成物（１１．６ｇ、７１％）を白色の固体として得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ ９．７４（ｔ，Ｊ＝１Ｈｚ，１Ｈ），４．１７（ｄ，Ｊ＝１Ｈｚ，２Ｈ），３．８３（ｍ，２Ｈ），３．６５（ｍ，１７０Ｈ），３．３９（ｓ，３Ｈ）。
【００４２】
ジエチルα−ヒドロキシＰＥＧ−１９００モノ（メチルエーテル）ホスホネートの合成。テトラヒドロフラン（５７ｍＬ）に溶解したＰＥＧ−１９００モノ（メチルエーテル）アセトアルデヒド（１０．７４ｇ、５．６６ｍｍｏｌ）を含む溶液に、ジエチルホスフィット（０．９３８ｇ、６．７９ｍｍｏｌ）を添加し、次いで１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデセ−７−エン（１．０３ｇ、６．７９ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で７２時間撹拌した。真空中で溶媒を除去し、残った橙黄色の固体をＴＨＦ／ヘキサンから再結晶することで、所望生成物（１１．０８ｇ、９６％）をオフホワイトの固体として得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ ４．１８（ｍ，４Ｈ），３．６４（ｍ，１７２Ｈ），３．３８（ｓ，３Ｈ）。
【００４３】
α−ヒドロキシＰＥＧ−３５０モノ（メチルエーテル）ホスホン酸の合成。塩化メチレン（５４ｍＬ）に溶解したジエチルα−ヒドロキシＰＥＧ−１９００モノ（メチルエーテル）ホスホネート（１１．０８ｇ、５．４４ｍｍｏｌ）を含む溶液にトリメチルシリルブロミド（２．４９ｇ、１６．３ｍｍｏｌ）を添加し、得られた溶液を室温で３時間撹拌した。真空中で溶媒を除去したところ、褐色の油状物が残った。得られた油状物をアセトン（５４ｍＬ）及び水（０．５ｍＬ）に溶解し、得られた溶液を室温で１６時間撹拌した。次いで、真空中で溶媒を除去し、残った橙色の固体をＴＨＦ／ヘキサンから再結晶することで、所望生成物（１０．７７ｇ、８６％）をオフホワイトの固体として得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ ４．１２（ｍ，２Ｈ），３．６５（ｍ，１７０Ｈ），３．３８（ｓ，３Ｈ）。
【００４４】
比較例１
親水性ホスフェートの合成
ジフェニルＰＥＧ−３５０モノ（メチルエーテル）ホスフェートの合成。ＣＨ2Ｃｌ2（８０ｍＬ）に溶解したＰＥＧ−３５０モノ（メチルエーテル）（８．５４ｇ、２４．４ｍｍｏｌ）を含む溶液に、トリエチルアミン（３．６８ｇ、３６．６ｍｍｏｌ）を添加し、次いで４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（０．２９８ｇ、２．４４ｍｍｏｌ）を添加した。得られた溶液を０℃に冷却し、ジフェニルクロロホスフェート（７．８７ｇ、２９．３ｍｍｏｌ）を滴下し、反応物を０℃で１０分間撹拌した。次いで、反応物を室温に加温し、さらに１６時間撹拌した。反応物を１０％ＨＣｌ（８０ｍＬ）の添加で奪活し、得られた層を分離した。有機層を水（８０ｍＬ）及びブライン（８０ｍＬ）で洗浄し、無水物ＭｇＳＯ4上で乾燥した。濾過し、真空中で溶媒を除去したところ、所望生成物（１４．２ｇ、１００％）が金色の油状物として残った。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ ７．３４（ｍ，４Ｈ），７．２２（ｍ，６Ｈ），４．３８（ｍ，２Ｈ），３．７３（ｍ，２Ｈ），３．６４（ｍ，２４Ｈ），３．５４（ｍ，２Ｈ），３．３８（ｓ，３Ｈ）。
【００４５】
ＰＥＧ−３５０モノ（メチルエーテル）リン酸の合成。酢酸（１０８ｍＬ）に溶解したジフェニルＰＥＧ−３５０モノ（メチルエーテル）ホスフェート（１４．２ｇ、２４．４ｍｍｏｌ）を含む溶液に酸化白金（IV）水和物（２００ｍｇ）を添加し、得られた懸濁液を５０℃に加熱し、水素の取込みが止むまでＨ2雰囲気下に置いた。反応物をセライトパッドで濾過して触媒を除去し、真空中で溶媒を除去したところ、所望生成物（１０．４９ｇ、１００％）が透明な黄色油状物として残った。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ ４．２０（ｍ，２Ｈ），３．６７（ｍ，２４Ｈ），３．５６（ｍ，２Ｈ），３．３９（ｓ，３Ｈ）。
【００４６】
実施例３
超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）ナノ粒子の合成。１００ｍＬ三つ口丸底フラスコにＦｅ（ａｃａｃ）3（０．７０６ｇ、２．０ｍｍｏｌ）及び無水ベンジルアルコール（２０ｍＬ）を仕込んだ。得られた溶液を窒素でスパージし、窒素雰囲気下において１６５℃で４時間加熱した。次いで、得られた（ＤＬＳで測定して）５ｎｍ酸化鉄粒子のコロイド懸濁液を室温に冷却し、その温度で貯蔵した。
【００４７】
実施例４
α−ヒドロキシＰＥＧ−３５０モノ（メチルエーテル）ホスホネートでコートした超常磁性酸化鉄ナノ粒子の合成。実施例３の超常磁性酸化鉄ナノ粒子をＴＨＦ中に懸濁した１ｍｇ Ｆｅ／ｍＬのコロイド懸濁液に、（Ｆｅ １モル当たりコンジュゲート１モルの比率で）実施例１のα−ヒドロキシホスホン酸コンジュゲートを添加し、得られた懸濁液を５０℃で１６時間加熱した。次いで、反応物を室温に冷却し、水で希釈し、褐色の水溶液をヘキサで３回洗浄した。水性層中に残留する揮発分を真空中で除去し、得られたナノ粒子を、接線流濾過を使用しながら３０ｋＤａ分子カットオフフィルターに対してＨ2Ｏで洗浄することで精製した。
【００４８】
実施例５
α−ヒドロキシＰＥＧ−１９００モノ（メチルエーテル）ホスホネートでコートした超常磁性酸化鉄ナノ粒子の合成。実施例１のコンジュゲートの代わりに実施例２のコンジュゲートを用いて実施例４を繰り返した。
【００４９】
比較例２
α−ヒドロキシＰＥＧ−３５０モノ（メチルエーテル）ホスフェートでコートした超常磁性酸化鉄ナノ粒子の合成。比較例１のコンジュゲートを用いて実施例４を繰り返した。
【００５０】
実施例６
５−ブロモ−１−ペンタナールの合成。２５０ｍＬ丸底フラスコ内で、塩化オキサリル（２．４２ｍＬ、０．０２２ｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（４０ｍＬ）と混合した。フラスコを窒素でブランケットし、溶液をドライアイス／アセトン浴中で−７８℃に冷却した。反応混合物を撹拌し、無水ジメチルスルホキシド（３．４ｍＬ、０．０４４ｍｏｌ）をフラスコにゆっくりと添加し、次いで５−ブロモ−１−ペンタノール（３．３４ｇ、０．０２０ｍｏｌ）を添加し、反応混合物を−７８℃で１５分間撹拌した。トリエチルアミン（１４．０ｍＬ、０．１ｍｏｌ）を反応混合物にゆっくりと添加した。トリエチルアミンの添加が完了した後、反応物を−７８℃で５分間撹拌した。反応物をドライアイス／アセトン浴から取り出し、室温に加温し、室温で１８時間撹拌した。
【００５１】
水（１００ｍＬ）を反応混合物に添加した。二相混合物を５００ｍＬ分液漏斗内で激しく振盪した。水性層を除去し、ジクロロメタン（１００ｍＬ）で抽出した。このジクロロメタンを反応混合物からのジクロロメタンと合わせた。合わせたジクロロメタン溶液を各１００ｍＬの１％ＨＣｌ(aq)、水、飽和ＮａＨＣＯ3(aq)及び飽和ＮａＣｌ(aq)で順次に洗浄した。ジクロロメタン溶液を硫酸マグネシウムで乾燥し、ジクロロメタン溶液を濾過によって回収した。真空下で溶媒を除去したところ、黄色の液体（１．８０ｇ）が残った。主生成物は５−ブロモ−１−ペンタナールであることが1Ｈ ＮＭＲによって確認された。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ ９．８１（ｍ，１Ｈ），３．４３（ｍ，３Ｈ），２．５０（ｍ，２Ｈ），２．０−１．４（ｍ，８Ｈ）。それ以上の精製なしに反応生成物を実施例７に供した。
【００５２】
実施例７
ジエチル（５−ブロモ−１−ヒドロキシ−ペンチル）ホスホネートの合成。２５０ｍＬ丸底フラスコ内で、５−ブロモペンタナール（１．６４ｇ、０．０１０ｍｏｌ）をジエチルエーテル（１５ｍＬ）に溶解した。反応物を窒素でブランケットした。過塩素酸リチウム（７．９２ｇ、０．０７５ｍｏｌ）を反応物に添加し、反応溶液を氷浴中で０℃に冷却した。クロロトリメチルシラン（０．６３１ｍＬ、０．０１０ｍｏｌ）をフラスコに添加し、次いでトリメチルホスフィット（２．１ｍＬ、０．０１２ｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で１８時間撹拌した。
【００５３】
室温で１８時間後、水（４０ｍＬ）を反応物に添加し、次いでジクロロメタン（４０ｍＬ）を添加した。有機層を分液漏斗に移し、水（４０ｍＬ）及びブライン（４０ｍＬ）で順次に洗浄した。塩化メチレン溶液を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過して塩化メチレン溶液を回収した。真空下で溶媒を除去したところ、黄色の油状物（３．０１ｇ）が残った。油状物を1Ｈ ＮＭＲ及び31Ｐ ＮＭＲによって特性決定し、主生成物はジエチル（５−ブロモ−１−ヒドロキシ−ペンチル）ホスホネートであることが確認された。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ ４．２５−４．００（ｍ，４Ｈ），３．００−３．４３（ｍ，２Ｈ），１．７８−１．９５（ｍ，２Ｈ），１．７８−１．６１（ｍ，３Ｈ），１．６１−１．４１（ｍ，２Ｈ），１．４０−１．２５（ｍ，６Ｈ）。31Ｐ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ ２６．５（ｓ，１Ｐ），２４．２−２４．７（ｍ，０．３Ｐ）。それ以上の精製なしに反応生成物を実施例８に供した。
【００５４】
実施例８
ジエチル５−（４−（エトキシカルボニル）ピペリジン−１−イル）−１−ヒドロキシペンチルホスホネートの合成。３００ｍＬ丸底フラスコ内で、ジエチル（５−ブロモ−１−ヒドロキシ−ペンチル）ホスホネート（３．０２ｇ、０．００９９ｍｏｌ）を無水トルエン（１００ｍＬ）に溶解した。トリエチルアミン（２．０８ｍＬ、０．０１５ｍｏｌ）を反応混合物に添加し、次いでエチルイソニペコテート（１．８４ｍＬ、０．０１２ｍｏｌ）を添加した。混合物を１８時間加熱還流した。真空下で溶媒を除去したところ、橙色のガムが残った。ガムをジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶解し、飽和ＮａＨＣＯ3水溶液（１００ｍＬ）及びブライン（１００ｍＬ）で順次に洗浄した。塩化メチレン溶液を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過によって回収した。真空下で溶媒を除去したところ、橙色の液体（１．７０ｇ）が残った。
【００５５】
橙色の液体をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製した。シリカゲルカラム（４０ｇ）を、１００％ジクロロメタンで開始し、３０分かけてジクロロメタン中２０体積％メタノールまで変化する溶媒勾配を用いて溶出した。生成物を含む画分を合わせ、真空下で溶媒を除去したところ、黄色の液体（０．６６ｇ）が残った。黄色の液体を1Ｈ ＮＭＲによって特性決定し、主生成物はジエチル５−（４−（エトキシカルボニル）ピペリジン−１−イル）−１−ヒドロキシペンチルホスホネートであることが確認された。1Ｈ ＮＭＲ（４００ｍＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ ４．９−４．５（ｓ，１Ｈ），４．２−４（ｍ，５Ｈ），３．８−３．７（ｍ，１Ｈ），２．９−２．７（ｍ，２Ｈ），２．４−２．１（ｍ，３Ｈ），２．１−１．９（ｍ，２Ｈ），１．９−１．８（ｍ，２Ｈ），１．８−１．３（ｍ，８Ｈ），１．３−１．２（ｍ，５Ｈ），１．２−１．１（ｍ，３Ｈ）。それ以上の精製なしに反応生成物を実施例９に供した。
【００５６】
実施例９
５−（４−（エトキシカルボニル）ピペリジン−１−イル）−１−ヒドロキシペンチルホスホン酸の合成。１００ｍＬフラスコ内で、ジエチル５−（４−（エトキシカルボニル）ピペリジン−１−イル）−１−ヒドロキシペンチルホスホネート（０．６６ｇ、０．００１７ｍｏｌ）をジクロロメタン（２５ｍＬ）に溶解した。ブロモトリメチルシラン（０．６９ｍＬ、０．００５２ｍｏｌ）を反応混合物に添加した。反応物を室温で一晩撹拌した。一晩の撹拌後、真空下で溶媒を除去したところ、橙色のガムが残った。ガムをアセトン（２０ｍＬ）に溶解した。水（０．４ｍＬ）を添加した。ガムが沈殿した。真空下で溶媒を除去したところ、赤色のガム（０．６ｇ）が残った。ガムを1Ｈ ＮＭＲによって特性決定し、生成物は５−（４−（エトキシカルボニル）ピペリジン−１−イル）−１−ヒドロキシペンチルホスホン酸であることが確認された。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ3ＯＤ）δ ４．３−４．１（ｍ，２Ｈ），３．９−３．４（ｍ，３Ｈ），３．４−２．５（ｍ，７Ｈ），２．５−１．３５（ｍ，１１Ｈ），１．３５−１．２（ｍ，３Ｈ）。
【００５７】
実施例１０
５−（４−（エトキシカルボニル）ピペリジン−１−イル）−１−ヒドロキシペンチルホスホネートでコートした酸化タンタルナノ粒子の合成。イソ酪酸（０．２４２ｇ、２．７５ｍｍｏｌ）及び水（０．０８ｇ、４．４４ｍｍｏｌ）を含む無水メタノール（１７ｍＬ）の溶液を、Ｎ2でスパージすることで４０分間ガス抜きした。これにＴａ2（ＯＥｔ）2（１ｇ、２．４６ｍｍｏｌ）を滴下し、反応混合物をＮ2雰囲気下で５時間撹拌することで、３〜４ｎｍナノ粒子の懸濁液を得た。５−（４−（エトキシカルボニル）ピペリジン−１−イル）−１−ヒドロキシペンチルホスホン酸（０．０８８ｇ、０．２０５ｍｍｏｌ）をメタノール（０．５ｍＬ）に溶解した溶液を酸化タンタルナノ粒子懸濁液（１ｍＬ）に滴下し、Ｎ2下において７０℃で一晩加熱した。室温に冷却した後、水（約３ｍＬ）を反応混合物に滴下した。ロータリーエバポレーター上においてメタノールを減圧下で蒸発させて除去した後、１Ｍ ＮＨ4ＯＨ（０．３３ｍＬ）を添加し、反応物を５０℃で一晩撹拌した。３５００Ｄａ分子量カットオフ再生セルロース膜を用いて、反応混合物を水（３×２Ｌ）に対して２４時間透析した。ＤＬＳによれば、粒度は水中で７ｎｍであると確認された。
【００５８】
実施例１１
ＳＰＩＯナノ粒子のコロイド懸濁液の特性決定。実施例４及び実施例５並びに比較例２において接線流濾過の結果として得られたコロイド懸濁液を、安定性及びゼータ電位に関して評価した。
【００５９】
１５０ｍＭ ＮａＣｌ水溶液を懸濁媒体として使用しながら、動的光散乱（ＤＬＳ）によって流体力学的直径（ＤH）を測定した。接線流濾過で精製したＳＰＩＯ懸濁液を１５０ｍＭ ＮａＣｌ水溶液で希釈し、１００ｎｍフィルターに通してダストを除去した後、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ ＺｅｔａＰＡＬＳを用いてＤＬＳ分析を行った。希釈は、ＤＬＳ測定中に最小で毎秒２００００カウントを与えるように実施した。測定は、修飾ナノ粒子を製造した直後及び室温で２週間貯蔵した後に行った。貯蔵後におけるＤHの顕著な増大は、ナノ粒子が凝集し、したがってそのコロイド懸濁液が安定でないことを表していた。
【００６０】
接線流濾過で精製したＳＰＩＯ懸濁液を１０ｍＭ ＮａＣｌで１４×に希釈し、希釈したＳＰＩＯ溶液を１００ｎｍフィルターに通してダストを除去した後、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ ＺｅｔａＰＡＬＳを用いてゼータ電位を測定した。３種のコロイド懸濁液のすべてに関し、ゼータ電位は一般に中性として認められている±１５ｍＶの範囲内にあった。
【００６１】
結果を表１に示す。
【００６２】
【表１】
実施例１２
ＭＲＩによるインビボ腫瘍のイメージング。動物に関係するすべての手続きは、ＧＥ Ｇｌｏｂａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認されたプロトコルの下で完了した。雌のＦｉｓｃｈｅｒ ３４４ラット（約１５０ｇ）において、０．１ｍＬのハンクス平衡塩類溶液中の２×１０6 Ｍａｔ Ｂ III細胞（ＡＴＣＣ＃ ＣＲＬ１６６６、ＡＴＣＣ（マナサス、米国ヴァージニア州））を皮下注射することで腫瘍を誘導した。注射部位は肩胛骨の間の背中に位置していた。移植から９日後、腫瘍が直径約１ｃｍになった時に腫瘍のイメージングを行った。
【００６３】
イメージングは、注文製造の約６ｃｍソレノイド受信ＲＦコイルを用いて臨床用の３Ｔ ＧＥ ＭＲ７５０スキャナー上で行った。イメージングの準備のため、それぞれ７５ｍｇ／ｋｇ及び５ｍｇ／ｋｇの用量でケタミン及びジアゼパムをＩＰ注射することで麻酔した。固定後、２４ゲージのカテーテルをを側尾静脈内に配置し、食塩水でプライムしたマイクロボアカテーテルライン延長部及びストップコックに連結した。カテーテル、ライン及びストップコックの死容積は約０．５ｍＬであった。次いで、前処理した動物をＲＦコイル内に配置し、スキャナーのボア内で位置決めした。注射前画像セットを取得し、次いでテーブル又は動物を移動させることなしにＰＥＧ−３５０ α−ヒドロキシホスホネートでコートした超常磁性酸化鉄ナノ粒子をストップコック経由で注射し、次いで食塩水（約０．８ｍＬ）でフラッシュした。注射の直後に（注射後約３０秒から始めて）、約３０分の動的取得時間を通じて画像セットを収集し、約１６のポストコントラスト時点の収集が得られた。注射に関しては、ＳＰＩＯ造影剤を１０ｍｇ Ｆｅ／ｍＬの濃度で生理食塩水中に懸濁し、注射前に滅菌濾過し、内毒素の存在について試験した。造影剤は３ｍｇ Ｆｅ／ｋｇ体重の用量で投与した。
【００６４】
１０のエコー時間での画像収集を可能にする３Ｄ高速勾配エコーパルスシーケンスを使用した。グラフィカルプレスクリプションインターフェースにより、腫瘍がトランスアキシャルスライス内で中央に位置しかつカバー範囲が深さ方向で腫瘍の大部分を含むようにイメージングスラブを位置決めした。バルスシーケンスパラメーターは次の通りであった。パルスシーケンス：３Ｄ ＭＥ ｆＧＲＥ、ＴＥ：４．１〜６８の範囲にわたり、スペーシングは７．１ｍｓ、ＴＲ：７５．５ｍｓ、フリップ角：２５度、帯域幅：６２．５ＭＨｚ、マトリクス：２５６×２５６、スライス厚さ：０．９ｍｍ、視野：８ｃｍであって、０．３１×０．３１×０．９のボクセル寸法を生じる。シーケンス取得時間は約２分であった。
【００６５】
ＩＤＬプラットホーム（ＩＤＬ ｖ．６．３、ＩＴＴ Ｃｏｒｐ．（ボールダー、米国コロラド州））上に構築されたカスタムソフトウェアツール（ＣｉｎｅＴｏｏｌ ｖ８．０．２、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いてイメージングデータセットを解析した。簡単に述べれば、かかる画像解析ツールは、注射前系列上に３Ｄ検査対象領域（ＲＯＩ）を手動描画し、続いてすべての時点で描画されたＲＯＩ内のあらゆるボクセルに関する指数回帰を行ってＴ2*時間定数を計算することを可能にした。代表的な画像及び差マップを図６に示す。
【００６６】
以上、本明細書中には本発明の若干の特徴のみを例示し説明してきたが、当業者には数多くの修正及び変更が想起されるであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は本発明の真の技術思想に含まれるこのような修正及び変更のすべてを包含することを理解すべきである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的には、ナノ粒子（特に遷移金属酸化物に基づくナノ粒子）を処理することで、安定な水性懸濁液を形成するのに十分な親水性をそれに付与し、したがってＭＲＩ及びＸ線イメージングのような診断イメージングにおける造影剤のような親水性を要求する用途で有用にするための方法、前記処理で得られる親水性ナノ粒子、前記安定な水性懸濁液、並びに前記イメージングにおける造影剤としての前記親水性ナノ粒子の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ナノ粒子、即ち適切にはナノメートル単位で測定される直径を有する粒子は、多種多様の最終用途に関して検討されてきた。これらの用途の一部はある程度の親水性を要求するが、ある種のナノ粒子の基材となる材料はこの属性に欠けることがある。例えば、ＭＲ及びＸ線イメージング用の造影剤として使用するのに適したイメージング特性を有するナノ粒子は、通例は適当な親水性に欠ける遷移金属酸化物に基づいている。したがって、これらのナノ粒子の表面特性を修飾して水性媒体との適合性を高め、これらのナノ粒子に安定な水性懸濁液を形成する能力を与えるための努力が行われてきた。しかし、造影剤としての使用のような若干の用途では、ナノ粒子は単分散の粒度分布を有することも好ましく、カルボキシレート基をもった炭水化物に基づく生物学的マトリックス中での錯体化による不均一な凝集のような多分散の粒度分布を生じる表面処理は問題がある。さらに、造影剤としてのインビボでの使用のような若干の用途では、表面処理は明確に定義された再現可能な構造を有すると共に、安全性試験にも適合することが望ましい。シラン系表面処理は、これらの目標を妨げる自己縮合を受けることがあるので問題を有し得る。
【０００３】
さらに、精製の結果として親水性の低下を生じないと共に、電解質を含む水性媒体中で懸濁安定性を示す親水性ナノ粒子に対するニーズが存在していた。例えば、ヒト被験体におけるインビボでの使用のための造影剤の製造に際しては、候補ナノ粒子は濾過に付されると共に、等張の水性媒体（即ち、約１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む媒体）中で懸濁安定性を示すことが期待されるのが通例である。単独のリン酸系物質（例えば、ポリリン酸）又は親水性部分（例えば、ポリエチレングリコール）に連結されたリン酸系物質を用いて、遷移金属酸化物にリン酸イオンを付着させることでこのタイプの親水性をナノ粒子に付与するための努力が存在していた。これに関して述べれば、ヒト被験体におけるインビボでの使用のためには、ヒト組織との望ましくない相互作用を避けるため本質的に中性のゼータ電位を有する親水性ナノ粒子が好ましい。しかし、かかる努力は、濾過後に１５０ｍＭ ＮａＣｌ水性媒体中でコロイド懸濁液として所望の安定性を示す親水的に修飾されたナノ粒子を生み出さなかった。例えば、かかる努力は、３０ｋＤａカットオフでの接線流濾過及びかかる水性媒体中で１週間以上の貯蔵後に動的光散乱（ＤＬＳ）で測定した場合に本質的に安定な粒度（増大しない流体力学的直径（ＤH））を示す懸濁液を生み出さなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
米国特許出願第２００３／２２９２８０号明細書
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、α−ヒドロキシ基を担持する炭素原子を介してα−ヒドロキシホスホン酸及び親水性部分を結合してなるコンジュゲートが、水不溶性ナノ粒子（特に遷移金属酸化物に基づくナノ粒子）の親水性を向上させるための作用物質として優れた性能を有するという発見を含んでいる。コンジュゲートの結合では、α−ヒドロキシホスホン酸の３つのヒドロキシル基のすべてが保存され、これがナノ粒子に対する優れた付着力をコンジュゲートに与えると考えられる。若干の実施形態では、コンジュゲートは次の構造Ｉを有している。
【０００６】
【化１】
式中、Ｓはスペーサーであり、ＬはＳとＲとの間の結合であり、Ｒは親水性部分であり、ｍ及びｐは１〜５であり、ｎ及びｏは０〜５である。若干の実施形態では、Ｓは直接結合、非置換又は置換脂肪族基又は脂環式基、非置換又は置換アリール基、ヘテロ脂肪族基或いはヘテロアリール基であり、若干の場合には１〜１０個の炭素原子からなる長さの直鎖アルキル基である。Ｌは、直接結合、カルボニル基、エーテル基、エステル基、第二級又は第三級アミン、第四級アミン基、アミド基、カルバメート基或いは尿素基である。好適なナノ粒子は、水中における糖又は食塩のように溶質の個々の分子が溶媒中に一様に分散するという古典的な意味では、水に不溶なものである。したがって、水中においてある程度の懸濁性を有するナノ粒子をα−ヒドロキシホスホン酸コンジュゲートで処理すること、及びこうして得られるコンジュゲートが付着したナノ粒子は、本発明に包含される。
【０００７】
コンジュゲートは、ヒトの組織と望ましくない反応を起こすことがある基又は部分を含まないことが特に有利である。したがって、コンジュゲートはナノ粒子に付着した場合に約−４０ｍＶ乃至４０ｍＶ、好ましくは約−１５ｍＶ乃至１５ｍＶのゼータ電位を示すのが好都合である。このように付着した場合、コンジュゲートは本質的に中性のゼータ電位を示すことが特に興味深い。これは、双性イオン又は非イオン性部分を親水性部分として使用することで簡便に達成される。
【０００８】
親水性部分はモノマー又はポリマーであり得るが、これらは本質的に中性の正味イオン電荷を有するのが好都合である。ポリマー親水性部分部分のうち、少なくとも部分的にエチレンオキシド単位に基づくポリエーテル（例えば、エチレンオキシド／プロピレンオキシドコポリマー及びポリエチレングリコール）が特に有利である。正味電荷を有しないモノマー親水性部分（特に双性イオン）は、安定性評価のための特性決定が非常に容易であるので、ヒト被験体に関してインビボで使用すべきナノ粒子を処理するために使用されるコンジュゲートにとって好都合である。これらのうち、４−ピペラジンカルボン酸に基づくものが特に有利である。
【０００９】
ヒト被験体に関してインビボで使用すべきナノ粒子を処理するために使用されるコンジュゲートにとってはまた、α−ヒドロキシホスホン酸と親水性部分との間の結合が炭化水素であること、即ち構造Ｉ中でＡが単結合であることも好都合である。これは、かかる処理ナノ粒子とヒトの組織との相互作用の可能性を最小にする。これに関して述べれば、次の構造II及び構造IIIのコンジュゲートが特に有利である。
【００１０】
【化２】
コンジュゲートは、好ましくは、ナノ粒子１個当たり約２個のコンジュゲートの比率でナノ粒子を処理するために使用した場合、ナノ粒子が水性媒体中にＤＬＳで測定して約５００ｎｍ以下のＤHを有する安定なコロイド懸濁液を形成し得るのに十分な親水性を有している。コンジュゲートは、このようにして処理されたナノ粒子に、等容のｎ−オクタノール及び０．１Ｍ ３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液（ｐＨ７．０）の間における分配係数の対数に関して１未満の値を示すのに十分な親水性を付与することが特に好都合である。
【００１１】
一層高い親水性を達成するようにコンジュゲートで処理されるナノ粒子は、好ましくは、遷移金属及び遷移金属化合物（例えば、酸化物、炭化物、硫化物、窒化物、リン化物、ホウ化物、ハロゲン化物、セレン化物、テルル化物及びこれらの組合せ）に基づいている。酸化物が特に有利である。酸化物構造はα−ヒドロキシホスホン酸の付着力に寄与すると考えられる。遷移金属化合物は、ＭＲ及びＸ線イメージング用の造影剤を製造するために有用である。元素周期表の第３周期の遷移金属は、常磁性（好都合には超常磁性）を示す化合物を形成するために有用であり、したがってＭＲＩ造影剤として有用である。特に好都合なのは、酸化鉄及び任意にはコバルト、銅、マンガン、ニッケル又はこれらの組合せに基づく超常磁性ナノ粒子である。これらのうち、最も好都合なのは、マグネタイト、マグヘマイト又はこれらの組合せに基づくナノ粒子であって、粒径が約１５ｎｍ以下でありかつ超常磁性を示すものである。これらは一般に超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）粒子といわれる。３４を超える原子番号の遷移金属及び亜鉛は、Ｘ線造影剤として有用な化合物を製造するために有用である。これらのうち、ハフニウム、モリブデン、銀、タンタル、タングステン及びジルコニウムが特に有利であり、タンタル（特に酸化タンタル）が最も好都合である。
【００１２】
親水的に修飾されたナノ粒子は、通例、ＤＬＳで測定して５００ｎｍ以下のＤHを有する。好都合には、そのＤHは５０ｎｍ以下であり、さらに好ましくは３０ｎｍ以下であり、最も好ましくはそのＤHは３〜３０ｎｍである。親水的に修飾されたナノ粒子がヒト被験体において例えばＭＲ又はＸ線造影剤としてインビボで使用する予定であれば、特に好都合なＤHは約８ｎｍ以下である。
【００１３】
親水的に修飾されたナノ粒子は、簡便にはナノ粒子をコンジュゲートと反応させることで製造される。好都合なアプローチは、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）のような有機溶媒中におけるナノ粒子のコロイド懸濁液を形成し、次いでそれを同一又は異なる有機溶媒中におけるコンジュゲートの有機溶液と混合することである。次いで、反応が本質的に完了するまで、混合物を高温に長時間保つ。通例、５０℃以上の温度で１６時間以上が好都合である。
【００１４】
親水的に修飾されたナノ粒子の安定な単分散水性コロイド懸濁液は容易に得られる。かかる懸濁液は、好ましくは、３０ｋＤａカットオフでの接線流濾過のような濾過、及び水性媒体を等張にするためのＮａＣｌ（即ち、約１５０ｎＭのＮａＣｌ）の添加のような電解質の添加に対して安定であるべきである。好ましくは、懸濁液は１週間以上の貯蔵に対して安定であり、さらに好ましくは、沈降ばかりでなく懸濁ナノ粒子のＤＬＳで測定されるＤＨの増大に対しても安定である。もし懸濁液をヒト被験体においてインビボで使用するのであれば、ＮａＣｌ、デキストロース又はこれらの組合せの添加によってそれを等張にするのが好都合である。
【００１５】
安定な単分散水性コロイド懸濁液は、簡便にはコロイド懸濁液を有機溶媒で希釈することで製造される。好都合なアプローチは、その中でナノ粒子をコンジュゲートと反応させた有機溶媒又は有機溶媒混合物を単に水の添加で希釈することである。別のアプローチは、有機溶媒中におけるナノ粒子のコロイド懸濁液を水中のコンジュゲートと反応させることである。いずれの場合にも、濾過又はヘキサンのような溶媒での有機抽出或いはこれらの組合せによって未反応の反応体を除去するのが好都合である。溶媒抽出後における水性相中の揮発分は、部分真空の適用によって除去できる。次いで、親水的に修飾されたナノ粒子は３０ｋＤａフィルターに対する接線流濾過によって精製できる。
【００１６】
親水的に修飾されたナノ粒子は、診断イメージングにおける造影剤として好都合に使用できる。通常のタイプのかかる診断イメージングはＭＲ及びＸ線イメージングである。いずれの場合にも、−１５ｍＶ乃至１５ｍＶのゼータ電位を有する親水的に修飾されたナノ粒子を使用するのが好都合である。ヒト被験体のインビボイメージングにおける好都合なアプローチは、ナノ粒子を好ましくは安定な等張水性懸濁液として静脈内に投与することである。イメージングがＭＲによる場合には、ナノ粒子は常磁性（好ましくは超常磁性）の化学種からなるべきであり、さらに好ましくはマグネタイト又はマグヘマイトのように酸化鉄に基づくものであるべきである。イメージングがＸ線による場合には、ナノ粒子は３４を超える原子番号の金属又は亜鉛（好ましくは、金、ハフニウム、モリブデン、銀、タンタル、タングステン又はジルコニウム）の遷移金属化合物からなるべきであり、最も好ましくは酸化タンタルに基づくものであるべきである。特に興味深い実施形態では、親水的に修飾されたナノ粒子は８ｎｍ以下のＤHを有し、腎臓を通して被験体の身体から排出される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
本発明の上記その他の特徴、態様及び利点は、添付の図面を参照しながら以下の詳細な説明を読んだ場合に一層よく理解されよう。添付の図面中では、図面全体を通じて類似の部分は同一の符号で示されている。
【図１】図１は、親水性ナノ粒子を製造するための好適なα−ヒドロキシホスホン酸の一般構造式である。
【図２】図２は、親水性ナノ粒子を製造するための特に有利なα−ヒドロキシホスホン酸の構造式（式中、Ｍｅはメチル基である。）である。
【図３】図３は、親水性部分Ｒが結合したα−ヒドロキシホスホン酸に至る合成経路である。
【図４】図４は、図２に示された特に有利なα−ヒドロキシホスホン酸に至る合成経路である。
【図５】図５は、図３に示すようにして合成されるタイプのα−ヒドロキシホスホン酸であって、親水性部分Ｒが超常磁性酸化鉄ＳＰＩＯナノ粒子に結合した場合を示す仮説模式図である。
【図６Ａ】図６Ａは、造影剤の不使用時における実施例１２に係る腫瘍のＴ1重み付き画像（ＴＥ＝４．１ｍｓ）である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、実施例４のナノ粒子造影剤の投与から３０分後における実施例１２に係る腫瘍のＴ1重み付き画像（ＴＥ＝４．１ｍｓ）である。
【図６Ｃ】図６Ｃは、図６Ａと図６Ｂとの間の差を示す差マップである。
【図６Ｄ】図６Ｄは、造影剤の不使用時における実施例１２に係る腫瘍のＴ2*重み付き画像（ＴＥ＝１８．４ｍｓ）である。
【図６Ｅ】図６Ｅは、実施例４のナノ粒子造影剤の投与から３０分後における実施例１２に係る腫瘍のＴ2*重み付き画像（ＴＥ＝１８．４ｍｓ）である。
【図６Ｆ】図６Ｆは、図６Ｄと図６Ｅとの間の差を示すＲ2*緩和差マップであって、腫瘍と筋肉組織との明確な区別を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明のコンジュゲートは、広義には多種多様の結合及び親水性部分を有するものとして定義される。重要な特徴は、化学的かつ立体的にアクセス可能なα−ヒドロキシホスホン酸の３つのヒドロキシル基を有することである。かかる構造はキラル中心を有するものの、個々の鏡像異性体及び可能なラセミ混合物のすべてが水不溶性ナノ粒子に親水性を付与するために適していると予想される。
【００１９】
これらのコンジュゲートは、α−ヒドロキシホスホン酸構造と親水性部分との間に、炭素、窒素、酸素及び硫黄に基づくものをはじめとする周知化学結合のいずれかを含み得る。特に有利な基は、炭化水素、カルボニル、エステル、エーテル、第二級又は第三級アミン、第四級アミン、尿素、カルバメート及びアミドである。コンジュゲートで処理すべきナノ粒子の所期の最終用途は、結合基の選択に影響を与えることがある。例えば、ナノ粒子を特にヒト被験体においてインビボで使用するのであれば、タンパク質のような組織成分との相互作用を生じることがある第四級基のような結合を避けるのが望ましい場合がある。不活性の観点から最も有利な結合基は炭化水素である。
【００２０】
親水性部分は、界面活性剤として知られているものを含め、水との良好な適合性を有することが知られている任意の部分であり得る。これらはアニオン性、カチオン性又は非イオン性であり得る。親水性部分は、単糖、二糖又はオリゴ糖のような炭水化物、非炭水化物系モノマーポリアルコール、エチレンオキシド基を有するポリエーテル、ポリビニルアルコールのようなペンダントヒドロキシル基を有する（エチレンオキシド基を有するポリエーテル以外の）非炭水化物系ポリマー、ポリ（エチレンイミン）、脂肪族又は脂環式アミン及びこれらの組合せであり得る。
【００２１】
若干の実施形態では、親水性部分はエチレンオキシドに基づいており、ポリ（エチレンオキシド）が特に有利である。特に約５０００ダルトン以下の分子量を有するもの、とりわけ約２０００ダルトン以下の分子量を有するものが有利である。約３５０ダルトンの分子量を有するポリ（エチレンオキシド）が特に有利である。
【００２２】
親水性部分はまた、１以上の正に帯電した部分、１以上の負に帯電した部分、及び帯電部分の間にあるスペーサー基を有する双性イオンであり得る。本願の目的のためには、正に帯電した部分及び負に帯電した部分の組合せは、生理学的ｐＨ値でそれが本質的に正味電荷を示さなければ双性イオンと見なされる。好適な正に帯電した部分には、プロトン化第一級アミン、プロトン化第二級アミン、プロトン化第三級アルキルアミン、第四級アルキルアミン、プロトン化アミジン、プロトン化グアニジン、プロトン化ピリジン、プロトン化ピリミジン、プロトン化ピラジン、プロトン化プリン、プロトン化イミダゾール、プロトン化ピロール又はこれらの組合せがあり、好適な負に帯電した部分には、脱プロトン化カルボン酸、脱プロトン化スルホン酸、脱プロトン化スルフィン酸、脱プロトン化ホスホン酸、脱プロトン化リン酸、脱プロトン化ホスフィン酸又はこれらの組合せがあり、好適なスペーサー基には、非置換及び置換の脂肪族基、脂環式基及びアリール基、ヘテロ脂肪族基、ヘテロアリール基、エーテル、アミド、エステル、カルバメート、尿素又はこれらの組合せがある。一実施形態では、スペーサー基は１〜１０個の炭素原子からなる長さの直鎖アルキル基を含んでいる。
【００２３】
ナノ粒子の所期の最終用途が正味イオン電荷を有するα−ヒドロキシホスホン酸コンジュゲートが付着した修飾親水性ナノ粒子に適合しているならば、親水性部分は双性イオンの形成に適するものとして上記に記載された正に帯電した部分のいずれか又は負に帯電した部分のいずれかであり得る。
【００２４】
コンジュゲートで処理すべきナノ粒子の所期の最終用途は、親水性部分の選択に影響を与えることがある。例えば、ナノ粒子を特にヒト被験体においてインビボで使用するのであれば、タンパク質のような組織成分との相互作用を生じることがあるイオン基のような親水性部分を避けるのが望ましい場合がある。インビボ用途のためには、本質的に正味電荷をもたない親水性部分（例えば、双性イオン及びエチレンオキシド単位を有するポリエーテル）が特に有利である。ヒト被験体で使用するためには、安全性評価のため容易かつ再現可能に特性決定される親水性部分（例えば、モノマー部分）が特に好都合である。特に好都合な親水性部分は４−ピペラジンカルボン酸に基づくものであって、これらはモノマーであると共に双性イオンとして正味電荷を有していない。細胞培養物のインビトロ接種のような、毒性があまり問題にならない用途のためには、ポリ（エチレン）イミンが適当な親水性部分であり得る。
【００２５】
特に好適な双性イオンは、２００８年１２月２９日に提出された米国特許出願第１２／３４４，６０４号（その開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす）に開示されている。これらには、カチオン性窒素と、カルボン酸、リン酸又はスルホン酸に基づくアニオン性基とを含む親水性部分、例えばＮ，Ｎ−ジメチル−−３−スルホ−Ｎ−（３−プロピル）プロパン−１−アミニウム、３−（メチル）プロピル）アミノ）プロパン−１−スルホン酸、３−（プロピルアミノ）プロパン−１−スルホン酸、２−（エトキシ（ヒドロキシ）ホスホリルオキシ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルエタンアミニウム、２−エチル（ヒドロキシ）ホスホリルオキシ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルエタンアミニウム、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−３−（Ｎ−プロピオニルスルファモイル）プロパン−１−アミニウム、Ｎ−（（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）メチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−プロパン−１−アミニウム、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−プロパン−１−アミニウム、３−（メチルプロピル）アミノ）プロパン酸、３−（プロピルアミノ）プロパン酸、Ｎ−（カルボキシメチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−プロパン−１−アミニウム、２−（メチルアミノ）酢酸、２−（プロピルアミノ）酢酸、２−（４−プロピルカルバモイル）ピペラジン−１−イル）酢酸、３−（４−プロピルカルバモイル）ピペラジン−１−イル）プロパン酸、２−（メチル（２−プロピルウレイド）エチル）アミノ）酢酸及び２−（２−（プロピルウレイド）エチル）アミノ酢酸がある。
【００２６】
好適な親水性ポリエーテルに基づく親水性部分は、１９９９年６月２９日に発行された米国特許第５，９１６，５３９号（その開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす）に開示されている。これらには、アミノ及びヒドロキシルを含む各種の末端基を有する様々な分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）並びにポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）とのコポリマーがある。
【００２７】
コンジュゲートは、好ましくは、金属ベースのナノ粒子１モルに対してコンジュゲート２モルの比率でナノ粒子と反応させた場合、ナノ粒子が安定な水性懸濁液を形成し得るのに十分な親水性を有している。これに関して述べれば、ナノ粒子は通例は遷移金属化合物（例えば、酸化物）又は遷移金属自体に基づいている。反応比率は、元素態金属のモル数を用いて規定するのが好都合である。これは、有機溶媒中におけるナノ粒子の出発懸濁液の元素分析で容易に求めることができる。ナノ粒子の化学構成及び処理前の平均粒度を知れば、ナノ粒子当たりのコンジュゲートの量を概算で求めることができる。コンジュゲートは、この比率で処理された１５ｎｍ未満の酸化鉄又は酸化タンタルナノ粒子に、等容のｎ−オクタノール及び０．１Ｍ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）の間における分配係数の対数に関して１未満の値を示すのに十分な親水性を与えるに足るだけの親水性を有することが特に好都合である。
【００２８】
α−ヒドロキシホスホン酸コンジュゲートが付着した修飾親水性ナノ粒子は、接線流濾過及び室温で１週間の貯蔵後に１５０ｍＭ ＮａＣｌ水中での動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した場合に流体力学的直径（ＤH）の実質的変化を示さない安定な水性コロイド懸濁液を形成するのに十分な親水性を有することが特に有利である。
【００２９】
コンジュゲートで処理すべきナノ粒子は、コンジュゲートのα−ヒドロキシホスホン酸部分が付着する５００ｎｍ以下の粒子に形成できる任意の水不溶性材料からなり得る。ＭＲ又はＸ線イメージングにおける造影剤として有用であるナノ粒子を使用することが有利である。しかし、遺伝子のトランスフェクション用細胞培養物のインフュージョンのような他の最終用途のためのナノ粒子もまた有利である。
【００３０】
ＭＲＩ造影剤として使用するためには、ナノ粒子の基材は常磁性の金属又はその化合物とすべきであり、超常磁性のものが特に有利である。これらの金属は、マンガンで始まって亜鉛で終わる元素周期表のIII周期の遷移金属から得るのが好都合である。特に興味深い材料群は酸化鉄に基づくものである。特に好都合な材料は、ＳＰＩＯとして知られるものである。これらの材料は、一般式［Ｆｅ2+Ｏ3］x［Ｆｅ2+Ｏ3（Ｍ2+Ｏ）］1-x（式中、１≧ｘ≧０）を有している。Ｍ2+は、鉄、マンガン、ニッケル、コバルト、マグネシウム、銅、亜鉛又はこれらの組合せのような二価金属イオンであり得る。金属イオン（Ｍ2+）が第一鉄イオン（Ｆｅ2+）であって、ｘ＝０の場合、材料はマグネタイト（Ｆｅ3Ｏ4）であり、ｘ＝１の場合、材料はマグヘマイト（γ−Ｆｅ2Ｏ3）である。
【００３１】
一般に超常磁性は、不対スピンの結晶含有領域が磁区といわれる熱力学的に独立した単一ドメイン粒子と見なし得る程度に大きい場合に生じる。これらの磁区は、それの個々の不対電子の和より大きい正味の磁気双極子を示す。磁場が印加されていなければ、すべての磁区がランダムに配向していて正味の磁化はない。外部磁場の印加はすべての磁区の双極子モーメントを再配向させ、その結果として正味の磁気モーメントが生じる。若干の実施形態では、これらの材料は透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）分析で示されるようにスピネル型結晶構造を示す。
【００３２】
Ｘ線造影剤として使用するためには、ナノ粒子の基材は、生物において通例見出される物質より実質的に大きい放射線不透過性の金属又はその化合物とすべきである。約５０ｎＭの濃度の場合、３４以上の有効原子番号を有する材料を使用するのが好都合である。かかる材料は、特に有利な最小の増強である約３０ハウンスフィールド単位（ＨＵ）以上の適切なコントラスト増強を生み出す可能性がある。このような特性を与え得る遷移金属元素の例には、タングステン、タンタル、ハフニウム、ジルコニウム、モリブデン、銀及び亜鉛がある。酸化タンタルは、Ｘ線イメージング用途で使用するのに適したコア組成物の１つの具体例であ。特に有利なのは、約１００〜約５０００ハウンスフィールド単位の範囲内のＣＴ信号を生み出す材料である。
【００３３】
α−ヒドロキシホスホン酸が付着した修飾親水性ナノ粒子は、診断イメージングにおける造影剤として使用できる。かかる用途では、これらのナノ粒子は被験体（若干の実施形態では、哺乳動物被験体）に投与され、次いで被験体はイメージングに付される。これらのナノ粒子はＭＲ及びＸ線イメージングにおいて特別の有用性を有するが、超音波又は放射性トレーサーイメージングにおいても造影剤として有用である。
【００３４】
特に哺乳動物被験体、さらにはヒト被験体の診断イメージングで使用する場合、α−ヒドロキシホスホン酸が付着した修飾親水性ナノ粒子は、通例は１種以上の賦形剤を含んでも含まなくてもよい薬学的に許容されるキャリヤー中に取り込まれる。投与が注射（特に非経口注射）による場合には、キャリヤーは通例、約１５０ｍＭのＮａＣｌ、５％デキストロース又はこれらの組合せの添加によって等張性にした水性媒体である。それはまた、通例、約７．３〜７．４の生理的ｐＨを有する。投与は、脈管内（ＩＭ）、皮下（ＳＱ）又は最も一般には静脈内（ＩＶ）に行うことができる。しかし、投与はまた、被験体の血液又は組織にナノ粒子をゆっくりと放出するデポの移植によって行うこともできる。
【００３５】
別法として、投与は胃腸管のイメージングのため経口摂取によって行うこともでき、或いは肺及び気道のイメージングのため吸入によって行うこともできる。
【００３６】
ヒト被験体への投与、特にＩＶ投与では、α−ヒドロキシホスホン酸が付着した修飾親水性ナノ粒子は使用する量で無毒であり、細菌やウイルスのようないかなる感染因子も含まず、またいかなる発熱原も含まないことが要求される。したがって、これらのナノ粒子は所要の精製操作に対して安定であり、親水性の低下を受けないことが必要である。
【００３７】
これらのナノ粒子は、適切な重量オスモル濃度及びｐＨを有する安定な水性コロイド懸濁液として、希釈のために適した濃縮水性コロイド懸濁液として、或いは再構成のために適した粉末（例えば、凍結乾燥によって得られる粉末）として、投与の現場に送達し得る。
【００３８】
実施例１
ＰＥＧ−３５０コンジュゲートの合成
ＰＥＧ−３５０モノ（メチルエーテル）アセトアルデヒドの合成。ＣＨ2Ｃｌ2（９８ｍＬ）に溶解したＰＥＧ−３５０モノ（メチルエーテル）（３．４３８ｇ、９．８２ｍｍｏｌ）を含む溶液にＤｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎ Ｐｅｒｉｏｄｉｎａｎｅ（５．００ｇ、１１．７９ｍｍｏｌ）を添加し、得られた溶液を室温で２０時間撹拌した。反応中に微細な白色沈殿が生じたが、反応終了時にこれをセライトパッドでの濾過によって除去した。真空中で濾液から溶媒を除去したところ、黄色の油状物中に懸濁された白色の固体が残った。固体をジエチルエーテルでトリチュレートし、固体をセライトパッドでの濾過によって除去した。真空中で濾液から溶媒を除去したところ、生成物ＰＥＧ−３５０モノ（メチルエーテル）アセトアルデヒド（３．４２ｇ、１００％）が黄色の油状物として残った。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ ９．７３（ｔ，Ｊ＝４Ｈｚ，１Ｈ），４．１６（ｄ，Ｊ＝４Ｈｚ，２Ｈ），７．６５（ｍ，２４Ｈ），３．３８（ｓ，３Ｈ）ｐｐｍ。ＩＲ（ｎｅａｔ）２８７３，１７３２，１４５５，１３５０，１１０９，１０４０，９４８，８５１，７４９ｃｍ-1。
【００３９】
ジエチルα−ヒドロキシＰＥＧ−３５０モノ（メチルエーテル）ホスホネートの合成。テトラヒドロフラン（５３ｍＬ）に溶解したＰＥＧ−３５０モノ（メチルエーテル）アセトアルデヒド（３．７１ｇ、１０．７ｍｍｏｌ）を含む溶液にジエチルホスフィット（１．７７ｇ、１２．８ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を０℃に冷却し、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデセ−７−エン（１．９４ｇ、１２．８ｍｍｏｌ）を添加した。０℃で１０分間撹拌した後、ｒｘｎを室温に加温し、さらに２４時間撹拌した。真空中で溶媒を除去し、残った暗黄色の油状物をカラムクロマトグラフィー（１００％ＣＨ2Ｃｌ2〜１５％ＭｅＯＨ／８５％ＣＨ2Ｃｌ2）によって精製することで、３．３０ｇ（６４％）の所望生成物ジエチルα−ヒドロキシＰＥＧ−３５０モノ（メチルエーテル）ホスホネートを黄色の油状物として得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ ４．１９（ｍ，６Ｈ），３．６５（ｍ，２４Ｈ），３．３８（ｓ，３Ｈ），１．３４（ｍ，６Ｈ）ｐｐｍ。31Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ ２３．１ｐｐｍ。ＩＲ（ｎｅａｔ）３３４３，２８７２，１７２５，１４５３，１２４８，１１０５，９６５，８５０，７９１ｃｍ-1。
【００４０】
α−ヒドロキシＰＥＧ−３５０モノ（メチルエーテル）ホスホン酸の合成。塩化メチレン（７４ｍＬ）に溶解したジエチルα−ヒドロキシＰＥＧ−３５０モノ（メチルエーテル）ホスホネート（３．６１ｇ、７．４３ｍｍｏｌ）を含む溶液にトリメチルシリルブロミド（３．４１ｇ、２２．３ｍｍｏｌ）を添加し、得られた溶液を室温で２時間撹拌した。真空中で溶媒を除去したところ、褐色の油状物が残った。得られた油状物をアセトン（７４ｍＬ）及び水（０．５ｍＬ）に溶解し、得られた溶液を室温で１．５時間撹拌した。次いで、真空中で溶媒を除去したところ、所望生成物α−ヒドロキシＰＥＧ−３５０モノ（メチルエーテル）ホスホン酸（２．６６ｇ、８４％）が金色の油状物として残った。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ ３．６５（ｍ，２４Ｈ），３．３８（ｓ，３Ｈ）。31Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ ２４．０ｐｐｍ。ＩＲ（ｎｅａｔ）３４６０，２８７０，１７２７，１４５６，１３５１，９４５，８４９ｃｍ-1。
【００４１】
実施例２
ＰＥＧ−１９００コンジュゲートの合成
ＰＥＧ−１９００モノ（メチルエーテル）アセトアルデヒドの合成。ＣＨ2Ｃｌ2（８６ｍＬ）に溶解したＰＥＧ−１９００モノ（メチルエーテル）（１６．３２ｇ、８．６０ｍｍｏｌ）を含む溶液にＤｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎ Ｐｅｒｉｏｄｉｎａｎｅ（４．００ｇ、９．４４ｍｍｏｌ）を添加し、得られた溶液を室温で２０時間撹拌した。反応中に微細な白色沈殿が生じたが、反応終了時にこれをセライトパッドでの濾過によって除去した。真空中で濾液から溶媒を除去したところ、白色の固体が残った。これをＴＨＦ／ヘキサンから再結晶することで、所望生成物（１１．６ｇ、７１％）を白色の固体として得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ ９．７４（ｔ，Ｊ＝１Ｈｚ，１Ｈ），４．１７（ｄ，Ｊ＝１Ｈｚ，２Ｈ），３．８３（ｍ，２Ｈ），３．６５（ｍ，１７０Ｈ），３．３９（ｓ，３Ｈ）。
【００４２】
ジエチルα−ヒドロキシＰＥＧ−１９００モノ（メチルエーテル）ホスホネートの合成。テトラヒドロフラン（５７ｍＬ）に溶解したＰＥＧ−１９００モノ（メチルエーテル）アセトアルデヒド（１０．７４ｇ、５．６６ｍｍｏｌ）を含む溶液に、ジエチルホスフィット（０．９３８ｇ、６．７９ｍｍｏｌ）を添加し、次いで１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデセ−７−エン（１．０３ｇ、６．７９ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で７２時間撹拌した。真空中で溶媒を除去し、残った橙黄色の固体をＴＨＦ／ヘキサンから再結晶することで、所望生成物（１１．０８ｇ、９６％）をオフホワイトの固体として得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ ４．１８（ｍ，４Ｈ），３．６４（ｍ，１７２Ｈ），３．３８（ｓ，３Ｈ）。
【００４３】
α−ヒドロキシＰＥＧ−３５０モノ（メチルエーテル）ホスホン酸の合成。塩化メチレン（５４ｍＬ）に溶解したジエチルα−ヒドロキシＰＥＧ−１９００モノ（メチルエーテル）ホスホネート（１１．０８ｇ、５．４４ｍｍｏｌ）を含む溶液にトリメチルシリルブロミド（２．４９ｇ、１６．３ｍｍｏｌ）を添加し、得られた溶液を室温で３時間撹拌した。真空中で溶媒を除去したところ、褐色の油状物が残った。得られた油状物をアセトン（５４ｍＬ）及び水（０．５ｍＬ）に溶解し、得られた溶液を室温で１６時間撹拌した。次いで、真空中で溶媒を除去し、残った橙色の固体をＴＨＦ／ヘキサンから再結晶することで、所望生成物（１０．７７ｇ、８６％）をオフホワイトの固体として得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ ４．１２（ｍ，２Ｈ），３．６５（ｍ，１７０Ｈ），３．３８（ｓ，３Ｈ）。
【００４４】
比較例１
親水性ホスフェートの合成
ジフェニルＰＥＧ−３５０モノ（メチルエーテル）ホスフェートの合成。ＣＨ2Ｃｌ2（８０ｍＬ）に溶解したＰＥＧ−３５０モノ（メチルエーテル）（８．５４ｇ、２４．４ｍｍｏｌ）を含む溶液に、トリエチルアミン（３．６８ｇ、３６．６ｍｍｏｌ）を添加し、次いで４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（０．２９８ｇ、２．４４ｍｍｏｌ）を添加した。得られた溶液を０℃に冷却し、ジフェニルクロロホスフェート（７．８７ｇ、２９．３ｍｍｏｌ）を滴下し、反応物を０℃で１０分間撹拌した。次いで、反応物を室温に加温し、さらに１６時間撹拌した。反応物を１０％ＨＣｌ（８０ｍＬ）の添加で奪活し、得られた層を分離した。有機層を水（８０ｍＬ）及びブライン（８０ｍＬ）で洗浄し、無水物ＭｇＳＯ4上で乾燥した。濾過し、真空中で溶媒を除去したところ、所望生成物（１４．２ｇ、１００％）が金色の油状物として残った。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ ７．３４（ｍ，４Ｈ），７．２２（ｍ，６Ｈ），４．３８（ｍ，２Ｈ），３．７３（ｍ，２Ｈ），３．６４（ｍ，２４Ｈ），３．５４（ｍ，２Ｈ），３．３８（ｓ，３Ｈ）。
【００４５】
ＰＥＧ−３５０モノ（メチルエーテル）リン酸の合成。酢酸（１０８ｍＬ）に溶解したジフェニルＰＥＧ−３５０モノ（メチルエーテル）ホスフェート（１４．２ｇ、２４．４ｍｍｏｌ）を含む溶液に酸化白金（IV）水和物（２００ｍｇ）を添加し、得られた懸濁液を５０℃に加熱し、水素の取込みが止むまでＨ2雰囲気下に置いた。反応物をセライトパッドで濾過して触媒を除去し、真空中で溶媒を除去したところ、所望生成物（１０．４９ｇ、１００％）が透明な黄色油状物として残った。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ ４．２０（ｍ，２Ｈ），３．６７（ｍ，２４Ｈ），３．５６（ｍ，２Ｈ），３．３９（ｓ，３Ｈ）。
【００４６】
実施例３
超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）ナノ粒子の合成。１００ｍＬ三つ口丸底フラスコにＦｅ（ａｃａｃ）3（０．７０６ｇ、２．０ｍｍｏｌ）及び無水ベンジルアルコール（２０ｍＬ）を仕込んだ。得られた溶液を窒素でスパージし、窒素雰囲気下において１６５℃で４時間加熱した。次いで、得られた（ＤＬＳで測定して）５ｎｍ酸化鉄粒子のコロイド懸濁液を室温に冷却し、その温度で貯蔵した。
【００４７】
実施例４
α−ヒドロキシＰＥＧ−３５０モノ（メチルエーテル）ホスホネートでコートした超常磁性酸化鉄ナノ粒子の合成。実施例３の超常磁性酸化鉄ナノ粒子をＴＨＦ中に懸濁した１ｍｇ Ｆｅ／ｍＬのコロイド懸濁液に、（Ｆｅ １モル当たりコンジュゲート１モルの比率で）実施例１のα−ヒドロキシホスホン酸コンジュゲートを添加し、得られた懸濁液を５０℃で１６時間加熱した。次いで、反応物を室温に冷却し、水で希釈し、褐色の水溶液をヘキサで３回洗浄した。水性層中に残留する揮発分を真空中で除去し、得られたナノ粒子を、接線流濾過を使用しながら３０ｋＤａ分子カットオフフィルターに対してＨ2Ｏで洗浄することで精製した。
【００４８】
実施例５
α−ヒドロキシＰＥＧ−１９００モノ（メチルエーテル）ホスホネートでコートした超常磁性酸化鉄ナノ粒子の合成。実施例１のコンジュゲートの代わりに実施例２のコンジュゲートを用いて実施例４を繰り返した。
【００４９】
比較例２
α−ヒドロキシＰＥＧ−３５０モノ（メチルエーテル）ホスフェートでコートした超常磁性酸化鉄ナノ粒子の合成。比較例１のコンジュゲートを用いて実施例４を繰り返した。
【００５０】
実施例６
５−ブロモ−１−ペンタナールの合成。２５０ｍＬ丸底フラスコ内で、塩化オキサリル（２．４２ｍＬ、０．０２２ｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（４０ｍＬ）と混合した。フラスコを窒素でブランケットし、溶液をドライアイス／アセトン浴中で−７８℃に冷却した。反応混合物を撹拌し、無水ジメチルスルホキシド（３．４ｍＬ、０．０４４ｍｏｌ）をフラスコにゆっくりと添加し、次いで５−ブロモ−１−ペンタノール（３．３４ｇ、０．０２０ｍｏｌ）を添加し、反応混合物を−７８℃で１５分間撹拌した。トリエチルアミン（１４．０ｍＬ、０．１ｍｏｌ）を反応混合物にゆっくりと添加した。トリエチルアミンの添加が完了した後、反応物を−７８℃で５分間撹拌した。反応物をドライアイス／アセトン浴から取り出し、室温に加温し、室温で１８時間撹拌した。
【００５１】
水（１００ｍＬ）を反応混合物に添加した。二相混合物を５００ｍＬ分液漏斗内で激しく振盪した。水性層を除去し、ジクロロメタン（１００ｍＬ）で抽出した。このジクロロメタンを反応混合物からのジクロロメタンと合わせた。合わせたジクロロメタン溶液を各１００ｍＬの１％ＨＣｌ(aq)、水、飽和ＮａＨＣＯ3(aq)及び飽和ＮａＣｌ(aq)で順次に洗浄した。ジクロロメタン溶液を硫酸マグネシウムで乾燥し、ジクロロメタン溶液を濾過によって回収した。真空下で溶媒を除去したところ、黄色の液体（１．８０ｇ）が残った。主生成物は５−ブロモ−１−ペンタナールであることが1Ｈ ＮＭＲによって確認された。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ ９．８１（ｍ，１Ｈ），３．４３（ｍ，３Ｈ），２．５０（ｍ，２Ｈ），２．０−１．４（ｍ，８Ｈ）。それ以上の精製なしに反応生成物を実施例７に供した。
【００５２】
実施例７
ジエチル（５−ブロモ−１−ヒドロキシ−ペンチル）ホスホネートの合成。２５０ｍＬ丸底フラスコ内で、５−ブロモペンタナール（１．６４ｇ、０．０１０ｍｏｌ）をジエチルエーテル（１５ｍＬ）に溶解した。反応物を窒素でブランケットした。過塩素酸リチウム（７．９２ｇ、０．０７５ｍｏｌ）を反応物に添加し、反応溶液を氷浴中で０℃に冷却した。クロロトリメチルシラン（０．６３１ｍＬ、０．０１０ｍｏｌ）をフラスコに添加し、次いでトリメチルホスフィット（２．１ｍＬ、０．０１２ｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で１８時間撹拌した。
【００５３】
室温で１８時間後、水（４０ｍＬ）を反応物に添加し、次いでジクロロメタン（４０ｍＬ）を添加した。有機層を分液漏斗に移し、水（４０ｍＬ）及びブライン（４０ｍＬ）で順次に洗浄した。塩化メチレン溶液を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過して塩化メチレン溶液を回収した。真空下で溶媒を除去したところ、黄色の油状物（３．０１ｇ）が残った。油状物を1Ｈ ＮＭＲ及び31Ｐ ＮＭＲによって特性決定し、主生成物はジエチル（５−ブロモ−１−ヒドロキシ−ペンチル）ホスホネートであることが確認された。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ ４．２５−４．００（ｍ，４Ｈ），３．００−３．４３（ｍ，２Ｈ），１．７８−１．９５（ｍ，２Ｈ），１．７８−１．６１（ｍ，３Ｈ），１．６１−１．４１（ｍ，２Ｈ），１．４０−１．２５（ｍ，６Ｈ）。31Ｐ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ ２６．５（ｓ，１Ｐ），２４．２−２４．７（ｍ，０．３Ｐ）。それ以上の精製なしに反応生成物を実施例８に供した。
【００５４】
実施例８
ジエチル５−（４−（エトキシカルボニル）ピペリジン−１−イル）−１−ヒドロキシペンチルホスホネートの合成。３００ｍＬ丸底フラスコ内で、ジエチル（５−ブロモ−１−ヒドロキシ−ペンチル）ホスホネート（３．０２ｇ、０．００９９ｍｏｌ）を無水トルエン（１００ｍＬ）に溶解した。トリエチルアミン（２．０８ｍＬ、０．０１５ｍｏｌ）を反応混合物に添加し、次いでエチルイソニペコテート（１．８４ｍＬ、０．０１２ｍｏｌ）を添加した。混合物を１８時間加熱還流した。真空下で溶媒を除去したところ、橙色のガムが残った。ガムをジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶解し、飽和ＮａＨＣＯ3水溶液（１００ｍＬ）及びブライン（１００ｍＬ）で順次に洗浄した。塩化メチレン溶液を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過によって回収した。真空下で溶媒を除去したところ、橙色の液体（１．７０ｇ）が残った。
【００５５】
橙色の液体をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製した。シリカゲルカラム（４０ｇ）を、１００％ジクロロメタンで開始し、３０分かけてジクロロメタン中２０体積％メタノールまで変化する溶媒勾配を用いて溶出した。生成物を含む画分を合わせ、真空下で溶媒を除去したところ、黄色の液体（０．６６ｇ）が残った。黄色の液体を1Ｈ ＮＭＲによって特性決定し、主生成物はジエチル５−（４−（エトキシカルボニル）ピペリジン−１−イル）−１−ヒドロキシペンチルホスホネートであることが確認された。1Ｈ ＮＭＲ（４００ｍＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ ４．９−４．５（ｓ，１Ｈ），４．２−４（ｍ，５Ｈ），３．８−３．７（ｍ，１Ｈ），２．９−２．７（ｍ，２Ｈ），２．４−２．１（ｍ，３Ｈ），２．１−１．９（ｍ，２Ｈ），１．９−１．８（ｍ，２Ｈ），１．８−１．３（ｍ，８Ｈ），１．３−１．２（ｍ，５Ｈ），１．２−１．１（ｍ，３Ｈ）。それ以上の精製なしに反応生成物を実施例９に供した。
【００５６】
実施例９
５−（４−（エトキシカルボニル）ピペリジン−１−イル）−１−ヒドロキシペンチルホスホン酸の合成。１００ｍＬフラスコ内で、ジエチル５−（４−（エトキシカルボニル）ピペリジン−１−イル）−１−ヒドロキシペンチルホスホネート（０．６６ｇ、０．００１７ｍｏｌ）をジクロロメタン（２５ｍＬ）に溶解した。ブロモトリメチルシラン（０．６９ｍＬ、０．００５２ｍｏｌ）を反応混合物に添加した。反応物を室温で一晩撹拌した。一晩の撹拌後、真空下で溶媒を除去したところ、橙色のガムが残った。ガムをアセトン（２０ｍＬ）に溶解した。水（０．４ｍＬ）を添加した。ガムが沈殿した。真空下で溶媒を除去したところ、赤色のガム（０．６ｇ）が残った。ガムを1Ｈ ＮＭＲによって特性決定し、生成物は５−（４−（エトキシカルボニル）ピペリジン−１−イル）−１−ヒドロキシペンチルホスホン酸であることが確認された。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ3ＯＤ）δ ４．３−４．１（ｍ，２Ｈ），３．９−３．４（ｍ，３Ｈ），３．４−２．５（ｍ，７Ｈ），２．５−１．３５（ｍ，１１Ｈ），１．３５−１．２（ｍ，３Ｈ）。
【００５７】
実施例１０
５−（４−（エトキシカルボニル）ピペリジン−１−イル）−１−ヒドロキシペンチルホスホネートでコートした酸化タンタルナノ粒子の合成。イソ酪酸（０．２４２ｇ、２．７５ｍｍｏｌ）及び水（０．０８ｇ、４．４４ｍｍｏｌ）を含む無水メタノール（１７ｍＬ）の溶液を、Ｎ2でスパージすることで４０分間ガス抜きした。これにＴａ2（ＯＥｔ）2（１ｇ、２．４６ｍｍｏｌ）を滴下し、反応混合物をＮ2雰囲気下で５時間撹拌することで、３〜４ｎｍナノ粒子の懸濁液を得た。５−（４−（エトキシカルボニル）ピペリジン−１−イル）−１−ヒドロキシペンチルホスホン酸（０．０８８ｇ、０．２０５ｍｍｏｌ）をメタノール（０．５ｍＬ）に溶解した溶液を酸化タンタルナノ粒子懸濁液（１ｍＬ）に滴下し、Ｎ2下において７０℃で一晩加熱した。室温に冷却した後、水（約３ｍＬ）を反応混合物に滴下した。ロータリーエバポレーター上においてメタノールを減圧下で蒸発させて除去した後、１Ｍ ＮＨ4ＯＨ（０．３３ｍＬ）を添加し、反応物を５０℃で一晩撹拌した。３５００Ｄａ分子量カットオフ再生セルロース膜を用いて、反応混合物を水（３×２Ｌ）に対して２４時間透析した。ＤＬＳによれば、粒度は水中で７ｎｍであると確認された。
【００５８】
実施例１１
ＳＰＩＯナノ粒子のコロイド懸濁液の特性決定。実施例４及び実施例５並びに比較例２において接線流濾過の結果として得られたコロイド懸濁液を、安定性及びゼータ電位に関して評価した。
【００５９】
１５０ｍＭ ＮａＣｌ水溶液を懸濁媒体として使用しながら、動的光散乱（ＤＬＳ）によって流体力学的直径（ＤH）を測定した。接線流濾過で精製したＳＰＩＯ懸濁液を１５０ｍＭ ＮａＣｌ水溶液で希釈し、１００ｎｍフィルターに通してダストを除去した後、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ ＺｅｔａＰＡＬＳを用いてＤＬＳ分析を行った。希釈は、ＤＬＳ測定中に最小で毎秒２００００カウントを与えるように実施した。測定は、修飾ナノ粒子を製造した直後及び室温で２週間貯蔵した後に行った。貯蔵後におけるＤHの顕著な増大は、ナノ粒子が凝集し、したがってそのコロイド懸濁液が安定でないことを表していた。
【００６０】
接線流濾過で精製したＳＰＩＯ懸濁液を１０ｍＭ ＮａＣｌで１４×に希釈し、希釈したＳＰＩＯ溶液を１００ｎｍフィルターに通してダストを除去した後、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ ＺｅｔａＰＡＬＳを用いてゼータ電位を測定した。３種のコロイド懸濁液のすべてに関し、ゼータ電位は一般に中性として認められている±１５ｍＶの範囲内にあった。
【００６１】
結果を表１に示す。
【００６２】
【表１】
実施例１２
ＭＲＩによるインビボ腫瘍のイメージング。動物に関係するすべての手続きは、ＧＥ Ｇｌｏｂａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認されたプロトコルの下で完了した。雌のＦｉｓｃｈｅｒ ３４４ラット（約１５０ｇ）において、０．１ｍＬのハンクス平衡塩類溶液中の２×１０6 Ｍａｔ Ｂ III細胞（ＡＴＣＣ＃ ＣＲＬ１６６６、ＡＴＣＣ（マナサス、米国ヴァージニア州））を皮下注射することで腫瘍を誘導した。注射部位は肩胛骨の間の背中に位置していた。移植から９日後、腫瘍が直径約１ｃｍになった時に腫瘍のイメージングを行った。
【００６３】
イメージングは、注文製造の約６ｃｍソレノイド受信ＲＦコイルを用いて臨床用の３Ｔ ＧＥ ＭＲ７５０スキャナー上で行った。イメージングの準備のため、それぞれ７５ｍｇ／ｋｇ及び５ｍｇ／ｋｇの用量でケタミン及びジアゼパムをＩＰ注射することで麻酔した。固定後、２４ゲージのカテーテルをを側尾静脈内に配置し、食塩水でプライムしたマイクロボアカテーテルライン延長部及びストップコックに連結した。カテーテル、ライン及びストップコックの死容積は約０．５ｍＬであった。次いで、前処理した動物をＲＦコイル内に配置し、スキャナーのボア内で位置決めした。注射前画像セットを取得し、次いでテーブル又は動物を移動させることなしにＰＥＧ−３５０ α−ヒドロキシホスホネートでコートした超常磁性酸化鉄ナノ粒子をストップコック経由で注射し、次いで食塩水（約０．８ｍＬ）でフラッシュした。注射の直後に（注射後約３０秒から始めて）、約３０分の動的取得時間を通じて画像セットを収集し、約１６のポストコントラスト時点の収集が得られた。注射に関しては、ＳＰＩＯ造影剤を１０ｍｇ Ｆｅ／ｍＬの濃度で生理食塩水中に懸濁し、注射前に滅菌濾過し、内毒素の存在について試験した。造影剤は３ｍｇ Ｆｅ／ｋｇ体重の用量で投与した。
【００６４】
１０のエコー時間での画像収集を可能にする３Ｄ高速勾配エコーパルスシーケンスを使用した。グラフィカルプレスクリプションインターフェースにより、腫瘍がトランスアキシャルスライス内で中央に位置しかつカバー範囲が深さ方向で腫瘍の大部分を含むようにイメージングスラブを位置決めした。バルスシーケンスパラメーターは次の通りであった。パルスシーケンス：３Ｄ ＭＥ ｆＧＲＥ、ＴＥ：４．１〜６８の範囲にわたり、スペーシングは７．１ｍｓ、ＴＲ：７５．５ｍｓ、フリップ角：２５度、帯域幅：６２．５ＭＨｚ、マトリクス：２５６×２５６、スライス厚さ：０．９ｍｍ、視野：８ｃｍであって、０．３１×０．３１×０．９のボクセル寸法を生じる。シーケンス取得時間は約２分であった。
【００６５】
ＩＤＬプラットホーム（ＩＤＬ ｖ．６．３、ＩＴＴ Ｃｏｒｐ．（ボールダー、米国コロラド州））上に構築されたカスタムソフトウェアツール（ＣｉｎｅＴｏｏｌ ｖ８．０．２、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いてイメージングデータセットを解析した。簡単に述べれば、かかる画像解析ツールは、注射前系列上に３Ｄ検査対象領域（ＲＯＩ）を手動描画し、続いてすべての時点で描画されたＲＯＩ内のあらゆるボクセルに関する指数回帰を行ってＴ2*時間定数を計算することを可能にした。代表的な画像及び差マップを図６に示す。
【００６６】
以上、本明細書中には本発明の若干の特徴のみを例示し説明してきたが、当業者には数多くの修正及び変更が想起されるであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は本発明の真の技術思想に含まれるこのような修正及び変更のすべてを包含することを理解すべきである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１以上のα−ヒドロキシホスホネート部分が付着した水不溶性ナノ粒子を含む組成物。
【請求項２】
１以上のα−ヒドロキシホスホネート部分が次の式を有する、請求項１記載の組成物。
【化１】
式中、Ｓはスペーサーであり、ＬはＳとＲとの間の結合であり、Ｒは親水性部分であり、ｍ及びｐは１〜５であり、ｎ及びｏは０〜５である。
【請求項３】
α−ヒドロキシホスホネートが
【化２】
及び
【化３】
からなる群から選択される、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
哺乳動物被験体への注射に適した診断剤組成物であって、
次の式を有するα−ヒドロキシホスホネート部分が付着した水不溶性ナノ粒子、及び
薬学的に許容されるキャリヤー又は賦形剤
を含む診断剤組成物。
【化４】
式中、Ｓはスペーサーであり、ＬはＳとＲとの間の結合であり、Ｒは親水性部分であり、ｍ及びｐは１〜５であり、ｎ及びｏは０〜５である。
【請求項５】
ヒト被験体への注射に適している、請求項４記載の診断剤組成物。
【請求項６】
α−ヒドロキシホスホネートが
【化５】
及び
【化６】
からなる群から選択される、請求項４記載の診断剤組成物。
【請求項７】
α−ヒドロキシホスホネート部分が付着した水不溶性ナノ粒子を診断イメージングで利用する方法であって、
ａ．前記ナノ粒子を被験体に投与する段階、及び
ｂ．前記ナノ粒子が造影剤として作用する診断イメージングに前記被験体を付す段階
を含む方法。
【請求項８】
α−ヒドロキシホスホネート部分が次の式を有する、請求項７記載の方法。
【化７】
式中、Ｓはスペーサーであり、ＬはＳとＲとの間の結合であり、Ｒは親水性部分であり、ｍ及びｐは１〜５であり、ｎ及びｏは０〜５である。
【請求項９】
α−ヒドロキシホスホネート部分が付着した水不溶性ナノ粒子の製造方法であって、
ａ．懸濁剤中におけるナノ粒子の懸濁液を用意する段階、及び
ｂ．前記懸濁液を前記α−ヒドロキシホスホネート部分に接触させる段階
を含む方法。
【請求項１０】
α−ヒドロキシホスホネート部分が次の式を有する、請求項９記載の方法。
【化８】
式中、Ｓはスペーサーであり、ＬはＳとＲとの間の結合であり、Ｒは親水性部分であり、ｍ及びｐは１〜５であり、ｎ及びｏは０〜５である。
【請求項１】
１以上のα−ヒドロキシホスホネート部分が付着した水不溶性ナノ粒子を含む組成物。
【請求項２】
１以上のα−ヒドロキシホスホネート部分が次の式を有する、請求項１記載の組成物。
【化１】
式中、Ｓはスペーサーであり、ＬはＳとＲとの間の結合であり、Ｒは親水性部分であり、ｍ及びｐは１〜５であり、ｎ及びｏは０〜５である。
【請求項３】
α−ヒドロキシホスホネートが
【化２】
及び
【化３】
からなる群から選択される、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
哺乳動物被験体への注射に適した診断剤組成物であって、
次の式を有するα−ヒドロキシホスホネート部分が付着した水不溶性ナノ粒子、及び
薬学的に許容されるキャリヤー又は賦形剤
を含む診断剤組成物。
【化４】
式中、Ｓはスペーサーであり、ＬはＳとＲとの間の結合であり、Ｒは親水性部分であり、ｍ及びｐは１〜５であり、ｎ及びｏは０〜５である。
【請求項５】
ヒト被験体への注射に適している、請求項４記載の診断剤組成物。
【請求項６】
α−ヒドロキシホスホネートが
【化５】
及び
【化６】
からなる群から選択される、請求項４記載の診断剤組成物。
【請求項７】
α−ヒドロキシホスホネート部分が付着した水不溶性ナノ粒子を診断イメージングで利用する方法であって、
ａ．前記ナノ粒子を被験体に投与する段階、及び
ｂ．前記ナノ粒子が造影剤として作用する診断イメージングに前記被験体を付す段階
を含む方法。
【請求項８】
α−ヒドロキシホスホネート部分が次の式を有する、請求項７記載の方法。
【化７】
式中、Ｓはスペーサーであり、ＬはＳとＲとの間の結合であり、Ｒは親水性部分であり、ｍ及びｐは１〜５であり、ｎ及びｏは０〜５である。
【請求項９】
α−ヒドロキシホスホネート部分が付着した水不溶性ナノ粒子の製造方法であって、
ａ．懸濁剤中におけるナノ粒子の懸濁液を用意する段階、及び
ｂ．前記懸濁液を前記α−ヒドロキシホスホネート部分に接触させる段階
を含む方法。
【請求項１０】
α−ヒドロキシホスホネート部分が次の式を有する、請求項９記載の方法。
【化８】
式中、Ｓはスペーサーであり、ＬはＳとＲとの間の結合であり、Ｒは親水性部分であり、ｍ及びｐは１〜５であり、ｎ及びｏは０〜５である。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図６Ｅ】
【図６Ｆ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図６Ｅ】
【図６Ｆ】
【公表番号】特表２０１３−５０９３８１（Ｐ２０１３−５０９３８１Ａ）
【公表日】平成２５年３月１４日（２０１３．３．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５３５８４０（Ｐ２０１２−５３５８４０）
【出願日】平成２２年１０月２９日（２０１０．１０．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６６４２９
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０５１４２２
【国際公開日】平成２３年５月５日（２０１１．５．５）
【出願人】（３９００４１５４２）ゼネラル・エレクトリック・カンパニイ (6,332)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年３月１４日（２０１３．３．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１０月２９日（２０１０．１０．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６６４２９
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０５１４２２
【国際公開日】平成２３年５月５日（２０１１．５．５）
【出願人】（３９００４１５４２）ゼネラル・エレクトリック・カンパニイ (6,332)
【Ｆターム（参考）】
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