観察装置、観察方法、及び培養物の製造方法
【課題】培養容器の中から培地ドロップの領域を精度よく識別可能な観察方法を提供する。
【解決手段】内部に培養物の培養に用いられる培地ドロップを有した培養容器を複数の照明方向から照明し（ステップＳ１）、このように照明した培養容器を複数の照明方向についてそれぞれ撮像し（ステップＳ２）、このように撮像した複数の照明方向についての培養容器の画像を重ね合わせて培養容器の合成画像を生成し（ステップＳ５）、このように生成した合成画像から培養容器中における培地ドロップの領域を識別する（ステップＳ６）。
【解決手段】内部に培養物の培養に用いられる培地ドロップを有した培養容器を複数の照明方向から照明し（ステップＳ１）、このように照明した培養容器を複数の照明方向についてそれぞれ撮像し（ステップＳ２）、このように撮像した複数の照明方向についての培養容器の画像を重ね合わせて培養容器の合成画像を生成し（ステップＳ５）、このように生成した合成画像から培養容器中における培地ドロップの領域を識別する（ステップＳ６）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養容器の中から培養物の培養に用いられる培地の領域を検出するための観察装置及び観察方法に関し、さらに、このような観察装置及び観察方法を利用した培養物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生殖補助医療技術（ＡＲＴ）の発展に伴い、体外受精による受精卵を培養しながらその生育状態を観察することが行われている。受精卵などの培養物の状況を観察する装置の例として、培養顕微鏡が挙げられる（例えば、特許文献１を参照）。培養顕微鏡は、受精卵の培養に好適な環境を形成する培養装置（インベキュータ）と、培養装置に収容された培養容器内の受精卵の状態を顕微観察する顕微観察系とを備え、予め設定された一定時間ごとに受精卵の観察画像を取得し、ユーザが受精卵を目視により認識した上で、受精卵の生育状態の観察、記録、管理等を自動で行うことができるように構成される。
【０００３】
このような装置において、培養容器中の受精卵の成育状態を観察する場合、始めに観察対象の受精卵を検出しなければならないが、その検出手順としては大略的に、培養容器全体を撮影してこの全体観察画像に基づいて培養容器内からミネラルオイルに浸された培地（培地ドロップ）を検出した後で、この培地ドロップ内で観察視野位置を変えつつ培地ドロップの顕微観察画像を複数取得し、この顕微観察画像を基に培地ドロップ内に１つ（または複数個）ずつ注入された観察対象の受精卵を他の異物と判別して検出する、という流れになっている。このように受精卵を認識するためには一般に高倍視野での顕微観察が必要であるところ、観察倍率が高くなるにつれて観察視野（観察範囲）が狭くなってくるため、顕微観察のみでは広い観察範囲に対して多数の顕微観察画像を撮影する必要がある。そのため、前述のように顕微観察による受精卵の検出に先立って、マクロ観察により培地ドロップの領域を事前に検出できれば、その後に顕微観察において観察画像を取得する領域も自ずと限定され、観察時間全体を短縮化することが可能になる。
【０００４】
受精卵の自動観察では、培地ドロップの探査領域を限定するための方法として、探査領域を機械的に指定する方法と、培養環境のチェックのために加えられているフェノールの着色により、培地ドロップ領域を色分離する方法がある。ところが、探査領域を機械的に指定する方法では、ユーザが手動で培地ドロップをディッシュ内に作り込むため、初期の探査領域をほぼディッシュ全面に指定して探査を行うしかなく、領域限定の効果が得られない。また、色分離する方法では、効率良く探査領域を限定できるものの、着色後の色の濃さは環境によって未知であり、ユーザによっては、フェノールなしで観察等を行うこともある。また、ディッシュの上面あるいは下面にペンで書き込みを行うユーザも少なくなく、色分離による抽出では、色の濃さや書き込みの有無によって、培地ドロップ領域の検出精度が変化してしまう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−２２９６１９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、広い観察視野での観察画像から、色情報に依らずに、培地ドロップ領域を抽出するための方策が望まれている。
【０００７】
本発明は、このような問題に鑑みてなされたものであり、培養容器の中から培地の領域を精度よく識別可能な観察装置、観察方法、及び培養物の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
このような目的達成のため、本発明を例示する態様に従えば、内部に培養物の培養に用いられる培地を有した培養容器を複数の照明方向から照明可能な照明部と、前記照明部に照明された前記培養容器を前記複数の照明方向についてそれぞれ撮像する撮像部と、前記撮像部にそれぞれ撮像された前記複数の照明方向についての前記培養容器の画像を重ね合わせて前記培養容器の合成画像を生成する画像合成部と、前記画像合成部に生成された前記合成画像から前記培養容器中における前記培地を識別する画像解析部とを備えて構成されることを特徴とする培養物の観察装置が提供される。
【０００９】
また、本発明を例示する態様に従えば、内部に培養物の培養に用いられる培地を有した培養容器を複数の照明方向から照明し、前記照明された前記培養容器を前記複数の照明方向についてそれぞれ撮像し、前記撮像された前記複数の照明方向についての前記培養容器の画像を重ね合わせて前記培養容器の合成画像を生成し、前記生成された前記合成画像から前記培養容器中における前記培地を識別することを特徴とする培養物の観察方法が提供される。
【００１０】
また、本発明を例示する態様に従えば、所定の環境条件で培養物を培養し、内部に前記培養物が培養される培地を有した培養容器中から、本発明に係る観察装置を用いて前記培地を識別することを特徴とする培養物の製造方法が提供される。
【００１１】
また、本発明を例示する態様に従えば、所定の環境条件で培養物を培養し、内部に前記培養物が培養される培地を有した培養容器を複数の照明方向から照明し、前記照明された前記培養容器を前記複数の照明方向についてそれぞれ撮像し、前記撮像された前記複数の照明方向についての前記培養容器の画像を重ね合わせて前記培養容器の合成画像を生成し、前記生成された前記合成画像から前記培養容器中における前記培地を識別することを特徴とする培養物の製造方法が提供される。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、培養容器の中から培地の領域を精度よく識別することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】観察方法の概要を示すフローチャートである。
【図２】本発明の適用例として示す培養観察システムの概要構成図である。
【図３】上記培養観察システムのブロック図である。
【図４】（Ａ）は培養容器の平面図であり、（Ｂ）はディッシュを示す斜視図である。
【図５】第１照明部の概要構成図である。
【図６】合成画像を生成する過程を示す模式図である。
【図７】画像処理装置の概要構成を示すブロック図である。
【図８】受精卵の製造方法の概要を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、図面を参照して本発明の好ましい実施形態について説明する。本実施形態に係る観察装置を適用したシステムの一例として、培養観察システムの概要構成図及びブロック図を、それぞれ図２及び図３に示す。
【００１５】
培養観察システムＢＳは、大別的には、筐体１の上部に設けられた培養室２と、複数の培養容器１０を収容保持する棚状のストッカー３と、培養容器１０内の試料を観察する観察ユニット５と、培養容器１０をストッカー３と観察ユニット５との間で搬送する搬送ユニット４と、システムの作動を統括的に制御する制御ユニット６と、画像表示装置を備えた操作盤７などから構成される。
【００１６】
培養室２は、培養環境を形成する部屋であり、環境変化やコンタミネーションを防止するためサンプル投入後は密閉状態に保持される。培養室２に付随して、培養室２内の温度を昇温・降温させる温度調整装置２１、湿度を調整する加湿器２２、ＣＯ2ガスやＮ2ガス等のガスを供給するガス供給装置２３、培養室２全体の環境を均一化させるための循環ファン２４、培養室２の温度や湿度、二酸化炭素濃度等を検出する環境センサ２５などが設けられている。各機器の作動は制御ユニット６により制御され、培養室２の温度や湿度、二酸化炭素濃度等により規定される培養環境が、操作盤７において設定された培養条件に合致した状態に維持される。
【００１７】
ストッカー３は、図２における紙面直行の前後方向、及び上下方向にそれぞれ複数に仕切られた棚状に形成されている。各棚にはそれぞれ固有の番地が設定されており、例えば前後方向をＡ〜Ｃ列、上下方向を１〜７段とした場合に、Ａ列５段の棚がＡ−５のように設定される。
【００１８】
培養容器１０は、培養物の種類や目的等に応じてフラスコやディッシュ、ウェルプレートなど適宜なものが選択され、本実施形態では、図４（Ａ）に示すように、透光性の材質で形成された直径約３５ｍｍの５つのディッシュ１１（容器１１ａ及び蓋１１ｂからなる）と、ディッシュ１１を保持するホルダ１２とを備えた構成を例示しており、図４（Ｂ）に示すように、培養物たる受精卵Ｊは、ｐＨに応じて変色するフェノールレッドなどのｐＨ指示薬が入った培地ドロップＤとともに各ディッシュ１１に注入される。ディッシュ１１の底面には、ピペット等により滴下された２０［μｌ］程度の培地ドロップＤが１〜複数個形成されており（図４（Ｂ）では３個を図示）、培地ドロップＤはディッシュ１１内において無色透明のミネラルオイルＯによって浸された状態となっている。それぞれの培地ドロップＤ内には、例えば対外受精のために同一母体から同時期に採卵された受精卵Ｊが１個（または複数個）ずつ挿入されている。また、培養容器１０にはコード番号が付与され、ストッカー３の指定番地に対応づけて収容される。
【００１９】
搬送ユニット４は、培養室２の内部に上下方向に移動可能に設けられてＺ軸駆動機構により昇降されるＺステージ４１、Ｚステージ４１に前後方向に移動可能に取り付けられてＹ軸駆動機構により前後移動されるＹステージ４２、Ｙステージ４２に左右方向に移動可能に取り付けられてＸ軸駆動機構により左右移動されるＸステージ４３などからなり、Ｘステージ４３の先端側に培養容器１０を持ち上げ支持する支持アーム４５が設けられている。搬送ユニット４は、支持アーム４５がストッカー３の全棚と観察ユニット５との間を移動可能な移動範囲を有して構成される。Ｘ軸駆動機構、Ｙ軸駆動機構、Ｚ軸駆動機構は、例えばボールネジとエンコーダ付きのサーボモータにより構成され、その作動が制御ユニット６により制御される。
【００２０】
観察ユニット５は、試料台１５の下側から試料を照明する第１照明部５１、顕微観察系の光軸に沿って試料台１５の上方から試料を照明する第２照明部５２、下方から試料を照明する第３照明部５３、試料のマクロ観察を行うマクロ観察系５４、試料のミクロ観察を行う顕微観察系５５、及び画像処理装置１００（図２を参照）などから構成される。試料台１５は、透光性を有する材質で構成されるとともに観察領域に透明な窓部１６が設けられている。また、試料台１５は、制御ユニット６からの作動制御によりＸＹ方向（水平面内方向）およびＺ方向（上下方向）に移動可能な微細駆動ステージからなり、その上面部に載置された培養容器１０をＸＹ方向に移動させることにより、培養容器１０をマクロ観察系５４の光軸上へ挿入したり、顕微観察系５５の光軸上へ挿入したりすることが可能になっている。
【００２１】
第１照明部５１は、図５にも示すように、下部フレーム１ｂ側に設けられたリング照明装置５１ａ等から構成され、試料台１５の下側から培養容器１０を照明する。リング照明装置５１ａは、円形に並ぶように複数配設されたＬＥＤ等の発光装置５１ｂを有して構成されており、複数の発光装置５１ｂのうち一部を発光させることにより、照明σの小さな系で、マクロ観察系５４の光軸に対して傾斜した照明方向から培養容器１０を照明する。また、リング照明装置５１ａは、発光装置５１ｂの発光位置を変えて、培養容器１０に対する照明方向をマクロ観察系５４の光軸中心に回転変位させることで、培養容器１０やマクロ観察系５４等を回転させることなく、培養容器１０を複数の照明方向から照明できるようになっている。
【００２２】
第２照明部５２は、ＬＥＤ等の光源と、位相リングやコンデンサレンズ等からなる照明光学系とを有して培養室２に設けられており、試料台１５の上方から顕微観察系５５の光軸に沿って培養容器１０中の試料を照明する。第３照明部５３は、それぞれ落射照明観察や蛍光観察に好適な波長の光を射出する複数のＬＥＤや水銀等の光源と、各光源から射出された光を顕微観察系５５の光軸に重畳させるビームスプリッタや蛍光フィルタ等からなる照明光学系とを有して、培養室２の下側に位置する下部フレーム１ｂ内に配設されており、試料台１５の下方から顕微観察系５５の光軸に沿って培養容器１０中の試料を照明する。
【００２３】
マクロ観察系５４は、観察光学系５４ａと、この観察光学系５４ａにより結像された試料の像を撮影するＣＣＤカメラ等の撮像装置５４ｃとを有し、第１照明部５１の上方に位置して培養室２内に設けられている。マクロ観察系５４は、第１照明部５１によりバックライト照明された試料（培養容器１０）の透過光の像を撮像して全体観察画像（マクロ画像）をカラー画像として取得する。
【００２４】
顕微観察系５５は、対物レンズや中間変倍レンズ、蛍光フィルタ等からなる観察光学系５５ａと、観察光学系５５ａにより結像された試料の像を撮影する冷却ＣＣＤカメラ等の撮像装置５５ｃとを有し、下部フレーム１ｂの内部に配設されている。上記の第２照明部５２と顕微観察系５５とにより位相差観察用の顕微鏡が構成される。対物レンズ及び中間変倍レンズは、それぞれ複数設けられるとともに、詳細図示を省略するレボルバやスライダなどの変位機構を用いて複数倍率に設定可能に構成されており、初期選択のレンズ設定に応じて、本実施形態では少なくとも低倍観察用と高倍観察用との２種類の倍率の間で変倍可能なように切り換えられる。顕微観察系５５は、第２照明部５２により照明された試料の透過光による位相差画像や、第３照明部５３により照明されて試料が発する蛍光による蛍光画像など、培養容器１０内の試料を顕微鏡観察した顕微観察画像（ミクロ画像）を撮影する。
【００２５】
画像処理装置１００は、マクロ観察系５４の撮像装置５４ｃ及び顕微観察系５５の撮像装置５５ｃから入力された信号をＡ／Ｄ変換するとともに、各種の画像処理を施して全体観察画像または顕微観察画像の画像データを生成する。また、画像処理装置１００は、これらの観察画像（全体観察画像及び顕微観察画像）の画像データに対して画像合成や画像解析を施し、培地ドロップＤや受精卵Ｊの識別等を行う。画像処理装置１００は、具体的には、次述する制御ユニット６のＲＯＭに記憶された画像処理プログラムが実行されることにより構築される。なお、この画像処理装置１００については、後に詳述する。
【００２６】
制御ユニット６は、処理を実行するＣＰＵ６１、培養観察システムＢＳの制御プログラムや制御データ等が設定記憶されたＲＯＭ６２、観察条件や画像データ等を一時記憶するＲＡＭ６３などを有し、培養観察システムＢＳの作動を制御する。そのため、図３に示すように、培養室２、搬送装置４、観察ユニット５、操作盤７の各構成機器が制御ユニット６に接続されている。ＲＡＭ６３には、観察プログラムに応じた培養室２の環境条件や、観察スケジュール、観察ユニット５における観察種別や観察位置、観察倍率等が設定され記憶される。また、ＲＡＭ６３には、観察ユニット５により撮影された画像データを記録する画像データ記憶領域が設けられ、培養容器１０のコード番号や撮影日時等を含むインデックス・データと画像データとが対応付けて記録される。
【００２７】
操作盤７には、キーボードやスイッチ等の入出力機器が設けられた操作パネル７１、操作画面や画像データ等を表示する表示パネル７２が設けられ、操作パネル７１において観察プログラムの設定や条件選択、動作指令等の入力が行われる。通信部６５は有線または無線の通信規格に準拠して構成されており、この通信部６５に外部接続されるコンピュータ等との間でデータの送受信が可能になっている。
【００２８】
このように概要構成される培養観察システムＢＳでは、操作盤７において設定された観察プログラムの設定条件に従い、ＣＰＵ６１がＲＯＭ６２に記憶された制御プログラムに基づいて各部の作動を制御するとともに、培養容器１０内の試料の撮影を自動的に実行する。すなわち、操作パネル７１に対するパネル操作（または通信部６５を介したリモート操作）によって観察プログラムがスタートされると、ＣＰＵ６１が、ＲＡＭ６３に記憶された環境条件の各条件値を読み込むとともに、環境センサ２５から入力される培養室２の環境状態を検出し、条件値と実測値との差異に応じて温度調整装置２１、加湿器２２、ガス供給装置２３、循環ファン２４等を作動させて、培養室２の温度や湿度、二酸化炭素濃度などの培養環境についてフィードバック制御が行われる。
【００２９】
また、ＣＰＵ６１は、ＲＡＭ６３に記憶された観察条件を読み込む、観察スケジュールに基づいて搬送ユニット４のＸ，Ｙ，Ｚステージ４１，４２，４３を作動させてストッカー３から観察対象の培養容器１０を観察ユニット５の試料台１５に搬送して、観察ユニット５による観察を開始させる。例えば、観察プログラムにおいて設定された観察がマクロ観察である場合には、搬送ユニット４によりストッカー３から搬送してきた培養容器１０をマクロ観察系５４の光軸上に位置決めして試料台１５に載置し、第１照明部５１（リング照明装置５１ａ）の発光装置５１ｂを点灯させて培養容器１０の下方から照明光（透過光）を斜め方向に照射し、このようにマクロ観察系５４の光軸に対して傾斜した照明方向から照明された培養容器１０の上方から撮像装置５４ｃにより全体観察像を撮影する。撮像装置５４ｃから制御ユニット６に入力された信号は、画像処理装置１００により処理されて全体観察画像が生成され、その画像データが撮影日時等のインデックス・データなどとともにＲＡＭ６３の画像データ記憶領域に記憶される。
【００３０】
なおこのとき、第１照明部５１（リング照明装置５１ａ）は、発光装置５１ｂの発光位置を変えて、培養容器１０に対する照明方向をマクロ観察系５４の光軸中心に回転変位させることで、培養容器１０を予め設定された複数の照明方向（例えば、４種類の照明方向）から照明し、マクロ観察系５４の撮像装置５４ｃは、第１照明部５１によりいずれかの照明方向で照明された培養容器１０の全体観察像を、当該設定された全ての照明方向についてそれぞれ撮像する。そのため、複数の照明方向にそれぞれ対応する複数の画像データが、ＲＡＭ６３の画像データ記憶領域にそれぞれ記憶されることになる。
【００３１】
また、観察プログラムにおいて設定された観察が、培養容器１０内の特定位置の試料のミクロ観察である場合には、搬送ユニット４により搬送してきた培養容器１０内の特定位置を顕微観察系５５の光軸上に位置決めして試料台１５に載置し、第２照明部５２または第３照明部５３の光源を点灯させて、透過照明、落射照明、蛍光による顕微観察像を撮像装置５５ｃに撮影させる。撮像装置５５ｃにより撮影されて制御ユニット６に入力された信号は、画像処理装置１００により処理されて顕微観察画像（位相差画像、蛍光画像等）が生成され、その画像データが撮影日時等のインデックス・データなどとともにＲＡＭ６３の画像データ記憶領域に記憶される。
【００３２】
ＣＰＵ６１は、上記のような全体観察像の撮影や顕微観察像の撮影を、観察プログラムに設定された観察スケジュールに基づいて順次実行する。ＲＡＭ６３に記憶された画像データは、操作パネル７１から入力される画像表示指令に応じてＲＡＭ６３から読み出され、例えば指定時刻の全体観察画像や顕微観察画像、画像解析の解析結果などが表示パネル７２に表示される。
【００３３】
さて、このように構成される培養観察システムＢＳにおいて、培養容器１０（ディッシュ１１）中の受精卵Ｊの生育状態を観察する場合、培養容器１０内から観察対象の受精卵を検出しなければならないが、その一連の検出手順としては大略的に、マクロ観察系５４により培養容器１０を撮影して全体観察画像（マクロ画像）を取得し、この全体観察画像から培地ドロップＤを検出した後で、この培地ドロップＤを顕微観察系５５により撮影し、この培地ドロップＤに１つ（または複数個）ずつ注入された観察対象の受精卵を他の異物と判別して受精卵を認識する、という流れになっている。受精卵を検出するためには一般に高倍視野での顕微観察が必要であるところ、観察倍率が高くなるにつれてその観察視野（観察範囲）が狭くなってくるため、培養容器１０内の広い観察範囲に対して多数の画像を撮像取得する必要がある。そのため前述のように、顕微観察による受精卵の検出に先立って、マクロ観察により受精卵が含まれる培地ドロップＤの領域を予め検出できれば、その後に顕微観察において高倍画像を取得する領域も限定され、観察時間全体を短縮化することが可能になる。
【００３４】
しかしながら、培地ドロップＤの色は赤色から無色透明まであり、全体観察画像（マクロ画像）を用いて、色味や輝度の濃淡から培地ドロップＤの領域を検出するのは容易ではない。そこで、本実施形態においては、培地ドロップＤのレンズ効果と偏射照明法を利用して、培地ドロップＤの周辺部に明暗差をつけた全体観察画像を撮像取得し、例えば図６に示すように、４種類の照明方向でそれぞれ撮像取得した４枚の全体観察画像Ｇ１，Ｇ２，Ｇ３，Ｇ４を重ね合わせて全体観察画像の合成画像ＧＸを生成するとともに、生成した合成画像ＧＸから培養容器１０中における培地ドロップＤの領域を特定（識別）する。このように、複数の照明方向でそれぞれ撮像取得した全体観察画像Ｇ１，Ｇ２，Ｇ３，Ｇ４の合成画像ＧＸを用いるようにすれば、培地ドロップＤの周辺部全体に明暗差がつくため、色情報に依らずに、培地ドロップＤの領域を精度よく識別することができる。なお、図６に示す４枚の全体観察画像Ｇ１，Ｇ２，Ｇ３，Ｇ４はそれぞれ、培養容器１０に対する照明方向をマクロ観察系５４の光軸中心に４５度ずつ回転変位させて撮像取得した画像である。
【００３５】
合成画像ＧＸを用いた培地ドロップＤの領域の検出（識別）は、培地ドロップＤが一般に円形状に形成されるという特徴を利用して、所定の画像処理方法により行われる。例えば、合成画像ＧＸに対して公知の微分処理を行って微分画像を生成し、当該微分画像からハフ変換により円の検出を行うことで、培地ドロップＤの領域を検出（識別）することができる。また例えば、微分画像の全点について極座標のθ方向に積分を行って、所定の半径範囲でピークを示す点を抽出ことにより、円形状の抽出を行うことで、培地ドロップＤの領域を検出（識別）するようにしてもよい。また例えば、いわゆるレベルセット法（動的輪郭法）を用いて、微分画像から円形状の抽出を行うことで、培地ドロップＤの領域を検出（識別）するようにしてもよい。なおこのとき、画像に写し込まれる培地ドロップＤ（例えば、２０μｌ程度の直径約７ｍｍ）の像の大きさは、画像取得条件（観察倍率等）によりほぼ決まっていることから、培地ドロップＤの候補となり得るオブジェクト（抽出した円形状の輪郭に囲まれた領域）の面積を公知の画像処理手法により算出し、面積による判別基準として定めた設定範囲（上限値及び下限値）から逸脱しているものを除外する。
【００３６】
培地ドロップＤの領域を検出（識別）するための画像処理は、培養観察システムＢＳの画像処理装置１００において実行される。図７に示すように、画像処理装置１００は、撮像装置５４ｃにより観察対象の培養容器１０が撮影された全体観察画像（マクロ画像）を取得して記憶する画像記憶部１１０と、画像記憶部１１０に保存されている複数の照明方向で撮像取得された全体観察画像をそれぞれ重ね合わせて合成画像を生成する画像合成部１２０と、画像合成部１２０により生成された合成画像に基づいて培地ドロップＤを検出する画像解析部１３０と、画像合成部１２０により生成された合成画像や画像解析部１３０により解析された判断結果を外部に出力する出力部１４０とを備え、画像合成部１２０及び画像解析部１３０により判断された培地ドロップＤの画像や検出結果を、例えば表示パネル７２に出力して表示させるように構成される。画像処理装置１００は、ＲＯＭ６２に予め設定記憶された画像処理プログラムがＣＰＵ６１に読み込まれ、ＣＰＵ６１によって画像処理プログラムに基づく処理が順次実行されることによって構成される。
【００３７】
以上のように構成される培養観察システムＢＳを用いた培養容器１０内の観察方法について、図１に示すフローチャートを参照しながら説明する。前述したように、培養観察システムＢＳでは、観察プログラムにおいて設定された観察条件に従って、所定時間ごとに指定された培養容器１０内の観察が行われる。具体的には、ＣＰＵ６１は搬送ユニット４の各ステージを作動させてストッカー３から観察対象の培養容器１０を観察ユニット５に搬送（本実施形態ではマクロ観察系５４の光軸上に配置）し、撮像装置５４ｃによりマクロ画像を撮影させる。
【００３８】
このときまず、ＣＰＵ６１は、第１照明部５１を作動させてマクロ観察系５４の光軸に対して傾斜した照明方向から培養容器１０を照明し（ステップＳ１）、マクロ観察系５４の撮像装置５４ｃを作動させて培養容器１０の全体観察像を撮像する（ステップＳ２）。ここで、ＣＰＵ６１は、予め設定された全ての照明方向について培養容器１０の全体観察像を撮像したか否か判定する（ステップＳ３）。このステップＳ３において判定がＮＯの場合、ステップＳ４へ進み、ＣＰＵ６１は、発光装置５１ｂの発光位置を変えて、培養容器１０に対する照明方向をマクロ観察系５４の光軸中心に回転変位させてから、ステップＳ１〜Ｓ２までの処理を繰り返す。またこのとき、画像処理装置１００は、撮像装置５４ｃにより撮像された全体観察画像（マクロ画像）をステップＳ２において取得し、この取得した画像を、培養容器１０のコード番号や観察位置、観察時刻などのインデックス・データとともに画像記憶部１１０に保存する。
【００３９】
一方、ステップＳ３において判定がＹＥＳの場合、ステップＳ５へ進み、画像合成部１２０は、画像記憶部１１０に保存されている複数の照明方向で撮像取得された全体観察画像をそれぞれ重ね合わせて、（培養容器１０についての）全体観察画像の合成画像を生成する。なおこのとき、出力部１４０によって、画像合成部１２０で生成された全体観察画像（バードビュー画像）の合成画像等が操作盤７の表示パネル７２等に表示される。
【００４０】
そして、ステップＳ６において、画像解析部１３０は、画像合成部１２０により生成された合成画像から、前述した円検出の手法を用いて、ディッシュ１１内における培地ドロップＤの領域を検出（識別）する。なおこのとき、画像解析部１３０により検出された培地ドロップＤの領域を示す検出結果が出力部１４０から出力される。
【００４１】
出力部１４０から出力された検出結果は、操作盤７の表示パネル７２に表示され、合成画像もしくは全体観察画像中に、培地ドロップＤの領域を示す輪郭を表示したり、培地ドロップＤであることを示す記号「Ｄ」を表示させたり、培地ドロップＤの輪郭を他の領域と異なる色相や輝度で表示する等が例示される。
【００４２】
なお、出力部１４０から出力される検出データを、通信部６５を介して外部接続されるコンピュータ等に送信して、同様の画像を表示させたり、培地ドロップＤの色変化（ｐＨ変化）や受精卵Ｊの生育状態を観察するための基礎データとして用いたりするように構成することができる。
【００４３】
これにより、ユーザは、表示パネル７２に表示された画像や外部接続されたコンピュータ等のモニタに表示された画像を参照することにより、培地ドロップＤを直ちに認識することができ、培地ドロップＤの領域についてのみ顕微観察系５５による顕微観察画像を取得して（背景のみの無用な撮影を回避して）、培地ドロップＤの中から目的とする受精卵Ｊを効率的に検出することができる。
【００４４】
次に、培養物たる受精卵の製造方法について図８を追加参照して概要説明する。まず、ステップＳ１１０において、受精卵（培養物）を培地ドロップＤと共に培養容器１０（ディッシュ１１）内に注入し、この培養容器１０を受精卵の培養に適した環境条件に維持された培養室２内に収納して、当該環境条件の下で受精卵を培養する。なお、この環境条件は、制御ユニット６において培養室２内の温度や湿度、二酸化炭素濃度等が受精卵の培養環境に合わせて調節される。
【００４５】
ステップＳ１２０では、培養容器１０内の受精卵観察の前段階として、前述した観察方法のステップＳ１〜Ｓ６（図１を参照）を実行して、ディッシュ１１内から培地ドロップＤの領域を識別する。次いで、ステップＳ１３０では、第２照明部５２を用いて顕微観察系５５により培地ドロップＤの顕微観察画像（例えば位相差画像）を撮影し、この観察画像に写し込まれる複数のオブジェクトの中から受精卵を識別する。このとき培養容器１０（ディッシュ１１）内において、１個の培地ドロップＤに対して受精卵が各１個（または複数個）ずつ識別される。
【００４６】
続いて、ステップＳ１４０では、培地ドロップＤごとに識別された複数の受精卵を所定の選別基準に基づいて選別する。受精卵の選別基準としては、卵割のタイミングや卵割球の形態等に基づいて受精卵のグレードが判定されて、この選別基準を満足する良好なものが選別される。例えば、良好な生育状態を経たものとして、卵内全ての卵細胞において卵割の起きたタイミングが同時期であるか否かに基づいて行われる。すなわち、正常な受精卵の卵割については、同じ世代の各細胞はほぼ同時期のタイミングで分裂し、胚内には同じ世代の細胞のみが存在する。一方、異常な受精卵の卵割については、同じ世代の細胞であっても分裂するタイミングがずれて、胚内には異なる世代の細胞が混在してしまう。
【００４７】
ステップＳ１５０では、上記選別した受精卵（胚盤胞と称される状態にまで成長した良好な受精卵）を採取して、例えばマイナス１９６℃の液体窒素の中で凍結保存する。そして、この受精卵（胚盤胞）は所定の周期のときに母体へ戻される（胚移植される）。なお、培養される受精卵は、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、マウス等の受精卵であってもよい。また、受精卵の保存は胚盤胞の状態で保存してもよいし、分割期（４細胞期胚、８細胞期胚）の状態で保存してもよい。
【００４８】
以上説明したように、本実施形態によれば、複数の照明方向でそれぞれ撮像取得した全体観察画像の合成画像を用いることで、培地ドロップＤの周辺部全体に明暗差をつけられるため、色情報に依らずに、培養容器１０（ディッシュ１１）内における培地ドロップＤの領域を精度よく識別することができる。
【００４９】
また、培養容器１０（ディッシュ１１）に対する撮像方向（すなわち、マクロ観察系５４の光軸）に対して傾斜した複数の照明方向から、培養容器１０を照明することで、培地ドロップＤのレンズ効果を利用して、培地ドロップＤの周辺部に明暗差をつけた培養容器１０の全体観察画像を撮像取得することができるため、培地ドロップＤの周辺部全体に明暗差がついた合成画像を確実に得ることができる。
【００５０】
また、合成画像に対して微分処理を行った微分画像から円の検出を行うことで、培地ドロップＤの領域を識別するようにすれば、培地ドロップＤの領域を簡便な方法で精度よく識別することができる。
【００５１】
なお、上述の実施形態において、４種類の照明方向でそれぞれ撮像取得した４枚の全体観察画像Ｇ１，Ｇ２，Ｇ３，Ｇ４を重ね合わせて全体観察画像の合成画像ＧＸを生成しているが、これに限られるものではなく、例えば、８種類の照明方向でそれぞれ撮像取得した８枚の全体観察画像を重ね合わせて合成画像を生成してもよく、複数の照明方向でそれぞれ撮像取得した複数の全体観察画像を重ね合わせて合成画像を生成すればよい。さらには、積分時間内に照明方向を連続的に変化させた全体観察画像を用いてもよい。
【００５２】
また、上述の実施形態において、第１照明部５１は、発光装置５１ｂの発光位置を変えて、培養容器１０に対する照明方向をマクロ観察系５４の光軸中心に回転変位させることで、培養容器１０を複数の照明方向から照明可能に構成されているが、これに限られるものではない。例えば、図５の二点鎖線で示すように、リング照明装置５１ａに、複数の発光装置５１ｂのうち一部からの光だけを通過させるようなシャッター部材５１ｃを設け、当該シャッター部材５１ｃをマクロ観察系５４の光軸中心に回転変位させることで、照明方向を変えるような構成であってもよい。また、発光装置５１ｂの発光位置を変えて、培養容器１０に対する照明方向をマクロ観察系５４の光軸中心に回転変位させる構成では、培養容器１０やマクロ観察系５４等を回転させる必要がないので、位置合わせをせずに全体観察画像を重ね合わせることが可能であるが、画像の回転補正及びパースペクティブ補正を行えば、マクロ観察系５４を光軸中心に回転させる構成であってもよい。
【００５３】
また、上述の実施形態において、複数の全体観察画像を重ね合わせて合成画像を生成してから微分画像を生成しているが、これに限られるものではなく、画像合成前の全体観察画像に対してそれぞれ微分処理を行ってから、これらを重ね合わせて微分画像の合成画像を生成するようにしてもよい。さらには、照明方向を回転させる間に積算した画像を用いてもよい。
【符号の説明】
【００５４】
ＢＳ 培養観察システム ＧＸ 合成画像
Ｄ 培地ドロップ Ｊ 受精卵
５ 観察ユニット
６ 制御ユニット ７ 操作盤
１０ 培養容器 １１ ディッシュ
５１ 第１照明部 ５１ａ リング照明装置
５１ｂ 発光装置 ５１ｃ シャッター部材
５４ マクロ観察系 ５４ｃ 撮像装置
６１ ＣＰＵ ６２ ＲＯＭ
６３ ＲＡＭ
１００ 画像処理装置 １２０ 画像合成部
１３０ 画像解析部 １４０ 出力部
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養容器の中から培養物の培養に用いられる培地の領域を検出するための観察装置及び観察方法に関し、さらに、このような観察装置及び観察方法を利用した培養物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生殖補助医療技術（ＡＲＴ）の発展に伴い、体外受精による受精卵を培養しながらその生育状態を観察することが行われている。受精卵などの培養物の状況を観察する装置の例として、培養顕微鏡が挙げられる（例えば、特許文献１を参照）。培養顕微鏡は、受精卵の培養に好適な環境を形成する培養装置（インベキュータ）と、培養装置に収容された培養容器内の受精卵の状態を顕微観察する顕微観察系とを備え、予め設定された一定時間ごとに受精卵の観察画像を取得し、ユーザが受精卵を目視により認識した上で、受精卵の生育状態の観察、記録、管理等を自動で行うことができるように構成される。
【０００３】
このような装置において、培養容器中の受精卵の成育状態を観察する場合、始めに観察対象の受精卵を検出しなければならないが、その検出手順としては大略的に、培養容器全体を撮影してこの全体観察画像に基づいて培養容器内からミネラルオイルに浸された培地（培地ドロップ）を検出した後で、この培地ドロップ内で観察視野位置を変えつつ培地ドロップの顕微観察画像を複数取得し、この顕微観察画像を基に培地ドロップ内に１つ（または複数個）ずつ注入された観察対象の受精卵を他の異物と判別して検出する、という流れになっている。このように受精卵を認識するためには一般に高倍視野での顕微観察が必要であるところ、観察倍率が高くなるにつれて観察視野（観察範囲）が狭くなってくるため、顕微観察のみでは広い観察範囲に対して多数の顕微観察画像を撮影する必要がある。そのため、前述のように顕微観察による受精卵の検出に先立って、マクロ観察により培地ドロップの領域を事前に検出できれば、その後に顕微観察において観察画像を取得する領域も自ずと限定され、観察時間全体を短縮化することが可能になる。
【０００４】
受精卵の自動観察では、培地ドロップの探査領域を限定するための方法として、探査領域を機械的に指定する方法と、培養環境のチェックのために加えられているフェノールの着色により、培地ドロップ領域を色分離する方法がある。ところが、探査領域を機械的に指定する方法では、ユーザが手動で培地ドロップをディッシュ内に作り込むため、初期の探査領域をほぼディッシュ全面に指定して探査を行うしかなく、領域限定の効果が得られない。また、色分離する方法では、効率良く探査領域を限定できるものの、着色後の色の濃さは環境によって未知であり、ユーザによっては、フェノールなしで観察等を行うこともある。また、ディッシュの上面あるいは下面にペンで書き込みを行うユーザも少なくなく、色分離による抽出では、色の濃さや書き込みの有無によって、培地ドロップ領域の検出精度が変化してしまう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−２２９６１９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、広い観察視野での観察画像から、色情報に依らずに、培地ドロップ領域を抽出するための方策が望まれている。
【０００７】
本発明は、このような問題に鑑みてなされたものであり、培養容器の中から培地の領域を精度よく識別可能な観察装置、観察方法、及び培養物の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
このような目的達成のため、本発明を例示する態様に従えば、内部に培養物の培養に用いられる培地を有した培養容器を複数の照明方向から照明可能な照明部と、前記照明部に照明された前記培養容器を前記複数の照明方向についてそれぞれ撮像する撮像部と、前記撮像部にそれぞれ撮像された前記複数の照明方向についての前記培養容器の画像を重ね合わせて前記培養容器の合成画像を生成する画像合成部と、前記画像合成部に生成された前記合成画像から前記培養容器中における前記培地を識別する画像解析部とを備えて構成されることを特徴とする培養物の観察装置が提供される。
【０００９】
また、本発明を例示する態様に従えば、内部に培養物の培養に用いられる培地を有した培養容器を複数の照明方向から照明し、前記照明された前記培養容器を前記複数の照明方向についてそれぞれ撮像し、前記撮像された前記複数の照明方向についての前記培養容器の画像を重ね合わせて前記培養容器の合成画像を生成し、前記生成された前記合成画像から前記培養容器中における前記培地を識別することを特徴とする培養物の観察方法が提供される。
【００１０】
また、本発明を例示する態様に従えば、所定の環境条件で培養物を培養し、内部に前記培養物が培養される培地を有した培養容器中から、本発明に係る観察装置を用いて前記培地を識別することを特徴とする培養物の製造方法が提供される。
【００１１】
また、本発明を例示する態様に従えば、所定の環境条件で培養物を培養し、内部に前記培養物が培養される培地を有した培養容器を複数の照明方向から照明し、前記照明された前記培養容器を前記複数の照明方向についてそれぞれ撮像し、前記撮像された前記複数の照明方向についての前記培養容器の画像を重ね合わせて前記培養容器の合成画像を生成し、前記生成された前記合成画像から前記培養容器中における前記培地を識別することを特徴とする培養物の製造方法が提供される。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、培養容器の中から培地の領域を精度よく識別することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】観察方法の概要を示すフローチャートである。
【図２】本発明の適用例として示す培養観察システムの概要構成図である。
【図３】上記培養観察システムのブロック図である。
【図４】（Ａ）は培養容器の平面図であり、（Ｂ）はディッシュを示す斜視図である。
【図５】第１照明部の概要構成図である。
【図６】合成画像を生成する過程を示す模式図である。
【図７】画像処理装置の概要構成を示すブロック図である。
【図８】受精卵の製造方法の概要を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、図面を参照して本発明の好ましい実施形態について説明する。本実施形態に係る観察装置を適用したシステムの一例として、培養観察システムの概要構成図及びブロック図を、それぞれ図２及び図３に示す。
【００１５】
培養観察システムＢＳは、大別的には、筐体１の上部に設けられた培養室２と、複数の培養容器１０を収容保持する棚状のストッカー３と、培養容器１０内の試料を観察する観察ユニット５と、培養容器１０をストッカー３と観察ユニット５との間で搬送する搬送ユニット４と、システムの作動を統括的に制御する制御ユニット６と、画像表示装置を備えた操作盤７などから構成される。
【００１６】
培養室２は、培養環境を形成する部屋であり、環境変化やコンタミネーションを防止するためサンプル投入後は密閉状態に保持される。培養室２に付随して、培養室２内の温度を昇温・降温させる温度調整装置２１、湿度を調整する加湿器２２、ＣＯ2ガスやＮ2ガス等のガスを供給するガス供給装置２３、培養室２全体の環境を均一化させるための循環ファン２４、培養室２の温度や湿度、二酸化炭素濃度等を検出する環境センサ２５などが設けられている。各機器の作動は制御ユニット６により制御され、培養室２の温度や湿度、二酸化炭素濃度等により規定される培養環境が、操作盤７において設定された培養条件に合致した状態に維持される。
【００１７】
ストッカー３は、図２における紙面直行の前後方向、及び上下方向にそれぞれ複数に仕切られた棚状に形成されている。各棚にはそれぞれ固有の番地が設定されており、例えば前後方向をＡ〜Ｃ列、上下方向を１〜７段とした場合に、Ａ列５段の棚がＡ−５のように設定される。
【００１８】
培養容器１０は、培養物の種類や目的等に応じてフラスコやディッシュ、ウェルプレートなど適宜なものが選択され、本実施形態では、図４（Ａ）に示すように、透光性の材質で形成された直径約３５ｍｍの５つのディッシュ１１（容器１１ａ及び蓋１１ｂからなる）と、ディッシュ１１を保持するホルダ１２とを備えた構成を例示しており、図４（Ｂ）に示すように、培養物たる受精卵Ｊは、ｐＨに応じて変色するフェノールレッドなどのｐＨ指示薬が入った培地ドロップＤとともに各ディッシュ１１に注入される。ディッシュ１１の底面には、ピペット等により滴下された２０［μｌ］程度の培地ドロップＤが１〜複数個形成されており（図４（Ｂ）では３個を図示）、培地ドロップＤはディッシュ１１内において無色透明のミネラルオイルＯによって浸された状態となっている。それぞれの培地ドロップＤ内には、例えば対外受精のために同一母体から同時期に採卵された受精卵Ｊが１個（または複数個）ずつ挿入されている。また、培養容器１０にはコード番号が付与され、ストッカー３の指定番地に対応づけて収容される。
【００１９】
搬送ユニット４は、培養室２の内部に上下方向に移動可能に設けられてＺ軸駆動機構により昇降されるＺステージ４１、Ｚステージ４１に前後方向に移動可能に取り付けられてＹ軸駆動機構により前後移動されるＹステージ４２、Ｙステージ４２に左右方向に移動可能に取り付けられてＸ軸駆動機構により左右移動されるＸステージ４３などからなり、Ｘステージ４３の先端側に培養容器１０を持ち上げ支持する支持アーム４５が設けられている。搬送ユニット４は、支持アーム４５がストッカー３の全棚と観察ユニット５との間を移動可能な移動範囲を有して構成される。Ｘ軸駆動機構、Ｙ軸駆動機構、Ｚ軸駆動機構は、例えばボールネジとエンコーダ付きのサーボモータにより構成され、その作動が制御ユニット６により制御される。
【００２０】
観察ユニット５は、試料台１５の下側から試料を照明する第１照明部５１、顕微観察系の光軸に沿って試料台１５の上方から試料を照明する第２照明部５２、下方から試料を照明する第３照明部５３、試料のマクロ観察を行うマクロ観察系５４、試料のミクロ観察を行う顕微観察系５５、及び画像処理装置１００（図２を参照）などから構成される。試料台１５は、透光性を有する材質で構成されるとともに観察領域に透明な窓部１６が設けられている。また、試料台１５は、制御ユニット６からの作動制御によりＸＹ方向（水平面内方向）およびＺ方向（上下方向）に移動可能な微細駆動ステージからなり、その上面部に載置された培養容器１０をＸＹ方向に移動させることにより、培養容器１０をマクロ観察系５４の光軸上へ挿入したり、顕微観察系５５の光軸上へ挿入したりすることが可能になっている。
【００２１】
第１照明部５１は、図５にも示すように、下部フレーム１ｂ側に設けられたリング照明装置５１ａ等から構成され、試料台１５の下側から培養容器１０を照明する。リング照明装置５１ａは、円形に並ぶように複数配設されたＬＥＤ等の発光装置５１ｂを有して構成されており、複数の発光装置５１ｂのうち一部を発光させることにより、照明σの小さな系で、マクロ観察系５４の光軸に対して傾斜した照明方向から培養容器１０を照明する。また、リング照明装置５１ａは、発光装置５１ｂの発光位置を変えて、培養容器１０に対する照明方向をマクロ観察系５４の光軸中心に回転変位させることで、培養容器１０やマクロ観察系５４等を回転させることなく、培養容器１０を複数の照明方向から照明できるようになっている。
【００２２】
第２照明部５２は、ＬＥＤ等の光源と、位相リングやコンデンサレンズ等からなる照明光学系とを有して培養室２に設けられており、試料台１５の上方から顕微観察系５５の光軸に沿って培養容器１０中の試料を照明する。第３照明部５３は、それぞれ落射照明観察や蛍光観察に好適な波長の光を射出する複数のＬＥＤや水銀等の光源と、各光源から射出された光を顕微観察系５５の光軸に重畳させるビームスプリッタや蛍光フィルタ等からなる照明光学系とを有して、培養室２の下側に位置する下部フレーム１ｂ内に配設されており、試料台１５の下方から顕微観察系５５の光軸に沿って培養容器１０中の試料を照明する。
【００２３】
マクロ観察系５４は、観察光学系５４ａと、この観察光学系５４ａにより結像された試料の像を撮影するＣＣＤカメラ等の撮像装置５４ｃとを有し、第１照明部５１の上方に位置して培養室２内に設けられている。マクロ観察系５４は、第１照明部５１によりバックライト照明された試料（培養容器１０）の透過光の像を撮像して全体観察画像（マクロ画像）をカラー画像として取得する。
【００２４】
顕微観察系５５は、対物レンズや中間変倍レンズ、蛍光フィルタ等からなる観察光学系５５ａと、観察光学系５５ａにより結像された試料の像を撮影する冷却ＣＣＤカメラ等の撮像装置５５ｃとを有し、下部フレーム１ｂの内部に配設されている。上記の第２照明部５２と顕微観察系５５とにより位相差観察用の顕微鏡が構成される。対物レンズ及び中間変倍レンズは、それぞれ複数設けられるとともに、詳細図示を省略するレボルバやスライダなどの変位機構を用いて複数倍率に設定可能に構成されており、初期選択のレンズ設定に応じて、本実施形態では少なくとも低倍観察用と高倍観察用との２種類の倍率の間で変倍可能なように切り換えられる。顕微観察系５５は、第２照明部５２により照明された試料の透過光による位相差画像や、第３照明部５３により照明されて試料が発する蛍光による蛍光画像など、培養容器１０内の試料を顕微鏡観察した顕微観察画像（ミクロ画像）を撮影する。
【００２５】
画像処理装置１００は、マクロ観察系５４の撮像装置５４ｃ及び顕微観察系５５の撮像装置５５ｃから入力された信号をＡ／Ｄ変換するとともに、各種の画像処理を施して全体観察画像または顕微観察画像の画像データを生成する。また、画像処理装置１００は、これらの観察画像（全体観察画像及び顕微観察画像）の画像データに対して画像合成や画像解析を施し、培地ドロップＤや受精卵Ｊの識別等を行う。画像処理装置１００は、具体的には、次述する制御ユニット６のＲＯＭに記憶された画像処理プログラムが実行されることにより構築される。なお、この画像処理装置１００については、後に詳述する。
【００２６】
制御ユニット６は、処理を実行するＣＰＵ６１、培養観察システムＢＳの制御プログラムや制御データ等が設定記憶されたＲＯＭ６２、観察条件や画像データ等を一時記憶するＲＡＭ６３などを有し、培養観察システムＢＳの作動を制御する。そのため、図３に示すように、培養室２、搬送装置４、観察ユニット５、操作盤７の各構成機器が制御ユニット６に接続されている。ＲＡＭ６３には、観察プログラムに応じた培養室２の環境条件や、観察スケジュール、観察ユニット５における観察種別や観察位置、観察倍率等が設定され記憶される。また、ＲＡＭ６３には、観察ユニット５により撮影された画像データを記録する画像データ記憶領域が設けられ、培養容器１０のコード番号や撮影日時等を含むインデックス・データと画像データとが対応付けて記録される。
【００２７】
操作盤７には、キーボードやスイッチ等の入出力機器が設けられた操作パネル７１、操作画面や画像データ等を表示する表示パネル７２が設けられ、操作パネル７１において観察プログラムの設定や条件選択、動作指令等の入力が行われる。通信部６５は有線または無線の通信規格に準拠して構成されており、この通信部６５に外部接続されるコンピュータ等との間でデータの送受信が可能になっている。
【００２８】
このように概要構成される培養観察システムＢＳでは、操作盤７において設定された観察プログラムの設定条件に従い、ＣＰＵ６１がＲＯＭ６２に記憶された制御プログラムに基づいて各部の作動を制御するとともに、培養容器１０内の試料の撮影を自動的に実行する。すなわち、操作パネル７１に対するパネル操作（または通信部６５を介したリモート操作）によって観察プログラムがスタートされると、ＣＰＵ６１が、ＲＡＭ６３に記憶された環境条件の各条件値を読み込むとともに、環境センサ２５から入力される培養室２の環境状態を検出し、条件値と実測値との差異に応じて温度調整装置２１、加湿器２２、ガス供給装置２３、循環ファン２４等を作動させて、培養室２の温度や湿度、二酸化炭素濃度などの培養環境についてフィードバック制御が行われる。
【００２９】
また、ＣＰＵ６１は、ＲＡＭ６３に記憶された観察条件を読み込む、観察スケジュールに基づいて搬送ユニット４のＸ，Ｙ，Ｚステージ４１，４２，４３を作動させてストッカー３から観察対象の培養容器１０を観察ユニット５の試料台１５に搬送して、観察ユニット５による観察を開始させる。例えば、観察プログラムにおいて設定された観察がマクロ観察である場合には、搬送ユニット４によりストッカー３から搬送してきた培養容器１０をマクロ観察系５４の光軸上に位置決めして試料台１５に載置し、第１照明部５１（リング照明装置５１ａ）の発光装置５１ｂを点灯させて培養容器１０の下方から照明光（透過光）を斜め方向に照射し、このようにマクロ観察系５４の光軸に対して傾斜した照明方向から照明された培養容器１０の上方から撮像装置５４ｃにより全体観察像を撮影する。撮像装置５４ｃから制御ユニット６に入力された信号は、画像処理装置１００により処理されて全体観察画像が生成され、その画像データが撮影日時等のインデックス・データなどとともにＲＡＭ６３の画像データ記憶領域に記憶される。
【００３０】
なおこのとき、第１照明部５１（リング照明装置５１ａ）は、発光装置５１ｂの発光位置を変えて、培養容器１０に対する照明方向をマクロ観察系５４の光軸中心に回転変位させることで、培養容器１０を予め設定された複数の照明方向（例えば、４種類の照明方向）から照明し、マクロ観察系５４の撮像装置５４ｃは、第１照明部５１によりいずれかの照明方向で照明された培養容器１０の全体観察像を、当該設定された全ての照明方向についてそれぞれ撮像する。そのため、複数の照明方向にそれぞれ対応する複数の画像データが、ＲＡＭ６３の画像データ記憶領域にそれぞれ記憶されることになる。
【００３１】
また、観察プログラムにおいて設定された観察が、培養容器１０内の特定位置の試料のミクロ観察である場合には、搬送ユニット４により搬送してきた培養容器１０内の特定位置を顕微観察系５５の光軸上に位置決めして試料台１５に載置し、第２照明部５２または第３照明部５３の光源を点灯させて、透過照明、落射照明、蛍光による顕微観察像を撮像装置５５ｃに撮影させる。撮像装置５５ｃにより撮影されて制御ユニット６に入力された信号は、画像処理装置１００により処理されて顕微観察画像（位相差画像、蛍光画像等）が生成され、その画像データが撮影日時等のインデックス・データなどとともにＲＡＭ６３の画像データ記憶領域に記憶される。
【００３２】
ＣＰＵ６１は、上記のような全体観察像の撮影や顕微観察像の撮影を、観察プログラムに設定された観察スケジュールに基づいて順次実行する。ＲＡＭ６３に記憶された画像データは、操作パネル７１から入力される画像表示指令に応じてＲＡＭ６３から読み出され、例えば指定時刻の全体観察画像や顕微観察画像、画像解析の解析結果などが表示パネル７２に表示される。
【００３３】
さて、このように構成される培養観察システムＢＳにおいて、培養容器１０（ディッシュ１１）中の受精卵Ｊの生育状態を観察する場合、培養容器１０内から観察対象の受精卵を検出しなければならないが、その一連の検出手順としては大略的に、マクロ観察系５４により培養容器１０を撮影して全体観察画像（マクロ画像）を取得し、この全体観察画像から培地ドロップＤを検出した後で、この培地ドロップＤを顕微観察系５５により撮影し、この培地ドロップＤに１つ（または複数個）ずつ注入された観察対象の受精卵を他の異物と判別して受精卵を認識する、という流れになっている。受精卵を検出するためには一般に高倍視野での顕微観察が必要であるところ、観察倍率が高くなるにつれてその観察視野（観察範囲）が狭くなってくるため、培養容器１０内の広い観察範囲に対して多数の画像を撮像取得する必要がある。そのため前述のように、顕微観察による受精卵の検出に先立って、マクロ観察により受精卵が含まれる培地ドロップＤの領域を予め検出できれば、その後に顕微観察において高倍画像を取得する領域も限定され、観察時間全体を短縮化することが可能になる。
【００３４】
しかしながら、培地ドロップＤの色は赤色から無色透明まであり、全体観察画像（マクロ画像）を用いて、色味や輝度の濃淡から培地ドロップＤの領域を検出するのは容易ではない。そこで、本実施形態においては、培地ドロップＤのレンズ効果と偏射照明法を利用して、培地ドロップＤの周辺部に明暗差をつけた全体観察画像を撮像取得し、例えば図６に示すように、４種類の照明方向でそれぞれ撮像取得した４枚の全体観察画像Ｇ１，Ｇ２，Ｇ３，Ｇ４を重ね合わせて全体観察画像の合成画像ＧＸを生成するとともに、生成した合成画像ＧＸから培養容器１０中における培地ドロップＤの領域を特定（識別）する。このように、複数の照明方向でそれぞれ撮像取得した全体観察画像Ｇ１，Ｇ２，Ｇ３，Ｇ４の合成画像ＧＸを用いるようにすれば、培地ドロップＤの周辺部全体に明暗差がつくため、色情報に依らずに、培地ドロップＤの領域を精度よく識別することができる。なお、図６に示す４枚の全体観察画像Ｇ１，Ｇ２，Ｇ３，Ｇ４はそれぞれ、培養容器１０に対する照明方向をマクロ観察系５４の光軸中心に４５度ずつ回転変位させて撮像取得した画像である。
【００３５】
合成画像ＧＸを用いた培地ドロップＤの領域の検出（識別）は、培地ドロップＤが一般に円形状に形成されるという特徴を利用して、所定の画像処理方法により行われる。例えば、合成画像ＧＸに対して公知の微分処理を行って微分画像を生成し、当該微分画像からハフ変換により円の検出を行うことで、培地ドロップＤの領域を検出（識別）することができる。また例えば、微分画像の全点について極座標のθ方向に積分を行って、所定の半径範囲でピークを示す点を抽出ことにより、円形状の抽出を行うことで、培地ドロップＤの領域を検出（識別）するようにしてもよい。また例えば、いわゆるレベルセット法（動的輪郭法）を用いて、微分画像から円形状の抽出を行うことで、培地ドロップＤの領域を検出（識別）するようにしてもよい。なおこのとき、画像に写し込まれる培地ドロップＤ（例えば、２０μｌ程度の直径約７ｍｍ）の像の大きさは、画像取得条件（観察倍率等）によりほぼ決まっていることから、培地ドロップＤの候補となり得るオブジェクト（抽出した円形状の輪郭に囲まれた領域）の面積を公知の画像処理手法により算出し、面積による判別基準として定めた設定範囲（上限値及び下限値）から逸脱しているものを除外する。
【００３６】
培地ドロップＤの領域を検出（識別）するための画像処理は、培養観察システムＢＳの画像処理装置１００において実行される。図７に示すように、画像処理装置１００は、撮像装置５４ｃにより観察対象の培養容器１０が撮影された全体観察画像（マクロ画像）を取得して記憶する画像記憶部１１０と、画像記憶部１１０に保存されている複数の照明方向で撮像取得された全体観察画像をそれぞれ重ね合わせて合成画像を生成する画像合成部１２０と、画像合成部１２０により生成された合成画像に基づいて培地ドロップＤを検出する画像解析部１３０と、画像合成部１２０により生成された合成画像や画像解析部１３０により解析された判断結果を外部に出力する出力部１４０とを備え、画像合成部１２０及び画像解析部１３０により判断された培地ドロップＤの画像や検出結果を、例えば表示パネル７２に出力して表示させるように構成される。画像処理装置１００は、ＲＯＭ６２に予め設定記憶された画像処理プログラムがＣＰＵ６１に読み込まれ、ＣＰＵ６１によって画像処理プログラムに基づく処理が順次実行されることによって構成される。
【００３７】
以上のように構成される培養観察システムＢＳを用いた培養容器１０内の観察方法について、図１に示すフローチャートを参照しながら説明する。前述したように、培養観察システムＢＳでは、観察プログラムにおいて設定された観察条件に従って、所定時間ごとに指定された培養容器１０内の観察が行われる。具体的には、ＣＰＵ６１は搬送ユニット４の各ステージを作動させてストッカー３から観察対象の培養容器１０を観察ユニット５に搬送（本実施形態ではマクロ観察系５４の光軸上に配置）し、撮像装置５４ｃによりマクロ画像を撮影させる。
【００３８】
このときまず、ＣＰＵ６１は、第１照明部５１を作動させてマクロ観察系５４の光軸に対して傾斜した照明方向から培養容器１０を照明し（ステップＳ１）、マクロ観察系５４の撮像装置５４ｃを作動させて培養容器１０の全体観察像を撮像する（ステップＳ２）。ここで、ＣＰＵ６１は、予め設定された全ての照明方向について培養容器１０の全体観察像を撮像したか否か判定する（ステップＳ３）。このステップＳ３において判定がＮＯの場合、ステップＳ４へ進み、ＣＰＵ６１は、発光装置５１ｂの発光位置を変えて、培養容器１０に対する照明方向をマクロ観察系５４の光軸中心に回転変位させてから、ステップＳ１〜Ｓ２までの処理を繰り返す。またこのとき、画像処理装置１００は、撮像装置５４ｃにより撮像された全体観察画像（マクロ画像）をステップＳ２において取得し、この取得した画像を、培養容器１０のコード番号や観察位置、観察時刻などのインデックス・データとともに画像記憶部１１０に保存する。
【００３９】
一方、ステップＳ３において判定がＹＥＳの場合、ステップＳ５へ進み、画像合成部１２０は、画像記憶部１１０に保存されている複数の照明方向で撮像取得された全体観察画像をそれぞれ重ね合わせて、（培養容器１０についての）全体観察画像の合成画像を生成する。なおこのとき、出力部１４０によって、画像合成部１２０で生成された全体観察画像（バードビュー画像）の合成画像等が操作盤７の表示パネル７２等に表示される。
【００４０】
そして、ステップＳ６において、画像解析部１３０は、画像合成部１２０により生成された合成画像から、前述した円検出の手法を用いて、ディッシュ１１内における培地ドロップＤの領域を検出（識別）する。なおこのとき、画像解析部１３０により検出された培地ドロップＤの領域を示す検出結果が出力部１４０から出力される。
【００４１】
出力部１４０から出力された検出結果は、操作盤７の表示パネル７２に表示され、合成画像もしくは全体観察画像中に、培地ドロップＤの領域を示す輪郭を表示したり、培地ドロップＤであることを示す記号「Ｄ」を表示させたり、培地ドロップＤの輪郭を他の領域と異なる色相や輝度で表示する等が例示される。
【００４２】
なお、出力部１４０から出力される検出データを、通信部６５を介して外部接続されるコンピュータ等に送信して、同様の画像を表示させたり、培地ドロップＤの色変化（ｐＨ変化）や受精卵Ｊの生育状態を観察するための基礎データとして用いたりするように構成することができる。
【００４３】
これにより、ユーザは、表示パネル７２に表示された画像や外部接続されたコンピュータ等のモニタに表示された画像を参照することにより、培地ドロップＤを直ちに認識することができ、培地ドロップＤの領域についてのみ顕微観察系５５による顕微観察画像を取得して（背景のみの無用な撮影を回避して）、培地ドロップＤの中から目的とする受精卵Ｊを効率的に検出することができる。
【００４４】
次に、培養物たる受精卵の製造方法について図８を追加参照して概要説明する。まず、ステップＳ１１０において、受精卵（培養物）を培地ドロップＤと共に培養容器１０（ディッシュ１１）内に注入し、この培養容器１０を受精卵の培養に適した環境条件に維持された培養室２内に収納して、当該環境条件の下で受精卵を培養する。なお、この環境条件は、制御ユニット６において培養室２内の温度や湿度、二酸化炭素濃度等が受精卵の培養環境に合わせて調節される。
【００４５】
ステップＳ１２０では、培養容器１０内の受精卵観察の前段階として、前述した観察方法のステップＳ１〜Ｓ６（図１を参照）を実行して、ディッシュ１１内から培地ドロップＤの領域を識別する。次いで、ステップＳ１３０では、第２照明部５２を用いて顕微観察系５５により培地ドロップＤの顕微観察画像（例えば位相差画像）を撮影し、この観察画像に写し込まれる複数のオブジェクトの中から受精卵を識別する。このとき培養容器１０（ディッシュ１１）内において、１個の培地ドロップＤに対して受精卵が各１個（または複数個）ずつ識別される。
【００４６】
続いて、ステップＳ１４０では、培地ドロップＤごとに識別された複数の受精卵を所定の選別基準に基づいて選別する。受精卵の選別基準としては、卵割のタイミングや卵割球の形態等に基づいて受精卵のグレードが判定されて、この選別基準を満足する良好なものが選別される。例えば、良好な生育状態を経たものとして、卵内全ての卵細胞において卵割の起きたタイミングが同時期であるか否かに基づいて行われる。すなわち、正常な受精卵の卵割については、同じ世代の各細胞はほぼ同時期のタイミングで分裂し、胚内には同じ世代の細胞のみが存在する。一方、異常な受精卵の卵割については、同じ世代の細胞であっても分裂するタイミングがずれて、胚内には異なる世代の細胞が混在してしまう。
【００４７】
ステップＳ１５０では、上記選別した受精卵（胚盤胞と称される状態にまで成長した良好な受精卵）を採取して、例えばマイナス１９６℃の液体窒素の中で凍結保存する。そして、この受精卵（胚盤胞）は所定の周期のときに母体へ戻される（胚移植される）。なお、培養される受精卵は、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、マウス等の受精卵であってもよい。また、受精卵の保存は胚盤胞の状態で保存してもよいし、分割期（４細胞期胚、８細胞期胚）の状態で保存してもよい。
【００４８】
以上説明したように、本実施形態によれば、複数の照明方向でそれぞれ撮像取得した全体観察画像の合成画像を用いることで、培地ドロップＤの周辺部全体に明暗差をつけられるため、色情報に依らずに、培養容器１０（ディッシュ１１）内における培地ドロップＤの領域を精度よく識別することができる。
【００４９】
また、培養容器１０（ディッシュ１１）に対する撮像方向（すなわち、マクロ観察系５４の光軸）に対して傾斜した複数の照明方向から、培養容器１０を照明することで、培地ドロップＤのレンズ効果を利用して、培地ドロップＤの周辺部に明暗差をつけた培養容器１０の全体観察画像を撮像取得することができるため、培地ドロップＤの周辺部全体に明暗差がついた合成画像を確実に得ることができる。
【００５０】
また、合成画像に対して微分処理を行った微分画像から円の検出を行うことで、培地ドロップＤの領域を識別するようにすれば、培地ドロップＤの領域を簡便な方法で精度よく識別することができる。
【００５１】
なお、上述の実施形態において、４種類の照明方向でそれぞれ撮像取得した４枚の全体観察画像Ｇ１，Ｇ２，Ｇ３，Ｇ４を重ね合わせて全体観察画像の合成画像ＧＸを生成しているが、これに限られるものではなく、例えば、８種類の照明方向でそれぞれ撮像取得した８枚の全体観察画像を重ね合わせて合成画像を生成してもよく、複数の照明方向でそれぞれ撮像取得した複数の全体観察画像を重ね合わせて合成画像を生成すればよい。さらには、積分時間内に照明方向を連続的に変化させた全体観察画像を用いてもよい。
【００５２】
また、上述の実施形態において、第１照明部５１は、発光装置５１ｂの発光位置を変えて、培養容器１０に対する照明方向をマクロ観察系５４の光軸中心に回転変位させることで、培養容器１０を複数の照明方向から照明可能に構成されているが、これに限られるものではない。例えば、図５の二点鎖線で示すように、リング照明装置５１ａに、複数の発光装置５１ｂのうち一部からの光だけを通過させるようなシャッター部材５１ｃを設け、当該シャッター部材５１ｃをマクロ観察系５４の光軸中心に回転変位させることで、照明方向を変えるような構成であってもよい。また、発光装置５１ｂの発光位置を変えて、培養容器１０に対する照明方向をマクロ観察系５４の光軸中心に回転変位させる構成では、培養容器１０やマクロ観察系５４等を回転させる必要がないので、位置合わせをせずに全体観察画像を重ね合わせることが可能であるが、画像の回転補正及びパースペクティブ補正を行えば、マクロ観察系５４を光軸中心に回転させる構成であってもよい。
【００５３】
また、上述の実施形態において、複数の全体観察画像を重ね合わせて合成画像を生成してから微分画像を生成しているが、これに限られるものではなく、画像合成前の全体観察画像に対してそれぞれ微分処理を行ってから、これらを重ね合わせて微分画像の合成画像を生成するようにしてもよい。さらには、照明方向を回転させる間に積算した画像を用いてもよい。
【符号の説明】
【００５４】
ＢＳ 培養観察システム ＧＸ 合成画像
Ｄ 培地ドロップ Ｊ 受精卵
５ 観察ユニット
６ 制御ユニット ７ 操作盤
１０ 培養容器 １１ ディッシュ
５１ 第１照明部 ５１ａ リング照明装置
５１ｂ 発光装置 ５１ｃ シャッター部材
５４ マクロ観察系 ５４ｃ 撮像装置
６１ ＣＰＵ ６２ ＲＯＭ
６３ ＲＡＭ
１００ 画像処理装置 １２０ 画像合成部
１３０ 画像解析部 １４０ 出力部
【特許請求の範囲】
【請求項１】
内部に培養物の培養に用いられる培地を有した培養容器を複数の照明方向から照明可能な照明部と、
前記照明部に照明された前記培養容器を前記複数の照明方向についてそれぞれ撮像する撮像部と、
前記撮像部にそれぞれ撮像された前記複数の照明方向についての前記培養容器の画像を重ね合わせて前記培養容器の合成画像を生成する画像合成部と、
前記画像合成部に生成された前記合成画像から前記培養容器中における前記培地を識別する画像解析部とを備えて構成されることを特徴とする培養物の観察装置。
【請求項２】
前記照明部は、前記撮像部の光軸に対して傾斜した照明方向から前記培養容器を照明するとともに、前記撮像部の光軸中心に前記照明方向を回転変位させることで、前記複数の照明方向から照明可能であることを特徴とする請求項１に記載の培養物の観察装置。
【請求項３】
前記画像解析部は、前記合成画像に対して微分処理を行った微分画像から円の検出を行うことで、前記培養容器中における前記培地を識別することを特徴とする請求項１または２に記載の培養物の観察装置。
【請求項４】
内部に培養物の培養に用いられる培地を有した培養容器を複数の照明方向から照明し、
前記照明された前記培養容器を前記複数の照明方向についてそれぞれ撮像し、
前記撮像された前記複数の照明方向についての前記培養容器の画像を重ね合わせて前記培養容器の合成画像を生成し、
前記生成された前記合成画像から前記培養容器中における前記培地を識別することを特徴とする培養物の観察方法。
【請求項５】
前記培養容器に対する撮像方向に対して傾斜した前記複数の照明方向から、前記培養容器を照明することを特徴とする請求項４に記載の培養物の観察方法。
【請求項６】
前記合成画像に対して微分処理を行った微分画像から円の検出を行うことで、前記培養容器中における前記培地を識別することを特徴とする請求項４または５に記載の培養物の観察方法。
【請求項７】
所定の環境条件で培養物を培養し、
内部に前記培養物が培養される培地を有した培養容器中から、請求項１から３のいずれか一項に記載の観察装置を用いて前記培地を識別することを特徴とする培養物の製造方法。
【請求項８】
所定の環境条件で培養物を培養し、
内部に前記培養物が培養される培地を有した培養容器を複数の照明方向から照明し、
前記照明された前記培養容器を前記複数の照明方向についてそれぞれ撮像し、
前記撮像された前記複数の照明方向についての前記培養容器の画像を重ね合わせて前記培養容器の合成画像を生成し、
前記生成された前記合成画像から前記培養容器中における前記培地を識別することを特徴とする培養物の製造方法。
【請求項９】
前記識別された培地に含まれる培養物を所定の選別基準に基づいて選別し、
前記選別された培養物を前記培養容器中から採取して保存することを特徴とする請求項７または８に記載の培養物の製造方法。
【請求項１】
内部に培養物の培養に用いられる培地を有した培養容器を複数の照明方向から照明可能な照明部と、
前記照明部に照明された前記培養容器を前記複数の照明方向についてそれぞれ撮像する撮像部と、
前記撮像部にそれぞれ撮像された前記複数の照明方向についての前記培養容器の画像を重ね合わせて前記培養容器の合成画像を生成する画像合成部と、
前記画像合成部に生成された前記合成画像から前記培養容器中における前記培地を識別する画像解析部とを備えて構成されることを特徴とする培養物の観察装置。
【請求項２】
前記照明部は、前記撮像部の光軸に対して傾斜した照明方向から前記培養容器を照明するとともに、前記撮像部の光軸中心に前記照明方向を回転変位させることで、前記複数の照明方向から照明可能であることを特徴とする請求項１に記載の培養物の観察装置。
【請求項３】
前記画像解析部は、前記合成画像に対して微分処理を行った微分画像から円の検出を行うことで、前記培養容器中における前記培地を識別することを特徴とする請求項１または２に記載の培養物の観察装置。
【請求項４】
内部に培養物の培養に用いられる培地を有した培養容器を複数の照明方向から照明し、
前記照明された前記培養容器を前記複数の照明方向についてそれぞれ撮像し、
前記撮像された前記複数の照明方向についての前記培養容器の画像を重ね合わせて前記培養容器の合成画像を生成し、
前記生成された前記合成画像から前記培養容器中における前記培地を識別することを特徴とする培養物の観察方法。
【請求項５】
前記培養容器に対する撮像方向に対して傾斜した前記複数の照明方向から、前記培養容器を照明することを特徴とする請求項４に記載の培養物の観察方法。
【請求項６】
前記合成画像に対して微分処理を行った微分画像から円の検出を行うことで、前記培養容器中における前記培地を識別することを特徴とする請求項４または５に記載の培養物の観察方法。
【請求項７】
所定の環境条件で培養物を培養し、
内部に前記培養物が培養される培地を有した培養容器中から、請求項１から３のいずれか一項に記載の観察装置を用いて前記培地を識別することを特徴とする培養物の製造方法。
【請求項８】
所定の環境条件で培養物を培養し、
内部に前記培養物が培養される培地を有した培養容器を複数の照明方向から照明し、
前記照明された前記培養容器を前記複数の照明方向についてそれぞれ撮像し、
前記撮像された前記複数の照明方向についての前記培養容器の画像を重ね合わせて前記培養容器の合成画像を生成し、
前記生成された前記合成画像から前記培養容器中における前記培地を識別することを特徴とする培養物の製造方法。
【請求項９】
前記識別された培地に含まれる培養物を所定の選別基準に基づいて選別し、
前記選別された培養物を前記培養容器中から採取して保存することを特徴とする請求項７または８に記載の培養物の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図７】
【図８】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図７】
【図８】
【図６】
【公開番号】特開２０１２−３９９３１（Ｐ２０１２−３９９３１Ａ）
【公開日】平成２４年３月１日（２０１２．３．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１８３６６５（Ｐ２０１０−１８３６６５）
【出願日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【出願人】（０００００４１１２）株式会社ニコン (12,601)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月１日（２０１２．３．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【出願人】（０００００４１１２）株式会社ニコン (12,601)
【Ｆターム（参考）】
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