角化促進剤、フィラグリン産生促進剤、ロリクリン産生促進剤、ＰＡＤＩ−１産生促進剤、ヒスチダーゼ産生促進剤
【課題】
本発明の目的は、皮膚の角化を促進し、皮膚の水分を維持し、シワの形成、肌理の不正常、荒れ肌等の皮膚のトラブルを改善する組成物に関する。さらにはフィラグリン、ロリクリン、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ−１（ＰＡＤＩ−１）、ヒスチダーゼ等の産生を促進し、角化を促進して美しい皮膚を保つ製剤を得ることにある。
【解決手段】
真珠および／または貝殻に含まれる水不溶性タンパク質の酵素分解物を有効成分とする角化促進剤、フィラグリン産生促進剤、ロリクリン産生促進剤、ＰＡＤＩ−１産生促進剤及びヒスチダーゼ産生促進剤
本発明の目的は、皮膚の角化を促進し、皮膚の水分を維持し、シワの形成、肌理の不正常、荒れ肌等の皮膚のトラブルを改善する組成物に関する。さらにはフィラグリン、ロリクリン、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ−１（ＰＡＤＩ−１）、ヒスチダーゼ等の産生を促進し、角化を促進して美しい皮膚を保つ製剤を得ることにある。
【解決手段】
真珠および／または貝殻に含まれる水不溶性タンパク質の酵素分解物を有効成分とする角化促進剤、フィラグリン産生促進剤、ロリクリン産生促進剤、ＰＡＤＩ−１産生促進剤及びヒスチダーゼ産生促進剤
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚の角化を促進し、皮膚の水分を維持し、シワの形成、肌理の不正常、荒れ肌等の皮膚のトラブルを改善する組成物に関する。さらにはフィラグリン(Filaggrin)、ロリクリン(Loricrin)、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ−１（ＰＡＤＩ−１）、ヒスチダーゼ(Histidase)等の産生を促進し、角化を促進して美しい皮膚を保つ製剤を得ることである。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は体の最も外側に存在しており、細菌などの外界からの刺激に対するバリアとしての役割を有している。皮膚においては、表皮細胞が基底細胞から有棘細胞、顆粒細胞、さらには角層細胞へと約４週間かけて角化し、これらの細胞中で細胞間脂質やＮＭＦ（天然保湿因子）、さらにはコーニファイドエンベローブを形成することによってバリア機能を成し遂げている。
皮膚の加齢や外部環境の変化への不完全な角層の対応によって、シワの形成、肌理の不正常、荒れ肌等が起こるが、角層水分量の低下が重要な因子になっている。
角質の水分保持には天然保湿因子が関わっているがこの天然保湿因子の多くの部分がタンパク質の分解によって生じたアミノ酸が関わっている。
この天然保湿成分の主成分であるアミノ酸は、ケラトヒアリン顆粒に由来するフィラグリンが角質層内で分解することによって産生する。このフィラグリンは、表皮ケラチノサイトにおいてプロフィラグリンとして発現し、直ちにリン酸化し、ケラトヒアリン顆粒に蓄積する。その後脱リン酸、加水分解を経てフィラグリンへと分解され、角質層へと移行し、ケラチンフィラメントの凝集効率を高め、角質細胞の内部構築に関与する。近年、このフィラグリンが皮膚の水分保持に非常に重要かつ必要不可欠であること、及び乾燥などの条件によりフィラグリンの合成力が低下し、角質層におけるアミノ酸量が低下することが明らかになっている。
表皮細胞の角化過程において表皮顆粒層に存在するケラトヒアリン顆粒で産生されるプロフィラグリンが角化する時に、脱リン酸化とプロテアーゼの作用で分解され、フィラグリンというタンパク質を遊離し、そのフィラグリンのアルギニン残基がペプチジルアルギニンデイミナーゼという酵素によってシトルリン残基になる等の修飾を受けて、フィラグリンが徐々にケラチン繊維の間からはずれ、分解されてＮＭＦ成分が作り出される。
また、フィラグリンの分解によって生じたヒスチジンからヒスチダーゼの作用によってtrans-ウロカニン酸が産生され、紫外線から皮膚を守る。
このようにフィラグリン、ペプチジルアルギニンデイミナーゼやヒスチダーゼの合成促進が角質の水分保持や紫外線からの防御機能に重要な役割を果たしている。
また、ロリクリンは周辺帯(cornified cell envelope)の主要成分でありその発現はケラトヒアリン顆粒より始まり次第に周辺帯に組み込まれていく、周辺帯の構成タンパク質の重要な１つであり、天然保湿因子の形成をはじめ種々の角層機能に関わり、シワの形成、肌理の不正常、荒れ肌等の発生を抑制する。
これらの産生を促進する物質はいくつか知られているが、充分に満足するものは得られていなかった。（特許文献１〜３）
【０００３】
真珠および／または貝殻に含まれる水不溶性タンパク質の利用に関しては、化粧品原料に利用され、また、加水分解しても利用されている。加水分解は保湿作用、細胞賦活作用等が知られている。（特許文献４〜６）
【０００４】
【特許文献１】特開平２００１−２８８１１３号公報
【特許文献２】特開２００３−１４６８８６号公報
【特許文献３】特開２００６−２４１０９５号公報
【特許文献４】特開昭６１−６４７６７号公報
【特許文献５】特開昭６２−２９８５０７号公報
【特許文献６】特開平０２−７６５９７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は皮膚の水分を維持し、シワの形成、肌理の不正常、荒れ肌等の皮膚のトラブルを改善する組成物さらにはフィラグリン、ロリクリン、ＰＡＤＩ−１、ヒスチダーゼ等の産生を促進し、角化を促進して美しい皮膚を保つ製剤を得ることである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らが鋭意検討した結果、真珠および／または貝殻に含まれる水不溶性タンパク質の酵素分解物が上記目的を達することがわかった。
真珠は、貝の体内で生成される生体鉱物であり、真珠層を形成する。
貝殻は、軟体動物や腕足動物などが外套膜の外面に分泌する硬組織で、代表的な生体鉱物のひとつである。（貝殻を作る動物を貝という）
ここで利用する貝殻は真珠層を形成するアコヤ貝、アワビ、白蝶貝、黒蝶貝、マべ貝、イケチョウ貝等が例示される。真珠は上記の真珠層を形成する貝に生成される物質である。
真珠や貝殻の中でアコヤ貝由来のものが広く養殖され入手も容易であるので利用価値が高いが特に限定されるわけではなく、これらの１種あるいは混合して用いる。
また、真珠は装飾用ではないので外観上の美しさのない、装飾品としては不適なものを用いればよい。
【０００７】
貝殻を用いる場合は、触手動物であるコケムシ類（フサコケムシ、チゴケムシ、コブコケムシ等）、環形動物である多毛類（カサネカンザシ、ウズマキゴカイ等）、脊索動物であるホヤ類（シロボヤ、エボヤ、ユウレイボヤ、ネンエキボヤ、シロウスボヤ等）、海藻類（フクロノリ、カゴメノリ、アオサ等）等々多種多様の生物や土等が付着しているのでこれらを取り除く。方法はカナブラシ等で擦り落とす方法もあるが、研磨石等と一緒に回転等の動きを加え、付着物を取り除く。
さらに用途等によっては真珠層のみにした方が効果が高い場合もあり稜柱層を取り除く場合もある。
稜柱層を取り除く方法としては、研磨石等と一緒に回転等の動きを加える方法やグランダー等で削り取る方法を用いる。
【０００８】
上記のように処理した、真珠および／または貝殻を脱灰する。脱灰は塩酸、蟻酸、硫酸、硝酸、乳酸、クエン酸、リンゴ酸、ＥＤＴＡ等の無機酸、有機酸、キレート剤等を用いてカルシウムを除くが、これは真珠や貝殻のままでは水不溶性タンパク質を酵素に反応させても反応速度が非常に遅く、実用的でない。このため、完全に脱灰する必要もなく、粉砕等酵素との接触が多くなる方法と併用することも可能である。
その後、不溶性物質を集める。遠心分離、ろ過等の方法で不溶性物質を得るが、用途によっては多少、水可溶性物質が残存してもよい。用途などによっては、水可溶性物質をほぼ完全に除いた方がよい場合があり、この場合は再度水を加え撹拌、必要によっては加温し、再度不溶性物質を集める。これを必要に応じて繰り返す。
【０００９】
酵素はタンパク分解酵素から選択されるが、パンクレアチン、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、カテプシン、パパイン、プロメライン、フィシンおよび細菌酵母、カビ由来のプロテアーゼ等が挙げられ、これらを１種以上選択して用いる。
酵素の量、反応時間や温度は、用いる酵素の種類、真珠および／または貝殻の状態等によって大きく異なるが、通常、酵素の量は、分解するタンパク質の０．００１〜１％、反応温度は室温〜７０℃、反応時間は３０分〜１か月程度が好ましい。
酵素反応後、加熱等によって酵素を失活させ、不溶物を、遠心分離やろ過等の方法で取り除く。
なお、真珠および／または貝殻に含まれる水不溶性タンパク質は酵素反応が起こりにくいので、酵素分解前にミキサーやコロイドミル等で微細な粉末にしておく方がよい。
【００１０】
本発明の皮膚角化促進剤は、経口、注射、外用のいずれでも薬効を発現するが、皮膚外用剤として用いるのが好ましい。皮膚外用剤には、皮膚化粧料、外用医薬部外品、医療用皮膚外用剤が含まれる。
【００１１】
また、本発明の皮膚角化促進剤には、上記成分の他に医薬品や化粧品の各種製剤において使用されている界面活性剤、油性成分、保湿剤、高分子化合物、紫外線吸収剤、抗炎症剤、殺菌剤、酸化防止剤、金属イオン封鎖剤、防腐剤、ビタミン類、色素、香料、水等を配合することができる。
【００１２】
上記界面活性剤としては、アニオン性、カチオン性、非イオン性、天然、合成のいずれの界面活性剤も使用できるが、皮膚に対する刺激性を考慮すると非イオン性のものを使用することが好ましい。非イオン性界面活性剤としては、例えばグリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、アルキルグリコシド等が挙げられる。
【００１３】
油性成分としては、油脂類、ロウ類、炭化水素類、高級脂肪酸類、高級アルコール類、エステル類、精油類、シリコーン油類などを挙げることができる。油脂類としては、例えば大豆油、ヌカ油、ホホバ油、アボガド油、アーモンド油、オリーブ油、カカオ油、ゴマ油、パーシック油、ヒマシ油、ヤシ油、ミンク油、牛脂、豚脂等の天然油脂、これらの天然油脂を水素添加して得られる硬化油及びミリスチン酸グリセリド、２−エチルヘキサン酸トリグリセリド等の合成トリグリセリド等が；ロウ類としては、例えばカルナバロウ、鯨ロウ、ミツロウ、ラノリン等が；炭化水素類としては、例えば流動パラフィン、ワセリン、パラフィンマイクロクリスタリンワックス、セレシン、スクワラン、ブリスタン等が；高級脂肪酸類としては、例えばラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘニン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ラノリン酸、イソステアリン酸等が；高級アルコール類としては、例えばラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、ラノリンアルコール、コレステロール、２−ヘキシルデカノール等が；エステル類としては、例えばオクタン酸セチル、オクタン酸トリグリセライド、乳酸ミリスチル、乳酸セチル、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸ミリスチル、ミリスチン酸オクチルドデシル、パルミチン酸イソプロピル、アジピン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、オレイン酸デシル、イソステアリン酸コレステロール、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル等が；精油類としては、例えばハッカ油、ジャスミン油、ショウ脳油、ヒノキ油、トウヒ油、リュウ油、テレピン油、ケイ皮油、ベルガモット油、ミカン油、ショウブ油、パイン油、ラベンダー油、ベイ油、クローブ油、ヒバ油、バラ油、ユーカリ油、レモン油、タイム油、ペパーミント油、ローズ油、セージ油、メントール、シネオール、オイゲノール、シトラール、シトロネラール、ボルネオール、リナロール、ゲラニオール、カンファー、チモール、スピラントール、ピネン、リモネン、テルペン系化合物等が；シリコーン油類としては、例えばジメチルポリシロキサン等が挙げられる。これら上述の油性成分は一種又は二種以上を組み合わせて使用することができる。本発明においては、このうち特にミリスチン酸グリセリド、２−エチルヘキサン酸トリグリセリド、ラノリン、流動パラフィン、ワセリン、パラフィンマイクロクリスタリンワックス、スクワラン、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、イソステアリン酸、セチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、コレステロール、オクタン酸セチル、オクタン酸トリグリセライド、ミリスチレン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルドデシル、イソステアリン酸コレステロール、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル、ハッカ油、トウヒ油、ケイ皮油、ローズ油、メントール、シネオール、オイゲノール、シトラール、シトロネラール、ゲラニオール、ピネン、リモネン、ジメチルポリシロキサンを使用することが好ましい。
【００１４】
本発明の皮膚角化促進剤には、さらに下記のような成分を配合することができるが、その成分もこれらに限定されるものではない。
（ａ）色素類；黄色４号、青色１号、黄色２０２号等の厚生省令に定められたタール色素別表Ｉ及びIIの色素、クロロフィル、リボフラビン、クロシン、紅花、アントラキノン等の食品添加物として認められている天然色素等。
（ｂ）ビタミン類；ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ等。
（ｃ）その他；殺菌剤、防腐剤、その他製剤上必要な成分等。
【００１５】
本発明の皮膚角化促進剤は、前記必須成分に必要に応じて前記任意成分を加え、常法に従って製造することができ、クリーム、乳液、化粧水等の形態とすることができる。
【００１６】
本発明の皮膚角化促進剤中には、真珠および／または貝殻に含まれる水不溶性タンパク質の酵素分解物を成分1日投与量（乾燥物換算）として０．０１μｇ〜１ｇ、特に０．１μｇ〜１０mg配合するのが好ましい。また、本発明の皮膚角化促進剤中に、真珠および／または貝殻に含まれる水不溶性タンパク質の酵素分解物は乾燥物換算で１μｇ〜１ｇ／１００ｇ、特に５μｇ〜１００mｇ／１００ｇ含有するのが好ましい。
【実施例】
【００１７】
次に実施例（製造例）を挙げて本発明を詳細に説明する。
【００１８】
製造例
貝肉、付着生物等をブラシで取り除いたアコヤ貝の貝殻（１００メッシュパスになるまで粉砕品）１０．０kgに水５０kgを加え、塩酸２０kgを撹拌しながら徐々に加えた。
ときどき撹拌しながら、３日間放置した。塩酸１kgをを撹拌しながら徐々に加えた。
ときどき撹拌しながら、２日間放置した。これに水を７０kgを撹拌しながら加えた後、遠心分離（日立社製、ＳＣＲ２０Ｂ連続式ローター13000rpm流量２００ml／min）で残渣を回収した。
残渣に水を３０kgを撹拌しながら加えた後、遠心分離（連続式ローター13000rpm流量２００ml／min）で残渣を回収した。
この操作を３回繰り返した。
この残渣に水２kgを加えて撹拌して撹拌し、コロイドミル（特殊機化社製マイコロイダーL型）砥石間隔１０ミクロンで４回粉砕した。
この液に過酸化水素水（１０％）を１．５kg加え、４０℃で２２時間放置した。この液を遠心分離（13000rpm、５min）した。
残渣に水２００gを加えよく撹拌した後、遠心分離（13000rpm、５min）した。
この操作を３回繰り返した後、これを凍結乾燥した。
これを２０ｇを水５kgに分散させた。水浴上で５０℃に保ちながら、４時間撹拌した後、ｐＨを８．４に５％ＮａＯＨで調整した後、トリプシン（和光純薬社製、ブタ膵臓由来トリプシン）を５０mｇ加え撹拌しつつ５０℃に保ちつつ２４時間反応させた。
この液のｐＨを７．３に５％ＮａＯＨで調整した後、遠心分離（5000rpm、１０min）した。
上澄みを沸騰水浴で２時間加温した後、３時間放冷した。
ろ過した後、エバポレーターで濃縮した後に凍結乾燥した。
【００１９】
確認試験
２継代目の人包皮由来ケラチノサイトを６ウェルのプレート１ウェルあたり１．０×１０5個播種し、５０〜７０％コンフルエントになるまで培養（３７℃、９５％Ａｉｒ、５％ＣＯ2）した。前日にＣａ濃度を１．８ｍＭに変更し、検体を加えて、４８時間培養する。その後、上清を捨てて、細胞を完全に溶解する。全ＲＮＡを抽出し、ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを作成し、定量リアルタイムＰＣＲを用いてフィラグリン、ロリクリン、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ−１及びヒスチダーゼの遺伝子発現量を検出した。
【００２０】
結果を図１に示す。その結果、製造例（真珠および／または貝殻に含まれる水不溶性タンパク質の酵素分解物）は、フィラグリン、ロリクリン、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ−１（ＰＡＤＩ−１）、ヒスチダーゼの遺伝子発現量を０．１％添加で無添加に比較して１０倍〜５０倍程度増加させることが明らかとなった。
フィラグリンに対する特異抗体を用いたウエスタンブロットの結果（図２に示す）、タンパク質レベルでも明らかな増加が認められた。
また、本確認実験終了後に人包皮由来ケラチノサイトをヘマトキシリン染色を行ったところ、無添加に比較してヘマトキシリンに染まる不定形物が多く見られ、ケラトヒアリン顆粒の増加が示唆された。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】製造例（真珠および／または貝殻に含まれる水不溶性タンパク質の酵素分解物）によるフィラグリン、ロリクリン、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ−１（ＰＡＤＩ−１）、ヒスチダーゼの遺伝子発現量変化を示す図である。 縦軸は製造例を添加していない場合の遺伝子発現量を１としてときの遺伝子発現量である。
【図２】フィラグリンに対する特異抗体を用いたウエスタンブロットの結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚の角化を促進し、皮膚の水分を維持し、シワの形成、肌理の不正常、荒れ肌等の皮膚のトラブルを改善する組成物に関する。さらにはフィラグリン(Filaggrin)、ロリクリン(Loricrin)、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ−１（ＰＡＤＩ−１）、ヒスチダーゼ(Histidase)等の産生を促進し、角化を促進して美しい皮膚を保つ製剤を得ることである。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は体の最も外側に存在しており、細菌などの外界からの刺激に対するバリアとしての役割を有している。皮膚においては、表皮細胞が基底細胞から有棘細胞、顆粒細胞、さらには角層細胞へと約４週間かけて角化し、これらの細胞中で細胞間脂質やＮＭＦ（天然保湿因子）、さらにはコーニファイドエンベローブを形成することによってバリア機能を成し遂げている。
皮膚の加齢や外部環境の変化への不完全な角層の対応によって、シワの形成、肌理の不正常、荒れ肌等が起こるが、角層水分量の低下が重要な因子になっている。
角質の水分保持には天然保湿因子が関わっているがこの天然保湿因子の多くの部分がタンパク質の分解によって生じたアミノ酸が関わっている。
この天然保湿成分の主成分であるアミノ酸は、ケラトヒアリン顆粒に由来するフィラグリンが角質層内で分解することによって産生する。このフィラグリンは、表皮ケラチノサイトにおいてプロフィラグリンとして発現し、直ちにリン酸化し、ケラトヒアリン顆粒に蓄積する。その後脱リン酸、加水分解を経てフィラグリンへと分解され、角質層へと移行し、ケラチンフィラメントの凝集効率を高め、角質細胞の内部構築に関与する。近年、このフィラグリンが皮膚の水分保持に非常に重要かつ必要不可欠であること、及び乾燥などの条件によりフィラグリンの合成力が低下し、角質層におけるアミノ酸量が低下することが明らかになっている。
表皮細胞の角化過程において表皮顆粒層に存在するケラトヒアリン顆粒で産生されるプロフィラグリンが角化する時に、脱リン酸化とプロテアーゼの作用で分解され、フィラグリンというタンパク質を遊離し、そのフィラグリンのアルギニン残基がペプチジルアルギニンデイミナーゼという酵素によってシトルリン残基になる等の修飾を受けて、フィラグリンが徐々にケラチン繊維の間からはずれ、分解されてＮＭＦ成分が作り出される。
また、フィラグリンの分解によって生じたヒスチジンからヒスチダーゼの作用によってtrans-ウロカニン酸が産生され、紫外線から皮膚を守る。
このようにフィラグリン、ペプチジルアルギニンデイミナーゼやヒスチダーゼの合成促進が角質の水分保持や紫外線からの防御機能に重要な役割を果たしている。
また、ロリクリンは周辺帯(cornified cell envelope)の主要成分でありその発現はケラトヒアリン顆粒より始まり次第に周辺帯に組み込まれていく、周辺帯の構成タンパク質の重要な１つであり、天然保湿因子の形成をはじめ種々の角層機能に関わり、シワの形成、肌理の不正常、荒れ肌等の発生を抑制する。
これらの産生を促進する物質はいくつか知られているが、充分に満足するものは得られていなかった。（特許文献１〜３）
【０００３】
真珠および／または貝殻に含まれる水不溶性タンパク質の利用に関しては、化粧品原料に利用され、また、加水分解しても利用されている。加水分解は保湿作用、細胞賦活作用等が知られている。（特許文献４〜６）
【０００４】
【特許文献１】特開平２００１−２８８１１３号公報
【特許文献２】特開２００３−１４６８８６号公報
【特許文献３】特開２００６−２４１０９５号公報
【特許文献４】特開昭６１−６４７６７号公報
【特許文献５】特開昭６２−２９８５０７号公報
【特許文献６】特開平０２−７６５９７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は皮膚の水分を維持し、シワの形成、肌理の不正常、荒れ肌等の皮膚のトラブルを改善する組成物さらにはフィラグリン、ロリクリン、ＰＡＤＩ−１、ヒスチダーゼ等の産生を促進し、角化を促進して美しい皮膚を保つ製剤を得ることである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らが鋭意検討した結果、真珠および／または貝殻に含まれる水不溶性タンパク質の酵素分解物が上記目的を達することがわかった。
真珠は、貝の体内で生成される生体鉱物であり、真珠層を形成する。
貝殻は、軟体動物や腕足動物などが外套膜の外面に分泌する硬組織で、代表的な生体鉱物のひとつである。（貝殻を作る動物を貝という）
ここで利用する貝殻は真珠層を形成するアコヤ貝、アワビ、白蝶貝、黒蝶貝、マべ貝、イケチョウ貝等が例示される。真珠は上記の真珠層を形成する貝に生成される物質である。
真珠や貝殻の中でアコヤ貝由来のものが広く養殖され入手も容易であるので利用価値が高いが特に限定されるわけではなく、これらの１種あるいは混合して用いる。
また、真珠は装飾用ではないので外観上の美しさのない、装飾品としては不適なものを用いればよい。
【０００７】
貝殻を用いる場合は、触手動物であるコケムシ類（フサコケムシ、チゴケムシ、コブコケムシ等）、環形動物である多毛類（カサネカンザシ、ウズマキゴカイ等）、脊索動物であるホヤ類（シロボヤ、エボヤ、ユウレイボヤ、ネンエキボヤ、シロウスボヤ等）、海藻類（フクロノリ、カゴメノリ、アオサ等）等々多種多様の生物や土等が付着しているのでこれらを取り除く。方法はカナブラシ等で擦り落とす方法もあるが、研磨石等と一緒に回転等の動きを加え、付着物を取り除く。
さらに用途等によっては真珠層のみにした方が効果が高い場合もあり稜柱層を取り除く場合もある。
稜柱層を取り除く方法としては、研磨石等と一緒に回転等の動きを加える方法やグランダー等で削り取る方法を用いる。
【０００８】
上記のように処理した、真珠および／または貝殻を脱灰する。脱灰は塩酸、蟻酸、硫酸、硝酸、乳酸、クエン酸、リンゴ酸、ＥＤＴＡ等の無機酸、有機酸、キレート剤等を用いてカルシウムを除くが、これは真珠や貝殻のままでは水不溶性タンパク質を酵素に反応させても反応速度が非常に遅く、実用的でない。このため、完全に脱灰する必要もなく、粉砕等酵素との接触が多くなる方法と併用することも可能である。
その後、不溶性物質を集める。遠心分離、ろ過等の方法で不溶性物質を得るが、用途によっては多少、水可溶性物質が残存してもよい。用途などによっては、水可溶性物質をほぼ完全に除いた方がよい場合があり、この場合は再度水を加え撹拌、必要によっては加温し、再度不溶性物質を集める。これを必要に応じて繰り返す。
【０００９】
酵素はタンパク分解酵素から選択されるが、パンクレアチン、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、カテプシン、パパイン、プロメライン、フィシンおよび細菌酵母、カビ由来のプロテアーゼ等が挙げられ、これらを１種以上選択して用いる。
酵素の量、反応時間や温度は、用いる酵素の種類、真珠および／または貝殻の状態等によって大きく異なるが、通常、酵素の量は、分解するタンパク質の０．００１〜１％、反応温度は室温〜７０℃、反応時間は３０分〜１か月程度が好ましい。
酵素反応後、加熱等によって酵素を失活させ、不溶物を、遠心分離やろ過等の方法で取り除く。
なお、真珠および／または貝殻に含まれる水不溶性タンパク質は酵素反応が起こりにくいので、酵素分解前にミキサーやコロイドミル等で微細な粉末にしておく方がよい。
【００１０】
本発明の皮膚角化促進剤は、経口、注射、外用のいずれでも薬効を発現するが、皮膚外用剤として用いるのが好ましい。皮膚外用剤には、皮膚化粧料、外用医薬部外品、医療用皮膚外用剤が含まれる。
【００１１】
また、本発明の皮膚角化促進剤には、上記成分の他に医薬品や化粧品の各種製剤において使用されている界面活性剤、油性成分、保湿剤、高分子化合物、紫外線吸収剤、抗炎症剤、殺菌剤、酸化防止剤、金属イオン封鎖剤、防腐剤、ビタミン類、色素、香料、水等を配合することができる。
【００１２】
上記界面活性剤としては、アニオン性、カチオン性、非イオン性、天然、合成のいずれの界面活性剤も使用できるが、皮膚に対する刺激性を考慮すると非イオン性のものを使用することが好ましい。非イオン性界面活性剤としては、例えばグリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、アルキルグリコシド等が挙げられる。
【００１３】
油性成分としては、油脂類、ロウ類、炭化水素類、高級脂肪酸類、高級アルコール類、エステル類、精油類、シリコーン油類などを挙げることができる。油脂類としては、例えば大豆油、ヌカ油、ホホバ油、アボガド油、アーモンド油、オリーブ油、カカオ油、ゴマ油、パーシック油、ヒマシ油、ヤシ油、ミンク油、牛脂、豚脂等の天然油脂、これらの天然油脂を水素添加して得られる硬化油及びミリスチン酸グリセリド、２−エチルヘキサン酸トリグリセリド等の合成トリグリセリド等が；ロウ類としては、例えばカルナバロウ、鯨ロウ、ミツロウ、ラノリン等が；炭化水素類としては、例えば流動パラフィン、ワセリン、パラフィンマイクロクリスタリンワックス、セレシン、スクワラン、ブリスタン等が；高級脂肪酸類としては、例えばラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘニン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ラノリン酸、イソステアリン酸等が；高級アルコール類としては、例えばラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、ラノリンアルコール、コレステロール、２−ヘキシルデカノール等が；エステル類としては、例えばオクタン酸セチル、オクタン酸トリグリセライド、乳酸ミリスチル、乳酸セチル、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸ミリスチル、ミリスチン酸オクチルドデシル、パルミチン酸イソプロピル、アジピン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、オレイン酸デシル、イソステアリン酸コレステロール、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル等が；精油類としては、例えばハッカ油、ジャスミン油、ショウ脳油、ヒノキ油、トウヒ油、リュウ油、テレピン油、ケイ皮油、ベルガモット油、ミカン油、ショウブ油、パイン油、ラベンダー油、ベイ油、クローブ油、ヒバ油、バラ油、ユーカリ油、レモン油、タイム油、ペパーミント油、ローズ油、セージ油、メントール、シネオール、オイゲノール、シトラール、シトロネラール、ボルネオール、リナロール、ゲラニオール、カンファー、チモール、スピラントール、ピネン、リモネン、テルペン系化合物等が；シリコーン油類としては、例えばジメチルポリシロキサン等が挙げられる。これら上述の油性成分は一種又は二種以上を組み合わせて使用することができる。本発明においては、このうち特にミリスチン酸グリセリド、２−エチルヘキサン酸トリグリセリド、ラノリン、流動パラフィン、ワセリン、パラフィンマイクロクリスタリンワックス、スクワラン、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、イソステアリン酸、セチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、コレステロール、オクタン酸セチル、オクタン酸トリグリセライド、ミリスチレン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルドデシル、イソステアリン酸コレステロール、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル、ハッカ油、トウヒ油、ケイ皮油、ローズ油、メントール、シネオール、オイゲノール、シトラール、シトロネラール、ゲラニオール、ピネン、リモネン、ジメチルポリシロキサンを使用することが好ましい。
【００１４】
本発明の皮膚角化促進剤には、さらに下記のような成分を配合することができるが、その成分もこれらに限定されるものではない。
（ａ）色素類；黄色４号、青色１号、黄色２０２号等の厚生省令に定められたタール色素別表Ｉ及びIIの色素、クロロフィル、リボフラビン、クロシン、紅花、アントラキノン等の食品添加物として認められている天然色素等。
（ｂ）ビタミン類；ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ等。
（ｃ）その他；殺菌剤、防腐剤、その他製剤上必要な成分等。
【００１５】
本発明の皮膚角化促進剤は、前記必須成分に必要に応じて前記任意成分を加え、常法に従って製造することができ、クリーム、乳液、化粧水等の形態とすることができる。
【００１６】
本発明の皮膚角化促進剤中には、真珠および／または貝殻に含まれる水不溶性タンパク質の酵素分解物を成分1日投与量（乾燥物換算）として０．０１μｇ〜１ｇ、特に０．１μｇ〜１０mg配合するのが好ましい。また、本発明の皮膚角化促進剤中に、真珠および／または貝殻に含まれる水不溶性タンパク質の酵素分解物は乾燥物換算で１μｇ〜１ｇ／１００ｇ、特に５μｇ〜１００mｇ／１００ｇ含有するのが好ましい。
【実施例】
【００１７】
次に実施例（製造例）を挙げて本発明を詳細に説明する。
【００１８】
製造例
貝肉、付着生物等をブラシで取り除いたアコヤ貝の貝殻（１００メッシュパスになるまで粉砕品）１０．０kgに水５０kgを加え、塩酸２０kgを撹拌しながら徐々に加えた。
ときどき撹拌しながら、３日間放置した。塩酸１kgをを撹拌しながら徐々に加えた。
ときどき撹拌しながら、２日間放置した。これに水を７０kgを撹拌しながら加えた後、遠心分離（日立社製、ＳＣＲ２０Ｂ連続式ローター13000rpm流量２００ml／min）で残渣を回収した。
残渣に水を３０kgを撹拌しながら加えた後、遠心分離（連続式ローター13000rpm流量２００ml／min）で残渣を回収した。
この操作を３回繰り返した。
この残渣に水２kgを加えて撹拌して撹拌し、コロイドミル（特殊機化社製マイコロイダーL型）砥石間隔１０ミクロンで４回粉砕した。
この液に過酸化水素水（１０％）を１．５kg加え、４０℃で２２時間放置した。この液を遠心分離（13000rpm、５min）した。
残渣に水２００gを加えよく撹拌した後、遠心分離（13000rpm、５min）した。
この操作を３回繰り返した後、これを凍結乾燥した。
これを２０ｇを水５kgに分散させた。水浴上で５０℃に保ちながら、４時間撹拌した後、ｐＨを８．４に５％ＮａＯＨで調整した後、トリプシン（和光純薬社製、ブタ膵臓由来トリプシン）を５０mｇ加え撹拌しつつ５０℃に保ちつつ２４時間反応させた。
この液のｐＨを７．３に５％ＮａＯＨで調整した後、遠心分離（5000rpm、１０min）した。
上澄みを沸騰水浴で２時間加温した後、３時間放冷した。
ろ過した後、エバポレーターで濃縮した後に凍結乾燥した。
【００１９】
確認試験
２継代目の人包皮由来ケラチノサイトを６ウェルのプレート１ウェルあたり１．０×１０5個播種し、５０〜７０％コンフルエントになるまで培養（３７℃、９５％Ａｉｒ、５％ＣＯ2）した。前日にＣａ濃度を１．８ｍＭに変更し、検体を加えて、４８時間培養する。その後、上清を捨てて、細胞を完全に溶解する。全ＲＮＡを抽出し、ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを作成し、定量リアルタイムＰＣＲを用いてフィラグリン、ロリクリン、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ−１及びヒスチダーゼの遺伝子発現量を検出した。
【００２０】
結果を図１に示す。その結果、製造例（真珠および／または貝殻に含まれる水不溶性タンパク質の酵素分解物）は、フィラグリン、ロリクリン、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ−１（ＰＡＤＩ−１）、ヒスチダーゼの遺伝子発現量を０．１％添加で無添加に比較して１０倍〜５０倍程度増加させることが明らかとなった。
フィラグリンに対する特異抗体を用いたウエスタンブロットの結果（図２に示す）、タンパク質レベルでも明らかな増加が認められた。
また、本確認実験終了後に人包皮由来ケラチノサイトをヘマトキシリン染色を行ったところ、無添加に比較してヘマトキシリンに染まる不定形物が多く見られ、ケラトヒアリン顆粒の増加が示唆された。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】製造例（真珠および／または貝殻に含まれる水不溶性タンパク質の酵素分解物）によるフィラグリン、ロリクリン、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ−１（ＰＡＤＩ−１）、ヒスチダーゼの遺伝子発現量変化を示す図である。 縦軸は製造例を添加していない場合の遺伝子発現量を１としてときの遺伝子発現量である。
【図２】フィラグリンに対する特異抗体を用いたウエスタンブロットの結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
真珠および／または貝殻に含まれる水不溶性タンパク質の酵素分解物を有効成分とする角化促進剤
【請求項２】
真珠および／または貝殻に含まれる水不溶性タンパク質の酵素分解物を有効成分とするフィラグリン産生促進剤
【請求項３】
真珠および／または貝殻に含まれる水不溶性タンパク質の酵素分解物を有効成分とするロリクリン産生促進剤
【請求項４】
真珠および／または貝殻に含まれる水不溶性タンパク質の酵素分解物を有効成分とするペプチジルアルギニンデイミナーゼ−１産生促進剤
【請求項５】
真珠および／または貝殻に含まれる水不溶性タンパク質の酵素分解物を有効成分とするヒスチダーゼ産生促進剤
【請求項６】
真珠および／または貝殻がアコヤ貝の真珠および／または貝殻である請求項１乃至請求項５の角化促進剤、フィラグリン産生促進剤、ロリクリン産生促進剤、ＰＡＤＩ−１産生促進剤、ヒスチダーゼ産生促進剤
【請求項１】
真珠および／または貝殻に含まれる水不溶性タンパク質の酵素分解物を有効成分とする角化促進剤
【請求項２】
真珠および／または貝殻に含まれる水不溶性タンパク質の酵素分解物を有効成分とするフィラグリン産生促進剤
【請求項３】
真珠および／または貝殻に含まれる水不溶性タンパク質の酵素分解物を有効成分とするロリクリン産生促進剤
【請求項４】
真珠および／または貝殻に含まれる水不溶性タンパク質の酵素分解物を有効成分とするペプチジルアルギニンデイミナーゼ−１産生促進剤
【請求項５】
真珠および／または貝殻に含まれる水不溶性タンパク質の酵素分解物を有効成分とするヒスチダーゼ産生促進剤
【請求項６】
真珠および／または貝殻がアコヤ貝の真珠および／または貝殻である請求項１乃至請求項５の角化促進剤、フィラグリン産生促進剤、ロリクリン産生促進剤、ＰＡＤＩ−１産生促進剤、ヒスチダーゼ産生促進剤
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１３−２３４３８（Ｐ２０１３−２３４３８Ａ）
【公開日】平成２５年２月４日（２０１３．２．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１５６３１７（Ｐ２０１１−１５６３１７）
【出願日】平成２３年７月１５日（２０１１．７．１５）
【出願人】（０００１６６９５９）御木本製薬株式会社 (66)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年２月４日（２０１３．２．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年７月１５日（２０１１．７．１５）
【出願人】（０００１６６９５９）御木本製薬株式会社 (66)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]