角膜潰瘍治療剤
本発明は、角膜潰瘍を効果的に治療することが可能な医薬、詳細にはトリプトライドもしくはその誘導体またはその医薬上許容しうる塩を含有する角膜潰瘍治療剤を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は角膜潰瘍治療剤に関する。より詳細には、本発明は、トリプトライドまたはその誘導体を含有する角膜潰瘍治療剤に関する。
【背景技術】
角膜は、上皮細胞、ボーマン膜、角膜実質、デスメ膜、内皮細胞からなる。角膜は正常では無血管組織であり、血管の代わりに前眼房の房水から栄養を受け取る。角膜はまた免疫系細胞も有していない。従って、角膜は他の組織に比べ、非常に特殊な組織であると言える。
角膜潰瘍は、主にコラーゲンから構成されている角膜実質（以下、単に実質と記載することもある）がコラーゲン分解酵素の活性化や過剰分泌により融解し欠損している状態である。角膜潰瘍を引き起こすコラーゲン分解酵素としては、細菌性コラゲナーゼとマトリックスメタロプロテアーゼ群（ＭＭＰｓ）が知られている。角膜に細菌などが感染すると、細菌性コラゲナーゼが分泌され、これが直接的に角膜実質のコラーゲンを分解し、角膜潰瘍を引き起こす。同時に、細菌などの微生物はその他の酵素や毒素を分泌し、これらの因子が生物学的信号となって角膜実質細胞（角膜線維芽細胞と呼ばれることもある）の活性化を引き起こし、活性化された角膜実質細胞が不活性なＭＭＰｓ（ｐｒｏＭＭＰｓ）を産生し、ｐｒｏＭＭＰｓが分泌される。さらにｐｒｏＭＭＰｓは、亢進した活性化機構および細菌性の酵素による限定分解により活性なＭＭＰｓとなりこれが角膜潰瘍を引き起こす（活性化ＭＭＰｓの活性のコントロールは、ＴＩＭＰｓ（Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ）の濃度に依存する）。実質コラーゲンの破壊により生じた細胞外環境の変化はさらに角膜実質細胞の活性化に伴うＭＭＰｓの産生・活性化または浸潤してきた炎症性細胞により分泌されるＭＭＰｓにより潰瘍を進行させるので、ここに角膜実質細胞の活性化と角膜実質の破壊の悪循環が生じる。抗生物質などで細菌が殺されると細菌性コラゲナーゼ分泌は抑制され細菌による直接的な角膜実質破壊は抑制されるが、抗生物質などは一旦細菌などから角膜実質細胞に送られた生物学的信号による角膜実質細胞の活性化を抑制することができないため、臨床的には潰瘍の進行が認められることがある。この悪循環を抑制する因子は現在のところステロイド薬だけであると考えられていた（西田輝夫ら編，「月刊眼科診療プラクティス（第７９号）角結膜疾患の薬物療法」，第１版，株式会社文光堂，２００２年１月，ｐ．９−１１）。
トリプトライドは、雷公藤（Ｔｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ ｗｉｌｆｏｒｄｉｉ）の主活性成分である。トリプトライドおよびその誘導体は免疫抑制作用を有することが知られており、自己免疫疾患治療剤や抗炎症剤としての使用が公知である（例えば、国際公開第９７／３１９２０号パンフレット、特表２００１−５０４４３７号公報、国際公開第９６／０８２６２号パンフレット、国際公開第９８／５２９５１号パンフレット、国際公開第００／１２４８３号パンフレット、国際公開第０２／２８８６２号パンフレット、国際公開第００／６３２１２号パンフレット、国際公開第９８／５２９３３号パンフレット、米国特許第５９７２９９８号明細書、米国特許第６００４９９９号明細書、国際公開第０２／０７０４７２号パンフレット、および国際公開第０２／０７４７５９号パンフレット）。しかし、トリプトライドおよびその誘導体が角膜においてｐｒｏＭＭＰｓ産生抑制やｐｒｏＭＭＰｓ活性化抑制を示すことは記載も示唆もされていない。
フィニ（Ｆｉｎｉ）ら著，「アーカイブズ・オブ・ダーマトロジカル・リサーチ（Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」，（独国），１９９８年，第２９０巻追補，ｐ．Ｓ１２−Ｓ２３には、合成ＭＭＰ阻害剤が、角膜のＭＭＰｓを阻害することによって動物モデルにおいて角膜潰瘍の進行を阻害しうることが記載されている。しかし、トリプトライドおよびその誘導体が角膜においてｐｒｏＭＭＰｓ産生抑制やｐｒｏＭＭＰｓ活性化抑制を示すことは記載も示唆もされていない。
リン（Ｌｉｎ）ら著，「アースライティス・アンド・ルーマティズム（ＡＲＴＨＲＩＴＳ ＆ ＲＨＥＵＭＡＴＩＳＭ）」，（米国），２００１年９月，第４４巻，第９号，ｐ．２１９３−２２２０には、トリプトライドがヒト滑液線維芽細胞においてＭＭＰｓの前駆体であるｐｒｏＭＭＰ１および３の産生を抑制することが記載されている。しかし、トリプトライドおよびその誘導体が角膜においてもｐｒｏＭＭＰｓ産生抑制やｐｒｏＭＭＰｓ活性化抑制を示すことを示唆する記載はない。
【発明の開示】
上述したように角膜実質細胞の活性化と角膜実質破壊の悪循環を抑制することが可能な角膜潰瘍治療剤は現在ステロイド薬だけであるが、ステロイド薬は様々な副反応を引き起こすことが知られており、角膜潰瘍の治療においてもステロイド薬の使用により症状が悪化する例も多い。従って、本発明者らは、ステロイド薬を使用しなくとも上記悪循環を断ち切り角膜潰瘍を治療することが可能な医薬を創製すべく鋭意検討を重ねた結果、トリプトライドおよびその誘導体が角膜においてＴＩＭＰｓの産生に影響を与えることなくｐｒｏＭＭＰｓの産生および活性化を有効に阻害し、これにより角膜潰瘍の症状を治癒・緩解することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）トリプトライドもしくはその誘導体またはその医薬上許容しうる塩を含有する角膜潰瘍治療剤。
（２）眼局所投与用である、上記（１）に記載の角膜潰瘍治療剤。
（３）点眼剤である、上記（２）に記載の角膜潰瘍治療剤。
（４）トリプトライドもしくはその誘導体またはその医薬上許容しうる塩を含有する角膜潰瘍治療用医薬組成物。
（５）眼局所投与用に用いる、上記（４）に記載の角膜潰瘍治療用医薬組成物。
（６）点眼剤に用いる、上記（５）に記載の角膜潰瘍治療用医薬組成物。
（７）トリプトライドもしくはその誘導体またはその医薬上許容しうる塩を投与することを含む角膜潰瘍の治療方法。
（８）眼局所投与用として投与することを含む、上記（７）に記載の角膜潰瘍の治療方法。
（９）点眼剤として投与することを含む、上記（８）に記載の角膜潰瘍の治療方法。
（１０）角膜潰瘍治療剤を製造するためのトリプトライドもしくはその誘導体またはその医薬上許容しうる塩の使用。
（１１）角膜潰瘍治療剤が眼局所投与用である、上記（１０）に記載の使用。
（１２）角膜潰瘍治療剤が点眼剤である、上記（１１）に記載の使用。
（１３）上記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の角膜潰瘍治療剤、および当該治療剤を角膜潰瘍の治療に使用し得るかまたは使用すべきであることを記載した書類を含む商業的パッケージ。
（１４）上記（４）〜（６）のいずれか１項に記載の医薬組成物、および当該組成物を角膜潰瘍の治療に使用し得るかまたは使用すべきであることを記載した書類を含む商業的パッケージ。
【図面の簡単な説明】
図１はＩＬ−１βにより誘発したコラーゲン分解に対してトリプトライドが及ぼす影響を、分解したコラーゲンの量を、１ウェルあたりのヒドロキシプロリン量で表したグラフである。Ｎ＝３，平均±ＳＥＭ，ＩＬ−１β濃度０．１ｎｇ／ｍｌ。＊ｐ＜０．００１（シェフェ法）
図２はウサギ角膜実質細胞によるＭＭＰおよびｐｒｏＭＭＰｓの発現にトリプトライドが及ぼす影響を示す図である。プラスミノーゲン非添加条件下で培養を行い、グリコシル化ｐｒｏＭＭＰ−１、ｐｒｏＭＭＰ−１およびｐｒｏＭＭＰ−３についてはウエスタンブロットを、ｐｒｏＭＭＰ−９、ｐｒｏＭＭＰ−２およびＭＭＰ−２についてはゼラチンザイモグラフィーを行った結果を示している。またＩＬ−１β（−）はＩＬ−１β非添加時、ＩＬ−１β（＋）はＩＬ−１β添加時の結果をそれぞれ示している。
図３はウサギ角膜実質細胞によるＭＭＰｓおよびｐｒｏＭＭＰｓの発現にトリプトライドが及ぼす影響を示す図である。６０ｍｇ／ｍｌのプラスミノーゲン添加条件下で培養を行い、グリコシル化ｐｒｏＭＭＰ−１、ｐｒｏＭＭＰ−１、ＭＭＰ−１、ｐｒｏＭＭＰ−３およびＭＭＰ−３についてはウエスタンブロットを、ｐｒｏＭＭＰ−９二量体、ｐｒｏＭＭＰ−９、ＭＭＰ−９中間体、ＭＭＰ−９、ｐｒｏＭＭＰ−２およびＭＭＰ−２についてはゼラチンザイモグラフィーを行った結果を示している。またＩＬ−１β（−）はＩＬ−１β非添加時、ＩＬ−１β（＋）はＩＬ−１β添加時の結果をそれぞれ示している。
図４はＩＬ−１βにより誘発したコラーゲン分解に対してデキサメタゾンが及ぼす影響を、分解したコラーゲンの量を、１ウェルあたりのヒドロキシプロリン量で表したグラフである。Ｎ＝３，平均±ＳＥＭ，ＩＬ−１β濃度０．１ｎｇ／ｍｌ。＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．００１（シェフェ法）
図５はウサギ角膜実質細胞によるＭＭＰおよびｐｒｏＭＭＰｓの発現にデキサメタゾンが及ぼす影響を示す図である。プラスミノーゲン非添加条件下で培養を行い、グリコシル化ｐｒｏＭＭＰ−１、ｐｒｏＭＭＰ−１およびｐｒｏＭＭＰ−３についてはウエスタンブロットを、ｐｒｏＭＭＰ−９、ｐｒｏＭＭＰ−２およびＭＭＰ−２についてはゼラチンザイモグラフィーを行った結果を示している。またＩＬ−１β（−）はＩＬ−１β非添加時、ＩＬ−１β（＋）はＩＬ−１β添加時の結果をそれぞれ示している。
図６はウサギ角膜実質細胞によるＭＭＰｓおよびｐｒｏＭＭＰｓの発現にデキサメタゾンが及ぼす影響を示す図である。６０ｍｇ／ｍｌのプラスミノーゲン添加条件下で培養を行い、グリコシル化ｐｒｏＭＭＰ−１、ｐｒｏＭＭＰ−１、ＭＭＰ−１、ｐｒｏＭＭＰ−３およびＭＭＰ−３についてはウエスタンブロットを、ｐｒｏＭＭＰ−９二量体、ｐｒｏＭＭＰ−９、ＭＭＰ−９中間体、ＭＭＰ−９、ｐｒｏＭＭＰ−２およびＭＭＰ−２についてはゼラチンザイモグラフィーを行った結果を示している。またＩＬ−１β（−）はＩＬ−１β非添加時、ＩＬ−１β（＋）はＩＬ−１β添加時の結果をそれぞれ示している。
図７はＴＩＭＰ−１産生を、ｍＲＮＡのコピー数の相対値で表したグラフである。Ｎ＝２〜４，平均±ＳＤ，ＩＬ−１β濃度０．１ｎｇ／ｍｌ，デキサメタゾン濃度１ｎＭ，トリプトライド濃度３μＭ。
図８はＩＬ−１βにより誘発したコラーゲン分解に対してトリプトライドおよびコハク酸トリプトライドナトリウム塩が及ぼす影響を、分解したコラーゲンの量を、１ウェルあたりのヒドロキシプロリン量で表したグラフである。またＩＬ−１β（−）はＩＬ−１β非添加時、ＩＬ−１β（＋）はＩＬ−１β添加時の結果をそれぞれ示している。Ｎ＝３、平均±ＳＤ、ＩＬ−１β濃度０．１ｎｇ／ｍｌ。＊ｐ＜０．００１（ダネット法）
図９はウサギ角膜実質細胞によるＭＭＰｓおよびｐｒｏＭＭＰｓの発現にトリプトライドおよびコハク酸トリプトライドナトリウム塩が及ぼす影響を示す図である。プラスミノーゲン添加条件下で培養を行い、ｐｒｏＭＭＰ−９、ＭＭＰ−９、ｐｒｏＭＭＰ−２およびＭＭＰ−２についてゼラチンザイモグラフィーを行った結果を示している。またＩＬ−１β（−）はＩＬ−１β非添加時、ＩＬ−１β（＋）はＩＬ−１β添加時の結果をそれぞれ示している。ＩＬ−１β濃度０．１ｎｇ／ｍｌ。
発明の詳細な説明
本明細書における角膜潰瘍とは、角膜の上皮が欠損し、当該上皮欠損部分の実質も一部欠損している状態を示し、細菌感染などの生物学的刺激に由来するものであっても化学的または物理的刺激に由来するものであってもよく、その要因は特に限定されない。
本明細書におけるトリプトライドとは以下の構造を有する化合物であって、その由来は天然であっても合成であってもよい。
天然由来のトリプトライドとしては、Ｔｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ ｗｉｌｆｏｒｄｉｉ由来のものが挙げられる。例えば、国際公開第９８／５２９５１号パンフレットに記載のようなＴｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ ｗｉｌｆｏｒｄｉｉのエタノール抽出物等の溶媒抽出物、またその抽出物をさらに精製したものなどが挙げられ、Ｔｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ ｗｉｌｆｏｒｄｉｉ由来であれば液体、固体等どのような最終形態をとっていようとも本発明に用いることができる。
本明細書におけるトリプトライドの誘導体としては、国際公開第９７／３１９２０号パンフレット、特表２００１−５０４４３７号公報、国際公開第９６／０８２６２号パンフレット、国際公開第９８／５２９５１号パンフレット、国際公開第００／１２４８３号パンフレット、国際公開第０２／２８８６２号パンフレット、国際公開第００／６３２１２号パンフレット、国際公開第９８／５２９３３号パンフレット、米国特許第５９７２９９８号明細書、米国特許第６００４９９９号明細書、国際公開第０２／０７０４７２号パンフレット、国際公開第０２／０７４７５９号パンフレットに記載のトリプトライド誘導体が挙げられ、これらの誘導体は、それぞれの文献を参照することにより合成可能である。以下に各文献に記載のトリプトライド誘導体を具体的に記載する。
国際公開第９７／３１９２０号パンフレットおよび特表２００１−５０４４３７号公報には、
コハク酸トリプトライド
コハク酸トリプトライド Ｔｒｉｓ塩
コハク酸トリプトライド ナトリウム塩
コハク酸トリプトライド リジン塩
トリプトライド １４−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシンエステル
トリプトライドの１４−（３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピオン酸）エステル 塩酸塩
トリプトライドの１４−（４’−Ｎ−ピロリジノ）ブチレートエステル 塩酸塩
１６−ヒドロキシトリプトライド ビス−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシンエステル
などのトリプトライド誘導体が記載されている。
国際公開第９６／０８２６２号パンフレットには、以下に示す構造を有するＴｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ ｗｉｌｆｏｒｄｉｉのエタノール抽出物およびその精製トリプトライド成分が記載されている。
国際公開第９８／５２９５１号パンフレットおよび米国特許第６００４９９９号明細書には、
［５ａＲ−（５ａα，６α，６ａα，７ａα，７ｂβ，８ａＳ＊，８ｂα）］−３，３ｂ，４，５，５ａ，６，６ａ，７ａ，７ｂ，８ｂ，９，１０−ドデカヒドロ−５ａ，６−ジヒドロキシ−８ｂ−メチル−６ａ−（１−メチルエチル）−１Ｈ−ビスオキシレノ［４ｂ，５：６，７］フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−１−オン
［１Ｓ−（１α，２β，３α，３ａβ，４ａＲ＊，４ｂα，１１ａα）］−３−クロロ−１，２，３，３ａ，４ｂ，５，６，９，９ｂ，１０，１１，１１ａ−ドデカヒドロ−１，２，１１ａ−トリヒドロキシ−４ｂ−メチル−２−（１−メチルエチル）−７Ｈ−オキシレノ［４ｂ，５］フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−７−オン
［１Ｓ−（１α，２β，３α，３ａβ，４ａＲ＊，４ｂα，１１β，１１ａα）］−３−クロロ−１，２，３，３ａ，４ｂ，５，６，９，９ｂ，１０，１１，１１ａ−ドデカヒドロ−１，１１ａ−ジヒドロキシ−４ｂ−メチル−２−（１−メチルエチル）−２，１１−エポキシ−７Ｈ−オキシレノ［４ｂ，５］フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−７−オン
［１Ｓ−（１α，２β，３α，３ａβ，４ａＲ＊，４ｂα，１１β，１１ａα）］−３−ブロモ−１，２，３，３ａ，４ｂ，５，６，９，９ｂ，１０，１１，１１ａ−ドデカヒドロ−１，１１ａ−ジヒドロキシ−４ｂ−メチル−２−（１−メチルエチル）−２，１１−エポキシ−７Ｈ−オキシレノ［４ｂ，５］フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−７−オン
［３ｂＳ−（３ｂα，５ａβ，６β，６ａβ，７ａβ，７ｂα，８ａＲ＊，８ｂβ，１０β）］−３，３ｂ，４，５，５ａ，６，６ａ，７ａ，７ｂ，８ｂ，９，１０−ドデカヒドロ−５ａ，６，１０−トリヒドロキシ−８ｂ−メチル−６ａ−（１−メチルエチル）−１Ｈ−ビスオキシレノ［４ｂ，５：６，７］フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−１−オン
［１Ｓ−（１α，２β，３α，３ａβ，４ａＲ＊，４ｂα，６α，９ｂβ，１１ａα）］−３−クロロ−１，２，３，３ａ，４ｂ，５，６，９，９ｂ，１０，１１，１１ａ−ドデカヒドロ−１，２，６，１１ａ−テトラヒドロキシ−４ｂ−メチル−２−（１−メチルエチル）−７Ｈ−オキシレノ［４ｂ，５］フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−７−オン
［１Ｓ−（１α，２β，３α，３ａβ，４ａＲ＊，４ｂα，６α，９ｂβ，１１β，１１ａα）］−３−クロロ−１，２，３，３ａ，４ｂ，５，６，９，９ｂ，１０，１１，１１ａ−ドデカヒドロ−１，６，１１ａ−トリヒドロキシ−４ｂ−メチル−２−（１−メチルエチル）−２，１１−エポキシ−７Ｈ−オキシレノ［４ｂ，５］フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−７−オン
［３ｂＳ−（３ｂα，５ａβ，６β，６ａβ，７ａβ，７ｂα，８ａＲ＊，８ｂβ）］−３，３ｂ，４，５，５ａ，６，６ａ，７ａ，７ｂ，８ｂ，９，１０−ドデカヒドロ−５ａ，６−ジヒドロキシ−６ａ−（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）−８ｂ−メチル−１Ｈ−ビスオキシレノ［４ｂ，５：６，７］フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−１−オン
［１Ｓ−（１α，２β，３α，３ａβ，４ａＲ＊，４ｂα，９ｂβ，１１ａα）］−３−クロロ−１，２，３，３ａ，４ｂ，５，６，９，９ｂ，１０，１１，１１ａ−ドデカヒドロ−１，２，１１ａ−トリヒドロキシ−２−（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）−４ｂ−メチル−７Ｈ−オキシレノ［４ｂ，５］フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−７−オン
［１Ｓ−（１α，２β，３α，３ａβ，４ａＲ＊，４ｂα，９ｂβ，１１β，１１ａα）］−３−クロロ−１，２，３，３ａ，４ｂ，５，６，９，９ｂ，１０，１１，１１ａ−ドデカヒドロ−１，１１ａ−ジヒドロキシ−２−（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）−４ｂ−メチル−２，１１−エポキシ−７Ｈ−オキシレノ［４ｂ，５］フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−７−オン
［３ｂＳ−（３ｂα，５ａβ，６β，６ａβ，７ａβ，７ｂα，８ａＲ＊，８ｂβ）］−６ａ−（２−ヒドロキシ−１−メチルエチル）−３，３ｂ，４，５，５ａ，６，６ａ，７ａ，７ｂ，８ｂ，９，１０−ドデカヒドロ−５ａ，６−ジヒドロキシ−８ｂ−メチル−１Ｈ−ビスオキシレノ「４ｂ，５：６，７］フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−１−オン
［１Ｓ−（１α，２β，３α，３ａβ，４ａＲ＊，４ｂα，９ｂβ，１１ａα）］−３−クロロ−２−（２−ヒドロキシ−１−メチルエチル）−１，２，３，３ａ，４ｂ，５，６，９，９ｂ，１０，１１，１１ａ−ドデカヒドロ−１，２，１１ａ−トリヒドロキシ−４ｂ−メチル−７Ｈ−オキシレノ［４ｂ，５］フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−７−オン
［１Ｓ−（１α，２β，３α，３ａβ，４ａＲ＊，４ｂα，９ｂβ，１１β，１１ａα）］−３−クロロ−２−（２−ヒドロキシ−１−メチルエチル）−１，２，３，３ａ，４ｂ，５，６，９，９ｂ，１０，１１，１１ａ−ドデカヒドロ−１，１１ａ−ジヒドロキシ−４ｂ−メチル−１，１１−エポキシ−７Ｈ−オキシレノ［４ｂ，５］フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−７−オン
［３ｂＳ−（３ｂα，５ａβ，６β，６ａβ，７ａβ，７ｂα，８ａＲ＊，８ｂβ）］−モノ［３，３ｂ，４，５，５ａ，６，６ａ，７ａ，７ｂ，８ｂ，９，１０−ドデカヒドロ−５ａ−ヒドロキシ−８ｂ−メチル−６ａ−（１−メチルエチル）−１−オキソ−１Ｈ−ビスオキシレノ［４ｂ，５：６，７］フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−６−イル］エステル・ブタン二酸
［１Ｓ−（１α，２β，３α，３ａβ，４ａＲ＊，４ｂα，９ｂβ，１１ａα）］−モノ［３−クロロ−１，３，３ａ，４ｂ，５，６，７，９，９ｂ，１０，１１，１１ａ−ドデカヒドロ−２，１１ａ−ジヒドロキシ−４ｂ−メチル−２−（１−メチルエチル）−７−オキソ−２Ｈ−オキシレノ［４ｂ，５］フェナントロ［２，１−ｃ］フラン−１−イル］エステル・ブタン二酸
［３ｂＳ−（３ｂα，５ａβ，６β，６ａβ，７ａβ，７ｂα，８ａＲ＊，８ｂβ）］−モノ［３，３ｂ，４，５，５ａ，６，６ａ，７ａ，７ｂ，８ｂ，９，１０−ドデカヒドロ−５ａ−ヒドロキシ−８ｂ−メチル−６ａ−（１−メチルエチル）−１−オキソ−１Ｈ−ビスオキシレノ［４ｂ，５：６，７］フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−６−イル］エステル・ペンタン二酸
［３ｂＳ−（３ｂα，５ａβ，６β，６ａβ，７ａβ，７ｂα，８ａＲ＊，８ｂβ，１０β）］−３，３ｂ，４，５，５ａ，６，６ａ，７ａ，７ｂ，８ｂ，９，１０−ドデカヒドロ−５ａ−ヒドロキシ−８ｂ−メチル−６ａ−（１−メチルエチル）−１−オキソ−１Ｈ−ビスオキシレノ［４ｂ，５：６，７］フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−６，１０−ジイルエステル・ブタン二酸
［３ｂＳ−（３ｂα，５ａβ，６β，６ａβ，７ａβ，７ｂα，８ａＲ＊，８ｂβ）］−モノ［２−［６−（３−カルボキシ−１−オキソプロポキシ）−１，３，３ｂ，４，５，５ａ，６，７ａ，７ｂ，８ｂ，９，１０−ドデカヒドロ−５ａ−ヒドロキシ−８ｂ−メチル−１−オキソ−６ａＨ−ビスオキシレノ［４ｂ，５：６，７］フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−６ａ−イル］−プロピル］エステル・ブタン二酸
［３ｂＳ−（３ｂα，５ａβ，６β，６ａβ，７ａβ，７ｂα，８ａＲ＊，８ｂβ）］−３，３ｂ，４，５，５ａ，６，６ａ，７ａ，７ｂ，８ｂ，９，１０−ドデカヒドロ−５ａ−ヒドロキシ−８ｂ−メチル−６ａ−（１−メチルエチル）−１Ｈ−ビスオキシレノ［４ｂ，５：６，７］フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−６−イルエステル・Ｌ−アラニントリフルオロ酢酸
［３ｂＳ−（３ｂα，５ａβ，６β，６ａβ，７ａβ，７ｂα，８ａＲ＊，８ｂβ）］−３，３ｂ，４，５，５ａ，６，６ａ，７ａ，７ｂ，８ｂ，９，１０−ドデカヒドロ−５ａ−ヒドロキシ−８ｂ−メチル−６ａ−（１−メチルエチル）−１Ｈ−ビスオキシレノ［４ｂ，５：６，７］フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−６−イルエステル・Ｌ−フェニルアラニントリフルオロ酢酸
などのトリプトライド誘導体が記載されている。
国際公開第００／１２４８３号パンフレットには、以下に示す構造を有するトリプトライド誘導体が記載されている。
国際公開第０２／２８８６２号パンフレットには、以下に示す構造を有する化合物が記載されている。
国際公開第００／６３２１２号パンフレットには、
１２−チオシアノ−１３−ヒドロキシトリプトライド
が記載されている。
国際公開第９８／５２９３３号パンフレットおよび米国特許第５９７２９９８号明細書には、［５ａＳ−（５ａα，５ｂα，８β，９α，９ａＲ＊，１０ａβ）］−４，５ａ，５ｂ，８，９，１０ａ，１１，１１ａ−オクタヒドロ−５ｂ，８，９−トリヒドロキシ−５ａ−メチル−８−（１−メチルエチル）−１Ｈ−オキシレノ［８ａ，９］フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−３（５Ｈ）−オン
［５ａＲ−（５ａα，６α，７β，９ａα，９ｂα）］−３ｂ，４，５，５ａ，６，７，９ａ，９ｂ，１０，１１−デカヒドロ−５ａ，６，７，９ａ−テトラヒドロキシ−９ｂ−メチル−７−（１−メチルエチル）−フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−１（３Ｈ）−オン
［５Ｒ−（５α，５ａβ，６β，７α，９ａβ，９ｂβ）］−３ｂ，４，５，５ａ，６，７，９ａ，１０，１１−デカヒドロ−５ａ，６，９ａ−トリヒドロキシ−９ｂ−メチル−７−（１−メチルエチル）−５，７−エポキシフェナントロ［１，２−ｃ］フラン−１（３Ｈ）−オン
［５ａＳ−（５ａα，５ｂα，８β，９α，９ａＲ＊，１０ａβ）］−４，５ａ，５ｂ，６，７，８，９，１０ａ，１１，１１ａ−デカヒドロ−５ｂ，８，９−トリヒドロキシ−５ａ−メチル−８−（１−メチルエチル）−１Ｈ−オキシレノ［８ａ，９］フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−３（５Ｈ）−オン
［５ａＲ−（５ａα，６α，７β，９ａα，９ｂα）］−３ｂ，４，５，５ａ，６，７，８，９，９ａ，９ｂ，１０，１１−ドデカヒドロ−５ａ，６，７，９ａ−テトラヒドロキシ−９ｂ−メチル−７−（１−メチルエチル）−フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−１（３Ｈ）−オン
［５Ｒ−（５α，５ａβ，６β，７α，９ａβ，９ｂβ）］−３ｂ，４，５，５ａ，６，７，８，９，９ａ，９ｂ，１０，１１−ドデカヒドロ−５ａ，６，９ａ−トリヒドロキシ−９ｂ−メチル−７−（１−メチルエチル）−５，７−エポキシフェナントロ［１，２−ｃ］フラン−１（３Ｈ）−オン
［４Ｓ−（４α，５ａα，５ｂα，８β，９α，９ａＲ＊，１０ａβ，１１ａβ）］−８−（１−メチルエチル）−４，５ａ，５ｂ，８，９，１０ａ，１１，１１ａ−オクタヒドロ−４，５ｂ，８，９−テトラヒドロキシ−５ａ−メチル−１Ｈ−オキシレノ［８ａ，９］フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−３（５Ｈ）−オン
［５ａＲ−（５ａα，６α，７β，９ａα，９ｂα，１１α）］−３ｂ，４，５，５ａ，６，７，９ａ，９ｂ，１０，１１−デカヒドロ−５ａ，６，７，９ａ，１１−ペンタヒドロキシ−９ｂ−メチル−７−（１−メチルエチル）−フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−１（３Ｈ）−オン
［３ｂＳ−（３ｂα，５α，５ａβ，６β，７α，９ａβ，９ｂβ，１１β）］−３ｂ，４，５，５ａ，６，７，９ａ，９ｂ，１０，１１−デカヒドロ−５ａ，６，９ａ，１１−テトラヒドロキシ−９ｂ−メチル−７−（１−メチルエチル）−５，７−エポキシフェナントロ［１，２−ｃ］−フラン−１（３Ｈ）−オン
［５ａＳ−（５ａα，５ｂα，８β，９α，９ａＲ＊，１０ａβ，１１ａβ）］−４，５ａ，５ｂ，８，９，１０ａ，１１，１１ａ−オクタヒドロ−５ｂ，８，９−トリヒドロキシ−８−（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）−５ａ−メチル−１Ｈ−オキシレノ［８ａ，９］フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−３（５Ｈ）−オン
［５ａＲ−（５ａα，６α，７β，９ａα，９ｂα）］−３ｂ，４，５，５ａ，６，７，９ａ，９ｂ，１０，１１−デカヒドロ−５ａ，６，７，９ａ−テトラヒドロキシ−７−（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）−９ｂ−メチル−フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−１（３Ｈ）−オン
［３ｂＳ−（３ｂα，５α，５ａβ，６β，７α，９ａβ，９ｂβ）］−３ｂ，４，５，５ａ，６，７，９ａ，９ｂ，１０，１１−デカヒドロ−５ａ，６，９ａ−トリヒドロキシ−７−（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）−９ｂ−メチル−５，７−エポキシフェナントロ［１，２−ｃ］フラン−１（３Ｈ）−オン
［５ａＳ−（５ａα，５ｂα，８β，９α，９ａＲ＊，１０ａβ）］−４，５ａ，５ｂ，８，９，１０ａ，１１，１１ａ−オクタヒドロ−５ｂ，８，９−トリヒドロキシ−５ａ−メチル−８−（２−ヒドロキシ−１−メチルエチル）−１Ｈ−オキシレノ［８ａ，９］フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−３（５Ｈ）−オン
［５ａＲ−（５ａα，６α，７β，９ａα，９ｂα）］−３ｂ，４，５，５ａ，６，７，９ａ，９ｂ，１０，１１−デカヒドロ−５ａ，６，７，９ａ−テトラヒドロキシ−７−（２−ヒドロキシ−１−メチルエチル）−９ｂ−メチル−フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−１（３Ｈ）−オン
［５Ｒ−（５α，５ａβ，６β，７α，９ａβ，９ｂβ）］−３ｂ，４，５，５ａ，６，７，９ａ，９ｂ，１０，１１−デカヒドロ−５ａ，６，９ａ−トリヒドロキシ−９ｂ−メチル−７−（２−ヒドロキシ−１−メチルエチル）−５，７−エポキシフェナントロ［１，２−ｃ］フラン−１（３Ｈ）−オン
［５ａＳ−（５ａα，５ｂα，８β，９α，９ａＳ＊，１０ａβ，１１ａβ）］−モノ［３，４，５，５ａ，５ｂ，８，９，１０ａ，１１，１１ａ−デカヒドロ−５ｂ，８−ジヒドロキシ−５ａ−メチル−８−（１−メチルエチル）−３−オキソ−１Ｈ−オキシレノ［８ａ，９］フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−９−イル］エステル・ブタン二酸
［３ｂＳ−（３ｂα，５ａβ，６β，７α，９ａβ，９ｂβ）］−モノ［１，３，３ｂ，４，５，５ａ，６，７，９ａ，９ｂ，１０，１１−ドデカヒドロ−５ａ，７，９ａ−トリヒドロキシ−９ｂ−メチル−７−（１−メチルエチル）−１−オキソフェナントロ［１，２−ｃ］フラン−６−イル］エステル・ブタン二酸
［３ｂＳ−（３ｂα，５α，５ａβ，６β，７α，９ａβ，９ｂβ）］−モノ［１，３，３ｂ，４，５，５ａ，６，７，９ａ，９ｂ，１０，１１−ドデカヒドロ−５ａ，９ａ−ジヒドロキシ−９ｂ−メチル−７−（１−メチルエチル）−１−オキソ−５，７−エポキシフェナントロ［１，２−ｃ］フラン−６−イル］エステル・ブタン二酸
［５ａＳ−（５ａα，５ｂβ，８β，９α，９ａＳ＊，１０ａβ，１１ａβ）］−モノ［３，４，５，５ａ，８，９，１０ａ，１１，１１ａ−デカヒドロ−５ｂ，８−ジヒドロキシ−５ａ−メチル−８−（１−メチルエチル）−３−オキソ−１Ｈ−オキシレノ［８ａ，９］フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−９−イル］エステル・ペンタン二酸
［４Ｓ−（４α，５ａα，５ｂα，８β，９α，９ａＳ＊，１０ａβ，１１ａβ）］−３，４，５，５ａ，５ｂ，８，９，１０ａ，１１，１１ａ−デカヒドロ−５ｂ，８−ジヒドロキシ−５ａ−メチル−８−（１−メチルエチル）−３−オキソ−１Ｈ−オキシレノ［８ａ，９］フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−４，９−ジイルエステル・ブタン二酸
［３ｂＳ−（３ｂα，５ａβ，６β，７α，９ａβ，９ｂβ）］−１，３，３ｂ，４，５，５ａ，６，７，９ａ，９ｂ，１０，１１−ドデカヒドロ−５ａ，７，９ａ−トリヒドロキシ−９ｂ−メチル−７−（１−メチルエチル）−１−オキソフェナントロ［１，２−ｃ］フラン−６−イルエステル・Ｌ−アラニン・トリフルオロ酢酸
［３ｂＳ−（３ｂα，５ａβ，６β，７α，９ａβ，９ｂβ）］−１，３，３ｂ，４，５，５ａ，６，７，９ａ，９ｂ，１０，１１−ドデカヒドロ−５ａ，７，９ａ−トリヒドロキシ−９ｂ−メチル−７−（１−メチルエチル）−１−オキソフェナントロ［１，２−ｃ］フラン−６−イルエステル・Ｌ−フェニルアラニン・トリフルオロ酢酸
などのトリプトライド誘導体が記載されている。
国際公開第０２／０７０４７２号パンフレットには、以下に示す構造を有するトリプトライド誘導体が記載されている。
国際公開第０２／０７４７５９号パンフレットには、
トリプトライド １４−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−α−ｔ−ブチル−Ｌ−グルタミン酸エステル
トリプトライド １４−α−ベンジルオキシカルボニル−Ｄ−グルタミン酸エステル
トリプトライド １４−γ−ベンジル−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−（Ｌ）−グルタミン酸エステルＤ体混合物
トリプトライド １４−β−ベンジル−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−（Ｌ）−アスパラギン酸エステルＤ体混合物
トリプトライド １４−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−β−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−β−ｔｅｒｔ−ブチル−（Ｌ）−アスパラギン酸エステルＤ体混合物
トリプトライド １４−γ−Ｌ−グルタミン酸エステル
などのトリプトライド誘導体が記載されている。
本発明で用いるトリプトライドまたはその誘導体は、医薬上許容しうる塩の形態のものを適宜用いることもできる。そのような塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩、過塩素酸塩等の無機酸塩；ギ酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、プロピオン酸塩、シュウ酸塩、グリコール酸塩、コハク酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、ヒドロキシマレイン酸塩、メチルマレイン酸塩、フマール酸塩、アジピン酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、ケイ皮酸塩、アスコルビン酸塩、サリチル酸塩、２−アセトキシ安息香酸塩、ニコチン酸塩、イソニコチン酸塩等の有機酸塩；メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、イソチオン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ナフタレンスルホン酸塩等のスルホン酸塩；アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等の酸性アミノ酸塩；ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩；トリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ピリジン塩、ピコリン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩等の有機塩基塩；リジン塩、アルギニン塩等の塩基性アミノ酸塩等の酸付加塩および塩基付加塩などを挙げることができる。また、場合によっては水和物、またはアルコール等との溶媒和物であってもよい。
本発明の角膜潰瘍治療剤は、トリプトライドまたはその誘導体の角膜潰瘍治癒作用に悪影響を与えない限り、トリプトライドまたはその誘導体以外の任意の成分を含むことができる。そのような成分には例えば、抗菌剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、抗アレルギー剤、抗ウイルス剤、血管収縮剤などが挙げられ、具体的には、塩酸ロメフロキサシン、オフロキサシン、ノルフロキサシン、レボフロキサシン、エリスロマイシン、スルフイソキサゾール、塩酸オキシテトラサイクリン、硫酸ポリオキシンＢ、塩酸セフメノキシム、クロラムフェニコール、スルベニシリン、トブラマイシン、硫酸ゲンタマイシン、硫酸シソマイシン、硫酸フラジオマイシン、硫酸ミクロマイシン等の抗菌剤；シクロスポリン、ラパマイシン、タクロリムス等の免疫抑制剤；アズレン、インドメタシン、塩化リゾチーム、ジクロフェナクナトリウム、プラノプロフェン等の抗炎症剤；フマル酸ケトチフェン、トラニラスト、メタキジン、ジフェンヒドラミン等の抗アレルギー剤；アシクロビル、イドクスウリジン、ピマリシン等の抗ウイルス剤；硝酸テトラハイドロゾリン、塩酸オキシメタゾリン等の血管収縮剤などが挙げられる。
本発明の角膜潰瘍治療剤は、当該分野で通常用いられているような添加剤を投与形態に応じ適宜加えることも可能である。
本発明の角膜潰瘍治療剤は、角膜潰瘍の治療効果を奏する限りその投与経路は特に限定されないが、好ましくは眼局所投与される。眼局所投与用剤形には、例えば、点眼剤や眼軟膏剤が挙げられる。
例えば、本発明の角膜潰瘍治療剤を点眼剤または眼軟膏剤として用いる場合、安定剤（例えば、亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエンなど）、溶解補助剤（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、マクロゴール、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油など）、懸濁化剤（例えば、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなど）、乳化剤（例えば、ポリビニルピロリドン、大豆レシチン、卵黄レシチン、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリソルベート８０など）、緩衝剤（例えば、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸、イプシロンアミノカプロン酸など）、粘稠剤（例えば、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースなどの水溶性セルロース誘導体、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム、カルボキシビニルポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、マクロゴールなど）、保存剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、グルコン酸クロルヘキシジン、クロロブタノール、ベンジルアルコール、デヒドロ酢酸ナトリウム、パラオキシ安息香酸エステル類、エデト酸ナトリウム、ホウ酸など）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、ホウ酸、ブドウ糖、プロピレングリコールなど）、ｐＨ調整剤（例えば、塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸など）、清涼化剤（例えば、１−メントール、ｄ−カンフル、ｄ−ボルネオール、ハッカ油など）、軟膏基剤（白色ワセリン、精製ラノリン、流動パラフィン、植物油（オリーブ油、椿油、落花生油など）など）などを添加剤として加えることができる。これら添加剤の添加量は、添加する添加剤の種類、用途などによって異なるが、添加剤の目的を達成し得る濃度を添加すればよい。
本発明の角膜潰瘍治療剤を点眼剤または眼軟膏剤とする場合、製剤分野で通常用いられている方法に従って製造すればよく、例えば第１４改正日本薬局方、製剤総則、点眼剤の項および眼軟膏剤の項に記載された方法に基づき製造することができる。
本発明の角膜潰瘍治療剤の投与対象は特に限定されず、ヒトをはじめサル、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、イヌ、ウマ、ウシ等種々の哺乳動物における角膜潰瘍治療に有用である。
本発明の角膜潰瘍治療剤をヒトに投与する場合には、トリプトライドまたはその誘導体の濃度として約１００ｎＭ〜約１０００μＭ、好ましくは約１μＭ〜約１００μＭのトリプトライドまたはその誘導体を含む溶液を、１日１回〜６回、１回に片眼あたり１〜２滴を投与すればよい。
【実施例】
以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に記載するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
実施例１．トリプトライド
試薬の調製
〔トリプトライド溶液の調製〕
トリプトライド〔ＰＧ４９０〕（ＡＬＥＸＩＳ ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬＳ社製，スイス、Ｔｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ ｗｉｌｆｏｒｄｉｉからの単離物、純度９８％）１ｍｇをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）０．９２５ｍｌに溶解した（３．０×１０−３Ｍ）。この溶液を無血清イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）にて５００倍希釈した（６．０×１０−６Ｍ）。以降、順次０．２％ＤＭＳＯの入った無血清ＭＥＭで１０倍希釈した。
〔デキサメタゾン溶液の調製〕
デキサメタゾン（シグマアルドリッチジャパン社製）３９．２５ｍｇをＤＭＳＯ１．０ｍｌに溶解した（１．０×１０−１Ｍ）。この溶液を無血清ＭＥＭにて５００倍希釈した（２．０×１０−４Ｍ）。以降、０．２％ＤＭＳＯの入った無血清ＭＥＭで順次１０倍希釈した。
〔エールリッヒ試薬溶液の調製〕
６０％過塩素酸１０ｍｌと２−プロパノール６５ｍｌとを混合し、ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド６．６ｇを加えて溶解した。
〔ヒドロキシプロリン標準溶液の調製〕
ヒドロキシプロリン２０ｍｇを全量５０ｍｌの蒸留水に溶解して、４００μｇ／ｍｌのヒドロキシプロリン溶液を調製し冷蔵保存した。
４００μｇ／ｍｌヒドロキシプロリン（ＨＹＰ）溶液をもとに２０μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、０μｇ／ｍｌ ＨＹＰ溶液を調製した。
〔使用動物〕
Ｊａｐａｎｅｓｅ ａｌｂｉｎｏ ｒａｂｂｉｔ（体重２．５〜３．０ｋｇ、オス）をバイオテック（日）から購入して用いた。
〔その他用いた物質〕
ＭＥＭおよび組織培養培地１９９（ＴＣＭ１９９）は、Ｇｉｂｃｏ（米国）製のものを使用した。組織培養プレートはＣｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（米国）製のものを使用した。Ｕｌｔｒａ−ｆｒｅｅ（登録商標）−ＭＣフィルターはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（米国）製のものを使用した。ネイティブなブタタイプＩコラーゲン（酸可溶化）および５倍濃縮ダルベッコ改変イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）は、新田ゼラチン（日本）から入手した。ウシプラスミノーゲンは、Ｓｉｇｍａ（米国）から入手した。ＩＬ−１βは、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（米国）から入手した。Ｓ−２２５１（Ｈ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ）は第一化学薬品株式会社（日本）から入手した。ヒツジ抗ウサギＭＭＰ−１抗体およびヒツジ抗ウサギＭＭＰ−３抗体は、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｋａｎｓａｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒの永瀬氏から提供されたものを用いた。
角膜実質細胞の調製
ウサギ角膜実質細胞はＭｉｓｈｉｍａら、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．２８，１５２１−６（１９８７）の記載に従って調製し培養した。ウサギをペントバルビタールナトリウムの過投与により供死した。眼球を摘出し、角強膜切開して角膜を摘出した。実質を上皮および内皮から分離した。角膜実質細胞は、コラゲナーゼ（Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ，Ｓｉｇｍａ（米国）＃Ｃ−０１３０）（２ｍｇ／ｍｌ）で３７℃３〜４時間消化して実質から遊離させた。細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を添加したＭＥＭで培養し、３７℃湿度１００％のインキュベーター中、５％ＣＯ２条件下で増殖させ、その後、１０％ＦＢＳを含むＭＥＭで継代培養した。
三次元培養
コラーゲンゲルを新田ゼラチンのマニュアルに基づいて調製した。すなわち、得られたウサギ角膜実質細胞をＰＢＳ（−）で洗浄後、０．０５％トリプシンを１ｍｌ加え、ＣＯ２インキュベーター内で数分間放置し細胞を剥離した。１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ ５ｍｌを加えて、トリプシンの反応を止め、１５ｍｌ遠心管に細胞懸濁液を移して、１５００ｒｐｍ、５分間遠心した。上清を除去した後、一定量の無血清ＭＥＭを加えて細胞を懸濁し、ビルケルチュルク血球計算板（萱垣医理科工業）を用いて細胞数をカウントした。１５００ｒｐｍ、５分間遠心し上清を除去後、無血清ＭＥＭを加えて２２０万個／ｍｌの細胞懸濁液を調製した。Ａ．酸可溶化タイプＩコラーゲン（３ｍｇ／ｍｌ）、Ｂ．５倍濃縮ＤＭＥＭ、Ｃ．再構築緩衝液（０．０５Ｎ ＮａＯＨ、０．２６Ｍ ＮａＨＣＯ３、０．２Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ ７．３）、Ｄ．細胞懸濁液（２．２×１０６細胞／ｍｌ）を、Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄ＝７：２：１：１の割合で、氷中で冷却しながら混合した。このコラーゲン溶液を０．５ｍｌ／ウェルで２４ウェルの培養プレートに入れ、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内で０．５〜５時間放置した。次いで、ＩＬ−１β（０．１ｎｇ／ｍＬ）および種々の濃度のトリプトライドまたはデキサメタゾンを含む０．５ｍｌの無血清ＭＥＭを重層し、４８時間培養した。
実験例
〔コラーゲン分解活性の測定〕
三次元培養後、培地を回収し、１００ｋＤａを超える分子量の分解されていないコラーゲン原線維を限外濾過により取り除いた。濾液をヒートブロックで１１０℃２４時間、塩酸により加水分解した。加水分解物中のヒドロキシプロリン量を、エールリッヒ試薬を用い分光光度計を用いて測定した（Ｂｅｒｇｍａｎら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，３５，１９６１−５（１９６３））。分解したコラーゲンの量を、１ウェルあたりのヒドロキシプロリン量で表した。
〔ウエスタンブロット〕
三次元培養後、回収した培地を還元条件下１２．５％ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、分離されたタンパク質をＰＶＤＦメンブレン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ（登録商標）−Ｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製，米国）上に転写した。転写したメンブレンをブロックした後、ヒツジ抗（ウサギＭＭＰ−１）抗体またはヒツジ抗（ウサギＭＭＰ−３）抗体と反応させた。抗原の免疫検出をＥＣＬ（登録商標）ウエスタンブロット検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製，英国）を用いて行った。抗体との反応性および分子量によって各ＭＭＰを同定した。
〔ゼラチンザイモグラフィー〕
三次元培養後、０．１％ゼラチンを含有する１０％ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲルでＢｉｒｋｅｄａｌ−Ｈａｎｓｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１０７，１１７３−８（１９８２）に記載の方法に従って回収した培地を分離した。培地のサンプルを、還元剤を含まないＳＤＳ−サンプル緩衝液（１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ６．８、２０％グリセロール、２％ ＳＤＳ、０．００２％ブロモフェノールブルー）と混合した。４℃で電気泳動した後、ゲルを２．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で１時間洗浄し、プロテアーゼ活性を回復させた。次いで、反応緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ７．５、５ｍＭ ＣａＣｌ２および１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）中で、３７℃１８時間、ゲルをインキュベートした。ゲルをクマシーブリリアントブルーで染色した。分子量により各ＭＭＰを同定した。
〔ＲＴ−ＰＣＲ〕
三次元培養後、コラゲナーゼを添加してコラーゲンゲルを溶解し、細胞を回収した。細胞よりＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製，独国）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した後、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ １μｇをＲｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製，米国）を用いてｃＤＮＡへ変換した。このｃＤＮＡとＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ溶液（ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ−ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ社製，独国）、ｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒおよびウサギＴＩＭＰ−１ ｐｒｉｍｅｒ（日本遺伝子研究所にて合成。Ｈａｎら，Ｎａｇｏｙａ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．６２，１１５−１２６（１９９９））を混合し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製，独国）を用いてＴＩＭＰ−１のｍＲＮＡの発現量を検討した。
実験例１
トリプトライドがＩＬ−１β誘発コラーゲン分解に及ぼす影響を調べた。トリプトライド溶液を用いて上記三次元培養を行った後、上記コラーゲン溶解活性の測定に記載の方法に従って、実験を行った。結果を図１に示す。
図１によれば、トリプトライドがＩＬ−１β誘発コラーゲン分解を濃度依存的に抑制することがわかる。
実験例２
トリプトライドがウサギ角膜実質細胞のＭＭＰおよびｐｒｏＭＭＰｓの発現に及ぼす影響を調べた。トリプトライド溶液を用いて上記三次元培養を行った後、上記ウエスタンブロットまたはゼラチンザイモグラフィーに記載の方法に従って、実験を行った。結果を図２に示す。
図２によれば、トリプトライドがＩＬ−１βによって引き起こされるグリコシル化ｐｒｏＭＭＰ−１、ｐｒｏＭＭＰ−１、ｐｒｏＭＭＰ−３の増加を抑制することがわかる。
実験例３
トリプトライドがウサギ角膜実質細胞のＭＭＰｓおよびｐｒｏＭＭＰｓの発現に及ぼす影響を調べた。トリプトライド溶液を用いて上記三次元培養を行った後、上記ウエスタンブロットまたはゼラチンザイモグラフィーに記載の方法に従って、実験を行った。結果を図３に示す。
図３によれば、トリプトライドがＩＬ−１βおよびプラスミノーゲンによって引き起こされるグリコシル化ｐｒｏＭＭＰ−１、ｐｒｏＭＭＰ−１、ｐｒｏＭＭＰ−３の増加および活性化ならびにｐｒｏＭＭＰ−９活性化を抑制することがわかる。
実験例４
デキサメタゾンがＩＬ−１β誘発コラーゲン分解に及ぼす影響を調べた。デキサメタゾン溶液を用いて上記三次元培養を行った後、上記コラーゲン溶解活性の測定に記載の方法に従って、実験を行った。結果を図４に示す。
図４によれば、デキサメタゾンがＩＬ−１β誘発コラーゲン分解を濃度依存的に抑制することがわかる。
実験例５
デキサメタゾンがウサギ角膜実質細胞のＭＭＰおよびｐｒｏＭＭＰｓの発現に及ぼす影響を調べた。デキサメタゾン溶液を用いて上記三次元培養を行った後、上記ウエスタンブロットまたはゼラチンザイモグラフィーに記載の方法に従って、実験を行った。結果を図５に示す。
図５によれば、デキサメタゾンがＩＬ−１βにより引き起こされるグリコシル化ｐｒｏＭＭＰ−１、ｐｒｏＭＭＰ−１およびｐｒｏＭＭＰ−３の増加を抑制することがわかる。
実験例６
トリプトライドがウサギ角膜実質細胞のＭＭＰｓおよびｐｒｏＭＭＰｓの発現に及ぼす影響を調べた。トリプトライド溶液を用いて上記三次元培養を行った後、上記ウエスタンブロットまたはゼラチンザイモグラフィーに記載の方法に従って、実験を行った。結果を図６に示す。
図６によれば、デキサメタゾンがＩＬ−１βおよびプラスミノーゲンによって引き起こされるｐｒｏＭＭＰ−１活性化、ｐｒｏＭＭＰ−３増加、ならびにｐｒｏＭＭＰ−２およびｐｒｏＭＭＰ−９の活性化を抑制することがわかる。
実験例７
トリプトライドおよびデキサメタゾンがＴＩＭＰ−１産生に及ぼす影響を調べた。上記ＲＴ−ＰＣＲに記載の方法に従って、実験を行った。結果を図７に示す。
図７によれば、ＩＬ−１βによって引き起こされるＴＩＭＰ−１産生（ｍＲＮＡレベル）をデキサメタゾンは抑制してしまうが、トリプトライドは抑制しないことがわかる。
デキサメタゾンがＴＩＭＰ−１産生を抑制するということはすなわち、内因性ＭＭＰ阻害剤の発現量を抑制するということを意味し、これによりコラーゲン分解が亢進する可能性がある。しかしながら、トリプトライドはＴＩＭＰ−１産生には影響を与えないので、デキサメタゾンよりもより効果的にコラーゲン分解を抑制すると考えられる。
実施例２．コハク酸トリプトライド ナトリウム塩
コハク酸トリプトライド
トリプトライド〔ＰＧ４９０〕（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製、米国、Ｔｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ ｗｉｌｆｏｒｄｉｉからの単離物、純度９８％）（０．０５ｇ、０．１３ｍｍｏｌ）と４−ジメチルアミノピリジン（０．０１７ｇ、０．１４ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（１ｍＬ）とピリジン（５ｍＬ）の混合溶液に溶解させ、無水コハク酸（０．０７５ｇ、０．７５ｍｍｏｌ）を加え、窒素雰囲気下、８５℃で３０分間攪拌した。溶媒を減圧蒸留し、１Ｎ−水酸化カリウム水溶液（２ｍＬ）を加え、酢酸エチルで洗浄した。水層を１Ｎ−塩酸で酸性とし、酢酸エチル（１００ｍＬ）で抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで脱水乾燥した。溶媒を減圧留去して、コハク酸トリプトライド（０．０１２ｇ、１８．７％）を黄色固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ：０．８３（３Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．６Ｈｚ）、０．９４（３Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．２Ｈｚ）、１．０５（３Ｈ、ｓ）、１．２１（１Ｈ、ｍ）、１．５５（１Ｈ、ｍ）、１．８９（２Ｈ、ｍ）、２．１５（２Ｈ、ｍ）、２．３０（１Ｈ、ｍ）、２．７４−２．７６（５Ｈ、ｍ）、３．４５（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝５．７Ｈｚ）、３．５２（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝３．３Ｈｚ）、３．８２（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝３．０Ｈｚ）、４．６６（２Ｈ、ｓ）、５．０９（１Ｈ、ｓ）．
コハク酸トリプトライドナトリウム塩
上記で得られたコハク酸トリプトライド（０．０１ｇ、０．０２ｍｍｏｌ）と炭酸水素ナトリウム（０．００２ｇ、０．０２ｍｍｏｌ）に水（２０ｍＬ）を加え、室温で３０分間攪拌した。水溶液を濾過し、濾液を凍結乾燥してコハク酸トリプトライドナトリウム塩（０．０１ｇ、９５．４％）を黄色フォームとして得た。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：０．７４（３Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．２Ｈｚ）、０．８６（３Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．９Ｈｚ）、０．９１（３Ｈ、ｓ、２０−ＣＨ３）、１．２８−１．３０（２Ｈ、ｂｒ）、１．８０−２．２３（７Ｈ、ｍ）、２．３８−２．５１（３Ｈ、ｍ）、３．５５（１Ｈ、ｍ）、３．７０（１Ｈ、ｍ）、３．９５（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝３．０Ｈｚ）、４．８３（２Ｈ、ｂｒｓ）、４．９７（１Ｈ、ｓ、１４−ＣＨ）．
試薬の調製
被験物質としてトリプトライド〔ＰＧ４９０〕（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製、米国、Ｔｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ ｗｉｌｆｏｒｄｉｉからの単離物、純度９８％）、および上記で得られたコハク酸トリプトライドナトリウム塩を用いた。
〔トリプトライド溶液の調製〕
トリプトライド〔ＰＧ４９０〕（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製、米国、Ｔｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ ｗｉｌｆｏｒｄｉｉからの単離物、純度９８％）１ｍｇをＤＭＳＯ２７．７μＬに溶解した（１．０×１０−１Ｍ）。これをＤＭＳＯにて１０倍希釈した（１．０×１０−２Ｍ）。それぞれのＤＭＳＯを用いて調製した溶液を無血清ＭＥＭで５００倍希釈した（２．０×１０−４Ｍ、２．０×１０−５Ｍ）。
〔コハク酸トリプトライドナトリウム塩溶液の調製〕
上記で得られたコハク酸トリプトライドナトリウム塩２．１７ｍｇをＤＭＳＯ４５μＬに溶解した（１．０×１０−１Ｍ）。これをＤＭＳＯにて１０倍希釈した（１．０×１０−２Ｍ）。それぞれのＤＭＳＯを用いて調製した溶液を無血清ＭＥＭで５００倍希釈した（２．０×１０−４Ｍ、２．０×１０−５Ｍ）。
〔使用動物〕
Ｊａｐａｎｅｓｅ ａｌｂｉｎｏ ｒａｂｂｉｔ（体重約２ｋｇ、オス、北山ラベスから購入）を用いた。
その他は実施例１と同様にして行った。
実験例８
トリプトライドおよびコハク酸トリプトライドナトリウム塩がウサギ角膜実質細胞によるＩＬ−１β誘発コラーゲン分解に及ぼす影響を調べた。被験物質溶液を用いて前述の三次元培養を行った後、前述のコラーゲン分解活性の測定の記載の方法に従って、実験を行った。結果を図８に示す。
図８によれば、トリプトライドおよびコハク酸トリプトライドナトリウム塩がＩＬ−１β誘発コラーゲン分解を濃度依存的に抑制することがわかる。
実験例９
トリプトライドおよびコハク酸トリプトライドナトリウム塩がウサギ角膜実質細胞のＭＭＰｓおよびｐｒｏＭＭＰｓの発現に及ぼす影響を調べた。被験物質溶液を用いて前述の三次元培養を行った後、前述のゼラチンザイモグラフィーに記載の方法に従って、実験を行った。結果を図９に示す。
図９によれば、トリプトライドがＩＬ−１βによって引き起こされるｐｒｏＭＭＰ−２およびＭＭＰ−２の増加、並びにｐｒｏＭＭＰ−９活性化を抑制し、コハク酸トリプトライドナトリウム塩がＭＭＰ−２増加およびＭＭＰ−９活性化を抑制することがわかる。
製剤例１：点眼剤
トリプトライド ３．６ｍｇ
ポリソルベート８０ ０．１ｇ
リン酸二水素ナトリウム ０．１ｇ
塩化ナトリウム ０．９ｇ
塩化ベンザルコニウム ０．００５ｇ
水酸化ナトリウム 適量（ｐＨ７．０）
滅菌精製水 Ｔｏｔａｌ １００ｍＬ
以上を混和して懸濁点眼剤とする。
製剤例２：点眼剤
トリプトライド ３６ｍｇ
ホウ酸 ７００ｍｇ
ホウ砂 適量
塩化ナトリウム ５００ｍｇ
ヒドロキシメチルセルロース ５００ｍｇ
エデト酸ナトリウム ０．０５ｍｇ
塩化ベンザルコニウム ０．０００５ｍｇ
滅菌精製水 Ｔｏｔａｌ １００ｍＬ
以上を混和して懸濁点眼剤とする。
製剤例３：眼軟膏剤
トリプトライド ３．６ｍｇ
精製ラノリン １０ｇ
白色ワセリン １００ｇ
以上を混和して眼軟膏剤とする。
製剤例４：眼軟膏剤
トリプトライド ３．６ｍｇ
ダイズ油 ５ｇ
白色ワセリン １００ｇ
以上を混和して眼軟膏剤とする。
製剤例５：点眼剤
コハク酸トリプトライド ナトリウム塩 ４．８ｍｇ
ホウ酸 ７００ｍｇ
ホウ砂 適量
塩化ナトリウム ５００ｍｇ
ヒドロキシメチルセルロース ５００ｍｇ
エデト酸ナトリウム ０．００５ｍｇ
塩化ベンザルコニウム ０．０００５ｍｇ
滅菌精製水 Ｔｏｔａｌ １００ｍＬ
以上を混和して懸濁点眼剤とする。
製剤例６：眼軟膏剤
コハク酸トリプトライド ナトリウム塩 ４．８ｍｇ
精製ラノリン １０ｇ
白色ワセリン １００ｇ
以上を混和して眼軟膏剤とする。
【産業上の利用可能性】
本発明によれば、ステロイド薬のような副作用の危惧なく、角膜潰瘍を治療することが可能となる。
本出願は、日本で出願された特願２００３−０５２０７２を基礎としており、それらの内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【技術分野】
本発明は角膜潰瘍治療剤に関する。より詳細には、本発明は、トリプトライドまたはその誘導体を含有する角膜潰瘍治療剤に関する。
【背景技術】
角膜は、上皮細胞、ボーマン膜、角膜実質、デスメ膜、内皮細胞からなる。角膜は正常では無血管組織であり、血管の代わりに前眼房の房水から栄養を受け取る。角膜はまた免疫系細胞も有していない。従って、角膜は他の組織に比べ、非常に特殊な組織であると言える。
角膜潰瘍は、主にコラーゲンから構成されている角膜実質（以下、単に実質と記載することもある）がコラーゲン分解酵素の活性化や過剰分泌により融解し欠損している状態である。角膜潰瘍を引き起こすコラーゲン分解酵素としては、細菌性コラゲナーゼとマトリックスメタロプロテアーゼ群（ＭＭＰｓ）が知られている。角膜に細菌などが感染すると、細菌性コラゲナーゼが分泌され、これが直接的に角膜実質のコラーゲンを分解し、角膜潰瘍を引き起こす。同時に、細菌などの微生物はその他の酵素や毒素を分泌し、これらの因子が生物学的信号となって角膜実質細胞（角膜線維芽細胞と呼ばれることもある）の活性化を引き起こし、活性化された角膜実質細胞が不活性なＭＭＰｓ（ｐｒｏＭＭＰｓ）を産生し、ｐｒｏＭＭＰｓが分泌される。さらにｐｒｏＭＭＰｓは、亢進した活性化機構および細菌性の酵素による限定分解により活性なＭＭＰｓとなりこれが角膜潰瘍を引き起こす（活性化ＭＭＰｓの活性のコントロールは、ＴＩＭＰｓ（Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ）の濃度に依存する）。実質コラーゲンの破壊により生じた細胞外環境の変化はさらに角膜実質細胞の活性化に伴うＭＭＰｓの産生・活性化または浸潤してきた炎症性細胞により分泌されるＭＭＰｓにより潰瘍を進行させるので、ここに角膜実質細胞の活性化と角膜実質の破壊の悪循環が生じる。抗生物質などで細菌が殺されると細菌性コラゲナーゼ分泌は抑制され細菌による直接的な角膜実質破壊は抑制されるが、抗生物質などは一旦細菌などから角膜実質細胞に送られた生物学的信号による角膜実質細胞の活性化を抑制することができないため、臨床的には潰瘍の進行が認められることがある。この悪循環を抑制する因子は現在のところステロイド薬だけであると考えられていた（西田輝夫ら編，「月刊眼科診療プラクティス（第７９号）角結膜疾患の薬物療法」，第１版，株式会社文光堂，２００２年１月，ｐ．９−１１）。
トリプトライドは、雷公藤（Ｔｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ ｗｉｌｆｏｒｄｉｉ）の主活性成分である。トリプトライドおよびその誘導体は免疫抑制作用を有することが知られており、自己免疫疾患治療剤や抗炎症剤としての使用が公知である（例えば、国際公開第９７／３１９２０号パンフレット、特表２００１−５０４４３７号公報、国際公開第９６／０８２６２号パンフレット、国際公開第９８／５２９５１号パンフレット、国際公開第００／１２４８３号パンフレット、国際公開第０２／２８８６２号パンフレット、国際公開第００／６３２１２号パンフレット、国際公開第９８／５２９３３号パンフレット、米国特許第５９７２９９８号明細書、米国特許第６００４９９９号明細書、国際公開第０２／０７０４７２号パンフレット、および国際公開第０２／０７４７５９号パンフレット）。しかし、トリプトライドおよびその誘導体が角膜においてｐｒｏＭＭＰｓ産生抑制やｐｒｏＭＭＰｓ活性化抑制を示すことは記載も示唆もされていない。
フィニ（Ｆｉｎｉ）ら著，「アーカイブズ・オブ・ダーマトロジカル・リサーチ（Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」，（独国），１９９８年，第２９０巻追補，ｐ．Ｓ１２−Ｓ２３には、合成ＭＭＰ阻害剤が、角膜のＭＭＰｓを阻害することによって動物モデルにおいて角膜潰瘍の進行を阻害しうることが記載されている。しかし、トリプトライドおよびその誘導体が角膜においてｐｒｏＭＭＰｓ産生抑制やｐｒｏＭＭＰｓ活性化抑制を示すことは記載も示唆もされていない。
リン（Ｌｉｎ）ら著，「アースライティス・アンド・ルーマティズム（ＡＲＴＨＲＩＴＳ ＆ ＲＨＥＵＭＡＴＩＳＭ）」，（米国），２００１年９月，第４４巻，第９号，ｐ．２１９３−２２２０には、トリプトライドがヒト滑液線維芽細胞においてＭＭＰｓの前駆体であるｐｒｏＭＭＰ１および３の産生を抑制することが記載されている。しかし、トリプトライドおよびその誘導体が角膜においてもｐｒｏＭＭＰｓ産生抑制やｐｒｏＭＭＰｓ活性化抑制を示すことを示唆する記載はない。
【発明の開示】
上述したように角膜実質細胞の活性化と角膜実質破壊の悪循環を抑制することが可能な角膜潰瘍治療剤は現在ステロイド薬だけであるが、ステロイド薬は様々な副反応を引き起こすことが知られており、角膜潰瘍の治療においてもステロイド薬の使用により症状が悪化する例も多い。従って、本発明者らは、ステロイド薬を使用しなくとも上記悪循環を断ち切り角膜潰瘍を治療することが可能な医薬を創製すべく鋭意検討を重ねた結果、トリプトライドおよびその誘導体が角膜においてＴＩＭＰｓの産生に影響を与えることなくｐｒｏＭＭＰｓの産生および活性化を有効に阻害し、これにより角膜潰瘍の症状を治癒・緩解することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）トリプトライドもしくはその誘導体またはその医薬上許容しうる塩を含有する角膜潰瘍治療剤。
（２）眼局所投与用である、上記（１）に記載の角膜潰瘍治療剤。
（３）点眼剤である、上記（２）に記載の角膜潰瘍治療剤。
（４）トリプトライドもしくはその誘導体またはその医薬上許容しうる塩を含有する角膜潰瘍治療用医薬組成物。
（５）眼局所投与用に用いる、上記（４）に記載の角膜潰瘍治療用医薬組成物。
（６）点眼剤に用いる、上記（５）に記載の角膜潰瘍治療用医薬組成物。
（７）トリプトライドもしくはその誘導体またはその医薬上許容しうる塩を投与することを含む角膜潰瘍の治療方法。
（８）眼局所投与用として投与することを含む、上記（７）に記載の角膜潰瘍の治療方法。
（９）点眼剤として投与することを含む、上記（８）に記載の角膜潰瘍の治療方法。
（１０）角膜潰瘍治療剤を製造するためのトリプトライドもしくはその誘導体またはその医薬上許容しうる塩の使用。
（１１）角膜潰瘍治療剤が眼局所投与用である、上記（１０）に記載の使用。
（１２）角膜潰瘍治療剤が点眼剤である、上記（１１）に記載の使用。
（１３）上記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の角膜潰瘍治療剤、および当該治療剤を角膜潰瘍の治療に使用し得るかまたは使用すべきであることを記載した書類を含む商業的パッケージ。
（１４）上記（４）〜（６）のいずれか１項に記載の医薬組成物、および当該組成物を角膜潰瘍の治療に使用し得るかまたは使用すべきであることを記載した書類を含む商業的パッケージ。
【図面の簡単な説明】
図１はＩＬ−１βにより誘発したコラーゲン分解に対してトリプトライドが及ぼす影響を、分解したコラーゲンの量を、１ウェルあたりのヒドロキシプロリン量で表したグラフである。Ｎ＝３，平均±ＳＥＭ，ＩＬ−１β濃度０．１ｎｇ／ｍｌ。＊ｐ＜０．００１（シェフェ法）
図２はウサギ角膜実質細胞によるＭＭＰおよびｐｒｏＭＭＰｓの発現にトリプトライドが及ぼす影響を示す図である。プラスミノーゲン非添加条件下で培養を行い、グリコシル化ｐｒｏＭＭＰ−１、ｐｒｏＭＭＰ−１およびｐｒｏＭＭＰ−３についてはウエスタンブロットを、ｐｒｏＭＭＰ−９、ｐｒｏＭＭＰ−２およびＭＭＰ−２についてはゼラチンザイモグラフィーを行った結果を示している。またＩＬ−１β（−）はＩＬ−１β非添加時、ＩＬ−１β（＋）はＩＬ−１β添加時の結果をそれぞれ示している。
図３はウサギ角膜実質細胞によるＭＭＰｓおよびｐｒｏＭＭＰｓの発現にトリプトライドが及ぼす影響を示す図である。６０ｍｇ／ｍｌのプラスミノーゲン添加条件下で培養を行い、グリコシル化ｐｒｏＭＭＰ−１、ｐｒｏＭＭＰ−１、ＭＭＰ−１、ｐｒｏＭＭＰ−３およびＭＭＰ−３についてはウエスタンブロットを、ｐｒｏＭＭＰ−９二量体、ｐｒｏＭＭＰ−９、ＭＭＰ−９中間体、ＭＭＰ−９、ｐｒｏＭＭＰ−２およびＭＭＰ−２についてはゼラチンザイモグラフィーを行った結果を示している。またＩＬ−１β（−）はＩＬ−１β非添加時、ＩＬ−１β（＋）はＩＬ−１β添加時の結果をそれぞれ示している。
図４はＩＬ−１βにより誘発したコラーゲン分解に対してデキサメタゾンが及ぼす影響を、分解したコラーゲンの量を、１ウェルあたりのヒドロキシプロリン量で表したグラフである。Ｎ＝３，平均±ＳＥＭ，ＩＬ−１β濃度０．１ｎｇ／ｍｌ。＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．００１（シェフェ法）
図５はウサギ角膜実質細胞によるＭＭＰおよびｐｒｏＭＭＰｓの発現にデキサメタゾンが及ぼす影響を示す図である。プラスミノーゲン非添加条件下で培養を行い、グリコシル化ｐｒｏＭＭＰ−１、ｐｒｏＭＭＰ−１およびｐｒｏＭＭＰ−３についてはウエスタンブロットを、ｐｒｏＭＭＰ−９、ｐｒｏＭＭＰ−２およびＭＭＰ−２についてはゼラチンザイモグラフィーを行った結果を示している。またＩＬ−１β（−）はＩＬ−１β非添加時、ＩＬ−１β（＋）はＩＬ−１β添加時の結果をそれぞれ示している。
図６はウサギ角膜実質細胞によるＭＭＰｓおよびｐｒｏＭＭＰｓの発現にデキサメタゾンが及ぼす影響を示す図である。６０ｍｇ／ｍｌのプラスミノーゲン添加条件下で培養を行い、グリコシル化ｐｒｏＭＭＰ−１、ｐｒｏＭＭＰ−１、ＭＭＰ−１、ｐｒｏＭＭＰ−３およびＭＭＰ−３についてはウエスタンブロットを、ｐｒｏＭＭＰ−９二量体、ｐｒｏＭＭＰ−９、ＭＭＰ−９中間体、ＭＭＰ−９、ｐｒｏＭＭＰ−２およびＭＭＰ−２についてはゼラチンザイモグラフィーを行った結果を示している。またＩＬ−１β（−）はＩＬ−１β非添加時、ＩＬ−１β（＋）はＩＬ−１β添加時の結果をそれぞれ示している。
図７はＴＩＭＰ−１産生を、ｍＲＮＡのコピー数の相対値で表したグラフである。Ｎ＝２〜４，平均±ＳＤ，ＩＬ−１β濃度０．１ｎｇ／ｍｌ，デキサメタゾン濃度１ｎＭ，トリプトライド濃度３μＭ。
図８はＩＬ−１βにより誘発したコラーゲン分解に対してトリプトライドおよびコハク酸トリプトライドナトリウム塩が及ぼす影響を、分解したコラーゲンの量を、１ウェルあたりのヒドロキシプロリン量で表したグラフである。またＩＬ−１β（−）はＩＬ−１β非添加時、ＩＬ−１β（＋）はＩＬ−１β添加時の結果をそれぞれ示している。Ｎ＝３、平均±ＳＤ、ＩＬ−１β濃度０．１ｎｇ／ｍｌ。＊ｐ＜０．００１（ダネット法）
図９はウサギ角膜実質細胞によるＭＭＰｓおよびｐｒｏＭＭＰｓの発現にトリプトライドおよびコハク酸トリプトライドナトリウム塩が及ぼす影響を示す図である。プラスミノーゲン添加条件下で培養を行い、ｐｒｏＭＭＰ−９、ＭＭＰ−９、ｐｒｏＭＭＰ−２およびＭＭＰ−２についてゼラチンザイモグラフィーを行った結果を示している。またＩＬ−１β（−）はＩＬ−１β非添加時、ＩＬ−１β（＋）はＩＬ−１β添加時の結果をそれぞれ示している。ＩＬ−１β濃度０．１ｎｇ／ｍｌ。
発明の詳細な説明
本明細書における角膜潰瘍とは、角膜の上皮が欠損し、当該上皮欠損部分の実質も一部欠損している状態を示し、細菌感染などの生物学的刺激に由来するものであっても化学的または物理的刺激に由来するものであってもよく、その要因は特に限定されない。
本明細書におけるトリプトライドとは以下の構造を有する化合物であって、その由来は天然であっても合成であってもよい。
天然由来のトリプトライドとしては、Ｔｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ ｗｉｌｆｏｒｄｉｉ由来のものが挙げられる。例えば、国際公開第９８／５２９５１号パンフレットに記載のようなＴｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ ｗｉｌｆｏｒｄｉｉのエタノール抽出物等の溶媒抽出物、またその抽出物をさらに精製したものなどが挙げられ、Ｔｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ ｗｉｌｆｏｒｄｉｉ由来であれば液体、固体等どのような最終形態をとっていようとも本発明に用いることができる。
本明細書におけるトリプトライドの誘導体としては、国際公開第９７／３１９２０号パンフレット、特表２００１−５０４４３７号公報、国際公開第９６／０８２６２号パンフレット、国際公開第９８／５２９５１号パンフレット、国際公開第００／１２４８３号パンフレット、国際公開第０２／２８８６２号パンフレット、国際公開第００／６３２１２号パンフレット、国際公開第９８／５２９３３号パンフレット、米国特許第５９７２９９８号明細書、米国特許第６００４９９９号明細書、国際公開第０２／０７０４７２号パンフレット、国際公開第０２／０７４７５９号パンフレットに記載のトリプトライド誘導体が挙げられ、これらの誘導体は、それぞれの文献を参照することにより合成可能である。以下に各文献に記載のトリプトライド誘導体を具体的に記載する。
国際公開第９７／３１９２０号パンフレットおよび特表２００１−５０４４３７号公報には、
コハク酸トリプトライド
コハク酸トリプトライド Ｔｒｉｓ塩
コハク酸トリプトライド ナトリウム塩
コハク酸トリプトライド リジン塩
トリプトライド １４−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシンエステル
トリプトライドの１４−（３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピオン酸）エステル 塩酸塩
トリプトライドの１４−（４’−Ｎ−ピロリジノ）ブチレートエステル 塩酸塩
１６−ヒドロキシトリプトライド ビス−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシンエステル
などのトリプトライド誘導体が記載されている。
国際公開第９６／０８２６２号パンフレットには、以下に示す構造を有するＴｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ ｗｉｌｆｏｒｄｉｉのエタノール抽出物およびその精製トリプトライド成分が記載されている。
国際公開第９８／５２９５１号パンフレットおよび米国特許第６００４９９９号明細書には、
［５ａＲ−（５ａα，６α，６ａα，７ａα，７ｂβ，８ａＳ＊，８ｂα）］−３，３ｂ，４，５，５ａ，６，６ａ，７ａ，７ｂ，８ｂ，９，１０−ドデカヒドロ−５ａ，６−ジヒドロキシ−８ｂ−メチル−６ａ−（１−メチルエチル）−１Ｈ−ビスオキシレノ［４ｂ，５：６，７］フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−１−オン
［１Ｓ−（１α，２β，３α，３ａβ，４ａＲ＊，４ｂα，１１ａα）］−３−クロロ−１，２，３，３ａ，４ｂ，５，６，９，９ｂ，１０，１１，１１ａ−ドデカヒドロ−１，２，１１ａ−トリヒドロキシ−４ｂ−メチル−２−（１−メチルエチル）−７Ｈ−オキシレノ［４ｂ，５］フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−７−オン
［１Ｓ−（１α，２β，３α，３ａβ，４ａＲ＊，４ｂα，１１β，１１ａα）］−３−クロロ−１，２，３，３ａ，４ｂ，５，６，９，９ｂ，１０，１１，１１ａ−ドデカヒドロ−１，１１ａ−ジヒドロキシ−４ｂ−メチル−２−（１−メチルエチル）−２，１１−エポキシ−７Ｈ−オキシレノ［４ｂ，５］フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−７−オン
［１Ｓ−（１α，２β，３α，３ａβ，４ａＲ＊，４ｂα，１１β，１１ａα）］−３−ブロモ−１，２，３，３ａ，４ｂ，５，６，９，９ｂ，１０，１１，１１ａ−ドデカヒドロ−１，１１ａ−ジヒドロキシ−４ｂ−メチル−２−（１−メチルエチル）−２，１１−エポキシ−７Ｈ−オキシレノ［４ｂ，５］フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−７−オン
［３ｂＳ−（３ｂα，５ａβ，６β，６ａβ，７ａβ，７ｂα，８ａＲ＊，８ｂβ，１０β）］−３，３ｂ，４，５，５ａ，６，６ａ，７ａ，７ｂ，８ｂ，９，１０−ドデカヒドロ−５ａ，６，１０−トリヒドロキシ−８ｂ−メチル−６ａ−（１−メチルエチル）−１Ｈ−ビスオキシレノ［４ｂ，５：６，７］フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−１−オン
［１Ｓ−（１α，２β，３α，３ａβ，４ａＲ＊，４ｂα，６α，９ｂβ，１１ａα）］−３−クロロ−１，２，３，３ａ，４ｂ，５，６，９，９ｂ，１０，１１，１１ａ−ドデカヒドロ−１，２，６，１１ａ−テトラヒドロキシ−４ｂ−メチル−２−（１−メチルエチル）−７Ｈ−オキシレノ［４ｂ，５］フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−７−オン
［１Ｓ−（１α，２β，３α，３ａβ，４ａＲ＊，４ｂα，６α，９ｂβ，１１β，１１ａα）］−３−クロロ−１，２，３，３ａ，４ｂ，５，６，９，９ｂ，１０，１１，１１ａ−ドデカヒドロ−１，６，１１ａ−トリヒドロキシ−４ｂ−メチル−２−（１−メチルエチル）−２，１１−エポキシ−７Ｈ−オキシレノ［４ｂ，５］フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−７−オン
［３ｂＳ−（３ｂα，５ａβ，６β，６ａβ，７ａβ，７ｂα，８ａＲ＊，８ｂβ）］−３，３ｂ，４，５，５ａ，６，６ａ，７ａ，７ｂ，８ｂ，９，１０−ドデカヒドロ−５ａ，６−ジヒドロキシ−６ａ−（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）−８ｂ−メチル−１Ｈ−ビスオキシレノ［４ｂ，５：６，７］フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−１−オン
［１Ｓ−（１α，２β，３α，３ａβ，４ａＲ＊，４ｂα，９ｂβ，１１ａα）］−３−クロロ−１，２，３，３ａ，４ｂ，５，６，９，９ｂ，１０，１１，１１ａ−ドデカヒドロ−１，２，１１ａ−トリヒドロキシ−２−（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）−４ｂ−メチル−７Ｈ−オキシレノ［４ｂ，５］フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−７−オン
［１Ｓ−（１α，２β，３α，３ａβ，４ａＲ＊，４ｂα，９ｂβ，１１β，１１ａα）］−３−クロロ−１，２，３，３ａ，４ｂ，５，６，９，９ｂ，１０，１１，１１ａ−ドデカヒドロ−１，１１ａ−ジヒドロキシ−２−（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）−４ｂ−メチル−２，１１−エポキシ−７Ｈ−オキシレノ［４ｂ，５］フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−７−オン
［３ｂＳ−（３ｂα，５ａβ，６β，６ａβ，７ａβ，７ｂα，８ａＲ＊，８ｂβ）］−６ａ−（２−ヒドロキシ−１−メチルエチル）−３，３ｂ，４，５，５ａ，６，６ａ，７ａ，７ｂ，８ｂ，９，１０−ドデカヒドロ−５ａ，６−ジヒドロキシ−８ｂ−メチル−１Ｈ−ビスオキシレノ「４ｂ，５：６，７］フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−１−オン
［１Ｓ−（１α，２β，３α，３ａβ，４ａＲ＊，４ｂα，９ｂβ，１１ａα）］−３−クロロ−２−（２−ヒドロキシ−１−メチルエチル）−１，２，３，３ａ，４ｂ，５，６，９，９ｂ，１０，１１，１１ａ−ドデカヒドロ−１，２，１１ａ−トリヒドロキシ−４ｂ−メチル−７Ｈ−オキシレノ［４ｂ，５］フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−７−オン
［１Ｓ−（１α，２β，３α，３ａβ，４ａＲ＊，４ｂα，９ｂβ，１１β，１１ａα）］−３−クロロ−２−（２−ヒドロキシ−１−メチルエチル）−１，２，３，３ａ，４ｂ，５，６，９，９ｂ，１０，１１，１１ａ−ドデカヒドロ−１，１１ａ−ジヒドロキシ−４ｂ−メチル−１，１１−エポキシ−７Ｈ−オキシレノ［４ｂ，５］フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−７−オン
［３ｂＳ−（３ｂα，５ａβ，６β，６ａβ，７ａβ，７ｂα，８ａＲ＊，８ｂβ）］−モノ［３，３ｂ，４，５，５ａ，６，６ａ，７ａ，７ｂ，８ｂ，９，１０−ドデカヒドロ−５ａ−ヒドロキシ−８ｂ−メチル−６ａ−（１−メチルエチル）−１−オキソ−１Ｈ−ビスオキシレノ［４ｂ，５：６，７］フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−６−イル］エステル・ブタン二酸
［１Ｓ−（１α，２β，３α，３ａβ，４ａＲ＊，４ｂα，９ｂβ，１１ａα）］−モノ［３−クロロ−１，３，３ａ，４ｂ，５，６，７，９，９ｂ，１０，１１，１１ａ−ドデカヒドロ−２，１１ａ−ジヒドロキシ−４ｂ−メチル−２−（１−メチルエチル）−７−オキソ−２Ｈ−オキシレノ［４ｂ，５］フェナントロ［２，１−ｃ］フラン−１−イル］エステル・ブタン二酸
［３ｂＳ−（３ｂα，５ａβ，６β，６ａβ，７ａβ，７ｂα，８ａＲ＊，８ｂβ）］−モノ［３，３ｂ，４，５，５ａ，６，６ａ，７ａ，７ｂ，８ｂ，９，１０−ドデカヒドロ−５ａ−ヒドロキシ−８ｂ−メチル−６ａ−（１−メチルエチル）−１−オキソ−１Ｈ−ビスオキシレノ［４ｂ，５：６，７］フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−６−イル］エステル・ペンタン二酸
［３ｂＳ−（３ｂα，５ａβ，６β，６ａβ，７ａβ，７ｂα，８ａＲ＊，８ｂβ，１０β）］−３，３ｂ，４，５，５ａ，６，６ａ，７ａ，７ｂ，８ｂ，９，１０−ドデカヒドロ−５ａ−ヒドロキシ−８ｂ−メチル−６ａ−（１−メチルエチル）−１−オキソ−１Ｈ−ビスオキシレノ［４ｂ，５：６，７］フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−６，１０−ジイルエステル・ブタン二酸
［３ｂＳ−（３ｂα，５ａβ，６β，６ａβ，７ａβ，７ｂα，８ａＲ＊，８ｂβ）］−モノ［２−［６−（３−カルボキシ−１−オキソプロポキシ）−１，３，３ｂ，４，５，５ａ，６，７ａ，７ｂ，８ｂ，９，１０−ドデカヒドロ−５ａ−ヒドロキシ−８ｂ−メチル−１−オキソ−６ａＨ−ビスオキシレノ［４ｂ，５：６，７］フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−６ａ−イル］−プロピル］エステル・ブタン二酸
［３ｂＳ−（３ｂα，５ａβ，６β，６ａβ，７ａβ，７ｂα，８ａＲ＊，８ｂβ）］−３，３ｂ，４，５，５ａ，６，６ａ，７ａ，７ｂ，８ｂ，９，１０−ドデカヒドロ−５ａ−ヒドロキシ−８ｂ−メチル−６ａ−（１−メチルエチル）−１Ｈ−ビスオキシレノ［４ｂ，５：６，７］フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−６−イルエステル・Ｌ−アラニントリフルオロ酢酸
［３ｂＳ−（３ｂα，５ａβ，６β，６ａβ，７ａβ，７ｂα，８ａＲ＊，８ｂβ）］−３，３ｂ，４，５，５ａ，６，６ａ，７ａ，７ｂ，８ｂ，９，１０−ドデカヒドロ−５ａ−ヒドロキシ−８ｂ−メチル−６ａ−（１−メチルエチル）−１Ｈ−ビスオキシレノ［４ｂ，５：６，７］フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−６−イルエステル・Ｌ−フェニルアラニントリフルオロ酢酸
などのトリプトライド誘導体が記載されている。
国際公開第００／１２４８３号パンフレットには、以下に示す構造を有するトリプトライド誘導体が記載されている。
国際公開第０２／２８８６２号パンフレットには、以下に示す構造を有する化合物が記載されている。
国際公開第００／６３２１２号パンフレットには、
１２−チオシアノ−１３−ヒドロキシトリプトライド
が記載されている。
国際公開第９８／５２９３３号パンフレットおよび米国特許第５９７２９９８号明細書には、［５ａＳ−（５ａα，５ｂα，８β，９α，９ａＲ＊，１０ａβ）］−４，５ａ，５ｂ，８，９，１０ａ，１１，１１ａ−オクタヒドロ−５ｂ，８，９−トリヒドロキシ−５ａ−メチル−８−（１−メチルエチル）−１Ｈ−オキシレノ［８ａ，９］フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−３（５Ｈ）−オン
［５ａＲ−（５ａα，６α，７β，９ａα，９ｂα）］−３ｂ，４，５，５ａ，６，７，９ａ，９ｂ，１０，１１−デカヒドロ−５ａ，６，７，９ａ−テトラヒドロキシ−９ｂ−メチル−７−（１−メチルエチル）−フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−１（３Ｈ）−オン
［５Ｒ−（５α，５ａβ，６β，７α，９ａβ，９ｂβ）］−３ｂ，４，５，５ａ，６，７，９ａ，１０，１１−デカヒドロ−５ａ，６，９ａ−トリヒドロキシ−９ｂ−メチル−７−（１−メチルエチル）−５，７−エポキシフェナントロ［１，２−ｃ］フラン−１（３Ｈ）−オン
［５ａＳ−（５ａα，５ｂα，８β，９α，９ａＲ＊，１０ａβ）］−４，５ａ，５ｂ，６，７，８，９，１０ａ，１１，１１ａ−デカヒドロ−５ｂ，８，９−トリヒドロキシ−５ａ−メチル−８−（１−メチルエチル）−１Ｈ−オキシレノ［８ａ，９］フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−３（５Ｈ）−オン
［５ａＲ−（５ａα，６α，７β，９ａα，９ｂα）］−３ｂ，４，５，５ａ，６，７，８，９，９ａ，９ｂ，１０，１１−ドデカヒドロ−５ａ，６，７，９ａ−テトラヒドロキシ−９ｂ−メチル−７−（１−メチルエチル）−フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−１（３Ｈ）−オン
［５Ｒ−（５α，５ａβ，６β，７α，９ａβ，９ｂβ）］−３ｂ，４，５，５ａ，６，７，８，９，９ａ，９ｂ，１０，１１−ドデカヒドロ−５ａ，６，９ａ−トリヒドロキシ−９ｂ−メチル−７−（１−メチルエチル）−５，７−エポキシフェナントロ［１，２−ｃ］フラン−１（３Ｈ）−オン
［４Ｓ−（４α，５ａα，５ｂα，８β，９α，９ａＲ＊，１０ａβ，１１ａβ）］−８−（１−メチルエチル）−４，５ａ，５ｂ，８，９，１０ａ，１１，１１ａ−オクタヒドロ−４，５ｂ，８，９−テトラヒドロキシ−５ａ−メチル−１Ｈ−オキシレノ［８ａ，９］フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−３（５Ｈ）−オン
［５ａＲ−（５ａα，６α，７β，９ａα，９ｂα，１１α）］−３ｂ，４，５，５ａ，６，７，９ａ，９ｂ，１０，１１−デカヒドロ−５ａ，６，７，９ａ，１１−ペンタヒドロキシ−９ｂ−メチル−７−（１−メチルエチル）−フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−１（３Ｈ）−オン
［３ｂＳ−（３ｂα，５α，５ａβ，６β，７α，９ａβ，９ｂβ，１１β）］−３ｂ，４，５，５ａ，６，７，９ａ，９ｂ，１０，１１−デカヒドロ−５ａ，６，９ａ，１１−テトラヒドロキシ−９ｂ−メチル−７−（１−メチルエチル）−５，７−エポキシフェナントロ［１，２−ｃ］−フラン−１（３Ｈ）−オン
［５ａＳ−（５ａα，５ｂα，８β，９α，９ａＲ＊，１０ａβ，１１ａβ）］−４，５ａ，５ｂ，８，９，１０ａ，１１，１１ａ−オクタヒドロ−５ｂ，８，９−トリヒドロキシ−８−（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）−５ａ−メチル−１Ｈ−オキシレノ［８ａ，９］フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−３（５Ｈ）−オン
［５ａＲ−（５ａα，６α，７β，９ａα，９ｂα）］−３ｂ，４，５，５ａ，６，７，９ａ，９ｂ，１０，１１−デカヒドロ−５ａ，６，７，９ａ−テトラヒドロキシ−７−（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）−９ｂ−メチル−フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−１（３Ｈ）−オン
［３ｂＳ−（３ｂα，５α，５ａβ，６β，７α，９ａβ，９ｂβ）］−３ｂ，４，５，５ａ，６，７，９ａ，９ｂ，１０，１１−デカヒドロ−５ａ，６，９ａ−トリヒドロキシ−７−（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）−９ｂ−メチル−５，７−エポキシフェナントロ［１，２−ｃ］フラン−１（３Ｈ）−オン
［５ａＳ−（５ａα，５ｂα，８β，９α，９ａＲ＊，１０ａβ）］−４，５ａ，５ｂ，８，９，１０ａ，１１，１１ａ−オクタヒドロ−５ｂ，８，９−トリヒドロキシ−５ａ−メチル−８−（２−ヒドロキシ−１−メチルエチル）−１Ｈ−オキシレノ［８ａ，９］フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−３（５Ｈ）−オン
［５ａＲ−（５ａα，６α，７β，９ａα，９ｂα）］−３ｂ，４，５，５ａ，６，７，９ａ，９ｂ，１０，１１−デカヒドロ−５ａ，６，７，９ａ−テトラヒドロキシ−７−（２−ヒドロキシ−１−メチルエチル）−９ｂ−メチル−フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−１（３Ｈ）−オン
［５Ｒ−（５α，５ａβ，６β，７α，９ａβ，９ｂβ）］−３ｂ，４，５，５ａ，６，７，９ａ，９ｂ，１０，１１−デカヒドロ−５ａ，６，９ａ−トリヒドロキシ−９ｂ−メチル−７−（２−ヒドロキシ−１−メチルエチル）−５，７−エポキシフェナントロ［１，２−ｃ］フラン−１（３Ｈ）−オン
［５ａＳ−（５ａα，５ｂα，８β，９α，９ａＳ＊，１０ａβ，１１ａβ）］−モノ［３，４，５，５ａ，５ｂ，８，９，１０ａ，１１，１１ａ−デカヒドロ−５ｂ，８−ジヒドロキシ−５ａ−メチル−８−（１−メチルエチル）−３−オキソ−１Ｈ−オキシレノ［８ａ，９］フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−９−イル］エステル・ブタン二酸
［３ｂＳ−（３ｂα，５ａβ，６β，７α，９ａβ，９ｂβ）］−モノ［１，３，３ｂ，４，５，５ａ，６，７，９ａ，９ｂ，１０，１１−ドデカヒドロ−５ａ，７，９ａ−トリヒドロキシ−９ｂ−メチル−７−（１−メチルエチル）−１−オキソフェナントロ［１，２−ｃ］フラン−６−イル］エステル・ブタン二酸
［３ｂＳ−（３ｂα，５α，５ａβ，６β，７α，９ａβ，９ｂβ）］−モノ［１，３，３ｂ，４，５，５ａ，６，７，９ａ，９ｂ，１０，１１−ドデカヒドロ−５ａ，９ａ−ジヒドロキシ−９ｂ−メチル−７−（１−メチルエチル）−１−オキソ−５，７−エポキシフェナントロ［１，２−ｃ］フラン−６−イル］エステル・ブタン二酸
［５ａＳ−（５ａα，５ｂβ，８β，９α，９ａＳ＊，１０ａβ，１１ａβ）］−モノ［３，４，５，５ａ，８，９，１０ａ，１１，１１ａ−デカヒドロ−５ｂ，８−ジヒドロキシ−５ａ−メチル−８−（１−メチルエチル）−３−オキソ−１Ｈ−オキシレノ［８ａ，９］フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−９−イル］エステル・ペンタン二酸
［４Ｓ−（４α，５ａα，５ｂα，８β，９α，９ａＳ＊，１０ａβ，１１ａβ）］−３，４，５，５ａ，５ｂ，８，９，１０ａ，１１，１１ａ−デカヒドロ−５ｂ，８−ジヒドロキシ−５ａ−メチル−８−（１−メチルエチル）−３−オキソ−１Ｈ−オキシレノ［８ａ，９］フェナントロ［１，２−ｃ］フラン−４，９−ジイルエステル・ブタン二酸
［３ｂＳ−（３ｂα，５ａβ，６β，７α，９ａβ，９ｂβ）］−１，３，３ｂ，４，５，５ａ，６，７，９ａ，９ｂ，１０，１１−ドデカヒドロ−５ａ，７，９ａ−トリヒドロキシ−９ｂ−メチル−７−（１−メチルエチル）−１−オキソフェナントロ［１，２−ｃ］フラン−６−イルエステル・Ｌ−アラニン・トリフルオロ酢酸
［３ｂＳ−（３ｂα，５ａβ，６β，７α，９ａβ，９ｂβ）］−１，３，３ｂ，４，５，５ａ，６，７，９ａ，９ｂ，１０，１１−ドデカヒドロ−５ａ，７，９ａ−トリヒドロキシ−９ｂ−メチル−７−（１−メチルエチル）−１−オキソフェナントロ［１，２−ｃ］フラン−６−イルエステル・Ｌ−フェニルアラニン・トリフルオロ酢酸
などのトリプトライド誘導体が記載されている。
国際公開第０２／０７０４７２号パンフレットには、以下に示す構造を有するトリプトライド誘導体が記載されている。
国際公開第０２／０７４７５９号パンフレットには、
トリプトライド １４−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−α−ｔ−ブチル−Ｌ−グルタミン酸エステル
トリプトライド １４−α−ベンジルオキシカルボニル−Ｄ−グルタミン酸エステル
トリプトライド １４−γ−ベンジル−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−（Ｌ）−グルタミン酸エステルＤ体混合物
トリプトライド １４−β−ベンジル−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−（Ｌ）−アスパラギン酸エステルＤ体混合物
トリプトライド １４−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−β−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−β−ｔｅｒｔ−ブチル−（Ｌ）−アスパラギン酸エステルＤ体混合物
トリプトライド １４−γ−Ｌ−グルタミン酸エステル
などのトリプトライド誘導体が記載されている。
本発明で用いるトリプトライドまたはその誘導体は、医薬上許容しうる塩の形態のものを適宜用いることもできる。そのような塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩、過塩素酸塩等の無機酸塩；ギ酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、プロピオン酸塩、シュウ酸塩、グリコール酸塩、コハク酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、ヒドロキシマレイン酸塩、メチルマレイン酸塩、フマール酸塩、アジピン酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、ケイ皮酸塩、アスコルビン酸塩、サリチル酸塩、２−アセトキシ安息香酸塩、ニコチン酸塩、イソニコチン酸塩等の有機酸塩；メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、イソチオン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ナフタレンスルホン酸塩等のスルホン酸塩；アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等の酸性アミノ酸塩；ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩；トリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ピリジン塩、ピコリン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩等の有機塩基塩；リジン塩、アルギニン塩等の塩基性アミノ酸塩等の酸付加塩および塩基付加塩などを挙げることができる。また、場合によっては水和物、またはアルコール等との溶媒和物であってもよい。
本発明の角膜潰瘍治療剤は、トリプトライドまたはその誘導体の角膜潰瘍治癒作用に悪影響を与えない限り、トリプトライドまたはその誘導体以外の任意の成分を含むことができる。そのような成分には例えば、抗菌剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、抗アレルギー剤、抗ウイルス剤、血管収縮剤などが挙げられ、具体的には、塩酸ロメフロキサシン、オフロキサシン、ノルフロキサシン、レボフロキサシン、エリスロマイシン、スルフイソキサゾール、塩酸オキシテトラサイクリン、硫酸ポリオキシンＢ、塩酸セフメノキシム、クロラムフェニコール、スルベニシリン、トブラマイシン、硫酸ゲンタマイシン、硫酸シソマイシン、硫酸フラジオマイシン、硫酸ミクロマイシン等の抗菌剤；シクロスポリン、ラパマイシン、タクロリムス等の免疫抑制剤；アズレン、インドメタシン、塩化リゾチーム、ジクロフェナクナトリウム、プラノプロフェン等の抗炎症剤；フマル酸ケトチフェン、トラニラスト、メタキジン、ジフェンヒドラミン等の抗アレルギー剤；アシクロビル、イドクスウリジン、ピマリシン等の抗ウイルス剤；硝酸テトラハイドロゾリン、塩酸オキシメタゾリン等の血管収縮剤などが挙げられる。
本発明の角膜潰瘍治療剤は、当該分野で通常用いられているような添加剤を投与形態に応じ適宜加えることも可能である。
本発明の角膜潰瘍治療剤は、角膜潰瘍の治療効果を奏する限りその投与経路は特に限定されないが、好ましくは眼局所投与される。眼局所投与用剤形には、例えば、点眼剤や眼軟膏剤が挙げられる。
例えば、本発明の角膜潰瘍治療剤を点眼剤または眼軟膏剤として用いる場合、安定剤（例えば、亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエンなど）、溶解補助剤（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、マクロゴール、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油など）、懸濁化剤（例えば、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなど）、乳化剤（例えば、ポリビニルピロリドン、大豆レシチン、卵黄レシチン、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリソルベート８０など）、緩衝剤（例えば、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸、イプシロンアミノカプロン酸など）、粘稠剤（例えば、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースなどの水溶性セルロース誘導体、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム、カルボキシビニルポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、マクロゴールなど）、保存剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、グルコン酸クロルヘキシジン、クロロブタノール、ベンジルアルコール、デヒドロ酢酸ナトリウム、パラオキシ安息香酸エステル類、エデト酸ナトリウム、ホウ酸など）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、ホウ酸、ブドウ糖、プロピレングリコールなど）、ｐＨ調整剤（例えば、塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸など）、清涼化剤（例えば、１−メントール、ｄ−カンフル、ｄ−ボルネオール、ハッカ油など）、軟膏基剤（白色ワセリン、精製ラノリン、流動パラフィン、植物油（オリーブ油、椿油、落花生油など）など）などを添加剤として加えることができる。これら添加剤の添加量は、添加する添加剤の種類、用途などによって異なるが、添加剤の目的を達成し得る濃度を添加すればよい。
本発明の角膜潰瘍治療剤を点眼剤または眼軟膏剤とする場合、製剤分野で通常用いられている方法に従って製造すればよく、例えば第１４改正日本薬局方、製剤総則、点眼剤の項および眼軟膏剤の項に記載された方法に基づき製造することができる。
本発明の角膜潰瘍治療剤の投与対象は特に限定されず、ヒトをはじめサル、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、イヌ、ウマ、ウシ等種々の哺乳動物における角膜潰瘍治療に有用である。
本発明の角膜潰瘍治療剤をヒトに投与する場合には、トリプトライドまたはその誘導体の濃度として約１００ｎＭ〜約１０００μＭ、好ましくは約１μＭ〜約１００μＭのトリプトライドまたはその誘導体を含む溶液を、１日１回〜６回、１回に片眼あたり１〜２滴を投与すればよい。
【実施例】
以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に記載するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
実施例１．トリプトライド
試薬の調製
〔トリプトライド溶液の調製〕
トリプトライド〔ＰＧ４９０〕（ＡＬＥＸＩＳ ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬＳ社製，スイス、Ｔｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ ｗｉｌｆｏｒｄｉｉからの単離物、純度９８％）１ｍｇをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）０．９２５ｍｌに溶解した（３．０×１０−３Ｍ）。この溶液を無血清イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）にて５００倍希釈した（６．０×１０−６Ｍ）。以降、順次０．２％ＤＭＳＯの入った無血清ＭＥＭで１０倍希釈した。
〔デキサメタゾン溶液の調製〕
デキサメタゾン（シグマアルドリッチジャパン社製）３９．２５ｍｇをＤＭＳＯ１．０ｍｌに溶解した（１．０×１０−１Ｍ）。この溶液を無血清ＭＥＭにて５００倍希釈した（２．０×１０−４Ｍ）。以降、０．２％ＤＭＳＯの入った無血清ＭＥＭで順次１０倍希釈した。
〔エールリッヒ試薬溶液の調製〕
６０％過塩素酸１０ｍｌと２−プロパノール６５ｍｌとを混合し、ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド６．６ｇを加えて溶解した。
〔ヒドロキシプロリン標準溶液の調製〕
ヒドロキシプロリン２０ｍｇを全量５０ｍｌの蒸留水に溶解して、４００μｇ／ｍｌのヒドロキシプロリン溶液を調製し冷蔵保存した。
４００μｇ／ｍｌヒドロキシプロリン（ＨＹＰ）溶液をもとに２０μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、０μｇ／ｍｌ ＨＹＰ溶液を調製した。
〔使用動物〕
Ｊａｐａｎｅｓｅ ａｌｂｉｎｏ ｒａｂｂｉｔ（体重２．５〜３．０ｋｇ、オス）をバイオテック（日）から購入して用いた。
〔その他用いた物質〕
ＭＥＭおよび組織培養培地１９９（ＴＣＭ１９９）は、Ｇｉｂｃｏ（米国）製のものを使用した。組織培養プレートはＣｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（米国）製のものを使用した。Ｕｌｔｒａ−ｆｒｅｅ（登録商標）−ＭＣフィルターはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（米国）製のものを使用した。ネイティブなブタタイプＩコラーゲン（酸可溶化）および５倍濃縮ダルベッコ改変イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）は、新田ゼラチン（日本）から入手した。ウシプラスミノーゲンは、Ｓｉｇｍａ（米国）から入手した。ＩＬ−１βは、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（米国）から入手した。Ｓ−２２５１（Ｈ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ）は第一化学薬品株式会社（日本）から入手した。ヒツジ抗ウサギＭＭＰ−１抗体およびヒツジ抗ウサギＭＭＰ−３抗体は、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｋａｎｓａｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒの永瀬氏から提供されたものを用いた。
角膜実質細胞の調製
ウサギ角膜実質細胞はＭｉｓｈｉｍａら、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．２８，１５２１−６（１９８７）の記載に従って調製し培養した。ウサギをペントバルビタールナトリウムの過投与により供死した。眼球を摘出し、角強膜切開して角膜を摘出した。実質を上皮および内皮から分離した。角膜実質細胞は、コラゲナーゼ（Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ，Ｓｉｇｍａ（米国）＃Ｃ−０１３０）（２ｍｇ／ｍｌ）で３７℃３〜４時間消化して実質から遊離させた。細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を添加したＭＥＭで培養し、３７℃湿度１００％のインキュベーター中、５％ＣＯ２条件下で増殖させ、その後、１０％ＦＢＳを含むＭＥＭで継代培養した。
三次元培養
コラーゲンゲルを新田ゼラチンのマニュアルに基づいて調製した。すなわち、得られたウサギ角膜実質細胞をＰＢＳ（−）で洗浄後、０．０５％トリプシンを１ｍｌ加え、ＣＯ２インキュベーター内で数分間放置し細胞を剥離した。１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ ５ｍｌを加えて、トリプシンの反応を止め、１５ｍｌ遠心管に細胞懸濁液を移して、１５００ｒｐｍ、５分間遠心した。上清を除去した後、一定量の無血清ＭＥＭを加えて細胞を懸濁し、ビルケルチュルク血球計算板（萱垣医理科工業）を用いて細胞数をカウントした。１５００ｒｐｍ、５分間遠心し上清を除去後、無血清ＭＥＭを加えて２２０万個／ｍｌの細胞懸濁液を調製した。Ａ．酸可溶化タイプＩコラーゲン（３ｍｇ／ｍｌ）、Ｂ．５倍濃縮ＤＭＥＭ、Ｃ．再構築緩衝液（０．０５Ｎ ＮａＯＨ、０．２６Ｍ ＮａＨＣＯ３、０．２Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ ７．３）、Ｄ．細胞懸濁液（２．２×１０６細胞／ｍｌ）を、Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄ＝７：２：１：１の割合で、氷中で冷却しながら混合した。このコラーゲン溶液を０．５ｍｌ／ウェルで２４ウェルの培養プレートに入れ、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内で０．５〜５時間放置した。次いで、ＩＬ−１β（０．１ｎｇ／ｍＬ）および種々の濃度のトリプトライドまたはデキサメタゾンを含む０．５ｍｌの無血清ＭＥＭを重層し、４８時間培養した。
実験例
〔コラーゲン分解活性の測定〕
三次元培養後、培地を回収し、１００ｋＤａを超える分子量の分解されていないコラーゲン原線維を限外濾過により取り除いた。濾液をヒートブロックで１１０℃２４時間、塩酸により加水分解した。加水分解物中のヒドロキシプロリン量を、エールリッヒ試薬を用い分光光度計を用いて測定した（Ｂｅｒｇｍａｎら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，３５，１９６１−５（１９６３））。分解したコラーゲンの量を、１ウェルあたりのヒドロキシプロリン量で表した。
〔ウエスタンブロット〕
三次元培養後、回収した培地を還元条件下１２．５％ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、分離されたタンパク質をＰＶＤＦメンブレン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ（登録商標）−Ｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製，米国）上に転写した。転写したメンブレンをブロックした後、ヒツジ抗（ウサギＭＭＰ−１）抗体またはヒツジ抗（ウサギＭＭＰ−３）抗体と反応させた。抗原の免疫検出をＥＣＬ（登録商標）ウエスタンブロット検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製，英国）を用いて行った。抗体との反応性および分子量によって各ＭＭＰを同定した。
〔ゼラチンザイモグラフィー〕
三次元培養後、０．１％ゼラチンを含有する１０％ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲルでＢｉｒｋｅｄａｌ−Ｈａｎｓｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１０７，１１７３−８（１９８２）に記載の方法に従って回収した培地を分離した。培地のサンプルを、還元剤を含まないＳＤＳ−サンプル緩衝液（１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ６．８、２０％グリセロール、２％ ＳＤＳ、０．００２％ブロモフェノールブルー）と混合した。４℃で電気泳動した後、ゲルを２．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で１時間洗浄し、プロテアーゼ活性を回復させた。次いで、反応緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ７．５、５ｍＭ ＣａＣｌ２および１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）中で、３７℃１８時間、ゲルをインキュベートした。ゲルをクマシーブリリアントブルーで染色した。分子量により各ＭＭＰを同定した。
〔ＲＴ−ＰＣＲ〕
三次元培養後、コラゲナーゼを添加してコラーゲンゲルを溶解し、細胞を回収した。細胞よりＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製，独国）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した後、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ １μｇをＲｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製，米国）を用いてｃＤＮＡへ変換した。このｃＤＮＡとＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ溶液（ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ−ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ社製，独国）、ｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒおよびウサギＴＩＭＰ−１ ｐｒｉｍｅｒ（日本遺伝子研究所にて合成。Ｈａｎら，Ｎａｇｏｙａ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．６２，１１５−１２６（１９９９））を混合し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製，独国）を用いてＴＩＭＰ−１のｍＲＮＡの発現量を検討した。
実験例１
トリプトライドがＩＬ−１β誘発コラーゲン分解に及ぼす影響を調べた。トリプトライド溶液を用いて上記三次元培養を行った後、上記コラーゲン溶解活性の測定に記載の方法に従って、実験を行った。結果を図１に示す。
図１によれば、トリプトライドがＩＬ−１β誘発コラーゲン分解を濃度依存的に抑制することがわかる。
実験例２
トリプトライドがウサギ角膜実質細胞のＭＭＰおよびｐｒｏＭＭＰｓの発現に及ぼす影響を調べた。トリプトライド溶液を用いて上記三次元培養を行った後、上記ウエスタンブロットまたはゼラチンザイモグラフィーに記載の方法に従って、実験を行った。結果を図２に示す。
図２によれば、トリプトライドがＩＬ−１βによって引き起こされるグリコシル化ｐｒｏＭＭＰ−１、ｐｒｏＭＭＰ−１、ｐｒｏＭＭＰ−３の増加を抑制することがわかる。
実験例３
トリプトライドがウサギ角膜実質細胞のＭＭＰｓおよびｐｒｏＭＭＰｓの発現に及ぼす影響を調べた。トリプトライド溶液を用いて上記三次元培養を行った後、上記ウエスタンブロットまたはゼラチンザイモグラフィーに記載の方法に従って、実験を行った。結果を図３に示す。
図３によれば、トリプトライドがＩＬ−１βおよびプラスミノーゲンによって引き起こされるグリコシル化ｐｒｏＭＭＰ−１、ｐｒｏＭＭＰ−１、ｐｒｏＭＭＰ−３の増加および活性化ならびにｐｒｏＭＭＰ−９活性化を抑制することがわかる。
実験例４
デキサメタゾンがＩＬ−１β誘発コラーゲン分解に及ぼす影響を調べた。デキサメタゾン溶液を用いて上記三次元培養を行った後、上記コラーゲン溶解活性の測定に記載の方法に従って、実験を行った。結果を図４に示す。
図４によれば、デキサメタゾンがＩＬ−１β誘発コラーゲン分解を濃度依存的に抑制することがわかる。
実験例５
デキサメタゾンがウサギ角膜実質細胞のＭＭＰおよびｐｒｏＭＭＰｓの発現に及ぼす影響を調べた。デキサメタゾン溶液を用いて上記三次元培養を行った後、上記ウエスタンブロットまたはゼラチンザイモグラフィーに記載の方法に従って、実験を行った。結果を図５に示す。
図５によれば、デキサメタゾンがＩＬ−１βにより引き起こされるグリコシル化ｐｒｏＭＭＰ−１、ｐｒｏＭＭＰ−１およびｐｒｏＭＭＰ−３の増加を抑制することがわかる。
実験例６
トリプトライドがウサギ角膜実質細胞のＭＭＰｓおよびｐｒｏＭＭＰｓの発現に及ぼす影響を調べた。トリプトライド溶液を用いて上記三次元培養を行った後、上記ウエスタンブロットまたはゼラチンザイモグラフィーに記載の方法に従って、実験を行った。結果を図６に示す。
図６によれば、デキサメタゾンがＩＬ−１βおよびプラスミノーゲンによって引き起こされるｐｒｏＭＭＰ−１活性化、ｐｒｏＭＭＰ−３増加、ならびにｐｒｏＭＭＰ−２およびｐｒｏＭＭＰ−９の活性化を抑制することがわかる。
実験例７
トリプトライドおよびデキサメタゾンがＴＩＭＰ−１産生に及ぼす影響を調べた。上記ＲＴ−ＰＣＲに記載の方法に従って、実験を行った。結果を図７に示す。
図７によれば、ＩＬ−１βによって引き起こされるＴＩＭＰ−１産生（ｍＲＮＡレベル）をデキサメタゾンは抑制してしまうが、トリプトライドは抑制しないことがわかる。
デキサメタゾンがＴＩＭＰ−１産生を抑制するということはすなわち、内因性ＭＭＰ阻害剤の発現量を抑制するということを意味し、これによりコラーゲン分解が亢進する可能性がある。しかしながら、トリプトライドはＴＩＭＰ−１産生には影響を与えないので、デキサメタゾンよりもより効果的にコラーゲン分解を抑制すると考えられる。
実施例２．コハク酸トリプトライド ナトリウム塩
コハク酸トリプトライド
トリプトライド〔ＰＧ４９０〕（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製、米国、Ｔｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ ｗｉｌｆｏｒｄｉｉからの単離物、純度９８％）（０．０５ｇ、０．１３ｍｍｏｌ）と４−ジメチルアミノピリジン（０．０１７ｇ、０．１４ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（１ｍＬ）とピリジン（５ｍＬ）の混合溶液に溶解させ、無水コハク酸（０．０７５ｇ、０．７５ｍｍｏｌ）を加え、窒素雰囲気下、８５℃で３０分間攪拌した。溶媒を減圧蒸留し、１Ｎ−水酸化カリウム水溶液（２ｍＬ）を加え、酢酸エチルで洗浄した。水層を１Ｎ−塩酸で酸性とし、酢酸エチル（１００ｍＬ）で抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで脱水乾燥した。溶媒を減圧留去して、コハク酸トリプトライド（０．０１２ｇ、１８．７％）を黄色固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ：０．８３（３Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．６Ｈｚ）、０．９４（３Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．２Ｈｚ）、１．０５（３Ｈ、ｓ）、１．２１（１Ｈ、ｍ）、１．５５（１Ｈ、ｍ）、１．８９（２Ｈ、ｍ）、２．１５（２Ｈ、ｍ）、２．３０（１Ｈ、ｍ）、２．７４−２．７６（５Ｈ、ｍ）、３．４５（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝５．７Ｈｚ）、３．５２（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝３．３Ｈｚ）、３．８２（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝３．０Ｈｚ）、４．６６（２Ｈ、ｓ）、５．０９（１Ｈ、ｓ）．
コハク酸トリプトライドナトリウム塩
上記で得られたコハク酸トリプトライド（０．０１ｇ、０．０２ｍｍｏｌ）と炭酸水素ナトリウム（０．００２ｇ、０．０２ｍｍｏｌ）に水（２０ｍＬ）を加え、室温で３０分間攪拌した。水溶液を濾過し、濾液を凍結乾燥してコハク酸トリプトライドナトリウム塩（０．０１ｇ、９５．４％）を黄色フォームとして得た。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：０．７４（３Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．２Ｈｚ）、０．８６（３Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．９Ｈｚ）、０．９１（３Ｈ、ｓ、２０−ＣＨ３）、１．２８−１．３０（２Ｈ、ｂｒ）、１．８０−２．２３（７Ｈ、ｍ）、２．３８−２．５１（３Ｈ、ｍ）、３．５５（１Ｈ、ｍ）、３．７０（１Ｈ、ｍ）、３．９５（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝３．０Ｈｚ）、４．８３（２Ｈ、ｂｒｓ）、４．９７（１Ｈ、ｓ、１４−ＣＨ）．
試薬の調製
被験物質としてトリプトライド〔ＰＧ４９０〕（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製、米国、Ｔｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ ｗｉｌｆｏｒｄｉｉからの単離物、純度９８％）、および上記で得られたコハク酸トリプトライドナトリウム塩を用いた。
〔トリプトライド溶液の調製〕
トリプトライド〔ＰＧ４９０〕（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製、米国、Ｔｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ ｗｉｌｆｏｒｄｉｉからの単離物、純度９８％）１ｍｇをＤＭＳＯ２７．７μＬに溶解した（１．０×１０−１Ｍ）。これをＤＭＳＯにて１０倍希釈した（１．０×１０−２Ｍ）。それぞれのＤＭＳＯを用いて調製した溶液を無血清ＭＥＭで５００倍希釈した（２．０×１０−４Ｍ、２．０×１０−５Ｍ）。
〔コハク酸トリプトライドナトリウム塩溶液の調製〕
上記で得られたコハク酸トリプトライドナトリウム塩２．１７ｍｇをＤＭＳＯ４５μＬに溶解した（１．０×１０−１Ｍ）。これをＤＭＳＯにて１０倍希釈した（１．０×１０−２Ｍ）。それぞれのＤＭＳＯを用いて調製した溶液を無血清ＭＥＭで５００倍希釈した（２．０×１０−４Ｍ、２．０×１０−５Ｍ）。
〔使用動物〕
Ｊａｐａｎｅｓｅ ａｌｂｉｎｏ ｒａｂｂｉｔ（体重約２ｋｇ、オス、北山ラベスから購入）を用いた。
その他は実施例１と同様にして行った。
実験例８
トリプトライドおよびコハク酸トリプトライドナトリウム塩がウサギ角膜実質細胞によるＩＬ−１β誘発コラーゲン分解に及ぼす影響を調べた。被験物質溶液を用いて前述の三次元培養を行った後、前述のコラーゲン分解活性の測定の記載の方法に従って、実験を行った。結果を図８に示す。
図８によれば、トリプトライドおよびコハク酸トリプトライドナトリウム塩がＩＬ−１β誘発コラーゲン分解を濃度依存的に抑制することがわかる。
実験例９
トリプトライドおよびコハク酸トリプトライドナトリウム塩がウサギ角膜実質細胞のＭＭＰｓおよびｐｒｏＭＭＰｓの発現に及ぼす影響を調べた。被験物質溶液を用いて前述の三次元培養を行った後、前述のゼラチンザイモグラフィーに記載の方法に従って、実験を行った。結果を図９に示す。
図９によれば、トリプトライドがＩＬ−１βによって引き起こされるｐｒｏＭＭＰ−２およびＭＭＰ−２の増加、並びにｐｒｏＭＭＰ−９活性化を抑制し、コハク酸トリプトライドナトリウム塩がＭＭＰ−２増加およびＭＭＰ−９活性化を抑制することがわかる。
製剤例１：点眼剤
トリプトライド ３．６ｍｇ
ポリソルベート８０ ０．１ｇ
リン酸二水素ナトリウム ０．１ｇ
塩化ナトリウム ０．９ｇ
塩化ベンザルコニウム ０．００５ｇ
水酸化ナトリウム 適量（ｐＨ７．０）
滅菌精製水 Ｔｏｔａｌ １００ｍＬ
以上を混和して懸濁点眼剤とする。
製剤例２：点眼剤
トリプトライド ３６ｍｇ
ホウ酸 ７００ｍｇ
ホウ砂 適量
塩化ナトリウム ５００ｍｇ
ヒドロキシメチルセルロース ５００ｍｇ
エデト酸ナトリウム ０．０５ｍｇ
塩化ベンザルコニウム ０．０００５ｍｇ
滅菌精製水 Ｔｏｔａｌ １００ｍＬ
以上を混和して懸濁点眼剤とする。
製剤例３：眼軟膏剤
トリプトライド ３．６ｍｇ
精製ラノリン １０ｇ
白色ワセリン １００ｇ
以上を混和して眼軟膏剤とする。
製剤例４：眼軟膏剤
トリプトライド ３．６ｍｇ
ダイズ油 ５ｇ
白色ワセリン １００ｇ
以上を混和して眼軟膏剤とする。
製剤例５：点眼剤
コハク酸トリプトライド ナトリウム塩 ４．８ｍｇ
ホウ酸 ７００ｍｇ
ホウ砂 適量
塩化ナトリウム ５００ｍｇ
ヒドロキシメチルセルロース ５００ｍｇ
エデト酸ナトリウム ０．００５ｍｇ
塩化ベンザルコニウム ０．０００５ｍｇ
滅菌精製水 Ｔｏｔａｌ １００ｍＬ
以上を混和して懸濁点眼剤とする。
製剤例６：眼軟膏剤
コハク酸トリプトライド ナトリウム塩 ４．８ｍｇ
精製ラノリン １０ｇ
白色ワセリン １００ｇ
以上を混和して眼軟膏剤とする。
【産業上の利用可能性】
本発明によれば、ステロイド薬のような副作用の危惧なく、角膜潰瘍を治療することが可能となる。
本出願は、日本で出願された特願２００３−０５２０７２を基礎としており、それらの内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリプトライドもしくはその誘導体またはその医薬上許容しうる塩を含有する角膜潰瘍治療剤。
【請求項２】
眼局所投与用である、請求の範囲１に記載の角膜潰瘍治療剤。
【請求項３】
点眼剤である、請求の範囲２に記載の角膜潰瘍治療剤。
【請求項４】
トリプトライドもしくはその誘導体またはその医薬上許容しうる塩を含有する角膜潰瘍治療用医薬組成物。
【請求項５】
眼局所投与用に用いる、請求の範囲４に記載の角膜潰瘍治療用医薬組成物。
【請求項６】
点眼剤に用いる、請求の範囲５に記載の角膜潰瘍治療用医薬組成物。
【請求項７】
トリプトライドもしくはその誘導体またはその医薬上許容しうる塩を投与することを含む角膜潰瘍の治療方法。
【請求項８】
眼局所投与用として投与することを含む、請求の範囲７に記載の角膜潰瘍の治療方法。
【請求項９】
点眼剤として投与することを含む、請求の範囲８に記載の角膜潰瘍の治療方法。
【請求項１０】
角膜潰瘍治療剤を製造するためのトリプトライドもしくはその誘導体またはその医薬上許容しうる塩の使用。
【請求項１１】
角膜潰瘍治療剤が眼局所投与用である、請求の範囲１０に記載の使用。
【請求項１２】
角膜潰瘍治療剤が点眼剤である、請求の範囲１１に記載の使用。
【請求項１３】
請求の範囲１〜３のいずれか１項に記載の角膜潰瘍治療剤、および当該治療剤を角膜潰瘍の治療に使用し得るかまたは使用すべきであることを記載した書類を含む商業的パッケージ。
【請求項１４】
請求の範囲４〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物、および当該組成物を角膜潰瘍の治療に使用し得るかまたは使用すべきであることを記載した書類を含む商業的パッケージ。
【請求項１】
トリプトライドもしくはその誘導体またはその医薬上許容しうる塩を含有する角膜潰瘍治療剤。
【請求項２】
眼局所投与用である、請求の範囲１に記載の角膜潰瘍治療剤。
【請求項３】
点眼剤である、請求の範囲２に記載の角膜潰瘍治療剤。
【請求項４】
トリプトライドもしくはその誘導体またはその医薬上許容しうる塩を含有する角膜潰瘍治療用医薬組成物。
【請求項５】
眼局所投与用に用いる、請求の範囲４に記載の角膜潰瘍治療用医薬組成物。
【請求項６】
点眼剤に用いる、請求の範囲５に記載の角膜潰瘍治療用医薬組成物。
【請求項７】
トリプトライドもしくはその誘導体またはその医薬上許容しうる塩を投与することを含む角膜潰瘍の治療方法。
【請求項８】
眼局所投与用として投与することを含む、請求の範囲７に記載の角膜潰瘍の治療方法。
【請求項９】
点眼剤として投与することを含む、請求の範囲８に記載の角膜潰瘍の治療方法。
【請求項１０】
角膜潰瘍治療剤を製造するためのトリプトライドもしくはその誘導体またはその医薬上許容しうる塩の使用。
【請求項１１】
角膜潰瘍治療剤が眼局所投与用である、請求の範囲１０に記載の使用。
【請求項１２】
角膜潰瘍治療剤が点眼剤である、請求の範囲１１に記載の使用。
【請求項１３】
請求の範囲１〜３のいずれか１項に記載の角膜潰瘍治療剤、および当該治療剤を角膜潰瘍の治療に使用し得るかまたは使用すべきであることを記載した書類を含む商業的パッケージ。
【請求項１４】
請求の範囲４〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物、および当該組成物を角膜潰瘍の治療に使用し得るかまたは使用すべきであることを記載した書類を含む商業的パッケージ。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０７５８８８
【国際公開日】平成１６年９月１０日（２００４．９．１０）
【発行日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０２９６４（Ｐ２００５−５０２９６４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００２４０６
【国際出願日】平成１６年２月２７日（２００４．２．２７）
【出願人】（５０３０７９３５４）
【出願人】（０００１９９１７５）千寿製薬株式会社 (46)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年９月１０日（２００４．９．１０）
【発行日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００２４０６
【国際出願日】平成１６年２月２７日（２００４．２．２７）
【出願人】（５０３０７９３５４）
【出願人】（０００１９９１７５）千寿製薬株式会社 (46)
【Ｆターム（参考）】
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