角膜知覚回復剤
本発明は、角膜手術後の角膜知覚の回復やドライアイの症状を改善する新規な医薬を提供し、この医薬は、Ｒｈｏタンパク阻害剤を含有することにより、白内障手術後、ＬＡＳＩＫ手術後、ＰＲＫ手術後、角膜移植手術後、神経麻痺性角膜症、角膜潰瘍、糖尿病性角膜症などの角膜神経変性に伴う角膜知覚低下、ドライアイ症状の改善に有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明はＲｈｏタンパク阻害剤を含有する角膜神経突起形成促進剤、および角膜神経突起形成促進による角膜知覚の回復、改善、並びにドライアイの治療剤に関する。
【背景技術】
レーザー屈折矯正角膜切除術（ＰＲＫ）、レーザー角膜切削形成術（レーシック；ＬＡＳＩＫ）、角膜移植などの角膜手術後には、角膜神経が切断されるため、通常約３週間から１年間角膜知覚機能の低下症状が起きるといわれている。例えば、ＬＡＳＩＫ後には明らかに角膜神経が切断されていること（Ｔｕｕｌｉ Ｕ．Ｌｉｎｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｅｙｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６６：７５５−７６３，１９９８）、また、ＬＡＳＩＫ後に神経像が認められないか、あるいは神経線維束が短く連結していない角膜領域において、角膜知覚が低下することが報告されている（Ｔｕｕｌｉ Ｕ．Ｌｉｎｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ＆ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，４１：３９３−３９７，２０００）。
ＰＲＫおよびＬＡＳＩＫ後における角膜知覚の低下は涙腺応答低下、涙液減少の原因であることが示唆されている（Ａｎｇ，Ｒｏｂｅｒｔ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ １２：３１８−３２２，２００１）。そしてこの角膜知覚機能低下のため角膜手術後の患者では瞬目回数が減少しドライアイ症状が認められることが問題となっている。一方、ドライアイ患者では、涙液機能の低下が角膜知覚の低下をもたらし、この角膜知覚の低下がさらに涙液機能の低下を悪化させ、角膜表面の症状を重篤化させることが問題となっている。
しかし、現在角膜手術後の角膜知覚の回復は自然回復に委ねられ、またドライアイの治療においても角膜知覚を回復させるための積極的治療は施されていないのが現状である。
また、神経麻痺性角膜症、角膜潰瘍、糖尿病性角膜症などの角膜神経変性を伴う疾患でも角膜知覚低下が引き起こされる。
ＲｈｏタンパクはＲｈｏファミリー（Ｒｈｏ、Ｒａｃ、Ｃｄｃ４２などを含む）に包含される低分子Ｇタンパクであり、アクチン細胞骨格形成や、神経突起退縮反応に関係することが知られている。
例えば、Ｒｈｏタンパク阻害剤であるＣ３酵素は３Ｔ３線維芽細胞の細胞突起を伸展させることが知られており（Ｈｉｒｏｓｅ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１４１：１６２５−１６３６，１９９８）、Ｒｈｏタンパク阻害剤の有効量を患者に投与することによって中枢神経軸索成長を促進する方法が開示されている（特表２００１−５１５０１８号公報、欧州特許出願公開第１，０１１，３３０号明細書）。また、Ｒｈｏタンパクのエフェクター分子の一つであるＲｈｏキナーゼの阻害剤が網膜神経節細胞の軸索伸展作用を有し、視神経細胞の再生促進作用を有することが知られている（国際公開第０２／８３１７５号パンフレット、欧州特許出願公開第１，１４２，５８５号明細書）。国際公開第０３／０２０２８１号パンフレットでは、ＬＡＳＩＫなどの手術後の角膜神経傷害に起因する病態を治療する目的に神経再生または神経突起伸展を促進する化合物が使えるとされており、それら化合物の例として神経栄養性因子刺激物質であるネオトロフィンなどの化合物が例示されているが、Ｒｈｏタンパク阻害剤の記載はなく、またそれらを示唆する記載もない。
三叉神経に対しては、ラット三叉神経組織培養（ｔｒｉｇｅｍｉｎａｌ ｔｒａｃｔ ｉｎ ｗｈｏｌｅ ｍｏｕｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅｓ）系において、神経成長因子（ＮＧＦ）などの神経栄養因子誘発神経軸索伸展がＲｈｏ活性化剤（リゾホスファチジン酸）で阻害され、ドミナントネガティブＲｈｏを細胞に導入することで促進されることが報告されている（Ｏｚｄｉｎｌｅｒ，Ｐ．Ｈａｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，４３８：３７７−３８７，２００１）。その一方、神経栄養因子非存在下では、Ｒｈｏが三叉神経軸索伸展に有効かどうかについては分からないとの記載があり、Ｒｈｏタンパク阻害剤の三叉神経に対する効果についても未だ判明していない。
一方、Ｒｈｏ活性化作用を有する化合物が角膜上皮伸展作用を有し、Ｒｈｏタンパク阻害剤であるＣ３酵素によってその角膜上皮の伸展が抑制されることから、Ｒｈｏ活性化作用を有する化合物が、角膜潰瘍、角膜上皮剥離、角膜炎などの角膜障害に有用であることが開示されている（特開２０００−２６４８４７号公報、欧州特許出願公開第１，１４２，５８５号明細書）。
【発明の開示】
レーザー屈折矯正角膜切除術（ＰＲＫ）、レーザー角膜切削形成術（レーシック；ＬＡＳＩＫ）、角膜移植などの角膜手術後などの角膜知覚機能低下や、ドライアイ患者における角膜知覚低下を回復させる医薬を提供することである。
本発明者らは、角膜術後の角膜知覚回復やドライアイにおける角膜知覚症状を改善する新しいタイプの医薬を提供することを目的に検討を行ったところ、Ｒｈｏタンパク阻害剤が三叉神経（以後、角膜神経ということもある。）細胞の神経突起形成促進効果を有することを初めて見出し、これらの知見に基づいてさらに研究をすすめ、Ｒｈｏタンパク阻害剤を角膜知覚回復などの医薬として利用する本発明を完成した。
すなわち、本発明は、
（１）Ｒｈｏタンパク阻害剤を含有する角膜神経突起形成促進剤；
（２）Ｒｈｏタンパク阻害剤を含有する角膜神経軸索伸展促進剤；
（３）Ｒｈｏタンパク阻害剤を含有する角膜知覚回復剤；
（４）Ｒｈｏタンパク阻害剤を含有する、ドライアイ治療剤；
（５）Ｒｈｏタンパク阻害剤を含有する角膜神経突起形成促進用組成物；
（６）Ｒｈｏタンパク阻害剤を含有する角膜神経軸索伸展促進用組成物；
（７）Ｒｈｏタンパク阻害剤を含有する角膜知覚回復用組成物；
（８）Ｒｈｏタンパク阻害剤を含有するドライアイ治療用組成物；
（９）角膜神経突起形成促進用組成物を製造するためのＲｈｏタンパク阻害剤の使用；
（１０）角膜神経軸索伸展促進用組成物を製造するためのＲｈｏタンパク阻害剤の使用；
（１１）角膜知覚回復用組成物を製造するためのＲｈｏタンパク阻害剤の使用；
（１２）ドライアイ治療用組成物を製造するためのＲｈｏタンパク阻害剤の使用；
（１３）角膜神経の神経突起形成促進が必要とされる対象にＲｈｏタンパク阻害剤の有効量を投与することによる角膜神経の神経突起形成を促進する方法；
（１４）角膜神経の軸索伸展促進が必要とされる対象にＲｈｏタンパク阻害剤の有効量を投与することによる角膜神経の軸索伸展を促進する方法；
（１５）角膜知覚の回復が必要とされる対象にＲｈｏタンパク阻害剤の有効量を投与することによる角膜知覚を回復する方法；
（１６）ドライアイに罹患した対象にＲｈｏタンパク阻害剤の有効量を投与することによるドライアイを治療する方法
に関するものである。
【図面の簡単な説明】
図１は試験例１におけるウサギ培養三叉神経細胞の蛍光顕微鏡像を示す。ＡはＣ３酵素無添加培養液で２４時間培養したウサギ三叉神経細胞を、ＢはＣ３酵素を最終濃度２μｇ／ｍＬになるよう添加した培養液で２４時間培養した細胞を示す。
図２は試験例１における神経突起形成細胞の全細胞数に対する比率（％）を示す。縦軸は全細胞に対する神経突起形成細胞の割合を示す。各値は３例の平均値±標準誤差を示す。図中＊はコントロールに対する有意差（ｐ＜０．０５）を示す。
図３は試験例２における培養ウサギ三叉神経細胞の蛍光顕微鏡像を示す。Ａは被験物質無添加培養液、Ｂは化合物１添加（最終濃度１０μＭ）培養液、Ｃは化合物２添加（最終濃度１０μＭ）培養液、Ｄは化合物３添加（最終濃度１μＭ）培養液、Ｅは化合物４添加（最終濃度１０μＭ）培養液で４８時間培養した細胞を示す。
図４は試験例２におけるカウントした全細胞数に対する神経突起形成細胞の比率（％）を示すグラフである。各値は３例の平均値±標準誤差を示す。図中＊は無添加群に対する有意差ｐ＜０．０５を、＊＊は無添加群に対する有意差ｐ＜０．０１を示す。
図５は試験例３において、ウサギ角膜（Ｃ）と三叉神経節（Ｔ）におけるＲＯＣＫ ＩおよびＲＯＣＫ ＩＩウェスタンブロッティングの結果を示す。
発明の詳細な説明
本明細書中において、「Ｒｈｏタンパク阻害剤」とは、不活性型のＧＤＰ結合型Ｒｈｏタンパク質が活性型のＧＴＰ結合型Ｒｈｏタンパク質へと活性化されるのを阻害する全ての阻害剤、およびＲｈｏタンパクまたはＲｈｏタンパクフラグメントに対する抗体など、並びにＲｈｏタンパクの作用を伝達するエフェクター分子、例えばＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）の働きを阻害するすべての阻害剤などをも包含するものである。「角膜神経」とは、知覚神経である三叉神経の支配をうけ角膜周囲に形成される輪状神経叢、角膜実質に網目上に分布する実質内神経叢、ボーマン膜直下で形成される上皮下神経叢、ボーマン膜を貫通したところで形成される基底細胞神経叢および神経線維をいう。本発明における「神経突起」とは、ニューロン（神経細胞）の細胞体から出る突起（樹状突起および軸索）をいい、「形成」とは細胞体から前記神経突起が生成または／および伸展することをいう。どの程度の神経突起形成をもって促進されている状態というかは、当業者には明らかである。神経突起形成の促進は、例えば、神経細胞を蛍光染色し、蛍光顕微鏡を用いて細胞の状態を観察することにより確認することができる。また、蛍光顕微鏡での観察結果を画像解析ソフトなどを用いて解析してもよい。さらに、その結果を統計学的処理することにより神経突起形成の状態を数値化することも可能である。さらに別の方法として、神経細胞体および神経突起を構成するもの、例えばニューロフィラメントを認識する抗体、およびこれと反応する西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗体で標識した後、ＨＲＰを発色させて吸光度を測定することによりニューロフィラメント量を測定し、神経突起形成の指標とすることもできる。
Ｒｈｏタンパク阻害剤としては、例えばＣ３細胞外酵素（Ｅｘｏｅｎｚｙｍｅ Ｃ３、本明細書においては単にＣ３酵素ということもある。）、トキシンＡ（Ｔｏｘｉｎ Ａ）およびトキシンＢ（Ｔｏｘｉｎ Ｂ）並びにＲｈｏキナーゼ阻害剤が挙げられる。
このうち、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（以後、ＲＯＣＫ阻害剤ということもある。）としては、例えば、特開昭６１−２２７５８１号公報（米国特許第４，６７８，７８３号明細書）に記載の化合物、例えば、塩酸ファスジルなどで代表されるイソキノリンスルホニル誘導体；国際公開第００／５７９１４号パンフレットおよび特開２０００−４４５１３号公報に記載の化合物、例えば、エタクリン酸および４−［２−（２，３，４，５，６−ペンタフルオロフェニル）アクリロイル］桂皮酸などのＲｈｏキナーゼ阻害剤；国際公開第０２／０７６９７７号パンフレット（欧州特許公開第１，３７０，５５２号明細書、同第１，３７０，５５３号明細書）記載の化合物、例えば、２−クロロ−６，７−ジメトキシ−Ｎ−［５−１Ｈ−インダゾリル］キナゾリン−４−アミンなどのＲｈｏキナーゼ阻害剤；および国際公開第０２／１００８３３号パンフレットに記載の化合物、例えば、Ｎ−（１−ベンジル−４−ピペリジニル）−１Ｈ−インダゾール−５−アミン・２塩酸塩・１水和物などのＲｈｏキナーゼ阻害剤が挙げられる。
なお、以下の説明において、本発明で用いるＲｈｏタンパク阻害剤を含有する薬剤および組成物をまとめて、「本発明の医薬」ということもある。
本発明の医薬は、哺乳動物（例えばヒト、ラット、マウス、ウサギ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコなど）における角膜神経が障害、切断または欠損した、例えばＰＲＫやＬＡＳＩＫ後の低下した角膜知覚回復のための治療薬として、あるいは神経麻痺性角膜症、角膜潰瘍、糖尿病性角膜症などの角膜神経変性に伴う角膜知覚低下や角膜知覚の低下したドライアイの治療薬として有用である。
本発明の医薬は全身的または局所的に投与される。全身的には、経口投与に加え、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射など非経口的にも投与される。局所的には、眼に投与される。
本発明の医薬の製剤形態としては、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、坐剤などの固形剤、およびシロップ剤、注射剤、点眼剤などの液剤などが挙げられる。
本発明の医薬を顆粒および錠剤として製造する場合には、例えば賦形剤（乳糖、白糖、ブドウ糖、デンプン、結晶セルロースなど）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウムなど）、崩壊剤（デンプン、カルメロースナトリウム、炭酸カルシウムなど）、結合剤（デンプン糊液、ヒドロキシプロピルセルロース液、カルメロース液、アラビアゴム液、ゼラチン液、アルギン酸ナトリウム液など）などを用いることにより任意の剤形を製造することができる。また、顆粒剤および錠剤には、適当なコーティング剤（ゼラチン、白糖、アラビアゴム、カルナバロウなど）、腸溶性コーティング剤（例えば酢酸フタル酸セルロース、メタアクリル酸コポリマー、ヒドロキシプロピルセルロースフタレート、カルボキシメチルエチルセルロースなど）などで剤皮を施してもよい。
本発明の医薬をカプセル剤として製造する場合には、適当な賦形剤、例えば流動性と滑沢性を向上させるためのステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、軽質無水ケイ酸など、また加圧流動性のための結晶セルロースや乳糖などの他、上記崩壊剤などを適宜添加したものを均等に混和または粒状もしくは粒状としたものに適当なコーティング剤で剤皮を施したものを充填するか、適当なカプセル基剤（ゼラチンなど）にグリセリンまたはソルビトールなどを加えて塑性を増したカプセル基剤で被包成形することもできる。これらカプセル剤には必要に応じて、着色剤、保存剤［二酸化イオウ、パラベン類（パラオキシ安息香酸メチル、エチル、プロピルエステル）］などを加えることができる。カプセル剤は通常のカプセルの他、腸溶性コーティングカプセル、胃内抵抗性カプセル、放出制御カプセルとすることもできる。腸溶性カプセルとする場合、腸溶性コーティング剤でコーティングした化合物、または化合物に上記の適当な賦形剤を添加したものを、通常のカプセルに充填または、カプセル自身を腸溶性コーティング剤でコーティング、もしくは腸溶性高分子を基剤として成形することができる。
本発明の医薬を坐剤として製造する場合には、坐剤基剤（例えばカカオ脂、マクロゴールなど）を適宜選択して使用することができる。
本発明の医薬をシロップ剤として製造する場合、例えば安定剤（エデト酸ナトリウムなど）、懸濁化剤（アラビアゴム、カルメロースなど）、矯味剤（単シロップ、ブドウ糖など）、芳香剤などを適宜選択して使用することができる。
本発明の医薬を注射剤または点眼剤として製造する場合、医薬上許容される添加物、例えば等張化剤（塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、ホウ酸、ホウ砂、ブドウ糖、プロピレングリコールなど）、緩衝剤（リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸緩衝液、イプシロンアミノカプロン酸緩衝液など）、保存剤（パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂など）、増粘剤（ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコールなど）、安定化剤（亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエンなど）、ｐＨ調整剤（塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸など）などを適宜添加した溶液に溶解または分散することによって製造することができる。
上記シロップ剤、注射剤および点眼剤における添加剤の添加量は、添加する添加剤の種類、用途などによって異なるが、添加剤の目的を達成し得る濃度を添加すればよく、等張化剤は、通常、浸透圧が約２２９〜約３４３ｍＯｓｍとなるよう、約０．５〜約５．０ｗ／ｖ％を添加する。また、緩衝剤は約０．０１〜約２．０ｗ／ｖ％程度、増粘剤は約０．０１〜約１．０ｗ／ｖ％程度、安定化剤は約０．００１〜約１．０ｗ／ｖ％程度になるように添加する。ｐＨ調整剤は、適宜添加し、通常ｐＨ約３〜約９、好ましくは約４〜約８になるように添加する。
特に本発明の医薬を点眼剤として使用する場合、本発明の医薬に含まれるＲｈｏタンパク阻害剤の濃度は、通常下限は約０．００００１ｗ／ｖ％、好ましくは約０．００００５ｗ／ｖ％、より好ましくは約０．０００１ｗ／ｖ％であり、上限は約０．１ｗ／ｖ％、好ましくは約０．０５ｗ／ｖ％、より好ましくは約０．０１ｗ／ｖ％、さらに好ましくは約０．００５ｗ／ｖ％、なおさらに好ましくは約０．００１ｗ／ｖ％に調製される。
本発明の医薬の投与量は対象となる疾患、症状、投与対象、Ｒｈｏタンパク阻害剤の種類、投与方法などにより異なるが、例えばＰＲＫ手術後の角膜知覚回復剤として成人の眼に局所的に使用する場合には、例えばＣ３酵素約０．００１ｗ／ｖ％含有する点眼液を、あるいは、Ｎ−（１−ベンジル−４−ピペリジニル）−１Ｈ−インダゾール−５−アミン・２塩酸塩・１／２水和物などのＲｈｏタンパク阻害剤を約０．００３ｗ／ｖ％含有する点眼液を、１回約２０〜約５０μＬ、１日数回点眼するのがよい。
また、本発明の医薬をＬＡＳＩＫ手術後の角膜知覚回復剤として成人に経口投与する場合、例えば、４−［２−（２，３，４，５，６−ペンタフルオロフェニル）アクリロイル］桂皮酸などのＲｈｏタンパク阻害剤を約１０ｍｇ含有する錠剤を１日１回ないし２回服用するのがよい。
【実施例】
本発明を以下の試験例及び実施例に従いさらに詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
試験例１ 培養ウサギ三叉神経細胞の神経突起形成促進作用
１）使用動物
福崎養兎組合より購入した日本白色種ウサギ（生後２〜３日）を使用した。
２）被験物質
Ｃ３酵素〔ｕｐｓｔａｔｅ社製；Ｅｘｏｅｎｚｙｍｅ Ｃ３（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｎｚｙｍｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ）；Ｃａｔａｌｏｇ ＃１３−１１８，Ｌｏｔ ＃２３３３０〕
３）試験方法
細胞培養：三叉神経細胞の単離はＣｈａｎらの報告（Ｃｈａｎ，Ｋｗａｎ Ｙ．ａｎｄ Ｈａｓｃｈｋｅ，Ｒｉｃｈａｒｄ Ｈ．，Ｅｘｐ．Ｅｙｅ Ｒｅｓ．，４１：６８７−６９９，１９８５）を参考にして行った。すなわち、ウサギをエーテル麻酔下、生理食塩水で心臓を灌流後、三叉神経節を切り出し、神経分散液（住友ベークライト社製）を用いて、三叉神経節を分散させた後、ポリリジンでコートした８ウェルカルチャースライド（ＢＥＣＴＯＮ ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ社製）に細胞を播種した。細胞数は１ウェルあたり約３×１０３細胞とし、培養条件は５％ＣＯ２、９５％空気下、湿度１００％、３７℃とした。細胞培養にはニューロベーサル培養液（ＧＩＢＣＯ社製）にＢ２７ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ社製；０．０２ｍＬ／ｍＬ培養液）およびＬ−グルタミン酸（ＧＩＢＣＯ社製；最終濃度１ｍＭ）を添加した培養液を用い、細胞播種直後にＣ３酵素（２μｇ／ｍＬ最終濃度）を添加して２４時間培養した。
免疫染色：培養２４時間後に、細胞を４％パラホルムアルデヒドを用いて室温で２時間固定し、神経細胞に特異的な中間径フィラメントであるニューロフィラメントを特異的に認識する抗ニューロフィラメント２００抗体（Ｓｉｇｍａ社製）およびこれと反応する蛍光二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）を用いて神経細胞体および神経突起を蛍光染色した。染色細胞は蛍光顕微鏡からコンピュータに画像（１画像：１．８３ｍｍ×１．３６ｍｍ）として取り込み、画像中の全細胞数（ｔ）をカウントすると共に、画像解析ソフト（ＭａｃＳＣＯＰＥ，ＭＩＴＡＮＩ ＣＯ．社製）を用いて細胞の神経突起の長さを測定し、細胞体の直径の２倍以上長さの神経突起を持つ細胞を神経突起形成細胞（ａ）としてカウントした。各画像中の全細胞数の合計（ｔ１＋ｔ２＋…＋ｔｎ＝Σｔ）が約１００以上となるまで複数の画像を取り込んだ。その時の総神経突起形成細胞数（ａ１＋ａ２＋…＋ａｎ＝Σａ）の全細胞数合計（Σｔ）に対する比率（％）を計算した。この比率について、Ｃ３酵素添加群と無添加群（コントロール群）とを比較するために、ｔ−ｔｅｓｔにより検定して危険率５％未満を有意であると判定した。
４）試験結果
図１は培養ウサギ三叉神経細胞の蛍光顕微鏡像を示している。図１中、ＡはＣ３酵素無添加培養液で２４時間培養したコントロール群の細胞を、ＢはＣ３酵素を最終濃度２μｇ／ｍＬ添加した培養液で２４時間培養した細胞を、図２は各群の全細胞数に対する神経突起形成細胞数の比率を示す。
神経突起形成細胞の比率はコントロール群では全細胞の約２１％、Ｃ３酵素添加群では全細胞の約４６％であり、Ｃ３酵素添加により突起形成細胞数の有意な増加が認められた（図２）。
以上のことから、Ｒｈｏ阻害活性を有するＣ３酵素は三叉神経細胞の突起形成を促進することが分かった。
試験例２ 培養ウサギ三叉神経の突起形成促進作用
１）使用動物
北山ラベス社より購入した日本白色種ウサギ（生後２〜３日）を使用した。
２）被験物質
ＲＯＣＫ阻害剤として、２−クロロ−６，７−ジメトキシ−Ｎ−［５−１Ｈ−インダゾリル］キナゾリン−４−アミン、Ｎ−（１−ベンジル−４−ピペリジニル）−１Ｈ−インダゾール−５−アミン・２塩酸塩、４−［２−（２，３，４，５，６−ペンタフルオロフェニル）アクリロイル］桂皮酸および塩酸ファスジルを使用した。
２−クロロ−６，７−ジメトキシ−Ｎ−［５−１Ｈ−インダゾリル］キナゾリン−４−アミン（以下、化合物１と記載する。）は参考例１に従い合成したものを使用した。Ｎ−（１−ベンジル−４−ピペリジニル）−１Ｈ−インダゾール−５−アミン・２塩酸塩・１／２水和物（以下、化合物２と記載する。）は参考例２に従い合成したものを使用した。４−［２−（２，３，４，５，６−ペンタフルオロフェニル）アクリロイル］桂皮酸（以下、化合物３と記載する。）は参考例３に従い合成したものを使用した。塩酸ファスジル（以下、化合物４と記載する。）は市販の塩酸ファスジル水和物注射液「エリル注３０ｍｇ」（旭化成株式会社製）を使用した。
３）細胞培養
ウサギ三叉神経細胞の単離は試験例１と同様に行った。細胞培養にはニューロベーサル培養液（ＧＩＢＣＯ社製）にＢ２７ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ社製；最終濃度２％ｖ／ｖ）およびＬ−グルタミン（ＧＩＢＣＯ社製；最終濃度１ｍＭ）を添加した培養液を用い、２４ウェルプレートの各ウェルにポリリジン／ラミニンコーティング済み円形カバーグラス（直径１２ｍｍ；住友ベークライト社製）を入れ、そのカバーグラス上に約３×１０３細胞／ウェルとなるように細胞を播種した。細胞がカバーグラスに接着後（約２時間）、上記培養液をそれぞれの被験物質添加培養液（化合物１，最終濃度１０μＭ；化合物２，最終濃度１０μＭ；化合物３，最終濃度１μＭ；化合物４，最終濃度１０μＭ）に交換し、４８時間培養した。培養条件は、５％ＣＯ２、９５％空気下、湿度１００％、温度３７℃で行った。
４）免疫染色
培養４８時間後の細胞を４％パラホルムアルデヒドを用いて室温で２時間固定した。
神経細胞に特異的な中間径フィラメントであるニューロフィラメントを認識する抗ニューロフィラメント２００抗体（Ｓｉｇｍａ社製）およびこれと反応する蛍光二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）を用いて固定した標本を蛍光染色し、蛍光顕微鏡を用いて染色された細胞を検出した。染色像は、コンピュータに画像１画像：１．８３ｍｍ×１．３６ｍｍとして取り込んだ。画像中の全細胞数（ｔ）をカウントすると共に、画像解析ソフト（ＭａｃＳＣＯＰＥ，ＭＩＴＡＮＩ ＣＯ．）を用いて細胞の神経突起長および細胞体直径を測定し、細胞体直径の２倍以上長さの神経突起を有する細胞を神経突起形成細胞（ａ）としてカウントした。各画像中の全細胞数の合計（ｔ１＋ｔ２＋…＋ｔｎ＝Σｔ）が約１００以上となるまで画像を取り込んだ。その時の総神経突起形成細胞数（ａ１＋ａ２＋…＋ａｎ＝Σａ）の全細胞数（Σｔ）に対する比率（％）を計算した。
５）統計学的処理
神経突起形成細胞比率について、無添加群（コントロール）と被験物質添加群との比較をＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ多重比較検定法により行ない、危険率５％未満を有意であると判定した。
６）試験結果
図３に培養ウサギ三叉神経細胞の蛍光顕微鏡像を示す。
図３Ａは、被験物質無添加培養液で４８時間培養した細胞を、図３Ｂは化合物１を添加した培養液で４８時間培養した細胞を、図３Ｃは化合物２を添加した培養液で４８時間培養した細胞を、図３Ｄは化合物３を添加した培養液で４８時間培養した細胞を、図３Ｅは化合物４を添加した培養液で４８時間培養した細胞を示している。
図４は、全細胞数に対する無添加群およびそれぞれ被験物質添加群の神経突起形成細胞数の比率を示している。全細胞に対する神経突起形成細胞の比率は、無添加群で約３１％、化合物１添加群で約４１％、化合物２添加群で約５７％、化合物３添加群で約５１％、化合物４添加群で約７０％であり、被験物質添加群では神経突起形成細胞比率の有意な増加あるいは増加傾向が認められた。
以上の結果からＲＯＣＫ阻害剤は、三叉神経細胞の神経突起形成を促進する作用を有することが明らかとなった。
参考例１ ２−クロロ−６，７−ジメトキシ−Ｎ−［５−１Ｈ−インダゾリル］キナゾリン−４−アミンの合成（国際公開第０２／０７６９７７号パンフレット、実施例１）
２，４−ジクロロ−６，７−ジメトキシキナゾリン（８．６ｇ，６４．５８ｍｍｏｌ）、５−アミノインダゾール（４．８ｇ，３６．０４ｍｍｏｌ）および酢酸カリウム（７．３５１ｇ，７４．９１ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン／精製水（１３８ｍＬ／６２ｍＬ）中に加え、一晩室温下で攪拌した。混合物に精製水（１３０ｍＬ）を加え、結晶を析出させた。析出した結晶は精製水で洗浄し、ＤＭＦ−水から再結晶し目的とする２−クロロ−６，７−ジメトキシ−Ｎ−［５−１Ｈ−インダゾリル］キナゾリン−４−アミンの微黄色粉末を得た。
ｍｐ ２７８．７−２８３．８℃． １Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ６）δ３．９３（ｓ，３Ｈ），３．９６（ｓ，３Ｈ），７．１６（ｓ，１Ｈ），７．６０（ｍ，２Ｈ），７．９０（ｓ，１Ｈ），８．０３（ｓ，１Ｈ），８．１２（ｓ，１Ｈ），９．９４（ｓ，１Ｈ），１３．１３（ｂｒ ｓ，１Ｈ）． Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１７Ｈ１５Ｎ５Ｏ２Ｃｌ・１／２Ｈ２Ｏ：Ｃ，５５．９７，Ｈ，４．１４，Ｎ，１９．２０． Ｆｏｕｎｄ：Ｃ，５６．０５，Ｈ，４．４６，Ｎ，１９．２２．
参考例２ Ｎ−（１−ベンジル−４−ピペリジニル）−１Ｈ−インダゾール−５−アミン・２塩酸塩・１／２水和物の合成（国際公開第０２／１００８３３号パンフレット、実施例１）
１−ベンジル−４−ピペリドン（１４．２１ｇ，７５．１ｍｍｏｌ，１３．９２ｍＬ）の１，２−ジクロロエタン（８０ｍＬ）溶液中に、室温にて５−アミノインダゾール（１０．０ｇ，７５．１０ｍｍｏｌ）、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（１１．５ｇ，５２．６ｍｍｏｌ）、酢酸（４．２９ｍＬ，７５．１ｍｍｏｌ）を加え、室温にて終夜攪拌した。次に、反応液を１Ｎ−水酸化ナトリウム水溶液に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄してから、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去して得られた残渣をメタノールから再結晶することにより、Ｎ−（１−ベンジル−４−ピペリジニル）−１Ｈ−インダゾール−５−アミン（７．８ｇ，３４％）を得た。
ｍｐ １５０．１−１５２．２℃． １Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１．３９（ｍ，２Ｈ），１．９４（ｍ，２Ｈ），２．０８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝１０．８），２．７９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝１１．４），３．１９（ｍ，１Ｈ），３．４７（ｓ，３Ｈ），５．１１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８），６．６８（ｂｒ ｓ，１Ｈ），６．８３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．９，１．７），７．２０−７．３７（ｍ，６Ｈ），１２．５８（ｂｒ ｓ，１Ｈ）． Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１９Ｈ２２Ｎ４：Ｃ，７４．４８，Ｈ，７．２４，Ｎ，１８．２９． Ｆｏｕｎｄ：Ｃ，７４．４２，Ｈ，７．２７，Ｎ，１８．３７
得られたＮ−（１−ベンジル−４−ピペリジニル）−１Ｈ−インダゾール−５−アミン（６．０ｇ，１９．５８ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（６０ｍＬ）溶液中に、室温にて１Ｎ−塩酸／エーテル溶液（３８ｍＬ）および４Ｎ−塩酸／酢酸エチル溶液（１３ｍＬ）を加え、室温にて３０分間攪拌した。析出した固体を濾取し、メタノールから再結晶することにより、Ｎ−（１−ベンジル−４−ピペリジニル）−１Ｈ−インダゾール−５−アミン・２塩酸塩・１／２水和物（４．３２ｇ，５６％）を得た。
ｍｐ １９３．０−１９４．６℃． １Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ２．１８（ｍ，１．７５Ｈ），２．５１（ｍ，０．２５Ｈ），２．９８（ｍ，１．５Ｈ），３．１７（ｍ，０．５Ｈ），３．４１（ｍ，２Ｈ），３．６８（ｍ，０．７５Ｈ），３．９０（ｍ，０．２５Ｈ），４．２５（ｍ，１．５Ｈ），４．４６（ｍ，０．５Ｈ），７．４０−７．６４（ｍ，６Ｈ），７．５９（ｍ，１Ｈ），７．７０（ｍ，１Ｈ），７．９２（ｍ，１Ｈ），８．２０（ｓ，１Ｈ），１１．０２（ｂｒ ｓ，０．７５Ｈ），１１．５３（ｂｒ ｓ，０．２５Ｈ）． Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１９Ｈ２２Ｎ４２ＨＣｌ １／２Ｈ２Ｏ：Ｃ，５８．７６，Ｈ，６．４９，Ｎ，１４．４３． Ｆｏｕｎｄ：Ｃ，５８．４９，Ｈ，６．４８，Ｎ，１４．４５．
参考例３ ４−［２−（２，３，４，５，６−ペンタフルオロフェニル）アクリロイル］桂皮酸の合成（特開２０００−４４５１３号公報、実施例８）
工程１
窒素雰囲気下、ドライアイスで冷却しながら、イソブテン（２７ｍＬ）に（２，３，４，５，６−ペンタフルオロフェニル）酢酸（２０ｇ，９３．５ｍｏｌ）、エーテル（７ｍＬ）および濃硫酸（０．５ｍＬ）を加え、耐圧管中、室温で３日間撹拌した。１０％炭酸水素ナトリウム水溶液と氷との混合物に、ドライアイスで冷却した反応液を加え撹拌した。エーテルを加えて抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮し、（２，３，４，５，６−ペンタフルオロフェニル）酢酸 ｔ−ブチルエステル（２４．４ｇ，９７％）を得た。
工程２
４−ホルミル安息香酸（２０ｇ，０．１３３ｍｏｌ）のピリジン（１３８ｍＬ）溶液にマロン酸エチルモノカリウム塩（４６ｇ，０．２７０ｍｏｌ）、ｐ−トルエンスルホン酸・１水和物（５０ｇ，０．２６３ｍｏｌ）およびピペリジン（２．０ｍＬ）を加え、混合液を徐々に加熱したのち１２０℃で１．５時間撹拌した。氷冷下、反応液に２Ｎ塩酸を加えて酸性とし、析出物を濾取することにより４−カルボキシ桂皮酸 エチルエステル（２６．５８ｇ，９１％）を結晶として得た。
工程３
窒素雰囲気下、４−カルボキシ桂皮酸 エチルエステル（５．０ｇ，２２．７ｍｍｏｌ）のクロロホルム（１５ｍＬ）溶液に塩化チオニル（８．４ｍＬ）を滴下したのち、ジメチルホルムアミド（１滴）を加え３０分間加熱還流した。反応液を減圧濃縮し酸クロライドを得た。
窒素雰囲気下、工程１で得た（２，３，４，５，６−ペンタフルオロフェニル）酢酸 ｔ−ブチルエステル（６．３５ｇ，２３．５ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１００ｍＬ）溶液に、ドライアイスで冷却しながらリチウムビス（トリメチルシリル）アミドの１Ｍトルエン溶液（２６ｍＬ）を滴下した。５分後、さらに工程２で得た酸クロライドのテトラヒドロフラン（１００ｍＬ）溶液を滴下した。滴下終了２０分後に、室温で１．５時間撹拌した。反応液に５％クエン酸水溶液（１２０ｍＬ）を加え、エーテルで抽出した。有機層を水、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後減圧濃縮した。得られる残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、４−［（２ＲＳ）−２−（ｔ−ブトキシカルボニル）−２−（２，３，４，５，６−ペンタフルオロフェニル）アセチル］桂皮酸 エチルエステル（４．８３ｇ，４４％）を結晶として得た。
工程４
工程３で得た４−［（２ＲＳ）−２−（ｔ−ブトキシカルボニル）−２−（２，３，４，５，６−ペンタフルオロフェニル）アセチル］桂皮酸 エチルエステル（５．６ｇ，１１．６ｍｍｏｌ）のジオキサン（２４ｍｌ）溶液を耐圧管に入れ、濃塩酸（２４ｍｌ）を加えた。１３０℃に加熱しながら４時間撹拌した。反応液を氷冷して析出物を濾取し、４−［（２，３，４，５，６−ペンタフルオロフェニル）アセチル］桂皮酸（３．７ｇ，９０％）を結晶として得た。この４−［（２，３，４，５，６−ペンタフルオロフェニル）アセチル］桂皮酸（２．０３ｇ，５．７ｍｍｏｌ）のジオキサン（１１５ｍＬ）溶液を耐圧管に入れ、パラホルムアルデヒド（０．７ｇ）、ジメチルアミン塩酸塩（１．８６ｇ，２２．８ｍｍｏｌ）、酢酸（１０滴）および無水硫酸マグネシウム（８ｇ）を加えて１３０℃に加熱しながら一晩撹拌した。氷冷下、反応液に０．１Ｎ塩酸を加えて酸性とし酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄、無水硫酸マグネシウムで乾燥後減圧濃縮した。析出物を濾取し、標記化合物１．４６ｇ（９３％）を結晶として得た。
ｍｐ ２１４．０−２１７．０℃． １Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ６．２５（ｓ，１Ｈ），６．３０（ｓ，１Ｈ），６．４６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６．２），７．５７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４），７．６４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．９），７．７８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４）
試験例３ ウサギ三叉神経節および角膜組織におけるＲＯＣＫ Ｉ，ＲＯＣＫ ＩＩのタンパク質発現
１）使用動物
日本白色種雄性ウサギを北山ラベス社より購入して実験に使用した。
２）組織可溶性タンパク質の調製
動物を安楽死させた後、三叉神経節および角膜を摘出した。摘出した組織は氷冷したリン酸緩衝生理食塩水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中に移して洗浄し、氷冷した０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）および１ｔａｂｌｅｔ／１０ｍｌのＰｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（ｃｏｍｐｌｅｔｅ，Ｍｉｎｉ；Ｒｏｃｈｅ社製）を含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）中に移して超音波破砕をおこなった。超音波破砕処理により得られた各組織由来の細胞粗破砕液を遠心分離（１０，０００×ｇ，１５分，４℃）し、上清を回収して組織可溶性タンパク質溶液を得た。溶液中のタンパク質量はＢＣＡプロテインアッセイリージェント（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いて定量した。
３）ウェスタンブロッティング法を用いたＲＯＣＫ Ｉ，ＲＯＣＫ ＩＩの検出
調製した組織可溶性タンパク質に含まれるＲＯＣＫ Ｉ，ＲＯＣＫ ＩＩをウェスタンブロッティング法を用いて検出した。２５μｇのタンパク質を含む調製溶液を８％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル（ＴＥＦＣＯ社製）を用いて電気泳動法により分離し、ゲル内に分離されたタンパク質をＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に電気的に転写した。タンパク質の転写された膜を５％のスキムミルクでブロッキングした後、ヤギ抗ＲＯＣＫ Ｉ抗体あるいはヤギ抗ＲＯＣＫ ＩＩ抗体（ともにＳＡＮＴＡ ＣＲＵＺ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社製）と反応させ、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）結合抗ヤギＩｇＧ抗体（バイオラッド社製）を用いて二次標識した。抗原の免疫検出はＡＰ発色キット（バイオラッド社製）を用いておこなった。
４）試験結果
図５にウェスタンブロッティングの結果を示した。ＲＯＣＫ ＩおよびＲＯＣＫ ＩＩともにウサギ三叉神経節および角膜組織の可溶性タンパク質中にタンパク質レベルで発現していることが確認できた。
実施例１ 錠剤
Ｃ３酵素 １０ ｍｇ
乳糖 ８０ ｍｇ
デンプン １７ ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ３ ｍｇ
結晶セルロース １０ ｍｇ
以上の成分を１錠分の材料として、常法により錠剤を成形する。錠剤は必要に応じて通常用いられる腸溶性コーティング剤（例えばフタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）、糖衣およびフィルム（例えばエチルセルロース）を適用してもよい。主薬成分であるＣ３酵素を、化合物１、２、３又は４に変えてもよい。また添加剤との配合比を変えることにより、主薬の成分量が２０ｍｇ、５ｍｇ、１ｍｇ、０．５ｍｇ、０．１ｍｇ／錠の錠剤を調製しうる。
実施例２ カプセル剤
Ｃ３酵素 ５０ ｍｇ
マンニトール ７５ ｍｇ
デンプン １７ ｍｇ
ステアリン酸カルシウム ３ ｍｇ
以上の成分を１カプセル分の材料として均一に混合し、常法により顆粒状とし、硬カプセルに充填する。充填前に必要に応じて、通常用いられる腸溶性コーティング剤（例えばフタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、糖衣またはフィルム（例えばエチルセルロース）を顆粒に適用してもよい。主薬成分であるＣ３酵素を、化合物１、２、３又は４に変えてもよい。また添加剤との配合比を変えることにより、主薬の成分量が２０ｍｇ、１０ｍｇ、５ｍｇ、１ｍｇ、０．５ｍｇ、０．１ｍｇ／カプセルのカプセル剤を調製しうる。
実施例３ 注射剤
Ｃ３酵素 ７５０ ｍｇ
カルボキシメチルセルロースナトリウム ５００ ｍｇ
注射用水 全量 １００ ｍＬ
以上の成分を常法により無菌的に混和して注射剤を調製する。主薬成分であるＣ３酵素を、化合物１、２、３又は４に変えてもよい。また添加剤の配合比を変えることにより、主薬の成分量が１０００ｍｇ、５００ｍｇ、２００ｍｇ、１００ｍｇ／１００ｍＬである注射剤を調製することができる。
実施例４ 点眼剤
Ｃ３酵素 ５ ｍｇ
ホウ酸 ７００ ｍｇ
ホウ砂 適量（ｐＨ７．０）
塩化ナトリウム ５００ ｍｇ
ヒドロキシメチルセルロース ０．５ ｇ
エデト酸ナトリウム ０．０５ ｍｇ
塩化ベンザルコニウム ０．００５ｍｇ
滅菌精製水 全量 １００ ｍＬ
滅菌精製水８０ｍＬを約８０℃まで加温し、ヒドロキシメチルセルロースを加えて攪拌し、液温を室温まで戻す。この液にＣ３酵素、塩化ナトリウム、ホウ酸、エデト酸ナトリウムおよび塩化ベンザルコニウムを加えて溶解する。ホウ砂を適量加えてｐＨを７に調整する。滅菌精製水を加えて１００ｍＬまでメスアップする。主薬成分であるＣ３酵素を、化合物１、２、３又は４に変えてもよい。また添加剤の配合比を変えることにより、主薬の濃度が１ｗ／ｖ％、０．５ｗ／ｖ％、０．３ｗ／ｖ％、０．１ｗ／ｖ％、０．０５ｗ／ｖ％、０．０３ｗ／ｖ％、０．０１ｗ／ｖ％、０．００３ｗ／ｖ％、０．００１ｗ／ｖ％である点眼剤を調製することができる。
実施例５ 点眼剤
Ｃ３酵素 １０ ｍｇ
Ｄ−マンニトール ４．５ ｇ
リン酸二水素ナトリウム ０．１ ｇ
水酸化ナトリウム 適量（ｐＨ ７．０）
滅菌精製水 全量 １００ ｍＬ
滅菌精製水８０ｍＬにＣ３酵素、Ｄ−マンニトール、リン酸二水素ナトリウムを加えて溶解する。水酸化ナトリウムを適量加えてｐＨを５．０に調整する。滅菌精製水を加えて１００ｍＬまでメスアップする。調製した点眼剤をメンブランフィルターで滅菌ろ過後、ディスポーザブル（ユニットドーズ）容器に充填、密封する。主薬成分であるＣ３酵素を、化合物１、２、３又は４に変えてもよい。また添加剤の配合比を変えてもよい。また添加剤の配合比を変えることにより、主薬の濃度が１ｗ／ｖ％、０．５ｗ／ｖ％、０．３ｗ／ｖ％、０．１ｗ／ｖ％、０．０５ｗ／ｖ％、０．０３ｗ／ｖ％、０．００５ｗ／ｖ％、０．００３ｗ／ｖ％、０．００１ｗ／ｖ％である点眼剤を調製することができる。
【産業上の利用可能性】
本発明のＲｈｏタンパク阻害剤を含有する医薬は三叉神経細胞の神経突起形成促進作用を有することから、角膜神経の損傷などに伴う角膜知覚機能低下の改善および角膜知覚機能低下に伴うドライアイ症状の改善に有用である。具体的には、Ｒｈｏタンパク阻害剤を適用することにより、白内障手術後やＬＡＳＩＫ手術後の角膜知覚の低下、神経麻痺性角膜症、角膜潰瘍、糖尿病性角膜症などの角膜神経変性に伴う角膜知覚低下やドライアイ症状の改善効果が期待できる。
以上、本発明の具体的な態様のいくつかを詳細に説明したが、当業者であれば示された特定の態様には、本発明の教示と利点から実質的に逸脱しない範囲で様々な修正と変更をなすことは可能である。従って、そのような修正および変更も、すべて後記の特許請求の範囲で請求される本発明の精神と範囲内に含まれるものである。
本出願は、日本で出願された特願２００３−１１４８１９および特願２００３−２７３１７７を基礎としており、それらの内容は本出願にすベて包含されるものである。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【技術分野】
本発明はＲｈｏタンパク阻害剤を含有する角膜神経突起形成促進剤、および角膜神経突起形成促進による角膜知覚の回復、改善、並びにドライアイの治療剤に関する。
【背景技術】
レーザー屈折矯正角膜切除術（ＰＲＫ）、レーザー角膜切削形成術（レーシック；ＬＡＳＩＫ）、角膜移植などの角膜手術後には、角膜神経が切断されるため、通常約３週間から１年間角膜知覚機能の低下症状が起きるといわれている。例えば、ＬＡＳＩＫ後には明らかに角膜神経が切断されていること（Ｔｕｕｌｉ Ｕ．Ｌｉｎｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｅｙｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６６：７５５−７６３，１９９８）、また、ＬＡＳＩＫ後に神経像が認められないか、あるいは神経線維束が短く連結していない角膜領域において、角膜知覚が低下することが報告されている（Ｔｕｕｌｉ Ｕ．Ｌｉｎｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ＆ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，４１：３９３−３９７，２０００）。
ＰＲＫおよびＬＡＳＩＫ後における角膜知覚の低下は涙腺応答低下、涙液減少の原因であることが示唆されている（Ａｎｇ，Ｒｏｂｅｒｔ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ １２：３１８−３２２，２００１）。そしてこの角膜知覚機能低下のため角膜手術後の患者では瞬目回数が減少しドライアイ症状が認められることが問題となっている。一方、ドライアイ患者では、涙液機能の低下が角膜知覚の低下をもたらし、この角膜知覚の低下がさらに涙液機能の低下を悪化させ、角膜表面の症状を重篤化させることが問題となっている。
しかし、現在角膜手術後の角膜知覚の回復は自然回復に委ねられ、またドライアイの治療においても角膜知覚を回復させるための積極的治療は施されていないのが現状である。
また、神経麻痺性角膜症、角膜潰瘍、糖尿病性角膜症などの角膜神経変性を伴う疾患でも角膜知覚低下が引き起こされる。
ＲｈｏタンパクはＲｈｏファミリー（Ｒｈｏ、Ｒａｃ、Ｃｄｃ４２などを含む）に包含される低分子Ｇタンパクであり、アクチン細胞骨格形成や、神経突起退縮反応に関係することが知られている。
例えば、Ｒｈｏタンパク阻害剤であるＣ３酵素は３Ｔ３線維芽細胞の細胞突起を伸展させることが知られており（Ｈｉｒｏｓｅ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１４１：１６２５−１６３６，１９９８）、Ｒｈｏタンパク阻害剤の有効量を患者に投与することによって中枢神経軸索成長を促進する方法が開示されている（特表２００１−５１５０１８号公報、欧州特許出願公開第１，０１１，３３０号明細書）。また、Ｒｈｏタンパクのエフェクター分子の一つであるＲｈｏキナーゼの阻害剤が網膜神経節細胞の軸索伸展作用を有し、視神経細胞の再生促進作用を有することが知られている（国際公開第０２／８３１７５号パンフレット、欧州特許出願公開第１，１４２，５８５号明細書）。国際公開第０３／０２０２８１号パンフレットでは、ＬＡＳＩＫなどの手術後の角膜神経傷害に起因する病態を治療する目的に神経再生または神経突起伸展を促進する化合物が使えるとされており、それら化合物の例として神経栄養性因子刺激物質であるネオトロフィンなどの化合物が例示されているが、Ｒｈｏタンパク阻害剤の記載はなく、またそれらを示唆する記載もない。
三叉神経に対しては、ラット三叉神経組織培養（ｔｒｉｇｅｍｉｎａｌ ｔｒａｃｔ ｉｎ ｗｈｏｌｅ ｍｏｕｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅｓ）系において、神経成長因子（ＮＧＦ）などの神経栄養因子誘発神経軸索伸展がＲｈｏ活性化剤（リゾホスファチジン酸）で阻害され、ドミナントネガティブＲｈｏを細胞に導入することで促進されることが報告されている（Ｏｚｄｉｎｌｅｒ，Ｐ．Ｈａｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，４３８：３７７−３８７，２００１）。その一方、神経栄養因子非存在下では、Ｒｈｏが三叉神経軸索伸展に有効かどうかについては分からないとの記載があり、Ｒｈｏタンパク阻害剤の三叉神経に対する効果についても未だ判明していない。
一方、Ｒｈｏ活性化作用を有する化合物が角膜上皮伸展作用を有し、Ｒｈｏタンパク阻害剤であるＣ３酵素によってその角膜上皮の伸展が抑制されることから、Ｒｈｏ活性化作用を有する化合物が、角膜潰瘍、角膜上皮剥離、角膜炎などの角膜障害に有用であることが開示されている（特開２０００−２６４８４７号公報、欧州特許出願公開第１，１４２，５８５号明細書）。
【発明の開示】
レーザー屈折矯正角膜切除術（ＰＲＫ）、レーザー角膜切削形成術（レーシック；ＬＡＳＩＫ）、角膜移植などの角膜手術後などの角膜知覚機能低下や、ドライアイ患者における角膜知覚低下を回復させる医薬を提供することである。
本発明者らは、角膜術後の角膜知覚回復やドライアイにおける角膜知覚症状を改善する新しいタイプの医薬を提供することを目的に検討を行ったところ、Ｒｈｏタンパク阻害剤が三叉神経（以後、角膜神経ということもある。）細胞の神経突起形成促進効果を有することを初めて見出し、これらの知見に基づいてさらに研究をすすめ、Ｒｈｏタンパク阻害剤を角膜知覚回復などの医薬として利用する本発明を完成した。
すなわち、本発明は、
（１）Ｒｈｏタンパク阻害剤を含有する角膜神経突起形成促進剤；
（２）Ｒｈｏタンパク阻害剤を含有する角膜神経軸索伸展促進剤；
（３）Ｒｈｏタンパク阻害剤を含有する角膜知覚回復剤；
（４）Ｒｈｏタンパク阻害剤を含有する、ドライアイ治療剤；
（５）Ｒｈｏタンパク阻害剤を含有する角膜神経突起形成促進用組成物；
（６）Ｒｈｏタンパク阻害剤を含有する角膜神経軸索伸展促進用組成物；
（７）Ｒｈｏタンパク阻害剤を含有する角膜知覚回復用組成物；
（８）Ｒｈｏタンパク阻害剤を含有するドライアイ治療用組成物；
（９）角膜神経突起形成促進用組成物を製造するためのＲｈｏタンパク阻害剤の使用；
（１０）角膜神経軸索伸展促進用組成物を製造するためのＲｈｏタンパク阻害剤の使用；
（１１）角膜知覚回復用組成物を製造するためのＲｈｏタンパク阻害剤の使用；
（１２）ドライアイ治療用組成物を製造するためのＲｈｏタンパク阻害剤の使用；
（１３）角膜神経の神経突起形成促進が必要とされる対象にＲｈｏタンパク阻害剤の有効量を投与することによる角膜神経の神経突起形成を促進する方法；
（１４）角膜神経の軸索伸展促進が必要とされる対象にＲｈｏタンパク阻害剤の有効量を投与することによる角膜神経の軸索伸展を促進する方法；
（１５）角膜知覚の回復が必要とされる対象にＲｈｏタンパク阻害剤の有効量を投与することによる角膜知覚を回復する方法；
（１６）ドライアイに罹患した対象にＲｈｏタンパク阻害剤の有効量を投与することによるドライアイを治療する方法
に関するものである。
【図面の簡単な説明】
図１は試験例１におけるウサギ培養三叉神経細胞の蛍光顕微鏡像を示す。ＡはＣ３酵素無添加培養液で２４時間培養したウサギ三叉神経細胞を、ＢはＣ３酵素を最終濃度２μｇ／ｍＬになるよう添加した培養液で２４時間培養した細胞を示す。
図２は試験例１における神経突起形成細胞の全細胞数に対する比率（％）を示す。縦軸は全細胞に対する神経突起形成細胞の割合を示す。各値は３例の平均値±標準誤差を示す。図中＊はコントロールに対する有意差（ｐ＜０．０５）を示す。
図３は試験例２における培養ウサギ三叉神経細胞の蛍光顕微鏡像を示す。Ａは被験物質無添加培養液、Ｂは化合物１添加（最終濃度１０μＭ）培養液、Ｃは化合物２添加（最終濃度１０μＭ）培養液、Ｄは化合物３添加（最終濃度１μＭ）培養液、Ｅは化合物４添加（最終濃度１０μＭ）培養液で４８時間培養した細胞を示す。
図４は試験例２におけるカウントした全細胞数に対する神経突起形成細胞の比率（％）を示すグラフである。各値は３例の平均値±標準誤差を示す。図中＊は無添加群に対する有意差ｐ＜０．０５を、＊＊は無添加群に対する有意差ｐ＜０．０１を示す。
図５は試験例３において、ウサギ角膜（Ｃ）と三叉神経節（Ｔ）におけるＲＯＣＫ ＩおよびＲＯＣＫ ＩＩウェスタンブロッティングの結果を示す。
発明の詳細な説明
本明細書中において、「Ｒｈｏタンパク阻害剤」とは、不活性型のＧＤＰ結合型Ｒｈｏタンパク質が活性型のＧＴＰ結合型Ｒｈｏタンパク質へと活性化されるのを阻害する全ての阻害剤、およびＲｈｏタンパクまたはＲｈｏタンパクフラグメントに対する抗体など、並びにＲｈｏタンパクの作用を伝達するエフェクター分子、例えばＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）の働きを阻害するすべての阻害剤などをも包含するものである。「角膜神経」とは、知覚神経である三叉神経の支配をうけ角膜周囲に形成される輪状神経叢、角膜実質に網目上に分布する実質内神経叢、ボーマン膜直下で形成される上皮下神経叢、ボーマン膜を貫通したところで形成される基底細胞神経叢および神経線維をいう。本発明における「神経突起」とは、ニューロン（神経細胞）の細胞体から出る突起（樹状突起および軸索）をいい、「形成」とは細胞体から前記神経突起が生成または／および伸展することをいう。どの程度の神経突起形成をもって促進されている状態というかは、当業者には明らかである。神経突起形成の促進は、例えば、神経細胞を蛍光染色し、蛍光顕微鏡を用いて細胞の状態を観察することにより確認することができる。また、蛍光顕微鏡での観察結果を画像解析ソフトなどを用いて解析してもよい。さらに、その結果を統計学的処理することにより神経突起形成の状態を数値化することも可能である。さらに別の方法として、神経細胞体および神経突起を構成するもの、例えばニューロフィラメントを認識する抗体、およびこれと反応する西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗体で標識した後、ＨＲＰを発色させて吸光度を測定することによりニューロフィラメント量を測定し、神経突起形成の指標とすることもできる。
Ｒｈｏタンパク阻害剤としては、例えばＣ３細胞外酵素（Ｅｘｏｅｎｚｙｍｅ Ｃ３、本明細書においては単にＣ３酵素ということもある。）、トキシンＡ（Ｔｏｘｉｎ Ａ）およびトキシンＢ（Ｔｏｘｉｎ Ｂ）並びにＲｈｏキナーゼ阻害剤が挙げられる。
このうち、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（以後、ＲＯＣＫ阻害剤ということもある。）としては、例えば、特開昭６１−２２７５８１号公報（米国特許第４，６７８，７８３号明細書）に記載の化合物、例えば、塩酸ファスジルなどで代表されるイソキノリンスルホニル誘導体；国際公開第００／５７９１４号パンフレットおよび特開２０００−４４５１３号公報に記載の化合物、例えば、エタクリン酸および４−［２−（２，３，４，５，６−ペンタフルオロフェニル）アクリロイル］桂皮酸などのＲｈｏキナーゼ阻害剤；国際公開第０２／０７６９７７号パンフレット（欧州特許公開第１，３７０，５５２号明細書、同第１，３７０，５５３号明細書）記載の化合物、例えば、２−クロロ−６，７−ジメトキシ−Ｎ−［５−１Ｈ−インダゾリル］キナゾリン−４−アミンなどのＲｈｏキナーゼ阻害剤；および国際公開第０２／１００８３３号パンフレットに記載の化合物、例えば、Ｎ−（１−ベンジル−４−ピペリジニル）−１Ｈ−インダゾール−５−アミン・２塩酸塩・１水和物などのＲｈｏキナーゼ阻害剤が挙げられる。
なお、以下の説明において、本発明で用いるＲｈｏタンパク阻害剤を含有する薬剤および組成物をまとめて、「本発明の医薬」ということもある。
本発明の医薬は、哺乳動物（例えばヒト、ラット、マウス、ウサギ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコなど）における角膜神経が障害、切断または欠損した、例えばＰＲＫやＬＡＳＩＫ後の低下した角膜知覚回復のための治療薬として、あるいは神経麻痺性角膜症、角膜潰瘍、糖尿病性角膜症などの角膜神経変性に伴う角膜知覚低下や角膜知覚の低下したドライアイの治療薬として有用である。
本発明の医薬は全身的または局所的に投与される。全身的には、経口投与に加え、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射など非経口的にも投与される。局所的には、眼に投与される。
本発明の医薬の製剤形態としては、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、坐剤などの固形剤、およびシロップ剤、注射剤、点眼剤などの液剤などが挙げられる。
本発明の医薬を顆粒および錠剤として製造する場合には、例えば賦形剤（乳糖、白糖、ブドウ糖、デンプン、結晶セルロースなど）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウムなど）、崩壊剤（デンプン、カルメロースナトリウム、炭酸カルシウムなど）、結合剤（デンプン糊液、ヒドロキシプロピルセルロース液、カルメロース液、アラビアゴム液、ゼラチン液、アルギン酸ナトリウム液など）などを用いることにより任意の剤形を製造することができる。また、顆粒剤および錠剤には、適当なコーティング剤（ゼラチン、白糖、アラビアゴム、カルナバロウなど）、腸溶性コーティング剤（例えば酢酸フタル酸セルロース、メタアクリル酸コポリマー、ヒドロキシプロピルセルロースフタレート、カルボキシメチルエチルセルロースなど）などで剤皮を施してもよい。
本発明の医薬をカプセル剤として製造する場合には、適当な賦形剤、例えば流動性と滑沢性を向上させるためのステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、軽質無水ケイ酸など、また加圧流動性のための結晶セルロースや乳糖などの他、上記崩壊剤などを適宜添加したものを均等に混和または粒状もしくは粒状としたものに適当なコーティング剤で剤皮を施したものを充填するか、適当なカプセル基剤（ゼラチンなど）にグリセリンまたはソルビトールなどを加えて塑性を増したカプセル基剤で被包成形することもできる。これらカプセル剤には必要に応じて、着色剤、保存剤［二酸化イオウ、パラベン類（パラオキシ安息香酸メチル、エチル、プロピルエステル）］などを加えることができる。カプセル剤は通常のカプセルの他、腸溶性コーティングカプセル、胃内抵抗性カプセル、放出制御カプセルとすることもできる。腸溶性カプセルとする場合、腸溶性コーティング剤でコーティングした化合物、または化合物に上記の適当な賦形剤を添加したものを、通常のカプセルに充填または、カプセル自身を腸溶性コーティング剤でコーティング、もしくは腸溶性高分子を基剤として成形することができる。
本発明の医薬を坐剤として製造する場合には、坐剤基剤（例えばカカオ脂、マクロゴールなど）を適宜選択して使用することができる。
本発明の医薬をシロップ剤として製造する場合、例えば安定剤（エデト酸ナトリウムなど）、懸濁化剤（アラビアゴム、カルメロースなど）、矯味剤（単シロップ、ブドウ糖など）、芳香剤などを適宜選択して使用することができる。
本発明の医薬を注射剤または点眼剤として製造する場合、医薬上許容される添加物、例えば等張化剤（塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、ホウ酸、ホウ砂、ブドウ糖、プロピレングリコールなど）、緩衝剤（リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸緩衝液、イプシロンアミノカプロン酸緩衝液など）、保存剤（パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂など）、増粘剤（ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコールなど）、安定化剤（亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエンなど）、ｐＨ調整剤（塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸など）などを適宜添加した溶液に溶解または分散することによって製造することができる。
上記シロップ剤、注射剤および点眼剤における添加剤の添加量は、添加する添加剤の種類、用途などによって異なるが、添加剤の目的を達成し得る濃度を添加すればよく、等張化剤は、通常、浸透圧が約２２９〜約３４３ｍＯｓｍとなるよう、約０．５〜約５．０ｗ／ｖ％を添加する。また、緩衝剤は約０．０１〜約２．０ｗ／ｖ％程度、増粘剤は約０．０１〜約１．０ｗ／ｖ％程度、安定化剤は約０．００１〜約１．０ｗ／ｖ％程度になるように添加する。ｐＨ調整剤は、適宜添加し、通常ｐＨ約３〜約９、好ましくは約４〜約８になるように添加する。
特に本発明の医薬を点眼剤として使用する場合、本発明の医薬に含まれるＲｈｏタンパク阻害剤の濃度は、通常下限は約０．００００１ｗ／ｖ％、好ましくは約０．００００５ｗ／ｖ％、より好ましくは約０．０００１ｗ／ｖ％であり、上限は約０．１ｗ／ｖ％、好ましくは約０．０５ｗ／ｖ％、より好ましくは約０．０１ｗ／ｖ％、さらに好ましくは約０．００５ｗ／ｖ％、なおさらに好ましくは約０．００１ｗ／ｖ％に調製される。
本発明の医薬の投与量は対象となる疾患、症状、投与対象、Ｒｈｏタンパク阻害剤の種類、投与方法などにより異なるが、例えばＰＲＫ手術後の角膜知覚回復剤として成人の眼に局所的に使用する場合には、例えばＣ３酵素約０．００１ｗ／ｖ％含有する点眼液を、あるいは、Ｎ−（１−ベンジル−４−ピペリジニル）−１Ｈ−インダゾール−５−アミン・２塩酸塩・１／２水和物などのＲｈｏタンパク阻害剤を約０．００３ｗ／ｖ％含有する点眼液を、１回約２０〜約５０μＬ、１日数回点眼するのがよい。
また、本発明の医薬をＬＡＳＩＫ手術後の角膜知覚回復剤として成人に経口投与する場合、例えば、４−［２−（２，３，４，５，６−ペンタフルオロフェニル）アクリロイル］桂皮酸などのＲｈｏタンパク阻害剤を約１０ｍｇ含有する錠剤を１日１回ないし２回服用するのがよい。
【実施例】
本発明を以下の試験例及び実施例に従いさらに詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
試験例１ 培養ウサギ三叉神経細胞の神経突起形成促進作用
１）使用動物
福崎養兎組合より購入した日本白色種ウサギ（生後２〜３日）を使用した。
２）被験物質
Ｃ３酵素〔ｕｐｓｔａｔｅ社製；Ｅｘｏｅｎｚｙｍｅ Ｃ３（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｎｚｙｍｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ）；Ｃａｔａｌｏｇ ＃１３−１１８，Ｌｏｔ ＃２３３３０〕
３）試験方法
細胞培養：三叉神経細胞の単離はＣｈａｎらの報告（Ｃｈａｎ，Ｋｗａｎ Ｙ．ａｎｄ Ｈａｓｃｈｋｅ，Ｒｉｃｈａｒｄ Ｈ．，Ｅｘｐ．Ｅｙｅ Ｒｅｓ．，４１：６８７−６９９，１９８５）を参考にして行った。すなわち、ウサギをエーテル麻酔下、生理食塩水で心臓を灌流後、三叉神経節を切り出し、神経分散液（住友ベークライト社製）を用いて、三叉神経節を分散させた後、ポリリジンでコートした８ウェルカルチャースライド（ＢＥＣＴＯＮ ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ社製）に細胞を播種した。細胞数は１ウェルあたり約３×１０３細胞とし、培養条件は５％ＣＯ２、９５％空気下、湿度１００％、３７℃とした。細胞培養にはニューロベーサル培養液（ＧＩＢＣＯ社製）にＢ２７ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ社製；０．０２ｍＬ／ｍＬ培養液）およびＬ−グルタミン酸（ＧＩＢＣＯ社製；最終濃度１ｍＭ）を添加した培養液を用い、細胞播種直後にＣ３酵素（２μｇ／ｍＬ最終濃度）を添加して２４時間培養した。
免疫染色：培養２４時間後に、細胞を４％パラホルムアルデヒドを用いて室温で２時間固定し、神経細胞に特異的な中間径フィラメントであるニューロフィラメントを特異的に認識する抗ニューロフィラメント２００抗体（Ｓｉｇｍａ社製）およびこれと反応する蛍光二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）を用いて神経細胞体および神経突起を蛍光染色した。染色細胞は蛍光顕微鏡からコンピュータに画像（１画像：１．８３ｍｍ×１．３６ｍｍ）として取り込み、画像中の全細胞数（ｔ）をカウントすると共に、画像解析ソフト（ＭａｃＳＣＯＰＥ，ＭＩＴＡＮＩ ＣＯ．社製）を用いて細胞の神経突起の長さを測定し、細胞体の直径の２倍以上長さの神経突起を持つ細胞を神経突起形成細胞（ａ）としてカウントした。各画像中の全細胞数の合計（ｔ１＋ｔ２＋…＋ｔｎ＝Σｔ）が約１００以上となるまで複数の画像を取り込んだ。その時の総神経突起形成細胞数（ａ１＋ａ２＋…＋ａｎ＝Σａ）の全細胞数合計（Σｔ）に対する比率（％）を計算した。この比率について、Ｃ３酵素添加群と無添加群（コントロール群）とを比較するために、ｔ−ｔｅｓｔにより検定して危険率５％未満を有意であると判定した。
４）試験結果
図１は培養ウサギ三叉神経細胞の蛍光顕微鏡像を示している。図１中、ＡはＣ３酵素無添加培養液で２４時間培養したコントロール群の細胞を、ＢはＣ３酵素を最終濃度２μｇ／ｍＬ添加した培養液で２４時間培養した細胞を、図２は各群の全細胞数に対する神経突起形成細胞数の比率を示す。
神経突起形成細胞の比率はコントロール群では全細胞の約２１％、Ｃ３酵素添加群では全細胞の約４６％であり、Ｃ３酵素添加により突起形成細胞数の有意な増加が認められた（図２）。
以上のことから、Ｒｈｏ阻害活性を有するＣ３酵素は三叉神経細胞の突起形成を促進することが分かった。
試験例２ 培養ウサギ三叉神経の突起形成促進作用
１）使用動物
北山ラベス社より購入した日本白色種ウサギ（生後２〜３日）を使用した。
２）被験物質
ＲＯＣＫ阻害剤として、２−クロロ−６，７−ジメトキシ−Ｎ−［５−１Ｈ−インダゾリル］キナゾリン−４−アミン、Ｎ−（１−ベンジル−４−ピペリジニル）−１Ｈ−インダゾール−５−アミン・２塩酸塩、４−［２−（２，３，４，５，６−ペンタフルオロフェニル）アクリロイル］桂皮酸および塩酸ファスジルを使用した。
２−クロロ−６，７−ジメトキシ−Ｎ−［５−１Ｈ−インダゾリル］キナゾリン−４−アミン（以下、化合物１と記載する。）は参考例１に従い合成したものを使用した。Ｎ−（１−ベンジル−４−ピペリジニル）−１Ｈ−インダゾール−５−アミン・２塩酸塩・１／２水和物（以下、化合物２と記載する。）は参考例２に従い合成したものを使用した。４−［２−（２，３，４，５，６−ペンタフルオロフェニル）アクリロイル］桂皮酸（以下、化合物３と記載する。）は参考例３に従い合成したものを使用した。塩酸ファスジル（以下、化合物４と記載する。）は市販の塩酸ファスジル水和物注射液「エリル注３０ｍｇ」（旭化成株式会社製）を使用した。
３）細胞培養
ウサギ三叉神経細胞の単離は試験例１と同様に行った。細胞培養にはニューロベーサル培養液（ＧＩＢＣＯ社製）にＢ２７ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ社製；最終濃度２％ｖ／ｖ）およびＬ−グルタミン（ＧＩＢＣＯ社製；最終濃度１ｍＭ）を添加した培養液を用い、２４ウェルプレートの各ウェルにポリリジン／ラミニンコーティング済み円形カバーグラス（直径１２ｍｍ；住友ベークライト社製）を入れ、そのカバーグラス上に約３×１０３細胞／ウェルとなるように細胞を播種した。細胞がカバーグラスに接着後（約２時間）、上記培養液をそれぞれの被験物質添加培養液（化合物１，最終濃度１０μＭ；化合物２，最終濃度１０μＭ；化合物３，最終濃度１μＭ；化合物４，最終濃度１０μＭ）に交換し、４８時間培養した。培養条件は、５％ＣＯ２、９５％空気下、湿度１００％、温度３７℃で行った。
４）免疫染色
培養４８時間後の細胞を４％パラホルムアルデヒドを用いて室温で２時間固定した。
神経細胞に特異的な中間径フィラメントであるニューロフィラメントを認識する抗ニューロフィラメント２００抗体（Ｓｉｇｍａ社製）およびこれと反応する蛍光二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）を用いて固定した標本を蛍光染色し、蛍光顕微鏡を用いて染色された細胞を検出した。染色像は、コンピュータに画像１画像：１．８３ｍｍ×１．３６ｍｍとして取り込んだ。画像中の全細胞数（ｔ）をカウントすると共に、画像解析ソフト（ＭａｃＳＣＯＰＥ，ＭＩＴＡＮＩ ＣＯ．）を用いて細胞の神経突起長および細胞体直径を測定し、細胞体直径の２倍以上長さの神経突起を有する細胞を神経突起形成細胞（ａ）としてカウントした。各画像中の全細胞数の合計（ｔ１＋ｔ２＋…＋ｔｎ＝Σｔ）が約１００以上となるまで画像を取り込んだ。その時の総神経突起形成細胞数（ａ１＋ａ２＋…＋ａｎ＝Σａ）の全細胞数（Σｔ）に対する比率（％）を計算した。
５）統計学的処理
神経突起形成細胞比率について、無添加群（コントロール）と被験物質添加群との比較をＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ多重比較検定法により行ない、危険率５％未満を有意であると判定した。
６）試験結果
図３に培養ウサギ三叉神経細胞の蛍光顕微鏡像を示す。
図３Ａは、被験物質無添加培養液で４８時間培養した細胞を、図３Ｂは化合物１を添加した培養液で４８時間培養した細胞を、図３Ｃは化合物２を添加した培養液で４８時間培養した細胞を、図３Ｄは化合物３を添加した培養液で４８時間培養した細胞を、図３Ｅは化合物４を添加した培養液で４８時間培養した細胞を示している。
図４は、全細胞数に対する無添加群およびそれぞれ被験物質添加群の神経突起形成細胞数の比率を示している。全細胞に対する神経突起形成細胞の比率は、無添加群で約３１％、化合物１添加群で約４１％、化合物２添加群で約５７％、化合物３添加群で約５１％、化合物４添加群で約７０％であり、被験物質添加群では神経突起形成細胞比率の有意な増加あるいは増加傾向が認められた。
以上の結果からＲＯＣＫ阻害剤は、三叉神経細胞の神経突起形成を促進する作用を有することが明らかとなった。
参考例１ ２−クロロ−６，７−ジメトキシ−Ｎ−［５−１Ｈ−インダゾリル］キナゾリン−４−アミンの合成（国際公開第０２／０７６９７７号パンフレット、実施例１）
２，４−ジクロロ−６，７−ジメトキシキナゾリン（８．６ｇ，６４．５８ｍｍｏｌ）、５−アミノインダゾール（４．８ｇ，３６．０４ｍｍｏｌ）および酢酸カリウム（７．３５１ｇ，７４．９１ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン／精製水（１３８ｍＬ／６２ｍＬ）中に加え、一晩室温下で攪拌した。混合物に精製水（１３０ｍＬ）を加え、結晶を析出させた。析出した結晶は精製水で洗浄し、ＤＭＦ−水から再結晶し目的とする２−クロロ−６，７−ジメトキシ−Ｎ−［５−１Ｈ−インダゾリル］キナゾリン−４−アミンの微黄色粉末を得た。
ｍｐ ２７８．７−２８３．８℃． １Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ６）δ３．９３（ｓ，３Ｈ），３．９６（ｓ，３Ｈ），７．１６（ｓ，１Ｈ），７．６０（ｍ，２Ｈ），７．９０（ｓ，１Ｈ），８．０３（ｓ，１Ｈ），８．１２（ｓ，１Ｈ），９．９４（ｓ，１Ｈ），１３．１３（ｂｒ ｓ，１Ｈ）． Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１７Ｈ１５Ｎ５Ｏ２Ｃｌ・１／２Ｈ２Ｏ：Ｃ，５５．９７，Ｈ，４．１４，Ｎ，１９．２０． Ｆｏｕｎｄ：Ｃ，５６．０５，Ｈ，４．４６，Ｎ，１９．２２．
参考例２ Ｎ−（１−ベンジル−４−ピペリジニル）−１Ｈ−インダゾール−５−アミン・２塩酸塩・１／２水和物の合成（国際公開第０２／１００８３３号パンフレット、実施例１）
１−ベンジル−４−ピペリドン（１４．２１ｇ，７５．１ｍｍｏｌ，１３．９２ｍＬ）の１，２−ジクロロエタン（８０ｍＬ）溶液中に、室温にて５−アミノインダゾール（１０．０ｇ，７５．１０ｍｍｏｌ）、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（１１．５ｇ，５２．６ｍｍｏｌ）、酢酸（４．２９ｍＬ，７５．１ｍｍｏｌ）を加え、室温にて終夜攪拌した。次に、反応液を１Ｎ−水酸化ナトリウム水溶液に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄してから、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去して得られた残渣をメタノールから再結晶することにより、Ｎ−（１−ベンジル−４−ピペリジニル）−１Ｈ−インダゾール−５−アミン（７．８ｇ，３４％）を得た。
ｍｐ １５０．１−１５２．２℃． １Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１．３９（ｍ，２Ｈ），１．９４（ｍ，２Ｈ），２．０８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝１０．８），２．７９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝１１．４），３．１９（ｍ，１Ｈ），３．４７（ｓ，３Ｈ），５．１１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８），６．６８（ｂｒ ｓ，１Ｈ），６．８３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．９，１．７），７．２０−７．３７（ｍ，６Ｈ），１２．５８（ｂｒ ｓ，１Ｈ）． Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１９Ｈ２２Ｎ４：Ｃ，７４．４８，Ｈ，７．２４，Ｎ，１８．２９． Ｆｏｕｎｄ：Ｃ，７４．４２，Ｈ，７．２７，Ｎ，１８．３７
得られたＮ−（１−ベンジル−４−ピペリジニル）−１Ｈ−インダゾール−５−アミン（６．０ｇ，１９．５８ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（６０ｍＬ）溶液中に、室温にて１Ｎ−塩酸／エーテル溶液（３８ｍＬ）および４Ｎ−塩酸／酢酸エチル溶液（１３ｍＬ）を加え、室温にて３０分間攪拌した。析出した固体を濾取し、メタノールから再結晶することにより、Ｎ−（１−ベンジル−４−ピペリジニル）−１Ｈ−インダゾール−５−アミン・２塩酸塩・１／２水和物（４．３２ｇ，５６％）を得た。
ｍｐ １９３．０−１９４．６℃． １Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ２．１８（ｍ，１．７５Ｈ），２．５１（ｍ，０．２５Ｈ），２．９８（ｍ，１．５Ｈ），３．１７（ｍ，０．５Ｈ），３．４１（ｍ，２Ｈ），３．６８（ｍ，０．７５Ｈ），３．９０（ｍ，０．２５Ｈ），４．２５（ｍ，１．５Ｈ），４．４６（ｍ，０．５Ｈ），７．４０−７．６４（ｍ，６Ｈ），７．５９（ｍ，１Ｈ），７．７０（ｍ，１Ｈ），７．９２（ｍ，１Ｈ），８．２０（ｓ，１Ｈ），１１．０２（ｂｒ ｓ，０．７５Ｈ），１１．５３（ｂｒ ｓ，０．２５Ｈ）． Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１９Ｈ２２Ｎ４２ＨＣｌ １／２Ｈ２Ｏ：Ｃ，５８．７６，Ｈ，６．４９，Ｎ，１４．４３． Ｆｏｕｎｄ：Ｃ，５８．４９，Ｈ，６．４８，Ｎ，１４．４５．
参考例３ ４−［２−（２，３，４，５，６−ペンタフルオロフェニル）アクリロイル］桂皮酸の合成（特開２０００−４４５１３号公報、実施例８）
工程１
窒素雰囲気下、ドライアイスで冷却しながら、イソブテン（２７ｍＬ）に（２，３，４，５，６−ペンタフルオロフェニル）酢酸（２０ｇ，９３．５ｍｏｌ）、エーテル（７ｍＬ）および濃硫酸（０．５ｍＬ）を加え、耐圧管中、室温で３日間撹拌した。１０％炭酸水素ナトリウム水溶液と氷との混合物に、ドライアイスで冷却した反応液を加え撹拌した。エーテルを加えて抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮し、（２，３，４，５，６−ペンタフルオロフェニル）酢酸 ｔ−ブチルエステル（２４．４ｇ，９７％）を得た。
工程２
４−ホルミル安息香酸（２０ｇ，０．１３３ｍｏｌ）のピリジン（１３８ｍＬ）溶液にマロン酸エチルモノカリウム塩（４６ｇ，０．２７０ｍｏｌ）、ｐ−トルエンスルホン酸・１水和物（５０ｇ，０．２６３ｍｏｌ）およびピペリジン（２．０ｍＬ）を加え、混合液を徐々に加熱したのち１２０℃で１．５時間撹拌した。氷冷下、反応液に２Ｎ塩酸を加えて酸性とし、析出物を濾取することにより４−カルボキシ桂皮酸 エチルエステル（２６．５８ｇ，９１％）を結晶として得た。
工程３
窒素雰囲気下、４−カルボキシ桂皮酸 エチルエステル（５．０ｇ，２２．７ｍｍｏｌ）のクロロホルム（１５ｍＬ）溶液に塩化チオニル（８．４ｍＬ）を滴下したのち、ジメチルホルムアミド（１滴）を加え３０分間加熱還流した。反応液を減圧濃縮し酸クロライドを得た。
窒素雰囲気下、工程１で得た（２，３，４，５，６−ペンタフルオロフェニル）酢酸 ｔ−ブチルエステル（６．３５ｇ，２３．５ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１００ｍＬ）溶液に、ドライアイスで冷却しながらリチウムビス（トリメチルシリル）アミドの１Ｍトルエン溶液（２６ｍＬ）を滴下した。５分後、さらに工程２で得た酸クロライドのテトラヒドロフラン（１００ｍＬ）溶液を滴下した。滴下終了２０分後に、室温で１．５時間撹拌した。反応液に５％クエン酸水溶液（１２０ｍＬ）を加え、エーテルで抽出した。有機層を水、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後減圧濃縮した。得られる残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、４−［（２ＲＳ）−２−（ｔ−ブトキシカルボニル）−２−（２，３，４，５，６−ペンタフルオロフェニル）アセチル］桂皮酸 エチルエステル（４．８３ｇ，４４％）を結晶として得た。
工程４
工程３で得た４−［（２ＲＳ）−２−（ｔ−ブトキシカルボニル）−２−（２，３，４，５，６−ペンタフルオロフェニル）アセチル］桂皮酸 エチルエステル（５．６ｇ，１１．６ｍｍｏｌ）のジオキサン（２４ｍｌ）溶液を耐圧管に入れ、濃塩酸（２４ｍｌ）を加えた。１３０℃に加熱しながら４時間撹拌した。反応液を氷冷して析出物を濾取し、４−［（２，３，４，５，６−ペンタフルオロフェニル）アセチル］桂皮酸（３．７ｇ，９０％）を結晶として得た。この４−［（２，３，４，５，６−ペンタフルオロフェニル）アセチル］桂皮酸（２．０３ｇ，５．７ｍｍｏｌ）のジオキサン（１１５ｍＬ）溶液を耐圧管に入れ、パラホルムアルデヒド（０．７ｇ）、ジメチルアミン塩酸塩（１．８６ｇ，２２．８ｍｍｏｌ）、酢酸（１０滴）および無水硫酸マグネシウム（８ｇ）を加えて１３０℃に加熱しながら一晩撹拌した。氷冷下、反応液に０．１Ｎ塩酸を加えて酸性とし酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄、無水硫酸マグネシウムで乾燥後減圧濃縮した。析出物を濾取し、標記化合物１．４６ｇ（９３％）を結晶として得た。
ｍｐ ２１４．０−２１７．０℃． １Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ６．２５（ｓ，１Ｈ），６．３０（ｓ，１Ｈ），６．４６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６．２），７．５７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４），７．６４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．９），７．７８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４）
試験例３ ウサギ三叉神経節および角膜組織におけるＲＯＣＫ Ｉ，ＲＯＣＫ ＩＩのタンパク質発現
１）使用動物
日本白色種雄性ウサギを北山ラベス社より購入して実験に使用した。
２）組織可溶性タンパク質の調製
動物を安楽死させた後、三叉神経節および角膜を摘出した。摘出した組織は氷冷したリン酸緩衝生理食塩水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中に移して洗浄し、氷冷した０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）および１ｔａｂｌｅｔ／１０ｍｌのＰｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（ｃｏｍｐｌｅｔｅ，Ｍｉｎｉ；Ｒｏｃｈｅ社製）を含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）中に移して超音波破砕をおこなった。超音波破砕処理により得られた各組織由来の細胞粗破砕液を遠心分離（１０，０００×ｇ，１５分，４℃）し、上清を回収して組織可溶性タンパク質溶液を得た。溶液中のタンパク質量はＢＣＡプロテインアッセイリージェント（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いて定量した。
３）ウェスタンブロッティング法を用いたＲＯＣＫ Ｉ，ＲＯＣＫ ＩＩの検出
調製した組織可溶性タンパク質に含まれるＲＯＣＫ Ｉ，ＲＯＣＫ ＩＩをウェスタンブロッティング法を用いて検出した。２５μｇのタンパク質を含む調製溶液を８％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル（ＴＥＦＣＯ社製）を用いて電気泳動法により分離し、ゲル内に分離されたタンパク質をＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に電気的に転写した。タンパク質の転写された膜を５％のスキムミルクでブロッキングした後、ヤギ抗ＲＯＣＫ Ｉ抗体あるいはヤギ抗ＲＯＣＫ ＩＩ抗体（ともにＳＡＮＴＡ ＣＲＵＺ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社製）と反応させ、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）結合抗ヤギＩｇＧ抗体（バイオラッド社製）を用いて二次標識した。抗原の免疫検出はＡＰ発色キット（バイオラッド社製）を用いておこなった。
４）試験結果
図５にウェスタンブロッティングの結果を示した。ＲＯＣＫ ＩおよびＲＯＣＫ ＩＩともにウサギ三叉神経節および角膜組織の可溶性タンパク質中にタンパク質レベルで発現していることが確認できた。
実施例１ 錠剤
Ｃ３酵素 １０ ｍｇ
乳糖 ８０ ｍｇ
デンプン １７ ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ３ ｍｇ
結晶セルロース １０ ｍｇ
以上の成分を１錠分の材料として、常法により錠剤を成形する。錠剤は必要に応じて通常用いられる腸溶性コーティング剤（例えばフタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）、糖衣およびフィルム（例えばエチルセルロース）を適用してもよい。主薬成分であるＣ３酵素を、化合物１、２、３又は４に変えてもよい。また添加剤との配合比を変えることにより、主薬の成分量が２０ｍｇ、５ｍｇ、１ｍｇ、０．５ｍｇ、０．１ｍｇ／錠の錠剤を調製しうる。
実施例２ カプセル剤
Ｃ３酵素 ５０ ｍｇ
マンニトール ７５ ｍｇ
デンプン １７ ｍｇ
ステアリン酸カルシウム ３ ｍｇ
以上の成分を１カプセル分の材料として均一に混合し、常法により顆粒状とし、硬カプセルに充填する。充填前に必要に応じて、通常用いられる腸溶性コーティング剤（例えばフタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、糖衣またはフィルム（例えばエチルセルロース）を顆粒に適用してもよい。主薬成分であるＣ３酵素を、化合物１、２、３又は４に変えてもよい。また添加剤との配合比を変えることにより、主薬の成分量が２０ｍｇ、１０ｍｇ、５ｍｇ、１ｍｇ、０．５ｍｇ、０．１ｍｇ／カプセルのカプセル剤を調製しうる。
実施例３ 注射剤
Ｃ３酵素 ７５０ ｍｇ
カルボキシメチルセルロースナトリウム ５００ ｍｇ
注射用水 全量 １００ ｍＬ
以上の成分を常法により無菌的に混和して注射剤を調製する。主薬成分であるＣ３酵素を、化合物１、２、３又は４に変えてもよい。また添加剤の配合比を変えることにより、主薬の成分量が１０００ｍｇ、５００ｍｇ、２００ｍｇ、１００ｍｇ／１００ｍＬである注射剤を調製することができる。
実施例４ 点眼剤
Ｃ３酵素 ５ ｍｇ
ホウ酸 ７００ ｍｇ
ホウ砂 適量（ｐＨ７．０）
塩化ナトリウム ５００ ｍｇ
ヒドロキシメチルセルロース ０．５ ｇ
エデト酸ナトリウム ０．０５ ｍｇ
塩化ベンザルコニウム ０．００５ｍｇ
滅菌精製水 全量 １００ ｍＬ
滅菌精製水８０ｍＬを約８０℃まで加温し、ヒドロキシメチルセルロースを加えて攪拌し、液温を室温まで戻す。この液にＣ３酵素、塩化ナトリウム、ホウ酸、エデト酸ナトリウムおよび塩化ベンザルコニウムを加えて溶解する。ホウ砂を適量加えてｐＨを７に調整する。滅菌精製水を加えて１００ｍＬまでメスアップする。主薬成分であるＣ３酵素を、化合物１、２、３又は４に変えてもよい。また添加剤の配合比を変えることにより、主薬の濃度が１ｗ／ｖ％、０．５ｗ／ｖ％、０．３ｗ／ｖ％、０．１ｗ／ｖ％、０．０５ｗ／ｖ％、０．０３ｗ／ｖ％、０．０１ｗ／ｖ％、０．００３ｗ／ｖ％、０．００１ｗ／ｖ％である点眼剤を調製することができる。
実施例５ 点眼剤
Ｃ３酵素 １０ ｍｇ
Ｄ−マンニトール ４．５ ｇ
リン酸二水素ナトリウム ０．１ ｇ
水酸化ナトリウム 適量（ｐＨ ７．０）
滅菌精製水 全量 １００ ｍＬ
滅菌精製水８０ｍＬにＣ３酵素、Ｄ−マンニトール、リン酸二水素ナトリウムを加えて溶解する。水酸化ナトリウムを適量加えてｐＨを５．０に調整する。滅菌精製水を加えて１００ｍＬまでメスアップする。調製した点眼剤をメンブランフィルターで滅菌ろ過後、ディスポーザブル（ユニットドーズ）容器に充填、密封する。主薬成分であるＣ３酵素を、化合物１、２、３又は４に変えてもよい。また添加剤の配合比を変えてもよい。また添加剤の配合比を変えることにより、主薬の濃度が１ｗ／ｖ％、０．５ｗ／ｖ％、０．３ｗ／ｖ％、０．１ｗ／ｖ％、０．０５ｗ／ｖ％、０．０３ｗ／ｖ％、０．００５ｗ／ｖ％、０．００３ｗ／ｖ％、０．００１ｗ／ｖ％である点眼剤を調製することができる。
【産業上の利用可能性】
本発明のＲｈｏタンパク阻害剤を含有する医薬は三叉神経細胞の神経突起形成促進作用を有することから、角膜神経の損傷などに伴う角膜知覚機能低下の改善および角膜知覚機能低下に伴うドライアイ症状の改善に有用である。具体的には、Ｒｈｏタンパク阻害剤を適用することにより、白内障手術後やＬＡＳＩＫ手術後の角膜知覚の低下、神経麻痺性角膜症、角膜潰瘍、糖尿病性角膜症などの角膜神経変性に伴う角膜知覚低下やドライアイ症状の改善効果が期待できる。
以上、本発明の具体的な態様のいくつかを詳細に説明したが、当業者であれば示された特定の態様には、本発明の教示と利点から実質的に逸脱しない範囲で様々な修正と変更をなすことは可能である。従って、そのような修正および変更も、すべて後記の特許請求の範囲で請求される本発明の精神と範囲内に含まれるものである。
本出願は、日本で出願された特願２００３−１１４８１９および特願２００３−２７３１７７を基礎としており、それらの内容は本出願にすベて包含されるものである。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｒｈｏタンパク阻害剤を含有する角膜神経突起形成促進剤。
【請求項２】
Ｒｈｏタンパク阻害剤を含有する角膜神経軸索伸展促進剤。
【請求項３】
Ｒｈｏタンパク阻害剤を含有する角膜知覚回復剤。
【請求項４】
Ｒｈｏタンパク阻害剤を含有するドライアイ治療剤。
【請求項５】
Ｒｈｏタンパク阻害剤を含有する角膜神経突起形成促進用組成物。
【請求項６】
Ｒｈｏタンパク阻害剤を含有する角膜神経軸索伸展促進用組成物。
【請求項７】
Ｒｈｏタンパク阻害剤を含有する角膜知覚回復用組成物。
【請求項８】
Ｒｈｏタンパク阻害剤を含有するドライアイ治療用組成物。
【請求項９】
角膜神経突起形成促進用組成物を製造するためのＲｈｏタンパク阻害剤の使用。
【請求項１０】
角膜神経軸索伸展促進用組成物を製造するためのＲｈｏタンパク阻害剤の使用。
【請求項１１】
角膜知覚回復用組成物を製造するためのＲｈｏタンパク阻害剤の使用。
【請求項１２】
ドライアイ治療用組成物を製造するためのＲｈｏタンパク阻害剤の使用。
【請求項１３】
角膜神経の神経突起形成促進が必要とされる対象にＲｈｏタンパク阻害剤の有効量を投与することによる角膜神経の神経突起形成を促進する方法。
【請求項１４】
角膜神経の軸索伸展促進が必要とされる対象にＲｈｏタンパク阻害剤の有効量を投与することによる角膜神経の軸索伸展を促進する方法。
【請求項１５】
角膜知覚の回復が必要とされる対象にＲｈｏタンパク阻害剤の有効量を投与することによる角膜知覚を回復する方法。
【請求項１６】
ドライアイに罹患した対象にＲｈｏタンパク阻害剤の有効量を投与することによるドライアイを治療する方法。
【請求項１】
Ｒｈｏタンパク阻害剤を含有する角膜神経突起形成促進剤。
【請求項２】
Ｒｈｏタンパク阻害剤を含有する角膜神経軸索伸展促進剤。
【請求項３】
Ｒｈｏタンパク阻害剤を含有する角膜知覚回復剤。
【請求項４】
Ｒｈｏタンパク阻害剤を含有するドライアイ治療剤。
【請求項５】
Ｒｈｏタンパク阻害剤を含有する角膜神経突起形成促進用組成物。
【請求項６】
Ｒｈｏタンパク阻害剤を含有する角膜神経軸索伸展促進用組成物。
【請求項７】
Ｒｈｏタンパク阻害剤を含有する角膜知覚回復用組成物。
【請求項８】
Ｒｈｏタンパク阻害剤を含有するドライアイ治療用組成物。
【請求項９】
角膜神経突起形成促進用組成物を製造するためのＲｈｏタンパク阻害剤の使用。
【請求項１０】
角膜神経軸索伸展促進用組成物を製造するためのＲｈｏタンパク阻害剤の使用。
【請求項１１】
角膜知覚回復用組成物を製造するためのＲｈｏタンパク阻害剤の使用。
【請求項１２】
ドライアイ治療用組成物を製造するためのＲｈｏタンパク阻害剤の使用。
【請求項１３】
角膜神経の神経突起形成促進が必要とされる対象にＲｈｏタンパク阻害剤の有効量を投与することによる角膜神経の神経突起形成を促進する方法。
【請求項１４】
角膜神経の軸索伸展促進が必要とされる対象にＲｈｏタンパク阻害剤の有効量を投与することによる角膜神経の軸索伸展を促進する方法。
【請求項１５】
角膜知覚の回復が必要とされる対象にＲｈｏタンパク阻害剤の有効量を投与することによる角膜知覚を回復する方法。
【請求項１６】
ドライアイに罹患した対象にＲｈｏタンパク阻害剤の有効量を投与することによるドライアイを治療する方法。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９１６６２
【国際公開日】平成１６年１０月２８日（２００４．１０．２８）
【発行日】平成１８年７月６日（２００６．７．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０５４６７（Ｐ２００５−５０５４６７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００５４５６
【国際出願日】平成１６年４月１６日（２００４．４．１６）
【出願人】（０００１９９１７５）千寿製薬株式会社 (46)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年１０月２８日（２００４．１０．２８）
【発行日】平成１８年７月６日（２００６．７．６）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００５４５６
【国際出願日】平成１６年４月１６日（２００４．４．１６）
【出願人】（０００１９９１７５）千寿製薬株式会社 (46)
【Ｆターム（参考）】
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