試料中の動的細胞追跡法
本発明は、試料中の細胞を動的に追跡する方法であって、試料の連続する２つの時間経過画像中の細胞間の対応尺度を生成する段階と、前記対応尺度を評価して、これらの２つの画像中の個々の細胞を関連付ける事象を生成する段階であり、それらの事象が、グループ：不変、細胞除去、細胞移動、細胞衝突及び細胞分裂の中から選択される段階と、これらの２つの画像中の個々の細胞を関連付ける事象の追跡出力を提供する段階とを含む方法を提供する。本発明では、関連付ける事象を確定する前記段階が、生成された細胞衝突事象及び細胞分裂事象の正当性を、このような事象毎に適応閾値を計算し、それらの閾値を事象パラメーターと比較することによって検証することを含む。試料中の細胞を動的に追跡するシステムも提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体物質の位置を決定するシステム及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
この１０年の間に、生物学的プロセスに関して実施されたデータ測定の量は爆発的に増大した。この爆発は主に、技術の向上、特にコンピューター技術の向上によるものと考えることができる。しかし、データ量は増えたが、それらのデータの分析はデータ量増大のペースに追いついていない。したがって、データの自動分析がますます求められている。
【０００３】
生物学的データの最も基本的な観察の１つは、細胞の挙動を経時的に測定することである。細胞の数及び構造は時間経過とともに変化する。具体的には、増殖、構造、細胞分裂、細胞死などの細胞事象に関する測定量の一連の推移が、加えられた刺激と細胞の挙動との間の因果関係を暗示し、演繹することが報告されている。具体的な例を挙げると、ハイスループットアッセイでは、臨床治療での薬物の効能を判定する際に、ウェルへのその薬物の添加、細胞の構造及び数の変化の大きさ、並びに構造及び数の変化速度が重要である。さらに、細胞寿命のどの点で点滴注入が効果を現わすのかも興味深い。例えば、細胞癌に対する治療が細胞分裂を抑制することがある。細胞を追跡する必要がある大部分の研究は、訓練された生物学者の専門的技術を必要とする。ハイスループットスクリーニングのための追跡の費用は極端に高い。後に、ハイスループットアッセイに適した細胞追跡法を示す。
【０００４】
細胞を追跡するためには一般に、コンピューターを使用して、複数の細胞のうちの単一の細胞を染料で標識し、その細胞が１つのフレームから別のフレームへ移動したときにその細胞を追跡する必要があるであろう。たとえその１つの細胞が標識されていたとしても、１つのフレームから別のフレームに移るときに存在する複数の細胞の中からその細胞を識別できるとは限らないため、標識された細胞の移動を追跡するこのプロセスはエラーを生じやすく、時間もかかる。さらに、細胞を標識するために利用する染料が、細胞の正常な機能を妨げる可能性もあり、そのため、細胞が１つのフレームから別のフレームへ移動するときに細胞がどのように機能するかを示す真の画像は得られないであろう。
【０００５】
細胞を追跡するためにコンピューターが利用するアルゴリズムは、カルマンフィルター、粒子フィルターなどいくつかある。カルマンフィルターは、動的な系の状態を、不完全で雑音の多い一連の測定から推定する効率的な再帰型フィルターである。カルマンフィルターは、細胞などの物体の１つの点から別の点への移動を追跡するために、２次統計量に基づく追跡法を使用する。カルマンフィルターは、動的測定モデルがガウス雑音と線形関係にあると仮定する追跡法を使用する。しかし、細胞画像列では、多くの干渉因子、例えば背景クラッタが存在し、細胞境界の鮮明な画像を生成することが難しく、このことがしばしば、カルマンフィルター追跡が失敗に終わるなる原因となる。
【０００６】
逐次モンテカルロ法の一形態である粒子フィルタリングは、ランダムサンプリングに基づく精巧なモデル推定技法を使用する。粒子フィルターは、ガウス分布の仮定を必要とせず、動的測定モデルは非線形モデルでもよい。粒子フィルターには、カルマンフィルターの欠点が１つもない。しかし、速度が遅いという欠点がある。しかし、そうは言われているものの、粒子フィルターは遅くはない。
【０００７】
粒子フィルターとカルマンフィルターの基本的な違いは、それらのフィルターが状態を表す方法にある。カルマンフィルターは、パラメーター毎に１つの値を記憶し、それぞれのパラメーター間の対応する分散及び相関を、共分散行列の形で記憶する。粒子フィルターは、それぞれの粒子が、状態ベクトルとその対応する重みとを含む対に対応する「粒子」の集合を維持する。追跡対象の物体の全体的挙動は、粒子の集合の統計量から導き出すことができる。数十、数百又は数千の粒子を使用して単一の物体を追跡することができる。
【０００８】
複数の時間経過画像をまたぐ細胞の追跡では、連続する２つの画像が一度に関与する。これらの２つの画像間では、一方の画像（前のフレーム）がもう一方の画像（現在のフレーム）よりも早く取得される。粒子フィルターの基本的着想は、逐次重点サンプリングの概念を使用した関連した確率分布の近似、及び関連した重みを有する一組の離散的ランダムサンプルを使用した確率分布の近似である。粒子フィルターアルゴリズムの目的は、現在のフレームと前のフレームとを関連付ける事象を識別することであり、複数の時点画像中の細胞の非線形移動に対して効率的であることが証明されている。粒子フィルターアルゴリズムでは、画像のそれぞれの細胞を、状態ベクトル／特徴ベクトルと呼ばれる一組の尺度によって表現する必要がある。このシナリオでは、特徴ベクトルが、Ｘ座標、Ｙ座標及びフォームファクターを尺度として含み、これら尺度は、経時的に細胞を追跡するための１次入力である。
【０００９】
粒子フィルターの使用の一例がＷＯ２００８／１００７０４に開示されている。この文献の開示は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【００１０】
特徴ベクトルは、分割された画像から生成される。したがって、分割をより適切に実施することがこの追跡アルゴリズムの要諦である。粒子フィルターは、それぞれの細胞の周囲に粒子の雲（cloud）を生成する。この雲は、フレーム内のある１つの細胞につきまとい、次のフレームでその細胞を追跡するために使用される。粒子フィルターにおける追跡は、連続する２つのフレーム間の細胞の対応尺度によって達成される。対応は、（前のフレームの細胞につきまとう）それぞれの雲と（現在のフレーム内のある１つの細胞を表す）それぞれの特徴ベクトルとの間のエントロピーを計算することによって得られる。対応尺度は、２つのマトリックスの形態で提示され、１つのマトリックスは、前のフレームから現在のフレームへの対応を表し（以下、Ｃｌｏｕｄ＿ｔｏ＿Ｍｅａｓｕｒｅという。）、別のマトリックスは、現在のフレームから前のフレームへの対応を表す（以下、Ｍｅａｓｕｒｅ＿ｔｏ＿Ｃｌｏｕｄという。）。ある粒子フィルター用途では、この対応尺度を評価して、連続する２つの画像中の個々の細胞を関連付ける事象を生成し、この事象は、親子関係によって、グループ：不変、細胞除去、細胞移動、細胞衝突及び細胞分裂の中から選択される。しかし、時に、細胞の対応が誤った事象の生成につながり、細胞の対応を検証することが必要となる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ，”Ｏｎｌｉｎｅ Ｔｒａｃｋｉｎｇ ｏｆ Ｍｉｇｒａｔｉｎｇ ａｎｄ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ Ｉｍａｇｅｄ ｗｉｔｈ Ｐｈａｓｅ−Ｃｏｎｔｒａｓｔ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ”，Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｖｉｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐａｔｔｅｒｎ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，２００６０６１７，ＩＳＢＮ ９７８−０−７６９５−２６４６−１；Ａｂｓｔｒａｃｔ，Ｓｅｃｔｉｏｎ １．１，２
【発明の概要】
【００１２】
本発明の目的は、試料中の細胞を動的に追跡する新しい方法及びシステムであって、先行技術の１つ以上の欠点を克服した方法及びシステムを提供することにある。この目的は、独立請求項に記載された方法及びシステムによって達成される。
【００１３】
本発明に基づく方法及びシステムの１つの利点は、粒子フィルターによって生成された事象の正当性を検証する自動意思決定システムであって、既存の細胞追跡アルゴリズムに比べて、細胞追跡の正確さを最高３０％向上させることができる自動意思決定システムを提供することである。
【００１４】
一態様によれば、試料中の細胞を動的に追跡する方法であって、
・試料の連続する２つの時間経過画像中の細胞間の対応尺度を生成する段階と、
・前記対応尺度を評価して、それらの２つの画像中の個々の細胞を関連付ける事象を生成する段階であり、その事象が、グループ：不変、細胞除去、細胞移動、細胞衝突及び細胞分裂の中から選択される段階と、
・それらの２つの画像中の個々の細胞を関連付ける事象の追跡出力を提供する段階と
を含み、
・関連付ける事象を確定する前記段階が、生成された細胞衝突事象及び細胞分裂事象の正当性を、このような事象毎に適応閾値を計算し、その閾値を事象パラメーターと比較することによって検証することを含む方法が提供される。
【００１５】
他の態様によれば、適応閾値が、生成された事象に関与した細胞のうちの１つ以上の細胞のサイズから計算される。さらに、適応閾値を、生成された事象に関与した最も小さな細胞の半径に比例させることができる。より具体的には、適応閾値を、前記最も小さな細胞の半径に、試料中の細胞の運動に応じた変数を乗じることによって計算することができ、一実施形態では、この変数が、５乃至２０、好ましくは７．５乃至１５の範囲のユーザ定義パラメーターである。
【００１６】
一態様によれば、生成された細胞衝突事象については、前記事象パラメーターが、前の画像中の関連付けられた細胞間の空間関係であり、生成された細胞分裂事象については、前記事象パラメーターが、後の画像中の関連付けられた細胞間の空間関係である。より具体的には、生成された細胞衝突事象については、前記事象パラメーターを、前の画像中の関連付けられた細胞間の距離とすることができ、生成された細胞分裂事象については、前記事象パラメーターを、後の画像中の関連付けられた細胞間の距離とすることができる。
【００１７】
一態様によれば、対応尺度を生成する前記段階が粒子フィルターアルゴリズムを含む。
【００１８】
一態様によれば、この方法はさらに、
・被追跡細胞毎に、生成された追跡出力から親及び子カウントを計算する段落であり、
・親カウント＞１のときに、親細胞を子細胞に関連付ける衝突事象が生成され、
・子カウント＞１のときに、子細胞を親細胞に関連付ける分裂事象が生成される
段階と、
・生成された細胞衝突事象及び細胞分裂事象の正当性を、このような事象毎に適応閾値を計算し、その閾値を事象パラメーターと比較することによって検証する段階と
・追跡出力を更新する段階と
を含む。
【００１９】
さらに別の態様によれば、試料中の細胞を動的に追跡するシステムであって、試料の連続する時間経過画像を提供するように配置された撮像システムと、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の方法に従って試料中の細胞を追跡するように配置された画像受信装置とを備えるシステムが提供される。
【００２０】
本発明の実施形態は従属請求項に記載されている。
【００２１】
本発明のこれらの利点及びその他の利点は、添付図面を参照して以下の説明を読むことによってより明白となる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明に基づく一般的な撮像システムのブロック図である。
【図２】本発明に基づく図１の画像受信装置の概略図である。
【図３】本発明に基づく粒子フィルターアルゴリズムグラフィカルユーザインタフェースのコンピュータースクリーンショットを示す図である。
【図４】本発明に基づく粒子フィルターアルゴリズムの流れ図である。
【図５】細胞の対応を処理する本発明に基づく新規の方法の他の流れ図である。
【図６】本発明に基づく新規の閾値論理を適用した後の、前の画像及び現在の画像の図である。
【図７】本発明に基づく粒子フィルターによって検出された細胞分裂を示す、前の画像及び現在の画像の図である。
【図８】本発明に基づく粒子フィルターによって検出された細胞衝突を示す、前の画像及び現在の画像の図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
現時点における本発明の好ましい実施形態を図面を参照して説明する。それらの図面では、同様の構成要素が同じ符号によって識別される。好ましい実施形態の以下の説明は例示が目的であり、それらの実施形態が本発明の範囲を限定することは意図されていない。
【００２４】
図１は、一般的なディジタル顕微鏡システムの主要な構成要素のブロック図を示す。この自動ディジタル顕微鏡システム１００は以下の構成要素を含む：光源１０１、コリメータ１０２、任意選択の非球面光学部品１０４、ビームフォールディング光学部品１０５、対物レンズ１０７、試料１０９、試料ホルダー１１１、ステージ１１３、チューブレンズ１１５、光学検出器１１７、任意選択の通信リンク１１９及び任意選択のコンピューター１２１。
【００２５】
光源１０１は、ランプ、レーザー、複数のレーザー、発光ダイオード（ＬＥＤ）、複数のＬＥＤ、又は光ビーム１０１ａを発生させる当業者に知られている任意のタイプの光源とすることができる。光ビーム１０１ａは、光源１０１、コリメータ１０２、任意選択の非球面光学部品１０４、ビームフォールディング光学部品１０５及び対物レンズ１０７によって送達されて試料１０９を照らす。試料１０９は、生きた生体物質／生物、生物細胞、非生物試料などである。非球面光学部品１０４は一般的なパウエルレンズである。ビームフォールディング光学部品１０５は、一般的なスキャニングミラー又はダイクロイックミラーである。試料１０９から放射された光は対物レンズ１０７によって集められ、次いで、一般的なチューブレンズ１１５によって光学検出器１１７上に試料１０９の像が形成される。光学検出器１１７は、電荷結合素子（ＣＣＤ）、相補型金属酸化物半導体（ＣＭＯＳ）像検出器、又は当業者によって利用されている任意の２−Ｄアレイ光学検出器とすることができる。光学検出器１１７は適宜、通信リンク１１９によって、電気的に又は無線でコンピューター１２１に接続される。他の実施形態では、光学検出器１１７の代わりに、対物レンズ１０７と協力して中間像をさらに拡大し、標本の詳細を観察できるようにする一般的な顕微鏡接眼レンズ又は接眼鏡が使用される。さらに、光学検出器１１７の代わりに、２つ、３つ又は４つ以上の光学検出器１１７を利用することもできる。試料１０９は試料ホルダー１１１上に取り付けられ、試料ホルダー１１１は、一般的なマイクロタイタープレート、顕微鏡スライド、チップ、ガラスプレート、ペトリ皿又は任意のタイプの試料ホルダーと呼ばれることがある。
【００２６】
他の実施形態では、顕微鏡システム１００が適宜、通信リンク１１９によって従来のコンピューター１２１に電気的に又は無線で接続される。通信リンク１１９は、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、無線ローカルネットワーク、ワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）、ユニバーサルシリアルバス（ＵＳＢ）、Ｅｔｈｅｒｎｅｔ（登録商標）リンク、光ファイバなど、自動顕微鏡システム１００とコンピューター１２１の間のデータ転送を容易にすることができる任意のネットワークとすることができる。
【００２７】
顕微鏡システム１００は、光学検出器１１７又は一般的な顕微鏡接眼レンズを利用することによって物体ステージ１１３上に置かれた試料１０９又は任意のタイプの物体の画像を捕捉する能力を有する画像送信装置、撮像装置又は撮像システムと呼ばれることがある。さらに、顕微鏡システム１００を例えば、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（米ニュージャージー州ピスカタウェイ）製のＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０００又はＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ ３０００とすることもできる。顕微鏡システム１００は、一般的な共焦点顕微鏡、蛍光顕微鏡、落射蛍光顕微鏡、位相差顕微鏡、微分干渉コントラスト顕微鏡、又は当業者に知られている任意のタイプの顕微鏡とすることができる。他の実施形態では、顕微鏡システム１００が、生物などの画像を検出し、分析し、提供することができる一般的なハイスループット、ハイコンテント細胞内（subcellular）撮像分析装置である。さらに、顕微鏡システム１００を、自動細胞撮像システム又は自動細胞内（subcellular）撮像システムとすることもできる。
【００２８】
試料からの反射光又は蛍光を受け取る光学検出器１１７は、光電子増倍管、電荷結合素子（ＣＣＤ）、相補型金属酸化物半導体（ＣＭＯＳ）像検出器、又は当業者によって利用されている任意の光学検出器とすることができる。光学検出器１１７は、通信リンク１１９によってコンピューター１０３に電気的に又は無線で接続される。他の実施形態では、光学検出器１１７の代わりに、対物レンズ１０７と協力して中間像をさらに拡大し、標本の詳細を観察できるようにする一般的な顕微鏡接眼レンズ又は接眼鏡が使用される。
【００２９】
コンピューター１２１は、画像受信装置１２１又は画像検出装置１２１と呼ばれることがある。本発明の他の実施形態では、画像受信装置１２１が画像送信装置１００内に位置する。画像受信装置１２１は、試料１１５の画像を光学検出器１０７から受信する能力を有する一般的なコンピューターの働きをし、次いで、画像受信装置１０３は、標準画像処理ソフトウェアプログラム、アルゴリズム又は式を利用することによって、その画像を表示し、保存し、又は処理することができる。さらに、コンピューター１０３を、パーソナルディジタルアシスタント（ＰＤＡ）、ラップトップコンピューター、ノートブックコンピューター、携帯電話、ハードドライブベースの装置、又は通信リンク１１９を介して情報を受信し、送信し、記憶することができる任意の装置とすることもできる。本発明では１台のコンピューターが利用されるが、コンピューター１２１の代わりに複数のコンピューターを利用することもできる。
【００３０】
図２は、図１の細胞追跡システムの画像受信装置の概略図を示す。画像受信装置若しくは撮像受信装置１２１又は画像受信装置２０３は、従来のコンピューターに関連した一般的な構成要素を含む。画像受信装置２０３を、画像送信システム１００上に収容することもできる。画像受信装置２０３は、プロセッサー２０３ａ、入力／出力（Ｉ／Ｏ）コントローラ２０３ｂ、大容量記憶装置２０３ｃ、メモリー２０３ｄ、ビデオアダプター２０３ｅ、接続インタフェース２０３ｆ、及び上記のシステム構成要素をプロセッサー２０３ａに電気的に又は無線で動作可能に結合するシステムバス２０３ｇを含む。システムバス２０３ｇはさらに、一般的なコンピューターシステム構成要素をプロセッサー２０３ａに電気的に又は無線で動作可能に結合する。プロセッサー２０３ａは、処理ユニット、中央処理ユニット（ＣＰＵ）、複数の処理ユニット又は並列処理ユニットと呼ばれることがある。システムバス２０３ｇは、従来のコンピューターに関連した一般的なバスとすることができる。メモリー２０３ｄは、リードオンリーメモリー（ＲＯＭ）及びランダムアクセスメモリー（ＲＡＭ）を含む。ＲＯＭは、起動時のコンピューターの構成要素間の情報転送を支援する基本ルーチンを含む一般的な入力／出力システムを含む。
【００３１】
入力／出力コントローラ２０３ｂはバス２０３ｇによってプロセッサー２０３ａに接続され、そこで入力／出力コントローラ２０３ｂは、粒子フィルターグラフィカルユーザインタフェース（ＧＵＩ）及びキーボード、ポインティングデバイスなどの入力装置２０４を介して、ユーザが、コマンド及び情報をコンピューターに入力することを可能にするインタフェースの働きをする。利用される一般的なポインティングデバイスは、ジョイスティック、マウス、ゲームパッドなどである。システムバス２０３ｇには、ビデオアダプター２０３ｅによって、表示装置２０６が電気的に又は無線で接続される。表示装置２０６は、一般的なコンピューターモニター、プラズマテレビジョン、液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）、又はコンピューター２０３によって生成された文字及び／若しくは静止画像を表示する能力を有する任意の装置とすることができる。コンピューター２０３のビデオアダプター２０３ｅのとなりには接続インタフェース２０３ｆがある。接続インタフェース２０３ｆは、前述のとおり通信リンク１１９によって光学検出器１１７に接続されたネットワークインタフェースと呼ばれることがある。さらに、画像受信装置２０３は、画像受信装置２０３を別のコンピューターに結合することを可能にするネットワークアダプター又はモデムを含むことができる。
【００３２】
メモリー２０３ｄの上には大容量記憶装置２０３ｃがあり、大容量記憶装置２０３ｃには、１．ハードディスクから読み取り、ハードディスクへ書き込むためのハードディスクドライブ構成要素（図示せず）及びハードディスクドライブインタフェース（図示せず）、２．磁気ディスクドライブ（図示せず）及びハードディスクドライブインタフェース（図示せず）、並びに３．ＣＤ−ＲＯＭ、他の光学式媒体などの取外し可能な光ディスクから読み取り、光ディスクに書き込むための光ディスクドライブ（図示せず）及び光ディスクドライブインタフェース（図示せず）が含まれる。上記のドライブ及びそれらの関連コンピューター可読媒体は、コンピューター可読命令、データ構造、プログラムモジュール及び他のデータの不揮発性記憶をコンピューター１０３に提供する。さらに、上記のドライブは、図４及び５の流れ図で説明する、生体物質の位置を決定し、又は細胞の移動を追跡するための本発明のアルゴリズム、ソフトウェア又は式を有する技術的な効果を含む。
【００３３】
このソフトウェアは、生体物質ロケータグラフィカルユーザインタフェース（ＧＵＩ）を有する。生体物質ロケータＧＵＩは、コンピューターユーザがコンピューター２０３と容易に対話することを可能にするように設計されたソフトウェアプログラムである一般的なＧＵＩと同じ機能のうちの一部の機能を有する特別にプログラムされたＧＵＩである。生体物質ロケータＧＵＩは、１．追跡ターゲット、２．粒子の数、及び３．閾値ファクターを表示する図３に示されているようなスクリーンショットを含む。
粒子フィルター
前述のとおり、ＷＯ２００８／１００７０４は、本発明に基づく事象の検証を利用することができる粒子フィルターの一実施形態を詳細に開示している。
【００３４】
粒子フィルター（すなわち細胞追跡）のための最初の処理段階は画像の分割である。分割後すぐに、画像のそれぞれの細胞に固有の識別番号（細胞ＩＤ）を割り当てる。粒子フィルターの実際の追跡アルゴリズムは、連続する２つのフレームの細胞ＩＤ間の対応を見つける。このアルゴリズムは主に、予測、観察／測定及び更新と呼ばれる３つの段階を実行する（図４）。
【００３５】
図４は、細胞追跡ソフトウェアアプリケーションで粒子フィルターアルゴリズムが使用される方法の一例の流れ図を概略的に示す。
【００３６】
ブロック４０１で、ユーザが、あるプロトコルで記憶された細胞粒子フィルターアルゴリズムを、プロセッサー２０３ａ上で開始する。それによって、ユーザは例えば、生体物質ロケータＧＵＩ又は細胞追跡ＧＵＩを操作して、図３のコンピュータースクリーンショット上の生体物質ＧＵＩのドロップダウンリストの中の粒子フィルターアルゴリズムを選択する。
【００３７】
次に、ブロック４０３で、粒子フィルターアルゴリズムを初期化する。粒子フィルターを追跡アルゴリズムとして起動する時間経過画像スタックに対する分析を選択した後、最初の段階は、最初の画像フレームのそれぞれの細胞の周囲の粒子雲を更新する／生成する段階である。粒子雲は、最初の画像フレーム内のそれぞれの細胞に対して生成された特徴ベクトルの助けを借りて更新される。
【００３８】
ブロック４０５で、生体物質又は細胞の位置を予測する。この予測段階は、それぞれの試料に、細胞につきまとう雲の小さなランダムな摂動を追加する。これは、ある細胞が次のフレームにあるか否かの予測である。
【００３９】
次に、ブロック４０７で、新たな細胞位置を追跡し、確定する。この段階では、細胞間の対応を評価する手段として、現在時刻に実際に観察された細胞の反応（特徴ベクトル）を、それぞれの粒子の予測と比較する。この段階は、中核をなす論理を使用して、前の画像フレームと現在の画像フレームとの間の複数の細胞間の対応を見つけ出す。この段階は、現在のフレームの細胞を前のフレームの細胞に関連付けることによって、関連付けられた事象を生成する。この新たな細胞位置の追跡４０７ついては、後に、図５の流れ図でより詳細に説明する。
【００４０】
ブロック４０９で、粒子雲を更新する。雲は、現在のフレームの測定（特徴ベクトル）に対して更新され、最終的に次のフレームの細胞に対して使用される。次に、ブロック４１１で、そのフレームが最後のフレームであるか否かを判定する。そのフレームが最後のフレームでない場合、処理は、細胞位置の予測に戻る。そのフレームが最後のフレームである場合、ブロック４１３で、この処理は終了する。
【００４１】
この実施形態では、それぞれの雲及び特徴ベクトルに対するエントロピー値を使用して生成された２つの対応マトリックスを介して、連続する２つの画像フレームの細胞間の対応にアクセスする。本明細書ではＣｌｏｕｄ＿ｔｏ＿Ｍｅａｓｕｒｅと呼ぶ一方の対応マトリックスは、現在のフレームの１つ又は多くの細胞ＩＤに対応する前のフレームの細胞ＩＤを捕捉する。これは子カウントを表す。本明細書ではＭｅａｓｕｒｅ＿ｔｏ＿Ｃｌｏｕｄと呼ぶもう一方の対応マトリックスは、親カウントを表す前のフレームの１つ又は多くの細胞ＩＤに対応する現在のフレームの細胞ＩＤを捕捉する。粒子フィルターアルゴリズムの目的は、現在（現在のフレーム）を過去（現在のフレームよりも早く処理された任意のフレーム；通常は単純に１つ前のフレーム）に関連付ける事象を識別することである。関連付けの結果は、事象、例えば不変（標準の追跡）、細胞除去、細胞移動、細胞衝突及び細胞分裂の形で提示される。
【００４２】
対応マトリックスのそれぞれの要素は、細胞ＩＤを含まないか、単一の細胞ＩＤを含むか、又は多くの細胞ＩＤを含むかのいずれかである。それぞれの要素は、事象が生成されたときに、標準の追跡に対応する細胞間の１対１の対合を生成し、１対多又は多対１の対合に従う。生物領域に対して識別されるこれらのさまざまな事象は、衝突、分裂、新たな細胞の移動及び細胞の除去と呼ばれる。下表１は、さまざまなケースの図表現及び粒子フィルターによって生成されるそれらの対応尺度を示す。表中の破線の円は存在する細胞を表し、点線の円は存在しない細胞を表す。対応マトリックスを解釈する手がかりを以下に示す。
【００４３】
１．Ｃｌｏｕｄ＿ｔｏ＿Ｍｅａｓｕｒｅ［Ａ］＝Ｂ又はＭｅａｓｕｒｅ＿ｔｏ＿Ｃｌｏｕｄ［Ｂ］
これは、前のフレームの細胞ＩＤ Ａが現在のフレームの細胞ＩＤ Ｂに関連付けられたときの標準の追跡（不変）を表す。
【００４４】
２．Ｃｌｏｕｄ＿ｔｏ＿Ｍｅａｓｕｒｅ［Ａ］＝ＮＵＬＬ
これは、現在のフレームの特徴が前のフレームの細胞ＩＤ Ａに関連付けられないときの細胞除去を表す。
【００４５】
３．Ｃｌｏｕｄ＿ｔｏ＿Ｍｅａｓｕｒｅ［Ａ］＝Ｂ，Ｃ
これは、前のフレームの細胞ＩＤ Ａが現在のフレームの細胞ＩＤ Ｂ及びＣに関連付けられたときの細胞分裂を表す。
【００４６】
４．Ｍｅａｓｕｒｅ＿ｔｏ＿Ｃｌｏｕｄ［Ｂ］＝ＮＵＬＬ
これは、現在のフレームの細胞ＩＤが前のフレームの細胞と一切関連を持たないときの細胞移動又は新たな細胞を表す。
【００４７】
５．Ｍｅａｓｕｒｅ＿ｔｏ＿Ｃｌｏｕｄ［Ｂ］＝Ｅ，Ｆ
これは、現在のフレームの単一の細胞ＩＤ Ｂが前のフレームの細胞ＩＤ Ｅ及びＦに関連付けられたときの細胞衝突を表す。
【００４８】
粒子フィルターによって生成される追跡出力は完全に、上で論じた対応マトリックスに基づく。
【００４９】
【表１】
この表は、以下の３つの部分に分けられる：１．前のフレームから現在のフレームへの以前の生体物質（細胞）の移動のそれぞれの発生、２．前のフレームから現在のフレームへの移動に対する対応尺度、及び３．事象のタイプ。対応尺度は、前のフレームから現在のフレームへ細胞が移動したときに、その細胞に起こったことをユーザに知らせる。事象は、前のフレームから現在のフレームへ細胞が移動したときに、細胞の衝突、分裂、移動、除去などのうちのどの種類の事象が起こったのかを記述する。この表は、前のフレームから現在のフレームへ細胞が移動するときに細胞に起こることの異なる１０の例を含む。
【００５０】
第１の例では、前のフレームに細胞ＩＤ ９があり、細胞ＩＤ ９が、現在のフレームの細胞ＩＤ １１になる。この対応尺度は、前のフレームの細胞ＩＤ ９が現在のフレームの細胞ＩＤ １１に関連付けられたとき、及び現在のフレームの細胞ＩＤ １１が前のフレームの細胞ＩＤ ９に関連付けられたときの標準の追跡（不変事象）を表す単純なＣｌｏｕｄｓ＿ｔｏ＿ｍｅａｓｕｒｅ［９］＝１１及びＭｅａｓｕｒｅ＿ｔｏ＿Ｃｌｏｕｄ［１１］＝９である。この第１の例に対応する事象は、細胞ＩＤ ９が、細胞ＩＤ １１として新たな位置へ完全に移動した標準の追跡である。第２の例では、前のフレームに細胞ＩＤ ９があり、現在のフレームを見たときに細胞ＩＤ ９が消失している。この対応尺度は、現在のフレームの特徴が前のフレームの細胞ＩＤ ９に関連付けられないときの細胞除去を表すＣｌｏｕｄ＿ｔｏ＿Ｍｅａｓｕｒｅ［９］＝Ｎｕｌｌである。この例に対応する事象は細胞除去である。
【００５１】
第３の例では、前のフレームに２つの細胞ＩＤ ９及び１０がある。現在のフレームへ移動したときに、前のフレームの細胞ＩＤ ９は変化しており、細胞除去事象を指示するＣｌｏｕｄ＿ｔｏ＿Ｍｅａｓｕｒｅ［９］＝Ｎｕｌｌがある。細胞ＩＤ １０については、対応尺度Ｃｌｏｕｄ＿ｔｏ＿Ｍｅａｓｕｒｅ［１０］＝１１が不変追跡事象を指示している。しかし、対応尺度Ｍｅａｓｕｒｅ＿ｔｏ＿Ｃｌｏｕｄ［１１］＝９，１０は、前のフレームに細胞ＩＤ ９があり、次いで細胞ＩＤ ９が移動して、現在の現在のフレームで細胞ＩＤ １０と結合して細胞ＩＤ １１を形成した細胞衝突事象があることを指示している。この図に示されているように、細胞ＩＤ ９と１０の間の距離は比較的に大きく、したがって、９と１０の間の細胞間距離が、後により詳細に論じる閾値よりも大きいため、細胞ＩＤ ９は除去されたはずである。
【００５２】
第４の例では、前のフレームには細胞ＩＤがないが、現在のフレームには新たな細胞ＩＤ １１がある。この例に対する対応尺度は、Ｍｅａｓｕｒｅ＿ｔｏ＿Ｃｌｏｕｄ［１１］＝Ｎｕｌｌである。この事象は、現在のフレームの細胞ＩＤが前のフレームの細胞と一切関連を持たないときの細胞移動又は新たな細胞と呼ばれる。第５の例では、前のフレームには細胞ＩＤ ９だけしかないが、現在のフレームには細胞ＩＤ １０及び１１がある。対応尺度Ｃｌｏｕｄ＿ｔｏ＿Ｍｅａｓｕｒｅ［９］＝１０，１１は細胞ＩＤ ９の細胞分裂を指示しているが、対応尺度Ｍｅａｓｕｒｅ＿ｔｏ＿Ｃｌｏｕｄ［１０］＝９及びＭｅａｓｕｒｅ＿ｔｏ＿Ｃｌｏｕｄ［１１］＝Ｎｕｌｌは、細胞ＩＤ ９が現在のフレーム内の細胞ＩＤ １０を表す不変事象、及び細胞ＩＤ １１に対する細胞移動事象を指示している。この図に示されているとおり、細胞ＩＤ １０と１１の間の距離は比較的に大きく、したがって、１０と１１の間の細胞間距離が、後により詳細に論じる閾値よりも大きいため、細胞ＩＤ １１は新たな（移動した）細胞と考えるべきである。
【００５３】
細胞ＩＤ ９及び細胞ＩＤ １０を含む第６の例では、細胞ＩＤ ９が、前のフレームから現在のフレームへ移動して細胞ＩＤ １１を生成している。対応尺度Ｃｌｏｕｄ＿ｔｏ＿Ｍｅａｓｕｒｅ［９］＝１１及びＣｌｏｕｄ＿ｔｏ＿Ｍｅａｓｕｒｅ［１０］＝Ｎｕｌｌは、細胞ＩＤ ９が現在のフレーム内の細胞ＩＤ １１を表す不変事象、及び細胞ＩＤ １０に対する細胞除去事象を指示しているが、対応尺度Ｍｅａｓｕｒｅ＿ｔｏ＿Ｃｌｏｕｄ［１１］＝９，１０は、細胞ＩＤ ９と１０の細胞衝突を指示している。この図に示されているように、細胞ＩＤ ９と１０の間の距離は比較的に小さく、したがって、細胞ＩＤ ９と１０の間の細胞間距離が、後により詳細に論じる閾値よりも小さいため、この事象は細胞衝突と考えるべきである。
【００５４】
第７の例では、前のフレーム内の細胞ＩＤ ９及び１０が現在のフレームへ移動し、そこでそれらの細胞ＩＤが衝突して細胞ＩＤ １１を形成する。この対応尺度は、Ｃｌｏｕｄ＿ｔｏ＿Ｍｅａｓｕｒｅ［９］＝１１及びＭｅａｓｕｒｅ＿ｔｏ＿Ｃｌｏｕｄ［１１］＝１０である。この図から、この事象が明確な細胞衝突であることが分かるが、両方の尺度が１対１の尺度であり、そのためこの事象は粒子フィルターによって衝突と認識されないため、粒子フィルターによって生成された対応尺度はいずれも衝突を認識しないことに留意すべきである。第８の例では、前のフレームの細胞ＩＤ ９が、現在のフレームの細胞ＩＤ １０と細胞ＩＤ １１に分割される。対応尺度Ｃｌｏｕｄ＿ｔｏ＿Ｍｅａｓｕｒｅ［９］＝１０，１１は細胞ＩＤ ９の細胞分裂を指示するが、対応尺度Ｍｅａｓｕｒｅ＿ｔｏ＿Ｃｌｏｕｄ［１０］＝９及びＭｅａｓｕｒｅ＿ｔｏ＿Ｃｌｏｕｄ［１１］＝Ｎｕｌｌは、細胞ＩＤ ９が現在のフレーム内の細胞ＩＤ １０を表す不変事象、及び細胞ＩＤ １１に対する細胞移動事象を指示している。この図に示されているように、細胞ＩＤ １０と１１の間の距離は比較的に小さく、１０と１１の間の細胞間距離が、後により詳細に論じる閾値よりも小さいため、この事象は、細胞ＩＤ ９の細胞分裂と考えるべきである。
【００５５】
第９の例では、前のフレームの細胞ＩＤ ９が、現在のフレームに２つの細胞ＩＤ １０及び１１を生成している。対応尺度は、Ｃｌｏｕｄ＿ｔｏ＿Ｍｅａｓｕｒｅ［９］＝１０及びＭｅａｓｕｒｅ＿ｔｏ＿Ｃｌｏｕｄ［１１］＝９である。しかし、この図から分かるとおり、この事象は明確な細胞分裂事象であるが、全ての尺度が１対１の尺度であり、そのためこの事象は粒子フィルターによって衝突と認識されないため、粒子フィルターによって生成される対応尺度はいずれも分裂を認識しないことに留意すべきである。最後の例では、前のフレームに２つの細胞ＩＤ ９及び１２がある。前のフレームの細胞ＩＤ ９は細胞ＩＤ １０及び１１を生成しており、これは、対応尺度Ｃｌｏｕｄ＿ｔｏ＿Ｍｅａｓｕｒｅ［９］＝１０，１１、Ｃｌｏｕｄ＿ｔｏ＿Ｍｅａｓｕｒｅ［１２］＝１０、Ｍｅａｓｕｒｅ＿ｔｏ＿Ｃｌｏｕｄ［１０］＝９及びＭｅａｓｕｒｅ＿ｔｏ＿Ｃｌｏｕｄ［１１］＝９を有する。これは不明確な事象を表し、したがって標準の追跡事象とみなすべきである。
【００５６】
図５は、新たな細胞位置を測定するブロック４０７の下に位置する、細胞の対応を処理する新規の方法の流れ図を示す。ブロック５０１で、新たな細胞位置を測定するこの処理段階は一般に、連続する２つの画像フレームの細胞を関連付けるための中核をなす対応尺度を、上で論じたとおりに生成する。これらの尺度の要素は、それらの尺度に関連した１つ又は複数の細胞ＩＤ事象を含みうる。ブロック５０３で、それらの対応尺度を評価して、不変事象、細胞除去事象、細胞移動事象（表１の例１、２及び４）など、追加の検証又は解釈を必要としない明確な単一のＩＤ事象を識別し、そのデータを直接に使用して、ブロック５０５によって指示された標準の追跡を介して、ブロック５１３で追跡出力を生成する。本明細書では、追跡出力を生成すること５１３が一般に、連続する２つの画像フレームの細胞ＩＤを関連付けることを意味する。しかし、ブロック５０３で、ある要素が複数の細胞ＩＤに関連すると識別された場合、これは、追跡事象として処理されなければならない。追跡事象に遭遇したときには、ブロック５０７から５１１で、その事象の正当性を、局所閾値の助けを借りて検証する。事象の自動検証及び局所閾値の計算については後に説明する。事象の正当性を検証する間に、検証された事象を表す新たな対応尺度が生成され、最終的にブロック５１３で追跡出力を生成する。
【００５７】
ブロック５１３での追跡出力の生成に続いて、ブロック５１５で、「親子関係」に基づいて追跡出力の訂正を実行することができる。訂正ブロック５１５は、それまでに識別されていない衝突事象又は分裂事象を捕捉し、複数の事象に関連付ける同じ細胞ＩＤの複製を追跡出力が含むことを防ぐのに役立つ。ブロック５１５において、親カウントは、現在のフレームの単一の細胞に関連付けられた前のフレームの細胞の数を表す。親カウントが１よりも大きな値を有するとき、その事象は衝突として確定される。同様に、子カウントは、前のフレームの単一の細胞に関連付けられた現在のフレームの細胞の数を表す。子カウントが１よりも大きい値を有するとき、その事象は分裂として確定される。したがって、親子関係に基づくこの処理は正当な追加の事象を捕捉するが、追跡出力が生成されるまではそれらの事象は捕捉されない。その後、ブロック５１７で、最終的な追跡出力を保存する。
【００５８】
一実施形態によれば、ブロック５０３で複数の細胞ＩＤに関連すると識別された追跡事象は、ブロック５０７及び５０８で、以下の手順に基づく検証を受ける。
【００５９】
１．衝突に関して前のフレームの細胞ＩＤを識別する。前のフレームの細胞Ｘ、Ｙを現在のフレームの細胞Ｚに関連付ける（すなわちＭｅａｓｕｒｅ＿ｔｏ＿Ｃｌｏｕｄ＝［Ｚ］＝Ｘ，Ｙ）。
【００６０】
２．Ｃｌｏｕｄ＿ｔｏ＿Ｍｅａｓｕｒｅマトリックスにおいて、ＩＤ Ｘ又はＹが複数のＩＤに関連付けられているか否かを判定する。Ｃｌｏｕｄ＿ｔｏ＿Ｍｅａｓｕｒｅマトリックスが、前のいずれかの細胞に関して複数の対応を示さない場合、これは真の衝突とみなされ、Ｃｌｏｕｄ＿ｔｏ＿Ｍｅａｓｕｒｅマトリックスが前のいずれかの細胞に関して複数の対応を示す場合、その事象は不明確な事象とみなされる。例えばＣｌｏｕｄ＿ｔｏ＿Ｍｅａｓｕｒｅ［Ｘ］＝Ｚ，Ａであるとき、これは不明確なケースである。
【００６１】
３．明確な事象に関しては、実行時に生成された閾値に基づいて、前の画像の細胞がグループ分けされる。前のフレームの細胞ＩＤ間の事象パラメーターが閾値よりも大きい場合、一方のグループが除去された細胞とみなされ、標準的に追跡された細胞は、マトリックスＣｌｏｕｄ＿ｔｏ＿Ｍｅａｓｕｒｅの助けを借りて識別される。
【００６２】
４．不明確なケースは、不明確な細胞以外の細胞の標準の追跡又は分割を表す。実際に分割を受ける細胞は、Ｍｅａｓｕｒｅ＿ｔｏ＿Ｃｌｏｕｄマトリックスとして捕捉された細胞の対応によって評価される。
【００６３】
５．細胞分裂に遭遇したときには、段階１から４で説明したのと同様の論理を繰り返す。これは、２つの異なるマトリックス及び現在のフレーム又は前のフレームを入れ替えるだけである。
【００６４】
ブロック５０７で、その事象が真の事象であるか否かを検証するために、それぞれの事象に対する適応閾値を計算する。一実施形態によれば、以前の画像（１つ以上）及び／又は現在の画像から取得可能な空間情報に基づいて、適応閾値を計算する。より具体的には、生成された事象に関与した細胞に関する空間情報から、この閾値を計算することができる。細胞の運動学的挙動は少なくとも部分的に細胞のサイズに関係するため、この閾値は例えば、関与した細胞のうちの１つ以上の細胞のサイズに基づいて計算することができる。それに加えて、又はその代わりに、この閾値が、２つ以上の以前の画像から測定された運動学的パラメーターに基づいてもよい。
【００６５】
適応閾値を計算するプロセスの一例は以下の段階を含む。
【００６６】
１．事象を生成する細胞のグループの領域を、このアルゴリズムに対する入力として使用する段階
２．事象を生成すると仮定される細胞の中で最も小さな領域を見つける段階
３．その事象に対する閾値（Ｔ）を、最も小さな細胞の半径のある倍数として計算する段階
この例の乗数は、ユーザ定義のパラメーター（すなわち図１の閾値ファクター）として設計される。この乗数の値は、高速で非常にランダムな細胞の移動に対してはより大きくする。しかし、複数の時間経過画像をまたいで低速で安定した細胞の移動に対しては、この乗数値を小さくすべきである。この乗数の一般的な範囲は７．５乃至１５と定義される。
【００６７】
最大事象はある値で正当とみなされ、これを超える事象は誤りである。適応閾値は、それを超えると粒子フィルターが余分な事象を捕捉しない飽和値を有する。
【００６８】
この閾値は局所閾値であり、それぞれの事象に対して新たな閾値が計算されること、及びこの閾値は標準の追跡に影響を及ぼさないこと、すなわち、この閾値に対する小さな変更はあまりに異なる出力を生成しないことに留意すべきである。
【００６９】
ブロック５０９で、この適応閾値を前記事象に対する事象パラメーターと比較することにより、正当性検証の対象である事象の正当性を検証する。適応閾値と同様に、この事象パラメーターも、例えば、以前の画像（１つ以上）及び／又は現在の画像から取得可能な、生成された事象に関与した細胞に関する空間情報に基づくことができる。生成された細胞衝突事象については、この事象パラメーターを例えば、前の画像中の関連付けられた細胞間の空間関係とすることができ、生成された細胞分裂事象については、この事象パラメーターを、後の画像中の関連付けられた細胞間の空間関係とすることができる。より具体的には、この事象パラメーターを、その事象に関与した関連付けられた細胞間の距離とすることができる。
【００７０】
前述のとおり、ブロック５１５で、追跡出力は親子関係に基づいて訂正される。表１に示した例７及び９はそれぞれ、衝突及び分裂の非常に特別なケースを表す。これは、前の現在のフレームの細胞ＩＤと現在のフレームの細胞ＩＤの間の可能な１対１関係を例示し、したがって、標準の追跡シナリオを指示する。一実施形態によれば、追跡出力から親及び子カウントを得ることにより親子関係を考慮することによって、この不明確性を訂正することができる。親カウントは、現在のフレーム内の唯一の細胞に接続する前のフレームの細胞の数を表す。また、子カウントは、前のフレーム内の唯一の細胞に接続する現在のフレームの細胞の数を表し、以下の段階を含むことができる。
【００７１】
１．既に生成された追跡出力から親及び子供カウントを計算する段階
２．親カウント＞１であるか、又は子カウント＞１であるかに応じて、前のフレームの細胞ＩＤと現在のフレーム細胞ＩＤとの間の細胞対応を生成する段階。すなわち、親カウント＞１は衝突に対応し、子カウント＞１は分裂に対応する。
【００７２】
３．自動的に生成された閾値Ｔを使用して、対応／事象を検証する段階
４．生成された新たな事象に基づいて追跡出力を更新する段階
標準的に追跡された細胞につきまとう雲の連続する更新は、その細胞を事実上新たな位置へ移動させることがありえる。したがって、雲の集合は、現在のフレームからの細胞尺度（特徴ベクトル）を使用して更新される。
粒子フィルターの性能を示す例
図６ａ及び６ｂは、事象の検証によって粒子アルゴリズムの改良の導入が実現された一例を示す。図６ａは前のフレームを示し、図６ｂは現在のフレームを示す。粒子フィルタリングによって画像６ａ及び６ｂを評価したとき、細胞ＩＤ １２に対する追跡出力は、Ｃｌｏｕｄ＿ｔｏ＿Ｍｅａｓｕｒｅ［１２］＝１３，１４であった。この追跡出力により、この事象は細胞分裂事象として捕捉される。しかし、この細胞分裂事象の正当性を検証した後、この事象は、１つの新たな細胞の移動と、前のフレーム内の２つの細胞の不変事象とを表すものと訂正された。すなわちＣｌｏｕｄ＿ｔｏ＿Ｍｅａｓｕｒｅ［１２］＝１３及びＭｅａｓｕｒｅ＿ｔｏ＿Ｃｌｏｕｄ［１４］＝ＮＵＬＬである。
【００７３】
図７ａ及び７ｂは、粒子フィルタリングによる評価が、この事象を、１対多関係を有する細胞分裂事象として、すなわちＣｌｏｕｄ＿ｔｏ＿Ｍｅａｓｕｒｅ［１２］＝１３，１４、Ｍｅａｓｕｒｅ＿ｔｏ＿Ｃｌｏｕｄ［１３］＝１２及びＭｅａｓｕｒｅ＿ｔｏ＿Ｃｌｏｕｄ［１４］＝１２として捕捉する他の例を示す。このケースでは、細胞分裂事象の正当性の検証が、その事象が真の細胞分裂であることを明らかにする。同様に、図８ａ及び８ｂは、粒子フィルタリングによる評価が、この事象を、多対１関係を有する細胞衝突事象として、すなわちＣｌｏｕｄ＿ｔｏ＿Ｍｅａｓｕｒｅ［１２］＝１４、Ｃｌｏｕｄ＿ｔｏ＿Ｍｅａｓｕｒｅ［１３］＝１４及びＭｅａｓｕｒｅ＿ｔｏ＿Ｃｌｏｕｄ［１４］＝１２，１３として捕捉する例を示し、この事象の正当性の検証は、その事象が真の細胞衝突であることを明らかにする。
【００７４】
粒子フィルターと近接（ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ）との性能比較では、粒子フィルターの追跡機能の性能の方が約３０％高いことが示されている。粒子フィルターのＵＩは、図３に示すように、粒子の数を入力するオプションを設けている。粒子フィルターの性能は粒子数に依存する。常に、粒子数が多いほど追跡の正確さは向上する。細胞が密集して存在するときには、粒子数をより大きくすべきである。ＩｎＣｅｌｌによって取得した時間経過画像スタックに対する実験中に、本発明の発明者らは以下の知見を見出した。
【００７５】
細胞の密度が低いときには、粒子数＝２５が適当である。
【００７６】
細胞の密度が中程度であるときには、粒子数＝５０が適当である。
【００７７】
細胞の密度が高いときには、粒子数＝１００から１５０が適当である。
【００７８】
改良されたこの粒子フィルターアルゴリズムの正確さを、既存の追跡アルゴリズム（すなわち近接）に対して評価する。この評価は、２つの別個の画像スタック、すなわちｃｅｌｌ ｔｒａｃｋ−３及び１７１００６−ｃｅｌｌ ｔｒａｃｋｉｎｇ−２２ｈｒｓ−２．ｘｄｃｅに対して実施する。画像スタック毎に、両方の追跡アルゴリズムに対して単一の分割技法を適用した。適当なパラメーターを使用して近接の効率を捕捉する（すなわち両方の画像スタックに対して相対閾値＝２．５及び異常値検出＝４．０）。しかし、粒子フィルターは、異なる粒子数値及び異なる閾値ファクター値を用いて評価した。分析結果は下表２に表示されている。
【００７９】
【表２】
本発明は、ユーザが物体の移動を追跡することができる自動システム及び方法、例えば、ユーザが、複数の細胞の中の１つ以上の細胞がどのように機能するかを判定するために、その１つ以上の細胞が時間経過とともに１つの点から別の点へ移動するときに、その１つ以上の細胞の移動を追跡することができる自動システム及び方法を提供する。ユーザは、その１つ以上の細胞の移動を追跡し、その１つ以上の細胞が細胞分裂を経ているか否か、又は２つ以上の細胞が合体したか否かなど、その１つ以上の細胞の構造が変化したか否かを判定することができる。このユーザは、その１つ以上の細胞を最適に追跡して、その１つ以上の細胞が時間及び距離に関して移動するときに、その１つ以上の細胞のおおよその位置を見つけることができる。したがって、本発明は、細胞機能を研究するために細胞の移動を追跡する手段をユーザに提供する。
【００８０】
特定の実施形態に関して本発明を説明したが、当業者には明らかなとおり、以下の特許請求の範囲に記載された本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本発明の多くの変更及び変形を実施することができる。
【符号の説明】
【００８１】
１００ 自動ディジタル顕微鏡システム
１０１ 光源
１０１ａ 光ビーム
１０２ コリメータ
１０４ 非球面光学部品
１０５ ビームフォールディング光学部品
１０７ 対物レンズ
１０９ 試料
１１１ 試料ホルダー
１１３ ステージ
１１５ チューブレンズ
１１７ 光学検出器
１１９ 通信リンク
１２１ コンピューター
２０３ 画像受信装置
２０３ａ プロセッサー
２０３ｂ 入力／出力（Ｉ／Ｏ）コントローラ
２０３ｃ 大容量記憶装置
２０３ｄ メモリー
２０３ｅ ビデオアダプター
２０３ｆ 接続インタフェース
２０３ｇ システムバス
２０４ 入力装置
２０６ 表示装置
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体物質の位置を決定するシステム及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
この１０年の間に、生物学的プロセスに関して実施されたデータ測定の量は爆発的に増大した。この爆発は主に、技術の向上、特にコンピューター技術の向上によるものと考えることができる。しかし、データ量は増えたが、それらのデータの分析はデータ量増大のペースに追いついていない。したがって、データの自動分析がますます求められている。
【０００３】
生物学的データの最も基本的な観察の１つは、細胞の挙動を経時的に測定することである。細胞の数及び構造は時間経過とともに変化する。具体的には、増殖、構造、細胞分裂、細胞死などの細胞事象に関する測定量の一連の推移が、加えられた刺激と細胞の挙動との間の因果関係を暗示し、演繹することが報告されている。具体的な例を挙げると、ハイスループットアッセイでは、臨床治療での薬物の効能を判定する際に、ウェルへのその薬物の添加、細胞の構造及び数の変化の大きさ、並びに構造及び数の変化速度が重要である。さらに、細胞寿命のどの点で点滴注入が効果を現わすのかも興味深い。例えば、細胞癌に対する治療が細胞分裂を抑制することがある。細胞を追跡する必要がある大部分の研究は、訓練された生物学者の専門的技術を必要とする。ハイスループットスクリーニングのための追跡の費用は極端に高い。後に、ハイスループットアッセイに適した細胞追跡法を示す。
【０００４】
細胞を追跡するためには一般に、コンピューターを使用して、複数の細胞のうちの単一の細胞を染料で標識し、その細胞が１つのフレームから別のフレームへ移動したときにその細胞を追跡する必要があるであろう。たとえその１つの細胞が標識されていたとしても、１つのフレームから別のフレームに移るときに存在する複数の細胞の中からその細胞を識別できるとは限らないため、標識された細胞の移動を追跡するこのプロセスはエラーを生じやすく、時間もかかる。さらに、細胞を標識するために利用する染料が、細胞の正常な機能を妨げる可能性もあり、そのため、細胞が１つのフレームから別のフレームへ移動するときに細胞がどのように機能するかを示す真の画像は得られないであろう。
【０００５】
細胞を追跡するためにコンピューターが利用するアルゴリズムは、カルマンフィルター、粒子フィルターなどいくつかある。カルマンフィルターは、動的な系の状態を、不完全で雑音の多い一連の測定から推定する効率的な再帰型フィルターである。カルマンフィルターは、細胞などの物体の１つの点から別の点への移動を追跡するために、２次統計量に基づく追跡法を使用する。カルマンフィルターは、動的測定モデルがガウス雑音と線形関係にあると仮定する追跡法を使用する。しかし、細胞画像列では、多くの干渉因子、例えば背景クラッタが存在し、細胞境界の鮮明な画像を生成することが難しく、このことがしばしば、カルマンフィルター追跡が失敗に終わるなる原因となる。
【０００６】
逐次モンテカルロ法の一形態である粒子フィルタリングは、ランダムサンプリングに基づく精巧なモデル推定技法を使用する。粒子フィルターは、ガウス分布の仮定を必要とせず、動的測定モデルは非線形モデルでもよい。粒子フィルターには、カルマンフィルターの欠点が１つもない。しかし、速度が遅いという欠点がある。しかし、そうは言われているものの、粒子フィルターは遅くはない。
【０００７】
粒子フィルターとカルマンフィルターの基本的な違いは、それらのフィルターが状態を表す方法にある。カルマンフィルターは、パラメーター毎に１つの値を記憶し、それぞれのパラメーター間の対応する分散及び相関を、共分散行列の形で記憶する。粒子フィルターは、それぞれの粒子が、状態ベクトルとその対応する重みとを含む対に対応する「粒子」の集合を維持する。追跡対象の物体の全体的挙動は、粒子の集合の統計量から導き出すことができる。数十、数百又は数千の粒子を使用して単一の物体を追跡することができる。
【０００８】
複数の時間経過画像をまたぐ細胞の追跡では、連続する２つの画像が一度に関与する。これらの２つの画像間では、一方の画像（前のフレーム）がもう一方の画像（現在のフレーム）よりも早く取得される。粒子フィルターの基本的着想は、逐次重点サンプリングの概念を使用した関連した確率分布の近似、及び関連した重みを有する一組の離散的ランダムサンプルを使用した確率分布の近似である。粒子フィルターアルゴリズムの目的は、現在のフレームと前のフレームとを関連付ける事象を識別することであり、複数の時点画像中の細胞の非線形移動に対して効率的であることが証明されている。粒子フィルターアルゴリズムでは、画像のそれぞれの細胞を、状態ベクトル／特徴ベクトルと呼ばれる一組の尺度によって表現する必要がある。このシナリオでは、特徴ベクトルが、Ｘ座標、Ｙ座標及びフォームファクターを尺度として含み、これら尺度は、経時的に細胞を追跡するための１次入力である。
【０００９】
粒子フィルターの使用の一例がＷＯ２００８／１００７０４に開示されている。この文献の開示は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【００１０】
特徴ベクトルは、分割された画像から生成される。したがって、分割をより適切に実施することがこの追跡アルゴリズムの要諦である。粒子フィルターは、それぞれの細胞の周囲に粒子の雲（cloud）を生成する。この雲は、フレーム内のある１つの細胞につきまとい、次のフレームでその細胞を追跡するために使用される。粒子フィルターにおける追跡は、連続する２つのフレーム間の細胞の対応尺度によって達成される。対応は、（前のフレームの細胞につきまとう）それぞれの雲と（現在のフレーム内のある１つの細胞を表す）それぞれの特徴ベクトルとの間のエントロピーを計算することによって得られる。対応尺度は、２つのマトリックスの形態で提示され、１つのマトリックスは、前のフレームから現在のフレームへの対応を表し（以下、Ｃｌｏｕｄ＿ｔｏ＿Ｍｅａｓｕｒｅという。）、別のマトリックスは、現在のフレームから前のフレームへの対応を表す（以下、Ｍｅａｓｕｒｅ＿ｔｏ＿Ｃｌｏｕｄという。）。ある粒子フィルター用途では、この対応尺度を評価して、連続する２つの画像中の個々の細胞を関連付ける事象を生成し、この事象は、親子関係によって、グループ：不変、細胞除去、細胞移動、細胞衝突及び細胞分裂の中から選択される。しかし、時に、細胞の対応が誤った事象の生成につながり、細胞の対応を検証することが必要となる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ，”Ｏｎｌｉｎｅ Ｔｒａｃｋｉｎｇ ｏｆ Ｍｉｇｒａｔｉｎｇ ａｎｄ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ Ｉｍａｇｅｄ ｗｉｔｈ Ｐｈａｓｅ−Ｃｏｎｔｒａｓｔ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ”，Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｖｉｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐａｔｔｅｒｎ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，２００６０６１７，ＩＳＢＮ ９７８−０−７６９５−２６４６−１；Ａｂｓｔｒａｃｔ，Ｓｅｃｔｉｏｎ １．１，２
【発明の概要】
【００１２】
本発明の目的は、試料中の細胞を動的に追跡する新しい方法及びシステムであって、先行技術の１つ以上の欠点を克服した方法及びシステムを提供することにある。この目的は、独立請求項に記載された方法及びシステムによって達成される。
【００１３】
本発明に基づく方法及びシステムの１つの利点は、粒子フィルターによって生成された事象の正当性を検証する自動意思決定システムであって、既存の細胞追跡アルゴリズムに比べて、細胞追跡の正確さを最高３０％向上させることができる自動意思決定システムを提供することである。
【００１４】
一態様によれば、試料中の細胞を動的に追跡する方法であって、
・試料の連続する２つの時間経過画像中の細胞間の対応尺度を生成する段階と、
・前記対応尺度を評価して、それらの２つの画像中の個々の細胞を関連付ける事象を生成する段階であり、その事象が、グループ：不変、細胞除去、細胞移動、細胞衝突及び細胞分裂の中から選択される段階と、
・それらの２つの画像中の個々の細胞を関連付ける事象の追跡出力を提供する段階と
を含み、
・関連付ける事象を確定する前記段階が、生成された細胞衝突事象及び細胞分裂事象の正当性を、このような事象毎に適応閾値を計算し、その閾値を事象パラメーターと比較することによって検証することを含む方法が提供される。
【００１５】
他の態様によれば、適応閾値が、生成された事象に関与した細胞のうちの１つ以上の細胞のサイズから計算される。さらに、適応閾値を、生成された事象に関与した最も小さな細胞の半径に比例させることができる。より具体的には、適応閾値を、前記最も小さな細胞の半径に、試料中の細胞の運動に応じた変数を乗じることによって計算することができ、一実施形態では、この変数が、５乃至２０、好ましくは７．５乃至１５の範囲のユーザ定義パラメーターである。
【００１６】
一態様によれば、生成された細胞衝突事象については、前記事象パラメーターが、前の画像中の関連付けられた細胞間の空間関係であり、生成された細胞分裂事象については、前記事象パラメーターが、後の画像中の関連付けられた細胞間の空間関係である。より具体的には、生成された細胞衝突事象については、前記事象パラメーターを、前の画像中の関連付けられた細胞間の距離とすることができ、生成された細胞分裂事象については、前記事象パラメーターを、後の画像中の関連付けられた細胞間の距離とすることができる。
【００１７】
一態様によれば、対応尺度を生成する前記段階が粒子フィルターアルゴリズムを含む。
【００１８】
一態様によれば、この方法はさらに、
・被追跡細胞毎に、生成された追跡出力から親及び子カウントを計算する段落であり、
・親カウント＞１のときに、親細胞を子細胞に関連付ける衝突事象が生成され、
・子カウント＞１のときに、子細胞を親細胞に関連付ける分裂事象が生成される
段階と、
・生成された細胞衝突事象及び細胞分裂事象の正当性を、このような事象毎に適応閾値を計算し、その閾値を事象パラメーターと比較することによって検証する段階と
・追跡出力を更新する段階と
を含む。
【００１９】
さらに別の態様によれば、試料中の細胞を動的に追跡するシステムであって、試料の連続する時間経過画像を提供するように配置された撮像システムと、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の方法に従って試料中の細胞を追跡するように配置された画像受信装置とを備えるシステムが提供される。
【００２０】
本発明の実施形態は従属請求項に記載されている。
【００２１】
本発明のこれらの利点及びその他の利点は、添付図面を参照して以下の説明を読むことによってより明白となる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明に基づく一般的な撮像システムのブロック図である。
【図２】本発明に基づく図１の画像受信装置の概略図である。
【図３】本発明に基づく粒子フィルターアルゴリズムグラフィカルユーザインタフェースのコンピュータースクリーンショットを示す図である。
【図４】本発明に基づく粒子フィルターアルゴリズムの流れ図である。
【図５】細胞の対応を処理する本発明に基づく新規の方法の他の流れ図である。
【図６】本発明に基づく新規の閾値論理を適用した後の、前の画像及び現在の画像の図である。
【図７】本発明に基づく粒子フィルターによって検出された細胞分裂を示す、前の画像及び現在の画像の図である。
【図８】本発明に基づく粒子フィルターによって検出された細胞衝突を示す、前の画像及び現在の画像の図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
現時点における本発明の好ましい実施形態を図面を参照して説明する。それらの図面では、同様の構成要素が同じ符号によって識別される。好ましい実施形態の以下の説明は例示が目的であり、それらの実施形態が本発明の範囲を限定することは意図されていない。
【００２４】
図１は、一般的なディジタル顕微鏡システムの主要な構成要素のブロック図を示す。この自動ディジタル顕微鏡システム１００は以下の構成要素を含む：光源１０１、コリメータ１０２、任意選択の非球面光学部品１０４、ビームフォールディング光学部品１０５、対物レンズ１０７、試料１０９、試料ホルダー１１１、ステージ１１３、チューブレンズ１１５、光学検出器１１７、任意選択の通信リンク１１９及び任意選択のコンピューター１２１。
【００２５】
光源１０１は、ランプ、レーザー、複数のレーザー、発光ダイオード（ＬＥＤ）、複数のＬＥＤ、又は光ビーム１０１ａを発生させる当業者に知られている任意のタイプの光源とすることができる。光ビーム１０１ａは、光源１０１、コリメータ１０２、任意選択の非球面光学部品１０４、ビームフォールディング光学部品１０５及び対物レンズ１０７によって送達されて試料１０９を照らす。試料１０９は、生きた生体物質／生物、生物細胞、非生物試料などである。非球面光学部品１０４は一般的なパウエルレンズである。ビームフォールディング光学部品１０５は、一般的なスキャニングミラー又はダイクロイックミラーである。試料１０９から放射された光は対物レンズ１０７によって集められ、次いで、一般的なチューブレンズ１１５によって光学検出器１１７上に試料１０９の像が形成される。光学検出器１１７は、電荷結合素子（ＣＣＤ）、相補型金属酸化物半導体（ＣＭＯＳ）像検出器、又は当業者によって利用されている任意の２−Ｄアレイ光学検出器とすることができる。光学検出器１１７は適宜、通信リンク１１９によって、電気的に又は無線でコンピューター１２１に接続される。他の実施形態では、光学検出器１１７の代わりに、対物レンズ１０７と協力して中間像をさらに拡大し、標本の詳細を観察できるようにする一般的な顕微鏡接眼レンズ又は接眼鏡が使用される。さらに、光学検出器１１７の代わりに、２つ、３つ又は４つ以上の光学検出器１１７を利用することもできる。試料１０９は試料ホルダー１１１上に取り付けられ、試料ホルダー１１１は、一般的なマイクロタイタープレート、顕微鏡スライド、チップ、ガラスプレート、ペトリ皿又は任意のタイプの試料ホルダーと呼ばれることがある。
【００２６】
他の実施形態では、顕微鏡システム１００が適宜、通信リンク１１９によって従来のコンピューター１２１に電気的に又は無線で接続される。通信リンク１１９は、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、無線ローカルネットワーク、ワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）、ユニバーサルシリアルバス（ＵＳＢ）、Ｅｔｈｅｒｎｅｔ（登録商標）リンク、光ファイバなど、自動顕微鏡システム１００とコンピューター１２１の間のデータ転送を容易にすることができる任意のネットワークとすることができる。
【００２７】
顕微鏡システム１００は、光学検出器１１７又は一般的な顕微鏡接眼レンズを利用することによって物体ステージ１１３上に置かれた試料１０９又は任意のタイプの物体の画像を捕捉する能力を有する画像送信装置、撮像装置又は撮像システムと呼ばれることがある。さらに、顕微鏡システム１００を例えば、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（米ニュージャージー州ピスカタウェイ）製のＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０００又はＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ ３０００とすることもできる。顕微鏡システム１００は、一般的な共焦点顕微鏡、蛍光顕微鏡、落射蛍光顕微鏡、位相差顕微鏡、微分干渉コントラスト顕微鏡、又は当業者に知られている任意のタイプの顕微鏡とすることができる。他の実施形態では、顕微鏡システム１００が、生物などの画像を検出し、分析し、提供することができる一般的なハイスループット、ハイコンテント細胞内（subcellular）撮像分析装置である。さらに、顕微鏡システム１００を、自動細胞撮像システム又は自動細胞内（subcellular）撮像システムとすることもできる。
【００２８】
試料からの反射光又は蛍光を受け取る光学検出器１１７は、光電子増倍管、電荷結合素子（ＣＣＤ）、相補型金属酸化物半導体（ＣＭＯＳ）像検出器、又は当業者によって利用されている任意の光学検出器とすることができる。光学検出器１１７は、通信リンク１１９によってコンピューター１０３に電気的に又は無線で接続される。他の実施形態では、光学検出器１１７の代わりに、対物レンズ１０７と協力して中間像をさらに拡大し、標本の詳細を観察できるようにする一般的な顕微鏡接眼レンズ又は接眼鏡が使用される。
【００２９】
コンピューター１２１は、画像受信装置１２１又は画像検出装置１２１と呼ばれることがある。本発明の他の実施形態では、画像受信装置１２１が画像送信装置１００内に位置する。画像受信装置１２１は、試料１１５の画像を光学検出器１０７から受信する能力を有する一般的なコンピューターの働きをし、次いで、画像受信装置１０３は、標準画像処理ソフトウェアプログラム、アルゴリズム又は式を利用することによって、その画像を表示し、保存し、又は処理することができる。さらに、コンピューター１０３を、パーソナルディジタルアシスタント（ＰＤＡ）、ラップトップコンピューター、ノートブックコンピューター、携帯電話、ハードドライブベースの装置、又は通信リンク１１９を介して情報を受信し、送信し、記憶することができる任意の装置とすることもできる。本発明では１台のコンピューターが利用されるが、コンピューター１２１の代わりに複数のコンピューターを利用することもできる。
【００３０】
図２は、図１の細胞追跡システムの画像受信装置の概略図を示す。画像受信装置若しくは撮像受信装置１２１又は画像受信装置２０３は、従来のコンピューターに関連した一般的な構成要素を含む。画像受信装置２０３を、画像送信システム１００上に収容することもできる。画像受信装置２０３は、プロセッサー２０３ａ、入力／出力（Ｉ／Ｏ）コントローラ２０３ｂ、大容量記憶装置２０３ｃ、メモリー２０３ｄ、ビデオアダプター２０３ｅ、接続インタフェース２０３ｆ、及び上記のシステム構成要素をプロセッサー２０３ａに電気的に又は無線で動作可能に結合するシステムバス２０３ｇを含む。システムバス２０３ｇはさらに、一般的なコンピューターシステム構成要素をプロセッサー２０３ａに電気的に又は無線で動作可能に結合する。プロセッサー２０３ａは、処理ユニット、中央処理ユニット（ＣＰＵ）、複数の処理ユニット又は並列処理ユニットと呼ばれることがある。システムバス２０３ｇは、従来のコンピューターに関連した一般的なバスとすることができる。メモリー２０３ｄは、リードオンリーメモリー（ＲＯＭ）及びランダムアクセスメモリー（ＲＡＭ）を含む。ＲＯＭは、起動時のコンピューターの構成要素間の情報転送を支援する基本ルーチンを含む一般的な入力／出力システムを含む。
【００３１】
入力／出力コントローラ２０３ｂはバス２０３ｇによってプロセッサー２０３ａに接続され、そこで入力／出力コントローラ２０３ｂは、粒子フィルターグラフィカルユーザインタフェース（ＧＵＩ）及びキーボード、ポインティングデバイスなどの入力装置２０４を介して、ユーザが、コマンド及び情報をコンピューターに入力することを可能にするインタフェースの働きをする。利用される一般的なポインティングデバイスは、ジョイスティック、マウス、ゲームパッドなどである。システムバス２０３ｇには、ビデオアダプター２０３ｅによって、表示装置２０６が電気的に又は無線で接続される。表示装置２０６は、一般的なコンピューターモニター、プラズマテレビジョン、液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）、又はコンピューター２０３によって生成された文字及び／若しくは静止画像を表示する能力を有する任意の装置とすることができる。コンピューター２０３のビデオアダプター２０３ｅのとなりには接続インタフェース２０３ｆがある。接続インタフェース２０３ｆは、前述のとおり通信リンク１１９によって光学検出器１１７に接続されたネットワークインタフェースと呼ばれることがある。さらに、画像受信装置２０３は、画像受信装置２０３を別のコンピューターに結合することを可能にするネットワークアダプター又はモデムを含むことができる。
【００３２】
メモリー２０３ｄの上には大容量記憶装置２０３ｃがあり、大容量記憶装置２０３ｃには、１．ハードディスクから読み取り、ハードディスクへ書き込むためのハードディスクドライブ構成要素（図示せず）及びハードディスクドライブインタフェース（図示せず）、２．磁気ディスクドライブ（図示せず）及びハードディスクドライブインタフェース（図示せず）、並びに３．ＣＤ−ＲＯＭ、他の光学式媒体などの取外し可能な光ディスクから読み取り、光ディスクに書き込むための光ディスクドライブ（図示せず）及び光ディスクドライブインタフェース（図示せず）が含まれる。上記のドライブ及びそれらの関連コンピューター可読媒体は、コンピューター可読命令、データ構造、プログラムモジュール及び他のデータの不揮発性記憶をコンピューター１０３に提供する。さらに、上記のドライブは、図４及び５の流れ図で説明する、生体物質の位置を決定し、又は細胞の移動を追跡するための本発明のアルゴリズム、ソフトウェア又は式を有する技術的な効果を含む。
【００３３】
このソフトウェアは、生体物質ロケータグラフィカルユーザインタフェース（ＧＵＩ）を有する。生体物質ロケータＧＵＩは、コンピューターユーザがコンピューター２０３と容易に対話することを可能にするように設計されたソフトウェアプログラムである一般的なＧＵＩと同じ機能のうちの一部の機能を有する特別にプログラムされたＧＵＩである。生体物質ロケータＧＵＩは、１．追跡ターゲット、２．粒子の数、及び３．閾値ファクターを表示する図３に示されているようなスクリーンショットを含む。
粒子フィルター
前述のとおり、ＷＯ２００８／１００７０４は、本発明に基づく事象の検証を利用することができる粒子フィルターの一実施形態を詳細に開示している。
【００３４】
粒子フィルター（すなわち細胞追跡）のための最初の処理段階は画像の分割である。分割後すぐに、画像のそれぞれの細胞に固有の識別番号（細胞ＩＤ）を割り当てる。粒子フィルターの実際の追跡アルゴリズムは、連続する２つのフレームの細胞ＩＤ間の対応を見つける。このアルゴリズムは主に、予測、観察／測定及び更新と呼ばれる３つの段階を実行する（図４）。
【００３５】
図４は、細胞追跡ソフトウェアアプリケーションで粒子フィルターアルゴリズムが使用される方法の一例の流れ図を概略的に示す。
【００３６】
ブロック４０１で、ユーザが、あるプロトコルで記憶された細胞粒子フィルターアルゴリズムを、プロセッサー２０３ａ上で開始する。それによって、ユーザは例えば、生体物質ロケータＧＵＩ又は細胞追跡ＧＵＩを操作して、図３のコンピュータースクリーンショット上の生体物質ＧＵＩのドロップダウンリストの中の粒子フィルターアルゴリズムを選択する。
【００３７】
次に、ブロック４０３で、粒子フィルターアルゴリズムを初期化する。粒子フィルターを追跡アルゴリズムとして起動する時間経過画像スタックに対する分析を選択した後、最初の段階は、最初の画像フレームのそれぞれの細胞の周囲の粒子雲を更新する／生成する段階である。粒子雲は、最初の画像フレーム内のそれぞれの細胞に対して生成された特徴ベクトルの助けを借りて更新される。
【００３８】
ブロック４０５で、生体物質又は細胞の位置を予測する。この予測段階は、それぞれの試料に、細胞につきまとう雲の小さなランダムな摂動を追加する。これは、ある細胞が次のフレームにあるか否かの予測である。
【００３９】
次に、ブロック４０７で、新たな細胞位置を追跡し、確定する。この段階では、細胞間の対応を評価する手段として、現在時刻に実際に観察された細胞の反応（特徴ベクトル）を、それぞれの粒子の予測と比較する。この段階は、中核をなす論理を使用して、前の画像フレームと現在の画像フレームとの間の複数の細胞間の対応を見つけ出す。この段階は、現在のフレームの細胞を前のフレームの細胞に関連付けることによって、関連付けられた事象を生成する。この新たな細胞位置の追跡４０７ついては、後に、図５の流れ図でより詳細に説明する。
【００４０】
ブロック４０９で、粒子雲を更新する。雲は、現在のフレームの測定（特徴ベクトル）に対して更新され、最終的に次のフレームの細胞に対して使用される。次に、ブロック４１１で、そのフレームが最後のフレームであるか否かを判定する。そのフレームが最後のフレームでない場合、処理は、細胞位置の予測に戻る。そのフレームが最後のフレームである場合、ブロック４１３で、この処理は終了する。
【００４１】
この実施形態では、それぞれの雲及び特徴ベクトルに対するエントロピー値を使用して生成された２つの対応マトリックスを介して、連続する２つの画像フレームの細胞間の対応にアクセスする。本明細書ではＣｌｏｕｄ＿ｔｏ＿Ｍｅａｓｕｒｅと呼ぶ一方の対応マトリックスは、現在のフレームの１つ又は多くの細胞ＩＤに対応する前のフレームの細胞ＩＤを捕捉する。これは子カウントを表す。本明細書ではＭｅａｓｕｒｅ＿ｔｏ＿Ｃｌｏｕｄと呼ぶもう一方の対応マトリックスは、親カウントを表す前のフレームの１つ又は多くの細胞ＩＤに対応する現在のフレームの細胞ＩＤを捕捉する。粒子フィルターアルゴリズムの目的は、現在（現在のフレーム）を過去（現在のフレームよりも早く処理された任意のフレーム；通常は単純に１つ前のフレーム）に関連付ける事象を識別することである。関連付けの結果は、事象、例えば不変（標準の追跡）、細胞除去、細胞移動、細胞衝突及び細胞分裂の形で提示される。
【００４２】
対応マトリックスのそれぞれの要素は、細胞ＩＤを含まないか、単一の細胞ＩＤを含むか、又は多くの細胞ＩＤを含むかのいずれかである。それぞれの要素は、事象が生成されたときに、標準の追跡に対応する細胞間の１対１の対合を生成し、１対多又は多対１の対合に従う。生物領域に対して識別されるこれらのさまざまな事象は、衝突、分裂、新たな細胞の移動及び細胞の除去と呼ばれる。下表１は、さまざまなケースの図表現及び粒子フィルターによって生成されるそれらの対応尺度を示す。表中の破線の円は存在する細胞を表し、点線の円は存在しない細胞を表す。対応マトリックスを解釈する手がかりを以下に示す。
【００４３】
１．Ｃｌｏｕｄ＿ｔｏ＿Ｍｅａｓｕｒｅ［Ａ］＝Ｂ又はＭｅａｓｕｒｅ＿ｔｏ＿Ｃｌｏｕｄ［Ｂ］
これは、前のフレームの細胞ＩＤ Ａが現在のフレームの細胞ＩＤ Ｂに関連付けられたときの標準の追跡（不変）を表す。
【００４４】
２．Ｃｌｏｕｄ＿ｔｏ＿Ｍｅａｓｕｒｅ［Ａ］＝ＮＵＬＬ
これは、現在のフレームの特徴が前のフレームの細胞ＩＤ Ａに関連付けられないときの細胞除去を表す。
【００４５】
３．Ｃｌｏｕｄ＿ｔｏ＿Ｍｅａｓｕｒｅ［Ａ］＝Ｂ，Ｃ
これは、前のフレームの細胞ＩＤ Ａが現在のフレームの細胞ＩＤ Ｂ及びＣに関連付けられたときの細胞分裂を表す。
【００４６】
４．Ｍｅａｓｕｒｅ＿ｔｏ＿Ｃｌｏｕｄ［Ｂ］＝ＮＵＬＬ
これは、現在のフレームの細胞ＩＤが前のフレームの細胞と一切関連を持たないときの細胞移動又は新たな細胞を表す。
【００４７】
５．Ｍｅａｓｕｒｅ＿ｔｏ＿Ｃｌｏｕｄ［Ｂ］＝Ｅ，Ｆ
これは、現在のフレームの単一の細胞ＩＤ Ｂが前のフレームの細胞ＩＤ Ｅ及びＦに関連付けられたときの細胞衝突を表す。
【００４８】
粒子フィルターによって生成される追跡出力は完全に、上で論じた対応マトリックスに基づく。
【００４９】
【表１】
この表は、以下の３つの部分に分けられる：１．前のフレームから現在のフレームへの以前の生体物質（細胞）の移動のそれぞれの発生、２．前のフレームから現在のフレームへの移動に対する対応尺度、及び３．事象のタイプ。対応尺度は、前のフレームから現在のフレームへ細胞が移動したときに、その細胞に起こったことをユーザに知らせる。事象は、前のフレームから現在のフレームへ細胞が移動したときに、細胞の衝突、分裂、移動、除去などのうちのどの種類の事象が起こったのかを記述する。この表は、前のフレームから現在のフレームへ細胞が移動するときに細胞に起こることの異なる１０の例を含む。
【００５０】
第１の例では、前のフレームに細胞ＩＤ ９があり、細胞ＩＤ ９が、現在のフレームの細胞ＩＤ １１になる。この対応尺度は、前のフレームの細胞ＩＤ ９が現在のフレームの細胞ＩＤ １１に関連付けられたとき、及び現在のフレームの細胞ＩＤ １１が前のフレームの細胞ＩＤ ９に関連付けられたときの標準の追跡（不変事象）を表す単純なＣｌｏｕｄｓ＿ｔｏ＿ｍｅａｓｕｒｅ［９］＝１１及びＭｅａｓｕｒｅ＿ｔｏ＿Ｃｌｏｕｄ［１１］＝９である。この第１の例に対応する事象は、細胞ＩＤ ９が、細胞ＩＤ １１として新たな位置へ完全に移動した標準の追跡である。第２の例では、前のフレームに細胞ＩＤ ９があり、現在のフレームを見たときに細胞ＩＤ ９が消失している。この対応尺度は、現在のフレームの特徴が前のフレームの細胞ＩＤ ９に関連付けられないときの細胞除去を表すＣｌｏｕｄ＿ｔｏ＿Ｍｅａｓｕｒｅ［９］＝Ｎｕｌｌである。この例に対応する事象は細胞除去である。
【００５１】
第３の例では、前のフレームに２つの細胞ＩＤ ９及び１０がある。現在のフレームへ移動したときに、前のフレームの細胞ＩＤ ９は変化しており、細胞除去事象を指示するＣｌｏｕｄ＿ｔｏ＿Ｍｅａｓｕｒｅ［９］＝Ｎｕｌｌがある。細胞ＩＤ １０については、対応尺度Ｃｌｏｕｄ＿ｔｏ＿Ｍｅａｓｕｒｅ［１０］＝１１が不変追跡事象を指示している。しかし、対応尺度Ｍｅａｓｕｒｅ＿ｔｏ＿Ｃｌｏｕｄ［１１］＝９，１０は、前のフレームに細胞ＩＤ ９があり、次いで細胞ＩＤ ９が移動して、現在の現在のフレームで細胞ＩＤ １０と結合して細胞ＩＤ １１を形成した細胞衝突事象があることを指示している。この図に示されているように、細胞ＩＤ ９と１０の間の距離は比較的に大きく、したがって、９と１０の間の細胞間距離が、後により詳細に論じる閾値よりも大きいため、細胞ＩＤ ９は除去されたはずである。
【００５２】
第４の例では、前のフレームには細胞ＩＤがないが、現在のフレームには新たな細胞ＩＤ １１がある。この例に対する対応尺度は、Ｍｅａｓｕｒｅ＿ｔｏ＿Ｃｌｏｕｄ［１１］＝Ｎｕｌｌである。この事象は、現在のフレームの細胞ＩＤが前のフレームの細胞と一切関連を持たないときの細胞移動又は新たな細胞と呼ばれる。第５の例では、前のフレームには細胞ＩＤ ９だけしかないが、現在のフレームには細胞ＩＤ １０及び１１がある。対応尺度Ｃｌｏｕｄ＿ｔｏ＿Ｍｅａｓｕｒｅ［９］＝１０，１１は細胞ＩＤ ９の細胞分裂を指示しているが、対応尺度Ｍｅａｓｕｒｅ＿ｔｏ＿Ｃｌｏｕｄ［１０］＝９及びＭｅａｓｕｒｅ＿ｔｏ＿Ｃｌｏｕｄ［１１］＝Ｎｕｌｌは、細胞ＩＤ ９が現在のフレーム内の細胞ＩＤ １０を表す不変事象、及び細胞ＩＤ １１に対する細胞移動事象を指示している。この図に示されているとおり、細胞ＩＤ １０と１１の間の距離は比較的に大きく、したがって、１０と１１の間の細胞間距離が、後により詳細に論じる閾値よりも大きいため、細胞ＩＤ １１は新たな（移動した）細胞と考えるべきである。
【００５３】
細胞ＩＤ ９及び細胞ＩＤ １０を含む第６の例では、細胞ＩＤ ９が、前のフレームから現在のフレームへ移動して細胞ＩＤ １１を生成している。対応尺度Ｃｌｏｕｄ＿ｔｏ＿Ｍｅａｓｕｒｅ［９］＝１１及びＣｌｏｕｄ＿ｔｏ＿Ｍｅａｓｕｒｅ［１０］＝Ｎｕｌｌは、細胞ＩＤ ９が現在のフレーム内の細胞ＩＤ １１を表す不変事象、及び細胞ＩＤ １０に対する細胞除去事象を指示しているが、対応尺度Ｍｅａｓｕｒｅ＿ｔｏ＿Ｃｌｏｕｄ［１１］＝９，１０は、細胞ＩＤ ９と１０の細胞衝突を指示している。この図に示されているように、細胞ＩＤ ９と１０の間の距離は比較的に小さく、したがって、細胞ＩＤ ９と１０の間の細胞間距離が、後により詳細に論じる閾値よりも小さいため、この事象は細胞衝突と考えるべきである。
【００５４】
第７の例では、前のフレーム内の細胞ＩＤ ９及び１０が現在のフレームへ移動し、そこでそれらの細胞ＩＤが衝突して細胞ＩＤ １１を形成する。この対応尺度は、Ｃｌｏｕｄ＿ｔｏ＿Ｍｅａｓｕｒｅ［９］＝１１及びＭｅａｓｕｒｅ＿ｔｏ＿Ｃｌｏｕｄ［１１］＝１０である。この図から、この事象が明確な細胞衝突であることが分かるが、両方の尺度が１対１の尺度であり、そのためこの事象は粒子フィルターによって衝突と認識されないため、粒子フィルターによって生成された対応尺度はいずれも衝突を認識しないことに留意すべきである。第８の例では、前のフレームの細胞ＩＤ ９が、現在のフレームの細胞ＩＤ １０と細胞ＩＤ １１に分割される。対応尺度Ｃｌｏｕｄ＿ｔｏ＿Ｍｅａｓｕｒｅ［９］＝１０，１１は細胞ＩＤ ９の細胞分裂を指示するが、対応尺度Ｍｅａｓｕｒｅ＿ｔｏ＿Ｃｌｏｕｄ［１０］＝９及びＭｅａｓｕｒｅ＿ｔｏ＿Ｃｌｏｕｄ［１１］＝Ｎｕｌｌは、細胞ＩＤ ９が現在のフレーム内の細胞ＩＤ １０を表す不変事象、及び細胞ＩＤ １１に対する細胞移動事象を指示している。この図に示されているように、細胞ＩＤ １０と１１の間の距離は比較的に小さく、１０と１１の間の細胞間距離が、後により詳細に論じる閾値よりも小さいため、この事象は、細胞ＩＤ ９の細胞分裂と考えるべきである。
【００５５】
第９の例では、前のフレームの細胞ＩＤ ９が、現在のフレームに２つの細胞ＩＤ １０及び１１を生成している。対応尺度は、Ｃｌｏｕｄ＿ｔｏ＿Ｍｅａｓｕｒｅ［９］＝１０及びＭｅａｓｕｒｅ＿ｔｏ＿Ｃｌｏｕｄ［１１］＝９である。しかし、この図から分かるとおり、この事象は明確な細胞分裂事象であるが、全ての尺度が１対１の尺度であり、そのためこの事象は粒子フィルターによって衝突と認識されないため、粒子フィルターによって生成される対応尺度はいずれも分裂を認識しないことに留意すべきである。最後の例では、前のフレームに２つの細胞ＩＤ ９及び１２がある。前のフレームの細胞ＩＤ ９は細胞ＩＤ １０及び１１を生成しており、これは、対応尺度Ｃｌｏｕｄ＿ｔｏ＿Ｍｅａｓｕｒｅ［９］＝１０，１１、Ｃｌｏｕｄ＿ｔｏ＿Ｍｅａｓｕｒｅ［１２］＝１０、Ｍｅａｓｕｒｅ＿ｔｏ＿Ｃｌｏｕｄ［１０］＝９及びＭｅａｓｕｒｅ＿ｔｏ＿Ｃｌｏｕｄ［１１］＝９を有する。これは不明確な事象を表し、したがって標準の追跡事象とみなすべきである。
【００５６】
図５は、新たな細胞位置を測定するブロック４０７の下に位置する、細胞の対応を処理する新規の方法の流れ図を示す。ブロック５０１で、新たな細胞位置を測定するこの処理段階は一般に、連続する２つの画像フレームの細胞を関連付けるための中核をなす対応尺度を、上で論じたとおりに生成する。これらの尺度の要素は、それらの尺度に関連した１つ又は複数の細胞ＩＤ事象を含みうる。ブロック５０３で、それらの対応尺度を評価して、不変事象、細胞除去事象、細胞移動事象（表１の例１、２及び４）など、追加の検証又は解釈を必要としない明確な単一のＩＤ事象を識別し、そのデータを直接に使用して、ブロック５０５によって指示された標準の追跡を介して、ブロック５１３で追跡出力を生成する。本明細書では、追跡出力を生成すること５１３が一般に、連続する２つの画像フレームの細胞ＩＤを関連付けることを意味する。しかし、ブロック５０３で、ある要素が複数の細胞ＩＤに関連すると識別された場合、これは、追跡事象として処理されなければならない。追跡事象に遭遇したときには、ブロック５０７から５１１で、その事象の正当性を、局所閾値の助けを借りて検証する。事象の自動検証及び局所閾値の計算については後に説明する。事象の正当性を検証する間に、検証された事象を表す新たな対応尺度が生成され、最終的にブロック５１３で追跡出力を生成する。
【００５７】
ブロック５１３での追跡出力の生成に続いて、ブロック５１５で、「親子関係」に基づいて追跡出力の訂正を実行することができる。訂正ブロック５１５は、それまでに識別されていない衝突事象又は分裂事象を捕捉し、複数の事象に関連付ける同じ細胞ＩＤの複製を追跡出力が含むことを防ぐのに役立つ。ブロック５１５において、親カウントは、現在のフレームの単一の細胞に関連付けられた前のフレームの細胞の数を表す。親カウントが１よりも大きな値を有するとき、その事象は衝突として確定される。同様に、子カウントは、前のフレームの単一の細胞に関連付けられた現在のフレームの細胞の数を表す。子カウントが１よりも大きい値を有するとき、その事象は分裂として確定される。したがって、親子関係に基づくこの処理は正当な追加の事象を捕捉するが、追跡出力が生成されるまではそれらの事象は捕捉されない。その後、ブロック５１７で、最終的な追跡出力を保存する。
【００５８】
一実施形態によれば、ブロック５０３で複数の細胞ＩＤに関連すると識別された追跡事象は、ブロック５０７及び５０８で、以下の手順に基づく検証を受ける。
【００５９】
１．衝突に関して前のフレームの細胞ＩＤを識別する。前のフレームの細胞Ｘ、Ｙを現在のフレームの細胞Ｚに関連付ける（すなわちＭｅａｓｕｒｅ＿ｔｏ＿Ｃｌｏｕｄ＝［Ｚ］＝Ｘ，Ｙ）。
【００６０】
２．Ｃｌｏｕｄ＿ｔｏ＿Ｍｅａｓｕｒｅマトリックスにおいて、ＩＤ Ｘ又はＹが複数のＩＤに関連付けられているか否かを判定する。Ｃｌｏｕｄ＿ｔｏ＿Ｍｅａｓｕｒｅマトリックスが、前のいずれかの細胞に関して複数の対応を示さない場合、これは真の衝突とみなされ、Ｃｌｏｕｄ＿ｔｏ＿Ｍｅａｓｕｒｅマトリックスが前のいずれかの細胞に関して複数の対応を示す場合、その事象は不明確な事象とみなされる。例えばＣｌｏｕｄ＿ｔｏ＿Ｍｅａｓｕｒｅ［Ｘ］＝Ｚ，Ａであるとき、これは不明確なケースである。
【００６１】
３．明確な事象に関しては、実行時に生成された閾値に基づいて、前の画像の細胞がグループ分けされる。前のフレームの細胞ＩＤ間の事象パラメーターが閾値よりも大きい場合、一方のグループが除去された細胞とみなされ、標準的に追跡された細胞は、マトリックスＣｌｏｕｄ＿ｔｏ＿Ｍｅａｓｕｒｅの助けを借りて識別される。
【００６２】
４．不明確なケースは、不明確な細胞以外の細胞の標準の追跡又は分割を表す。実際に分割を受ける細胞は、Ｍｅａｓｕｒｅ＿ｔｏ＿Ｃｌｏｕｄマトリックスとして捕捉された細胞の対応によって評価される。
【００６３】
５．細胞分裂に遭遇したときには、段階１から４で説明したのと同様の論理を繰り返す。これは、２つの異なるマトリックス及び現在のフレーム又は前のフレームを入れ替えるだけである。
【００６４】
ブロック５０７で、その事象が真の事象であるか否かを検証するために、それぞれの事象に対する適応閾値を計算する。一実施形態によれば、以前の画像（１つ以上）及び／又は現在の画像から取得可能な空間情報に基づいて、適応閾値を計算する。より具体的には、生成された事象に関与した細胞に関する空間情報から、この閾値を計算することができる。細胞の運動学的挙動は少なくとも部分的に細胞のサイズに関係するため、この閾値は例えば、関与した細胞のうちの１つ以上の細胞のサイズに基づいて計算することができる。それに加えて、又はその代わりに、この閾値が、２つ以上の以前の画像から測定された運動学的パラメーターに基づいてもよい。
【００６５】
適応閾値を計算するプロセスの一例は以下の段階を含む。
【００６６】
１．事象を生成する細胞のグループの領域を、このアルゴリズムに対する入力として使用する段階
２．事象を生成すると仮定される細胞の中で最も小さな領域を見つける段階
３．その事象に対する閾値（Ｔ）を、最も小さな細胞の半径のある倍数として計算する段階
この例の乗数は、ユーザ定義のパラメーター（すなわち図１の閾値ファクター）として設計される。この乗数の値は、高速で非常にランダムな細胞の移動に対してはより大きくする。しかし、複数の時間経過画像をまたいで低速で安定した細胞の移動に対しては、この乗数値を小さくすべきである。この乗数の一般的な範囲は７．５乃至１５と定義される。
【００６７】
最大事象はある値で正当とみなされ、これを超える事象は誤りである。適応閾値は、それを超えると粒子フィルターが余分な事象を捕捉しない飽和値を有する。
【００６８】
この閾値は局所閾値であり、それぞれの事象に対して新たな閾値が計算されること、及びこの閾値は標準の追跡に影響を及ぼさないこと、すなわち、この閾値に対する小さな変更はあまりに異なる出力を生成しないことに留意すべきである。
【００６９】
ブロック５０９で、この適応閾値を前記事象に対する事象パラメーターと比較することにより、正当性検証の対象である事象の正当性を検証する。適応閾値と同様に、この事象パラメーターも、例えば、以前の画像（１つ以上）及び／又は現在の画像から取得可能な、生成された事象に関与した細胞に関する空間情報に基づくことができる。生成された細胞衝突事象については、この事象パラメーターを例えば、前の画像中の関連付けられた細胞間の空間関係とすることができ、生成された細胞分裂事象については、この事象パラメーターを、後の画像中の関連付けられた細胞間の空間関係とすることができる。より具体的には、この事象パラメーターを、その事象に関与した関連付けられた細胞間の距離とすることができる。
【００７０】
前述のとおり、ブロック５１５で、追跡出力は親子関係に基づいて訂正される。表１に示した例７及び９はそれぞれ、衝突及び分裂の非常に特別なケースを表す。これは、前の現在のフレームの細胞ＩＤと現在のフレームの細胞ＩＤの間の可能な１対１関係を例示し、したがって、標準の追跡シナリオを指示する。一実施形態によれば、追跡出力から親及び子カウントを得ることにより親子関係を考慮することによって、この不明確性を訂正することができる。親カウントは、現在のフレーム内の唯一の細胞に接続する前のフレームの細胞の数を表す。また、子カウントは、前のフレーム内の唯一の細胞に接続する現在のフレームの細胞の数を表し、以下の段階を含むことができる。
【００７１】
１．既に生成された追跡出力から親及び子供カウントを計算する段階
２．親カウント＞１であるか、又は子カウント＞１であるかに応じて、前のフレームの細胞ＩＤと現在のフレーム細胞ＩＤとの間の細胞対応を生成する段階。すなわち、親カウント＞１は衝突に対応し、子カウント＞１は分裂に対応する。
【００７２】
３．自動的に生成された閾値Ｔを使用して、対応／事象を検証する段階
４．生成された新たな事象に基づいて追跡出力を更新する段階
標準的に追跡された細胞につきまとう雲の連続する更新は、その細胞を事実上新たな位置へ移動させることがありえる。したがって、雲の集合は、現在のフレームからの細胞尺度（特徴ベクトル）を使用して更新される。
粒子フィルターの性能を示す例
図６ａ及び６ｂは、事象の検証によって粒子アルゴリズムの改良の導入が実現された一例を示す。図６ａは前のフレームを示し、図６ｂは現在のフレームを示す。粒子フィルタリングによって画像６ａ及び６ｂを評価したとき、細胞ＩＤ １２に対する追跡出力は、Ｃｌｏｕｄ＿ｔｏ＿Ｍｅａｓｕｒｅ［１２］＝１３，１４であった。この追跡出力により、この事象は細胞分裂事象として捕捉される。しかし、この細胞分裂事象の正当性を検証した後、この事象は、１つの新たな細胞の移動と、前のフレーム内の２つの細胞の不変事象とを表すものと訂正された。すなわちＣｌｏｕｄ＿ｔｏ＿Ｍｅａｓｕｒｅ［１２］＝１３及びＭｅａｓｕｒｅ＿ｔｏ＿Ｃｌｏｕｄ［１４］＝ＮＵＬＬである。
【００７３】
図７ａ及び７ｂは、粒子フィルタリングによる評価が、この事象を、１対多関係を有する細胞分裂事象として、すなわちＣｌｏｕｄ＿ｔｏ＿Ｍｅａｓｕｒｅ［１２］＝１３，１４、Ｍｅａｓｕｒｅ＿ｔｏ＿Ｃｌｏｕｄ［１３］＝１２及びＭｅａｓｕｒｅ＿ｔｏ＿Ｃｌｏｕｄ［１４］＝１２として捕捉する他の例を示す。このケースでは、細胞分裂事象の正当性の検証が、その事象が真の細胞分裂であることを明らかにする。同様に、図８ａ及び８ｂは、粒子フィルタリングによる評価が、この事象を、多対１関係を有する細胞衝突事象として、すなわちＣｌｏｕｄ＿ｔｏ＿Ｍｅａｓｕｒｅ［１２］＝１４、Ｃｌｏｕｄ＿ｔｏ＿Ｍｅａｓｕｒｅ［１３］＝１４及びＭｅａｓｕｒｅ＿ｔｏ＿Ｃｌｏｕｄ［１４］＝１２，１３として捕捉する例を示し、この事象の正当性の検証は、その事象が真の細胞衝突であることを明らかにする。
【００７４】
粒子フィルターと近接（ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ）との性能比較では、粒子フィルターの追跡機能の性能の方が約３０％高いことが示されている。粒子フィルターのＵＩは、図３に示すように、粒子の数を入力するオプションを設けている。粒子フィルターの性能は粒子数に依存する。常に、粒子数が多いほど追跡の正確さは向上する。細胞が密集して存在するときには、粒子数をより大きくすべきである。ＩｎＣｅｌｌによって取得した時間経過画像スタックに対する実験中に、本発明の発明者らは以下の知見を見出した。
【００７５】
細胞の密度が低いときには、粒子数＝２５が適当である。
【００７６】
細胞の密度が中程度であるときには、粒子数＝５０が適当である。
【００７７】
細胞の密度が高いときには、粒子数＝１００から１５０が適当である。
【００７８】
改良されたこの粒子フィルターアルゴリズムの正確さを、既存の追跡アルゴリズム（すなわち近接）に対して評価する。この評価は、２つの別個の画像スタック、すなわちｃｅｌｌ ｔｒａｃｋ−３及び１７１００６−ｃｅｌｌ ｔｒａｃｋｉｎｇ−２２ｈｒｓ−２．ｘｄｃｅに対して実施する。画像スタック毎に、両方の追跡アルゴリズムに対して単一の分割技法を適用した。適当なパラメーターを使用して近接の効率を捕捉する（すなわち両方の画像スタックに対して相対閾値＝２．５及び異常値検出＝４．０）。しかし、粒子フィルターは、異なる粒子数値及び異なる閾値ファクター値を用いて評価した。分析結果は下表２に表示されている。
【００７９】
【表２】
本発明は、ユーザが物体の移動を追跡することができる自動システム及び方法、例えば、ユーザが、複数の細胞の中の１つ以上の細胞がどのように機能するかを判定するために、その１つ以上の細胞が時間経過とともに１つの点から別の点へ移動するときに、その１つ以上の細胞の移動を追跡することができる自動システム及び方法を提供する。ユーザは、その１つ以上の細胞の移動を追跡し、その１つ以上の細胞が細胞分裂を経ているか否か、又は２つ以上の細胞が合体したか否かなど、その１つ以上の細胞の構造が変化したか否かを判定することができる。このユーザは、その１つ以上の細胞を最適に追跡して、その１つ以上の細胞が時間及び距離に関して移動するときに、その１つ以上の細胞のおおよその位置を見つけることができる。したがって、本発明は、細胞機能を研究するために細胞の移動を追跡する手段をユーザに提供する。
【００８０】
特定の実施形態に関して本発明を説明したが、当業者には明らかなとおり、以下の特許請求の範囲に記載された本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本発明の多くの変更及び変形を実施することができる。
【符号の説明】
【００８１】
１００ 自動ディジタル顕微鏡システム
１０１ 光源
１０１ａ 光ビーム
１０２ コリメータ
１０４ 非球面光学部品
１０５ ビームフォールディング光学部品
１０７ 対物レンズ
１０９ 試料
１１１ 試料ホルダー
１１３ ステージ
１１５ チューブレンズ
１１７ 光学検出器
１１９ 通信リンク
１２１ コンピューター
２０３ 画像受信装置
２０３ａ プロセッサー
２０３ｂ 入力／出力（Ｉ／Ｏ）コントローラ
２０３ｃ 大容量記憶装置
２０３ｄ メモリー
２０３ｅ ビデオアダプター
２０３ｆ 接続インタフェース
２０３ｇ システムバス
２０４ 入力装置
２０６ 表示装置
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の細胞を動的に追跡する方法であって、
・試料の連続する２つの時間経過画像中の細胞間の対応尺度を生成する段階と、
・前記対応尺度を評価して、前記２つの画像中の個々の細胞を関連付ける事象を生成する段階であり、前記事象が、グループ：不変、細胞除去、細胞移動、細胞衝突及び細胞分裂の中から選択される段階と、
・前記２つの画像中の個々の細胞を関連付ける事象の追跡出力を提供する段階と
を含み、
・関連付ける事象を確定する前記段階が、生成された細胞衝突事象及び細胞分裂事象の正当性を、このような事象毎に適応閾値を計算し、前記閾値を事象パラメーターと比較することによって検証すること
を含む方法。
【請求項２】
前記適応閾値が、前記生成された事象に関与した細胞のうちの１つ以上の細胞のサイズから計算される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記適応閾値が、前記生成された事象に関与した最も小さな細胞の半径に比例する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記適応閾値が、前記最も小さな細胞の半径に、試料中の細胞の運動に応じた変数を乗じることによって計算される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記適応閾値が、前記最も小さな細胞の半径に、５乃至２０、好ましくは７．５乃至１５の範囲のユーザ定義パラメーターを乗じることによって計算される、請求項３記載の方法。
【請求項６】
・生成された細胞衝突事象については、前記事象パラメーターが、前の画像中の関連付けられた細胞間の空間関係であり、
・生成された細胞分裂事象については、前記事象パラメーターが、後の画像中の関連付けられた細胞間の空間関係である、
請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
・生成された細胞衝突事象については、前記事象パラメーターが、前の画像中の関連付けられた細胞間の距離であり、
・生成された細胞分裂事象については、前記事象パラメーターが、後の画像中の関連付けられた細胞間の距離である、
請求項５記載の方法。
【請求項８】
対応尺度を生成する前記段階が粒子フィルターアルゴリズムを含む、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
・被追跡細胞毎に、生成された前記追跡出力から親及び子カウントを計算する段落であり、
親カウント＞１のときに、親細胞を子細胞に関連付ける衝突事象が生成され、
子カウント＞１のときに、子細胞を親細胞に関連付ける分裂事象が生成される
段階と、
・生成された細胞衝突事象及び細胞分裂事象の正当性を、このような事象毎に適応閾値を計算し、前記閾値を事象パラメーターと比較することによって検証する段階と
・前記追跡出力を更新する段階と
をさらに含む、請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
試料中の細胞を動的に追跡するシステムであって、前記試料の連続する時間経過画像を提供するように配置された撮像システムと、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の方法に従って試料中の細胞を追跡するように配置された画像受信装置とを備えるシステム。
【請求項１】
試料中の細胞を動的に追跡する方法であって、
・試料の連続する２つの時間経過画像中の細胞間の対応尺度を生成する段階と、
・前記対応尺度を評価して、前記２つの画像中の個々の細胞を関連付ける事象を生成する段階であり、前記事象が、グループ：不変、細胞除去、細胞移動、細胞衝突及び細胞分裂の中から選択される段階と、
・前記２つの画像中の個々の細胞を関連付ける事象の追跡出力を提供する段階と
を含み、
・関連付ける事象を確定する前記段階が、生成された細胞衝突事象及び細胞分裂事象の正当性を、このような事象毎に適応閾値を計算し、前記閾値を事象パラメーターと比較することによって検証すること
を含む方法。
【請求項２】
前記適応閾値が、前記生成された事象に関与した細胞のうちの１つ以上の細胞のサイズから計算される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記適応閾値が、前記生成された事象に関与した最も小さな細胞の半径に比例する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記適応閾値が、前記最も小さな細胞の半径に、試料中の細胞の運動に応じた変数を乗じることによって計算される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記適応閾値が、前記最も小さな細胞の半径に、５乃至２０、好ましくは７．５乃至１５の範囲のユーザ定義パラメーターを乗じることによって計算される、請求項３記載の方法。
【請求項６】
・生成された細胞衝突事象については、前記事象パラメーターが、前の画像中の関連付けられた細胞間の空間関係であり、
・生成された細胞分裂事象については、前記事象パラメーターが、後の画像中の関連付けられた細胞間の空間関係である、
請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
・生成された細胞衝突事象については、前記事象パラメーターが、前の画像中の関連付けられた細胞間の距離であり、
・生成された細胞分裂事象については、前記事象パラメーターが、後の画像中の関連付けられた細胞間の距離である、
請求項５記載の方法。
【請求項８】
対応尺度を生成する前記段階が粒子フィルターアルゴリズムを含む、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
・被追跡細胞毎に、生成された前記追跡出力から親及び子カウントを計算する段落であり、
親カウント＞１のときに、親細胞を子細胞に関連付ける衝突事象が生成され、
子カウント＞１のときに、子細胞を親細胞に関連付ける分裂事象が生成される
段階と、
・生成された細胞衝突事象及び細胞分裂事象の正当性を、このような事象毎に適応閾値を計算し、前記閾値を事象パラメーターと比較することによって検証する段階と
・前記追跡出力を更新する段階と
をさらに含む、請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
試料中の細胞を動的に追跡するシステムであって、前記試料の連続する時間経過画像を提供するように配置された撮像システムと、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の方法に従って試料中の細胞を追跡するように配置された画像受信装置とを備えるシステム。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２０１２−５２７２３６（Ｐ２０１２−５２７２３６Ａ）
【公表日】平成２４年１１月８日（２０１２．１１．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１１７８８（Ｐ２０１２−５１１７８８）
【出願日】平成２２年５月１７日（２０１０．５．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２０１０／０５０５３０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１３４８７５
【国際公開日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【出願人】（５９７０６４７１３）ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・アクチボラグ (109)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１１月８日（２０１２．１１．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年５月１７日（２０１０．５．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２０１０／０５０５３０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１３４８７５
【国際公開日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【出願人】（５９７０６４７１３）ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・アクチボラグ (109)
【Ｆターム（参考）】
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