試料分析チップ、これを用いた試料分析装置、試料分析方法及び遺伝子解析方法、並びに試料分析チップの製造方法
【課題】送液方法が簡易でかつ各ウェルの液量ばらつきがなく、低コストの試料分析チップを提供する。
【解決手段】基材１０１に複数のウェル１０２と、各ウェルに繋がる流路と、流路に溶液を注入するための注入口１０７とを有し、基材を回転させてウェルに溶液を配液する試料分析チップであって、流路は、各ウェルに送液する主流路１０３、および主流路とウェルとを連絡する側路１０５を有し、主流路はウェルより回転中心側に設けられ、隣り合うウェルの間で回転中心に対して一つの山１０３ａを有するように形成され、側路が、回転中心方向に対して傾いて形成され、山は、山の頂点と回転中心とを通る基準線に対して、一方側で隣り合う主流路の山と連絡する幅広主流路と、他方側で隣り合う主流路の山と連絡し幅広主流路より路幅が小さい幅狭主流路とを有し、幅広主流路における回転中心から離間した端部が、側路と連絡している。
【解決手段】基材１０１に複数のウェル１０２と、各ウェルに繋がる流路と、流路に溶液を注入するための注入口１０７とを有し、基材を回転させてウェルに溶液を配液する試料分析チップであって、流路は、各ウェルに送液する主流路１０３、および主流路とウェルとを連絡する側路１０５を有し、主流路はウェルより回転中心側に設けられ、隣り合うウェルの間で回転中心に対して一つの山１０３ａを有するように形成され、側路が、回転中心方向に対して傾いて形成され、山は、山の頂点と回転中心とを通る基準線に対して、一方側で隣り合う主流路の山と連絡する幅広主流路と、他方側で隣り合う主流路の山と連絡し幅広主流路より路幅が小さい幅狭主流路とを有し、幅広主流路における回転中心から離間した端部が、側路と連絡している。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生化学反応の検出や分析等に用いる試料分析チップ、これを用いた試料分析装置、試料分析方法及び遺伝子解析方法、並びに試料分析チップの製造方法に関する。特にＤＮＡ解析に使用可能なディスポーザブルチップとその製造方法に関する。
本願は、２００９年３月３１日に日本に出願された特願２００９−０８５２７２号、特願２００９−０８５２７３号及び特願２００９−０８５２７４号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
従来、例えばＤＮＡ反応、たんぱく質反応等の生化学反応の分野において、微量の試料溶液を処理する反応装置として、μ−ＴＡＳ（Ｔｏｔａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ）やＬａｂ−ｏｎ−Ｃｈｉｐと呼ばれる技術が知られている。これは、１個のチップやカートリッジに複数の反応室（以下、ウェル）や流路を供えたものであり、複数の検体の解析、あるいは複数の反応を行うことができる。これらの技術はチップ及びカートリッジを小型化することで扱う薬品を少量にすることが出来、様々なメリットがあるとされてきた。
【０００３】
そのメリットとは例えば従来使用していた強酸や強アルカリ薬品の分量が微量化することで人体への影響や環境への影響が格段に低くなること、また、生化学反応等に用いられる高額な試薬類の消費量が微量化することで分析、反応に費やすコストを低減できること、などが挙げられる。
【０００４】
チップやカートリッジを用いて生化学反応を最も効率よく行うためには、複数のウェルにそれぞれ異なる種類の薬品や検体、酵素を配置し、これら薬品や検体、酵素と反応を起こす試薬を一本ないし数本の主導管からまとめてウェルに流し入れ、異なった複数の反応を生じさせる必要がある。
【０００５】
この手法を用いれば、複数種の検体を同じ試薬で同時に処理をしたり、また逆に一種類の検体に同時に複数の処理を施したりすることが出来、従来かかっていた時間や手間を大幅に減らすことが可能である。
【０００６】
この種の手法を用いる際、複数の反応場に等量のサンプルを送液する技術と、各ウェルの中身を混ざり合わないようにする技術が重要となる。このようなウェルへの送液を行うチップについての先行技術としては以下のものが挙げられる。
【０００７】
特許文献１では、液溜めから遠心力を用いてウェルへの送液を行うチップにおいて、ウェルを独立させるために流路を変形、密封している。そのため流路を押しつぶす機構が必要であり、自動化が困難である。また、従来の遠心送液チップのように中央の液溜りから周囲のウェルに遠心送液を行うと、各ウェルへの送液量にばらつきが生じてしまう。
【０００８】
特許文献２では、遠心方法を自転＋公転を織り交ぜることで各ウェルへの送液量にばらつきを解決している。しかし、この手法もチップが自転＋公転するための複雑な機構とスペースが必要となる。
【０００９】
特許文献３では液体貯留部と遠心方向に伸びる流路を有するウェルを複数連結させた分析用媒体が公開されているが、この文献では液の配液性などには注視しておらず、逆にウェルに詰まった空気との押し合いで流体を制御するとある。この手法では液体貯留部と液体貯留部の間流路の液体は送液されない上、各ウェルに送液される液量は大きくバラつき、反応のたびに結果に差異が生じてしまう。
【００１０】
従って、従来の第一の問題点は、送液方法が簡易でかつ各ウェルの液量ばらつきが少ないチップが実現されていないということである。
【００１１】
また第二の問題点として、これらの手法には、サンプル物質を装置中の複数のウェルに分配する必要があるため、チャンバの相互汚染による誤った試験結果に繋がるおそれがある。
【００１２】
上記問題を解決する手法としては、少なくとも一方の部材に流路などの加工が施された２つの部材を張り合わせてからなる密閉型のチップが提案されている。例えば、特許文献１には、装填チャンバ、主導管およびプロセスチャンバ（ウェル）を含む構造を提供する第１の主面部材と、第２の主面部材からなり、プロセスチャンバが装填チャンバから延びる導管に沿って配置され、装填チャンバ、導管、およびプロセスチャンバはサンプル処理装置の長さに沿って整列される密閉型のプロセスアレイ及びサンプル処理装置が開示された。
【００１３】
特許文献４に記載のプロセスアレイには、１本の主導管から枝分かれしたフィード導管を介して接続された複数のプロセスチャンバが設けられている。このため、複数種の検体を同じ試薬で処理する等の操作が可能である。これらのプロセスアレイを用いて生化学反応を最も効率良く行うためには、まず、複数の反応場にそれぞれ異なる種類の薬品や検体、酵素を配置する。そして、これらと反応を起こす試薬を、１本ないし複数本の主導管からそれぞれの反応場に流し入れる。このようにして、複数の異なる反応を生じさせる必要がある。この手法を用いれば、複数種の検体を同じ試薬で同時に処理したり、逆に１種類の検体に対して複数の処理を同時に施したりすることができる。これによって、従来かかっていた時間や手間を大幅に減らすことが可能である。
【００１４】
この種の手法として、例えば、液体導入口、流路、液体排出口等を備えたマイクロ流体チップを用い、反応に必要な試薬成分の一部をチップの流路内に凍結乾燥等の方法により固体状態で固定し、反応に必要な残りの試薬成分を液体状態で送液し、流路内でこれらの成分を接触させて反応を生じさせる、という技術が開示される。
【００１５】
また、特許文献５には、装填チャンバ、プロセスチャンバ、及び流路が形成された樹脂基材と平板状の金属基材とを貼り合せてからなるサンプル処理装置が開示されている。また、各プロセスチャンバに異なる反応を行わせるときなどには流路を閉塞して各プロセスチャンバを密閉空間にする方法が開示されている。このサンプル処理装置では平坦な金属基材を流路内に押し込むように変形させることで流路を閉塞させている。
【００１６】
しかしながら、特許文献１に記載のプロセスアレイは、第１の主面部材と第２の主面部材との間に感圧接着剤が使用されている。感圧接着剤の使用は反応中に接着剤からの溶出物が発生し、ウェル内の試薬に影響を与える可能性がある。また、接着層の耐熱性や耐水性の問題が生じやすく、特許文献１の構成では流路を外部からの影響を受けないように密閉するのは不十分である。
【００１７】
また、生化学反応等を行わせる際に反応温度や温度サイクル条件を精密に制御することは極めて重要である。特許文献２に記載のサンプル処理装置には、金属基材側を平坦な板状形成されている。このため、熱ブロック等との密着性が上がり、熱サイクルを伴う反応を行うときに好適である、と記載されている。しかしながら、特許文献２に記載のサンプル処理装置を用い反応を行う際には、流路を閉塞し各プロセスチャンバを密閉空間にする必要がある。このサンプル処理装置では平坦な金属基材を流路内に押し込むように変形させることで、流路を閉塞している。このように金属基材を変形させることによって、金属基材の平坦性が損なわれ、熱ブロックとの密着性が低下し、熱応答性が不十分になり、所望の反応を確実かつ短時間に行わせることが難しいという問題がある。さらに、特許文献２の方法では、流路の閉塞が不十分になってしまう場合、チャンバの相互汚染による誤った試験結果に繋がる場合がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】特表２００４−５０２１６４号公報
【特許文献２】特許第３６９９７２１号公報
【特許文献３】特開２００８−８３０１７号公報
【特許文献４】特許第４１８１０４６号公報
【特許文献５】特表２００４−５０２１６４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
以上のような従来技術の問題点を鑑みて、本発明はウェルへの送液を行う試料分析チップにおいて、送液方法が簡易でかつ各ウェルの液量ばらつきがなく、低コストの試料分析チップを提供することを課題とする。
また、容易に作製することができ、かつチップ上のウェルでの試料汚染等の生じることのない試料分析チップ、これを用いた試料分析装置、試料分析方法及び遺伝子解析方法、並びに試料分析チップの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
上記課題を解決するために、この発明は以下の手段を提案している。
本発明の試料分析チップは、基材に複数のウェルと、各前記ウェルに繋がる流路と、前記流路に溶液を注入するための注入口とを有し、前記基材を回転させて前記ウェルに溶液を配液する試料分析チップであって、前記流路は、各前記ウェルに送液する主流路、および前記主流路と前記ウェルとを連絡する側路を有し、該主流路は前記ウェルより回転中心側に設けられ、隣り合う前記ウェルの間で前記回転中心に対して一つの山を有するように形成され、前記側路が、前記回転中心方向に対して傾いて形成され、前記山は、前記山の頂点と前記回転中心とを通る基準線に対して、一方側で隣り合う前記主流路の山と連絡する幅広主流路と、他方側で隣り合う前記主流路の山と連絡し前記幅広主流路より路幅が小さい幅狭主流路とを有し、前記幅広主流路における前記回転中心から離間した端部が、前記側路と連絡していることを特徴としている。
【００２１】
また、上記の試料分析チップにおいて、前記基材が円盤状であり、前記ウェルは該基材と同心円状に配置されていることがより好ましい。
また、上記の試料分析チップにおいて、前記主流路が、前記回転中心方向に対して傾いて形成されていることがより好ましい。
また、上記の試料分析チップにおいて、前記側路に余剰溶液を溜める廃液部が設けられたことがより好ましい。
【００２２】
また、上記の試料分析チップにおいて、前記廃液部が、廃液を溜める廃液チャンバと、前記側路を分岐し、該廃液チャンバと連絡する廃液チャンバ分岐流路とを有することがより好ましい。
また、上記の試料分析チップにおいて、前記廃液部は、前記回転中心方向に対して前記側路の内側に設けられていることがより好ましい。
また、上記の試料分析チップにおいて、前記ウェルに連通する分岐流路は前記廃液チャンバ分岐流路より送液時の圧力損失が低いことがより好ましい。
【００２３】
また、上記の試料分析チップにおいて、前記ウェルに連絡する分岐流路の断面積が、前記廃液チャンバ分岐流路の断面積よりも大きいことがより好ましい。
また、上記の試料分析チップにおいて、前記廃液チャンバ分岐流路よりも前記ウェルに連絡する分岐流路の表面粗さが小さいことがより好ましい。
また、上記の試料分析チップにおいて、前記廃液チャンバ分岐流路の流路内表面を撥水処理したことがより好ましい。
【００２４】
また、上記の試料分析チップにおいて、前記ウェルに連絡する分岐流路の流路内表面を親水処理したことがより好ましい。
また、上記の試料分析チップにおいて、前記試料分析チップは前記ウェル及び前記流路を形成した第一の基材と、該基材と貼り合わせた第二の基材とを有することがより好ましい。
また、上記の試料分析チップにおいて、前記基材のいずれか一方が光透過性材料で形成されていることがより好ましい。
【００２５】
また、上記の試料分析チップにおいて、前記第一の基材が光透過性の樹脂材料であり、前記第二の基材が金属材料であることがより好ましい。
また、上記の試料分析チップにおいて、前記第一の基材が、可視光に対して光透過性でありかつ赤外線に対して光吸収性の樹脂からなり、前記第二の基材が、少なくとも波長８００ｎｍ以上の赤外線を透過する板状又はフィルム状であることがより好ましい。
また、上記の試料分析チップにおいて、前記第一の基材は、ポリプロピレン、ポリカーボネート、アクリル樹脂のいずれかの樹脂基材であることがより好ましい。
【００２６】
また、上記の試料分析チップにおいて、前記第一の基材は、８００ｎｍ以上の波長領域に吸収を有する赤外線吸収剤を含むことがより好ましい。
また、上記の試料分析チップにおいて、前記第二の基材は、ポリプロピレン、ポリカーボネート、アクリル樹脂のいずれかの樹脂基材であることがより好ましい。
また、上記の試料分析チップにおいて、前記第二の基材の厚みが、０．０５〜０．５ｍｍの範囲にあることがより好ましい。
また、上記の試料分析チップにおいて、前記第一の基材に試料分析チップを回転させるための担特部が設けられていることがより好ましい。
【００２７】
また、本発明の試料分析チップの製造方法は、上記のいずれかに記載の試料分析チップの製造方法であって、前記第二の基材側から赤外線レーザを照射し、前記第一の基材と前記第二の基材とを溶融接着し、張り合わせることを特徴としている。
また、上記の試料分析チップの製造方法において、前記赤外線レーザの波長が、８００〜１２００ｎｍの範囲にあることがより好ましい。
また、上記の試料分析チップの製造方法において、前記第一の基材と前記第二の基材とを張り合わせる前に、前記ウェルに試薬を固定する工程を含むことがより好ましい。
【００２８】
また、本発明の試料分析装置は、上記のいずれかに記載の試料分析チップを設置し、回転させる手段と、前記ウェルでの反応を検出するための検出測定手段と、を有することを特徴としている。
また、本発明の試料分析方法は、上記のいずれかに記載の試料分析チップの前記主流路に溶液を注入する工程と、該試料分析チップを回転させて溶液を前記各ウェルに配液する工程と、を有することを特徴としている。
また、上記の試料分析方法において、前記ウェルに配液する工程の後に、ミネラルオイルを前記各ウェルに配液する工程を有ることがより好ましい。
また、本発明の遺伝子解析方法は、上記のいずれかに記載の試料分析方法を用いたことを特徴としている。
【発明の効果】
【００２９】
本発明による第一の形態の試料分析チップによれば、簡易で機能的、かつ安全安価な試料分析チップを実現することができる。さらに、１種類の検体に対して複数の処理を施すことができる。
【００３０】
また、主流路が各ウェルの間で回転中心に対して一つの山を形成しているので、この主流路の山部で送液が切れ、液分配のムラを低減させることができる。さらには当該流路山部の断面積を小さくすることで、液分配時のムラをより減少させることができる。
【００３１】
さらには、流路山部から隣接する流路山部までの主流路の容積を任意に設計すれば、同等の容量のサンプルを前期流路山部に挟まれた流路谷部から連通するウェルに送液することができるため、使用する溶液試料の量をウェルごとに任意に設定することができる。
【００３２】
また、本発明による第二の形態の試料分析チップによれば、主流路からウェルに遠心力によって送液された際、送液のムラによって所定の分量を越えて送液されたウェルでは、余剰分を廃液チャンバに捨てることができる。そのため、全てのウェルに所望の液量よりも余分に送液すれば、全てのウェルに同じ量の溶液を送液することができることから、配液バラつきを低減することができる。
【００３３】
更に、主流路とウェルとを連通する側路に廃液チャンバに連通する分岐流路を設けることで他のウェルとのサンプルの接触を失くし、コンタミネーションを抑えることができる。
【００３４】
また、本発明の第三の形態に係る試料分析チップによれば、簡易な構成で小型、安価な反応チップを実現することができる。本発明の試料分析チップでは、第一の基材と第二の基材とを組み合わせて、赤外線レーザで融着することにより、チップやチップに固定されている試薬に殆ど影響を与えない密閉型のチップを実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】本発明の第一の形態に係る試料分析チップの一様態の平面図。
【図２】本発明の第一の形態に係る試料分析チップの一様態の平面図。
【図３】本発明の第一の形態に係る試料分析チップの一様態の平面図。
【図４】本発明の第二の形態に係る試料分析チップの一様態の平面図。
【図５】本発明の第二の形態に係る試料分析チップの側路、廃液部及びウェルの配置を示した平面図。
【図６】本発明の第二の形態に係る試料分析チップの一様態の平面図。
【図７】本発明の第二の形態に係る試料分析チップの一様態の平面図。
【図８】本発明の試料分析チップの説明のための斜視図。
【図９】本発明の試料分析チップの説明のための断面図。
【図１０】本発明の第三の形態に係る試料分析チップの斜視図である。
【図１１】本発明の第三の形態に係る試料分析チップを構成する第一の基材の平面図である。
【図１２】本発明の第三の形態に係る試料分析チップの一実施形態における流路とウェルの断面図である。
【図１３】実施例１における検出測定結果のグラフ。
【図１４】実施例１におけるネガティブコントロール測定結果のグラフ。
【図１５】実施例１におけるポジティブコントロール測定結果のグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明の第一の形態の試料分析チップを図面に基づいて説明する。
図１は本発明の試料分析チップの一様態を示した平面図である。本発明のチップは、基材１０１上に複数のウェル１０２と、ウェルに溶液、例えば液体試料（溶液）を送液するための流路を有している。流路は、各ウェルに送液するために、少なくとも各ウェルと連絡する一つの主流路１０３を有し、さらに主流路とウェルをつなぐ側路１０５を有する。流路には溶液を注入するための注入口を有する。図１の様態では、主流路の端部に注入口（ＩＮＬＥＴ）及びもう一方の端部に空気の脱出口を兼ねた余剰溶液の出口（ＯＵＴＬＥＴ）を有している。
【００３７】
本発明の試料分析チップは当該チップを回転させることにより生じる遠心力により、各ウェル１０２に配液するものであることから、中央部に回転軸の貫く点（以下、中心点）のある円盤形状であることが好ましいが、チップを貫く回転軸に対して回転可能に形成されて入れば特に制限はない。円盤形状であれば、その中心が回転軸となるようにして、その円盤形状のチップに同心円状になるようにウェルを配置することができるため、スペースが効率的である。均等にウェルに配液するには遠心力を均等に掛けることが重要であるが、チップを、ＩＮＬＥＴ／ＯＵＴＬＥＴ１０７の領域を除き、中心点を軸とする回転対称性を持つように設計することで容易に実現することができる。すなわち、Ｎ個のウェルがあるとすると、Ｎ回対称となるようにすると、均等に遠心力を掛けることができる。もちろん、各ウェルの配液量を異ならせる場合には、この限りではない。また同心円状にウェルが配置されていることにより、基材を回転させることによって、一箇所の検査領域で全てのウェルの分析が可能である。
【００３８】
主流路１０３はウェルよりも中心点側に形成されている。さらに、本発明の試料分析チップでは、この主流路が、隣り合うウェルの間で中心点方向に一つの山を有するように形成されていることを特徴とする。ここで隣り合うウェルとは、主流路からウェルへの送液流路が前後しているウェルを意味する。また、中心点方向への山を有するとは中心点方向への極大点（主流路山部１０３ａ）を持つことを意味している。このように、隣り合うウェルの間で中心点方向に一つの山を有するように形成することで、主流路に注入された液体が、チップ回転時に主流路山部で自然と途切れるため、各ウェルへの配液量のバラツキを低減することができる。
【００３９】
ウェル１０２と主流路１０３との連絡箇所、即ち主流路１０３と側路１０５との接続箇所は、主流路の山部と山部の間の谷部１３０ｂであることが好ましい。谷部とは主流路の山と山との間で最も中心点から距離が遠い箇所である。この箇所でウェルと主流路を連絡することにより、配液時の主流路への溶液の残留を減らすことができる。
【００４０】
また主流路１０３と、ウェル１０２との連絡口は、後述する試料分析チップを用いた処理方法に記載するように、チップを回転させる前の段階では、ウェルに溶液が浸入しない程度の幅及び断面積である必要がある。
【００４１】
また、ウェル１０２内に空気を残留させないために、ウェルの中心点に最も距離が近い点で主流路と連結することが好ましい。つまり、側路１０５を形成する場合には、ウェル側の中心点に最も近い点と、主流路側の谷部を結ぶように形成することが好ましい。
【００４２】
図２は本発明の試料分析チップの別の一様態を示した平面図である。図２の様態では、主流路の路幅が主流路山部１０３ａで狭く、主流路谷部１０３ｂで広くなっている。主流路山部１０３ａに該当する領域に存在する溶液が少ない方が、配液バラツキが少ないため、山部の主流路の断面積は、他の部分の断面積よりも小さいことが好ましい。したがって、山部の流路幅を狭くする、及び／または、深さを浅くすることが好ましい。また同様の理由で山部に近づくにつれて主流路の断面積が小さくなるようにすることが好ましい。
【００４３】
さらに、主流路谷部１０３ｂの路幅を広げることで、各ウェル１０２への配液量を制御することができる。したがって、図３の試料分析チップのように山と山との間の流路をチャンバ様とし、主流路山部から隣接する主流路山部までの主流路の容積を任意に設計すれば、同等の容量のサンプルを両山部に挟まれた谷部から連通するウェルに送液することができるため、任意量の溶液を各ウェルに設定することが可能である。
【００４４】
またウェル１０２の容積は１μｌ以上１００μｌ以下であることが好ましい。１μｌより小さいと、遠心力が十分に働かず、ウェルへの送液が行われ辛く、また１００μｌよりも大きいと、試薬の混合性が低下したり、ウェル内の温度の均一性が低下する、といった現象が生じる可能性がある．
【００４５】
また図２の様態では、側路１０５は中心点の方向から傾いて形成されている。このように側路を傾斜させて形成することにより、遠心力を掛けたときにウェルの空気が側路の内側に沿って主流路方向へ移動し、一方溶液は側路の外側に沿ってウェル方向へ移動するため、スムーズにウェル内へ溶液を移動させることができる。傾斜させる角度としては、中心点の方向と側路との為す角が１０度から８０度の間であることが好ましい。１０度以下だとウェルからの排気とウェルへの溶液の浸入が干渉して溶液の浸入を阻んでしまう場合があり、８０度を超えると、側路方向への遠心力が弱く、溶液がウェルへ移動しない場合がある。
【００４６】
図３は本発明の試料分析チップのさらに別の一様態である。図３の試料分析チップでは、主流路１０３の山が中心点方向に対して傾いていることで、側路１０５に対して主流路の左右の基材平面での面積が不均等に設計されている。側路１０５に対して左右の主流路が路幅の狭い流路側と、広い流路側が存在し、広い流路側にウェルとの連絡口である側路１０５が形成されていることで、ウェルから側路へ移動した空気と、主流路の溶液の入れ替わり時に面積が大きい主流路側に偏って気泡と液体の入れ替わりが生じる。このため主流路への残液を減らすことができる。したがって、各ウェルに接続する側路及び主流路を上記のような構成とし、主流路が路幅の狭い流路側と、広い流路側が山部を境に交互に形成されるようにすることで、各チャンバ様主流路で同様の現象が同時に生じるために、配液のバラつきを減少する事ができる。
【００４７】
本発明の第二の形態の試料分析チップを図面に基づいて説明する。
図４は本発明の試料分析チップの一様態を示した平面図である。本発明のチップは、基材１０１上に複数のウェル１０２と、ウェルに溶液、例えば液体試料（溶液）を送液するための流路を有している。流路は、各ウェルに送液するために、少なくとも各ウェルと連絡する一つの主流路１０３を有し、さらに主流路とウェルをつなぐ側路１０５を有する。流路には溶液を注入するための注入口を有する。図４の様態では、主流路の端部に注入口（ＩＮＬＥＴ）及びもう一方の端部に空気の脱出口を兼ねた余剰溶液の出口（ＯＵＴＬＥＴ）を有している。
【００４８】
本発明の試料分析チップは当該チップを回転させることにより生じる遠心力により、各ウェル１０２に配液するものであることから、中央部に回転軸の貫く点（以下、中心点）のある円盤形状であることが好ましいが、チップを貫く回転軸に対して回転可能に形成されて入れば特に制限はない。円盤形状であれば、その中心が回転軸となるようにして、その円盤形状のチップに同心円状になるようにウェルを配置することができるため、スペースが効率的である。均等にウェルに配液するには遠心力を均等に掛けることが重要であるが、チップを、ＩＮＬＥＴ／ＯＵＴＬＥＴ１０７の領域を除き、中心点を軸とする回転対称性を持つように設計することで容易に実現することができる。すなわち、Ｎ個のウェルがあるとすると、Ｎ回対称となるようにすると、均等に遠心力を掛けることができる。もちろん、各ウェルの配液量を異ならせる場合には、この限りではない。また同心円状にウェルが配置されていることにより、基材を回転させることによって、一箇所の検査領域で全てのウェルの分析が可能である。
【００４９】
主流路１０３はウェル１０２よりも中心点側に形成されている。主流路１０３と、ウェル１０２との連絡口は、後述する試料分析チップを用いた処理方法に記載するように、チップを回転させる前の段階では、ウェルに溶液が浸入しない程度の幅及び断面積である必要がある。表面張力が関係するため用いる溶液にも拠るが、例えば溶媒が水であるとすると、２×２ｍｍ２以下であればこの条件を満たす。
【００５０】
ウェル１０２の容積は１μｌ以上１００μｌ以下であることが好ましい。１μｌより小さいと、遠心力が十分に働かず、ウェルへの送液が行われ辛く、また１００μｌよりも大きいと、試薬の混合性が低下したり、ウェル内の温度の均一性が低下する、といった現象が生じる可能性がある．
【００５１】
また、ウェル１０２内に空気を残留させないために、ウェルの中心点に最も距離が近い点で主流路と連結することが好ましい。つまり、ウェル側の中心点に最も近い点で、側路１０５とウェルとが接続するように形成することが好ましい。
【００５２】
さらに、本発明の試料分析チップでは、各ウェル１０２と主流路１０３を連絡する側路１０５において、側路ごとに廃液部１０４が設けられている。廃液部は、側路から分岐した廃液分岐流路１０４ａと、廃液分岐流路に連結した廃液チャンバ１０４ｂにより構成することができる。廃液部がウェル１０２と主流路１０３とを連絡する側路に設けられていることにより、ウェルに余剰な溶液が送液された際に、廃液部に余剰溶液が送液されて溜められ、一定の容量の溶液がウェルとウェル分岐流路１０５ａに残される。したがって、余剰溶液による配液バラツキを低減させることができる。
【００５３】
配液の際に、廃液チャンバ１０４ｂよりもウェル１０２が先に溶液で満たされることで、各ウェルに確実に溶液試料を充填することができる。そのために、廃液チャンバ分岐流路よりもウェル分岐流路に送液されやすいようにすることが重要である。
【００５４】
このための方法としては、廃液チャンバ分岐流路１０４ａよりもウェル分岐流路１０５ａの断面積を広くすることで送液時の圧力損失に差が生じ、ウェルに優先的に送液することができる。この手法により、まずウェルが溶液で満たされ、その後余剰溶液を廃液チャンバに送液することができる。したがって、廃液部を断面積の狭い廃液チャンバ分岐流路１０４ａと容量の大きい廃液チャンバ１０４ｂからなる構成とすることで、ウェル分岐流路側に送液されやすく、かつ廃液部の容量を調整することができる。なお余剰溶液の廃液量は、ウェルの容量と、廃液チャンバの容量によって調節することができる。遠心送液時の各ウェル間のばらつきが大きいほど廃液チャンバの容量が必要となる。
【００５５】
また、別の方法としては、廃液チャンバ分岐流路よりもウェル分岐流路の流路内の表面粗さを小さくすることで送液時の圧損に差が生じ、ウェルに優先的に送液することができる。
【００５６】
また、別の方法としては、廃液チャンバ分岐流路の流路表面を撥水処理することにより、送液時の圧損に差が生じ、ウェルに優先的に送液することができる。また逆に、ウェル分岐流路の流路表面を親水処理することにより、送液時の圧損に差が生じ、ウェルに優先的に送液することができる。撥水処理の方法としては、フッ素系材料によるコーティング等が一般的であり、対薬品性も強く、逆に反応への影響も生じない。また、親水処理の手法としてはプラズマ処理やコロナ放電処理などが挙げられ、どちらも一般的な手法と言える。
【００５７】
さらに、側路１０５の形状及び廃液部１０４の配置によってもウェル側の分岐流路に優先的に送液されやすいようにすることができる。図５（Ａ）、（Ｂ）は、側路１０５とウェル１０２、廃液チャンバ１０４ｂおよび廃液チャンバ分岐流路１０４ａからなる廃液部を模式的に示したものである。実線の矢印は中心点の方向（回転中心方向）を示している。
【００５８】
図５の各構成では、側路１０５は回転中心方向から傾いて形成されている。このように側路を傾斜させて形成することにより、遠心力を掛けたときにウェル１０２の空気が側路の内側に沿って主流路方向へ移動し、一方溶液は側路の外側に沿ってウェル方向へ移動するため、スムーズにウェル内へ溶液を移動させることができる。傾斜させる角度としては、中心点の方向と側路との為す角が１０度から８０度の間であることが好ましい。１０度以下だとウェルからの排気とウェルへの溶液の浸入が干渉して溶液の浸入を阻んでしまう場合があり、８０度を超えると、側路方向への遠心力が弱く、溶液がウェルへ移動しない場合がある。
【００５９】
図５（Ａ）図５（Ｂ）では、傾いた側路１０５において、廃液チャンバ分岐流路１０４ａにより廃液部１０４が側路１０５から中心点側で分岐している。図５（Ａ）では側路１０５はウェル１０２に直進しているパターン、図５（Ｂ）では廃液部との分岐点でウェル側の側路（ウェル分岐流路１０５ａ）が折れ曲がっているパターンである。廃液チャンバ分岐流路１０４ａの折れ曲がりは、分岐前の側路の傾きと同じ方向に傾いていれば任意の形状とすることができる。また、廃液量が廃液チャンバ分岐流路部分の容量で十分な場合には、廃液部の末端の廃液チャンバ１０４ｂがなくともよい。
【００６０】
前述のように、溶液に掛かる遠心力により、破線の矢印で示した中心点から外側の流路、すなわちウェル側の分岐流路に先に流れ込むことになり、廃液チャンバ１０４ｂよりもウェル１０２が先に溶液で満たされ、各ウェルに確実に溶液試料を充填することができる。また、図５（Ｂ）のようにウェル側の流路を曲げると、ウェル分岐流路１０５ａ小さく、あるいはウェルを直接側路の分岐箇所で接続することができることから、ウェルに溶液が充填された後、余剰溶液を廃液チャンバに送液するまでの流路が短くなり、ウェルへの配液バラつきをより低減させることができる。
【００６１】
一方、溶液量が所定の容量より少ない場合は、廃液部によって各ウェルの試料容量のバラつきを低減することができないが、主流路の形状を工夫することによって、元々の送液時の送液量のばらつきについても抑えることが可能である。例えば、本発明の第一の形態の試料分析チップと組み合わせた様態の試料分析チップとすることができる。図６および図７に、このような本発明の試料分析チップの別の様態を示した。
なお、下記の様態で説明していない第一の形態の試料分析チップの事項についても、第二の形態と矛盾しない限り、組み合わせて本発明の試料分析チップとすることができる。
【００６２】
図６の試料分析チップでは、主流路１０３が、隣り合うウェルの間で中心点方向に一つの山を有するように形成されている。ここで隣り合うウェルとは、主流路からウェルへの送液流路が前後しているウェルを意味する。また、中心点方向への山を有するとは中心点方向への極大点（主流路山部１０３ａ）を持つことを意味している。このように、隣り合うウェルの間で中心点方向に一つの山を有するように形成することで、主流路に注入された液体が、チップ回転時に主流路山部で自然と途切れるため、各ウェルへの配液量のバラツキを低減することができる。
【００６３】
ウェル１０２と主流路１０３との連絡箇所、即ち主流路１０３と側路１０５との接続箇所は、主流路の山部と山部の間の谷部１３０ｂであることが好ましい。谷部とは主流路の山と山との間で最も中心点から距離が遠い箇所である。この箇所でウェルと主流路を連絡することにより、配液時の主流路への溶液の残留を減らすことができる。
【００６４】
また図６の試料分析チップでは、主流路１０３の路幅が主流路山部１０３ａで狭く、主流路谷部１０３ｂで広くなっている。主流路山部１０３ａに該当する領域に存在する溶液が少ない方が、配液バラツキが少ないため、山部の主流路の断面積は、他の部分の断面積よりも小さいことが好ましい。したがって、山部の流路幅を狭くする、及び／または、深さを浅くすることが好ましい。また同様の理由で山部に近づくにつれて主流路の断面積が小さくなるようにすることが好ましい。
【００６５】
さらに、主流路谷部１０３ｂの路幅を広げることで、各ウェル１０２への配液量を制御することができる。したがって、図２ｂの試料分析チップのように山と山との間の流路をチャンバ様とし、主流路山部から隣接する主流路山部までの主流路の容積を任意に設計すれば、同等の容量のサンプルを両山部に挟まれた谷部から連通するウェルに送液することができるため、任意量の溶液を各ウェルに設定することが可能である。
【００６６】
図７は本発明の試料分析チップの別の一様態である。図７の試料分析チップでは、主流路１０３の山が中心点方向に対して傾いていることで、側路１０５に対して主流路の左右の基材平面での面積が不均等に設計されている。側路１０５に対して左右の主流路が路幅の狭い流路側と、広い流路側が存在し、広い流路側にウェルとの連絡口である側路１０５が形成されていることで、ウェルから側路へ移動した空気と、主流路の溶液の入れ替わり時に面積が大きい主流路側に偏って気泡と液体の入れ替わりが生じる。このため主流路への残液を減らすことができる。したがって、各ウェルに接続する側路及び主流路を上記のような構成とし、主流路が路幅の狭い流路側と、広い流路側が山部を境に交互に形成されるようにすることで、各チャンバ様主流路で同様の現象が同時に生じるために、配液のバラつきを減少する事ができる。
【００６７】
次に第一の実施形態及び第二の実施形態に係る本発明の試料分析チップの製造方法について説明する。
【００６８】
図８は本発明の試料分析チップの構造の一様態を示した斜視図である。
本発明の試料分析チップはウェル及び流路（主流路及び側路を含む）を形成した第一の基材４０１に、第二の基材４０２を貼り合わせることで作製することができる。第一の基材及び第二の基材の少なくとも一方には試料分析装置の具備するチップ回転機構によってチップを回転させるための回転手段として、例えばチップ回転機構に固定するための担持部４０５を有する。また注入口及び空気の脱出口を兼ねた出口（ＩＮＬＥＴ／ＯＵＴＬＥＴ）のための貫通孔を第一の基材及び第二の基材の一方に、少なくとも一つ形成する。貫通孔は基材を貼り合わせたときに主流路の端部に一致する。以下では、説明の便宜上、蛍光反応等を検出、測定する際に測定する面に位置する基材側を「上側」、下側に位置する側を「下側」とする。
【００６９】
基材としては、試料に影響を与えないものであれば特に制限はないが、特にポリプロピレン、ポリカーボネート、アクリルのいずれかを含む樹脂材料を用いれば、良好な可視光透過性を確保することができる。ポリプロピレンとしては、ホモポリプロピレンやポリプロピレンとポリエチレンとのランダム共重合体を使用することができる。また、アクリルとしては、ポリメタクリル酸メチル、または、メタクリル酸メチルとその他のメタクリル酸エステル、アクリル酸エステル、スチレンなどのモノマーとの共重合体を使用することができる。また、これらの樹脂材料を使用する場合、チップの耐熱性や強度を確保することもできる。樹脂材料以外としては、アルミニウム、銅、銀、ニッケル、真鍮、金等の金属材料を挙げることができる。金属材料を用いた場合、加えて熱伝導率及び封止性能に優れる。なお貼り合わせる基材のうち少なくとも上側基材のウェル底部を透明とすることで、蛍光等の検出・分析を外部から行うことができる。なお本発明における「透明」及び「光透過性」とは、検出光の波長領域での平均透過率が７０％以上であるものとする。可視光領域（波長３５０〜７８０ｎｍ）で光透過性材料の材料を用いれば、チップ内での試料状態の視認が容易であるが、これに限られるわけではない。
【００７０】
ウェル及び流路、廃液部を形成する基材の加工方法としては、樹脂材料の場合には、射出成形、真空成形等の各種樹脂成形法や、機械切削などを用いることができる。金属材料の場合には、厚手の基材を用いた研削加工やエッチング、薄手の金属シートにプレス加工や絞り加工を施すことで形成することができる。
【００７１】
また、第１の基材として特にポリプロピレン、ポリカーボネート、アクリルのいずれかを含む樹脂材料を用いた場合、良好な光透過性、耐熱性、強度を確保することができる。また、第１の基材の厚みが５０μｍ〜３ｍｍの範囲にある場合、良好な光透過性、耐熱
性、強度を確保でき、凹部の加工を確実に行うことができる。
【００７２】
また、第２の基材の厚みが１０μｍ〜３００μｍの範囲にある場合、第２の基材の熱伝導性及び封止性の双方を満足することができる。第２の基材の厚みが３００μｍよりも大きいと、熱容量が大きくなり、熱応答性が低下するおそれがある。
【００７３】
図９に本発明の試料分析チップの断面図を示した。第一の基材４０１には、チップを貫通する溶液の注入口２０３と、注入液がチップに流れ込むための主流路となる溝１０３と、チップの外周部に延びた各ウェルと連通する側路となる溝１０５と、チップの外周部のウェルとなる窪み１０２とが成形されている。なお図５の断面図は注入口（ＩＮＬＥＴ／ＯＵＴＬＥＴ）からウェルまでの経路を模式的に示したものであり、主流路及び側路の形状はこれに限られない。注入される溶液をすべてのウェルに充満するためには、主流路の容積は、各ウェルの容積の合計より大きい必要がある。ただし、ウェルに試薬５０１が固定されている場合、その分反応ウェルに入れる液体試料の量が減るため、流れ込む流路の容積をその分減少してもよい。蛍光反応や測定のため、第一基材側で検出測定を行なう場合には、ウェルの凹部が光を散乱させない平滑な形状となっていることが好ましい。
【００７４】
基材を貼り合わせる前に、ウェル１０２に反応用の試薬５０１を固定する。各ウェルで異なる試薬を用いることができる。各反応ウェルにそれぞれ異なる試薬を固定することによって、１つ検体（試料）に対して複数の処理を施すことができる。また、実際反応を行うための試薬の一部を各ウェルに固定し、残りの試薬は液体試料と一緒に導入するようにしてもよい。
【００７５】
試薬５０１の固定方法としては、例えば第１の基材のウェル部分に液体試薬をピペット等で滴下し、第一の基材４０１を遠心装置で２０００〜３０００ｒｐｍ、５分程度遠心することで適量の液体試薬が液面を平坦な状態で残存するようにして、これを乾燥させることでウェルに固定することができる。
【００７６】
また、試薬をウェルに固定した後、ワックス５０２を滴下してもよい。具体的には、ワックスをホットプレート上に溶融させ、ピペットを用いて乾燥させた試薬を覆うように滴下する。このとき、ワックスは数秒で固化する。ワックスは、試薬をウェルの凹部に固定させる役割を有する。
【００７７】
基材の貼り合わせ方法としては、一方の基材に接着層として樹脂コーティング層を設け、これを溶融させて両基材を接着する方法が挙げられる。樹脂コーティング層は、熱伝導率の高い金属材料基材に設けて溶融接着することが好ましい。樹脂コーティング層の材料としては、ＰＥＴやポリアセタール、ポリエステルやポリプロピレン等の樹脂材料を用いることができる。
【００７８】
この貼り合わせ方法においては、微細加工しやすく、蛍光測定に好適な光透過性の樹脂材料を第一の基材に用い、第二の材料としては熱伝導率が高く樹脂コーティング層を設けて溶融接着による貼り合わせが容易な金属材料を用いることが好ましい。また金属基材表面に樹脂コーティング層を形成することにより、材料を選定する際に金属基材自体の耐薬品性は考慮しなくて良い。
【００７９】
また、基材表面に樹脂コーティング層を形成する際、樹脂コーティング層の下地としてアンカー層を形成することによりレーザを用いた融着が可能である。アンカー層にはレーザ波長光を吸収するカーボンブラック（光吸収性材料）が練り込まれており、レーザ光を照射することにより発熱して樹脂コーティング層を溶融接着することができる。あるいは、アンカー層にカーボンブラックを添加することに代えて、樹脂コーティング層にカーボンブラックを添加したり、樹脂コーティング層の表面を黒色に塗装したりしても良い。例えば波長９００ｎｍ程度の赤外光フォトダイオードレーザーの光を照射することによっても樹脂コーティング層を効率良く溶融することができる。レーザ溶着は、熱溶着と異なり、チップを加熱する必要がないことから、チップやチップに固定されている試薬に殆ど影響を与えずに 基材の貼り合わせをすることができる。
【００８０】
本発明の第三の形態の試料分析チップ及びその製造方法を図面に基づいて説明する。
なお、説明の便宜上、蛍光反応等を検出、測定する際に測定する面の側に位置する基材側を「上側」、下側に位置する側を「下側」とする。
【００８１】
図１０は、本発明の第三の形態に係る試料分析チップの斜視図である。図１０に示した本発明の試料分析チップの形態では、上側の第一の基材４０１’と、下側の第二の基材４０２’の２つの部材を組み合わせて形成されており、第一の基材には試薬等の溶液を送液するための流路と、溶液と試薬類とを反応させるためのウェルが形成されている。また第一の基材又は第二の基材に、形成された流路に溶液を注入するために注入口及び空気の脱出口を兼ねた出口として少なくとも一つの貫通孔４０３が設けられている。
【００８２】
図１１に、第一の基材上に形成されたウェル１０２及び流路（主流路又は注入部１０３、側路１０５）の例を示した。本発明のチップは、基材１０１上の外周部の複数のウェル１０２と、ウェルに溶液、例えば液体試料を送液するための流路を有している。流路は図１１Ａ又は図１１Ｂのような形状で注入口から溶液を注入する主流路又は注入部１０３と、各ウェルに配液するために主流路又は注入部とウェルとを連絡する側路１０５を有する。
【００８３】
また、本発明の第三の形態に係る試料分析チップは、矛盾しない限り、第一の形態及び第二の形態に係る本発明の事項と組み合わせて本発明の試料分析チップとすることができる。例えば、主流路１０３の形状を第一の形態で示した波状の形状としてもよく、あるいは側路１０５に廃液部を有する形状としても良い。また、第一の形態あるいは第二の形態以外の構成と組み合わせても良い。
【００８４】
本発明の試料分析チップは当該チップを回転させることにより生じる遠心力により、各ウェル１０２に配液するものである。遠心力による送液の利点は、各ウェル１０２に排気のための開口部を設置する必要がなく、遠心力によって、溶液試料と各ウェルにある空気を置換してウェルに入ることができることである。このことによりウェルの密閉性を高めることができ、外部からの汚染を防ぐことができる。チップを回転させることから、チップの形状は中央部に回転軸の貫く点（以下、中心点）のある円盤形状であることが好ましいが、チップを貫く回転軸に対して回転可能に形成されて入れば特に制限はない。円盤形状であれば、その中心が回転軸となるようにして、その円盤形状のチップに同心円状になるようにウェルを配置することができるため、スペースが効率的であるまた同心円状にウェルが配置されていることにより、基材を回転させることによって、一箇所の検査領域で全てのウェルの分析が可能である。
【００８５】
外部の回転機構によりチップを回転させるための回転手段として、例えば図１０で示したような担持部４０５が第一の基材に設けられている。
【００８６】
本発明の試料分析チップは、第１の樹脂基材４０１’が、可視光を透過する光透過性樹脂基材であり、また第２の樹脂基材４０２’は、赤外線透過性を有する。このような構成とすることで、赤外線レーザによって第一の基材の第二の基材との界面の部分を溶融し、接着することにより製造することが可能である。レーザ溶着は、熱溶着に比べ、チップ製造時に、チップやチップに固定されている試薬に殆ど影響を与えないことが最大の利点である。感圧接着剤の使用に比べて、接着剤によるウェル内の試薬の汚染がなく、溶着したチップの耐熱性や耐水性を十分に確保することができる。以下、さらに詳細に説明する。
【００８７】
ウェルの蛍光測定を行うためには、測定する面の側に位置する第一の基材４０１’の少なくともウェル１０２部分が７５０ｎｍ以下の可視光を透過する光透過性を有することが必要である。少なくとも蛍光波長において５０％以上の平均透過率であることが好ましく、より好ましくは７０％以上の平均透過率である。このため、第一の基材としてポリプロピレン、ポリカーボネート、アクリルのいずれかを含む樹脂材料を用いることが好ましい。これらの材料を用いることで、良好な可視光透過性を確保することができる。ポリプロピレンとしては、ホモポリプロピレンやポリプロピレンとポリエチレンとのランダム共重合体を使用することができる。また、アクリルとしては、ポリメタクリル酸メチル、または、メタクリル酸メチルとその他のメタクリル酸エステル、アクリル酸エステル、スチレンなどのモノマーとの共重合体を使用することができる。また、これらの樹脂材料を使用する場合、チップの耐熱性や強度を確保することもできる。
【００８８】
また、第一の基材４０１’の厚みが０．０５ｍｍ〜３ｍｍの範囲にある場合、良好な可視光透過性、耐熱性、強度を確保でき、流路とウェルの加工を確実に行うことができる。なお、第一の基材は射出成形、真空成形等の各種樹脂成形法や、機械切削などを用いることができる。第一の基材側にウェル１０２、流路及び担持部４０５を形成することによって、赤外線照射側である第二の基材を板状あるいはフィルム状の基材とすることができ、後述のように、融着ムラのない張り合わせが可能である。また第一の基材の少なくともウェルの底部は、蛍光反応等の光学測定のため、平坦な面を形成する。
【００８９】
また、赤外線レーザで第一の基材４０１と第二の基材４０２’を溶着する際、レーザ溶着の効率を上げるため、第一の基材は赤外線レーザに対して光吸収性であることが好ましい。特に第一の基材の少なくとも張り合わせ面を含む一部が赤外線吸収することにより、樹脂を溶融させ、接着することが容易である。
【００９０】
また第一の基材４０１’に赤外線吸収剤を含有することによって、赤外線レーザ光を吸収し、赤外線の光エネルギーを熱エネルギーに変換する効率を上げることができる。また赤外線吸収剤を含有させることで赤外線部分に吸収がない樹脂を用いることができる。赤外線レーザ光は、一般的に７５０ｎｍ以上の波長を有する半導体レーザを使用することによって得られる。したがって、赤外吸収剤としては、７５０ｎｍ以上の領域に最大吸収波長を有する化合物、いわゆる色素化合物を使用することができる。色素化合物は、一般的に染料と顔料の２つの種類に分けることができるが、樹脂基材との相溶性や透明性の観点から、染料タイプのものが好ましい。さらに可視光領域の透明性を確保するため、できるだけ７５０ｎｍ以下の可視領域に吸収の少ない赤外線吸収剤が好ましい。具体的な例としては、ＢＡＳＦ社のＬｕｍｏｇｅｎ（登録商標）ＩＲ７６５、Ｌｕｍｏｇｅｎ（登録商標）ＩＲ７８８などが挙げられる。
【００９１】
例えば、ポリプロピレンを樹脂基材として使用される場合、ポリプロピレンは赤外線部分に吸収がないため、プロピレン樹脂に赤外線吸収剤を添加することが必要である。具体的には、一例として、予めプロピレン樹脂１００重量部に対して赤外線吸収剤を０．０１重量部添加し、コンパウンドし赤外線吸収剤含有のプロピレン樹脂ペレットを作製する。これを用いて射出成形によって本実施形態の試料分析チップの第一の基材が作製される。また、予めプロピレン樹脂１００重量部に対して赤外線吸収剤を０．１重量部添加し、赤外線吸収剤含有のプロピレン樹脂マスターバッチを作製する。そして、射出成形を行う際、前記の赤外線吸収剤含有のプロピレン樹脂マスターバッチとプロピレン樹脂との一定の割合で混合して射出成形を行うことによって、赤外線吸収剤の含有量を調整することができる。
【００９２】
第二の基材４０２’としては、赤外線レーザに対して透過性を有することが必要である。第二の基材に用いる材料としては、第一の基材と同じ又は近い組成を有する樹脂が好ましい。例えば、第一の基材にポリプロピレンを使う場合、第二の基材はホモポリプロピレンやポリプロピレンとポリエチレンとのランダム共重合体が好ましい。組成の同じ又は近い樹脂同士は、一般的に接着しやすい。また、組成の同じ又は近い樹脂は、普通溶融温度の差が小さい。これによって、レーザ溶着の効果を挙げることができる。
【００９３】
第二の基材４０２’は、第一の基材と同様な方法でウェル１０２、流路及び担持部４０５を形成することが可能であるが、両面が平滑面の板状あるいはフィルム状の基材であることが好ましい。板状あるいはフィルム状の基材であれば、基材の膜厚差等に起因する融着ムラがなく第一の基材と第二の基材を密着性よく張り合わせるができる。また、第二の基材の厚みは、０．０１ｍｍ〜２ｍｍ、より好ましくは、０．０５〜０．５ｍｍの範囲にあれば、第二の基材の溶着性や強度を確保することができる。さらに、第二の基材は、ヒートブロックと接するため、前記の厚みであれば、十分な熱効率を得ることができる。
【００９４】
図１２は、図１１Ｂの試料分析チップの破線Ｓでの断面図である。注入される液体試料をすべてのウェルに充満するため、注入口と連通している主流路の容積は、各ウェルの容積の合計より大きい必要がある。ただし、ウェルに試薬が固定されている場合、その分ウェルに入れる液体試料の量が減るため、主流路の容積をその分減少してもよい。
【００９５】
図１２に示す本発明の試料分析チップでは、各ウェルに試薬が固定されている。各ウェルにそれぞれ異なる試薬を固定することによって、１つ検体（試料）に対して複数の処理を施すことができる。また、実際反応を行うための試薬の一部を各ウェルに固定してもよい。残りの試薬は液体試料と一緒に導入することができる。
【００９６】
基材を張り合わせる前に、ウェル１０２に反応用の試薬５０１を固定する。各ウェルで異なる試薬を用いることができる。各反応ウェルにそれぞれ異なる試薬を固定することによって、１つ検体（試料）に対して複数の処理を施すことができる。また、実際反応を行うための試薬の一部を各ウェルに固定し、残りの試薬は液体試料と一緒に導入するようにしてもよい。これによって、チップの保存性が向上すると共に各ウェルに異なる反応を行うことができ、複数の検査を同時に施すことができる。
【００９７】
試薬５０１の固定方法としては、例えば第１の基材４０１’のウェル部分に液体試薬をピペット等で滴下し、第一の基材を遠心装置で２０００〜３０００ｒｐｍ、５分程度遠心することで適量の液体試薬が液面を平坦な状態で残存するようにして、これを乾燥させることでウェルに固定することができる。
【００９８】
さらに、試薬をウェルに固定した後、ワックス５０２を滴下してもよい。具体的には、ワックスをホットプレート上に溶融させ、ピペットを用いて乾燥させた試薬を覆うように滴下する。このとき、ワックスは数秒で固化する。ワックスは、試薬をウェルの凹部に固定させる役割を有する。
【００９９】
次に、本発明の試料分析チップにおいては、第一の基材側４０１’のウェル１０２の窪みに試薬を固定した後、赤外線レーザで第一の基材と第二の基材４０２’とを溶着させることによって、密閉型のチップが製造される。赤外線レーザとしては、第一の基材表面を溶融させることができれば特に制限はないが、赤外線の波長としては８００〜１２００ｎｍがレーザ溶着に好都合で好ましい。実用的な観点から、レーザ溶着機の出力は３０以上であることが好ましい。例えば、出力３０〜２５０Ｗのレーザ機は一般的に市販されているので、これらのレーザ機を使えば特に問題ない。具体的には、第一の基材と第二の基材を貼り合せて、例えば波長８０８ｎｍ程度の赤外光フォトダイオートレーザを用いて、第二の基材側からレーザビームを一定の速度でスキャンしチップを照射することによって、第一の基材を第二の基材が溶着される。レーザの出力パワーとスキャン速度を調整することによって、レーザ溶着は効率よく行うことができる。以上の工程で、試料分析チップの製造が完了する。
【０１００】
次に本発明の各実施形態の試料分析チップを用いた試料分析方法について説明する。
【０１０１】
本発明の試料分析チップは、例えば、ＤＮＡ、たんぱく質等の試料において生化学物質の検出や分析に用いることができる。各ウェル１０２に試薬を固定し、液体試料を各ウェルに配液する。この場合には各ウェルで異なる試薬を用いることができる。あるいは試料を各ウェルに固定し、液体試薬を各ウェルに配液する。この場合には各ウェルで異なる試料を用いることができる。
【０１０２】
次に第一の基材４０１と第二の基材４０２を貼り合わせた本発明の試料分析チップに対して、まず、注入口４０３（１０７）から試薬等の溶液を主流路１０３に注入する。この段階では、主流路のみが溶液で満たされ、前述のように側路には浸入していない。これは、溶液の表面張力と、ウェル側には空気の抜け穴がないことによりウェル側からの空気圧があるためである。試料分析方法に用いる試料分析装置にはこのような溶液注入手段を備えていてもよい。
【０１０３】
次に、試料分析方法に用いる試料分析装置には試料分析チップを回転させるためのチップ回転機構を有する。チップ回転機構には、公知一般の遠心装置を用いることができる。試料分析装置に試料分析チップを設置し、回転機構によりチップの中心点でチップの垂直方向を回転軸として、チップを回転させる。回転速度としては溶液に掛かる遠心力が前述の空気圧と表面張力に打ち勝って、ウェルに流入する回転速度が必要である。チップの形態にも寄るが、約１０００ｒｐｍ以上であることが好ましい。チップの回転速度が約１０００ｒｐｍより小さいと、ウェルに溶液が流入せず、液量が一定にならないおそれがある。
【０１０４】
液体試料の配液後、試料・試薬の反応を阻害しないオイルを同様の工程で各ウェルに配液してもよい。オイルの注入によって、反応中に液の蒸発を防ぐことができる。オイルには先に配液した溶液よりも比重が軽いものを用いる必要がある。チップを回転させ、遠心力によって配液した際に、側路側で各ウェルの栓の役割をするためである。オイルの種類としては、試料・試薬の反応を阻害しないものであれば特に制限はないが、ミネラルオイルやシリコンオイルを好適に用いることができる。
【０１０５】
ワックス５０２を試薬の固定に用いる場合には、試料分析装置に電熱線等からなるヒータやペルチェ素子を用いた温度制御手段を備えていてもよい。ワックスの融点以上にチップを加熱することでワックスを溶融させ、ウェル内で試薬と溶液（試料）を混合させることができる。また当該温度制御手段は、例えばＰＣＲ反応等の試薬の反応制御にも用いることができる。
【０１０６】
その後、ウェルで試薬及び試料を混合し、反応状態を蛍光検出等の手法によって分析することができる。試料分析装置は、試料分析チップの基材上側のウェルの位置で測定を行なうための検出測定手段を有する。回転機構によりチップを回転させて、所定のウェルを測定することができる。本発明の試料分析チップでは基材の上側を透明とすることで、チップの外部から光学的測定を行なうことが可能である。
【０１０７】
以上のように各工程で試料分析チップに作用させる機構を備えることで、省スペースかつ試料分析の容易な試料分析装置とすることができる。
【０１０８】
次に本発明の試料分析方法の例を説明する。
【０１０９】
遺伝子解析の１例としては、例えば体細胞変異の検出や、生殖細胞変異の検出が挙げられる。遺伝子型の違いによって、発現するタンパク質の種類等が異なるため、例えば薬の代謝酵素の働きの違いを生み、結果として薬の最適投与量や副作用の出やすさ等に個人差が生じる。この事を医療現場で利用し、各患者の“遺伝子型”を調べる事で、オーダーメイド医療を行うことが出来る。
【０１１０】
・ＳＮＰｓの検出
ヒトゲノムの中には、その約０．１％に個人特有の塩基配列の違いが存在し、ＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）と呼ばれおり、生殖細胞変異のひとつである。ＳＮＰの特定方法の一つとして、例えば蛍光を用いたＰＣＲ‐ＰＨＦＡ（ＰＣＲ−Ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｈｏｍｏｄｕｐｌｅｘ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）法が利用されている。ＰＣＲ‐ＰＨＦＡ法は検出変異部位を増幅するＰＣＲ工程と、増幅断片と対応プローブによる競合的鎖置換反応工程から成り立っている。当該方法によれば、蛍光試薬の発光差によって変異を検出するが、本発明の試料分析チップを用いることで、各ウェルの配液バラツキが少ないため、正確なＳＮＰｓ検出を行うことが出来る。また上記以外のＳＮＰ検出方法としてインベーダー法（登録商標）、Ｔａｑｍａｎ ＰＣＲ法等についても同様に本発明の試料分析チップを用いることが可能である。
【０１１１】
以下に、本発明を用いてワルファリン（抗血液凝固剤。心臓病や高血圧用の薬として用いられる）に対する副作用に関与するＳＮＰついてＰＣＲ‐ＰＨＦＡ法を使った解析例を説明する。
【０１１２】
血液などから得られる検体核酸を精製して、溶液試料とする。本発明の試料分析チップに注入前または注入後配液前に、検体核酸の増幅を行なう。なお、ワルファリンに関与するＳＮＰの検出にはＶＫＯＲＣ１やＣＹＰ２Ｃ９内のＳＮＰが議論されることが多く、ＣＹＰ２Ｃ９＊２やＣＹＰ２Ｃ９＊３などが有名である。検体からこれらのＳＮＰを含む遺伝子断片をマルチプレックスＰＣＲにて増幅する。
【０１１３】
上記の検出方法では、一つのＳＮＰを判定するために２つの検出用のウェルが必要となるので１検体試料につき１０個以上のウェルが形成された試料分析チップを使用すると良く、それぞれのウェルに競合的鎖置換反応を行うためのＳＮＰ検出用の試薬を固定する。
【０１１４】
上記ＰＣＲにより核酸が増幅された試料を、各ウェルに配液充填する。各ウェルを温調し、前記試薬に混入された蛍光試薬の発光差によって変異を検出する。一つのＳＮＰに対し２つのウェルのうち一つのみ陽性反応ならばホモ、二つ陽性ならヘテロと判定することができる。
【０１１５】
・Ｋ‐ｒａｓ遺伝子変異の検出
上がん細胞に特徴的な変異、また分子標的薬に抵抗性を示す変異はそのほとんどが体細胞変異である．生殖細胞変異（ＳＮＰなど）の場合、どの細胞でも共通の変異が見られるのに対し、体細胞変異では変異を起こした細胞でのみ変異がみられ、変異を起こしていない細胞（通常は正常細胞）では変異は見られない．
【０１１６】
つまり、試料のうちの多くは正常細胞で一部変異細胞が含まれる場合、多くの正常な遺伝子中に存在するわずかな変異遺伝子を検出しなければならず、この点が生殖細胞における変異検出と異なる点で、体細胞の遺伝子変異検出をより困難にしている点である．
【０１１７】
Ｋ‐ｒａｓ遺伝子は変異ががん細胞に存在すると分子標的薬がほとんどの患者群で奏効しないことが示された遺伝子であり、この遺伝子を簡便、迅速、安価、高精度に検出することが希望されつつある。
【０１１８】
以下に、Ｋ‐ｒａｓ遺伝子のＰＣＲ‐ＰＨＦＡ法での解析例を説明する．
【０１１９】
上記遺伝子変異の検出用のウェルにはプローブ核酸を含む試薬が固定される。Ｋ‐ｒａｓ遺伝子の検出は野生型と１３種類の変異があるので少なくとも１４のウェルが形成された本発明の試料分析チップを使用し、当該ウェルのそれぞれに対応した試薬が固定化されていることが好ましい。
【０１２０】
大腸癌などのがん細胞を採取し、検体核酸を精製して、溶液試料とする。本発明の試料分析チップに注入前または注入後配液前に、検体核酸の増幅を行なう。
【０１２１】
上記ＰＣＲにより核酸が増幅された試料を、各ウェルに配液充填する。ウェルを温調し、前記試薬に混入された蛍光試薬の発光差によって変異を検出することができる。
【０１２２】
（実施例）
以下に本発明における実施例を示すが本発明はこれらに限定されるものではない。
【０１２３】
＜実施例１＞
実施例１では、本発明の試料分析チップをＳＮＰｓ解析チップとして用いた例を示す。
ＳＮＰｓチップ基材として、ポリプロピレン樹脂を用いて、図２に示すような円盤状の外形を持ち、同心円上に波状の主流路１０３と、主流路谷部１０３ｂに連絡口を持つ側路１０５と、側路の末端にウェル１０２を有するチップを射出成形により形成した。この基材（ポリプロピレン基材）にはそれぞれ２３個のウェル及び側路が形成されている。また主流路は周期的に面積を変え、隣接する主流路山部１０３ａの間の主流路の容積は１２μｌとなるように設計した。
【０１２４】
上記ポリプロピレン基材と貼り合わせる第二の基材として、樹脂コーティング層としてポリプロピレン樹脂がコーティングされたアルミシート基材を用いた。樹脂コーティング層には、厚みが約０．０７ｍｍのものを使用した。樹脂コーティング層は融点が１２０度前後であり、アルミニウム側に熱を与えれば溶融するように該アルミ基材にコーティングされている。
【０１２５】
さらに、アルミニウム層と樹脂コーティング層の間にカーボンを練りこんだアンカー層が設けられ、レーザ光照射による発熱でも樹脂コーティング層が溶融する構成となっている。
【０１２６】
該ポリプロピレン基材上のウェルにはインベーダー反応用プローブ試薬とＤＮＡポリメラーゼ、クリベースといった酵素類をピペットで滴下し乾燥固定させた。
【０１２７】
該ポリプロピレン基材と該アルミ基材を重ね合わせ、アルミ基材側に１３０度以上の熱を加えることで、該樹脂コーティング層を溶融させて該ポリプロピレン基材とアルミ基材を溶着した。
【０１２８】
上記の工程で作製したチップに、精製されたゲノムを加えたバッファ溶液を溶液試料としてピペットにて送液し、主流路１０３に充填した。この段階ではウェル及び側路には試料は浸入していなかった。
【０１２９】
なお上記各試薬類は下記表１に記載した分量で用いた。
【０１３０】
【表１】
【０１３１】
送液後、５０００ｒｐｍにてチップ中心を軸としてチップを回転させたところ、各ウェルには１１μｌの試料が送液された。チップに遠心力を与える手段として、化学、生物反応における試薬の分離などに用いられる卓上小型遠心機を利用した簡易な遠心装置を作成し、これを用いた。遠心時の回転数は回転数測定器にて測定して調整した。
【０１３２】
なお、遠心時のチップの回転方向に関しては、側路の傾き方向に対していずれの方向に回転させた場合でも回転数の増加中はチップ内の液挙動に影響を及ぼすが、ウェルの配液のばらつきに影響しない事が確認できた。
【０１３３】
続いて、反応に阻害の無いミネラルオイルを同様の手法で送液したところ、試料はウェルを満たし、残った溶液で側路の半分程度を満たし、オイルは側路の残り半分と流路谷の８割を満たした。
【０１３４】
なお、本実施例はウェル２２箇所に反応用試薬としてインベーダー反応用プローブを固定した。また、反応結果の成否を判定するために、コンタミネーションの有無の確認としてネガティブコントロールを１箇所に設定し、１枚のチップ上で反応試験を行った。
【０１３５】
該反応容器がオイルによって独立した状態の試料分析チップに９５℃と６８℃を交互に３５サイクルかけ、ＰＣＲ反応によってサンプルのゲノムを増幅する。続いて、６３℃で３０ｍｉｎ温調することにより、酵素反応によりウェル内で蛍光検出反応を生じる。
【０１３６】
また、このときチップのポリプロピレン基材側は透明であることから、蛍光検出をポリプロピレン基材を通して外部から行った。本実施例では光電子増倍管と光ファイバを組み合わせた蛍光検出装置によって上記蛍光反応を測定した。
【０１３７】
図１３及び１４は本実施例によって検出された蛍光反応によるＳＮＰｓの解析結果のグラフである。各グラフの縦軸は検出された光の強度であり、蛍光の強度を示す。横軸は時間軸である。
【０１３８】
図１３は反応を行った１つのウェルの結果であり、所定の時間内に混合した試薬類による蛍光検出反応が生じていることが確認された。
【０１３９】
図１４は試薬類をあらかじめ固定していないウェルのため、蛍光反応は検出されなかった。これにより両隣からのコンタミネーションは生じていないことが確認された。
【０１４０】
また、図１５はポリプロピレン製のチューブにて一般的な手法で最適の分量比で試薬類とサンプルを混合して得られた検出データである（ポジティブコントロール）。図６と図８を比較すると、図１５が示す本実施例によるチップ内の反応は図８の反応と一致していることから、本実施例では最適な分量比による反応であることが確認できる。これにより、所望した量のサンプルを配液できていることが分かる。
【０１４１】
本実施例１のように本発明では貼り合わせる基材を反応に合った材質で選定することで、より簡易に、かつ短時間で効率よく反応工程を行うことが可能となった。
【０１４２】
＜実施例２＞
実施例２として、別の流路の形状の本発明試料分析チップの検討を行なった。
【０１４３】
本実施例では、図３に示した形状の試料分析チップを作製した。実施例１では生化学反応の阻害物質の混合を防ぐために耐薬品性の高いポリプロピレン樹脂を射出成形することによりチップを製作したが、流路形状の検討を行うために今回はアクリル樹脂をφ６ｍｍからφ０．４ｍｍまでのエンドミルによって機械切削加工し、流路形状を形成した。
【０１４４】
実施例１で使用した図２の形状の試料分析チップ（チップ１）及び上記図３の形状の試料分析チップ（チップ２）にブロモフェノールブルー色素で色付けをした純水を主流路に送液し、実施例１同様に５０００ｒｐｍで円形状のチップの中心を軸に回転させ、１０回の試行でばらつきを計測した。なお、いずれの試料分析チップも各ウェルに均等に送液されたと想定した場合の液量は１２μｌである。
【０１４５】
チップ１では、送液量は最小値で９．５μｌ、最大値で１４．０μｌであった。これに対し、チップ２でのばらつきは最小値で１１．０μｌ、最大値で１２．５μｌとなり、配液量のばらつきをさらに大きく抑制できる事が示された。
【０１４６】
＜実施例３＞
実施例３における本発明に係る試料分析チップの第一の基材４０１として、ポリプロピレン樹脂を用いて、図７に示すような円盤状の外形を持ち、同心円上に波状の主流路１０３と、主流路谷部１０３ｂに連絡口を持つ側路１０５と、側路の末端にウェル１０２を有し、さらに側路から分岐したウェル分岐流路１０５ａと廃液チャンバ分岐流路１０４ａ、及び廃液チャンバ１０５ｂを有するチップを射出成型により形成した。この基材（ポリプロピレン基材）にはそれぞれ２３個のウェル及び側路が形成されている。主流路は周期的に面積を変え、主流路の山と山の間の谷部１０３ｂの容積は１５μｌとなるように設計し、また、ウェル分岐流路の容積が、２μｌ、ウェルの内容積が１１μｌ、廃液チャンバの容積が５μｌとなるように設計した。
【０１４７】
上記ポリプロピレン基材と貼り合わせる第二の基材４０２として、樹脂コーティング層としてポリプロピレン樹脂がコーティングされたアルミシート基材を用いた。樹脂コーティング層には、厚みが約０．０７ｍｍのものを使用した。樹脂コーティング層は融点が１２０度前後であり、アルミニウム側に熱を与えれば溶融するように該アルミ基材にコーティングされている。
【０１４８】
さらに、アルミニウム層と樹脂コーティング層の間にカーボンを練りこんだアンカー層が設けられ、レーザ光照射による発熱でも樹脂コーティング層が溶融する構成となっている。
【０１４９】
該ポリプロピレン基材上のウェルにはインベーダー反応用プローブ試薬とＤＮＡポリメラーゼ、クリベースといった酵素類をピペットで滴下し乾燥固定させた。
【０１５０】
該ポリプロピレン基材と該アルミ基材を重ね合わせ、アルミ基材側に１３０度以上の熱を加えることで、該樹脂コーティング層が溶融させて該ポリプロピレン基材とアルミ基材を溶着した。
【０１５１】
上記の工程で作製したチップに、精製されたゲノムを加えたバッファ溶液を溶液試料としてピペットにて送液し、主流路１０３に充填した。この段階ではウェル及び側路には試料は浸入していなかった。
【０１５２】
なお上記各試薬類は実施例１の表１に記載した分量と同様の分量で用いた。
【０１５３】
送液後、５０００ｒｐｍにてチップ中心を軸としてチップを回転させたところ、各ウェルとウェル分岐流路が満たされ、廃液チャンバには０．５μｌ〜３μｌの溶液が溜められた。各ウェルには１１μｌの試料が送液された。チップに遠心力を与える手段として、化学、生物反応における試薬の分離などに用いられる卓上小型遠心機を利用した簡易な遠心装置を作成し、これを用いた。遠心時の回転数は回転数測定器にて測定して調整した。
【０１５４】
なお、遠心時のチップの回転方向に関しては、側路の傾き方向に対していずれの方向に回転させた場合でも回転数の増加中はチップ内の液挙動に影響を及ぼすが、ウェルの配液のばらつきに影響しない事が確認できた。
【０１５５】
続いて、反応に阻害の無い試薬類表（表１）記載のミネラルオイルを同様の手法で送液したところ、試料はウェルを満たし、残った溶液で側路の半分程度を満たし、ミネラルオイルはウェル分岐流路と廃液チャンバ分岐流路及び側路を完全に満たし、主流路の一部を満たした。
【０１５６】
なお、本実施例はウェル２２箇所に反応用試薬としてインベーダー反応用プローブを固定した。また、反応結果の成否を判定するために、コンタミネーションの有無の確認としてネガティブコントロールを１箇所に設定し、１枚のチップ上で反応試験を行った。
【０１５７】
該反応容器がオイルによって独立した状態の試料分析チップに９５℃と６８℃を交互に３５サイクルかけ、ＰＣＲ反応によってサンプルのゲノムを増幅する。続いて、６３℃で３０ｍｉｎ温調することにより、酵素反応によりウェル内で蛍光検出反応を生じる。
【０１５８】
また、このときチップのポリプロピレン基材側は透明であることから、蛍光検出をポリプロピレン基材を通して外部から行った。本実施例では光電子増倍管と光ファイバを組み合わせた蛍光検出装置によって上記蛍光反応を測定した。
【０１５９】
測定の結果、実施例１と同様に、各ウェルに配液された試薬により、所定の時間内に混合した試薬類による蛍光検出反応が生じていることが確認され、一般的な手法で最適の分量比で試薬類とサンプルを混合して得られた検出データと同様の結果が得られた。また、ネガティブコントロールのウェルでは、蛍光反応は検出されなかった。これにより両隣からのコンタミネーションは生じていないことが確認された。
【０１６０】
＜実施例４＞
本発明の試料分析チップの実施例として、図１１（Ｂ）及び図３に記載された試料分析チップを作製した。第一の基材４０１’は、ポリプロピレン樹脂を用いて射出成形により加工した。側路１０５の幅は約１ｍｍであり、ウェル１０２は上部が平坦な台形になっており、ウェル底部の直径は約３ｍｍで、容積約７μｌである。
【０１６１】
ポリプロピレンは赤外線部分に吸収がないため、プロピレン樹脂に赤外線吸収剤を添加することが必要である。本実施例では、予めプロピレン樹脂１００重量部に対して赤外線吸収剤としてＢＡＳＦ社のＬｕｍｏｇｅｎ（登録商標）ＩＲ７６５を０．０１重量部添加し、混合して赤外線吸収剤含有のプロピレン樹脂ペレットを用意し、これを用いて射出成形により上記試料分析チップの第一の基材を作製した。
【０１６２】
また第二の基材４０２’として、厚み約０．１５ｍｍのプロピレンフィルムを使用した。
【０１６３】
第一の基材４０１’上のウェルにはインベーダー反応用プローブ試薬とＤＮＡポリメラーゼ、クリベースといった酵素類をピペットで滴下し乾燥固定させた。
【０１６４】
第一の基材４０１’と第二の基材４０２’を重ね合わせ、波長８０８ｎｍ、出力１４０Wの赤外光フォトダイオートレーザを用いて、第二の基材側からレーザビームを一定の速度でスキャンしチップを照射することによって、第一の基材を第二の基材を溶着した。
【０１６５】
上記の工程で作製したチップに、バッファ溶液と精製されたゲノムを加えたバッファ溶液を溶液試料としてピペットにて送液し、主流路１０３に充填した。この段階ではウェル及び側路には試料は浸入していなかった。
【０１６６】
なお上記各試薬類は実施例１の表１に記載した分量と同様の分量で用いた。
【０１６７】
送液後、５０００ｒｐｍにてチップ中心を軸としてチップを回転させたところ、各ウェルに１１μｌの試料が送液された。チップに遠心力を与える手段として、化学、生物反応における試薬の分離などに用いられる卓上小型遠心機を利用した簡易な遠心装置を作成し、これを用いた。遠心時の回転数は回転数測定器にて測定して調整した。
【０１６８】
続いて、反応に阻害の無い試薬類表（表１）記載のミネラルオイルを同様の手法で送液したところ、試料はウェルを満たし、残った溶液で側路の半分程度を満たした。
【０１６９】
なお、本実施例はウェル２２箇所に反応用試薬としてインベーダー反応用プローブを固定した。また、反応結果の成否を判定するために、コンタミネーションの有無の確認としてネガティブコントロールを１箇所に設定し、１枚のチップ上で反応試験を行った。
【０１７０】
該反応容器がオイルによって独立した状態の試料分析チップに９５℃と６８℃を交互に３５サイクルかけ、ＰＣＲ反応によってサンプルのゲノムを増幅する。続いて、６３℃で３０ｍｉｎ温調することにより、酵素反応によりウェル内で蛍光検出反応を生じる。
【０１７１】
また、このとき蛍光検出をチップの第一の基材４０１’側の外部から行った。本実施例では光電子増倍管と光ファイバを組み合わせた蛍光検出装置によって上記蛍光反応を測定した。
【０１７２】
測定の結果、実施例１と同様に、各ウェルに配液された試薬により、所定の時間内に混合した試薬類による蛍光検出反応が生じていることが確認され、一般的な手法で最適の分量比で試薬類とサンプルを混合して得られた検出データと同様の結果が得られた。また、ネガティブコントロールのウェルでは、蛍光反応は検出されなかった。これにより両隣からのコンタミネーションは生じていないことが確認された。
【０１７３】
（産業上の利用可能性）
本発明の反応チップは、例えば核酸等の試料において生化学物質の検出や分析に用いることができる。特にＳＮＰの変異を検出できることから、がんなどの遺伝子、生殖細胞や体細胞遺伝子の変異を検出する手法へ利用することができる。また、複数の溶液を混合する容器、反応容器として利用することが可能である。
【０１７４】
（産業上の利用可能性）
本発明の反応チップは、例えば核酸等の試料において生化学物質の検出や分析に用いることができる。特にＳＮＰの変異を検出できることから、がんなどの遺伝子、生殖細胞や体細胞遺伝子の変異を検出する手法へ利用することができる。また、複数の溶液を混合する容器、反応容器として利用することが可能である。
【符号の説明】
【０１７５】
１０１・・・基材
１０２・・・ウェル
１０３・・・主流路
１０３ａ・・主流路山部
１０３ｂ・・主流路谷部
１０４・・・廃液部
１０４ａ・・・廃液チャンバ分岐流路
１０４ｂ・・・廃液チャンバ
１０５ａ・・・ウェル分岐流路
１０５・・・側路
１０７・・・ＩＮＬＥＴ／ＯＵＴＬＥＴ
４０１・・・第一の基材
４０１’・・・第一の基材（光透過性樹脂）
４０２・・・第二の基材
４０２’・・・第二の基材（赤外線透過性樹脂）
４０３・・・ＩＮＬＥＴ／ＯＵＴＬＥＴ（貫通孔）
４０５・・・担持部
５０１・・・固定試薬類
５０２・・・ワックス
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生化学反応の検出や分析等に用いる試料分析チップ、これを用いた試料分析装置、試料分析方法及び遺伝子解析方法、並びに試料分析チップの製造方法に関する。特にＤＮＡ解析に使用可能なディスポーザブルチップとその製造方法に関する。
本願は、２００９年３月３１日に日本に出願された特願２００９−０８５２７２号、特願２００９−０８５２７３号及び特願２００９−０８５２７４号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
従来、例えばＤＮＡ反応、たんぱく質反応等の生化学反応の分野において、微量の試料溶液を処理する反応装置として、μ−ＴＡＳ（Ｔｏｔａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ）やＬａｂ−ｏｎ−Ｃｈｉｐと呼ばれる技術が知られている。これは、１個のチップやカートリッジに複数の反応室（以下、ウェル）や流路を供えたものであり、複数の検体の解析、あるいは複数の反応を行うことができる。これらの技術はチップ及びカートリッジを小型化することで扱う薬品を少量にすることが出来、様々なメリットがあるとされてきた。
【０００３】
そのメリットとは例えば従来使用していた強酸や強アルカリ薬品の分量が微量化することで人体への影響や環境への影響が格段に低くなること、また、生化学反応等に用いられる高額な試薬類の消費量が微量化することで分析、反応に費やすコストを低減できること、などが挙げられる。
【０００４】
チップやカートリッジを用いて生化学反応を最も効率よく行うためには、複数のウェルにそれぞれ異なる種類の薬品や検体、酵素を配置し、これら薬品や検体、酵素と反応を起こす試薬を一本ないし数本の主導管からまとめてウェルに流し入れ、異なった複数の反応を生じさせる必要がある。
【０００５】
この手法を用いれば、複数種の検体を同じ試薬で同時に処理をしたり、また逆に一種類の検体に同時に複数の処理を施したりすることが出来、従来かかっていた時間や手間を大幅に減らすことが可能である。
【０００６】
この種の手法を用いる際、複数の反応場に等量のサンプルを送液する技術と、各ウェルの中身を混ざり合わないようにする技術が重要となる。このようなウェルへの送液を行うチップについての先行技術としては以下のものが挙げられる。
【０００７】
特許文献１では、液溜めから遠心力を用いてウェルへの送液を行うチップにおいて、ウェルを独立させるために流路を変形、密封している。そのため流路を押しつぶす機構が必要であり、自動化が困難である。また、従来の遠心送液チップのように中央の液溜りから周囲のウェルに遠心送液を行うと、各ウェルへの送液量にばらつきが生じてしまう。
【０００８】
特許文献２では、遠心方法を自転＋公転を織り交ぜることで各ウェルへの送液量にばらつきを解決している。しかし、この手法もチップが自転＋公転するための複雑な機構とスペースが必要となる。
【０００９】
特許文献３では液体貯留部と遠心方向に伸びる流路を有するウェルを複数連結させた分析用媒体が公開されているが、この文献では液の配液性などには注視しておらず、逆にウェルに詰まった空気との押し合いで流体を制御するとある。この手法では液体貯留部と液体貯留部の間流路の液体は送液されない上、各ウェルに送液される液量は大きくバラつき、反応のたびに結果に差異が生じてしまう。
【００１０】
従って、従来の第一の問題点は、送液方法が簡易でかつ各ウェルの液量ばらつきが少ないチップが実現されていないということである。
【００１１】
また第二の問題点として、これらの手法には、サンプル物質を装置中の複数のウェルに分配する必要があるため、チャンバの相互汚染による誤った試験結果に繋がるおそれがある。
【００１２】
上記問題を解決する手法としては、少なくとも一方の部材に流路などの加工が施された２つの部材を張り合わせてからなる密閉型のチップが提案されている。例えば、特許文献１には、装填チャンバ、主導管およびプロセスチャンバ（ウェル）を含む構造を提供する第１の主面部材と、第２の主面部材からなり、プロセスチャンバが装填チャンバから延びる導管に沿って配置され、装填チャンバ、導管、およびプロセスチャンバはサンプル処理装置の長さに沿って整列される密閉型のプロセスアレイ及びサンプル処理装置が開示された。
【００１３】
特許文献４に記載のプロセスアレイには、１本の主導管から枝分かれしたフィード導管を介して接続された複数のプロセスチャンバが設けられている。このため、複数種の検体を同じ試薬で処理する等の操作が可能である。これらのプロセスアレイを用いて生化学反応を最も効率良く行うためには、まず、複数の反応場にそれぞれ異なる種類の薬品や検体、酵素を配置する。そして、これらと反応を起こす試薬を、１本ないし複数本の主導管からそれぞれの反応場に流し入れる。このようにして、複数の異なる反応を生じさせる必要がある。この手法を用いれば、複数種の検体を同じ試薬で同時に処理したり、逆に１種類の検体に対して複数の処理を同時に施したりすることができる。これによって、従来かかっていた時間や手間を大幅に減らすことが可能である。
【００１４】
この種の手法として、例えば、液体導入口、流路、液体排出口等を備えたマイクロ流体チップを用い、反応に必要な試薬成分の一部をチップの流路内に凍結乾燥等の方法により固体状態で固定し、反応に必要な残りの試薬成分を液体状態で送液し、流路内でこれらの成分を接触させて反応を生じさせる、という技術が開示される。
【００１５】
また、特許文献５には、装填チャンバ、プロセスチャンバ、及び流路が形成された樹脂基材と平板状の金属基材とを貼り合せてからなるサンプル処理装置が開示されている。また、各プロセスチャンバに異なる反応を行わせるときなどには流路を閉塞して各プロセスチャンバを密閉空間にする方法が開示されている。このサンプル処理装置では平坦な金属基材を流路内に押し込むように変形させることで流路を閉塞させている。
【００１６】
しかしながら、特許文献１に記載のプロセスアレイは、第１の主面部材と第２の主面部材との間に感圧接着剤が使用されている。感圧接着剤の使用は反応中に接着剤からの溶出物が発生し、ウェル内の試薬に影響を与える可能性がある。また、接着層の耐熱性や耐水性の問題が生じやすく、特許文献１の構成では流路を外部からの影響を受けないように密閉するのは不十分である。
【００１７】
また、生化学反応等を行わせる際に反応温度や温度サイクル条件を精密に制御することは極めて重要である。特許文献２に記載のサンプル処理装置には、金属基材側を平坦な板状形成されている。このため、熱ブロック等との密着性が上がり、熱サイクルを伴う反応を行うときに好適である、と記載されている。しかしながら、特許文献２に記載のサンプル処理装置を用い反応を行う際には、流路を閉塞し各プロセスチャンバを密閉空間にする必要がある。このサンプル処理装置では平坦な金属基材を流路内に押し込むように変形させることで、流路を閉塞している。このように金属基材を変形させることによって、金属基材の平坦性が損なわれ、熱ブロックとの密着性が低下し、熱応答性が不十分になり、所望の反応を確実かつ短時間に行わせることが難しいという問題がある。さらに、特許文献２の方法では、流路の閉塞が不十分になってしまう場合、チャンバの相互汚染による誤った試験結果に繋がる場合がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】特表２００４−５０２１６４号公報
【特許文献２】特許第３６９９７２１号公報
【特許文献３】特開２００８−８３０１７号公報
【特許文献４】特許第４１８１０４６号公報
【特許文献５】特表２００４−５０２１６４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
以上のような従来技術の問題点を鑑みて、本発明はウェルへの送液を行う試料分析チップにおいて、送液方法が簡易でかつ各ウェルの液量ばらつきがなく、低コストの試料分析チップを提供することを課題とする。
また、容易に作製することができ、かつチップ上のウェルでの試料汚染等の生じることのない試料分析チップ、これを用いた試料分析装置、試料分析方法及び遺伝子解析方法、並びに試料分析チップの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
上記課題を解決するために、この発明は以下の手段を提案している。
本発明の試料分析チップは、基材に複数のウェルと、各前記ウェルに繋がる流路と、前記流路に溶液を注入するための注入口とを有し、前記基材を回転させて前記ウェルに溶液を配液する試料分析チップであって、前記流路は、各前記ウェルに送液する主流路、および前記主流路と前記ウェルとを連絡する側路を有し、該主流路は前記ウェルより回転中心側に設けられ、隣り合う前記ウェルの間で前記回転中心に対して一つの山を有するように形成され、前記側路が、前記回転中心方向に対して傾いて形成され、前記山は、前記山の頂点と前記回転中心とを通る基準線に対して、一方側で隣り合う前記主流路の山と連絡する幅広主流路と、他方側で隣り合う前記主流路の山と連絡し前記幅広主流路より路幅が小さい幅狭主流路とを有し、前記幅広主流路における前記回転中心から離間した端部が、前記側路と連絡していることを特徴としている。
【００２１】
また、上記の試料分析チップにおいて、前記基材が円盤状であり、前記ウェルは該基材と同心円状に配置されていることがより好ましい。
また、上記の試料分析チップにおいて、前記主流路が、前記回転中心方向に対して傾いて形成されていることがより好ましい。
また、上記の試料分析チップにおいて、前記側路に余剰溶液を溜める廃液部が設けられたことがより好ましい。
【００２２】
また、上記の試料分析チップにおいて、前記廃液部が、廃液を溜める廃液チャンバと、前記側路を分岐し、該廃液チャンバと連絡する廃液チャンバ分岐流路とを有することがより好ましい。
また、上記の試料分析チップにおいて、前記廃液部は、前記回転中心方向に対して前記側路の内側に設けられていることがより好ましい。
また、上記の試料分析チップにおいて、前記ウェルに連通する分岐流路は前記廃液チャンバ分岐流路より送液時の圧力損失が低いことがより好ましい。
【００２３】
また、上記の試料分析チップにおいて、前記ウェルに連絡する分岐流路の断面積が、前記廃液チャンバ分岐流路の断面積よりも大きいことがより好ましい。
また、上記の試料分析チップにおいて、前記廃液チャンバ分岐流路よりも前記ウェルに連絡する分岐流路の表面粗さが小さいことがより好ましい。
また、上記の試料分析チップにおいて、前記廃液チャンバ分岐流路の流路内表面を撥水処理したことがより好ましい。
【００２４】
また、上記の試料分析チップにおいて、前記ウェルに連絡する分岐流路の流路内表面を親水処理したことがより好ましい。
また、上記の試料分析チップにおいて、前記試料分析チップは前記ウェル及び前記流路を形成した第一の基材と、該基材と貼り合わせた第二の基材とを有することがより好ましい。
また、上記の試料分析チップにおいて、前記基材のいずれか一方が光透過性材料で形成されていることがより好ましい。
【００２５】
また、上記の試料分析チップにおいて、前記第一の基材が光透過性の樹脂材料であり、前記第二の基材が金属材料であることがより好ましい。
また、上記の試料分析チップにおいて、前記第一の基材が、可視光に対して光透過性でありかつ赤外線に対して光吸収性の樹脂からなり、前記第二の基材が、少なくとも波長８００ｎｍ以上の赤外線を透過する板状又はフィルム状であることがより好ましい。
また、上記の試料分析チップにおいて、前記第一の基材は、ポリプロピレン、ポリカーボネート、アクリル樹脂のいずれかの樹脂基材であることがより好ましい。
【００２６】
また、上記の試料分析チップにおいて、前記第一の基材は、８００ｎｍ以上の波長領域に吸収を有する赤外線吸収剤を含むことがより好ましい。
また、上記の試料分析チップにおいて、前記第二の基材は、ポリプロピレン、ポリカーボネート、アクリル樹脂のいずれかの樹脂基材であることがより好ましい。
また、上記の試料分析チップにおいて、前記第二の基材の厚みが、０．０５〜０．５ｍｍの範囲にあることがより好ましい。
また、上記の試料分析チップにおいて、前記第一の基材に試料分析チップを回転させるための担特部が設けられていることがより好ましい。
【００２７】
また、本発明の試料分析チップの製造方法は、上記のいずれかに記載の試料分析チップの製造方法であって、前記第二の基材側から赤外線レーザを照射し、前記第一の基材と前記第二の基材とを溶融接着し、張り合わせることを特徴としている。
また、上記の試料分析チップの製造方法において、前記赤外線レーザの波長が、８００〜１２００ｎｍの範囲にあることがより好ましい。
また、上記の試料分析チップの製造方法において、前記第一の基材と前記第二の基材とを張り合わせる前に、前記ウェルに試薬を固定する工程を含むことがより好ましい。
【００２８】
また、本発明の試料分析装置は、上記のいずれかに記載の試料分析チップを設置し、回転させる手段と、前記ウェルでの反応を検出するための検出測定手段と、を有することを特徴としている。
また、本発明の試料分析方法は、上記のいずれかに記載の試料分析チップの前記主流路に溶液を注入する工程と、該試料分析チップを回転させて溶液を前記各ウェルに配液する工程と、を有することを特徴としている。
また、上記の試料分析方法において、前記ウェルに配液する工程の後に、ミネラルオイルを前記各ウェルに配液する工程を有ることがより好ましい。
また、本発明の遺伝子解析方法は、上記のいずれかに記載の試料分析方法を用いたことを特徴としている。
【発明の効果】
【００２９】
本発明による第一の形態の試料分析チップによれば、簡易で機能的、かつ安全安価な試料分析チップを実現することができる。さらに、１種類の検体に対して複数の処理を施すことができる。
【００３０】
また、主流路が各ウェルの間で回転中心に対して一つの山を形成しているので、この主流路の山部で送液が切れ、液分配のムラを低減させることができる。さらには当該流路山部の断面積を小さくすることで、液分配時のムラをより減少させることができる。
【００３１】
さらには、流路山部から隣接する流路山部までの主流路の容積を任意に設計すれば、同等の容量のサンプルを前期流路山部に挟まれた流路谷部から連通するウェルに送液することができるため、使用する溶液試料の量をウェルごとに任意に設定することができる。
【００３２】
また、本発明による第二の形態の試料分析チップによれば、主流路からウェルに遠心力によって送液された際、送液のムラによって所定の分量を越えて送液されたウェルでは、余剰分を廃液チャンバに捨てることができる。そのため、全てのウェルに所望の液量よりも余分に送液すれば、全てのウェルに同じ量の溶液を送液することができることから、配液バラつきを低減することができる。
【００３３】
更に、主流路とウェルとを連通する側路に廃液チャンバに連通する分岐流路を設けることで他のウェルとのサンプルの接触を失くし、コンタミネーションを抑えることができる。
【００３４】
また、本発明の第三の形態に係る試料分析チップによれば、簡易な構成で小型、安価な反応チップを実現することができる。本発明の試料分析チップでは、第一の基材と第二の基材とを組み合わせて、赤外線レーザで融着することにより、チップやチップに固定されている試薬に殆ど影響を与えない密閉型のチップを実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】本発明の第一の形態に係る試料分析チップの一様態の平面図。
【図２】本発明の第一の形態に係る試料分析チップの一様態の平面図。
【図３】本発明の第一の形態に係る試料分析チップの一様態の平面図。
【図４】本発明の第二の形態に係る試料分析チップの一様態の平面図。
【図５】本発明の第二の形態に係る試料分析チップの側路、廃液部及びウェルの配置を示した平面図。
【図６】本発明の第二の形態に係る試料分析チップの一様態の平面図。
【図７】本発明の第二の形態に係る試料分析チップの一様態の平面図。
【図８】本発明の試料分析チップの説明のための斜視図。
【図９】本発明の試料分析チップの説明のための断面図。
【図１０】本発明の第三の形態に係る試料分析チップの斜視図である。
【図１１】本発明の第三の形態に係る試料分析チップを構成する第一の基材の平面図である。
【図１２】本発明の第三の形態に係る試料分析チップの一実施形態における流路とウェルの断面図である。
【図１３】実施例１における検出測定結果のグラフ。
【図１４】実施例１におけるネガティブコントロール測定結果のグラフ。
【図１５】実施例１におけるポジティブコントロール測定結果のグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明の第一の形態の試料分析チップを図面に基づいて説明する。
図１は本発明の試料分析チップの一様態を示した平面図である。本発明のチップは、基材１０１上に複数のウェル１０２と、ウェルに溶液、例えば液体試料（溶液）を送液するための流路を有している。流路は、各ウェルに送液するために、少なくとも各ウェルと連絡する一つの主流路１０３を有し、さらに主流路とウェルをつなぐ側路１０５を有する。流路には溶液を注入するための注入口を有する。図１の様態では、主流路の端部に注入口（ＩＮＬＥＴ）及びもう一方の端部に空気の脱出口を兼ねた余剰溶液の出口（ＯＵＴＬＥＴ）を有している。
【００３７】
本発明の試料分析チップは当該チップを回転させることにより生じる遠心力により、各ウェル１０２に配液するものであることから、中央部に回転軸の貫く点（以下、中心点）のある円盤形状であることが好ましいが、チップを貫く回転軸に対して回転可能に形成されて入れば特に制限はない。円盤形状であれば、その中心が回転軸となるようにして、その円盤形状のチップに同心円状になるようにウェルを配置することができるため、スペースが効率的である。均等にウェルに配液するには遠心力を均等に掛けることが重要であるが、チップを、ＩＮＬＥＴ／ＯＵＴＬＥＴ１０７の領域を除き、中心点を軸とする回転対称性を持つように設計することで容易に実現することができる。すなわち、Ｎ個のウェルがあるとすると、Ｎ回対称となるようにすると、均等に遠心力を掛けることができる。もちろん、各ウェルの配液量を異ならせる場合には、この限りではない。また同心円状にウェルが配置されていることにより、基材を回転させることによって、一箇所の検査領域で全てのウェルの分析が可能である。
【００３８】
主流路１０３はウェルよりも中心点側に形成されている。さらに、本発明の試料分析チップでは、この主流路が、隣り合うウェルの間で中心点方向に一つの山を有するように形成されていることを特徴とする。ここで隣り合うウェルとは、主流路からウェルへの送液流路が前後しているウェルを意味する。また、中心点方向への山を有するとは中心点方向への極大点（主流路山部１０３ａ）を持つことを意味している。このように、隣り合うウェルの間で中心点方向に一つの山を有するように形成することで、主流路に注入された液体が、チップ回転時に主流路山部で自然と途切れるため、各ウェルへの配液量のバラツキを低減することができる。
【００３９】
ウェル１０２と主流路１０３との連絡箇所、即ち主流路１０３と側路１０５との接続箇所は、主流路の山部と山部の間の谷部１３０ｂであることが好ましい。谷部とは主流路の山と山との間で最も中心点から距離が遠い箇所である。この箇所でウェルと主流路を連絡することにより、配液時の主流路への溶液の残留を減らすことができる。
【００４０】
また主流路１０３と、ウェル１０２との連絡口は、後述する試料分析チップを用いた処理方法に記載するように、チップを回転させる前の段階では、ウェルに溶液が浸入しない程度の幅及び断面積である必要がある。
【００４１】
また、ウェル１０２内に空気を残留させないために、ウェルの中心点に最も距離が近い点で主流路と連結することが好ましい。つまり、側路１０５を形成する場合には、ウェル側の中心点に最も近い点と、主流路側の谷部を結ぶように形成することが好ましい。
【００４２】
図２は本発明の試料分析チップの別の一様態を示した平面図である。図２の様態では、主流路の路幅が主流路山部１０３ａで狭く、主流路谷部１０３ｂで広くなっている。主流路山部１０３ａに該当する領域に存在する溶液が少ない方が、配液バラツキが少ないため、山部の主流路の断面積は、他の部分の断面積よりも小さいことが好ましい。したがって、山部の流路幅を狭くする、及び／または、深さを浅くすることが好ましい。また同様の理由で山部に近づくにつれて主流路の断面積が小さくなるようにすることが好ましい。
【００４３】
さらに、主流路谷部１０３ｂの路幅を広げることで、各ウェル１０２への配液量を制御することができる。したがって、図３の試料分析チップのように山と山との間の流路をチャンバ様とし、主流路山部から隣接する主流路山部までの主流路の容積を任意に設計すれば、同等の容量のサンプルを両山部に挟まれた谷部から連通するウェルに送液することができるため、任意量の溶液を各ウェルに設定することが可能である。
【００４４】
またウェル１０２の容積は１μｌ以上１００μｌ以下であることが好ましい。１μｌより小さいと、遠心力が十分に働かず、ウェルへの送液が行われ辛く、また１００μｌよりも大きいと、試薬の混合性が低下したり、ウェル内の温度の均一性が低下する、といった現象が生じる可能性がある．
【００４５】
また図２の様態では、側路１０５は中心点の方向から傾いて形成されている。このように側路を傾斜させて形成することにより、遠心力を掛けたときにウェルの空気が側路の内側に沿って主流路方向へ移動し、一方溶液は側路の外側に沿ってウェル方向へ移動するため、スムーズにウェル内へ溶液を移動させることができる。傾斜させる角度としては、中心点の方向と側路との為す角が１０度から８０度の間であることが好ましい。１０度以下だとウェルからの排気とウェルへの溶液の浸入が干渉して溶液の浸入を阻んでしまう場合があり、８０度を超えると、側路方向への遠心力が弱く、溶液がウェルへ移動しない場合がある。
【００４６】
図３は本発明の試料分析チップのさらに別の一様態である。図３の試料分析チップでは、主流路１０３の山が中心点方向に対して傾いていることで、側路１０５に対して主流路の左右の基材平面での面積が不均等に設計されている。側路１０５に対して左右の主流路が路幅の狭い流路側と、広い流路側が存在し、広い流路側にウェルとの連絡口である側路１０５が形成されていることで、ウェルから側路へ移動した空気と、主流路の溶液の入れ替わり時に面積が大きい主流路側に偏って気泡と液体の入れ替わりが生じる。このため主流路への残液を減らすことができる。したがって、各ウェルに接続する側路及び主流路を上記のような構成とし、主流路が路幅の狭い流路側と、広い流路側が山部を境に交互に形成されるようにすることで、各チャンバ様主流路で同様の現象が同時に生じるために、配液のバラつきを減少する事ができる。
【００４７】
本発明の第二の形態の試料分析チップを図面に基づいて説明する。
図４は本発明の試料分析チップの一様態を示した平面図である。本発明のチップは、基材１０１上に複数のウェル１０２と、ウェルに溶液、例えば液体試料（溶液）を送液するための流路を有している。流路は、各ウェルに送液するために、少なくとも各ウェルと連絡する一つの主流路１０３を有し、さらに主流路とウェルをつなぐ側路１０５を有する。流路には溶液を注入するための注入口を有する。図４の様態では、主流路の端部に注入口（ＩＮＬＥＴ）及びもう一方の端部に空気の脱出口を兼ねた余剰溶液の出口（ＯＵＴＬＥＴ）を有している。
【００４８】
本発明の試料分析チップは当該チップを回転させることにより生じる遠心力により、各ウェル１０２に配液するものであることから、中央部に回転軸の貫く点（以下、中心点）のある円盤形状であることが好ましいが、チップを貫く回転軸に対して回転可能に形成されて入れば特に制限はない。円盤形状であれば、その中心が回転軸となるようにして、その円盤形状のチップに同心円状になるようにウェルを配置することができるため、スペースが効率的である。均等にウェルに配液するには遠心力を均等に掛けることが重要であるが、チップを、ＩＮＬＥＴ／ＯＵＴＬＥＴ１０７の領域を除き、中心点を軸とする回転対称性を持つように設計することで容易に実現することができる。すなわち、Ｎ個のウェルがあるとすると、Ｎ回対称となるようにすると、均等に遠心力を掛けることができる。もちろん、各ウェルの配液量を異ならせる場合には、この限りではない。また同心円状にウェルが配置されていることにより、基材を回転させることによって、一箇所の検査領域で全てのウェルの分析が可能である。
【００４９】
主流路１０３はウェル１０２よりも中心点側に形成されている。主流路１０３と、ウェル１０２との連絡口は、後述する試料分析チップを用いた処理方法に記載するように、チップを回転させる前の段階では、ウェルに溶液が浸入しない程度の幅及び断面積である必要がある。表面張力が関係するため用いる溶液にも拠るが、例えば溶媒が水であるとすると、２×２ｍｍ２以下であればこの条件を満たす。
【００５０】
ウェル１０２の容積は１μｌ以上１００μｌ以下であることが好ましい。１μｌより小さいと、遠心力が十分に働かず、ウェルへの送液が行われ辛く、また１００μｌよりも大きいと、試薬の混合性が低下したり、ウェル内の温度の均一性が低下する、といった現象が生じる可能性がある．
【００５１】
また、ウェル１０２内に空気を残留させないために、ウェルの中心点に最も距離が近い点で主流路と連結することが好ましい。つまり、ウェル側の中心点に最も近い点で、側路１０５とウェルとが接続するように形成することが好ましい。
【００５２】
さらに、本発明の試料分析チップでは、各ウェル１０２と主流路１０３を連絡する側路１０５において、側路ごとに廃液部１０４が設けられている。廃液部は、側路から分岐した廃液分岐流路１０４ａと、廃液分岐流路に連結した廃液チャンバ１０４ｂにより構成することができる。廃液部がウェル１０２と主流路１０３とを連絡する側路に設けられていることにより、ウェルに余剰な溶液が送液された際に、廃液部に余剰溶液が送液されて溜められ、一定の容量の溶液がウェルとウェル分岐流路１０５ａに残される。したがって、余剰溶液による配液バラツキを低減させることができる。
【００５３】
配液の際に、廃液チャンバ１０４ｂよりもウェル１０２が先に溶液で満たされることで、各ウェルに確実に溶液試料を充填することができる。そのために、廃液チャンバ分岐流路よりもウェル分岐流路に送液されやすいようにすることが重要である。
【００５４】
このための方法としては、廃液チャンバ分岐流路１０４ａよりもウェル分岐流路１０５ａの断面積を広くすることで送液時の圧力損失に差が生じ、ウェルに優先的に送液することができる。この手法により、まずウェルが溶液で満たされ、その後余剰溶液を廃液チャンバに送液することができる。したがって、廃液部を断面積の狭い廃液チャンバ分岐流路１０４ａと容量の大きい廃液チャンバ１０４ｂからなる構成とすることで、ウェル分岐流路側に送液されやすく、かつ廃液部の容量を調整することができる。なお余剰溶液の廃液量は、ウェルの容量と、廃液チャンバの容量によって調節することができる。遠心送液時の各ウェル間のばらつきが大きいほど廃液チャンバの容量が必要となる。
【００５５】
また、別の方法としては、廃液チャンバ分岐流路よりもウェル分岐流路の流路内の表面粗さを小さくすることで送液時の圧損に差が生じ、ウェルに優先的に送液することができる。
【００５６】
また、別の方法としては、廃液チャンバ分岐流路の流路表面を撥水処理することにより、送液時の圧損に差が生じ、ウェルに優先的に送液することができる。また逆に、ウェル分岐流路の流路表面を親水処理することにより、送液時の圧損に差が生じ、ウェルに優先的に送液することができる。撥水処理の方法としては、フッ素系材料によるコーティング等が一般的であり、対薬品性も強く、逆に反応への影響も生じない。また、親水処理の手法としてはプラズマ処理やコロナ放電処理などが挙げられ、どちらも一般的な手法と言える。
【００５７】
さらに、側路１０５の形状及び廃液部１０４の配置によってもウェル側の分岐流路に優先的に送液されやすいようにすることができる。図５（Ａ）、（Ｂ）は、側路１０５とウェル１０２、廃液チャンバ１０４ｂおよび廃液チャンバ分岐流路１０４ａからなる廃液部を模式的に示したものである。実線の矢印は中心点の方向（回転中心方向）を示している。
【００５８】
図５の各構成では、側路１０５は回転中心方向から傾いて形成されている。このように側路を傾斜させて形成することにより、遠心力を掛けたときにウェル１０２の空気が側路の内側に沿って主流路方向へ移動し、一方溶液は側路の外側に沿ってウェル方向へ移動するため、スムーズにウェル内へ溶液を移動させることができる。傾斜させる角度としては、中心点の方向と側路との為す角が１０度から８０度の間であることが好ましい。１０度以下だとウェルからの排気とウェルへの溶液の浸入が干渉して溶液の浸入を阻んでしまう場合があり、８０度を超えると、側路方向への遠心力が弱く、溶液がウェルへ移動しない場合がある。
【００５９】
図５（Ａ）図５（Ｂ）では、傾いた側路１０５において、廃液チャンバ分岐流路１０４ａにより廃液部１０４が側路１０５から中心点側で分岐している。図５（Ａ）では側路１０５はウェル１０２に直進しているパターン、図５（Ｂ）では廃液部との分岐点でウェル側の側路（ウェル分岐流路１０５ａ）が折れ曲がっているパターンである。廃液チャンバ分岐流路１０４ａの折れ曲がりは、分岐前の側路の傾きと同じ方向に傾いていれば任意の形状とすることができる。また、廃液量が廃液チャンバ分岐流路部分の容量で十分な場合には、廃液部の末端の廃液チャンバ１０４ｂがなくともよい。
【００６０】
前述のように、溶液に掛かる遠心力により、破線の矢印で示した中心点から外側の流路、すなわちウェル側の分岐流路に先に流れ込むことになり、廃液チャンバ１０４ｂよりもウェル１０２が先に溶液で満たされ、各ウェルに確実に溶液試料を充填することができる。また、図５（Ｂ）のようにウェル側の流路を曲げると、ウェル分岐流路１０５ａ小さく、あるいはウェルを直接側路の分岐箇所で接続することができることから、ウェルに溶液が充填された後、余剰溶液を廃液チャンバに送液するまでの流路が短くなり、ウェルへの配液バラつきをより低減させることができる。
【００６１】
一方、溶液量が所定の容量より少ない場合は、廃液部によって各ウェルの試料容量のバラつきを低減することができないが、主流路の形状を工夫することによって、元々の送液時の送液量のばらつきについても抑えることが可能である。例えば、本発明の第一の形態の試料分析チップと組み合わせた様態の試料分析チップとすることができる。図６および図７に、このような本発明の試料分析チップの別の様態を示した。
なお、下記の様態で説明していない第一の形態の試料分析チップの事項についても、第二の形態と矛盾しない限り、組み合わせて本発明の試料分析チップとすることができる。
【００６２】
図６の試料分析チップでは、主流路１０３が、隣り合うウェルの間で中心点方向に一つの山を有するように形成されている。ここで隣り合うウェルとは、主流路からウェルへの送液流路が前後しているウェルを意味する。また、中心点方向への山を有するとは中心点方向への極大点（主流路山部１０３ａ）を持つことを意味している。このように、隣り合うウェルの間で中心点方向に一つの山を有するように形成することで、主流路に注入された液体が、チップ回転時に主流路山部で自然と途切れるため、各ウェルへの配液量のバラツキを低減することができる。
【００６３】
ウェル１０２と主流路１０３との連絡箇所、即ち主流路１０３と側路１０５との接続箇所は、主流路の山部と山部の間の谷部１３０ｂであることが好ましい。谷部とは主流路の山と山との間で最も中心点から距離が遠い箇所である。この箇所でウェルと主流路を連絡することにより、配液時の主流路への溶液の残留を減らすことができる。
【００６４】
また図６の試料分析チップでは、主流路１０３の路幅が主流路山部１０３ａで狭く、主流路谷部１０３ｂで広くなっている。主流路山部１０３ａに該当する領域に存在する溶液が少ない方が、配液バラツキが少ないため、山部の主流路の断面積は、他の部分の断面積よりも小さいことが好ましい。したがって、山部の流路幅を狭くする、及び／または、深さを浅くすることが好ましい。また同様の理由で山部に近づくにつれて主流路の断面積が小さくなるようにすることが好ましい。
【００６５】
さらに、主流路谷部１０３ｂの路幅を広げることで、各ウェル１０２への配液量を制御することができる。したがって、図２ｂの試料分析チップのように山と山との間の流路をチャンバ様とし、主流路山部から隣接する主流路山部までの主流路の容積を任意に設計すれば、同等の容量のサンプルを両山部に挟まれた谷部から連通するウェルに送液することができるため、任意量の溶液を各ウェルに設定することが可能である。
【００６６】
図７は本発明の試料分析チップの別の一様態である。図７の試料分析チップでは、主流路１０３の山が中心点方向に対して傾いていることで、側路１０５に対して主流路の左右の基材平面での面積が不均等に設計されている。側路１０５に対して左右の主流路が路幅の狭い流路側と、広い流路側が存在し、広い流路側にウェルとの連絡口である側路１０５が形成されていることで、ウェルから側路へ移動した空気と、主流路の溶液の入れ替わり時に面積が大きい主流路側に偏って気泡と液体の入れ替わりが生じる。このため主流路への残液を減らすことができる。したがって、各ウェルに接続する側路及び主流路を上記のような構成とし、主流路が路幅の狭い流路側と、広い流路側が山部を境に交互に形成されるようにすることで、各チャンバ様主流路で同様の現象が同時に生じるために、配液のバラつきを減少する事ができる。
【００６７】
次に第一の実施形態及び第二の実施形態に係る本発明の試料分析チップの製造方法について説明する。
【００６８】
図８は本発明の試料分析チップの構造の一様態を示した斜視図である。
本発明の試料分析チップはウェル及び流路（主流路及び側路を含む）を形成した第一の基材４０１に、第二の基材４０２を貼り合わせることで作製することができる。第一の基材及び第二の基材の少なくとも一方には試料分析装置の具備するチップ回転機構によってチップを回転させるための回転手段として、例えばチップ回転機構に固定するための担持部４０５を有する。また注入口及び空気の脱出口を兼ねた出口（ＩＮＬＥＴ／ＯＵＴＬＥＴ）のための貫通孔を第一の基材及び第二の基材の一方に、少なくとも一つ形成する。貫通孔は基材を貼り合わせたときに主流路の端部に一致する。以下では、説明の便宜上、蛍光反応等を検出、測定する際に測定する面に位置する基材側を「上側」、下側に位置する側を「下側」とする。
【００６９】
基材としては、試料に影響を与えないものであれば特に制限はないが、特にポリプロピレン、ポリカーボネート、アクリルのいずれかを含む樹脂材料を用いれば、良好な可視光透過性を確保することができる。ポリプロピレンとしては、ホモポリプロピレンやポリプロピレンとポリエチレンとのランダム共重合体を使用することができる。また、アクリルとしては、ポリメタクリル酸メチル、または、メタクリル酸メチルとその他のメタクリル酸エステル、アクリル酸エステル、スチレンなどのモノマーとの共重合体を使用することができる。また、これらの樹脂材料を使用する場合、チップの耐熱性や強度を確保することもできる。樹脂材料以外としては、アルミニウム、銅、銀、ニッケル、真鍮、金等の金属材料を挙げることができる。金属材料を用いた場合、加えて熱伝導率及び封止性能に優れる。なお貼り合わせる基材のうち少なくとも上側基材のウェル底部を透明とすることで、蛍光等の検出・分析を外部から行うことができる。なお本発明における「透明」及び「光透過性」とは、検出光の波長領域での平均透過率が７０％以上であるものとする。可視光領域（波長３５０〜７８０ｎｍ）で光透過性材料の材料を用いれば、チップ内での試料状態の視認が容易であるが、これに限られるわけではない。
【００７０】
ウェル及び流路、廃液部を形成する基材の加工方法としては、樹脂材料の場合には、射出成形、真空成形等の各種樹脂成形法や、機械切削などを用いることができる。金属材料の場合には、厚手の基材を用いた研削加工やエッチング、薄手の金属シートにプレス加工や絞り加工を施すことで形成することができる。
【００７１】
また、第１の基材として特にポリプロピレン、ポリカーボネート、アクリルのいずれかを含む樹脂材料を用いた場合、良好な光透過性、耐熱性、強度を確保することができる。また、第１の基材の厚みが５０μｍ〜３ｍｍの範囲にある場合、良好な光透過性、耐熱
性、強度を確保でき、凹部の加工を確実に行うことができる。
【００７２】
また、第２の基材の厚みが１０μｍ〜３００μｍの範囲にある場合、第２の基材の熱伝導性及び封止性の双方を満足することができる。第２の基材の厚みが３００μｍよりも大きいと、熱容量が大きくなり、熱応答性が低下するおそれがある。
【００７３】
図９に本発明の試料分析チップの断面図を示した。第一の基材４０１には、チップを貫通する溶液の注入口２０３と、注入液がチップに流れ込むための主流路となる溝１０３と、チップの外周部に延びた各ウェルと連通する側路となる溝１０５と、チップの外周部のウェルとなる窪み１０２とが成形されている。なお図５の断面図は注入口（ＩＮＬＥＴ／ＯＵＴＬＥＴ）からウェルまでの経路を模式的に示したものであり、主流路及び側路の形状はこれに限られない。注入される溶液をすべてのウェルに充満するためには、主流路の容積は、各ウェルの容積の合計より大きい必要がある。ただし、ウェルに試薬５０１が固定されている場合、その分反応ウェルに入れる液体試料の量が減るため、流れ込む流路の容積をその分減少してもよい。蛍光反応や測定のため、第一基材側で検出測定を行なう場合には、ウェルの凹部が光を散乱させない平滑な形状となっていることが好ましい。
【００７４】
基材を貼り合わせる前に、ウェル１０２に反応用の試薬５０１を固定する。各ウェルで異なる試薬を用いることができる。各反応ウェルにそれぞれ異なる試薬を固定することによって、１つ検体（試料）に対して複数の処理を施すことができる。また、実際反応を行うための試薬の一部を各ウェルに固定し、残りの試薬は液体試料と一緒に導入するようにしてもよい。
【００７５】
試薬５０１の固定方法としては、例えば第１の基材のウェル部分に液体試薬をピペット等で滴下し、第一の基材４０１を遠心装置で２０００〜３０００ｒｐｍ、５分程度遠心することで適量の液体試薬が液面を平坦な状態で残存するようにして、これを乾燥させることでウェルに固定することができる。
【００７６】
また、試薬をウェルに固定した後、ワックス５０２を滴下してもよい。具体的には、ワックスをホットプレート上に溶融させ、ピペットを用いて乾燥させた試薬を覆うように滴下する。このとき、ワックスは数秒で固化する。ワックスは、試薬をウェルの凹部に固定させる役割を有する。
【００７７】
基材の貼り合わせ方法としては、一方の基材に接着層として樹脂コーティング層を設け、これを溶融させて両基材を接着する方法が挙げられる。樹脂コーティング層は、熱伝導率の高い金属材料基材に設けて溶融接着することが好ましい。樹脂コーティング層の材料としては、ＰＥＴやポリアセタール、ポリエステルやポリプロピレン等の樹脂材料を用いることができる。
【００７８】
この貼り合わせ方法においては、微細加工しやすく、蛍光測定に好適な光透過性の樹脂材料を第一の基材に用い、第二の材料としては熱伝導率が高く樹脂コーティング層を設けて溶融接着による貼り合わせが容易な金属材料を用いることが好ましい。また金属基材表面に樹脂コーティング層を形成することにより、材料を選定する際に金属基材自体の耐薬品性は考慮しなくて良い。
【００７９】
また、基材表面に樹脂コーティング層を形成する際、樹脂コーティング層の下地としてアンカー層を形成することによりレーザを用いた融着が可能である。アンカー層にはレーザ波長光を吸収するカーボンブラック（光吸収性材料）が練り込まれており、レーザ光を照射することにより発熱して樹脂コーティング層を溶融接着することができる。あるいは、アンカー層にカーボンブラックを添加することに代えて、樹脂コーティング層にカーボンブラックを添加したり、樹脂コーティング層の表面を黒色に塗装したりしても良い。例えば波長９００ｎｍ程度の赤外光フォトダイオードレーザーの光を照射することによっても樹脂コーティング層を効率良く溶融することができる。レーザ溶着は、熱溶着と異なり、チップを加熱する必要がないことから、チップやチップに固定されている試薬に殆ど影響を与えずに 基材の貼り合わせをすることができる。
【００８０】
本発明の第三の形態の試料分析チップ及びその製造方法を図面に基づいて説明する。
なお、説明の便宜上、蛍光反応等を検出、測定する際に測定する面の側に位置する基材側を「上側」、下側に位置する側を「下側」とする。
【００８１】
図１０は、本発明の第三の形態に係る試料分析チップの斜視図である。図１０に示した本発明の試料分析チップの形態では、上側の第一の基材４０１’と、下側の第二の基材４０２’の２つの部材を組み合わせて形成されており、第一の基材には試薬等の溶液を送液するための流路と、溶液と試薬類とを反応させるためのウェルが形成されている。また第一の基材又は第二の基材に、形成された流路に溶液を注入するために注入口及び空気の脱出口を兼ねた出口として少なくとも一つの貫通孔４０３が設けられている。
【００８２】
図１１に、第一の基材上に形成されたウェル１０２及び流路（主流路又は注入部１０３、側路１０５）の例を示した。本発明のチップは、基材１０１上の外周部の複数のウェル１０２と、ウェルに溶液、例えば液体試料を送液するための流路を有している。流路は図１１Ａ又は図１１Ｂのような形状で注入口から溶液を注入する主流路又は注入部１０３と、各ウェルに配液するために主流路又は注入部とウェルとを連絡する側路１０５を有する。
【００８３】
また、本発明の第三の形態に係る試料分析チップは、矛盾しない限り、第一の形態及び第二の形態に係る本発明の事項と組み合わせて本発明の試料分析チップとすることができる。例えば、主流路１０３の形状を第一の形態で示した波状の形状としてもよく、あるいは側路１０５に廃液部を有する形状としても良い。また、第一の形態あるいは第二の形態以外の構成と組み合わせても良い。
【００８４】
本発明の試料分析チップは当該チップを回転させることにより生じる遠心力により、各ウェル１０２に配液するものである。遠心力による送液の利点は、各ウェル１０２に排気のための開口部を設置する必要がなく、遠心力によって、溶液試料と各ウェルにある空気を置換してウェルに入ることができることである。このことによりウェルの密閉性を高めることができ、外部からの汚染を防ぐことができる。チップを回転させることから、チップの形状は中央部に回転軸の貫く点（以下、中心点）のある円盤形状であることが好ましいが、チップを貫く回転軸に対して回転可能に形成されて入れば特に制限はない。円盤形状であれば、その中心が回転軸となるようにして、その円盤形状のチップに同心円状になるようにウェルを配置することができるため、スペースが効率的であるまた同心円状にウェルが配置されていることにより、基材を回転させることによって、一箇所の検査領域で全てのウェルの分析が可能である。
【００８５】
外部の回転機構によりチップを回転させるための回転手段として、例えば図１０で示したような担持部４０５が第一の基材に設けられている。
【００８６】
本発明の試料分析チップは、第１の樹脂基材４０１’が、可視光を透過する光透過性樹脂基材であり、また第２の樹脂基材４０２’は、赤外線透過性を有する。このような構成とすることで、赤外線レーザによって第一の基材の第二の基材との界面の部分を溶融し、接着することにより製造することが可能である。レーザ溶着は、熱溶着に比べ、チップ製造時に、チップやチップに固定されている試薬に殆ど影響を与えないことが最大の利点である。感圧接着剤の使用に比べて、接着剤によるウェル内の試薬の汚染がなく、溶着したチップの耐熱性や耐水性を十分に確保することができる。以下、さらに詳細に説明する。
【００８７】
ウェルの蛍光測定を行うためには、測定する面の側に位置する第一の基材４０１’の少なくともウェル１０２部分が７５０ｎｍ以下の可視光を透過する光透過性を有することが必要である。少なくとも蛍光波長において５０％以上の平均透過率であることが好ましく、より好ましくは７０％以上の平均透過率である。このため、第一の基材としてポリプロピレン、ポリカーボネート、アクリルのいずれかを含む樹脂材料を用いることが好ましい。これらの材料を用いることで、良好な可視光透過性を確保することができる。ポリプロピレンとしては、ホモポリプロピレンやポリプロピレンとポリエチレンとのランダム共重合体を使用することができる。また、アクリルとしては、ポリメタクリル酸メチル、または、メタクリル酸メチルとその他のメタクリル酸エステル、アクリル酸エステル、スチレンなどのモノマーとの共重合体を使用することができる。また、これらの樹脂材料を使用する場合、チップの耐熱性や強度を確保することもできる。
【００８８】
また、第一の基材４０１’の厚みが０．０５ｍｍ〜３ｍｍの範囲にある場合、良好な可視光透過性、耐熱性、強度を確保でき、流路とウェルの加工を確実に行うことができる。なお、第一の基材は射出成形、真空成形等の各種樹脂成形法や、機械切削などを用いることができる。第一の基材側にウェル１０２、流路及び担持部４０５を形成することによって、赤外線照射側である第二の基材を板状あるいはフィルム状の基材とすることができ、後述のように、融着ムラのない張り合わせが可能である。また第一の基材の少なくともウェルの底部は、蛍光反応等の光学測定のため、平坦な面を形成する。
【００８９】
また、赤外線レーザで第一の基材４０１と第二の基材４０２’を溶着する際、レーザ溶着の効率を上げるため、第一の基材は赤外線レーザに対して光吸収性であることが好ましい。特に第一の基材の少なくとも張り合わせ面を含む一部が赤外線吸収することにより、樹脂を溶融させ、接着することが容易である。
【００９０】
また第一の基材４０１’に赤外線吸収剤を含有することによって、赤外線レーザ光を吸収し、赤外線の光エネルギーを熱エネルギーに変換する効率を上げることができる。また赤外線吸収剤を含有させることで赤外線部分に吸収がない樹脂を用いることができる。赤外線レーザ光は、一般的に７５０ｎｍ以上の波長を有する半導体レーザを使用することによって得られる。したがって、赤外吸収剤としては、７５０ｎｍ以上の領域に最大吸収波長を有する化合物、いわゆる色素化合物を使用することができる。色素化合物は、一般的に染料と顔料の２つの種類に分けることができるが、樹脂基材との相溶性や透明性の観点から、染料タイプのものが好ましい。さらに可視光領域の透明性を確保するため、できるだけ７５０ｎｍ以下の可視領域に吸収の少ない赤外線吸収剤が好ましい。具体的な例としては、ＢＡＳＦ社のＬｕｍｏｇｅｎ（登録商標）ＩＲ７６５、Ｌｕｍｏｇｅｎ（登録商標）ＩＲ７８８などが挙げられる。
【００９１】
例えば、ポリプロピレンを樹脂基材として使用される場合、ポリプロピレンは赤外線部分に吸収がないため、プロピレン樹脂に赤外線吸収剤を添加することが必要である。具体的には、一例として、予めプロピレン樹脂１００重量部に対して赤外線吸収剤を０．０１重量部添加し、コンパウンドし赤外線吸収剤含有のプロピレン樹脂ペレットを作製する。これを用いて射出成形によって本実施形態の試料分析チップの第一の基材が作製される。また、予めプロピレン樹脂１００重量部に対して赤外線吸収剤を０．１重量部添加し、赤外線吸収剤含有のプロピレン樹脂マスターバッチを作製する。そして、射出成形を行う際、前記の赤外線吸収剤含有のプロピレン樹脂マスターバッチとプロピレン樹脂との一定の割合で混合して射出成形を行うことによって、赤外線吸収剤の含有量を調整することができる。
【００９２】
第二の基材４０２’としては、赤外線レーザに対して透過性を有することが必要である。第二の基材に用いる材料としては、第一の基材と同じ又は近い組成を有する樹脂が好ましい。例えば、第一の基材にポリプロピレンを使う場合、第二の基材はホモポリプロピレンやポリプロピレンとポリエチレンとのランダム共重合体が好ましい。組成の同じ又は近い樹脂同士は、一般的に接着しやすい。また、組成の同じ又は近い樹脂は、普通溶融温度の差が小さい。これによって、レーザ溶着の効果を挙げることができる。
【００９３】
第二の基材４０２’は、第一の基材と同様な方法でウェル１０２、流路及び担持部４０５を形成することが可能であるが、両面が平滑面の板状あるいはフィルム状の基材であることが好ましい。板状あるいはフィルム状の基材であれば、基材の膜厚差等に起因する融着ムラがなく第一の基材と第二の基材を密着性よく張り合わせるができる。また、第二の基材の厚みは、０．０１ｍｍ〜２ｍｍ、より好ましくは、０．０５〜０．５ｍｍの範囲にあれば、第二の基材の溶着性や強度を確保することができる。さらに、第二の基材は、ヒートブロックと接するため、前記の厚みであれば、十分な熱効率を得ることができる。
【００９４】
図１２は、図１１Ｂの試料分析チップの破線Ｓでの断面図である。注入される液体試料をすべてのウェルに充満するため、注入口と連通している主流路の容積は、各ウェルの容積の合計より大きい必要がある。ただし、ウェルに試薬が固定されている場合、その分ウェルに入れる液体試料の量が減るため、主流路の容積をその分減少してもよい。
【００９５】
図１２に示す本発明の試料分析チップでは、各ウェルに試薬が固定されている。各ウェルにそれぞれ異なる試薬を固定することによって、１つ検体（試料）に対して複数の処理を施すことができる。また、実際反応を行うための試薬の一部を各ウェルに固定してもよい。残りの試薬は液体試料と一緒に導入することができる。
【００９６】
基材を張り合わせる前に、ウェル１０２に反応用の試薬５０１を固定する。各ウェルで異なる試薬を用いることができる。各反応ウェルにそれぞれ異なる試薬を固定することによって、１つ検体（試料）に対して複数の処理を施すことができる。また、実際反応を行うための試薬の一部を各ウェルに固定し、残りの試薬は液体試料と一緒に導入するようにしてもよい。これによって、チップの保存性が向上すると共に各ウェルに異なる反応を行うことができ、複数の検査を同時に施すことができる。
【００９７】
試薬５０１の固定方法としては、例えば第１の基材４０１’のウェル部分に液体試薬をピペット等で滴下し、第一の基材を遠心装置で２０００〜３０００ｒｐｍ、５分程度遠心することで適量の液体試薬が液面を平坦な状態で残存するようにして、これを乾燥させることでウェルに固定することができる。
【００９８】
さらに、試薬をウェルに固定した後、ワックス５０２を滴下してもよい。具体的には、ワックスをホットプレート上に溶融させ、ピペットを用いて乾燥させた試薬を覆うように滴下する。このとき、ワックスは数秒で固化する。ワックスは、試薬をウェルの凹部に固定させる役割を有する。
【００９９】
次に、本発明の試料分析チップにおいては、第一の基材側４０１’のウェル１０２の窪みに試薬を固定した後、赤外線レーザで第一の基材と第二の基材４０２’とを溶着させることによって、密閉型のチップが製造される。赤外線レーザとしては、第一の基材表面を溶融させることができれば特に制限はないが、赤外線の波長としては８００〜１２００ｎｍがレーザ溶着に好都合で好ましい。実用的な観点から、レーザ溶着機の出力は３０以上であることが好ましい。例えば、出力３０〜２５０Ｗのレーザ機は一般的に市販されているので、これらのレーザ機を使えば特に問題ない。具体的には、第一の基材と第二の基材を貼り合せて、例えば波長８０８ｎｍ程度の赤外光フォトダイオートレーザを用いて、第二の基材側からレーザビームを一定の速度でスキャンしチップを照射することによって、第一の基材を第二の基材が溶着される。レーザの出力パワーとスキャン速度を調整することによって、レーザ溶着は効率よく行うことができる。以上の工程で、試料分析チップの製造が完了する。
【０１００】
次に本発明の各実施形態の試料分析チップを用いた試料分析方法について説明する。
【０１０１】
本発明の試料分析チップは、例えば、ＤＮＡ、たんぱく質等の試料において生化学物質の検出や分析に用いることができる。各ウェル１０２に試薬を固定し、液体試料を各ウェルに配液する。この場合には各ウェルで異なる試薬を用いることができる。あるいは試料を各ウェルに固定し、液体試薬を各ウェルに配液する。この場合には各ウェルで異なる試料を用いることができる。
【０１０２】
次に第一の基材４０１と第二の基材４０２を貼り合わせた本発明の試料分析チップに対して、まず、注入口４０３（１０７）から試薬等の溶液を主流路１０３に注入する。この段階では、主流路のみが溶液で満たされ、前述のように側路には浸入していない。これは、溶液の表面張力と、ウェル側には空気の抜け穴がないことによりウェル側からの空気圧があるためである。試料分析方法に用いる試料分析装置にはこのような溶液注入手段を備えていてもよい。
【０１０３】
次に、試料分析方法に用いる試料分析装置には試料分析チップを回転させるためのチップ回転機構を有する。チップ回転機構には、公知一般の遠心装置を用いることができる。試料分析装置に試料分析チップを設置し、回転機構によりチップの中心点でチップの垂直方向を回転軸として、チップを回転させる。回転速度としては溶液に掛かる遠心力が前述の空気圧と表面張力に打ち勝って、ウェルに流入する回転速度が必要である。チップの形態にも寄るが、約１０００ｒｐｍ以上であることが好ましい。チップの回転速度が約１０００ｒｐｍより小さいと、ウェルに溶液が流入せず、液量が一定にならないおそれがある。
【０１０４】
液体試料の配液後、試料・試薬の反応を阻害しないオイルを同様の工程で各ウェルに配液してもよい。オイルの注入によって、反応中に液の蒸発を防ぐことができる。オイルには先に配液した溶液よりも比重が軽いものを用いる必要がある。チップを回転させ、遠心力によって配液した際に、側路側で各ウェルの栓の役割をするためである。オイルの種類としては、試料・試薬の反応を阻害しないものであれば特に制限はないが、ミネラルオイルやシリコンオイルを好適に用いることができる。
【０１０５】
ワックス５０２を試薬の固定に用いる場合には、試料分析装置に電熱線等からなるヒータやペルチェ素子を用いた温度制御手段を備えていてもよい。ワックスの融点以上にチップを加熱することでワックスを溶融させ、ウェル内で試薬と溶液（試料）を混合させることができる。また当該温度制御手段は、例えばＰＣＲ反応等の試薬の反応制御にも用いることができる。
【０１０６】
その後、ウェルで試薬及び試料を混合し、反応状態を蛍光検出等の手法によって分析することができる。試料分析装置は、試料分析チップの基材上側のウェルの位置で測定を行なうための検出測定手段を有する。回転機構によりチップを回転させて、所定のウェルを測定することができる。本発明の試料分析チップでは基材の上側を透明とすることで、チップの外部から光学的測定を行なうことが可能である。
【０１０７】
以上のように各工程で試料分析チップに作用させる機構を備えることで、省スペースかつ試料分析の容易な試料分析装置とすることができる。
【０１０８】
次に本発明の試料分析方法の例を説明する。
【０１０９】
遺伝子解析の１例としては、例えば体細胞変異の検出や、生殖細胞変異の検出が挙げられる。遺伝子型の違いによって、発現するタンパク質の種類等が異なるため、例えば薬の代謝酵素の働きの違いを生み、結果として薬の最適投与量や副作用の出やすさ等に個人差が生じる。この事を医療現場で利用し、各患者の“遺伝子型”を調べる事で、オーダーメイド医療を行うことが出来る。
【０１１０】
・ＳＮＰｓの検出
ヒトゲノムの中には、その約０．１％に個人特有の塩基配列の違いが存在し、ＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）と呼ばれおり、生殖細胞変異のひとつである。ＳＮＰの特定方法の一つとして、例えば蛍光を用いたＰＣＲ‐ＰＨＦＡ（ＰＣＲ−Ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｈｏｍｏｄｕｐｌｅｘ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）法が利用されている。ＰＣＲ‐ＰＨＦＡ法は検出変異部位を増幅するＰＣＲ工程と、増幅断片と対応プローブによる競合的鎖置換反応工程から成り立っている。当該方法によれば、蛍光試薬の発光差によって変異を検出するが、本発明の試料分析チップを用いることで、各ウェルの配液バラツキが少ないため、正確なＳＮＰｓ検出を行うことが出来る。また上記以外のＳＮＰ検出方法としてインベーダー法（登録商標）、Ｔａｑｍａｎ ＰＣＲ法等についても同様に本発明の試料分析チップを用いることが可能である。
【０１１１】
以下に、本発明を用いてワルファリン（抗血液凝固剤。心臓病や高血圧用の薬として用いられる）に対する副作用に関与するＳＮＰついてＰＣＲ‐ＰＨＦＡ法を使った解析例を説明する。
【０１１２】
血液などから得られる検体核酸を精製して、溶液試料とする。本発明の試料分析チップに注入前または注入後配液前に、検体核酸の増幅を行なう。なお、ワルファリンに関与するＳＮＰの検出にはＶＫＯＲＣ１やＣＹＰ２Ｃ９内のＳＮＰが議論されることが多く、ＣＹＰ２Ｃ９＊２やＣＹＰ２Ｃ９＊３などが有名である。検体からこれらのＳＮＰを含む遺伝子断片をマルチプレックスＰＣＲにて増幅する。
【０１１３】
上記の検出方法では、一つのＳＮＰを判定するために２つの検出用のウェルが必要となるので１検体試料につき１０個以上のウェルが形成された試料分析チップを使用すると良く、それぞれのウェルに競合的鎖置換反応を行うためのＳＮＰ検出用の試薬を固定する。
【０１１４】
上記ＰＣＲにより核酸が増幅された試料を、各ウェルに配液充填する。各ウェルを温調し、前記試薬に混入された蛍光試薬の発光差によって変異を検出する。一つのＳＮＰに対し２つのウェルのうち一つのみ陽性反応ならばホモ、二つ陽性ならヘテロと判定することができる。
【０１１５】
・Ｋ‐ｒａｓ遺伝子変異の検出
上がん細胞に特徴的な変異、また分子標的薬に抵抗性を示す変異はそのほとんどが体細胞変異である．生殖細胞変異（ＳＮＰなど）の場合、どの細胞でも共通の変異が見られるのに対し、体細胞変異では変異を起こした細胞でのみ変異がみられ、変異を起こしていない細胞（通常は正常細胞）では変異は見られない．
【０１１６】
つまり、試料のうちの多くは正常細胞で一部変異細胞が含まれる場合、多くの正常な遺伝子中に存在するわずかな変異遺伝子を検出しなければならず、この点が生殖細胞における変異検出と異なる点で、体細胞の遺伝子変異検出をより困難にしている点である．
【０１１７】
Ｋ‐ｒａｓ遺伝子は変異ががん細胞に存在すると分子標的薬がほとんどの患者群で奏効しないことが示された遺伝子であり、この遺伝子を簡便、迅速、安価、高精度に検出することが希望されつつある。
【０１１８】
以下に、Ｋ‐ｒａｓ遺伝子のＰＣＲ‐ＰＨＦＡ法での解析例を説明する．
【０１１９】
上記遺伝子変異の検出用のウェルにはプローブ核酸を含む試薬が固定される。Ｋ‐ｒａｓ遺伝子の検出は野生型と１３種類の変異があるので少なくとも１４のウェルが形成された本発明の試料分析チップを使用し、当該ウェルのそれぞれに対応した試薬が固定化されていることが好ましい。
【０１２０】
大腸癌などのがん細胞を採取し、検体核酸を精製して、溶液試料とする。本発明の試料分析チップに注入前または注入後配液前に、検体核酸の増幅を行なう。
【０１２１】
上記ＰＣＲにより核酸が増幅された試料を、各ウェルに配液充填する。ウェルを温調し、前記試薬に混入された蛍光試薬の発光差によって変異を検出することができる。
【０１２２】
（実施例）
以下に本発明における実施例を示すが本発明はこれらに限定されるものではない。
【０１２３】
＜実施例１＞
実施例１では、本発明の試料分析チップをＳＮＰｓ解析チップとして用いた例を示す。
ＳＮＰｓチップ基材として、ポリプロピレン樹脂を用いて、図２に示すような円盤状の外形を持ち、同心円上に波状の主流路１０３と、主流路谷部１０３ｂに連絡口を持つ側路１０５と、側路の末端にウェル１０２を有するチップを射出成形により形成した。この基材（ポリプロピレン基材）にはそれぞれ２３個のウェル及び側路が形成されている。また主流路は周期的に面積を変え、隣接する主流路山部１０３ａの間の主流路の容積は１２μｌとなるように設計した。
【０１２４】
上記ポリプロピレン基材と貼り合わせる第二の基材として、樹脂コーティング層としてポリプロピレン樹脂がコーティングされたアルミシート基材を用いた。樹脂コーティング層には、厚みが約０．０７ｍｍのものを使用した。樹脂コーティング層は融点が１２０度前後であり、アルミニウム側に熱を与えれば溶融するように該アルミ基材にコーティングされている。
【０１２５】
さらに、アルミニウム層と樹脂コーティング層の間にカーボンを練りこんだアンカー層が設けられ、レーザ光照射による発熱でも樹脂コーティング層が溶融する構成となっている。
【０１２６】
該ポリプロピレン基材上のウェルにはインベーダー反応用プローブ試薬とＤＮＡポリメラーゼ、クリベースといった酵素類をピペットで滴下し乾燥固定させた。
【０１２７】
該ポリプロピレン基材と該アルミ基材を重ね合わせ、アルミ基材側に１３０度以上の熱を加えることで、該樹脂コーティング層を溶融させて該ポリプロピレン基材とアルミ基材を溶着した。
【０１２８】
上記の工程で作製したチップに、精製されたゲノムを加えたバッファ溶液を溶液試料としてピペットにて送液し、主流路１０３に充填した。この段階ではウェル及び側路には試料は浸入していなかった。
【０１２９】
なお上記各試薬類は下記表１に記載した分量で用いた。
【０１３０】
【表１】
【０１３１】
送液後、５０００ｒｐｍにてチップ中心を軸としてチップを回転させたところ、各ウェルには１１μｌの試料が送液された。チップに遠心力を与える手段として、化学、生物反応における試薬の分離などに用いられる卓上小型遠心機を利用した簡易な遠心装置を作成し、これを用いた。遠心時の回転数は回転数測定器にて測定して調整した。
【０１３２】
なお、遠心時のチップの回転方向に関しては、側路の傾き方向に対していずれの方向に回転させた場合でも回転数の増加中はチップ内の液挙動に影響を及ぼすが、ウェルの配液のばらつきに影響しない事が確認できた。
【０１３３】
続いて、反応に阻害の無いミネラルオイルを同様の手法で送液したところ、試料はウェルを満たし、残った溶液で側路の半分程度を満たし、オイルは側路の残り半分と流路谷の８割を満たした。
【０１３４】
なお、本実施例はウェル２２箇所に反応用試薬としてインベーダー反応用プローブを固定した。また、反応結果の成否を判定するために、コンタミネーションの有無の確認としてネガティブコントロールを１箇所に設定し、１枚のチップ上で反応試験を行った。
【０１３５】
該反応容器がオイルによって独立した状態の試料分析チップに９５℃と６８℃を交互に３５サイクルかけ、ＰＣＲ反応によってサンプルのゲノムを増幅する。続いて、６３℃で３０ｍｉｎ温調することにより、酵素反応によりウェル内で蛍光検出反応を生じる。
【０１３６】
また、このときチップのポリプロピレン基材側は透明であることから、蛍光検出をポリプロピレン基材を通して外部から行った。本実施例では光電子増倍管と光ファイバを組み合わせた蛍光検出装置によって上記蛍光反応を測定した。
【０１３７】
図１３及び１４は本実施例によって検出された蛍光反応によるＳＮＰｓの解析結果のグラフである。各グラフの縦軸は検出された光の強度であり、蛍光の強度を示す。横軸は時間軸である。
【０１３８】
図１３は反応を行った１つのウェルの結果であり、所定の時間内に混合した試薬類による蛍光検出反応が生じていることが確認された。
【０１３９】
図１４は試薬類をあらかじめ固定していないウェルのため、蛍光反応は検出されなかった。これにより両隣からのコンタミネーションは生じていないことが確認された。
【０１４０】
また、図１５はポリプロピレン製のチューブにて一般的な手法で最適の分量比で試薬類とサンプルを混合して得られた検出データである（ポジティブコントロール）。図６と図８を比較すると、図１５が示す本実施例によるチップ内の反応は図８の反応と一致していることから、本実施例では最適な分量比による反応であることが確認できる。これにより、所望した量のサンプルを配液できていることが分かる。
【０１４１】
本実施例１のように本発明では貼り合わせる基材を反応に合った材質で選定することで、より簡易に、かつ短時間で効率よく反応工程を行うことが可能となった。
【０１４２】
＜実施例２＞
実施例２として、別の流路の形状の本発明試料分析チップの検討を行なった。
【０１４３】
本実施例では、図３に示した形状の試料分析チップを作製した。実施例１では生化学反応の阻害物質の混合を防ぐために耐薬品性の高いポリプロピレン樹脂を射出成形することによりチップを製作したが、流路形状の検討を行うために今回はアクリル樹脂をφ６ｍｍからφ０．４ｍｍまでのエンドミルによって機械切削加工し、流路形状を形成した。
【０１４４】
実施例１で使用した図２の形状の試料分析チップ（チップ１）及び上記図３の形状の試料分析チップ（チップ２）にブロモフェノールブルー色素で色付けをした純水を主流路に送液し、実施例１同様に５０００ｒｐｍで円形状のチップの中心を軸に回転させ、１０回の試行でばらつきを計測した。なお、いずれの試料分析チップも各ウェルに均等に送液されたと想定した場合の液量は１２μｌである。
【０１４５】
チップ１では、送液量は最小値で９．５μｌ、最大値で１４．０μｌであった。これに対し、チップ２でのばらつきは最小値で１１．０μｌ、最大値で１２．５μｌとなり、配液量のばらつきをさらに大きく抑制できる事が示された。
【０１４６】
＜実施例３＞
実施例３における本発明に係る試料分析チップの第一の基材４０１として、ポリプロピレン樹脂を用いて、図７に示すような円盤状の外形を持ち、同心円上に波状の主流路１０３と、主流路谷部１０３ｂに連絡口を持つ側路１０５と、側路の末端にウェル１０２を有し、さらに側路から分岐したウェル分岐流路１０５ａと廃液チャンバ分岐流路１０４ａ、及び廃液チャンバ１０５ｂを有するチップを射出成型により形成した。この基材（ポリプロピレン基材）にはそれぞれ２３個のウェル及び側路が形成されている。主流路は周期的に面積を変え、主流路の山と山の間の谷部１０３ｂの容積は１５μｌとなるように設計し、また、ウェル分岐流路の容積が、２μｌ、ウェルの内容積が１１μｌ、廃液チャンバの容積が５μｌとなるように設計した。
【０１４７】
上記ポリプロピレン基材と貼り合わせる第二の基材４０２として、樹脂コーティング層としてポリプロピレン樹脂がコーティングされたアルミシート基材を用いた。樹脂コーティング層には、厚みが約０．０７ｍｍのものを使用した。樹脂コーティング層は融点が１２０度前後であり、アルミニウム側に熱を与えれば溶融するように該アルミ基材にコーティングされている。
【０１４８】
さらに、アルミニウム層と樹脂コーティング層の間にカーボンを練りこんだアンカー層が設けられ、レーザ光照射による発熱でも樹脂コーティング層が溶融する構成となっている。
【０１４９】
該ポリプロピレン基材上のウェルにはインベーダー反応用プローブ試薬とＤＮＡポリメラーゼ、クリベースといった酵素類をピペットで滴下し乾燥固定させた。
【０１５０】
該ポリプロピレン基材と該アルミ基材を重ね合わせ、アルミ基材側に１３０度以上の熱を加えることで、該樹脂コーティング層が溶融させて該ポリプロピレン基材とアルミ基材を溶着した。
【０１５１】
上記の工程で作製したチップに、精製されたゲノムを加えたバッファ溶液を溶液試料としてピペットにて送液し、主流路１０３に充填した。この段階ではウェル及び側路には試料は浸入していなかった。
【０１５２】
なお上記各試薬類は実施例１の表１に記載した分量と同様の分量で用いた。
【０１５３】
送液後、５０００ｒｐｍにてチップ中心を軸としてチップを回転させたところ、各ウェルとウェル分岐流路が満たされ、廃液チャンバには０．５μｌ〜３μｌの溶液が溜められた。各ウェルには１１μｌの試料が送液された。チップに遠心力を与える手段として、化学、生物反応における試薬の分離などに用いられる卓上小型遠心機を利用した簡易な遠心装置を作成し、これを用いた。遠心時の回転数は回転数測定器にて測定して調整した。
【０１５４】
なお、遠心時のチップの回転方向に関しては、側路の傾き方向に対していずれの方向に回転させた場合でも回転数の増加中はチップ内の液挙動に影響を及ぼすが、ウェルの配液のばらつきに影響しない事が確認できた。
【０１５５】
続いて、反応に阻害の無い試薬類表（表１）記載のミネラルオイルを同様の手法で送液したところ、試料はウェルを満たし、残った溶液で側路の半分程度を満たし、ミネラルオイルはウェル分岐流路と廃液チャンバ分岐流路及び側路を完全に満たし、主流路の一部を満たした。
【０１５６】
なお、本実施例はウェル２２箇所に反応用試薬としてインベーダー反応用プローブを固定した。また、反応結果の成否を判定するために、コンタミネーションの有無の確認としてネガティブコントロールを１箇所に設定し、１枚のチップ上で反応試験を行った。
【０１５７】
該反応容器がオイルによって独立した状態の試料分析チップに９５℃と６８℃を交互に３５サイクルかけ、ＰＣＲ反応によってサンプルのゲノムを増幅する。続いて、６３℃で３０ｍｉｎ温調することにより、酵素反応によりウェル内で蛍光検出反応を生じる。
【０１５８】
また、このときチップのポリプロピレン基材側は透明であることから、蛍光検出をポリプロピレン基材を通して外部から行った。本実施例では光電子増倍管と光ファイバを組み合わせた蛍光検出装置によって上記蛍光反応を測定した。
【０１５９】
測定の結果、実施例１と同様に、各ウェルに配液された試薬により、所定の時間内に混合した試薬類による蛍光検出反応が生じていることが確認され、一般的な手法で最適の分量比で試薬類とサンプルを混合して得られた検出データと同様の結果が得られた。また、ネガティブコントロールのウェルでは、蛍光反応は検出されなかった。これにより両隣からのコンタミネーションは生じていないことが確認された。
【０１６０】
＜実施例４＞
本発明の試料分析チップの実施例として、図１１（Ｂ）及び図３に記載された試料分析チップを作製した。第一の基材４０１’は、ポリプロピレン樹脂を用いて射出成形により加工した。側路１０５の幅は約１ｍｍであり、ウェル１０２は上部が平坦な台形になっており、ウェル底部の直径は約３ｍｍで、容積約７μｌである。
【０１６１】
ポリプロピレンは赤外線部分に吸収がないため、プロピレン樹脂に赤外線吸収剤を添加することが必要である。本実施例では、予めプロピレン樹脂１００重量部に対して赤外線吸収剤としてＢＡＳＦ社のＬｕｍｏｇｅｎ（登録商標）ＩＲ７６５を０．０１重量部添加し、混合して赤外線吸収剤含有のプロピレン樹脂ペレットを用意し、これを用いて射出成形により上記試料分析チップの第一の基材を作製した。
【０１６２】
また第二の基材４０２’として、厚み約０．１５ｍｍのプロピレンフィルムを使用した。
【０１６３】
第一の基材４０１’上のウェルにはインベーダー反応用プローブ試薬とＤＮＡポリメラーゼ、クリベースといった酵素類をピペットで滴下し乾燥固定させた。
【０１６４】
第一の基材４０１’と第二の基材４０２’を重ね合わせ、波長８０８ｎｍ、出力１４０Wの赤外光フォトダイオートレーザを用いて、第二の基材側からレーザビームを一定の速度でスキャンしチップを照射することによって、第一の基材を第二の基材を溶着した。
【０１６５】
上記の工程で作製したチップに、バッファ溶液と精製されたゲノムを加えたバッファ溶液を溶液試料としてピペットにて送液し、主流路１０３に充填した。この段階ではウェル及び側路には試料は浸入していなかった。
【０１６６】
なお上記各試薬類は実施例１の表１に記載した分量と同様の分量で用いた。
【０１６７】
送液後、５０００ｒｐｍにてチップ中心を軸としてチップを回転させたところ、各ウェルに１１μｌの試料が送液された。チップに遠心力を与える手段として、化学、生物反応における試薬の分離などに用いられる卓上小型遠心機を利用した簡易な遠心装置を作成し、これを用いた。遠心時の回転数は回転数測定器にて測定して調整した。
【０１６８】
続いて、反応に阻害の無い試薬類表（表１）記載のミネラルオイルを同様の手法で送液したところ、試料はウェルを満たし、残った溶液で側路の半分程度を満たした。
【０１６９】
なお、本実施例はウェル２２箇所に反応用試薬としてインベーダー反応用プローブを固定した。また、反応結果の成否を判定するために、コンタミネーションの有無の確認としてネガティブコントロールを１箇所に設定し、１枚のチップ上で反応試験を行った。
【０１７０】
該反応容器がオイルによって独立した状態の試料分析チップに９５℃と６８℃を交互に３５サイクルかけ、ＰＣＲ反応によってサンプルのゲノムを増幅する。続いて、６３℃で３０ｍｉｎ温調することにより、酵素反応によりウェル内で蛍光検出反応を生じる。
【０１７１】
また、このとき蛍光検出をチップの第一の基材４０１’側の外部から行った。本実施例では光電子増倍管と光ファイバを組み合わせた蛍光検出装置によって上記蛍光反応を測定した。
【０１７２】
測定の結果、実施例１と同様に、各ウェルに配液された試薬により、所定の時間内に混合した試薬類による蛍光検出反応が生じていることが確認され、一般的な手法で最適の分量比で試薬類とサンプルを混合して得られた検出データと同様の結果が得られた。また、ネガティブコントロールのウェルでは、蛍光反応は検出されなかった。これにより両隣からのコンタミネーションは生じていないことが確認された。
【０１７３】
（産業上の利用可能性）
本発明の反応チップは、例えば核酸等の試料において生化学物質の検出や分析に用いることができる。特にＳＮＰの変異を検出できることから、がんなどの遺伝子、生殖細胞や体細胞遺伝子の変異を検出する手法へ利用することができる。また、複数の溶液を混合する容器、反応容器として利用することが可能である。
【０１７４】
（産業上の利用可能性）
本発明の反応チップは、例えば核酸等の試料において生化学物質の検出や分析に用いることができる。特にＳＮＰの変異を検出できることから、がんなどの遺伝子、生殖細胞や体細胞遺伝子の変異を検出する手法へ利用することができる。また、複数の溶液を混合する容器、反応容器として利用することが可能である。
【符号の説明】
【０１７５】
１０１・・・基材
１０２・・・ウェル
１０３・・・主流路
１０３ａ・・主流路山部
１０３ｂ・・主流路谷部
１０４・・・廃液部
１０４ａ・・・廃液チャンバ分岐流路
１０４ｂ・・・廃液チャンバ
１０５ａ・・・ウェル分岐流路
１０５・・・側路
１０７・・・ＩＮＬＥＴ／ＯＵＴＬＥＴ
４０１・・・第一の基材
４０１’・・・第一の基材（光透過性樹脂）
４０２・・・第二の基材
４０２’・・・第二の基材（赤外線透過性樹脂）
４０３・・・ＩＮＬＥＴ／ＯＵＴＬＥＴ（貫通孔）
４０５・・・担持部
５０１・・・固定試薬類
５０２・・・ワックス
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材に複数のウェルと、各前記ウェルに繋がる流路と、前記流路に溶液を注入するための注入口とを有し、前記基材を回転させて前記ウェルに溶液を配液する試料分析チップであって、
前記流路は、各前記ウェルに送液する主流路、および前記主流路と前記ウェルとを連絡する側路を有し、
該主流路は前記ウェルより回転中心側に設けられ、隣り合う前記ウェルの間で前記回転中心に対して一つの山を有するように形成され、
前記側路が、前記回転中心方向に対して傾いて形成され、
前記山は、前記山の頂点と前記回転中心とを通る基準線に対して、一方側で隣り合う前記主流路の山と連絡する幅広主流路と、他方側で隣り合う前記主流路の山と連絡し前記幅広主流路より路幅が小さい幅狭主流路とを有し、
前記幅広主流路における前記回転中心から離間した端部が、前記側路と連絡していることを特徴とする試料分析チップ。
【請求項２】
前記基材が円盤状であり、前記ウェルは該基材と同心円状に配置されていることを特徴とする請求項１に記載の試料分析チップ。
【請求項３】
前記主流路が、前記回転中心方向に対して傾いて形成されていることを特徴とする請求項１または２に記載の試料分析チップ。
【請求項４】
前記側路に余剰溶液を溜める廃液部が設けられたことを特徴とする請求項１ないし３のいずれかに記載の試料分析チップ。
【請求項５】
前記廃液部が、廃液を溜める廃液チャンバと、
前記側路を分岐し、該廃液チャンバと連絡する廃液チャンバ分岐流路と
を有することを特徴とする請求項４記載の試料分析チップ。
【請求項６】
前記廃液部は、前記回転中心方向に対して前記側路の内側に設けられていることを特徴とする請求項４に記載の試料分析チップ。
【請求項７】
前記ウェルに連通する分岐流路は前記廃液チャンバ分岐流路より送液時の圧力損失が低いことを特徴とする請求項５または６に記載の試料分析チップ。
【請求項８】
前記ウェルに連絡する分岐流路の断面積が、前記廃液チャンバ分岐流路の断面積よりも大きいことを特徴とする請求項７に記載の試料分析チップ。
【請求項９】
前記廃液チャンバ分岐流路よりも前記ウェルに連絡する分岐流路の表面粗さが小さいことを特徴とする請求項７に記載の試料分析チップ。
【請求項１０】
前記廃液チャンバ分岐流路の流路内表面を撥水処理したことを特徴とする請求項７に記載の試料分析チップ。
【請求項１１】
前記ウェルに連絡する分岐流路の流路内表面を親水処理したことを特徴とする請求項７に記載の試料分析チップ。
【請求項１２】
前記試料分析チップは前記ウェル及び前記流路を形成した第一の基材と、該基材と貼り合わせた第二の基材とを有する請求項１ないし１１のいずれかに記載の試料分析チップ。
【請求項１３】
前記基材のいずれか一方が光透過性材料で形成されていることを特徴とする請求項１２に記載の試料分析チップ。
【請求項１４】
前記第一の基材が光透過性の樹脂材料であり、前記第二の基材が金属材料であることを特徴とする請求項１３に記載の試料分析チップ。
【請求項１５】
前記第一の基材が、可視光に対して光透過性でありかつ赤外線に対して光吸収性の樹脂からなり、
前記第二の基材が、少なくとも波長８００ｎｍ以上の赤外線を透過する板状又はフィルム状であることを特徴とする請求項１３に記載の試料分析チップ。
【請求項１６】
前記第一の基材は、ポリプロピレン、ポリカーボネート、アクリル樹脂のいずれかの樹脂基材であることを特徴とする請求項１５に記載の試料分析チップ。
【請求項１７】
前記第一の基材は、８００ｎｍ以上の波長領域に吸収を有する赤外線吸収剤を含むことを特徴とする請求項１５又は１６に記載の試料分析チップ。
【請求項１８】
前記第二の基材は、ポリプロピレン、ポリカーボネート、アクリル樹脂のいずれかの樹脂基材であることを特徴とする請求項１５に記載の試料分析チップ。
【請求項１９】
前記第二の基材の厚みが、０．０５〜０．５ｍｍの範囲にあることを特徴とする請求項１２ないし１８のいずれか１項に記載の試料分析チップ。
【請求項２０】
前記第一の基材に試料分析チップを回転させるための担特部が設けられていることを特徴とする請求項１２ないし１９のいずれかに記載の試料分析チップ。
【請求項２１】
請求項１５〜１９のいずれかに記載の試料分析チップの製造方法であって、
前記第二の基材側から赤外線レーザを照射し、
前記第一の基材と前記第二の基材とを溶融接着し、張り合わせることを特徴とする試料分析チップの製造方法。
【請求項２２】
前記赤外線レーザの波長が、８００〜１２００ｎｍの範囲にあることを特徴とする請求項２１に記載の試料分析チップの製造方法。
【請求項２３】
前記第一の基材と前記第二の基材とを張り合わせる前に、前記ウェルに試薬を固定する工程を含むことを特徴とする請求項２１又は２２に記載の試料分析チップの製造方法。
【請求項２４】
請求項１ないし２０のいずれかに記載の試料分析チップを設置し、回転させる手段と、
前記ウェルでの反応を検出するための検出測定手段と、を有する試料分析装置。
【請求項２５】
請求項１ないし２０のいずれかに記載の試料分析チップの前記主流路に溶液を注入する工程と、
該試料分析チップを回転させて溶液を前記各ウェルに配液する工程と、
を有する試料分析方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の試料分析方法において、
前記ウェルに配液する工程の後に、ミネラルオイルを前記各ウェルに配液する工程を有することを特徴とする試料分析方法。
【請求項２７】
請求項２５又は２６に記載の試料分析方法を用いたことを特徴とする遺伝子解析方法。
【請求項１】
基材に複数のウェルと、各前記ウェルに繋がる流路と、前記流路に溶液を注入するための注入口とを有し、前記基材を回転させて前記ウェルに溶液を配液する試料分析チップであって、
前記流路は、各前記ウェルに送液する主流路、および前記主流路と前記ウェルとを連絡する側路を有し、
該主流路は前記ウェルより回転中心側に設けられ、隣り合う前記ウェルの間で前記回転中心に対して一つの山を有するように形成され、
前記側路が、前記回転中心方向に対して傾いて形成され、
前記山は、前記山の頂点と前記回転中心とを通る基準線に対して、一方側で隣り合う前記主流路の山と連絡する幅広主流路と、他方側で隣り合う前記主流路の山と連絡し前記幅広主流路より路幅が小さい幅狭主流路とを有し、
前記幅広主流路における前記回転中心から離間した端部が、前記側路と連絡していることを特徴とする試料分析チップ。
【請求項２】
前記基材が円盤状であり、前記ウェルは該基材と同心円状に配置されていることを特徴とする請求項１に記載の試料分析チップ。
【請求項３】
前記主流路が、前記回転中心方向に対して傾いて形成されていることを特徴とする請求項１または２に記載の試料分析チップ。
【請求項４】
前記側路に余剰溶液を溜める廃液部が設けられたことを特徴とする請求項１ないし３のいずれかに記載の試料分析チップ。
【請求項５】
前記廃液部が、廃液を溜める廃液チャンバと、
前記側路を分岐し、該廃液チャンバと連絡する廃液チャンバ分岐流路と
を有することを特徴とする請求項４記載の試料分析チップ。
【請求項６】
前記廃液部は、前記回転中心方向に対して前記側路の内側に設けられていることを特徴とする請求項４に記載の試料分析チップ。
【請求項７】
前記ウェルに連通する分岐流路は前記廃液チャンバ分岐流路より送液時の圧力損失が低いことを特徴とする請求項５または６に記載の試料分析チップ。
【請求項８】
前記ウェルに連絡する分岐流路の断面積が、前記廃液チャンバ分岐流路の断面積よりも大きいことを特徴とする請求項７に記載の試料分析チップ。
【請求項９】
前記廃液チャンバ分岐流路よりも前記ウェルに連絡する分岐流路の表面粗さが小さいことを特徴とする請求項７に記載の試料分析チップ。
【請求項１０】
前記廃液チャンバ分岐流路の流路内表面を撥水処理したことを特徴とする請求項７に記載の試料分析チップ。
【請求項１１】
前記ウェルに連絡する分岐流路の流路内表面を親水処理したことを特徴とする請求項７に記載の試料分析チップ。
【請求項１２】
前記試料分析チップは前記ウェル及び前記流路を形成した第一の基材と、該基材と貼り合わせた第二の基材とを有する請求項１ないし１１のいずれかに記載の試料分析チップ。
【請求項１３】
前記基材のいずれか一方が光透過性材料で形成されていることを特徴とする請求項１２に記載の試料分析チップ。
【請求項１４】
前記第一の基材が光透過性の樹脂材料であり、前記第二の基材が金属材料であることを特徴とする請求項１３に記載の試料分析チップ。
【請求項１５】
前記第一の基材が、可視光に対して光透過性でありかつ赤外線に対して光吸収性の樹脂からなり、
前記第二の基材が、少なくとも波長８００ｎｍ以上の赤外線を透過する板状又はフィルム状であることを特徴とする請求項１３に記載の試料分析チップ。
【請求項１６】
前記第一の基材は、ポリプロピレン、ポリカーボネート、アクリル樹脂のいずれかの樹脂基材であることを特徴とする請求項１５に記載の試料分析チップ。
【請求項１７】
前記第一の基材は、８００ｎｍ以上の波長領域に吸収を有する赤外線吸収剤を含むことを特徴とする請求項１５又は１６に記載の試料分析チップ。
【請求項１８】
前記第二の基材は、ポリプロピレン、ポリカーボネート、アクリル樹脂のいずれかの樹脂基材であることを特徴とする請求項１５に記載の試料分析チップ。
【請求項１９】
前記第二の基材の厚みが、０．０５〜０．５ｍｍの範囲にあることを特徴とする請求項１２ないし１８のいずれか１項に記載の試料分析チップ。
【請求項２０】
前記第一の基材に試料分析チップを回転させるための担特部が設けられていることを特徴とする請求項１２ないし１９のいずれかに記載の試料分析チップ。
【請求項２１】
請求項１５〜１９のいずれかに記載の試料分析チップの製造方法であって、
前記第二の基材側から赤外線レーザを照射し、
前記第一の基材と前記第二の基材とを溶融接着し、張り合わせることを特徴とする試料分析チップの製造方法。
【請求項２２】
前記赤外線レーザの波長が、８００〜１２００ｎｍの範囲にあることを特徴とする請求項２１に記載の試料分析チップの製造方法。
【請求項２３】
前記第一の基材と前記第二の基材とを張り合わせる前に、前記ウェルに試薬を固定する工程を含むことを特徴とする請求項２１又は２２に記載の試料分析チップの製造方法。
【請求項２４】
請求項１ないし２０のいずれかに記載の試料分析チップを設置し、回転させる手段と、
前記ウェルでの反応を検出するための検出測定手段と、を有する試料分析装置。
【請求項２５】
請求項１ないし２０のいずれかに記載の試料分析チップの前記主流路に溶液を注入する工程と、
該試料分析チップを回転させて溶液を前記各ウェルに配液する工程と、
を有する試料分析方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の試料分析方法において、
前記ウェルに配液する工程の後に、ミネラルオイルを前記各ウェルに配液する工程を有することを特徴とする試料分析方法。
【請求項２７】
請求項２５又は２６に記載の試料分析方法を用いたことを特徴とする遺伝子解析方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公開番号】特開２０１２−１３２９３５（Ｐ２０１２−１３２９３５Ａ）
【公開日】平成２４年７月１２日（２０１２．７．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−７３３４４（Ｐ２０１２−７３３４４）
【出願日】平成２４年３月２８日（２０１２．３．２８）
【分割の表示】特願２０１１−５０７２２２（Ｐ２０１１−５０７２２２）の分割
【原出願日】平成２２年３月３０日（２０１０．３．３０）
【出願人】（０００００３１９３）凸版印刷株式会社 (10,630)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年７月１２日（２０１２．７．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年３月２８日（２０１２．３．２８）
【分割の表示】特願２０１１−５０７２２２（Ｐ２０１１−５０７２２２）の分割
【原出願日】平成２２年３月３０日（２０１０．３．３０）
【出願人】（０００００３１９３）凸版印刷株式会社 (10,630)
【Ｆターム（参考）】
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