試料観測装置及び試料観測方法
【課題】 光軸方向の構造を含む操作構造を用い、試料の観測を好適に行うことが可能な試料観測装置及び観測方法を提供する。
【解決手段】 第１基板１２及び第２基板１４を積層して構成され、第１基板１２に設けられた凹状構造部によって基板１２、１４の間に操作構造１５が形成された試料操作素子１０と、ステージ５０及び試料保持治具５４、５６によって構成されて操作素子１０を保持する素子保持部と、対物レンズ５８とによって試料観測装置１Ａを構成する。素子保持部は、操作構造１５の観測構造部２０に対し、基板１２、１４の積層方向に直交する軸を観測光軸Ａｘとして操作素子１０を保持する。また、対物レンズ５８は、操作素子１０の側面１１に対面するように光軸Ａｘ上に配置され、側面１１を介して観測構造部２０の内部にある試料の観測を行う。
【解決手段】 第１基板１２及び第２基板１４を積層して構成され、第１基板１２に設けられた凹状構造部によって基板１２、１４の間に操作構造１５が形成された試料操作素子１０と、ステージ５０及び試料保持治具５４、５６によって構成されて操作素子１０を保持する素子保持部と、対物レンズ５８とによって試料観測装置１Ａを構成する。素子保持部は、操作構造１５の観測構造部２０に対し、基板１２、１４の積層方向に直交する軸を観測光軸Ａｘとして操作素子１０を保持する。また、対物レンズ５８は、操作素子１０の側面１１に対面するように光軸Ａｘ上に配置され、側面１１を介して観測構造部２０の内部にある試料の観測を行う。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料の微小空間内での封止操作、または微小流路内での移動操作などを行う試料操作素子を用いて試料の観測を行うための試料観測装置、及び試料観測方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
様々な微量液体の簡便な取扱い、あるいは、その反応プロセスの計測等を目的として、微量液体試料の操作を行うための微小成形加工された操作素子が提案されている。そのような素子の１つとして、ＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane）と呼ばれるシリコーンゴムを材料としたシート状の基板部材を用い、凹状または溝状等の構造が所定のパターンで一方の面に形成されたＰＤＭＳ基板を他の基板に積層、密着させることで、試料に対する微小な封止構造、流路構造などの操作構造を構成する素子がある（試料操作素子については、特許文献１〜３、非特許文献１等を参照）。
【０００３】
このような素子では、例えば、試料を操作するための微小な操作構造に対応するパターンが形成されたマスク等によって型を作製し、この型を用いてＰＤＭＳ基板を作製する方法を用いることができる。この方法では、一度、型を作ってしまえば、簡単な操作で同じ素子を繰り返し作製して、試料の操作に利用することができる。また、ＰＤＭＳのシート基板は、ガラス基板などに対する吸着性が高く、２つの基板を密着させることによる微小構造の作成に適している。また、このような操作素子は、例えばガラスなどのＰＤＭＳ以外の材料による基板を用いても同様に構成することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００４−３３９１９号公報
【特許文献２】特開２００４−３０９４０５号公報
【特許文献３】特開２００７−２６８４９０号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】T. Thorsen et al., "Microfluidic Large-Scale Integration",Sience Vol.298 (2002) pp.580-584
【非特許文献２】K. Funakoshi et al., "Lipid Bilayer Formation by ContactingMonolayers in a Microfluidic Device for Membrane Protein Analysis", Anal.Chem. Vol.78 (2006) pp.8169-8174
【非特許文献３】鷲津正夫、「新しい黒膜作成法」、生物物理 Vol.35 No.1 (1995) pp.48-49
【非特許文献４】M. Gel et al., "Microorifice-Based High-Yield Cell Fusion onMicrofluidic Chip: Electrofusion of Selected Pairs and Fusant Viability",IEEE Transactions on Nanobioscience Vol.8 No.4 (2009) pp.300-305
【非特許文献５】T. Ide et al., "Simultaneous Optical and Electrical SingleChannel Recordings on a PEG Glass", Langmuir 26(11) (2009) pp.8540-8543
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記した微小操作構造を有する試料操作素子は、ＭＥＭＳ（Micro ElectroMechanical Systems）技術などの微細加工技術を利用して作製されるものであり、潜在的な高機能化性、及び高生産性が期待されている。しかしながら、操作素子の高機能化を図ると、その構造が複雑になり、ＭＥＭＳ等の特徴である高生産性が損なわれる可能性がある。
【０００７】
ＭＥＭＳを利用した微小な流路構造を有する試料操作素子は、例えば、ＣＡＤによるマスクの設計とマスク製作、紫外線重合性樹脂によるレプリカの製作、ＰＤＭＳ等の熱重合性樹脂による流路基板の製作、及び流路構造を覆う他の基板への流路基板の貼り付けによって作製される。このような方法では、流路構造が複雑になった場合でも、空間分解能が２μｍ程度の構造の作製が可能である。一方、さらに流路構造が複雑になり、例えば、顕微鏡光学系などの観測系に対して光軸方向（光の進行方向）にも構造を作りたい場合等には、上記のように微小構造が形成された流路基板を複数層にわたって重ねることで、３次元流路構造を構築する必要がある。
【０００８】
そのような操作素子の例として、全細胞記録に用いるパッチクランプ法、あるいは、１分子レベルの膜タンパク質の観測に用いる流路素子が考えられる。すなわち、生体膜あるいは人工膜上の膜タンパク質の観測では、試料操作素子において、全細胞の固定（トラップ）、あるいは、細胞から採取した生体膜や人工膜が構築できるような微細操作構造を設けることが必要である。具体的には、例えば、操作構造において観測用の空間として設けられた観測構造部の内部に、全細胞を固定、あるいは、生細胞から採取した生体膜や人工膜を張って、その空間を電気的に絶縁された２つの区画（コンパートメント）に分ける操作を行う。
【０００９】
このように観測構造部内に全細胞を固定、あるいは、生細胞から採取した生体膜および人工膜を形成する場合、膜の形成状態の観測、あるいは膜に取り込まれた１分子レベルのタンパク質の観測を考えると、観測系の光軸に対して垂直な面内に膜を形成することが好ましい。また、その膜の上下に分けられた２つのコンパートメントのそれぞれに対して、試料溶液の供給、交換などのための入力流路、出力流路を設けなくてはならない。
【００１０】
この場合、水平面（光軸に垂直な面）内に操作構造が形成された通常の操作素子ではなく、垂直方向（光軸方向）を含めて立体的に形成された操作構造が必要となる。このような操作素子を作製する場合、３次元流路構造の上方部分が形成された流路基板、及び下方部分が形成された流路基板の２層の流路基板を用意し、それらを重ね合わせる構成が考えられる。しかしながら、このような構成では、各基板に形成された微小操作構造を高精度に位置合わせして基板を重ね合わせることは困難、煩雑であり、試料操作素子の高生産性が損なわれることとなる。
【００１１】
本発明は、以上の問題点を解決するためになされたものであり、光軸方向の構造を含む微小操作構造を用い、全細胞を固定、あるいは、細胞から採取した生体膜、および、人工膜や膜タンパク質などの試料の観測を好適に行うことが可能な試料観測装置、及び試料観測方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
このような目的を達成するために、本発明による試料観測装置は、（１）光透過性材料から形成された第１基板、及び所定の材料から形成された第２基板を積層して構成され、第１基板の第２基板と密着する操作面に設けられた凹状構造部によって、第１基板と第２基板との間に試料の操作のための操作構造が形成された試料操作素子と、（２）操作構造に含まれて試料の観測に用いられる観測構造部に対し、第１基板及び第２基板の積層方向に直交する軸を観測光軸として試料操作素子を保持する素子保持手段と、（３）試料操作素子の側面に対面するように観測光軸上に、試料操作素子の側面を介して観測構造部の内部にある試料の観測を行うように配置される対物レンズとを備えることを特徴とする。
【００１３】
また、本発明による試料観測方法は、（ａ）光透過性材料から形成された第１基板、及び所定の材料から形成された第２基板を積層して構成され、第１基板の第２基板と密着する操作面に設けられた凹状構造部によって、第１基板と第２基板との間に試料の操作のための操作構造が形成された試料操作素子を準備する素子準備ステップと、（ｂ）操作構造に含まれて試料の観測に用いられる観測構造部に対し、第１基板及び第２基板の積層方向に直交する軸を観測光軸として試料操作素子を保持する素子保持ステップと、（ｃ）試料操作素子の側面に対面するように観測光軸上に対物レンズを配置し、対物レンズ、及び試料操作素子の側面を介して観測構造部の内部にある試料の観測を行う試料観測ステップとを備えることを特徴とする。
【００１４】
上記した試料観測装置、及び試料観測方法においては、光透過性材料からなり、所定のパターンで凹状構造部が形成された第１基板を、光透過性材料などの所定の材料からなる第２基板に対して積層、密着させることで、微小操作構造を有する試料操作素子を構成する。そして、基板間の操作面に直交する基板の積層方向に対し、積層方向に直交する軸を観測光軸として操作素子を保持し、対物レンズを含む観測光学系を介して操作素子の側面から観測構造部内の試料の観測を行っている。
【００１５】
このように、操作構造が形成された操作面に平行な軸を観測光軸に設定して、試料操作素子を保持することにより、第１、第２基板の間の操作面における観測構造部を含む操作構造を、光軸方向の構造を含む立体的な操作構造として利用することができる。そして、この状態で、対物レンズ及び試料操作素子の側面を介して試料の観測を行うことにより、観測構造部の内部にある細胞、あるいは、人工膜や膜タンパク質などの試料の観測を、好適に行うことが可能となる。
【００１６】
ここで、試料操作素子の具体的な構成については、試料操作素子の操作構造において、観測構造部は、その内部にある試料に対物レンズの焦点が合う位置に形成されていることが好ましい。このような構成によれば、観測構造部の内部にある試料を、対物レンズを介して好適に観測することができる。この場合の操作構造の例としては、対物レンズに対面する操作素子の側面の近傍に観測構造部を設ける構成がある。
【００１７】
また、試料操作素子において、対物レンズに対面する側面に、対物レンズと観測構造部との間で光が通過する光学面を含む側面凹状構造部が形成されていることが好ましい。このような構成によれば、観測構造部の内部にある試料を、操作素子の側面に形成された略平坦な光学面を介して好適に観測することができる。
【００１８】
また、具体的な操作構造の例としては、試料操作素子の操作構造において、観測構造部に対して、観測構造部の内部に試料を導入するための第１入力流路、第２入力流路と、観測構造部の内部から試料を排出するための第１出力流路、第２出力流路とが形成されている構成を用いることができる。このような構成は、上記した細胞、あるいは、人工膜や膜タンパク質などを試料とした観測に好適に適用することができる。また、操作素子における具体的な操作構造については、上記以外にも様々な構造を用いることが可能である。
【００１９】
試料の操作構造となる凹状構造部が設けられる第１基板の材料については、第１基板を構成する光透過性材料は、シリコーンまたはガラスであることが好ましい。また、第１基板を構成する光透過性材料がシリコーンである場合には、特に、ＰＤＭＳを用いることが好ましい。このような材料を用いることにより、第１、第２基板を積層、密着させて形成され、試料の観測に用いられる試料操作素子を、好適に構成することができる。ＰＤＭＳは、絶縁性が高いことが知られており、電気的な計測にも、そのまま用いることができるが、ガラスを素子として用いる場合には、一般的にはシランなどによりガラス表面の疎水処理を施すことが好ましいといわれている（非特許文献４参照）。シラン処理は、試料の観測、操作部分だけで充分である。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の試料観測装置、及び試料観測方法によれば、第１、第２基板を積層して構成された操作構造を有する試料操作素子に対し、基板の積層方向に直交する軸を観測光軸として操作素子を保持し、対物レンズを含む観測光学系を介して、操作素子の側面から観測構造部の内部にある試料の観測を行うことにより、光軸方向の構造を含む微小操作構造を用いて、試料の観測を好適に行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】第１、第２基板が積層された試料操作素子の基本構成を示す図である。
【図２】試料操作素子を用いた試料観測装置の一実施形態の構成を示す図である。
【図３】試料操作素子の観測構造部を含む操作構造の一例を示す斜視図である。
【図４】図３に示した操作構造を一部拡大して示す平面図である。
【図５】試料操作素子を用いた人工膜の形成方法について示す図である。
【図６】観測構造部の内部における人工膜の形成について示す模式図である。
【図７】試料操作素子の操作構造の他の例を示す平面図である。
【図８】試料操作素子の操作構造の他の例を示す平面図である。
【図９】試料操作素子の構成の他の例を示す斜視図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、図面とともに本発明による試料観測装置及び試料観測方法の好適な実施形態について詳細に説明する。なお、図面の説明においては同一要素には同一符号を付し、重複する説明を省略する。また、図面の寸法比率は、説明のものと必ずしも一致していない。
【００２３】
本発明による試料観測装置、観測方法において試料の操作、観測に用いられる試料操作素子は、試料に対する微小な封止構造、流路構造等の操作構造を有する素子であり、それぞれ所定の材料から形成された第１、第２基板を積層して構成される。また、第１基板の第２基板と密着する面である操作面には、凹状または溝状などの微小構造が形成され、この第１基板の操作面と、第２基板の操作面（試料載置面）とが密着することで、それらの間で試料の操作構造が構成される。最初に、このような試料操作素子について、その基本的な構成、使用形態について説明する。
【００２４】
ここで、以下においては、凹状構造が形成される第１基板の材料については、主にＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane、ポリジメチルシロキサン）を用いる場合を例として説明する。ＭＥＭＳ技術等を利用したＰＤＭＳの微細構造（マイクロ流路等）は、試料が微量ですむこと、他のデバイスと組み合わせて小型化できること、廉価であることなどにより、工業的な発展が期待されており、既に実用化されているものもある。
【００２５】
ＰＤＭＳは、モールディングによりサブミクロンの構造までが転写できること、自己吸着性があるので基板に貼り付けるだけでシールが可能であること、光学顕微鏡等を用いて生物試料等を観測する場合に無色透明であること、自家蛍光もほとんど見られないこと、生体試料に対して悪影響を及ぼさないこと、毒性がないこと等の利点を有する。ただし、試料操作素子の基板の材料については、後述するように、ＰＤＭＳ以外にも、例えばガラスなどの様々な材料を用いることが可能である。
【００２６】
図１は、本発明による試料観測装置、観測方法において用いられる、第１、第２基板が積層された試料操作素子の基本構成を模式的に示す図である。ここで、図１（ａ）は、第１基板と第２基板とを密着させる前における試料操作素子の状態を示し、図１（ｂ）は、第１基板と第２基板とを積層、密着させて、それらの間に操作構造が形成された試料操作素子とした状態を示している。
【００２７】
試料の観測に用いられる試料操作素子１０は、図１に示すように、光透過性材料から形成された第１基板１２と、所定の材料から形成された第２基板１４とによって構成されている。第１基板１２には、第２基板１４の試料載置面（図中の上面）１４ａと密着する操作面（図中の下面）１２ａに、凹状構造部１３が設けられている。これにより、第１基板１２と第２基板１４との間に、試料の操作を行うための操作構造１５が形成される。
【００２８】
図１（ｂ）では、試料操作素子１０に設けられる操作構造１５として、微小空間内で試料の封止操作を行う封止構造（微小チャンバ）を用いた例を示している。ここでは、第１基板１２と第２基板１４との間で凹状構造部１３によって構成された操作構造１５の空間内に、観測対象の試料Ｓ２を含む試料溶液Ｓ１が封止されている。また、操作構造１５としては、上記した封止構造以外にも、例えば、微小流路内で試料の移動操作を行う流路構造（微小流路）など、様々な構造を用いることができる。
【００２９】
このような試料操作素子１０に対し、操作構造１５の内部にある試料を観測する場合、通常、図中に矢印Ａによって示すように、第１、第２基板１２、１４の積層方向に沿った方向から観測を行う。しかしながら、このような構成では、例えば操作構造１５内の人工膜を観測対象とした場合に、人工膜を断面方向から観測することになって、その平面構造を観測することができないなど、試料観測についての自由度を充分に得られないという問題がある。これに対して、本発明による試料観測装置、観測方法は、図中に矢印Ｂによって示すように、第１、第２基板１２、１４の積層方向に直交する方向、すなわち、操作構造１５が形成された操作面１２ａに平行な方向から、操作素子１０の側面１１を介して、操作構造１５の内部にある試料の観測を行うものである。
【００３０】
図２は、試料操作素子を用いた試料観測装置の一実施形態の構成を示す図である。本実施形態による試料観測装置１Ａは、試料操作素子１０と、試料保持ステージ５０と、試料保持治具５４、５６と、対物レンズ５８とを備え、試料操作素子１０の操作構造の内部にある試料を、対物レンズ５８を含む観測光学系を介して、ステージ５０の下方から観測する顕微鏡装置として構成されている。
【００３１】
試料操作素子１０は、図１に関して上述したように、第１基板１２と第２基板１４との２層の基板を、その操作面と試料載置面とが密着した状態で積層して構成されている。また、第１基板１２の第２基板１４と密着する操作面には、所定パターンで凹状構造部１３が設けられ、この凹状構造部１３によって、第１基板１２と第２基板１４との間に試料の操作のための操作構造１５が形成されている（素子準備ステップ）。また、本実施形態の試料操作素子１０において、操作構造１５は、試料の観測に用いられる観測構造部２０を少なくとも含むパターンで構成されている。
【００３２】
この試料操作素子１０は、試料保持治具５４、５６を介して、保持ステージ５０によって保持されている。保持ステージ５０には、操作素子１０の観測構造部２０の内部にある試料を下方から観測するための光透過部となる開口部５２が設けられている。本実施形態においては、これらのステージ５０、及び保持治具５４、５６によって、操作素子１０を保持する素子保持手段が構成されている。
【００３３】
特に、図２に示す構成では、このステージ５０及び保持治具５４、５６からなる素子保持手段は、操作構造１５に含まれる観測構造部２０に対し、第１、第２基板１２、１４の積層方向に直交する軸（基板間の操作面に対して平行な軸）を観測光軸Ａｘとして、試料操作素子１０を縦向きに立てた状態で保持している。具体的には、第１基板１２側の第１試料保持治具５４と、第２基板１４側の第２試料保持治具５６とによって、操作素子１０を縦向きの状態で挟み込み、これらの操作素子１０、保持治具５４、５６をステージ５０上に載置することで、試料操作素子１０が保持されている（素子保持ステップ）。
【００３４】
この試料操作素子１０に対し、保持ステージ５０の開口部５２の下方には、対物レンズ５８が設置されている。対物レンズ５８は、縦置きの状態にされた試料操作素子１０の側面１１に対面するように、観測光軸Ａｘ上の所定位置に配置されている。これにより、図２に示す試料観測装置１Ａは、対物レンズ５８、及び試料操作素子１０の側面１１を介して、操作構造１５の観測構造部２０の内部にある試料の観測を行うことが可能なように構成されている（試料観測ステップ）。
【００３５】
このような構成において、対物レンズ５８を含む観測光学系の光軸となる観測光軸Ａｘは、第１基板１２の内部を通過する。このため、第１基板１２としては、光透過性材料から形成された基板、具体的には例えば、ＰＤＭＳ基板、ガラス基板などが用いられる。一方、第２基板１４としては、好ましくは、第１基板１２と同様に、ＰＤＭＳ基板、ガラス基板などの光透過性材料から形成された基板が用いられる。
【００３６】
また、図２に示す構成では、操作構造１５が設けられて縦向きに保持された試料操作素子１０において、対物レンズ５８に対面する側面１１に側面凹状構造部１６が形成されている。この側面凹状構造部１６のうちで、観測構造部２０側の面は、対物レンズ５８と観測構造部２０との間で光が通過する平坦な光学面となっている。また、操作素子１０の側面１１、または側面凹状構造部１６が形成されている場合にはその光学面において発生する収差が問題となる場合には、必要に応じて、操作素子１０と対物レンズ５８との間において、操作素子１０と屈折率が等しいイマージョンオイル１８が用いられる。
【００３７】
本実施形態による試料操作素子１０を含む試料観測装置１Ａ、及び試料観測方法の効果について説明する。
【００３８】
上記した試料観測装置１Ａ、及び試料観測方法においては、光透過性材料からなり、所定のパターンで凹状構造部が形成された第１基板１２を、光透過性材料などの所定の材料からなる第２基板１４に対して積層、密着させることで、操作構造１５を有する試料操作素子１０を構成する。そして、基板１２、１４の積層方向に直交する軸を観測光軸Ａｘとして、ステージ５０及び保持治具５４、５６によって操作素子１０を縦向きに保持し、対物レンズ５８を含む観測光学系を介して操作素子１０の側面（図中の下面）１１から観測構造部２０内の試料の観測を行っている。
【００３９】
このように、操作構造１５が形成された操作面に平行な軸を観測光軸Ａｘに設定して試料操作素子１０を保持することにより、第１、第２基板１２、１４の間の操作面における観測構造部２０を含む操作構造１５を、光軸Ａｘの方向の構造を含む立体的な操作構造として利用することができる。
【００４０】
すなわち、このような構成では、それぞれ操作構造が形成された複数の基板を用意し、それらを高精度に位置合わせして多段に重ね合わせることで立体的な操作構造とする構成に比べて、試料操作素子１０を縦置きにすることで容易に、光軸方向の構造を含む３次元操作構造を実現することができる。そして、この状態で、対物レンズ５８、及び試料操作素子１０の側面１１を介して試料の観測を行うことにより、観測構造部２０の内部にある人工膜や膜タンパク質などの試料の観測を好適に行うことが可能となる。なお、観測光軸Ａｘについては、さらに、対物レンズ５８に対面する操作素子１０の側面１１に対して略直交する軸に設定することが好ましい。
【００４１】
ここで、試料操作素子１０の具体的な構成については、操作素子１０の操作構造１５において、観測構造部２０は、その内部にある試料に対物レンズ５８の焦点が合う位置に形成されていることが好ましい。このような構成によれば、観測構造部２０の内部にある試料を、対物レンズ５８を介して好適に観測することができる。この場合の構造の例としては、試料操作素子１０の操作構造１５において、対物レンズ５８に対面する試料操作素子１０の側面１１の近傍に観測構造部２０を設ける構成がある。
【００４２】
また、図２に示した構成では、試料操作素子１０において、対物レンズ５８に対面する側面１１に、対物レンズ５８と観測構造部２０との間で光が通過する光学面を含む側面凹状構造部１６が形成されている。このような構成によれば、観測構造部２０の内部にある試料を、操作素子１０の側面１１に形成された凹状構造部１６の平坦な光学面を介して、好適に観測することができる。
【００４３】
すなわち、第１基板１２としてＰＤＭＳ基板を用いる場合、側面１１は例えばカッターによる切り出しで形成される。また、石英ガラス基板を用いる場合、側面１１は例えばダイシングによる切削で形成される。このような場合には、操作素子１０の側面１１では、光学観測に好適に用いることが可能な平面が得られない。これに対して、操作素子１０に操作構造１５とともに側面凹状構造部１６を形成しておき、その内側の平坦面を光学観測用の光学面として用いることにより、試料の観測を好適に行うことができる。なお、この側面凹状構造部１６については、側面１１において必要な平面度が得られている場合等、不要であれば設けない構成としても良い。
【００４４】
試料の操作構造１５となる凹状構造部が設けられる第１基板１２の材料については、第１基板１２を構成する光透過性材料は、シリコーン（シリコーン樹脂、シリコーンゴム）またはガラスであることが好ましい。また、第１基板１２を構成する光透過性材料がシリコーンである場合には、特に、第２基板１４に対する密着性に優れる、上述したＰＤＭＳを用いることが好ましい。このような材料を用いることにより、基板１２、１４を積層、密着させて形成される試料操作素子１０を、好適に構成することができる。
【００４５】
また、第１基板１２の材料については、上記したＰＤＭＳなどのシリコーン、あるいはガラス等に限らず、第２基板１４に密着して操作構造１５を形成可能であって、観測構造部２０の内部にある試料の観測が可能なものであれば、様々な材料を用いて良い。また、基板１２の材料の光透過性については、試料の観測に用いる光の波長を考慮して選択することが好ましい。例えば、観測光として赤外光を用いる場合には、第１基板１２としてシリコン基板を用いることも可能である。
【００４６】
また、第２基板１４の材料についても、第１基板１２と同様に、上記したシリコーン、ＰＤＭＳ、ガラス等の光透過性材料を用いることが好ましい。ただし、第２基板１４については、一般には、第１基板１２に対する密着性等を考慮して、操作構造１５を形成するために好適な材料から形成された基板を用いればよい。
【００４７】
第１基板１２及び第２基板１４の材料として、ＰＤＭＳ、またはガラスを用いる場合、その組合せについては、第１基板−第２基板がＰＤＭＳ−ＰＤＭＳ、ＰＤＭＳ−ガラス、ガラス−ＰＤＭＳ、ガラス−ガラス、のいずれの組合せを用いても良い。基板１２、１４をガラス＋ガラスによって構成する場合、基板同士の密着は、例えば熱融着によって実現される。また、基板１２、１４をＰＤＭＳ＋ガラス、ガラス＋ＰＤＭＳ、またはＰＤＭＳ＋ＰＤＭＳによって構成する場合、基板同士の密着は、そのまま接触させるか、もしくはプラズマ、紫外線などによる表面処理を行った後に接触させることで実現される。
【００４８】
また、試料操作素子１０における具体的な操作構造１５としては、例えば、操作構造１５において、観測構造部２０に対して、観測構造部２０の内部に試料を導入するための第１入力流路、第２入力流路と、観測構造部２０の内部から試料を排出するための第１出力流路、第２出力流路とが形成されている構成を用いることができる。このような構成は、上記した人工膜や膜タンパク質などを観測対象とした場合に、好適に適用することができる。以下、このような構成を例として、試料操作素子１０の具体的な構造、及びそれを用いた試料の観測について説明する。
【００４９】
図３は、図２に示した試料観測装置１Ａにおいて用いられる、試料操作素子１０の観測構造部２０を含む操作構造１５の一例を示す斜視図である。ここでは、試料操作素子１０を構成する第１基板１２及び第２基板１４について、それらを分解した状態でそれぞれの構造を示している。また、図４は、図３に示した試料操作素子１０における操作構造１５の構成について、観測構造部２０及び側面凹状構造部１６を含む側面１１側の部分を拡大して示す平面図である。
【００５０】
図３、図４に示す構成において、第１基板１２には、その操作面１２ａ上に、基板間の操作構造１５となる凹状構造部１３が所定パターン、所定深さで形成されている。本構成例による操作素子１０では、試料の観測に用いられる観測構造部２０として、微小な矩形チャンバ状の構造部２０が、対物レンズに対面する側面１１の近傍に設けられている。また、この観測構造部２０に対し、操作構造１５において、それぞれ２系統の入力流路、及び出力流路が設けられている。
【００５１】
具体的には、側面１１の近傍の略中央部に設けられている観測構造部２０に対して、図中の右側には、観測構造部２０の上部に接続する第１入力流路２５と、下部に接続する第２入力流路２６とが設けられている。また、第１入力流路２５、第２入力流路２６の観測構造部２０とは反対側の端部には、それぞれ円形状の第１入力部２１、第２入力部２２が設けられている。
【００５２】
また、図中の左側には、観測構造部２０の上部に接続する第１出力流路２７と、下部に接続する第２出力流路２８とが設けられている。第１出力流路２７、第２出力流路２８の観測構造部２０とは反対側の端部には、それぞれ円形状の第１出力部２３、第２出力部２４が設けられている。このような構成において、上部の流路２５、２７、及び下部の流路２６、２８の交差部分に、観測構造部２０が配置されている。また、観測構造部２０の下方の側面１１には、光が通過する平坦な光学面１７を含む側面凹状構造部１６が形成されている。
【００５３】
また、第１基板１２と積層される第２基板１４には、第１基板１２に形成された入力部２１、２２、及び出力部２３、２４に対応する位置に、それぞれ貫通孔からなる円形状の第１入力口３１、第２入力口３２、第１出力口３３、第２出力口３４が形成されている。第１入力流路２５に液体試料を導入する入力部２１、入力口３１に対し、第１入力チューブ３５が接続される（図２参照）。また、第２入力流路２６に液体試料を導入する入力部２２、入力口３２に対し、第２入力チューブ３６が接続される。また、第１出力流路２７から液体試料を排出する出力部２３、出力口３３に対し、第１出力チューブ３７が接続される。また、第２出力流路２８から液体試料を排出する出力部２４、出力口３４に対し、第２出力チューブ３８が接続される。
【００５４】
また、観測構造部２０には、図４に示すように、その第１入力流路２５と第２入力流路２６との間の所定位置に、突起部２０ａが設けられている。同様に、第１出力流路２７と第２出力流路２８との間の所定位置に、突起部２０ｂが設けられている。これらの突起部２０ａ、２０ｂは、観測構造部２０内における細胞の固定、あるいは、細胞から採取した生体膜や人工膜の形成に用いられる。
【００５５】
図３、図４に示した試料操作素子１０の作製手順の例について、以下に具体的に説明する。ここでは、操作素子１０を構成する第１、第２基板１２、１４の両者をＰＤＭＳ基板とするとともに、作製された操作素子１０を用いて、観測構造部２０の内部で人工膜の形成、観測、及び膜タンパク質の観測を行う例について説明する。
【００５６】
まず、第１基板１２に形成する操作構造１５の流路パターンをＣＡＤによって設計し、設計された流路パターンに対応するフォトマスクを石英基板上に作製する。また、シート状のＰＤＭＳ基板作製用の型に用いられるシリコン基板を用意し、その上面上に、スピンコートによって、紫外線硬化樹脂（ＳＵ−８３０００、日本化薬製）を塗布する。そして、ＳＵ−８が塗布されたシリコン基板上にフォトマスクを設置し、紫外線を照射して樹脂を硬化させ、現像、洗浄、乾燥過程を経て、微小流路パターンの型を得る。
【００５７】
次に、流路パターンの型をプラスチックケースの内部に設置し、プライマーを１／１０量加えた後、攪拌、脱気したＰＤＭＳ（Ｓｉｌｐｏｔ１８４、東レダウコーニング製）を適当量流し込む。そして、再度、脱気して、気泡がないことを確認した後、７５℃のオーブン内で１時間、ＰＤＭＳを熱硬化させる。硬化処理が終了したら、オーブンから取り出し、自然冷却させたシリコン基板上で硬化したＰＤＭＳシートを、適当な大きさに切り出して、シリコン基板の型から剥がすことで、ＰＤＭＳの第１基板１２が完成する。
【００５８】
ここで、第１基板１２に形成される操作構造１５の流路パターンにおいて、各流路の幅は例えば５μｍ、深さは例えば１０μｍである。また、入力流路、出力流路において、観測構造部２０の近傍での２系統の流路間の距離は例えば１５μｍである。また、流路間のギャップとして形成される観測構造部２０の幅（ギャップ間の距離）は例えば１０μｍである。細胞を固定する場合には、細胞の大きさに合わせて調整されることが好ましい。例えば大腸菌や精子の場合には１μｍ、動物細胞の場合には２μｍ程度である。また、第１基板１２の対物レンズに対面する側面１１から観測構造部２０の中心までの距離は、対物レンズの焦点距離等を考慮して例えば１６０μｍに設定される。また、側面凹状構造部１６の側面１１からの形成幅は、例えば１０μｍである。また、試料操作素子１０の全体のチップサイズは、例えば２５ｍｍ×１０ｍｍである。
【００５９】
続いて、第１基板１２に貼り合わせる平坦なＰＤＭＳの第２基板１４を用意する。この第２基板１４には、φ２ｍｍの生検トレパンを用いて、その４箇所に貫通孔による入力口３１、３２、出力口３３、３４を形成する。また、これらの貫通孔に対して、それぞれ同外径の液体試料の導入、排出用のチューブ３５、３６、３７、３８を差し込み、瞬間接着剤等によって接着、固定する。
【００６０】
チューブ３５〜３８がついた第２基板１４を、その入力口３１、３２、出力口３３、３４がそれぞれ対応する入力部２１、２２、出力部２３、２４に接続されるように位置合わせした状態で第１基板１２に貼り合わせて、試料操作素子１０とする。この際、ＰＤＭＳ基板の流路側を、３０秒程度プラズマ処理しておくと、両者の接着がより強固になる。なお、チューブの取り付け、基板の貼り合わせについては、どちらを先に行っても良い。
【００６１】
以上のように作製された試料操作素子１０を用い、観測構造部２０の内部において、人工膜の形成、観測を行うことを考える。図５は、試料操作素子１０を用いた人工膜の形成方法について示す図である。また、図６は、観測構造部２０の内部における人工膜の形成について示す模式図である。
【００６２】
観測構造部２０への人工脂質膜の形成は、基本的には非特許文献２に記載された方法を改良して行った。上記のように組み立てた試料操作素子１０の各チューブの先端には、図５に示すように、それぞれ三方コック、及びシリンジを取り付ける。なお、図５においては、説明の簡単のために、第１基板１２の入力部、出力部、第２基板１４の入力口、出力口、及びそれらに接続された入力チューブ、出力チューブについて図示を省略して、操作構造１５における入力流路２５、２６、及び出力流路２７、２８と、三方コック及びシリンジとの実質的な接続関係を示している。
【００６３】
図５に示す構成では、具体的には、第１入力流路２５の入力チューブに対し、三方コック６１を介して、試料導入用シリンジ６２、及びバッファ導入用シリンジ６３が接続されている。また、第２入力流路２６の入力チューブに対し、三方コック６６を介して、試料導入用シリンジ６７、及びバッファ導入用シリンジ６８が接続されている。また、第１出力流路２７の出力チューブに対し、三方コック７１を介して、溶液排出用シリンジ７２、及び気泡抜き用排出部７３が接続されている。また、第２出力流路２８の出力チューブに対し、三方コック７６を介して、溶液排出用シリンジ７７、及び気泡抜き用排出部７８が接続されている。
【００６４】
このような構成の試料操作素子１０、及び試料溶液の導入系、排出系を用いた人工膜の形成方法について説明する。なお、ここでは、観測構造部２０の内部に人工膜を形成するため、試料導入用シリンジ６２、６７から流路に供給する試料としては、脂質＋有機溶媒を用いるものとする。具体的には例えば、７ｍＭ−ＤＭＰＣ及び４ｍＭ−コレステロールを含んだｎ−デカン溶液を試料溶液として用いることができる。また、バッファ導入用シリンジ６３、６８から流路に供給するバッファ溶液としては、好ましくは、水溶液系のバッファ溶液が用いられる。
【００６５】
まず、出力側の三方コック７１、７６を、それぞれ気泡抜き用排出部７３、７８側に設定し、入力側のバッファ導入用シリンジ６３、６８により、流路２５〜２８、及び観測構造部２０の内部をバッファ溶液で満たす。排出部７３、７８にバッファ溶液が到達した時点で、三方コック７１、７６を溶液排出用シリンジ７２、７７側に変更する。
【００６６】
次に、下側の第２入力流路２６に接続された三方コック６６を試料導入用シリンジ６７側に変更し、１μＬ以下の容量の試料溶液（脂質＋有機溶媒）を流路２６に導入する。観測構造部２０のギャップ（下側のコンパートメント）の容積を満たすためには、この試料溶液は、例えば５００ｆＬ程度あれば良い。
【００６７】
第２入力流路２６に導入した試料溶液の先端が、観測構造部２０のコンパートメントに到達した時点で、上側の第１入力流路２５に接続された三方コック６１を試料導入用シリンジ６２側に変更し、同様に試料溶液を流路２５に導入する。これらの操作により、入力流路２５、２６からの試料溶液が観測構造部２０において接触した時点で、入力側の三方コック６１、６６をそれぞれバッファ導入用シリンジ６３、６８側に変更し、試料溶液の有機溶媒をバッファ水溶液で洗い流し始める。
【００６８】
観測構造部２０における上下のコンパートメント内の有機溶媒が残り少なくなってくると、観測構造部２０のギャップ部分において、脂質による人工膜が形成されつつあることを示す干渉縞が観測される。そして、それが最終的には、ほぼ黒くなって（黒膜）、観測構造部２０の内部での人工膜Ｓ３（図５参照）の構築がほぼ完了する。また、このように形成された人工膜Ｓ３を利用すれば、膜タンパク質の観測を好適に行うことができる。
【００６９】
観測構造部２０における人工膜Ｓ３の形成のメカニズムに関しては、推定の域を出ないが、脂質（両親媒性物質）の物理的な性質をもとに、図６に示すようなメカニズムで人工膜が形成されるものと推定される。すなわち、水溶液系のバッファ溶液Ｓ４で各流路２５〜２８及び観測構造部２０が満たされている状態で、図６（ａ）に示すように、第２入力流路２６から観測構造部２０の下側のコンパートメントへと、脂質Ｓ６を含んだ有機溶媒Ｓ５を導入する。
【００７０】
この状態で、さらに、第１入力流路２５から観測構造部２０の上側のコンパートメントへと、脂質Ｓ８を含んだ有機溶媒Ｓ７を導入する。そして、バッファ溶液Ｓ４によって有機溶媒Ｓ５、Ｓ７を洗い流すと、最終的に、図６（ｂ）に示すように、観測構造部２０の上下のコンパートメントの間において、脂質二重層からなる人工膜Ｓ３が形成される。なお、人工膜を形成するための観測構造部２０におけるギャップ構造の形状、物理化学的な性質等に関しては、非特許文献３、４においても記載がある。また、図５に示した構成の操作素子１０において、入力流路２５、２６、出力流路２７、２８に加えて、有機溶媒の洗浄補助用に追加の入力流路を設けて、３入力＋２出力の構成としても良い。
【００７１】
ここで、図５に示すように、操作素子１０を縦置きとした状態で、側面１１側から対物レンズ５８を介して観測構造部２０内の試料を観測する構成では、人工膜Ｓ３の２次元的な平面構造を観測することが可能である。この場合、例えば、人工膜Ｓ３の形成過程において、光の干渉の具合から膜の厚みを推定できるなどの利点がある。また、このような膜系について計測を行う場合、人工膜部分での電気抵抗のシールディングの確認が必要になる場合がある。この場合、電位計測、あるいは電流計測のための電極は、入力、あるいは出力チューブを分岐し、電極を設置して計測すれば良い。
【００７２】
膜タンパク質の観測について考えると、膜タンパク質の取扱いは、生体同様の膜構造があって始めて可能となる。膜タンパク質の特徴は、膜構造に内在するか周辺にあって、その構造を安定化し、機能を持つことである。膜は、両親媒性の性質を持つ脂肪酸が、自然科学の法則に従って、膜タンパク質以外の脂質等の疎水的な性質を持つ生体物質を取り込みながら構造を作る。
【００７３】
膜タンパク質の研究では、パッチクランプ法の開発により、１分子レベルでの機能の解明が行われるようになった。しかし、この方法も、ピペットの形状やガラス表面の化学的な性質を制御するには、熟練を要するという欠点がある。生体膜あるいは人工膜としての構造は、膜自身の厚みが例えば５０〜１００ｎｍと非常に薄いため、完全な構造を確認することが難しく、また、膜としての機能を電気的に確認することも困難である。
【００７４】
近年になって、ビデオマイクロスコピー法の発展により、平面膜法（非特許文献５）なども、膜タンパク質の１分子計測の実験系の構築において試みられるようになった。創薬研究の５０％が膜タンパク質に対するものであり、簡便な手法が望まれているという現状があるが、どの手法も研究レベルでは利用できるものの、構造の再現性に難があると考えられている。このような状況で、ＭＥＭＳ技術を利用した微小操作構造を有する試料操作素子にも期待がかかっている。しかしながら、このような試料操作素子においても、３次元操作構造の作製は容易ではない。
【００７５】
これに対して、上記のように試料操作素子１０を縦置きにすることで、操作構造１５を光軸方向の構造を含む立体的な操作構造として利用して、操作構造１５に設けられた観測構造部２０において試料の観測を行う構成によれば、図５、図６に示すように、人工膜の形成、観測、及び膜タンパク質の観測を、容易かつ確実に行うことが可能である。なお、観測構造部２０のギャップにトラップされた全細胞の膜の観測と操作、あるいは、細胞から採取した生体膜の観測と操作も、手順は多少異なるが、同様の操作により容易に行うことが可能である。
【００７６】
試料操作素子１０の構成について、さらに説明する。上記した構成例では、第１、第２基板１２、１４の両者をＰＤＭＳ基板としたが、ＰＤＭＳの第１基板１２に対して、第２基板１４をガラス基板等の他の材料からなる基板としても良い。また、操作構造１５となる凹状構造部１３が形成される第１基板１２を他の材料からなる基板、例えばガラス基板によって構成しても良い。
【００７７】
ガラス基板に所定パターンの凹状構造部を形成するための加工は、フォトリソグラフィ及びエッチングによって行うことができる。具体的には、ガラス基板表面に対してフォトレジスト（ポジ型レジストもしくはネガ型レジスト）を、スピンコートによって均一の厚み（例えば０．１〜２０μｍ）で塗布する。その後、所望のパターンに形成したフォトマスクを用いてレジストに対して露光を行い、現像することで、ガラス基板上に所望の形状のフォトレジストパターンを形成することができる。
【００７８】
このフォトレジストパターンをマスクとして、ガラス基板をエッチングによって加工して、最後にフォトレジストを剥離する。ガラス基板のエッチングには、ウエットエッチング、ドライエッチングを用いることができる。具体的には、ウエットエッチングには、フッ酸やバッファードフッ酸を用いることができる。ドライエッチングには、ＲＩＥ（反応性イオンエッチング）にＣＨＦ３などのＦ系ガスを用いて加工することができる。
【００７９】
ドライエッチングによってガラスを、例えば１０μｍ以上に深く加工する場合には、フォトレジストではエッチング選択比が小さい。このため、Ｃｒ、Ｔｉ、ａ−Ｓｉなどのメタル膜をあらかじめガラス基板上に、例えば０．１〜１０μｍの厚みで成膜し、このメタル膜をフォトエッチとエッチングによりパターニングし、パターニングされたメタル膜をマスクとしてガラスのエッチング加工を行っても良い。
【００８０】
ガラス基板に形成される凹状構造部において、溝状構造に段差を付ける場合には、一度エッチング加工したガラス基板に対してフォトレジストを形成し、アライメント露光装置によってレジストをパターニングし、段差を追加するべき部分を開口させて、エッチング加工によって段差を形成する。また、ガラス基板上に、３次元加工したレジストや樹脂を形成し、その形状をエッチングによってガラス基板に転写しても良い。
【００８１】
なお、この場合の基板の材料については、ガラスに限られるものではなく、光透過性の材料であれば良い。また、基板の加工についても、フォトエッチングに限らず、例えば多軸加工機や成型、ナノインプリントなど、様々な方法を用いて良い。また、第１基板１２をガラス基板とした場合、第２基板１４については、ガラス基板、ＰＤＭＳ基板のいずれを用いても良く、それ以外の材料の基板を用いても良い。
【００８２】
試料操作素子１０における観測構造部２０を含む操作構造１５の構成について、さらに説明する。操作構造１５の具体的な構成については、図３、図４に示した構成例に限られるものではなく、観測対象とする試料の種類、現象等に応じて、様々な構成の操作構造１５を用いることが可能である。
【００８３】
図７、図８は、それぞれ試料操作素子の操作構造の他の例を示す平面図である。図７に示す試料操作素子１０Ａの操作構造１５では、観測構造部２０、流路２５〜２８、及び光学面１７を含む側面凹状構造部１６については図３、図４に示した構成と同様であるが、第２基板１４から試料の導入、排出を行う円形状の入力部２１、２２、出力部２３、２４に代えて、素子側面から試料の導入、排出を行うように側面に露出した、半円形状の入力部２１ａ、２２ａ、及び出力部２３ａ、２４ａが形成されている。なお、図３、図７に示した構成において、不要な場合には側面凹状構造部１６を設けない構成としても良い。
【００８４】
図８（ａ）に示す試料操作素子１０Ｂの操作構造１５では、観測構造部２０に対し、１系統の入力流路２５、及び同じく１系統の出力流路２７のみが形成されている。このように、操作構造１５における流路パターンについては、試料操作素子の用途、試料の種類等に応じて様々なパターンに設定して良い。また、図８（ｂ）に示す試料操作素子１０Ｃの操作構造１５では、観測構造部２０を試料を封止する微小チャンバとして、流路パターンを形成しない構成としている。このような構成においても、試料の観測を好適に行うことができる。なお、図８（ａ）、（ｂ）に示した構成においても、必要な場合には側面凹状構造部１６を設ける構成としても良い。
【００８５】
図９は、試料操作素子の構成の他の例を示す斜視図である。ここでは、操作構造が形成された第１基板として複数の基板を用意し、それらを積層することで、さらなる高機能化を図る構成を示している。具体的には、図９に示す構成例では、同一パターンの操作構造１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃがそれぞれ形成された３層の流路基板１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃを基板の背を利用して積層し、最も外側の基板１２Ａに対して平板状の第２基板１４を積層することで、３層の３次元流路構造を有する試料操作素子１０Ｄを実現している。このような構成では、例えば３つの観測構造部において同時に人工膜の形成、観測を行うことが可能である。なお、ＰＤＭＳ基板を積層する場合には、表面をプラズマ処理しておくと、その接合がより強固になる。
【００８６】
また、図９に示す構成例では、３段に積層された基板１２Ａ〜１２Ｃにおける操作構造１５Ａ〜１５Ｃに対し、その側面から試料溶液を導入、排出するために追加的に基板８０を設け、この基板８０に形成された貫通孔８１、及び貫通孔８１に接続されたチューブ８２を介して、試料操作素子１０Ｄの各段の操作構造１５Ａ〜１５Ｃへの試料溶液の導入、排出を行っている。この構成では、３段の操作構造１５Ａ〜１５Ｃにおいて、人工膜の形成などの同じ操作を並行して行うため、試料溶液の導入、排出を全体で１系統として構成している。
【００８７】
なお、図９の構成においても、図３と同様に、第２基板１４側から試料溶液を導入、排出する構成としても良い。この場合、各基板１２Ａ〜１２Ｃでの入力部、出力部の位置合わせについては、アライナーを用いて、あるいはミリメートルオーダの位置合わせであれば目視で行うことができる。また、基板を積層した後に、生検トレパン等によって一気に必要な入力口、出力口等を形成するなどの方法も考えられる。
【００８８】
なお、ガラス基板とガラス基板、あるいはその他の基板を積層する場合、それらの基板を接続する方法としては、Ａｒビームやプラズマを用いた表面活性によるダイレクトボンディング（室温〜２００℃程度）、オプティカルコンタクト（３００℃〜１１００℃）、陽極接合（２００℃〜４５０℃）などの方法を用いることができる。また、凹状構造部の加工を施した以外の部分において、メタル膜や半田、樹脂等を形成して加熱ボンディング（数１０℃〜４００℃）によって接続する方法を用いても良い。また、第１、第２基板でアライメントが必要な場合には、例えばアライメント機構を設けたボンディング装置を用いることができる。
【００８９】
本発明による試料観測装置、及び試料観測方法は、上記実施形態、及び構成例に限られるものではなく、様々な変形が可能である。例えば、試料観測装置の構成については、図２では、ステージ５０の下方に対物レンズ５８を設置する構成を示したが、このような構成に限らず、例えば対物レンズ５８をステージ上の試料操作素子１０の上方に設置し、上方から試料の観測を行う構成としても良い。また、試料操作素子１０を保持する素子保持手段の構成についても、図２に示した保持治具５４、５６を用いた構成以外にも、具体的には様々な構成を用いることが可能である。例えば、操作素子１０が縦向きに自立可能な構造を有する場合には、ステージ５０のみによって素子保持手段を構成しても良い。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明は、光軸方向の構造を含んで形成された微小操作構造を用い、人工膜や膜タンパク質などの試料の観測を好適に行うことが可能な試料観測装置、及び試料観測方法として利用可能である。
【符号の説明】
【００９１】
１Ａ…試料観測装置、１０…試料操作素子、１１…側面、１２…第１基板、１２ａ…操作面、１３…凹状構造部、１４…第２基板、１４ａ…試料載置面、１５…操作構造、１６…側面凹状構造部、１７…光学面、１８…イマージョンオイル、
２０…観測構造部、２０ａ、２０ｂ…突起部、２１…第１入力部、２２…第２入力部、２３…第１出力部、２４…第２出力部、２５…第１入力流路、２６…第２入力流路、２７…第１出力流路、２８…第２出力流路、３１…第１入力口、３２…第２入力口、３３…第１出力口、３４…第２出力口、３５…第１入力チューブ、３６…第２入力チューブ、３７…第１出力チューブ、３８…第２出力チューブ、
５０…試料保持ステージ、５２…開口部、５４、５６…試料保持治具、５８…対物レンズ、６１、６６…三方コック、６２、６７…試料導入用シリンジ、６３、６８…バッファ導入用シリンジ、７１、７６…三方コック、７２、７７…溶液排出用シリンジ、７３、７８…気泡抜き用排出部、
Ａｘ…観測光軸、Ｓ１…試料溶液、Ｓ２…観測対象の試料、Ｓ３…人工膜、Ｓ４…バッファ水溶液、Ｓ５、Ｓ７…有機溶媒、Ｓ６、Ｓ８…脂質。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料の微小空間内での封止操作、または微小流路内での移動操作などを行う試料操作素子を用いて試料の観測を行うための試料観測装置、及び試料観測方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
様々な微量液体の簡便な取扱い、あるいは、その反応プロセスの計測等を目的として、微量液体試料の操作を行うための微小成形加工された操作素子が提案されている。そのような素子の１つとして、ＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane）と呼ばれるシリコーンゴムを材料としたシート状の基板部材を用い、凹状または溝状等の構造が所定のパターンで一方の面に形成されたＰＤＭＳ基板を他の基板に積層、密着させることで、試料に対する微小な封止構造、流路構造などの操作構造を構成する素子がある（試料操作素子については、特許文献１〜３、非特許文献１等を参照）。
【０００３】
このような素子では、例えば、試料を操作するための微小な操作構造に対応するパターンが形成されたマスク等によって型を作製し、この型を用いてＰＤＭＳ基板を作製する方法を用いることができる。この方法では、一度、型を作ってしまえば、簡単な操作で同じ素子を繰り返し作製して、試料の操作に利用することができる。また、ＰＤＭＳのシート基板は、ガラス基板などに対する吸着性が高く、２つの基板を密着させることによる微小構造の作成に適している。また、このような操作素子は、例えばガラスなどのＰＤＭＳ以外の材料による基板を用いても同様に構成することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００４−３３９１９号公報
【特許文献２】特開２００４−３０９４０５号公報
【特許文献３】特開２００７−２６８４９０号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】T. Thorsen et al., "Microfluidic Large-Scale Integration",Sience Vol.298 (2002) pp.580-584
【非特許文献２】K. Funakoshi et al., "Lipid Bilayer Formation by ContactingMonolayers in a Microfluidic Device for Membrane Protein Analysis", Anal.Chem. Vol.78 (2006) pp.8169-8174
【非特許文献３】鷲津正夫、「新しい黒膜作成法」、生物物理 Vol.35 No.1 (1995) pp.48-49
【非特許文献４】M. Gel et al., "Microorifice-Based High-Yield Cell Fusion onMicrofluidic Chip: Electrofusion of Selected Pairs and Fusant Viability",IEEE Transactions on Nanobioscience Vol.8 No.4 (2009) pp.300-305
【非特許文献５】T. Ide et al., "Simultaneous Optical and Electrical SingleChannel Recordings on a PEG Glass", Langmuir 26(11) (2009) pp.8540-8543
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記した微小操作構造を有する試料操作素子は、ＭＥＭＳ（Micro ElectroMechanical Systems）技術などの微細加工技術を利用して作製されるものであり、潜在的な高機能化性、及び高生産性が期待されている。しかしながら、操作素子の高機能化を図ると、その構造が複雑になり、ＭＥＭＳ等の特徴である高生産性が損なわれる可能性がある。
【０００７】
ＭＥＭＳを利用した微小な流路構造を有する試料操作素子は、例えば、ＣＡＤによるマスクの設計とマスク製作、紫外線重合性樹脂によるレプリカの製作、ＰＤＭＳ等の熱重合性樹脂による流路基板の製作、及び流路構造を覆う他の基板への流路基板の貼り付けによって作製される。このような方法では、流路構造が複雑になった場合でも、空間分解能が２μｍ程度の構造の作製が可能である。一方、さらに流路構造が複雑になり、例えば、顕微鏡光学系などの観測系に対して光軸方向（光の進行方向）にも構造を作りたい場合等には、上記のように微小構造が形成された流路基板を複数層にわたって重ねることで、３次元流路構造を構築する必要がある。
【０００８】
そのような操作素子の例として、全細胞記録に用いるパッチクランプ法、あるいは、１分子レベルの膜タンパク質の観測に用いる流路素子が考えられる。すなわち、生体膜あるいは人工膜上の膜タンパク質の観測では、試料操作素子において、全細胞の固定（トラップ）、あるいは、細胞から採取した生体膜や人工膜が構築できるような微細操作構造を設けることが必要である。具体的には、例えば、操作構造において観測用の空間として設けられた観測構造部の内部に、全細胞を固定、あるいは、生細胞から採取した生体膜や人工膜を張って、その空間を電気的に絶縁された２つの区画（コンパートメント）に分ける操作を行う。
【０００９】
このように観測構造部内に全細胞を固定、あるいは、生細胞から採取した生体膜および人工膜を形成する場合、膜の形成状態の観測、あるいは膜に取り込まれた１分子レベルのタンパク質の観測を考えると、観測系の光軸に対して垂直な面内に膜を形成することが好ましい。また、その膜の上下に分けられた２つのコンパートメントのそれぞれに対して、試料溶液の供給、交換などのための入力流路、出力流路を設けなくてはならない。
【００１０】
この場合、水平面（光軸に垂直な面）内に操作構造が形成された通常の操作素子ではなく、垂直方向（光軸方向）を含めて立体的に形成された操作構造が必要となる。このような操作素子を作製する場合、３次元流路構造の上方部分が形成された流路基板、及び下方部分が形成された流路基板の２層の流路基板を用意し、それらを重ね合わせる構成が考えられる。しかしながら、このような構成では、各基板に形成された微小操作構造を高精度に位置合わせして基板を重ね合わせることは困難、煩雑であり、試料操作素子の高生産性が損なわれることとなる。
【００１１】
本発明は、以上の問題点を解決するためになされたものであり、光軸方向の構造を含む微小操作構造を用い、全細胞を固定、あるいは、細胞から採取した生体膜、および、人工膜や膜タンパク質などの試料の観測を好適に行うことが可能な試料観測装置、及び試料観測方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
このような目的を達成するために、本発明による試料観測装置は、（１）光透過性材料から形成された第１基板、及び所定の材料から形成された第２基板を積層して構成され、第１基板の第２基板と密着する操作面に設けられた凹状構造部によって、第１基板と第２基板との間に試料の操作のための操作構造が形成された試料操作素子と、（２）操作構造に含まれて試料の観測に用いられる観測構造部に対し、第１基板及び第２基板の積層方向に直交する軸を観測光軸として試料操作素子を保持する素子保持手段と、（３）試料操作素子の側面に対面するように観測光軸上に、試料操作素子の側面を介して観測構造部の内部にある試料の観測を行うように配置される対物レンズとを備えることを特徴とする。
【００１３】
また、本発明による試料観測方法は、（ａ）光透過性材料から形成された第１基板、及び所定の材料から形成された第２基板を積層して構成され、第１基板の第２基板と密着する操作面に設けられた凹状構造部によって、第１基板と第２基板との間に試料の操作のための操作構造が形成された試料操作素子を準備する素子準備ステップと、（ｂ）操作構造に含まれて試料の観測に用いられる観測構造部に対し、第１基板及び第２基板の積層方向に直交する軸を観測光軸として試料操作素子を保持する素子保持ステップと、（ｃ）試料操作素子の側面に対面するように観測光軸上に対物レンズを配置し、対物レンズ、及び試料操作素子の側面を介して観測構造部の内部にある試料の観測を行う試料観測ステップとを備えることを特徴とする。
【００１４】
上記した試料観測装置、及び試料観測方法においては、光透過性材料からなり、所定のパターンで凹状構造部が形成された第１基板を、光透過性材料などの所定の材料からなる第２基板に対して積層、密着させることで、微小操作構造を有する試料操作素子を構成する。そして、基板間の操作面に直交する基板の積層方向に対し、積層方向に直交する軸を観測光軸として操作素子を保持し、対物レンズを含む観測光学系を介して操作素子の側面から観測構造部内の試料の観測を行っている。
【００１５】
このように、操作構造が形成された操作面に平行な軸を観測光軸に設定して、試料操作素子を保持することにより、第１、第２基板の間の操作面における観測構造部を含む操作構造を、光軸方向の構造を含む立体的な操作構造として利用することができる。そして、この状態で、対物レンズ及び試料操作素子の側面を介して試料の観測を行うことにより、観測構造部の内部にある細胞、あるいは、人工膜や膜タンパク質などの試料の観測を、好適に行うことが可能となる。
【００１６】
ここで、試料操作素子の具体的な構成については、試料操作素子の操作構造において、観測構造部は、その内部にある試料に対物レンズの焦点が合う位置に形成されていることが好ましい。このような構成によれば、観測構造部の内部にある試料を、対物レンズを介して好適に観測することができる。この場合の操作構造の例としては、対物レンズに対面する操作素子の側面の近傍に観測構造部を設ける構成がある。
【００１７】
また、試料操作素子において、対物レンズに対面する側面に、対物レンズと観測構造部との間で光が通過する光学面を含む側面凹状構造部が形成されていることが好ましい。このような構成によれば、観測構造部の内部にある試料を、操作素子の側面に形成された略平坦な光学面を介して好適に観測することができる。
【００１８】
また、具体的な操作構造の例としては、試料操作素子の操作構造において、観測構造部に対して、観測構造部の内部に試料を導入するための第１入力流路、第２入力流路と、観測構造部の内部から試料を排出するための第１出力流路、第２出力流路とが形成されている構成を用いることができる。このような構成は、上記した細胞、あるいは、人工膜や膜タンパク質などを試料とした観測に好適に適用することができる。また、操作素子における具体的な操作構造については、上記以外にも様々な構造を用いることが可能である。
【００１９】
試料の操作構造となる凹状構造部が設けられる第１基板の材料については、第１基板を構成する光透過性材料は、シリコーンまたはガラスであることが好ましい。また、第１基板を構成する光透過性材料がシリコーンである場合には、特に、ＰＤＭＳを用いることが好ましい。このような材料を用いることにより、第１、第２基板を積層、密着させて形成され、試料の観測に用いられる試料操作素子を、好適に構成することができる。ＰＤＭＳは、絶縁性が高いことが知られており、電気的な計測にも、そのまま用いることができるが、ガラスを素子として用いる場合には、一般的にはシランなどによりガラス表面の疎水処理を施すことが好ましいといわれている（非特許文献４参照）。シラン処理は、試料の観測、操作部分だけで充分である。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の試料観測装置、及び試料観測方法によれば、第１、第２基板を積層して構成された操作構造を有する試料操作素子に対し、基板の積層方向に直交する軸を観測光軸として操作素子を保持し、対物レンズを含む観測光学系を介して、操作素子の側面から観測構造部の内部にある試料の観測を行うことにより、光軸方向の構造を含む微小操作構造を用いて、試料の観測を好適に行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】第１、第２基板が積層された試料操作素子の基本構成を示す図である。
【図２】試料操作素子を用いた試料観測装置の一実施形態の構成を示す図である。
【図３】試料操作素子の観測構造部を含む操作構造の一例を示す斜視図である。
【図４】図３に示した操作構造を一部拡大して示す平面図である。
【図５】試料操作素子を用いた人工膜の形成方法について示す図である。
【図６】観測構造部の内部における人工膜の形成について示す模式図である。
【図７】試料操作素子の操作構造の他の例を示す平面図である。
【図８】試料操作素子の操作構造の他の例を示す平面図である。
【図９】試料操作素子の構成の他の例を示す斜視図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、図面とともに本発明による試料観測装置及び試料観測方法の好適な実施形態について詳細に説明する。なお、図面の説明においては同一要素には同一符号を付し、重複する説明を省略する。また、図面の寸法比率は、説明のものと必ずしも一致していない。
【００２３】
本発明による試料観測装置、観測方法において試料の操作、観測に用いられる試料操作素子は、試料に対する微小な封止構造、流路構造等の操作構造を有する素子であり、それぞれ所定の材料から形成された第１、第２基板を積層して構成される。また、第１基板の第２基板と密着する面である操作面には、凹状または溝状などの微小構造が形成され、この第１基板の操作面と、第２基板の操作面（試料載置面）とが密着することで、それらの間で試料の操作構造が構成される。最初に、このような試料操作素子について、その基本的な構成、使用形態について説明する。
【００２４】
ここで、以下においては、凹状構造が形成される第１基板の材料については、主にＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane、ポリジメチルシロキサン）を用いる場合を例として説明する。ＭＥＭＳ技術等を利用したＰＤＭＳの微細構造（マイクロ流路等）は、試料が微量ですむこと、他のデバイスと組み合わせて小型化できること、廉価であることなどにより、工業的な発展が期待されており、既に実用化されているものもある。
【００２５】
ＰＤＭＳは、モールディングによりサブミクロンの構造までが転写できること、自己吸着性があるので基板に貼り付けるだけでシールが可能であること、光学顕微鏡等を用いて生物試料等を観測する場合に無色透明であること、自家蛍光もほとんど見られないこと、生体試料に対して悪影響を及ぼさないこと、毒性がないこと等の利点を有する。ただし、試料操作素子の基板の材料については、後述するように、ＰＤＭＳ以外にも、例えばガラスなどの様々な材料を用いることが可能である。
【００２６】
図１は、本発明による試料観測装置、観測方法において用いられる、第１、第２基板が積層された試料操作素子の基本構成を模式的に示す図である。ここで、図１（ａ）は、第１基板と第２基板とを密着させる前における試料操作素子の状態を示し、図１（ｂ）は、第１基板と第２基板とを積層、密着させて、それらの間に操作構造が形成された試料操作素子とした状態を示している。
【００２７】
試料の観測に用いられる試料操作素子１０は、図１に示すように、光透過性材料から形成された第１基板１２と、所定の材料から形成された第２基板１４とによって構成されている。第１基板１２には、第２基板１４の試料載置面（図中の上面）１４ａと密着する操作面（図中の下面）１２ａに、凹状構造部１３が設けられている。これにより、第１基板１２と第２基板１４との間に、試料の操作を行うための操作構造１５が形成される。
【００２８】
図１（ｂ）では、試料操作素子１０に設けられる操作構造１５として、微小空間内で試料の封止操作を行う封止構造（微小チャンバ）を用いた例を示している。ここでは、第１基板１２と第２基板１４との間で凹状構造部１３によって構成された操作構造１５の空間内に、観測対象の試料Ｓ２を含む試料溶液Ｓ１が封止されている。また、操作構造１５としては、上記した封止構造以外にも、例えば、微小流路内で試料の移動操作を行う流路構造（微小流路）など、様々な構造を用いることができる。
【００２９】
このような試料操作素子１０に対し、操作構造１５の内部にある試料を観測する場合、通常、図中に矢印Ａによって示すように、第１、第２基板１２、１４の積層方向に沿った方向から観測を行う。しかしながら、このような構成では、例えば操作構造１５内の人工膜を観測対象とした場合に、人工膜を断面方向から観測することになって、その平面構造を観測することができないなど、試料観測についての自由度を充分に得られないという問題がある。これに対して、本発明による試料観測装置、観測方法は、図中に矢印Ｂによって示すように、第１、第２基板１２、１４の積層方向に直交する方向、すなわち、操作構造１５が形成された操作面１２ａに平行な方向から、操作素子１０の側面１１を介して、操作構造１５の内部にある試料の観測を行うものである。
【００３０】
図２は、試料操作素子を用いた試料観測装置の一実施形態の構成を示す図である。本実施形態による試料観測装置１Ａは、試料操作素子１０と、試料保持ステージ５０と、試料保持治具５４、５６と、対物レンズ５８とを備え、試料操作素子１０の操作構造の内部にある試料を、対物レンズ５８を含む観測光学系を介して、ステージ５０の下方から観測する顕微鏡装置として構成されている。
【００３１】
試料操作素子１０は、図１に関して上述したように、第１基板１２と第２基板１４との２層の基板を、その操作面と試料載置面とが密着した状態で積層して構成されている。また、第１基板１２の第２基板１４と密着する操作面には、所定パターンで凹状構造部１３が設けられ、この凹状構造部１３によって、第１基板１２と第２基板１４との間に試料の操作のための操作構造１５が形成されている（素子準備ステップ）。また、本実施形態の試料操作素子１０において、操作構造１５は、試料の観測に用いられる観測構造部２０を少なくとも含むパターンで構成されている。
【００３２】
この試料操作素子１０は、試料保持治具５４、５６を介して、保持ステージ５０によって保持されている。保持ステージ５０には、操作素子１０の観測構造部２０の内部にある試料を下方から観測するための光透過部となる開口部５２が設けられている。本実施形態においては、これらのステージ５０、及び保持治具５４、５６によって、操作素子１０を保持する素子保持手段が構成されている。
【００３３】
特に、図２に示す構成では、このステージ５０及び保持治具５４、５６からなる素子保持手段は、操作構造１５に含まれる観測構造部２０に対し、第１、第２基板１２、１４の積層方向に直交する軸（基板間の操作面に対して平行な軸）を観測光軸Ａｘとして、試料操作素子１０を縦向きに立てた状態で保持している。具体的には、第１基板１２側の第１試料保持治具５４と、第２基板１４側の第２試料保持治具５６とによって、操作素子１０を縦向きの状態で挟み込み、これらの操作素子１０、保持治具５４、５６をステージ５０上に載置することで、試料操作素子１０が保持されている（素子保持ステップ）。
【００３４】
この試料操作素子１０に対し、保持ステージ５０の開口部５２の下方には、対物レンズ５８が設置されている。対物レンズ５８は、縦置きの状態にされた試料操作素子１０の側面１１に対面するように、観測光軸Ａｘ上の所定位置に配置されている。これにより、図２に示す試料観測装置１Ａは、対物レンズ５８、及び試料操作素子１０の側面１１を介して、操作構造１５の観測構造部２０の内部にある試料の観測を行うことが可能なように構成されている（試料観測ステップ）。
【００３５】
このような構成において、対物レンズ５８を含む観測光学系の光軸となる観測光軸Ａｘは、第１基板１２の内部を通過する。このため、第１基板１２としては、光透過性材料から形成された基板、具体的には例えば、ＰＤＭＳ基板、ガラス基板などが用いられる。一方、第２基板１４としては、好ましくは、第１基板１２と同様に、ＰＤＭＳ基板、ガラス基板などの光透過性材料から形成された基板が用いられる。
【００３６】
また、図２に示す構成では、操作構造１５が設けられて縦向きに保持された試料操作素子１０において、対物レンズ５８に対面する側面１１に側面凹状構造部１６が形成されている。この側面凹状構造部１６のうちで、観測構造部２０側の面は、対物レンズ５８と観測構造部２０との間で光が通過する平坦な光学面となっている。また、操作素子１０の側面１１、または側面凹状構造部１６が形成されている場合にはその光学面において発生する収差が問題となる場合には、必要に応じて、操作素子１０と対物レンズ５８との間において、操作素子１０と屈折率が等しいイマージョンオイル１８が用いられる。
【００３７】
本実施形態による試料操作素子１０を含む試料観測装置１Ａ、及び試料観測方法の効果について説明する。
【００３８】
上記した試料観測装置１Ａ、及び試料観測方法においては、光透過性材料からなり、所定のパターンで凹状構造部が形成された第１基板１２を、光透過性材料などの所定の材料からなる第２基板１４に対して積層、密着させることで、操作構造１５を有する試料操作素子１０を構成する。そして、基板１２、１４の積層方向に直交する軸を観測光軸Ａｘとして、ステージ５０及び保持治具５４、５６によって操作素子１０を縦向きに保持し、対物レンズ５８を含む観測光学系を介して操作素子１０の側面（図中の下面）１１から観測構造部２０内の試料の観測を行っている。
【００３９】
このように、操作構造１５が形成された操作面に平行な軸を観測光軸Ａｘに設定して試料操作素子１０を保持することにより、第１、第２基板１２、１４の間の操作面における観測構造部２０を含む操作構造１５を、光軸Ａｘの方向の構造を含む立体的な操作構造として利用することができる。
【００４０】
すなわち、このような構成では、それぞれ操作構造が形成された複数の基板を用意し、それらを高精度に位置合わせして多段に重ね合わせることで立体的な操作構造とする構成に比べて、試料操作素子１０を縦置きにすることで容易に、光軸方向の構造を含む３次元操作構造を実現することができる。そして、この状態で、対物レンズ５８、及び試料操作素子１０の側面１１を介して試料の観測を行うことにより、観測構造部２０の内部にある人工膜や膜タンパク質などの試料の観測を好適に行うことが可能となる。なお、観測光軸Ａｘについては、さらに、対物レンズ５８に対面する操作素子１０の側面１１に対して略直交する軸に設定することが好ましい。
【００４１】
ここで、試料操作素子１０の具体的な構成については、操作素子１０の操作構造１５において、観測構造部２０は、その内部にある試料に対物レンズ５８の焦点が合う位置に形成されていることが好ましい。このような構成によれば、観測構造部２０の内部にある試料を、対物レンズ５８を介して好適に観測することができる。この場合の構造の例としては、試料操作素子１０の操作構造１５において、対物レンズ５８に対面する試料操作素子１０の側面１１の近傍に観測構造部２０を設ける構成がある。
【００４２】
また、図２に示した構成では、試料操作素子１０において、対物レンズ５８に対面する側面１１に、対物レンズ５８と観測構造部２０との間で光が通過する光学面を含む側面凹状構造部１６が形成されている。このような構成によれば、観測構造部２０の内部にある試料を、操作素子１０の側面１１に形成された凹状構造部１６の平坦な光学面を介して、好適に観測することができる。
【００４３】
すなわち、第１基板１２としてＰＤＭＳ基板を用いる場合、側面１１は例えばカッターによる切り出しで形成される。また、石英ガラス基板を用いる場合、側面１１は例えばダイシングによる切削で形成される。このような場合には、操作素子１０の側面１１では、光学観測に好適に用いることが可能な平面が得られない。これに対して、操作素子１０に操作構造１５とともに側面凹状構造部１６を形成しておき、その内側の平坦面を光学観測用の光学面として用いることにより、試料の観測を好適に行うことができる。なお、この側面凹状構造部１６については、側面１１において必要な平面度が得られている場合等、不要であれば設けない構成としても良い。
【００４４】
試料の操作構造１５となる凹状構造部が設けられる第１基板１２の材料については、第１基板１２を構成する光透過性材料は、シリコーン（シリコーン樹脂、シリコーンゴム）またはガラスであることが好ましい。また、第１基板１２を構成する光透過性材料がシリコーンである場合には、特に、第２基板１４に対する密着性に優れる、上述したＰＤＭＳを用いることが好ましい。このような材料を用いることにより、基板１２、１４を積層、密着させて形成される試料操作素子１０を、好適に構成することができる。
【００４５】
また、第１基板１２の材料については、上記したＰＤＭＳなどのシリコーン、あるいはガラス等に限らず、第２基板１４に密着して操作構造１５を形成可能であって、観測構造部２０の内部にある試料の観測が可能なものであれば、様々な材料を用いて良い。また、基板１２の材料の光透過性については、試料の観測に用いる光の波長を考慮して選択することが好ましい。例えば、観測光として赤外光を用いる場合には、第１基板１２としてシリコン基板を用いることも可能である。
【００４６】
また、第２基板１４の材料についても、第１基板１２と同様に、上記したシリコーン、ＰＤＭＳ、ガラス等の光透過性材料を用いることが好ましい。ただし、第２基板１４については、一般には、第１基板１２に対する密着性等を考慮して、操作構造１５を形成するために好適な材料から形成された基板を用いればよい。
【００４７】
第１基板１２及び第２基板１４の材料として、ＰＤＭＳ、またはガラスを用いる場合、その組合せについては、第１基板−第２基板がＰＤＭＳ−ＰＤＭＳ、ＰＤＭＳ−ガラス、ガラス−ＰＤＭＳ、ガラス−ガラス、のいずれの組合せを用いても良い。基板１２、１４をガラス＋ガラスによって構成する場合、基板同士の密着は、例えば熱融着によって実現される。また、基板１２、１４をＰＤＭＳ＋ガラス、ガラス＋ＰＤＭＳ、またはＰＤＭＳ＋ＰＤＭＳによって構成する場合、基板同士の密着は、そのまま接触させるか、もしくはプラズマ、紫外線などによる表面処理を行った後に接触させることで実現される。
【００４８】
また、試料操作素子１０における具体的な操作構造１５としては、例えば、操作構造１５において、観測構造部２０に対して、観測構造部２０の内部に試料を導入するための第１入力流路、第２入力流路と、観測構造部２０の内部から試料を排出するための第１出力流路、第２出力流路とが形成されている構成を用いることができる。このような構成は、上記した人工膜や膜タンパク質などを観測対象とした場合に、好適に適用することができる。以下、このような構成を例として、試料操作素子１０の具体的な構造、及びそれを用いた試料の観測について説明する。
【００４９】
図３は、図２に示した試料観測装置１Ａにおいて用いられる、試料操作素子１０の観測構造部２０を含む操作構造１５の一例を示す斜視図である。ここでは、試料操作素子１０を構成する第１基板１２及び第２基板１４について、それらを分解した状態でそれぞれの構造を示している。また、図４は、図３に示した試料操作素子１０における操作構造１５の構成について、観測構造部２０及び側面凹状構造部１６を含む側面１１側の部分を拡大して示す平面図である。
【００５０】
図３、図４に示す構成において、第１基板１２には、その操作面１２ａ上に、基板間の操作構造１５となる凹状構造部１３が所定パターン、所定深さで形成されている。本構成例による操作素子１０では、試料の観測に用いられる観測構造部２０として、微小な矩形チャンバ状の構造部２０が、対物レンズに対面する側面１１の近傍に設けられている。また、この観測構造部２０に対し、操作構造１５において、それぞれ２系統の入力流路、及び出力流路が設けられている。
【００５１】
具体的には、側面１１の近傍の略中央部に設けられている観測構造部２０に対して、図中の右側には、観測構造部２０の上部に接続する第１入力流路２５と、下部に接続する第２入力流路２６とが設けられている。また、第１入力流路２５、第２入力流路２６の観測構造部２０とは反対側の端部には、それぞれ円形状の第１入力部２１、第２入力部２２が設けられている。
【００５２】
また、図中の左側には、観測構造部２０の上部に接続する第１出力流路２７と、下部に接続する第２出力流路２８とが設けられている。第１出力流路２７、第２出力流路２８の観測構造部２０とは反対側の端部には、それぞれ円形状の第１出力部２３、第２出力部２４が設けられている。このような構成において、上部の流路２５、２７、及び下部の流路２６、２８の交差部分に、観測構造部２０が配置されている。また、観測構造部２０の下方の側面１１には、光が通過する平坦な光学面１７を含む側面凹状構造部１６が形成されている。
【００５３】
また、第１基板１２と積層される第２基板１４には、第１基板１２に形成された入力部２１、２２、及び出力部２３、２４に対応する位置に、それぞれ貫通孔からなる円形状の第１入力口３１、第２入力口３２、第１出力口３３、第２出力口３４が形成されている。第１入力流路２５に液体試料を導入する入力部２１、入力口３１に対し、第１入力チューブ３５が接続される（図２参照）。また、第２入力流路２６に液体試料を導入する入力部２２、入力口３２に対し、第２入力チューブ３６が接続される。また、第１出力流路２７から液体試料を排出する出力部２３、出力口３３に対し、第１出力チューブ３７が接続される。また、第２出力流路２８から液体試料を排出する出力部２４、出力口３４に対し、第２出力チューブ３８が接続される。
【００５４】
また、観測構造部２０には、図４に示すように、その第１入力流路２５と第２入力流路２６との間の所定位置に、突起部２０ａが設けられている。同様に、第１出力流路２７と第２出力流路２８との間の所定位置に、突起部２０ｂが設けられている。これらの突起部２０ａ、２０ｂは、観測構造部２０内における細胞の固定、あるいは、細胞から採取した生体膜や人工膜の形成に用いられる。
【００５５】
図３、図４に示した試料操作素子１０の作製手順の例について、以下に具体的に説明する。ここでは、操作素子１０を構成する第１、第２基板１２、１４の両者をＰＤＭＳ基板とするとともに、作製された操作素子１０を用いて、観測構造部２０の内部で人工膜の形成、観測、及び膜タンパク質の観測を行う例について説明する。
【００５６】
まず、第１基板１２に形成する操作構造１５の流路パターンをＣＡＤによって設計し、設計された流路パターンに対応するフォトマスクを石英基板上に作製する。また、シート状のＰＤＭＳ基板作製用の型に用いられるシリコン基板を用意し、その上面上に、スピンコートによって、紫外線硬化樹脂（ＳＵ−８３０００、日本化薬製）を塗布する。そして、ＳＵ−８が塗布されたシリコン基板上にフォトマスクを設置し、紫外線を照射して樹脂を硬化させ、現像、洗浄、乾燥過程を経て、微小流路パターンの型を得る。
【００５７】
次に、流路パターンの型をプラスチックケースの内部に設置し、プライマーを１／１０量加えた後、攪拌、脱気したＰＤＭＳ（Ｓｉｌｐｏｔ１８４、東レダウコーニング製）を適当量流し込む。そして、再度、脱気して、気泡がないことを確認した後、７５℃のオーブン内で１時間、ＰＤＭＳを熱硬化させる。硬化処理が終了したら、オーブンから取り出し、自然冷却させたシリコン基板上で硬化したＰＤＭＳシートを、適当な大きさに切り出して、シリコン基板の型から剥がすことで、ＰＤＭＳの第１基板１２が完成する。
【００５８】
ここで、第１基板１２に形成される操作構造１５の流路パターンにおいて、各流路の幅は例えば５μｍ、深さは例えば１０μｍである。また、入力流路、出力流路において、観測構造部２０の近傍での２系統の流路間の距離は例えば１５μｍである。また、流路間のギャップとして形成される観測構造部２０の幅（ギャップ間の距離）は例えば１０μｍである。細胞を固定する場合には、細胞の大きさに合わせて調整されることが好ましい。例えば大腸菌や精子の場合には１μｍ、動物細胞の場合には２μｍ程度である。また、第１基板１２の対物レンズに対面する側面１１から観測構造部２０の中心までの距離は、対物レンズの焦点距離等を考慮して例えば１６０μｍに設定される。また、側面凹状構造部１６の側面１１からの形成幅は、例えば１０μｍである。また、試料操作素子１０の全体のチップサイズは、例えば２５ｍｍ×１０ｍｍである。
【００５９】
続いて、第１基板１２に貼り合わせる平坦なＰＤＭＳの第２基板１４を用意する。この第２基板１４には、φ２ｍｍの生検トレパンを用いて、その４箇所に貫通孔による入力口３１、３２、出力口３３、３４を形成する。また、これらの貫通孔に対して、それぞれ同外径の液体試料の導入、排出用のチューブ３５、３６、３７、３８を差し込み、瞬間接着剤等によって接着、固定する。
【００６０】
チューブ３５〜３８がついた第２基板１４を、その入力口３１、３２、出力口３３、３４がそれぞれ対応する入力部２１、２２、出力部２３、２４に接続されるように位置合わせした状態で第１基板１２に貼り合わせて、試料操作素子１０とする。この際、ＰＤＭＳ基板の流路側を、３０秒程度プラズマ処理しておくと、両者の接着がより強固になる。なお、チューブの取り付け、基板の貼り合わせについては、どちらを先に行っても良い。
【００６１】
以上のように作製された試料操作素子１０を用い、観測構造部２０の内部において、人工膜の形成、観測を行うことを考える。図５は、試料操作素子１０を用いた人工膜の形成方法について示す図である。また、図６は、観測構造部２０の内部における人工膜の形成について示す模式図である。
【００６２】
観測構造部２０への人工脂質膜の形成は、基本的には非特許文献２に記載された方法を改良して行った。上記のように組み立てた試料操作素子１０の各チューブの先端には、図５に示すように、それぞれ三方コック、及びシリンジを取り付ける。なお、図５においては、説明の簡単のために、第１基板１２の入力部、出力部、第２基板１４の入力口、出力口、及びそれらに接続された入力チューブ、出力チューブについて図示を省略して、操作構造１５における入力流路２５、２６、及び出力流路２７、２８と、三方コック及びシリンジとの実質的な接続関係を示している。
【００６３】
図５に示す構成では、具体的には、第１入力流路２５の入力チューブに対し、三方コック６１を介して、試料導入用シリンジ６２、及びバッファ導入用シリンジ６３が接続されている。また、第２入力流路２６の入力チューブに対し、三方コック６６を介して、試料導入用シリンジ６７、及びバッファ導入用シリンジ６８が接続されている。また、第１出力流路２７の出力チューブに対し、三方コック７１を介して、溶液排出用シリンジ７２、及び気泡抜き用排出部７３が接続されている。また、第２出力流路２８の出力チューブに対し、三方コック７６を介して、溶液排出用シリンジ７７、及び気泡抜き用排出部７８が接続されている。
【００６４】
このような構成の試料操作素子１０、及び試料溶液の導入系、排出系を用いた人工膜の形成方法について説明する。なお、ここでは、観測構造部２０の内部に人工膜を形成するため、試料導入用シリンジ６２、６７から流路に供給する試料としては、脂質＋有機溶媒を用いるものとする。具体的には例えば、７ｍＭ−ＤＭＰＣ及び４ｍＭ−コレステロールを含んだｎ−デカン溶液を試料溶液として用いることができる。また、バッファ導入用シリンジ６３、６８から流路に供給するバッファ溶液としては、好ましくは、水溶液系のバッファ溶液が用いられる。
【００６５】
まず、出力側の三方コック７１、７６を、それぞれ気泡抜き用排出部７３、７８側に設定し、入力側のバッファ導入用シリンジ６３、６８により、流路２５〜２８、及び観測構造部２０の内部をバッファ溶液で満たす。排出部７３、７８にバッファ溶液が到達した時点で、三方コック７１、７６を溶液排出用シリンジ７２、７７側に変更する。
【００６６】
次に、下側の第２入力流路２６に接続された三方コック６６を試料導入用シリンジ６７側に変更し、１μＬ以下の容量の試料溶液（脂質＋有機溶媒）を流路２６に導入する。観測構造部２０のギャップ（下側のコンパートメント）の容積を満たすためには、この試料溶液は、例えば５００ｆＬ程度あれば良い。
【００６７】
第２入力流路２６に導入した試料溶液の先端が、観測構造部２０のコンパートメントに到達した時点で、上側の第１入力流路２５に接続された三方コック６１を試料導入用シリンジ６２側に変更し、同様に試料溶液を流路２５に導入する。これらの操作により、入力流路２５、２６からの試料溶液が観測構造部２０において接触した時点で、入力側の三方コック６１、６６をそれぞれバッファ導入用シリンジ６３、６８側に変更し、試料溶液の有機溶媒をバッファ水溶液で洗い流し始める。
【００６８】
観測構造部２０における上下のコンパートメント内の有機溶媒が残り少なくなってくると、観測構造部２０のギャップ部分において、脂質による人工膜が形成されつつあることを示す干渉縞が観測される。そして、それが最終的には、ほぼ黒くなって（黒膜）、観測構造部２０の内部での人工膜Ｓ３（図５参照）の構築がほぼ完了する。また、このように形成された人工膜Ｓ３を利用すれば、膜タンパク質の観測を好適に行うことができる。
【００６９】
観測構造部２０における人工膜Ｓ３の形成のメカニズムに関しては、推定の域を出ないが、脂質（両親媒性物質）の物理的な性質をもとに、図６に示すようなメカニズムで人工膜が形成されるものと推定される。すなわち、水溶液系のバッファ溶液Ｓ４で各流路２５〜２８及び観測構造部２０が満たされている状態で、図６（ａ）に示すように、第２入力流路２６から観測構造部２０の下側のコンパートメントへと、脂質Ｓ６を含んだ有機溶媒Ｓ５を導入する。
【００７０】
この状態で、さらに、第１入力流路２５から観測構造部２０の上側のコンパートメントへと、脂質Ｓ８を含んだ有機溶媒Ｓ７を導入する。そして、バッファ溶液Ｓ４によって有機溶媒Ｓ５、Ｓ７を洗い流すと、最終的に、図６（ｂ）に示すように、観測構造部２０の上下のコンパートメントの間において、脂質二重層からなる人工膜Ｓ３が形成される。なお、人工膜を形成するための観測構造部２０におけるギャップ構造の形状、物理化学的な性質等に関しては、非特許文献３、４においても記載がある。また、図５に示した構成の操作素子１０において、入力流路２５、２６、出力流路２７、２８に加えて、有機溶媒の洗浄補助用に追加の入力流路を設けて、３入力＋２出力の構成としても良い。
【００７１】
ここで、図５に示すように、操作素子１０を縦置きとした状態で、側面１１側から対物レンズ５８を介して観測構造部２０内の試料を観測する構成では、人工膜Ｓ３の２次元的な平面構造を観測することが可能である。この場合、例えば、人工膜Ｓ３の形成過程において、光の干渉の具合から膜の厚みを推定できるなどの利点がある。また、このような膜系について計測を行う場合、人工膜部分での電気抵抗のシールディングの確認が必要になる場合がある。この場合、電位計測、あるいは電流計測のための電極は、入力、あるいは出力チューブを分岐し、電極を設置して計測すれば良い。
【００７２】
膜タンパク質の観測について考えると、膜タンパク質の取扱いは、生体同様の膜構造があって始めて可能となる。膜タンパク質の特徴は、膜構造に内在するか周辺にあって、その構造を安定化し、機能を持つことである。膜は、両親媒性の性質を持つ脂肪酸が、自然科学の法則に従って、膜タンパク質以外の脂質等の疎水的な性質を持つ生体物質を取り込みながら構造を作る。
【００７３】
膜タンパク質の研究では、パッチクランプ法の開発により、１分子レベルでの機能の解明が行われるようになった。しかし、この方法も、ピペットの形状やガラス表面の化学的な性質を制御するには、熟練を要するという欠点がある。生体膜あるいは人工膜としての構造は、膜自身の厚みが例えば５０〜１００ｎｍと非常に薄いため、完全な構造を確認することが難しく、また、膜としての機能を電気的に確認することも困難である。
【００７４】
近年になって、ビデオマイクロスコピー法の発展により、平面膜法（非特許文献５）なども、膜タンパク質の１分子計測の実験系の構築において試みられるようになった。創薬研究の５０％が膜タンパク質に対するものであり、簡便な手法が望まれているという現状があるが、どの手法も研究レベルでは利用できるものの、構造の再現性に難があると考えられている。このような状況で、ＭＥＭＳ技術を利用した微小操作構造を有する試料操作素子にも期待がかかっている。しかしながら、このような試料操作素子においても、３次元操作構造の作製は容易ではない。
【００７５】
これに対して、上記のように試料操作素子１０を縦置きにすることで、操作構造１５を光軸方向の構造を含む立体的な操作構造として利用して、操作構造１５に設けられた観測構造部２０において試料の観測を行う構成によれば、図５、図６に示すように、人工膜の形成、観測、及び膜タンパク質の観測を、容易かつ確実に行うことが可能である。なお、観測構造部２０のギャップにトラップされた全細胞の膜の観測と操作、あるいは、細胞から採取した生体膜の観測と操作も、手順は多少異なるが、同様の操作により容易に行うことが可能である。
【００７６】
試料操作素子１０の構成について、さらに説明する。上記した構成例では、第１、第２基板１２、１４の両者をＰＤＭＳ基板としたが、ＰＤＭＳの第１基板１２に対して、第２基板１４をガラス基板等の他の材料からなる基板としても良い。また、操作構造１５となる凹状構造部１３が形成される第１基板１２を他の材料からなる基板、例えばガラス基板によって構成しても良い。
【００７７】
ガラス基板に所定パターンの凹状構造部を形成するための加工は、フォトリソグラフィ及びエッチングによって行うことができる。具体的には、ガラス基板表面に対してフォトレジスト（ポジ型レジストもしくはネガ型レジスト）を、スピンコートによって均一の厚み（例えば０．１〜２０μｍ）で塗布する。その後、所望のパターンに形成したフォトマスクを用いてレジストに対して露光を行い、現像することで、ガラス基板上に所望の形状のフォトレジストパターンを形成することができる。
【００７８】
このフォトレジストパターンをマスクとして、ガラス基板をエッチングによって加工して、最後にフォトレジストを剥離する。ガラス基板のエッチングには、ウエットエッチング、ドライエッチングを用いることができる。具体的には、ウエットエッチングには、フッ酸やバッファードフッ酸を用いることができる。ドライエッチングには、ＲＩＥ（反応性イオンエッチング）にＣＨＦ３などのＦ系ガスを用いて加工することができる。
【００７９】
ドライエッチングによってガラスを、例えば１０μｍ以上に深く加工する場合には、フォトレジストではエッチング選択比が小さい。このため、Ｃｒ、Ｔｉ、ａ−Ｓｉなどのメタル膜をあらかじめガラス基板上に、例えば０．１〜１０μｍの厚みで成膜し、このメタル膜をフォトエッチとエッチングによりパターニングし、パターニングされたメタル膜をマスクとしてガラスのエッチング加工を行っても良い。
【００８０】
ガラス基板に形成される凹状構造部において、溝状構造に段差を付ける場合には、一度エッチング加工したガラス基板に対してフォトレジストを形成し、アライメント露光装置によってレジストをパターニングし、段差を追加するべき部分を開口させて、エッチング加工によって段差を形成する。また、ガラス基板上に、３次元加工したレジストや樹脂を形成し、その形状をエッチングによってガラス基板に転写しても良い。
【００８１】
なお、この場合の基板の材料については、ガラスに限られるものではなく、光透過性の材料であれば良い。また、基板の加工についても、フォトエッチングに限らず、例えば多軸加工機や成型、ナノインプリントなど、様々な方法を用いて良い。また、第１基板１２をガラス基板とした場合、第２基板１４については、ガラス基板、ＰＤＭＳ基板のいずれを用いても良く、それ以外の材料の基板を用いても良い。
【００８２】
試料操作素子１０における観測構造部２０を含む操作構造１５の構成について、さらに説明する。操作構造１５の具体的な構成については、図３、図４に示した構成例に限られるものではなく、観測対象とする試料の種類、現象等に応じて、様々な構成の操作構造１５を用いることが可能である。
【００８３】
図７、図８は、それぞれ試料操作素子の操作構造の他の例を示す平面図である。図７に示す試料操作素子１０Ａの操作構造１５では、観測構造部２０、流路２５〜２８、及び光学面１７を含む側面凹状構造部１６については図３、図４に示した構成と同様であるが、第２基板１４から試料の導入、排出を行う円形状の入力部２１、２２、出力部２３、２４に代えて、素子側面から試料の導入、排出を行うように側面に露出した、半円形状の入力部２１ａ、２２ａ、及び出力部２３ａ、２４ａが形成されている。なお、図３、図７に示した構成において、不要な場合には側面凹状構造部１６を設けない構成としても良い。
【００８４】
図８（ａ）に示す試料操作素子１０Ｂの操作構造１５では、観測構造部２０に対し、１系統の入力流路２５、及び同じく１系統の出力流路２７のみが形成されている。このように、操作構造１５における流路パターンについては、試料操作素子の用途、試料の種類等に応じて様々なパターンに設定して良い。また、図８（ｂ）に示す試料操作素子１０Ｃの操作構造１５では、観測構造部２０を試料を封止する微小チャンバとして、流路パターンを形成しない構成としている。このような構成においても、試料の観測を好適に行うことができる。なお、図８（ａ）、（ｂ）に示した構成においても、必要な場合には側面凹状構造部１６を設ける構成としても良い。
【００８５】
図９は、試料操作素子の構成の他の例を示す斜視図である。ここでは、操作構造が形成された第１基板として複数の基板を用意し、それらを積層することで、さらなる高機能化を図る構成を示している。具体的には、図９に示す構成例では、同一パターンの操作構造１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃがそれぞれ形成された３層の流路基板１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃを基板の背を利用して積層し、最も外側の基板１２Ａに対して平板状の第２基板１４を積層することで、３層の３次元流路構造を有する試料操作素子１０Ｄを実現している。このような構成では、例えば３つの観測構造部において同時に人工膜の形成、観測を行うことが可能である。なお、ＰＤＭＳ基板を積層する場合には、表面をプラズマ処理しておくと、その接合がより強固になる。
【００８６】
また、図９に示す構成例では、３段に積層された基板１２Ａ〜１２Ｃにおける操作構造１５Ａ〜１５Ｃに対し、その側面から試料溶液を導入、排出するために追加的に基板８０を設け、この基板８０に形成された貫通孔８１、及び貫通孔８１に接続されたチューブ８２を介して、試料操作素子１０Ｄの各段の操作構造１５Ａ〜１５Ｃへの試料溶液の導入、排出を行っている。この構成では、３段の操作構造１５Ａ〜１５Ｃにおいて、人工膜の形成などの同じ操作を並行して行うため、試料溶液の導入、排出を全体で１系統として構成している。
【００８７】
なお、図９の構成においても、図３と同様に、第２基板１４側から試料溶液を導入、排出する構成としても良い。この場合、各基板１２Ａ〜１２Ｃでの入力部、出力部の位置合わせについては、アライナーを用いて、あるいはミリメートルオーダの位置合わせであれば目視で行うことができる。また、基板を積層した後に、生検トレパン等によって一気に必要な入力口、出力口等を形成するなどの方法も考えられる。
【００８８】
なお、ガラス基板とガラス基板、あるいはその他の基板を積層する場合、それらの基板を接続する方法としては、Ａｒビームやプラズマを用いた表面活性によるダイレクトボンディング（室温〜２００℃程度）、オプティカルコンタクト（３００℃〜１１００℃）、陽極接合（２００℃〜４５０℃）などの方法を用いることができる。また、凹状構造部の加工を施した以外の部分において、メタル膜や半田、樹脂等を形成して加熱ボンディング（数１０℃〜４００℃）によって接続する方法を用いても良い。また、第１、第２基板でアライメントが必要な場合には、例えばアライメント機構を設けたボンディング装置を用いることができる。
【００８９】
本発明による試料観測装置、及び試料観測方法は、上記実施形態、及び構成例に限られるものではなく、様々な変形が可能である。例えば、試料観測装置の構成については、図２では、ステージ５０の下方に対物レンズ５８を設置する構成を示したが、このような構成に限らず、例えば対物レンズ５８をステージ上の試料操作素子１０の上方に設置し、上方から試料の観測を行う構成としても良い。また、試料操作素子１０を保持する素子保持手段の構成についても、図２に示した保持治具５４、５６を用いた構成以外にも、具体的には様々な構成を用いることが可能である。例えば、操作素子１０が縦向きに自立可能な構造を有する場合には、ステージ５０のみによって素子保持手段を構成しても良い。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明は、光軸方向の構造を含んで形成された微小操作構造を用い、人工膜や膜タンパク質などの試料の観測を好適に行うことが可能な試料観測装置、及び試料観測方法として利用可能である。
【符号の説明】
【００９１】
１Ａ…試料観測装置、１０…試料操作素子、１１…側面、１２…第１基板、１２ａ…操作面、１３…凹状構造部、１４…第２基板、１４ａ…試料載置面、１５…操作構造、１６…側面凹状構造部、１７…光学面、１８…イマージョンオイル、
２０…観測構造部、２０ａ、２０ｂ…突起部、２１…第１入力部、２２…第２入力部、２３…第１出力部、２４…第２出力部、２５…第１入力流路、２６…第２入力流路、２７…第１出力流路、２８…第２出力流路、３１…第１入力口、３２…第２入力口、３３…第１出力口、３４…第２出力口、３５…第１入力チューブ、３６…第２入力チューブ、３７…第１出力チューブ、３８…第２出力チューブ、
５０…試料保持ステージ、５２…開口部、５４、５６…試料保持治具、５８…対物レンズ、６１、６６…三方コック、６２、６７…試料導入用シリンジ、６３、６８…バッファ導入用シリンジ、７１、７６…三方コック、７２、７７…溶液排出用シリンジ、７３、７８…気泡抜き用排出部、
Ａｘ…観測光軸、Ｓ１…試料溶液、Ｓ２…観測対象の試料、Ｓ３…人工膜、Ｓ４…バッファ水溶液、Ｓ５、Ｓ７…有機溶媒、Ｓ６、Ｓ８…脂質。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光透過性材料から形成された第１基板、及び所定の材料から形成された第２基板を積層して構成され、前記第１基板の前記第２基板と密着する操作面に設けられた凹状構造部によって、前記第１基板と前記第２基板との間に試料の操作のための操作構造が形成された試料操作素子と、
前記操作構造に含まれて前記試料の観測に用いられる観測構造部に対し、前記第１基板及び前記第２基板の積層方向に直交する軸を観測光軸として前記試料操作素子を保持する素子保持手段と、
前記試料操作素子の側面に対面するように前記観測光軸上に、前記試料操作素子の前記側面を介して前記観測構造部の内部にある前記試料の観測を行うように配置される対物レンズと
を備えることを特徴とする試料観測装置。
【請求項２】
前記試料操作素子の前記操作構造において、前記観測構造部は、その内部にある前記試料に前記対物レンズの焦点が合う位置に形成されていることを特徴とする請求項１記載の試料観測装置。
【請求項３】
前記試料操作素子において、前記対物レンズに対面する前記側面に、前記対物レンズと前記観測構造部との間で光が通過する光学面を含む側面凹状構造部が形成されていることを特徴とする請求項１または２記載の試料観測装置。
【請求項４】
前記試料操作素子の前記操作構造において、前記観測構造部に対して、前記観測構造部の内部に前記試料を導入するための第１入力流路、第２入力流路と、前記観測構造部の内部から前記試料を排出するための第１出力流路、第２出力流路とが形成されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項記載の試料観測装置。
【請求項５】
前記第１基板を構成する前記光透過性材料は、シリコーンまたはガラスであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項記載の試料観測装置。
【請求項６】
前記第１基板を構成する前記光透過性材料は、ＰＤＭＳであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項記載の試料観測装置。
【請求項７】
光透過性材料から形成された第１基板、及び所定の材料から形成された第２基板を積層して構成され、前記第１基板の前記第２基板と密着する操作面に設けられた凹状構造部によって、前記第１基板と前記第２基板との間に試料の操作のための操作構造が形成された試料操作素子を準備する素子準備ステップと、
前記操作構造に含まれて前記試料の観測に用いられる観測構造部に対し、前記第１基板及び前記第２基板の積層方向に直交する軸を観測光軸として前記試料操作素子を保持する素子保持ステップと、
前記試料操作素子の側面に対面するように前記観測光軸上に対物レンズを配置し、前記対物レンズ、及び前記試料操作素子の前記側面を介して前記観測構造部の内部にある前記試料の観測を行う試料観測ステップと
を備えることを特徴とする試料観測方法。
【請求項８】
前記試料操作素子の前記操作構造において、前記観測構造部は、その内部にある前記試料に前記対物レンズの焦点が合う位置に形成されていることを特徴とする請求項７記載の試料観測方法。
【請求項９】
前記試料操作素子において、前記対物レンズに対面する前記側面に、前記対物レンズと前記観測構造部との間で光が通過する光学面を含む側面凹状構造部が形成されていることを特徴とする請求項７または８記載の試料観測方法。
【請求項１０】
前記試料操作素子の前記操作構造において、前記観測構造部に対して、前記観測構造部の内部に前記試料を導入するための第１入力流路、第２入力流路と、前記観測構造部の内部から前記試料を排出するための第１出力流路、第２出力流路とが形成されていることを特徴とする請求項７〜９のいずれか一項記載の試料観測方法。
【請求項１１】
前記第１基板を構成する前記光透過性材料は、シリコーンまたはガラスであることを特徴とする請求項７〜１０のいずれか一項記載の試料観測方法。
【請求項１２】
前記第１基板を構成する前記光透過性材料は、ＰＤＭＳであることを特徴とする請求項７〜１０のいずれか一項記載の試料観測方法。
【請求項１】
光透過性材料から形成された第１基板、及び所定の材料から形成された第２基板を積層して構成され、前記第１基板の前記第２基板と密着する操作面に設けられた凹状構造部によって、前記第１基板と前記第２基板との間に試料の操作のための操作構造が形成された試料操作素子と、
前記操作構造に含まれて前記試料の観測に用いられる観測構造部に対し、前記第１基板及び前記第２基板の積層方向に直交する軸を観測光軸として前記試料操作素子を保持する素子保持手段と、
前記試料操作素子の側面に対面するように前記観測光軸上に、前記試料操作素子の前記側面を介して前記観測構造部の内部にある前記試料の観測を行うように配置される対物レンズと
を備えることを特徴とする試料観測装置。
【請求項２】
前記試料操作素子の前記操作構造において、前記観測構造部は、その内部にある前記試料に前記対物レンズの焦点が合う位置に形成されていることを特徴とする請求項１記載の試料観測装置。
【請求項３】
前記試料操作素子において、前記対物レンズに対面する前記側面に、前記対物レンズと前記観測構造部との間で光が通過する光学面を含む側面凹状構造部が形成されていることを特徴とする請求項１または２記載の試料観測装置。
【請求項４】
前記試料操作素子の前記操作構造において、前記観測構造部に対して、前記観測構造部の内部に前記試料を導入するための第１入力流路、第２入力流路と、前記観測構造部の内部から前記試料を排出するための第１出力流路、第２出力流路とが形成されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項記載の試料観測装置。
【請求項５】
前記第１基板を構成する前記光透過性材料は、シリコーンまたはガラスであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項記載の試料観測装置。
【請求項６】
前記第１基板を構成する前記光透過性材料は、ＰＤＭＳであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項記載の試料観測装置。
【請求項７】
光透過性材料から形成された第１基板、及び所定の材料から形成された第２基板を積層して構成され、前記第１基板の前記第２基板と密着する操作面に設けられた凹状構造部によって、前記第１基板と前記第２基板との間に試料の操作のための操作構造が形成された試料操作素子を準備する素子準備ステップと、
前記操作構造に含まれて前記試料の観測に用いられる観測構造部に対し、前記第１基板及び前記第２基板の積層方向に直交する軸を観測光軸として前記試料操作素子を保持する素子保持ステップと、
前記試料操作素子の側面に対面するように前記観測光軸上に対物レンズを配置し、前記対物レンズ、及び前記試料操作素子の前記側面を介して前記観測構造部の内部にある前記試料の観測を行う試料観測ステップと
を備えることを特徴とする試料観測方法。
【請求項８】
前記試料操作素子の前記操作構造において、前記観測構造部は、その内部にある前記試料に前記対物レンズの焦点が合う位置に形成されていることを特徴とする請求項７記載の試料観測方法。
【請求項９】
前記試料操作素子において、前記対物レンズに対面する前記側面に、前記対物レンズと前記観測構造部との間で光が通過する光学面を含む側面凹状構造部が形成されていることを特徴とする請求項７または８記載の試料観測方法。
【請求項１０】
前記試料操作素子の前記操作構造において、前記観測構造部に対して、前記観測構造部の内部に前記試料を導入するための第１入力流路、第２入力流路と、前記観測構造部の内部から前記試料を排出するための第１出力流路、第２出力流路とが形成されていることを特徴とする請求項７〜９のいずれか一項記載の試料観測方法。
【請求項１１】
前記第１基板を構成する前記光透過性材料は、シリコーンまたはガラスであることを特徴とする請求項７〜１０のいずれか一項記載の試料観測方法。
【請求項１２】
前記第１基板を構成する前記光透過性材料は、ＰＤＭＳであることを特徴とする請求項７〜１０のいずれか一項記載の試料観測方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１２−１８５０７３（Ｐ２０１２−１８５０７３Ａ）
【公開日】平成２４年９月２７日（２０１２．９．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−４９２０３（Ｐ２０１１−４９２０３）
【出願日】平成２３年３月７日（２０１１．３．７）
【出願人】（０００２３６４３６）浜松ホトニクス株式会社 (1,479)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年９月２７日（２０１２．９．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月７日（２０１１．３．７）
【出願人】（０００２３６４３６）浜松ホトニクス株式会社 (1,479)
【Ｆターム（参考）】
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