誘導性間葉系幹細胞およびその作製方法
【課題】ヒトの胚またはＥＳ細胞を利用することなく、間葉系幹細胞と同様の自己複製能および分化能を有する細胞を提供すること。
【解決手段】特定の塩基配列を有する遺伝子の少なくとも１つを細胞に導入する工程を包含する方法によって、誘導性間葉系幹細胞を作製する方法、並びに作製するためのキット。前記遺伝子の発現を検出することによって、誘導性間葉系幹細胞を検出する方法、並びに検出するためのキット、検出するためのマイクロアレイ、並びに、間葉系幹細胞の分化能を制御する因子をスクリーニングする方法。
【解決手段】特定の塩基配列を有する遺伝子の少なくとも１つを細胞に導入する工程を包含する方法によって、誘導性間葉系幹細胞を作製する方法、並びに作製するためのキット。前記遺伝子の発現を検出することによって、誘導性間葉系幹細胞を検出する方法、並びに検出するためのキット、検出するためのマイクロアレイ、並びに、間葉系幹細胞の分化能を制御する因子をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト細胞から誘導した誘導性間葉系幹細胞、およびその作製方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
間葉系幹細胞（以下、適宜「ＭＳＣ」と称する。）は、哺乳類の骨髄等の組織中に存在する体性幹細胞の一つであり、脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞に分化する多分化能、及び自己増殖能を有する幹細胞として知られている。ＭＳＣは、その分化多能性の故に、多くの組織についての再生医療のための移植材料として注目されている。すなわち、ＭＳＣを用いて、従来の治療方法では再生しなかった、疾病や障害により失った組織を再生し、機能を回復させる「細胞移植による再生医療」である。具体的には、例えば、下肢虚血（ビュルガー病）患者に対する骨髄間葉系幹細胞の移植、歯周病患部への骨髄間葉系幹細胞の移植、変形性関節症患者に対する骨髄間葉系幹細胞の移植、脳梗塞、心筋梗塞への間葉系幹細胞の移植等の治療が開始または計画されている。
【０００３】
このように、ＭＳＣを再生医療に利用するためには、まず、幹細胞を生体組織から採取し、それを未分化のままで増殖させ、さらに増殖させた未分化幹細胞を所望の細胞へ分化誘導し、再生治療用の組織を調製することが必要となる。
【０００４】
本発明者らはこれまでに、ＭＳＣの採取に際して、採取母体に安全で、且つ採取が容易な分離採取を行うために、口腔組織からＭＳＣを分離採取する方法を報告している（特許文献１参照）。また、基底膜細胞外基質の存在下において、または線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）等の含有培地でＭＳＣを培養することによって、ＭＳＣを著しく速く増殖させ、かつ、その分化能を維持できることを見出して、従来の培養方法と比較して顕著に多くのＭＳＣを得る培養方法を報告している（特許文献２参照）。
【０００５】
さらに、本発明者らは間葉系幹細胞を用いた再生医療を実用化するために、培養した細胞から間葉系幹細胞を識別し、当該間葉系幹細胞を分離する方法を開発した。より具体的には、本発明者らは、形態的に類似しているためにその識別が困難な間葉系幹細胞と線維芽細胞とを、間葉系幹細胞検出用遺伝子マーカーおよび／または間葉系幹細胞検出用タンパク質マーカーを用いて効果的に識別し、分離する方法を開発した（特許文献３参照）。また本発明者らは、分子マーカーを用いて、未分化の間葉系幹細胞と、線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、および脂肪細胞等の他の結合組織系の細胞とを精度よく識別し、未分化の間葉系幹細胞を分離する方法を開発した（特許文献４参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００３−５２３６５号公報（公開日：平成１５年２月２５日）
【特許文献２】特開２００３−５２３６０号公報（公開日：平成１５年２月２５日）
【特許文献３】特開２００８−０９２９１９号公報（公開日：平成２０年４月２４日）
【特許文献４】国際公開ＷＯ２００６／１０６８２３（国際公開日：２００６（平成１８）年１０月１２日）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
骨髄、脂肪または滑膜に由来するネイティブなＭＳＣは、多くの国民（約３０００万人）が罹患する不治の疾患（骨軟骨疾患、心筋梗塞、脳梗塞、歯周病など）に対して新しい治療法を提供し得る。ＭＳＣを骨、軟骨または脂肪へ分化させることは比較的容易であるが、心筋、肝臓、神経などへの分化効率は低い。また、自家のＭＳＣは個体差が大きく、ＭＳＣの数は加齢とともに著しく減少する。このように、培養が困難であるＭＳＣから再生医療に必要な数の細胞を調製する際にネイティブなＭＳＣを出発材料とすることには限界がある。さらに、肝炎、心臓疾患などに罹患した重症患者からの骨髄または脂肪組織の分離は困難である。
【０００８】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、ヒトの胚またはＥＳ細胞を利用することなく、間葉系幹細胞と同様の自己複製能および分化能を有する細胞を作製する技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
近年、体細胞の核を初期化して胚性幹細胞（ＥＳ細胞）様の誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を取得する技術が開発された。ｉＰＳ細胞は、ヒト受精卵を用いないので倫理的な問題がなく、臨床応用が大いに期待されている。なお、ｉＰＳ細胞の作製に必要とされる因子は、ＥＳ細胞に特異的に発現する遺伝子を指標にスクリーニングされた。また、このような遺伝子は、ＥＳＴデータベースを利用したコンピューター解析およびノザンブロット解析に基づいて見出されている。
【００１０】
これまでに、ＤＮＡマイクロアレイ分析を用いて、ＭＳＣと線維芽細胞または分化細胞との間で遺伝子発現プロファイルが比較されている。しかし、これまでになされた報告は具体的な結論を導いておらず、ＭＳＣを人為的に調製する技術を示唆すらしていない。
【００１１】
本発明者らは、独自の観点に基づいて、ＤＮＡマイクロアレイおよびリアルタイムＰＣＲ分析を用いて、ヒトＭＳＣに特徴的な遺伝子を多数同定し、中でも、９つの遺伝子がＭＳＣの自己複製能および分化能の維持に重要であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、誘導性間葉系幹細胞を作製する方法を提供する。本発明にかかる作製方法は、表２に記載の遺伝子の少なくとも１つを細胞に導入する工程を包含することを特徴としており、間葉系幹細胞選択的な無血清培地を用いて培養する工程をさらに包含することが好ましい。
【００１３】
後述する実施例に示すように、表２に記載の遺伝子は、ＭＳＣにおいてその発現が亢進しており、表２に記載の遺伝子に対するｓｉＲＮＡを用いることによってＭＳＣの自己複製能や分化能が抑制される。すなわち、表２に記載の遺伝子を細胞に導入することによって、誘導性間葉系幹細胞を作製することができる。なお、表２に記載の遺伝子は、表２に記載のアクセッション番号を参照することによって、当業者は本発明に必要な遺伝子配列を入手し得る。なお、表２にはヒト遺伝子のみを示しているが、対応する動物遺伝子を使用してもよい。
【００１４】
また、本発明は、誘導性間葉系幹細胞を作製するためのキットを提供する。本発明にかかるキットは、（ａ）表２に記載のアクセッション番号のいずれか１つに示される塩基配列またはその相補配列を有するポリヌクレオチド；（ｂ）上記（ａ）のフラグメントであるポリヌクレオチド；および（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、からなる群より選択されるポリヌクレオチドの１つ以上を備えていることを特徴としている。
【００１５】
本発明は、誘導性間葉系幹細胞を作製するさらなる方法を提供する。本発明にかかる作製方法は、細胞を脱分化条件下にて長期間培養する工程、および培養後の細胞を、間葉系幹細胞選択的な無血清培地を用いて人工マトリックス上でさらに培養する工程を包含することを特徴としている。
【００１６】
上述した誘導性間葉系幹細胞を作製する方法は、誘導性間葉系幹細胞の誘導に好適な因子を培地に添加する工程をさらに包含することが好ましい。上記因子は、表５に記載の因子であっても、後述するスクリーニング方法によって得られた、細胞を間葉系幹細胞様の細胞に誘導する因子であってもよい。
【００１７】
本発明は、誘導性間葉系幹細胞を検出する方法を提供する。本発明にかかる方法は、目的の細胞において、表２に記載の遺伝子の少なくとも１つの発現を検出する工程を包含することを特徴としている。
【００１８】
表２に記載の遺伝子は、ＭＳＣにおいて発現が亢進している転写因子の遺伝子である。よって、上記遺伝子は、誘導性間葉系幹細胞の検出マーカーとして利用可能である。また、上記遺伝子またはそのフラグメントは、誘導性間葉系幹細胞を検出するためのプローブやマイクロアレイに利用可能である。
【００１９】
すなわち、本発明は、誘導性間葉系幹細胞を検出するためのキットを提供する。本発明にかかるキットは、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択されるポリヌクレオチドの１つ以上を備えていることを特徴としている：（ａ）表２に記載のアクセッション番号のいずれか１つに示される塩基配列またはその相補配列を有するポリヌクレオチド；（ｂ）上記（ａ）のフラグメントであるポリヌクレオチド；および、（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【００２０】
また、本発明は、誘導性間葉系幹細胞を検出するためのマイクロアレイを提供する。本発明にかかるマイクロアレイは、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択されるポリヌクレオチドの１つ以上が固定化されていることを特徴としている：（ａ）表２に記載のアクセッション番号のいずれか１つに示される塩基配列またはその相補配列を有するポリヌクレオチド；（ｂ）上記（ａ）のフラグメントであるポリヌクレオチド；および、（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【００２１】
本発明は、誘導性間葉系幹細胞を検出するためのさらなるキットを提供する。本発明にかかるキットは、表２に記載の遺伝子にコードされるポリペプチドと特異的に結合する抗体を備えていることを特徴としている。
【００２２】
上述したように、表２に記載の遺伝子は、ＭＳＣにおいてその発現が亢進している。よって、上記遺伝子にコードされるタンパク質（ポリペプチド）に対する抗体は、誘導性間葉系幹細胞を首尾よく検出し得る。
【００２３】
本発明は、細胞を誘導性間葉系幹細胞に誘導する因子をスクリーニングする方法を提供する。本発明にかかるスクリーニング方法は、候補物質の存在下にて培養した細胞において、表２に記載の遺伝子の少なくとも１つの発現を検出する工程を包含することを特徴としている。
【００２４】
上述したように、表２に記載の遺伝子は、ＭＳＣにおいてその発現が亢進している。よって、上記遺伝子は、候補物質の存在下にて培養した細胞が誘導性間葉系幹細胞に誘導されたか否かを知る指標となり得る。
【００２５】
本発明は、間葉系幹細胞の自己複製能を制御する因子をスクリーニングする方法を提供する。本発明にかかるスクリーニング方法は、候補物質の存在下にて培養した目的の細胞において、表２に記載の遺伝子の少なくとも１つの発現を検出する工程を包含することを特徴としている。
【００２６】
後述する実施例に示すように、表２に記載の遺伝子に対するｓｉＲＮＡを用いることによって間葉系幹細胞の自己複製能を抑制することができる。よって、正常な間葉系幹細胞様の細胞を用いれば、間葉系幹細胞の自己複製能を抑制する因子をスクリーニングし得、また、自己複製能を抑制させた間葉系幹細胞を用いれば、抑制された自己複製能を補完し得る因子（すなわち、自己複製能を活性化する因子）をスクリーニングし得る。
【００２７】
本発明は、間葉系幹細胞の分化能を制御する因子をスクリーニングする方法を提供する。本発明にかかるスクリーニング方法は、候補物質の存在下にて培養した目的の細胞において、表２に記載の遺伝子の少なくとも１つの発現を検出する工程を包含することを特徴としている。
【００２８】
後述する実施例にて示すように、表２に記載の遺伝子に対するｓｉＲＮＡを用いることによって間葉系幹細胞の分化能を抑制することができる。よって、正常な間葉系幹細胞様の細胞を用いれば、間葉系幹細胞の分化能を抑制する因子をスクリーニングし得、また、分化能を抑制させた間葉系幹細胞を用いれば、抑制された分化能を補完し得る因子（すなわち、分化能を活性化する因子）をスクリーニングし得る。
【発明の効果】
【００２９】
本発明を用いれば、ヒトの胚またはＥＳ細胞を利用することなく、間葉系幹細胞と同様の自己複製能および分化能を有する細胞（誘導性間葉系幹細胞）を簡便に作製することができる。また、本発明を用いれば、誘導性間葉系幹細胞を検出することができる。さらに、本発明を用いれば、細胞を誘導性間葉系幹細胞に誘導する因子、間葉系幹細胞の自己複製能を制御する因子、および間葉系幹細胞の分化能を制御する因子をスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ＭＳＣに特徴的な遺伝子についての、ＤＮＡマイクロアレイ分析およびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析の結果の比較を示す図である。
【図２】骨分化誘導培地（ＯＰ）、軟骨分化誘導培地（ＣＰ）、脂肪分化誘導培地（ＡＰ）、または分化因子を含まない培地（Ｍ）中での培養２４時間後の、ＭＳＣに特徴的な遺伝子の発現低下を示す図である。図中、ＭはＭＳＣ、ＯＰは骨前駆細胞、ＣＰは軟骨前駆細胞、ＡＰは脂肪前駆細胞、Ｏは骨芽細胞、Ｃは軟骨細胞、Ａは脂肪細胞を示す。
【図３】骨髄ＭＳＣ、滑膜線維芽細胞および皮膚線維芽細胞の増殖に対するＧＡＴＡ６ ｓｉＲＮＡの影響を調べた結果を示す図である。
【図４】骨髄ＭＳＣの骨分化中におけるアルカリホスファターゼ活性の上昇に対するＭＳＣに特徴的な転写因子のｓｉＲＮＡの影響を調べた結果を示す図である。
【図５】骨髄ＭＳＣの脂肪分化中におけるＧＰＤＨ活性の上昇に対するＭＳＣに特徴的な転写因子のｓｉＲＮＡが与える影響を調べた結果を示す図である。
【図６】抗ＧＡＴＡ６抗体および抗ＬＩＦ抗体を用いた、成熟マウスの上腕骨内ＭＳＣに対する免疫組織化学の結果を示す図である。
【図７】非接着性の骨髄細胞内には、存在するＭＳＣに特徴的な遺伝子転写物が欠損していることを調べた結果を示す図である。
【図８】ＭＳＣに特徴的な分子に対する抗体の種々の組合せを用いた、成熟マウスの上腕骨の骨髄内ＭＳＣ様細胞の二重染色の結果を示す図である。
【図９】上腕骨の軟骨膜に存在するＭＳＣに特徴的な分子の発現を示す図である。
【図１０】上腕骨の骨膜に存在するＭＳＣに特徴的な分子の発現を示す図である。
【図１１】ヨード酢酸の投与による関節症の発症およびＭＳＣのＳＴＥＭＮＥＳＳに関わる遺伝子の誘導を示す図である。
【図１２】ヒト歯肉に由来する線維芽細胞から作製された誘導性間葉系幹細胞を示す図である。
【図１３】ヒト歯髄に由来する線維芽細胞から作製された誘導性間葉系幹細胞を示す図である。
【図１４】ヒト歯髄に由来する線維芽細胞から誘導した誘導性間葉系幹細胞の骨分化能を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
幹細胞は、自己複製能（self-renewal）および多分化能（multi-potency）という２つの際立った特徴（ＳＴＥＭＮＥＳＳ）を有している。近年、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）のＳＴＥＭＮＥＳＳを制御する、あるいはＳＴＥＭＮＥＳＳ状態へのリプログラミングを誘導する転写因子が同定されて、これに基づいてｉＰＳ細胞が作製された。本発明者らは、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）のＳＴＥＭＮＥＳＳを制御する因子を同定し、本発明を完成するに至った。
【００３２】
本発明者らによって同定された、ＭＳＣのＳＴＥＭＮＥＳＳを制御する因子は、表２に示される９種類の転写因子である。これらの転写因子は、ＭＳＣにおいて選択的に発現しており、これらの転写因子に対するｓｉＲＮＡは、ＭＳＣの自己複製能および多分化能を低下させた。また、ＭＳＣ独自の遺伝子発現パターンを維持するためにも、これら９種類の転写因子が必須であることを見出した。
【００３３】
なお、本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。本発明にかかるポリペプチドはまた、天然供給源より単離されても、組換え生成されても、化学合成されてもよい。また、本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。また、「遺伝子」には、ＤＮＡのみならず、ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）をも含む意味である。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「遺伝子配列」、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。
【００３４】
〔１．誘導性間葉系幹細胞およびその作製方法〕
本発明は、誘導性間葉系幹細胞を作製する方法を提供する。本発明にかかる作製方法は、上述した９種類の転写因子の遺伝子を細胞に導入する工程を包含する方法である。上記転写因子に関する情報は、表２に示されており、表２に記載のアクセッション番号を参照することによって、当業者は本発明に必要な遺伝子配列を入手し得る。導入される遺伝子は、表２に記載のいずれか１つであってもよいが、３つ以上であることが好ましく、５つ以下であることがより好ましい。
【００３５】
本明細書中にて使用される場合、用語「誘導性間葉系幹細胞」は、間葉系幹細胞のＳＴＥＭＮＥＳＳ状態へのリプログラミングを誘導する因子を用いて、細胞から誘導された細胞が意図され、Induced progenitor of mesenchyme （ｉＰＭ）細胞ともいう。本発明者らによって見出された、間葉系幹細胞のＳＴＥＭＮＥＳＳを制御する因子は、間葉系幹細胞のＳＴＥＭＮＥＳＳ状態へのリプログラミングを誘導する因子でもあり得る。
【００３６】
間葉系幹細胞への誘導に用いられる細胞としては、特に限定されず、ＥＳ細胞および体性幹細胞を含む、あらゆる細胞が利用可能である。例えば、線維芽細胞、細網細胞、脂肪細胞、マクロファージ（組織球または大食細胞）、肥満細胞、形質細胞、リンパ球、上皮細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞が、本発明に利用可能な細胞として挙げられ、特に、線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞および脂肪細胞が好ましい。また、生体から調製された初代培養細胞でも、樹立された細胞株であってもよく、神経細胞、肝細胞等の組織由来の細胞であってもよい。
【００３７】
ｉＰＭ細胞は、以下の点でネイティブなＭＳＣよりも有利である：（１）増殖能および分化能が非常に高い；（２）種々の疾患（心筋梗塞、脳梗塞、肝炎、肺繊維症など）に適用可能である；（３）重症患者であっても口腔粘膜細胞などから調製可能である；（４）患者の細胞を用いるので、間葉系の罹患組織を試験管内で再構築することが容易である。
【００３８】
ｉＰＳ細胞と同様に、ｉＰＭ細胞は、以下の点でＥＳ細胞よりも有利である：（１）自家細胞から作製し得るので免疫拒絶反応が回避可能である；（２）ヒト胚を利用しないので倫理的問題を有していない。
【００３９】
また、ｉＰＭ細胞は、以下の点でｉＰＳ細胞よりも有利である：（１）癌化しにくい（リプログラミングによる初期化過程は癌化過程と一部共通するメカニズムを使用する。また、初期化は不完全になりやすい。）；（２）細胞作製の効率が高い；（３）薬剤法での誘導が可能である；（４）分化効率が高く、最終目的細胞の調製が容易かつ単純である。
【００４０】
さらに、本発明者らによって得られた知見に基づけば、ｉＰＭ細胞の作製は、ｉＰＳ細胞の作製と比較して以下の点で有利である：（１）癌遺伝子を必須としない；（２）目的遺伝子の転写を直接促進する；（３）染色体構造改変が最少である；（４）誘導に要する期間が短い；（５）誘導効率が高い；（６）細胞集団が不均質になりにくい。
【００４１】
例えば、上記転写因子の遺伝子を線維芽細胞に導入する（例えばTet-on Gene Expression System; Clontechを用いる）。複数の遺伝子を導入する際には、別々に導入してもよいが、当該分野で公知の手法（例えばGateway（登録商標）マルチサイトシステム（Invitrogen））を用いて同時に導入することが好ましい。遺伝子導入された細胞は、例えば薬剤耐性マーカーを用いて導入を確認する。導入後の培養は、ｉＰＭの増殖を選択的に促進する条件下で行われることが好ましい。これにより、線維芽細胞の増殖が抑制される。なお、間葉系幹細胞選択的な無血清培地（例えばSTK2; Two-Cells）を用いることが好ましいが、これに限定されない。また、人工マトリックス上で培養することが好ましいが、これに限定されない。培養後の細胞コロニーを回収し、ＭＳＣマーカーが誘導されていること、および線維芽細胞のマーカーが抑制されていることを、確認する。用いるＭＳＣマーカーとしては、上記転写因子が好ましいが、これらに限定されず、例えば、特許文献３に記載の遺伝子であってもよい。このように取得されたｉＰＭ細胞は自己複製能および分化能を獲得しているが、分化用の各種誘導培地を用いて目的の細胞に分化することを確認することが好ましい。また、遺伝子ではなく目的タンパク質を細胞に導入する方法を用いてもよい。
【００４２】
本発明にかかる作製方法は、誘導性間葉系幹細胞の誘導に好適な因子を培地に添加する工程をさらに包含することが好ましい。上記因子は、培養培地に添加される種々の増殖因子等（例えば表５に記載の因子）であっても、後述するスクリーニング方法によって得られる因子（細胞を間葉系幹細胞様の細胞に誘導する因子）であってもよい。
【００４３】
また、本発明は、上記作製方法に利用可能なキットを提供する。本発明にかかるキットは、（ａ）表２に記載のアクセッション番号のいずれか１つに示される塩基配列またはその相補配列を有するポリヌクレオチド；（ｂ）上記（ａ）のフラグメントであるポリヌクレオチド；および、（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、からなる群より選択されるポリヌクレオチドの１つ以上を備えていることを特徴としている。このように特定されたポリヌクレオチドを備えているキットを、当該分野における周知の遺伝子導入技術と組み合わせて用いることにより、当業者は、上記ポリヌクレオチドを標的細胞の遺伝子に導入して誘導性間葉系幹細胞を作製することができる。
【００４４】
本発明はまた、誘導性間葉系幹細胞を作製するさらなる方法を提供する。本発明にかかる作製方法は、細胞を脱分化条件下にて長期間培養する工程、および培養後の細胞を、間葉系幹細胞選択的な無血清培地を用いて人工マトリックス上でさらに培養する工程を包含する方法である。本明細書中にて使用される場合、「脱分化条件」は、培養系にて分化細胞を脱分化させるための条件であり、具体的には、分化の維持に必要な細胞外マトリックス、増殖因子、サイトカインなどを、培地および培養皿から除去した条件下にて細胞を培養することが意図される。なお、除去されるべき細胞外マトリックス、増殖因子、サイトカインなどは、用いられる細胞の系統ごとによってその組合せが異なる。したがって、成分が未知である血清を使用しないことが望ましく、無血清培地に生存因子および増殖因子を添加し、かつ分化維持に関わる因子を除くべきである。脱分化した細胞を幹細胞へと積極的に変化させるには、ＭＳＣのＳＴＥＭＮＥＳＳを促進する因子（増殖因子、サイトカイン、細胞外マトリックスなど）を、上記の無血清培地に添加する。細胞を脱分化条件下にて培養する期間は細胞や薬剤によって異なり、１週間〜３週間が好ましいが、１週間以内であってもよい。
【００４５】
脱分化条件下にて長期間培養された細胞（例えば、体細胞）はＭＳＣ様細胞に誘導される。このような細胞を間葉系幹細胞の増殖を選択的に促進する条件下で培養することによって、誘導性間葉系幹細胞を首尾よく作製し得る。間葉系幹細胞の増殖を選択的に促進する条件については上述したとおりであり、体細胞（例えば線維芽細胞）の増殖を抑制するために、間葉系幹細胞選択的な無血清培地を用い、人工マトリックス上で培養することが好ましい。
【００４６】
本発明にかかる作製方法もまた、誘導性間葉系幹細胞の誘導に好適な因子を培地に添加する工程をさらに包含することが好ましい。上記因子は、培養培地に添加される種々の増殖因子等（例えば表５に記載の因子）であっても、後述するスクリーニング方法によって得られる因子（細胞を間葉系幹細胞様の細胞に誘導する因子）であってもよい。
【００４７】
後述する実施例にて示すように、本発明者らは誘導性間葉系幹細胞を作製した。この作製された細胞が確かに誘導性間葉系幹細胞であることを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。
【００４８】
誘導性間葉系幹細胞を用いれば、疾患解析系（疾患モデル）を開発することができる。例えば、遺伝性疾患の患者の線維芽細胞から作製した誘導性間葉系幹細胞を、試験管内で分化を誘導することによって、疾患発症メカニズムの解析および治療薬のスクリーニングに利用することができる。間葉系幹細胞に関するこれまでの知見に基づけば、骨軟骨筋肉系疾患、心臓病、腎臓疾患、血管病、肝臓・肺繊維症、神経系疾患などの疾患を対象とし得る。
【００４９】
〔２．誘導性間葉系幹細胞の検出〕
本発明は、誘導性間葉系幹細胞を検出する方法を提供する。本発明にかかる検出方法は、上述した９種類の転写因子の遺伝子の少なくとも１つの発現を検出する工程を包含する方法である。上述したように、上記転写因子に関する情報は、表２に示されており、表２に記載のアクセッション番号を参照することによって、当業者は本発明に必要な遺伝子配列を入手し得る。導入される遺伝子は、表２に記載のいずれか１つであってもよいが、３つ以上であることが好ましく、全てであることが最も好ましい。上記遺伝子は、誘導性間葉系幹細胞の検出マーカーとして利用可能である。また、上記遺伝子またはそのフラグメントは、誘導性間葉系幹細胞を検出するためのプローブやマイクロアレイに利用可能である。
【００５０】
本発明にかかる誘導性間葉系幹細胞の検出方法（以下、「本発明の検出方法」という）は、表２に記載の遺伝子の少なくとも１つを検出マーカーとして用い、被検細胞において、当該検出マーカーの発現を検出する工程を含む方法といえる。本発明の検出方法は、上記の工程が含まれていればよく、その他の工程、条件、使用材料、使用機器等の具体的な構成については特に限定されない。
【００５１】
本発明の検出方法において使用する「被検細胞」は、本発明の検出方法が適用され得る細胞であれば特に限定されない。例えば、誘導性間葉系幹細胞が含まれている、または誘導性間葉系幹細胞が含まれている可能性がある、体細胞由来の細胞集団が挙げられる。
【００５２】
表２に記載の遺伝子は、ＭＳＣにおいて選択的に発現が亢進されている遺伝子である。すなわち、当該遺伝子は、体細胞（例えば、線維芽細胞（ＦＢ）、骨芽細胞（ＯＳ）、軟骨細胞（ＣＨ）および脂肪細胞（ＡＤ））におけるその発現量が相対的に低く、かつＭＳＣにおけるその発現量が相対的に高い遺伝子であるといえる。
【００５３】
したがって、誘導性間葉系幹細胞を作製すべく誘導処理を行った体細胞由来の細胞集団において、表２に記載された遺伝子の発現を検出し、誘導処理の前後でその発現量が増加したことが検出されれば、当該被検細胞は誘導性間葉系幹細胞を含む細胞であるということが判断できる。よって、表２に記載された遺伝子の発現量の変動を確認するのみでは、被検細胞が誘導性間葉系幹細胞であるか否かを識別することはできないが、少なくとも被検細胞が誘導性間葉系幹細胞を含んでいることを判断することができる。つまり、表２に記載された遺伝子は誘導性間葉系幹細胞を検出するための検出マーカーとして利用され得るということである。
【００５４】
すなわち、表２に記載された遺伝子は、ＦＢ、ＯＳ、ＣＨ、ＡＤなどの細胞以外にＭＳＣが含まれている細胞集団であっても、誘導処理によって誘導性間葉系幹細胞が誘導されたか否かを識別する際に用いられ得る。
【００５５】
本発明の検出方法においては、表２に記載されている遺伝子のうち１つ以上を検出することにより本発明の目的を達成し得るが、２つ以上の遺伝子を適宜組み合わせて検出することが好ましい。２つ以上の遺伝子を検出することによって、検出精度を向上させることができる。
【００５６】
なお、上記転写因子を有する細胞の局在については、従来公知の免疫組織化学の手法、例えばデュアル免疫蛍光ラベリング等の蛍光抗体法や酵素抗体法を用いて確認することができる。
【００５７】
上述したように、表２に記載された遺伝子は、誘導性間葉系幹細胞の検出マーカーとして利用可能である。上記検出マーカーの遺伝子の発現を検出する際には、遺伝子の発現の検出に用いられる従来公知の方法を好適に用いることができる。例えば、上記検出マーカーの遺伝子の発現を検出するために、ノーザンブロッティング法を用いることができる。また、上記検出マーカーの遺伝子の発現を検出するために、表２に記載された遺伝子の全長またはその断片（フラグメント）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、上記遺伝子全長またはその一部を検出し得る塩基配列を有する検出用プローブを用いることができる。
【００５８】
上記検出用プローブを用いる誘導性間葉系幹細胞における遺伝子の発現検出は、公知の方法を用いて適宜実施することができる。例えば、本発明における検出マーカーの遺伝子の公知の塩基配列から、ＤＮＡプローブとして適当な長さのＤＮＡプローブを作製し、蛍光標識等の標識を適宜付与しておき、これを被検細胞とハイブリダイズさせることにより、誘導性間葉系幹細胞の検出を行い得る。また上記検出用プローブとしては、本発明における検出マーカーの遺伝子のアンチセンス鎖の全長配列または部分配列からなる検出用のプローブも採用し得る。
【００５９】
すなわち、本発明は、上記検出方法に利用可能なキットを提供する。本発明にかかる検出用キットは、（ａ）表２に記載のアクセッション番号のいずれか１つに示される塩基配列またはその相補配列を有するポリヌクレオチド；（ｂ）上記（ａ）のフラグメントであるポリヌクレオチド；および、（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、からなる群より選択されるポリヌクレオチドの１つ以上を備えていることを特徴としている。
【００６０】
上記検出用プローブの作製に際して、検出マーカーの遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、および１×ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム）、０．１％のＳＤＳ（Sodium dodecyl sulfate）を含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、より好適には、６５℃でのハイブリダイゼーション、および０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理を挙げることができる。
【００６１】
なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば種々の要素を組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００６２】
また、被検細胞における検出マーカーの遺伝子の発現を検出するに際しては、被検細胞の遺伝子を増幅するために、定量的または半定量的ＰＣＲを用いることができる。上記定量的または半定量的ＰＣＲとしては、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）を用いることができる。上記定量的または半定量的ＰＣＲを行うに際しては、本発明における検出マーカーの遺伝子を増幅するためのセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーからなる１対のプライマーセットを用いる。
【００６３】
また、本発明の検出方法は、インベーダ（Invader（登録商標））法を利用して簡便に行うこともできる。例えば、上述の検出マーカーの遺伝子に特異的にハイブリダイズする塩基配列と酵素切断部位とを有するシグナルプローブを設計し、被検細胞から抽出したトータルＲＮＡ（ｃＤＮＡでも構わない）、インベーダオリゴ（Invader（登録商標） Oligo）、クリベース酵素（Cleavase（登録商標） Enzyme）、およびフレットプローブ（FRET Probe）とともに所定の温度、所定の時間（例えば、６３℃、２時間等）反応させることにより行うことができる。なお、具体的な実験手法や条件については、下記参考文献を参照して適宜行うことができる（参考文献：(i) T. J. Griffin et al., Proc Natl Acad Sci U S A 96, 6301-6 (1999) 、(ii) M. W. Kaiser et al., J Biol Chem 274, 21387-94 (1999) 、(iii) V. Lyamichev et al., Nat Biotechnol 17, 292-6 (1999) 、(iv) R. W. Kwiatkowski et al., Mol Diagn 4, 353-64 (1999) 、(v) J. G. Hall et al., Proc Natl Acad Sci U S A 97, 8272-7 (2000) 、(vi) M. Nagano et al., J Lipid Res 43, 1011-8 (2002) 等参照）。
【００６４】
上記のように、インベーダ法を利用すれば、遺伝子増幅の必要がない場合もあり、迅速かつ低コストで行うことができる。なお、市販のインベーダ法キットを利用すれば、より一層簡便に本発明を実施できる。
【００６５】
また、in situハイブリダイゼーションを用いて、本発明の検出方法を行うこともできる。例えば、上述の検出マーカーまたはその部分配列を標識したものを検出用プローブとして用い、スライドグラス上の被検細胞の標本に直接分子雑種を形成させて、その部分を検出することにより簡易に行うことができる。具体的には、スライドグラス上に被検細胞の薄切片（パラフィン切片、凍結切片など）を調製し、これに標識した検出用プローブをハイブリダイズさせ、ノーザンハイブリダイゼーション法と同じように、検出用プローブを洗い落とし、写真用エマルジョンを塗布し、露光する。現像後、銀粒子の分布から、ハイブリダイズした場所を特定する。より具体的な実験手法や条件については、下記参考文献を用いて適宜行うことができる（参考文献：(i)「in situハイブリダイゼーション法」、（1995年７月）、古庄敏行、井村裕夫監修、金原出版（株）発行、932頁〜937頁、(ii)「in situハイブリダイゼーションによる遺伝子発現の解析」、「遺伝子工学実験」、（1991年５月）、野村慎太郎著、（社）日本アイソトープ協会発行、221頁〜232頁等参照）。
【００６６】
in situハイブリダイゼーション法には、ラジオアイソトープ（主として35S）標識したＤＮＡを検出用プローブとして、その座位をオートラジオグラフィーで検出する方法と、標識された検出用プローブの蛍光シグナルを蛍光顕微鏡下で検出する方法があるが、いずれの方法を用いてもよい。
【００６７】
他方、上記検出用キット以外によっても、本発明の検出方法を実行し得る。例えば、誘導性間葉系幹細胞の検出用マイクロアレイを用いて検出マーカーの遺伝子の発現を検出することができる。
【００６８】
すなわち、本発明は、上記検出方法に利用可能なマイクロアレイを提供する。本発明にかかる検出用マイクロアレイは、（ａ）表２に記載のアクセッション番号のいずれか１つに示される塩基配列またはその相補配列を有するポリヌクレオチド；（ｂ）上記（ａ）のフラグメントであるポリヌクレオチド；および、（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、からなる群より選択されるポリヌクレオチドの１つ以上が固定化されていることを特徴としている。
【００６９】
上記検出マーカーの遺伝子の部分塩基配列からなるポリヌクレオチドのサイズは、当該ポリヌクレオチドも用いてマイクロアレイを構成した場合に、目的とする検出マーカーの遺伝子が検出し得るサイズであれば特に限定されない。
【００７０】
上記マイクロアレイとしては、例えば、米国Affymetrix社のＤＮＡマイクロアレイやスタンフォード（Stanford）型のＤＮＡマイクロアレイ等、その他半導体製造で用いられる微細加工技術を用いてシリカ基板上に直接オリゴヌクレオチドを化学合成するＤＮＡマイクロアレイを含む従来公知のあらゆるタイプのマイクロアレイを好適に用いることができ、その具体的な大きさ、形状、システム等については特に限定されない。上記検出用マイクロアレイは、本発明の検出方法の実施に利用されるものであり、本発明が意図する範囲に含まれる。
【００７１】
上述した検出用マイクロアレイは、少なくとも一つの遺伝子を検出することができるように構成されていれば、本発明の目的を達成し得るが、多数の検出マーカーの遺伝子群の発現を網羅的かつ体系的に解析できるとの理由により、２つ以上の遺伝子、より好ましくはできるだけ多数の遺伝子を検出し得るように構成されていることが好ましい。誘導性間葉系幹細胞であるか否かを非常に簡便かつ精度よく識別できるようになるからである。
【００７２】
また、誘導性間葉系幹細胞の検出用マイクロアレイには、表２に記載された誘導性間葉系幹細胞のマーカーのみならず、その他の分子マーカーが固定化されていてもよい。例えば、特許文献３に開示されているＭＳＣ検出用遺伝子分子マーカー、「Ishii,M., Koike,C., Igarashi,A., Yamanaka,K., Pan,H., Higashi,Y., Kawaguchi,H., Sugiyama,M., Kamata,N., Iwata,T., Matsubara,T., Nakamura,K., Kurihara, H., Tsuji,K., and Kato,Y. Molecular Markers Distinguish Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells from Fibroblasts. Biochem Biophys Res Commun.332(1),297-303,2005.」に開示されている分子マーカー、等が挙げられる。
【００７３】
上述したように、表２に記載された遺伝子は、誘導性間葉系幹細胞の検出マーカーとして利用可能である。このことは、当該遺伝子がコードするタンパク質の発現を指標にして検出マーカーの遺伝子の発現を検出し得ることを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。すなわち、表２に記載された遺伝子にコードされるポリペプチドもまた、本発明における検出マーカーであり得る。この場合、目的のタンパク質を、例えば組換えによって生成し、このタンパク質と特異的に結合する抗体を作製し、当該抗体を用いて、後述する公知の方法に従って当該タンパク質の発現量を検出すればよい。
【００７４】
すなわち、本発明は、上記検出方法に利用可能なさらなるキットを提供する。本発明にかかる検出用キットは、表２に記載の遺伝子にコードされるポリペプチドと特異的に結合する抗体を備えていることを特徴としている。なお、上記抗体は、上記ポリペプチドによって惹起される抗体ともいえる。
【００７５】
上述したように、表２に記載の遺伝子は、ＭＳＣにおいてその発現が亢進している。よって、上記遺伝子にコードされるポリペプチドに対する抗体は、誘導性間葉系幹細胞を首尾よく検出し得る。
【００７６】
上記抗体は、ポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよい。上記抗体の作製は、例えば、表２に記載された遺伝子がコードするポリペプチドの全長またはその部分断片を抗原として、従来公知の常法により作製することができる。上記ポリペプチドの部分断片は、免疫原性を有するものであればよい。
【００７７】
例えば、モノクローナル抗体を生産する方法としては、特に限定されず、例えば、抗原でマウスを免疫した後、そのマウス脾臓リンパ球とマウス由来のミエローマ細胞とを融合させてなる抗体産生ハイブリドーマにより、モノクローナル抗体を得ればよい。ハイブリドーマの生産方法は、従来公知の方法、例えば、ハイブリドーマ法（Kohler, G. and Milstein, C., Nature 256, 495-497(1975)）、トリオーマ法、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ法（Kozbor, Immunology Today 4, 72(1983)）、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss, Inc., 77-96(1985)）等を利用することが可能であり、特に限定されない。
【００７８】
また、上記抗原としては、ポリペプチドであれば特に限定されないが、抗原決定基とする物質をキャリアタンパク質に結合してなる抗原タンパク質が用いられてもよい。具体的には、上記抗原がハプテンであれば、抗体の産生等を誘導する能力をもたないため、抗体を産生することができないが、抗原を異種由来のタンパク質などの生体高分子からなる担体と共有結合させて抗原タンパク質を得て、これで免疫すれば、抗体産生を誘導することができる。上記担体としては、特に限定されず、オボアルブミン、γグロブリン、ヘモシアニン等、この分野で従来公知の各種タンパク質を好適に用いることができる。また、モノクローナル抗体は遺伝子組換え技術等によっても生産できる。
【００７９】
また、ポリクローナル抗体を生産する方法としては、実験動物に抗原を接種・感作させ、その体液から抗体成分を精製して取得する方法を挙げることができる。なお、免疫させる動物としては、マウス、ラット、ウサギ、サル、ウマ等の従来公知の実験動物を用いることができ、特に限定されない。また、抗原を接種し感作させる場合、その間隔や量についても常法にしたがって適宜行うことができる。
【００８０】
さらに、本発明の抗体を用いて、被検細胞における検出マーカーのタンパク質の発現を検出するには、公知の抗体を用いた免疫学的測定法を用いて実施することができる。上記免疫学的測定法としては、例えばＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法等の公知の免疫学的測定法を挙げることができる。また、上述した以外にも、例えば、ウェスタンブロッティング法、酵素免疫測定法、抗体による凝集や沈降や溶血反応を観察する方法、組織免疫染色や細胞免疫染色などの形態学的検出法も必要に応じて利用することができる。
【００８１】
〔３．細胞を誘導性間葉系幹細胞に誘導する因子のスクリーニング〕
本発明は、細胞を誘導性間葉系幹細胞に誘導する因子をスクリーニングする方法を提供する。上述したように、表２に記載の遺伝子は、本発明者らによって見出されたＭＳＣのＳＴＥＭＮＥＳＳを制御する因子であり、ＭＳＣにおいて選択的に発現が亢進されている遺伝子である。よって、候補物質の存在下にて培養した細胞における表２に記載の遺伝子の発現量が、候補物質の非存在下と比較して増加した場合、またはＭＳＣにおける発現量に匹敵する場合、その候補因子は、細胞を誘導性間葉系幹細胞に誘導する因子であり得る。
【００８２】
すなわち、本発明にかかるスクリーニング方法は、候補物質の存在下にて培養した細胞において、表２に記載の遺伝子の少なくとも１つの発現を検出する工程を包含することを特徴としている。一実施形態において、本発明にかかるスクリーニング方法は、上記細胞にて検出した遺伝子の、候補物質の非存在下にて培養した細胞における発現を検出する工程をさらに包含することが好ましい。別の実施形態において、本発明にかかるスクリーニング方法は、上記細胞にて検出した遺伝子の、ＭＳＣにおける発現を検出する工程をさらに包含することが好ましい。なお、各遺伝子のＭＳＣにおける発現はデータとして予め蓄積されていてもよい。上述したように、表２に記載の遺伝子は、ＭＳＣにおいてその発現が亢進している。よって、上記遺伝子は、候補物質の存在下にて培養した細胞が誘導性間葉系幹細胞に誘導されたか否かを知る指標となり得る。
【００８３】
本方法に適用される候補物質は、核酸、ペプチド、タンパク質、有機化合物、無機化合物のいずれであってもよい。核酸を候補物質として存在させる場合には、用いる細胞に導入し、導入前後における、表２に記載の遺伝子の発現量の変動を確認すればよい。また、導入後の細胞とＭＳＣとの間で表２に記載の遺伝子の発現量を比較すればよい。ペプチドや化合物を候補物質として存在させる場合には、候補因子を培地に添加し、添加の前後における、表２に記載の遺伝子の発現量の変動を確認すればよい。また、添加後の細胞とＭＳＣとの間で表２に記載の遺伝子の発現量を比較すればよい。
【００８４】
なお、遺伝子の検出には、上述した検出方法、検出用キット、検出用マイクロアレイを用いればよい。また、遺伝子の発現量を調べるには、当該分野における種々の公知の手法を用いればよく、例えば、後述する実施例に示すようなリアルタイム逆転写ＰＣＲが好適に利用される。
【００８５】
〔４．間葉系幹細胞の自己複製能を制御する因子のスクリーニング〕
本発明は、間葉系幹細胞の自己複製能を制御する因子をスクリーニングする方法を提供する。本発明にかかるスクリーニング方法は、候補物質の存在下にて培養した目的の細胞において、表２に記載の遺伝子の少なくとも１つの発現を検出する工程を包含することを特徴としている。
【００８６】
正常なＭＳＣまたはＭＳＣ様の細胞を用いれば、ＭＳＣの自己複製能を活性化または抑制する因子をスクリーニングし得る。また、後述する実施例に示すように、ＭＳＣにおいて表２に記載の遺伝子をノックダウンすることによってＭＳＣの自己複製能を抑制することができる。よって、自己複製能を抑制させたＭＳＣを用いれば、抑制された自己複製能を補完し得る因子（すなわち、自己複製能を活性化する因子）をスクリーニングし得る。遺伝子のノックダウンには、ｓｉＲＮＡ（short interference RNA, small interfering RNA）が好適に用いられるが、これに限定されず、当該分野における種々の公知の手法が採用され得る。
【００８７】
ｓｉＲＮＡは、目的の遺伝子の発現をＲＮＡｉの原理によって抑制することができるものであれば、その塩基配列は特に限定されない。本明細書において「ｓｉＲＮＡ」とは、ｓｔＲＮＡ（small temporal RNA）、およびｓｈＲＮＡ（short hairpin RNA）をも含む意味である。またｓｉＲＮＡの塩基配列の設計は発現抑制を所望する遺伝子の塩基配列情報をもとにして、公知の方法によって行われ得る。現在、ｓｉＲＮＡを設計する際に用いられるソフトウェアが市販されており、効率の観点から当該ソフトウェアを用いて設計することが好ましい。市販のソフトウェアとしては、例えばＲＮＡｉ社製（http://www.rnai.co.jp/）のsiDirectＴＭ等が挙げられる。
【００８８】
上記のようにして設計されたｓｉＲＮＡの合成は、公知の自動ヌクレオチド合成器によって行われ得る。なお現在、ｓｉＲＮＡの設計から合成までを、企業に委託することが可能である。委託先としては、Ambion社、Invitrogen社、QIAGEN社、Dharmacon社等が挙げられる。
【００８９】
後述する実施例において使用したｓｉＲＮＡの塩基配列は以下の通りである。ＥＴＶ５に対するｓｉＲＮＡのセンス鎖の塩基配列を配列番号１に示し、アンチセンス鎖の塩基配列を配列番号２に示した。ＨＭＧＡ２に対するｓｉＲＮＡのセンス鎖の塩基配列を配列番号３に示し、アンチセンス鎖の塩基配列を配列番号４に示した。ＫＬＦ１２に対するｓｉＲＮＡのセンス鎖の塩基配列を配列番号５に示し、アンチセンス鎖の塩基配列を配列番号６に示した。ＳＩＭ２に対するｓｉＲＮＡのセンス鎖の塩基配列を配列番号７に示し、アンチセンス鎖の塩基配列を配列番号８に示した。ＳＯＸ１１に対するｓｉＲＮＡのセンス鎖の塩基配列を配列番号９に示し、アンチセンス鎖の塩基配列を配列番号１０に示した。ＥＴＶ１に対するｓｉＲＮＡのセンス鎖の塩基配列を配列番号１１に示し、アンチセンス鎖の塩基配列を配列番号１２に示した。ＦＯＸＰ１に対するｓｉＲＮＡのセンス鎖の塩基配列を配列番号１３に示し、アンチセンス鎖の塩基配列を配列番号１４に示した。ＰＲＤＭ１６に対するｓｉＲＮＡのセンス鎖の塩基配列を配列番号１５に示し、アンチセンス鎖の塩基配列を配列番号１６に示した。ＧＡＴＡ６に対するｓｉＲＮＡのセンス鎖の塩基配列を配列番号１７に示し、アンチセンス鎖の塩基配列を配列番号１８に示した。
【００９０】
本方法に適用される候補物質は、核酸、ペプチド、タンパク質、有機化合物、無機化合物のいずれであってもよい。核酸を候補物質として存在させる場合には、用いる細胞に導入し、導入前後における、表２に記載の遺伝子の発現量の変動を確認すればよい。また、導入後の細胞と無処置の正常ＭＳＣとの間で表２に記載の遺伝子の発現量を比較すればよい。ペプチドや化合物を候補物質として存在させる場合には、候補因子を培地に添加し、添加の前後における、表２に記載の遺伝子の発現量の変動を確認すればよい。また、添加後の細胞と無処置の正常ＭＳＣとの間で表２に記載の遺伝子の発現量を比較すればよい。
【００９１】
なお、遺伝子の検出には、上述した検出方法、検出用キット、検出用マイクロアレイを用いればよい。また、遺伝子の発現量を調べるには、当該分野における種々の公知の手法を用いればよく、例えば、後述する実施例に示すようなリアルタイム逆転写ＰＣＲが好適に利用される。
【００９２】
〔５．間葉系幹細胞の分化能を制御する因子のスクリーニング〕
本発明は、間葉系幹細胞の分化能を制御する因子をスクリーニングする方法を提供する。本発明にかかるスクリーニング方法は、候補物質の存在下にて培養した目的の細胞において、表２に記載の遺伝子の少なくとも１つの発現を検出する工程を包含することを特徴としている。
【００９３】
正常なＭＳＣまたはＭＳＣ様の細胞を用いれば、ＭＳＣの分化能を活性化または抑制する因子をスクリーニングし得る。また、後述する実施例に示すように、ＭＳＣにおいて表２に記載の遺伝子をノックダウンすることによってＭＳＣの分化能を抑制することができる。よって、分化能を抑制させたＭＳＣを用いれば、抑制された分化能を補完し得る因子（すなわち、分化能を活性化する因子）をスクリーニングし得る。上述したように、遺伝子のノックダウンには、ｓｉＲＮＡが好適に用いられるが、これに限定されず、当該分野における種々の公知の手法が採用され得る。
【００９４】
本方法に適用される候補物質もまた、核酸、ペプチド、タンパク質、有機化合物、無機化合物のいずれであってもよい。核酸を候補物質として存在させる場合には、用いる細胞に導入し、導入前後における、表２に記載の遺伝子の発現量の変動を確認すればよい。また、導入後の細胞と無処置の正常ＭＳＣとの間で表２に記載の遺伝子の発現量を比較すればよい。ペプチドや化合物を候補物質として存在させる場合には、候補因子を培地に添加し、添加の前後における、表２に記載の遺伝子の発現量の変動を確認すればよい。また、添加後の細胞と無処置の正常ＭＳＣとの間で表２に記載の遺伝子の発現量を比較すればよい。
【００９５】
なお、遺伝子の検出には、上述した検出方法、検出用キット、検出用マイクロアレイを用いればよい。また、遺伝子の発現量を調べるには、当該分野における種々の公知の手法を用いればよく、例えば、後述する実施例に示すようなリアルタイム逆転写ＰＣＲが好適に利用される。
【００９６】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【００９７】
また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【実施例】
【００９８】
本発明について、以下の実施例に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されない。
【００９９】
〔１：手順〕
〔１−１：細胞培養〕
ヒト腸骨由来のＭＳＣを、BioWhittaker Inc（Walkersville, MD）から購入した。あるいは、広島大学での倫理的委員会によって認可されたプロトコールに従って腸骨稜から調製した。ヒトの皮膚の線維芽細胞を、クラボウ（Osaka, Japan）から購入し、ヒトの歯肉の線維芽細胞を、公知の手順に従って単離した。ヒトの変形性関節炎の滑膜線維芽細胞を、Cell Applications Inc（SanDiego, California）から購入した。ＭＳＣ培養液の調製および骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞への分化を、公知の手順に従った。間葉系幹細胞を増幅させるためにＦＧＦ−２を１ｎｇ／ｍＬで使用した。遺伝子発現上でのＦＧＦの直接的な作用を避けるため、ＦＧＦをＲＮＡ分離の７２時間前に間葉系幹細胞および線維芽細胞の培養液から除去した。
【０１００】
〔１−２：ＤＮＡマイクロアレイ分析〕
全ＲＮＡを、３株の間葉系幹細胞（６〜９継代）、３株の線維芽細胞（７〜１４継代）、２８日間分化誘導培養液で培養した３株の間葉系幹細胞、変形性関節炎の滑膜に由来する３株のＭＳＣの、コンフルエントの培養物から、RNeasy Miniキット（Qiagen, Chatsworth, CA）を使用して単離した。ＤＮＡマイクロアレイ分析を、３８５００遺伝子、４７０００転写物変異体、５４０００プローブ（Affymetrix Inc.）を含むヒトゲノムU133 plus 2.0チップを用いたクラボウ遺伝子チップ分析サービスによって行った。生データ（マイクロアレイスイートversion 5.0, SF = 1; Affymetrix Inc.）を、GeneSpring（Silicon Genetics,Rodwood City ,LA）を使用してglobal median normalization法に従って標準化した。標準化は、フラッグ値によって制限され、中央値はpresentまたはmarginalの範囲以上の遺伝子を使って算出された。２倍以上の増減で基準化された強度での遺伝子のふるい分けを、分化前後の発現プロファイル遺伝子リストを作成するために使用した。生データをGEO（GSE9451）に登録した。
【０１０１】
〔１−３：リアルタイム逆転写ＰＣＲ〕
リアルタイム逆転写ＰＣＲ分析を、ABI prism 7900HT Sequence Detection System装置、およびソフトウェア（Applied Biosystems Inc、Foster City ,CA）を使用して行った。プライマーおよびプローブを、Applied Biosystems Incから購入した。データを、１８Ｓ ｒＲＮＡに対して標準化した。
【０１０２】
〔１−４：間葉系幹細胞に特徴的な多数の遺伝子の発現に対する、間葉系幹細胞に特徴的な転写因子のｓｉＲＮＡの効果〕
ＥＴＶ１、ＥＴＶ５、ＦＯＸＰ１、ＧＡＴＡ６、ＨＭＧＡ２、ＫＬＦ１２、ＰＲＤＭ１６、ＳＩＭ２、およびＳＯＸ１１についてのｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを、それぞれのヌクレオチド配列を標的として設計し、RNAi Co., Ltd.（Tokyo, Japan）にて合成した。ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを、Lipofectamin 2000（Invitrogen）を使用して１０％ウシ胎仔血清存在下で１２ウエルプレート（直径２２ｍｍ）中にて培養した間葉系幹細胞に、製造者の手順に従って形質移入した。形質移入後に、４８時間（ｎ＝２）および７２時間（ｎ＝２）のノックダウンの効果を、リアルタイム逆転写ＰＣＲによって調査した。
【０１０３】
〔１−５：細胞増殖、アルカリホスファターゼ、ＧＰＤＨ、アリザリンレッド染色、オイルレッドＯ染色〕
間葉系幹細胞、滑膜線維芽細胞、または皮膚線維芽細胞を、２４ウエルの組織培養プレート上で培養し、４０％コンフルエントの段階で、各ｓｉＲＮＡ、またはコントロールｓｉＲＮＡを、Lipofectamin 2000を使用して形質移入した。形質転換細胞を、１０％ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭ培地へ移し、２〜６日間インキュベートした。細胞数を、WST-8試薬（生化学工業，Tokyo, Japan）を使用して計数した。分化の際の潜在的なノックダウンの効果を検証するために、４８ウエルの多穴組織培養プレートにて培養した細胞に対して、８０％コンフルエントの段階で、各ｓｉＲＮＡ又はコントロールｓｉＲＮＡをLipofectamin 2000を使用して形質移入した。形質移入の2日後に、培地を、骨形成および脂肪生成の誘導培地に交換した。アルカリホスファターゼ活性およびＧＰＤＨ活性を測定した。
【０１０４】
〔１−６：免疫組織化学的検査〕
Ｃ５７／ＢＬ／６Ｊマウス(生後０．５〜５６日齢)および胎齢１５．５日の妊娠したマウスを用いた。動物を、ペントバルビタールを使用して麻酔し、４％パラホルムアルデヒドを経心的に灌流した後に、複数の臓器および組織を採取した。肢標本を、１０％ＥＤＴＡを用いて４℃で脱灰した。標本をパラフィン包埋し、回転ミクロトーム（HM355,MICROM,ドイツ）を用いて連続切片（厚さ４μｍ）を作製した。免疫組織化学に用いた抗体は以下の通りである：ポリクローナルヤギ抗ヒトＦＬＧ（1:100, sc-25896, Santa Cruz Biotech. USA），モノクローナルマウス抗ヒトＩＧＦＢＰ３（1:500, I4527, Sigma），モノクローナルマウス抗ヒトＶＥＧＦ（1:1000, 05443, Upstate Inc., USA），ポリクローナルウサギ抗ヒトＧＡＴＡ６（1:500, sc-9055, Santa Cruz Biotech），ポリクローナルウサギ抗マウスＴＲＰＣ４（1:2000, ACC018, Alomone Labs Ltd., イスラエル），ポリクローナルウサギ抗ヒトＴＧＭ２（1:10, AB15536, Abcam Ltd., USA），ポリクローナルウサギ抗ヒトＨＴＲ７（1:300, AB5661, Chemicon Int. Inc., USA），ポリクローナルウサギ抗ヒトＡＤＤ３（1:500, sc-25733, Santa Cruz Biotech），モノクローナルマウス抗マウスＭＥＴ（1:500, sc-8057, Santa Cruz Biotech），ポリクローナルヤギ抗ヒトＬＩＦ（1:500, sc-1336, Santa Cruz Biotech）。抗原修復を、１０ｍＭ ＨＣｌ混和０，１％ペプシン３７℃１０分処理−ＶＥＧＦ、ＧＡＴＡ６，ＴＲＰＣ４，ＨＴＲ７，ＩＧＦＢＰ３，ＦＬＧ，あるいは１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６，０）を用いた９０℃で１０分間のマイクロ波処理（H2800, Energy BeaMSCiences, Inc., USA）−ＴＧＭ２，ＭＥＴ，ＡＤＤ３，ＬＩＦのいずれかで行った。免疫反応性を、Alexa Flour567（５６８ｎｍ，赤）およびAlexa Flour647（６４７ｎｍ，緑）．を併用して可視化した。細胞核を、ＤＡＰＩ（青，S24535, Molecular Probe, USA）を用いて染色した。共焦点の蛍光像を記録した後に、同じ検体をＨＥ染色し、対応した二重免疫陽性細胞の局在を、対応した免疫蛍光およびＨＥ染色された細胞像の重なりによって検証した。二重染色された細胞の発生頻度は３，４画像内にて二重免疫陽性細胞および単陽性細胞を計数して推定した。全ての陽性細胞中における二重免疫陽性細胞の発生頻度を、３段階（高（＞７０％），中（３０−７０％），低（＜３０％））に分類した。同一研究において、免疫反応性を、ＡＢＣ法（ABC Elite kit, Vector, USA）によって発色する3,3′-diaminobenzidine（DAB; SK-4100, Funakoshi, Japan）を用いて可視化した。
【０１０５】
〔２：結果〕
〔２−１：ＭＳＣに特徴的な遺伝子の同定〕
ＤＮＡマイクロアレイ分析のために、線維芽細胞が混入していないＭＳＣ株を用いた。全ての調べられた、単一細胞に由来するコロニーの遺伝子発現プロファイルは、親のＭＳＣ集団のプロファイルに類似した。このことは、発生上の不均一性がなかったことを示している。さらに、適切な分化誘導培地にて分化させた骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞を用いた。これらの細胞のほとんどが２１〜２８日間以内に分化した。５４６７５個のＤＮＡマイクロアレイプローブ（Affymetrix Inc.）を用いて、ＭＳＣ（Ｍ）、骨芽細胞（Ｏ）、軟骨細胞（Ｃ）、脂肪細胞（Ａ）、および線維芽細胞（Ｆ）における遺伝子発現レベルを比較した。クラスター分析は、３つのＭＳＣ株の遺伝子発現プロファイルが、他の株の一つのプロファイルと互いに似ているが、他の全ての細胞のプロファイルと異なっていることを示した。このことは、ＭＳＣ株の中に、調製物ごとのいくらかの小さな変動を示唆している。これらの条件下で、１４８の遺伝子の発現レベルは、分化した細胞および線維芽細胞よりもＭＳＣにおいて２倍以上高かった（表１）。
【０１０６】
【表１】
【０１０７】
表１には、線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞と比較してMSCにおいて選択的に発現される遺伝子群（発現量が２倍以上のもの）を示している（ｎ＝３）。表中に示したMSCに特徴的な遺伝子のいくつかが、変形性関節炎の滑膜線維芽細胞において、線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞の１．５倍以上高い発現レベルを示した（該当する遺伝子を太字で示した。）。また、ケラチン関連遺伝子に下線を付した。
【０１０８】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて、調べた７１個全ての遺伝子の発現が、様々な分化細胞（Ｏ，Ｃ，Ａのいずれか）および線維芽細胞（Ｆ）と比べてＭＳＣ（Ｍ）では選択的に増強されていることを決定した（図１）。
【０１０９】
ＭＳＣに特徴的な遺伝子のＤＮＡマイクロアレイ分析を、それぞれの細胞種（線維芽細胞（Ｆ）、ＭＳＣ（Ｍ）、骨芽細胞（Ｏ）、軟骨細胞（Ｃ）、脂肪細胞（Ａ））について３株ずつ用いて行った。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを、ＭＳＣ（Ｍ）、骨芽細胞（Ｏ）、軟骨細胞（Ｃ）、脂肪細胞（Ａ）についてはそれぞれ６株、線維芽細胞（Ｆ）については４株を使用して行った。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって、１４８個のＭＳＣに特徴的な遺伝子のうち、７１の異なる発現をする遺伝子が確認された。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで決定されたプロファイルを元にしたＭＳＣに特徴的な遺伝子の中に含まれているＶＥＧＦ、およびＭＳＣ／軟骨形成マーカーである白血病抑制因子（ＬＩＦ）についても、併せて示した。値を、３〜６ウエルの平均値±標準誤差を示している（一部２ウエルにて評価した。）。
【０１１０】
図１に示すように、ＤＮＡマイクロアレイおよびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析は、これらの遺伝子における類似した発現パターンを示し、再現性があることを示した。また、ＤＮＡマイクロアレイおよびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって、ポジティブコントロールとしてのＬＩＦがＭＳＣおよび軟骨細胞の両方に高発現していることを示した（図１）。
【０１１１】
ＭＳＣに特徴的な遺伝子が多分化能に関与しているのであれば、それらの遺伝子は他のＭＳＣ様の細胞にも発現している可能性がある。調べた結果、ＭＳＣに特徴的な遺伝子の約５０％（表１における太字）が、実際に皮膚線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞においてよりも変形性関節炎の滑膜線維芽細胞において１．５倍以上高発現していることがわかった。このことは、おそらく変形性関節炎の滑膜線維芽細胞が皮膚線維芽細胞と異なって多分化能を有しているからと考えられる。さらに、変形性関節炎の滑膜線維芽細胞が骨分化や脂肪分化能を有していることを確認した（データは示さず）。ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）およびＭＥＴは、８個のケラチン関連遺伝子（表１における下線）およびケラチン結合タンパク質をコードするＦＬＧとともに、骨髄ＭＳＣにて高発現が示されたが、変形性関節炎の滑膜線維芽細胞では高発現されていなかった。このことは、ＨＧＦ−ＭＥＴ自己分泌ループおよび高ケラチン細胞骨格が骨髄ＭＳＣの特徴であることを示している。
【０１１２】
ＭＳＣに特徴的な遺伝子のいくつかが実際に未分化状態に関連しているのであれば、それらの遺伝子の発現は分化の開始直後に抑制されると考えられる。しかし、実際には、これらの遺伝子（転写因子を含む）の９３％が、骨分化、軟骨分化、脂肪分化の分化誘導培地による培養後２４時間以内に、骨前駆細胞（ＯＰ）、軟骨前駆細胞（ＣＰ）、脂肪前駆細胞（ＡＰ）において発現が低下した（図２ＡおよびＢ）。同じ２４時間の間に、骨芽細胞に特徴的な遺伝子（アルカリファオスファターゼおよびＰＴＨレセプター）、軟骨細胞に特徴的な遺伝子（アグリカンおよびタイプ２コラーゲン）、脂肪細胞に特徴的な遺伝子（ＰＰＡＲγおよびＣ／ＥＢＰα）のいずれも、その発現が上昇していなかった（図２Ｃ）。これらのことは、ＭＳＣに特徴的な分子のほとんどが前駆細胞において発現しないことを示している。
【０１１３】
なお、図２において、Ａは、３つのＭＳＣ株を用いたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって決定されたｍＲＮＡ発現レベルを示し、Ｂは、骨分化誘導培地、軟骨分化誘導培地、脂肪分化誘導培地を用いた培養２４時間後の、７１個のＭＳＣに特徴的な遺伝子の発現低下を示す。調べられた７１個の遺伝子のうち、２４時間培養後に有意に発現低下した遺伝子の割合を分類した。図２において、Ｃは、骨分化誘導培地（ＯＰ）、軟骨分化誘導培地（ＣＰ）、脂肪分化誘導培地（ＡＰ）、分化因子なし培地（Ｍ）を用いて、ＭＳＣを２４時間または２８日間培養し、組織特異的な遺伝子発現を確認した。３つの株を用いたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによってｍＲＮＡレベルを決定した。値は３ウエルの平均値±標準誤差である。
【０１１４】
〔２−２：ＭＳＣに特徴的な転写因子のノックダウンの影響〕
興味深いことに、ＭＳＣに特徴的な遺伝子は９つの転写因子（ＥＴＶ１、ＥＴＶ５、ＦＯＸＰ１、ＧＡＴＡ６、ＨＭＧＡ２、ＫＬＦ１２、ＰＲＤＭ１６、ＳＩＭ２、ＳＯＸ１１）を含むことがわかった。表１に示すように、ＳＯＸ１１を除くほとんどの遺伝子が滑膜線維芽細胞において高発現していた。表２に、９つの転写因子に関する情報を示す。
【０１１５】
【表２】
【０１１６】
これらの転写因子が担っているであろう役割を調べるために、これらの遺伝子を標的として設計したｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを用いた。ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの添加によって、４８〜７２時間（ｓｉＲＮＡにより標的のｍＲＮＡレベルが５０〜８０％に減少した時間）以内に、ＭＳＣに特徴的な遺伝子のほとんど（７１個中５３個；７５％）のｍＲＮＡレベルを有意に発現低下させた（表３）。
【０１１７】
【表３】
【０１１８】
ＭＳＣに特徴的な遺伝子のｍＲＮＡレベルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって評価した。表中の括弧の値は、コントロールを１としたときのｍＲＮＡレベルを示している。有意な発現低下を示している遺伝子を示す（＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００５，†ｐ＜０．０００５）。
【０１１９】
各ｓｉＲＮＡは、ＭＳＣに特徴的な遺伝子の異なるセットを発現低下させた。このことは、これらの発現低下がｓｉＲＮＡの一般的な毒性の影響ではないことを示唆している。また、これらのことは、９つの転写因子がＭＳＣの分子的な特徴に必須であることを示唆している。
【０１２０】
転写因子の機能的な役割を評価するために、ＭＳＣの増殖におけるｓｉＲＮＡの影響を調べた。また、これらの実験において変形性関節炎の関節から単離された滑膜線維芽細胞、骨髄ＭＳＣ、および皮膚線維芽細胞を用いた。ネガティブコントロールｓｉＲＮＡを形質移入したこれらの細胞は、分化後少なくとも６日間まで増殖し続けた。ＧＡＴＡ６のｓｉＲＮＡは、皮膚線維芽細胞の増殖に影響しなかったが、骨髄ＭＳＣの数を減少させ、滑膜線維芽細胞の増殖を停止させた（図３）。細胞数はＷＳＴ−８試薬を用いてＯＤ４９０とＯＤ６３０との比による評価法を用いて算出した。値は３つの培養での平均値±標準誤差を示す。ステューデントＴ検定を用いてネガティブコントロールｓｉＲＮＡと比較している（＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００５）。
【０１２１】
表４は、ＭＳＣ（４種類）、滑膜線維芽細胞（４種類）、皮膚線維芽細胞（３種類）の増殖に対する、９つの転写因子のノックダウンの影響を示している。示した値は、ｓｉＲＮＡを形質移入した後に培養した細胞数増加の、コントロールｓｉＲＮＡを形質移入した後に培養した細胞増加に対する割合（６日目）を示している。
【０１２２】
【表４】
【０１２３】
９６ウエルプレートにて培養し４０％コンフルエントの段階でｓｉＲＮＡを移入し、１０％ウシ胎児血清とともに６日間培養した。ＷＳＴ−８試薬を用いて０日目から６日目の間の細胞数増加を計測した。値は、コントロールｓｉＲＮＡを形質移入された細胞と比べたときの、細胞数の増加のパーセンテージを示している（３培養系の平均値±標準誤差で示す。）。
【０１２４】
ＥＴＶ５およびＳＯＸ１１のノックダウンは、ＭＳＣおよび滑膜線維芽細胞の両方の増殖を停止させた。そして、ＥＴＶ１、ＦＯＸＰ１、ＧＡＴＡ６、ＨＭＧＡ２、ＰＲＤＭ１６、ＳＩＭ２のノックダウンは、これらの細胞の増殖を中程度、あるいは顕著に抑制した。しかし、ｓｉＲＮＡヌクレオチドは皮膚線維芽細胞の増殖にほとんど影響しなかった。このことから、増殖の抑制はｓｉＲＮＡが正常に機能していることを示唆する。ノックダウンの影響は、細胞または株の種類に依存して変動するが、細胞株は細胞種ほどノックダウンに影響しなかった。ノックダウンが骨髄ＭＳＣよりも滑膜線維芽細胞の増殖に顕著な抑制を誘発したのかは不明であるが、滑膜線維芽細胞は生体内で変形性関節炎の関節において活動的な増殖を示した。
【０１２５】
また、ＭＳＣの骨分化能および脂肪分化能に対するノックダウンの効果を調べた。ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを、分化誘導培地で培養する二日前に加えた。アルカリファオスファターゼ活性は、骨分化誘導培地での培養８日後に上昇し始めた。ＭＳＣにおけるＳＩＭ２およびＳＯＸ１１のノックダウンは、酵素活性の上昇を中程度抑制したが、ＨＭＧＡ２およびＰＲＤＭ１６のノックダウンは、酵素活性に対してほとんど影響せず、他のｓｉＲＮＡヌクレオチドでは抑制効果が認められなかった。さらなる実験において、ＳＩＭ２、ＳＯＸ１１、ＦＯＸＰ１のノックダウンにともなって基質石灰化を遅らせた（アリザリンレッド染色で確認）が、いずれのｓｉＲＮＡヌクレオチドも石灰化の最大レベルを低下させることはなかった（示さず）。
【０１２６】
また、骨分化に対するｓｉＲＮＡの影響を調べた。ここでは、骨細胞のマーカーであるＡＬＰａｓｅ活性を用いて評価した（図４）。４８ウエルの組織培養用プレートにて８０％コンフルエントに達した際に、ｓｉＲＮＡまたはコントロールｓｉＲＮＡを細胞に形質移入し、１０％ウシ胎児血清存在下で２４時間静置し、その後１０％ウシ胎児血清添加ＤＭＥＭにより２日間培養した。さらに、これらの細胞を、１０％ウシ胎児血清添加ＤＭＥＭ（点線）、または骨分化誘導培地（実線）に移し、示す日数にわたって培養した。値は３つの培養で平均値±標準誤差を示す。ステューデントＴ検定を用いてネガティブコントロールｓｉＲＮＡと比較している（＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００５）。いくつかの転写因子について、ｓｉＲＮＡを前処置することによってＡＬＰａｓｅ活性の誘導を抑制することがわかった。具体的には、ＡＬＰａｓｅ活性は分化誘導後４日目に上昇し始め、８日目以降にはＨＭＧＡ２、ＰＲＤＭ１６、ＳＩＭ２、ＳＯＸ１１のｓｉＲＮＡがＡＬＰａｓｅの誘導を抑制した。
【０１２７】
さらに、脂肪分化に対するｓｉＲＮＡの影響を調べた。ここでは、脂肪細胞のマーカーであるＧＰＤＨ活性を用いて評価した（図５）。４８ウエルの組織培養用プレートにて８０％コンフルエントに達した際に、ｓｉＲＮＡまたはコントロールｓｉＲＮＡを細胞に形質移入し、１０％ウシ胎児血清存在下で２４時間静置し、その後１０％ウシ胎児血清添加ＤＭＥＭにより２日間培養した。さらに、これらの細胞を、１０％ウシ胎児血清添加ＤＭＥＭ（点線）、または脂肪分化誘導培地（実線）に移し、示す日数にわたって培養した。値は３つの培養で平均値±標準誤差を示す。ステューデントＴ検定を用いてネガティブコントロールｓｉＲＮＡと比較している（＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００５）。いくつかの転写因子について、ｓｉＲＮＡを前処置することによってＧＰＤＨ活性の誘導を抑制することがわかった。具体的には、ＧＰＤＨ活性は分化誘導後８日目に上昇し始め、１２日目にはＥＴＶ１、ＦＯＸＰ１、ＰＲＤＭ１６、ＳＯＸ１１のｓｉＲＮＡがＧＰＤＨの誘導を抑制した。
【０１２８】
なお、各種細胞へのｓｉＲＮＡオリゴの導入効率はほぼ等しいことを確認している。よって、比較した細胞間での遺伝子発現の抑制効率も同等であるといえる。
【０１２９】
〔２−３：ＭＳＣの免疫組織化学〕
同定したＭＳＣマーカー（転写因子ではないものも含む。）について、ＭＳＣに特徴的な分子に対する市販の抗体のうち、どの分化細胞よりもＭＳＣにおいてそのｍＲＮＡレベルが高発現しているＧＡＴＡ６、ＡＤＤ３、ＦＬＧ、ＨＴＲ７、ＩＧＦＢＰ３，ＭＥＴ、ＴＧＭ２、ＴＲＰＣ４、ＶＥＧＦに対する抗体を選択した（図１）。また、ＭＳＣおよび軟骨細胞において、骨芽細胞、脂肪細胞、線維芽細胞においてよりも高いレベルで発現されていたＬＩＦの抗体を選択した（図１）。ＭＳＣ集団に対する一連の二重免疫蛍光染色を行った。そして、共焦点蛍光顕微鏡によって、単一のまたは二重の、免疫陽性の存在を示す証拠を見出した（図６）。
【０１３０】
生後５６日齢の上腕骨の骨髄および骨を、抗ＧＡＴＡ６（Ｂ、Ｄ、Ｅ）、抗ＬＩＦ抗体（Ｃ、Ｄ、Ｅ）あるいは非特異的な血清（Ｆ）とインキュベーションした後、蛍光二次抗体を用いて染色した。ＧＡＴＡ６はいくつかの骨髄細胞の細胞質に存在した。骨髄内にはＧＡＴＡ６免疫陽性の細胞が比較的多く存在した。そして、骨表面のＧＡＴＡ６免疫陽性細胞は骨芽細胞様の形状を有している。また、ＧＡＴＡ６免疫陽性細胞はまた骨膜にも散らばっていた（示さず）。ＬＩＦはいくつかの骨髄細胞の細胞質に存在した。そして、ＬＩＦ免疫陽性細胞は骨膜外に散らばっていた（示さず）。共焦点蛍光顕微鏡と光学顕微鏡にて得られた画像が互いに重ね合わせると、比較的多くの、ＧＡＴＡ６およびＬＩＦの二重免疫陽性細胞が、骨髄内および骨内膜付近に存在し、そしてわずかに骨表面に存在した。二重免疫陽性細胞の割合は高かった（７０％以上）。しかし、骨膜内には二重免疫陽性細胞が認められなかった（示さず）。
【０１３１】
このように、ＧＡＴＡ６陽性細胞（図６Ｂ）、ＬＩＦ陽性細胞（図６Ｃ）は、成熟したマウス上腕骨の骨髄内部、および骨内膜付近に存在した。そして、それらのほとんどが二重に陽性の細胞であった（図６ＤおよびＥ）。非特異的血清および二次抗体単独は特異的な染色は示さなかった。よって、二重染色細胞は多分化能のない造血細胞や線維芽細胞ではないと考えられる。なぜなら、ＧＡＴＡ６およびＬＩＦのｍＲＮＡレベルは骨髄細胞全画分、非接着性骨髄細胞、皮膚線維芽細胞のすべてのうちで非常に低いか、あるいは検出不可能であるからである（図７）。
【０１３２】
ＲＮＡを、ドナーの骨髄液から直接回収した（Ｗｈｏｌｅ ＢＭＣ）。さらに、他のドナーからの骨髄細胞を播種し、培養液内の非接着性細胞からＲＮＡを回収した。次いで、ドナーの骨髄細胞を２４時間または９６時間培養し、接着細胞からＲＮＡを抽出した。さらに、細胞がコンフルエントに達した際にも、ＭＳＣの接着細胞層からＲＮＡを採取した。コントロールに皮膚線維芽細胞を用いて、ＭＳＣに特徴的な遺伝子のｍＲＮＡレベルを、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって決定した。これらのＭＳＣにおけるｍＲＮＡレベルは、他のＭＳＣ株と類似した値であった。値は、二つの培養物における値の平均を示している。
【０１３３】
図７はまた、ＦＬＧ、ＴＧＭ２、ＨＴＲ７が、ＭＳＣにおいて発現しているが他の細胞では発現しなかったこと、ＭＥＴ、ＴＲＰＣ４、ＩＧＦＢＰが、線維芽細胞よりもＭＳＣにおいて高いレベルで発現していたが、非接着性の骨髄細胞では発現していなかったこと、ＡＤＤ３およびＶＥＧＦが、ＭＳＣよりも非接着性の骨髄細胞および線維芽細胞において低レベルで発現していたことを示している。これらのＭＳＣに特徴的な分子の抗体はまた、生体内である程度の骨髄細胞とも反応した。図８は、種々の抗体を用いてマウス骨髄内の二重免疫陽性細胞の同定を示している。抗体産生に用いられた動物種（ウサギ、ヤギ、マウス）とペプシンおよびマイクロ波処置とによって抗原修復した後の免疫反応性の保存を考慮して、二重免疫染色を試験する抗体の組合せを決定した。
【０１３４】
５６日齢のマウス骨髄内のＭＳＣ様細胞を種々の抗体で二重染色し、そして共焦点蛍光顕微鏡を使って評価した。比較的多くのＴＲＰＣ４陽性／ＦＬＧ陽性二重染色細胞が骨髄内と骨内膜付近に存在していた（図８Ａ）。また、比較的多くのＬＩＦ陽性／ＡＤＤ３陽性二重染色細胞が骨髄内に存在し、いくつかのＬＩＦ陽性／ＡＤＤ３陽性二重染色細胞が骨内膜付近に存在したが、骨膜には存在しなかった（図８Ｂ）。多くのＧＡＴＡ６陽性／ＦＬＧ陽性二重染色細胞が骨髄内に存在し、そしていくつかのＧＡＴＡ６陽性／ＦＬＧ陽性二重染色細胞が骨内膜付近に存在していたが、骨膜には存在しなかった（図８Ｃ）。比較的多くのＴＭＧ２陽性／ＬＩＦ陽性二重染色細胞が骨髄内に存在し、そしていくつかのＴＭＧ２陽性／ＬＩＦ陽性二重染色細胞が骨内膜付近に存在していた（図８Ｄ）。いくつかのＴＲＰＣ４陽性／ＩＧＦＢＰ３陽性二重染色細胞が骨髄内に存在していたが、骨膜には存在しなかった（図８Ｅ）。いくつかのＴＧＭ２陽性／ＭＥＴ陽性二重染色細胞が骨髄内と骨内膜付近に存在したが、ＭＥＴ陽性は骨膜には存在しなかった（図８Ｆ）。比較的多くのＬＩＦ陽性／ＭＥＴ陽性二重染色細胞が骨髄内に検出された。そしていくつかのＬＩＦ陽性／ＭＥＴ陽性二重染色細胞が骨内膜付近に存在したが、骨膜には存在しなかった（図８Ｇ）。ひとつのＡＤＤ３陽性／ＭＥＴ陽性二重染色細胞が骨内膜付近に存在したが、ＡＤＤ３陽性／ＭＥＴ陽性は骨膜には存在しなかった（図８Ｈ）。わずかな数のＴＲＰＣ４陽性／ＶＥＧＦ陽性二重染色細胞が骨髄内と骨内膜付近に存在したが、骨膜には存在しなかった（図８Ｉ）。ＧＡＴＡ６陽性／ＶＥＧＦ陽性細胞は骨内膜付近に存在したが、骨内膜表面には存在しなかったが、ＧＡＴＡ６陽性／ＶＥＧＦ陰性は骨表面に存在した。ＧＡＴＡ６陽性あるいはＶＥＧＦ陽性細胞の毛細血管への結合は観察されなかった（図８Ｊ）。ひとつのＧＡＴＡ６陽性／ＩＧＦＢＰ３陽性細胞が骨内膜付近に存在した（図８Ｋ）。ＧＡＴＡ６陽性／ＭＥＴ陽性細胞の数は骨髄内で少なく、また骨内膜付近には存在したが、骨表面にはなく、骨膜にもなかった（図８Ｌ）。ＦＬＧ陽性／ＶＥＧＦ陽性細胞の数は少なく、骨内膜付近に少数存在したが、骨表面や骨膜には存在しなかった（図８Ｍ）。骨髄内のＦＬＧ陽性／ＩＧＦＢＰ３陽性細胞の数は少なく、骨表面や骨膜には検出されなかった（図８Ｎ）。ネガティブコントロールとしての二次抗体単独あるいはコントロールＩｇＧによっては染色されなかった（図８Ｏ）。
【０１３５】
このように、二重免疫陽性細胞の発現率は、ＴＲＣ４／ＦＬＧ（Ａ）において高く、ＬＩＦ／ＡＤＤ３（Ｂ）、ＧＡＴＡ６／ＦＬＧ（Ｃ）、ＴＧＭ２／ＬＩＦ（Ｄ）において中程度、その他の組合せでは低かった。さまざまな組合せの中で、ＧＡＴＡ６／ＦＬＧおよびＴＧＭ２／ＬＩＦが、ＧＡＴＡ６／ＬＩＦ（図６）とともに、ＭＳＣ様細胞の同定に役立つことが判明した。これらは、非接着性の骨髄細胞や皮膚線維芽細胞では発現していない（図７）。線維芽細胞は通常骨髄内に存在ないのでＴＲＰＣ４／ＦＬＧもまた役立つ可能性がある。ＭＥＴ、ＩＧＦＢＰ３、ＶＥＧＦの抗体による、単一または二重の免疫陽性細胞の染色率が低いことは、抗体の質、検体の処理、あるいはこれらのマーカーのｍＲＮＡレベルが常にタンパク質レベルに翻訳して変化する訳ではないことに起因するかもしれない。にもかかわらず、抗体の組合せの全てが、二重免疫陽性細胞の存在を明らかにした。このことは、骨髄細胞各部が生体内で同時にいくつかのＭＳＣマーカータンパクを合成することを示している。
【０１３６】
また、ＧＡＴＡ６、ＬＩＦ、ＦＬＧおよびＴＧＭ２は非接着性の骨髄細胞、造血細胞、線維芽細胞で発現していなかったので、これらの分子を同時に発現する接着性の骨髄細胞はＭＳＣといえる。なお、ＬＩＦはＭＳＣ単独のマーカーではないものの、抗ＬＩＦ抗体が軟骨組織以外の骨髄においてＭＳＣの免疫組織化学を調べる際に有用であるといえる。
【０１３７】
軟骨膜、骨膜もまた、培養によってかあるいは移植後に、軟骨細胞、骨芽細胞に分化するＭＳＣ様細胞を含んでいるので、上腕骨の軟骨膜にあるＭＳＣに特徴的な分子の発現を調べた。ＭＳＣに特徴的な分子のいくつか（ＧＡＴＡ６（図９Ｃ，Ｄ）、ＬＩＦ（図９Ａ，Ｂ）、ＡＤＤ３（図９Ａ，Ｂ）、ＦＬＧ（図９Ｃ，Ｄ）、ＨＴＲ７（示さず）に対する抗体は、軟骨膜内で細胞集団に反応した。一方で、図９に示す組織内に二重免疫陽性細胞は検出されなかった。同様の結果が骨膜においても得られた（図１０）。さらに、軟骨細胞（図９Ａ，Ｃ）も骨細胞（示さず）も、ＧＡＴＡ６、ＦＬＧ、ＡＤＤ３、ＶＥＧＦ（示さず）の抗体に反応しないが、一方で抗ＬＩＦ抗体は軟骨細胞（図９Ａ）に反応し、骨細胞（示さず）に反応しないことを確認した。従って、ＤＮＡマイクロアレイデータは少なくとも部分的には生体内状態に関連しているようである。
【０１３８】
〔２−４：誘導性間葉系幹細胞の誘導に好適な因子〕
表２に示す遺伝子の発現量が、増殖因子等によって影響を受けるかどうかを調べた。
【０１３９】
実験には、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β、インスリン、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）、脂肪酸、ビタミンＣ（ＶＣ）、ウシ胎児血清を用いた。具体的には、３株のヒト骨髄由来細胞（ＭＳＣ−Ｒ１４−Ｐ６、ＭＳＣ−Ｒ１７−Ｐ５、ＭＳＣ−Ｒ６０−Ｐ５）を用いた。培養ディッシュには、ファルコン６ｗｅｌｌ−ｐｌａｔｅを用いた。１０ｃｍディッシュにて１０％ＦＢＳ＋ＦＧＦを含む培地を用いて培養した各細胞を回収し、細胞数を計数した。これらの細胞を２×１０５／ｗｅｌｌ（すなわち、２×１０５／ｃｍ２）にて６ウエルプレートに播種した。１０％ＦＢＳを含む培地、および１０％ＦＢＳ＋ＦＧＦを含む培地をコントロールとし、これら以外の全てについてＡ＋Ｂ１＋Ｃ＋ＥＧＦ＋ＶＣ＋ＰＡを含む無血清培地を用いて細胞を培養し、２４時間後（細胞がほぼサブコンフルエントになった後）に、コントロール以外の培地を、以下を含む培地に交換した。
（１）Ａ＋Ｂ１＋Ｃ＋ＥＧＦ＋ＶＣ＋ＰＡ
（２）Ａ＋Ｂ１＋Ｃ＋ＥＧＦ＋ＶＣ＋ＰＡ−ＦＧＦ
（３）Ａ＋Ｂ１＋Ｃ＋ＥＧＦ＋ＶＣ＋ＰＡ−ＴＧＦ
（４）Ａ＋Ｂ１＋Ｃ＋ＥＧＦ＋ＶＣ＋ＰＡ−ＨＧＦ
（５）Ａ＋Ｂ１＋Ｃ＋ＥＧＦ＋ＶＣ＋ＰＡ−ＰＤＧＦ
（６）Ａ＋Ｂ１＋Ｃ＋ＥＧＦ＋ＶＣ＋ＰＡ−ＥＧＦ
（７）Ａ＋Ｂ１＋Ｃ＋ＥＧＦ＋ＶＣ＋ＰＡ−インスリン
（８）Ａ＋Ｂ１＋Ｃ＋ＥＧＦ＋ＶＣ＋ＰＡ−ＶＣ
（９）Ａ＋Ｂ１＋Ｃ＋ＥＧＦ＋ＶＣ＋ＰＡ−Ｂ１
（１０）Ａ＋Ｂ１＋Ｃ＋ＥＧＦ＋ＶＣ＋ＰＡ−Ｄｅｘ
このような培地中にて細胞をさらに３日間で培養し、トリアゾールを用いて回収した細胞からＲＮＡを抽出した。なお、添加した因子の濃度は以下の通りである：ＰＡ：１０μｇ／ｍｌ、ＦＧＦ：３ｎｇ／ｍｌ、ＴＧＦ：１０ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、ＰＤＧＦ：１０ｎｇ／ｍｌ、ＥＧＦ：２０ｎｇ／ｍｌ、Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ（Ｄｅｘ）：１０−８Ｍ、インスリン：１０μｇ／ｍｌ、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｌｉｐｉｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（ＣＤ）：原液を１００〜２００倍希釈、ＶＣ：５０μｇ／ｍｌ。
【０１４０】
結果を表５に示す。ＭＳＣに特徴的な転写因子の発現量を異なる組合せにて促進または抑制する因子が見出された。すなわち、表５の増殖因子は、それぞれ異なる組合せの、ＭＳＣのＳＴＥＭＮＥＳＳに関わる遺伝子（転写因子を含む。）を誘導し得た。このように、これらの因子は、誘導性間葉系幹細胞の誘導に好適な因子といえる。
【０１４１】
【表５】
【０１４２】
〔２−５：関節症の発症およびＭＳＣのＳＴＥＭＮＥＳＳに関わる遺伝子の誘導〕
６週齢のＳＤ系ラットの大腿骨膝関節腔に、モノヨード酢酸（０．０３，０．０６または１．５ｍｇ／ｊｏｉｎｔ）を投与した２週間後に、同関節の軟骨からＲＮＡを抽出した。そして、ＭＳＣのＳＴＥＭＮＥＳＳに関わる転写因子（表２に記載の遺伝子についての対応ラット遺伝子）の発現レベルを検討した。その結果、関節炎を発症したラットの軟骨では、分化マーカーであるアグリカンおよびＩＩ型コラーゲンの発現が低下している一方で、ＭＳＣのＳＴＥＭＮＥＳＳに関わる転写因子の数種類がその発現レベルを亢進していた（図１１）。つまり、炎症によって軟骨細胞が脱分化するとともに、少なくとも一部の脱分化細胞がＭＳＣ様細胞へ変化したと推察される。したがって、各種の組織（軟骨を含む。）に各種の薬物を注射して、ＭＳＣのＳＴＥＭＮＥＳＳに関わる転写因子の発現を促進すれば、誘導性間葉系幹細胞を生体内で誘導することができる。また、表５の増殖因子を疾患部位へ投与することにより、生体内にて誘導性間葉系幹細胞の数を増加させることができると考えられる。そして、これらの実験モデルは、幹細胞を誘導する薬物をスクリーニングする際に有用である。
【０１４３】
〔２−６：種々の組織に由来する線維芽細胞からの誘導性間葉系幹細胞の作製〕
ヒト歯肉由来の線維芽細胞を分離した。次いで、これらの細胞を、ＭＳＣのＳＴＥＭＮＥＳＳを促進する因子（表５）を添加した無血清培地ＳＴＫ２（ＤＳファーマバイオメデイカル社製）を用いて７日間培養した。その後、骨分化誘導培地を用いて１５〜２０日間培養した（図１２）。高レベルのアルカリホスファターゼ活性および石灰化（アリザリン赤染色）が誘導された（それぞれ図１２ＡおよびＢ）。なお、通常の培養法を用いて同じ細胞を培養した場合は、アルカリホスファターゼ活性および石灰化レベルが低かった（結果は示さず）。
【０１４４】
同様の実験を、分離培養したヒト歯髄由来の線維芽細胞を用いて行った。具体的には、ヒト歯髄由来の線維芽細胞を分離し、次いで、これらの細胞を、ＭＳＣのＳＴＥＭＮＥＳＳを促進する因子（表５）を添加した無血清培地ＳＴＫ２（ＤＳファーマバイオメデイカル社製）を用いて７日間培養した。その後、骨分化誘導培地を用いて２〜３週間培養した。結果を図１３に示す。ヒト歯肉由来の線維芽細胞の場合と同様に、ヒト歯髄由来の線維芽細胞においても、高レベルのアルカリホスファターゼ活性および石灰化（アリザリン赤染色）が誘導された（それぞれ図１３ＡおよびＢ）。
【０１４５】
このように、ＭＳＣのＳＴＥＭＮＥＳＳを促進する因子を添加した無血清培地を用いることにより、種々の組織に由来する線維芽細胞から誘導性間葉系幹細胞を作製することができた。これらの誘導性間葉系幹細胞は再生医療に有用である。また、上述した無血清培地に別の薬剤をさらに追加すれば、骨分化能がより高い誘導性間葉系幹細胞を作製し得るので、本系は薬剤スクリーニング系として非常に有用である。
【０１４６】
〔２−７：歯髄由来の線維芽細胞から誘導した誘導性間葉系幹細胞の骨分化能〕
ヒト歯髄由来の線維芽細胞を５×１０３個／ｃｍ２の密度にて培養皿に播種して、コンフルエントになるまで培養した。培養条件は、ＭＳＣのＳＴＥＭＮＥＳＳを促進する因子（表５）を添加した無血清培地ＳＴＫ２を用いて５日間培養（Ａ）、または通常の増殖培地（抗生物質および１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ）を用いて１３日間培養（Ｂ）である。その後、培地を骨分化誘導培地に交換して骨分化誘導を開始した。Ａは１４日間、Ｂは２０日間骨分化誘導培地を用いて培養した後に、アリザリン赤染色によって骨分化能を評価した。骨分化の方法をTutsumiらの方法に従って行った（Retention of multilineage differentiation potential of mesenchymal cells during proliferation in response to FGF. Tsutsumi S, Shimazu A, Miyazaki K, Pan H, Koike C, Yoshida E, Takagishi K, Kato Y. Biochem Biophys Res Commun. 2001 Oct 26;288(2):413-9.）。
【０１４７】
このように、ＭＳＣのＳＴＥＭＮＥＳＳを促進する因子を添加した無血清培地を用いることにより、誘導性間葉系幹細胞を作製し得た。また、上記無血清培地に別の薬剤をさらに追加すれば、分化能がより高い誘導性間葉系幹細胞を作製し得るので。本系は薬剤スクリーニング系として有用である。
【０１４８】
以上のように、骨髄ＭＳＣの特徴となる分子の発現が、これらの細胞において選択的に発現している転写因子によって決定されることを見出した。そして、これらの転写因子のいくつかは、明らかにＭＳＣのＳＴＥＭＮＥＳＳの調節に関与していた。特に、ＥＴＶ１、ＥＴＶ５、ＦＯＸＰ１、ＧＡＴＡ６、ＨＭＧＡ２、ＳＩＭ２、ＳＯＸ１１のノックダウンはＭＳＣの自己複製能を抑制した。また、ＦＯＸＰ１、ＳＯＸ１１、ＥＴＶ１、ＳＩＭ２、ＰＲＤＭ１６のノックダウンは骨分化や脂肪分化のポテンシャルを低下させた。さらに、滑膜線維芽細胞が生体内に存在するＭＳＣ様細胞であることを同定した。そして、骨髄内のＭＳＣ様細胞の局在は幹細胞が骨の発生、成長に生理学的に関与することを示し、成熟した骨髄はＭＳＣの供給源であることが示された。これらの知見は、再生医療における成人骨髄ＭＳＣの使用を大いに促進し得る。
【産業上の利用可能性】
【０１４９】
本発明は、ヒトの胚またはＥＳ細胞を利用することなく、間葉系幹細胞と同様の自己複製能および分化能を有する細胞を提供し得るので、医薬分野、特に再生医療に関連する分野に大いに貢献し得る。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト細胞から誘導した誘導性間葉系幹細胞、およびその作製方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
間葉系幹細胞（以下、適宜「ＭＳＣ」と称する。）は、哺乳類の骨髄等の組織中に存在する体性幹細胞の一つであり、脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞に分化する多分化能、及び自己増殖能を有する幹細胞として知られている。ＭＳＣは、その分化多能性の故に、多くの組織についての再生医療のための移植材料として注目されている。すなわち、ＭＳＣを用いて、従来の治療方法では再生しなかった、疾病や障害により失った組織を再生し、機能を回復させる「細胞移植による再生医療」である。具体的には、例えば、下肢虚血（ビュルガー病）患者に対する骨髄間葉系幹細胞の移植、歯周病患部への骨髄間葉系幹細胞の移植、変形性関節症患者に対する骨髄間葉系幹細胞の移植、脳梗塞、心筋梗塞への間葉系幹細胞の移植等の治療が開始または計画されている。
【０００３】
このように、ＭＳＣを再生医療に利用するためには、まず、幹細胞を生体組織から採取し、それを未分化のままで増殖させ、さらに増殖させた未分化幹細胞を所望の細胞へ分化誘導し、再生治療用の組織を調製することが必要となる。
【０００４】
本発明者らはこれまでに、ＭＳＣの採取に際して、採取母体に安全で、且つ採取が容易な分離採取を行うために、口腔組織からＭＳＣを分離採取する方法を報告している（特許文献１参照）。また、基底膜細胞外基質の存在下において、または線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）等の含有培地でＭＳＣを培養することによって、ＭＳＣを著しく速く増殖させ、かつ、その分化能を維持できることを見出して、従来の培養方法と比較して顕著に多くのＭＳＣを得る培養方法を報告している（特許文献２参照）。
【０００５】
さらに、本発明者らは間葉系幹細胞を用いた再生医療を実用化するために、培養した細胞から間葉系幹細胞を識別し、当該間葉系幹細胞を分離する方法を開発した。より具体的には、本発明者らは、形態的に類似しているためにその識別が困難な間葉系幹細胞と線維芽細胞とを、間葉系幹細胞検出用遺伝子マーカーおよび／または間葉系幹細胞検出用タンパク質マーカーを用いて効果的に識別し、分離する方法を開発した（特許文献３参照）。また本発明者らは、分子マーカーを用いて、未分化の間葉系幹細胞と、線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、および脂肪細胞等の他の結合組織系の細胞とを精度よく識別し、未分化の間葉系幹細胞を分離する方法を開発した（特許文献４参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００３−５２３６５号公報（公開日：平成１５年２月２５日）
【特許文献２】特開２００３−５２３６０号公報（公開日：平成１５年２月２５日）
【特許文献３】特開２００８−０９２９１９号公報（公開日：平成２０年４月２４日）
【特許文献４】国際公開ＷＯ２００６／１０６８２３（国際公開日：２００６（平成１８）年１０月１２日）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
骨髄、脂肪または滑膜に由来するネイティブなＭＳＣは、多くの国民（約３０００万人）が罹患する不治の疾患（骨軟骨疾患、心筋梗塞、脳梗塞、歯周病など）に対して新しい治療法を提供し得る。ＭＳＣを骨、軟骨または脂肪へ分化させることは比較的容易であるが、心筋、肝臓、神経などへの分化効率は低い。また、自家のＭＳＣは個体差が大きく、ＭＳＣの数は加齢とともに著しく減少する。このように、培養が困難であるＭＳＣから再生医療に必要な数の細胞を調製する際にネイティブなＭＳＣを出発材料とすることには限界がある。さらに、肝炎、心臓疾患などに罹患した重症患者からの骨髄または脂肪組織の分離は困難である。
【０００８】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、ヒトの胚またはＥＳ細胞を利用することなく、間葉系幹細胞と同様の自己複製能および分化能を有する細胞を作製する技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
近年、体細胞の核を初期化して胚性幹細胞（ＥＳ細胞）様の誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を取得する技術が開発された。ｉＰＳ細胞は、ヒト受精卵を用いないので倫理的な問題がなく、臨床応用が大いに期待されている。なお、ｉＰＳ細胞の作製に必要とされる因子は、ＥＳ細胞に特異的に発現する遺伝子を指標にスクリーニングされた。また、このような遺伝子は、ＥＳＴデータベースを利用したコンピューター解析およびノザンブロット解析に基づいて見出されている。
【００１０】
これまでに、ＤＮＡマイクロアレイ分析を用いて、ＭＳＣと線維芽細胞または分化細胞との間で遺伝子発現プロファイルが比較されている。しかし、これまでになされた報告は具体的な結論を導いておらず、ＭＳＣを人為的に調製する技術を示唆すらしていない。
【００１１】
本発明者らは、独自の観点に基づいて、ＤＮＡマイクロアレイおよびリアルタイムＰＣＲ分析を用いて、ヒトＭＳＣに特徴的な遺伝子を多数同定し、中でも、９つの遺伝子がＭＳＣの自己複製能および分化能の維持に重要であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、誘導性間葉系幹細胞を作製する方法を提供する。本発明にかかる作製方法は、表２に記載の遺伝子の少なくとも１つを細胞に導入する工程を包含することを特徴としており、間葉系幹細胞選択的な無血清培地を用いて培養する工程をさらに包含することが好ましい。
【００１３】
後述する実施例に示すように、表２に記載の遺伝子は、ＭＳＣにおいてその発現が亢進しており、表２に記載の遺伝子に対するｓｉＲＮＡを用いることによってＭＳＣの自己複製能や分化能が抑制される。すなわち、表２に記載の遺伝子を細胞に導入することによって、誘導性間葉系幹細胞を作製することができる。なお、表２に記載の遺伝子は、表２に記載のアクセッション番号を参照することによって、当業者は本発明に必要な遺伝子配列を入手し得る。なお、表２にはヒト遺伝子のみを示しているが、対応する動物遺伝子を使用してもよい。
【００１４】
また、本発明は、誘導性間葉系幹細胞を作製するためのキットを提供する。本発明にかかるキットは、（ａ）表２に記載のアクセッション番号のいずれか１つに示される塩基配列またはその相補配列を有するポリヌクレオチド；（ｂ）上記（ａ）のフラグメントであるポリヌクレオチド；および（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、からなる群より選択されるポリヌクレオチドの１つ以上を備えていることを特徴としている。
【００１５】
本発明は、誘導性間葉系幹細胞を作製するさらなる方法を提供する。本発明にかかる作製方法は、細胞を脱分化条件下にて長期間培養する工程、および培養後の細胞を、間葉系幹細胞選択的な無血清培地を用いて人工マトリックス上でさらに培養する工程を包含することを特徴としている。
【００１６】
上述した誘導性間葉系幹細胞を作製する方法は、誘導性間葉系幹細胞の誘導に好適な因子を培地に添加する工程をさらに包含することが好ましい。上記因子は、表５に記載の因子であっても、後述するスクリーニング方法によって得られた、細胞を間葉系幹細胞様の細胞に誘導する因子であってもよい。
【００１７】
本発明は、誘導性間葉系幹細胞を検出する方法を提供する。本発明にかかる方法は、目的の細胞において、表２に記載の遺伝子の少なくとも１つの発現を検出する工程を包含することを特徴としている。
【００１８】
表２に記載の遺伝子は、ＭＳＣにおいて発現が亢進している転写因子の遺伝子である。よって、上記遺伝子は、誘導性間葉系幹細胞の検出マーカーとして利用可能である。また、上記遺伝子またはそのフラグメントは、誘導性間葉系幹細胞を検出するためのプローブやマイクロアレイに利用可能である。
【００１９】
すなわち、本発明は、誘導性間葉系幹細胞を検出するためのキットを提供する。本発明にかかるキットは、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択されるポリヌクレオチドの１つ以上を備えていることを特徴としている：（ａ）表２に記載のアクセッション番号のいずれか１つに示される塩基配列またはその相補配列を有するポリヌクレオチド；（ｂ）上記（ａ）のフラグメントであるポリヌクレオチド；および、（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【００２０】
また、本発明は、誘導性間葉系幹細胞を検出するためのマイクロアレイを提供する。本発明にかかるマイクロアレイは、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択されるポリヌクレオチドの１つ以上が固定化されていることを特徴としている：（ａ）表２に記載のアクセッション番号のいずれか１つに示される塩基配列またはその相補配列を有するポリヌクレオチド；（ｂ）上記（ａ）のフラグメントであるポリヌクレオチド；および、（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【００２１】
本発明は、誘導性間葉系幹細胞を検出するためのさらなるキットを提供する。本発明にかかるキットは、表２に記載の遺伝子にコードされるポリペプチドと特異的に結合する抗体を備えていることを特徴としている。
【００２２】
上述したように、表２に記載の遺伝子は、ＭＳＣにおいてその発現が亢進している。よって、上記遺伝子にコードされるタンパク質（ポリペプチド）に対する抗体は、誘導性間葉系幹細胞を首尾よく検出し得る。
【００２３】
本発明は、細胞を誘導性間葉系幹細胞に誘導する因子をスクリーニングする方法を提供する。本発明にかかるスクリーニング方法は、候補物質の存在下にて培養した細胞において、表２に記載の遺伝子の少なくとも１つの発現を検出する工程を包含することを特徴としている。
【００２４】
上述したように、表２に記載の遺伝子は、ＭＳＣにおいてその発現が亢進している。よって、上記遺伝子は、候補物質の存在下にて培養した細胞が誘導性間葉系幹細胞に誘導されたか否かを知る指標となり得る。
【００２５】
本発明は、間葉系幹細胞の自己複製能を制御する因子をスクリーニングする方法を提供する。本発明にかかるスクリーニング方法は、候補物質の存在下にて培養した目的の細胞において、表２に記載の遺伝子の少なくとも１つの発現を検出する工程を包含することを特徴としている。
【００２６】
後述する実施例に示すように、表２に記載の遺伝子に対するｓｉＲＮＡを用いることによって間葉系幹細胞の自己複製能を抑制することができる。よって、正常な間葉系幹細胞様の細胞を用いれば、間葉系幹細胞の自己複製能を抑制する因子をスクリーニングし得、また、自己複製能を抑制させた間葉系幹細胞を用いれば、抑制された自己複製能を補完し得る因子（すなわち、自己複製能を活性化する因子）をスクリーニングし得る。
【００２７】
本発明は、間葉系幹細胞の分化能を制御する因子をスクリーニングする方法を提供する。本発明にかかるスクリーニング方法は、候補物質の存在下にて培養した目的の細胞において、表２に記載の遺伝子の少なくとも１つの発現を検出する工程を包含することを特徴としている。
【００２８】
後述する実施例にて示すように、表２に記載の遺伝子に対するｓｉＲＮＡを用いることによって間葉系幹細胞の分化能を抑制することができる。よって、正常な間葉系幹細胞様の細胞を用いれば、間葉系幹細胞の分化能を抑制する因子をスクリーニングし得、また、分化能を抑制させた間葉系幹細胞を用いれば、抑制された分化能を補完し得る因子（すなわち、分化能を活性化する因子）をスクリーニングし得る。
【発明の効果】
【００２９】
本発明を用いれば、ヒトの胚またはＥＳ細胞を利用することなく、間葉系幹細胞と同様の自己複製能および分化能を有する細胞（誘導性間葉系幹細胞）を簡便に作製することができる。また、本発明を用いれば、誘導性間葉系幹細胞を検出することができる。さらに、本発明を用いれば、細胞を誘導性間葉系幹細胞に誘導する因子、間葉系幹細胞の自己複製能を制御する因子、および間葉系幹細胞の分化能を制御する因子をスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ＭＳＣに特徴的な遺伝子についての、ＤＮＡマイクロアレイ分析およびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析の結果の比較を示す図である。
【図２】骨分化誘導培地（ＯＰ）、軟骨分化誘導培地（ＣＰ）、脂肪分化誘導培地（ＡＰ）、または分化因子を含まない培地（Ｍ）中での培養２４時間後の、ＭＳＣに特徴的な遺伝子の発現低下を示す図である。図中、ＭはＭＳＣ、ＯＰは骨前駆細胞、ＣＰは軟骨前駆細胞、ＡＰは脂肪前駆細胞、Ｏは骨芽細胞、Ｃは軟骨細胞、Ａは脂肪細胞を示す。
【図３】骨髄ＭＳＣ、滑膜線維芽細胞および皮膚線維芽細胞の増殖に対するＧＡＴＡ６ ｓｉＲＮＡの影響を調べた結果を示す図である。
【図４】骨髄ＭＳＣの骨分化中におけるアルカリホスファターゼ活性の上昇に対するＭＳＣに特徴的な転写因子のｓｉＲＮＡの影響を調べた結果を示す図である。
【図５】骨髄ＭＳＣの脂肪分化中におけるＧＰＤＨ活性の上昇に対するＭＳＣに特徴的な転写因子のｓｉＲＮＡが与える影響を調べた結果を示す図である。
【図６】抗ＧＡＴＡ６抗体および抗ＬＩＦ抗体を用いた、成熟マウスの上腕骨内ＭＳＣに対する免疫組織化学の結果を示す図である。
【図７】非接着性の骨髄細胞内には、存在するＭＳＣに特徴的な遺伝子転写物が欠損していることを調べた結果を示す図である。
【図８】ＭＳＣに特徴的な分子に対する抗体の種々の組合せを用いた、成熟マウスの上腕骨の骨髄内ＭＳＣ様細胞の二重染色の結果を示す図である。
【図９】上腕骨の軟骨膜に存在するＭＳＣに特徴的な分子の発現を示す図である。
【図１０】上腕骨の骨膜に存在するＭＳＣに特徴的な分子の発現を示す図である。
【図１１】ヨード酢酸の投与による関節症の発症およびＭＳＣのＳＴＥＭＮＥＳＳに関わる遺伝子の誘導を示す図である。
【図１２】ヒト歯肉に由来する線維芽細胞から作製された誘導性間葉系幹細胞を示す図である。
【図１３】ヒト歯髄に由来する線維芽細胞から作製された誘導性間葉系幹細胞を示す図である。
【図１４】ヒト歯髄に由来する線維芽細胞から誘導した誘導性間葉系幹細胞の骨分化能を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
幹細胞は、自己複製能（self-renewal）および多分化能（multi-potency）という２つの際立った特徴（ＳＴＥＭＮＥＳＳ）を有している。近年、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）のＳＴＥＭＮＥＳＳを制御する、あるいはＳＴＥＭＮＥＳＳ状態へのリプログラミングを誘導する転写因子が同定されて、これに基づいてｉＰＳ細胞が作製された。本発明者らは、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）のＳＴＥＭＮＥＳＳを制御する因子を同定し、本発明を完成するに至った。
【００３２】
本発明者らによって同定された、ＭＳＣのＳＴＥＭＮＥＳＳを制御する因子は、表２に示される９種類の転写因子である。これらの転写因子は、ＭＳＣにおいて選択的に発現しており、これらの転写因子に対するｓｉＲＮＡは、ＭＳＣの自己複製能および多分化能を低下させた。また、ＭＳＣ独自の遺伝子発現パターンを維持するためにも、これら９種類の転写因子が必須であることを見出した。
【００３３】
なお、本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。本発明にかかるポリペプチドはまた、天然供給源より単離されても、組換え生成されても、化学合成されてもよい。また、本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。また、「遺伝子」には、ＤＮＡのみならず、ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）をも含む意味である。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「遺伝子配列」、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。
【００３４】
〔１．誘導性間葉系幹細胞およびその作製方法〕
本発明は、誘導性間葉系幹細胞を作製する方法を提供する。本発明にかかる作製方法は、上述した９種類の転写因子の遺伝子を細胞に導入する工程を包含する方法である。上記転写因子に関する情報は、表２に示されており、表２に記載のアクセッション番号を参照することによって、当業者は本発明に必要な遺伝子配列を入手し得る。導入される遺伝子は、表２に記載のいずれか１つであってもよいが、３つ以上であることが好ましく、５つ以下であることがより好ましい。
【００３５】
本明細書中にて使用される場合、用語「誘導性間葉系幹細胞」は、間葉系幹細胞のＳＴＥＭＮＥＳＳ状態へのリプログラミングを誘導する因子を用いて、細胞から誘導された細胞が意図され、Induced progenitor of mesenchyme （ｉＰＭ）細胞ともいう。本発明者らによって見出された、間葉系幹細胞のＳＴＥＭＮＥＳＳを制御する因子は、間葉系幹細胞のＳＴＥＭＮＥＳＳ状態へのリプログラミングを誘導する因子でもあり得る。
【００３６】
間葉系幹細胞への誘導に用いられる細胞としては、特に限定されず、ＥＳ細胞および体性幹細胞を含む、あらゆる細胞が利用可能である。例えば、線維芽細胞、細網細胞、脂肪細胞、マクロファージ（組織球または大食細胞）、肥満細胞、形質細胞、リンパ球、上皮細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞が、本発明に利用可能な細胞として挙げられ、特に、線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞および脂肪細胞が好ましい。また、生体から調製された初代培養細胞でも、樹立された細胞株であってもよく、神経細胞、肝細胞等の組織由来の細胞であってもよい。
【００３７】
ｉＰＭ細胞は、以下の点でネイティブなＭＳＣよりも有利である：（１）増殖能および分化能が非常に高い；（２）種々の疾患（心筋梗塞、脳梗塞、肝炎、肺繊維症など）に適用可能である；（３）重症患者であっても口腔粘膜細胞などから調製可能である；（４）患者の細胞を用いるので、間葉系の罹患組織を試験管内で再構築することが容易である。
【００３８】
ｉＰＳ細胞と同様に、ｉＰＭ細胞は、以下の点でＥＳ細胞よりも有利である：（１）自家細胞から作製し得るので免疫拒絶反応が回避可能である；（２）ヒト胚を利用しないので倫理的問題を有していない。
【００３９】
また、ｉＰＭ細胞は、以下の点でｉＰＳ細胞よりも有利である：（１）癌化しにくい（リプログラミングによる初期化過程は癌化過程と一部共通するメカニズムを使用する。また、初期化は不完全になりやすい。）；（２）細胞作製の効率が高い；（３）薬剤法での誘導が可能である；（４）分化効率が高く、最終目的細胞の調製が容易かつ単純である。
【００４０】
さらに、本発明者らによって得られた知見に基づけば、ｉＰＭ細胞の作製は、ｉＰＳ細胞の作製と比較して以下の点で有利である：（１）癌遺伝子を必須としない；（２）目的遺伝子の転写を直接促進する；（３）染色体構造改変が最少である；（４）誘導に要する期間が短い；（５）誘導効率が高い；（６）細胞集団が不均質になりにくい。
【００４１】
例えば、上記転写因子の遺伝子を線維芽細胞に導入する（例えばTet-on Gene Expression System; Clontechを用いる）。複数の遺伝子を導入する際には、別々に導入してもよいが、当該分野で公知の手法（例えばGateway（登録商標）マルチサイトシステム（Invitrogen））を用いて同時に導入することが好ましい。遺伝子導入された細胞は、例えば薬剤耐性マーカーを用いて導入を確認する。導入後の培養は、ｉＰＭの増殖を選択的に促進する条件下で行われることが好ましい。これにより、線維芽細胞の増殖が抑制される。なお、間葉系幹細胞選択的な無血清培地（例えばSTK2; Two-Cells）を用いることが好ましいが、これに限定されない。また、人工マトリックス上で培養することが好ましいが、これに限定されない。培養後の細胞コロニーを回収し、ＭＳＣマーカーが誘導されていること、および線維芽細胞のマーカーが抑制されていることを、確認する。用いるＭＳＣマーカーとしては、上記転写因子が好ましいが、これらに限定されず、例えば、特許文献３に記載の遺伝子であってもよい。このように取得されたｉＰＭ細胞は自己複製能および分化能を獲得しているが、分化用の各種誘導培地を用いて目的の細胞に分化することを確認することが好ましい。また、遺伝子ではなく目的タンパク質を細胞に導入する方法を用いてもよい。
【００４２】
本発明にかかる作製方法は、誘導性間葉系幹細胞の誘導に好適な因子を培地に添加する工程をさらに包含することが好ましい。上記因子は、培養培地に添加される種々の増殖因子等（例えば表５に記載の因子）であっても、後述するスクリーニング方法によって得られる因子（細胞を間葉系幹細胞様の細胞に誘導する因子）であってもよい。
【００４３】
また、本発明は、上記作製方法に利用可能なキットを提供する。本発明にかかるキットは、（ａ）表２に記載のアクセッション番号のいずれか１つに示される塩基配列またはその相補配列を有するポリヌクレオチド；（ｂ）上記（ａ）のフラグメントであるポリヌクレオチド；および、（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、からなる群より選択されるポリヌクレオチドの１つ以上を備えていることを特徴としている。このように特定されたポリヌクレオチドを備えているキットを、当該分野における周知の遺伝子導入技術と組み合わせて用いることにより、当業者は、上記ポリヌクレオチドを標的細胞の遺伝子に導入して誘導性間葉系幹細胞を作製することができる。
【００４４】
本発明はまた、誘導性間葉系幹細胞を作製するさらなる方法を提供する。本発明にかかる作製方法は、細胞を脱分化条件下にて長期間培養する工程、および培養後の細胞を、間葉系幹細胞選択的な無血清培地を用いて人工マトリックス上でさらに培養する工程を包含する方法である。本明細書中にて使用される場合、「脱分化条件」は、培養系にて分化細胞を脱分化させるための条件であり、具体的には、分化の維持に必要な細胞外マトリックス、増殖因子、サイトカインなどを、培地および培養皿から除去した条件下にて細胞を培養することが意図される。なお、除去されるべき細胞外マトリックス、増殖因子、サイトカインなどは、用いられる細胞の系統ごとによってその組合せが異なる。したがって、成分が未知である血清を使用しないことが望ましく、無血清培地に生存因子および増殖因子を添加し、かつ分化維持に関わる因子を除くべきである。脱分化した細胞を幹細胞へと積極的に変化させるには、ＭＳＣのＳＴＥＭＮＥＳＳを促進する因子（増殖因子、サイトカイン、細胞外マトリックスなど）を、上記の無血清培地に添加する。細胞を脱分化条件下にて培養する期間は細胞や薬剤によって異なり、１週間〜３週間が好ましいが、１週間以内であってもよい。
【００４５】
脱分化条件下にて長期間培養された細胞（例えば、体細胞）はＭＳＣ様細胞に誘導される。このような細胞を間葉系幹細胞の増殖を選択的に促進する条件下で培養することによって、誘導性間葉系幹細胞を首尾よく作製し得る。間葉系幹細胞の増殖を選択的に促進する条件については上述したとおりであり、体細胞（例えば線維芽細胞）の増殖を抑制するために、間葉系幹細胞選択的な無血清培地を用い、人工マトリックス上で培養することが好ましい。
【００４６】
本発明にかかる作製方法もまた、誘導性間葉系幹細胞の誘導に好適な因子を培地に添加する工程をさらに包含することが好ましい。上記因子は、培養培地に添加される種々の増殖因子等（例えば表５に記載の因子）であっても、後述するスクリーニング方法によって得られる因子（細胞を間葉系幹細胞様の細胞に誘導する因子）であってもよい。
【００４７】
後述する実施例にて示すように、本発明者らは誘導性間葉系幹細胞を作製した。この作製された細胞が確かに誘導性間葉系幹細胞であることを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。
【００４８】
誘導性間葉系幹細胞を用いれば、疾患解析系（疾患モデル）を開発することができる。例えば、遺伝性疾患の患者の線維芽細胞から作製した誘導性間葉系幹細胞を、試験管内で分化を誘導することによって、疾患発症メカニズムの解析および治療薬のスクリーニングに利用することができる。間葉系幹細胞に関するこれまでの知見に基づけば、骨軟骨筋肉系疾患、心臓病、腎臓疾患、血管病、肝臓・肺繊維症、神経系疾患などの疾患を対象とし得る。
【００４９】
〔２．誘導性間葉系幹細胞の検出〕
本発明は、誘導性間葉系幹細胞を検出する方法を提供する。本発明にかかる検出方法は、上述した９種類の転写因子の遺伝子の少なくとも１つの発現を検出する工程を包含する方法である。上述したように、上記転写因子に関する情報は、表２に示されており、表２に記載のアクセッション番号を参照することによって、当業者は本発明に必要な遺伝子配列を入手し得る。導入される遺伝子は、表２に記載のいずれか１つであってもよいが、３つ以上であることが好ましく、全てであることが最も好ましい。上記遺伝子は、誘導性間葉系幹細胞の検出マーカーとして利用可能である。また、上記遺伝子またはそのフラグメントは、誘導性間葉系幹細胞を検出するためのプローブやマイクロアレイに利用可能である。
【００５０】
本発明にかかる誘導性間葉系幹細胞の検出方法（以下、「本発明の検出方法」という）は、表２に記載の遺伝子の少なくとも１つを検出マーカーとして用い、被検細胞において、当該検出マーカーの発現を検出する工程を含む方法といえる。本発明の検出方法は、上記の工程が含まれていればよく、その他の工程、条件、使用材料、使用機器等の具体的な構成については特に限定されない。
【００５１】
本発明の検出方法において使用する「被検細胞」は、本発明の検出方法が適用され得る細胞であれば特に限定されない。例えば、誘導性間葉系幹細胞が含まれている、または誘導性間葉系幹細胞が含まれている可能性がある、体細胞由来の細胞集団が挙げられる。
【００５２】
表２に記載の遺伝子は、ＭＳＣにおいて選択的に発現が亢進されている遺伝子である。すなわち、当該遺伝子は、体細胞（例えば、線維芽細胞（ＦＢ）、骨芽細胞（ＯＳ）、軟骨細胞（ＣＨ）および脂肪細胞（ＡＤ））におけるその発現量が相対的に低く、かつＭＳＣにおけるその発現量が相対的に高い遺伝子であるといえる。
【００５３】
したがって、誘導性間葉系幹細胞を作製すべく誘導処理を行った体細胞由来の細胞集団において、表２に記載された遺伝子の発現を検出し、誘導処理の前後でその発現量が増加したことが検出されれば、当該被検細胞は誘導性間葉系幹細胞を含む細胞であるということが判断できる。よって、表２に記載された遺伝子の発現量の変動を確認するのみでは、被検細胞が誘導性間葉系幹細胞であるか否かを識別することはできないが、少なくとも被検細胞が誘導性間葉系幹細胞を含んでいることを判断することができる。つまり、表２に記載された遺伝子は誘導性間葉系幹細胞を検出するための検出マーカーとして利用され得るということである。
【００５４】
すなわち、表２に記載された遺伝子は、ＦＢ、ＯＳ、ＣＨ、ＡＤなどの細胞以外にＭＳＣが含まれている細胞集団であっても、誘導処理によって誘導性間葉系幹細胞が誘導されたか否かを識別する際に用いられ得る。
【００５５】
本発明の検出方法においては、表２に記載されている遺伝子のうち１つ以上を検出することにより本発明の目的を達成し得るが、２つ以上の遺伝子を適宜組み合わせて検出することが好ましい。２つ以上の遺伝子を検出することによって、検出精度を向上させることができる。
【００５６】
なお、上記転写因子を有する細胞の局在については、従来公知の免疫組織化学の手法、例えばデュアル免疫蛍光ラベリング等の蛍光抗体法や酵素抗体法を用いて確認することができる。
【００５７】
上述したように、表２に記載された遺伝子は、誘導性間葉系幹細胞の検出マーカーとして利用可能である。上記検出マーカーの遺伝子の発現を検出する際には、遺伝子の発現の検出に用いられる従来公知の方法を好適に用いることができる。例えば、上記検出マーカーの遺伝子の発現を検出するために、ノーザンブロッティング法を用いることができる。また、上記検出マーカーの遺伝子の発現を検出するために、表２に記載された遺伝子の全長またはその断片（フラグメント）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、上記遺伝子全長またはその一部を検出し得る塩基配列を有する検出用プローブを用いることができる。
【００５８】
上記検出用プローブを用いる誘導性間葉系幹細胞における遺伝子の発現検出は、公知の方法を用いて適宜実施することができる。例えば、本発明における検出マーカーの遺伝子の公知の塩基配列から、ＤＮＡプローブとして適当な長さのＤＮＡプローブを作製し、蛍光標識等の標識を適宜付与しておき、これを被検細胞とハイブリダイズさせることにより、誘導性間葉系幹細胞の検出を行い得る。また上記検出用プローブとしては、本発明における検出マーカーの遺伝子のアンチセンス鎖の全長配列または部分配列からなる検出用のプローブも採用し得る。
【００５９】
すなわち、本発明は、上記検出方法に利用可能なキットを提供する。本発明にかかる検出用キットは、（ａ）表２に記載のアクセッション番号のいずれか１つに示される塩基配列またはその相補配列を有するポリヌクレオチド；（ｂ）上記（ａ）のフラグメントであるポリヌクレオチド；および、（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、からなる群より選択されるポリヌクレオチドの１つ以上を備えていることを特徴としている。
【００６０】
上記検出用プローブの作製に際して、検出マーカーの遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、および１×ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム）、０．１％のＳＤＳ（Sodium dodecyl sulfate）を含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、より好適には、６５℃でのハイブリダイゼーション、および０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理を挙げることができる。
【００６１】
なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば種々の要素を組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００６２】
また、被検細胞における検出マーカーの遺伝子の発現を検出するに際しては、被検細胞の遺伝子を増幅するために、定量的または半定量的ＰＣＲを用いることができる。上記定量的または半定量的ＰＣＲとしては、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）を用いることができる。上記定量的または半定量的ＰＣＲを行うに際しては、本発明における検出マーカーの遺伝子を増幅するためのセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーからなる１対のプライマーセットを用いる。
【００６３】
また、本発明の検出方法は、インベーダ（Invader（登録商標））法を利用して簡便に行うこともできる。例えば、上述の検出マーカーの遺伝子に特異的にハイブリダイズする塩基配列と酵素切断部位とを有するシグナルプローブを設計し、被検細胞から抽出したトータルＲＮＡ（ｃＤＮＡでも構わない）、インベーダオリゴ（Invader（登録商標） Oligo）、クリベース酵素（Cleavase（登録商標） Enzyme）、およびフレットプローブ（FRET Probe）とともに所定の温度、所定の時間（例えば、６３℃、２時間等）反応させることにより行うことができる。なお、具体的な実験手法や条件については、下記参考文献を参照して適宜行うことができる（参考文献：(i) T. J. Griffin et al., Proc Natl Acad Sci U S A 96, 6301-6 (1999) 、(ii) M. W. Kaiser et al., J Biol Chem 274, 21387-94 (1999) 、(iii) V. Lyamichev et al., Nat Biotechnol 17, 292-6 (1999) 、(iv) R. W. Kwiatkowski et al., Mol Diagn 4, 353-64 (1999) 、(v) J. G. Hall et al., Proc Natl Acad Sci U S A 97, 8272-7 (2000) 、(vi) M. Nagano et al., J Lipid Res 43, 1011-8 (2002) 等参照）。
【００６４】
上記のように、インベーダ法を利用すれば、遺伝子増幅の必要がない場合もあり、迅速かつ低コストで行うことができる。なお、市販のインベーダ法キットを利用すれば、より一層簡便に本発明を実施できる。
【００６５】
また、in situハイブリダイゼーションを用いて、本発明の検出方法を行うこともできる。例えば、上述の検出マーカーまたはその部分配列を標識したものを検出用プローブとして用い、スライドグラス上の被検細胞の標本に直接分子雑種を形成させて、その部分を検出することにより簡易に行うことができる。具体的には、スライドグラス上に被検細胞の薄切片（パラフィン切片、凍結切片など）を調製し、これに標識した検出用プローブをハイブリダイズさせ、ノーザンハイブリダイゼーション法と同じように、検出用プローブを洗い落とし、写真用エマルジョンを塗布し、露光する。現像後、銀粒子の分布から、ハイブリダイズした場所を特定する。より具体的な実験手法や条件については、下記参考文献を用いて適宜行うことができる（参考文献：(i)「in situハイブリダイゼーション法」、（1995年７月）、古庄敏行、井村裕夫監修、金原出版（株）発行、932頁〜937頁、(ii)「in situハイブリダイゼーションによる遺伝子発現の解析」、「遺伝子工学実験」、（1991年５月）、野村慎太郎著、（社）日本アイソトープ協会発行、221頁〜232頁等参照）。
【００６６】
in situハイブリダイゼーション法には、ラジオアイソトープ（主として35S）標識したＤＮＡを検出用プローブとして、その座位をオートラジオグラフィーで検出する方法と、標識された検出用プローブの蛍光シグナルを蛍光顕微鏡下で検出する方法があるが、いずれの方法を用いてもよい。
【００６７】
他方、上記検出用キット以外によっても、本発明の検出方法を実行し得る。例えば、誘導性間葉系幹細胞の検出用マイクロアレイを用いて検出マーカーの遺伝子の発現を検出することができる。
【００６８】
すなわち、本発明は、上記検出方法に利用可能なマイクロアレイを提供する。本発明にかかる検出用マイクロアレイは、（ａ）表２に記載のアクセッション番号のいずれか１つに示される塩基配列またはその相補配列を有するポリヌクレオチド；（ｂ）上記（ａ）のフラグメントであるポリヌクレオチド；および、（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、からなる群より選択されるポリヌクレオチドの１つ以上が固定化されていることを特徴としている。
【００６９】
上記検出マーカーの遺伝子の部分塩基配列からなるポリヌクレオチドのサイズは、当該ポリヌクレオチドも用いてマイクロアレイを構成した場合に、目的とする検出マーカーの遺伝子が検出し得るサイズであれば特に限定されない。
【００７０】
上記マイクロアレイとしては、例えば、米国Affymetrix社のＤＮＡマイクロアレイやスタンフォード（Stanford）型のＤＮＡマイクロアレイ等、その他半導体製造で用いられる微細加工技術を用いてシリカ基板上に直接オリゴヌクレオチドを化学合成するＤＮＡマイクロアレイを含む従来公知のあらゆるタイプのマイクロアレイを好適に用いることができ、その具体的な大きさ、形状、システム等については特に限定されない。上記検出用マイクロアレイは、本発明の検出方法の実施に利用されるものであり、本発明が意図する範囲に含まれる。
【００７１】
上述した検出用マイクロアレイは、少なくとも一つの遺伝子を検出することができるように構成されていれば、本発明の目的を達成し得るが、多数の検出マーカーの遺伝子群の発現を網羅的かつ体系的に解析できるとの理由により、２つ以上の遺伝子、より好ましくはできるだけ多数の遺伝子を検出し得るように構成されていることが好ましい。誘導性間葉系幹細胞であるか否かを非常に簡便かつ精度よく識別できるようになるからである。
【００７２】
また、誘導性間葉系幹細胞の検出用マイクロアレイには、表２に記載された誘導性間葉系幹細胞のマーカーのみならず、その他の分子マーカーが固定化されていてもよい。例えば、特許文献３に開示されているＭＳＣ検出用遺伝子分子マーカー、「Ishii,M., Koike,C., Igarashi,A., Yamanaka,K., Pan,H., Higashi,Y., Kawaguchi,H., Sugiyama,M., Kamata,N., Iwata,T., Matsubara,T., Nakamura,K., Kurihara, H., Tsuji,K., and Kato,Y. Molecular Markers Distinguish Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells from Fibroblasts. Biochem Biophys Res Commun.332(1),297-303,2005.」に開示されている分子マーカー、等が挙げられる。
【００７３】
上述したように、表２に記載された遺伝子は、誘導性間葉系幹細胞の検出マーカーとして利用可能である。このことは、当該遺伝子がコードするタンパク質の発現を指標にして検出マーカーの遺伝子の発現を検出し得ることを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。すなわち、表２に記載された遺伝子にコードされるポリペプチドもまた、本発明における検出マーカーであり得る。この場合、目的のタンパク質を、例えば組換えによって生成し、このタンパク質と特異的に結合する抗体を作製し、当該抗体を用いて、後述する公知の方法に従って当該タンパク質の発現量を検出すればよい。
【００７４】
すなわち、本発明は、上記検出方法に利用可能なさらなるキットを提供する。本発明にかかる検出用キットは、表２に記載の遺伝子にコードされるポリペプチドと特異的に結合する抗体を備えていることを特徴としている。なお、上記抗体は、上記ポリペプチドによって惹起される抗体ともいえる。
【００７５】
上述したように、表２に記載の遺伝子は、ＭＳＣにおいてその発現が亢進している。よって、上記遺伝子にコードされるポリペプチドに対する抗体は、誘導性間葉系幹細胞を首尾よく検出し得る。
【００７６】
上記抗体は、ポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよい。上記抗体の作製は、例えば、表２に記載された遺伝子がコードするポリペプチドの全長またはその部分断片を抗原として、従来公知の常法により作製することができる。上記ポリペプチドの部分断片は、免疫原性を有するものであればよい。
【００７７】
例えば、モノクローナル抗体を生産する方法としては、特に限定されず、例えば、抗原でマウスを免疫した後、そのマウス脾臓リンパ球とマウス由来のミエローマ細胞とを融合させてなる抗体産生ハイブリドーマにより、モノクローナル抗体を得ればよい。ハイブリドーマの生産方法は、従来公知の方法、例えば、ハイブリドーマ法（Kohler, G. and Milstein, C., Nature 256, 495-497(1975)）、トリオーマ法、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ法（Kozbor, Immunology Today 4, 72(1983)）、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss, Inc., 77-96(1985)）等を利用することが可能であり、特に限定されない。
【００７８】
また、上記抗原としては、ポリペプチドであれば特に限定されないが、抗原決定基とする物質をキャリアタンパク質に結合してなる抗原タンパク質が用いられてもよい。具体的には、上記抗原がハプテンであれば、抗体の産生等を誘導する能力をもたないため、抗体を産生することができないが、抗原を異種由来のタンパク質などの生体高分子からなる担体と共有結合させて抗原タンパク質を得て、これで免疫すれば、抗体産生を誘導することができる。上記担体としては、特に限定されず、オボアルブミン、γグロブリン、ヘモシアニン等、この分野で従来公知の各種タンパク質を好適に用いることができる。また、モノクローナル抗体は遺伝子組換え技術等によっても生産できる。
【００７９】
また、ポリクローナル抗体を生産する方法としては、実験動物に抗原を接種・感作させ、その体液から抗体成分を精製して取得する方法を挙げることができる。なお、免疫させる動物としては、マウス、ラット、ウサギ、サル、ウマ等の従来公知の実験動物を用いることができ、特に限定されない。また、抗原を接種し感作させる場合、その間隔や量についても常法にしたがって適宜行うことができる。
【００８０】
さらに、本発明の抗体を用いて、被検細胞における検出マーカーのタンパク質の発現を検出するには、公知の抗体を用いた免疫学的測定法を用いて実施することができる。上記免疫学的測定法としては、例えばＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法等の公知の免疫学的測定法を挙げることができる。また、上述した以外にも、例えば、ウェスタンブロッティング法、酵素免疫測定法、抗体による凝集や沈降や溶血反応を観察する方法、組織免疫染色や細胞免疫染色などの形態学的検出法も必要に応じて利用することができる。
【００８１】
〔３．細胞を誘導性間葉系幹細胞に誘導する因子のスクリーニング〕
本発明は、細胞を誘導性間葉系幹細胞に誘導する因子をスクリーニングする方法を提供する。上述したように、表２に記載の遺伝子は、本発明者らによって見出されたＭＳＣのＳＴＥＭＮＥＳＳを制御する因子であり、ＭＳＣにおいて選択的に発現が亢進されている遺伝子である。よって、候補物質の存在下にて培養した細胞における表２に記載の遺伝子の発現量が、候補物質の非存在下と比較して増加した場合、またはＭＳＣにおける発現量に匹敵する場合、その候補因子は、細胞を誘導性間葉系幹細胞に誘導する因子であり得る。
【００８２】
すなわち、本発明にかかるスクリーニング方法は、候補物質の存在下にて培養した細胞において、表２に記載の遺伝子の少なくとも１つの発現を検出する工程を包含することを特徴としている。一実施形態において、本発明にかかるスクリーニング方法は、上記細胞にて検出した遺伝子の、候補物質の非存在下にて培養した細胞における発現を検出する工程をさらに包含することが好ましい。別の実施形態において、本発明にかかるスクリーニング方法は、上記細胞にて検出した遺伝子の、ＭＳＣにおける発現を検出する工程をさらに包含することが好ましい。なお、各遺伝子のＭＳＣにおける発現はデータとして予め蓄積されていてもよい。上述したように、表２に記載の遺伝子は、ＭＳＣにおいてその発現が亢進している。よって、上記遺伝子は、候補物質の存在下にて培養した細胞が誘導性間葉系幹細胞に誘導されたか否かを知る指標となり得る。
【００８３】
本方法に適用される候補物質は、核酸、ペプチド、タンパク質、有機化合物、無機化合物のいずれであってもよい。核酸を候補物質として存在させる場合には、用いる細胞に導入し、導入前後における、表２に記載の遺伝子の発現量の変動を確認すればよい。また、導入後の細胞とＭＳＣとの間で表２に記載の遺伝子の発現量を比較すればよい。ペプチドや化合物を候補物質として存在させる場合には、候補因子を培地に添加し、添加の前後における、表２に記載の遺伝子の発現量の変動を確認すればよい。また、添加後の細胞とＭＳＣとの間で表２に記載の遺伝子の発現量を比較すればよい。
【００８４】
なお、遺伝子の検出には、上述した検出方法、検出用キット、検出用マイクロアレイを用いればよい。また、遺伝子の発現量を調べるには、当該分野における種々の公知の手法を用いればよく、例えば、後述する実施例に示すようなリアルタイム逆転写ＰＣＲが好適に利用される。
【００８５】
〔４．間葉系幹細胞の自己複製能を制御する因子のスクリーニング〕
本発明は、間葉系幹細胞の自己複製能を制御する因子をスクリーニングする方法を提供する。本発明にかかるスクリーニング方法は、候補物質の存在下にて培養した目的の細胞において、表２に記載の遺伝子の少なくとも１つの発現を検出する工程を包含することを特徴としている。
【００８６】
正常なＭＳＣまたはＭＳＣ様の細胞を用いれば、ＭＳＣの自己複製能を活性化または抑制する因子をスクリーニングし得る。また、後述する実施例に示すように、ＭＳＣにおいて表２に記載の遺伝子をノックダウンすることによってＭＳＣの自己複製能を抑制することができる。よって、自己複製能を抑制させたＭＳＣを用いれば、抑制された自己複製能を補完し得る因子（すなわち、自己複製能を活性化する因子）をスクリーニングし得る。遺伝子のノックダウンには、ｓｉＲＮＡ（short interference RNA, small interfering RNA）が好適に用いられるが、これに限定されず、当該分野における種々の公知の手法が採用され得る。
【００８７】
ｓｉＲＮＡは、目的の遺伝子の発現をＲＮＡｉの原理によって抑制することができるものであれば、その塩基配列は特に限定されない。本明細書において「ｓｉＲＮＡ」とは、ｓｔＲＮＡ（small temporal RNA）、およびｓｈＲＮＡ（short hairpin RNA）をも含む意味である。またｓｉＲＮＡの塩基配列の設計は発現抑制を所望する遺伝子の塩基配列情報をもとにして、公知の方法によって行われ得る。現在、ｓｉＲＮＡを設計する際に用いられるソフトウェアが市販されており、効率の観点から当該ソフトウェアを用いて設計することが好ましい。市販のソフトウェアとしては、例えばＲＮＡｉ社製（http://www.rnai.co.jp/）のsiDirectＴＭ等が挙げられる。
【００８８】
上記のようにして設計されたｓｉＲＮＡの合成は、公知の自動ヌクレオチド合成器によって行われ得る。なお現在、ｓｉＲＮＡの設計から合成までを、企業に委託することが可能である。委託先としては、Ambion社、Invitrogen社、QIAGEN社、Dharmacon社等が挙げられる。
【００８９】
後述する実施例において使用したｓｉＲＮＡの塩基配列は以下の通りである。ＥＴＶ５に対するｓｉＲＮＡのセンス鎖の塩基配列を配列番号１に示し、アンチセンス鎖の塩基配列を配列番号２に示した。ＨＭＧＡ２に対するｓｉＲＮＡのセンス鎖の塩基配列を配列番号３に示し、アンチセンス鎖の塩基配列を配列番号４に示した。ＫＬＦ１２に対するｓｉＲＮＡのセンス鎖の塩基配列を配列番号５に示し、アンチセンス鎖の塩基配列を配列番号６に示した。ＳＩＭ２に対するｓｉＲＮＡのセンス鎖の塩基配列を配列番号７に示し、アンチセンス鎖の塩基配列を配列番号８に示した。ＳＯＸ１１に対するｓｉＲＮＡのセンス鎖の塩基配列を配列番号９に示し、アンチセンス鎖の塩基配列を配列番号１０に示した。ＥＴＶ１に対するｓｉＲＮＡのセンス鎖の塩基配列を配列番号１１に示し、アンチセンス鎖の塩基配列を配列番号１２に示した。ＦＯＸＰ１に対するｓｉＲＮＡのセンス鎖の塩基配列を配列番号１３に示し、アンチセンス鎖の塩基配列を配列番号１４に示した。ＰＲＤＭ１６に対するｓｉＲＮＡのセンス鎖の塩基配列を配列番号１５に示し、アンチセンス鎖の塩基配列を配列番号１６に示した。ＧＡＴＡ６に対するｓｉＲＮＡのセンス鎖の塩基配列を配列番号１７に示し、アンチセンス鎖の塩基配列を配列番号１８に示した。
【００９０】
本方法に適用される候補物質は、核酸、ペプチド、タンパク質、有機化合物、無機化合物のいずれであってもよい。核酸を候補物質として存在させる場合には、用いる細胞に導入し、導入前後における、表２に記載の遺伝子の発現量の変動を確認すればよい。また、導入後の細胞と無処置の正常ＭＳＣとの間で表２に記載の遺伝子の発現量を比較すればよい。ペプチドや化合物を候補物質として存在させる場合には、候補因子を培地に添加し、添加の前後における、表２に記載の遺伝子の発現量の変動を確認すればよい。また、添加後の細胞と無処置の正常ＭＳＣとの間で表２に記載の遺伝子の発現量を比較すればよい。
【００９１】
なお、遺伝子の検出には、上述した検出方法、検出用キット、検出用マイクロアレイを用いればよい。また、遺伝子の発現量を調べるには、当該分野における種々の公知の手法を用いればよく、例えば、後述する実施例に示すようなリアルタイム逆転写ＰＣＲが好適に利用される。
【００９２】
〔５．間葉系幹細胞の分化能を制御する因子のスクリーニング〕
本発明は、間葉系幹細胞の分化能を制御する因子をスクリーニングする方法を提供する。本発明にかかるスクリーニング方法は、候補物質の存在下にて培養した目的の細胞において、表２に記載の遺伝子の少なくとも１つの発現を検出する工程を包含することを特徴としている。
【００９３】
正常なＭＳＣまたはＭＳＣ様の細胞を用いれば、ＭＳＣの分化能を活性化または抑制する因子をスクリーニングし得る。また、後述する実施例に示すように、ＭＳＣにおいて表２に記載の遺伝子をノックダウンすることによってＭＳＣの分化能を抑制することができる。よって、分化能を抑制させたＭＳＣを用いれば、抑制された分化能を補完し得る因子（すなわち、分化能を活性化する因子）をスクリーニングし得る。上述したように、遺伝子のノックダウンには、ｓｉＲＮＡが好適に用いられるが、これに限定されず、当該分野における種々の公知の手法が採用され得る。
【００９４】
本方法に適用される候補物質もまた、核酸、ペプチド、タンパク質、有機化合物、無機化合物のいずれであってもよい。核酸を候補物質として存在させる場合には、用いる細胞に導入し、導入前後における、表２に記載の遺伝子の発現量の変動を確認すればよい。また、導入後の細胞と無処置の正常ＭＳＣとの間で表２に記載の遺伝子の発現量を比較すればよい。ペプチドや化合物を候補物質として存在させる場合には、候補因子を培地に添加し、添加の前後における、表２に記載の遺伝子の発現量の変動を確認すればよい。また、添加後の細胞と無処置の正常ＭＳＣとの間で表２に記載の遺伝子の発現量を比較すればよい。
【００９５】
なお、遺伝子の検出には、上述した検出方法、検出用キット、検出用マイクロアレイを用いればよい。また、遺伝子の発現量を調べるには、当該分野における種々の公知の手法を用いればよく、例えば、後述する実施例に示すようなリアルタイム逆転写ＰＣＲが好適に利用される。
【００９６】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【００９７】
また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【実施例】
【００９８】
本発明について、以下の実施例に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されない。
【００９９】
〔１：手順〕
〔１−１：細胞培養〕
ヒト腸骨由来のＭＳＣを、BioWhittaker Inc（Walkersville, MD）から購入した。あるいは、広島大学での倫理的委員会によって認可されたプロトコールに従って腸骨稜から調製した。ヒトの皮膚の線維芽細胞を、クラボウ（Osaka, Japan）から購入し、ヒトの歯肉の線維芽細胞を、公知の手順に従って単離した。ヒトの変形性関節炎の滑膜線維芽細胞を、Cell Applications Inc（SanDiego, California）から購入した。ＭＳＣ培養液の調製および骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞への分化を、公知の手順に従った。間葉系幹細胞を増幅させるためにＦＧＦ−２を１ｎｇ／ｍＬで使用した。遺伝子発現上でのＦＧＦの直接的な作用を避けるため、ＦＧＦをＲＮＡ分離の７２時間前に間葉系幹細胞および線維芽細胞の培養液から除去した。
【０１００】
〔１−２：ＤＮＡマイクロアレイ分析〕
全ＲＮＡを、３株の間葉系幹細胞（６〜９継代）、３株の線維芽細胞（７〜１４継代）、２８日間分化誘導培養液で培養した３株の間葉系幹細胞、変形性関節炎の滑膜に由来する３株のＭＳＣの、コンフルエントの培養物から、RNeasy Miniキット（Qiagen, Chatsworth, CA）を使用して単離した。ＤＮＡマイクロアレイ分析を、３８５００遺伝子、４７０００転写物変異体、５４０００プローブ（Affymetrix Inc.）を含むヒトゲノムU133 plus 2.0チップを用いたクラボウ遺伝子チップ分析サービスによって行った。生データ（マイクロアレイスイートversion 5.0, SF = 1; Affymetrix Inc.）を、GeneSpring（Silicon Genetics,Rodwood City ,LA）を使用してglobal median normalization法に従って標準化した。標準化は、フラッグ値によって制限され、中央値はpresentまたはmarginalの範囲以上の遺伝子を使って算出された。２倍以上の増減で基準化された強度での遺伝子のふるい分けを、分化前後の発現プロファイル遺伝子リストを作成するために使用した。生データをGEO（GSE9451）に登録した。
【０１０１】
〔１−３：リアルタイム逆転写ＰＣＲ〕
リアルタイム逆転写ＰＣＲ分析を、ABI prism 7900HT Sequence Detection System装置、およびソフトウェア（Applied Biosystems Inc、Foster City ,CA）を使用して行った。プライマーおよびプローブを、Applied Biosystems Incから購入した。データを、１８Ｓ ｒＲＮＡに対して標準化した。
【０１０２】
〔１−４：間葉系幹細胞に特徴的な多数の遺伝子の発現に対する、間葉系幹細胞に特徴的な転写因子のｓｉＲＮＡの効果〕
ＥＴＶ１、ＥＴＶ５、ＦＯＸＰ１、ＧＡＴＡ６、ＨＭＧＡ２、ＫＬＦ１２、ＰＲＤＭ１６、ＳＩＭ２、およびＳＯＸ１１についてのｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを、それぞれのヌクレオチド配列を標的として設計し、RNAi Co., Ltd.（Tokyo, Japan）にて合成した。ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを、Lipofectamin 2000（Invitrogen）を使用して１０％ウシ胎仔血清存在下で１２ウエルプレート（直径２２ｍｍ）中にて培養した間葉系幹細胞に、製造者の手順に従って形質移入した。形質移入後に、４８時間（ｎ＝２）および７２時間（ｎ＝２）のノックダウンの効果を、リアルタイム逆転写ＰＣＲによって調査した。
【０１０３】
〔１−５：細胞増殖、アルカリホスファターゼ、ＧＰＤＨ、アリザリンレッド染色、オイルレッドＯ染色〕
間葉系幹細胞、滑膜線維芽細胞、または皮膚線維芽細胞を、２４ウエルの組織培養プレート上で培養し、４０％コンフルエントの段階で、各ｓｉＲＮＡ、またはコントロールｓｉＲＮＡを、Lipofectamin 2000を使用して形質移入した。形質転換細胞を、１０％ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭ培地へ移し、２〜６日間インキュベートした。細胞数を、WST-8試薬（生化学工業，Tokyo, Japan）を使用して計数した。分化の際の潜在的なノックダウンの効果を検証するために、４８ウエルの多穴組織培養プレートにて培養した細胞に対して、８０％コンフルエントの段階で、各ｓｉＲＮＡ又はコントロールｓｉＲＮＡをLipofectamin 2000を使用して形質移入した。形質移入の2日後に、培地を、骨形成および脂肪生成の誘導培地に交換した。アルカリホスファターゼ活性およびＧＰＤＨ活性を測定した。
【０１０４】
〔１−６：免疫組織化学的検査〕
Ｃ５７／ＢＬ／６Ｊマウス(生後０．５〜５６日齢)および胎齢１５．５日の妊娠したマウスを用いた。動物を、ペントバルビタールを使用して麻酔し、４％パラホルムアルデヒドを経心的に灌流した後に、複数の臓器および組織を採取した。肢標本を、１０％ＥＤＴＡを用いて４℃で脱灰した。標本をパラフィン包埋し、回転ミクロトーム（HM355,MICROM,ドイツ）を用いて連続切片（厚さ４μｍ）を作製した。免疫組織化学に用いた抗体は以下の通りである：ポリクローナルヤギ抗ヒトＦＬＧ（1:100, sc-25896, Santa Cruz Biotech. USA），モノクローナルマウス抗ヒトＩＧＦＢＰ３（1:500, I4527, Sigma），モノクローナルマウス抗ヒトＶＥＧＦ（1:1000, 05443, Upstate Inc., USA），ポリクローナルウサギ抗ヒトＧＡＴＡ６（1:500, sc-9055, Santa Cruz Biotech），ポリクローナルウサギ抗マウスＴＲＰＣ４（1:2000, ACC018, Alomone Labs Ltd., イスラエル），ポリクローナルウサギ抗ヒトＴＧＭ２（1:10, AB15536, Abcam Ltd., USA），ポリクローナルウサギ抗ヒトＨＴＲ７（1:300, AB5661, Chemicon Int. Inc., USA），ポリクローナルウサギ抗ヒトＡＤＤ３（1:500, sc-25733, Santa Cruz Biotech），モノクローナルマウス抗マウスＭＥＴ（1:500, sc-8057, Santa Cruz Biotech），ポリクローナルヤギ抗ヒトＬＩＦ（1:500, sc-1336, Santa Cruz Biotech）。抗原修復を、１０ｍＭ ＨＣｌ混和０，１％ペプシン３７℃１０分処理−ＶＥＧＦ、ＧＡＴＡ６，ＴＲＰＣ４，ＨＴＲ７，ＩＧＦＢＰ３，ＦＬＧ，あるいは１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６，０）を用いた９０℃で１０分間のマイクロ波処理（H2800, Energy BeaMSCiences, Inc., USA）−ＴＧＭ２，ＭＥＴ，ＡＤＤ３，ＬＩＦのいずれかで行った。免疫反応性を、Alexa Flour567（５６８ｎｍ，赤）およびAlexa Flour647（６４７ｎｍ，緑）．を併用して可視化した。細胞核を、ＤＡＰＩ（青，S24535, Molecular Probe, USA）を用いて染色した。共焦点の蛍光像を記録した後に、同じ検体をＨＥ染色し、対応した二重免疫陽性細胞の局在を、対応した免疫蛍光およびＨＥ染色された細胞像の重なりによって検証した。二重染色された細胞の発生頻度は３，４画像内にて二重免疫陽性細胞および単陽性細胞を計数して推定した。全ての陽性細胞中における二重免疫陽性細胞の発生頻度を、３段階（高（＞７０％），中（３０−７０％），低（＜３０％））に分類した。同一研究において、免疫反応性を、ＡＢＣ法（ABC Elite kit, Vector, USA）によって発色する3,3′-diaminobenzidine（DAB; SK-4100, Funakoshi, Japan）を用いて可視化した。
【０１０５】
〔２：結果〕
〔２−１：ＭＳＣに特徴的な遺伝子の同定〕
ＤＮＡマイクロアレイ分析のために、線維芽細胞が混入していないＭＳＣ株を用いた。全ての調べられた、単一細胞に由来するコロニーの遺伝子発現プロファイルは、親のＭＳＣ集団のプロファイルに類似した。このことは、発生上の不均一性がなかったことを示している。さらに、適切な分化誘導培地にて分化させた骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞を用いた。これらの細胞のほとんどが２１〜２８日間以内に分化した。５４６７５個のＤＮＡマイクロアレイプローブ（Affymetrix Inc.）を用いて、ＭＳＣ（Ｍ）、骨芽細胞（Ｏ）、軟骨細胞（Ｃ）、脂肪細胞（Ａ）、および線維芽細胞（Ｆ）における遺伝子発現レベルを比較した。クラスター分析は、３つのＭＳＣ株の遺伝子発現プロファイルが、他の株の一つのプロファイルと互いに似ているが、他の全ての細胞のプロファイルと異なっていることを示した。このことは、ＭＳＣ株の中に、調製物ごとのいくらかの小さな変動を示唆している。これらの条件下で、１４８の遺伝子の発現レベルは、分化した細胞および線維芽細胞よりもＭＳＣにおいて２倍以上高かった（表１）。
【０１０６】
【表１】
【０１０７】
表１には、線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞と比較してMSCにおいて選択的に発現される遺伝子群（発現量が２倍以上のもの）を示している（ｎ＝３）。表中に示したMSCに特徴的な遺伝子のいくつかが、変形性関節炎の滑膜線維芽細胞において、線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞の１．５倍以上高い発現レベルを示した（該当する遺伝子を太字で示した。）。また、ケラチン関連遺伝子に下線を付した。
【０１０８】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて、調べた７１個全ての遺伝子の発現が、様々な分化細胞（Ｏ，Ｃ，Ａのいずれか）および線維芽細胞（Ｆ）と比べてＭＳＣ（Ｍ）では選択的に増強されていることを決定した（図１）。
【０１０９】
ＭＳＣに特徴的な遺伝子のＤＮＡマイクロアレイ分析を、それぞれの細胞種（線維芽細胞（Ｆ）、ＭＳＣ（Ｍ）、骨芽細胞（Ｏ）、軟骨細胞（Ｃ）、脂肪細胞（Ａ））について３株ずつ用いて行った。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを、ＭＳＣ（Ｍ）、骨芽細胞（Ｏ）、軟骨細胞（Ｃ）、脂肪細胞（Ａ）についてはそれぞれ６株、線維芽細胞（Ｆ）については４株を使用して行った。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって、１４８個のＭＳＣに特徴的な遺伝子のうち、７１の異なる発現をする遺伝子が確認された。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで決定されたプロファイルを元にしたＭＳＣに特徴的な遺伝子の中に含まれているＶＥＧＦ、およびＭＳＣ／軟骨形成マーカーである白血病抑制因子（ＬＩＦ）についても、併せて示した。値を、３〜６ウエルの平均値±標準誤差を示している（一部２ウエルにて評価した。）。
【０１１０】
図１に示すように、ＤＮＡマイクロアレイおよびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析は、これらの遺伝子における類似した発現パターンを示し、再現性があることを示した。また、ＤＮＡマイクロアレイおよびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって、ポジティブコントロールとしてのＬＩＦがＭＳＣおよび軟骨細胞の両方に高発現していることを示した（図１）。
【０１１１】
ＭＳＣに特徴的な遺伝子が多分化能に関与しているのであれば、それらの遺伝子は他のＭＳＣ様の細胞にも発現している可能性がある。調べた結果、ＭＳＣに特徴的な遺伝子の約５０％（表１における太字）が、実際に皮膚線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞においてよりも変形性関節炎の滑膜線維芽細胞において１．５倍以上高発現していることがわかった。このことは、おそらく変形性関節炎の滑膜線維芽細胞が皮膚線維芽細胞と異なって多分化能を有しているからと考えられる。さらに、変形性関節炎の滑膜線維芽細胞が骨分化や脂肪分化能を有していることを確認した（データは示さず）。ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）およびＭＥＴは、８個のケラチン関連遺伝子（表１における下線）およびケラチン結合タンパク質をコードするＦＬＧとともに、骨髄ＭＳＣにて高発現が示されたが、変形性関節炎の滑膜線維芽細胞では高発現されていなかった。このことは、ＨＧＦ−ＭＥＴ自己分泌ループおよび高ケラチン細胞骨格が骨髄ＭＳＣの特徴であることを示している。
【０１１２】
ＭＳＣに特徴的な遺伝子のいくつかが実際に未分化状態に関連しているのであれば、それらの遺伝子の発現は分化の開始直後に抑制されると考えられる。しかし、実際には、これらの遺伝子（転写因子を含む）の９３％が、骨分化、軟骨分化、脂肪分化の分化誘導培地による培養後２４時間以内に、骨前駆細胞（ＯＰ）、軟骨前駆細胞（ＣＰ）、脂肪前駆細胞（ＡＰ）において発現が低下した（図２ＡおよびＢ）。同じ２４時間の間に、骨芽細胞に特徴的な遺伝子（アルカリファオスファターゼおよびＰＴＨレセプター）、軟骨細胞に特徴的な遺伝子（アグリカンおよびタイプ２コラーゲン）、脂肪細胞に特徴的な遺伝子（ＰＰＡＲγおよびＣ／ＥＢＰα）のいずれも、その発現が上昇していなかった（図２Ｃ）。これらのことは、ＭＳＣに特徴的な分子のほとんどが前駆細胞において発現しないことを示している。
【０１１３】
なお、図２において、Ａは、３つのＭＳＣ株を用いたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって決定されたｍＲＮＡ発現レベルを示し、Ｂは、骨分化誘導培地、軟骨分化誘導培地、脂肪分化誘導培地を用いた培養２４時間後の、７１個のＭＳＣに特徴的な遺伝子の発現低下を示す。調べられた７１個の遺伝子のうち、２４時間培養後に有意に発現低下した遺伝子の割合を分類した。図２において、Ｃは、骨分化誘導培地（ＯＰ）、軟骨分化誘導培地（ＣＰ）、脂肪分化誘導培地（ＡＰ）、分化因子なし培地（Ｍ）を用いて、ＭＳＣを２４時間または２８日間培養し、組織特異的な遺伝子発現を確認した。３つの株を用いたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによってｍＲＮＡレベルを決定した。値は３ウエルの平均値±標準誤差である。
【０１１４】
〔２−２：ＭＳＣに特徴的な転写因子のノックダウンの影響〕
興味深いことに、ＭＳＣに特徴的な遺伝子は９つの転写因子（ＥＴＶ１、ＥＴＶ５、ＦＯＸＰ１、ＧＡＴＡ６、ＨＭＧＡ２、ＫＬＦ１２、ＰＲＤＭ１６、ＳＩＭ２、ＳＯＸ１１）を含むことがわかった。表１に示すように、ＳＯＸ１１を除くほとんどの遺伝子が滑膜線維芽細胞において高発現していた。表２に、９つの転写因子に関する情報を示す。
【０１１５】
【表２】
【０１１６】
これらの転写因子が担っているであろう役割を調べるために、これらの遺伝子を標的として設計したｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを用いた。ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの添加によって、４８〜７２時間（ｓｉＲＮＡにより標的のｍＲＮＡレベルが５０〜８０％に減少した時間）以内に、ＭＳＣに特徴的な遺伝子のほとんど（７１個中５３個；７５％）のｍＲＮＡレベルを有意に発現低下させた（表３）。
【０１１７】
【表３】
【０１１８】
ＭＳＣに特徴的な遺伝子のｍＲＮＡレベルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって評価した。表中の括弧の値は、コントロールを１としたときのｍＲＮＡレベルを示している。有意な発現低下を示している遺伝子を示す（＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００５，†ｐ＜０．０００５）。
【０１１９】
各ｓｉＲＮＡは、ＭＳＣに特徴的な遺伝子の異なるセットを発現低下させた。このことは、これらの発現低下がｓｉＲＮＡの一般的な毒性の影響ではないことを示唆している。また、これらのことは、９つの転写因子がＭＳＣの分子的な特徴に必須であることを示唆している。
【０１２０】
転写因子の機能的な役割を評価するために、ＭＳＣの増殖におけるｓｉＲＮＡの影響を調べた。また、これらの実験において変形性関節炎の関節から単離された滑膜線維芽細胞、骨髄ＭＳＣ、および皮膚線維芽細胞を用いた。ネガティブコントロールｓｉＲＮＡを形質移入したこれらの細胞は、分化後少なくとも６日間まで増殖し続けた。ＧＡＴＡ６のｓｉＲＮＡは、皮膚線維芽細胞の増殖に影響しなかったが、骨髄ＭＳＣの数を減少させ、滑膜線維芽細胞の増殖を停止させた（図３）。細胞数はＷＳＴ−８試薬を用いてＯＤ４９０とＯＤ６３０との比による評価法を用いて算出した。値は３つの培養での平均値±標準誤差を示す。ステューデントＴ検定を用いてネガティブコントロールｓｉＲＮＡと比較している（＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００５）。
【０１２１】
表４は、ＭＳＣ（４種類）、滑膜線維芽細胞（４種類）、皮膚線維芽細胞（３種類）の増殖に対する、９つの転写因子のノックダウンの影響を示している。示した値は、ｓｉＲＮＡを形質移入した後に培養した細胞数増加の、コントロールｓｉＲＮＡを形質移入した後に培養した細胞増加に対する割合（６日目）を示している。
【０１２２】
【表４】
【０１２３】
９６ウエルプレートにて培養し４０％コンフルエントの段階でｓｉＲＮＡを移入し、１０％ウシ胎児血清とともに６日間培養した。ＷＳＴ−８試薬を用いて０日目から６日目の間の細胞数増加を計測した。値は、コントロールｓｉＲＮＡを形質移入された細胞と比べたときの、細胞数の増加のパーセンテージを示している（３培養系の平均値±標準誤差で示す。）。
【０１２４】
ＥＴＶ５およびＳＯＸ１１のノックダウンは、ＭＳＣおよび滑膜線維芽細胞の両方の増殖を停止させた。そして、ＥＴＶ１、ＦＯＸＰ１、ＧＡＴＡ６、ＨＭＧＡ２、ＰＲＤＭ１６、ＳＩＭ２のノックダウンは、これらの細胞の増殖を中程度、あるいは顕著に抑制した。しかし、ｓｉＲＮＡヌクレオチドは皮膚線維芽細胞の増殖にほとんど影響しなかった。このことから、増殖の抑制はｓｉＲＮＡが正常に機能していることを示唆する。ノックダウンの影響は、細胞または株の種類に依存して変動するが、細胞株は細胞種ほどノックダウンに影響しなかった。ノックダウンが骨髄ＭＳＣよりも滑膜線維芽細胞の増殖に顕著な抑制を誘発したのかは不明であるが、滑膜線維芽細胞は生体内で変形性関節炎の関節において活動的な増殖を示した。
【０１２５】
また、ＭＳＣの骨分化能および脂肪分化能に対するノックダウンの効果を調べた。ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを、分化誘導培地で培養する二日前に加えた。アルカリファオスファターゼ活性は、骨分化誘導培地での培養８日後に上昇し始めた。ＭＳＣにおけるＳＩＭ２およびＳＯＸ１１のノックダウンは、酵素活性の上昇を中程度抑制したが、ＨＭＧＡ２およびＰＲＤＭ１６のノックダウンは、酵素活性に対してほとんど影響せず、他のｓｉＲＮＡヌクレオチドでは抑制効果が認められなかった。さらなる実験において、ＳＩＭ２、ＳＯＸ１１、ＦＯＸＰ１のノックダウンにともなって基質石灰化を遅らせた（アリザリンレッド染色で確認）が、いずれのｓｉＲＮＡヌクレオチドも石灰化の最大レベルを低下させることはなかった（示さず）。
【０１２６】
また、骨分化に対するｓｉＲＮＡの影響を調べた。ここでは、骨細胞のマーカーであるＡＬＰａｓｅ活性を用いて評価した（図４）。４８ウエルの組織培養用プレートにて８０％コンフルエントに達した際に、ｓｉＲＮＡまたはコントロールｓｉＲＮＡを細胞に形質移入し、１０％ウシ胎児血清存在下で２４時間静置し、その後１０％ウシ胎児血清添加ＤＭＥＭにより２日間培養した。さらに、これらの細胞を、１０％ウシ胎児血清添加ＤＭＥＭ（点線）、または骨分化誘導培地（実線）に移し、示す日数にわたって培養した。値は３つの培養で平均値±標準誤差を示す。ステューデントＴ検定を用いてネガティブコントロールｓｉＲＮＡと比較している（＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００５）。いくつかの転写因子について、ｓｉＲＮＡを前処置することによってＡＬＰａｓｅ活性の誘導を抑制することがわかった。具体的には、ＡＬＰａｓｅ活性は分化誘導後４日目に上昇し始め、８日目以降にはＨＭＧＡ２、ＰＲＤＭ１６、ＳＩＭ２、ＳＯＸ１１のｓｉＲＮＡがＡＬＰａｓｅの誘導を抑制した。
【０１２７】
さらに、脂肪分化に対するｓｉＲＮＡの影響を調べた。ここでは、脂肪細胞のマーカーであるＧＰＤＨ活性を用いて評価した（図５）。４８ウエルの組織培養用プレートにて８０％コンフルエントに達した際に、ｓｉＲＮＡまたはコントロールｓｉＲＮＡを細胞に形質移入し、１０％ウシ胎児血清存在下で２４時間静置し、その後１０％ウシ胎児血清添加ＤＭＥＭにより２日間培養した。さらに、これらの細胞を、１０％ウシ胎児血清添加ＤＭＥＭ（点線）、または脂肪分化誘導培地（実線）に移し、示す日数にわたって培養した。値は３つの培養で平均値±標準誤差を示す。ステューデントＴ検定を用いてネガティブコントロールｓｉＲＮＡと比較している（＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００５）。いくつかの転写因子について、ｓｉＲＮＡを前処置することによってＧＰＤＨ活性の誘導を抑制することがわかった。具体的には、ＧＰＤＨ活性は分化誘導後８日目に上昇し始め、１２日目にはＥＴＶ１、ＦＯＸＰ１、ＰＲＤＭ１６、ＳＯＸ１１のｓｉＲＮＡがＧＰＤＨの誘導を抑制した。
【０１２８】
なお、各種細胞へのｓｉＲＮＡオリゴの導入効率はほぼ等しいことを確認している。よって、比較した細胞間での遺伝子発現の抑制効率も同等であるといえる。
【０１２９】
〔２−３：ＭＳＣの免疫組織化学〕
同定したＭＳＣマーカー（転写因子ではないものも含む。）について、ＭＳＣに特徴的な分子に対する市販の抗体のうち、どの分化細胞よりもＭＳＣにおいてそのｍＲＮＡレベルが高発現しているＧＡＴＡ６、ＡＤＤ３、ＦＬＧ、ＨＴＲ７、ＩＧＦＢＰ３，ＭＥＴ、ＴＧＭ２、ＴＲＰＣ４、ＶＥＧＦに対する抗体を選択した（図１）。また、ＭＳＣおよび軟骨細胞において、骨芽細胞、脂肪細胞、線維芽細胞においてよりも高いレベルで発現されていたＬＩＦの抗体を選択した（図１）。ＭＳＣ集団に対する一連の二重免疫蛍光染色を行った。そして、共焦点蛍光顕微鏡によって、単一のまたは二重の、免疫陽性の存在を示す証拠を見出した（図６）。
【０１３０】
生後５６日齢の上腕骨の骨髄および骨を、抗ＧＡＴＡ６（Ｂ、Ｄ、Ｅ）、抗ＬＩＦ抗体（Ｃ、Ｄ、Ｅ）あるいは非特異的な血清（Ｆ）とインキュベーションした後、蛍光二次抗体を用いて染色した。ＧＡＴＡ６はいくつかの骨髄細胞の細胞質に存在した。骨髄内にはＧＡＴＡ６免疫陽性の細胞が比較的多く存在した。そして、骨表面のＧＡＴＡ６免疫陽性細胞は骨芽細胞様の形状を有している。また、ＧＡＴＡ６免疫陽性細胞はまた骨膜にも散らばっていた（示さず）。ＬＩＦはいくつかの骨髄細胞の細胞質に存在した。そして、ＬＩＦ免疫陽性細胞は骨膜外に散らばっていた（示さず）。共焦点蛍光顕微鏡と光学顕微鏡にて得られた画像が互いに重ね合わせると、比較的多くの、ＧＡＴＡ６およびＬＩＦの二重免疫陽性細胞が、骨髄内および骨内膜付近に存在し、そしてわずかに骨表面に存在した。二重免疫陽性細胞の割合は高かった（７０％以上）。しかし、骨膜内には二重免疫陽性細胞が認められなかった（示さず）。
【０１３１】
このように、ＧＡＴＡ６陽性細胞（図６Ｂ）、ＬＩＦ陽性細胞（図６Ｃ）は、成熟したマウス上腕骨の骨髄内部、および骨内膜付近に存在した。そして、それらのほとんどが二重に陽性の細胞であった（図６ＤおよびＥ）。非特異的血清および二次抗体単独は特異的な染色は示さなかった。よって、二重染色細胞は多分化能のない造血細胞や線維芽細胞ではないと考えられる。なぜなら、ＧＡＴＡ６およびＬＩＦのｍＲＮＡレベルは骨髄細胞全画分、非接着性骨髄細胞、皮膚線維芽細胞のすべてのうちで非常に低いか、あるいは検出不可能であるからである（図７）。
【０１３２】
ＲＮＡを、ドナーの骨髄液から直接回収した（Ｗｈｏｌｅ ＢＭＣ）。さらに、他のドナーからの骨髄細胞を播種し、培養液内の非接着性細胞からＲＮＡを回収した。次いで、ドナーの骨髄細胞を２４時間または９６時間培養し、接着細胞からＲＮＡを抽出した。さらに、細胞がコンフルエントに達した際にも、ＭＳＣの接着細胞層からＲＮＡを採取した。コントロールに皮膚線維芽細胞を用いて、ＭＳＣに特徴的な遺伝子のｍＲＮＡレベルを、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって決定した。これらのＭＳＣにおけるｍＲＮＡレベルは、他のＭＳＣ株と類似した値であった。値は、二つの培養物における値の平均を示している。
【０１３３】
図７はまた、ＦＬＧ、ＴＧＭ２、ＨＴＲ７が、ＭＳＣにおいて発現しているが他の細胞では発現しなかったこと、ＭＥＴ、ＴＲＰＣ４、ＩＧＦＢＰが、線維芽細胞よりもＭＳＣにおいて高いレベルで発現していたが、非接着性の骨髄細胞では発現していなかったこと、ＡＤＤ３およびＶＥＧＦが、ＭＳＣよりも非接着性の骨髄細胞および線維芽細胞において低レベルで発現していたことを示している。これらのＭＳＣに特徴的な分子の抗体はまた、生体内である程度の骨髄細胞とも反応した。図８は、種々の抗体を用いてマウス骨髄内の二重免疫陽性細胞の同定を示している。抗体産生に用いられた動物種（ウサギ、ヤギ、マウス）とペプシンおよびマイクロ波処置とによって抗原修復した後の免疫反応性の保存を考慮して、二重免疫染色を試験する抗体の組合せを決定した。
【０１３４】
５６日齢のマウス骨髄内のＭＳＣ様細胞を種々の抗体で二重染色し、そして共焦点蛍光顕微鏡を使って評価した。比較的多くのＴＲＰＣ４陽性／ＦＬＧ陽性二重染色細胞が骨髄内と骨内膜付近に存在していた（図８Ａ）。また、比較的多くのＬＩＦ陽性／ＡＤＤ３陽性二重染色細胞が骨髄内に存在し、いくつかのＬＩＦ陽性／ＡＤＤ３陽性二重染色細胞が骨内膜付近に存在したが、骨膜には存在しなかった（図８Ｂ）。多くのＧＡＴＡ６陽性／ＦＬＧ陽性二重染色細胞が骨髄内に存在し、そしていくつかのＧＡＴＡ６陽性／ＦＬＧ陽性二重染色細胞が骨内膜付近に存在していたが、骨膜には存在しなかった（図８Ｃ）。比較的多くのＴＭＧ２陽性／ＬＩＦ陽性二重染色細胞が骨髄内に存在し、そしていくつかのＴＭＧ２陽性／ＬＩＦ陽性二重染色細胞が骨内膜付近に存在していた（図８Ｄ）。いくつかのＴＲＰＣ４陽性／ＩＧＦＢＰ３陽性二重染色細胞が骨髄内に存在していたが、骨膜には存在しなかった（図８Ｅ）。いくつかのＴＧＭ２陽性／ＭＥＴ陽性二重染色細胞が骨髄内と骨内膜付近に存在したが、ＭＥＴ陽性は骨膜には存在しなかった（図８Ｆ）。比較的多くのＬＩＦ陽性／ＭＥＴ陽性二重染色細胞が骨髄内に検出された。そしていくつかのＬＩＦ陽性／ＭＥＴ陽性二重染色細胞が骨内膜付近に存在したが、骨膜には存在しなかった（図８Ｇ）。ひとつのＡＤＤ３陽性／ＭＥＴ陽性二重染色細胞が骨内膜付近に存在したが、ＡＤＤ３陽性／ＭＥＴ陽性は骨膜には存在しなかった（図８Ｈ）。わずかな数のＴＲＰＣ４陽性／ＶＥＧＦ陽性二重染色細胞が骨髄内と骨内膜付近に存在したが、骨膜には存在しなかった（図８Ｉ）。ＧＡＴＡ６陽性／ＶＥＧＦ陽性細胞は骨内膜付近に存在したが、骨内膜表面には存在しなかったが、ＧＡＴＡ６陽性／ＶＥＧＦ陰性は骨表面に存在した。ＧＡＴＡ６陽性あるいはＶＥＧＦ陽性細胞の毛細血管への結合は観察されなかった（図８Ｊ）。ひとつのＧＡＴＡ６陽性／ＩＧＦＢＰ３陽性細胞が骨内膜付近に存在した（図８Ｋ）。ＧＡＴＡ６陽性／ＭＥＴ陽性細胞の数は骨髄内で少なく、また骨内膜付近には存在したが、骨表面にはなく、骨膜にもなかった（図８Ｌ）。ＦＬＧ陽性／ＶＥＧＦ陽性細胞の数は少なく、骨内膜付近に少数存在したが、骨表面や骨膜には存在しなかった（図８Ｍ）。骨髄内のＦＬＧ陽性／ＩＧＦＢＰ３陽性細胞の数は少なく、骨表面や骨膜には検出されなかった（図８Ｎ）。ネガティブコントロールとしての二次抗体単独あるいはコントロールＩｇＧによっては染色されなかった（図８Ｏ）。
【０１３５】
このように、二重免疫陽性細胞の発現率は、ＴＲＣ４／ＦＬＧ（Ａ）において高く、ＬＩＦ／ＡＤＤ３（Ｂ）、ＧＡＴＡ６／ＦＬＧ（Ｃ）、ＴＧＭ２／ＬＩＦ（Ｄ）において中程度、その他の組合せでは低かった。さまざまな組合せの中で、ＧＡＴＡ６／ＦＬＧおよびＴＧＭ２／ＬＩＦが、ＧＡＴＡ６／ＬＩＦ（図６）とともに、ＭＳＣ様細胞の同定に役立つことが判明した。これらは、非接着性の骨髄細胞や皮膚線維芽細胞では発現していない（図７）。線維芽細胞は通常骨髄内に存在ないのでＴＲＰＣ４／ＦＬＧもまた役立つ可能性がある。ＭＥＴ、ＩＧＦＢＰ３、ＶＥＧＦの抗体による、単一または二重の免疫陽性細胞の染色率が低いことは、抗体の質、検体の処理、あるいはこれらのマーカーのｍＲＮＡレベルが常にタンパク質レベルに翻訳して変化する訳ではないことに起因するかもしれない。にもかかわらず、抗体の組合せの全てが、二重免疫陽性細胞の存在を明らかにした。このことは、骨髄細胞各部が生体内で同時にいくつかのＭＳＣマーカータンパクを合成することを示している。
【０１３６】
また、ＧＡＴＡ６、ＬＩＦ、ＦＬＧおよびＴＧＭ２は非接着性の骨髄細胞、造血細胞、線維芽細胞で発現していなかったので、これらの分子を同時に発現する接着性の骨髄細胞はＭＳＣといえる。なお、ＬＩＦはＭＳＣ単独のマーカーではないものの、抗ＬＩＦ抗体が軟骨組織以外の骨髄においてＭＳＣの免疫組織化学を調べる際に有用であるといえる。
【０１３７】
軟骨膜、骨膜もまた、培養によってかあるいは移植後に、軟骨細胞、骨芽細胞に分化するＭＳＣ様細胞を含んでいるので、上腕骨の軟骨膜にあるＭＳＣに特徴的な分子の発現を調べた。ＭＳＣに特徴的な分子のいくつか（ＧＡＴＡ６（図９Ｃ，Ｄ）、ＬＩＦ（図９Ａ，Ｂ）、ＡＤＤ３（図９Ａ，Ｂ）、ＦＬＧ（図９Ｃ，Ｄ）、ＨＴＲ７（示さず）に対する抗体は、軟骨膜内で細胞集団に反応した。一方で、図９に示す組織内に二重免疫陽性細胞は検出されなかった。同様の結果が骨膜においても得られた（図１０）。さらに、軟骨細胞（図９Ａ，Ｃ）も骨細胞（示さず）も、ＧＡＴＡ６、ＦＬＧ、ＡＤＤ３、ＶＥＧＦ（示さず）の抗体に反応しないが、一方で抗ＬＩＦ抗体は軟骨細胞（図９Ａ）に反応し、骨細胞（示さず）に反応しないことを確認した。従って、ＤＮＡマイクロアレイデータは少なくとも部分的には生体内状態に関連しているようである。
【０１３８】
〔２−４：誘導性間葉系幹細胞の誘導に好適な因子〕
表２に示す遺伝子の発現量が、増殖因子等によって影響を受けるかどうかを調べた。
【０１３９】
実験には、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β、インスリン、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）、脂肪酸、ビタミンＣ（ＶＣ）、ウシ胎児血清を用いた。具体的には、３株のヒト骨髄由来細胞（ＭＳＣ−Ｒ１４−Ｐ６、ＭＳＣ−Ｒ１７−Ｐ５、ＭＳＣ−Ｒ６０−Ｐ５）を用いた。培養ディッシュには、ファルコン６ｗｅｌｌ−ｐｌａｔｅを用いた。１０ｃｍディッシュにて１０％ＦＢＳ＋ＦＧＦを含む培地を用いて培養した各細胞を回収し、細胞数を計数した。これらの細胞を２×１０５／ｗｅｌｌ（すなわち、２×１０５／ｃｍ２）にて６ウエルプレートに播種した。１０％ＦＢＳを含む培地、および１０％ＦＢＳ＋ＦＧＦを含む培地をコントロールとし、これら以外の全てについてＡ＋Ｂ１＋Ｃ＋ＥＧＦ＋ＶＣ＋ＰＡを含む無血清培地を用いて細胞を培養し、２４時間後（細胞がほぼサブコンフルエントになった後）に、コントロール以外の培地を、以下を含む培地に交換した。
（１）Ａ＋Ｂ１＋Ｃ＋ＥＧＦ＋ＶＣ＋ＰＡ
（２）Ａ＋Ｂ１＋Ｃ＋ＥＧＦ＋ＶＣ＋ＰＡ−ＦＧＦ
（３）Ａ＋Ｂ１＋Ｃ＋ＥＧＦ＋ＶＣ＋ＰＡ−ＴＧＦ
（４）Ａ＋Ｂ１＋Ｃ＋ＥＧＦ＋ＶＣ＋ＰＡ−ＨＧＦ
（５）Ａ＋Ｂ１＋Ｃ＋ＥＧＦ＋ＶＣ＋ＰＡ−ＰＤＧＦ
（６）Ａ＋Ｂ１＋Ｃ＋ＥＧＦ＋ＶＣ＋ＰＡ−ＥＧＦ
（７）Ａ＋Ｂ１＋Ｃ＋ＥＧＦ＋ＶＣ＋ＰＡ−インスリン
（８）Ａ＋Ｂ１＋Ｃ＋ＥＧＦ＋ＶＣ＋ＰＡ−ＶＣ
（９）Ａ＋Ｂ１＋Ｃ＋ＥＧＦ＋ＶＣ＋ＰＡ−Ｂ１
（１０）Ａ＋Ｂ１＋Ｃ＋ＥＧＦ＋ＶＣ＋ＰＡ−Ｄｅｘ
このような培地中にて細胞をさらに３日間で培養し、トリアゾールを用いて回収した細胞からＲＮＡを抽出した。なお、添加した因子の濃度は以下の通りである：ＰＡ：１０μｇ／ｍｌ、ＦＧＦ：３ｎｇ／ｍｌ、ＴＧＦ：１０ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、ＰＤＧＦ：１０ｎｇ／ｍｌ、ＥＧＦ：２０ｎｇ／ｍｌ、Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ（Ｄｅｘ）：１０−８Ｍ、インスリン：１０μｇ／ｍｌ、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｌｉｐｉｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（ＣＤ）：原液を１００〜２００倍希釈、ＶＣ：５０μｇ／ｍｌ。
【０１４０】
結果を表５に示す。ＭＳＣに特徴的な転写因子の発現量を異なる組合せにて促進または抑制する因子が見出された。すなわち、表５の増殖因子は、それぞれ異なる組合せの、ＭＳＣのＳＴＥＭＮＥＳＳに関わる遺伝子（転写因子を含む。）を誘導し得た。このように、これらの因子は、誘導性間葉系幹細胞の誘導に好適な因子といえる。
【０１４１】
【表５】
【０１４２】
〔２−５：関節症の発症およびＭＳＣのＳＴＥＭＮＥＳＳに関わる遺伝子の誘導〕
６週齢のＳＤ系ラットの大腿骨膝関節腔に、モノヨード酢酸（０．０３，０．０６または１．５ｍｇ／ｊｏｉｎｔ）を投与した２週間後に、同関節の軟骨からＲＮＡを抽出した。そして、ＭＳＣのＳＴＥＭＮＥＳＳに関わる転写因子（表２に記載の遺伝子についての対応ラット遺伝子）の発現レベルを検討した。その結果、関節炎を発症したラットの軟骨では、分化マーカーであるアグリカンおよびＩＩ型コラーゲンの発現が低下している一方で、ＭＳＣのＳＴＥＭＮＥＳＳに関わる転写因子の数種類がその発現レベルを亢進していた（図１１）。つまり、炎症によって軟骨細胞が脱分化するとともに、少なくとも一部の脱分化細胞がＭＳＣ様細胞へ変化したと推察される。したがって、各種の組織（軟骨を含む。）に各種の薬物を注射して、ＭＳＣのＳＴＥＭＮＥＳＳに関わる転写因子の発現を促進すれば、誘導性間葉系幹細胞を生体内で誘導することができる。また、表５の増殖因子を疾患部位へ投与することにより、生体内にて誘導性間葉系幹細胞の数を増加させることができると考えられる。そして、これらの実験モデルは、幹細胞を誘導する薬物をスクリーニングする際に有用である。
【０１４３】
〔２−６：種々の組織に由来する線維芽細胞からの誘導性間葉系幹細胞の作製〕
ヒト歯肉由来の線維芽細胞を分離した。次いで、これらの細胞を、ＭＳＣのＳＴＥＭＮＥＳＳを促進する因子（表５）を添加した無血清培地ＳＴＫ２（ＤＳファーマバイオメデイカル社製）を用いて７日間培養した。その後、骨分化誘導培地を用いて１５〜２０日間培養した（図１２）。高レベルのアルカリホスファターゼ活性および石灰化（アリザリン赤染色）が誘導された（それぞれ図１２ＡおよびＢ）。なお、通常の培養法を用いて同じ細胞を培養した場合は、アルカリホスファターゼ活性および石灰化レベルが低かった（結果は示さず）。
【０１４４】
同様の実験を、分離培養したヒト歯髄由来の線維芽細胞を用いて行った。具体的には、ヒト歯髄由来の線維芽細胞を分離し、次いで、これらの細胞を、ＭＳＣのＳＴＥＭＮＥＳＳを促進する因子（表５）を添加した無血清培地ＳＴＫ２（ＤＳファーマバイオメデイカル社製）を用いて７日間培養した。その後、骨分化誘導培地を用いて２〜３週間培養した。結果を図１３に示す。ヒト歯肉由来の線維芽細胞の場合と同様に、ヒト歯髄由来の線維芽細胞においても、高レベルのアルカリホスファターゼ活性および石灰化（アリザリン赤染色）が誘導された（それぞれ図１３ＡおよびＢ）。
【０１４５】
このように、ＭＳＣのＳＴＥＭＮＥＳＳを促進する因子を添加した無血清培地を用いることにより、種々の組織に由来する線維芽細胞から誘導性間葉系幹細胞を作製することができた。これらの誘導性間葉系幹細胞は再生医療に有用である。また、上述した無血清培地に別の薬剤をさらに追加すれば、骨分化能がより高い誘導性間葉系幹細胞を作製し得るので、本系は薬剤スクリーニング系として非常に有用である。
【０１４６】
〔２−７：歯髄由来の線維芽細胞から誘導した誘導性間葉系幹細胞の骨分化能〕
ヒト歯髄由来の線維芽細胞を５×１０３個／ｃｍ２の密度にて培養皿に播種して、コンフルエントになるまで培養した。培養条件は、ＭＳＣのＳＴＥＭＮＥＳＳを促進する因子（表５）を添加した無血清培地ＳＴＫ２を用いて５日間培養（Ａ）、または通常の増殖培地（抗生物質および１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ）を用いて１３日間培養（Ｂ）である。その後、培地を骨分化誘導培地に交換して骨分化誘導を開始した。Ａは１４日間、Ｂは２０日間骨分化誘導培地を用いて培養した後に、アリザリン赤染色によって骨分化能を評価した。骨分化の方法をTutsumiらの方法に従って行った（Retention of multilineage differentiation potential of mesenchymal cells during proliferation in response to FGF. Tsutsumi S, Shimazu A, Miyazaki K, Pan H, Koike C, Yoshida E, Takagishi K, Kato Y. Biochem Biophys Res Commun. 2001 Oct 26;288(2):413-9.）。
【０１４７】
このように、ＭＳＣのＳＴＥＭＮＥＳＳを促進する因子を添加した無血清培地を用いることにより、誘導性間葉系幹細胞を作製し得た。また、上記無血清培地に別の薬剤をさらに追加すれば、分化能がより高い誘導性間葉系幹細胞を作製し得るので。本系は薬剤スクリーニング系として有用である。
【０１４８】
以上のように、骨髄ＭＳＣの特徴となる分子の発現が、これらの細胞において選択的に発現している転写因子によって決定されることを見出した。そして、これらの転写因子のいくつかは、明らかにＭＳＣのＳＴＥＭＮＥＳＳの調節に関与していた。特に、ＥＴＶ１、ＥＴＶ５、ＦＯＸＰ１、ＧＡＴＡ６、ＨＭＧＡ２、ＳＩＭ２、ＳＯＸ１１のノックダウンはＭＳＣの自己複製能を抑制した。また、ＦＯＸＰ１、ＳＯＸ１１、ＥＴＶ１、ＳＩＭ２、ＰＲＤＭ１６のノックダウンは骨分化や脂肪分化のポテンシャルを低下させた。さらに、滑膜線維芽細胞が生体内に存在するＭＳＣ様細胞であることを同定した。そして、骨髄内のＭＳＣ様細胞の局在は幹細胞が骨の発生、成長に生理学的に関与することを示し、成熟した骨髄はＭＳＣの供給源であることが示された。これらの知見は、再生医療における成人骨髄ＭＳＣの使用を大いに促進し得る。
【産業上の利用可能性】
【０１４９】
本発明は、ヒトの胚またはＥＳ細胞を利用することなく、間葉系幹細胞と同様の自己複製能および分化能を有する細胞を提供し得るので、医薬分野、特に再生医療に関連する分野に大いに貢献し得る。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表２に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子の少なくとも１つを細胞に導入する工程を包含する、誘導性間葉系幹細胞の作製方法。
【請求項２】
間葉系幹細胞選択的な無血清培地を用いて培養する工程をさらに包含する、請求項１に記載の作製方法。
【請求項３】
細胞を脱分化条件下にて長期間培養する工程、および培養後の細胞を、間葉系幹細胞選択的な無血清培地を用いて人工マトリックス上でさらに培養する工程を包含する、誘導性間葉系幹細胞の作製方法。
【請求項４】
誘導性間葉系幹細胞の誘導に好適な因子を培地に添加する工程をさらに包含する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の作製方法。
【請求項５】
下記（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択されるポリヌクレオチドの１つ以上を備えている、誘導性間葉系幹細胞を作製するためのキット：
（ａ）表２に記載のアクセッション番号のいずれか１つに示される塩基配列またはその相補配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）上記（ａ）のフラグメントであるポリヌクレオチド；および
（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【請求項６】
目的の細胞において、表２に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子の少なくとも１つの発現を検出する工程を包含する、誘導性間葉系幹細胞を検出する方法。
【請求項７】
下記（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択されるポリヌクレオチドの１つ以上を備えている、誘導性間葉系幹細胞を検出するためのキット：
（ａ）表２に記載のアクセッション番号のいずれか１つに示される塩基配列またはその相補配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）上記（ａ）のフラグメントであるポリヌクレオチド；および
（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【請求項８】
下記（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択されるポリヌクレオチドの１つ以上が固定化されている、誘導性間葉系幹細胞を検出するためのマイクロアレイ：
（ａ）表２に記載のアクセッション番号のいずれか１つに示される塩基配列またはその相補配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）上記（ａ）のフラグメントであるポリヌクレオチド；および
（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【請求項９】
表２に記載のアクセッション番号のいずれか１つに示される塩基配列を有するポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドと特異的に結合する抗体を備えている、誘導性間葉系幹細胞を検出するためのキット。
【請求項１０】
候補物質の存在下にて培養した細胞において、表２に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子の少なくとも１つの発現を検出する工程を包含する、細胞を誘導性間葉系幹細胞に誘導する因子をスクリーニングする方法。
【請求項１１】
候補物質の非存在下にて培養した細胞における上記遺伝子の発現を検出する工程をさらに包含する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
間葉系幹細胞における上記遺伝子の発現を検出する工程をさらに包含する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
候補物質の存在下にて培養した目的の細胞において、表２に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子の少なくとも１つの発現を検出する工程を包含する、間葉系幹細胞の自己複製能を制御する因子をスクリーニングする方法。
【請求項１４】
上記細胞が、自己複製能を抑制された間葉系幹細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
候補物質の非存在下にて培養した、自己複製能を抑制された間葉系幹細胞における上記遺伝子の発現を検出する工程をさらに包含する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
間葉系幹細胞における上記遺伝子の発現を検出する工程をさらに包含する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
候補物質の存在下にて培養した目的の細胞において、表２に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子の少なくとも１つの発現を検出する工程を包含する、間葉系幹細胞の分化能を制御する因子をスクリーニングする方法。
【請求項１８】
上記細胞が、分化能を抑制された間葉系幹細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
候補物質の非存在下にて培養した、分化能を抑制された間葉系幹細胞における上記遺伝子の発現を検出する工程をさらに包含する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
間葉系幹細胞における上記遺伝子の発現を検出する工程をさらに包含する、請求項１８に記載の方法。
【請求項１】
表２に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子の少なくとも１つを細胞に導入する工程を包含する、誘導性間葉系幹細胞の作製方法。
【請求項２】
間葉系幹細胞選択的な無血清培地を用いて培養する工程をさらに包含する、請求項１に記載の作製方法。
【請求項３】
細胞を脱分化条件下にて長期間培養する工程、および培養後の細胞を、間葉系幹細胞選択的な無血清培地を用いて人工マトリックス上でさらに培養する工程を包含する、誘導性間葉系幹細胞の作製方法。
【請求項４】
誘導性間葉系幹細胞の誘導に好適な因子を培地に添加する工程をさらに包含する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の作製方法。
【請求項５】
下記（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択されるポリヌクレオチドの１つ以上を備えている、誘導性間葉系幹細胞を作製するためのキット：
（ａ）表２に記載のアクセッション番号のいずれか１つに示される塩基配列またはその相補配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）上記（ａ）のフラグメントであるポリヌクレオチド；および
（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【請求項６】
目的の細胞において、表２に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子の少なくとも１つの発現を検出する工程を包含する、誘導性間葉系幹細胞を検出する方法。
【請求項７】
下記（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択されるポリヌクレオチドの１つ以上を備えている、誘導性間葉系幹細胞を検出するためのキット：
（ａ）表２に記載のアクセッション番号のいずれか１つに示される塩基配列またはその相補配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）上記（ａ）のフラグメントであるポリヌクレオチド；および
（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【請求項８】
下記（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択されるポリヌクレオチドの１つ以上が固定化されている、誘導性間葉系幹細胞を検出するためのマイクロアレイ：
（ａ）表２に記載のアクセッション番号のいずれか１つに示される塩基配列またはその相補配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）上記（ａ）のフラグメントであるポリヌクレオチド；および
（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【請求項９】
表２に記載のアクセッション番号のいずれか１つに示される塩基配列を有するポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドと特異的に結合する抗体を備えている、誘導性間葉系幹細胞を検出するためのキット。
【請求項１０】
候補物質の存在下にて培養した細胞において、表２に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子の少なくとも１つの発現を検出する工程を包含する、細胞を誘導性間葉系幹細胞に誘導する因子をスクリーニングする方法。
【請求項１１】
候補物質の非存在下にて培養した細胞における上記遺伝子の発現を検出する工程をさらに包含する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
間葉系幹細胞における上記遺伝子の発現を検出する工程をさらに包含する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
候補物質の存在下にて培養した目的の細胞において、表２に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子の少なくとも１つの発現を検出する工程を包含する、間葉系幹細胞の自己複製能を制御する因子をスクリーニングする方法。
【請求項１４】
上記細胞が、自己複製能を抑制された間葉系幹細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
候補物質の非存在下にて培養した、自己複製能を抑制された間葉系幹細胞における上記遺伝子の発現を検出する工程をさらに包含する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
間葉系幹細胞における上記遺伝子の発現を検出する工程をさらに包含する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
候補物質の存在下にて培養した目的の細胞において、表２に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子の少なくとも１つの発現を検出する工程を包含する、間葉系幹細胞の分化能を制御する因子をスクリーニングする方法。
【請求項１８】
上記細胞が、分化能を抑制された間葉系幹細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
候補物質の非存在下にて培養した、分化能を抑制された間葉系幹細胞における上記遺伝子の発現を検出する工程をさらに包含する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
間葉系幹細胞における上記遺伝子の発現を検出する工程をさらに包含する、請求項１８に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図７】
【図１１】
【図６】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図７】
【図１１】
【図６】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公開番号】特開２０１２−１４３１５８（Ｐ２０１２−１４３１５８Ａ）
【公開日】平成２４年８月２日（２０１２．８．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１１５３７８（Ｐ２００９−１１５３７８）
【出願日】平成２１年５月１２日（２００９．５．１２）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ・「Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｅｌｌｓ 第１４巻 第３号」 発行日 ２００９年３月 発行所 日本分子生物学会 ・「日本再生医療学会雑誌「再生医療」 第８巻 増刊号」 発行日 ２００９年２月５日 発行所 日本再生医療学会 ・「バイオデンティスト育成プログラム」プログラムおよび要旨 発行日 ２００９年１月 発行所 広島大学大学院医歯薬学総合研究科 ・「先端歯学国際教育研究ネットワーク日・米シンポジウム プログラム＆抄録集」 発行日 ２００９年２月１２日 発行所 新潟大学大学院医歯学総合研究科
【出願人】（５０４１３６５６８）国立大学法人広島大学 (924)
【出願人】（５０３３２８１９３）株式会社ツーセル (24)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年８月２日（２０１２．８．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年５月１２日（２００９．５．１２）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ・「Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｅｌｌｓ 第１４巻 第３号」 発行日 ２００９年３月 発行所 日本分子生物学会 ・「日本再生医療学会雑誌「再生医療」 第８巻 増刊号」 発行日 ２００９年２月５日 発行所 日本再生医療学会 ・「バイオデンティスト育成プログラム」プログラムおよび要旨 発行日 ２００９年１月 発行所 広島大学大学院医歯薬学総合研究科 ・「先端歯学国際教育研究ネットワーク日・米シンポジウム プログラム＆抄録集」 発行日 ２００９年２月１２日 発行所 新潟大学大学院医歯学総合研究科
【出願人】（５０４１３６５６８）国立大学法人広島大学 (924)
【出願人】（５０３３２８１９３）株式会社ツーセル (24)
【Ｆターム（参考）】
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