貧血の予防および治療用の方法および組成物
【課題】エリスロポイエチンの高グリコシル化アナログを投与する工程を包含する、哺乳動物におけるヘマトクリットの増加および維持法を提供する。
【解決手段】アナログを等モル量の組換えヒトエリスロポイエチンより低頻度で投与して、目標に匹敵するヘマトクリットを得て貧血を治療することができる。あるいは、より低いモル量の高グリコシル化アナログを投与して、目標に匹敵するヘマトクリットを得て貧血を治療することができる。新規の高グリコシル化エリスロポイエチンアナログ、前記アナログの産生法、および前記アナログを含む組成物。
【解決手段】アナログを等モル量の組換えヒトエリスロポイエチンより低頻度で投与して、目標に匹敵するヘマトクリットを得て貧血を治療することができる。あるいは、より低いモル量の高グリコシル化アナログを投与して、目標に匹敵するヘマトクリットを得て貧血を治療することができる。新規の高グリコシル化エリスロポイエチンアナログ、前記アナログの産生法、および前記アナログを含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、エリスロポイエチンの高グリコシル化アナログを用いた哺乳動物におけるヘマトクリットの増加に関する。より詳細には、本発明は、ヘマトクリットを上昇および維持して貧血を治療するのための、組換えヒトエリスロポイエチンと比較してより低頻度の高グリコシル化アナログの投与に関する。本発明はまた、ヘマトクリットを上昇および維持して貧血を治療するための、組換えヒトエリスロポイエチンと比較して等価の投薬頻度でより少量の高グリコシル化アナログの投与に関する。エリスロポイエチンの新規の高グリコシル化アナログもまた提供される。
【０００２】
（発明の背景）
エリスロポイエチン（Ｅｐｏ）は、赤血球前駆細胞の赤血球への成熟に必要な糖タンパク質ホルモンである。これは、腎臓で産生され、循環する赤血球レベルの調節に必須である。低レベルの組織酸素シグナルによって特徴づけられる条件によりＥｐｏの産生を増加させ、赤血球生成を刺激する。例えば、慢性腎不全（ＣＲＦ）に認められるような腎機能低下により、典型的には、Ｅｐｏの産生が減少し、それに伴って赤血球が減少する。
【０００３】
ヒト尿中Ｅｐｏは、Ｍｉｙａｋｅら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５２、５５５８、１９７７）によって、再生不良性貧血患者から精製された。しかし、この供給源から得られた精製Ｅｐｏタンパク質の量は、治療に適用するには不十分であった。ヒトＥｐｏおよび組換えタンパク質をコードする遺伝子の同定およびクローニングは、Ｌｉｎに付与された米国特許第４，７０３，００８号（その開示は本明細書中に参照により取込まれる）で開示された。細胞培地からの組換えヒトエリスロポイエチンの精製法は、Ｌａｉらに付与された米国特許第４，６６７，０１６号（本明細書中に参照により取込まれる）に開示されている。哺乳動物宿主細胞由来の生物活性Ｅｐｏの産生（治療への適用に適切なＥｐｏ量）がはじめて可能となった。さらに、遺伝子配列についての知識および精製タンパク質の利用可能性の増加により、このタンパク質の作用様式がより理解されている。
【０００４】
ヒト尿由来Ｅｐｏ（Ｍｉｙａｋｅら、前出）および哺乳動物細胞で発現する組換えヒトＥｐｏは、糖タンパク質の全分子量の約４０％を含む３つのＮ連結およびＯ連結オリゴ糖鎖を含む。第２４位、第３８位、および第８３位に位置するアスパラギン残基でＮ連結グリコシル化が起こり、第１２６位に位置するセリン残基でＯ連結グリコシル化が起こる（Ｌａｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６１、３１１６、１９８６、Ｂｒｏｎｄｙら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、２６５、３２９、１０８８）。オリゴ糖鎖は、典型的には鎖あたり４つまでのシアル酸を有するＮ連結鎖および２つまでのシアル酸有するＯ連結鎖を有する末端シアル酸残基で修飾されていることが認められている。したがって、Ｅｐｏポリペプチドは、全部で１４個までのシアル酸に適応することができる。
【０００５】
種々の研究で、Ｅｐｏ炭水化物鎖の変更により生物活性に影響を与え得ることが示されている。しかし、１つの研究では、単独かグリコシル化部位であるアスパラギンまたはセリン残基の変異誘発によるＮ連結またはＯ連結オリゴ糖鎖の除去により、哺乳動物細胞において産生されたＥｐｏのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性の変化が急激に減少する（Ｄｕｂｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３、１７５１６、１９８８）。しかし、ＤｅＬｏｒｍｅら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３１、９８７１〜９８７６、１９９２）は、ＥｐｏのＮ連結グリコシル化部位の除去により生物活性がｉｎ ｖｉｖｏで減少するが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで減少しないことを報告した。
【０００６】
Ｅｐｏのシアル酸含有量とｉｎ ｖｉｖｏでの生物活性との間の関係は、単離Ｅｐｏイソ型のｉｎ ｖｉｖｏ活性の測定により開示された。単離Ｅｐｏイソ型の等モルの濃縮物の正常なマウスのヘマトクリットを上昇させる能力によって測定したところ、Ｅｐｏ分子あたりのシアル酸含有量の段階的増加により、対応するｉｎ ｖｉｖｏでの生物活性を段階的に増加することが見出された（Ｅｇｒｉｅら、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ．、１０、２６３、１９９３）。より高いシアル酸を含有するＥｐｏイソ型はまた、より長い血清半減期を示すがＥｐｏレセプターに対する親和性が減少した。これは血清の半減期がｉｎ ｖｉｖｏ生物活性の重要な決定因子であることを示唆している。
【０００７】
Ｅｐｏポリペプチドにおける新規のグリコシル化部位の導入により、さらなる炭水化物鎖を有する分子を産生することができる。ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／０５８６７およびＷＯ９４／０９２５７（その全体が参考として援用される）を参照のこと。少なくとも１つのさらなるＮ連結炭水化物鎖および／または少なくとも１つのさらなるＯ連結炭水化物鎖を有するＥｐｏグリコシル化アナログが開示されている。１つのさらなるＮ連結鎖を有するグリコシル化アナログは、組換えヒトＥｐｏ（ｒＨｕＥｐｏ）（イソ型９〜１４）および分子あたり１４個のシアル酸を有するｒＨｕＥｐｏの精製イソ型と比較してより長い循環半減期を有することが測定された。
【０００８】
組換えヒトエリスロポイエチン（ｒＨｕＥｐｏ）の投与は、末期腎疾患の貧血患者の赤血球レベルの上昇に有効である（Ｅｓｃｈｂａｃｈら、Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３１６、７３〜３８、１９８７）。その後の研究では、ｒＨｕＥｐｏでの治療により種々の他の条件に伴う貧血を治癒することができることが示されている。（Ｆｉｓｃｈｌら、Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３２２、１４８８〜１４９３、１９９０、Ｌａｕｐａｃｉｓ、Ｌａｎｃｅｔ、３４１、１２２８〜１２３２、１９９３）。ＣＲＦに伴う貧血、ＨＩＶ感染患者におけるＡＺＴ（ジドブジン）治療に関する貧血、化学療法を受けた骨髄性悪性腫瘍を有さない患者の貧血、同種異系間の輸血の必要性を減少させるための手術を受けた患者の貧血の治療におけるｒＨｕＥｐｏの使用について規制当局の許可が下りている。全ての承認された適応症（手術適応症を除く）についての現在の治療には、推奨された目標ヘマトクリット範囲に到達させるための、静脈内（ＩＶ）または皮下（ＳＣ）注射のいずれかによって投与された１週間に３回の５０〜１５０単位／ｋｇの開始用量が含まれる。手術適応症については、毎日、手術前の１０日間、手術日、および術後４日間にｒＨｕＥｐｏ（ＥＰＯＧＥＮ（登録商標）Ｐａｃｋａｇｅ Ｉｎｓｅｒｔ、１２／２３／９６）を投与する。一般に、現在推奨されているｒＨｕＥｐｏの開始投与量により、約６週間から８週間でヘマトクリットが目標範囲に上昇する。一旦目標ヘマトクリット範囲が達成されると、維持投薬スケジュールが確立し、これは患者に依存して変化するが、典型的には、ＣＲＦを有する貧血患者では１週間に３回である。上記のｒＨｕＥｐｏの投与は、貧血の治療に有効で十分に耐えられる投薬計画である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第４，７０３，００８号
【特許文献２】米国特許第４，６６７，０１６号
【特許文献３】国際公開第９１／０５８６７号
【特許文献４】国際公開第９４／０９２５７号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｍｉｙａｋｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５２、５５５８、１９７７
【非特許文献２】Ｌａｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６１、３１１６、１９８６
【非特許文献３】Ｂｒｏｎｄｙら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、２６５、３２９、１０８８
【非特許文献４】Ｄｕｂｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３、１７５１６、１９８８
【非特許文献５】ＤｅＬｏｒｍｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３１、９８７１〜９８７６、１９９２
【非特許文献６】Ｅｇｒｉｅら、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ．、１０、２６３、１９９３
【非特許文献７】Ｅｓｃｈｂａｃｈら、Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３１６、７３〜３８、１９８７
【非特許文献８】Ｆｉｓｃｈｌら、Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３２２、１４８８〜１４９３、１９９０
【非特許文献９】Ｌａｕｐａｃｉｓ、Ｌａｎｃｅｔ、３４１、１２２８〜１２３２、１９９３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ｒＨｕＥｐｏより効力の高い治療を有することが望ましいであろう。このような分子に対する利点は、低頻度および／または低用量で投与することができることであろう。現在の治療では、ＥＰＯＧＥＮ（登録商標）を、貧血患者には１週間に３回の投与および手術患者には１日１回の投与を必要とする。低頻度の投薬スケジュールは、医師および患者双方に、特に、医師のオフィスまたはクリニックに定期的に来診しない患者またはＥｐｏを自己注射する患者に好都合である。より有効な分子の別の利点は、患者へのより少量の薬物投与で類似のヘマトクリット増加が得られることである。
【００１２】
したがって、本発明の目的は、低頻度の投薬スケジュールを可能にする貧血治療用のより有効な分子を特定することである。本発明のさらなる目的は、より低用量で投与した場合、少なくともＥｐｏと匹敵するレベルでヘマトクリットを増加および維持する分子を提供することである。本発明の目的はまた、より低頻度の投薬用に選択されたこれらの分子がｒＨｕＥｐｏと少なくとも同様の耐性を示し、患者によっては潜在的により有効に耐性を示すことである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
Ｎ４７と命名されている高グリコシル化Ｅｐｏアナログ（Ａｓｎ３０Ｔｈｒ３２Ｖａｌ８７Ａｓｎ８８Ｔｈｒ９０Ｅｐｏ）は、ｒＨｕＥｐｏと同用量かつ同頻度で投与された場合、組換えヒトエリスロポイエチン（ｒＨｕＥｐｏ）よりも長い血清半減期およびより高いｉｎ ｖｉｖｏ活性を有することが見出された。さらに、このアナログは、１週間に１回の投与でマウスのヘマトクリットの上昇させることが示されており、これは、ｒＨｕＥｐｏを１週間に３回投与した場合のヘマトクリットの上昇に匹敵する。マウスおよびヒトに投与したＥｐｏアナログＮ４７の薬物動態と類似であった。
【００１４】
本発明は、薬学的組成物中の治療有効量のエリスロポイエチンの高グリコシル化アナログを投与する工程を包含する哺乳動物におけるヘマトクリットの上昇および維持法であって、等モル量の組換えヒトエリスロポイエチンより低頻度で前記アナログを投与して目標に匹敵するヘマトクリットを得る方法を提供する。患者の最適なヘマトクリット範囲に到達するための本発明の投薬頻度は、１週間に３回未満である。投薬頻度は、１週間に２回、１週間に１回、または１週間に１回未満（１週間おきに１回、１ヶ月に１回、または２カ月おきに１回など）であり得る。患者の目標ヘマトクリットを維持するために必要な投薬頻度は、１週間に３回未満である。投薬頻度は、１週間に２回、１週間に１回、または１週間に１回未満（２週間おきに１回、１ヶ月に１回、または２週間おきに１回）であり得る。
【００１５】
本発明はまた、治療有効量のＥｐｏ高グリコシル化アナログを投与する工程を包含する哺乳動物におけるヘマトクリットの上昇および維持法であって、組換えヒトエリスロポイエチンより低いモル量で前記アナログを投与して目標に匹敵するヘマトクリットを得る方法を提供する。
【００１６】
１週間に３回未満の投薬頻度に適切であるＥｐｏの高グリコシル化アナログを含む薬学的組成物もまた提供する。この組成物は、Ｅｐｏの高グリコシル化アナログの使用に適切な薬学的に許容可能なアジュバントを含む。
【００１７】
本発明を、赤血球レベルを減少させる任意の条件（腎機能の衰退または低下、（慢性腎不全）骨髄抑制療法、癌、ウイルス感染、慢性疾患、および手術中の過剰な出血）で使用することができる。１つの実施形態では、１週間に１回の投薬またはそれ以下の頻度の投薬を用いた治療は、慢性腎不全に起因する貧血用である。
【００１８】
Ｅｐｏの新規の高グリコシル化アナログもまた提供する。アナログは、ｒＨｕＥｐｏと比較して少なくとも１つのさらなる炭水化物鎖を含み、少なくとも１つのＮ連結炭水化物鎖は第５２位、第５３位、第５５位、第８６位、および第１１４位のいずれかに付加されている。新規の高グリコシル化アナログは、２つ、３つ、または４つのさらなる炭水化物鎖を有しても、４つを超えるさらなる鎖を有してもよい。
【００１９】
（図面の説明）
図１は、ヒトエリスロポイエチンのアミノ酸配列を示す図である。
【００２０】
図２は、無血清培地中でのＣＨＯ細胞発現由来のｒＨｕＥｐｏおよびＥｐｏの高グリコシル化アナログのウェスタンブロット分析を示す図である。アナログＮ５３およびＮ６１の構築を、実施例１に記載する。各アナログのＮ連結炭水化物鎖数を示す。
【００２１】
図３は、非低酸素（ｅｘｈｙｐｏｘｉｃ）赤血球増加症マウスバイオアッセイにおけるｒＨｕＥｐｏ、ＥｐｏアナログＮ４、Ｎ１８、およびＮ５０（４つのＮ連結炭水化物鎖を含む）、Ｎ４７（５つのＮ連結炭水化物鎖を含む）、Ｎ５３（６つのＮ連結炭水化物鎖を含む）の活性を比較した図である。実験手順を、実施例３に示す。各ポイントは、５匹の動物の平均応答を示す。アナログＮ４、Ｎ１８、およびＮ４７は、ＷＯ９４／０９２５７に以前に示されている。
【００２２】
図４は、静脈内注射（ＩＶ）によって正常なラットに投与したｒＨｕＥｐｏおよびＥｐｏアナログＮ４７の血清半減期を比較した図である。実験手順を、実施例４に示す。結果は、各群の平均（±ＳＤ）である。
【００２３】
図５は、静脈内注射（ＩＶ）によってビーグル犬に投与したｒＨｕＥｐｏおよびＥｐｏアナログＮ４７の血清半減期を比較した図である。実験手順を、実施例４に示す。結果は、各群の平均（±ＳＤ）である。
【００２４】
図６は、１週間に３回（ＴＩＷ）を６週間腹腔内注射によって投与した種々の用量のｒＨｕＥｐｏまたはＥｐｏアナログＮ４７に対する応答によるマウスのヘマトクリットの増加を示す図である。実験手順を、実施例５に示す。結果は、各用量群についてのヘマトクリット変化の群平均（±ＳＤ）を示す。
【００２５】
図７は、１週間に１回（ＱＷ）または１週間に３回（ＴＩＷ）の投与頻度で、腹腔内（ＩＰ）または静脈内（ＩＶ）経路によって注射されたｒＨｕＥｐｏおよびＥｐｏアナログＮ４７のマウスにおける相対効力を比較した図である。実験手順を、実施例５に示す。各ポイントは、以下の個々の実験由来のデータの平均（±ＳＤ）を示す：Ｎ４７、ＩＰ、ＴＩＷ（ｎ＝５）；Ｎ４７、ＩＶ、ＴＩＷ（ｎ＝１）；Ｎ４７、ＩＰ、ＱＷ（ｎ＝２）；Ｎ４７、ＩＶ、ＱＷ（ｎ＝３）；ｒＨｕＥｐｏ、ＩＰ、ＴＩＷ（ｎ＝５）；ｒＨｕＥｐｏ、ＩＶ、ＱＷ（ｎ＝２）。各実験では、用量あたり７〜１３匹のマウスを使用した。
【００２６】
図８は、１週間に１回（ＱＷ）を６週間静脈内注射によって投与した種々の用量のｒＨｕＥｐｏまたはＥｐｏアナログＮ４７に対する応答によるマウスのヘマトクリットの増加を示す図である。実験手順を、実施例５に示す。結果は、各用量群についてのヘマトクリットの変化の群平均（±ＳＤ）を示す。
【００２７】
図９は、１週間に１回（ＱＷ）または１週間おきに１回（ＥＯＷ）を約６週間静脈内（ＩＶ）注射によって投与した種々の用量のｒＨｕＥｐｏまたはＥｐｏアナログＮ４７に対する応答によるマウスのヘマトクリットの増加を示す図である。実験手順を、実施例５に示す。結果は、各用量群についてのヘマトクリット変化の群平均（±ＳＤ）を示す。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】ヒトエリスロポイエチンのアミノ酸配列を示す図である。
【図２】無血清培地中でのＣＨＯ細胞発現由来のｒＨｕＥｐｏおよびＥｐｏの高グリコシル化アナログのウェスタンブロット分析を示す図である。
【図３】非低酸素（ｅｘｈｙｐｏｘｉｃ）赤血球増加症マウスバイオアッセイにおけるｒＨｕＥｐｏ、ＥｐｏアナログＮ４、Ｎ１８、およびＮ５０（４つのＮ連結炭水化物鎖を含む）、Ｎ４７（５つのＮ連結炭水化物鎖を含む）、Ｎ５３（６つのＮ連結炭水化物鎖を含む）の活性を比較した図である。
【図４】静脈内注射（ＩＶ）によって正常なラットに投与したｒＨｕＥｐｏおよびＥｐｏアナログＮ４７の血清半減期を比較した図である。
【図５】静脈内注射（ＩＶ）によってビーグル犬に投与したｒＨｕＥｐｏおよびＥｐｏアナログＮ４７の血清半減期を比較した図である。
【図６】１週間に３回（ＴＩＷ）を６週間腹腔内注射によって投与した種々の用量のｒＨｕＥｐｏまたはＥｐｏアナログＮ４７に対する応答によるマウスのヘマトクリットの増加を示す図である。
【図７】１週間に１回（ＱＷ）または１週間に３回（ＴＩＷ）の投与頻度で、腹腔内（ＩＰ）または静脈内（ＩＶ）経路によって注射されたｒＨｕＥｐｏおよびＥｐｏアナログＮ４７のマウスにおける相対効力を比較した図である。。
【図８】１週間に１回（ＱＷ）を６週間静脈内注射によって投与した種々の用量のｒＨｕＥｐｏまたはＥｐｏアナログＮ４７に対する応答によるマウスのヘマトクリットの増加を示す図である。
【図９】１週間に１回（ＱＷ）または１週間おきに１回（ＥＯＷ）を約６週間静脈内（ＩＶ）注射によって投与した種々の用量のｒＨｕＥｐｏまたはＥｐｏアナログＮ４７に対する応答によるマウスのヘマトクリットの増加を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、薬学的組成物中の治療有効量のエリスロポイエチンの高グリコシル化アナログを投与する工程を包含する、ヘマクリットの上昇および維持法を提供する。このアナログを、等モル量のｒＨｕＥｐｏよりも低頻度で投与して、目標に匹敵するヘマトクリットを得る。本発明はまた、ｒＨｕＥｐｏより低モル量で高グリコシル化アナログを投与して目標に匹敵するヘマトクリットを得る、ヘマトクリットの上昇および維持法を提供する。この組成物を、静脈内、皮下、または腹腔内経路によって投与することができる。
【００３０】
驚いたことに、アナログＮ４７（ＷＯ９７／０９２５７に記載の高グリコシル化Ｅｐｏアナログ）は１週間に１回の投与でｒＨｕＥｐｏでは１週間に３回の投与で認められるヘマトクリット増加を達成することができることを見出した。アナログＮ４７は、以下のアミノ酸の変化を有する：第３０位でのｔｒｐのａｓｎへの変化、第３２位でのｈｉｓのｔｈｒへの変化、第８７位でのｐｒｏのｖａｌへの変化、第８８位でのｔｒｐのａｓｎへの変化、第９０位でのｐｒｏのｔｈｒへの変化（この変化により、第３０位および第８８位のアスパラギンでさらに２つのＮ連結炭水化物鎖が得られる）。アナログを、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中で発現させ（実施例１に記載）、実施例２に記載のように精製して１７〜２２個のシアル酸のイソ型を得た。アナログＮ４７は、静脈内注射した場合、ラットおよびビーグル犬でｒＨｕＥｐｏより長い血清半減期を示した（図４および図５）。１週間に３回腹腔内注射した場合、Ｎ４７は、より低濃度でｒＨｕＥｐｏと類似の正常なマウスのヘマトクリットの増加を誘導する（図６）。Ｎ４７の効力は、１週間に３回投与した場合、ｒＨｕＥｐｏより約３〜４倍高いことが示された（図６および図７）。類似の用量で１週間に１回投与した場合、ｒＨｕＥｐｏは、正常なマウスのヘマトクリットをほとんど刺激せず、Ｎ４７では著しい増加を示した（図８）。Ｎ４７の効力は、１週間に１回の投薬でｒＨｕＥｐｏより約１４倍高かった（図７）。有意に、１週間に１回のアナログＮ４７投与についてのヘマトクリット反応は、１週間に３回のｒＨｕＥｐｏ投与に相当する。１週間おきに投与した場合でさえも、Ｎ４７は正常なマウスにおけるヘマトクリットを有意に増加させた（図９）。まとめると、データは、Ｅｐｏ高グリコシル化アナログ、特にアナログＮ４７、を使用してｒＨｕＥｐｏを用いた現在の治療よりも低頻度の投薬でヘマトクリットを有利に上昇させることができることを示した。
【００３１】
マウスにおいて得られた上記の結果によってヒトに対する推定を行うことができることもまた示された。１１人の持続的携帯型腹膜透析（ＣＡＰＤ）患者に対するｒＨｕＥｐｏおよびアナログＮ４７の投与についての薬物動態学的パラメーターは、ｒＨｕＥｐｏより３倍長い血清半減期を有する（実施例６および表５）。これらの結果は、Ｅｐｏ高グリコシル化アナログにより、ヒトにおいてｒＨｕＥｐｏより低頻度の投薬が可能となることを示唆する。
【００３２】
本明細書中で使用されるとき、用語「高グリコシル化Ｅｐｏアナログ」は、さらなる炭水化物鎖を有する少なくとも１つのさらなるグリコシル化部位を含むＥｐｏをいう。グリコシル化部位は、Ｎ連結またはＯ連結炭水化物鎖用であり得る。ポリペプチド鎖中のＮ連結炭水化物付加のためのコンセンサス部位（アミノ酸Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）をコードするために、ＤＮＡ配列の変更によって新規のＮ連結グリコシル化部位を導入するか、あるいはセリンまたはトレオニン残基をコードするためのＤＮＡ配列の変更によって新規のＯ連結部位を導入する。グリコシル化に利用可能なＥｐｏポリペプチドの部位を増加または変化させるアミノ酸残基の付加、欠失、または置換を導入するための変異誘発技術によって、アナログを構築する。Ｅｐｏ高グリコシル化アナログをコードするＤＮＡを、真核生物宿主細胞にトランスフェクトして、発現した糖タンパク質をさらなる炭水化物鎖の存在について分析する。
【００３３】
Ｅｐｏの高グリコシル化アナログは、ｒＨｕＥｐｏで測定されたものと類似であるかより低いｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を示し、これは、炭水化物鎖の付加によってＥｐｏレセプターへの結合が促進されず、場合によっては減少し得ることが示唆される。しかし、高グリコシル化は、典型的には、血清の半減期を増加させ、潜在的にｉｎ ｖｉｖｏでの生物活性を増加させることができる。第８８位にさらなるＮ連結炭水化物鎖を有する１つのＥｐｏアナログは、ｒＨｕＥｐｏ（イソ型９〜１４）または分子あたり１４個のシアル酸を有するｒＨｕＥｐｏの精製イソ型と比較してレセプターに対する親和性が減少するが、Ｅｐｏイソ型９〜１４の混合物または単離Ｅｐｏイソ型１４のいずれかと比較してより長い循環半減期を示し、ｉｎ ｖｉｖｏ活性が増加する。
【００３４】
本発明にしたがって投与することができるＥｐｏの高グリコシル化アナログは、少なくとも１つのさらなるＮ連結またはＯ連結炭水化物鎖を有する。１つの実施形態では、アナログは、２つのさらなるＮ連結炭水化物鎖を有する。１つの他の実施形態では、アナログは、３つ、４つ、またはそれ以上のさらなるＮ連結炭水化物鎖を有する。例として、本発明のアナログは、ヒトＥｐｏ配列の第３０位、第５１位、第５７位、第６９位、第８８位、第８９位、第１３６位、および第１３８位の１つまたは複数のアミノ酸残基に少なくとも１つのさらなるＮ連結鎖を有する。１つの実施形態では、アナログは、ヒトＥｐｏの第３０位および第８８位の残基にさらなるＮ連結炭水化物鎖を有する。ヒトＥｐｏのアミノ酸残基数を、図１および配列番号１に示す。図１は、１６６アミノ酸の推定成熟Ｅｐｏポリペプチドを示すのに対して、Ｃ末端アルギニン残基の除去後の組換えＥｐｏは１６５アミノ酸を有する。これは、ｒＨｕＥｐｏおよび高グリコシル化Ｅｐｏアナログが１６５個または１６６個のアミノ酸のいずれかを有し得ると理解される。
【００３５】
本発明のアナログは、少なくとも４つのＮ連結炭水化物鎖を有する。４つの鎖のうちの３つは、第２４位、第３８位、および第８３位で天然に存在する部位であり得る。しかし、本発明のいくつかのアナログは、１つまたは複数の部位が欠失して新規の部位で置換されるように、１つまたは複数の天然に存在するグリコシル化部位が変更し得ることが意図される。このようなアナログも、本発明によって得られる。例えば、第２４位、第３８位、および第８３位での任意の部位を欠失させて第８８位の部位と置換することができる。任意に、アナログは、第１２６位にＯ連結部位を有し得る。
【００３６】
本発明はまた、少なくとも１つのさらなる炭水化物鎖を有する新規のＥｐｏ高グリコシル化アナログを提供する。さらなるＮ連結炭水化物鎖を第５２位、第５３位、第５５位、第８６位、および第１１４位のいずれかに付加してこれらがグリコシル化部位として修飾されていることを見出した。表１に記載のように、特定の実施形態にはＮ４９〜Ｎ６１のアナログが含まれる。新規のアナログは、第５２位、第５３位、第５５位、第８６位、および第１１４位のいずれかに少なくとも１つの新規のＮ連結グリコシル化部位を有し、さらに、他の部位にさらなるＮ連結またはＯ連結炭水化物鎖を含むことができる。アナログは、１つ、２つ、３つ、または４つのさらなる炭水化物鎖を有するか、４つを超えるさらなる鎖を有することができる。１つの好ましい実施形態では、アナログは、３つのさらなるＮ連結炭水化物鎖（全部で６つのＮ連結鎖）を有する。別の好ましい実施形態では、アナログは４つのさらなるＮ連結鎖（全部で７つのＮ連結鎖）を有する。３つもしくは４つまたは４つを超えるさらなるＮ連結炭水化物鎖を有するアナログは、第５２位、第５３位、第５５位、第８６位、および第１１４位のいずれかにさらなる鎖を有することができるが、これらに限定されない。
【００３７】
驚いたことに、第３０位、第５３位、および第８８位に３つのさらなるＮ連結鎖を有する高グリコシル化アナログ（全部で６つのＮ連結鎖）は、２つのさらなる鎖（全部で５つの鎖）を有するアナログＮ４７よりｉｎ ｖｉｖｏ活性が高いことが見出された。結果を図３に示す。アナログのｉｎ ｖｉｖｏ活性がＮ連結炭水化物鎖数に直接依存することは明白である。これらの結果により、Ｎ４７よりも多数のＮ連結炭水化物鎖を有するアナログをさらに低頻度で投薬することができる治療設定を推定することができる。
【００３８】
当業者が利用可能な種々の変異誘発技術（部位特異的変異誘発、ＰＣＲ変異誘発、およびカセット変異誘発）（Ｚｏｌｌｅｒら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．、１００、４６８〜５００、（１９８３）、Ｈｕｇｕｃｈｉ、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、１７７〜１８３、（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、１９９０、Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ、３４、３１５〜３２３、（１９８５）など）によって、アナログを調製することができる。実施例１は、新規のＥｐｏ高グリコシル化アナログを構築するためのＰＣＲ変異誘発技術の使用を記載している。
【００３９】
変異誘発を受けたＥｐｏＤＮＡ配列を、哺乳動物宿主細胞中での維持に適切なベクターを用いる標準的な技術を用いて発現ベクターに挿入する。典型的には、ベクターは、以下のエレメントを含む：プロモーターおよび他の「上流」調節エレメント、複製起点、リボゾーム結合部位、転写終結部位、ポリリンカー部位、および哺乳動物宿主での使用に適合し得る選択マーカー。ベクターはまた、真核生物宿主細胞においても同様に増殖および維持することができるエレメントを含むことができる。
【００４０】
適切な細胞または細胞株は、ヒト供給源を含む哺乳動物供給源由来の任意の細胞を含む。例として、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ受諾番号ＣＲＬ１６５１）、ヒト２９３、胎児ハムスター卵巣細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ受諾番号ＣＣＬ１０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）欠乏細胞、Ｕｒｌａｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７、４２１６〜４２２０、１９８０）が含まれる。他の適切な哺乳動物細胞株には、ＨｅＬａ、マウスＬ−９２９、および３Ｔ３が含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、ＤＨＦＲ欠乏ＣＨＯ細胞を使用する。
【００４１】
Ｅｐｏ高グリコシル化アナログをコードする配列を含むベクターを、標準的な形質転換技術またはトランスフェクション技術によって移入する。形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞の培養、増幅、およびスクリーニングを、公的に利用可能な方法（Ｇｅｔｈｉｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、２９３、６２０〜６２５、（１９８１）、Ｋａｕｆｍａｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５、１７５０〜１７５９、（１９８５）、米国特許第４，４１９，４４６号）を用いて行う。Ｅｐｏ高グリコシル化アナログをコードする配列を保有する宿主細胞を、アナログが発現できる条件下で培養する。アナログを、本質的に以前に記載（ＷＯ９４／０９２５７）および実施例２に記載の手順を用いて細胞培地から回収および精製する。精製手順により、さらなる炭水化物鎖の付加に起因するより大量にシアル酸を含むＥｐｏの単離が可能になる。
【００４２】
Ｅｐｏ高グリコシル化アナログには、新規のグリコシル化部位に加えて、新規のグリコシル化部位を作製せず、高グリコシル化アナログの生物活性を実質的に変化させないアミノ酸残基の付加、欠失、または置換を含み得る。生物活性に影響を与えることなく変化し得るＥｐｏのこれらの個々の部位または領域を、Ｓｙｅｄら、Ｎａｔｕｒｅ、３９５、５１１、１９９８に記載のＥｐｏ−Ｅｐｏレセプター複合体の構造試験によって特定することができる。Ｅｐｏ−Ｅｐｏレセプター複合体の構造試験によってＥｐｏのレセプター結合部位と相互作用するか密接に近位である残基、およびＥｐｏアミノ酸配列の変更時に回避すべき残基が明らかになる。あるいは、アラニンスキャニング変異誘発（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４、１０８１〜１０８５、（１９８９））によるアミノ酸置換耐性を示す領域を経験的に特定することができる。この方法では、選択したアミノ酸残基を、それぞれ、中性アミノ酸（例えば、アラニン）で置換して生物活性に対する影響を測定する。
【００４３】
保存的アミノ酸変化は、ポリペプチドの構造および／または機能をほとんど変化させないと一般的に認識されている。したがって、本発明は、Ｅｐｏ高グリコシル化アナログ内に１つまたは複数の保存的アミノ酸変化を含む。保存的アミノ酸変化は、一般的には、あるアミノ酸と構造および／または機能が類似する別のアミノ酸（例えば、サイズ、電荷、および形態の類似する側鎖を有するアミノ酸）との置換を含む。これらの変化の性質は、当業者に周知であり、以下の表１にまとめられている。このような保存的置換を、「好ましい置換」の見出しで示す。移入することができるより多くの実質的な変化（「例示的置換」）も意図される。当業者は、最初にこの部位が比較的保存的な様式での置換によって修飾されるべきであることを認識する。このような置換によって生物活性が保存される場合、より多数の置換的変化（例示的置換）を移入することができ、そして／または他の付加／欠失を行って得られた産物をスクリーニングすることができる。
【００４４】
【表１】
【００４５】
本発明はまた、生物活性に実質的に影響を与えない、高グリコシル化Ｅｐｏアナログのアミノ酸の欠失または付加も提供する。このような付加および欠失は、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に存在するか、その内部に存在する。一般に、比較的小さな欠失または付加は、Ｅｐｏまたは高グリコシル化アナログの構造および／または機能にほとんど影響を与えない。１つの実施形態では、欠失または付加は、５〜１０残基であるか、２〜５アミノ酸残基、または１〜２残基であり得る。
【００４６】
用語「モル量」は、対応するグリコシル化を含まないエリスロポイエチンポリペプチドの分子量に基づいた高グリコシル化アナログまたはｒＨｕＥｐｏの量をいう。ｒＨｕＥｐｏおよびアナログの等量は、このような量を測定するのに使用される手順の通常の変形を考慮した場合に等しい量をいう。ｒＨｕＥｐｏおよびアナログの分子量が炭水化物鎖数に依存して変化するので、この方法によって等量を同定する必要がある。ｒＨｕＥｐｏについては、エリスロポイエチンポリペプチドの分子量は、図１および配列番号１に記載の１〜１６５のアミノ酸残基に基づいて計算される。高グリコシル化アナログについては、分子量は、図１および配列番号１に記載の残基１〜１６５のアミノ酸変化に依存して調整される。
【００４７】
高グリコシル化アナログの投薬頻度は、治療条件および標的ヘマトクリットに依存して変化するが、一般に、１週間に３回未満である。投薬頻度は、１週間に約２回、１週間に約１回である。投薬頻度はまた、１週間に１回未満（例えば、２週間おきに約１回（１４日に約１回）、１ヶ月に１回、または２カ月おきに１回）であり得る。実際に使用される投薬頻度は、Ｅｐｏアナログに対する種々の個体の応答が様々であるので、本明細書中に開示の頻度はいくらか変化し得ることが理解される。用語「約」は、このような変形を反映することが意図される。
【００４８】
本明細書中で使用される、用語「治療有効量」は、目標ヘマトクリットまたは患者に利益を与える目標ヘマトクリット範囲に対するヘマトクリットを増加させるか、目標ヘマトクリットでまたは目標ヘマトクリットの範囲内を患者が維持する高グリコシル化アナログの量をいう。この量は、個体によって変化し、患者の全体的な体調、貧血の重症度および根底にある原因、ならびに個々の患者の最終的な目標ヘマトクリットを含む多数の因子に依存する。目標ヘマトクリットは、典型的には、少なくとも３０％または３０％〜３８％の範囲内、好ましくは３８％以上、より好ましくは４０％〜４５％である。ｒＨｕＥｐｏについての目標ヘマトクリット範囲に関する一般的なガイドラインはまた、１９９６年１２月２３日付けのＥＰＯＧＥＮ（登録商標）パッケージインサートにも見出されており、３０％〜３６％、または３２％〜３８％であると記載されている。このような目標は個体によって変化するので、医師の裁量によって患者に投与される実際の目標ヘマトクリットが任意に決定されることが適切であり得ることが理解される。それにもかかわらず、目標ヘマトクリットの決定は、十分に当業者のレベル内である。
【００４９】
本発明の組成物の治療有効量は、当業者が容易に確認することができる。実施例６は、１週間に１回および１週間に３回の投薬におけるアナログＮ４７の治療有効量を決定するための１つの目的を有する臨床プロトコールを示す。１週間に１回の投与について投薬範囲は、約０．０７５μｇ〜約４．５μｇエリスロポイエチン／ｋｇ／用量である。１週間に３回の投与についての投薬範囲は、約０．０２５μｇ〜約１．５μｇエリスロポイエチン／ｋｇ／用量である。この投薬範囲を、当業者における日常の投薬範囲で、任意の調整物を含む他のＥｐｏ高グリコシル化アナログと使用することができる。
【００５０】
本発明のすぐれた有利な点は、投与される用量または投薬スケジュールによってＥｐｏアナログを「調整する」ことができる、高グリコシル化の範囲が投薬量または投薬間隔のいずれかに相関する能力である。図３に示すように、１つ、２つ、または３つのさらなる炭水化物鎖を有するＥｐｏアナログのｉｎ ｖｉｖｏ活性の増加に基づいて、治療を行う医師は、治療する貧血の状態に適切で便利なアナログを選択することができる。例えば、急性貧血でより大量の有効量を必要とする患者または長期治療を必要とする患者では、３つもしくは４つまたは４つを超えるさらなる炭水化物鎖を有する高グリコシル化アナログの投与が好ましい。あまり重篤でない貧血の患者または比較的単息の治療期間を必要とする患者では、１つまたは２つのさらなる炭水化物鎖を有するアナログが好ましい。本発明のアナログにより、広範な種々の根底となる条件に起因し得る貧血の予防および治療に医師がかなり柔軟に対応できる。本発明はまた、治療中の赤血球生成の増加を維持するための治療有効量の鉄の投与を提供する。投与量を、ｒＨｕＥｐｏを用いた治療に基づいて当業者が容易に決定することができる。
【００５１】
本発明を使用して、赤血球産生を刺激し、貧血を予防および治療することができる。本発明によって治療可能な病状には、腎機能の衰退または低下（慢性腎不全）に伴う貧血、骨髄抑制療法（化学療法または高ウイルス薬（ＡＺＴ）など）に伴う貧血、非骨髄癌の進行に伴う貧血、ウイルス感染（ＨＩＶなど）に伴う貧血、および慢性疾患に伴う貧血が含まれる。それ以外は健常な個体の貧血（予想される手術中の出血など）を引き起こし得る状態も治療可能である。一般に、ｒＨｕＥｐｏで治療可能な任意の病状もまた、本発明のＥｐｏ高グリコシル化アナログを用いて治療することができる。
【００５２】
本発明はまた、薬学的に許容可能な希釈剤、キャリア、可溶化剤、乳化剤、防腐剤、および／またはアジュバントと共に治療有効量のＥｐｏ高イグリコシル化アナログを含む薬学的組成物を提供する。この組成物は、１週間に３回未満の伴う投薬スケジュールに適切である。この組成物は、液体または凍結乾燥形態であってよく、種々のｐＨ値およびイオン強度の希釈剤（Ｔｒｉｓ、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、またはリン酸緩衝液）、可溶化剤（ＴｗｅｅｎまたはＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅなど）、キャリア（ヒト血清アルブミンまたはゼラチンなど）、防腐剤（チメロサール、パラベン、塩化ベンジルアルコニウムまたはベンジルアルコールなど）、抗酸化剤（アスコルビン酸またはメタ亜硫酸水素塩など）、および他の成分（リジンまたはグリシン）を含む。特定の組成物の選択は、治療する病状、投与経路、および所望の薬物動態学的パラメーターを含む多数の因子に依存する。薬学的組成物に適切な成分のより広範な調査は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１８版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、（１９８０）に見出される。好ましい実施形態では、本発明のＥｐｏグリコシル化アナログを、ヒトアルブミンおよび任意選択的に防腐剤としてベンジルアルコールを含む等張塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム緩衝液としての液体形態で処方する。組成物は、１つ、２つ、３つ、もしくは４つ、または４つを超えるさらなる炭水化物鎖を有するアナログを含むことが好ましい。
【００５３】
本発明の組成物は、皮下または静脈内注射のいずれかで投与されることが好ましい。最終的に選択される投与経路は、因子の数に依存し、当業者によって確認することができる。
【００５４】
以下の実施例は、本発明をより完全に例示するために提示されているが、本発明の範囲を制限するために構成されていない。
【実施例１】
【００５５】
高グリコシル化Ｅｐｏアナログの構築
高グリコシル化ＥｐｏアナログをコードするｃＤＮＡの構築
Ｅｐｏアナログを、いくつかの異なる方法を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ変異誘発によって作製した。アナログＮ４９およびＮ５０を、ＷＯ９４／０９２５７に記載のように構築した。アナログを、重複ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法の変形によっても構築した。基本的な手順には、２つの連続的な工程が含まれる。第１の工程では、全部で４つのオリゴヌクレオチド（５’（正方向）プライマー、逆方向変異誘発プライマー、正方向変異誘発プライマー（通常、逆方向変異誘発プライマーに相補的）、および３’（逆方向）プライマー）を用いるＥｐｏまたはＥｐｏアナログテンプレートＤＮＡについて、２つの反応（ＰＣＲ１およびＰＣＲ２）を行った。変異誘発プライマーは、これらの各変化部位に所望のヌクレオチド変化ならびに６〜１４個の正確な適合ヌクレオチドを含んでいた。ＰＣＲ１を、５’（正方向）プライマーおよび逆方向変異誘発プライマーに使用した。ＰＣＲ２を、３’（逆方向）プライマーおよび正方向変異誘発プライマーに使用した。増幅ＤＮＡフラグメントを、アガロースゲル電気泳動で分離した。正確なサイズのＤＮＡフラグメントを含むアガロースの小片を、ゲルから切り出した。ＰＣＲ１およびＰＣＲ２由来のＤＮＡフラグメントを合わせ、５’正方向プライマーおよび３’逆方向プライマーのみを用いて第３のＰＣＲ反応を行った。したがって、所望の変異を含む全長ＤＮＡセグメントを増幅した。場合によっては、同一のＰＣＲプロセスを用いてすでに変化したＤＮＡへの新規の置換物を移入することによって、２つまたは３つの変異を組み合わせた。これらの複数のグリコシル化部位アナログを構築するために、１つの二重および三重部位アナログ（上記のように作製）を、ＰＣＲテンプレートとして使用し、さらなるグリコシル化部位を、適切なプライマーを用いた部位特異的変異誘発によって移入した。
【００５６】
ＥｐｏアナログＮ５１、Ｎ５２、およびＮ５３を、重複ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法１によって構築した。各場合に１つのさらなるＮグリコシル化部位を移入した。Ｎ５６は、ＰＣＲテンプレートとしてｐＤＳＲα２Ｅｐｏの使用により天然の配列ＨｕＥｐｏのグリコシル化部位（Ｎ１１４、Ｔ１１６）が付加されており、Ｎ５１はｐＤＳＲα２ Ｅｐｏ Ｎ４７テンプレート（Ａｓｎ３０、Ｔｈｒ３２、Ｖａｌ８７、Ａｓｎ８８、Ｔｈｒ９０）の使用によりＮ４７ ＥｐｏにＯ連結グリコシル化部位（Ｔｈｒ１２５）が付加されており、アナログＮ５９はｐＤＳＲα２ Ｅｐｏ Ｎ４７テンプレートを用いてアナログＮ４７にグリコシル化部位（Ａｓｎ５７）が付加されていた。
【００５７】
Ｃｈｅｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１、５６９５，（１９９４）を適用したプロトコールを用いて、方法１についてのポリメラーゼ連鎖反応を行った。３’（逆方向）プライマーは、終結コドンの後ろにＸｂａＩ制限部位を移入した配列を含んでいた：
ＡＴＣＴＡＧＡＡＧＴＴＧＣＴＣＴＣＴＧＧＡＣＡＧＴＴＣＣＴ（配列番号２）。
【００５８】
５’正方向反応プライマー：
ＧＡＡＧＣＴＴＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＧＧＴＧＣＡＣＧＡＡＴＧ（配列番号３）は、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ制限部位の後ろにＥｐｏ開始コドン（ＡＴＧ）の上流のＫｏｚａｋ配列を有する。典型的なＰＣＲ反応混合物には、以下を含んでいた：４μｌの各正方向および逆方向プライマー（５ｐｍｏｌ／μｌ）、１μｌのテンプレート（２５ｎｇ）、１０μｌの５×ＬＰ緩衝液（１００ｍＭトリシン（ｐＨ８．７）／２５％グリセロール／４２５ｍＭ ＫＯＡｃ）、１０μｌのｄＮＴＰストック（それぞれ１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、０．８μｌのｒｔＴｈポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、２．５Ｕ／μｌ）、および２μｌのＶｅｎｔポリメラーゼ（ＮＥＢ、１×ＬＰ緩衝液中で１：１００で新たに希釈後０．０１Ｕ／μｌ）。Ｈ２Ｏを添加して、最終体積を５０μｌにした。全ての成分を表示の順に添加し、第１サイクルの温度が６０℃を超えたときに１μｌの５０ｍＭ ＭｇＯＡｃの添加によってＰＣＲを開始した。典型的な反応条件は、以下であった：９４℃で１０秒間、５０℃で１分間、６８℃で５分間を２サイクル、その後９４℃で１０秒間、５５℃で１分間を１０秒間、６８℃で５分間を２５サイクル。増幅したフラグメントを、アガロースゲル電気泳動で分離し、正確なサイズのＤＮＡフラグメントを製造者が提供する手順（Ｂｉｏ １０１，Ｉｎｃ）によってＧｅｎｅｃｌｅａｎＴＭキットを用いて精製した。精製したＤＮＡを、Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＸｂａ Ｉで消化し、ＧｅｎｅｃｌｅａｎＴＭキットを用いて再度精製した。次いで、フラグメントを、Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＸｂａ Ｉで切断したｐＤＳＲα２ベクターにライゲートした。ライゲートしたＤＮＡを、キャリアｔＲＮＡの存在下、２体積のエタノールの０．３Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）溶液で沈殿させ、Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換した。Ｅｐｏアナログを、ｍｉｎｉ ＤＮＡ ｐｒｅｐに対する制限消化によってスクリーニングした。次いで、ポジティブクローン由来のプラスミドを調製し、インサートを配列決定して所望の変異の存在を確認し、さらなるアミノ酸変化が移入されていないことを確認した。
【００５９】
アナログＮ５４〜Ｎ６１を、重複ＰＣＲストラテジー法２を用いて構築した。３’（逆方向）プライマーは、終結コドンの後ろにＸｂａＩ制限部位を移入した配列を含んでいた：
ＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＴＴＧＣＴＣＴＣＴＧＧＡＣＡＧ（配列番号４）。
【００６０】
５’正方向反応プライマー：
ＣＡＡＣＡＡＧＣＴＴＧＣＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＧＧＧ（配列番号５）は、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ制限部位の後ろにＥｐｏ開始コドン（ＡＴＧ）の上流のＫｏｚａｋ配列を有する。Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＵｌＴｍａ ＤＮＡポリメラーゼおよび同伴試薬（１０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、３μｌの１ｍＭ ｄＮＴＰ、５ｐｍｏｌの各プライマー、および最終体積を１００μｌにするための水）を用いて、より忠実度の高いＰＣＲストラテジーを行った。ＰＣＲ混合物が９４℃に達した後、０．５単位のＵｌＴｍａポリメラーゼを添加した。次いで、９４℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、および７２℃で９０秒間を５サイクルするＰＣＲ反応を行った。引き続き９４℃で３０秒間、７２℃で９０秒間を２５サイクル行った。正確なサイズの産物のバンドを、電気泳動後にアガロースゲルから切り出した。
【００６１】
各アナログについて得られたＰＣＲ産物を、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キットを用いて精製した。精製したＤＮＡを、Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＸｂａ Ｉ制限酵素（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含む１００μｌの制限消化物中、３７℃で１時間消化した。消化物を、再びゲル精製して、消化されたフラグメントをＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＸｂａ Ｉ消化ｐＤＳＲα２ベクターにライゲートした。
【００６２】
ライゲートしたＤＮＡを、キャリアｔＲＮＡの存在下でエタノールの０．３Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）溶液中で沈殿させ、Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換した。正確なサイズおよび型のＤＮＡインサートを含むクローンを同定するために、最初にＥｐｏアナログをコロニーＰＣＲによってスクリーニングした。この手順を用いて、プラスミドを含む細胞をＥｐｏの正方向および逆方向プライマーを含むＰＣＲチューブに入れた。次いで、混合物を、上記の反応条件を用いたＰＣＲに供した。次いで、ポジティブクローン由来のプラスミドを調製し、Ｅｐｏインサートを配列決定して所望の変異の存在を確認し、さらなるアミノ酸変化が移入されていないことを確認した。
【００６３】
【表２】
【００６４】
炭水化物付加の分析
発現ベクターｐＤＳＲα２に挿入された高グリコシル化Ｅｐｏアナログについての構築物を、ＣＯＳ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトＣＯＳ細胞由来の上清をウェスタンブロットで分析して、発現および分泌したＥｐｏアナログがさらなる炭水化物を含むかどうかを決定した。サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウェルに直接ロードし、モノクローナル抗体９Ｇ８Ａを用いた免疫ブロット法によって分析した（Ｅｌｌｉｏｔｔら、（１９９６）、Ｂｌｏｏｄ、８７、２７１４）。アナログサンプルの移動度を、ｒＨｕＥｐｏを含むサンプルの移動度と比較した。図１は、アナログＮ４（４つの炭水化物鎖）およびＮ４７（５つの炭水化物鎖）と比較したアナログＮ５３およびＮ６１の移動度の減少を示す。移動度は、アナログＮ５３には６つの炭水化物鎖が存在し、アナログＮ６１には７つの炭水化物鎖が存在することと一致する。全ての高グリコシルがアナログのデータを、表２に示す。
【００６５】
ｉｎ ｖｉｔｒｏバイオアッセイ
ｒＨｕＥｐｏまたはアナログを発現するＣＯＳまたはＣＨＯで馴化した培地を、ＵＴ７−Ｅｐｏ細胞による３Ｈ−チミジン取り込みの刺激についてアッセイした（Ｋｏｍａｔｓｕら、Ｂｌｏｏｄ、８２、４５６）。ＵＴ７−Ｅｐｏ細胞は、Ｅｐｏ感受性で、その細胞表面にヒトＥｐｏレセプターを発現する。ＵＴ７−Ｅｐｏ細胞を、成長培地（Ｌ−グルタミン、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、および３０２４ｍｇ／Ｌの重炭酸ナトリウムを含むが、αチオグリセロールもβメルカプトエタノール（ＧＩＢＣＯ）／１０％ｖ／ｖウシ胎児血清／１％ｖ／ｖ Ｌ−グルタミン−ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）／１単位／ｍＬ ｒＨｕＥｐｏも含まない、１×Ｉｓｃｏｖｅ改変ダルベッコ培地）中で約３×１０５細胞／ｍＬに増殖させた。遠心分離（約５００×ｇ）によって回収した細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水で２回洗浄し、アッセイ培地（Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）／１％Ｌ−グルタミン／４％ウシ胎児血清を含まない１×ＲＰＭＩ Ｍｅｄｉｕｍ １６４０）中に５×１０４細胞／ｍＬで懸濁した。アッセイ培地で少なくとも５倍希釈した１００μｌの試験サンプルまたはＥｐｏ標準（ｒＨｕＥｐｏ）を、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルに添加した。次いで、５０μＬの懸濁細胞を添加し（５０００細胞／ウェル）、プレートを加湿インキュベーター中、３７℃で５％ＣＯ２でインキュベートした。７２時間後、アッセイ培地で１：１００に希釈した５０μＬのメチル−３Ｈ−チミジン（１ｍＣｉ／ｍＬ、２０Ｃｉ／ｍＭｏｌｅ）を添加した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２でさらに４時間インキュベートした。標識された細胞を、ガラスファイバーフィルターマット上に回収し、脱イオン水、および２−プロパノールで洗浄し、乾燥して計数した。各アナログについて測定された反応とｒＨｕＥｐｏ標準の反応との比較によって活性を測定した。次いで、ｉｎ ｖｉｔｒｏを免疫活性によって測定された各アナログの濃度で割ることによって比生物活性を決定した（Ｅｌｌｉｏｔｔら、（１９９６）、Ｂｌｏｏｄ、８７、２７１４）。結果を表２に示す。
【００６６】
【表３】
【実施例２】
【００６７】
組換えヒトエリスロポイエチンおよび高グリコシル化エリスロポイエチンアナログの調製
本明細書中に記載の試験で使用する組換えヒトエリスロポイエチン（ｒＨｕＥｐｏ）を、ヒトエリスロポイエチン遺伝子を保有する組換えプラスミドでトランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞によって発現させた。組換え産物を馴化培地から回収し、本質的にＬａｉら、前出に記載のように精製した。得られたｒＨｕＥｐｏ調製物は、等電点電気泳動によって決定したところ、主に９〜１４個のシアル酸のイソ型を有する。
【００６８】
組換え高グリコシル化エリスロポイエチンアナログを、ＷＯ９１／０５８６７およびＷＯ９４／０９２５７（本明細書中に参照により取込まれる）に記載のＥｐｏアナログ遺伝子を保有する組換えプラスミドでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞中で発現させた。高グリコシル化アナログを、下記のように培養上清から精製した。
【００６９】
馴化培地の濃縮および透析濾過（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）
トランスフェクトＣＨＯ細胞株の３つの連続的回収物（それぞれ５〜８日）由来の馴化培地（無血清）を回収し、０．４５μｍのフィルターでろ過し、１０，０００分子量カットオフメンブランを備えたタンジェンシャルフロー限外濾過システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２０μＭ ＣｕＳＯ４（ｐＨ７．０）中に透析濾過した。透析濾過した培地（ＤＦＭ）を、２回濾過（０．４５μｍ）し、精製に使用するまで−２０℃で保存した。
【００７０】
精製
全ての手順を、２℃〜８℃で行った。
【００７１】
陰イオン交換クロマトグラフィー（１０）
明澄化したＤＦＭを、１０ｍＭビスＴｒｉｓプロパン（ＢＴＰ）（ｐＨ７．０）で平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、６ｃｍ×１８ｃｍ）にかけ、２カラム体積の１０ｍＭ ＢＴＰで洗浄し、全ての非結合種を溶出させた。高グリコシル化アナログが４つ、５つ、または６つのＮ連結炭水化物鎖を有するかどうかに依存して以下の勾配で運転した。この段階で使用した全ての緩衝液は、１ｍＭグリシン、２０μＭ ＣｕＳＯ４、６Ｍ尿素、５μｇ／ｍＬロイペプチン、および１μｇ／ｍＬペプスタチンを含む。４つのＮ連結炭水化物鎖を有するアナログについては、勾配は、１０ｍＭ酢酸、０．１ｍＭ ＮａＣｌ〜５００ｍＭ酢酸、５ｍＭ ＮａＣｌを４９カラム体積分溶出し、高塩条件で２体積分維持するものであった。５つのＮ連結炭水化物鎖を有するアナログについては、勾配は、０．７Ｍ酢酸、７ｍＭ ＮａＣｌ〜１．０Ｍ酢酸、１２ｍＭ ＮａＣｌを３０カラム体積分溶出し、高塩条件で２体積分維持するものであった。４６のＮ連結炭水化物鎖を有するアナログについては、勾配は、１．０Ｍ酢酸、１０ｍＭ ＮａＣｌ〜１．５Ｍ酢酸、２０ｍＭ ＮａＣｌを５０カラム体積分溶出し、高塩条件で２体積分維持するものであった。勾配後、カラムを、２カラム体積分の１０ｍＭ ＢＴＰ（ｐＨ７．０）で洗浄し、高イソ型画分を、０．６Ｍ ＮａＣｌ、１００ｍＭ ＢＴＰ（ｐＨ７．０）で溶出した。
【００７２】
逆相クロマトグラフィー（Ｃ４）
Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（１Ｑ）由来の高塩ストリップを、２０％エタノール、１０ｍＭ ＢＴＰ（ｐＨ７．０）で平衡化したＶｙｄａｃ Ｃ４逆相カラム（３０μｍ粒子、４ｃｍ×１８ｃｍ）にかけ、１０ｍＭ ＢＴＰ（ｐＨ７．０）で緩衝化した９４％エタノールにより３０体積分で勾配させたカラムから溶出させた。エタノールの存在下での凝集の可能性を最小限にするために、プールした産物のピーク（約６０％エタノールでの溶出分）を、４体積分の１０ｍＭ ＢＴＰ（ｐＨ７．０）で希釈した。
【００７３】
陽イオン交換クロマトグラフィー（２Ｑ）
逆相カラムから溶出した希釈溶出物を、１０ｍＭ ＢＴＰ（ｐＨ７．０）で平衡化した第２のＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆｓｔ Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、３ｃｍ×９ｃｍ）カラムにかけた。カラムを、平行化緩衝液で洗浄し、高グリコシル化Ｅｐｏアナログを、０．６Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）で溶出した。
【００７４】
精製したタンパク質を、セントリコン（１０，０００分子量カットオフ）によって２０ｍＭ ＮａＰＯ４（ｐＨ６．０）と交換し、０．２μｍのフィルターで濾過して、２〜８℃で保存した。
【実施例３】
【００７５】
ｒＨｕＥｐｏならびに４つ、５つ、および６つのＮ連結炭水化物鎖を含むｒＨｕＥｐｏアナログのｉｎ ｖｉｖｏ生物活性
４つ、５つ、および６つのＮ連結炭水化物鎖を含むＥｐｏアナログのｉｎ ｖｉｖｏ活性を、過低酸素（ｅｘｈｙｐｏｘｉｃ）赤血球増加症マウスバイオアッセイにおけるｒＨｕＥｐｏの活性と比較した。このアッセイは、外因的に投与した試験サンプルに対する応答におけるマウスのエリスロポイエチン増加の測定により、新規に合成した赤血球への５９Ｆｅの取り込みを定量する。下記のように行ったアッセイは、Ｃｏｔｅｓ ａｎｄ Ｂａｎｇｈａｍ（Ｎａｔｕｒｅ、１９１、１０６５、（１９６１））の修正形態である。
【００７６】
このアッセイでは、雌ＢＤＦ１マウスを、最初に低圧チャンバー（０．４〜０．５ａｔｍ）中の低酸素条件に１日に約１８時間で１４日間の暴露によって予め馴化させる。低酸素条件を代償するために、マウスは、赤血球数増加のための赤血球生成の刺激に応答し、相対的な酸素保有能力を得る。最終低圧暴露の完了後、マウスを、腹腔内注射による試験サンプル投与前に、周囲の気圧に約７２時間維持する。周囲気圧で、マウスは比較的赤血球が増加し、内因性エリスロポイエチン産生および赤血球生成速度の増加に応答する。サンプル投与の５日後、０．２ｍＬの０．２〜０．３μＣｉの５９ＦｅＣｌを、尾静脈に静脈注射する。４８時間後、動物を屠殺し、試験サンプルによるエリスロポイエチンの増加を、全血の０．５ｍＬサンプル中に組込まれた５９Ｆｅの量の測定によって同定する。
【００７７】
ｒＨｕＥｐｏならびに４つ、５つ、または６つのＮ連結炭水化物鎖を含む５つの異なるＥｐｏアナログを、図３に記載のこのアッセイにおいて試験した。各サンプルを、適切な濃度範囲内の６つまたは７つの異なる希釈でアッセイした。全てのサンプルを、０．５％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝化生理食塩水で希釈し、各希釈物の０．４ｍＬを、５匹の予め馴化したマウスに投与した。５９Ｆｅ投与の４８時間後、０．５ｍＬの血液中に組込まれた量を、ガンマ計数によって測定した。各サンプルの結果を、投薬量のｌｏｇに対する組込まれた５９Ｆｅの％としてプロットする。
【００７８】
図３に示すように、このアッセイで試験した５つ全ての高グリコシル化Ｅｐｏアナログは、ｒＨｕＥｐｏより強力である。さらに、各アナログの効力は、Ｎ連結炭水化物鎖の数に直接依存し、アナログの炭水化物鎖数の増加につれて活性が増加した。したがって、６つのＮ連結炭水化物鎖を含むアナログＮ５３が最も強力なアナログであった。同様に、５つのＮ連結炭水化物鎖を含むアナログＮ４７は、４つのＮ連結鎖を含むアナログより強力であった。４つのＮ連結炭水化物鎖を含む３つのアナログ（Ｎ４、Ｎ４８、およびＮ５０）の効力は、互いにほぼ同じであり、ｒＨｕＥｐｏの効力より強力であった。
【００７９】
この実験では、ｒＨｕＥｐｏおよび４０％の５９Ｆｅ組込みを必要とする４つ、５つ、または６つのＮ連結炭水化物鎖を含むアナログの用量は、それぞれ、１０，７００ｎｇ、６４０ｎｇ、１４０ｎｇ、および３８ｎｇであった。この赤血球生成レベルの生成に必要な物質の量に基づいて、４つ、５つ、または６つのＮ連結炭水化物鎖を含むＥｐｏアナログは、ｒＨｕＥｐｏより１７倍、７７倍、および２８０倍強力である。
【実施例４】
【００８０】
ラットおよびビーグル犬におけるｒＨｕＥｐｏおよびＥｐｏアナログＮ４７のＩＶ薬物動態
ＥｐｏＮ４７アナログおよびｒＨｕＥｐｏの薬物動態を比較するために、ラットおよびビーグル犬における２つの異なる研究を行った。
【００８１】
ラットの研究では、１μＣｉ（約０．１μｇのペプチド／ｋｇ）の１２５Ｉ−ＥｐｏＮ４７アナログまたは１２５Ｉ−組換えヒトエリスロポイエチン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）のいずれかを、３１４ｇ〜３６３ｇの正常な雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに手術によって移植した頚動脈カニューレで静脈内注射した。投与後の種々の時点で、０．３ｍＬの血液を採血し、血清を遠心分離によって調製した。０．１ｍＬの各血清サンプルにおける１２５Ｉ−ｒＨｕＥｐｏまたは１２５Ｉ− Ｅｐｏ Ｎ４７アナログのレベルを、９０％エタノールとの４℃で一晩のインキュベーションによって同定した。各血清サンプルにおけるエタノール沈殿タンパク質を遠心分離によって回収し、ガンマカウンターで放射能を測定した。得られた血清濃度対時間の薬物動態学曲線を図４に示す。各ポイントは、Ｎ４７アナログ群の５匹のラットおよびｒＨｕＥｐｏ群の６匹のラットの群平均を示す。薬物動態学的曲線を、ＰＣＮＯＮＬＩＮ４．０非線形回帰分析（統計学的コンサルタント、１９９２）を用いて各ラットについて決定し、各群についての結果を平均した。
【００８２】
【表４】
【００８３】
イヌでの研究では、７．８ｋｇ〜９．５ｋｇの間の重量の正常なビーグル犬の橈側皮静脈に、約２９μＣｉの１２５Ｉ−ｒＨｕＥｐｏまたは１２５Ｉ−Ｎ４７（約０．１μｇペプチド／ｋｇ）を静脈内ボーラス注射した。投与から２４時間後の種々の時点で、約１ｍＬ〜２ｍＬの血液を採血し、血清を調製した。０．１ｍＬ血清中の１２５Ｉ−ｒＨｕＥｐｏおよび１２５Ｉ−Ｎ４７濃度を、上記のように計算した。イヌを用いた研究についての血清濃度対時間の薬物動態曲線を、図５に示す。時点は、各群の２つの動物の群平均である。薬物動態学的パラメーターを、表４にまとめる。
【００８４】
【表５】
【００８５】
ラットおよびイヌの研究では、ｒＨｕＥｐｏおよびＮ４７アナログは、二相性の血清クリアランスを示した。ラットにおけるクリアランスは、ｒＨｕＥｐｏはＥｐｏ Ｎ４７アナログより約３．７倍迅速であり、β半減期はＥｐｏ Ｎ４７アナログはｒＨｕＥｐｏより約２．８倍長かった。イヌを用いた研究における薬物動態学的パラメーターは、おおよそラットで認められたパラメーターと一致した。イヌでは、ｒＨｕＥｐｏのクリアランスは、Ｅｐｏ Ｎ４７アナログより３．５倍速く、Ｅｐｏ Ｎ４７アナログのβ半減期は、ｒＨｕＥｐｏより３．５倍長かった。
【実施例５】
【００８６】
ｒＨｕＥｐｏおよびＥｐｏアナログＮ４７投与後のヘマトクリットの用量反応
週３回（ＴＩＷ）投与でのヘマトクリット用量反応研究
正常なマウスにおけるｒＨｕＥｐｏおよびＥｐｏアナログＮ４７のｉｎ ｖｉｖｏでの生物学的効果を、週に３回で６週間までの腹腔内注射または静脈内注射のいずれかによる用量範囲の投与後に比較した。ヘマトクリットの測定を、眼窩後方（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ）の出血によって週２回行った。
【００８７】
約３０ｇの正常なＣＤ１マウス（群あたり１０〜１３匹）に、ｒＨｕＥｐｏ（０．６２５〜１０μｇペプチド／ｋｇ／用量の用量範囲）、Ｅｐｏ Ｎ４７アナログ（０．１５６〜１．２５μｇペプチド／ｋｇ／用量の用量範囲）、または賦形剤コントロールのいずれかを１週間に３回を全部で６週間腹腔内注射した。賦形剤コントロールおよび種々のｒＨｕＥｐｏおよびＮ４７アナログ投薬調製物用の希釈剤は、０．０２５％マウス血清アルブミンを含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）であった。全てのマウスについてのヘマトクリットを、ベースラインの時点および眼窩後方出血後１週間に２回測定した。実験の終了時に、全ての動物由来の血清を回収し、溶液放射性免疫沈降法によって注射した物質に対する抗体についてアッセイした。中和抗体について負であると判断された動物由来のヘマトクリットデータを、その後の分析に使用した。
【００８８】
図６に示すように、ｒＨｕＥｐｏおよびＥｐｏ Ｎ４７アナログは共に、６週間の研究で用量に依存して増加するが、Ｎ４７アナログは、所与の濃度でｒＨｕＥｐｏと比較してより多いヘマトクリットの増加を促進する。この実験では、Ｅｐｏ Ｎ４７アナログは、腹膜内注射によって１週間に３回投与した場合、約３倍〜４倍強力である。
【００８９】
ｒＨｕＥｐｏおよびアナログＮ４７の用量反応研究を、腹膜内注射と類似の手順を用いた１週間に３回の静脈内注射によって行った。得られた結果は、腹膜内投与の結果に類似し、特に、この研究により、１週間に３回投与した場合、ＥｐｏＮ４７アナログはｒＨｕＥｐｏより強力であることがさらに確認された。
【００９０】
正常なマウスのヘマトクリットの上昇におけるｒＨｕＥｐｏおよびＥｐｏ Ｎ４７アナログの生物活性をより十分に比較および定量するために、実験結果を、相対有効性プロットによっても分析した。各実験について、各用量でのｒＨｕＥｐｏおよびＮ４７アナログの活性を、研究の最初の３８日にわたるヘマトクリットの増加を台形加算（ｔｒａｐｅｚｏｉｄａｌ ｓｕｍｍａｔｉｏｎ）による合計によって決定し、曲線下面積（ＡＵＣ）を得た。次いで、これを、ｌｏｇ用量をμｇペプチド／ｋｇ／週でプロットした。同一または異なる投与経路または投薬頻度で投与された化合物の効力の相違を、関連するｌｏｇ−用量反応直線間の距離の測定によって決定することができる。図７に、２つの異なる経路（腹膜内および静脈内）および２つの異なる投薬スケジュールで投与したｒＨｕＥｐｏおよびＥｐｏ Ｎ４７アナログの活性を比較することによる全ての実験についての相対的な効力データをまとめる。
【００９１】
図７に示すように、１週間に３回投与した場合、Ｅｐｏ Ｎ４７アナログは、静脈内または腹腔内経路のいずれかで注射した場合は同一の効力を示し、１週間に３回腹膜内注射したｒＨｕＥｐｏよりも３．６倍強力であった。
【００９２】
１週間に１回（ＯＷ）の投与でのヘマトクリット用量反応研究
正常なマウスにおけるヘマトクリットの増加でのｒＨｕＥｐｏおよびＥｐｏアナログＮ４７の比較を、腹膜内または静脈内のいずれかの経路での６週間の投与による週に１回の投薬によって行った。
【００９３】
約３０ｇの正常なＣＤ１マウス（群あたり８〜１０匹）を、０．０２５％マウス血清アルブミンを含むＰＢＳで調製した種々の濃度のｒＨｕＥｐｏまたはＥｐｏ Ｎ４７アナログのいずれかまたは賦形剤コントロールを１週間に１回全部で６週間静脈内注射した。アナログ用量は、６．２５〜２５μｇペプチド／ｋｇ／用量範囲で変化し、ｒＨｕＥｐｏの用量は、２５〜２００μｇ／ｋｇ／用量範囲で変化した。全てのマウスのヘマトクリットを、ベースラインおよびその後の１週間に２回の眼窩後方出血によって測定した。実験の終了時に、全ての動物由来の血清を回収し、溶液放射性免疫沈降法によって注射した物質に対する抗体についてアッセイした。中和抗体について負であると判断された動物由来のヘマトクリットデータを、その後の分析に使用した。
【００９４】
図８に示すように、１週間に１回投与した場合、ｒＨｕＥｐｏおよびアナログＮ４７は、正常なマウスのヘマトクリットを増加させることができ、反応を示すために必要なｒＨｕＥｐｏの用量は、アナログＮ４７についての用量よりも有意に多かった。例えば、本実験では、２５μｇペプチド／ｋｇ／週のＮ４７は、６週間で、４１．２ポイントヘマトクリットを増加させ、同用量のｒＨｕＥｐｏは１２．５ポイントしかヘマトクリットを上昇させなかった。
【００９５】
ｒＨｕＥｐｏおよびアナログＮ４７の用量反応研究を、上記と類似の手順を用いた１週間に１回の腹腔内注射によって行った。得られた結果は、静脈内投与の結果と一致し、１週間に１回投与した場合、ｒＨｕＥｐｏと比較してアナログＮ４７の効力がより高いことがさらに確認された。
【００９６】
ｒＨｕＥｐｏおよびＮ４７をそれぞれ１週間に１回投与した場合の活性の相違を定量するために、上記の全ての関連する実験から相対効力プロットを作製した。図７に示すように、１週間に１回投与した場合、静脈内経路および腹膜内経路での注射では、アナログＮ４７は同一の強力を示す。アナログＮ４７は、それぞれ、１週間に１回投与した場合、ｒＨｕＥｐｏより約１４倍の効力である。
【００９７】
さらに、図６のｌｏｇ−用量反応プロットも以下に示す：（１）１週間に１回投与した所与の用量のアナログＮ４７は、３回に分けて投与された（ＴＩＷ）ｒＨｕＥｐｏの合計した１週間あたりの用量と効力はほぼ同一である、（２）１週間位１回（ＱＷ）投与した所与の用量のｒＨｕＥｐｏは、３回に分けて投与した（ＴＩＷ）アナログＮ４７の１週間あたりの用量の合計より約２％しか有効ではなかった、（３）マウスにおいて、アナログＮ４７は、ＴＩＷで投与した場合、ＱＷと比較して約４倍効力が高い。
【００９８】
１週間おきに１回（ＥＯＷ）の投与でのヘマトクリット用量反応研究
また、１週間おきに１回注射した場合にマウスがマトクリットを増加させる能力を評価するために、実験を行った。正常なＣＤ−１マウス（群あたり１０匹）を、０．０２５％のマウス血清アルブミンを含むＰＢＳ中に調製した種々の濃度のＥｐｏ Ｎ４７アナログで１週間に１回または１週間おきに１回のいずれかを全部で約６週間静脈内注射した。アナログＮ４７を、１週間おきに２００、１００、２５μｇ／ｋｇ／用量または１週間に１回１２．５μｇ／ｋｇ／用量のいずれかで投与した。全てのマウスのヘマトクリットを、眼窩後方出血によってベースラインおよびその後１週間に２回測定した。
【００９９】
図９に示すように、アナログＮ４７は、１ヶ月に２回投与した場合でさえ、用量依存性様式で正常なマウスのヘマトクリットを増加させることができる。予想したように、より低頻度で投与した場合、ヘマクリットを増加させるにはより大量のＮ４７アナログが必要である。６週間で、１週間おきに２００μｇ／ｋｇのＮ４７アナログの用量の投与で、１週間に１回１２．５μｇ／ｋｇを投与する場合とほぼ同一の範囲でヘマトクリットが増加した。
【実施例６】
【０１００】
持続的携帯型腹膜透析（ＣＡＰＤ）患者におけるＥｐｏ Ｎ４７アナログおよびｒＨｕＥｐｏのＩＶ薬物動態
ラットおよびビーグル犬におけるｒＨｕＥｐｏと比較してＥｐｏ Ｎ４７アナログの血清半減期が顕著に増加するという見地から、ヒトにおいても増加を認めることができるかどうかを決定することが目的であった。
【０１０１】
１１人の安定なＣＡＰＤ患者（２７歳〜７５歳の７人の男性、４人の女性）について、二重盲式で、無作為の交差デザイン研究を行った。第１の患者群には、１００Ｕ／ｋｇのｒＨｕＥｐｏ（０．５μｇペプチド／ｋｇと等価）を投与し、第２の患者群には０．５μｇペプチド／ｋｇのＥｐｏ Ｎ４７アナログを投与し、両群は単回ボーラス静脈注射として投与した。留置カニューレで静脈血サンプル（３ｍＬ）を、静脈内注射前および静脈内注射から５、１０、１５、３０分後ならびに１、２、５、８、１２、１６、２４、３０、３６、４８、６０、７２、および９６時間後に採血した。２８日の洗い出し期間後、第１の患者群に単回静脈内用量のＥｐｏアナログ Ｎ４７を投与し、第２の患者群に単回静脈用量音ｒＨｕＥｐｏを投与した。第１の治療サイクルで、血液サンプルを得た。血清中のｒＨｕＥｐｏおよびＥｐｏ Ｎ４７アナログのレベルを、ベースラインの内因性Ｅｐｏレベルを差し引いた後にＥＬＩＳＡによって測定した。交差デザイン効果についての判断の後に評価した薬物動態学的パラメーター（平均±ＳＥ）を、表５に示す。血清濃度のＡＵＣを、直線的台形加算を用いて計算した。ｔ１／２Ｚを以下のように定義する：ｌｏｇ（２）／ＫＺ（ＫＺを、ｌｎ（血清濃度）のタイムカーブの末端部分の勾配として計算する）。クリアランス（１）を、用量／ＡＵＣと定義する。分布体積（Ｖｄ）を、Ｃ１／Ｋと定義する。
【０１０２】
【表６】
【０１０３】
Ｅｐｏ Ｎ４７アナログについての平均血清半減期（２５．３時間）は、ｒＨｕＥｐｏ（８．５時間）より３倍長く、クリアランスは、ｒＨｕＥｐｏがアナログＮ４７よりも２．５倍速かった。
【実施例７】
【０１０４】
Ｅｐｏ Ｎ４７アナログの第二相用量所見および用量スケジューリング研究
透析を受けているＣＲＦ患者が皮下または静脈内注射でアナログＮ４７を投与された場合のアナログＮ４７の最適な用量および用量スケジュールを調査するために、多施設で、無作為の、連続的な段階的用量拡大研究を開始する。
【０１０５】
投薬スケジュールを以下に示す。
【０１０６】
１週間に１回の投薬：０．０７５、０．２２５、０．４５、０．７５、１．５および４．５μｇのペプチド／ｋｇ／用量
１週間に３回の投薬：０．０２５、０．０７５、０．１５、０．２５、０．５、および１．５μｇのペプチド／ｋｇ／用量。
【０１０７】
以下の２つのパートからなる研究を行う。第１のパートは、４週間にわたり最適な速度でヘモグロビンが増加する１週間に１回または３回投与されたアナログＮ４７の用量（１ｇ／ｄＬ以上であるが３ｇ／ｄＬ未満）を評価するために設計された段階的用量増加研究である。各研究の第２のパートは、（静脈内または皮下のいずれかの投与経路で１週間に１回または３回投与する場合）治療目標のヘマトクリットを維持するために必要な容量を決定するために設計されている。
【０１０８】
予備的結果は、アナログＮ４７の１週間に１回の投薬を使用して貧血のＣＲＦ患者のヘマトクリットを増加および維持することができることを示す。最初の結果により、両投与経路において、１週間に３回の投薬スケジュールで治療を開始するための好ましい用量は、０．１５および０．２５μｇ／ペプチド／ｋｇ／用量であり、１週間に１回の投薬スケジュールでは０．４５および０．７５μｇ／ペプチド／ｋｇ／用量であることが示唆される。
【０１０９】
本発明は、その好ましい実施形態と考えられるものを記載しているが、本発明は開示の実施形態に制限されず、それどころか、添付の特許請求の範囲の精神および範囲内に含まれる種々の修正形態および等価物を対象とすることが意図され、この範囲は、全てのこのような修正形態および等価物を含めるために最も広範に解釈される。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、エリスロポイエチンの高グリコシル化アナログを用いた哺乳動物におけるヘマトクリットの増加に関する。より詳細には、本発明は、ヘマトクリットを上昇および維持して貧血を治療するのための、組換えヒトエリスロポイエチンと比較してより低頻度の高グリコシル化アナログの投与に関する。本発明はまた、ヘマトクリットを上昇および維持して貧血を治療するための、組換えヒトエリスロポイエチンと比較して等価の投薬頻度でより少量の高グリコシル化アナログの投与に関する。エリスロポイエチンの新規の高グリコシル化アナログもまた提供される。
【０００２】
（発明の背景）
エリスロポイエチン（Ｅｐｏ）は、赤血球前駆細胞の赤血球への成熟に必要な糖タンパク質ホルモンである。これは、腎臓で産生され、循環する赤血球レベルの調節に必須である。低レベルの組織酸素シグナルによって特徴づけられる条件によりＥｐｏの産生を増加させ、赤血球生成を刺激する。例えば、慢性腎不全（ＣＲＦ）に認められるような腎機能低下により、典型的には、Ｅｐｏの産生が減少し、それに伴って赤血球が減少する。
【０００３】
ヒト尿中Ｅｐｏは、Ｍｉｙａｋｅら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５２、５５５８、１９７７）によって、再生不良性貧血患者から精製された。しかし、この供給源から得られた精製Ｅｐｏタンパク質の量は、治療に適用するには不十分であった。ヒトＥｐｏおよび組換えタンパク質をコードする遺伝子の同定およびクローニングは、Ｌｉｎに付与された米国特許第４，７０３，００８号（その開示は本明細書中に参照により取込まれる）で開示された。細胞培地からの組換えヒトエリスロポイエチンの精製法は、Ｌａｉらに付与された米国特許第４，６６７，０１６号（本明細書中に参照により取込まれる）に開示されている。哺乳動物宿主細胞由来の生物活性Ｅｐｏの産生（治療への適用に適切なＥｐｏ量）がはじめて可能となった。さらに、遺伝子配列についての知識および精製タンパク質の利用可能性の増加により、このタンパク質の作用様式がより理解されている。
【０００４】
ヒト尿由来Ｅｐｏ（Ｍｉｙａｋｅら、前出）および哺乳動物細胞で発現する組換えヒトＥｐｏは、糖タンパク質の全分子量の約４０％を含む３つのＮ連結およびＯ連結オリゴ糖鎖を含む。第２４位、第３８位、および第８３位に位置するアスパラギン残基でＮ連結グリコシル化が起こり、第１２６位に位置するセリン残基でＯ連結グリコシル化が起こる（Ｌａｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６１、３１１６、１９８６、Ｂｒｏｎｄｙら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、２６５、３２９、１０８８）。オリゴ糖鎖は、典型的には鎖あたり４つまでのシアル酸を有するＮ連結鎖および２つまでのシアル酸有するＯ連結鎖を有する末端シアル酸残基で修飾されていることが認められている。したがって、Ｅｐｏポリペプチドは、全部で１４個までのシアル酸に適応することができる。
【０００５】
種々の研究で、Ｅｐｏ炭水化物鎖の変更により生物活性に影響を与え得ることが示されている。しかし、１つの研究では、単独かグリコシル化部位であるアスパラギンまたはセリン残基の変異誘発によるＮ連結またはＯ連結オリゴ糖鎖の除去により、哺乳動物細胞において産生されたＥｐｏのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性の変化が急激に減少する（Ｄｕｂｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３、１７５１６、１９８８）。しかし、ＤｅＬｏｒｍｅら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３１、９８７１〜９８７６、１９９２）は、ＥｐｏのＮ連結グリコシル化部位の除去により生物活性がｉｎ ｖｉｖｏで減少するが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで減少しないことを報告した。
【０００６】
Ｅｐｏのシアル酸含有量とｉｎ ｖｉｖｏでの生物活性との間の関係は、単離Ｅｐｏイソ型のｉｎ ｖｉｖｏ活性の測定により開示された。単離Ｅｐｏイソ型の等モルの濃縮物の正常なマウスのヘマトクリットを上昇させる能力によって測定したところ、Ｅｐｏ分子あたりのシアル酸含有量の段階的増加により、対応するｉｎ ｖｉｖｏでの生物活性を段階的に増加することが見出された（Ｅｇｒｉｅら、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ．、１０、２６３、１９９３）。より高いシアル酸を含有するＥｐｏイソ型はまた、より長い血清半減期を示すがＥｐｏレセプターに対する親和性が減少した。これは血清の半減期がｉｎ ｖｉｖｏ生物活性の重要な決定因子であることを示唆している。
【０００７】
Ｅｐｏポリペプチドにおける新規のグリコシル化部位の導入により、さらなる炭水化物鎖を有する分子を産生することができる。ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／０５８６７およびＷＯ９４／０９２５７（その全体が参考として援用される）を参照のこと。少なくとも１つのさらなるＮ連結炭水化物鎖および／または少なくとも１つのさらなるＯ連結炭水化物鎖を有するＥｐｏグリコシル化アナログが開示されている。１つのさらなるＮ連結鎖を有するグリコシル化アナログは、組換えヒトＥｐｏ（ｒＨｕＥｐｏ）（イソ型９〜１４）および分子あたり１４個のシアル酸を有するｒＨｕＥｐｏの精製イソ型と比較してより長い循環半減期を有することが測定された。
【０００８】
組換えヒトエリスロポイエチン（ｒＨｕＥｐｏ）の投与は、末期腎疾患の貧血患者の赤血球レベルの上昇に有効である（Ｅｓｃｈｂａｃｈら、Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３１６、７３〜３８、１９８７）。その後の研究では、ｒＨｕＥｐｏでの治療により種々の他の条件に伴う貧血を治癒することができることが示されている。（Ｆｉｓｃｈｌら、Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３２２、１４８８〜１４９３、１９９０、Ｌａｕｐａｃｉｓ、Ｌａｎｃｅｔ、３４１、１２２８〜１２３２、１９９３）。ＣＲＦに伴う貧血、ＨＩＶ感染患者におけるＡＺＴ（ジドブジン）治療に関する貧血、化学療法を受けた骨髄性悪性腫瘍を有さない患者の貧血、同種異系間の輸血の必要性を減少させるための手術を受けた患者の貧血の治療におけるｒＨｕＥｐｏの使用について規制当局の許可が下りている。全ての承認された適応症（手術適応症を除く）についての現在の治療には、推奨された目標ヘマトクリット範囲に到達させるための、静脈内（ＩＶ）または皮下（ＳＣ）注射のいずれかによって投与された１週間に３回の５０〜１５０単位／ｋｇの開始用量が含まれる。手術適応症については、毎日、手術前の１０日間、手術日、および術後４日間にｒＨｕＥｐｏ（ＥＰＯＧＥＮ（登録商標）Ｐａｃｋａｇｅ Ｉｎｓｅｒｔ、１２／２３／９６）を投与する。一般に、現在推奨されているｒＨｕＥｐｏの開始投与量により、約６週間から８週間でヘマトクリットが目標範囲に上昇する。一旦目標ヘマトクリット範囲が達成されると、維持投薬スケジュールが確立し、これは患者に依存して変化するが、典型的には、ＣＲＦを有する貧血患者では１週間に３回である。上記のｒＨｕＥｐｏの投与は、貧血の治療に有効で十分に耐えられる投薬計画である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第４，７０３，００８号
【特許文献２】米国特許第４，６６７，０１６号
【特許文献３】国際公開第９１／０５８６７号
【特許文献４】国際公開第９４／０９２５７号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｍｉｙａｋｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５２、５５５８、１９７７
【非特許文献２】Ｌａｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６１、３１１６、１９８６
【非特許文献３】Ｂｒｏｎｄｙら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、２６５、３２９、１０８８
【非特許文献４】Ｄｕｂｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３、１７５１６、１９８８
【非特許文献５】ＤｅＬｏｒｍｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３１、９８７１〜９８７６、１９９２
【非特許文献６】Ｅｇｒｉｅら、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ．、１０、２６３、１９９３
【非特許文献７】Ｅｓｃｈｂａｃｈら、Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３１６、７３〜３８、１９８７
【非特許文献８】Ｆｉｓｃｈｌら、Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３２２、１４８８〜１４９３、１９９０
【非特許文献９】Ｌａｕｐａｃｉｓ、Ｌａｎｃｅｔ、３４１、１２２８〜１２３２、１９９３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ｒＨｕＥｐｏより効力の高い治療を有することが望ましいであろう。このような分子に対する利点は、低頻度および／または低用量で投与することができることであろう。現在の治療では、ＥＰＯＧＥＮ（登録商標）を、貧血患者には１週間に３回の投与および手術患者には１日１回の投与を必要とする。低頻度の投薬スケジュールは、医師および患者双方に、特に、医師のオフィスまたはクリニックに定期的に来診しない患者またはＥｐｏを自己注射する患者に好都合である。より有効な分子の別の利点は、患者へのより少量の薬物投与で類似のヘマトクリット増加が得られることである。
【００１２】
したがって、本発明の目的は、低頻度の投薬スケジュールを可能にする貧血治療用のより有効な分子を特定することである。本発明のさらなる目的は、より低用量で投与した場合、少なくともＥｐｏと匹敵するレベルでヘマトクリットを増加および維持する分子を提供することである。本発明の目的はまた、より低頻度の投薬用に選択されたこれらの分子がｒＨｕＥｐｏと少なくとも同様の耐性を示し、患者によっては潜在的により有効に耐性を示すことである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
Ｎ４７と命名されている高グリコシル化Ｅｐｏアナログ（Ａｓｎ３０Ｔｈｒ３２Ｖａｌ８７Ａｓｎ８８Ｔｈｒ９０Ｅｐｏ）は、ｒＨｕＥｐｏと同用量かつ同頻度で投与された場合、組換えヒトエリスロポイエチン（ｒＨｕＥｐｏ）よりも長い血清半減期およびより高いｉｎ ｖｉｖｏ活性を有することが見出された。さらに、このアナログは、１週間に１回の投与でマウスのヘマトクリットの上昇させることが示されており、これは、ｒＨｕＥｐｏを１週間に３回投与した場合のヘマトクリットの上昇に匹敵する。マウスおよびヒトに投与したＥｐｏアナログＮ４７の薬物動態と類似であった。
【００１４】
本発明は、薬学的組成物中の治療有効量のエリスロポイエチンの高グリコシル化アナログを投与する工程を包含する哺乳動物におけるヘマトクリットの上昇および維持法であって、等モル量の組換えヒトエリスロポイエチンより低頻度で前記アナログを投与して目標に匹敵するヘマトクリットを得る方法を提供する。患者の最適なヘマトクリット範囲に到達するための本発明の投薬頻度は、１週間に３回未満である。投薬頻度は、１週間に２回、１週間に１回、または１週間に１回未満（１週間おきに１回、１ヶ月に１回、または２カ月おきに１回など）であり得る。患者の目標ヘマトクリットを維持するために必要な投薬頻度は、１週間に３回未満である。投薬頻度は、１週間に２回、１週間に１回、または１週間に１回未満（２週間おきに１回、１ヶ月に１回、または２週間おきに１回）であり得る。
【００１５】
本発明はまた、治療有効量のＥｐｏ高グリコシル化アナログを投与する工程を包含する哺乳動物におけるヘマトクリットの上昇および維持法であって、組換えヒトエリスロポイエチンより低いモル量で前記アナログを投与して目標に匹敵するヘマトクリットを得る方法を提供する。
【００１６】
１週間に３回未満の投薬頻度に適切であるＥｐｏの高グリコシル化アナログを含む薬学的組成物もまた提供する。この組成物は、Ｅｐｏの高グリコシル化アナログの使用に適切な薬学的に許容可能なアジュバントを含む。
【００１７】
本発明を、赤血球レベルを減少させる任意の条件（腎機能の衰退または低下、（慢性腎不全）骨髄抑制療法、癌、ウイルス感染、慢性疾患、および手術中の過剰な出血）で使用することができる。１つの実施形態では、１週間に１回の投薬またはそれ以下の頻度の投薬を用いた治療は、慢性腎不全に起因する貧血用である。
【００１８】
Ｅｐｏの新規の高グリコシル化アナログもまた提供する。アナログは、ｒＨｕＥｐｏと比較して少なくとも１つのさらなる炭水化物鎖を含み、少なくとも１つのＮ連結炭水化物鎖は第５２位、第５３位、第５５位、第８６位、および第１１４位のいずれかに付加されている。新規の高グリコシル化アナログは、２つ、３つ、または４つのさらなる炭水化物鎖を有しても、４つを超えるさらなる鎖を有してもよい。
【００１９】
（図面の説明）
図１は、ヒトエリスロポイエチンのアミノ酸配列を示す図である。
【００２０】
図２は、無血清培地中でのＣＨＯ細胞発現由来のｒＨｕＥｐｏおよびＥｐｏの高グリコシル化アナログのウェスタンブロット分析を示す図である。アナログＮ５３およびＮ６１の構築を、実施例１に記載する。各アナログのＮ連結炭水化物鎖数を示す。
【００２１】
図３は、非低酸素（ｅｘｈｙｐｏｘｉｃ）赤血球増加症マウスバイオアッセイにおけるｒＨｕＥｐｏ、ＥｐｏアナログＮ４、Ｎ１８、およびＮ５０（４つのＮ連結炭水化物鎖を含む）、Ｎ４７（５つのＮ連結炭水化物鎖を含む）、Ｎ５３（６つのＮ連結炭水化物鎖を含む）の活性を比較した図である。実験手順を、実施例３に示す。各ポイントは、５匹の動物の平均応答を示す。アナログＮ４、Ｎ１８、およびＮ４７は、ＷＯ９４／０９２５７に以前に示されている。
【００２２】
図４は、静脈内注射（ＩＶ）によって正常なラットに投与したｒＨｕＥｐｏおよびＥｐｏアナログＮ４７の血清半減期を比較した図である。実験手順を、実施例４に示す。結果は、各群の平均（±ＳＤ）である。
【００２３】
図５は、静脈内注射（ＩＶ）によってビーグル犬に投与したｒＨｕＥｐｏおよびＥｐｏアナログＮ４７の血清半減期を比較した図である。実験手順を、実施例４に示す。結果は、各群の平均（±ＳＤ）である。
【００２４】
図６は、１週間に３回（ＴＩＷ）を６週間腹腔内注射によって投与した種々の用量のｒＨｕＥｐｏまたはＥｐｏアナログＮ４７に対する応答によるマウスのヘマトクリットの増加を示す図である。実験手順を、実施例５に示す。結果は、各用量群についてのヘマトクリット変化の群平均（±ＳＤ）を示す。
【００２５】
図７は、１週間に１回（ＱＷ）または１週間に３回（ＴＩＷ）の投与頻度で、腹腔内（ＩＰ）または静脈内（ＩＶ）経路によって注射されたｒＨｕＥｐｏおよびＥｐｏアナログＮ４７のマウスにおける相対効力を比較した図である。実験手順を、実施例５に示す。各ポイントは、以下の個々の実験由来のデータの平均（±ＳＤ）を示す：Ｎ４７、ＩＰ、ＴＩＷ（ｎ＝５）；Ｎ４７、ＩＶ、ＴＩＷ（ｎ＝１）；Ｎ４７、ＩＰ、ＱＷ（ｎ＝２）；Ｎ４７、ＩＶ、ＱＷ（ｎ＝３）；ｒＨｕＥｐｏ、ＩＰ、ＴＩＷ（ｎ＝５）；ｒＨｕＥｐｏ、ＩＶ、ＱＷ（ｎ＝２）。各実験では、用量あたり７〜１３匹のマウスを使用した。
【００２６】
図８は、１週間に１回（ＱＷ）を６週間静脈内注射によって投与した種々の用量のｒＨｕＥｐｏまたはＥｐｏアナログＮ４７に対する応答によるマウスのヘマトクリットの増加を示す図である。実験手順を、実施例５に示す。結果は、各用量群についてのヘマトクリットの変化の群平均（±ＳＤ）を示す。
【００２７】
図９は、１週間に１回（ＱＷ）または１週間おきに１回（ＥＯＷ）を約６週間静脈内（ＩＶ）注射によって投与した種々の用量のｒＨｕＥｐｏまたはＥｐｏアナログＮ４７に対する応答によるマウスのヘマトクリットの増加を示す図である。実験手順を、実施例５に示す。結果は、各用量群についてのヘマトクリット変化の群平均（±ＳＤ）を示す。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】ヒトエリスロポイエチンのアミノ酸配列を示す図である。
【図２】無血清培地中でのＣＨＯ細胞発現由来のｒＨｕＥｐｏおよびＥｐｏの高グリコシル化アナログのウェスタンブロット分析を示す図である。
【図３】非低酸素（ｅｘｈｙｐｏｘｉｃ）赤血球増加症マウスバイオアッセイにおけるｒＨｕＥｐｏ、ＥｐｏアナログＮ４、Ｎ１８、およびＮ５０（４つのＮ連結炭水化物鎖を含む）、Ｎ４７（５つのＮ連結炭水化物鎖を含む）、Ｎ５３（６つのＮ連結炭水化物鎖を含む）の活性を比較した図である。
【図４】静脈内注射（ＩＶ）によって正常なラットに投与したｒＨｕＥｐｏおよびＥｐｏアナログＮ４７の血清半減期を比較した図である。
【図５】静脈内注射（ＩＶ）によってビーグル犬に投与したｒＨｕＥｐｏおよびＥｐｏアナログＮ４７の血清半減期を比較した図である。
【図６】１週間に３回（ＴＩＷ）を６週間腹腔内注射によって投与した種々の用量のｒＨｕＥｐｏまたはＥｐｏアナログＮ４７に対する応答によるマウスのヘマトクリットの増加を示す図である。
【図７】１週間に１回（ＱＷ）または１週間に３回（ＴＩＷ）の投与頻度で、腹腔内（ＩＰ）または静脈内（ＩＶ）経路によって注射されたｒＨｕＥｐｏおよびＥｐｏアナログＮ４７のマウスにおける相対効力を比較した図である。。
【図８】１週間に１回（ＱＷ）を６週間静脈内注射によって投与した種々の用量のｒＨｕＥｐｏまたはＥｐｏアナログＮ４７に対する応答によるマウスのヘマトクリットの増加を示す図である。
【図９】１週間に１回（ＱＷ）または１週間おきに１回（ＥＯＷ）を約６週間静脈内（ＩＶ）注射によって投与した種々の用量のｒＨｕＥｐｏまたはＥｐｏアナログＮ４７に対する応答によるマウスのヘマトクリットの増加を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、薬学的組成物中の治療有効量のエリスロポイエチンの高グリコシル化アナログを投与する工程を包含する、ヘマクリットの上昇および維持法を提供する。このアナログを、等モル量のｒＨｕＥｐｏよりも低頻度で投与して、目標に匹敵するヘマトクリットを得る。本発明はまた、ｒＨｕＥｐｏより低モル量で高グリコシル化アナログを投与して目標に匹敵するヘマトクリットを得る、ヘマトクリットの上昇および維持法を提供する。この組成物を、静脈内、皮下、または腹腔内経路によって投与することができる。
【００３０】
驚いたことに、アナログＮ４７（ＷＯ９７／０９２５７に記載の高グリコシル化Ｅｐｏアナログ）は１週間に１回の投与でｒＨｕＥｐｏでは１週間に３回の投与で認められるヘマトクリット増加を達成することができることを見出した。アナログＮ４７は、以下のアミノ酸の変化を有する：第３０位でのｔｒｐのａｓｎへの変化、第３２位でのｈｉｓのｔｈｒへの変化、第８７位でのｐｒｏのｖａｌへの変化、第８８位でのｔｒｐのａｓｎへの変化、第９０位でのｐｒｏのｔｈｒへの変化（この変化により、第３０位および第８８位のアスパラギンでさらに２つのＮ連結炭水化物鎖が得られる）。アナログを、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中で発現させ（実施例１に記載）、実施例２に記載のように精製して１７〜２２個のシアル酸のイソ型を得た。アナログＮ４７は、静脈内注射した場合、ラットおよびビーグル犬でｒＨｕＥｐｏより長い血清半減期を示した（図４および図５）。１週間に３回腹腔内注射した場合、Ｎ４７は、より低濃度でｒＨｕＥｐｏと類似の正常なマウスのヘマトクリットの増加を誘導する（図６）。Ｎ４７の効力は、１週間に３回投与した場合、ｒＨｕＥｐｏより約３〜４倍高いことが示された（図６および図７）。類似の用量で１週間に１回投与した場合、ｒＨｕＥｐｏは、正常なマウスのヘマトクリットをほとんど刺激せず、Ｎ４７では著しい増加を示した（図８）。Ｎ４７の効力は、１週間に１回の投薬でｒＨｕＥｐｏより約１４倍高かった（図７）。有意に、１週間に１回のアナログＮ４７投与についてのヘマトクリット反応は、１週間に３回のｒＨｕＥｐｏ投与に相当する。１週間おきに投与した場合でさえも、Ｎ４７は正常なマウスにおけるヘマトクリットを有意に増加させた（図９）。まとめると、データは、Ｅｐｏ高グリコシル化アナログ、特にアナログＮ４７、を使用してｒＨｕＥｐｏを用いた現在の治療よりも低頻度の投薬でヘマトクリットを有利に上昇させることができることを示した。
【００３１】
マウスにおいて得られた上記の結果によってヒトに対する推定を行うことができることもまた示された。１１人の持続的携帯型腹膜透析（ＣＡＰＤ）患者に対するｒＨｕＥｐｏおよびアナログＮ４７の投与についての薬物動態学的パラメーターは、ｒＨｕＥｐｏより３倍長い血清半減期を有する（実施例６および表５）。これらの結果は、Ｅｐｏ高グリコシル化アナログにより、ヒトにおいてｒＨｕＥｐｏより低頻度の投薬が可能となることを示唆する。
【００３２】
本明細書中で使用されるとき、用語「高グリコシル化Ｅｐｏアナログ」は、さらなる炭水化物鎖を有する少なくとも１つのさらなるグリコシル化部位を含むＥｐｏをいう。グリコシル化部位は、Ｎ連結またはＯ連結炭水化物鎖用であり得る。ポリペプチド鎖中のＮ連結炭水化物付加のためのコンセンサス部位（アミノ酸Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）をコードするために、ＤＮＡ配列の変更によって新規のＮ連結グリコシル化部位を導入するか、あるいはセリンまたはトレオニン残基をコードするためのＤＮＡ配列の変更によって新規のＯ連結部位を導入する。グリコシル化に利用可能なＥｐｏポリペプチドの部位を増加または変化させるアミノ酸残基の付加、欠失、または置換を導入するための変異誘発技術によって、アナログを構築する。Ｅｐｏ高グリコシル化アナログをコードするＤＮＡを、真核生物宿主細胞にトランスフェクトして、発現した糖タンパク質をさらなる炭水化物鎖の存在について分析する。
【００３３】
Ｅｐｏの高グリコシル化アナログは、ｒＨｕＥｐｏで測定されたものと類似であるかより低いｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を示し、これは、炭水化物鎖の付加によってＥｐｏレセプターへの結合が促進されず、場合によっては減少し得ることが示唆される。しかし、高グリコシル化は、典型的には、血清の半減期を増加させ、潜在的にｉｎ ｖｉｖｏでの生物活性を増加させることができる。第８８位にさらなるＮ連結炭水化物鎖を有する１つのＥｐｏアナログは、ｒＨｕＥｐｏ（イソ型９〜１４）または分子あたり１４個のシアル酸を有するｒＨｕＥｐｏの精製イソ型と比較してレセプターに対する親和性が減少するが、Ｅｐｏイソ型９〜１４の混合物または単離Ｅｐｏイソ型１４のいずれかと比較してより長い循環半減期を示し、ｉｎ ｖｉｖｏ活性が増加する。
【００３４】
本発明にしたがって投与することができるＥｐｏの高グリコシル化アナログは、少なくとも１つのさらなるＮ連結またはＯ連結炭水化物鎖を有する。１つの実施形態では、アナログは、２つのさらなるＮ連結炭水化物鎖を有する。１つの他の実施形態では、アナログは、３つ、４つ、またはそれ以上のさらなるＮ連結炭水化物鎖を有する。例として、本発明のアナログは、ヒトＥｐｏ配列の第３０位、第５１位、第５７位、第６９位、第８８位、第８９位、第１３６位、および第１３８位の１つまたは複数のアミノ酸残基に少なくとも１つのさらなるＮ連結鎖を有する。１つの実施形態では、アナログは、ヒトＥｐｏの第３０位および第８８位の残基にさらなるＮ連結炭水化物鎖を有する。ヒトＥｐｏのアミノ酸残基数を、図１および配列番号１に示す。図１は、１６６アミノ酸の推定成熟Ｅｐｏポリペプチドを示すのに対して、Ｃ末端アルギニン残基の除去後の組換えＥｐｏは１６５アミノ酸を有する。これは、ｒＨｕＥｐｏおよび高グリコシル化Ｅｐｏアナログが１６５個または１６６個のアミノ酸のいずれかを有し得ると理解される。
【００３５】
本発明のアナログは、少なくとも４つのＮ連結炭水化物鎖を有する。４つの鎖のうちの３つは、第２４位、第３８位、および第８３位で天然に存在する部位であり得る。しかし、本発明のいくつかのアナログは、１つまたは複数の部位が欠失して新規の部位で置換されるように、１つまたは複数の天然に存在するグリコシル化部位が変更し得ることが意図される。このようなアナログも、本発明によって得られる。例えば、第２４位、第３８位、および第８３位での任意の部位を欠失させて第８８位の部位と置換することができる。任意に、アナログは、第１２６位にＯ連結部位を有し得る。
【００３６】
本発明はまた、少なくとも１つのさらなる炭水化物鎖を有する新規のＥｐｏ高グリコシル化アナログを提供する。さらなるＮ連結炭水化物鎖を第５２位、第５３位、第５５位、第８６位、および第１１４位のいずれかに付加してこれらがグリコシル化部位として修飾されていることを見出した。表１に記載のように、特定の実施形態にはＮ４９〜Ｎ６１のアナログが含まれる。新規のアナログは、第５２位、第５３位、第５５位、第８６位、および第１１４位のいずれかに少なくとも１つの新規のＮ連結グリコシル化部位を有し、さらに、他の部位にさらなるＮ連結またはＯ連結炭水化物鎖を含むことができる。アナログは、１つ、２つ、３つ、または４つのさらなる炭水化物鎖を有するか、４つを超えるさらなる鎖を有することができる。１つの好ましい実施形態では、アナログは、３つのさらなるＮ連結炭水化物鎖（全部で６つのＮ連結鎖）を有する。別の好ましい実施形態では、アナログは４つのさらなるＮ連結鎖（全部で７つのＮ連結鎖）を有する。３つもしくは４つまたは４つを超えるさらなるＮ連結炭水化物鎖を有するアナログは、第５２位、第５３位、第５５位、第８６位、および第１１４位のいずれかにさらなる鎖を有することができるが、これらに限定されない。
【００３７】
驚いたことに、第３０位、第５３位、および第８８位に３つのさらなるＮ連結鎖を有する高グリコシル化アナログ（全部で６つのＮ連結鎖）は、２つのさらなる鎖（全部で５つの鎖）を有するアナログＮ４７よりｉｎ ｖｉｖｏ活性が高いことが見出された。結果を図３に示す。アナログのｉｎ ｖｉｖｏ活性がＮ連結炭水化物鎖数に直接依存することは明白である。これらの結果により、Ｎ４７よりも多数のＮ連結炭水化物鎖を有するアナログをさらに低頻度で投薬することができる治療設定を推定することができる。
【００３８】
当業者が利用可能な種々の変異誘発技術（部位特異的変異誘発、ＰＣＲ変異誘発、およびカセット変異誘発）（Ｚｏｌｌｅｒら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．、１００、４６８〜５００、（１９８３）、Ｈｕｇｕｃｈｉ、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、１７７〜１８３、（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、１９９０、Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ、３４、３１５〜３２３、（１９８５）など）によって、アナログを調製することができる。実施例１は、新規のＥｐｏ高グリコシル化アナログを構築するためのＰＣＲ変異誘発技術の使用を記載している。
【００３９】
変異誘発を受けたＥｐｏＤＮＡ配列を、哺乳動物宿主細胞中での維持に適切なベクターを用いる標準的な技術を用いて発現ベクターに挿入する。典型的には、ベクターは、以下のエレメントを含む：プロモーターおよび他の「上流」調節エレメント、複製起点、リボゾーム結合部位、転写終結部位、ポリリンカー部位、および哺乳動物宿主での使用に適合し得る選択マーカー。ベクターはまた、真核生物宿主細胞においても同様に増殖および維持することができるエレメントを含むことができる。
【００４０】
適切な細胞または細胞株は、ヒト供給源を含む哺乳動物供給源由来の任意の細胞を含む。例として、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ受諾番号ＣＲＬ１６５１）、ヒト２９３、胎児ハムスター卵巣細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ受諾番号ＣＣＬ１０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）欠乏細胞、Ｕｒｌａｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７、４２１６〜４２２０、１９８０）が含まれる。他の適切な哺乳動物細胞株には、ＨｅＬａ、マウスＬ−９２９、および３Ｔ３が含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、ＤＨＦＲ欠乏ＣＨＯ細胞を使用する。
【００４１】
Ｅｐｏ高グリコシル化アナログをコードする配列を含むベクターを、標準的な形質転換技術またはトランスフェクション技術によって移入する。形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞の培養、増幅、およびスクリーニングを、公的に利用可能な方法（Ｇｅｔｈｉｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、２９３、６２０〜６２５、（１９８１）、Ｋａｕｆｍａｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５、１７５０〜１７５９、（１９８５）、米国特許第４，４１９，４４６号）を用いて行う。Ｅｐｏ高グリコシル化アナログをコードする配列を保有する宿主細胞を、アナログが発現できる条件下で培養する。アナログを、本質的に以前に記載（ＷＯ９４／０９２５７）および実施例２に記載の手順を用いて細胞培地から回収および精製する。精製手順により、さらなる炭水化物鎖の付加に起因するより大量にシアル酸を含むＥｐｏの単離が可能になる。
【００４２】
Ｅｐｏ高グリコシル化アナログには、新規のグリコシル化部位に加えて、新規のグリコシル化部位を作製せず、高グリコシル化アナログの生物活性を実質的に変化させないアミノ酸残基の付加、欠失、または置換を含み得る。生物活性に影響を与えることなく変化し得るＥｐｏのこれらの個々の部位または領域を、Ｓｙｅｄら、Ｎａｔｕｒｅ、３９５、５１１、１９９８に記載のＥｐｏ−Ｅｐｏレセプター複合体の構造試験によって特定することができる。Ｅｐｏ−Ｅｐｏレセプター複合体の構造試験によってＥｐｏのレセプター結合部位と相互作用するか密接に近位である残基、およびＥｐｏアミノ酸配列の変更時に回避すべき残基が明らかになる。あるいは、アラニンスキャニング変異誘発（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４、１０８１〜１０８５、（１９８９））によるアミノ酸置換耐性を示す領域を経験的に特定することができる。この方法では、選択したアミノ酸残基を、それぞれ、中性アミノ酸（例えば、アラニン）で置換して生物活性に対する影響を測定する。
【００４３】
保存的アミノ酸変化は、ポリペプチドの構造および／または機能をほとんど変化させないと一般的に認識されている。したがって、本発明は、Ｅｐｏ高グリコシル化アナログ内に１つまたは複数の保存的アミノ酸変化を含む。保存的アミノ酸変化は、一般的には、あるアミノ酸と構造および／または機能が類似する別のアミノ酸（例えば、サイズ、電荷、および形態の類似する側鎖を有するアミノ酸）との置換を含む。これらの変化の性質は、当業者に周知であり、以下の表１にまとめられている。このような保存的置換を、「好ましい置換」の見出しで示す。移入することができるより多くの実質的な変化（「例示的置換」）も意図される。当業者は、最初にこの部位が比較的保存的な様式での置換によって修飾されるべきであることを認識する。このような置換によって生物活性が保存される場合、より多数の置換的変化（例示的置換）を移入することができ、そして／または他の付加／欠失を行って得られた産物をスクリーニングすることができる。
【００４４】
【表１】
【００４５】
本発明はまた、生物活性に実質的に影響を与えない、高グリコシル化Ｅｐｏアナログのアミノ酸の欠失または付加も提供する。このような付加および欠失は、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に存在するか、その内部に存在する。一般に、比較的小さな欠失または付加は、Ｅｐｏまたは高グリコシル化アナログの構造および／または機能にほとんど影響を与えない。１つの実施形態では、欠失または付加は、５〜１０残基であるか、２〜５アミノ酸残基、または１〜２残基であり得る。
【００４６】
用語「モル量」は、対応するグリコシル化を含まないエリスロポイエチンポリペプチドの分子量に基づいた高グリコシル化アナログまたはｒＨｕＥｐｏの量をいう。ｒＨｕＥｐｏおよびアナログの等量は、このような量を測定するのに使用される手順の通常の変形を考慮した場合に等しい量をいう。ｒＨｕＥｐｏおよびアナログの分子量が炭水化物鎖数に依存して変化するので、この方法によって等量を同定する必要がある。ｒＨｕＥｐｏについては、エリスロポイエチンポリペプチドの分子量は、図１および配列番号１に記載の１〜１６５のアミノ酸残基に基づいて計算される。高グリコシル化アナログについては、分子量は、図１および配列番号１に記載の残基１〜１６５のアミノ酸変化に依存して調整される。
【００４７】
高グリコシル化アナログの投薬頻度は、治療条件および標的ヘマトクリットに依存して変化するが、一般に、１週間に３回未満である。投薬頻度は、１週間に約２回、１週間に約１回である。投薬頻度はまた、１週間に１回未満（例えば、２週間おきに約１回（１４日に約１回）、１ヶ月に１回、または２カ月おきに１回）であり得る。実際に使用される投薬頻度は、Ｅｐｏアナログに対する種々の個体の応答が様々であるので、本明細書中に開示の頻度はいくらか変化し得ることが理解される。用語「約」は、このような変形を反映することが意図される。
【００４８】
本明細書中で使用される、用語「治療有効量」は、目標ヘマトクリットまたは患者に利益を与える目標ヘマトクリット範囲に対するヘマトクリットを増加させるか、目標ヘマトクリットでまたは目標ヘマトクリットの範囲内を患者が維持する高グリコシル化アナログの量をいう。この量は、個体によって変化し、患者の全体的な体調、貧血の重症度および根底にある原因、ならびに個々の患者の最終的な目標ヘマトクリットを含む多数の因子に依存する。目標ヘマトクリットは、典型的には、少なくとも３０％または３０％〜３８％の範囲内、好ましくは３８％以上、より好ましくは４０％〜４５％である。ｒＨｕＥｐｏについての目標ヘマトクリット範囲に関する一般的なガイドラインはまた、１９９６年１２月２３日付けのＥＰＯＧＥＮ（登録商標）パッケージインサートにも見出されており、３０％〜３６％、または３２％〜３８％であると記載されている。このような目標は個体によって変化するので、医師の裁量によって患者に投与される実際の目標ヘマトクリットが任意に決定されることが適切であり得ることが理解される。それにもかかわらず、目標ヘマトクリットの決定は、十分に当業者のレベル内である。
【００４９】
本発明の組成物の治療有効量は、当業者が容易に確認することができる。実施例６は、１週間に１回および１週間に３回の投薬におけるアナログＮ４７の治療有効量を決定するための１つの目的を有する臨床プロトコールを示す。１週間に１回の投与について投薬範囲は、約０．０７５μｇ〜約４．５μｇエリスロポイエチン／ｋｇ／用量である。１週間に３回の投与についての投薬範囲は、約０．０２５μｇ〜約１．５μｇエリスロポイエチン／ｋｇ／用量である。この投薬範囲を、当業者における日常の投薬範囲で、任意の調整物を含む他のＥｐｏ高グリコシル化アナログと使用することができる。
【００５０】
本発明のすぐれた有利な点は、投与される用量または投薬スケジュールによってＥｐｏアナログを「調整する」ことができる、高グリコシル化の範囲が投薬量または投薬間隔のいずれかに相関する能力である。図３に示すように、１つ、２つ、または３つのさらなる炭水化物鎖を有するＥｐｏアナログのｉｎ ｖｉｖｏ活性の増加に基づいて、治療を行う医師は、治療する貧血の状態に適切で便利なアナログを選択することができる。例えば、急性貧血でより大量の有効量を必要とする患者または長期治療を必要とする患者では、３つもしくは４つまたは４つを超えるさらなる炭水化物鎖を有する高グリコシル化アナログの投与が好ましい。あまり重篤でない貧血の患者または比較的単息の治療期間を必要とする患者では、１つまたは２つのさらなる炭水化物鎖を有するアナログが好ましい。本発明のアナログにより、広範な種々の根底となる条件に起因し得る貧血の予防および治療に医師がかなり柔軟に対応できる。本発明はまた、治療中の赤血球生成の増加を維持するための治療有効量の鉄の投与を提供する。投与量を、ｒＨｕＥｐｏを用いた治療に基づいて当業者が容易に決定することができる。
【００５１】
本発明を使用して、赤血球産生を刺激し、貧血を予防および治療することができる。本発明によって治療可能な病状には、腎機能の衰退または低下（慢性腎不全）に伴う貧血、骨髄抑制療法（化学療法または高ウイルス薬（ＡＺＴ）など）に伴う貧血、非骨髄癌の進行に伴う貧血、ウイルス感染（ＨＩＶなど）に伴う貧血、および慢性疾患に伴う貧血が含まれる。それ以外は健常な個体の貧血（予想される手術中の出血など）を引き起こし得る状態も治療可能である。一般に、ｒＨｕＥｐｏで治療可能な任意の病状もまた、本発明のＥｐｏ高グリコシル化アナログを用いて治療することができる。
【００５２】
本発明はまた、薬学的に許容可能な希釈剤、キャリア、可溶化剤、乳化剤、防腐剤、および／またはアジュバントと共に治療有効量のＥｐｏ高イグリコシル化アナログを含む薬学的組成物を提供する。この組成物は、１週間に３回未満の伴う投薬スケジュールに適切である。この組成物は、液体または凍結乾燥形態であってよく、種々のｐＨ値およびイオン強度の希釈剤（Ｔｒｉｓ、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、またはリン酸緩衝液）、可溶化剤（ＴｗｅｅｎまたはＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅなど）、キャリア（ヒト血清アルブミンまたはゼラチンなど）、防腐剤（チメロサール、パラベン、塩化ベンジルアルコニウムまたはベンジルアルコールなど）、抗酸化剤（アスコルビン酸またはメタ亜硫酸水素塩など）、および他の成分（リジンまたはグリシン）を含む。特定の組成物の選択は、治療する病状、投与経路、および所望の薬物動態学的パラメーターを含む多数の因子に依存する。薬学的組成物に適切な成分のより広範な調査は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１８版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、（１９８０）に見出される。好ましい実施形態では、本発明のＥｐｏグリコシル化アナログを、ヒトアルブミンおよび任意選択的に防腐剤としてベンジルアルコールを含む等張塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム緩衝液としての液体形態で処方する。組成物は、１つ、２つ、３つ、もしくは４つ、または４つを超えるさらなる炭水化物鎖を有するアナログを含むことが好ましい。
【００５３】
本発明の組成物は、皮下または静脈内注射のいずれかで投与されることが好ましい。最終的に選択される投与経路は、因子の数に依存し、当業者によって確認することができる。
【００５４】
以下の実施例は、本発明をより完全に例示するために提示されているが、本発明の範囲を制限するために構成されていない。
【実施例１】
【００５５】
高グリコシル化Ｅｐｏアナログの構築
高グリコシル化ＥｐｏアナログをコードするｃＤＮＡの構築
Ｅｐｏアナログを、いくつかの異なる方法を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ変異誘発によって作製した。アナログＮ４９およびＮ５０を、ＷＯ９４／０９２５７に記載のように構築した。アナログを、重複ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法の変形によっても構築した。基本的な手順には、２つの連続的な工程が含まれる。第１の工程では、全部で４つのオリゴヌクレオチド（５’（正方向）プライマー、逆方向変異誘発プライマー、正方向変異誘発プライマー（通常、逆方向変異誘発プライマーに相補的）、および３’（逆方向）プライマー）を用いるＥｐｏまたはＥｐｏアナログテンプレートＤＮＡについて、２つの反応（ＰＣＲ１およびＰＣＲ２）を行った。変異誘発プライマーは、これらの各変化部位に所望のヌクレオチド変化ならびに６〜１４個の正確な適合ヌクレオチドを含んでいた。ＰＣＲ１を、５’（正方向）プライマーおよび逆方向変異誘発プライマーに使用した。ＰＣＲ２を、３’（逆方向）プライマーおよび正方向変異誘発プライマーに使用した。増幅ＤＮＡフラグメントを、アガロースゲル電気泳動で分離した。正確なサイズのＤＮＡフラグメントを含むアガロースの小片を、ゲルから切り出した。ＰＣＲ１およびＰＣＲ２由来のＤＮＡフラグメントを合わせ、５’正方向プライマーおよび３’逆方向プライマーのみを用いて第３のＰＣＲ反応を行った。したがって、所望の変異を含む全長ＤＮＡセグメントを増幅した。場合によっては、同一のＰＣＲプロセスを用いてすでに変化したＤＮＡへの新規の置換物を移入することによって、２つまたは３つの変異を組み合わせた。これらの複数のグリコシル化部位アナログを構築するために、１つの二重および三重部位アナログ（上記のように作製）を、ＰＣＲテンプレートとして使用し、さらなるグリコシル化部位を、適切なプライマーを用いた部位特異的変異誘発によって移入した。
【００５６】
ＥｐｏアナログＮ５１、Ｎ５２、およびＮ５３を、重複ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法１によって構築した。各場合に１つのさらなるＮグリコシル化部位を移入した。Ｎ５６は、ＰＣＲテンプレートとしてｐＤＳＲα２Ｅｐｏの使用により天然の配列ＨｕＥｐｏのグリコシル化部位（Ｎ１１４、Ｔ１１６）が付加されており、Ｎ５１はｐＤＳＲα２ Ｅｐｏ Ｎ４７テンプレート（Ａｓｎ３０、Ｔｈｒ３２、Ｖａｌ８７、Ａｓｎ８８、Ｔｈｒ９０）の使用によりＮ４７ ＥｐｏにＯ連結グリコシル化部位（Ｔｈｒ１２５）が付加されており、アナログＮ５９はｐＤＳＲα２ Ｅｐｏ Ｎ４７テンプレートを用いてアナログＮ４７にグリコシル化部位（Ａｓｎ５７）が付加されていた。
【００５７】
Ｃｈｅｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１、５６９５，（１９９４）を適用したプロトコールを用いて、方法１についてのポリメラーゼ連鎖反応を行った。３’（逆方向）プライマーは、終結コドンの後ろにＸｂａＩ制限部位を移入した配列を含んでいた：
ＡＴＣＴＡＧＡＡＧＴＴＧＣＴＣＴＣＴＧＧＡＣＡＧＴＴＣＣＴ（配列番号２）。
【００５８】
５’正方向反応プライマー：
ＧＡＡＧＣＴＴＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＧＧＴＧＣＡＣＧＡＡＴＧ（配列番号３）は、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ制限部位の後ろにＥｐｏ開始コドン（ＡＴＧ）の上流のＫｏｚａｋ配列を有する。典型的なＰＣＲ反応混合物には、以下を含んでいた：４μｌの各正方向および逆方向プライマー（５ｐｍｏｌ／μｌ）、１μｌのテンプレート（２５ｎｇ）、１０μｌの５×ＬＰ緩衝液（１００ｍＭトリシン（ｐＨ８．７）／２５％グリセロール／４２５ｍＭ ＫＯＡｃ）、１０μｌのｄＮＴＰストック（それぞれ１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、０．８μｌのｒｔＴｈポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、２．５Ｕ／μｌ）、および２μｌのＶｅｎｔポリメラーゼ（ＮＥＢ、１×ＬＰ緩衝液中で１：１００で新たに希釈後０．０１Ｕ／μｌ）。Ｈ２Ｏを添加して、最終体積を５０μｌにした。全ての成分を表示の順に添加し、第１サイクルの温度が６０℃を超えたときに１μｌの５０ｍＭ ＭｇＯＡｃの添加によってＰＣＲを開始した。典型的な反応条件は、以下であった：９４℃で１０秒間、５０℃で１分間、６８℃で５分間を２サイクル、その後９４℃で１０秒間、５５℃で１分間を１０秒間、６８℃で５分間を２５サイクル。増幅したフラグメントを、アガロースゲル電気泳動で分離し、正確なサイズのＤＮＡフラグメントを製造者が提供する手順（Ｂｉｏ １０１，Ｉｎｃ）によってＧｅｎｅｃｌｅａｎＴＭキットを用いて精製した。精製したＤＮＡを、Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＸｂａ Ｉで消化し、ＧｅｎｅｃｌｅａｎＴＭキットを用いて再度精製した。次いで、フラグメントを、Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＸｂａ Ｉで切断したｐＤＳＲα２ベクターにライゲートした。ライゲートしたＤＮＡを、キャリアｔＲＮＡの存在下、２体積のエタノールの０．３Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）溶液で沈殿させ、Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換した。Ｅｐｏアナログを、ｍｉｎｉ ＤＮＡ ｐｒｅｐに対する制限消化によってスクリーニングした。次いで、ポジティブクローン由来のプラスミドを調製し、インサートを配列決定して所望の変異の存在を確認し、さらなるアミノ酸変化が移入されていないことを確認した。
【００５９】
アナログＮ５４〜Ｎ６１を、重複ＰＣＲストラテジー法２を用いて構築した。３’（逆方向）プライマーは、終結コドンの後ろにＸｂａＩ制限部位を移入した配列を含んでいた：
ＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＴＴＧＣＴＣＴＣＴＧＧＡＣＡＧ（配列番号４）。
【００６０】
５’正方向反応プライマー：
ＣＡＡＣＡＡＧＣＴＴＧＣＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＧＧＧ（配列番号５）は、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ制限部位の後ろにＥｐｏ開始コドン（ＡＴＧ）の上流のＫｏｚａｋ配列を有する。Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＵｌＴｍａ ＤＮＡポリメラーゼおよび同伴試薬（１０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、３μｌの１ｍＭ ｄＮＴＰ、５ｐｍｏｌの各プライマー、および最終体積を１００μｌにするための水）を用いて、より忠実度の高いＰＣＲストラテジーを行った。ＰＣＲ混合物が９４℃に達した後、０．５単位のＵｌＴｍａポリメラーゼを添加した。次いで、９４℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、および７２℃で９０秒間を５サイクルするＰＣＲ反応を行った。引き続き９４℃で３０秒間、７２℃で９０秒間を２５サイクル行った。正確なサイズの産物のバンドを、電気泳動後にアガロースゲルから切り出した。
【００６１】
各アナログについて得られたＰＣＲ産物を、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キットを用いて精製した。精製したＤＮＡを、Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＸｂａ Ｉ制限酵素（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含む１００μｌの制限消化物中、３７℃で１時間消化した。消化物を、再びゲル精製して、消化されたフラグメントをＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＸｂａ Ｉ消化ｐＤＳＲα２ベクターにライゲートした。
【００６２】
ライゲートしたＤＮＡを、キャリアｔＲＮＡの存在下でエタノールの０．３Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）溶液中で沈殿させ、Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換した。正確なサイズおよび型のＤＮＡインサートを含むクローンを同定するために、最初にＥｐｏアナログをコロニーＰＣＲによってスクリーニングした。この手順を用いて、プラスミドを含む細胞をＥｐｏの正方向および逆方向プライマーを含むＰＣＲチューブに入れた。次いで、混合物を、上記の反応条件を用いたＰＣＲに供した。次いで、ポジティブクローン由来のプラスミドを調製し、Ｅｐｏインサートを配列決定して所望の変異の存在を確認し、さらなるアミノ酸変化が移入されていないことを確認した。
【００６３】
【表２】
【００６４】
炭水化物付加の分析
発現ベクターｐＤＳＲα２に挿入された高グリコシル化Ｅｐｏアナログについての構築物を、ＣＯＳ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトＣＯＳ細胞由来の上清をウェスタンブロットで分析して、発現および分泌したＥｐｏアナログがさらなる炭水化物を含むかどうかを決定した。サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウェルに直接ロードし、モノクローナル抗体９Ｇ８Ａを用いた免疫ブロット法によって分析した（Ｅｌｌｉｏｔｔら、（１９９６）、Ｂｌｏｏｄ、８７、２７１４）。アナログサンプルの移動度を、ｒＨｕＥｐｏを含むサンプルの移動度と比較した。図１は、アナログＮ４（４つの炭水化物鎖）およびＮ４７（５つの炭水化物鎖）と比較したアナログＮ５３およびＮ６１の移動度の減少を示す。移動度は、アナログＮ５３には６つの炭水化物鎖が存在し、アナログＮ６１には７つの炭水化物鎖が存在することと一致する。全ての高グリコシルがアナログのデータを、表２に示す。
【００６５】
ｉｎ ｖｉｔｒｏバイオアッセイ
ｒＨｕＥｐｏまたはアナログを発現するＣＯＳまたはＣＨＯで馴化した培地を、ＵＴ７−Ｅｐｏ細胞による３Ｈ−チミジン取り込みの刺激についてアッセイした（Ｋｏｍａｔｓｕら、Ｂｌｏｏｄ、８２、４５６）。ＵＴ７−Ｅｐｏ細胞は、Ｅｐｏ感受性で、その細胞表面にヒトＥｐｏレセプターを発現する。ＵＴ７−Ｅｐｏ細胞を、成長培地（Ｌ−グルタミン、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、および３０２４ｍｇ／Ｌの重炭酸ナトリウムを含むが、αチオグリセロールもβメルカプトエタノール（ＧＩＢＣＯ）／１０％ｖ／ｖウシ胎児血清／１％ｖ／ｖ Ｌ−グルタミン−ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）／１単位／ｍＬ ｒＨｕＥｐｏも含まない、１×Ｉｓｃｏｖｅ改変ダルベッコ培地）中で約３×１０５細胞／ｍＬに増殖させた。遠心分離（約５００×ｇ）によって回収した細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水で２回洗浄し、アッセイ培地（Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）／１％Ｌ−グルタミン／４％ウシ胎児血清を含まない１×ＲＰＭＩ Ｍｅｄｉｕｍ １６４０）中に５×１０４細胞／ｍＬで懸濁した。アッセイ培地で少なくとも５倍希釈した１００μｌの試験サンプルまたはＥｐｏ標準（ｒＨｕＥｐｏ）を、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルに添加した。次いで、５０μＬの懸濁細胞を添加し（５０００細胞／ウェル）、プレートを加湿インキュベーター中、３７℃で５％ＣＯ２でインキュベートした。７２時間後、アッセイ培地で１：１００に希釈した５０μＬのメチル−３Ｈ−チミジン（１ｍＣｉ／ｍＬ、２０Ｃｉ／ｍＭｏｌｅ）を添加した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２でさらに４時間インキュベートした。標識された細胞を、ガラスファイバーフィルターマット上に回収し、脱イオン水、および２−プロパノールで洗浄し、乾燥して計数した。各アナログについて測定された反応とｒＨｕＥｐｏ標準の反応との比較によって活性を測定した。次いで、ｉｎ ｖｉｔｒｏを免疫活性によって測定された各アナログの濃度で割ることによって比生物活性を決定した（Ｅｌｌｉｏｔｔら、（１９９６）、Ｂｌｏｏｄ、８７、２７１４）。結果を表２に示す。
【００６６】
【表３】
【実施例２】
【００６７】
組換えヒトエリスロポイエチンおよび高グリコシル化エリスロポイエチンアナログの調製
本明細書中に記載の試験で使用する組換えヒトエリスロポイエチン（ｒＨｕＥｐｏ）を、ヒトエリスロポイエチン遺伝子を保有する組換えプラスミドでトランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞によって発現させた。組換え産物を馴化培地から回収し、本質的にＬａｉら、前出に記載のように精製した。得られたｒＨｕＥｐｏ調製物は、等電点電気泳動によって決定したところ、主に９〜１４個のシアル酸のイソ型を有する。
【００６８】
組換え高グリコシル化エリスロポイエチンアナログを、ＷＯ９１／０５８６７およびＷＯ９４／０９２５７（本明細書中に参照により取込まれる）に記載のＥｐｏアナログ遺伝子を保有する組換えプラスミドでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞中で発現させた。高グリコシル化アナログを、下記のように培養上清から精製した。
【００６９】
馴化培地の濃縮および透析濾過（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）
トランスフェクトＣＨＯ細胞株の３つの連続的回収物（それぞれ５〜８日）由来の馴化培地（無血清）を回収し、０．４５μｍのフィルターでろ過し、１０，０００分子量カットオフメンブランを備えたタンジェンシャルフロー限外濾過システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２０μＭ ＣｕＳＯ４（ｐＨ７．０）中に透析濾過した。透析濾過した培地（ＤＦＭ）を、２回濾過（０．４５μｍ）し、精製に使用するまで−２０℃で保存した。
【００７０】
精製
全ての手順を、２℃〜８℃で行った。
【００７１】
陰イオン交換クロマトグラフィー（１０）
明澄化したＤＦＭを、１０ｍＭビスＴｒｉｓプロパン（ＢＴＰ）（ｐＨ７．０）で平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、６ｃｍ×１８ｃｍ）にかけ、２カラム体積の１０ｍＭ ＢＴＰで洗浄し、全ての非結合種を溶出させた。高グリコシル化アナログが４つ、５つ、または６つのＮ連結炭水化物鎖を有するかどうかに依存して以下の勾配で運転した。この段階で使用した全ての緩衝液は、１ｍＭグリシン、２０μＭ ＣｕＳＯ４、６Ｍ尿素、５μｇ／ｍＬロイペプチン、および１μｇ／ｍＬペプスタチンを含む。４つのＮ連結炭水化物鎖を有するアナログについては、勾配は、１０ｍＭ酢酸、０．１ｍＭ ＮａＣｌ〜５００ｍＭ酢酸、５ｍＭ ＮａＣｌを４９カラム体積分溶出し、高塩条件で２体積分維持するものであった。５つのＮ連結炭水化物鎖を有するアナログについては、勾配は、０．７Ｍ酢酸、７ｍＭ ＮａＣｌ〜１．０Ｍ酢酸、１２ｍＭ ＮａＣｌを３０カラム体積分溶出し、高塩条件で２体積分維持するものであった。４６のＮ連結炭水化物鎖を有するアナログについては、勾配は、１．０Ｍ酢酸、１０ｍＭ ＮａＣｌ〜１．５Ｍ酢酸、２０ｍＭ ＮａＣｌを５０カラム体積分溶出し、高塩条件で２体積分維持するものであった。勾配後、カラムを、２カラム体積分の１０ｍＭ ＢＴＰ（ｐＨ７．０）で洗浄し、高イソ型画分を、０．６Ｍ ＮａＣｌ、１００ｍＭ ＢＴＰ（ｐＨ７．０）で溶出した。
【００７２】
逆相クロマトグラフィー（Ｃ４）
Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（１Ｑ）由来の高塩ストリップを、２０％エタノール、１０ｍＭ ＢＴＰ（ｐＨ７．０）で平衡化したＶｙｄａｃ Ｃ４逆相カラム（３０μｍ粒子、４ｃｍ×１８ｃｍ）にかけ、１０ｍＭ ＢＴＰ（ｐＨ７．０）で緩衝化した９４％エタノールにより３０体積分で勾配させたカラムから溶出させた。エタノールの存在下での凝集の可能性を最小限にするために、プールした産物のピーク（約６０％エタノールでの溶出分）を、４体積分の１０ｍＭ ＢＴＰ（ｐＨ７．０）で希釈した。
【００７３】
陽イオン交換クロマトグラフィー（２Ｑ）
逆相カラムから溶出した希釈溶出物を、１０ｍＭ ＢＴＰ（ｐＨ７．０）で平衡化した第２のＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆｓｔ Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、３ｃｍ×９ｃｍ）カラムにかけた。カラムを、平行化緩衝液で洗浄し、高グリコシル化Ｅｐｏアナログを、０．６Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）で溶出した。
【００７４】
精製したタンパク質を、セントリコン（１０，０００分子量カットオフ）によって２０ｍＭ ＮａＰＯ４（ｐＨ６．０）と交換し、０．２μｍのフィルターで濾過して、２〜８℃で保存した。
【実施例３】
【００７５】
ｒＨｕＥｐｏならびに４つ、５つ、および６つのＮ連結炭水化物鎖を含むｒＨｕＥｐｏアナログのｉｎ ｖｉｖｏ生物活性
４つ、５つ、および６つのＮ連結炭水化物鎖を含むＥｐｏアナログのｉｎ ｖｉｖｏ活性を、過低酸素（ｅｘｈｙｐｏｘｉｃ）赤血球増加症マウスバイオアッセイにおけるｒＨｕＥｐｏの活性と比較した。このアッセイは、外因的に投与した試験サンプルに対する応答におけるマウスのエリスロポイエチン増加の測定により、新規に合成した赤血球への５９Ｆｅの取り込みを定量する。下記のように行ったアッセイは、Ｃｏｔｅｓ ａｎｄ Ｂａｎｇｈａｍ（Ｎａｔｕｒｅ、１９１、１０６５、（１９６１））の修正形態である。
【００７６】
このアッセイでは、雌ＢＤＦ１マウスを、最初に低圧チャンバー（０．４〜０．５ａｔｍ）中の低酸素条件に１日に約１８時間で１４日間の暴露によって予め馴化させる。低酸素条件を代償するために、マウスは、赤血球数増加のための赤血球生成の刺激に応答し、相対的な酸素保有能力を得る。最終低圧暴露の完了後、マウスを、腹腔内注射による試験サンプル投与前に、周囲の気圧に約７２時間維持する。周囲気圧で、マウスは比較的赤血球が増加し、内因性エリスロポイエチン産生および赤血球生成速度の増加に応答する。サンプル投与の５日後、０．２ｍＬの０．２〜０．３μＣｉの５９ＦｅＣｌを、尾静脈に静脈注射する。４８時間後、動物を屠殺し、試験サンプルによるエリスロポイエチンの増加を、全血の０．５ｍＬサンプル中に組込まれた５９Ｆｅの量の測定によって同定する。
【００７７】
ｒＨｕＥｐｏならびに４つ、５つ、または６つのＮ連結炭水化物鎖を含む５つの異なるＥｐｏアナログを、図３に記載のこのアッセイにおいて試験した。各サンプルを、適切な濃度範囲内の６つまたは７つの異なる希釈でアッセイした。全てのサンプルを、０．５％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝化生理食塩水で希釈し、各希釈物の０．４ｍＬを、５匹の予め馴化したマウスに投与した。５９Ｆｅ投与の４８時間後、０．５ｍＬの血液中に組込まれた量を、ガンマ計数によって測定した。各サンプルの結果を、投薬量のｌｏｇに対する組込まれた５９Ｆｅの％としてプロットする。
【００７８】
図３に示すように、このアッセイで試験した５つ全ての高グリコシル化Ｅｐｏアナログは、ｒＨｕＥｐｏより強力である。さらに、各アナログの効力は、Ｎ連結炭水化物鎖の数に直接依存し、アナログの炭水化物鎖数の増加につれて活性が増加した。したがって、６つのＮ連結炭水化物鎖を含むアナログＮ５３が最も強力なアナログであった。同様に、５つのＮ連結炭水化物鎖を含むアナログＮ４７は、４つのＮ連結鎖を含むアナログより強力であった。４つのＮ連結炭水化物鎖を含む３つのアナログ（Ｎ４、Ｎ４８、およびＮ５０）の効力は、互いにほぼ同じであり、ｒＨｕＥｐｏの効力より強力であった。
【００７９】
この実験では、ｒＨｕＥｐｏおよび４０％の５９Ｆｅ組込みを必要とする４つ、５つ、または６つのＮ連結炭水化物鎖を含むアナログの用量は、それぞれ、１０，７００ｎｇ、６４０ｎｇ、１４０ｎｇ、および３８ｎｇであった。この赤血球生成レベルの生成に必要な物質の量に基づいて、４つ、５つ、または６つのＮ連結炭水化物鎖を含むＥｐｏアナログは、ｒＨｕＥｐｏより１７倍、７７倍、および２８０倍強力である。
【実施例４】
【００８０】
ラットおよびビーグル犬におけるｒＨｕＥｐｏおよびＥｐｏアナログＮ４７のＩＶ薬物動態
ＥｐｏＮ４７アナログおよびｒＨｕＥｐｏの薬物動態を比較するために、ラットおよびビーグル犬における２つの異なる研究を行った。
【００８１】
ラットの研究では、１μＣｉ（約０．１μｇのペプチド／ｋｇ）の１２５Ｉ−ＥｐｏＮ４７アナログまたは１２５Ｉ−組換えヒトエリスロポイエチン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）のいずれかを、３１４ｇ〜３６３ｇの正常な雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに手術によって移植した頚動脈カニューレで静脈内注射した。投与後の種々の時点で、０．３ｍＬの血液を採血し、血清を遠心分離によって調製した。０．１ｍＬの各血清サンプルにおける１２５Ｉ−ｒＨｕＥｐｏまたは１２５Ｉ− Ｅｐｏ Ｎ４７アナログのレベルを、９０％エタノールとの４℃で一晩のインキュベーションによって同定した。各血清サンプルにおけるエタノール沈殿タンパク質を遠心分離によって回収し、ガンマカウンターで放射能を測定した。得られた血清濃度対時間の薬物動態学曲線を図４に示す。各ポイントは、Ｎ４７アナログ群の５匹のラットおよびｒＨｕＥｐｏ群の６匹のラットの群平均を示す。薬物動態学的曲線を、ＰＣＮＯＮＬＩＮ４．０非線形回帰分析（統計学的コンサルタント、１９９２）を用いて各ラットについて決定し、各群についての結果を平均した。
【００８２】
【表４】
【００８３】
イヌでの研究では、７．８ｋｇ〜９．５ｋｇの間の重量の正常なビーグル犬の橈側皮静脈に、約２９μＣｉの１２５Ｉ−ｒＨｕＥｐｏまたは１２５Ｉ−Ｎ４７（約０．１μｇペプチド／ｋｇ）を静脈内ボーラス注射した。投与から２４時間後の種々の時点で、約１ｍＬ〜２ｍＬの血液を採血し、血清を調製した。０．１ｍＬ血清中の１２５Ｉ−ｒＨｕＥｐｏおよび１２５Ｉ−Ｎ４７濃度を、上記のように計算した。イヌを用いた研究についての血清濃度対時間の薬物動態曲線を、図５に示す。時点は、各群の２つの動物の群平均である。薬物動態学的パラメーターを、表４にまとめる。
【００８４】
【表５】
【００８５】
ラットおよびイヌの研究では、ｒＨｕＥｐｏおよびＮ４７アナログは、二相性の血清クリアランスを示した。ラットにおけるクリアランスは、ｒＨｕＥｐｏはＥｐｏ Ｎ４７アナログより約３．７倍迅速であり、β半減期はＥｐｏ Ｎ４７アナログはｒＨｕＥｐｏより約２．８倍長かった。イヌを用いた研究における薬物動態学的パラメーターは、おおよそラットで認められたパラメーターと一致した。イヌでは、ｒＨｕＥｐｏのクリアランスは、Ｅｐｏ Ｎ４７アナログより３．５倍速く、Ｅｐｏ Ｎ４７アナログのβ半減期は、ｒＨｕＥｐｏより３．５倍長かった。
【実施例５】
【００８６】
ｒＨｕＥｐｏおよびＥｐｏアナログＮ４７投与後のヘマトクリットの用量反応
週３回（ＴＩＷ）投与でのヘマトクリット用量反応研究
正常なマウスにおけるｒＨｕＥｐｏおよびＥｐｏアナログＮ４７のｉｎ ｖｉｖｏでの生物学的効果を、週に３回で６週間までの腹腔内注射または静脈内注射のいずれかによる用量範囲の投与後に比較した。ヘマトクリットの測定を、眼窩後方（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ）の出血によって週２回行った。
【００８７】
約３０ｇの正常なＣＤ１マウス（群あたり１０〜１３匹）に、ｒＨｕＥｐｏ（０．６２５〜１０μｇペプチド／ｋｇ／用量の用量範囲）、Ｅｐｏ Ｎ４７アナログ（０．１５６〜１．２５μｇペプチド／ｋｇ／用量の用量範囲）、または賦形剤コントロールのいずれかを１週間に３回を全部で６週間腹腔内注射した。賦形剤コントロールおよび種々のｒＨｕＥｐｏおよびＮ４７アナログ投薬調製物用の希釈剤は、０．０２５％マウス血清アルブミンを含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）であった。全てのマウスについてのヘマトクリットを、ベースラインの時点および眼窩後方出血後１週間に２回測定した。実験の終了時に、全ての動物由来の血清を回収し、溶液放射性免疫沈降法によって注射した物質に対する抗体についてアッセイした。中和抗体について負であると判断された動物由来のヘマトクリットデータを、その後の分析に使用した。
【００８８】
図６に示すように、ｒＨｕＥｐｏおよびＥｐｏ Ｎ４７アナログは共に、６週間の研究で用量に依存して増加するが、Ｎ４７アナログは、所与の濃度でｒＨｕＥｐｏと比較してより多いヘマトクリットの増加を促進する。この実験では、Ｅｐｏ Ｎ４７アナログは、腹膜内注射によって１週間に３回投与した場合、約３倍〜４倍強力である。
【００８９】
ｒＨｕＥｐｏおよびアナログＮ４７の用量反応研究を、腹膜内注射と類似の手順を用いた１週間に３回の静脈内注射によって行った。得られた結果は、腹膜内投与の結果に類似し、特に、この研究により、１週間に３回投与した場合、ＥｐｏＮ４７アナログはｒＨｕＥｐｏより強力であることがさらに確認された。
【００９０】
正常なマウスのヘマトクリットの上昇におけるｒＨｕＥｐｏおよびＥｐｏ Ｎ４７アナログの生物活性をより十分に比較および定量するために、実験結果を、相対有効性プロットによっても分析した。各実験について、各用量でのｒＨｕＥｐｏおよびＮ４７アナログの活性を、研究の最初の３８日にわたるヘマトクリットの増加を台形加算（ｔｒａｐｅｚｏｉｄａｌ ｓｕｍｍａｔｉｏｎ）による合計によって決定し、曲線下面積（ＡＵＣ）を得た。次いで、これを、ｌｏｇ用量をμｇペプチド／ｋｇ／週でプロットした。同一または異なる投与経路または投薬頻度で投与された化合物の効力の相違を、関連するｌｏｇ−用量反応直線間の距離の測定によって決定することができる。図７に、２つの異なる経路（腹膜内および静脈内）および２つの異なる投薬スケジュールで投与したｒＨｕＥｐｏおよびＥｐｏ Ｎ４７アナログの活性を比較することによる全ての実験についての相対的な効力データをまとめる。
【００９１】
図７に示すように、１週間に３回投与した場合、Ｅｐｏ Ｎ４７アナログは、静脈内または腹腔内経路のいずれかで注射した場合は同一の効力を示し、１週間に３回腹膜内注射したｒＨｕＥｐｏよりも３．６倍強力であった。
【００９２】
１週間に１回（ＯＷ）の投与でのヘマトクリット用量反応研究
正常なマウスにおけるヘマトクリットの増加でのｒＨｕＥｐｏおよびＥｐｏアナログＮ４７の比較を、腹膜内または静脈内のいずれかの経路での６週間の投与による週に１回の投薬によって行った。
【００９３】
約３０ｇの正常なＣＤ１マウス（群あたり８〜１０匹）を、０．０２５％マウス血清アルブミンを含むＰＢＳで調製した種々の濃度のｒＨｕＥｐｏまたはＥｐｏ Ｎ４７アナログのいずれかまたは賦形剤コントロールを１週間に１回全部で６週間静脈内注射した。アナログ用量は、６．２５〜２５μｇペプチド／ｋｇ／用量範囲で変化し、ｒＨｕＥｐｏの用量は、２５〜２００μｇ／ｋｇ／用量範囲で変化した。全てのマウスのヘマトクリットを、ベースラインおよびその後の１週間に２回の眼窩後方出血によって測定した。実験の終了時に、全ての動物由来の血清を回収し、溶液放射性免疫沈降法によって注射した物質に対する抗体についてアッセイした。中和抗体について負であると判断された動物由来のヘマトクリットデータを、その後の分析に使用した。
【００９４】
図８に示すように、１週間に１回投与した場合、ｒＨｕＥｐｏおよびアナログＮ４７は、正常なマウスのヘマトクリットを増加させることができ、反応を示すために必要なｒＨｕＥｐｏの用量は、アナログＮ４７についての用量よりも有意に多かった。例えば、本実験では、２５μｇペプチド／ｋｇ／週のＮ４７は、６週間で、４１．２ポイントヘマトクリットを増加させ、同用量のｒＨｕＥｐｏは１２．５ポイントしかヘマトクリットを上昇させなかった。
【００９５】
ｒＨｕＥｐｏおよびアナログＮ４７の用量反応研究を、上記と類似の手順を用いた１週間に１回の腹腔内注射によって行った。得られた結果は、静脈内投与の結果と一致し、１週間に１回投与した場合、ｒＨｕＥｐｏと比較してアナログＮ４７の効力がより高いことがさらに確認された。
【００９６】
ｒＨｕＥｐｏおよびＮ４７をそれぞれ１週間に１回投与した場合の活性の相違を定量するために、上記の全ての関連する実験から相対効力プロットを作製した。図７に示すように、１週間に１回投与した場合、静脈内経路および腹膜内経路での注射では、アナログＮ４７は同一の強力を示す。アナログＮ４７は、それぞれ、１週間に１回投与した場合、ｒＨｕＥｐｏより約１４倍の効力である。
【００９７】
さらに、図６のｌｏｇ−用量反応プロットも以下に示す：（１）１週間に１回投与した所与の用量のアナログＮ４７は、３回に分けて投与された（ＴＩＷ）ｒＨｕＥｐｏの合計した１週間あたりの用量と効力はほぼ同一である、（２）１週間位１回（ＱＷ）投与した所与の用量のｒＨｕＥｐｏは、３回に分けて投与した（ＴＩＷ）アナログＮ４７の１週間あたりの用量の合計より約２％しか有効ではなかった、（３）マウスにおいて、アナログＮ４７は、ＴＩＷで投与した場合、ＱＷと比較して約４倍効力が高い。
【００９８】
１週間おきに１回（ＥＯＷ）の投与でのヘマトクリット用量反応研究
また、１週間おきに１回注射した場合にマウスがマトクリットを増加させる能力を評価するために、実験を行った。正常なＣＤ−１マウス（群あたり１０匹）を、０．０２５％のマウス血清アルブミンを含むＰＢＳ中に調製した種々の濃度のＥｐｏ Ｎ４７アナログで１週間に１回または１週間おきに１回のいずれかを全部で約６週間静脈内注射した。アナログＮ４７を、１週間おきに２００、１００、２５μｇ／ｋｇ／用量または１週間に１回１２．５μｇ／ｋｇ／用量のいずれかで投与した。全てのマウスのヘマトクリットを、眼窩後方出血によってベースラインおよびその後１週間に２回測定した。
【００９９】
図９に示すように、アナログＮ４７は、１ヶ月に２回投与した場合でさえ、用量依存性様式で正常なマウスのヘマトクリットを増加させることができる。予想したように、より低頻度で投与した場合、ヘマクリットを増加させるにはより大量のＮ４７アナログが必要である。６週間で、１週間おきに２００μｇ／ｋｇのＮ４７アナログの用量の投与で、１週間に１回１２．５μｇ／ｋｇを投与する場合とほぼ同一の範囲でヘマトクリットが増加した。
【実施例６】
【０１００】
持続的携帯型腹膜透析（ＣＡＰＤ）患者におけるＥｐｏ Ｎ４７アナログおよびｒＨｕＥｐｏのＩＶ薬物動態
ラットおよびビーグル犬におけるｒＨｕＥｐｏと比較してＥｐｏ Ｎ４７アナログの血清半減期が顕著に増加するという見地から、ヒトにおいても増加を認めることができるかどうかを決定することが目的であった。
【０１０１】
１１人の安定なＣＡＰＤ患者（２７歳〜７５歳の７人の男性、４人の女性）について、二重盲式で、無作為の交差デザイン研究を行った。第１の患者群には、１００Ｕ／ｋｇのｒＨｕＥｐｏ（０．５μｇペプチド／ｋｇと等価）を投与し、第２の患者群には０．５μｇペプチド／ｋｇのＥｐｏ Ｎ４７アナログを投与し、両群は単回ボーラス静脈注射として投与した。留置カニューレで静脈血サンプル（３ｍＬ）を、静脈内注射前および静脈内注射から５、１０、１５、３０分後ならびに１、２、５、８、１２、１６、２４、３０、３６、４８、６０、７２、および９６時間後に採血した。２８日の洗い出し期間後、第１の患者群に単回静脈内用量のＥｐｏアナログ Ｎ４７を投与し、第２の患者群に単回静脈用量音ｒＨｕＥｐｏを投与した。第１の治療サイクルで、血液サンプルを得た。血清中のｒＨｕＥｐｏおよびＥｐｏ Ｎ４７アナログのレベルを、ベースラインの内因性Ｅｐｏレベルを差し引いた後にＥＬＩＳＡによって測定した。交差デザイン効果についての判断の後に評価した薬物動態学的パラメーター（平均±ＳＥ）を、表５に示す。血清濃度のＡＵＣを、直線的台形加算を用いて計算した。ｔ１／２Ｚを以下のように定義する：ｌｏｇ（２）／ＫＺ（ＫＺを、ｌｎ（血清濃度）のタイムカーブの末端部分の勾配として計算する）。クリアランス（１）を、用量／ＡＵＣと定義する。分布体積（Ｖｄ）を、Ｃ１／Ｋと定義する。
【０１０２】
【表６】
【０１０３】
Ｅｐｏ Ｎ４７アナログについての平均血清半減期（２５．３時間）は、ｒＨｕＥｐｏ（８．５時間）より３倍長く、クリアランスは、ｒＨｕＥｐｏがアナログＮ４７よりも２．５倍速かった。
【実施例７】
【０１０４】
Ｅｐｏ Ｎ４７アナログの第二相用量所見および用量スケジューリング研究
透析を受けているＣＲＦ患者が皮下または静脈内注射でアナログＮ４７を投与された場合のアナログＮ４７の最適な用量および用量スケジュールを調査するために、多施設で、無作為の、連続的な段階的用量拡大研究を開始する。
【０１０５】
投薬スケジュールを以下に示す。
【０１０６】
１週間に１回の投薬：０．０７５、０．２２５、０．４５、０．７５、１．５および４．５μｇのペプチド／ｋｇ／用量
１週間に３回の投薬：０．０２５、０．０７５、０．１５、０．２５、０．５、および１．５μｇのペプチド／ｋｇ／用量。
【０１０７】
以下の２つのパートからなる研究を行う。第１のパートは、４週間にわたり最適な速度でヘモグロビンが増加する１週間に１回または３回投与されたアナログＮ４７の用量（１ｇ／ｄＬ以上であるが３ｇ／ｄＬ未満）を評価するために設計された段階的用量増加研究である。各研究の第２のパートは、（静脈内または皮下のいずれかの投与経路で１週間に１回または３回投与する場合）治療目標のヘマトクリットを維持するために必要な容量を決定するために設計されている。
【０１０８】
予備的結果は、アナログＮ４７の１週間に１回の投薬を使用して貧血のＣＲＦ患者のヘマトクリットを増加および維持することができることを示す。最初の結果により、両投与経路において、１週間に３回の投薬スケジュールで治療を開始するための好ましい用量は、０．１５および０．２５μｇ／ペプチド／ｋｇ／用量であり、１週間に１回の投薬スケジュールでは０．４５および０．７５μｇ／ペプチド／ｋｇ／用量であることが示唆される。
【０１０９】
本発明は、その好ましい実施形態と考えられるものを記載しているが、本発明は開示の実施形態に制限されず、それどころか、添付の特許請求の範囲の精神および範囲内に含まれる種々の修正形態および等価物を対象とすることが意図され、この範囲は、全てのこのような修正形態および等価物を含めるために最も広範に解釈される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬学的組成物中の治療有効量のエリスロポイエチンの高グリコシル化アナログを投与する工程を包含する哺乳動物におけるヘマトクリットの上昇および維持法であって、前記アナログを等モル量の組換えヒトエリスロポイエチンより低頻度で投与して目標に匹敵するヘマトクリットを得る、方法。
【請求項２】
前記エリスロポイエチンの高グリコシル化アナログ量を１週間に約２回投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記エリスロポイエチンの高グリコシル化アナログ量を１週間に約１回投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記エリスロポイエチンの高グリコシル化アナログ量を１週間おきに約１回投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記エリスロポイエチンの高グリコシル化アナログ量を１ヶ月に約１回投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記エリスロポイエチンの高グリコシル化アナログの投与量は約０．０７５〜４．５μｇ／エリスロポイエチンペプチド／ｋｇ／用量である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
薬学的組成物中の治療有効量のエリスロポイエチンの高グリコシル化アナログを投与する工程を包含する哺乳動物におけるヘマトクリットの上昇および維持法であって、前記アナログを組換えヒトエリスロポイエチンより低いモル量で投与して目標に匹敵するヘマトクリットを得る、方法。
【請求項８】
前記エリスロポイエチンの高グリコシル化アナログの投与量は約０．０２５〜１．５μｇ／エリスロポイエチンペプチド／ｋｇ／用量を１週間に３回である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記エリスロポイエチンの高グリコシル化アナログは、ヒトエリスロポイエチンと比較して少なくとも１つのさらなるグリコシル化部位を含み、炭水化物鎖が前記部位に付加されている、請求項１または請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記標的ヘマトクリットが少なくとも約３０％である、請求項１または請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記炭水化物鎖がヒトエリスロポイエチン配列の第３０位、第５１位、第５７位、第６９位、第８８位、第８９位、第１３６位、および第１３８位の１つまたは複数でＮ連結した炭水化物鎖である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
ヒトエリスロポイエチン配列の第３０位および第８８位でＮ連結したさらなる炭水化物鎖を有する、請求項９に記載のアナログ。
【請求項１３】
Ａｓｎ３０Ｔｈｒ３２Ｖａｌ８７Ａｓｎ８８Ｔｈｒ９０Ｅｐｏである、請求項１２に記載のアナログ。
【請求項１４】
前記薬学的組成物が薬学的に許容可能な希釈剤、キャリア、可溶化剤、乳化剤、防腐剤、および／またはアジュバントを含む、請求項１または請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
前記希釈剤がクエン酸ナトリウムまたはリン酸ナトリウムの緩衝液である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記キャリアがヒト血清アルブミンである、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記防腐剤がベンジルアルコールである、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１８】
前記哺乳動物が腎機能の衰退または低下に伴う貧血を罹患している、請求項１または請求項７に記載の方法。
【請求項１９】
前記哺乳動物が骨髄抑制療法に伴う貧血を罹患している、請求項１または請求項７に記載の方法。
【請求項２０】
前記骨髄抑制療法が化学療法または抗ウイルス薬を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記哺乳動物が過剰な出血に伴う貧血を罹患している、請求項１または請求項７に記載の方法。
【請求項２２】
治療有効量の鉄の投与をさらに包含する、請求項１または請求項７に記載の方法。
【請求項２３】
ヒトエリスロポイエチン配列の第５２位、第５３位、第５５位、第８６位、および第１１４位のいずれかで少なくとも１つのさらなるグリコシル化部位を含み、前記部位にＮ連結炭水化物鎖が付加されている、ヒトエリスロポイエチンのアナログ。
【請求項２４】
少なくとも２つのさらなるグリコシル化部位を含み、前記部位のそれぞれに炭水化物鎖が付着している、請求項２２に記載のアナログ。
【請求項２５】
少なくとも３つのさらなるグリコシル化部位を含み、前記部位のそれぞれに炭水化物鎖が付着している、請求項２２に記載のアナログ。
【請求項２６】
少なくとも４つのさらなるグリコシル化部位を含み、前記部位のそれぞれに炭水化物鎖が付着している、請求項２２に記載のアナログ。
【請求項２７】
Ａｓｎ５２Ｔｈｒ５４Ｅｐｏ、
Ａｓｎ５３Ｔｈｒ５５Ｅｐｏ、
Ａｓｎ３０Ｔｈｒ３２Ｖａｌ８７Ａｓｎ８８Ｔｈｒ９０Ｔｈｒ１２５Ｅｐｏ、
Ａｓｎ１１４Ｔｈｒ１１６Ｅｐｏ、
Ａｓｎ３０Ｔｈｒ３２Ａｓｎ５３Ｔｈｒ５５Ｖａｌ８７Ａｓｎ８８Ｔｈｒ９０Ｅｐｏ、
Ａｓｎ５５Ｔｈｒ５７Ｅｐｏ、
Ａｓｎ８６Ｖａｌ８７Ｔｈｒ８８Ｅｐｏ、
Ａｌａ８７Ａｓｎ８８Ｔｈｒ９０Ｅｐｏ、
Ｖａｌ８７Ａｓｎ８８Ｓｅｒ９０Ｅｐｏ、
Ｖａｌ８７Ａｓｎ８８Ｇｌｙ８９Ｔｈｒ９０Ｅｐｏ、
Ａｓｎ３０Ｔｈｒ３２Ａｓｎ５３Ｔｈｒ５５Ｅｐｏ、
Ａｓｎ３０Ｔｈｒ３２Ａｓｎ１１４Ｔｈｒ１１６Ｅｐｏ、および
Ａｓｎ３０Ｔｈｒ３２Ａｓｎ５３Ｔｈｒ５５Ｖａｌ８７Ａｓｎ８８Ｔｈｒ９０Ａｓｎ１１４Ｔｈｒ１１６Ｅｐｏ
からなる群から選択される、ヒトエリスロポイエチンのアナログ。
【請求項２８】
外因性ＤＮＡ配列の発現産物である、請求項２３〜請求項２７に記載のアナログ。
【請求項２９】
請求項２３〜請求項２７のアナログをコードする、ＤＮＡ配列。
【請求項３０】
宿主細胞が前記アナログを発現可能な様式で請求項２９に記載のＤＮＡ配列でトランスフェクトされている、真核生物宿主細胞。
【請求項３１】
薬学的に許容可能な希釈剤、アジュバント、またはキャリアと共に治療有効量の請求項２３〜請求項２７に記載のアナログを含む、組成物。
【請求項３２】
薬学的組成物中の治療有効量の請求項２３〜請求項２７に記載の前記アナログを投与する工程を包含する、哺乳動物におけるヘマトクリットの上昇および維持法。
【請求項３３】
等モル量の組換えヒトエリスロポイエチンより低頻度で前記アナログを投与して目標に匹敵するヘマトクリットを得る、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記アナログの量を、１週間に約１回、１週間おきに約１回、または１ヶ月に約１回投与する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
組換えヒトエリスロポイエチンより低いモル量で前記アナログを投与して目標に匹敵するヘマトクリットを得る、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記アナログの投与量が約０．０２５〜１．５μｇ／エリスロポイエチンペプチド／ｋｇ／用量を１週間に３回である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記アナログの投与量が約０．０２５μｇ／エリスロポイエチンペプチド／ｋｇ／用量を１週間に３回未満である、請求項３４に記載の方法。
【請求項１】
薬学的組成物中の治療有効量のエリスロポイエチンの高グリコシル化アナログを投与する工程を包含する哺乳動物におけるヘマトクリットの上昇および維持法であって、前記アナログを等モル量の組換えヒトエリスロポイエチンより低頻度で投与して目標に匹敵するヘマトクリットを得る、方法。
【請求項２】
前記エリスロポイエチンの高グリコシル化アナログ量を１週間に約２回投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記エリスロポイエチンの高グリコシル化アナログ量を１週間に約１回投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記エリスロポイエチンの高グリコシル化アナログ量を１週間おきに約１回投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記エリスロポイエチンの高グリコシル化アナログ量を１ヶ月に約１回投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記エリスロポイエチンの高グリコシル化アナログの投与量は約０．０７５〜４．５μｇ／エリスロポイエチンペプチド／ｋｇ／用量である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
薬学的組成物中の治療有効量のエリスロポイエチンの高グリコシル化アナログを投与する工程を包含する哺乳動物におけるヘマトクリットの上昇および維持法であって、前記アナログを組換えヒトエリスロポイエチンより低いモル量で投与して目標に匹敵するヘマトクリットを得る、方法。
【請求項８】
前記エリスロポイエチンの高グリコシル化アナログの投与量は約０．０２５〜１．５μｇ／エリスロポイエチンペプチド／ｋｇ／用量を１週間に３回である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記エリスロポイエチンの高グリコシル化アナログは、ヒトエリスロポイエチンと比較して少なくとも１つのさらなるグリコシル化部位を含み、炭水化物鎖が前記部位に付加されている、請求項１または請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記標的ヘマトクリットが少なくとも約３０％である、請求項１または請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記炭水化物鎖がヒトエリスロポイエチン配列の第３０位、第５１位、第５７位、第６９位、第８８位、第８９位、第１３６位、および第１３８位の１つまたは複数でＮ連結した炭水化物鎖である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
ヒトエリスロポイエチン配列の第３０位および第８８位でＮ連結したさらなる炭水化物鎖を有する、請求項９に記載のアナログ。
【請求項１３】
Ａｓｎ３０Ｔｈｒ３２Ｖａｌ８７Ａｓｎ８８Ｔｈｒ９０Ｅｐｏである、請求項１２に記載のアナログ。
【請求項１４】
前記薬学的組成物が薬学的に許容可能な希釈剤、キャリア、可溶化剤、乳化剤、防腐剤、および／またはアジュバントを含む、請求項１または請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
前記希釈剤がクエン酸ナトリウムまたはリン酸ナトリウムの緩衝液である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記キャリアがヒト血清アルブミンである、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記防腐剤がベンジルアルコールである、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１８】
前記哺乳動物が腎機能の衰退または低下に伴う貧血を罹患している、請求項１または請求項７に記載の方法。
【請求項１９】
前記哺乳動物が骨髄抑制療法に伴う貧血を罹患している、請求項１または請求項７に記載の方法。
【請求項２０】
前記骨髄抑制療法が化学療法または抗ウイルス薬を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記哺乳動物が過剰な出血に伴う貧血を罹患している、請求項１または請求項７に記載の方法。
【請求項２２】
治療有効量の鉄の投与をさらに包含する、請求項１または請求項７に記載の方法。
【請求項２３】
ヒトエリスロポイエチン配列の第５２位、第５３位、第５５位、第８６位、および第１１４位のいずれかで少なくとも１つのさらなるグリコシル化部位を含み、前記部位にＮ連結炭水化物鎖が付加されている、ヒトエリスロポイエチンのアナログ。
【請求項２４】
少なくとも２つのさらなるグリコシル化部位を含み、前記部位のそれぞれに炭水化物鎖が付着している、請求項２２に記載のアナログ。
【請求項２５】
少なくとも３つのさらなるグリコシル化部位を含み、前記部位のそれぞれに炭水化物鎖が付着している、請求項２２に記載のアナログ。
【請求項２６】
少なくとも４つのさらなるグリコシル化部位を含み、前記部位のそれぞれに炭水化物鎖が付着している、請求項２２に記載のアナログ。
【請求項２７】
Ａｓｎ５２Ｔｈｒ５４Ｅｐｏ、
Ａｓｎ５３Ｔｈｒ５５Ｅｐｏ、
Ａｓｎ３０Ｔｈｒ３２Ｖａｌ８７Ａｓｎ８８Ｔｈｒ９０Ｔｈｒ１２５Ｅｐｏ、
Ａｓｎ１１４Ｔｈｒ１１６Ｅｐｏ、
Ａｓｎ３０Ｔｈｒ３２Ａｓｎ５３Ｔｈｒ５５Ｖａｌ８７Ａｓｎ８８Ｔｈｒ９０Ｅｐｏ、
Ａｓｎ５５Ｔｈｒ５７Ｅｐｏ、
Ａｓｎ８６Ｖａｌ８７Ｔｈｒ８８Ｅｐｏ、
Ａｌａ８７Ａｓｎ８８Ｔｈｒ９０Ｅｐｏ、
Ｖａｌ８７Ａｓｎ８８Ｓｅｒ９０Ｅｐｏ、
Ｖａｌ８７Ａｓｎ８８Ｇｌｙ８９Ｔｈｒ９０Ｅｐｏ、
Ａｓｎ３０Ｔｈｒ３２Ａｓｎ５３Ｔｈｒ５５Ｅｐｏ、
Ａｓｎ３０Ｔｈｒ３２Ａｓｎ１１４Ｔｈｒ１１６Ｅｐｏ、および
Ａｓｎ３０Ｔｈｒ３２Ａｓｎ５３Ｔｈｒ５５Ｖａｌ８７Ａｓｎ８８Ｔｈｒ９０Ａｓｎ１１４Ｔｈｒ１１６Ｅｐｏ
からなる群から選択される、ヒトエリスロポイエチンのアナログ。
【請求項２８】
外因性ＤＮＡ配列の発現産物である、請求項２３〜請求項２７に記載のアナログ。
【請求項２９】
請求項２３〜請求項２７のアナログをコードする、ＤＮＡ配列。
【請求項３０】
宿主細胞が前記アナログを発現可能な様式で請求項２９に記載のＤＮＡ配列でトランスフェクトされている、真核生物宿主細胞。
【請求項３１】
薬学的に許容可能な希釈剤、アジュバント、またはキャリアと共に治療有効量の請求項２３〜請求項２７に記載のアナログを含む、組成物。
【請求項３２】
薬学的組成物中の治療有効量の請求項２３〜請求項２７に記載の前記アナログを投与する工程を包含する、哺乳動物におけるヘマトクリットの上昇および維持法。
【請求項３３】
等モル量の組換えヒトエリスロポイエチンより低頻度で前記アナログを投与して目標に匹敵するヘマトクリットを得る、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記アナログの量を、１週間に約１回、１週間おきに約１回、または１ヶ月に約１回投与する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
組換えヒトエリスロポイエチンより低いモル量で前記アナログを投与して目標に匹敵するヘマトクリットを得る、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記アナログの投与量が約０．０２５〜１．５μｇ／エリスロポイエチンペプチド／ｋｇ／用量を１週間に３回である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記アナログの投与量が約０．０２５μｇ／エリスロポイエチンペプチド／ｋｇ／用量を１週間に３回未満である、請求項３４に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１０−２４８２０７（Ｐ２０１０−２４８２０７Ａ）
【公開日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１０−１３００４６（Ｐ２０１０−１３００４６）
【出願日】平成２２年６月７日（２０１０．６．７）
【分割の表示】特願２０００−５７８４４５（Ｐ２０００−５７８４４５）の分割
【原出願日】平成１１年１０月１８日（１９９９．１０．１８）
【出願人】（５０００４９７１６）アムジエン・インコーポレーテツド (242)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１３００４６（Ｐ２０１０−１３００４６）
【出願日】平成２２年６月７日（２０１０．６．７）
【分割の表示】特願２０００−５７８４４５（Ｐ２０００−５７８４４５）の分割
【原出願日】平成１１年１０月１８日（１９９９．１０．１８）
【出願人】（５０００４９７１６）アムジエン・インコーポレーテツド (242)
【Ｆターム（参考）】
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