質量および物性の調節された可変質量ラベリング剤とこれを用いたペプチド配列およびタンパク質多重定量同時分析方法
本発明は、可変質量ラベリング剤、可変質量ラベリング剤セット、および多重可変質量ラベリング剤セットを提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、可変質量ラベリング剤と、これを用いたペプチド配列およびタンパク質多重定量同時分析方法に係り、さらに詳しくは、水素同位元素を含み、物性および質量を調節することにより相異なる質量値において定量信号を表示することが可能な可変質量ラベリング剤と、これを用いたペプチド配列およびタンパク質多重定量同時分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
質量分析技術は、タンパク質とペプチドの配列および定量分析に広く用いられている。例えば、タンパク質を同定するために、タンパク質を酵素分解して生成されたペプチド断片をＭＡＬＤＩ(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization)イオン化法またはエレクトロスプレーイオン化法(Electrospray Ionization、ＥＳＩ)を用いてイオン化させた後、質量分析器によって質量を測定してタンパク質の特徴を明らかにする。さらに正確には、一部のペプチドをさらに断片に切断してペプチドの配列を同定する方法を使用する。
【０００３】
質量分析器を用いたタンパク質とペプチドの定量分析のためには、同位元素を含んでいる化学標識を分析対象のタンパク質またはペプチドに付けて質量分析する方法が広く用いられてきている。お互い量を比較すべき同一種類の各種試料に、同位元素標識の異なる同一の化学標識を付けて質量分析を行うと、同位元素の質量差のため、質量分析スペクトルまたはタンデム質量分析スペクトル上で各試料の質量が異なるから、その相対的強さを比較することによりタンパク質の定量分析が可能になる。
【０００４】
最近、前述したペプチドの定量分析と配列分析を同時に行うために、同重体化学変形法が用いられている。米国特許公開ＵＳ２００５／０１４８０８７号および国際特許公開ＷＯ２００５／０６８４４６号などでは、ペプチドと反応させて結合させた後、タンデム質量分析過程で定量信号が現れるように、同位元素で標識された同重体化合物を開示している。
【０００５】
ところが、前記従来の技術に用いられるラベリング剤は、炭素、窒素または酸素などの同位元素を使用しているため、価格が高いという問題点を持つ。また、定量信号の現れる質量範囲が限定されているため、実験で引き起こされる雑音信号によって分析が妨害されるおそれがあるという問題点も持っている。これにより、相対的に価格が低い水素同位元素を用いてペプチド配列とタンパク質の量を同時に確認することが可能な新規の同重体ラベリング剤が要求される。また、定量信号の質量および物性を調節して広範囲な生体分子分析に対して有利となるように特性が与えられた、新規の同重体可変質量ラベリング剤が要求される。
【０００６】
本発明者は、韓国特許出願第２００８−００７０２７２号によって、水素同位元素のみを用い、定量信号の質量調節が可能であるうえ、ジペプチド構造を持つＭＢＩＴ(ｍａｓｓ−ｂａｌａｎｃｅｄ１Ｈ/２Ｈ−ｉｓｏｔｏｐｅ ｔａｇ)と命名された新規の同重体ラベリング剤を提示したことがある。また、韓国特許出願第２００９−００１９４４４号によって、２つの同重体ラベリング剤の質量調節基の役割を果たすアミノ酸残基をそれぞれ多様な物性の天然アミノ酸の各種残基に変えて定量信号質量を多変化させ、同重体ラベリング剤の物性を調節することができることを示した。天然アミノ酸を用いた多様なＭＢＩＴでは、アミノ酸残基の多様な物性差異により、各ＭＢＩＴ試薬の定量信号の強さが最大１０倍も異なった。質量範囲の多変化した可変質量ＭＢＩＴを２つ以上組み合わせて多様な試料を同時に多重定量分析するためには、互いに類似または均一の定量信号強さを有するＭＢＩＴ試薬を組み合わせなければならず、そうしなければ正確な結果を期待することができない。したがって、多重定量同時分析用試薬の開発のために、類似の定量信号強さが持てるように、同一の物性を有する様々なＭＢＩＴ試薬の開発が要求された。よって、韓国特許出願第１０−２００９−００５４５４０号では、同一の物性を有し且つ質量が多変化した同重体ラベリング剤およびラベリング剤セットとこれを用いた多重定量分析方法を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許公開ＵＳ２００５／０１４８０８７号
【特許文献２】国際特許公開ＷＯ２００５／０６８４４６号
【特許文献３】韓国特許出願第２００８−００７０２７２号
【特許文献４】韓国特許出願第２００９−００１９４４４号
【特許文献５】韓国特許出願第１０−２００９−００５４５４０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このような一連の発明によって、本発明者は、天然アミノ酸または人工アミノ酸を用いて定量信号質量を多変化させ且つ物性を調節することができる、ペプチド配列およびタンパク質多重定量同時分析用同重体ラベリング剤を提示し、２種以上のラベリング剤を用いたタンパク質多重定量同時分析方法を提示しようとする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の目的は、同位元素を含む、ペプチド配列およびタンパク質定量同時分析用新規同重体ラベルを提供することにある。
【００１０】
本発明の他の目的は、水素同位元素を含む、ペプチド配列およびタンパク質定量同時分析用同重体ラベルを提供することにある。
【００１１】
本発明の別の目的は、水素同位元素を含む、２つ以上のペプチド配列およびタンパク質定量同時分析用同重体ラベルからなる可変質量ラベリング剤を提供することにある。
【００１２】
本発明の別の目的は、水素同位元素を含み、且つ天然または人工アミノ酸を用いて質量を多変化させることができる、ペプチド配列およびタンパク質定量同時分析用同重体可変質量ラベルを提供することにある。
【００１３】
本発明の別の目的は、水素同位元素を含み、且つ天然または人工アミノ酸を用いて質量を多変化させることができる、２つ以上のペプチド配列およびタンパク質定量同時分析用同重体ラベルからなる可変質量ラベリング剤セットを提供することにある。
【００１４】
本発明の別の目的は、水素同位元素を含み、且つ天然または人工アミノ酸の使用により質量が多変化することにより相異なる質量値において定量信号が現れる、２つ以上のペプチド配列およびタンパク質定量同時分析用同重体人工可変質量ラベリング剤セットを提供することにある。
【００１５】
本発明の別の目的は、水素同位元素を含み、且つ同一物性の天然または人工アミノ酸を用いて質量を多変化させることができる、２つ以上のペプチド配列およびタンパク質多重定量同時分析用同重体ラベルからなる可変質量ラベリング剤セットを提供することにある。
【００１６】
本発明の別の目的は、水素同位元素を含み、且つ同一物性の天然または人工アミノ酸の使用により質量が多変化することにより相異なる質量値において定量信号が現れるが、定量信号の強さは類似している、２つ以上のペプチド配列およびタンパク質多重定量同時分析用同重体可変質量ラベリング剤セットを提供することにある。
【００１７】
本発明の別の目的は、水素同位元素を含む、同重体可変質量ラベリング剤セットを用いてペプチド配列を分析すると同時にタンパク質を定量分析する方法を提供することにある。
【００１８】
本発明の別の目的は、水素同位元素を含み且つ質量が多変化した、２つ以上の同重体可変質量ラベリング剤セットの組み合わせを用いてペプチド配列を分析すると同時にタンパク質を多重定量分析する方法を提供することにある。
【００１９】
本発明の前記およびその他の目的は、後述する本発明によって全て達成できる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明は、新しい同位元素として水素同位元素を含み、物性および質量が多変化することにより相異なる質量値において定量信号を表示することが可能な可変質量ラベリング剤、可変質量ラベリング剤セット、および多重可変質量ラベリング剤セットを提供し、水素同位元素を含む同重体可変質量ラベリング剤セットを用いてペプチド配列を分析すると同時にタンパク質を定量分析する方法、および前記可変質量ラベリング剤セットを用いてペプチド配列を分析すると同時にタンパク質を多重定量分析する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１はＭＢＩＴ試薬および技術の基本概念を示す概略図であって、（ａ）はＭＢＩＴ試薬の構造であり、（ｂ）はＭＢＩＴ試薬が１次アミン基に反応して標識される過程であり、（ｃ）はＭＢＩＴ試薬セットで区分標識されたペプチドをタンデム質量分析した場合に生成可能な断片イオンを示し、（ｄ）は概略的なタンデム質量分析スペクトルを示す。
【図２】図２はＭＢＩＴ技術で質量調節基（ＲＴ）として使用できるアミノ酸残基の種類を示す概略図であって、（ａ）はＭＢＩＴ技術において定量信号質量を調節することが可能な質量調節基（ＲＴ）として使用できるアミノ酸残基と当該アミノ酸を用いたときに現れる定量信号質量対の質量値を、ペプチドをダンタム質量分析する場合に２００Ｔｈ以下の質量値で生成できる断片イオンの分布と共に示し、（ｂ）は本発明で用いられた８種の質量調節基であって、２００Ｔｈ以下の質量値を持つ断片イオンとの干渉が少ない質量調節基を示す。
【図３】図３はＭＢＩＴ技術で質量調節基（ＲＴ）としてアルキル基を用いた場合の各ＭＢＩＴの固有値を示す図であって、（ａ）はＭＢＩＴ定量信号対の質量値を、タンデム質量分析する場合に２２０Ｔｈ以下の質量値で生成できる断片イオンの分布と共に示し、（ｂ）は質量調節基として使用されたアルキル基の種類による各ＭＢＩＴの固有標識シグニチャーと定量信号質量値を示す。
【図４】図４はＭＢＩＴを用いて行うことが可能なタンパク質の相対および絶対定量分析過程を示す概略図であって、（ａ）は相異なる条件で生成された同一タンパク質の未知量を相対定量分析するときに使用される定量分析過程であり、（ｂ）は 同定されたタンパク質の未知量を絶対定量分析するときに使用される定量分析過程である。
【図５（ａ）】図５（ａ）は同一の物性を有し且つ多様な質量値を有するＭＢＩＴセットのタンデム質量スペクトルで現れる特性を示す概略図である。
【図５（ｂ）】図５（ｂ）は、同一の物性を有し且つ多様な質量値を有するＭＢＩＴセットを２種以上用いて３つ以上の試料を同時に多重定量分析する過程を示す概略図である。
【図５（ｃ）】図５（ｃ）は、同一の物性を有し且つ多様な質量値を有するＭＢＩＴセットを２種以上用いて３つ以上の試料を同時に多重定量分析する過程を示す概略図である。
【図６】図６はＮ末端がアシル化されたジペプチド構造のＭＢＩＴ試薬を（ａ）固相合成法と（ｂ）液相有機合成法を用いて合成する過程を示す概略図である。
【図７】図７はＭＢＩＴ試薬を分析対象ペプチドと反応させるために活性エステルを形成する過程、およびこれにより形成されたＭＢＩＴ活性エステルを分析対象ペプチドと反応させる実験方法を示す概略図である。
【図８（ａ）】図８（ａ）はアンジオテンシンＩＩとロイシンエンケファリンとのペプチド混合物を８種のＮ末端がアシル化されたジペプチド構造のＭＢＩＴ試薬対と反応させた後、それぞれをＭＡＬＤＩ質量分析した結果を示す概略図であり、質量調節基を有するＡｃ−Ｘｘｘ−ＡｌａのＸｘｘがアラニンである図である。
【図８（ｂ）】図８（ｂ）はアンジオテンシンＩＩとロイシンエンケファリンとのペプチド混合物を８種のＮ末端がアシル化されたジペプチド構造のＭＢＩＴ試薬対と反応させた後、それぞれをＭＡＬＤＩ質量分析した結果を示す概略図であり、質量調節基を有するＡｃ−Ｘｘｘ−ＡｌａのＸｘｘがセリンである図である。
【図８（ｃ）】図８（ｃ）はアンジオテンシンＩＩとロイシンエンケファリンとのペプチド混合物を８種のＮ末端がアシル化されたジペプチド構造のＭＢＩＴ試薬対と反応させた後、それぞれをＭＡＬＤＩ質量分析した結果を示す概略図であり、質量調節基を有するＡｃ−Ｘｘｘ−ＡｌａのＸｘｘがバリンである図である。
【図８（ｄ）】図８（ｄ）はアンジオテンシンＩＩとロイシンエンケファリンとのペプチド混合物を８種のＮ末端がアシル化されたジペプチド構造のＭＢＩＴ試薬対と反応させた後、それぞれをＭＡＬＤＩ質量分析した結果を示す概略図であり、質量調節基を有するＡｃ−Ｘｘｘ−ＡｌａのＸｘｘがグルタミンである図である。
【図８（ｅ）】図８（ｅ）はアンジオテンシンＩＩとロイシンエンケファリンとのペプチド混合物を８種のＮ末端がアシル化されたジペプチド構造のＭＢＩＴ試薬対と反応させた後、それぞれをＭＡＬＤＩ質量分析した結果を示す概略図であり、質量調節基を有するＡｃ−Ｘｘｘ−ＡｌａのＸｘｘがヒスチジンである図である。
【図８（ｆ）】図８（ｆ）はアンジオテンシンＩＩとロイシンエンケファリンとのペプチド混合物を８種のＮ末端がアシル化されたジペプチド構造のＭＢＩＴ試薬対と反応させた後、それぞれをＭＡＬＤＩ質量分析した結果を示す概略図であり、質量調節基を有するＡｃ−Ｘｘｘ−ＡｌａのＸｘｘがフェニルアラニンである図である。
【図８（ｇ）】図８（ｇ）はアンジオテンシンＩＩとロイシンエンケファリンとのペプチド混合物を８種のＮ末端がアシル化されたジペプチド構造のＭＢＩＴ試薬対と反応させた後、それぞれをＭＡＬＤＩ質量分析した結果を示す概略図であり、質量調節基を有するＡｃ−Ｘｘｘ−ＡｌａのＸｘｘがアルギニンである図である。
【図８（ｈ）】図８（ｈ）はアンジオテンシンＩＩとロイシンエンケファリンとのペプチド混合物を８種のＮ末端がアシル化されたジペプチド構造のＭＢＩＴ試薬対と反応させた後、それぞれをＭＡＬＤＩ質量分析した結果を示す概略図であり、質量調節基を有するＡｃ−Ｘｘｘ−ＡｌａのＸｘｘがチロシンである図である。
【図９】図９は８種のＮ末端がアシル化されたジペプチド構造のＭＢＩＴ試薬対でそれぞれＭＢＩＴ反応が行われたアンジオテンシンＩＩイオン［ＭＡＧ（１）＋Ｈ］＋のＭＡＬＤＩタンデム質量分析結果を示す図である［質量調節基を有するＡｃ−Ｘｘｘ−Ａｌａ Ｘｘｘは（ａ）アラニン、（ｂ）セリン、（ｃ）バリン、（ｄ）グルタミン、（ｅ）ヒスチジン、（ｆ）フェニルアラニン、（ｇ）アルギニン、および（ｈ）チロシン］。
【図１０】図１０は図９の定量信号質量が表示される質量領域を拡大して示す図であって、ペプチドをタンデム質量分析する場合に２００Ｔｈ以下で生成できる断片イオンの分布と共に示した。Ｎ末端がアシル化されたジペプチド構造のＭＢＩＴ試薬（Ａｃ−Ｘｘｘ−Ａｌａ）において、質量調節基を含むＸｘｘが（ａ）アラニン、（ｂ）セリン、（ｃ）バリン、（ｄ）グルタミン、（ｅ）ヒスチジン、（ｆ）フェニルアラニン、（ｇ）アルギニン、および（ｈ）チロシンである場合のそのそれぞれの結果を示す。
【図１１】図１１はＭＢＩＴ反応の後、Ｈ＋が付いている形で検出されたロイシンエンケファリンイオン（［ＭＬＥ（１）＋Ｈ］＋）のタンデム質量分析結果スペクトルである。Ｎ末端がアシル化されたジペプチド構造のＭＢＩＴ試薬（Ａｃ−Ｘｘｘ−Ａｌａ）において、質量調節基を含むＸｘｘが塩基性の（ａ）ヒスチジン、（ｂ）アルギニンである場合のそれぞれの結果を示す。
【図１２】図１２はＭＢＩＴ試薬の質量調節基の種類による定量信号（ＸｂＳ、Ｘ＝ＨまたはＬ）の強さ、および定量信号から誘導される追加分解イオン（ＸａＳまたはＸｂＳ−ＮＨ３）の強さが全体断片イオンの信号強さの総合における占有比率を示す図である。エラーバーは８回の反復実験による標準偏差を意味する。
【図１３（ａ）】図１３（ａ）はＭＢＩＴ試薬で区分標識して多様な比率で混ぜたアンジオテンシンＩＩをタンデム質量分析で定量分析して得た標準定量分析曲線を示す図であり、Ｎ末端がアシル化されたジペプチド構造のＭＢＩＴ試薬（Ａｃ−Ｘｘｘ−Ａｌａ）において、質量調節基を含むＸｘｘがアラニンである場合の結果を示す図である。エラーバーは８回の反復実験による標準偏差を意味する。
【図１３（ｂ）】図１３（ｂ）はＭＢＩＴ試薬で区分標識して多様な比率で混ぜたアンジオテンシンＩＩをタンデム質量分析で定量分析して得た標準定量分析曲線を示す図であり、Ｎ末端がアシル化されたジペプチド構造のＭＢＩＴ試薬（Ａｃ−Ｘｘｘ−Ａｌａ）において、質量調節基を含むＸｘｘがセリンである場合の結果を示す図である。エラーバーは８回の反復実験による標準偏差を意味する。
【図１３（ｃ）】図１３（ｃ）はＭＢＩＴ試薬で区分標識して多様な比率で混ぜたアンジオテンシンＩＩをタンデム質量分析で定量分析して得た標準定量分析曲線を示す図であり、Ｎ末端がアシル化されたジペプチド構造のＭＢＩＴ試薬（Ａｃ−Ｘｘｘ−Ａｌａ）において、質量調節基を含むＸｘｘがバリンである場合の結果を示す図である。エラーバーは８回の反復実験による標準偏差を意味する。
【図１３（ｄ）】図１３（ｄ）はＭＢＩＴ試薬で区分標識して多様な比率で混ぜたアンジオテンシンＩＩをタンデム質量分析で定量分析して得た標準定量分析曲線を示す図であり、Ｎ末端がアシル化されたジペプチド構造のＭＢＩＴ試薬（Ａｃ−Ｘｘｘ−Ａｌａ）において、質量調節基を含むＸｘｘがグルタミンである場合の結果を示す図である。エラーバーは８回の反復実験による標準偏差を意味する。
【図１３（ｅ）】図１３（ｅ）はＭＢＩＴ試薬で区分標識して多様な比率で混ぜたアンジオテンシンＩＩをタンデム質量分析で定量分析して得た標準定量分析曲線を示す図であり、Ｎ末端がアシル化されたジペプチド構造のＭＢＩＴ試薬（Ａｃ−Ｘｘｘ−Ａｌａ）において、質量調節基を含むＸｘｘがヒスチジンである場合の結果を示す図である。エラーバーは８回の反復実験による標準偏差を意味する。
【図１３（ｆ）】図１３（ｆ）はＭＢＩＴ試薬で区分標識して多様な比率で混ぜたアンジオテンシンＩＩをタンデム質量分析で定量分析して得た標準定量分析曲線を示す図であり、Ｎ末端がアシル化されたジペプチド構造のＭＢＩＴ試薬（Ａｃ−Ｘｘｘ−Ａｌａ）において、質量調節基を含むＸｘｘがフェニルアラニンである場合の結果を示す図である。エラーバーは８回の反復実験による標準偏差を意味する。
【図１３（ｇ）】図１３（ｇ）はＭＢＩＴ試薬で区分標識して多様な比率で混ぜたアンジオテンシンＩＩをタンデム質量分析で定量分析して得た標準定量分析曲線を示す図であり、Ｎ末端がアシル化されたジペプチド構造のＭＢＩＴ試薬（Ａｃ−Ｘｘｘ−Ａｌａ）において、質量調節基を含むＸｘｘがアルギニンである場合の結果を示す図である。エラーバーは８回の反復実験による標準偏差を意味する。
【図１３（ｈ）】図１３（ｈ）はＭＢＩＴ試薬で区分標識して多様な比率で混ぜたアンジオテンシンＩＩをタンデム質量分析で定量分析して得た標準定量分析曲線を示す図であり、Ｎ末端がアシル化されたジペプチド構造のＭＢＩＴ試薬（Ａｃ−Ｘｘｘ−Ａｌａ）において、質量調節基を含むＸｘｘがチロシンである場合の結果を示す図である。エラーバーは８回の反復実験による標準偏差を意味する。
【図１４】図１４はＭＢＩＴ試薬で区分標識して多様な比率で混ぜたロイシンエンケファリンをタンデム質量分析で定量分析して得た標準定量分析曲線を示す図である。Ｎ末端がアシル化されたジペプチド構造のＭＢＩＴ試薬（Ａｃ−Ｘｘｘ−Ａｌａ）において、質量調節基を含むＸｘｘが（ａ）ヒスチジン、（ｂ）アルギニンである場合のそれぞれの結果を示す。
【図１５】図１５はＮ末端がアシル化されたジペプチド構造のＭＢＩＴで標識された分析体の定量分析測定限界を確認した結果である。
【図１６（ａ）】図１６（ａ）は同量のウシ血清アルブミンをトリプシンで酵素分解して生成されたペプチドをＭＢＩＴ試薬対で区分標識した後、混合して液相クロマトグラフィーおよびタンデム質量分析で定量分析した結果を示す図であり、ＹＬＹＥＩＡＲの配列を有するペプチドの結果を示しており、８種のＭＢＩＴ対で標識されたＹＬＹＥＩＡＲペプチドの液相クロマトグラフィー結果である。
【図１６（ｂ）】図１６（ｂ）は同量のウシ血清アルブミンをトリプシンで酵素分解して生成されたペプチドをＭＢＩＴ試薬対で区分標識した後、混合して液相クロマトグラフィーおよびタンデム質量分析で定量分析した結果を示す図であり、ＹＬＹＥＩＡＲの配列を有するペプチドの結果を示しており、質量調節基がアラミン側鎖である場合、各ＭＢＩＴ対で標識されたＹＬＹＥＩＡＲがクロマトグラフィーで検出されるそれぞれの分取(fraction)をＭＡＬＤＩタンデム質量分析で定量分析した結果を示す図である。定量分析して得られた相対的量の平均と標準偏差が数値でそれぞれ表示される。
【図１６（ｃ）】図１６（ｃ）は同量のウシ血清アルブミンをトリプシンで酵素分解して生成されたペプチドをＭＢＩＴ試薬対で区分標識した後、混合して液相クロマトグラフィーおよびタンデム質量分析で定量分析した結果を示す図であり、ＹＬＹＥＩＡＲの配列を有するペプチドの結果を示しており、質量調節基がセリン側鎖である場合、各ＭＢＩＴ対で標識されたＹＬＹＥＩＡＲがクロマトグラフィーで検出されるそれぞれの分取(fraction)をＭＡＬＤＩタンデム質量分析で定量分析した結果を示す図である。定量分析して得られた相対的量の平均と標準偏差が数値でそれぞれ表示される。
【図１６（ｄ）】図１６（ｄ）は同量のウシ血清アルブミンをトリプシンで酵素分解して生成されたペプチドをＭＢＩＴ試薬対で区分標識した後、混合して液相クロマトグラフィーおよびタンデム質量分析で定量分析した結果を示す図であり、ＹＬＹＥＩＡＲの配列を有するペプチドの結果を示しており、質量調節基がバリン側鎖である場合、各ＭＢＩＴ対で標識されたＹＬＹＥＩＡＲがクロマトグラフィーで検出されるそれぞれの分取(fraction)をＭＡＬＤＩタンデム質量分析で定量分析した結果を示す図である。定量分析して得られた相対的量の平均と標準偏差が数値でそれぞれ表示される。
【図１６（ｅ）】図１６（ｅ）は同量のウシ血清アルブミンをトリプシンで酵素分解して生成されたペプチドをＭＢＩＴ試薬対で区分標識した後、混合して液相クロマトグラフィーおよびタンデム質量分析で定量分析した結果を示す図であり、ＹＬＹＥＩＡＲの配列を有するペプチドの結果を示しており、質量調節基がグルタミン側鎖である場合、各ＭＢＩＴ対で標識されたＹＬＹＥＩＡＲがクロマトグラフィーで検出されるそれぞれの分取(fraction)をＭＡＬＤＩタンデム質量分析で定量分析した結果を示す図である。定量分析して得られた相対的量の平均と標準偏差が数値でそれぞれ表示される。
【図１６（ｆ）】図１６（ｆ）は同量のウシ血清アルブミンをトリプシンで酵素分解して生成されたペプチドをＭＢＩＴ試薬対で区分標識した後、混合して液相クロマトグラフィーおよびタンデム質量分析で定量分析した結果を示す図であり、ＹＬＹＥＩＡＲの配列を有するペプチドの結果を示しており、質量調節基がヒスチジン側鎖である場合、各ＭＢＩＴ対で標識されたＹＬＹＥＩＡＲがクロマトグラフィーで検出されるそれぞれの分取(fraction)をＭＡＬＤＩタンデム質量分析で定量分析した結果を示す図である。定量分析して得られた相対的量の平均と標準偏差が数値でそれぞれ表示される。
【図１６（ｇ）】図１６（ｇ）は同量のウシ血清アルブミンをトリプシンで酵素分解して生成されたペプチドをＭＢＩＴ試薬対で区分標識した後、混合して液相クロマトグラフィーおよびタンデム質量分析で定量分析した結果を示す図であり、ＹＬＹＥＩＡＲの配列を有するペプチドの結果を示しており、質量調節基がフェニルアラニン側鎖である場合、各ＭＢＩＴ対で標識されたＹＬＹＥＩＡＲがクロマトグラフィーで検出されるそれぞれの分取(fraction)をＭＡＬＤＩタンデム質量分析で定量分析した結果を示す図である。定量分析して得られた相対的量の平均と標準偏差が数値でそれぞれ表示される。
【図１６（ｈ）】図１６（ｈ）は同量のウシ血清アルブミンをトリプシンで酵素分解して生成されたペプチドをＭＢＩＴ試薬対で区分標識した後、混合して液相クロマトグラフィーおよびタンデム質量分析で定量分析した結果を示す図であり、ＹＬＹＥＩＡＲの配列を有するペプチドの結果を示しており、質量調節基がアルギニン側鎖である場合、各ＭＢＩＴ対で標識されたＹＬＹＥＩＡＲがクロマトグラフィーで検出されるそれぞれの分取(fraction)をＭＡＬＤＩタンデム質量分析で定量分析した結果を示す図である。定量分析して得られた相対的量の平均と標準偏差が数値でそれぞれ表示される。
【図１６（ｉ）】図１６（ｉ）は同量のウシ血清アルブミンをトリプシンで酵素分解して生成されたペプチドをＭＢＩＴ試薬対で区分標識した後、混合して液相クロマトグラフィーおよびタンデム質量分析で定量分析した結果を示す図であり、ＹＬＹＥＩＡＲの配列を有するペプチドの結果を示しており、質量調節基がチロシン側鎖である場合、各ＭＢＩＴ対で標識されたＹＬＹＥＩＡＲがクロマトグラフィーで検出されるそれぞれの分取(fraction)をＭＡＬＤＩタンデム質量分析で定量分析した結果を示す図である。定量分析して得られた相対的量の平均と標準偏差が数値でそれぞれ表示される。
【図１７】図１７は７種のアルキル基ＭＢＩＴ試薬対で反応が行われたアンジオテンシンＩＩのＭＡＬＤＩ質量分析結果を示す概略図である。ＭＢＩＴ試薬において、質量調節基が（ａ）エチル、（ｂ）プロピル、（ｃ）ブチル、（ｄ）ペンチル、（ｅ）ヘキシル、（ｆ）ヘプチル、および（ｇ）オクチルの場合をそれぞれ示す。ここで、ＸｎはＣｎの質量調節基を有するＮアシル化アミノ酸またはＮ−アシル−Ａｌａアミノ酸を意味する。
【図１８】図１８は７種のＭＢＩＴ試薬対でそれぞれＭＢＩＴ反応が行われたアンジオテンシンＩＩイオンのＭＡＬＤＩタンデム質量分析結果を示す図であって、各ＭＢＩＴ試薬対に対してＨＭＢＩＴで反応したペプチドとＬＭＢＩＴで反応したペプチドを１：１の混合比で混ぜてタンデム質量分析した結果である。 が（ａ）エチル、（ｂ）プロピル、（ｃ）ブチル、（ｄ）ペンチル、（ｅ）ヘキシル、（ｆ）ヘプチル、（ｇ）オクチルの質量調節基を有するＭＢＩＴが連結されたアンジオテンシンＩＩのＣＩＤスペクトルである。ここで、ＸｎはＣｎの質量調節基を有するＮアシル化アミノ酸またはＮ−アシル−Ａｌａアミノ酸を意味する。
【図１９】図１９はＭＢＩＴ試薬種類による各定量信号の強さを全体断片イオンの強さの総合に対する比率で計算して示す。
【図２０】図２０はＬＭＢＩＴが連結されたアンジオテンシンＩＩと、ＨＭＢＩＴが連結されたアンジオテンシンＩＩとを多様な混合比で混ぜて定量分析し、各混合比と測定によって得られた比の線形性を比較した図である。
【図２１】図２１はＭＢＩＴで標識された分析体の定量分析測定限界を確認した結果である。ＬＭＢＩＴ−とＨＭＢＩＴ−でそれぞれ標識されたアンジオテンシンＩＩを２：１の比率で混合した後、濃度を２倍ずつ持続的に薄めた試料をタンデム質量分析した結果のうち、定量信号質量（ｂＳ）が表示される領域を拡大した図である。ＭＢＩＴ試薬において、質量調節基が（ａ）エチル（Ｃ２）、（ｂ）ブチル（Ｃ４）、（ｃ）ペンチル（Ｃ５）、（ｄ）ヘキシル（Ｃ６）、（ｅ）ヘプチル（Ｃ７）、および（ｆ）オクチル（Ｃ８）の場合をそれぞれ示す。
【図２２】図２２は４つの相異なる生長条件で得られたＨＡ−Ｈｓｃ８２タンパク質の量、および定量分析を行うためにそれぞれの試料に使用したＭＢＩＴ試薬を示す図である。ＨＡ−Ｈｓｃ８２タンパク質を発現させた条件を（ａ）に示し、これらの条件下に生成されたＨＡ−Ｈｓｃ８２タンパク質を酵母から抽出および精製して電気泳動した後、Ｓｙｐｒｏ Ｒｕｂｙ ｓｔａｉｎで染色した結果を（ｂ）に示す。４つの条件のＨＡ−Ｈｓｃ８２タンパク質のゲルバンドを切り出してトリプシンで酵素分解した後、ＭＢＩＴ試薬に反応させたが、各タンパク質グループに反応したＭＢＩＴ試薬を（ｃ）に示す。ここで、ＸｎはＣｎの質量調節基を有するＮアシル化アミノ酸またはＮ−アシル−Ａｌａアミノ酸を意味する。
【図２３】図２３は図２２（ｃ）の６種の分析体を同量混合し、ＺｉｐＴｉｐで精製した後、質量分析した結果を示す図である。各分析体にはヘキシル（三角形）、ヘプチル（四角形）、およびオクチル（円形）の質量調節基を有するＭＢＩＴ試薬が付いている。５種のペプチドがタンデム質量分析に使用された。ここで、ＸｎはＣｎの質量調節基を有するＮアシル化アミノ酸またはＮ−アシル−Ａｌａアミノ酸を意味する。
【図２４】図２４はゲルイミジ化システムで定量した結果と、ＭＢＩＴ対で標識された分析体をＭＡＬＤＩタンデム質量分析で定量した結果とを比較して示す図である。 ４つの生長条件で得られたＨｓｃ８２タンパク質の相対的な量は３対のＭＢＩＴ試薬を用いて同時に定量することができる。
【図２５】図２５は（ａ）ヘキシル、（ｂ）ヘプチル、（ｃ）オクチルの質量調節基 を有するＭＢＩＴ対で標識された５種のペプチドのＭＡＬＤＩタンデム質量分析した結果からデノボ配列分析した結果を示す。アミノ酸コードに引かれた下線はその配列分析が正確に行われたことを意味する。アミノ酸コードに続く星印はそのアミノ酸にＭＢＩＴが標識されていることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、下記化学式１で表される可変質量ラベリング剤を提供する。
［化学式１］
【００２３】
【化１】
【００２４】
ここで、ＲＳおよびＲＢはそれぞれ直鎖または分枝鎖のＣ1〜Ｃ１８アルキルであり、ＲＳおよびＲＢの少なくとも一つは一つ以上の重水素を含み、ＲＴは質量調節基であり、リンカーは分析体との結合を誘導する反応性リンカーである。
【００２５】
本発明で使用される用語「反応性リンカー」は、アミンの求核攻撃に離脱基となる活性エステルであることを意味する。前記アミンは１次アミンであることを特徴とする。また、反応性リンカーは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル基、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル基、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシル基、ペンタハロベンジル基、４−ニトロフェニル基、および２−ニトロフェニル基よりなる群から選択できる。本発明の実施においては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル基がリンカーとして使用された。
【００２６】
本発明で使用される用語「前記質量調節基」は、分析体と結合した後、タンデム質量分析過程で分解されるとき、Ｎ-アシル化アミノ酸断片の質量を調節して定量信号がスペクトル上で他の断片と重ならないようにするために導入されるものを意味するものであって、ＲＴの種類を変えることにより、定量信号の質量を多様に変化させることができる。前記質量調節基は、類似または同一物性を有する天然または人工アミノ酸残基の側鎖のいずれか一つであることを特徴とする。
【００２７】
前記質量調節基のうち、天然アミノ酸残基の側鎖としては、アラニン（Ａｌａ）、セリン（Ｓｒ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、バリン（Ｖａｌ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、アルギニン（Ａｒｇ）、またはチロシン（Ｔｙｒ）の側鎖であり得る。
【００２８】
また、前記質量調節基は、直鎖または分枝鎖のＣ２〜Ｃ１８アルキルであってもよく、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチルまたはオクチルなどの直鎖または分枝鎖のアルキルであってもよい。
【００２９】
前記ＲＳおよびＲＢは、重水素を含んで同位元素の質量差による定量分析を可能とする役割を果たす。このため、前記ＲＳまたはＲＢはそれぞれ直鎖または分枝鎖Ｃ１〜Ｃ１８アルキルであり、ＲＳおよびＲＢの少なくとも一つは一つ以上の重水素を含み、好ましくは前記ＲＳおよびＲＢはメチルまたは一つ以上の重水素を含むメチルであることを特徴とする。前記ＲＳおよびＲＢは炭素の個数が同じアルキルからなっているが、含まれた重水素の数が互いに異ならなければならない。このような観点から、前記ＲＳとＲＢはそれぞれＣＨ３およびＣＤ３であり、或いはＣＤ３およびＣＨ３であることが好ましい。すなわち、前記化合物において、ＲＳとＲＢは、ＲＳがＣＨ３であればＲＢはＣＤ３であり、ＲＢがＣＨ３であればＲＳはＣＤ３である。
【００３０】
前記化学式１は、Ｎ末端がアシル化され、Ｃ末端にはアミンの求核攻撃に離脱基となるリンカーが付き、同位元素で標識されるジペプチドであることを特徴とする。また、前記ジペプチドは重水素で標識されるジペプチドであることを特徴とする。
【００３１】
また、本発明は、前記化学式１で表される可変質量ラベリング剤を２種以上含む可変質量ラベリング剤セットを提供する。
【００３２】
前記可変質量ラベリング剤セットは、前記化学式１で表される相異なる２化合物の対が一つのセットを成す。前記化合物対が、ＲＳとＲＢに含まれた重水素の総数が一定な化合物対になると、同位元素の質量差のため、スペクトル上で各試料の質量が異なり、その相対的強さを比較して定量分析を行うことができる。このような観点から、前記２種類以上の可変質量ラベリング剤それぞれのＲＳとＲＢに含まれた重水素の数が互いに異なり、前記２種類以上の可変質量ラベリング剤は互いに重水素の数が同一であることが好ましい。
【００３３】
すなわち、前記化合物対のＲＳとＲＢは、同一の炭素数を有する直鎖または分枝鎖のアルキルであり、第１化合物においてＲＳにＲＢより多い数の重水素を含んでいると、第２化合物ではＲＢの重水素の数がＲＳに比べて第１化合物の差異だけ多くなるように構成される。結果として、第１化合物と第２化合物の全体的な質量は同一に構成される。発明の実施において、実際合成されて使用された化合物対は、前記ＲＳとＲＢがそれぞれＣＨ３、ＣＤ３である化合物と、ＲＳとＲＢがそれぞれＣＤ３、ＣＨ３である化合物との対である。
【００３４】
また、本発明は、前記可変質量ラベリング剤セットを２種以上含む多重可変質量ラベリング剤セットを提供する。
【００３５】
また、本発明は、可変質量ラベリング剤で標識された分析体を含む混合物、その塩またはその水和物を提供する。本発明の実施において、前記化合物と分析体との結合は、リンカーが分析体のアミンと反応して離脱基として作用して分離されることにより行われる。
【００３６】
ここで、前記分析体は、タンパク質、炭水化物または脂質であることを特徴とする。また、前記分析体はペプチドであることを特徴とする。また、前記分析体は核酸または核酸誘導体であることを特徴とする。また、前記分析体はステロイドであることを特徴とする。
【００３７】
また、本発明は、可変質量ラベリング剤セットを分析体に結合させる段階と、前記可変質量ラベリング剤セットが結合した分析体を分解し、前記分析体を定量する段階とを含んでなることを特徴とする、ペプチド配列およびタンパク質定量同時分析方法を提供する。
【００３８】
ここで、前記定量のための分解法はタンデム質量分析法であることを特徴とする。
【００３９】
前記タンデム質量分析法は、ラベリング剤の質量調節基に応じて、分析における定量信号質量の位置が変わることを特徴とする。
【００４０】
前記定量信号質量を与える定量信号は、ｂＳイオン、ａＳイオン、ｂＳ−ＮＨ３イオン、
ｙＳｉｏｎ、およびＲＢ含有内部断片イオンよりなる群から選ばれる１種以上の断片イオンであることを特徴とする。
【００４１】
前記質量調節基が天然アミノ酸側鎖であれば、定量信号質量と標識シグニチャーは次のとおりである。
【００４２】
前記質量調節基がメチル基の場合、定量信号質量（ｂＳ）が１１４と１１７Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ａＳ）が８６と８９Ｔｈで現れ、標識シグニチャーが１８８Ｔｈで現れることを特徴とする。
【００４３】
前記質量調節基がセリン側鎖の場合、定量信号質量（ｂＳ）が１３０と１３３Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ａＳ）が１０２と１０５Ｔｈで現れ、標識シグニチャー（ｂ０）が２０４Ｔｈで現れることを特徴とする。
【００４４】
前記質量調節基がバリン側鎖の場合、定量信号質量（ｂＳ）が１４２と１４５Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ａＳ）が１１４と１１７Ｔｈで現れ、標識シグニチャー（ｂ０）が２１６Ｔｈで現れることを特徴とする。
【００４５】
前記質量調節基がグルタミン側鎖の場合、定量信号質量（ｂＳ）が１７１と１７４Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ａＳ）が１４３と１４６Ｔｈで現れ、標識シグニチャー（ｂ０）が２４５Ｔｈで現れることを特徴とする。
【００４６】
前記質量調節基がヒスチジン側鎖の場合、定量信号質量（ｂＳ）が１８０と１８３Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ａＳ）が１５２と１５５Ｔｈで現れ、標識シグニチャー（ｂ０）が２５４Ｔｈで現れることを特徴とする。
【００４７】
前記質量調節基がフェニルアラニン側鎖の場合、定量信号質量（ｂＳ）が１９０と１９３Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ａＳ）が１６２と１６５Ｔｈで現れ、標識シグニチャー（ｂ０）が２６４Ｔｈで現れることを特徴とする。
【００４８】
前記質量調節基がアルギニン側鎖の場合、定量信号質量（ｂＳ）が１９９と２０２Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ｂＳ−ＮＨ３）が１８２と１８５Ｔｈで現れ、標識シグニチャー（ｂ０）が２７３Ｔｈで現れることを特徴とする。
【００４９】
前記質量調節基がチロシン側鎖の場合、定量信号質量（ｂＳ）が２０６と２０９Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ａＳ）が１７８と１８１Ｔｈで現れ、標識シグニチャー（ｂ０）が２８０Ｔｈで現れることを特徴とする。
【００５０】
前記質量調節基が人工アミノ酸側鎖の場合、定量信号質量と標識シグニチャーは次のとおりである。
【００５１】
前記質量調節基がエチル基の場合、定量信号質量（ｂＳ）が１２８と１３１Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ａＳ）が１００と１０３Ｔｈで現れ、標識シグニチャー（ｂ０）が２０２Ｔｈで現れることを特徴とする。
【００５２】
前記質量調節基が直鎖または分枝鎖プロピル基の場合、定量信号質量（ｂＳ）が１４２と１４５Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ａＳ）が１１４と１１７Ｔｈで現れ、標識シグニチャー（ｂ０）が２１６Ｔｈで現れることを特徴とする。
【００５３】
前記質量調節基が直鎖または分枝鎖ブチル基の場合、定量信号質量（ｂＳ）が１５６と１５９Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ａＳ）が１２８と１３１Ｔｈで現れ、標識シグニチャー（ｂ０）が２３０Ｔｈで現れることを特徴とする。
【００５４】
前記質量調節基が直鎖または分枝鎖ペンチル基の場合、定量信号質量（ｂＳ）が１７０と１７３Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ａＳ）が１４２と１４５Ｔｈで現れ、標識シグニチャー（ｂ０）が２４４Ｔｈで現れることを特徴とする。
【００５５】
前記質量調節基が直鎖または分枝鎖ヘキシル基の場合、定量信号質量（ｂＳ）が１８４と１８７Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ａＳ）が１５６と１５９Ｔｈで現れ、標識シグニチ（ｂ０）ャが２５８Ｔｈで現れることを特徴とする。
【００５６】
前記質量調節基が直鎖または分枝鎖ヘプチル基の場合、定量信号質量（ｂＳ）が１９８と２０１Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ａＳ）が１７０と１７３Ｔｈで現れ、標識シグニチャー（ｂ０）が２７２Ｔｈで現れることを特徴とする。
【００５７】
前記質量調節基が直鎖または分枝鎖オクチル基の場合、定量信号質量（ｂＳ）が２１２と２１５Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ａＳ）が１８４と１８７Ｔｈで現れ、標識シグニチャー（ｂ０）が２８６Ｔｈで現れることを特徴とする。
【００５８】
また、本発明は、本発明に係る多重可変質量ラベリング剤セットを別の分析体に結合させ、分解して該当分析体を定量することを特徴とする、ペプチド配列およびタンパク質定量同時分析方法を提供する。
【００５９】
また、本発明は、本発明に係る多重可変質量ラベリング剤セットを分析体に結合させて定量する過程で、１種の試料と残りのそれぞれ異なる試料との比率を、質量調節基に応じて異なる定量信号質量によってそれぞれ別々に定量することにより、全体試料間の量を多重定量する分析方法を提供する。
【００６０】
以下、本発明の原理について図面を参照して具体的に説明する。
【００６１】
図１はＭＢＩＴ試薬および技術を示す概略図であって、（ａ）はＭＢＩＴ試薬の構造、（ｂ）はＭＢＩＴ試薬が１次アミン基に反応して標識される過程、（ｃ）はＭＢＩＴ試薬セットで区分標識されたペプチドをタンデム質量分析した場合に生成可能な断片イオン、（ｄ）は概略的なタンデム質量分析スペクトルをそれぞれ示す。
【００６２】
図１に示すように、理論的に限定されるのではないが、本発明に係る化合物１はＮ末端がアシル化され且つＣ末端にはリンカーが付いているジペプチドであって、図１（ａ）に表現されたような機能に区分できる。
【００６３】
このような化合物は、分析体の１次アミンと反応して図１（ｂ）に示すように分析体と結合することができる。同一の分子式に重水素が標識された部位のみが異なるＭＢＩＴ試薬対を、便宜上、ＨＭＢＩＴとＬＭＢＩＴに区分するが（Ｈ：ｈｅａｖｙ、Ｌ：Ｌｉｇｈｔ）、ＲＳに重水素が標識されたものをＨＭＢＩＴといい、ＲＢに重水素が標識されたものをＬＭＢＩＴという。このＬＭＢＩＴとＨＭＢＩＴとが結合した分析体は、全体的な重量は同一である。ところが、タンデム質量分析で現れる切断断片のうち、ＲＳとＲＢのいずれか一方のみを含んでいる断片は、ＬＭＢＩＴが連結された場合とＨＭＢＩＴが連結された場合に対して相異なる質量値を有し、図１の（ｃ−ｄ）におけるｂＳイオンのようにスペクトル上で異なる位置に現れる。これらピークの相対的強度はこれらが付いていた分析体の相対的な量として定量できる。これに対し、ＲＳとＲＢを全て含み或いは全く含まない切断断片の場合、質量値がＬＭＢＩＴ、ＨＭＢＩＴに関係なく一定に現れる。また、分析体がＭＢＩＴ試薬によって標識された場合、ｂＳイオンだけでなく、ｂｏイオンもスペクトル上で発見される。このｂｏイオンはＬＭＢＩＴ、ＨＭＢＩＴを問わずに一定に現れ、特定のＭＢＩＴによって分析体が標識されたことを確認可能にするから、標識シグニチャーイオン(tagging signature ion)として用いられる。
【００６４】
図２はＭＢＩＴ技術において質量調節基（ＲＴ）として使用できる天然アミノ酸残基の種類を示す概略図であって、（ａ）はＭＢＩＴ技術において定量信号質量を調節することが可能な質量調節基（ＲＴ）として使用できるアミノ酸残基と当該アミノ酸を用いたときに現れる定量信号質量対の質量値を、ペプチドをタンデム質量分析する場合に２００Ｔｈ以下の質量値で生成できる断片イオンの分布と共に示し、（ｂ）は本発明で用いられた８種の質量調節基であって、２２０Ｔｈ以下の質量値を有する断片イオンとの干渉が少ない質量調節基を示す。
【００６５】
質量調節基ＲＴの質量によって定量ピークの位置が異なるが、図２に示すように、アラニン（Ａｌａ）側鎖の場合には１１４／１１７Ｔｈで現れ、セリン（Ｓｅｒ）側鎖の場合には１３０／１３３Ｔｈで現れ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）側鎖の場合には１８０／１８３Ｔｈで現れ、バリン（Ｖａｌ）側鎖の場合には１４２／１４５Ｔｈで現れ、グルタミン（Ｇｌｎ）側鎖の場合には１７１／１７４Ｔｈで現れ、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）側鎖の場合には１９０／１９３Ｔｈで現れ、アルギニン（Ａｒｇ）側鎖の場合には１９９／２０２Ｔｈで現れ、チロシン（Ｔｙｒ）側鎖の場合には２０６／２０９Ｔｈで現れる。前述した質量調節基の場合、タンデム質量分析過程で生成される他の断片との重なりが少ない。前述した質量調節基以外にも、図２に示すようにトレオニン（Ｔｈｒ）、シスチン（Ｃｙｓ）、ロイシン（Ｌｅｕ）／イソロイシン（Ｉｌｅ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）の場合も質量調節基として使用される可能性を持っている。本特許の実施においては、図２ｂに示したアラニン（Ａｌａ）、セリン（Ｓｅｒ）、バリン（Ｖａｌ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、アルギニン（Ａｒｇ）、およびチロシン（Ｔｙｒ）の８つのアミノ酸側鎖が使用された。
【００６６】
図３はＭＢＩＴ技術において質量調節基（ＲＴ）として直鎖または分枝鎖のアルキル基を使用した場合の各ＭＢＩＴの固有値を示す図であって、（ａ）はＭＢＩＴ定量信号対の質量値を、タンデム質量分析する場合に２２０Ｔｈ以下の質量値で生成できる断片イオンの分布と共に概略に示し、（ｂ）は質量調節基として使用されたアルキル基の炭素数による各ＭＢＩＴの固有標識シグニチャーと定量信号質量値を示す。
【００６７】
質量調節基ＲＴの質量によって定量信号ＸｂＳの位置が変わるが、図３に示すように、メチル（Ｃ１）の場合には１１４／１１７Ｔｈで現れ、エチル（Ｃ２）の場合には１２８／１３１Ｔｈで現れ、直鎖または分枝鎖プロピル（Ｃ３）の場合には１４２／１４５Ｔｈで現れ、直鎖または分枝鎖ブチル（Ｃ４）の場合には１５６／１５９Ｔｈで現れ、直鎖または分枝鎖ペンチル（Ｃ５）の場合には１７０／１７３Ｔｈで現れ、直鎖または分枝鎖ヘキシル（Ｃ６）の場合には１８４／１８７Ｔｈで現れ、直鎖または分枝鎖ヘプチル（Ｃ７）の場合には１９８／２０１Ｔｈで現れ、直鎖または分枝鎖オクチル（Ｃ８）の場合には２１２／２１５Ｔｈで現れる。ＸｂＳから中性ＣＯ損失したＸａＳイオンは、質量調節基がメチルの場合には８６／８９Ｔｈで検出され、質量調節基がエチルの場合には１００／１０３Ｔｈで検出され、質量調節基が直鎖または分枝鎖プロピルの場合には１１４／１１７Ｔｈで検出され、質量調節基が直鎖または分枝鎖ブチルの場合には１２８／１３１Ｔｈで検出され、質量調節基が直鎖または分枝鎖ペンチルの場合には１４２／１４５Ｔｈで検出され、質量調節基が直鎖または分枝鎖ヘキシルの場合には１５６／１５９Ｔｈで検出され、質量調節基が直鎖または分枝鎖ヘプチルの場合には１７０／１７３Ｔｈで検出され、質量調節基が直鎖または分枝鎖オクチルの場合には１８４／１８７Ｔｈで検出される。また、各ＭＢＩＴの固有標識シグニチャー（ｂｏ）イオンは、質量調節基がメチルの場合には１８８Ｔｈで現れ、質量調節基がエチルの場合には２０２Ｔｈで現れ、質量調節基が直鎖または分枝鎖プロピルの場合には２１６Ｔｈで現れ、質量調節基が直鎖または分枝鎖ブチルの場合には２３０Ｔｈで現れ、質量調節基が直鎖または分枝鎖ペンチルの場合には２４４Ｔｈで現れ、質量調節基が直鎖または分枝鎖ヘキシルの場合には２５８Ｔｈで現れ、質量調節基が直鎖または分枝鎖ヘプチルの場合には２７２Ｔｈで現れ、質量調節基が直鎖または分枝鎖オクチルの場合には２８６Ｔｈで現れる。
【００６８】
本発明の一側面において、本発明は、下記化学式２で表される化合物と下記化合物とを結合させた分析体に関する。
［化学式２］
【００６９】
【化２】
【００７０】
ここで、ＲＳまたはＲＢは一つ以上の重水素を含む直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ１８アルキルであり、ＲＴは質量調節基である。本発明において、前記ＲＳまたはＲＢは含まれる重水素の数が互いに異なる同一のアルキルである。本発明の実施において、ＲＳまたはＲＢは、ＲＳがＣＨ３であればＲＢはＣＤ３であり、ＲＢがＣＨ３であればＲ２はＣＤ３である。本発明の実施において、前記質量調節基ＲＴは、製造上の便宜上、類似または同一物性の天然または人工アミノ酸の側鎖基の中からいずれか一つが選択できる。前記化学式２で表される化合物は、適切な活性化試薬との反応によって化学式１への変換が可能である。これに利用可能な活性化試薬としてはＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）／１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）の組み合わせ、１−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）／Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボイミド（ＤＩＣ）の組み合わせ、（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシル）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）などがあり、本発明の実施においてはＮＨＳ／ＥＤＣの組み合わせが用いられた。
【００７１】
図４はＭＢＩＴを用いて行うことが可能なタンパク質の相対および絶対定量分析過程を示す概略図であって、（ａ）は互いに異なる条件で生成された 同一タンパク質の未知量を相対定量分析するときに使用される定量分析過程を示し、（ｂ）は同定されたタンパク質の未知量を絶対定量分析するときに使用される定量分析過程を示す。
【００７２】
前記ＭＢＩＴ化合物は、図４のような方式でタンパク質の配列および定量同時分析に活用される。図４の（ａ）および（ｂ）に示すように、ＭＢＩＴ化合物を用いて、両試料間の相対的量の比を定量する相対定量分析、およびある試料の絶対量を求める絶対定量分析の両方ともが可能である。
【００７３】
２−ｐｌｅｘ相対定量分析は、図４の（ａ）に示されている過程によって行われる。両試料（未知量）のタンパク質をそれぞれ酵素分解する。試料１由来のペプチドと試料２由来のペプチドをそれぞれＨＭＢＩＴまたはＬＭＢＩＴで区分標識した後、混合してクロマトグラフィーで分離し、しかる後に、これをタンデム質量分析過程によって配列分析および同時定量分析する。
【００７４】
前述した相対定量分析と同様の過程を経るが、２つの試料の一方を既知量のタンパク質またはペプチドにして実験を行う場合、図４の（ｂ）に示すように絶対定量分析が可能となる。
【００７５】
図５（ａ）は同一物性を有し且つ多様な質量値を有するＭＢＩＴセットのタンデム質量スペクトルに現れる特性を示す概略図であり、図５（ｂ）および図５（ｃ）は、２種以上のＭＢＩＴセットを用いて３つ以上の試料を同時に多重定量分析する過程を示す概略図である。
【００７６】
質量調節基の物性調節によって定量信号の質量値は異なり定量信号の強さは各ＭＢＩＴの間で類似に現れるので、同一物性の多数のＭＢＩＴを使用した多重定量分析が可能になる。
【００７７】
まず、多重定量分析のために、互いに異なる条件または環境で生成されたタンパク質試料を酵素分解してペプチドに作る。第１の多重定量分析方法は次の過程によって行われる。準備されたペプチドのうち、一つの条件で収穫したペプチドを比較対象の個数だけ同一の量で分取し、それぞれを、相異なる質量信号値を有するＨＭＢＩＴ（またはＬＭＢＩＴ）可変質量ラベリング剤と反応させる。比較しようとする対象ペプチドは、それぞれ相異なる質量信号値を有するＬＭＢＩＴ（またはＨＭＢＩＴ）可変質量ラベリング剤と反応させる。
【００７８】
第２の多重定量方法は、準備された各ペプチドを二等分した後、それぞれに相異なる種類のＭＢＩＴ試薬（ＨＭＢＩＴ（ｎ−１）とＬＭＢＩＴ（ｎ）、またはＬＭＢＩＴ（ｎ−１）とＨＭＢＩＴ（ｎ））を反応させる。このように標識された全てのペプチドを混合してクロマトグラフィーで分離し、それぞれの同重体親イオンをタンデム質量分析して配列分析および定量分析すると、同時に多数の試料の量を定量分析することができる。第１の多重定量分析法は、同一の対照群を使用するので、対照群との比較によって多数のサンプル間の相対的な量を直ちに知ることができる。
【００７９】
第１の多重定量分析法を使用するとき、それぞれの比較対象試料を標識するＭＢＩＴ化合物の種類を変えて定量分析を繰返し行うか、或いは対照群を別の条件の試料として選択すると、多重試料の定量分析結果を統計的に多様な組み合わせで得ることができるため、定量結果の正確度を高めることができる。第２の定量方法は、相対的な量の差異が大きいため、只１回の比較によって相対的な量を知り難い場合に適用する場合、第１の方法より正確な定量が可能になる。
【実施例】
【００８０】
以下、実施例および添付図面を参照して、本発明に係る可変質量ラベリング剤とこれを用いたペプチド酸配列およびタンパク質定量同時分析方法について詳細に説明する。ところが、本発明が後述の内容に限定されるのではなく、当該分野における通常の知識を有する者であれば、本発明の技術的思想を逸脱することなく、本発明を多様な形態に具現することができるであろう。
【００８１】
下記では、質量調節基がアラニン（Ａｌａ）、セリン（Ｓｅｒ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、バリン（Ｖａｌ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、アルギニン（Ａｒｇ）またはチロシン（Ｔｙｒ）側鎖であるものと、エチル（Ｃ２）、プロピル（Ｃ３）、ブチル（Ｃ４）、ペンチル（Ｃ５）、ヘキシル（Ｃ６）、ヘプチル（Ｃ７）またはオクチル（Ｃ８）であるものを区分して実施した。
【００８２】
エチル（Ｃ２）、プロピル（Ｃ３）、ブチル（Ｃ４）、ペンチル（Ｃ５）、ヘキシル（Ｃ６）、ヘプチル（Ｃ７）またはオクチル（Ｃ８）の質量調節基を有するＭＢＩＴ試薬の場合、該当ジペプチド構造を便宜上ＨＸｎ−ＡｌａまたはＬＸｎ−Ａｌａ（Ｈ：Heavy、Ｌ：light）で表記する。
【００８３】
１．酸型ＭＢＩＴ試薬の合成
酸型ＭＢＩＴ試薬（ＸＭＢＩＴ−ＯＨ、Ｘ＝ＬまたはＨ）は、標準固相ペプチド合成法または液相有機合成法によって合成された。標準固相ペプチド合成法としては、アミノ酸残基が質量調節基として使用され、該当質量調節基がアラニン（Ａｌａ）、セリン（Ｓｅｒ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、バリン（Ｖａｌ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、アルギニン（Ａｒｇ）またはチロシン（Ｔｙｒ）などの天然アミノ酸の側鎖であるＭＢＩＴ試薬と、アシル基またはアミノ酸残基が質量調節基として使用され、該当質量調節基がエチル（Ｃ２）、プロピル（Ｃ３）、ブチル（Ｃ４）、ペンチル（Ｃ５）、ヘキシル（Ｃ６）、ヘプチル（Ｃ７）またはオクチル（Ｃ８）である全てのＭＢＩＴ試薬を合成することができる。液相有機合成法としては、アミノ酸残基が質量調節基として使用され、当該質量調節基がヘキシル（Ｃ６）、ヘプチル（Ｃ７）またはオクチル（Ｃ８）である場合の酸型ＭＢＩＴ試薬を合成することができる。
【００８４】
図６の（ａ）はＮ末端がアシル化されたジペプチド構造のＭＢＩＴ試薬を固相合成法を用いて合成する過程を概略に示し、図６の（ｂ）は液相有機合成法による酸型ＭＢＩＴ試薬の合成過程を示す。
【００８５】
（ａ）固相ペプチド合成法を用いた合成
物質
無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ピペリジン、ジクロロメタン（ＤＣＭ、ＨＰＬＣグレード）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、ＨＰＬＣグレード）、チオアニソール（ＴＡ、＞９９．５％）、エタンジチオール（ＥＤＴ、＞９９．５％）、無水酢酸、プロピオン酸、酪酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、Ｎ−Ｆｍｏｃ−アラニンはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。酢酸−ｄ３、Ｎ−Ｆｍｏｃ−アラニン−３，３，３，−ｄ３はＣＤＮ ｉｓｏｔｏｐｅ（Ｔｏｒｏｎｔｏ、カナダ）から購入した。２−塩化トリチルレジンはＭｅｒｃｋから購入した。Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボイミド（ＤＩＣ）、１−ベンゾトリアゾール、およびＮ末端がＦｍｏｃで保護された他の全てのアミノ酸はＡｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈから購入した。
【００８６】
合成過程
１）段階１
Ｎ−Ｆｍｏｃ−アラニンまたはＮ−Ｆｍｏｃ−アラニン−３，３，３−ｄ３（７５ｍｇ）を、水分が完全に除去されたジクロロメタン溶液１ｍＬに溶かした。ジクロロメタンのみではよく溶けないので、１００μＬのＤＭＦを入れて完全に溶解させた。準備したＮ−Ｆｍｏｃアミノ酸溶液と１７０μＬのＤＩＰＥＡを、火炎乾燥したバイアルに入っている２−塩化トリチルレジン０．１ｇと混合し、２〜４時間緩やかに攪拌した。レジンをペプチド合成用ポリプロピレン材質のカートリッジ（総量：５ｍＬ）に移した後、十分な量のジクロロメタン／メタノール／ＤＩＰＥＡ混合溶液（１７／２／１、ｖ／ｖ／ｖ）で３回洗浄した。その後、十分な量のジクロロメタンで３回、ＤＭＦで２回さらに洗浄した後、ジクロロメタンで２回さらに洗浄し、しかる後に、レジンから溶液を完全に除去し、減圧条件で完全に乾燥させる。
【００８７】
２）段階２
段階１で製造された乾燥レジンに約３ｍＬ程度のＤＭＦを入れて２〜３分間十分振とうし、ＤＭＦを除去する過程を約５回繰返し行ってレジンをＤＭＦに十分浸漬した。ＤＭＦに混ざっている２５％ピペリジン溶液を約３ｍＬ程度レジンに混ぜ、５分間攪拌した後、溶液を除去した。その後、さらに２５％ピペリジン溶液を３ｍＬ程度レジンにさらに入れた後、１５分間攪拌し、溶液を除去した。しかる後に、レジンを十分な量のＤＭＦで３回、メタノールで３回洗浄し、さらにＤＭＦで３回洗浄した。
【００８８】
３）段階３
アミノ酸側鎖が質量調節基として使用されるＭＢＩＴ試薬を合成する場合には次のように製造した。
【００８９】
段階２で製造されたレジンに、ＤＭＦに０．６Ｍ濃度で溶かしたＦｍｏｃ−アミノ酸（アラニン、セリン、バリン、グルタミン、ヒスチジン、フェニルアラニン、アルギニン、およびチロシンのいずれか一つ）溶液を１ｍＬ仕込んだ。同様に、ＤＭＦにそれぞれ０．６Ｍ濃度で溶かした１−ベンゾトリアゾール溶液、ＤＩＣ溶液を１ｍＬずつ仕込み、２時間３０分ゆっくり攪拌した。その後、混合溶液を除去し、レジンを十分な量のＤＭＦで３回、メタノールで３回洗浄し、さらにＤＭＦで３回洗浄した。
【００９０】
アシル基が質量調節基として使用されるＭＢＩＴ試薬を合成する場合には次のように製造した。
【００９１】
段階２で製造されたアラニン−ｄ３（またはアラニン−ｄ０）が付いているレジンに、ＤＭＦに０．６Ｍ濃度で溶かしたＦｍｏｃ−アラニン−ｄ０溶液（またはＦｍｏｃ−アラニン−３，３，３−ｄ３）、１−ベンゾトリアゾール溶液、およびＤＩＣ溶液を１ｍＬずつ仕込み、２時間３０分ゆっくり攪拌した。その後、混合溶液を除去し、レジンをＤＭＦで３回、メタノールで３回洗浄し、さらにＤＭＦで３回洗浄した。
【００９２】
４）段階４
段階３で製造されたレジンに、ＤＭＦに混ざっている２５％ピペリジン溶液を約３ｍＬ程度添加し、５分間攪拌した後、溶液を除去した。その後、さらに２５％ピペリジン溶液を３ｍＬ程度レジンにさらに加えた後、１５分間攪拌し、溶液を除去した。その後、レジンを十分な量のＤＭＦで３回、メタノールで３回洗浄し、さらにＤＭＦで３回洗浄した。
【００９３】
５）段階５
アミノ酸側鎖が質量調節基として使用されるＭＢＩＴ試薬を合成する場合には次のように製造した。
【００９４】
段階４で製造されたレジンに、０．６Ｍ濃度でＤＭＦにそれぞれ溶かした酢酸または酢酸−ｄ３を１ｍＬ加えた。レジンに最初反応させたものがＦｍｏｃ−アラニンの場合には酢酸−ｄ３を使用し、Ｆｍｏｃ−アラニン−３，３，３−ｄ３の場合には重水素で標識されていない酢酸を使用した。また、０．６Ｍ濃度でＤＭＦにそれぞれ溶かした１−ベンゾトリアゾール溶液とＤＩＣ溶液を１ｍＬずつレジンに混ぜ、２時間３０分ゆっくり攪拌した。その後、混合溶液を除去し、レジンを十分な量のＤＭＦで３回、メタノールで３回、ＤＭＦで３回、さらにメタノールで３回洗浄した後、減圧条件で完全に乾燥させてバイアルに移した。
【００９５】
アシル基が質量調節基として使用されるＭＢＩＴ試薬を合成する場合には次のように製造した。
【００９６】
段階４で製造されたレジンに、０．６Ｍ濃度でＤＭＦにそれぞれ溶かしたカルボン酸（プロピオン酸、酪酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、またはノナン酸）、１−ベンゾトリアゾール溶液、およびＤＩＣ溶液を１ｍＬずつ仕込み、２時間３０分ゆっくり攪拌した。その後、混合溶液を除去し、レジンをＤＭＦで３回、メタノールで３回、ＤＭＦで３回、さらにメタノールで３回洗浄した後、減圧条件で完全に乾燥させてバイアルに移した。
【００９７】
６）段階６
段階５で製造されたレジンに、ＴＦＡ／ベンゼン／ＴＡ／蒸留水／ＥＤＴ混合溶液（１６．５／１／１／１／０．５、ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）２ｍＬを混ぜ、３時間攪拌した。この過程で合成された酸型ＭＢＩＴ試薬がレジンから分離された。レジンは全て濾過し、残った溶液を別途に集め、体積が２００μＬ以下となるように窒素によって乾燥させた。その溶液に、冷たく冷したエーテルを添加して白色粉末状の生成物（酸型ＭＢＩＴ試薬）を沈殿させた。沈殿した生成物は、冷たく冷したエーテルで３回または４回洗浄した後、減圧条件で完全に乾燥させた。
【００９８】
（ｂ）液相有機合成法を用いた合成
物質
２−アミノ−４−ペンテン酸、無水酢酸（Ａｃ２Ｏ−ｄ０）、Ｂｏｃ−ｌ−アラニン−ｄ０、ＴＦＡ、４−オクテン、５−デケン、１−ヘプテン、およびグラブス触媒(Grubb’s catalyst、2nd generation)はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入し、ｄｌ−アラニン−ｄ３、および過重水素化無水酢酸（Ａｃ２Ｏ−ｄ６）はＣＤＮ Ｉｓｏｔｏｐｅｓ（Ｑｕｅｂｅｃ、カナダ）から購入した。
【００９９】
合成過程
１）段階１
２−アミノ−４−ペンテン酸（２ｍｍｏＬ）をｐＨ９〜１０の水（４ｍＬ）に溶かし、無水酢酸（４．０ｍｍｏＬ）を０℃で投入した。８Ｍ ＮａＯＨを投入してｐＨ１０程度に調節し、反応混合物を４時間０℃で攪拌した。濃い塩酸溶液を投入してｐＨ２以下に作って反応を終了した。生成物はメタノールに溶かし、精製して乾燥させて２−アセトアミド−４−ペンテン酸を固体として回収した。
【０１００】
２）段階２
アラニンベンジルエステルは、Ｂｏｃで保護されたアラニンに臭化ベンジルを加えてＢｏｃ−アラニンベンジルエステルを作った後、ＴＦＡを加えてＢｏｃを除去する過程によって作られる。ジオキサンと水との混合物（２／１、ｖ／ｖ）に０．３３Ｍで溶けた１−アラニン−ｄ３（１ｍｍｏＬ）に、１．５ｍＬの１Ｍ ＮａＯＨとジ−３次−ブチルジカルボネート（１．１ｍｍｏＬ）を投入した後、室温で６時間攪拌した。ジオキサンを蒸発させた後、氷を用いて混合物を冷却し、ＫＨＳＯ４飽和水溶液を加えてｐＨを２〜３程度に低めた。有機生成物は３回にわたって１０ｍＬの酢酸エチル（ＥＡ）で抽出され、無水Ｎａ２ＳＯ４の下で乾燥した。シリカゲルクロマトグラフィー精製によって、Ｂｏｃ−ｄｌ−アラニン−ｄ３（０．１４ｇ、０．７４ｍｍｏＬ）が得られた。０．５ｍｍｏＬのＢｏｃ−ｄｌ−アラニン−ｄ０またはＢｏｃ−ｄｌ−アラニン−ｄ３を無水アセトン（５ｍＬ）に溶かし、炭酸カリウム（０．７５ｍｍｏＬ）と臭化ベンジル（０．５５ｍｍｏＬ）を加えた。５時間の還流後、反応生成物は室温に冷却し、濃縮された後、クロロホルム（１０ｍＬ）に溶解された。有機層を炭酸ナトリウムの飽和水溶液（３０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４の下で乾燥させた後、シリカゲルクロマトグラフィーで精製してＢｏｃ−アラニン−ｄ０ベンジルエステルまたはＢｏｃ−アラニン−ｄ３ベンジルエステルを白色固体として得た。Ｂｏｃ−アラニン−ｄ０ベンジルエステルまたはＢｏｃ−アラニン−ｄ３ベンジルエステル（０．９８ｍｍｏＬ）を無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）に溶かし、８ｍｍｏＬのＴＦＡを０℃で加えて１時間攪拌した。減圧の下で溶媒を除去した後、残留物は高真空の下で乾燥させた。油状生成物（アラニン−ｄ０ベンジルエステルまたはアラニン−ｄ３ベンジルエステル）は無水ＴＨＦ（２ｍＬ）に保管した。
【０１０１】
３）段階３
段階２で製造された、ＴＨＦ（５ｍＬ）に溶けたアラニン−ｄ０ベンジルエステルまたはアラニン−ｄ３ベンジルエステル（０．５５ｍｍｏＬ）に、ＢＯＰ試薬（１．０１ｍｍｏＬ）を加えた後、３０分間室温で攪拌した。ＤＩＰＥＡ（３．３６ｍｍｏＬ）を０℃で投入し、さらに室温で１５分間攪拌した後、段階１で製造された、無水ＴＨＦに溶けた２−アセト−ｄ３−アミド−４−ペンテン酸または２−アセト−ｄ０−アミド−４−ペンテン酸を加えた後、一晩室温で攪拌した。溶媒を蒸発させた後、残留物はＥＡに溶解させた。有機層を水で洗浄した。残留油状生成物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーで精製することにより、ベンジル２−（２−アセトアミド−４−ペンテンアミド）プロパネートを無色固体として得た。
【０１０２】
４）段階４
ＤＣＭに、段階３で製造されたベンジル２−（２−アセトアミド−４−ペンテンアミド）プロパネート、アルケン（４−オクテン、５−デケン、または１−ヘプテン）、およびグラブス触媒を仕込んで４０℃で２４時間還流させた。触媒と溶媒を除去した後、シリカゲルクロマトグラフィーで精製した。この反応生成物は、２０ｍｏｌ％のＰｄ（ＯＨ）２と共に無水エタノールで混合した後、室温で一晩１気圧のＨ２圧力下で攪拌した。触媒をフィルターリングして濾した後、生成物を真空下で濃縮し、メタノールとエーテルの１：１混合物を用いた再結晶を行うことにより、酸型ＭＢＩＴ試薬を得た。
【０１０３】
２．ＭＢＩＴ試薬と分析体ペプチドとの結合
物質
無水アセトニトリル（ＡＣＮ、ＨＰＬＣグレード）、無水ＤＭＦ、ヒドロキシルアミンヒドロクロライド、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、ＨＰＬＣグレード）、α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ＨＣＣＡ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）は、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌ）から購入した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）パウダーはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入した。
【０１０４】
ＭＢＩＴ試薬の活性エステル製造およびモデルペプチドとの反応
図７はＭＢＩＴ試薬を分析対象ペプチドと反応させるために活性エステルを形成する過程、およびこれにより形成されたＭＢＩＴ活性エステルを分析対象ペプチドと反応させる実験方法を示す概略図である。
【０１０５】
ＭＢＩＴ試薬のスクインイミジルエステル（ＯＳｕ）を製造する方法、およびモデルペプチドに反応させる過程は図７に概略に示されている。ＤＭＦに溶けているＸＭＢＩＴ−ＯＨ（Ｘ＝ＬまたはＨ）、ＥＤＣ、およびＮＨＳを最終濃度がそれぞれ６０、３５、４０ｍＭとなるように混合し、室温で４５分間攪拌した。このように生成されたＸＭＢＩＴ−ＯＳｕ溶液は追加精製過程なしで分析体との反応に直ちに利用した。
【０１０６】
モデルペプチドとしては、アンジオテンシンＩＩ（ＤＲＶＹＩＨＰＦ）またはロイシンエンケファリン（ＹＧＧＦＬ）を使用した。アミノ酸残基が質量調節基として使用され且つ前記質量調節基がアラニン（Ａｌａ）、セリン（Ｓｅｒ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、バリン（Ｖａｌ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、アルギニン（Ａｒｇ）、およびチロシン（Ｔｙｒ）などの天然アミノ酸側鎖であるＭＢＩＴ試薬で実験した場合には、アンジオテンシンＩＩとロイシンエンケファリンが１：１のモル比で混合されたモデルペプチド混合物を使用し、残りのエチル（Ｃ２）、プロピル（Ｃ３）、ブチル（Ｃ４）、ペンチル（Ｃ５）、ヘキシル（Ｃ６）、ヘプチル（Ｃ７）またはオクチル（Ｃ８）を質量調節基として使用した場合はアンジオテンシンＩＩのみをモデルペプチドとして使用した。
【０１０７】
モデルペプチドまたはモデルペプチド混合物を、０．４ｍＭの濃度となるように５０ｍＭの重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）バッファに溶かした。このモデルペプチド溶液１０μＬを、準備されたＬＭＢＩＴ−ＯＳｕまたはＨＭＢＩＴ−ＯＳｕ溶液１０μＬと混ぜ、室温で５時間攪拌した。その後、１０μＬのヒドロキシルアミン溶液（８０ｍＭ ｉｎ １００ｍＭ ＮａＨＣＯ３）を仕込み、少なくとも５時間以上攪拌して副反応を可逆させ、過量のＭＢＩＴ−ＯＳｕ試薬を不活性化させた。しかる後に、１０％ＴＦＡを５μＬ添加して反応を完全に終結させた。
【０１０８】
ＢＳＡのトリプシンペプチドに対するＭＢＩＴ反応
アミノ酸残基が質量調節基として使用され且つ該当質量調節基がアラニン（Ａｌａ）、セリン（Ｓｅｒ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、バリン（Ｖａｌ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、アルギニン（Ａｒｇ）、またはチロシン（Ｔｙｒ）などの天然アミノ酸側鎖であるＭＢＩＴ試薬を用いて、ＢＳＡのトリプシンペプチドを標識する反応を行った。
【０１０９】
ｐＨ８．１の１００ｍＭ重炭酸ナトリウムバッファに溶解したＢＳＡ（０．６ｍｇ／ｍＬ）は、０．１％酢酸に溶解した改質トリプシン（０．１μｇ／μＬ）と６０：１の重量比で混合して３８℃で１２時間培養した。得られたトリプシンペプチド溶液を１６μＬずつ分取してＨＭＢＩＴ−ＯＳｕまたはＬＭＢＩＴ−ＯＳｕ溶液１４μＬと混合して３０分間攪拌した。その後、さらにＨＭＢＩＴ−ＯＳｕまたはＬＭＢＩＴ−ＯＳｕ溶液６μＬを仕込み、３０分〜２時間さらに攪拌した。その後、１０μＬの１００ｍＭヒドロキシルアミンを仕込み、少なくとも４時間攪拌して副反応を可逆させた後、残っているＸＭＢＩＴ−ＯＳｕを除去した。反応は１０μＬの１０％ＴＦＡを仕込んで完全に終結させた。
【０１１０】
Ｈｓｃ８２のトリプシンペプチドに対するＭＢＩＴ反応
エチル（Ｃ２）、プロピル（Ｃ３）、ブチル（Ｃ４）、ペンチル（Ｃ５）、ヘキシル（Ｃ６）、ヘプチル（Ｃ７）またはオクチル（Ｃ８）を質量調節基として使用した場合のうち、アミノ酸残基を質量調節基として有し且つ該当質量調節基がヘキシル（Ｃ６）、ヘプチル（Ｃ７）またはオクチル（Ｃ８）であるＭＢＩＴ試薬を用いて、Ｈｓｃ８２のトリプシンペプチドに標識する反応を行った。
【０１１１】
Ｎ末端ヘマグルチン（ＨＡ）標識Ｈｓｃ８２タンパク質は、４つの相異なる生長条件で得られた。ＨＡ−Ｈｓｃ８２タンパク質を発現させた条件は、Ｈｓｃ８２のようなＨｓｐ９０ファミリーであるＨｓｐ８２タンパク質の存在有無と酵母の生長温度とを組み合わせて、図２２の（ａ）に示すように合計４つの場合に分けられる。ｎｏｒｍ３０はＨｓｐ８２とＨｓｃ８２タンパク質の両方ともを持っている酵母を３０℃で生育させた場合であり、ｎｏｒｍ３９はＨｓｐ８２とＨｓｃ８２タンパク質の両方ともを持っている酵母を、これらのタンパク質を過発現させるために３９℃で育てて場合であり、ｄｅｌ３０はＨｓｐ８２タンパク質のみが除去された酵母を３０℃で育てて場合であり、ｄｅｌ３９はＨｓｐ８２タンパク質のみが除去された酵母を３９℃で生育させて過発現させた場合である。これらの条件下で生成されたＨＡ−Ｈｓｃ８２タンパク質は、酵母から抽出されてアンチ−ＨＡマトリクス（ｃｌｏｎｅ３Ｆ１０、Ｒｏｃｈｅ）とＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いて分離および精製された。発現されたＨＡ−Ｈｓｃ８２タンパク質の量はＳｙｐｒｏ Ｒｕｂｙ Ｓｔａｉｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）で染色した後、ＶｅｒｓａＤｏｃ ５０００ＭＰゲルイミジ化システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）で定量した。
【０１１２】
Ｈｓｃ８２のペプチドを得るために、次の方法でトリプシンを用いて各試料を酵素分解した。ゲルからタンパク質バンドを切り出した後、１００ｍＭ ＮａＨＣＯ３バッファに２０分間放置した。バッファを除去した後、ゲルを細かく切断し、ＡＣＮを加えて水を除去した。各試料に、５０ｍＭ ＮａＨＣＯ３バッファに溶けているトリプシン０．６６μｇを加えた後、３７℃で２０時間反応させた。蒸留水とＡＣＮとの混合溶液を用いてゲル断片からペプチドを抽出した後、各試料別に乾燥させた。
【０１１３】
乾燥した各試料に３５μＬの蒸留水を加えて溶かした。このように準備された各試料溶液を４μＬずつ分取してＨＭＢＩＴ−ＯＳｕとＬＭＢＩＴ−ＯＳｕ溶液４μＬと混合して５時間攪拌した。この際、ｎｏｒｍ３９とＬＸ６−Ａｌａを、ｄｅｌ３０とＬＸ７−Ａｌａを、ｄｅｌ３９とＬＸ８−Ａｌａを、ｎｏｒｍ３０とＨＸ６−Ａｌａ、 ＨＸ７−ＡｌａおよびＨＸ８−Ａｌａをそれぞれ反応させた。その後、４μＬのヒドロキシルアミン溶液（８０ｍＭ）を仕込み、少なくとも５時間以上攪拌して副反応を可逆させ、過量のＭＢＩＴ−ＯＳｕ試薬を不活性化させた。しかる後に、１０％ＴＦＡを２μＬ添加して反応を完全に終結させた。
【０１１４】
ＭＢＩＴ−モデルペプチドのＭＡＬＤＩ試料の製造
ＸＭＢＩＴが連結されたモデルペプチド溶液は、ＭＡＬＤＩ質量分析のために０．１％ＴＦＡ溶液に５００倍希釈した。ＬＭＢＩＴおよびＨＭＢＩＴが連結されたモデルペプチドは、７つの多様な比率で混合した。（［Ｌ］／［Ｈ］＝１／１、２．３／１、４／１、６．３／１、９／１、１２．３／１、１６／１）の７つの混合比で準備された各試料は、マトリクス溶液（５ｍｇ／ｍＬ ＨＣＣＡ ｉｎ ５０／５０／０．１、Ｈ２Ｏ／ＡＣＮ／ＴＦＡ）と１：１の体積比で混合した。試料／マトリクス混合物１μＬがＭＡＬＤＩプレートにロードされた。一つの試料スポット当りロードされたモデルペプチドの量はアンジオテンシンＩＩとロイシンエンケファリンがそれぞれ約２５０ｆｍｏｌずつであった。
【０１１５】
ＭＢＩＴに連結されたＢＳＡまたはＨｓｃ８２トリプシンペプチドのＬＣ−ＭＡＬＤＩ試料の製造
ＨＭＢＩＴまたはＬＭＢＩＴに連結されたトリプシンペプチド１：１の比率で混合し、その一分取量（６．４μＬ）を、ＰｅｐＭａｐカラム（孔径１００Å、粒径３ｍｍ、内径７５ｍｍ、長さ１５０ｍｍ）を取り付けた逆相ナノ液相クロマトグラフィー（Reverse-Phase Nano-Liquid Chromatography、ＲＰ−ｎａｎｏ−ＬＣ）分離機（ＬＣ−ｐａｃｋｉｎｇｓ社、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）に注入した。ＬＣは流速０．３μＬ／分で６０分間作動し、２−溶媒勾配を用いて作動した。体積比でＨ２Ｏ／ＡＣＮ／ＴＦＡ＝９５／５／０．１の溶媒ＡとＡＣＮ＝ＴＦＡ＝１００／０．１の溶媒Ｂが２−溶媒勾配に利用された。［溶媒Ａ］／［溶媒Ｂ］勾配は１００／０から始まり、０〜２０分の間に３０／７０に変わり、２０〜４０の間に０／１００に変わり、４０〜４５分まで０／１００に維持された。４５分となる時点で１００／０に急激に落ち、４５〜６０分の間１００／０の比率が維持された。溶出される試料は、マトリクス溶液と共に２５秒毎に単一ＭＡＬＤＩスポットにＰｒｏｂｏｔ ｍｉｃｒｏｆｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｌｌｅｃｔｏｒを用いて集められた。６０分間合計１４４個のＭＡＬＤＩスポットにＬＣ溶出してくる試料が分取されて塗布された。
【０１１６】
ＭＡＬＤＩ−ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ
前記方法によってＭＡＬＤＩターゲットに塗布された試料を分析するために、４７００ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）が陽イオンモードで質量対電荷比の範囲５００〜２５００Ｔｈで使用された。各塗布されたスポットに対してＴｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ（ＴＯＦ）スペクトルは１０００個の反復レーザーショットに対する結果を蓄積することにより得られた。
【０１１７】
ＸＭＢＩＴに連結されたモデルペプチドのイオンは質量調節基ＲＴの種類によって相異なる質量対電荷比の位置で検出され、それぞれのＸＭＢＩＴに連結されたペプチドはタンデム質量分析のための親イオンとして選択された。ＸＭＢＩＴに連結されたＢＳＡトリプシンペプチドの場合、多様な配列のペプチドが多様な溶出時間で検出されることを確認した。
【０１１８】
タンデム質量分析のために、各選択された衝突誘起解離（Collision-Induced Dissociation、ＣＩＤ）を１．３×１０−６ｔｏｒｒの大気圧下で行った。このＣＩＤスペクトルは、２０００回の反復レーザーショットに対する結果を蓄積することにより得られた。ＣＩＤスペクトルは、ＡＢＩ−４７００ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒに共に提供されているＤａｔａＥｘｐｌｏｒｅｒプログラムを用いてベースラインが補正された。ベースライン補正の後、ＬｂＳ、ＨｂＳイオンの強さを測定して相対的な量の比を決定した。各ＣＩＤスペクトルをＰＥＡＫＳ４．５（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．，カナダ）を用いて分析することにより、デノボ(de novo)配列分析が行われた。
【０１１９】
３．ＭＢＩＴを用いた実際実験結果
（ａ）質量調節基がアラニン（Ａｌａ）、セリン（Ｓｅｒ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、バリン（Ｖａｌ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、アルギニン（Ａｒｇ）、またはチロシン（Ｔｙｒ）などの天然アミノ酸の側鎖である場合
−ＭＢＩＴ試薬の検証
製造されたＭＢＩＴ試薬に正常的に合成されたかを検証するために、それぞれのＭＢＩＴ試薬をアンジオテンシンＩＩ（１０４６．５Ｔｈ）に標識して［ＭＡＧ（１）＋Ｈ］＋イオンの質量を検出し（図８（ａ）〜図８（ｈ））、タンデム質量分析（図９）を行った。ＬＭＢＩＴとＨＭＢＩＴでそれぞれ標識されたアンジオテンシンＩＩは、同一の質量値で検出された。［ＭＡＧ（１）＋Ｈ］＋イオンの質量値は、質量調節基がそれぞれアラニン側鎖の場合には１２３３．６Ｔｈ、セリン側鎖の場合には１２４９．６Ｔｈ、バリン側鎖の場合には１２６１．７Ｔｈ、グルタミン側鎖の場合には１２９０．７Ｔｈ、ヒスチジン側鎖の場合には１２９９．７Ｔｈ、フェニルアラニン側鎖の場合には１３０９．７Ｔｈ、アルギニン側鎖の場合には１３１８．７Ｔｈ、チロシン側鎖の場合には１３２５．７Ｔｈである。標識シグニチャーと定量信号質量値は、質量調節基がアラニン側鎖の場合には１８８Ｔｈ（ｂ０）、１１４Ｔｈ（ＬｂＳ）、および１１７Ｔｈ（ＨｂＳ）、セリン側鎖の場合には２０４Ｔｈ（ｂ０）、１３０Ｔｈ（ＬｂＳ）および１３３Ｔｈ（ＨｂＳ）、バリン側鎖の場合には２１６Ｔｈ（ｂ０）、１４２Ｔｈ（ＬｂＳ）および１４５Ｔｈ（ＨｂＳ）、グルタミン側鎖の場合には２４５Ｔｈ（ｂ０）、１７１Ｔｈ（ＬｂＳ）および１７４Ｔｈ（ＨｂＳ）、ヒスチジン側鎖の場合には２５４Ｔｈ（ｂ０）、１８０Ｔｈ（ＬｂＳ）、および１８３Ｔｈ（ＨｂＳ）、フェニルアラニン側鎖の場合には２６４Ｔｈ（ｂ０）、１９０Ｔｈ（ＬｂＳ）および１９３Ｔｈ（ＨｂＳ）、アルギニン側鎖の場合には２７３Ｔｈ（ｂ０）、１９９Ｔｈ（ＬｂＳ）および２０２Ｔｈ（ＨｂＳ）、そしてチロシン側鎖の場合は２８０Ｔｈ（ｂ０）、２０６Ｔｈ（ＬｂＳ）および２０９Ｔｈ（ＨｂＳ）でそれぞれ計測された。前記結果より、本発明で製造された天然アミノ酸残基を用いたＭＢＩＴ試薬が正常的に合成されたことが分かる。
【０１２０】
−ＭＢＩＴ連結されたモデルペプチドのタンデム質量分析
図８（ａ）〜図８（ｈ）はアンジオテンシンＩＩとロイシンエンケファリンとのペプチド混合物を８種のＭＢＩＴ試薬対で反応させた後、それぞれをＭＡＬＤＩ質量分析した結果を概略的に示す図である。図２の（ｂ）に示した８つの相異なる質量調節基ＲＴを有する８種のＭＢＩＴ試薬対それぞれをモデルペプチドと反応させてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析した結果を図８（ａ）〜図８（ｈ）に示す。図８（ａ）〜図８（ｈ）に示すように、［ＭＸＸ（ｎ）＋Ｈ］＋のＸＸはペプチドの種類を示し（ＡＧ＝アンジオテンシンＩＩ、ＬＥ＝ロシンエンケファリン）、ｎはペプチドに連結されたＭＢＩＴ試薬の個数を示す。Ｎ末端がアシル化されたジペプチド構造のＭＢＩＴ試薬（Ｎ−アセチル−ＸＸＸ−ＡｌａまたはＡｃ−ＸＡ）において、質量調節基を含むＸｘｘ（またはＸ）がアラニン（図８（ａ））、セリン（図８（ｂ））、バリン（図８（ｃ））、グルタミン（図８（ｄ））、ヒスチジン（図８（ｅ））、フェニルアラニン（図８（ｆ））、アルギニン（図８（ｇ））、およびチロシン（図８（ｈ））の場合をそれぞれ示した。質量調節基がアラニンの場合には１２３３．６Ｔｈ、セリンの場合には１２４９．６Ｔｈ、バリンの場合には１２６１．７Ｔｈ、グルタミンの場合には１２９０．７Ｔｈ、ヒスチジンの場合には１２９９．７Ｔｈ、フェニルアラニンの場合には１３０９．７Ｔｈ、アルギニンの場合には１３１８．７Ｔｈ、チロシンの場合には１３２５．７ＴｈでアンジオテンシンＩＩに該当する［ＭＡＧ（１）＋Ｈ］＋イオンが検出された。また、質量調節基がヒスチジンの場合とアルギニンの場合、８０９．５Ｔｈと８２８．５Ｔｈでロイシンエンケファリンに該当する［ＭＬＥ（１）＋Ｈ］＋イオンがそれぞれ検出された。モデルペプチドにそれぞれのＭＢＩＴ試薬で反応が行われた後で増加する質量値が、該当ＭＢＩＴ試薬によって理論的に増加しなければならない質量値と一致するので、各ＭＢＩＴ試薬は成功的に合成された。
【０１２１】
ロイシンエンケファリンは、質量調節基（ＲＴ）が塩基性を呈する場合にのみＨ＋が付いている状態で検出された。ＭＢＩＴに連結されたアンジオテンシンＩＩ［ＭＡＧ（１）＋Ｈ］＋）は、質量調節基ＲＴの種類と関係なく全てＭＡＬＤＩ質量分析によって検出された。アンジオテンシンＩＩのチロシン側鎖に副反応がさらに行われたと思われる［ＭＡＧ（２）＋Ｈ］＋も発見されたが、［ＭＡＧ（１）＋Ｈ］＋に比べて強さが弱かった。反応が行われていないアンジオテンシンＩＩ（［ＭＡＧ（０）＋Ｈ］＋）は、図８（ｅ）に示すように、ヒスチジンの側鎖が質量調節基ＲＴとして使用された場合（Ａｃ−ＨＡ ＭＢＩＴ）にのみ比較的大きく現れた。これはＡｃ−ＨＡ ＭＢＩＴの合成および分離精製過程を最適化して試薬の純度を高めることさえすれば解決される問題である。このＡｃ−ＨＡ ＭＢＩＴを除いた残りのＭＢＩＴをペプチドに連結する反応は図８（ａ）〜図８（ｈ）の信号強さ比から推定したときに完結に近く行われた。
【０１２２】
ロイシンエンケファリンは、アンジオテンシンＩＩとは異なり、ペプチド配列に塩基性のアミノ酸が存在しないため、ＭＡＬＤＩイオン化の収率が低下する。よって、一般にＭＡＬＤＩ質量分析スペクトル上であまり検出されない。ところが、図８（ｅ）と図８（ｆ）に示すように、塩基性の質量調節基ＲＴを有するＡｃ−ＨＡとＡｃ−ＲＡ ＭＢＩＴがロイシンエンケファリンに連結されたときには、強い信号強さでＭＡＬＤＩ質量分析によって検出された。これにより、塩基性質量調節基を有するＭＢＩＴ試薬は既存のＭＡＬＤＩ質量分析によってあまり検出されなかったペプチドのイオン化収率を増大させて検出を可能にする付加的な機能を持っていることが分かった。
【０１２３】
図９は８種のＭＢＩＴ試薬対でそれぞれＭＢＩＴ反応が行われたアンジオテンシンＩＩイオン［ＭＡＧ（１）＋Ｈ］＋）のＭＡＬＤＩタンデム質量分析結果を示す図であって、各ＭＢＩＴ試薬対に対してＨＭＢＩＴで反応したペプチドとＬＭＢＩＴで反応したペプチドを１：１の混合比で混ぜてタンデム質量分析した結果である。互いに異なるアミノ酸残基を有するＭＢＩＴ試薬が連結されたそれぞれのアンジオテンシンＩＩイオンのＣＩＤスペクトルを示すもので、図７の（ａ〜ｈ）においてそれぞれＡｃ−ＡＡ、Ａｃ−ＳＡ、Ａｃ−ＶＡ、Ａｃ−ＱＡ、Ａｃ−ＨＡ、Ａｃ−ＦＡ、Ａｃ−ＲＡ、およびＡｃ−ＹＡのＭＢＩＴが連結されたアンジオテンシンＩＩのＣＩＤスペクトルである。各種類のＭＢＩＴ試薬に対して［Ｌ］／［Ｈ］の混合比が１：１である試料のＣＩＤスペクトルを示した。Ｎ末端の１次アミンにＭＢＩＴ試薬が連結されるため、Ｃ末端を含んでいる断片としてのｙタイプイオンは、ＭＢＩＴ試薬の種類を問わずに同一の質量対電荷比の値をもって検出された。これに対し、Ｎ末端を含んでいる断片ａ−またはｂ−タイプイオンは質量調節基の種類によって互いに異なる位置で検出された。図８（ｇ）のＡｃ−ＲＡ ＭＢＩＴが連結された場合を除けば、残りの７種のＭＢＩＴは通常ＣＩＤスペクトルにおける断片イオン分布が類似であった。Ａｃ−ＲＡ ＭＢＩＴのアルギニン側鎖の強い塩基性が断片イオンの分布に変化を及ぼすということが分かった。標識シグニチャー（ｂ０）および定量信号として使用されるＸｂＳイオン対（Ｘ＝ＬまたはＨ）は、ＭＢＩＴの種類によって異なる質量対電荷比の値で現れた。Ａｃ−ＡＡ ＭＢＩＴの場合は１８８Ｔｈ（ｂ０）、１１４Ｔｈ（ＬｂＳ）、１１７Ｔｈ（ＨｂＳ）で、Ａｃ−ＳＡ ＭＢＩＴの場合は２０４Ｔｈ（ｂ０）、１３０Ｔｈ（ＬｂＳ）、１３３Ｔｈ（ＨｂＳ）で、Ａｃ−ＶＡ ＭＢＩＴの場合は２１６Ｔｈ（ｂ０）、１４２Ｔｈ（ＬｂＳ）、１４５Ｔｈ（ＨｂＳ）で、Ａｃ−ＱＡ ＭＢＩＴの場合は２４５Ｔｈ（ｂ０）、１７１Ｔｈ（ＬｂＳ）、１７４Ｔｈ（ＨｂＳ）で、Ａｃ−ＨＡ ＭＢＩＴの場合は２５４Ｔｈ（ｂ０）、１８０Ｔｈ（ＬｂＳ）、１８３Ｔｈ（ＨｂＳ）で、Ａｃ−ＦＡ ＭＢＩＴの場合は２６４Ｔｈ（ｂ０）、１９０Ｔｈ（ＬｂＳ）、１９３Ｔｈ（ＨｂＳ）で、Ａｃ−ＲＡ ＭＢＩＴの場合は２７３Ｔｈ（ｂ０）、１９９Ｔｈ（ＬｂＳ）、２０２Ｔｈ（ＨｂＳ）で、Ａｃ−ＹＡ ＭＢＩＴの場合は２８０Ｔｈ（ｂ０）、２０６Ｔｈ（ＬｂＳ）、２０９Ｔｈ（ＨｂＳ）でそれぞれ定量信号イオン対が現れた。これは図２の（ｂ）で予想される値と一致し、これによってもＭＢＩＴ試薬が完璧に合成されたことが分かる。
【０１２４】
ＸｂＳイオン対は、ＣＩＤ過程に由来する剰余エネルギーによってさらに分解が起こり得る。図９に示すように、Ａｃ−ＲＡ ＭＢＩＴに連結された場合は、アルギニン側鎖における中性ＮＨ３損失が大きいため、ＸｂＳ−ＮＨ３の信号が１８２、１８５Ｔｈでさらに観測された。 ＸｂＳから中性ＣＯ損失に該当する２８Ｄａの質量が減少したＸａＳイオンが、 残り７種のＭＢＩＴのうち、 Ａｃ−ＡＡ ＭＢＩＴの場合には８６Ｔｈ（ＬａＳ）、８９Ｔｈ（ＨａＳ）で、Ａｃ−ＳＡ ＭＢＩＴの場合には１０２Ｔｈ（ＬａＳ）、１０５Ｔｈ（ＨａＳ）で、Ａｃ−ＶＡ ＭＢＩＴの場合には１１４Ｔｈ（ＬａＳ）、１１７Ｔｈ（ＨａＳ）で、Ａｃ−ＱＡ ＭＢＩＴの場合には１４３Ｔｈ（ＬａＳ）、１４６Ｔｈ（ＨａＳ）で、Ａｃ−ＨＡ ＭＢＩＴの場合には１５２Ｔｈ（ＬａＳ）、１５５Ｔｈ（ＨａＳ）で、Ａｃ−ＦＡ ＭＢＩＴの場合には１６２Ｔｈ（ＬａＳ）、１６５Ｔｈ（ＨａＳ）で、Ａｃ−ＹＡ ＭＢＩＴの場合には１７８Ｔｈ（ＬａＳ）、１８１Ｔｈ（ＨａＳ）でさらに検出された。
【０１２５】
図１０は定量信号対ＸｂＳが現れる位置を各ＭＢＩＴの種類別に拡大して示す図である。図１０に示すように、［Ｌ］／［Ｈ］混合比１／１にほぼ一致する［ＬｂＳ］／［ＨｂＳ］の信号強さ比を示している。Ａｃ−ＡＡ ＭＢＩＴを用いた場合、ＸｂＳ対が現れる１１４、１１７Ｔｈ近くで、ペプチド由来のものと推定される未知の雑音信号が大きく検出された。Ａｃ−ＳＡの場合は定量信号の強さが相対的に弱く、１／１の混合比とよく一致しない信号強さ比を示した。ところが、残り６種のＭＢＩＴを用いた場合、近くで雑音信号も殆ど見えず、混合比とほぼ類似している定量信号強さ比が観察された。
【０１２６】
図１１はＭＢＩＴに連結されたロイシンエンケファリンのＣＩＤスペクトルを示す図である。図１１の（ａ）はＡｃ−ＨＡが連結されて検出されたロイシンエンケファリンの結果であり、（ｂ）はＡｃ−ＲＡが連結されて検出された結果である。上述したＭＢＩＴに連結されたアンジオテンシンＩＩのＣＩＤ結果と同様に、ｙタイプイオンの位置はＭＢＩＴの種類を問わずに一定に維持されるが、ａ−、ｂ−タイプイオンの位置は質量調節基の質量差によって異なった。また、Ａｃ−ＲＡに連結されたロイシンエンケファリンの場合、Ｎ末端の方面にアルギニン側鎖が存在するため、ａ−およびｂ−タイプイオンで中性ＮＨ３損失が多く発見された。また、Ａｃ−ＨＡとＡｃ−ＲＡに連結されたロイシンエンケファリンの場合、それぞれ断片イオンの分布に対する大きい差を示した。これは、連結されたＭＢＩＴの種類に応じて、分析体ペプチドの物理化学的性質を様々に調節することができることをいい、質量調節基ＲＴが定量信号質量の変化だけでなく分析体の物性も調節することができることを示唆する。
【０１２７】
図１２はＭＢＩＴ試薬の種類による各定量信号の強さを全体断片イオンの強さの総合に対する比率で計算して示した。正確な定量分析のためには優先的に定量信号となるＸｂＳイオンの強さが強くなければならず、定量信号イオンがさらに分解してはならない。質量調節基がグルタミン、ヒスチジン側鎖の場合には、定量信号質量の強さが最も強く現れ、定量信号質量に対する追加分解イオンの強さが相対的に弱かった。ヒスチジンの側鎖が質量調節基の場合には、ＸｂＳイオンの強さが最も強く現れてアルギニン側鎖が使用された場合の５倍以上の定量信号が増幅したことが分かった。グルタミン側鎖が使用された場合には、ＸｂＳで追加分解が起こって生成されるＸａＳイオンの強さが相対的に最も弱く現れた。このような結果より、多様な質量調節基のうちヒスチジン或いはグルタミンの側鎖が、ＭＢＩＴを用いたペプチドおよびタンパク質の定量分析において最も優れた性能を示すことが分かった。
【０１２８】
図１３（ａ）〜図１３（ｈ）はＬＭＢＩＴが連結れたアンジオテンシンＩＩとＨＭＢＩＴが連結されたアンジオテンシンＩＩを前述した多様な混合比で混ぜて定量分析し、各混合比と測定によって得られた比との線形性を比較した図である。Ａｃ−ＳＡ ＭＢＩＴを除いた残り７種のＭＢＩＴは、アンジオテンシンＩＩの定量分析において混合比と一致する測定比を示していることが分かる。特にグルタミン、ヒスチジンの側鎖が質量調節基として使用されたＡｃ−ＱＡ ＭＢＩＴとＡｃ−ＨＡ ＭＢＩＴの場合、各測定値の標準偏差も最も小さく（測定値の２０％以内）、線形性も最も良好に現れた。これは前述したようにＡｃ−ＱＡとＡｃ−ＨＡ ＭＢＩＴの場合に定量信号の強さが強く現れるためであると推定される。この結果より、Ａｃ−ＱＡとＡｃ−ＨＡがペプチドおよびタンパク質定量分析において最も良い性能を発揮するＭＢＩＴであることを確認することができた。Ａｃ−ＳＡを用いた結果よりは、混合比と実験により得られた測定比とが全く一致せず、何の線形性も示さないことが分かった。これはＡｃ−ＳＡが連結されたアンジオテンシンＩＩのＣＩＤで定量信号強さの異なるＭＢＩＴを用いた場合に比べて小さいうえ、定量信号が現れる位置１３０、１３３Ｔｈに予想できない雑音信号が現れるためであると推定される。この雑音信号はＭＢＩＴで標識されていないアンジオテンシンＩＩにおいても現れる雑音信号である。
【０１２９】
図１４はロイシンエンケファリンの定量分析の線形性を確認する図であって、実際検出されたＡｃ−ＨＡ ＭＢＩＴが連結された場合と、Ａｃ−ＲＡ ＭＢＩＴが連結された場合に対する結果である。図１３（ａ）〜図１３（ｈ）のアンジオテンシンＩＩの結果と同様に、混合比と実験により測定した測定比とが良い線形性をもってよく一致することを確認することができる。
【０１３０】
図１５はＭＢＩＴで標識された分析体の定量分析測定限界を確認した結果である。ＬＭＢＩＴ−とＨＭＢＩＴ−でそれぞれ標識されたアンジオテンシンＩＩを３：１の比率で混合した後、タンデム質量分析した結果のうち、定量信号質量（ｂＳ）が表示される領域を拡大した図である。Ｎ−末端がアシル化されたジペプチド構造のＭＢＩＴ試薬（Ａｃ−Ｘｘｘ−Ａｌａ）において、質量調節基を含むＸｘｘが（ａ）バリン、（ｂ）グルタミン、（ｃ）ヒスチジン、（ｄ）フェニルアラニン、（ｅ）アルギニン、および（ｆ）チロシンである場合を示している。一つのＭＡＬＤＩスポットに２５０ｆｍｏｌの試料が塗布された場合から濃度を２倍ずつ持続的に薄め、現れる定量信号の信号対雑音比を観察した。これは検出限界が約４〜８ｆｍｏｌに達することを示す。これは本発明に使用したＭＡＬＤＩ質量分析機器の測定限界に該当する値であって、さらに良い装備を使用すればＭＢＩＴ試薬の測定限界はさらに低くなるだろうと期待される。
【０１３１】
図１６（ａ）〜図１６（ｉ）は同量のウシ血清アルブミンをトリプシンで酵素分解して生成されたペプチドをＭＢＩＴ試薬対で区分標識した後、混合して液相クロマトグラフィーおよびタンデム質量分析で定量分析した結果を示す図である。ＹＬＹＥＩＡＲの配列を有するペプチドの結果を示す。図１６（ａ）は８種のＭＢＩＴ対で標識されたＹＬＹＥＩＡＲペプチドが分離されてくる液相クロマトグラフィー結果を示し、図１６（ｂ）〜図１６（ｉ）は、質量調節基がそれぞれアラニン（図１６（ｂ））、セリン（図１６（ｃ））、バリン（図１６（ｄ））、グルタミン（図１６（ｅ））、ヒスチジン（図１６（ｆ））、フェニルアラニン（図１６（ｇ））、アルギニン（図１６（ｈ））、およびチロシン（図１６（ｉ））側鎖の場合、各ＭＢＩＴ対で標識されたＹＬＹＥＩＡＲがクロマトグラフィーで検出されるそれぞれの分取(fraction)をＭＡＬＤＩタンデム質量分析で定量分析した結果を示す。定量分析して得られた相対的量の平均と標準偏差が数値でそれぞれ表示された。タンパク質の定量および配列分析のために、液相クロマトグラフィーの活用が普遍的なので、ＭＢＩＴが実際分析体の定量および配列分析を正しくするためにはＨＭＢＩＴに連結されたペプチドとＬＭＢＩＴに連結された同一のペプチドがクロマトグラフィー上で同一の時間で溶出されなければならない。ＨＭＢＩＴとＬＭＢＩＴにそれぞれ連結された同一のペプチドは各分取別に混合比が一定に観察されるため、クロマトグラフィー上で溶出時間が同一であることが分かる。
【０１３２】
（ｂ）質量調節基がエチル（Ｃ２）、プロピル（Ｃ３）、ブチル（Ｃ４）、ペンチル（Ｃ５）、ヘキシル（Ｃ６）、ヘプチル（Ｃ７）またはオクチル（Ｃ８）の場合
−ＭＢＩＴ試薬の検証
製造されたＭＢＩＴ試薬に正常的に合成されたかを検証するために、それぞれのＭＢＩＴ試薬をアンジオテンシンＩＩ（１０４６．５Ｔｈ）に標識して［ＭＡＧ（１）＋Ｈ］＋イオンの質量を検出し（図１７）、タンデム質量分析（図１８）を行った。ＬＭＢＩＴとＨＭＢＩＴでそれぞれ標識されたアンジオテンシンＩＩは同一の質量値で検出された。［ＭＡＧ（１）＋Ｈ］＋イオンの質量値は、質量調節基がそれぞれエチルの場合には１２４７．７Ｔｈ、プロピルの場合には１２６１．７Ｔｈ、ブチルの場合には１２７５．７Ｔｈ、ペンチルの場合には１２８９．７Ｔｈ、ヘキシルの場合には１３０３．７Ｔｈ、ヘプチルの場合には１３１７．７Ｔｈ、オクチルの場合には１３３１．８Ｔｈで分析体がそれぞれ観察された。標識シグニチャーと定量信号質量値は、質量調節基がエチルの場合にはそれぞれ２０２Ｔｈ（ｂ０）、１２８Ｔｈ（ＬｂＳ）、および１３１Ｔｈ（ＨｂＳ）で、質量調節基がプロピルの場合にはそれぞれ２１６Ｔｈ（ｂ０）、１４２Ｔｈ（ＬｂＳ）、および１４５Ｔｈ（ＨｂＳ）で、質量調節基がブチルの場合にはそれぞれ２３０Ｔｈ（ｂ０）、１５６Ｔｈ（ＬｂＳ）、および１５９Ｔｈ（ＨｂＳ）で、質量調節基がペンチルの場合にはそれぞれ２４４Ｔｈ（ｂ０）、１７０Ｔｈ（ＬｂＳ）、および１７３Ｔｈ（ＨｂＳ）で、質量調節基がヘキシルの場合にはそれぞれ２５８Ｔｈ（ｂ０）、１８４Ｔｈ（ＬｂＳ）、および１８７Ｔｈ（ＨｂＳ）で、質量調節基がヘプチルの場合にはそれぞれ２７２Ｔｈ（ｂ０）、１９８Ｔｈ（ＬｂＳ）、および２０１Ｔｈ（ＨｂＳ）で、質量調節基がオクチルの場合にはそれぞれ２８６Ｔｈ（ｂ０）、２１２Ｔｈ（ＬｂＳ）、および２１５Ｔｈ（ＨｂＳ）で観測された。前記結果より、本発明で製造されたエチル（Ｃ２）、プロピル（Ｃ３）、ブチル（Ｃ４）、ペンチル（Ｃ５）、ヘキシル（Ｃ６）、ヘプチル（Ｃ７）またはオクチル（Ｃ８）を質量調節基として用いたＭＢＩＴ試薬が正常的に合成されたことが分かる。
【０１３３】
−ＭＢＩＴ連結された標準ペプチドのタンデム質量分析
製造されたＭＢＩＴ試薬とペプチドとの反応性を確認するために、それぞれのＭＢＩＴ試薬をアンジオテンシンＩＩ（１０４６．５Ｔｈ）で反応させて質量分析した。図１７は互いに異なる質量調節基ＲＴを有する７種のＭＢＩＴ試薬対それぞれをモデルペプチドとしてのアンジオテンシンＩＩと反応させてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析した結果である。ＭＢＩＴ試薬において、質量調節基が（ａ）エチル、（ｂ）プロピル、（ｃ）ブチル、（ｄ）ペンチル、（ｅ）ヘキシル、（ｆ）ヘプチル、および（ｇ）オクチルの場合をそれぞれ示した。図１７から分かるように、質量調節基がエチルの場合には１２４７．７Ｔｈ、質量調節基がプロピルの場合には１２６１．７Ｔｈ、質量調節基がブチルの場合には１２７５．７Ｔｈ、質量調節基がペンチルの場合には１２８９．７Ｔｈ、質量調節基がヘキシルの場合には１３０３．７Ｔｈ、質量調節基がヘプチルの場合には１３１７．７Ｔｈ、質量調節基がオクチルの場合には１３３１．８Ｔｈでそれぞれ分析体が観測された。また、各分析体に対してタンデム質量分析によって標識シグニチャーおよび定量信号の質量値を確認した。その結果より、反応の行われていないペプチドまたはＭＢＩＴが２つ以上付いているペプチドなしで、アンジオテンシンＩＩに一つのＭＢＩＴが付いている反応結果物のみが存在するので、反応がよく行われたことが分かる。
【０１３４】
また、該当ＭＢＩＴ試薬対が与える定量信号質量を確認するために、７種のＭＢＩＴ試薬でそれぞれ反応が行われたアンジオテンシンＩＩイオンをＭＡＬＤＩタンデム質量分析した。図１８は各ＭＢＩＴ試薬対に対してＨＭＢＩＴが連結されたペプチドとＬＭＢＩＴが連結されたペプチドを１：１の混合比で混ぜてタンデム質量分析した結果を示す。図１８の（ａ）〜（ｇ）は、それぞれエチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、およびオクチルの質量調節基 を有する、ＭＢＩＴに連結されたアンジオテンシンＩＩのＣＩＤスペクトルである。その結果、図３の（ｂ）の予想値のように、標識シグニチャーと定量信号質量値は、質量調節基がエチルの場合にはそれぞれ２０２Ｔｈ（ｂ０）１２８Ｔｈ（ＬｂＳ）、および１３１Ｔｈ（ＨｂＳ）で、質量調節基がプロピルの場合にはそれぞれ２１６Ｔｈ（ｂ０）、１４２Ｔｈ（ＬｂＳ）、および１４５Ｔｈ（ＨｂＳ）で、質量調節基がブチルの場合にはそれぞれ２３０Ｔｈ（ｂ０）、１５６Ｔｈ（ＬｂＳ）、および１５９Ｔｈ（ＨｂＳ）で、質量調節基がペンチルの場合にはそれぞれ２４４Ｔｈ（ｂ０）、１７０Ｔｈ（ＬｂＳ）、および１７３Ｔｈ（ＨｂＳ）で、質量調節基がヘキシルの場合にはそれぞれ２５８Ｔｈ（ｂ０）、１８４Ｔｈ（ＬｂＳ）、および１８７Ｔｈ（ＨｂＳ）で、質量調節基がヘプチルの場合にはそれぞれ２７２Ｔｈ（ｂ０）、１９８Ｔｈ（ＬｂＳ）、および２０１Ｔｈ（ＨｂＳ）で、質量調節基がオクチルの場合にはそれぞれ２８６Ｔｈ（ｂ０）、２１２Ｔｈ（ＬｂＳ）、および２１５Ｔｈ（ＨｂＳ）で観測された。Ｎ末端の１次アミンにＭＢＩＴ試薬が連結されるため、Ｃ末端を含んでいる断片としてのｙタイプイオンは、ＭＢＩＴ試薬の種類を問わずに同一の質量対電荷比の値をもって検出された。また、全ての場合に大抵ＣＩＤスペクトルにおける断片イオンの分布が類似であった。これは各質量調節基の長さ差が断片イオンの分布に影響を及ぼさないことを示唆する。このような結果より、ＭＢＩＴ試薬が正しく合成されたこと、およびモデルペプチドとの反応が完璧に行われたことを確認することができる。
【０１３５】
図１９はＭＢＩＴ試薬の種類による各定量信号の強さを全体断片の強さの総合に対する比率で計算して示す。ＸｂＳの相対的大きさは、質量調節基がプロピル乃至オクチルの場合には３．８％程度と均一であり、質量調節基がメチルとエチルの場合にはそれぞれ１．９％、２．７％と他のＭＢＩＴに比べて小さかった。ＸａＳイオンの強さは質量調節基の長さが長いほど強く現れる。
【０１３６】
図２０はＬＭＢＩＴが連結されたアンジオテンシンＩＩとＨＭＢＩＴが連結されたアンジオテンシンＩＩを上述した多様な混合比で混ぜて定量分析し、各混合比と測定によって得られた比との線形性を示す図である。
【０１３７】
それぞれエチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチルおよびオクチルの質量調節基を有するＭＢＩＴ定量信号ＸａＳ（白色円）とＸｂＳ（黒色円）を用いた定量分析結果は図２０の（ａ）〜（ｇ）に示した。点線はＸａＳを用いた実験結果の趨勢線である。実線は ＸｂＳを用いた実験結果の趨勢線である。本発明に使用された全てのＭＢＩＴが、アンジオテンシンＩＩの定量分析において、混合比とよく一致する測定比を示していることが分かった。ＸａＳを用いた定量分析においても、ＸｂＳと同じ程度の線形性を示す。これはＸｂＳだけでなくＸａＳも定量に利用可能であることを示す。
【０１３８】
図２１はＭＢＩＴで標識された分析体の定量分析測定限界を確認した結果である。ＬＭＢＩＴとＨＭＢＩＴでそれぞれ標識されたアンジオテンシンＩＩを２：１の比率で混合した後、濃度を２倍ずつ持続的に薄めた試料をタンデム質量分析した結果のうち、定量信号質量（ ＸｂＳ）が表示される領域を拡大した図である。質量調節基が（ａ）エチル、（ｂ）ブチル、（ｃ）ペンチル、（ｄ）ヘキシル、（ｅ）ヘプチル、および（ｆ）オクチルの場合を示した。一つのＭＡＬＤＩスポットに２５０ｆｍｏｌの試料が塗布された場合から濃度を２倍ずつ持続的に薄め、現れる定量信号の信号対雑音比を観察した。全ての場合に約５ｆｍｏｌ程度の試料を測定することができることを確認した。これは本発明に使用したＭＡＬＤＩ質量分析機器の測定限界に該当する値であって、さらによい装備を使用する場合には、ＭＢＩＴ試薬の測定限界はさらに低くなるだろうと期待される。
【０１３９】
図２２は４つの相異なる成長条件で得られたＨＡ−Ｈｓｃ８２タンパク質の量と定量分析のためにそれぞれの試料に使用したＭＢＩＴ試薬を示す図である。ＨＡ−Ｈｓｃ８２タンパク質を発現させた条件を図２２の（ａ）に示した。ｎｏｒｍ３０はＨｓｐ８２とＨｓｃ８２タンパク質の両方ともを持っている酵母を３０℃で育てた場合であり、ｎｏｒｍ３９はＨｓｐ８２とＨｓｃ８２タンパク質の両方ともを持っている酵母を３９℃で育てた場合であり、ｄｅｌ３０はＨｓｐ８２タンパク質のみが除去された酵母を３０℃で育てた場合であり、ｄｅｌ３９はＨｓｐ８２タンパク質のみが除去された酵母を３９℃で育てた場合である。これらの条件下で生成されたＨＡ−Ｈｓｃ８２タンパク質を酵母から抽出および精製して電気泳動した後、Ｓｙｐｒｏ Ｒｕｂｙ ｓｔａｉｎで染色した結果を図２２の（ｂ）に示した。ゲルイミジ化システムでタンパク質の量を測定した結果、ｎｏｒｍ３０は３．４９μｇ、ｎｏｒｍ３９は５．７４μｇ、ｄｅｌ３０は２．９３μｇ、ｄｅｌ３９は４．９０μｇであった。４つの条件のＨＡ−Ｈｓｃ８２タンパク質のゲルバンドを切り出してトリプシンで酵素分解した後、ＭＢＩＴ試薬に反応させたが、各タンパク質グループに反応したＭＢＩＴ試薬を図２２の（ｃ）に示した。この際、ｎｏｒｍ３９とＬＸ６−Ａｌａを、ｄｅｌ３０とＬＸ７−Ａｌａを、ｄｅｌ３９とＬＸ８−Ａｌａを、ｎｏｒｍ３０とＨＸ６−Ａｌａ、ＨＸ７−Ａｌａおよび ＨＸ８−Ａｌａをそれぞれ反応させた（ＸｎはＣｎの質量調節基を有するＮアシル化アミノ酸またはＮ−アシル−Ａｌａアミノ酸を意味する。）。それぞれのＬＭＢＩＴとＨＭＢＩＴを１：１で混ぜて定量分析したときに予想される比率は、質量調節基がヘキシルの場合には１．６４であり、ヘプチルの場合には０．８４であり、オクチルの場合には１．４０である（ｎｏｒｍ３０：ｎｏｒｍ３９：ｄｅｌ３０：ｄｅｌ３９＝１：１．６４：０．８４：１．４０）。
【０１４０】
図２３は図２２（ｃ）の６種の分析体を同量混合し、ＺｉｐＴｉＰで精製した後、質量分析した結果を示す図である。各分析体には、ヘキシル（三角形）、ヘプチル（四角形）、およびオクチル（円形）の質量調節基を有するＭＢＩＴ試薬が付いている。質量スペクトル上で、同一の分析体はそれぞれに標識されたＭＢＩＴの質量差異（１４Ｄａ）だけずつ分離されて現れる。観測されたペプチドのうち、５つのペプチドがタンデム質量分析に使用された（ＶＬＥＩＲ、ＥＩＦＬＲ、ＬＬＤＡＰＡＡＩＲ、ＱＬＥＴＥＰＤＬＦＩＲ、ＧＶＶＤＳＥＤＬＰＬＮＬＳＲ）。
【０１４１】
図２４はゲルイミジ化システムで定量した結果と、ＭＢＩＴ対で標識された分析体をＭＡＬＤＩタンデム質量分析で定量した結果とを比較して示す図である。ヘキシルの質量調節基を有するＭＢＩＴから得た結果（ｎｏｒｍ３９／ｎｏｒｍ３０）の平均は１．６５であってゲルイミジ化システムで定量した結果に比べて０．８％大きく観測され、ヘプチルの質量調節基を有するＭＢＩＴから得た結果（ｄｅｌ３９／ｎｏｒｍ３０）は０．８５であって１．１％の差異を示し、 オクチルの質量調節基を有するＭＢＩＴから得た結果（ｄｅｌ３９／ｎｏｒｍ３０）は１．４６であって４．０％の差異を示した。ゲルイミジ化システムで定量した結果と類似している結果を示すことが分かる。この結果より、３対のＭＢＩＴ試薬を用いて４つの成長条件で得られたＨＳｃ８２タンパク質の相対的な量を同時に確認することができる（ｎｏｒｍ３０：ｎｏｒｍ３９：ｄｅｌ３０：ｄｅｌ３９＝１：１．６５：０．８５：１．４６）。
【０１４２】
図２５はヘキシル、ヘプチルおよびオクチルの質量調節基を有するＭＢＩＴ対で標識された５種の分析体のＭＡＬＤＩタンデム質量分析結果からデノボ配列分析(de novo sequencing)した結果を示す。アミノ酸コードに引かれた下線はそのアミノ酸の配列分析が正確に行われたことを意味する。アミノ酸コードの後ろに続く星印はそのアミノ酸にＭＢＩＴが標識されていることを示す。ロイシンとイソロイシンが同一の元素構成を持つため、全てロイシンのみで表記した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、可変質量ラベリング剤と、これを用いたペプチド配列およびタンパク質多重定量同時分析方法に係り、さらに詳しくは、水素同位元素を含み、物性および質量を調節することにより相異なる質量値において定量信号を表示することが可能な可変質量ラベリング剤と、これを用いたペプチド配列およびタンパク質多重定量同時分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
質量分析技術は、タンパク質とペプチドの配列および定量分析に広く用いられている。例えば、タンパク質を同定するために、タンパク質を酵素分解して生成されたペプチド断片をＭＡＬＤＩ(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization)イオン化法またはエレクトロスプレーイオン化法(Electrospray Ionization、ＥＳＩ)を用いてイオン化させた後、質量分析器によって質量を測定してタンパク質の特徴を明らかにする。さらに正確には、一部のペプチドをさらに断片に切断してペプチドの配列を同定する方法を使用する。
【０００３】
質量分析器を用いたタンパク質とペプチドの定量分析のためには、同位元素を含んでいる化学標識を分析対象のタンパク質またはペプチドに付けて質量分析する方法が広く用いられてきている。お互い量を比較すべき同一種類の各種試料に、同位元素標識の異なる同一の化学標識を付けて質量分析を行うと、同位元素の質量差のため、質量分析スペクトルまたはタンデム質量分析スペクトル上で各試料の質量が異なるから、その相対的強さを比較することによりタンパク質の定量分析が可能になる。
【０００４】
最近、前述したペプチドの定量分析と配列分析を同時に行うために、同重体化学変形法が用いられている。米国特許公開ＵＳ２００５／０１４８０８７号および国際特許公開ＷＯ２００５／０６８４４６号などでは、ペプチドと反応させて結合させた後、タンデム質量分析過程で定量信号が現れるように、同位元素で標識された同重体化合物を開示している。
【０００５】
ところが、前記従来の技術に用いられるラベリング剤は、炭素、窒素または酸素などの同位元素を使用しているため、価格が高いという問題点を持つ。また、定量信号の現れる質量範囲が限定されているため、実験で引き起こされる雑音信号によって分析が妨害されるおそれがあるという問題点も持っている。これにより、相対的に価格が低い水素同位元素を用いてペプチド配列とタンパク質の量を同時に確認することが可能な新規の同重体ラベリング剤が要求される。また、定量信号の質量および物性を調節して広範囲な生体分子分析に対して有利となるように特性が与えられた、新規の同重体可変質量ラベリング剤が要求される。
【０００６】
本発明者は、韓国特許出願第２００８−００７０２７２号によって、水素同位元素のみを用い、定量信号の質量調節が可能であるうえ、ジペプチド構造を持つＭＢＩＴ(ｍａｓｓ−ｂａｌａｎｃｅｄ１Ｈ/２Ｈ−ｉｓｏｔｏｐｅ ｔａｇ)と命名された新規の同重体ラベリング剤を提示したことがある。また、韓国特許出願第２００９−００１９４４４号によって、２つの同重体ラベリング剤の質量調節基の役割を果たすアミノ酸残基をそれぞれ多様な物性の天然アミノ酸の各種残基に変えて定量信号質量を多変化させ、同重体ラベリング剤の物性を調節することができることを示した。天然アミノ酸を用いた多様なＭＢＩＴでは、アミノ酸残基の多様な物性差異により、各ＭＢＩＴ試薬の定量信号の強さが最大１０倍も異なった。質量範囲の多変化した可変質量ＭＢＩＴを２つ以上組み合わせて多様な試料を同時に多重定量分析するためには、互いに類似または均一の定量信号強さを有するＭＢＩＴ試薬を組み合わせなければならず、そうしなければ正確な結果を期待することができない。したがって、多重定量同時分析用試薬の開発のために、類似の定量信号強さが持てるように、同一の物性を有する様々なＭＢＩＴ試薬の開発が要求された。よって、韓国特許出願第１０−２００９−００５４５４０号では、同一の物性を有し且つ質量が多変化した同重体ラベリング剤およびラベリング剤セットとこれを用いた多重定量分析方法を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許公開ＵＳ２００５／０１４８０８７号
【特許文献２】国際特許公開ＷＯ２００５／０６８４４６号
【特許文献３】韓国特許出願第２００８−００７０２７２号
【特許文献４】韓国特許出願第２００９−００１９４４４号
【特許文献５】韓国特許出願第１０−２００９−００５４５４０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このような一連の発明によって、本発明者は、天然アミノ酸または人工アミノ酸を用いて定量信号質量を多変化させ且つ物性を調節することができる、ペプチド配列およびタンパク質多重定量同時分析用同重体ラベリング剤を提示し、２種以上のラベリング剤を用いたタンパク質多重定量同時分析方法を提示しようとする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の目的は、同位元素を含む、ペプチド配列およびタンパク質定量同時分析用新規同重体ラベルを提供することにある。
【００１０】
本発明の他の目的は、水素同位元素を含む、ペプチド配列およびタンパク質定量同時分析用同重体ラベルを提供することにある。
【００１１】
本発明の別の目的は、水素同位元素を含む、２つ以上のペプチド配列およびタンパク質定量同時分析用同重体ラベルからなる可変質量ラベリング剤を提供することにある。
【００１２】
本発明の別の目的は、水素同位元素を含み、且つ天然または人工アミノ酸を用いて質量を多変化させることができる、ペプチド配列およびタンパク質定量同時分析用同重体可変質量ラベルを提供することにある。
【００１３】
本発明の別の目的は、水素同位元素を含み、且つ天然または人工アミノ酸を用いて質量を多変化させることができる、２つ以上のペプチド配列およびタンパク質定量同時分析用同重体ラベルからなる可変質量ラベリング剤セットを提供することにある。
【００１４】
本発明の別の目的は、水素同位元素を含み、且つ天然または人工アミノ酸の使用により質量が多変化することにより相異なる質量値において定量信号が現れる、２つ以上のペプチド配列およびタンパク質定量同時分析用同重体人工可変質量ラベリング剤セットを提供することにある。
【００１５】
本発明の別の目的は、水素同位元素を含み、且つ同一物性の天然または人工アミノ酸を用いて質量を多変化させることができる、２つ以上のペプチド配列およびタンパク質多重定量同時分析用同重体ラベルからなる可変質量ラベリング剤セットを提供することにある。
【００１６】
本発明の別の目的は、水素同位元素を含み、且つ同一物性の天然または人工アミノ酸の使用により質量が多変化することにより相異なる質量値において定量信号が現れるが、定量信号の強さは類似している、２つ以上のペプチド配列およびタンパク質多重定量同時分析用同重体可変質量ラベリング剤セットを提供することにある。
【００１７】
本発明の別の目的は、水素同位元素を含む、同重体可変質量ラベリング剤セットを用いてペプチド配列を分析すると同時にタンパク質を定量分析する方法を提供することにある。
【００１８】
本発明の別の目的は、水素同位元素を含み且つ質量が多変化した、２つ以上の同重体可変質量ラベリング剤セットの組み合わせを用いてペプチド配列を分析すると同時にタンパク質を多重定量分析する方法を提供することにある。
【００１９】
本発明の前記およびその他の目的は、後述する本発明によって全て達成できる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明は、新しい同位元素として水素同位元素を含み、物性および質量が多変化することにより相異なる質量値において定量信号を表示することが可能な可変質量ラベリング剤、可変質量ラベリング剤セット、および多重可変質量ラベリング剤セットを提供し、水素同位元素を含む同重体可変質量ラベリング剤セットを用いてペプチド配列を分析すると同時にタンパク質を定量分析する方法、および前記可変質量ラベリング剤セットを用いてペプチド配列を分析すると同時にタンパク質を多重定量分析する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１はＭＢＩＴ試薬および技術の基本概念を示す概略図であって、（ａ）はＭＢＩＴ試薬の構造であり、（ｂ）はＭＢＩＴ試薬が１次アミン基に反応して標識される過程であり、（ｃ）はＭＢＩＴ試薬セットで区分標識されたペプチドをタンデム質量分析した場合に生成可能な断片イオンを示し、（ｄ）は概略的なタンデム質量分析スペクトルを示す。
【図２】図２はＭＢＩＴ技術で質量調節基（ＲＴ）として使用できるアミノ酸残基の種類を示す概略図であって、（ａ）はＭＢＩＴ技術において定量信号質量を調節することが可能な質量調節基（ＲＴ）として使用できるアミノ酸残基と当該アミノ酸を用いたときに現れる定量信号質量対の質量値を、ペプチドをダンタム質量分析する場合に２００Ｔｈ以下の質量値で生成できる断片イオンの分布と共に示し、（ｂ）は本発明で用いられた８種の質量調節基であって、２００Ｔｈ以下の質量値を持つ断片イオンとの干渉が少ない質量調節基を示す。
【図３】図３はＭＢＩＴ技術で質量調節基（ＲＴ）としてアルキル基を用いた場合の各ＭＢＩＴの固有値を示す図であって、（ａ）はＭＢＩＴ定量信号対の質量値を、タンデム質量分析する場合に２２０Ｔｈ以下の質量値で生成できる断片イオンの分布と共に示し、（ｂ）は質量調節基として使用されたアルキル基の種類による各ＭＢＩＴの固有標識シグニチャーと定量信号質量値を示す。
【図４】図４はＭＢＩＴを用いて行うことが可能なタンパク質の相対および絶対定量分析過程を示す概略図であって、（ａ）は相異なる条件で生成された同一タンパク質の未知量を相対定量分析するときに使用される定量分析過程であり、（ｂ）は 同定されたタンパク質の未知量を絶対定量分析するときに使用される定量分析過程である。
【図５（ａ）】図５（ａ）は同一の物性を有し且つ多様な質量値を有するＭＢＩＴセットのタンデム質量スペクトルで現れる特性を示す概略図である。
【図５（ｂ）】図５（ｂ）は、同一の物性を有し且つ多様な質量値を有するＭＢＩＴセットを２種以上用いて３つ以上の試料を同時に多重定量分析する過程を示す概略図である。
【図５（ｃ）】図５（ｃ）は、同一の物性を有し且つ多様な質量値を有するＭＢＩＴセットを２種以上用いて３つ以上の試料を同時に多重定量分析する過程を示す概略図である。
【図６】図６はＮ末端がアシル化されたジペプチド構造のＭＢＩＴ試薬を（ａ）固相合成法と（ｂ）液相有機合成法を用いて合成する過程を示す概略図である。
【図７】図７はＭＢＩＴ試薬を分析対象ペプチドと反応させるために活性エステルを形成する過程、およびこれにより形成されたＭＢＩＴ活性エステルを分析対象ペプチドと反応させる実験方法を示す概略図である。
【図８（ａ）】図８（ａ）はアンジオテンシンＩＩとロイシンエンケファリンとのペプチド混合物を８種のＮ末端がアシル化されたジペプチド構造のＭＢＩＴ試薬対と反応させた後、それぞれをＭＡＬＤＩ質量分析した結果を示す概略図であり、質量調節基を有するＡｃ−Ｘｘｘ−ＡｌａのＸｘｘがアラニンである図である。
【図８（ｂ）】図８（ｂ）はアンジオテンシンＩＩとロイシンエンケファリンとのペプチド混合物を８種のＮ末端がアシル化されたジペプチド構造のＭＢＩＴ試薬対と反応させた後、それぞれをＭＡＬＤＩ質量分析した結果を示す概略図であり、質量調節基を有するＡｃ−Ｘｘｘ−ＡｌａのＸｘｘがセリンである図である。
【図８（ｃ）】図８（ｃ）はアンジオテンシンＩＩとロイシンエンケファリンとのペプチド混合物を８種のＮ末端がアシル化されたジペプチド構造のＭＢＩＴ試薬対と反応させた後、それぞれをＭＡＬＤＩ質量分析した結果を示す概略図であり、質量調節基を有するＡｃ−Ｘｘｘ−ＡｌａのＸｘｘがバリンである図である。
【図８（ｄ）】図８（ｄ）はアンジオテンシンＩＩとロイシンエンケファリンとのペプチド混合物を８種のＮ末端がアシル化されたジペプチド構造のＭＢＩＴ試薬対と反応させた後、それぞれをＭＡＬＤＩ質量分析した結果を示す概略図であり、質量調節基を有するＡｃ−Ｘｘｘ−ＡｌａのＸｘｘがグルタミンである図である。
【図８（ｅ）】図８（ｅ）はアンジオテンシンＩＩとロイシンエンケファリンとのペプチド混合物を８種のＮ末端がアシル化されたジペプチド構造のＭＢＩＴ試薬対と反応させた後、それぞれをＭＡＬＤＩ質量分析した結果を示す概略図であり、質量調節基を有するＡｃ−Ｘｘｘ−ＡｌａのＸｘｘがヒスチジンである図である。
【図８（ｆ）】図８（ｆ）はアンジオテンシンＩＩとロイシンエンケファリンとのペプチド混合物を８種のＮ末端がアシル化されたジペプチド構造のＭＢＩＴ試薬対と反応させた後、それぞれをＭＡＬＤＩ質量分析した結果を示す概略図であり、質量調節基を有するＡｃ−Ｘｘｘ−ＡｌａのＸｘｘがフェニルアラニンである図である。
【図８（ｇ）】図８（ｇ）はアンジオテンシンＩＩとロイシンエンケファリンとのペプチド混合物を８種のＮ末端がアシル化されたジペプチド構造のＭＢＩＴ試薬対と反応させた後、それぞれをＭＡＬＤＩ質量分析した結果を示す概略図であり、質量調節基を有するＡｃ−Ｘｘｘ−ＡｌａのＸｘｘがアルギニンである図である。
【図８（ｈ）】図８（ｈ）はアンジオテンシンＩＩとロイシンエンケファリンとのペプチド混合物を８種のＮ末端がアシル化されたジペプチド構造のＭＢＩＴ試薬対と反応させた後、それぞれをＭＡＬＤＩ質量分析した結果を示す概略図であり、質量調節基を有するＡｃ−Ｘｘｘ−ＡｌａのＸｘｘがチロシンである図である。
【図９】図９は８種のＮ末端がアシル化されたジペプチド構造のＭＢＩＴ試薬対でそれぞれＭＢＩＴ反応が行われたアンジオテンシンＩＩイオン［ＭＡＧ（１）＋Ｈ］＋のＭＡＬＤＩタンデム質量分析結果を示す図である［質量調節基を有するＡｃ−Ｘｘｘ−Ａｌａ Ｘｘｘは（ａ）アラニン、（ｂ）セリン、（ｃ）バリン、（ｄ）グルタミン、（ｅ）ヒスチジン、（ｆ）フェニルアラニン、（ｇ）アルギニン、および（ｈ）チロシン］。
【図１０】図１０は図９の定量信号質量が表示される質量領域を拡大して示す図であって、ペプチドをタンデム質量分析する場合に２００Ｔｈ以下で生成できる断片イオンの分布と共に示した。Ｎ末端がアシル化されたジペプチド構造のＭＢＩＴ試薬（Ａｃ−Ｘｘｘ−Ａｌａ）において、質量調節基を含むＸｘｘが（ａ）アラニン、（ｂ）セリン、（ｃ）バリン、（ｄ）グルタミン、（ｅ）ヒスチジン、（ｆ）フェニルアラニン、（ｇ）アルギニン、および（ｈ）チロシンである場合のそのそれぞれの結果を示す。
【図１１】図１１はＭＢＩＴ反応の後、Ｈ＋が付いている形で検出されたロイシンエンケファリンイオン（［ＭＬＥ（１）＋Ｈ］＋）のタンデム質量分析結果スペクトルである。Ｎ末端がアシル化されたジペプチド構造のＭＢＩＴ試薬（Ａｃ−Ｘｘｘ−Ａｌａ）において、質量調節基を含むＸｘｘが塩基性の（ａ）ヒスチジン、（ｂ）アルギニンである場合のそれぞれの結果を示す。
【図１２】図１２はＭＢＩＴ試薬の質量調節基の種類による定量信号（ＸｂＳ、Ｘ＝ＨまたはＬ）の強さ、および定量信号から誘導される追加分解イオン（ＸａＳまたはＸｂＳ−ＮＨ３）の強さが全体断片イオンの信号強さの総合における占有比率を示す図である。エラーバーは８回の反復実験による標準偏差を意味する。
【図１３（ａ）】図１３（ａ）はＭＢＩＴ試薬で区分標識して多様な比率で混ぜたアンジオテンシンＩＩをタンデム質量分析で定量分析して得た標準定量分析曲線を示す図であり、Ｎ末端がアシル化されたジペプチド構造のＭＢＩＴ試薬（Ａｃ−Ｘｘｘ−Ａｌａ）において、質量調節基を含むＸｘｘがアラニンである場合の結果を示す図である。エラーバーは８回の反復実験による標準偏差を意味する。
【図１３（ｂ）】図１３（ｂ）はＭＢＩＴ試薬で区分標識して多様な比率で混ぜたアンジオテンシンＩＩをタンデム質量分析で定量分析して得た標準定量分析曲線を示す図であり、Ｎ末端がアシル化されたジペプチド構造のＭＢＩＴ試薬（Ａｃ−Ｘｘｘ−Ａｌａ）において、質量調節基を含むＸｘｘがセリンである場合の結果を示す図である。エラーバーは８回の反復実験による標準偏差を意味する。
【図１３（ｃ）】図１３（ｃ）はＭＢＩＴ試薬で区分標識して多様な比率で混ぜたアンジオテンシンＩＩをタンデム質量分析で定量分析して得た標準定量分析曲線を示す図であり、Ｎ末端がアシル化されたジペプチド構造のＭＢＩＴ試薬（Ａｃ−Ｘｘｘ−Ａｌａ）において、質量調節基を含むＸｘｘがバリンである場合の結果を示す図である。エラーバーは８回の反復実験による標準偏差を意味する。
【図１３（ｄ）】図１３（ｄ）はＭＢＩＴ試薬で区分標識して多様な比率で混ぜたアンジオテンシンＩＩをタンデム質量分析で定量分析して得た標準定量分析曲線を示す図であり、Ｎ末端がアシル化されたジペプチド構造のＭＢＩＴ試薬（Ａｃ−Ｘｘｘ−Ａｌａ）において、質量調節基を含むＸｘｘがグルタミンである場合の結果を示す図である。エラーバーは８回の反復実験による標準偏差を意味する。
【図１３（ｅ）】図１３（ｅ）はＭＢＩＴ試薬で区分標識して多様な比率で混ぜたアンジオテンシンＩＩをタンデム質量分析で定量分析して得た標準定量分析曲線を示す図であり、Ｎ末端がアシル化されたジペプチド構造のＭＢＩＴ試薬（Ａｃ−Ｘｘｘ−Ａｌａ）において、質量調節基を含むＸｘｘがヒスチジンである場合の結果を示す図である。エラーバーは８回の反復実験による標準偏差を意味する。
【図１３（ｆ）】図１３（ｆ）はＭＢＩＴ試薬で区分標識して多様な比率で混ぜたアンジオテンシンＩＩをタンデム質量分析で定量分析して得た標準定量分析曲線を示す図であり、Ｎ末端がアシル化されたジペプチド構造のＭＢＩＴ試薬（Ａｃ−Ｘｘｘ−Ａｌａ）において、質量調節基を含むＸｘｘがフェニルアラニンである場合の結果を示す図である。エラーバーは８回の反復実験による標準偏差を意味する。
【図１３（ｇ）】図１３（ｇ）はＭＢＩＴ試薬で区分標識して多様な比率で混ぜたアンジオテンシンＩＩをタンデム質量分析で定量分析して得た標準定量分析曲線を示す図であり、Ｎ末端がアシル化されたジペプチド構造のＭＢＩＴ試薬（Ａｃ−Ｘｘｘ−Ａｌａ）において、質量調節基を含むＸｘｘがアルギニンである場合の結果を示す図である。エラーバーは８回の反復実験による標準偏差を意味する。
【図１３（ｈ）】図１３（ｈ）はＭＢＩＴ試薬で区分標識して多様な比率で混ぜたアンジオテンシンＩＩをタンデム質量分析で定量分析して得た標準定量分析曲線を示す図であり、Ｎ末端がアシル化されたジペプチド構造のＭＢＩＴ試薬（Ａｃ−Ｘｘｘ−Ａｌａ）において、質量調節基を含むＸｘｘがチロシンである場合の結果を示す図である。エラーバーは８回の反復実験による標準偏差を意味する。
【図１４】図１４はＭＢＩＴ試薬で区分標識して多様な比率で混ぜたロイシンエンケファリンをタンデム質量分析で定量分析して得た標準定量分析曲線を示す図である。Ｎ末端がアシル化されたジペプチド構造のＭＢＩＴ試薬（Ａｃ−Ｘｘｘ−Ａｌａ）において、質量調節基を含むＸｘｘが（ａ）ヒスチジン、（ｂ）アルギニンである場合のそれぞれの結果を示す。
【図１５】図１５はＮ末端がアシル化されたジペプチド構造のＭＢＩＴで標識された分析体の定量分析測定限界を確認した結果である。
【図１６（ａ）】図１６（ａ）は同量のウシ血清アルブミンをトリプシンで酵素分解して生成されたペプチドをＭＢＩＴ試薬対で区分標識した後、混合して液相クロマトグラフィーおよびタンデム質量分析で定量分析した結果を示す図であり、ＹＬＹＥＩＡＲの配列を有するペプチドの結果を示しており、８種のＭＢＩＴ対で標識されたＹＬＹＥＩＡＲペプチドの液相クロマトグラフィー結果である。
【図１６（ｂ）】図１６（ｂ）は同量のウシ血清アルブミンをトリプシンで酵素分解して生成されたペプチドをＭＢＩＴ試薬対で区分標識した後、混合して液相クロマトグラフィーおよびタンデム質量分析で定量分析した結果を示す図であり、ＹＬＹＥＩＡＲの配列を有するペプチドの結果を示しており、質量調節基がアラミン側鎖である場合、各ＭＢＩＴ対で標識されたＹＬＹＥＩＡＲがクロマトグラフィーで検出されるそれぞれの分取(fraction)をＭＡＬＤＩタンデム質量分析で定量分析した結果を示す図である。定量分析して得られた相対的量の平均と標準偏差が数値でそれぞれ表示される。
【図１６（ｃ）】図１６（ｃ）は同量のウシ血清アルブミンをトリプシンで酵素分解して生成されたペプチドをＭＢＩＴ試薬対で区分標識した後、混合して液相クロマトグラフィーおよびタンデム質量分析で定量分析した結果を示す図であり、ＹＬＹＥＩＡＲの配列を有するペプチドの結果を示しており、質量調節基がセリン側鎖である場合、各ＭＢＩＴ対で標識されたＹＬＹＥＩＡＲがクロマトグラフィーで検出されるそれぞれの分取(fraction)をＭＡＬＤＩタンデム質量分析で定量分析した結果を示す図である。定量分析して得られた相対的量の平均と標準偏差が数値でそれぞれ表示される。
【図１６（ｄ）】図１６（ｄ）は同量のウシ血清アルブミンをトリプシンで酵素分解して生成されたペプチドをＭＢＩＴ試薬対で区分標識した後、混合して液相クロマトグラフィーおよびタンデム質量分析で定量分析した結果を示す図であり、ＹＬＹＥＩＡＲの配列を有するペプチドの結果を示しており、質量調節基がバリン側鎖である場合、各ＭＢＩＴ対で標識されたＹＬＹＥＩＡＲがクロマトグラフィーで検出されるそれぞれの分取(fraction)をＭＡＬＤＩタンデム質量分析で定量分析した結果を示す図である。定量分析して得られた相対的量の平均と標準偏差が数値でそれぞれ表示される。
【図１６（ｅ）】図１６（ｅ）は同量のウシ血清アルブミンをトリプシンで酵素分解して生成されたペプチドをＭＢＩＴ試薬対で区分標識した後、混合して液相クロマトグラフィーおよびタンデム質量分析で定量分析した結果を示す図であり、ＹＬＹＥＩＡＲの配列を有するペプチドの結果を示しており、質量調節基がグルタミン側鎖である場合、各ＭＢＩＴ対で標識されたＹＬＹＥＩＡＲがクロマトグラフィーで検出されるそれぞれの分取(fraction)をＭＡＬＤＩタンデム質量分析で定量分析した結果を示す図である。定量分析して得られた相対的量の平均と標準偏差が数値でそれぞれ表示される。
【図１６（ｆ）】図１６（ｆ）は同量のウシ血清アルブミンをトリプシンで酵素分解して生成されたペプチドをＭＢＩＴ試薬対で区分標識した後、混合して液相クロマトグラフィーおよびタンデム質量分析で定量分析した結果を示す図であり、ＹＬＹＥＩＡＲの配列を有するペプチドの結果を示しており、質量調節基がヒスチジン側鎖である場合、各ＭＢＩＴ対で標識されたＹＬＹＥＩＡＲがクロマトグラフィーで検出されるそれぞれの分取(fraction)をＭＡＬＤＩタンデム質量分析で定量分析した結果を示す図である。定量分析して得られた相対的量の平均と標準偏差が数値でそれぞれ表示される。
【図１６（ｇ）】図１６（ｇ）は同量のウシ血清アルブミンをトリプシンで酵素分解して生成されたペプチドをＭＢＩＴ試薬対で区分標識した後、混合して液相クロマトグラフィーおよびタンデム質量分析で定量分析した結果を示す図であり、ＹＬＹＥＩＡＲの配列を有するペプチドの結果を示しており、質量調節基がフェニルアラニン側鎖である場合、各ＭＢＩＴ対で標識されたＹＬＹＥＩＡＲがクロマトグラフィーで検出されるそれぞれの分取(fraction)をＭＡＬＤＩタンデム質量分析で定量分析した結果を示す図である。定量分析して得られた相対的量の平均と標準偏差が数値でそれぞれ表示される。
【図１６（ｈ）】図１６（ｈ）は同量のウシ血清アルブミンをトリプシンで酵素分解して生成されたペプチドをＭＢＩＴ試薬対で区分標識した後、混合して液相クロマトグラフィーおよびタンデム質量分析で定量分析した結果を示す図であり、ＹＬＹＥＩＡＲの配列を有するペプチドの結果を示しており、質量調節基がアルギニン側鎖である場合、各ＭＢＩＴ対で標識されたＹＬＹＥＩＡＲがクロマトグラフィーで検出されるそれぞれの分取(fraction)をＭＡＬＤＩタンデム質量分析で定量分析した結果を示す図である。定量分析して得られた相対的量の平均と標準偏差が数値でそれぞれ表示される。
【図１６（ｉ）】図１６（ｉ）は同量のウシ血清アルブミンをトリプシンで酵素分解して生成されたペプチドをＭＢＩＴ試薬対で区分標識した後、混合して液相クロマトグラフィーおよびタンデム質量分析で定量分析した結果を示す図であり、ＹＬＹＥＩＡＲの配列を有するペプチドの結果を示しており、質量調節基がチロシン側鎖である場合、各ＭＢＩＴ対で標識されたＹＬＹＥＩＡＲがクロマトグラフィーで検出されるそれぞれの分取(fraction)をＭＡＬＤＩタンデム質量分析で定量分析した結果を示す図である。定量分析して得られた相対的量の平均と標準偏差が数値でそれぞれ表示される。
【図１７】図１７は７種のアルキル基ＭＢＩＴ試薬対で反応が行われたアンジオテンシンＩＩのＭＡＬＤＩ質量分析結果を示す概略図である。ＭＢＩＴ試薬において、質量調節基が（ａ）エチル、（ｂ）プロピル、（ｃ）ブチル、（ｄ）ペンチル、（ｅ）ヘキシル、（ｆ）ヘプチル、および（ｇ）オクチルの場合をそれぞれ示す。ここで、ＸｎはＣｎの質量調節基を有するＮアシル化アミノ酸またはＮ−アシル−Ａｌａアミノ酸を意味する。
【図１８】図１８は７種のＭＢＩＴ試薬対でそれぞれＭＢＩＴ反応が行われたアンジオテンシンＩＩイオンのＭＡＬＤＩタンデム質量分析結果を示す図であって、各ＭＢＩＴ試薬対に対してＨＭＢＩＴで反応したペプチドとＬＭＢＩＴで反応したペプチドを１：１の混合比で混ぜてタンデム質量分析した結果である。 が（ａ）エチル、（ｂ）プロピル、（ｃ）ブチル、（ｄ）ペンチル、（ｅ）ヘキシル、（ｆ）ヘプチル、（ｇ）オクチルの質量調節基を有するＭＢＩＴが連結されたアンジオテンシンＩＩのＣＩＤスペクトルである。ここで、ＸｎはＣｎの質量調節基を有するＮアシル化アミノ酸またはＮ−アシル−Ａｌａアミノ酸を意味する。
【図１９】図１９はＭＢＩＴ試薬種類による各定量信号の強さを全体断片イオンの強さの総合に対する比率で計算して示す。
【図２０】図２０はＬＭＢＩＴが連結されたアンジオテンシンＩＩと、ＨＭＢＩＴが連結されたアンジオテンシンＩＩとを多様な混合比で混ぜて定量分析し、各混合比と測定によって得られた比の線形性を比較した図である。
【図２１】図２１はＭＢＩＴで標識された分析体の定量分析測定限界を確認した結果である。ＬＭＢＩＴ−とＨＭＢＩＴ−でそれぞれ標識されたアンジオテンシンＩＩを２：１の比率で混合した後、濃度を２倍ずつ持続的に薄めた試料をタンデム質量分析した結果のうち、定量信号質量（ｂＳ）が表示される領域を拡大した図である。ＭＢＩＴ試薬において、質量調節基が（ａ）エチル（Ｃ２）、（ｂ）ブチル（Ｃ４）、（ｃ）ペンチル（Ｃ５）、（ｄ）ヘキシル（Ｃ６）、（ｅ）ヘプチル（Ｃ７）、および（ｆ）オクチル（Ｃ８）の場合をそれぞれ示す。
【図２２】図２２は４つの相異なる生長条件で得られたＨＡ−Ｈｓｃ８２タンパク質の量、および定量分析を行うためにそれぞれの試料に使用したＭＢＩＴ試薬を示す図である。ＨＡ−Ｈｓｃ８２タンパク質を発現させた条件を（ａ）に示し、これらの条件下に生成されたＨＡ−Ｈｓｃ８２タンパク質を酵母から抽出および精製して電気泳動した後、Ｓｙｐｒｏ Ｒｕｂｙ ｓｔａｉｎで染色した結果を（ｂ）に示す。４つの条件のＨＡ−Ｈｓｃ８２タンパク質のゲルバンドを切り出してトリプシンで酵素分解した後、ＭＢＩＴ試薬に反応させたが、各タンパク質グループに反応したＭＢＩＴ試薬を（ｃ）に示す。ここで、ＸｎはＣｎの質量調節基を有するＮアシル化アミノ酸またはＮ−アシル−Ａｌａアミノ酸を意味する。
【図２３】図２３は図２２（ｃ）の６種の分析体を同量混合し、ＺｉｐＴｉｐで精製した後、質量分析した結果を示す図である。各分析体にはヘキシル（三角形）、ヘプチル（四角形）、およびオクチル（円形）の質量調節基を有するＭＢＩＴ試薬が付いている。５種のペプチドがタンデム質量分析に使用された。ここで、ＸｎはＣｎの質量調節基を有するＮアシル化アミノ酸またはＮ−アシル−Ａｌａアミノ酸を意味する。
【図２４】図２４はゲルイミジ化システムで定量した結果と、ＭＢＩＴ対で標識された分析体をＭＡＬＤＩタンデム質量分析で定量した結果とを比較して示す図である。 ４つの生長条件で得られたＨｓｃ８２タンパク質の相対的な量は３対のＭＢＩＴ試薬を用いて同時に定量することができる。
【図２５】図２５は（ａ）ヘキシル、（ｂ）ヘプチル、（ｃ）オクチルの質量調節基 を有するＭＢＩＴ対で標識された５種のペプチドのＭＡＬＤＩタンデム質量分析した結果からデノボ配列分析した結果を示す。アミノ酸コードに引かれた下線はその配列分析が正確に行われたことを意味する。アミノ酸コードに続く星印はそのアミノ酸にＭＢＩＴが標識されていることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、下記化学式１で表される可変質量ラベリング剤を提供する。
［化学式１］
【００２３】
【化１】
【００２４】
ここで、ＲＳおよびＲＢはそれぞれ直鎖または分枝鎖のＣ1〜Ｃ１８アルキルであり、ＲＳおよびＲＢの少なくとも一つは一つ以上の重水素を含み、ＲＴは質量調節基であり、リンカーは分析体との結合を誘導する反応性リンカーである。
【００２５】
本発明で使用される用語「反応性リンカー」は、アミンの求核攻撃に離脱基となる活性エステルであることを意味する。前記アミンは１次アミンであることを特徴とする。また、反応性リンカーは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル基、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル基、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシル基、ペンタハロベンジル基、４−ニトロフェニル基、および２−ニトロフェニル基よりなる群から選択できる。本発明の実施においては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル基がリンカーとして使用された。
【００２６】
本発明で使用される用語「前記質量調節基」は、分析体と結合した後、タンデム質量分析過程で分解されるとき、Ｎ-アシル化アミノ酸断片の質量を調節して定量信号がスペクトル上で他の断片と重ならないようにするために導入されるものを意味するものであって、ＲＴの種類を変えることにより、定量信号の質量を多様に変化させることができる。前記質量調節基は、類似または同一物性を有する天然または人工アミノ酸残基の側鎖のいずれか一つであることを特徴とする。
【００２７】
前記質量調節基のうち、天然アミノ酸残基の側鎖としては、アラニン（Ａｌａ）、セリン（Ｓｒ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、バリン（Ｖａｌ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、アルギニン（Ａｒｇ）、またはチロシン（Ｔｙｒ）の側鎖であり得る。
【００２８】
また、前記質量調節基は、直鎖または分枝鎖のＣ２〜Ｃ１８アルキルであってもよく、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチルまたはオクチルなどの直鎖または分枝鎖のアルキルであってもよい。
【００２９】
前記ＲＳおよびＲＢは、重水素を含んで同位元素の質量差による定量分析を可能とする役割を果たす。このため、前記ＲＳまたはＲＢはそれぞれ直鎖または分枝鎖Ｃ１〜Ｃ１８アルキルであり、ＲＳおよびＲＢの少なくとも一つは一つ以上の重水素を含み、好ましくは前記ＲＳおよびＲＢはメチルまたは一つ以上の重水素を含むメチルであることを特徴とする。前記ＲＳおよびＲＢは炭素の個数が同じアルキルからなっているが、含まれた重水素の数が互いに異ならなければならない。このような観点から、前記ＲＳとＲＢはそれぞれＣＨ３およびＣＤ３であり、或いはＣＤ３およびＣＨ３であることが好ましい。すなわち、前記化合物において、ＲＳとＲＢは、ＲＳがＣＨ３であればＲＢはＣＤ３であり、ＲＢがＣＨ３であればＲＳはＣＤ３である。
【００３０】
前記化学式１は、Ｎ末端がアシル化され、Ｃ末端にはアミンの求核攻撃に離脱基となるリンカーが付き、同位元素で標識されるジペプチドであることを特徴とする。また、前記ジペプチドは重水素で標識されるジペプチドであることを特徴とする。
【００３１】
また、本発明は、前記化学式１で表される可変質量ラベリング剤を２種以上含む可変質量ラベリング剤セットを提供する。
【００３２】
前記可変質量ラベリング剤セットは、前記化学式１で表される相異なる２化合物の対が一つのセットを成す。前記化合物対が、ＲＳとＲＢに含まれた重水素の総数が一定な化合物対になると、同位元素の質量差のため、スペクトル上で各試料の質量が異なり、その相対的強さを比較して定量分析を行うことができる。このような観点から、前記２種類以上の可変質量ラベリング剤それぞれのＲＳとＲＢに含まれた重水素の数が互いに異なり、前記２種類以上の可変質量ラベリング剤は互いに重水素の数が同一であることが好ましい。
【００３３】
すなわち、前記化合物対のＲＳとＲＢは、同一の炭素数を有する直鎖または分枝鎖のアルキルであり、第１化合物においてＲＳにＲＢより多い数の重水素を含んでいると、第２化合物ではＲＢの重水素の数がＲＳに比べて第１化合物の差異だけ多くなるように構成される。結果として、第１化合物と第２化合物の全体的な質量は同一に構成される。発明の実施において、実際合成されて使用された化合物対は、前記ＲＳとＲＢがそれぞれＣＨ３、ＣＤ３である化合物と、ＲＳとＲＢがそれぞれＣＤ３、ＣＨ３である化合物との対である。
【００３４】
また、本発明は、前記可変質量ラベリング剤セットを２種以上含む多重可変質量ラベリング剤セットを提供する。
【００３５】
また、本発明は、可変質量ラベリング剤で標識された分析体を含む混合物、その塩またはその水和物を提供する。本発明の実施において、前記化合物と分析体との結合は、リンカーが分析体のアミンと反応して離脱基として作用して分離されることにより行われる。
【００３６】
ここで、前記分析体は、タンパク質、炭水化物または脂質であることを特徴とする。また、前記分析体はペプチドであることを特徴とする。また、前記分析体は核酸または核酸誘導体であることを特徴とする。また、前記分析体はステロイドであることを特徴とする。
【００３７】
また、本発明は、可変質量ラベリング剤セットを分析体に結合させる段階と、前記可変質量ラベリング剤セットが結合した分析体を分解し、前記分析体を定量する段階とを含んでなることを特徴とする、ペプチド配列およびタンパク質定量同時分析方法を提供する。
【００３８】
ここで、前記定量のための分解法はタンデム質量分析法であることを特徴とする。
【００３９】
前記タンデム質量分析法は、ラベリング剤の質量調節基に応じて、分析における定量信号質量の位置が変わることを特徴とする。
【００４０】
前記定量信号質量を与える定量信号は、ｂＳイオン、ａＳイオン、ｂＳ−ＮＨ３イオン、
ｙＳｉｏｎ、およびＲＢ含有内部断片イオンよりなる群から選ばれる１種以上の断片イオンであることを特徴とする。
【００４１】
前記質量調節基が天然アミノ酸側鎖であれば、定量信号質量と標識シグニチャーは次のとおりである。
【００４２】
前記質量調節基がメチル基の場合、定量信号質量（ｂＳ）が１１４と１１７Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ａＳ）が８６と８９Ｔｈで現れ、標識シグニチャーが１８８Ｔｈで現れることを特徴とする。
【００４３】
前記質量調節基がセリン側鎖の場合、定量信号質量（ｂＳ）が１３０と１３３Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ａＳ）が１０２と１０５Ｔｈで現れ、標識シグニチャー（ｂ０）が２０４Ｔｈで現れることを特徴とする。
【００４４】
前記質量調節基がバリン側鎖の場合、定量信号質量（ｂＳ）が１４２と１４５Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ａＳ）が１１４と１１７Ｔｈで現れ、標識シグニチャー（ｂ０）が２１６Ｔｈで現れることを特徴とする。
【００４５】
前記質量調節基がグルタミン側鎖の場合、定量信号質量（ｂＳ）が１７１と１７４Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ａＳ）が１４３と１４６Ｔｈで現れ、標識シグニチャー（ｂ０）が２４５Ｔｈで現れることを特徴とする。
【００４６】
前記質量調節基がヒスチジン側鎖の場合、定量信号質量（ｂＳ）が１８０と１８３Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ａＳ）が１５２と１５５Ｔｈで現れ、標識シグニチャー（ｂ０）が２５４Ｔｈで現れることを特徴とする。
【００４７】
前記質量調節基がフェニルアラニン側鎖の場合、定量信号質量（ｂＳ）が１９０と１９３Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ａＳ）が１６２と１６５Ｔｈで現れ、標識シグニチャー（ｂ０）が２６４Ｔｈで現れることを特徴とする。
【００４８】
前記質量調節基がアルギニン側鎖の場合、定量信号質量（ｂＳ）が１９９と２０２Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ｂＳ−ＮＨ３）が１８２と１８５Ｔｈで現れ、標識シグニチャー（ｂ０）が２７３Ｔｈで現れることを特徴とする。
【００４９】
前記質量調節基がチロシン側鎖の場合、定量信号質量（ｂＳ）が２０６と２０９Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ａＳ）が１７８と１８１Ｔｈで現れ、標識シグニチャー（ｂ０）が２８０Ｔｈで現れることを特徴とする。
【００５０】
前記質量調節基が人工アミノ酸側鎖の場合、定量信号質量と標識シグニチャーは次のとおりである。
【００５１】
前記質量調節基がエチル基の場合、定量信号質量（ｂＳ）が１２８と１３１Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ａＳ）が１００と１０３Ｔｈで現れ、標識シグニチャー（ｂ０）が２０２Ｔｈで現れることを特徴とする。
【００５２】
前記質量調節基が直鎖または分枝鎖プロピル基の場合、定量信号質量（ｂＳ）が１４２と１４５Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ａＳ）が１１４と１１７Ｔｈで現れ、標識シグニチャー（ｂ０）が２１６Ｔｈで現れることを特徴とする。
【００５３】
前記質量調節基が直鎖または分枝鎖ブチル基の場合、定量信号質量（ｂＳ）が１５６と１５９Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ａＳ）が１２８と１３１Ｔｈで現れ、標識シグニチャー（ｂ０）が２３０Ｔｈで現れることを特徴とする。
【００５４】
前記質量調節基が直鎖または分枝鎖ペンチル基の場合、定量信号質量（ｂＳ）が１７０と１７３Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ａＳ）が１４２と１４５Ｔｈで現れ、標識シグニチャー（ｂ０）が２４４Ｔｈで現れることを特徴とする。
【００５５】
前記質量調節基が直鎖または分枝鎖ヘキシル基の場合、定量信号質量（ｂＳ）が１８４と１８７Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ａＳ）が１５６と１５９Ｔｈで現れ、標識シグニチ（ｂ０）ャが２５８Ｔｈで現れることを特徴とする。
【００５６】
前記質量調節基が直鎖または分枝鎖ヘプチル基の場合、定量信号質量（ｂＳ）が１９８と２０１Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ａＳ）が１７０と１７３Ｔｈで現れ、標識シグニチャー（ｂ０）が２７２Ｔｈで現れることを特徴とする。
【００５７】
前記質量調節基が直鎖または分枝鎖オクチル基の場合、定量信号質量（ｂＳ）が２１２と２１５Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ａＳ）が１８４と１８７Ｔｈで現れ、標識シグニチャー（ｂ０）が２８６Ｔｈで現れることを特徴とする。
【００５８】
また、本発明は、本発明に係る多重可変質量ラベリング剤セットを別の分析体に結合させ、分解して該当分析体を定量することを特徴とする、ペプチド配列およびタンパク質定量同時分析方法を提供する。
【００５９】
また、本発明は、本発明に係る多重可変質量ラベリング剤セットを分析体に結合させて定量する過程で、１種の試料と残りのそれぞれ異なる試料との比率を、質量調節基に応じて異なる定量信号質量によってそれぞれ別々に定量することにより、全体試料間の量を多重定量する分析方法を提供する。
【００６０】
以下、本発明の原理について図面を参照して具体的に説明する。
【００６１】
図１はＭＢＩＴ試薬および技術を示す概略図であって、（ａ）はＭＢＩＴ試薬の構造、（ｂ）はＭＢＩＴ試薬が１次アミン基に反応して標識される過程、（ｃ）はＭＢＩＴ試薬セットで区分標識されたペプチドをタンデム質量分析した場合に生成可能な断片イオン、（ｄ）は概略的なタンデム質量分析スペクトルをそれぞれ示す。
【００６２】
図１に示すように、理論的に限定されるのではないが、本発明に係る化合物１はＮ末端がアシル化され且つＣ末端にはリンカーが付いているジペプチドであって、図１（ａ）に表現されたような機能に区分できる。
【００６３】
このような化合物は、分析体の１次アミンと反応して図１（ｂ）に示すように分析体と結合することができる。同一の分子式に重水素が標識された部位のみが異なるＭＢＩＴ試薬対を、便宜上、ＨＭＢＩＴとＬＭＢＩＴに区分するが（Ｈ：ｈｅａｖｙ、Ｌ：Ｌｉｇｈｔ）、ＲＳに重水素が標識されたものをＨＭＢＩＴといい、ＲＢに重水素が標識されたものをＬＭＢＩＴという。このＬＭＢＩＴとＨＭＢＩＴとが結合した分析体は、全体的な重量は同一である。ところが、タンデム質量分析で現れる切断断片のうち、ＲＳとＲＢのいずれか一方のみを含んでいる断片は、ＬＭＢＩＴが連結された場合とＨＭＢＩＴが連結された場合に対して相異なる質量値を有し、図１の（ｃ−ｄ）におけるｂＳイオンのようにスペクトル上で異なる位置に現れる。これらピークの相対的強度はこれらが付いていた分析体の相対的な量として定量できる。これに対し、ＲＳとＲＢを全て含み或いは全く含まない切断断片の場合、質量値がＬＭＢＩＴ、ＨＭＢＩＴに関係なく一定に現れる。また、分析体がＭＢＩＴ試薬によって標識された場合、ｂＳイオンだけでなく、ｂｏイオンもスペクトル上で発見される。このｂｏイオンはＬＭＢＩＴ、ＨＭＢＩＴを問わずに一定に現れ、特定のＭＢＩＴによって分析体が標識されたことを確認可能にするから、標識シグニチャーイオン(tagging signature ion)として用いられる。
【００６４】
図２はＭＢＩＴ技術において質量調節基（ＲＴ）として使用できる天然アミノ酸残基の種類を示す概略図であって、（ａ）はＭＢＩＴ技術において定量信号質量を調節することが可能な質量調節基（ＲＴ）として使用できるアミノ酸残基と当該アミノ酸を用いたときに現れる定量信号質量対の質量値を、ペプチドをタンデム質量分析する場合に２００Ｔｈ以下の質量値で生成できる断片イオンの分布と共に示し、（ｂ）は本発明で用いられた８種の質量調節基であって、２２０Ｔｈ以下の質量値を有する断片イオンとの干渉が少ない質量調節基を示す。
【００６５】
質量調節基ＲＴの質量によって定量ピークの位置が異なるが、図２に示すように、アラニン（Ａｌａ）側鎖の場合には１１４／１１７Ｔｈで現れ、セリン（Ｓｅｒ）側鎖の場合には１３０／１３３Ｔｈで現れ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）側鎖の場合には１８０／１８３Ｔｈで現れ、バリン（Ｖａｌ）側鎖の場合には１４２／１４５Ｔｈで現れ、グルタミン（Ｇｌｎ）側鎖の場合には１７１／１７４Ｔｈで現れ、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）側鎖の場合には１９０／１９３Ｔｈで現れ、アルギニン（Ａｒｇ）側鎖の場合には１９９／２０２Ｔｈで現れ、チロシン（Ｔｙｒ）側鎖の場合には２０６／２０９Ｔｈで現れる。前述した質量調節基の場合、タンデム質量分析過程で生成される他の断片との重なりが少ない。前述した質量調節基以外にも、図２に示すようにトレオニン（Ｔｈｒ）、シスチン（Ｃｙｓ）、ロイシン（Ｌｅｕ）／イソロイシン（Ｉｌｅ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）の場合も質量調節基として使用される可能性を持っている。本特許の実施においては、図２ｂに示したアラニン（Ａｌａ）、セリン（Ｓｅｒ）、バリン（Ｖａｌ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、アルギニン（Ａｒｇ）、およびチロシン（Ｔｙｒ）の８つのアミノ酸側鎖が使用された。
【００６６】
図３はＭＢＩＴ技術において質量調節基（ＲＴ）として直鎖または分枝鎖のアルキル基を使用した場合の各ＭＢＩＴの固有値を示す図であって、（ａ）はＭＢＩＴ定量信号対の質量値を、タンデム質量分析する場合に２２０Ｔｈ以下の質量値で生成できる断片イオンの分布と共に概略に示し、（ｂ）は質量調節基として使用されたアルキル基の炭素数による各ＭＢＩＴの固有標識シグニチャーと定量信号質量値を示す。
【００６７】
質量調節基ＲＴの質量によって定量信号ＸｂＳの位置が変わるが、図３に示すように、メチル（Ｃ１）の場合には１１４／１１７Ｔｈで現れ、エチル（Ｃ２）の場合には１２８／１３１Ｔｈで現れ、直鎖または分枝鎖プロピル（Ｃ３）の場合には１４２／１４５Ｔｈで現れ、直鎖または分枝鎖ブチル（Ｃ４）の場合には１５６／１５９Ｔｈで現れ、直鎖または分枝鎖ペンチル（Ｃ５）の場合には１７０／１７３Ｔｈで現れ、直鎖または分枝鎖ヘキシル（Ｃ６）の場合には１８４／１８７Ｔｈで現れ、直鎖または分枝鎖ヘプチル（Ｃ７）の場合には１９８／２０１Ｔｈで現れ、直鎖または分枝鎖オクチル（Ｃ８）の場合には２１２／２１５Ｔｈで現れる。ＸｂＳから中性ＣＯ損失したＸａＳイオンは、質量調節基がメチルの場合には８６／８９Ｔｈで検出され、質量調節基がエチルの場合には１００／１０３Ｔｈで検出され、質量調節基が直鎖または分枝鎖プロピルの場合には１１４／１１７Ｔｈで検出され、質量調節基が直鎖または分枝鎖ブチルの場合には１２８／１３１Ｔｈで検出され、質量調節基が直鎖または分枝鎖ペンチルの場合には１４２／１４５Ｔｈで検出され、質量調節基が直鎖または分枝鎖ヘキシルの場合には１５６／１５９Ｔｈで検出され、質量調節基が直鎖または分枝鎖ヘプチルの場合には１７０／１７３Ｔｈで検出され、質量調節基が直鎖または分枝鎖オクチルの場合には１８４／１８７Ｔｈで検出される。また、各ＭＢＩＴの固有標識シグニチャー（ｂｏ）イオンは、質量調節基がメチルの場合には１８８Ｔｈで現れ、質量調節基がエチルの場合には２０２Ｔｈで現れ、質量調節基が直鎖または分枝鎖プロピルの場合には２１６Ｔｈで現れ、質量調節基が直鎖または分枝鎖ブチルの場合には２３０Ｔｈで現れ、質量調節基が直鎖または分枝鎖ペンチルの場合には２４４Ｔｈで現れ、質量調節基が直鎖または分枝鎖ヘキシルの場合には２５８Ｔｈで現れ、質量調節基が直鎖または分枝鎖ヘプチルの場合には２７２Ｔｈで現れ、質量調節基が直鎖または分枝鎖オクチルの場合には２８６Ｔｈで現れる。
【００６８】
本発明の一側面において、本発明は、下記化学式２で表される化合物と下記化合物とを結合させた分析体に関する。
［化学式２］
【００６９】
【化２】
【００７０】
ここで、ＲＳまたはＲＢは一つ以上の重水素を含む直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ１８アルキルであり、ＲＴは質量調節基である。本発明において、前記ＲＳまたはＲＢは含まれる重水素の数が互いに異なる同一のアルキルである。本発明の実施において、ＲＳまたはＲＢは、ＲＳがＣＨ３であればＲＢはＣＤ３であり、ＲＢがＣＨ３であればＲ２はＣＤ３である。本発明の実施において、前記質量調節基ＲＴは、製造上の便宜上、類似または同一物性の天然または人工アミノ酸の側鎖基の中からいずれか一つが選択できる。前記化学式２で表される化合物は、適切な活性化試薬との反応によって化学式１への変換が可能である。これに利用可能な活性化試薬としてはＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）／１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）の組み合わせ、１−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）／Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボイミド（ＤＩＣ）の組み合わせ、（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシル）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）などがあり、本発明の実施においてはＮＨＳ／ＥＤＣの組み合わせが用いられた。
【００７１】
図４はＭＢＩＴを用いて行うことが可能なタンパク質の相対および絶対定量分析過程を示す概略図であって、（ａ）は互いに異なる条件で生成された 同一タンパク質の未知量を相対定量分析するときに使用される定量分析過程を示し、（ｂ）は同定されたタンパク質の未知量を絶対定量分析するときに使用される定量分析過程を示す。
【００７２】
前記ＭＢＩＴ化合物は、図４のような方式でタンパク質の配列および定量同時分析に活用される。図４の（ａ）および（ｂ）に示すように、ＭＢＩＴ化合物を用いて、両試料間の相対的量の比を定量する相対定量分析、およびある試料の絶対量を求める絶対定量分析の両方ともが可能である。
【００７３】
２−ｐｌｅｘ相対定量分析は、図４の（ａ）に示されている過程によって行われる。両試料（未知量）のタンパク質をそれぞれ酵素分解する。試料１由来のペプチドと試料２由来のペプチドをそれぞれＨＭＢＩＴまたはＬＭＢＩＴで区分標識した後、混合してクロマトグラフィーで分離し、しかる後に、これをタンデム質量分析過程によって配列分析および同時定量分析する。
【００７４】
前述した相対定量分析と同様の過程を経るが、２つの試料の一方を既知量のタンパク質またはペプチドにして実験を行う場合、図４の（ｂ）に示すように絶対定量分析が可能となる。
【００７５】
図５（ａ）は同一物性を有し且つ多様な質量値を有するＭＢＩＴセットのタンデム質量スペクトルに現れる特性を示す概略図であり、図５（ｂ）および図５（ｃ）は、２種以上のＭＢＩＴセットを用いて３つ以上の試料を同時に多重定量分析する過程を示す概略図である。
【００７６】
質量調節基の物性調節によって定量信号の質量値は異なり定量信号の強さは各ＭＢＩＴの間で類似に現れるので、同一物性の多数のＭＢＩＴを使用した多重定量分析が可能になる。
【００７７】
まず、多重定量分析のために、互いに異なる条件または環境で生成されたタンパク質試料を酵素分解してペプチドに作る。第１の多重定量分析方法は次の過程によって行われる。準備されたペプチドのうち、一つの条件で収穫したペプチドを比較対象の個数だけ同一の量で分取し、それぞれを、相異なる質量信号値を有するＨＭＢＩＴ（またはＬＭＢＩＴ）可変質量ラベリング剤と反応させる。比較しようとする対象ペプチドは、それぞれ相異なる質量信号値を有するＬＭＢＩＴ（またはＨＭＢＩＴ）可変質量ラベリング剤と反応させる。
【００７８】
第２の多重定量方法は、準備された各ペプチドを二等分した後、それぞれに相異なる種類のＭＢＩＴ試薬（ＨＭＢＩＴ（ｎ−１）とＬＭＢＩＴ（ｎ）、またはＬＭＢＩＴ（ｎ−１）とＨＭＢＩＴ（ｎ））を反応させる。このように標識された全てのペプチドを混合してクロマトグラフィーで分離し、それぞれの同重体親イオンをタンデム質量分析して配列分析および定量分析すると、同時に多数の試料の量を定量分析することができる。第１の多重定量分析法は、同一の対照群を使用するので、対照群との比較によって多数のサンプル間の相対的な量を直ちに知ることができる。
【００７９】
第１の多重定量分析法を使用するとき、それぞれの比較対象試料を標識するＭＢＩＴ化合物の種類を変えて定量分析を繰返し行うか、或いは対照群を別の条件の試料として選択すると、多重試料の定量分析結果を統計的に多様な組み合わせで得ることができるため、定量結果の正確度を高めることができる。第２の定量方法は、相対的な量の差異が大きいため、只１回の比較によって相対的な量を知り難い場合に適用する場合、第１の方法より正確な定量が可能になる。
【実施例】
【００８０】
以下、実施例および添付図面を参照して、本発明に係る可変質量ラベリング剤とこれを用いたペプチド酸配列およびタンパク質定量同時分析方法について詳細に説明する。ところが、本発明が後述の内容に限定されるのではなく、当該分野における通常の知識を有する者であれば、本発明の技術的思想を逸脱することなく、本発明を多様な形態に具現することができるであろう。
【００８１】
下記では、質量調節基がアラニン（Ａｌａ）、セリン（Ｓｅｒ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、バリン（Ｖａｌ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、アルギニン（Ａｒｇ）またはチロシン（Ｔｙｒ）側鎖であるものと、エチル（Ｃ２）、プロピル（Ｃ３）、ブチル（Ｃ４）、ペンチル（Ｃ５）、ヘキシル（Ｃ６）、ヘプチル（Ｃ７）またはオクチル（Ｃ８）であるものを区分して実施した。
【００８２】
エチル（Ｃ２）、プロピル（Ｃ３）、ブチル（Ｃ４）、ペンチル（Ｃ５）、ヘキシル（Ｃ６）、ヘプチル（Ｃ７）またはオクチル（Ｃ８）の質量調節基を有するＭＢＩＴ試薬の場合、該当ジペプチド構造を便宜上ＨＸｎ−ＡｌａまたはＬＸｎ−Ａｌａ（Ｈ：Heavy、Ｌ：light）で表記する。
【００８３】
１．酸型ＭＢＩＴ試薬の合成
酸型ＭＢＩＴ試薬（ＸＭＢＩＴ−ＯＨ、Ｘ＝ＬまたはＨ）は、標準固相ペプチド合成法または液相有機合成法によって合成された。標準固相ペプチド合成法としては、アミノ酸残基が質量調節基として使用され、該当質量調節基がアラニン（Ａｌａ）、セリン（Ｓｅｒ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、バリン（Ｖａｌ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、アルギニン（Ａｒｇ）またはチロシン（Ｔｙｒ）などの天然アミノ酸の側鎖であるＭＢＩＴ試薬と、アシル基またはアミノ酸残基が質量調節基として使用され、該当質量調節基がエチル（Ｃ２）、プロピル（Ｃ３）、ブチル（Ｃ４）、ペンチル（Ｃ５）、ヘキシル（Ｃ６）、ヘプチル（Ｃ７）またはオクチル（Ｃ８）である全てのＭＢＩＴ試薬を合成することができる。液相有機合成法としては、アミノ酸残基が質量調節基として使用され、当該質量調節基がヘキシル（Ｃ６）、ヘプチル（Ｃ７）またはオクチル（Ｃ８）である場合の酸型ＭＢＩＴ試薬を合成することができる。
【００８４】
図６の（ａ）はＮ末端がアシル化されたジペプチド構造のＭＢＩＴ試薬を固相合成法を用いて合成する過程を概略に示し、図６の（ｂ）は液相有機合成法による酸型ＭＢＩＴ試薬の合成過程を示す。
【００８５】
（ａ）固相ペプチド合成法を用いた合成
物質
無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ピペリジン、ジクロロメタン（ＤＣＭ、ＨＰＬＣグレード）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、ＨＰＬＣグレード）、チオアニソール（ＴＡ、＞９９．５％）、エタンジチオール（ＥＤＴ、＞９９．５％）、無水酢酸、プロピオン酸、酪酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、Ｎ−Ｆｍｏｃ−アラニンはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。酢酸−ｄ３、Ｎ−Ｆｍｏｃ−アラニン−３，３，３，−ｄ３はＣＤＮ ｉｓｏｔｏｐｅ（Ｔｏｒｏｎｔｏ、カナダ）から購入した。２−塩化トリチルレジンはＭｅｒｃｋから購入した。Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボイミド（ＤＩＣ）、１−ベンゾトリアゾール、およびＮ末端がＦｍｏｃで保護された他の全てのアミノ酸はＡｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈから購入した。
【００８６】
合成過程
１）段階１
Ｎ−Ｆｍｏｃ−アラニンまたはＮ−Ｆｍｏｃ−アラニン−３，３，３−ｄ３（７５ｍｇ）を、水分が完全に除去されたジクロロメタン溶液１ｍＬに溶かした。ジクロロメタンのみではよく溶けないので、１００μＬのＤＭＦを入れて完全に溶解させた。準備したＮ−Ｆｍｏｃアミノ酸溶液と１７０μＬのＤＩＰＥＡを、火炎乾燥したバイアルに入っている２−塩化トリチルレジン０．１ｇと混合し、２〜４時間緩やかに攪拌した。レジンをペプチド合成用ポリプロピレン材質のカートリッジ（総量：５ｍＬ）に移した後、十分な量のジクロロメタン／メタノール／ＤＩＰＥＡ混合溶液（１７／２／１、ｖ／ｖ／ｖ）で３回洗浄した。その後、十分な量のジクロロメタンで３回、ＤＭＦで２回さらに洗浄した後、ジクロロメタンで２回さらに洗浄し、しかる後に、レジンから溶液を完全に除去し、減圧条件で完全に乾燥させる。
【００８７】
２）段階２
段階１で製造された乾燥レジンに約３ｍＬ程度のＤＭＦを入れて２〜３分間十分振とうし、ＤＭＦを除去する過程を約５回繰返し行ってレジンをＤＭＦに十分浸漬した。ＤＭＦに混ざっている２５％ピペリジン溶液を約３ｍＬ程度レジンに混ぜ、５分間攪拌した後、溶液を除去した。その後、さらに２５％ピペリジン溶液を３ｍＬ程度レジンにさらに入れた後、１５分間攪拌し、溶液を除去した。しかる後に、レジンを十分な量のＤＭＦで３回、メタノールで３回洗浄し、さらにＤＭＦで３回洗浄した。
【００８８】
３）段階３
アミノ酸側鎖が質量調節基として使用されるＭＢＩＴ試薬を合成する場合には次のように製造した。
【００８９】
段階２で製造されたレジンに、ＤＭＦに０．６Ｍ濃度で溶かしたＦｍｏｃ−アミノ酸（アラニン、セリン、バリン、グルタミン、ヒスチジン、フェニルアラニン、アルギニン、およびチロシンのいずれか一つ）溶液を１ｍＬ仕込んだ。同様に、ＤＭＦにそれぞれ０．６Ｍ濃度で溶かした１−ベンゾトリアゾール溶液、ＤＩＣ溶液を１ｍＬずつ仕込み、２時間３０分ゆっくり攪拌した。その後、混合溶液を除去し、レジンを十分な量のＤＭＦで３回、メタノールで３回洗浄し、さらにＤＭＦで３回洗浄した。
【００９０】
アシル基が質量調節基として使用されるＭＢＩＴ試薬を合成する場合には次のように製造した。
【００９１】
段階２で製造されたアラニン−ｄ３（またはアラニン−ｄ０）が付いているレジンに、ＤＭＦに０．６Ｍ濃度で溶かしたＦｍｏｃ−アラニン−ｄ０溶液（またはＦｍｏｃ−アラニン−３，３，３−ｄ３）、１−ベンゾトリアゾール溶液、およびＤＩＣ溶液を１ｍＬずつ仕込み、２時間３０分ゆっくり攪拌した。その後、混合溶液を除去し、レジンをＤＭＦで３回、メタノールで３回洗浄し、さらにＤＭＦで３回洗浄した。
【００９２】
４）段階４
段階３で製造されたレジンに、ＤＭＦに混ざっている２５％ピペリジン溶液を約３ｍＬ程度添加し、５分間攪拌した後、溶液を除去した。その後、さらに２５％ピペリジン溶液を３ｍＬ程度レジンにさらに加えた後、１５分間攪拌し、溶液を除去した。その後、レジンを十分な量のＤＭＦで３回、メタノールで３回洗浄し、さらにＤＭＦで３回洗浄した。
【００９３】
５）段階５
アミノ酸側鎖が質量調節基として使用されるＭＢＩＴ試薬を合成する場合には次のように製造した。
【００９４】
段階４で製造されたレジンに、０．６Ｍ濃度でＤＭＦにそれぞれ溶かした酢酸または酢酸−ｄ３を１ｍＬ加えた。レジンに最初反応させたものがＦｍｏｃ−アラニンの場合には酢酸−ｄ３を使用し、Ｆｍｏｃ−アラニン−３，３，３−ｄ３の場合には重水素で標識されていない酢酸を使用した。また、０．６Ｍ濃度でＤＭＦにそれぞれ溶かした１−ベンゾトリアゾール溶液とＤＩＣ溶液を１ｍＬずつレジンに混ぜ、２時間３０分ゆっくり攪拌した。その後、混合溶液を除去し、レジンを十分な量のＤＭＦで３回、メタノールで３回、ＤＭＦで３回、さらにメタノールで３回洗浄した後、減圧条件で完全に乾燥させてバイアルに移した。
【００９５】
アシル基が質量調節基として使用されるＭＢＩＴ試薬を合成する場合には次のように製造した。
【００９６】
段階４で製造されたレジンに、０．６Ｍ濃度でＤＭＦにそれぞれ溶かしたカルボン酸（プロピオン酸、酪酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、またはノナン酸）、１−ベンゾトリアゾール溶液、およびＤＩＣ溶液を１ｍＬずつ仕込み、２時間３０分ゆっくり攪拌した。その後、混合溶液を除去し、レジンをＤＭＦで３回、メタノールで３回、ＤＭＦで３回、さらにメタノールで３回洗浄した後、減圧条件で完全に乾燥させてバイアルに移した。
【００９７】
６）段階６
段階５で製造されたレジンに、ＴＦＡ／ベンゼン／ＴＡ／蒸留水／ＥＤＴ混合溶液（１６．５／１／１／１／０．５、ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）２ｍＬを混ぜ、３時間攪拌した。この過程で合成された酸型ＭＢＩＴ試薬がレジンから分離された。レジンは全て濾過し、残った溶液を別途に集め、体積が２００μＬ以下となるように窒素によって乾燥させた。その溶液に、冷たく冷したエーテルを添加して白色粉末状の生成物（酸型ＭＢＩＴ試薬）を沈殿させた。沈殿した生成物は、冷たく冷したエーテルで３回または４回洗浄した後、減圧条件で完全に乾燥させた。
【００９８】
（ｂ）液相有機合成法を用いた合成
物質
２−アミノ−４−ペンテン酸、無水酢酸（Ａｃ２Ｏ−ｄ０）、Ｂｏｃ−ｌ−アラニン−ｄ０、ＴＦＡ、４−オクテン、５−デケン、１−ヘプテン、およびグラブス触媒(Grubb’s catalyst、2nd generation)はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入し、ｄｌ−アラニン−ｄ３、および過重水素化無水酢酸（Ａｃ２Ｏ−ｄ６）はＣＤＮ Ｉｓｏｔｏｐｅｓ（Ｑｕｅｂｅｃ、カナダ）から購入した。
【００９９】
合成過程
１）段階１
２−アミノ−４−ペンテン酸（２ｍｍｏＬ）をｐＨ９〜１０の水（４ｍＬ）に溶かし、無水酢酸（４．０ｍｍｏＬ）を０℃で投入した。８Ｍ ＮａＯＨを投入してｐＨ１０程度に調節し、反応混合物を４時間０℃で攪拌した。濃い塩酸溶液を投入してｐＨ２以下に作って反応を終了した。生成物はメタノールに溶かし、精製して乾燥させて２−アセトアミド−４−ペンテン酸を固体として回収した。
【０１００】
２）段階２
アラニンベンジルエステルは、Ｂｏｃで保護されたアラニンに臭化ベンジルを加えてＢｏｃ−アラニンベンジルエステルを作った後、ＴＦＡを加えてＢｏｃを除去する過程によって作られる。ジオキサンと水との混合物（２／１、ｖ／ｖ）に０．３３Ｍで溶けた１−アラニン−ｄ３（１ｍｍｏＬ）に、１．５ｍＬの１Ｍ ＮａＯＨとジ−３次−ブチルジカルボネート（１．１ｍｍｏＬ）を投入した後、室温で６時間攪拌した。ジオキサンを蒸発させた後、氷を用いて混合物を冷却し、ＫＨＳＯ４飽和水溶液を加えてｐＨを２〜３程度に低めた。有機生成物は３回にわたって１０ｍＬの酢酸エチル（ＥＡ）で抽出され、無水Ｎａ２ＳＯ４の下で乾燥した。シリカゲルクロマトグラフィー精製によって、Ｂｏｃ−ｄｌ−アラニン−ｄ３（０．１４ｇ、０．７４ｍｍｏＬ）が得られた。０．５ｍｍｏＬのＢｏｃ−ｄｌ−アラニン−ｄ０またはＢｏｃ−ｄｌ−アラニン−ｄ３を無水アセトン（５ｍＬ）に溶かし、炭酸カリウム（０．７５ｍｍｏＬ）と臭化ベンジル（０．５５ｍｍｏＬ）を加えた。５時間の還流後、反応生成物は室温に冷却し、濃縮された後、クロロホルム（１０ｍＬ）に溶解された。有機層を炭酸ナトリウムの飽和水溶液（３０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４の下で乾燥させた後、シリカゲルクロマトグラフィーで精製してＢｏｃ−アラニン−ｄ０ベンジルエステルまたはＢｏｃ−アラニン−ｄ３ベンジルエステルを白色固体として得た。Ｂｏｃ−アラニン−ｄ０ベンジルエステルまたはＢｏｃ−アラニン−ｄ３ベンジルエステル（０．９８ｍｍｏＬ）を無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）に溶かし、８ｍｍｏＬのＴＦＡを０℃で加えて１時間攪拌した。減圧の下で溶媒を除去した後、残留物は高真空の下で乾燥させた。油状生成物（アラニン−ｄ０ベンジルエステルまたはアラニン−ｄ３ベンジルエステル）は無水ＴＨＦ（２ｍＬ）に保管した。
【０１０１】
３）段階３
段階２で製造された、ＴＨＦ（５ｍＬ）に溶けたアラニン−ｄ０ベンジルエステルまたはアラニン−ｄ３ベンジルエステル（０．５５ｍｍｏＬ）に、ＢＯＰ試薬（１．０１ｍｍｏＬ）を加えた後、３０分間室温で攪拌した。ＤＩＰＥＡ（３．３６ｍｍｏＬ）を０℃で投入し、さらに室温で１５分間攪拌した後、段階１で製造された、無水ＴＨＦに溶けた２−アセト−ｄ３−アミド−４−ペンテン酸または２−アセト−ｄ０−アミド−４−ペンテン酸を加えた後、一晩室温で攪拌した。溶媒を蒸発させた後、残留物はＥＡに溶解させた。有機層を水で洗浄した。残留油状生成物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーで精製することにより、ベンジル２−（２−アセトアミド−４−ペンテンアミド）プロパネートを無色固体として得た。
【０１０２】
４）段階４
ＤＣＭに、段階３で製造されたベンジル２−（２−アセトアミド−４−ペンテンアミド）プロパネート、アルケン（４−オクテン、５−デケン、または１−ヘプテン）、およびグラブス触媒を仕込んで４０℃で２４時間還流させた。触媒と溶媒を除去した後、シリカゲルクロマトグラフィーで精製した。この反応生成物は、２０ｍｏｌ％のＰｄ（ＯＨ）２と共に無水エタノールで混合した後、室温で一晩１気圧のＨ２圧力下で攪拌した。触媒をフィルターリングして濾した後、生成物を真空下で濃縮し、メタノールとエーテルの１：１混合物を用いた再結晶を行うことにより、酸型ＭＢＩＴ試薬を得た。
【０１０３】
２．ＭＢＩＴ試薬と分析体ペプチドとの結合
物質
無水アセトニトリル（ＡＣＮ、ＨＰＬＣグレード）、無水ＤＭＦ、ヒドロキシルアミンヒドロクロライド、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、ＨＰＬＣグレード）、α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ＨＣＣＡ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）は、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌ）から購入した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）パウダーはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入した。
【０１０４】
ＭＢＩＴ試薬の活性エステル製造およびモデルペプチドとの反応
図７はＭＢＩＴ試薬を分析対象ペプチドと反応させるために活性エステルを形成する過程、およびこれにより形成されたＭＢＩＴ活性エステルを分析対象ペプチドと反応させる実験方法を示す概略図である。
【０１０５】
ＭＢＩＴ試薬のスクインイミジルエステル（ＯＳｕ）を製造する方法、およびモデルペプチドに反応させる過程は図７に概略に示されている。ＤＭＦに溶けているＸＭＢＩＴ−ＯＨ（Ｘ＝ＬまたはＨ）、ＥＤＣ、およびＮＨＳを最終濃度がそれぞれ６０、３５、４０ｍＭとなるように混合し、室温で４５分間攪拌した。このように生成されたＸＭＢＩＴ−ＯＳｕ溶液は追加精製過程なしで分析体との反応に直ちに利用した。
【０１０６】
モデルペプチドとしては、アンジオテンシンＩＩ（ＤＲＶＹＩＨＰＦ）またはロイシンエンケファリン（ＹＧＧＦＬ）を使用した。アミノ酸残基が質量調節基として使用され且つ前記質量調節基がアラニン（Ａｌａ）、セリン（Ｓｅｒ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、バリン（Ｖａｌ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、アルギニン（Ａｒｇ）、およびチロシン（Ｔｙｒ）などの天然アミノ酸側鎖であるＭＢＩＴ試薬で実験した場合には、アンジオテンシンＩＩとロイシンエンケファリンが１：１のモル比で混合されたモデルペプチド混合物を使用し、残りのエチル（Ｃ２）、プロピル（Ｃ３）、ブチル（Ｃ４）、ペンチル（Ｃ５）、ヘキシル（Ｃ６）、ヘプチル（Ｃ７）またはオクチル（Ｃ８）を質量調節基として使用した場合はアンジオテンシンＩＩのみをモデルペプチドとして使用した。
【０１０７】
モデルペプチドまたはモデルペプチド混合物を、０．４ｍＭの濃度となるように５０ｍＭの重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）バッファに溶かした。このモデルペプチド溶液１０μＬを、準備されたＬＭＢＩＴ−ＯＳｕまたはＨＭＢＩＴ−ＯＳｕ溶液１０μＬと混ぜ、室温で５時間攪拌した。その後、１０μＬのヒドロキシルアミン溶液（８０ｍＭ ｉｎ １００ｍＭ ＮａＨＣＯ３）を仕込み、少なくとも５時間以上攪拌して副反応を可逆させ、過量のＭＢＩＴ−ＯＳｕ試薬を不活性化させた。しかる後に、１０％ＴＦＡを５μＬ添加して反応を完全に終結させた。
【０１０８】
ＢＳＡのトリプシンペプチドに対するＭＢＩＴ反応
アミノ酸残基が質量調節基として使用され且つ該当質量調節基がアラニン（Ａｌａ）、セリン（Ｓｅｒ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、バリン（Ｖａｌ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、アルギニン（Ａｒｇ）、またはチロシン（Ｔｙｒ）などの天然アミノ酸側鎖であるＭＢＩＴ試薬を用いて、ＢＳＡのトリプシンペプチドを標識する反応を行った。
【０１０９】
ｐＨ８．１の１００ｍＭ重炭酸ナトリウムバッファに溶解したＢＳＡ（０．６ｍｇ／ｍＬ）は、０．１％酢酸に溶解した改質トリプシン（０．１μｇ／μＬ）と６０：１の重量比で混合して３８℃で１２時間培養した。得られたトリプシンペプチド溶液を１６μＬずつ分取してＨＭＢＩＴ−ＯＳｕまたはＬＭＢＩＴ−ＯＳｕ溶液１４μＬと混合して３０分間攪拌した。その後、さらにＨＭＢＩＴ−ＯＳｕまたはＬＭＢＩＴ−ＯＳｕ溶液６μＬを仕込み、３０分〜２時間さらに攪拌した。その後、１０μＬの１００ｍＭヒドロキシルアミンを仕込み、少なくとも４時間攪拌して副反応を可逆させた後、残っているＸＭＢＩＴ−ＯＳｕを除去した。反応は１０μＬの１０％ＴＦＡを仕込んで完全に終結させた。
【０１１０】
Ｈｓｃ８２のトリプシンペプチドに対するＭＢＩＴ反応
エチル（Ｃ２）、プロピル（Ｃ３）、ブチル（Ｃ４）、ペンチル（Ｃ５）、ヘキシル（Ｃ６）、ヘプチル（Ｃ７）またはオクチル（Ｃ８）を質量調節基として使用した場合のうち、アミノ酸残基を質量調節基として有し且つ該当質量調節基がヘキシル（Ｃ６）、ヘプチル（Ｃ７）またはオクチル（Ｃ８）であるＭＢＩＴ試薬を用いて、Ｈｓｃ８２のトリプシンペプチドに標識する反応を行った。
【０１１１】
Ｎ末端ヘマグルチン（ＨＡ）標識Ｈｓｃ８２タンパク質は、４つの相異なる生長条件で得られた。ＨＡ−Ｈｓｃ８２タンパク質を発現させた条件は、Ｈｓｃ８２のようなＨｓｐ９０ファミリーであるＨｓｐ８２タンパク質の存在有無と酵母の生長温度とを組み合わせて、図２２の（ａ）に示すように合計４つの場合に分けられる。ｎｏｒｍ３０はＨｓｐ８２とＨｓｃ８２タンパク質の両方ともを持っている酵母を３０℃で生育させた場合であり、ｎｏｒｍ３９はＨｓｐ８２とＨｓｃ８２タンパク質の両方ともを持っている酵母を、これらのタンパク質を過発現させるために３９℃で育てて場合であり、ｄｅｌ３０はＨｓｐ８２タンパク質のみが除去された酵母を３０℃で育てて場合であり、ｄｅｌ３９はＨｓｐ８２タンパク質のみが除去された酵母を３９℃で生育させて過発現させた場合である。これらの条件下で生成されたＨＡ−Ｈｓｃ８２タンパク質は、酵母から抽出されてアンチ−ＨＡマトリクス（ｃｌｏｎｅ３Ｆ１０、Ｒｏｃｈｅ）とＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いて分離および精製された。発現されたＨＡ−Ｈｓｃ８２タンパク質の量はＳｙｐｒｏ Ｒｕｂｙ Ｓｔａｉｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）で染色した後、ＶｅｒｓａＤｏｃ ５０００ＭＰゲルイミジ化システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）で定量した。
【０１１２】
Ｈｓｃ８２のペプチドを得るために、次の方法でトリプシンを用いて各試料を酵素分解した。ゲルからタンパク質バンドを切り出した後、１００ｍＭ ＮａＨＣＯ３バッファに２０分間放置した。バッファを除去した後、ゲルを細かく切断し、ＡＣＮを加えて水を除去した。各試料に、５０ｍＭ ＮａＨＣＯ３バッファに溶けているトリプシン０．６６μｇを加えた後、３７℃で２０時間反応させた。蒸留水とＡＣＮとの混合溶液を用いてゲル断片からペプチドを抽出した後、各試料別に乾燥させた。
【０１１３】
乾燥した各試料に３５μＬの蒸留水を加えて溶かした。このように準備された各試料溶液を４μＬずつ分取してＨＭＢＩＴ−ＯＳｕとＬＭＢＩＴ−ＯＳｕ溶液４μＬと混合して５時間攪拌した。この際、ｎｏｒｍ３９とＬＸ６−Ａｌａを、ｄｅｌ３０とＬＸ７−Ａｌａを、ｄｅｌ３９とＬＸ８−Ａｌａを、ｎｏｒｍ３０とＨＸ６−Ａｌａ、 ＨＸ７−ＡｌａおよびＨＸ８−Ａｌａをそれぞれ反応させた。その後、４μＬのヒドロキシルアミン溶液（８０ｍＭ）を仕込み、少なくとも５時間以上攪拌して副反応を可逆させ、過量のＭＢＩＴ−ＯＳｕ試薬を不活性化させた。しかる後に、１０％ＴＦＡを２μＬ添加して反応を完全に終結させた。
【０１１４】
ＭＢＩＴ−モデルペプチドのＭＡＬＤＩ試料の製造
ＸＭＢＩＴが連結されたモデルペプチド溶液は、ＭＡＬＤＩ質量分析のために０．１％ＴＦＡ溶液に５００倍希釈した。ＬＭＢＩＴおよびＨＭＢＩＴが連結されたモデルペプチドは、７つの多様な比率で混合した。（［Ｌ］／［Ｈ］＝１／１、２．３／１、４／１、６．３／１、９／１、１２．３／１、１６／１）の７つの混合比で準備された各試料は、マトリクス溶液（５ｍｇ／ｍＬ ＨＣＣＡ ｉｎ ５０／５０／０．１、Ｈ２Ｏ／ＡＣＮ／ＴＦＡ）と１：１の体積比で混合した。試料／マトリクス混合物１μＬがＭＡＬＤＩプレートにロードされた。一つの試料スポット当りロードされたモデルペプチドの量はアンジオテンシンＩＩとロイシンエンケファリンがそれぞれ約２５０ｆｍｏｌずつであった。
【０１１５】
ＭＢＩＴに連結されたＢＳＡまたはＨｓｃ８２トリプシンペプチドのＬＣ−ＭＡＬＤＩ試料の製造
ＨＭＢＩＴまたはＬＭＢＩＴに連結されたトリプシンペプチド１：１の比率で混合し、その一分取量（６．４μＬ）を、ＰｅｐＭａｐカラム（孔径１００Å、粒径３ｍｍ、内径７５ｍｍ、長さ１５０ｍｍ）を取り付けた逆相ナノ液相クロマトグラフィー（Reverse-Phase Nano-Liquid Chromatography、ＲＰ−ｎａｎｏ−ＬＣ）分離機（ＬＣ−ｐａｃｋｉｎｇｓ社、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）に注入した。ＬＣは流速０．３μＬ／分で６０分間作動し、２−溶媒勾配を用いて作動した。体積比でＨ２Ｏ／ＡＣＮ／ＴＦＡ＝９５／５／０．１の溶媒ＡとＡＣＮ＝ＴＦＡ＝１００／０．１の溶媒Ｂが２−溶媒勾配に利用された。［溶媒Ａ］／［溶媒Ｂ］勾配は１００／０から始まり、０〜２０分の間に３０／７０に変わり、２０〜４０の間に０／１００に変わり、４０〜４５分まで０／１００に維持された。４５分となる時点で１００／０に急激に落ち、４５〜６０分の間１００／０の比率が維持された。溶出される試料は、マトリクス溶液と共に２５秒毎に単一ＭＡＬＤＩスポットにＰｒｏｂｏｔ ｍｉｃｒｏｆｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｌｌｅｃｔｏｒを用いて集められた。６０分間合計１４４個のＭＡＬＤＩスポットにＬＣ溶出してくる試料が分取されて塗布された。
【０１１６】
ＭＡＬＤＩ−ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ
前記方法によってＭＡＬＤＩターゲットに塗布された試料を分析するために、４７００ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）が陽イオンモードで質量対電荷比の範囲５００〜２５００Ｔｈで使用された。各塗布されたスポットに対してＴｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ（ＴＯＦ）スペクトルは１０００個の反復レーザーショットに対する結果を蓄積することにより得られた。
【０１１７】
ＸＭＢＩＴに連結されたモデルペプチドのイオンは質量調節基ＲＴの種類によって相異なる質量対電荷比の位置で検出され、それぞれのＸＭＢＩＴに連結されたペプチドはタンデム質量分析のための親イオンとして選択された。ＸＭＢＩＴに連結されたＢＳＡトリプシンペプチドの場合、多様な配列のペプチドが多様な溶出時間で検出されることを確認した。
【０１１８】
タンデム質量分析のために、各選択された衝突誘起解離（Collision-Induced Dissociation、ＣＩＤ）を１．３×１０−６ｔｏｒｒの大気圧下で行った。このＣＩＤスペクトルは、２０００回の反復レーザーショットに対する結果を蓄積することにより得られた。ＣＩＤスペクトルは、ＡＢＩ−４７００ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒに共に提供されているＤａｔａＥｘｐｌｏｒｅｒプログラムを用いてベースラインが補正された。ベースライン補正の後、ＬｂＳ、ＨｂＳイオンの強さを測定して相対的な量の比を決定した。各ＣＩＤスペクトルをＰＥＡＫＳ４．５（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．，カナダ）を用いて分析することにより、デノボ(de novo)配列分析が行われた。
【０１１９】
３．ＭＢＩＴを用いた実際実験結果
（ａ）質量調節基がアラニン（Ａｌａ）、セリン（Ｓｅｒ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、バリン（Ｖａｌ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、アルギニン（Ａｒｇ）、またはチロシン（Ｔｙｒ）などの天然アミノ酸の側鎖である場合
−ＭＢＩＴ試薬の検証
製造されたＭＢＩＴ試薬に正常的に合成されたかを検証するために、それぞれのＭＢＩＴ試薬をアンジオテンシンＩＩ（１０４６．５Ｔｈ）に標識して［ＭＡＧ（１）＋Ｈ］＋イオンの質量を検出し（図８（ａ）〜図８（ｈ））、タンデム質量分析（図９）を行った。ＬＭＢＩＴとＨＭＢＩＴでそれぞれ標識されたアンジオテンシンＩＩは、同一の質量値で検出された。［ＭＡＧ（１）＋Ｈ］＋イオンの質量値は、質量調節基がそれぞれアラニン側鎖の場合には１２３３．６Ｔｈ、セリン側鎖の場合には１２４９．６Ｔｈ、バリン側鎖の場合には１２６１．７Ｔｈ、グルタミン側鎖の場合には１２９０．７Ｔｈ、ヒスチジン側鎖の場合には１２９９．７Ｔｈ、フェニルアラニン側鎖の場合には１３０９．７Ｔｈ、アルギニン側鎖の場合には１３１８．７Ｔｈ、チロシン側鎖の場合には１３２５．７Ｔｈである。標識シグニチャーと定量信号質量値は、質量調節基がアラニン側鎖の場合には１８８Ｔｈ（ｂ０）、１１４Ｔｈ（ＬｂＳ）、および１１７Ｔｈ（ＨｂＳ）、セリン側鎖の場合には２０４Ｔｈ（ｂ０）、１３０Ｔｈ（ＬｂＳ）および１３３Ｔｈ（ＨｂＳ）、バリン側鎖の場合には２１６Ｔｈ（ｂ０）、１４２Ｔｈ（ＬｂＳ）および１４５Ｔｈ（ＨｂＳ）、グルタミン側鎖の場合には２４５Ｔｈ（ｂ０）、１７１Ｔｈ（ＬｂＳ）および１７４Ｔｈ（ＨｂＳ）、ヒスチジン側鎖の場合には２５４Ｔｈ（ｂ０）、１８０Ｔｈ（ＬｂＳ）、および１８３Ｔｈ（ＨｂＳ）、フェニルアラニン側鎖の場合には２６４Ｔｈ（ｂ０）、１９０Ｔｈ（ＬｂＳ）および１９３Ｔｈ（ＨｂＳ）、アルギニン側鎖の場合には２７３Ｔｈ（ｂ０）、１９９Ｔｈ（ＬｂＳ）および２０２Ｔｈ（ＨｂＳ）、そしてチロシン側鎖の場合は２８０Ｔｈ（ｂ０）、２０６Ｔｈ（ＬｂＳ）および２０９Ｔｈ（ＨｂＳ）でそれぞれ計測された。前記結果より、本発明で製造された天然アミノ酸残基を用いたＭＢＩＴ試薬が正常的に合成されたことが分かる。
【０１２０】
−ＭＢＩＴ連結されたモデルペプチドのタンデム質量分析
図８（ａ）〜図８（ｈ）はアンジオテンシンＩＩとロイシンエンケファリンとのペプチド混合物を８種のＭＢＩＴ試薬対で反応させた後、それぞれをＭＡＬＤＩ質量分析した結果を概略的に示す図である。図２の（ｂ）に示した８つの相異なる質量調節基ＲＴを有する８種のＭＢＩＴ試薬対それぞれをモデルペプチドと反応させてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析した結果を図８（ａ）〜図８（ｈ）に示す。図８（ａ）〜図８（ｈ）に示すように、［ＭＸＸ（ｎ）＋Ｈ］＋のＸＸはペプチドの種類を示し（ＡＧ＝アンジオテンシンＩＩ、ＬＥ＝ロシンエンケファリン）、ｎはペプチドに連結されたＭＢＩＴ試薬の個数を示す。Ｎ末端がアシル化されたジペプチド構造のＭＢＩＴ試薬（Ｎ−アセチル−ＸＸＸ−ＡｌａまたはＡｃ−ＸＡ）において、質量調節基を含むＸｘｘ（またはＸ）がアラニン（図８（ａ））、セリン（図８（ｂ））、バリン（図８（ｃ））、グルタミン（図８（ｄ））、ヒスチジン（図８（ｅ））、フェニルアラニン（図８（ｆ））、アルギニン（図８（ｇ））、およびチロシン（図８（ｈ））の場合をそれぞれ示した。質量調節基がアラニンの場合には１２３３．６Ｔｈ、セリンの場合には１２４９．６Ｔｈ、バリンの場合には１２６１．７Ｔｈ、グルタミンの場合には１２９０．７Ｔｈ、ヒスチジンの場合には１２９９．７Ｔｈ、フェニルアラニンの場合には１３０９．７Ｔｈ、アルギニンの場合には１３１８．７Ｔｈ、チロシンの場合には１３２５．７ＴｈでアンジオテンシンＩＩに該当する［ＭＡＧ（１）＋Ｈ］＋イオンが検出された。また、質量調節基がヒスチジンの場合とアルギニンの場合、８０９．５Ｔｈと８２８．５Ｔｈでロイシンエンケファリンに該当する［ＭＬＥ（１）＋Ｈ］＋イオンがそれぞれ検出された。モデルペプチドにそれぞれのＭＢＩＴ試薬で反応が行われた後で増加する質量値が、該当ＭＢＩＴ試薬によって理論的に増加しなければならない質量値と一致するので、各ＭＢＩＴ試薬は成功的に合成された。
【０１２１】
ロイシンエンケファリンは、質量調節基（ＲＴ）が塩基性を呈する場合にのみＨ＋が付いている状態で検出された。ＭＢＩＴに連結されたアンジオテンシンＩＩ［ＭＡＧ（１）＋Ｈ］＋）は、質量調節基ＲＴの種類と関係なく全てＭＡＬＤＩ質量分析によって検出された。アンジオテンシンＩＩのチロシン側鎖に副反応がさらに行われたと思われる［ＭＡＧ（２）＋Ｈ］＋も発見されたが、［ＭＡＧ（１）＋Ｈ］＋に比べて強さが弱かった。反応が行われていないアンジオテンシンＩＩ（［ＭＡＧ（０）＋Ｈ］＋）は、図８（ｅ）に示すように、ヒスチジンの側鎖が質量調節基ＲＴとして使用された場合（Ａｃ−ＨＡ ＭＢＩＴ）にのみ比較的大きく現れた。これはＡｃ−ＨＡ ＭＢＩＴの合成および分離精製過程を最適化して試薬の純度を高めることさえすれば解決される問題である。このＡｃ−ＨＡ ＭＢＩＴを除いた残りのＭＢＩＴをペプチドに連結する反応は図８（ａ）〜図８（ｈ）の信号強さ比から推定したときに完結に近く行われた。
【０１２２】
ロイシンエンケファリンは、アンジオテンシンＩＩとは異なり、ペプチド配列に塩基性のアミノ酸が存在しないため、ＭＡＬＤＩイオン化の収率が低下する。よって、一般にＭＡＬＤＩ質量分析スペクトル上であまり検出されない。ところが、図８（ｅ）と図８（ｆ）に示すように、塩基性の質量調節基ＲＴを有するＡｃ−ＨＡとＡｃ−ＲＡ ＭＢＩＴがロイシンエンケファリンに連結されたときには、強い信号強さでＭＡＬＤＩ質量分析によって検出された。これにより、塩基性質量調節基を有するＭＢＩＴ試薬は既存のＭＡＬＤＩ質量分析によってあまり検出されなかったペプチドのイオン化収率を増大させて検出を可能にする付加的な機能を持っていることが分かった。
【０１２３】
図９は８種のＭＢＩＴ試薬対でそれぞれＭＢＩＴ反応が行われたアンジオテンシンＩＩイオン［ＭＡＧ（１）＋Ｈ］＋）のＭＡＬＤＩタンデム質量分析結果を示す図であって、各ＭＢＩＴ試薬対に対してＨＭＢＩＴで反応したペプチドとＬＭＢＩＴで反応したペプチドを１：１の混合比で混ぜてタンデム質量分析した結果である。互いに異なるアミノ酸残基を有するＭＢＩＴ試薬が連結されたそれぞれのアンジオテンシンＩＩイオンのＣＩＤスペクトルを示すもので、図７の（ａ〜ｈ）においてそれぞれＡｃ−ＡＡ、Ａｃ−ＳＡ、Ａｃ−ＶＡ、Ａｃ−ＱＡ、Ａｃ−ＨＡ、Ａｃ−ＦＡ、Ａｃ−ＲＡ、およびＡｃ−ＹＡのＭＢＩＴが連結されたアンジオテンシンＩＩのＣＩＤスペクトルである。各種類のＭＢＩＴ試薬に対して［Ｌ］／［Ｈ］の混合比が１：１である試料のＣＩＤスペクトルを示した。Ｎ末端の１次アミンにＭＢＩＴ試薬が連結されるため、Ｃ末端を含んでいる断片としてのｙタイプイオンは、ＭＢＩＴ試薬の種類を問わずに同一の質量対電荷比の値をもって検出された。これに対し、Ｎ末端を含んでいる断片ａ−またはｂ−タイプイオンは質量調節基の種類によって互いに異なる位置で検出された。図８（ｇ）のＡｃ−ＲＡ ＭＢＩＴが連結された場合を除けば、残りの７種のＭＢＩＴは通常ＣＩＤスペクトルにおける断片イオン分布が類似であった。Ａｃ−ＲＡ ＭＢＩＴのアルギニン側鎖の強い塩基性が断片イオンの分布に変化を及ぼすということが分かった。標識シグニチャー（ｂ０）および定量信号として使用されるＸｂＳイオン対（Ｘ＝ＬまたはＨ）は、ＭＢＩＴの種類によって異なる質量対電荷比の値で現れた。Ａｃ−ＡＡ ＭＢＩＴの場合は１８８Ｔｈ（ｂ０）、１１４Ｔｈ（ＬｂＳ）、１１７Ｔｈ（ＨｂＳ）で、Ａｃ−ＳＡ ＭＢＩＴの場合は２０４Ｔｈ（ｂ０）、１３０Ｔｈ（ＬｂＳ）、１３３Ｔｈ（ＨｂＳ）で、Ａｃ−ＶＡ ＭＢＩＴの場合は２１６Ｔｈ（ｂ０）、１４２Ｔｈ（ＬｂＳ）、１４５Ｔｈ（ＨｂＳ）で、Ａｃ−ＱＡ ＭＢＩＴの場合は２４５Ｔｈ（ｂ０）、１７１Ｔｈ（ＬｂＳ）、１７４Ｔｈ（ＨｂＳ）で、Ａｃ−ＨＡ ＭＢＩＴの場合は２５４Ｔｈ（ｂ０）、１８０Ｔｈ（ＬｂＳ）、１８３Ｔｈ（ＨｂＳ）で、Ａｃ−ＦＡ ＭＢＩＴの場合は２６４Ｔｈ（ｂ０）、１９０Ｔｈ（ＬｂＳ）、１９３Ｔｈ（ＨｂＳ）で、Ａｃ−ＲＡ ＭＢＩＴの場合は２７３Ｔｈ（ｂ０）、１９９Ｔｈ（ＬｂＳ）、２０２Ｔｈ（ＨｂＳ）で、Ａｃ−ＹＡ ＭＢＩＴの場合は２８０Ｔｈ（ｂ０）、２０６Ｔｈ（ＬｂＳ）、２０９Ｔｈ（ＨｂＳ）でそれぞれ定量信号イオン対が現れた。これは図２の（ｂ）で予想される値と一致し、これによってもＭＢＩＴ試薬が完璧に合成されたことが分かる。
【０１２４】
ＸｂＳイオン対は、ＣＩＤ過程に由来する剰余エネルギーによってさらに分解が起こり得る。図９に示すように、Ａｃ−ＲＡ ＭＢＩＴに連結された場合は、アルギニン側鎖における中性ＮＨ３損失が大きいため、ＸｂＳ−ＮＨ３の信号が１８２、１８５Ｔｈでさらに観測された。 ＸｂＳから中性ＣＯ損失に該当する２８Ｄａの質量が減少したＸａＳイオンが、 残り７種のＭＢＩＴのうち、 Ａｃ−ＡＡ ＭＢＩＴの場合には８６Ｔｈ（ＬａＳ）、８９Ｔｈ（ＨａＳ）で、Ａｃ−ＳＡ ＭＢＩＴの場合には１０２Ｔｈ（ＬａＳ）、１０５Ｔｈ（ＨａＳ）で、Ａｃ−ＶＡ ＭＢＩＴの場合には１１４Ｔｈ（ＬａＳ）、１１７Ｔｈ（ＨａＳ）で、Ａｃ−ＱＡ ＭＢＩＴの場合には１４３Ｔｈ（ＬａＳ）、１４６Ｔｈ（ＨａＳ）で、Ａｃ−ＨＡ ＭＢＩＴの場合には１５２Ｔｈ（ＬａＳ）、１５５Ｔｈ（ＨａＳ）で、Ａｃ−ＦＡ ＭＢＩＴの場合には１６２Ｔｈ（ＬａＳ）、１６５Ｔｈ（ＨａＳ）で、Ａｃ−ＹＡ ＭＢＩＴの場合には１７８Ｔｈ（ＬａＳ）、１８１Ｔｈ（ＨａＳ）でさらに検出された。
【０１２５】
図１０は定量信号対ＸｂＳが現れる位置を各ＭＢＩＴの種類別に拡大して示す図である。図１０に示すように、［Ｌ］／［Ｈ］混合比１／１にほぼ一致する［ＬｂＳ］／［ＨｂＳ］の信号強さ比を示している。Ａｃ−ＡＡ ＭＢＩＴを用いた場合、ＸｂＳ対が現れる１１４、１１７Ｔｈ近くで、ペプチド由来のものと推定される未知の雑音信号が大きく検出された。Ａｃ−ＳＡの場合は定量信号の強さが相対的に弱く、１／１の混合比とよく一致しない信号強さ比を示した。ところが、残り６種のＭＢＩＴを用いた場合、近くで雑音信号も殆ど見えず、混合比とほぼ類似している定量信号強さ比が観察された。
【０１２６】
図１１はＭＢＩＴに連結されたロイシンエンケファリンのＣＩＤスペクトルを示す図である。図１１の（ａ）はＡｃ−ＨＡが連結されて検出されたロイシンエンケファリンの結果であり、（ｂ）はＡｃ−ＲＡが連結されて検出された結果である。上述したＭＢＩＴに連結されたアンジオテンシンＩＩのＣＩＤ結果と同様に、ｙタイプイオンの位置はＭＢＩＴの種類を問わずに一定に維持されるが、ａ−、ｂ−タイプイオンの位置は質量調節基の質量差によって異なった。また、Ａｃ−ＲＡに連結されたロイシンエンケファリンの場合、Ｎ末端の方面にアルギニン側鎖が存在するため、ａ−およびｂ−タイプイオンで中性ＮＨ３損失が多く発見された。また、Ａｃ−ＨＡとＡｃ−ＲＡに連結されたロイシンエンケファリンの場合、それぞれ断片イオンの分布に対する大きい差を示した。これは、連結されたＭＢＩＴの種類に応じて、分析体ペプチドの物理化学的性質を様々に調節することができることをいい、質量調節基ＲＴが定量信号質量の変化だけでなく分析体の物性も調節することができることを示唆する。
【０１２７】
図１２はＭＢＩＴ試薬の種類による各定量信号の強さを全体断片イオンの強さの総合に対する比率で計算して示した。正確な定量分析のためには優先的に定量信号となるＸｂＳイオンの強さが強くなければならず、定量信号イオンがさらに分解してはならない。質量調節基がグルタミン、ヒスチジン側鎖の場合には、定量信号質量の強さが最も強く現れ、定量信号質量に対する追加分解イオンの強さが相対的に弱かった。ヒスチジンの側鎖が質量調節基の場合には、ＸｂＳイオンの強さが最も強く現れてアルギニン側鎖が使用された場合の５倍以上の定量信号が増幅したことが分かった。グルタミン側鎖が使用された場合には、ＸｂＳで追加分解が起こって生成されるＸａＳイオンの強さが相対的に最も弱く現れた。このような結果より、多様な質量調節基のうちヒスチジン或いはグルタミンの側鎖が、ＭＢＩＴを用いたペプチドおよびタンパク質の定量分析において最も優れた性能を示すことが分かった。
【０１２８】
図１３（ａ）〜図１３（ｈ）はＬＭＢＩＴが連結れたアンジオテンシンＩＩとＨＭＢＩＴが連結されたアンジオテンシンＩＩを前述した多様な混合比で混ぜて定量分析し、各混合比と測定によって得られた比との線形性を比較した図である。Ａｃ−ＳＡ ＭＢＩＴを除いた残り７種のＭＢＩＴは、アンジオテンシンＩＩの定量分析において混合比と一致する測定比を示していることが分かる。特にグルタミン、ヒスチジンの側鎖が質量調節基として使用されたＡｃ−ＱＡ ＭＢＩＴとＡｃ−ＨＡ ＭＢＩＴの場合、各測定値の標準偏差も最も小さく（測定値の２０％以内）、線形性も最も良好に現れた。これは前述したようにＡｃ−ＱＡとＡｃ−ＨＡ ＭＢＩＴの場合に定量信号の強さが強く現れるためであると推定される。この結果より、Ａｃ−ＱＡとＡｃ−ＨＡがペプチドおよびタンパク質定量分析において最も良い性能を発揮するＭＢＩＴであることを確認することができた。Ａｃ−ＳＡを用いた結果よりは、混合比と実験により得られた測定比とが全く一致せず、何の線形性も示さないことが分かった。これはＡｃ−ＳＡが連結されたアンジオテンシンＩＩのＣＩＤで定量信号強さの異なるＭＢＩＴを用いた場合に比べて小さいうえ、定量信号が現れる位置１３０、１３３Ｔｈに予想できない雑音信号が現れるためであると推定される。この雑音信号はＭＢＩＴで標識されていないアンジオテンシンＩＩにおいても現れる雑音信号である。
【０１２９】
図１４はロイシンエンケファリンの定量分析の線形性を確認する図であって、実際検出されたＡｃ−ＨＡ ＭＢＩＴが連結された場合と、Ａｃ−ＲＡ ＭＢＩＴが連結された場合に対する結果である。図１３（ａ）〜図１３（ｈ）のアンジオテンシンＩＩの結果と同様に、混合比と実験により測定した測定比とが良い線形性をもってよく一致することを確認することができる。
【０１３０】
図１５はＭＢＩＴで標識された分析体の定量分析測定限界を確認した結果である。ＬＭＢＩＴ−とＨＭＢＩＴ−でそれぞれ標識されたアンジオテンシンＩＩを３：１の比率で混合した後、タンデム質量分析した結果のうち、定量信号質量（ｂＳ）が表示される領域を拡大した図である。Ｎ−末端がアシル化されたジペプチド構造のＭＢＩＴ試薬（Ａｃ−Ｘｘｘ−Ａｌａ）において、質量調節基を含むＸｘｘが（ａ）バリン、（ｂ）グルタミン、（ｃ）ヒスチジン、（ｄ）フェニルアラニン、（ｅ）アルギニン、および（ｆ）チロシンである場合を示している。一つのＭＡＬＤＩスポットに２５０ｆｍｏｌの試料が塗布された場合から濃度を２倍ずつ持続的に薄め、現れる定量信号の信号対雑音比を観察した。これは検出限界が約４〜８ｆｍｏｌに達することを示す。これは本発明に使用したＭＡＬＤＩ質量分析機器の測定限界に該当する値であって、さらに良い装備を使用すればＭＢＩＴ試薬の測定限界はさらに低くなるだろうと期待される。
【０１３１】
図１６（ａ）〜図１６（ｉ）は同量のウシ血清アルブミンをトリプシンで酵素分解して生成されたペプチドをＭＢＩＴ試薬対で区分標識した後、混合して液相クロマトグラフィーおよびタンデム質量分析で定量分析した結果を示す図である。ＹＬＹＥＩＡＲの配列を有するペプチドの結果を示す。図１６（ａ）は８種のＭＢＩＴ対で標識されたＹＬＹＥＩＡＲペプチドが分離されてくる液相クロマトグラフィー結果を示し、図１６（ｂ）〜図１６（ｉ）は、質量調節基がそれぞれアラニン（図１６（ｂ））、セリン（図１６（ｃ））、バリン（図１６（ｄ））、グルタミン（図１６（ｅ））、ヒスチジン（図１６（ｆ））、フェニルアラニン（図１６（ｇ））、アルギニン（図１６（ｈ））、およびチロシン（図１６（ｉ））側鎖の場合、各ＭＢＩＴ対で標識されたＹＬＹＥＩＡＲがクロマトグラフィーで検出されるそれぞれの分取(fraction)をＭＡＬＤＩタンデム質量分析で定量分析した結果を示す。定量分析して得られた相対的量の平均と標準偏差が数値でそれぞれ表示された。タンパク質の定量および配列分析のために、液相クロマトグラフィーの活用が普遍的なので、ＭＢＩＴが実際分析体の定量および配列分析を正しくするためにはＨＭＢＩＴに連結されたペプチドとＬＭＢＩＴに連結された同一のペプチドがクロマトグラフィー上で同一の時間で溶出されなければならない。ＨＭＢＩＴとＬＭＢＩＴにそれぞれ連結された同一のペプチドは各分取別に混合比が一定に観察されるため、クロマトグラフィー上で溶出時間が同一であることが分かる。
【０１３２】
（ｂ）質量調節基がエチル（Ｃ２）、プロピル（Ｃ３）、ブチル（Ｃ４）、ペンチル（Ｃ５）、ヘキシル（Ｃ６）、ヘプチル（Ｃ７）またはオクチル（Ｃ８）の場合
−ＭＢＩＴ試薬の検証
製造されたＭＢＩＴ試薬に正常的に合成されたかを検証するために、それぞれのＭＢＩＴ試薬をアンジオテンシンＩＩ（１０４６．５Ｔｈ）に標識して［ＭＡＧ（１）＋Ｈ］＋イオンの質量を検出し（図１７）、タンデム質量分析（図１８）を行った。ＬＭＢＩＴとＨＭＢＩＴでそれぞれ標識されたアンジオテンシンＩＩは同一の質量値で検出された。［ＭＡＧ（１）＋Ｈ］＋イオンの質量値は、質量調節基がそれぞれエチルの場合には１２４７．７Ｔｈ、プロピルの場合には１２６１．７Ｔｈ、ブチルの場合には１２７５．７Ｔｈ、ペンチルの場合には１２８９．７Ｔｈ、ヘキシルの場合には１３０３．７Ｔｈ、ヘプチルの場合には１３１７．７Ｔｈ、オクチルの場合には１３３１．８Ｔｈで分析体がそれぞれ観察された。標識シグニチャーと定量信号質量値は、質量調節基がエチルの場合にはそれぞれ２０２Ｔｈ（ｂ０）、１２８Ｔｈ（ＬｂＳ）、および１３１Ｔｈ（ＨｂＳ）で、質量調節基がプロピルの場合にはそれぞれ２１６Ｔｈ（ｂ０）、１４２Ｔｈ（ＬｂＳ）、および１４５Ｔｈ（ＨｂＳ）で、質量調節基がブチルの場合にはそれぞれ２３０Ｔｈ（ｂ０）、１５６Ｔｈ（ＬｂＳ）、および１５９Ｔｈ（ＨｂＳ）で、質量調節基がペンチルの場合にはそれぞれ２４４Ｔｈ（ｂ０）、１７０Ｔｈ（ＬｂＳ）、および１７３Ｔｈ（ＨｂＳ）で、質量調節基がヘキシルの場合にはそれぞれ２５８Ｔｈ（ｂ０）、１８４Ｔｈ（ＬｂＳ）、および１８７Ｔｈ（ＨｂＳ）で、質量調節基がヘプチルの場合にはそれぞれ２７２Ｔｈ（ｂ０）、１９８Ｔｈ（ＬｂＳ）、および２０１Ｔｈ（ＨｂＳ）で、質量調節基がオクチルの場合にはそれぞれ２８６Ｔｈ（ｂ０）、２１２Ｔｈ（ＬｂＳ）、および２１５Ｔｈ（ＨｂＳ）で観測された。前記結果より、本発明で製造されたエチル（Ｃ２）、プロピル（Ｃ３）、ブチル（Ｃ４）、ペンチル（Ｃ５）、ヘキシル（Ｃ６）、ヘプチル（Ｃ７）またはオクチル（Ｃ８）を質量調節基として用いたＭＢＩＴ試薬が正常的に合成されたことが分かる。
【０１３３】
−ＭＢＩＴ連結された標準ペプチドのタンデム質量分析
製造されたＭＢＩＴ試薬とペプチドとの反応性を確認するために、それぞれのＭＢＩＴ試薬をアンジオテンシンＩＩ（１０４６．５Ｔｈ）で反応させて質量分析した。図１７は互いに異なる質量調節基ＲＴを有する７種のＭＢＩＴ試薬対それぞれをモデルペプチドとしてのアンジオテンシンＩＩと反応させてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析した結果である。ＭＢＩＴ試薬において、質量調節基が（ａ）エチル、（ｂ）プロピル、（ｃ）ブチル、（ｄ）ペンチル、（ｅ）ヘキシル、（ｆ）ヘプチル、および（ｇ）オクチルの場合をそれぞれ示した。図１７から分かるように、質量調節基がエチルの場合には１２４７．７Ｔｈ、質量調節基がプロピルの場合には１２６１．７Ｔｈ、質量調節基がブチルの場合には１２７５．７Ｔｈ、質量調節基がペンチルの場合には１２８９．７Ｔｈ、質量調節基がヘキシルの場合には１３０３．７Ｔｈ、質量調節基がヘプチルの場合には１３１７．７Ｔｈ、質量調節基がオクチルの場合には１３３１．８Ｔｈでそれぞれ分析体が観測された。また、各分析体に対してタンデム質量分析によって標識シグニチャーおよび定量信号の質量値を確認した。その結果より、反応の行われていないペプチドまたはＭＢＩＴが２つ以上付いているペプチドなしで、アンジオテンシンＩＩに一つのＭＢＩＴが付いている反応結果物のみが存在するので、反応がよく行われたことが分かる。
【０１３４】
また、該当ＭＢＩＴ試薬対が与える定量信号質量を確認するために、７種のＭＢＩＴ試薬でそれぞれ反応が行われたアンジオテンシンＩＩイオンをＭＡＬＤＩタンデム質量分析した。図１８は各ＭＢＩＴ試薬対に対してＨＭＢＩＴが連結されたペプチドとＬＭＢＩＴが連結されたペプチドを１：１の混合比で混ぜてタンデム質量分析した結果を示す。図１８の（ａ）〜（ｇ）は、それぞれエチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、およびオクチルの質量調節基 を有する、ＭＢＩＴに連結されたアンジオテンシンＩＩのＣＩＤスペクトルである。その結果、図３の（ｂ）の予想値のように、標識シグニチャーと定量信号質量値は、質量調節基がエチルの場合にはそれぞれ２０２Ｔｈ（ｂ０）１２８Ｔｈ（ＬｂＳ）、および１３１Ｔｈ（ＨｂＳ）で、質量調節基がプロピルの場合にはそれぞれ２１６Ｔｈ（ｂ０）、１４２Ｔｈ（ＬｂＳ）、および１４５Ｔｈ（ＨｂＳ）で、質量調節基がブチルの場合にはそれぞれ２３０Ｔｈ（ｂ０）、１５６Ｔｈ（ＬｂＳ）、および１５９Ｔｈ（ＨｂＳ）で、質量調節基がペンチルの場合にはそれぞれ２４４Ｔｈ（ｂ０）、１７０Ｔｈ（ＬｂＳ）、および１７３Ｔｈ（ＨｂＳ）で、質量調節基がヘキシルの場合にはそれぞれ２５８Ｔｈ（ｂ０）、１８４Ｔｈ（ＬｂＳ）、および１８７Ｔｈ（ＨｂＳ）で、質量調節基がヘプチルの場合にはそれぞれ２７２Ｔｈ（ｂ０）、１９８Ｔｈ（ＬｂＳ）、および２０１Ｔｈ（ＨｂＳ）で、質量調節基がオクチルの場合にはそれぞれ２８６Ｔｈ（ｂ０）、２１２Ｔｈ（ＬｂＳ）、および２１５Ｔｈ（ＨｂＳ）で観測された。Ｎ末端の１次アミンにＭＢＩＴ試薬が連結されるため、Ｃ末端を含んでいる断片としてのｙタイプイオンは、ＭＢＩＴ試薬の種類を問わずに同一の質量対電荷比の値をもって検出された。また、全ての場合に大抵ＣＩＤスペクトルにおける断片イオンの分布が類似であった。これは各質量調節基の長さ差が断片イオンの分布に影響を及ぼさないことを示唆する。このような結果より、ＭＢＩＴ試薬が正しく合成されたこと、およびモデルペプチドとの反応が完璧に行われたことを確認することができる。
【０１３５】
図１９はＭＢＩＴ試薬の種類による各定量信号の強さを全体断片の強さの総合に対する比率で計算して示す。ＸｂＳの相対的大きさは、質量調節基がプロピル乃至オクチルの場合には３．８％程度と均一であり、質量調節基がメチルとエチルの場合にはそれぞれ１．９％、２．７％と他のＭＢＩＴに比べて小さかった。ＸａＳイオンの強さは質量調節基の長さが長いほど強く現れる。
【０１３６】
図２０はＬＭＢＩＴが連結されたアンジオテンシンＩＩとＨＭＢＩＴが連結されたアンジオテンシンＩＩを上述した多様な混合比で混ぜて定量分析し、各混合比と測定によって得られた比との線形性を示す図である。
【０１３７】
それぞれエチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチルおよびオクチルの質量調節基を有するＭＢＩＴ定量信号ＸａＳ（白色円）とＸｂＳ（黒色円）を用いた定量分析結果は図２０の（ａ）〜（ｇ）に示した。点線はＸａＳを用いた実験結果の趨勢線である。実線は ＸｂＳを用いた実験結果の趨勢線である。本発明に使用された全てのＭＢＩＴが、アンジオテンシンＩＩの定量分析において、混合比とよく一致する測定比を示していることが分かった。ＸａＳを用いた定量分析においても、ＸｂＳと同じ程度の線形性を示す。これはＸｂＳだけでなくＸａＳも定量に利用可能であることを示す。
【０１３８】
図２１はＭＢＩＴで標識された分析体の定量分析測定限界を確認した結果である。ＬＭＢＩＴとＨＭＢＩＴでそれぞれ標識されたアンジオテンシンＩＩを２：１の比率で混合した後、濃度を２倍ずつ持続的に薄めた試料をタンデム質量分析した結果のうち、定量信号質量（ ＸｂＳ）が表示される領域を拡大した図である。質量調節基が（ａ）エチル、（ｂ）ブチル、（ｃ）ペンチル、（ｄ）ヘキシル、（ｅ）ヘプチル、および（ｆ）オクチルの場合を示した。一つのＭＡＬＤＩスポットに２５０ｆｍｏｌの試料が塗布された場合から濃度を２倍ずつ持続的に薄め、現れる定量信号の信号対雑音比を観察した。全ての場合に約５ｆｍｏｌ程度の試料を測定することができることを確認した。これは本発明に使用したＭＡＬＤＩ質量分析機器の測定限界に該当する値であって、さらによい装備を使用する場合には、ＭＢＩＴ試薬の測定限界はさらに低くなるだろうと期待される。
【０１３９】
図２２は４つの相異なる成長条件で得られたＨＡ−Ｈｓｃ８２タンパク質の量と定量分析のためにそれぞれの試料に使用したＭＢＩＴ試薬を示す図である。ＨＡ−Ｈｓｃ８２タンパク質を発現させた条件を図２２の（ａ）に示した。ｎｏｒｍ３０はＨｓｐ８２とＨｓｃ８２タンパク質の両方ともを持っている酵母を３０℃で育てた場合であり、ｎｏｒｍ３９はＨｓｐ８２とＨｓｃ８２タンパク質の両方ともを持っている酵母を３９℃で育てた場合であり、ｄｅｌ３０はＨｓｐ８２タンパク質のみが除去された酵母を３０℃で育てた場合であり、ｄｅｌ３９はＨｓｐ８２タンパク質のみが除去された酵母を３９℃で育てた場合である。これらの条件下で生成されたＨＡ−Ｈｓｃ８２タンパク質を酵母から抽出および精製して電気泳動した後、Ｓｙｐｒｏ Ｒｕｂｙ ｓｔａｉｎで染色した結果を図２２の（ｂ）に示した。ゲルイミジ化システムでタンパク質の量を測定した結果、ｎｏｒｍ３０は３．４９μｇ、ｎｏｒｍ３９は５．７４μｇ、ｄｅｌ３０は２．９３μｇ、ｄｅｌ３９は４．９０μｇであった。４つの条件のＨＡ−Ｈｓｃ８２タンパク質のゲルバンドを切り出してトリプシンで酵素分解した後、ＭＢＩＴ試薬に反応させたが、各タンパク質グループに反応したＭＢＩＴ試薬を図２２の（ｃ）に示した。この際、ｎｏｒｍ３９とＬＸ６−Ａｌａを、ｄｅｌ３０とＬＸ７−Ａｌａを、ｄｅｌ３９とＬＸ８−Ａｌａを、ｎｏｒｍ３０とＨＸ６−Ａｌａ、ＨＸ７−Ａｌａおよび ＨＸ８−Ａｌａをそれぞれ反応させた（ＸｎはＣｎの質量調節基を有するＮアシル化アミノ酸またはＮ−アシル−Ａｌａアミノ酸を意味する。）。それぞれのＬＭＢＩＴとＨＭＢＩＴを１：１で混ぜて定量分析したときに予想される比率は、質量調節基がヘキシルの場合には１．６４であり、ヘプチルの場合には０．８４であり、オクチルの場合には１．４０である（ｎｏｒｍ３０：ｎｏｒｍ３９：ｄｅｌ３０：ｄｅｌ３９＝１：１．６４：０．８４：１．４０）。
【０１４０】
図２３は図２２（ｃ）の６種の分析体を同量混合し、ＺｉｐＴｉＰで精製した後、質量分析した結果を示す図である。各分析体には、ヘキシル（三角形）、ヘプチル（四角形）、およびオクチル（円形）の質量調節基を有するＭＢＩＴ試薬が付いている。質量スペクトル上で、同一の分析体はそれぞれに標識されたＭＢＩＴの質量差異（１４Ｄａ）だけずつ分離されて現れる。観測されたペプチドのうち、５つのペプチドがタンデム質量分析に使用された（ＶＬＥＩＲ、ＥＩＦＬＲ、ＬＬＤＡＰＡＡＩＲ、ＱＬＥＴＥＰＤＬＦＩＲ、ＧＶＶＤＳＥＤＬＰＬＮＬＳＲ）。
【０１４１】
図２４はゲルイミジ化システムで定量した結果と、ＭＢＩＴ対で標識された分析体をＭＡＬＤＩタンデム質量分析で定量した結果とを比較して示す図である。ヘキシルの質量調節基を有するＭＢＩＴから得た結果（ｎｏｒｍ３９／ｎｏｒｍ３０）の平均は１．６５であってゲルイミジ化システムで定量した結果に比べて０．８％大きく観測され、ヘプチルの質量調節基を有するＭＢＩＴから得た結果（ｄｅｌ３９／ｎｏｒｍ３０）は０．８５であって１．１％の差異を示し、 オクチルの質量調節基を有するＭＢＩＴから得た結果（ｄｅｌ３９／ｎｏｒｍ３０）は１．４６であって４．０％の差異を示した。ゲルイミジ化システムで定量した結果と類似している結果を示すことが分かる。この結果より、３対のＭＢＩＴ試薬を用いて４つの成長条件で得られたＨＳｃ８２タンパク質の相対的な量を同時に確認することができる（ｎｏｒｍ３０：ｎｏｒｍ３９：ｄｅｌ３０：ｄｅｌ３９＝１：１．６５：０．８５：１．４６）。
【０１４２】
図２５はヘキシル、ヘプチルおよびオクチルの質量調節基を有するＭＢＩＴ対で標識された５種の分析体のＭＡＬＤＩタンデム質量分析結果からデノボ配列分析(de novo sequencing)した結果を示す。アミノ酸コードに引かれた下線はそのアミノ酸の配列分析が正確に行われたことを意味する。アミノ酸コードの後ろに続く星印はそのアミノ酸にＭＢＩＴが標識されていることを示す。ロイシンとイソロイシンが同一の元素構成を持つため、全てロイシンのみで表記した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式１で表される可変質量ラベリング剤：
［化学式１］
【化１】
ここで、ＲＳおよびＲＢはそれぞれ直鎖または分枝鎖のＣ1〜Ｃ１８アルキルであり、ＲＳおよびＲＢの少なくとも一つは一つ以上の重水素を含み、
ＲＴは天然または人工アミノ酸残基の側鎖であり、
リンカーはアミンの求核性攻撃に離脱基となる活性エステルまたはヒドロキシ基である。
【請求項２】
前記ＲＳおよびＲＢはそれぞれメチルであり、ＲＳおよびＲＢの少なくとも一つは一つ以上の重水素を含むことを特徴とする、請求項１に記載の可変質量ラベリング剤。
【請求項３】
前記ＲＳおよびＲＢはそれぞれＣＨ３およびＣＤ３であり、或いはそれぞれＣＤ３およびＣＨ３であることを特徴とする、請求項２に記載の可変質量ラベリング剤。
【請求項４】
前記ＲＴはアラニン（Ａｌａ）、セリン（Ｓｒ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、バリン（Ｖａｌ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、アルギニン（Ａｒｇ）、またはチロシン（Ｔｙｒ）の側鎖であることを特徴とする、請求項１に記載の可変質量ラベリング剤。
【請求項５】
前記ＲＴは直鎖または分枝鎖のＣ２〜Ｃ１８アルキルであることを特徴とする、請求項１に記載の可変質量ラベリング剤。
【請求項６】
前記ＲＴは直鎖または分枝鎖のエチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチルまたはオクチルであることを特徴とする、請求項５に記載の可変質量ラベリング剤。
【請求項７】
前記リンカーは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル基、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル基、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシル基、ペンタハロベンジル基、および４−ニトロフェニル基よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の可変質量ラベリング剤。
【請求項８】
請求項１の化学式１で表される可変質量ラベリング剤を２種以上含む、可変質量ラベリング剤セット。
【請求項９】
前記２種以上の可変質量ラベリング剤はそれぞれのＲＳとＲＢに含まれた重水素数が相異し、
前記２種以上の可変質量ラベリング剤は互いに重水素の数が同一であることを特徴とする、請求項８記載のの可変質量ラベリング剤セット。
【請求項１０】
請求項８の可変質量ラベリング剤セットを２種以上含む、多重可変質量ラベリング剤セット。
【請求項１１】
請求項１〜１０の可変質量ラベリング剤で標識された分析体を含む混合物、その塩またはその水和物。
【請求項１２】
前記分析体はタンパク質、炭水化物または脂質であることを特徴とする、請求項１１に記載の混合物、その塩またはその水和物。
【請求項１３】
前記分析体はペプチドであることを特徴とする、請求項１１に記載の混合物、その塩またはその水和物。
【請求項１４】
前記分析体は核酸または核酸誘導体であることを特徴とする、請求項１１に記載の混合物、その塩またはその水和物。
【請求項１５】
前記分析体はステロイドであることを特徴とする、請求項１１に記載の混合物、その塩またはその水和物。
【請求項１６】
請求項８または９の可変質量ラベリング剤セットを分析体に結合させる段階と、
前記可変質量ラベリング剤セットが結合している分析体を分解して前記分析体を定量する段階とを含むことを特徴とする、ペプチド配列およびタンパク質定量同時分析方法。
【請求項１７】
前記定量のための分解法はタンデム質量分析法であることを特徴とする、請求項１６に記載のペプチド配列およびタンパク質定量同時分析方法。
【請求項１８】
前記タンデム質量分析法は、ラベリング剤のＲＴに応じて、定量信号質量を与える定量信号の位置が変わることを特徴とする、請求項１７に記載のペプチド配列およびタンパク質定量同時分析方法。
【請求項１９】
前記定量信号質量を与える定量信号はｂＳイオン、ａＳイオン、およびＲＢイオンよりなる群から選択される１種以上の内部断片イオンによることを特徴とする、請求項１８に記載のペプチド配列およびタンパク質定量同時分析方法。
【請求項２０】
１）前記ＲＴがメチル基の場合、定量信号質量（ｂＳ）が１１４と１１７Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ａＳ）が８６と８９Ｔｈで現れ、標識シグニチャー（ｂ０）が１８８Ｔｈで現れ、
２）前記ＲＴがセリン側鎖の場合、定量信号質量（ｂＳ）が１３０と１３３Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ａＳ）が１０２と１０５Ｔｈで現れ、標識シグニチャー（ｂ０）が２０４Ｔｈで現れ、
３）前記ＲＴがバリン側鎖の場合、定量信号質量（ｂＳ）が１４２と１４５Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ａＳ）が１１４と１１７Ｔｈで現れ、標識シグニチャー（ｂ０）が２１６Ｔｈで現れ、
４）前記ＲＴがグルタミン側鎖の場合、定量信号質量（ｂＳ）が１７１と１７４Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ａＳ）が１４３と１４６Ｔｈで現れ、標識シグニチャー（ｂ０）が２４５Ｔｈで現れ、
５）前記ＲＴがヒスチジン側鎖の場合、定量信号質量（ｂＳ）が１８０と１８３Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ａＳ）が１５２と１５５Ｔｈで現れ、標識シグニチャー（ｂ０）が２５４Ｔｈで現れ、
６）前記ＲＴがフェニルアラニン側鎖の場合、定量信号質量（ｂＳ）が１９０と１９３Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ａＳ）が１６２と１６５Ｔｈで現れ、標識シグニチャー（ｂ０）が２６４Ｔｈで現れ、
７）前記ＲＴがアルギニン側鎖の場合、定量信号質量（ｂＳ）が１９９と２０２Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ｂＳ−ＮＨ３）が１８２と１８５Ｔｈで現れ、標識シグニチャー（ｂ０）が２７３Ｔｈで現れ、または
８）前記ＲＴがチロシン側鎖の場合、定量信号質量（ｂＳ）が２０６と２０９Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ａＳ）が１７８と１８１Ｔｈで現れ、標識シグニチャー（ｂ０）が２８０Ｔｈで現れることを特徴とする、請求項１６に記載のペプチド配列およびタンパク質定量同時分析方法。
【請求項２１】
１）前記ＲＴがエチル基の場合、定量信号質量（ｂＳ）が１２８と１３１Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ａＳ）が１００と１０３Ｔｈで現れ、標識シグニチャーが２０２Ｔｈで現れ、
２）前記ＲＴが直鎖または分枝鎖プロピル基の場合、定量信号質量（ｂＳ）が１４２と１４５Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ａＳ）が１１４と１１７Ｔｈで現れ、標識シグニチャー（ｂ０）が２１６Ｔｈで現れ、
３）前記ＲＴが直鎖または分枝鎖ブチル基の場合、定量信号質量（ｂＳ）が１５６と１５９Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ａＳ）が１２８と１３１Ｔｈで現れ、標識シグニチャー（ｂ０）が２３０Ｔｈで現れ、
４）前記ＲＴが直鎖または分枝鎖ペンチル基の場合、定量信号質量（ｂＳ）が１７０と１７３Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ａＳ）が１４２と１４５Ｔｈで現れ、標識シグニチャー（ｂ０）が２４４Ｔｈで現れ、
５）前記ＲＴが直鎖または分枝鎖ヘキシル基の場合、定量信号質量（ｂＳ）が１８４と１８７Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ａＳ）が１５６と１５９Ｔｈで現れ、標識シグニチャー（ｂ０）が２５８Ｔｈで現れ、
６）前記質量調節基が直鎖または分枝鎖ヘプチル基の場合、定量信号質量（ｂＳ）が１９８と２０１Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ａＳ）が１７０と１７３Ｔｈで現れ、標識シグニチャー（ｂ０）が２７２Ｔｈで現れ、または
７）前記質量調節基が直鎖または分枝鎖オクチル基の場合、定量信号質量（ｂＳ）が２１２と２１５Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ａＳ）が１８４と１８７Ｔｈで現れ、標識シグニチャー（ｂ０）が２８６Ｔｈで現れることを特徴とする、請求項１６に記載のペプチド配列およびタンパク質定量同時分析方法。
【請求項２２】
請求項１０による多重可変質量ラベリング剤セットを分析体に結合させ、分解して該当分析体を定量する、ペプチド配列およびタンパク質定量同時分析方法。
【請求項２３】
請求項１０による多重可変質量ラベリング剤セットを分析体に結合させて定量する過程で、１種の試料と残りのそれぞれ異なる試料との比率を請求項２０または２１に該当する方法でそれぞれ別々に定量する、多重定量分析方法。
【請求項１】
下記化学式１で表される可変質量ラベリング剤：
［化学式１］
【化１】
ここで、ＲＳおよびＲＢはそれぞれ直鎖または分枝鎖のＣ1〜Ｃ１８アルキルであり、ＲＳおよびＲＢの少なくとも一つは一つ以上の重水素を含み、
ＲＴは天然または人工アミノ酸残基の側鎖であり、
リンカーはアミンの求核性攻撃に離脱基となる活性エステルまたはヒドロキシ基である。
【請求項２】
前記ＲＳおよびＲＢはそれぞれメチルであり、ＲＳおよびＲＢの少なくとも一つは一つ以上の重水素を含むことを特徴とする、請求項１に記載の可変質量ラベリング剤。
【請求項３】
前記ＲＳおよびＲＢはそれぞれＣＨ３およびＣＤ３であり、或いはそれぞれＣＤ３およびＣＨ３であることを特徴とする、請求項２に記載の可変質量ラベリング剤。
【請求項４】
前記ＲＴはアラニン（Ａｌａ）、セリン（Ｓｒ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、バリン（Ｖａｌ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、アルギニン（Ａｒｇ）、またはチロシン（Ｔｙｒ）の側鎖であることを特徴とする、請求項１に記載の可変質量ラベリング剤。
【請求項５】
前記ＲＴは直鎖または分枝鎖のＣ２〜Ｃ１８アルキルであることを特徴とする、請求項１に記載の可変質量ラベリング剤。
【請求項６】
前記ＲＴは直鎖または分枝鎖のエチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチルまたはオクチルであることを特徴とする、請求項５に記載の可変質量ラベリング剤。
【請求項７】
前記リンカーは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル基、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル基、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシル基、ペンタハロベンジル基、および４−ニトロフェニル基よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の可変質量ラベリング剤。
【請求項８】
請求項１の化学式１で表される可変質量ラベリング剤を２種以上含む、可変質量ラベリング剤セット。
【請求項９】
前記２種以上の可変質量ラベリング剤はそれぞれのＲＳとＲＢに含まれた重水素数が相異し、
前記２種以上の可変質量ラベリング剤は互いに重水素の数が同一であることを特徴とする、請求項８記載のの可変質量ラベリング剤セット。
【請求項１０】
請求項８の可変質量ラベリング剤セットを２種以上含む、多重可変質量ラベリング剤セット。
【請求項１１】
請求項１〜１０の可変質量ラベリング剤で標識された分析体を含む混合物、その塩またはその水和物。
【請求項１２】
前記分析体はタンパク質、炭水化物または脂質であることを特徴とする、請求項１１に記載の混合物、その塩またはその水和物。
【請求項１３】
前記分析体はペプチドであることを特徴とする、請求項１１に記載の混合物、その塩またはその水和物。
【請求項１４】
前記分析体は核酸または核酸誘導体であることを特徴とする、請求項１１に記載の混合物、その塩またはその水和物。
【請求項１５】
前記分析体はステロイドであることを特徴とする、請求項１１に記載の混合物、その塩またはその水和物。
【請求項１６】
請求項８または９の可変質量ラベリング剤セットを分析体に結合させる段階と、
前記可変質量ラベリング剤セットが結合している分析体を分解して前記分析体を定量する段階とを含むことを特徴とする、ペプチド配列およびタンパク質定量同時分析方法。
【請求項１７】
前記定量のための分解法はタンデム質量分析法であることを特徴とする、請求項１６に記載のペプチド配列およびタンパク質定量同時分析方法。
【請求項１８】
前記タンデム質量分析法は、ラベリング剤のＲＴに応じて、定量信号質量を与える定量信号の位置が変わることを特徴とする、請求項１７に記載のペプチド配列およびタンパク質定量同時分析方法。
【請求項１９】
前記定量信号質量を与える定量信号はｂＳイオン、ａＳイオン、およびＲＢイオンよりなる群から選択される１種以上の内部断片イオンによることを特徴とする、請求項１８に記載のペプチド配列およびタンパク質定量同時分析方法。
【請求項２０】
１）前記ＲＴがメチル基の場合、定量信号質量（ｂＳ）が１１４と１１７Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ａＳ）が８６と８９Ｔｈで現れ、標識シグニチャー（ｂ０）が１８８Ｔｈで現れ、
２）前記ＲＴがセリン側鎖の場合、定量信号質量（ｂＳ）が１３０と１３３Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ａＳ）が１０２と１０５Ｔｈで現れ、標識シグニチャー（ｂ０）が２０４Ｔｈで現れ、
３）前記ＲＴがバリン側鎖の場合、定量信号質量（ｂＳ）が１４２と１４５Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ａＳ）が１１４と１１７Ｔｈで現れ、標識シグニチャー（ｂ０）が２１６Ｔｈで現れ、
４）前記ＲＴがグルタミン側鎖の場合、定量信号質量（ｂＳ）が１７１と１７４Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ａＳ）が１４３と１４６Ｔｈで現れ、標識シグニチャー（ｂ０）が２４５Ｔｈで現れ、
５）前記ＲＴがヒスチジン側鎖の場合、定量信号質量（ｂＳ）が１８０と１８３Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ａＳ）が１５２と１５５Ｔｈで現れ、標識シグニチャー（ｂ０）が２５４Ｔｈで現れ、
６）前記ＲＴがフェニルアラニン側鎖の場合、定量信号質量（ｂＳ）が１９０と１９３Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ａＳ）が１６２と１６５Ｔｈで現れ、標識シグニチャー（ｂ０）が２６４Ｔｈで現れ、
７）前記ＲＴがアルギニン側鎖の場合、定量信号質量（ｂＳ）が１９９と２０２Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ｂＳ−ＮＨ３）が１８２と１８５Ｔｈで現れ、標識シグニチャー（ｂ０）が２７３Ｔｈで現れ、または
８）前記ＲＴがチロシン側鎖の場合、定量信号質量（ｂＳ）が２０６と２０９Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ａＳ）が１７８と１８１Ｔｈで現れ、標識シグニチャー（ｂ０）が２８０Ｔｈで現れることを特徴とする、請求項１６に記載のペプチド配列およびタンパク質定量同時分析方法。
【請求項２１】
１）前記ＲＴがエチル基の場合、定量信号質量（ｂＳ）が１２８と１３１Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ａＳ）が１００と１０３Ｔｈで現れ、標識シグニチャーが２０２Ｔｈで現れ、
２）前記ＲＴが直鎖または分枝鎖プロピル基の場合、定量信号質量（ｂＳ）が１４２と１４５Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ａＳ）が１１４と１１７Ｔｈで現れ、標識シグニチャー（ｂ０）が２１６Ｔｈで現れ、
３）前記ＲＴが直鎖または分枝鎖ブチル基の場合、定量信号質量（ｂＳ）が１５６と１５９Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ａＳ）が１２８と１３１Ｔｈで現れ、標識シグニチャー（ｂ０）が２３０Ｔｈで現れ、
４）前記ＲＴが直鎖または分枝鎖ペンチル基の場合、定量信号質量（ｂＳ）が１７０と１７３Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ａＳ）が１４２と１４５Ｔｈで現れ、標識シグニチャー（ｂ０）が２４４Ｔｈで現れ、
５）前記ＲＴが直鎖または分枝鎖ヘキシル基の場合、定量信号質量（ｂＳ）が１８４と１８７Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ａＳ）が１５６と１５９Ｔｈで現れ、標識シグニチャー（ｂ０）が２５８Ｔｈで現れ、
６）前記質量調節基が直鎖または分枝鎖ヘプチル基の場合、定量信号質量（ｂＳ）が１９８と２０１Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ａＳ）が１７０と１７３Ｔｈで現れ、標識シグニチャー（ｂ０）が２７２Ｔｈで現れ、または
７）前記質量調節基が直鎖または分枝鎖オクチル基の場合、定量信号質量（ｂＳ）が２１２と２１５Ｔｈで現れ、別の定量信号質量（ａＳ）が１８４と１８７Ｔｈで現れ、標識シグニチャー（ｂ０）が２８６Ｔｈで現れることを特徴とする、請求項１６に記載のペプチド配列およびタンパク質定量同時分析方法。
【請求項２２】
請求項１０による多重可変質量ラベリング剤セットを分析体に結合させ、分解して該当分析体を定量する、ペプチド配列およびタンパク質定量同時分析方法。
【請求項２３】
請求項１０による多重可変質量ラベリング剤セットを分析体に結合させて定量する過程で、１種の試料と残りのそれぞれ異なる試料との比率を請求項２０または２１に該当する方法でそれぞれ別々に定量する、多重定量分析方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５（ａ）】
【図５（ｂ）】
【図５（ｃ）】
【図６】
【図７】
【図８（ａ）】
【図８（ｂ）】
【図８（ｃ）】
【図８（ｄ）】
【図８（ｅ）】
【図８（ｆ）】
【図８（ｇ）】
【図８（ｈ）】
【図９】
【図１０】
【図１１（ａ）】
【図１１（ｂ）】
【図１２】
【図１３（ａ）】
【図１３（ｂ）】
【図１３（ｃ）】
【図１３（ｄ）】
【図１３（ｅ）】
【図１３（ｆ）】
【図１３（ｇ）】
【図１３（ｈ）】
【図１４】
【図１５】
【図１６（ａ）】
【図１６（ｂ）】
【図１６（ｃ）】
【図１６（ｄ）】
【図１６（ｅ）】
【図１６（ｆ）】
【図１６（ｇ）】
【図１６（ｈ）】
【図１６（ｉ）】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５（ａ）】
【図５（ｂ）】
【図５（ｃ）】
【図６】
【図７】
【図８（ａ）】
【図８（ｂ）】
【図８（ｃ）】
【図８（ｄ）】
【図８（ｅ）】
【図８（ｆ）】
【図８（ｇ）】
【図８（ｈ）】
【図９】
【図１０】
【図１１（ａ）】
【図１１（ｂ）】
【図１２】
【図１３（ａ）】
【図１３（ｂ）】
【図１３（ｃ）】
【図１３（ｄ）】
【図１３（ｅ）】
【図１３（ｆ）】
【図１３（ｇ）】
【図１３（ｈ）】
【図１４】
【図１５】
【図１６（ａ）】
【図１６（ｂ）】
【図１６（ｃ）】
【図１６（ｄ）】
【図１６（ｅ）】
【図１６（ｆ）】
【図１６（ｇ）】
【図１６（ｈ）】
【図１６（ｉ）】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【公表番号】特表２０１０−５３４８５６（Ｐ２０１０−５３４８５６Ａ）
【公表日】平成２２年１１月１１日（２０１０．１１．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２０９５３（Ｐ２０１０−５２０９５３）
【出願日】平成２１年７月１０日（２００９．７．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００９／００３８０８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／００８１５９
【国際公開日】平成２２年１月２１日（２０１０．１．２１）
【出願人】（５０９３２７５４１）ポステク アカデミー−インダストリー ファウンデイション (3)
【氏名又は名称原語表記】ＰＯＳＴＥＣＨ ＡＣＡＤＥＭＹ−ＩＮＤＵＳＴＲＹ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
【住所又は居所原語表記】Ｐｏｈａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎ ３１，Ｈｙｏｊａ−ｄｏｎｇ，Ｎａｍ−ｇｕ，Ｐｏｈａｎｇ−ｓｉ，Ｇｙｅｏｎｇｓａｎｇｂｕｋ−ｄｏ ７９０−７８４，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１１月１１日（２０１０．１１．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月１０日（２００９．７．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００９／００３８０８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／００８１５９
【国際公開日】平成２２年１月２１日（２０１０．１．２１）
【出願人】（５０９３２７５４１）ポステク アカデミー−インダストリー ファウンデイション (3)
【氏名又は名称原語表記】ＰＯＳＴＥＣＨ ＡＣＡＤＥＭＹ−ＩＮＤＵＳＴＲＹ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
【住所又は居所原語表記】Ｐｏｈａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎ ３１，Ｈｙｏｊａ−ｄｏｎｇ，Ｎａｍ−ｇｕ，Ｐｏｈａｎｇ−ｓｉ，Ｇｙｅｏｎｇｓａｎｇｂｕｋ−ｄｏ ７９０−７８４，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
【Ｆターム（参考）】
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