質量分析によるタンパク質の新規な定量方法
【課題】質量分析によるタンパク質の新規な定量方法の提供。
【解決手段】本発明は、サンプル中の標的タンパク質を定量的に検出するための方法であって、二次フラグメントイオンを検出し、一連の定量的測定値を得、少なくとも１つの上記定量的測定値を、生成したプロテオタイピックペプチドの量及び上記サンプル中に存在する上記標的タンパク質の量と相関付けを行い、ここで、選択された質量（ｍ／ｚ）２の一次フラグメントイオンは、プロリン及び／又はヒスチジンを１番目に有する二価ペプチドであることを特徴とする、方法に関する。
【解決手段】本発明は、サンプル中の標的タンパク質を定量的に検出するための方法であって、二次フラグメントイオンを検出し、一連の定量的測定値を得、少なくとも１つの上記定量的測定値を、生成したプロテオタイピックペプチドの量及び上記サンプル中に存在する上記標的タンパク質の量と相関付けを行い、ここで、選択された質量（ｍ／ｚ）２の一次フラグメントイオンは、プロリン及び／又はヒスチジンを１番目に有する二価ペプチドであることを特徴とする、方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の定量分析の技術分野に関する。とりわけ、本発明は質量分析によるタンパク質の新規な定量分析法に関する。
【背景技術】
【０００２】
患者から採取した血液サンプル（血清、血漿）等の複雑流体中のタンパク質の分析が、診断において極めて重要であるため、タンパク質を定量分析するための技術が多く開発されている。現在、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫吸着法）が最も広く用いられており、種々の既知のＥＬＩＳＡ法の中でも、サンドイッチ反応が最も広く用いられている。これは、標的タンパク質に対する２種の抗体を必要とし、そのうち１種を酵素と結合させる。さらに近年、ＳＲＭ（選択反応モニタリング）や、いくつかのＳＲＭ分析を同時に行う場合にはＭＲＭ（多重反応モニタリング）といった質量分析技術によって、複雑流体中でタンパク質をそのプロテオタイピック（ｐｒｏｔｅｏｔｙｐｉｃ）ペプチドから定量分析することが、出願人他によって実現された（非特許文献１、２、３）。上記質量分析による分析の前工程において、分析対象のタンパク質をペプチドに断片化するために、酵素によって消化する。そして、プロテオタイピックペプチドと呼ばれる、そのタンパク質に固有のペプチドを質量分析によって分析する。
【０００３】
ＥＬＩＳＡ法と比較した場合のＳＲＭ又はＭＲＭによる分析の利点は、分析を実現するための経費及び時間をかなり削減できることであり、特にＥＬＩＳＡ法に必要な抗体を開発する必要がある場合に顕著である。従って、このような質量分析技術は、タンパク質の分析に好適な方法であると思われる。また、上記技術によって、例えば、プロテオーム解析における研究によってマーカー候補と同定された多数のタンパク質の分析という臨床的関心事をより容易に且つより速く実行することができるであろう（非特許文献４）。
【０００４】
ＭＲＭ分析の場合、ＭＲＭモードに特に適した三連四重極型質量分析計では、以下に詳述する原理に基づいて、プロテオタイピックペプチドを定量する。最初に、分析対象のペプチドを含むサンプルをイオン源に導入する。該イオン源では、上記ペプチドが気体状態でイオン化され、本来のペプチドに１つ、２つ又は３つものプロトンが付加し、１価、２価又は３価にもなった「分子」イオンに変換される。例えば、電気スプレー型のイオン源では、上記ペプチドは液体状態から気体状態に変化するのと同時にイオン化される（非特許文献５）。逆相液体クロマトグラフィーによってペプチドが事前に分離されている場合には、この型のイオン源が特に好適である。しかしながら、ペプチドのイオン化率は、種々の含有物の濃度及び性質によって変化し得る。この現象は、当業者には周知のマトリックス効果を反映している。また、ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化法）源では、上記ペプチドを固体状態からイオン化することもできる。
【０００５】
次いで、四重極型分析器（Ｑ１）では、プロテオタイピックペプチドをその質量電荷比（ｍ／ｚ）に基づいてフィルタリングすることができる。目的とするプロテオタイピックペプチドの質量電荷比（該比を（ｍ／ｚ）１とする）を有するペプチドのみが第２の四重極（ｑ２）に送られ、次に行われる断片化のためのプリカーサーイオンとしての役割を果たす。
【０００６】
上記ｑ２分析器は、質量電荷比（ｍ／ｚ）１を有するペプチドを一次フラグメントイオンへと断片化することができる。通常、この断片化は、プリカーサーペプチドと、窒素やアルゴン等の不活性ガスとの衝突によって行われる。
【０００７】
上記一次フラグメントイオンは、特定の質量電荷比（該比を（ｍ／ｚ）２とする）に基づいて一次フラグメントイオンをフィルタリングする第３の四重極（Ｑ３）に送られる。目的とするプロテオタイピックペプチドのフラグメントの特徴である上記質量電荷比（ｍ／ｚ）２を有する一次フラグメントイオンのみが、定量のために検出器に送られる。
【０００８】
この操作モードは、一方ではプリカーサーイオンの選択に、他方では一次フラグメントイオンの選択に関しており、２重の選択性を有している。従って、ＭＲＭモードの質量分析は定量に有利である。
【０００９】
上記一次フラグメントイオンによって誘導され、検出器によって測定される電流の強度は、一次フラグメントイオンの量に比例する。一次フラグメントイオンの量自体は、プリカーサーイオンの量に比例し、プリカーサーイオンの量自体は、分析対象のタンパク質の量に比例する。従って、上記一次フラグメントイオンにより誘導され、測定される電流の量は、分析対象のタンパク質の量に正比例する。しかしながら、上記一次フラグメントイオンにより誘導された電流の量に相当する測定ピークの面積を、対応する一次フラグメントイオンの量、最終的には分析対象のタンパク質の量に相関付けできるようにするためには、較正が必要となる。遷移（トランジション）と呼ばれる（ｍ／ｚ）１及び（ｍ／ｚ）２のペアは、ＭＲＭモード又はＭＳ／ＭＳ（すなわち、ＭＳ２）モードで操作することができる種々の質量分析計のモデルで分析することができる。例として、三連四重極型のモデル（非特許文献２）、又はイオントラップ型のモデル（非特許文献６）、さらには飛行時間型のモデル（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）（非特許文献７）が挙げられる。
【００１０】
タンパク質の分析に利用する遷移は、分析対象のタンパク質に特有のものでなければならず、再現性と信頼性の点で可能な限り感度がよく、可能な限り特異的で、可能な限り頑健性の高い分析となるものでなければならない。このため、それらは十分注意して選択されなければならない。
【００１１】
プロテオタイピックペプチド（ｍ／ｚ）１及び（ｍ／ｚ）２の選択のために開発された上記方法では、該選択は本質的に応答の強度に基づく。詳細は非特許文献８を参照されたい。また、ペプチド分離の精度、分析の前工程、アミノ酸組成、存在し得る他のタンパク質に同一プリカーサーペプチドが含まれないこと、及び、プリカーサーペプチドの電荷状態も上記選択で考慮される因子である。通常、プリカーサーイオンの断片化によって生成した質量は、ＭＲＭモード又はＭＳ／ＭＳ（ＭＳ２）のモードで測定される。そして、最も強いシグナルとなる一次フラグメントイオンが選択される。次に、得られるシグナルを最大限にするために、プリカーサーイオン断片化条件及び分析条件が最適化される。Ｑ１においては、二価イオンを選択するのが好適であり、Ｑ３においては、一価一次フラグメントイオン、好ましくは上記二価プリカーサーイオンよりｍ／ｚ比が高い一価一次フラグメントイオンを選択するのが好適であることが知られている。
【００１２】
当業者であれば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＭＩＤＡＳ及びＭＲＭパイロットソフトウェアや、ＭＲＭａｉｄ（非特許文献９）等の市販のソフトウェアを利用して、考え得るすべて遷移ペアを予想できるであろう。また、当業者であれば、Ｆ．Ｄｅｓｉｅｒｅら（非特許文献１０）によって構築されたＰｅｐｔｉｄｅＡｔｌａｓと呼ばれるデータベースを利用して、科学界によって報告されたペプチドＭＲＭ遷移をすべて集めることができるであろう。このＰｅｐｔｉｄｅＡｔｌａｓデータベースは、インターネット上で無料で入手可能である。
【００１３】
上記（ｍ／ｚ）１及び（ｍ／ｚ）２プロテオタイピックペプチドを選択するための他の方法は、他の研究の際に得られたＭＳ／ＭＳ断片化スペクトルを用いることである。この研究としては、例えば、プロテオーム解析によってバイオマーカーを発見及び同定する段階であってもよい。この方法は、ユーザーの集会においてＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社によって提案された（非特許文献９）。これにより、ＳＩＥＶＥソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて、実験的に同定されたペプチドからの遷移候補のリストを作成することができる。上記（ｍ／ｚ）１及び（ｍ／ｚ）２イオンの選択のためのある基準がＪ．Ｍｅａｄら（非特許文献９）によって詳述されており、以下に詳細に説明する。
・内部切断部位、すなわち、内部リシン又はアルギニンを有するペプチドは、そのリシン又はアルギニンの次にプロリンが続くものでなければ、避けるべきである。
・アスパラギン又はグルタミンを有するペプチドは、脱アミノされることがあるので、避けるべきである。
・Ｎ末端にグルタミン又はグルタミン酸を有するペプチドは、自然に環化することがあるので、避けるべきである。
・メチオニンを有するペプチドは、酸化されることがあるので、避けるべきである。
・システインを有するペプチドは、起こり得る変性、還元、及び、チオール官能基のブロッキングといった工程中に再現不可能に修飾されることがあるので、避けるべきである。
・プロリンを有するペプチドは、通常、ＭＳ／ＭＳにおいて非常に顕著な単一ピークを示す強度の強いフラグメントを生成するので、好ましいと考えられるが、単一の非常に顕著なフラグメントでは、複雑な混合物中で遷移の同定を実行することができない。実際、特有のフラグメントがいくつか同時に存在する場合においてのみ、目的とするプリカーサーイオンが実際に検出されることを確認することができる。
・Ｃ末端の隣（ｎ−１番目）、又は、Ｃ末端から２番目（ｎ−２番目）にプロリンを有するペプチドは、通常、一次ペプチドフラグメントのサイズが十分な特異性を有するには小さすぎると考えられるので、避けるべきである。
・プリカーサーより質量が大きいフラグメントを選択することが、特異性を向上させるために好ましい。このためには、二価プリカーサーイオンを選択する必要があり、プリカーサーより質量が大きく、最も強度の強い一次フラグメントイオン、すなわち、一価一次フラグメントイオンを選択する必要がある。
【００１４】
さらに、最も一般的には、複雑流体（血液、血清、血漿、尿、糞便、唾液等）中に数ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれるタンパク質の分析に適合する感度及び特異性を確保するために、質量分析による定量分析に先立って、消化工程に加えて、該消化工程の前後に他の工程をはさむべきである。例えば：
【００１５】
第一段階：分析対象のタンパク質ではない顕著なタンパク質を除去するためのタンパク質分画、又は、任意の好適な方法（電気泳動、クロマトグラフィー、免疫捕捉（非特許文献１１））によるサンプルの精製。しかしながら、後者の方法は、分析対象のタンパク質に対する特異的な抗体の存在又は調製が必要であり、この抗体を得るためには時間及び費用がかかり得る。更に、後に続ける質量分析による分析の性能レベルが、抗体の質及び特異性にある程度影響を受けることになる。
【００１６】
第二段階：変性、還元、及び、チオール官能基のブロッキング。
【００１７】
第三段階：消化。
【００１８】
第四段階：ペプチド分画。
【００１９】
第二段階によって、消化率を向上させることができ、再現性と信頼性の点から、分析のさらに高い頑健性を確保することができる。高い感度を必要としない場合には、第一段階及び第四段階は任意である（非特許文献２）。一方、高い感度が必要な場合（数ｎｇ／ｍｌ）には、それらは不可欠である。このことは、非特許文献１、１２、１１、１３、及び特許文献１に示されている。実際は、Ｑ１及びＱ３の三連四重極の精度を考えると、多くのペプチド（同重体又は擬似的同重体（ｑｕａｓｉ−ｉｓｏｂａｒｉｃ）ペプチド）が、同一の遷移、又は装置の質量の許容誤差に含まれる遷移を生成し得る（非特許文献１４）。この場合、プロテオタイピックペプチドと、同重体又は擬似的同重体混入物とが同時に投入されると、特異性の欠如のために誤った定量が行われる。質量分析の前工程のクロマトグラフィーによるペプチドの分離では、混入したペプチドの数を減少させることにより、特異性のレベルを補強する（非特許文献１５）。しかしながら、この補強的な分画工程は十分でない場合もあり（非特許文献１２）、従って、タンパク質の定量に用いるいかなる遷移も注意深く確認する必要がある。さらに、消化工程に加えて第一、第二、及び第四段階を含む完全な分析方法は、第一又は第四段階で抗体を使用しなければならない場合は特に、時間及び費用がかかる。
【００２０】
さらに最近では、ＭＲＭ３として知られる技術が、タンパク質を検出するために用いられている。この技術は、一次フラグメントイオンを選択すること、及び、二次フラグメントイオンを生成するために、それをさらに断片化することからなる。そして、この二次フラグメントイオンが検出される。Ｊ．Ｎｉｅｓｓｅｎら（非特許文献１６）は、特に以下の三つ組を利用している：プリカーサー／一次フラグメントイオン／二次フラグメントイオン（ＭＲＭ３遷移と称する）配列番号１：ＶＬＬＱＴＬＲ（二価）／配列番号２：ＬＬＱＴＬＲ（二価）／配列番号３：ＬＱＴＬＲ（一価）。しかしながら、著者らは、特にこのＭＲＭ３遷移を選択する理由について考察しておらず、標的タンパク質を分析することなく、その標的タンパク質の存在を単に示すのみに甘んじている。さらに最近では、Ａ．Ｉｚｒａｅｌ−Ｔｏｍａｓｅｖｉｃら（非特許文献１７）が、ＩＦＮ−αの検出のためにＭＳ３を用いている。ＭＳ３は、分析したプロテオタイピックペプチドの性質を示すためにＭＳ３の全スペクトルを用いるという点でＭＲＭ３と異なる。このために、著者らは、ＩＦＮ−α４の検出のために、配列番号４：ＨＤＦＧＦＰＱＥＥＦＧＮＱＦＱＫ（三価）の分子イオンを、２回目の断片化を受ける一次フラグメントイオンとして配列番号５：ＤＦＧＦＰＱＥＥＦＧＮＱＦＱＫ（二価）のイオンｙ１５２＋を選択しており、また、すべてのＩＦＮ−α４のサブタイプに対しては、配列番号６：ＹＳＰＣＡＷＥＶＶＲ（二価）の分子イオンを、２回目の断片化を受ける一次フラグメントイオンとして配列番号７：ＰＣＡＷＥＶＶＲ（二価）のイオンｙ８２＋を選択している。ＭＲＭ３モード及びＭＳ３モードのいずれでも定量分析を行っておらず、著者らは、ＩＦＮ−αのイオントラップ定量は満足のいくものではないことを強調している。著者らは、ＭＳ３において二次フラグメントイオンのシグナル／ノイズ比が改善されるとはしても、カウント数がＦＴ−ＩＣＲよりも１０００倍以上少ないと記載しており、ＳＲＭ（ＭＳ２）法及びＡＭＴ（精密質量−保持時間（Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｍａｓｓ ａｎｄ Ｔｉｍｅ））（断片化を伴わないＭＳ）法が好ましいと結論づけている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２１】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００４／００７２２５１号明細書
【非特許文献】
【００２２】
【非特許文献１】Ｔ．Ｆｏｒｔｉｎら，ＭＣＰ，２００８，Ｅ−ｐｕｂ
【非特許文献２】Ｌ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ＆Ｃ．Ｈｕｎｔｅｒ，ＭＣＰ，２００６，５７３−５８８
【非特許文献３】Ｈ．Ｚｈａｎｇら，ＭＣＰ，２００７，６４−７１
【非特許文献４】Ｓ．Ｃａｒｒ及びＬ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｃｌｉｎ．Ｃｅｍ．２００８，１７４９−１７５２
【非特許文献５】Ｇａｓｋｅｌｌ，Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｓｅ，Ｊ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．（１９９７），３２，６７７−６８８
【非特許文献６】Ｂ．Ｈａｎ及びＲ．Ｈｉｇｇｓ，Ｂｒｉｅｆ Ｆｕｎｃｔ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ．２００８年９月；７（５）：３４０−５４
【非特許文献７】Ｋ．−Ｙ．Ｗａｎｇら，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ，２００８，８０（１６）６１５９−６１６７
【非特許文献８】Ｖ．Ｆｕｓａｒｏら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２７；２００９；１９０−１９８
【非特許文献９】Ｊ．Ｍｅａｄら，ＭＣＰ，２００８年１１月１５日，Ｅ−ｐｕｂ
【非特許文献１０】Ｆ．Ｄｅｓｉｅｒｅら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００６年１月１日；３４（ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ６５５−８
【非特許文献１１】Ｋｕｌａｓｉｎｇａｍら，Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．，２００８，６４０−６４７
【非特許文献１２】Ｈ．Ｋｅｓｈｉｓｈｉａｎら，ＭＣＰ，２００７，２２１２−２２２９
【非特許文献１３】Ｌ．Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．，２００４，２３５−２３４４
【非特許文献１４】Ｊ．Ｓｈｅｒｍａｎら，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２００８，９：１１２０−１１２３
【非特許文献１５】Ｍ．Ｄｕｎｃａｎら，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２００９，９：１１２４−１１２７
【非特許文献１６】Ｊ．Ｎｉｅｓｓｅｎら，ＭＣＰ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２３，２００９，Ｅ−Ｐｕｂ
【非特許文献１７】Ａ．Ｉｚｒａｅｌ−Ｔｏｍａｓｅｖｉｃら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ａｌｐｈａ Ｓｕｂｔｙｐｅｓ ｉｎ Ｓｅｒｕｍ：Ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｉｘｔｕｒｅｓ，インターネット公開日：２００９年４月７日
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２３】
このような現状を鑑みて、本発明は、信頼性があり、実施が容易で、低コストの質量分析法を用いる新規なタンパク質分析方法を提供する。本発明は、ＭＲＭ３を用いるタンパク質分析方法であって、一次フラグメントイオンを特異的に選択することにも基づき、上記のような良好な定量分析が可能となるタンパク質分析方法を提供する。
【００２４】
本発明は、サンプル中の標的タンパク質を定量的に検出するための方法であって、
ａ）ペプチドを生成するために上記サンプルを処理する工程と、
ｂ）上記標的タンパク質から生成した少なくとも１つのプロテオタイピックペプチドを質量分析法によって定量分析する工程とを含み、
上記質量分析法では、
ｉ）上記プロテオタイピックペプチドをイオン化してプリカーサーイオンを生成し、上記プリカーサーイオンをその質量ｍ／ｚに基づいてフィルタリングし、目的とする上記標的タンパク質に応じて所定の質量（ｍ／ｚ）１のプリカーサーイオンを選択し、
ｉｉ）その選択されたプリカーサーイオンを一次フラグメントイオンへと断片化し、
ｉｉｉ）その生成した一次フラグメントイオンをその質量ｍ／ｚに基づいてフィルタリングし、目的とする上記標的タンパク質に応じて所定の質量（ｍ／ｚ）２の一次フラグメントイオンを選択し、
ｉｖ）その選択された一次フラグメントイオンを二次フラグメントイオンへと断片化し、
ｖ）上記二次フラグメントイオンの少なくとも一部を検出し、一連の定量的測定値を得、
ｖｉ）二次フラグメントイオンに関する少なくとも１つの定量的測定値を選択し、上記生成したプロテオタイピックペプチドの量及び上記サンプル中に存在する上記標的タンパク質の量と相関付けを行い、ここで、
選択された上記質量（ｍ／ｚ）２の一次フラグメントイオンは、プロリン及び／又はヒスチジンを１番目に有する二価ペプチドであることを特徴とする、方法に関する。
【００２５】
以下の説明により、本発明のさらに明確な理解が可能となる。はじめに、使用する用語のいくつかの定義を以下に示す。
【００２６】
「ペプチド」という用語は、少なくとも２つのアミノ酸が連結したものを意味するものである。当該アミノ酸は、天然アミノ酸でもよく、酵素の作用によって修飾されたアミノ酸等の修飾された天然アミノ酸でもよい。
【００２７】
通常、「ペプチド」という用語は、２から１００個のアミノ酸が連結したものを指す。また、６個より多いアミノ酸が連結したものは「タンパク質」と呼ばれることもあり、これら二つの概念を明瞭な境界線によって区別することはできない。本発明において、「タンパク質」という用語は、サンプル中に元々存在する連結したアミノ酸を意味し、「ペプチド」という用語は、例えば消化、化学的切断、又は質量分析計で断片化されることなどによって、初期タンパク質又はそのペプチドの少なくとも１つのペプチド結合が切断された結果生じる連結したアミノ酸を意味する。「タンパク質」という用語は、核タンパク質、リポタンパク質、リンタンパク質、金属タンパク質及び糖タンパク質、酵素、受容体、抗体及び抗原等のホロタンパク質やヘテロタンパク質を包含している。
【００２８】
本発明の方法によって分析することができるタンパク質は、特に、少なくとも１個のプロリンを２番目からｎ−２番目に、及び／又は、少なくとも１個のヒスチジンを１番目からｎ−２番目に有する、ｎ個のアミノ酸からなるペプチドを少なくとも１つ含むタンパク質であり、上記ペプチドは最初のタンパク質を切断すると得られる。当該ペプチドは１から１５個のアミノ酸を含むことが好ましく、少なくとも６個のアミノ酸を含むことが好ましい。
【００２９】
「プロテオタイピックペプチド」という用語は、タンパク質をペプチドに断片化するためのタンパク質の処理によって生成するペプチドを意味し、当該タンパク質又は当該タンパク質が属する極めて類似のタンパク質群に特有のものである。
【００３０】
「サンプル」という用語は、検出対象のタンパク質を含有できる任意のサンプルを意味するものである。サンプルは生物（すなわち、動物、植物、ヒト）由来であってもよい。その場合、体液（例えば、全血、血清、血漿、尿、脳脊髄液、有機分泌物）試料、組織試料、又は単離した細胞試料であってもよい。この試料は、そのまま用いてもよく、明細書中、特に記載のない限り、分析の前に、当業者に公知の方法に従って濃縮、抽出、凝縮、精製系の処理を行ってもよい。サンプルは、工業的に得られたもの、すなわち、全てを列挙したものではないものの、空気試料、水試料、表面から採取された試料、成分又は製品、又は食物由来の製品であってもよい。上記食物由来のサンプルの中でも、例えば乳製品（ヨーグルト、チーズ）、肉、魚、卵、果実、野菜、水、又は飲料（牛乳、フルーツジュース、ソーダ等）のサンプルが挙げられるが、これらに限定されない。また、これらの食物由来サンプルは、出来上がった料理又はソース由来であってもよい。また、食物サンプルは動物飼料、特に、動物用食品等に由来してもよい。
【００３１】
上記ｍ／ｚ比は、本発明において用いられるイオン化されたペプチドの質量電荷比である。「質量電荷比」、「比」さらには「質量」という用語が、このｍ／ｚ比に対して区別することなく使用される。この比の単位はＴｈであるが、その名の「質量」から拡張してＤａであってもよい。
【００３２】
本発明に係る方法の第一工程ａ）は、標的サンプルに含まれるタンパク質の処理である。ペプチドへと断片化するために、サンプルのタンパク質すべてを、例えばタンパク質分解酵素（プロテアーゼ）による、又は化学試薬の作用による消化などによって処理する。実際、タンパク質の切断は、物理化学的処理によって、生物学的処理によって、又はこれら２つの処理の組み合わせによって実行することができる。使用可能な処理の中でも、ヒドロキシルラジカル、特にＨ２Ｏ２による処理が挙げられる。ヒドロキシルラジカルによる処理はペプチド結合の切断を引き起こす。ペプチド結合の切断はタンパク質の任意のペプチド結合に無作為に起こる。ヒドロキシルラジカルの濃度によって、切断の数、すなわち、得られるペプチドフラグメントの長さが決まる。また、例えば、メチオニル残基のカルボキシル基単位でペプチド結合を特異的に切断する臭化シアン（ＣＮＢｒ）による処理等の他の化学的処理も使用可能である。また、タンパク質のトリフルオロ酢酸溶液を１０００℃で加熱することにより、アスパラギン酸残基単位での部分的な酸性切断を行うことも可能である。
【００３３】
しかしながら、酵素消化によるタンパク質の処理が好ましい。これは、物理化学的処理と比較して、タンパク質の構造がより多く保存され、制御がより容易である。「酵素消化」という用語は、適切な反応条件下での１種又は複数の酵素の単独又は複合的作用を意味するものである。プロテアーゼと称される、タンパク質を分解する酵素は、特定部位でタンパク質を切断する。通常、プロテアーゼはそれぞれ、アミノ酸配列を認識し、その配列内で常に同様の切断を行う。あるプロテアーゼは、単一のアミノ酸、又は、その間を切断する２つのアミノ酸からなる配列を認識し；他のプロテアーゼはさらに長い配列のみを認識する。これらのプロテアーゼは、エンドプロテアーゼであってもよく、エキソプロテアーゼであってもよい。公知のプロテアーゼの中でも、国際公開第２００５／０９８０７１号に記載されている以下のものが挙げられる：
【００３４】
・Ａｒｇ及びＬｙｓ残基のカルボキシル基でペプチド結合を切断するトリプシンや、リシンの−ＣＯ基のペプチド結合を切断するエンドリシンや、芳香属残基（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ及びＴｒｐ）のカルボキシル基でペプチド結合を加水分解するキモトリプシンや、芳香属残基（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ及びＴｒｐ）のＮＨ２基で切断するペプシンや、Ｇｌｕ残基のカルボキシル基でペプチド結合を切断する、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｖ８株のＶ８プロテアーゼなどの特異的酵素；
【００３５】
・疎水性アミノ酸（Ｘａａ−Ｌｅｕ、Ｘａａ−Ｉｌｅ、Ｘａａ−Ｐｈｅ）のＮＨ２基でペプチド結合を加水分解する、細菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ由来のサーモリシンや、全ての結合を実質的に加水分解し、制御された反応条件（酵素濃度及び反応時間）下でタンパク質をオリゴペプチドに変換できる細菌プロテアーゼであるサブチリシン及びプロナーゼなどの非特異的酵素。
【００３６】
複数のプロテアーゼについて、それらの作用様式が適合する場合、それらを同時に使用することができ、あるいは、それらを連続的に使用することもできる。本発明において、サンプルの消化は、例えばトリプシンといったプロテアーゼの酵素作用によって行われるのが好ましい。
【００３７】
このような処理工程によって、サンプル中に存在する、タンパク質に代表される大きな分子をより小さな分子であるペプチドに変換することができる。従って、その後、質量分析で得られる検出の感度が向上する。さらに、上記処理工程によって、所定の標的タンパク質の、リポーターペプチドとも呼ばれるいくつかのプロテオタイピックペプチドを生成することができる。例えば、他のタンパク質が同一のペプチド配列を含まないかどうか、又は他の遷移が阻害しないかどうか、などを確認することにより、各プロテオタイピックペプチドの特異性を実証しなければならない。こうして、上記処理によって、分析対象のタンパク質に特異的なプロテオタイピックペプチドが１つ以上得られる可能性を高めることができる。プロテオタイピックペプチドはそれぞれ、独立した分析によってタンパク質を定量することを可能にする。血液サンプルのような複雑流体中のＭＲＭ分析の特異性は確固としたものではない。従って、このような場合、各タンパク質について、いくつかのプロテオタイピックペプチドを分析することによって、それぞれの独立した分析の結果が実際に同じ量となることを確認できるであろう。従って、互いに正しく相関付けられた独立した分析を行うことによって、信頼性と再現性の点から、独立した各分析の特異性及び頑健性を確認することができるであろう。
【００３８】
このように、この後の方法において、上記質量分析による分析のために選択される所定の比（ｍ／ｚ）１を有する各プリカーサーイオンとは、分析対象の標的タンパク質のプロテオタイピックペプチドに由来することとなる。
【００３９】
サンプルの複雑さ次第では、上記処理工程の前に１つ以上の任意の工程を行ってもよい。サンプルの複雑さを低減するために、標的サンプル中に存在するタンパク質の分画という第一工程を行った後に、残ったタンパク質の処理を行ってもよい。「分画」という用語は、従来通り、存在する多くのタンパク質の精製を意味するものであり、これは、サンプル中の１つ以上のタンパク質を除去すること、又は、分析対象のタンパク質を含む１つ以上のタンパク質を選択することで行い得る。このような工程は、サンプル中に存在するアルブミン、ＩｇＧ、ＩｇＡ等の、分析対象の標的タンパク質ではない顕著なタンパク質を除去（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）することで行い得る。このような除去は、例えばアフィニティークロマトグラフィーによって行うことができる。この除去により、存在するタンパク質の数を減少させることで、サンプルの複雑さを低減することができる。アルブミン除去は出願人（上記Ｔ．Ｆｏｒｔｉｎら）によって提案されている。タンパク質のより大きなパネルの除去も、他のチーム（上記Ｈ．Ｋｅｓｈｉｓｈｉａｎら、及び、上記Ｖ．Ｋｕｌａｓｉｎｇａｍら）によって採用されている。本発明において、これらの方法を用いてもよい。しかしながら、アフィニティークロマトグラフィーには、免疫親和性樹脂を含む場合には、使用するクロマトグラフ媒体が高価であるという欠点がある。更に、上記Ｔ．Ｆｏｒｔｉｎらによって示されているように、捕獲の特異性が不十分であると、分析対象のタンパク質自体が親和性樹脂により部分的に保持されてしまい、後続の分析に送られないことがある。
【００４０】
タンパク質を分画するための別の方法は、標的タンパク質を、例えばアフィニティークロマトグラフィー等によって免疫精製することからなる。この方法によれば、分析対象のタンパク質のみを含む分画（少数の混入したタンパク質も含み得る）を得ることにより、サンプルの複雑さを劇的に低減することができる。このような方法は、上記Ｋｕｌａｓｉｎｇａｍらによって記載されている。しかしながら、本発明に係る方法では、分析対象のタンパク質に対する抗体を必要とするこのような方法を用いないのが有利である。これは、本発明に係る方法は、分析対象のタンパク質に対して特異性を有するため、残存タンパク質数を非常に少なくするタンパク質の分画を必要としないからである。
【００４１】
タンパク質を分画するためのさらに別の方法は、特に上記Ｓ．Ａ．Ｇｅｒｂｅｒらによって記載されているように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって分析対象のサンプルを精製した後、分析対象のタンパク質の分子量に相当するバンドを切り取ることからなる。通常、電気泳動やクロマトグラフィー等に基づく、当業者に周知のすべてのタンパク質分画法が、サンプルの複雑さを低減するために使用可能である。
【００４２】
タンパク質の分画を行うのであれば、特に、タンパク質の切断に至る処理工程の前であって、タンパク質の分画工程の後に、変性、還元、及びその後のタンパク質のチオール官能基のブロッキングという別の任意の工程を行ってもよい。任意ではあるが、この工程によって、消化処理率を向上させることができ、後続の分析でのさらに高い頑健性を確保することができる。あるタンパク質は、その三次元構造のおかげで、プロテアーゼのタンパク質分解作用に対して元々耐性がある（Ｖ．Ｂｒｕｎら，ＭＣＰ，２００７，２１３９−２１４９）。このような場合、変性、還元、及びその後のタンパク質のチオール官能基のブロッキングという工程によって、プロテアーゼの作用が促進され、サンプル間で同様の消化処理率が確保される。標的サンプル中に存在するすべてのタンパク質は、例えば、尿素又はグアニジン、及び、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）又はトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）によって変性及び還元することができる（Ｍ．Ｓｕｎら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．２００５，１６（５）：１２８２−１２９０）。その後、生成した遊離のチオール官能基を、例えば、ヨードアセトアミド又はアクリルアミド等によってブロッキングする（Ｂ．Ｈｅｒｂｅｒｔら，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２００１，２２：２０４６−２０５７）。
【００４３】
本発明の方法によれば、上記処理工程中に生成した少なくとも１つのプロテオタイピックペプチドを質量分析によって分析する。通常、１つのタンパク質につき１つのプロテオタイピックペプチドを分析するが、１つのタンパク質につきいくつかのペプチドを分析することも可能である。また、種々のタンパク質のプロテオタイピックペプチドを連続的に分析することも可能である。上記処理工程中に生成したすべてのペプチドを、質量分析計に投入することができる。しかしながら、最も一般的には、特に標的タンパク質のプロテオタイピックペプチドに分析を集中させるために、生成したペプチドを分画する。このようなペプチドの分画は、例えば電気泳動法やクロマトグラフィー法によって実行することができる。これらの分離方法は、単独で用いることもでき、また、多次元分離ができるように互いに組み合わせて用いることもできる。例えば、上記Ｔ．Ｆｏｒｔｉｎら、及び上記Ｈ．Ｋｅｓｈｉｓｈｉａｎらにより記載されているように、イオン交換クロマトグラフィーによる分離を逆相クロマトグラフィーと組み合わせることによって、多次元クロマトグラフィーを行うことができる。これらの刊行物では、クロマトグラフ媒体はカラム中、又はカートリッジ中（固相抽出）に存在し得る。
【００４４】
プロテオタイピックペプチドの電気泳動又はクロマトグラフィーの分画（又は、一次元、若しくは多次元クロマトグラフィーの保持時間）は各ペプチドに特有であるので、これらの方法を用いることによって、分析対象のプロテオタイピックペプチドを選択することができる。生成したペプチドのこのような分画によって、後続の質量分析による分析の特異性を高めることができる。
【００４５】
電気泳動法又はクロマトグラフィー法とは別のペプチド分画のための方法は、Ｎ−糖ペプチドを特異的に精製することからなる（Ｊ．Ｓｔａｌ−Ｚｅｎｇら，ＭＣＰ，２００７，１８０９−１８１７、及び特許出願：国際公開第２００８／０６６６２９号）。しかしながら、このような精製は、Ｎ−グリコシル化型の翻訳後修飾を受けたペプチドの定量のみを可能にするだけであって、あいにく、すべてのタンパク質がグリコシル化されるとは限らないので、その使用は制限される。
【００４６】
ペプチドを分画するためのさらに別の方法は、標的ペプチドを、例えばアフィニティークロマトグラフィー等によって免疫精製することからなる。この方法によれば、分析対象のペプチドのみを含む分画（少数の混入したペプチドも含み得る）を得ることにより、サンプルの複雑さを劇的に低減することができる。ＳＩＳＣＡＰＡと呼ばれるこのような方法は、上記Ｌ．Ａｎｄｅｒｓｏｎら、及び米国特許出願公開第２００４／００７２２５１号明細書に記載されている。しかしながら、特異的な抗ペプチド抗体を得ることは困難な場合もあり、この場合、本発明に係る方法では、このような方法を用いない。更に、本発明に係る方法は、分析対象のタンパク質に対して特異性を有するため、分析対象である１つのプロテオタイピックペプチドが得られるペプチドの免疫親和性分画を必要としない。
【００４７】
結論として、本発明に係る方法において、生成されたペプチドの質量分析による定量分析（工程ｂ）に相当）よりも先に、工程ａ）で生成したペプチドのクロマトグラフィー又は電気泳動による分離を行うことが好ましい。このようなクロマトグラフィーによる分離は、逆相クロマトグラフィー、マイクロ流路クロマトグラフィー、すなわち、流量が毎分１００μｌから５００μｌのクロマトグラフィーによる分離、又は、固相抽出（ＳＰＥ）による精製を用いるのが好ましい。
【００４８】
本発明に係る方法の工程ｂ）は、これより前の工程中に生成した少なくとも１つのプロテオタイピックペプチドを質量分析法によって検出することからなる。通常、１つのタンパク質当たり１つプロテオタイピックペプチドを分析するが、２つ以上を分析することも可能であり、その送られる順番は、選択したペプチド分画法によって質量分析計の前工程で調整される。
【００４９】
本発明では、様々なモデルの質量分析計を使用することができる。これらのモデルでは、ｍ／ｚ比に基づいた３つの分離工程とこれらの分離工程間に行われる２つの連続した断片化、すなわちＭＳ／ＭＳ／ＭＳ又はＭＳ３と呼ばれるタイプの分析が可能でなけらばならない。例として、三連四重極型（Ｌ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ及びＣ．Ｈｕｎｔｅｒ，ＭＣＰ，２００６，５７３−５８８…）、又はイオントラップ型（Ｂ．Ｈａｎ及びＲ．Ｈｉｇｇｓ，Ｂｒｉｅｆ Ｆｕｎｃｔ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ．２００８，Ｓｅｐ；７（５）：３４０−５４）、あるいは飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）（Ｋ．−Ｙ．Ｗａｎｇら，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ，２００８，８０（１６），６１５９−６１６７）のモデルが挙げられる。しかしながら、イオントラップが組み込まれたハイブリッド三連四重極型モデルが好ましい。分析対象のペプチドは、最も一般的には溶液として、選択された質量分析計に投入され、分析される。
【００５０】
第一工程ｉ）では、タンパク質の切断に至るタンパク質の処理によって得られるペプチドが、質量分析計に投入され、分子イオンを生成するためにイオン化される。上記分子イオンは、フラグメントイオンを生成するためにその後、断片化されるため、プリカーサーと呼ばれる。質量分析計に投入するために、通常、ペプチドを水溶液に溶解する。従って、分析対象のサンプルは液体であることが好ましい。分子がイオン化されるイオン源としては、例えば、ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化）型、又は電気スプレー（ＥＳＩ（電気スプレーイオン化））型がある。しかしながら、穏やかな条件の下、特に、常圧及び常温で電気スプレーイオン化を行うことが好ましい。
【００５１】
その後、生成したプリカーサーイオンは、その質量ｍ／ｚに基づいてフィルタリングされ、目的とする標的タンパク質に基づいて、所定の質量（ｍ／ｚ）１のプリカーサーイオンが選択される。このために、従来通り、上記イオンを電界で加速し、その質量電荷（ｍ／ｚ）比に依存する軌道に従って電界及び／又は磁界に誘導する。印加する電界及び／又は磁界を変えることによって、プリカーサーイオンの軌道を変えることができるので、目的とする（ｍ／ｚ）１比を選択することができる。本発明の好ましい特徴によれば、選択されたプリカーサーイオンは、アミノ酸数ｎが６から１５であり、且つ、少なくとも１個のプロリンを２番目からｎ−２番目に、及び／又は、少なくとも１個のヒスチジンを１番目からｎ−２番目に有する二価ペプチドである。このような選択によって、後続の工程での良好な特異性及び選択性を達成できるとともに、シグナル／ノイズ比が改善されることとなる。好ましい一実施形態によれば、選択されたプリカーサーイオンは二価であり、少なくとも、２個のプロリン、又は、１個のプロリンと１個のヒスチジンとを有する。これは、２個のプロリン、又は、１個のプロリンと１個のヒスチジンとを有するプリカーサーイオンを用いることにより、ＭＳ３で生成される二次フラグメントがさらに少なくなり、最も有効な定量分析を行うためによりふさわしいからである。
【００５２】
「プロリン（又はヒスチジン）を２番目からｎ−２番目に有するペプチド」という表現は、プロリン（又はヒスチジン）が２、３、４、５…ｎ−５、ｎ−４、ｎ−３又はｎ−２番目に位置することを意味するものである。１番目はＮ末端部に相当し、ｎ番目はＣ末端部に相当し、ｎはペプチド中に存在するアミノ酸数である。
【００５３】
その後、目的とする標的タンパク質に応じて選択されたプリカーサーイオンが、工程ｉｉ）で一次フラグメントイオンへ断片化される。次いで、生成された一次フラグメントイオンは、その質量ｍ／ｚに基づいてフィルタリングされ、所定の質量（ｍ／ｚ）２の一次フラグメントイオンが工程ｉｉｉ）で選択される。本発明の本質的特徴によれば、上記選択された一次フラグメントイオンは、プロリン又はヒスチジンを１番目（Ｎ末端）に有する二価ペプチドである。実際、プリカーサーイオンがプロリン又はヒスチジンを含む場合、そのプロリン又はヒスチジンそれぞれに対するＮ末端部のペプチド結合が断片化したものに相当する一次フラグメントイオンが存在する。本発明に係る方法の工程ｉｖ）では、選択された一次フラグメントイオンに対して、さらなる断片化が行われる。また、プリカーサーイオン及び一次フラグメントイオンの上記特定の選択によって、良好な断片化が行われることとなり、強いピークが得られることとなる。本発明において、比（ｍ／ｚ）１を有するプリカーサーイオン、及び比（ｍ／ｚ）２を有する一次フラグメントイオンは、分析対象のタンパク質に特有なものとなるように、且つ、再現性と信頼性の点からできるだけ感度がよく、できるだけ特異的で、できるだけ頑健性の高い分析ができるように選択される。
【００５４】
従来通り、２回の連続した断片化は、電界内で、例えば窒素やアルゴン等の不活性ガスとの衝突によって、又は、単に、例えば飛行時間チューブ内などで電位差を印加することによって行われる。電界の特徴によって、断片化の強度及び性質が決まる。このように、例えば四重極では、不活性ガスの存在下に印加された電界によって、イオンに供給される衝突エネルギーが決まる。当業者であれば、分析対象の遷移の感度が高まるように、この衝突エネルギーを最適化できよう。例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（アメリカ合衆国、フォスターシティー）の質量分析計ＡＢ ＳＣＩＥＸ ＱＴＲＡＰ（登録商標）５５００のｑ２では、衝突エネルギーを５から１８０ｅＶの間で変化させることが可能である。同様に、当業者であれば、可能な限り感度のよい分析ができるように、衝突工程の継続時間と、例えばイオントラップ内などの励起エネルギーとを最適化できよう。例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社の質量分析計ＡＢ ＳＣＩＥＸ ＱＴＲＡＰ（登録商標）５５００のＱ３では、励起時間と呼ばれる上記継続時間を０．０１０から５０ミリ秒の間で変化させることが可能であり、上記励起エネルギーを０から１（任意単位）の間で変化させることが可能である。
【００５５】
工程ｉ）からｉｉｉ）は、ＭＲＭ分析に従来から用いられる工程に相当する。特に、このような工程は、三連四重極で行うことができる。三連四重極は、大抵の場合は短い方の四重極からなる衝突セル（ｑ２と呼ばれる）によって隔てられた２つの直列の四重極分析器（Ｑ１及びＱ３と呼ばれる）を含む。もちろん、一次フラグメントイオンを二次フラグメントイオンへと断片化することができる質量分析計で、本発明に係る方法を実施することが必要である。本発明において、二次フラグメントイオンへの一次フラグメントイオンの断片化、及び一次フラグメントイオンの選択は、例えば、イオントラップを備えた三連四重極のＱ３で行うことができる。四重極Ｑ３にイオントラップ性能を有するハイブリッド三連四重極を使用してもよい。このような装置は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から３２００ＱＴＲＡＰ（登録商標）、４０００ＱＴＲＡＰ（登録商標）又はＡＢ ＳＣＩＥＸ ＱＴＲＡＰ（登録商標）５５００の名称で販売されている。また、任意のイオントラップ型分析器において、ＭＳ３モードで一次フラグメントイオンを断片化することも可能である。この場合、プリカーサーイオンは上記イオントラップにおいて選択され、一次フラグメントイオンへと断片化される。今度は、同一イオントラップ装置において一次フラグメントイオンが選択され、二次フラグメントイオンへと断片化される。イオントラップから検出器へ二次イオンが連続して放出されることにより、二次イオンが最終的に検出される。
【００５６】
本発明では、従来通りに、四重極型分析器（Ｑ１）によって、選択されたプロテオタイピックペプチドに由来するプリカーサー分子イオンをその質量電荷比（ｍ／ｚ）１に基づいてフィルタリングすることができる。目的とするプリカーサーイオンの質量電荷比（ｍ／ｚ）１を有するペプチドのみが、第二の四重極（ｑ２）に送られる。ｑ２分析器によって、質量電荷比（ｍ／ｚ）１を有するプリカーサーイオンを一次フラグメントイオンへ断片化することができる。通常、上記断片化は、プリカーサーペプチドと、窒素やアルゴン等の不活性ガスとの衝突によって行われる。次いで、一次フラグメントイオンは、質量電荷比（ｍ／ｚ）に基づいて一次フラグメントイオンをフィルタリングする第三の四重極（Ｑ３）に送られる。目的とするプロテオタイピックペプチドに特有のフラグメントの質量電荷比（ｍ／ｚ）２を有する一次フラグメントイオンのみに対して、本発明に係る方法の最終工程が行われることとなる。実際には、本発明に係る方法は、さらなる断片化を含み、後続の工程ｉｖ）では、選択された質量（ｍ／ｚ）２の一次フラグメントイオンが、二次フラグメントイオンへと断片化される。目的とするプロテオタイピックペプチドのフラグメントの質量電荷比（ｍ／ｚ）２を有する一次フラグメントイオンがＱ３で選択された後、今度はこの一次フラグメントイオンが、例えばイオントラップ等によって断片化される。そして、一次フラグメントイオンの断片化によって生じた種々の二次フラグメントイオンが得られる。次いで、これらの種々の二次イオンは、例えばイオントラップや四重極などからなる質量分析計によって検出器へと放出されることとなる。上記放出は、例えば、無線周波数によって時間の関数として調整された電圧を印加することによって、イオントラップから連続的に行なわれる。
【００５７】
誘導される電流を検出するために、上記二次フラグメントイオンが検出器に向けられる。当該検出器では、ｍ／ｚ比に応じて異なる時間で到達する二次フラグメントイオンが収集され、該イオンに関するシグナルが増幅される。本発明に係る方法の実施の一変形例によれば、工程ｖ）において、上記二次フラグメントイオンによって誘導される電流の強度を時間の関数として検出し、所定期間に得られたシグナルを、存在する各種イオンの質量ｍ／ｚに応じた質量スペクトルに分解し、上記所定期間に存在する検出された二次イオンそれぞれに関する質量ピークを得、選択された少なくとも１つの二次イオンの電流に相当するシグナルを再構成し、その相当する測定電流の強度を、工程ｖｉ）で選択される上記定量的測定値とする。一般に、全シグナルは時間の分割（ｆｒａｃｔｉｏｎ）、すなわち期間ｔによって得られる。期間ｔの継続期間は、質量分析器の走査速度、及び走査する質量範囲に依存するが、通常１秒未満である。各所定期間ｔに得られた全シグナルは、存在する各種イオンの質量ｍ／ｚに応じた質量スペクトルに分解され、上記期間ｔに検出された二次イオンそれぞれに関する質量ピークが得られる。二次イオンは、連続するいくつかの期間ｔにおいて観察される。この連続するいくつかの期間ｔは、プロテオタイピックペプチドが溶出する期間Ｔに相当する。プロテオタイピックペプチドによって生成された二次フラグメントイオンのシグナルが最大である期間ｔは、プロテオタイピックペプチドの溶出時間、すなわち保持時間に相当する。プロテオタイピックペプチドの溶出時間は、精製されたプロテオタイピックペプチドの溶液、又は精製された標的タンパク質の溶液、又はどちらか一方が特に豊富な溶液を用いて、例えば従来通りＭＲＭなどによって、決定することができる。従来法では、期間Ｔの最小継続期間は５から３０秒である。しかしながら、期間Ｔの継続期間は通常、延長されるので、シグナルの測定値は、プロテオタイピックペプチドの溶出時間の微小変化に影響されない。このように、期間Ｔの継続期間を、クロマトグラフィーによる分離の総時間に達するように延長することができる。しかしながら、従来通り、期間Ｔは通常、１分から５分の間で固定され、プロテオタイピックペプチドの溶出時間を中心としたものとなっている。少なくとも１つの二次イオンの電流に相当するシグナルであって、定量するタンパク質由来のプロテオタイピックペプチドに特異的なシグナルは、期間Ｔ中、分割期間ｔ毎に選択することができる。そして、このシグナルは、全シグナルから抽出することができる。期間Ｔの各瞬間ｔ、すなわち期間Ｔの各分割期間に測定された強度の総和に相当する電流の強度が、工程ｖｉ）で選択される定量的測定値に相当することとなる。実際、実施例１に詳述するように、イオンによって生成され、時間の関数として検出された電流に相当するシグナルは、所定期間ｔ（実際は非常に短い期間）毎に分解することができ、例えば、期間Ｔを最も代表する分割期間で合算され、存在する各種イオンの質量ｍ／ｚに応じた質量スペクトルが得られる。こうして、工程ｖ）で検出され、且つ、期間Ｔを最も代表する分割期間に存在する二次イオンに関する質量ピークが得られる。そして、所定の質量を有する１つ以上の二次イオンを選択することができ、その選択されたイオンの電流に相当するシグナルを再構成することができる。こうして、各期間ｔのフラグメントイオンによって誘導された電流であって、期間Ｔを最も代表する分割期間中に生じた電流の強度の合計が、プロテオタイピックペプチドの溶出に相当する期間Ｔを最も代表する分割期間の連続する期間ｔ中に観察されたシグナルの総和を積分することよって得られる。この合計は、例えば、存在するプロテオタイピックペプチドの量の決定を可能にする定量的測定値に相当することとなる。シグナルが合算された、期間Ｔを最も代表する分割期間の最初の期間ｔ及び最後の期間ｔは、シグナルが検出器のバックグラウンドノイズより大きい最初の期間ｔ及び最後の期間ｔと一致させてもよい。このように測定された電流の強度を、存在するプロテオタイピックペプチドの量を決定するための定量的測定値としてもよい。当該定量的測定値は、国際単位系（ＳＩ単位）であるｍｏｌ／ｍ３若しくはｋｇ／ｍ３系統、又はこれらの単位の倍数若しくは約数、又はその倍数若しくは約数を含む国際単位の通常の派生物によって表されるという特徴を有する。非限定的な例として、ｎｇ／ｍｌ又はｆｍｏｌ／ｌ等の単位が、定量的測定値を特徴づける単位である。工程ｖｉ）では、最大のｍ／ｚピークを有する二次フラグメントイオンに関する定量的測定値が選択されるのが好ましい。また、各種二次フラグメントイオンの定量的測定値を合算することも可能である。この場合、工程ｖｉ）では、例えば、最大のｍ／ｚピークを有する二次フラグメントイオンに関する少なくとも２つ（特に２つ又は３つ）の定量的測定値の合計値に基づいて、相関付けが実行される。
【００５８】
データ処理コンピューターアセンブリにより、検出器によって受信された情報を質量スペクトルに変換することができる。検出器によって測定された、選択された二次フラグメントイオンによって誘導された電流の強度は、二次フラグメントイオンの量に比例する。二次フラグメントイオンの量自体は、一次フラグメントイオンの量に比例し、一次フラグメントイオンの量自体は、選択されたプロテオタイピックペプチドのイオン化によって得られるプリカーサーイオンの量に比例し、プリカーサーイオンの量自体は、分析対象のタンパク質の量に比例する。従って、二次フラグメントイオンによって誘導された電流の測定量は、分析対象のタンパク質の量に正比例する。二次イオンに関する少なくとも１つの定量的測定値を選択し、この定量的測定値を、生成されたプロテオタイピックペプチドの量、及びサンプルの中に存在するタンパク質の量と相関付けを行うことによって、定量分析を行うことが可能になる。
【００５９】
二次フラグメントイオンによって誘導された電流の強度に相当する、測定されたピークの面積を、対応する二次フラグメントイオンの量と相関付けるためには、較正が必要である。上記対応する二次フラグメントイオンの量自体は、対応する一次フラグメントイオンの量と相関付けることができ、対応する一次フラグメントイオンの量自体は、プリカーサーイオンの量と相関付けることができ、プリカーサーイオンの量自体は、標的タンパク質の量と相関付けることができる。このために、本発明において、ＭＲＭ分析に用いられる従来の較正が行われてもよい。従来、ＭＲＭ分析は外部標準を用いて較正されるか、又は好ましくは、上記Ｔ．Ｆｏｒｔｉｎらによって記載されているような内部標準を用いて較正される。定量的測定値、及びプロテオタイピックペプチドの量、延いては標的タンパク質の量の相関は、分析対象の量が公知の標準シグナルに対して、測定されたシグナルを較正することにより得られる。較正曲線により上記較正を行うことができ、当該較正曲線は、例えば、様々な濃度の標準プロテオタイピックペプチドを連続投入すること（外部較正）によって、又は好ましくは内部標準として重ペプチドを用い、例えば、以下に詳述するＡＱＵＡ法、ＱｃｏｎＣＡＴ法若しくはＰＳＡＱ法などに従った内部較正によって得られる。「重ペプチド」という用語は、プロテオタイピックペプチドに相当するペプチドを意味するものであるが、１つ以上の炭素１２（１２Ｃ）原子が炭素１３（１３Ｃ）で置換されており、且つ／又は、１つ以上の窒素１４（１４Ｎ）原子が窒素１５（１５Ｎ）で置換されている。
【００６０】
内部標準（ＡＱＵＡ）としての重ペプチドの使用も、上記Ｓ．Ａ．Ｇｅｒｂｅｒらによって、さらには米国特許出願公開第２００４／０２２９２８３号明細書に提案されている。その原理は、通常の天然同位元素より重い同位元素を含むアミノ酸でプロテオタイピックペプチドを人工的に合成することである。そのようなアミノ酸は、例えば、炭素１２（１２Ｃ）原子のうちのいくつかを炭素１３（１３Ｃ）に置換すること、又は、窒素１４（１４Ｎ）原子のうちのいくつかを窒素１５（１５Ｎ）に置換することにより得られる。このように合成された人工ペプチド（ＡＱＵＡ）は、（質量が大きい以外は）天然ペプチドと同一の物理化学的性質を厳密に有している。通常、それを所定の濃度で、質量分光法による分析の前工程、例えば、標的サンプルのタンパク質の切断に至る処理と、該処理工程後に得られたペプチドの断片化との間に、サンプルに添加する。その結果、上記ＡＱＵＡペプチドは、ペプチドの断片化中に、分析対象の天然ペプチドとともに精製される。従って、これら２つのペプチドは、分析のために、質量分析計に同時に投入される。そして、それらは、上記源で同じイオン化率を示す。天然ペプチドと、濃度既知のＡＱＵＡペプチドのピークの面積を比較することによって、天然ペプチドの濃度を算出することができ、それにより分析対象のタンパク質の濃度にもさかのぼることができる。ＡＱＵＡ法の変形例が、ＱｃｏｎＣＡＴという名でＪ．−Ｍ．Ｐｒａｔｔら（Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２００６，１：１０２９−１０４３）によって提案されている。この変形例は、特許出願：国際公開第２００６／１２８４９２号にも記載されている。それは、各種ＡＱＵＡペプチドを連結すること、及び、組換え重タンパク質として人工ポリペプチドを生成することからなる。当該組換えタンパク質は、重同位元素を含むアミノ酸で合成される。このように、いくつかのタンパク質の同時分析を較正するための標準をより低コストで得ることができる。ＱｃｏｎＣＡＴ標準は、タンパク質の切断に至る処理の前工程で、並びに、タンパク質の分画、変性、還元、及びその後のタンパク質のチオール官能基のブロッキング工程を行う場合はそれらの工程の前に、最初から添加される。従って、ＱｃｏｎＣＡＴ標準は、天然タンパク質と同様にタンパク質の切断に至る処理サイクルを受ける。これにより、タンパク質の切断に至る処理工程の収率を考慮することができる。実際は、特に消化による天然タンパク質の処理は完全ではない場合がある。この場合、ＡＱＵＡ標準を用いると、天然タンパク質の量が少なく見積もられるであろう。従って、絶対的な分析のためには、タンパク質の切断に至る処理の収率を考慮することが重要な場合もある。しかしながら、Ｖ．Ｂｒｕｎら（ＭＣＰ，２００７，２１３９−２１４９）によって、おそらくＱｃｏｎＣＡＴタンパク質の異なる三次元構造のために、ＱｃｏｎＣＡＴ標準は、特に消化による天然タンパク質の処理での収率を正確に再現しない場合があることが示されている。
【００６１】
従って、上記Ｖ．Ｂｒｕｎらは、特許出願：国際公開第２００８／１４５７６３号に記載のＰＳＡＱと呼ばれる方法の使用を提案している。この場合、内部標準は、天然タンパク質と同一配列を有するが、重アミノ酸で合成された組換えタンパク質である。この合成は、重アミノ酸を用いてｅｘ ｖｉｖｏで行われる。この標準は、（質量が大きい以外は）天然タンパク質と同一の物理化学的性質を厳密に有している。それは、タンパク質分画工程を行う場合はその前に最初から添加される。従って、それはタンパク質分画工程中に天然タンパク質とともに精製される。それは、特に消化による処理において、天然タンパク質と同じ収率を示す。ペプチド分画工程が行われる場合、切断後に得られた重ペプチドも天然ペプチドとともに精製される。従って、２つのペプチドは、質量分析計に同時に投入され、定量分析される。そして、それらは、上記源で同一イオン化率を示す。ＰＳＡＱ法での天然ペプチド及び標準ペプチドのピーク面積を比較することにより、分析方法の全工程を考慮しつつ、分析対象のタンパク質の濃度を算出することができる。
【００６２】
本発明において、上記較正を行うために、質量分析による分析、特にＭＲＭ又はＭＳ分析で用いられるこれらすべての方法、すなわちＡＱＵＡ、ＱｃｏｎＣＡＴ又はＰＳＡＱなどの較正方法を用いてもよい。
【００６３】
従って、本発明に係る方法は、特にｉｎ ｖｉｔｒｏ診断のためのタンパク質の定量・定性分析のために行ってもよい。本発明に係る方法によって分析することができるいくつかのタンパク質と、選択されたプロテオタイピックペプチドとを下記表１Ａで詳細に示す。
【００６４】
【表１Ａ】
【００６５】
調査したタンパク質は、Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔデータベースの下記番号に対応する：プラスチン−１（Ｑ１４６５１）、エズリン（Ｐ１５３１１）、アミノアシラーゼ１（Ｑ０３１５４）、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（Ｐ０７２３７）、ケラチン，１型Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ２０（Ｐ３５９００）、１４−３−３シグマタンパク質（Ｐ３１９４７）、Ｓ１００−Ａ１１タンパク質 カルギザリン（Ｐ３１９４９）。
【００６６】
プロテオタイピックペプチドの理論的な質量は、そのアミノ酸配列から求められる。ＭＲＭ Ｐｉｌｏｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｅｄｉｔｏｒ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｋ社、ドイツ、ブレーメン）等、多くのソフトウェアパッケージによってこの計算を行うことができる。表１Ａに示す計算結果は、ＭＲＭパイロットによって行われたものである。二価プリカーサーイオン（Ｍ２Ｈ＋）の理論的な質量は、プロテオタイピックペプチドの理論的な質量に２つのプロトンの質量を加え、得られた合計を２で割ることにより求められる。
【００６７】
表１Ｂに、各タンパク質についての選択された二価プリカーサーイオンに関して、存在するプロリン及びヒスチジンの位置、並びに存在するアミノ酸数を示す（ＡＡはアミノ酸を意味する）。
【００６８】
【表１Ｂ】
【００６９】
タンパク質ジスルフィドイソメラーゼのタンパク質の場合、１７個のアミノ酸を有するプロテオタイピックペプチドＨＮＱＬＰＬＶＩＥＦＴＥＱＴＡＰＫ（配列番号１４）のみでは、対応する二価プリカーサーイオンの検出には至らず、ケラチン，１型Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ２０のタンパク質の場合、１８個のアミノ酸を有するペプチドＳＬＳＳＳＬＱＡＰＶＶＳＴＶＧＭＱＲ（配列番号２３）のみでは、対応する二価プリカーサーイオンの検出には至らない。表１Ｃに、各タンパク質について、存在するプロリン及びヒスチジンの位置と共に、選択された二価一次フラグメントイオンを示す。
【００７０】
【表１Ｃ】
【００７１】
付属の図を参照した以下の実施例は、全く制限するものでなく、本発明の例示を可能にするものである。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１Ａ】全イオンクロマトグラムで時間の関数として得られたシグナルの例を示す。
【図１Ｂ】図１Ａ中、１１．７０分から１１．９０分の間に溶出した二次フラグメントイオンの質量スペクトルを示す。
【図１Ｃ】図１ＡのＰＳＡのプロテオタイピックペプチドＬＳＥＰＡＥＬＴＤＡＶＫ（配列番号５０）の二次フラグメントｙ５、ｙ６、ｙ７−Ｈ２Ｏ、ｙ７及びｙ８の質量に相当する抽出されたイオンのクロマトグラムの、３点で平滑化された総和を示す。
【図１Ｄ】較正曲線の例である。
【図２Ａ】天然ペプチドＬＳＥＰＡＥＬＴＤＡＶＫ（配列番号５０）（保持時間１１．７８分）について得られたクロマトグラムを示す。
【図２Ｂ】重ペプチドＬＳＥＰＡＥＬＴＤＡＶＫ（配列番号５０）（保持時間１１．７９分）のクロマトグラムを示す。
【図３】較正曲線の他の例である。
【図４Ａ】較正曲線の他の例である。
【図４Ｂ】較正曲線の他の例である。
【図５Ａ】図５Ａ、５Ｂ及び５Ｃは、各種衝突エネルギー４０、３５及び３０ｅＶそれぞれで得られた各種質量スペクトルである。
【図５Ｂ】図５Ａ、５Ｂ及び５Ｃは、各種衝突エネルギー４０、３５及び３０ｅＶそれぞれで得られた各種質量スペクトルである。
【図５Ｃ】図５Ａ、５Ｂ及び５Ｃは、各種衝突エネルギー４０、３５及び３０ｅＶそれぞれで得られた各種質量スペクトルである。
【図５Ｄ】誘導された電流の強度の変化を、一次フラグメントイオンの生成に用いられた衝突エネルギー（ＣＥ）の関数として示す。
【図６Ａ】図６Ａ、６Ｂ及び６Ｃは、最も強度の強い一価フラグメントイオン（図６Ａ、０．０９８分から０．３００分の間に溶出）、又は、プロリンを含む一価型フラグメントイオン（図６Ｂ、０．１０１分から０．３０６分の間に溶出）、又は、その同一イオンの二価型（図６Ｃ、０．１０２分から０．２９８分の間に溶出）のいずれかを一次フラグメントイオンとして選択した時に、Ｔｐ４３５タンパク質のプロテオタイピックペプチドＳＡＰＳＰＬＴＹＲ（配列番号５３）から得られた二次フラグメントイオンの質量スペクトルを表わす。
【図６Ｂ】図６Ａ、６Ｂ及び６Ｃは、最も強度の強い一価フラグメントイオン（図６Ａ、０．０９８分から０．３００分の間に溶出）、又は、プロリンを含む一価型フラグメントイオン（図６Ｂ、０．１０１分から０．３０６分の間に溶出）、又は、その同一イオンの二価型（図６Ｃ、０．１０２分から０．２９８分の間に溶出）のいずれかを一次フラグメントイオンとして選択した時に、Ｔｐ４３５タンパク質のプロテオタイピックペプチドＳＡＰＳＰＬＴＹＲ（配列番号５３）から得られた二次フラグメントイオンの質量スペクトルを表わす。
【図６Ｃ】図６Ａ、６Ｂ及び６Ｃは、最も強度の強い一価フラグメントイオン（図６Ａ、０．０９８分から０．３００分の間に溶出）、又は、プロリンを含む一価型フラグメントイオン（図６Ｂ、０．１０１分から０．３０６分の間に溶出）、又は、その同一イオンの二価型（図６Ｃ、０．１０２分から０．２９８分の間に溶出）のいずれかを一次フラグメントイオンとして選択した時に、Ｔｐ４３５タンパク質のプロテオタイピックペプチドＳＡＰＳＰＬＴＹＲ（配列番号５３）から得られた二次フラグメントイオンの質量スペクトルを表わす。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００７３】
実施例１：腫瘍マーカーの外部較正を用いたＭＲＭ３による定量分析の原理：前立腺特異抗原（ＰＳＡ）
ＰＳＡ（前立腺特異抗原、Ｓｃｉｐａｃ社（イギリス）製）を、以下の校正範囲のポイントを得るために、女性の血清（フランス血液銀行［Ｆｒｅｎｃｈ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋ］）中、下記濃度で使用する。
・２００μｇ／ｍｌのポイントを得るために、女性の血清１６５μｌ中、１．１４ｍｇ／ｍｌのＰＳＡを３５μｌ
・５０μｇ／ｍｌのポイントを得るために、女性の血清１５０μｌ中、上記２００μｇ／ｍｌのポイントを５０μｌ
・１０μｇ／ｍｌのポイントを得るために、女性の血清１６０μｌ中、上記５０μｇ／ｍｌのポイントを４０μｌ
・１μｇ／ｍｌのポイントを得るために、Ｈ２Ｏ１８０μｌ中、上記１０μｇ／ｍｌのポイントを２０μｌ
・１００ｎｇ／ｍｌのポイントを得るために、Ｈ２Ｏ１８０μｌ中、上記１μｇ／ｍｌのポイントを２０μｌ
・１０ｎｇ／ｍｌのポイントを得るために、Ｈ２Ｏ１８０μｌ中、上記１００ｎｇ／ｍｌのポイントを２０μｌ
・１ｎｇ／ｍｌのポイントを得るために、Ｈ２Ｏ１８０μｌ中、上記１０ｎｇ／ｍｌのポイントを２０μｌ
・５μｇ／ｍｌのポイントを得るために、Ｈ２Ｏ１８０μｌ中、上記５０μｇ／ｍｌのポイントを２０μｌ
・５００ｎｇ／ｍｌのポイントを得るために、Ｈ２Ｏ１８０μｌ中、上記５μｇ／ｍｌのポイントを２０μｌ
・５０ｎｇ／ｍｌのポイントを得るために、Ｈ２Ｏ１８０μｌ中、上記５００ｎｇ／ｍｌのポイントを２０μｌ
【００７４】
０ｎｇ／ｍｌのポイントを得るために、女性の血清２００μｌを用いる。
【００７５】
次いで、上記範囲ポイント、及び、前立腺癌又は良性前立腺肥大症に罹患した患者から採取されたサンプルである分析対象の血清サンプルを、以下のプロトコルに従って消化する。
・ｐＨ＝８．０の５０ｍＭ重炭酸塩３ｍｌで、１００μｌの血清を希釈。
・最終濃度が１５ｍＭとなるようにジチオトレイトール（ＤＴＴ）を添加。
・６０℃で４０分間還元。
・常温でチューブを冷却。
・最終濃度が２５ｍＭとなるようにヨードアセトアミドを添加。
・常温、暗所で４０分間アルキル化。
・１／３０の比でトリプシンを添加。
・３７℃で４時間消化。
・最終濃度が１０ｍＭとなるようにＤＴＴを添加。
・６０℃で４０分間還元。
・常温でチューブを冷却。
・最終濃度が１５ｍＭとなるようにヨードアセトアミドを添加し、４０分間、常温、暗所でチオール官能基をアルキル化。
・１／３０の質量比でトリプシンを添加。
・３７℃で一晩、消化。
【００７６】
次いで、以下のプロトコルに従って、血清を脱塩し、濃縮する。
・ギ酸（すなわち、最終濃度の０．１％）によるサンプルの酸性化。
・１ｍｌのメタノール、次いで１ｍｌのＨ２Ｏ／０．１％ギ酸でＷａｔｅｒｓ社のＨＬＢ Ｏａｓｉｓカラムを平衡化。
・サンプルの投入、そのサンプルは重力で流れる。
・１ｍｌのＨ２Ｏ／０．１％ギ酸で洗浄。
・Ｈ２Ｏ／０．１％ギ酸混合物中の８０％メタノール１ｍｌで溶出。
【００７７】
その後、溶出した分画をｐＨ３．００の２００ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液３ｍｌで希釈する。
【００７８】
以下のプロトコルに従ってＷａｔｅｒｓ社のＯａｓｉｓ ＭＣＸ ＳＰＥカートリッジでサンプルを分画する。
・メタノール１ｍｌ、次いでｐＨ３．００の２００ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液１ｍｌでカートリッジを調整する。
・上記ｐＨ３．００の２００ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液で希釈した血清をすべて、ＭＣＸカートリッジに投入し、重力によって流す。
・ｐＨ３．００の２００ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液１ｍｌ、次いで８０％メタノール＋ｐＨ３．００の２０％酢酸緩衝液の１ｍｌでカートリッジを洗浄する。
・２００ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．５）／メタノール（５０／５０）１ｍｌで溶出を行う。
・体積を約１００μｌにするために、ＳｐｅｅｄＶａｃ（登録商標）ＳＰＤ２０１０型エバポレータ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ社、アメリカ合衆国、マサチューセッツ州、ウォルサム）で溶出液を２時間蒸発させる。
【００７９】
その後、溶出液を１０％アセトニトリル（ＡＣＮ）／９０％Ｈ２Ｏ＋０．５％ギ酸の混合液を、２００μｌとするのに十分量（ＱＳ）用いて溶かす。
【００８０】
得られたサンプルを１００μｌ投入し、下記条件に従って分析する。
・Ｄｉｏｎｅｘ社（アメリカ合衆国、カリフォルニア州、サニーベール）製のＵｌｔｉｍａｔｅ ３０００クロマトグラフィーシステム
・Ｗａｔｅｒｓ社のＳｙｍｍｅｔｒｙＣ１８カラム（内径２．１ｍｍ、長さ１００ｍｍ、粒子径３．５μｍ）
・溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ＋０．１％ギ酸
・溶媒Ｂ：ＡＣＮ＋０．１％ギ酸
【００８１】
下記表２に定義するＨＰＬＣ勾配：
【００８２】
【表２】
【００８３】
クロマトグラフィーカラムから流出する溶出液は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（アメリカ合衆国、フォスターシティー）製のＱＴＲＡＰ（登録商標）５５００質量分析計のイオン源に直接投入される。
【００８４】
用いる機械パラメーターを以下に示す。
走査タイプ：ＭＳ／ＭＳ／ＭＳ（ＭＳ３）
極性：正
走査モード：プロファイル（Ｐｒｏｆｉｌｅ）
イオン源：Ｔｕｒｂｏ Ｖ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社）
プリカーサー：６３６．８０Ｄａ
一次イオン：４７２．３０Ｄａ
Ｑ１設定：ユニット分解能（ｕｎｉｔ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）でフィルタリング
Ｑ３設定：線形イオントラップ
走査スピード：１００００Ｄａ／秒
Ｑ０でのトラッピング：有
Ｑ３での線形イオントラップ充填時間：２００．００ミリ秒
Ｑ３入力電圧：８．００Ｖ
断片化：有
励起時間：２５．００ミリ秒
Ｑ３でのイオントラップ走査増分：０．１２Ｄａ
走査開始質量（Ｄａ）：５００．００Ｄａ
走査終了質量（Ｄａ）：８５０．００Ｄａ
時間（秒）：０．０３５０秒
トラッピング無線周波数振幅（開始）：４．３０
トラッピング無線周波数振幅（終了）：４．４８
イオントラップ出力電圧（開始）：−１３６．２４Ｖ
イオントラップ出力電圧（終了）：−１２５．０９Ｖ
カーテンガス：５０．００ｐｓｉ
コーン電圧：５５００．００Ｖ
源温度：５００．００℃
噴霧ガス：５０．００ｐｓｉ
加熱ガス：４０．００ｐｓｉ
衝突セル充填：高
クラスタ分離電位：５０．００Ｖ
Ｑ０前の入力電位：３．００Ｖ
衝突エネルギー：２８．００ｅＶ
励起エネルギー（ＡＦ２）：０．０７
【００８５】
得られたシグナルは、全イオンクロマトグラムで時間の関数として表わされる（図１Ａ）。
【００８６】
各瞬間ｔにおいて、二次イオンの質量は質量スペクトルとして観察することができる。従って、質量スペクトルは、カラムから溶出し、同時に質量分析計に投入される各種の物質の質量を測定する。１１．７０分から１１．９０分の間で溶出した二次フラグメントイオンの質量を図１Ｂに示す。これらの質量のうちのいくつかは、ＰＳＡのプロテオタイピックペプチドＬＳＥＰＡＥＬＴＤＡＶＫ（配列番号５０）の二次フラグメントの質量に相当する。従って、質量５３３．０、６４６．２、７５７．６、７７５．４及び８４６．６はそれぞれ、フラグメントｙ５、ｙ６、ｙ７−Ｈ２Ｏ、ｙ７及びｙ８に相当する。先行技術では慣例として周知であるように、「ｙ５」フラグメントは、その配列がプロテオタイピックペプチドの配列の最後の５個のアミノ酸であるフラグメントであり、「ｙ６」フラグメントは最後の６個、といったぐあいである。
【００８７】
Ａｎａｌｙｓｔ１．５ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）によって、質量窓に対応するイオン電流を時間の関数として抽出することができる。従って、例えば、標的二次フラグメントそれぞれに対応する、例えば質量単位などの窓のクロマトグラムを得ることができる。このクロマトグラムを、抽出されたイオンクロマトグラムと呼ぶ。また、Ａｎａｌｙｓｔ１．５ソフトウェアによって、いくつかの抽出されたイオンクロマトグラムを合わせることができる。さらに、Ｓａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙアルゴリズム（Ａ．Ｓａｖｉｔｚｋｙ及びＭ．Ｇｏｌａｙ（１９６４）Ｓｍｏｏｔｈｉｎｇ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄａｔａ ｂｙ Ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｌｅａｓｔ Ｓｑｕａｒｅｓ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６：１６２７−１６３９）に従って、シグナルを平滑化することができる。このように、図１Ｃに、ＰＳＡのプロテオタイピックペプチドＬＳＥＰＡＥＬＴＤＡＶＫ（配列番号５０）の二次フラグメントｙ５、ｙ６、ｙ７−Ｈ２Ｏ、ｙ７及びｙ８の質量に対応する抽出されたイオンクロマトグラムの、３点で平滑化された総和を示す。
【００８８】
そして、Ａｎａｌｙｓｔ１．５ソフトウェアによって、抽出されたイオンクロマトグラムで観察されるピーク下の面積を積分することができる。このように、ＰＳＡ量が０から１０００ｎｇ／ｍｌの範囲のポイントについて、ペプチドＬＳＥＰＡＥＬＴＤＡＶＫ（配列番号５０）のｙ５、ｙ６、ｙ７−Ｈ２Ｏ、ｙ７及びｙ８イオンの総和のシグナルを測定することにより、下記表３を得ることができた。
【００８９】
【表３】
【００９０】
これらの結果から、図１Ｄに示す較正曲線を作成することができる。この曲線は、線形回帰を用いて、方程式（ｙ＝１．９×１０５Ｘ＋２．７６×１０５）としてモデル化されている。当該方程式により、ＰＳＡ量が未知の任意のヒト血清サンプルについて、ＰＳＡ濃度を算出できる。
【００９１】
例えば、以下の患者の血清を分析し、表４に示す以下の量を得ることができる。
【００９２】
【表４】
【００９３】
実施例２：腫瘍マーカーの内部較正を用いたＭＲＭ３による定量分析の原理：前立腺特異抗原（ＰＳＡ）
Ｔ．Ｔｏｒｔｉｎら（ＭＣＰ，２００８，Ｅ−ｐｕｂ）により記載されたプロトコルに従って、ある原子の重同位元素を含むアミノ酸を用いて、内部較正の標準を合成する。
【００９４】
こうして、ＰＳＡの器官型ペプチド（ｏｒｇａｎｏｔｙｐｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ）（ＬＳＥＰＡＥＬＴＤＡＶＫ）（配列番号５０）は、３つの炭素１２（１２Ｃ）原子の代わりに３つの炭素１３（１３Ｃ）原子を含むアラニンを２個含んで化学合成される。この合成は、ＡＢＩ４３３Ａ合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、アメリカ合衆国、フォスターシティー）及びＬ−（１３Ｃ３）−アラニン−Ｎ−ＦＭＯＣ（Ｅｕｒｉｓｏ−Ｔｏｐ社、フランス、サントーバン）を用いて行われる。合成の最後に、その重ペプチドを３０個の４ｍｌ容褐色ガラスボトルに分け、凍結乾燥する。
【００９５】
質量分析器（ＬＣＱイオントラップ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、アメリカ合衆国、マサチューセッツ州、ウォルサム）に連結されたクロマトグラフィーによって、合成重ペプチドの純度を確認する。その純度は、９５％を超えることが確認される。そして、褐色ガラスボトル中の重ペプチドの量を、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（フランス、マッシー）の１１００型アミノ酸分析器により、ボトル３本のサンプルに基づいて確認する。こうして、ボトルが純度９５％を超える重ペプチドを７９０μｇ含むことがわかる。
【００９６】
重ペプチド７９０μｇのボトル１本を、０．５％ギ酸が添加された水１ｍｌに溶かす。濃度６．２×１０−１０ｍｏｌ／μｌの重ペプチド原液が得られる。
【００９７】
６．２×１０−１１ｍｏｌ／μｌの溶液を得るために、上記重ペプチド原液をアセトニトリル／水（５０／５０）に１％ギ酸を加えた混合物で１０倍に希釈する。
【００９８】
６．２×１０−１２ｍｏｌ／μｌの溶液を得るために、上記６．２×１０−１１ｍｏｌ／μｌの溶液をアセトニトリル／水（５０／５０）に１％ギ酸を加えた混合物で１０倍に希釈する。
【００９９】
３．１×１０−１３ｍｏｌ／μｌの溶液を得るために、上記６．２×１０−１２ｍｏｌ／μｌの溶液をアセトニトリル／水（５０／５０）に１％ギ酸を加えた混合物で２０倍に希釈する。
【０１００】
３．１×１０−１４ｍｏｌ／μｌの溶液を得るために、上記３．１×１０−１３ｍｏｌ／μｌの溶液をアセトニトリル／水（５０／５０）に１％ギ酸を加えた混合物で１０倍に希釈する。
【０１０１】
３．１×１０−１５ｍｏｌ／μｌの溶液を得るために、上記３．１×１０−１４ｍｏｌ／μｌの溶液をアセトニトリル／水（５０／５０）に１％ギ酸を加えた混合物で１０倍に希釈する。
【０１０２】
患者の血清サンプル及びその各範囲ポイントを、実施例１に記載のプロトコルに従って処理し、酵素による消化工程と、Ｗａｔｅｒｓ社のＯａｓｉｓ ＨＬＢカラムでの脱塩工程との間で、３．１×１０−１５ｍｏｌ／μｌの重ペプチド溶液５０μｌを添加する。
【０１０３】
その後、患者の血清サンプル及びその各範囲ポイントを実施例１に記載のプロトコルに従って分析するとともに、以下の重ペプチドに対応するイオンのモニタリングも行う。
プリカーサー：６３９．８０Ｄａ
一次イオン：４７５．３０Ｄａ
【０１０４】
重ペプチドＬＳＥＰＡＥＬＴＤＡＶＫ（配列番号５０）は天然ペプチドと同じ物理化学的性質を有しているため、クロマトグラフィーでの保持時間が同じである。従って、２つのペプチドは質量分析計に同時に投入される。このことは、図２Ａの天然ペプチドＬＳＥＰＡＥＬＴＤＡＶＫ（配列番号５０）（保持時間１１．７８分）及び図２Ｂの重ペプチドＬＳＥＰＡＥＬＴＤＡＶＫ（配列番号５０）（保持時間１１．７９分）のクロマトグラムから見て取ることができる。
【０１０５】
一方、この重ペプチドは、天然ＰＳＡペプチドよりも６質量単位多い。その質量は、天然ペプチドの１２７７．６６ｇ／ｍｏｌに対して、１２７１．６６ｇ／ｍｏｌである。
【０１０６】
重ペプチドの量は、既知であり（１．５５×１０−１３ｍｏｌ）、且つ、範囲ポイントすべてで同じである。従って、再構成されたシグナルは、全範囲にわたって一定とならなければならない。しかしながら、シグナルの変化が重ペプチドにおいて観察され、このことは、この同一の変化が天然ペプチドのシグナルにも影響を及ぼしていることを意味する。従って、軽ペプチドのシグナルを修正するために、重ペプチドのシグナルを用いることができる。これを行うために、抽出されて一緒に添加された特異的な二次天然イオン及び重イオン間のクロマトグラフィーのピーク面積比を、Ａｎａｌｙｓｔ１．５ソフトウェアで求める。
【０１０７】
こうして、ＰＳＡ量が０から１０００ｎｇ／ｍｌの範囲のポイントで、天然及び重ペプチドＬＳＥＰＡＥＬＴＤＡＶＫ（配列番号５０）のｙ５、ｙ６、ｙ７−Ｈ２Ｏ、ｙ７及びｙ８イオンの総和のシグナルを測定することにより、下記表５を得ることができる。
【０１０８】
【表５】
【０１０９】
これらの結果から、図３に示す較正曲線を作成することができる。この曲線は、線形回帰を用いて、方程式（ｙ＝０．０２０８（Ｘ天然／Ｘ重）＋０．０１５４）としてモデル化される。当該方程式により、ＰＳＡ量が未知の任意のヒト血清サンプルについてＰＳＡ濃度を算出できる。
【０１１０】
例として、以下の患者の血清を分析し、表６に示す量が得られる。
【０１１１】
【表６】
【０１１２】
実施例３：外部若しくは内部較正を用いたＭＲＭ３、又は、ＥＬＩＳＡによって得られた血清ＰＳＡの定量分析の比較
患者の血清（その外部又は内部較正を用いたＭＲＭ３による分析はそれぞれ実施例１及び２に記載済みである）を、一方ではＶｉｄａｓ（登録商標）ＴＰＳＡキット（ビオメリュー、フランス、マーシー・レトワール）及びＶｉｄａｓ（登録商標）自動分析器を用いて、他方では総ＰＳＡキット及びＭｏｄｕｌａｒ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ Ｅ１７０自動分析器（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、ドイツ、マンハイム）を用いてＥＬＩＳＡで分析する。いずれの場合も、製造業者によって記載されたプロトコルを用いる。これらの血清は、前立腺癌（ＰＣａ）又は良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）に罹患した患者に対応している。表７に示すように、これらの３つの分析方法によって得られた量の比較を行う。
【０１１３】
【表７】
【０１１４】
その結果、外部又は内部較正を用いてＭＲＭ３法により求めた量は、従来のＥＬＩＳＡ法によって求めたものに非常に近いＰＳＡ濃度となる。
【０１１５】
なお、この点において、ＥＬＩＳＡ分析では血流中に存在するすべてのＰＳＡ分子を分析しているわけではない。これは、ＰＳＡがα−１抗キモトリプシン（ＡＣＴ）及びα−２マクログロブリン（Ａ２Ｍ）等のある種の血液抗プロテアーゼとともに複合体を形成するからである。Ａ２Ｍと結合したＰＳＡをＥＬＩＳＡでは検出することができないが、Ｔ．Ｆｏｒｔｉｎら（ＭＣＰ，２００８，Ｅ−ｐｕｂ）によって確認されているように、質量分析では分析可能である。ＰＳＡ−Ａ２Ｍ複合体は、総ＰＳＡの約１０％を占めるが、患者の病的状態によってこの量は変化し得る。このＰＳＡの特有の性質が、ＥＬＩＳＡ法とＭＲＭ３法との間で認められた量の差の原因の一つである。
【０１１６】
実施例４：ヒト血清中のトレポネーマパリダム組換えタンパク質の定量分析
本実施例は、梅毒の病原菌であるトレポネーマパリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）由来のタンパク質であり、組み換えにより発現させた２種類のタンパク質（ビオメリュー、フランス、マーシー・レトワール）を用いて行う。組換えタンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏでの発現及び精製を容易にするために、トレポネーマパリダムタンパク質の天然配列は、製造業者により修飾されている。用いた２種類のタンパク質の正確な配列を以下に示す。
【０１１７】
Ｔｐ４３５梅毒の配列
配列番号５１：
ＭＲＧＳＡＣＶＳＣＴＴＶＣＰＨＡＧＫＡＫＡＥＫＶＥＣＡＬＫＧＧＩＦＲＧＴＬＰＡＡＤＣＰＧＩＤＴＴＶＴＦＮＡＤＧＴＡＱＫＶＥＬＡＬＥＫＫＳＡＰＳＰＬＴＹＲＧＴＷＭＶＲＥＤＧＩＶＥＬＳＬＶＳＳＥＱＳＫＡＰＨＥＫＥＬＹＥＬＩＤＳＮＳＶＲＹＭＧＡＰＧＡＧＫＰＳＫＥＭＡＰＦＹＶＬＫＫＴＫＫＧＳＳＫＹＫＹＨＨＨＨＨ
【０１１８】
Ｔｐ５７４梅毒の配列
配列番号５２：
ＭＲＧＳＡＨＨＥＴＨＹＧＹＡＴＬＳＹＡＤＹＷＡＧＥＬＧＱＳＲＤＶＬＬＡＧＮＡＥＡＤＲＡＧＤＬＤＡＧＭＦＤＡＶＳＲＡＴＨＧＨＧＡＦＲＱＱＦＱＹＡＶＥＶＬＧＥＫＶＬＳＫＱＥＴＥＤＳＲＧＲＫＫＷＥＹＥＴＤＰＳＶＴＫＭＶＲＡＳＡＳＦＱＤＬＧＥＤＧＥＩＫＦＥＡＶＥＧＡＶＡＬＡＤＲＡＳＳＦＭＶＤＳＥＥＹＫＩＴＮＶＫＶＨＧＭＫＦＶＰＶＡＶＰＨＥＬＫＧＩＡＫＥＫＦＨＦＶＥＤＳＲＶＴＥＮＴＮＧＬＫＴＭＬＴＥＤＳＦＳＡＲＫＶＳＳＭＥＳＰＨＤＬＶＶＤＴＶＧＴＧＹＨＳＲＦＧＳＤＡＥＡＳＶＭＬＫＲＡＤＧＳＥＬＳＨＲＥＦＩＤＹＶＭＮＦＮＴＶＲＹＤＹＹＧＤＤＡＳＹＴＮＬＭＡＳＹＧＴＫＨＳＡＤＳＷＷＫＴＧＲＶＰＲＩＳＣＧＩＮＹＧＦＤＲＦＫＧＳＧＰＧＹＹＲＬＴＬＩＡＮＧＹＲＤＶＶＡＤＶＲＦＬＰＫＹＥＧＮＩＤＩＧＬＫＧＫＶＬＴＩＧＧＡＤＡＥＴＬＭＤＡＡＶＤＶＦＡＤＧＱＰＫＬＶＳＤＱＡＶＳＬＧＱＮＶＬＳＡＤＦＴＰＧＴＥＹＴＶＥＶＲＦＫＥＦＧＳＶＲＡＫＶＶＡＱＳＳＫＹＫＴＨＨＨＨＨＨ
【０１１９】
Ｂｉｏ−Ｒａｄ社（アメリカ合衆国、カリフォルニア州、ハーキュリーズ）の「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ」試薬を用いて、ブラッドフォード法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．Ｍ．（１９７６）Ａ Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｇｒａｍ Ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｔｈｅ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｄｙｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８−２５４）に従ったタンパク質分析により、Ｔｐ４３５及びＴｐ５７４について組換えタンパク質量を求める。
【０１２０】
結果、Ｔｐ４３５タンパク質バッチの量は０．９７ｍｇ／ｍｌであり、Ｔｐ５７４タンパク質バッチの量は１．４ｍｇ／ｍｌである。
【０１２１】
Ｔｐ４３５及びＴｐ５７４組換えタンパク質を以下の方法で消化する。
・各タンパク質８０μｇをサンプリングし、ｐＨ＝８．０の５０ｍＭ重炭酸アンモニウム緩衝液を添加し、最終的に４００μｌとなるようにする。
・１５０ｍＭのＤＴＴ１００μｌを添加する。
・９５℃で２０分間培養する。
・６０℃で２０分間培養する。
・サンプルを常温に冷却する。
・１５０ｍＭヨードアセトアミド１００μｌを添加する。
・常温、暗所で４０分間培養する。
・トリプシン４μｇを添加する。
・３７℃で４時間培養する。
・消化終了時の各タンパク質消化産物の濃度は１３３．３μｇ／ｍｌである。
【０１２２】
「健康」とされる患者（フランス血液銀行［Ｆｒｅｎｃｈ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋ］）の血清１００μｌを８サンプル、以下のプロトコルに従って同時に消化する。
・１００μｌの各血清を、ｐＨ＝８．０の５０ｍＭ重炭酸アンモニウム３ｍｌで希釈する。
・ＤＴＴを最終濃度が１５ｍＭとなるように添加する。
・６０℃で４０分間還元する。
・チューブを常温に冷却する。
・ヨードアセトアミドを最終濃度が２５ｍＭとなるように添加する。
・暗所、常温で４０分間、アルキル化を行う。
・１／３０の質量比でトリプシンを添加する。
・３７℃で４時間、消化を行う。
・ＤＴＴを最終濃度が１０ｍＭとなるように再添加する。
・６０℃で４０分間還元する。
・チューブを常温に冷却する。
・ヨードアセトアミドを最終濃度が１５ｍＭとなるように再添加する。
・暗所、常温でアルキル化を行う。
・１／３０の比でトリプシンを再添加する。
・３７℃で一晩、消化を行う。
・ギ酸（すなわち最終濃度の０．１％）でサンプルを酸性化する。
・メタノール１ｍｌ、次いで「超純」水／０．１％ギ酸の１ｍｌでＷａｔｅｒｓ社Ｏａｓｉｓ ＨＬＢカラムを平衡化する。
・サンプルを投入し、重力で流す。
・１ｍｌの水／０．１％ギ酸混合物で洗浄する。
・水／０．１％ギ酸混合物中の８０％メタノール１ｍｌで溶出する。
・体積が約５００μｌになるまで、ＳｐｅｅｄＶａｃ（登録商標）ＳＰＤ２０１０型のエバポレータ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ社、アメリカ合衆国、マサチューセッツ州、ウォルサム）で１時間、チューブを乾燥させる。
・均質な消化血清プールを得るために、処理した血清のチューブ８本を混合する。
【０１２３】
以下の較正範囲を調製する。
・１３３．３μｇ／ｍｌのＴｐ５７４タンパク質５０μｌを１３３．３μｇ／ｍｌのＴｐ４３５タンパク質５０μｌに添加する。Ｔｐ５７４及びＴｐ４３５タンパク質それぞれの濃度が２６．６μｇ／ｍｌとなる原液が得られるように、０．１％ギ酸が添加された水４００μｌに上記混合物をすべて添加する（原液）。そして、各タンパク質が１００００ｎｇ／ｍｌの溶液が得られるように、上記原液７５μｌを０．１％ギ酸が添加された水１２５μｌで希釈する。
・５０００ｍｇ／ｍｌの溶液が得られるように、上記原液３７．５μｌを０．１％ギ酸が添加された水１６２．５μｌで希釈する。
・１０００ｎｇ／ｍｌの溶液が得られるように、上記１０μｇ／ｍｌの溶液２０μｌを水１８０μｌで希釈する。
・１００ｎｇ／ｍｌの溶液が得られるように、上記１μｇ／ｍｌの溶液２０μｌを水１８０μｌで希釈する。
・１０ｎｇ／ｍｌの溶液が得られるように、上記１００ｎｇ／ｍｌの溶液２０μｌを水１８０μｌで希釈する。
・５００ｎｇ／ｍｌの溶液が得られるように、上記５μｇ／ｍｌの溶液２０μｌを水１８０μｌで希釈する。
・５０ｎｇ／ｍｌの溶液が得られるように、上記５００ｎｇ／ｍｌの溶液２０μｌを水１８０μｌで希釈する。
・１、５、１０、５０、１００、５００及び１０００ｎｇ／ｍｌのポイントを含む標準範囲を得るために、消化前の血清１００μｌに相当する消化された血清サンプルの７つ分に対してそれぞれ、上記の１００００から５０ｎｇ／ｍｌの各溶液１０μｌを添加する。
・０ｎｇ／ｍｌの範囲ポイントを得るために、上記血清サンプルの最後の分に水１０μｌを添加する。
【０１２４】
上記サンプル及びその各範囲ポイントを、以下のクロマトグラフィーパラメーターを用い、質量分析計の設定が異なる２つの期間で分析する。
・Ｄｉｏｎｅｘ社（アメリカ合衆国、カリフォルニア州、サニーベール）のＵｌｔｉｍａｔｅ３０００クロマトグラフィーシステム
・Ｗａｔｅｒｓ社のＳｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ１８カラム（内径２．１ｍｍ、長さ１００ｍｍ、粒子径３．５μｍ）
・溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ＋０．１％ギ酸
・溶媒Ｂ：ＡＣＮ＋０．１％ギ酸
【０１２５】
下記表８に定義するＨＰＬＣ勾配：
【０１２６】
【表８】
【０１２７】
期間１は、Ｔｐ４３５タンパク質のプロテオタイピックペプチドＳＡＰＳＰＬＴＹＲ（配列番号５３）のモニタリングに相当する。期間２は、Ｔｐ５７４タンパク質のプロテオタイピックペプチドＦＶＰＶＡＶＰＨＥＬＫ（配列番号５４）のモニタリングに相当する。
【０１２８】
各プロテオタイピックペプチドについて、以下の機械パラメーターに従って、１番目にプロリンを有する二価一次フラグメントが選択され、断片化される。
【０１２９】
Ｔｐ４３５タンパク質のための期間１：
以下のパラメーターを除けば、機械パラメーターは実施例１と同じである。
プリカーサー：４９６．５０Ｄａ
一次イオン：４１７．５０Ｄａ
Ｑ３入力バリア：４．００Ｖ
走査開始質量（Ｄａ）：４３０．００Ｄａ
走査終了質量（Ｄａ）：７５０．００Ｄａ
時間（秒）：０．０３２０秒
トラッピング無線周波数振幅（開始）：２．８８
トラッピング無線周波数振幅（終了）：４．１０
イオントラップ出力電圧（開始）：−１４２．０７Ｖ
イオントラップ出力電圧（終了）：−１２９．１３Ｖ
源温度：４５０．００℃
加熱ガス：５０．００ｐｓｉ
クラスタ分離電位：８０．００Ｖ
衝突エネルギー：１８．００ｅＶ
励起エネルギー（ＡＦ２）：０．１２
【０１３０】
Ｔｐ５７４タンパク質のための期間２：
以下のパラメーターを除けば、機械パラメーターは期間１と同じである。
プリカーサー：６１８．４０Ｄａ
一次イオン：４９５．５０Ｄａ
走査開始質量（Ｄａ）：５００．００Ｄａ
走査終了質量（Ｄａ）：８５０．００Ｄａ
時間（秒）：０．０３５０秒
トラッピング無線周波数振幅（開始）：３．１５
トラッピング無線周波数振幅（終了）：４．４８
イオントラップ出力電圧（開始）：−１３９．２４Ｖ
イオントラップ出力電圧（終了）：−１２５．０９Ｖ
クラスタ分離電位：９０．００Ｖ
衝突エネルギー：２５．００ｅＶ
励起エネルギー（ＡＦ２）：０．０９
【０１３１】
５から５０ｎｇ／ｍｌの各範囲ポイントについて、Ｔｐ４３５タンパク質のプロテオタイピックペプチドＳＡＰＳＰＬＴＹＲ（配列番号５３）のｙ３及びｙ５イオン（ｍ／ｚ６４９．４及び４３９．４）の総和のシグナルを測定することにより、下記表９を得ることができた。
【０１３２】
【表９】
【０１３３】
５から５０ｎｇ／ｍｌの各範囲ポイントについて、Ｔｐ５７４タンパク質のプロテオタイピックペプチドＦＶＰＶＡＶＰＨＥＬＫ（配列番号５４）のｙ５及びｙ７イオン（ｍ／ｚ６２３．４及び７９３．４）の総和のシグナルを測定することにより、下記表１０を得ることができた。
【０１３４】
【表１０】
【０１３５】
これらの結果から、図４Ａ及び４Ｂにそれぞれ示すＴｐ４３５タンパク質用及びＴｐ５７４タンパク質用の較正曲線を作成することができる。
【０１３６】
これらの曲線は、線形回帰を用いて方程式としてモデル化され、当該方程式により、Ｔｐ４３５量又はＴｐ５７４量が未知の任意のヒト血清サンプルについて、Ｔｐ４３５及びＴｐ５７４濃度を算出できる。
【０１３７】
Ｔｐ４３５濃度は、次の方程式によって算出される。
ｙ＝４．１４×１０５Ｘ−１．５×１０６
【０１３８】
Ｔｐ５７４濃度は、次の方程式によって算出される。
ｙ＝４．３８×１０４Ｘ−１．５×１０５
【０１３９】
実施例５：一次フラグメントとして二価イオンを用いたＭＲＭ３法による定量分析の性能レベルの改善
同じサンプル処理条件の下で、従来のＭＲＭ分析、又は二価一次フラグメントを用いないＭＲＭ３分析で得られた性能レベルと、実施例４において得られた分析性能レベルを比較する。各タンパク質について、上記３つの方法を用いて同じプロテオタイピックペプチド、すなわち、ＰＳＡについてはペプチドＬＳＥＰＡＥＬＴＤＡＶＫ（配列番号５０）、Ｔｐ４３５タンパク質についてはペプチドＳＡＰＳＰＬＴＹＲ（配列番号５３）、Ｔｐ５７４タンパク質についてはペプチドＦＶＰＶＡＶＰＨＥＬＫ（配列番号５４）を分析する。
【０１４０】
１３３．３μｇ／ｍｌのＴｐ５７４タンパク質５０μｌと、１３３．３μｇ／ｍｌのＴｐ４３５タンパク質５０μｌと、１３３．３μｇ／ｍｌのＰＳＡタンパク質５０μｌと、０．１％ギ酸が添加された水３５０μｌとを含む原液を用いて実施例４のプロトコルに従って調製されたサンプルに対して分析を行う。
【０１４１】
上記３種のタンパク質に対して、実施例４に記載されたクロマトグラフィー法及び質量分析法を使用して、二価一次フラグメントを用いたＭＲＭ３分析を行う。質量分析計の設定は、各プロテオタイピックペプチドに適した設定にあたる３つの期間において決定される。本実施例において、この分析を方法１と呼ぶ。
【０１４２】
一価一次フラグメントを用いたＭＲＭ３分析は、ｍ／ｚが６３６．８のＰＳＡのプロテオタイピックペプチドに対してはｙ９イオン（９４３．５ｍ／ｚ）を、ｍ／ｚが４９６．８のＴｐ４３５のプロテオタイピックペプチドに対してはｙ５イオン（６４９．２ｍ／ｚ）を、ｍ／ｚが６１８．８のＴｐ５７４のプロテオタイピックペプチドに対してはｙ５イオン（６２３．３ｍ／ｚ）を用いて行う。クロマトグラフィーのピークは、以下の二次フラグメントのシグナルを足し合わせることによって得られる：ＰＳＡのプロテオタイピックペプチドに対してはｍ／ｚ６０９＋６２７＋６４６＋６９８の二次フラグメントのシグナル、Ｔｐ４３５のプロテオタイピックペプチドに対してはｍ／ｚ６３１．２＋４５７．４＋４７５．４の二次フラグメントのシグナル、Ｔｐ５７４のプロテオタイピックペプチドに対してはｍ／ｚ４７７．５＋３６４．２＋６０５．４の二次フラグメントのシグナル。本実施例において、この分析を方法２と呼ぶ。
【０１４３】
方法２では、質量分析計の操作が３つの期間に分かれる。
【０１４４】
ＰＳＡのための期間１：
以下のパラメーターを除けば、機械パラメーターは実施例１と同じである。
プリカーサー：６３６．８０Ｄａ
一次イオン：９４３．５０Ｄａ
走査開始質量（Ｄａ）：６００．００Ｄａ
走査終了質量（Ｄａ）：８００．００Ｄａ
時間（秒）：０．０２００秒
トラッピング無線周波数振幅（開始）：３．５３
トラッピング無線周波数振幅（終了）：４．２９イオントラップ出力電圧（開始）：−１３５．２０Ｖ
イオントラップ出力電圧（終了）：−１２７．１１Ｖ
源温度：４５０．００℃
加熱ガス：５０．００ｐｓｉ
クラスタ分離電位：１２０．００Ｖ
Ｑ０前の入力電位：４．００Ｖ
衝突エネルギー：２３．００ｅＶ
励起エネルギー（ＡＦ２）：０．１２
【０１４５】
Ｔｐ４３５タンパク質のための期間２：
以下のパラメーターを除けば、機械パラメーターは期間１と同じである。
プリカーサー：４９６．５０Ｄａ
一次イオン：６４９．２０Ｄａ
Ｑ３入力バリア：４．００Ｖ
走査開始質量（Ｄａ）：４３０．００Ｄａ
走査終了質量（Ｄａ）：６４０．００Ｄａ
時間（秒）：０．０２１０秒
トラッピング無線周波数振幅（開始）：２．８８
トラッピング無線周波数振幅（終了）：３．６８
イオントラップ出力電圧（開始）：−１４２．０７Ｖ
イオントラップ出力電圧（終了）：−１３３．５８Ｖ
クラスタ分離電位：８０．００Ｖ
衝突エネルギー：２３．００ｅＶ
励起エネルギー（ＡＦ２）：０．１２
【０１４６】
Ｔｐ５７４タンパク質のための期間３：
以下のパラメーターを除けば、機械パラメーターは期間１と同じである。
プリカーサー：６１８．４０Ｄａ
一次イオン：６２３．３０Ｄａ
Ｑ３入力バリア：４．００Ｖ
走査開始質量（Ｄａ）：３５０．００Ｄａ
走査終了質量（Ｄａ）：６２０．００Ｄａ
時間（秒）：０．０２７０秒
トラッピング無線周波数振幅（開始）：２．５８
トラッピング無線周波数振幅（終了）：３．６０
イオントラップ出力電圧（開始）：−１４５．３０Ｖ
イオントラップ出力電圧（終了）：−１３４．３９Ｖ
衝突エネルギー：３５．００ｅＶ
励起エネルギー（ＡＦ２）：０．１０
【０１４７】
ＭＲＭ分析は、ｍ／ｚが６３６．８のＰＳＡのプロテオタイピックペプチドに対してはｙ９イオン（９４３．５ｍ／ｚ）を、ｍ／ｚが４９６．８のＴｐ４３５のプロテオタイピックペプチドに対してはｙ５イオン（６４９．２ｍ／ｚ）を、ｍ／ｚが６１８．８のＴｐ５７４のプロテオタイピックペプチドに対してはｙ５イオン（６２３．３ｍ／ｚ）を用いて行う。本実施例において、この分析を方法３と呼ぶ。
【０１４８】
方法３において、質量分析パラメーターは以下のとおりである。
走査タイプ：ＭＲＭ（ＭＲＭ）
極性：正
イオン源：Ｔｕｒｂｏ Ｖ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社）
Ｑ１設定：ユニット分解能でフィルタリング
Ｑ３設定：ユニット分解能でフィルタリング
２回の走査間の中断：５．００７ミリ秒
Ｑ１質量（Ｄａ）：４９６．２０
Ｑ３質量（Ｄａ）：６４９．３０
走査時間：３０．００
クラスタ分離電位：１１０Ｖ
衝突エネルギー：２５ｅＶ
衝突セル出力電位：１０Ｖ
【０１４９】
Ｑ１質量（Ｄａ）：６３６．８
Ｑ３質量（Ｄａ）：９４３．５
走査時間：３５．００
クラスタ分離電位：１１５Ｖ
衝突エネルギー：２３ｅＶ
衝突セル出力電位：２２Ｖ
【０１５０】
Ｑ１質量（Ｄａ）：６１８．４
Ｑ３質量（Ｄａ）：６２３．４
走査時間：３５．００
クラスタ分離電位：１２０Ｖ
衝突エネルギー：２９ｅＶ
衝突セル出力電位：１０Ｖ
【０１５１】
カーテンガス：５０．００ｐｓｉ
コーン電圧：５５００．００Ｖ
源温度：５００．００℃
噴霧ガス：５０．００ｐｓｉ
加熱ガス：４０．００ｐｓｉ
衝突セル充填：９．００（任意単位）
Ｑ０前の入力電位：５．００Ｖ
【０１５２】
表１１に示すように、バックグラウンドノイズで割ったシグナルの比が１０となるタンパク質量を算出することによって、上記３種のタンパク質の定量限界が求められる。
【０１５３】
【表１１】
【０１５４】
本発明に記載の方法で得られた定量限界は、方法２及び３で得られたものよりはるかに低い。従って、本発明では、他の方法より感度のよい定量分析となる。
【０１５５】
実施例６：衝突エネルギー最適化
ＭＲＭ３を実施するために、プリカーサーイオン及び一次フラグメントの選択は不可欠である。必ずしも最も強度の強い一次フラグメントを選択する必要はない。本発明において、プロリン又はヒスチジンを有する二価イオンは、より特異的な断片化を示し、ＭＳ３において生成される二次フラグメントがより少なくなること、及び、それらが最も有効な定量分析を行うのにはるかに適していることが実証された。
【０１５６】
例として、Ｔｐ４３５タンパク質のプロテオタイピックペプチドＳＡＰＳＰＬＴＹＲ（配列番号５３）の衝突エネルギーを最適化した。
【０１５７】
Ｔｐ４３５タンパク質５０μｌを消化し、Ｗａｔｅｒｓ社Ｏａｓｉｓ ＨＬＢカラムで脱塩し、０．１％ギ酸を添加したＡＣＮ／水の５０／５０混合物３００μｌに添加する。そして、その混合物を流量１０μｌ／分で質量分析計へ投入する。
【０１５８】
機械パラメーターは以下のとおりである。
走査タイプ：高感度プロダクトイオン（Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｉｏｎ（ＥＰＩ））
極性：正
走査モード：プロファイル
イオン源：Ｔｕｒｂｏ Ｖ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）
プリカーサー：４９６．２０Ｄａ
Ｑ１の分解能：ユニット
走査速度：１００００Ｄａ／秒
Ｑ０でのトラッピング：無
Ｑ３での線形イオントラップ充填時間：１．００ミリ秒
動的充填：アクティブ
ＴＩＣ標的 ＥＭＳ走査：１０．００×１０７カウント
ＴＩＣ標的：１０．００×１０７カウント
最大充填時間：２５０．０００ミリ秒
最小充填時間：０．０５０ミリ秒
初期設定充填時間：１．０００ミリ秒
Ｑ３入力電圧：８．００Ｖ
Ｑ３でのイオントラップ走査増分：０．１２Ｄａ
走査開始質量（Ｄａ）：２００．００Ｄａ
走査終了質量（Ｄａ）：６６７．０１Ｄａ
時間（秒）：０．０４６７秒
トラッピング無線周波数振幅（開始）：２．１９
トラッピング無線周波数振幅（終了）：３．８２
イオントラップ出力電圧（開始）：−１４９．３５Ｖ
イオントラップ出力電圧（終了）：−１２５．６８Ｖ
走査開始質量（Ｄａ）：６６７．０１Ｄａ
走査終了質量（Ｄａ）：１０００Ｄａ
時間（秒）：０．０３３３秒
トラッピング無線周波数振幅（開始）：３．８２
トラッピング無線周波数振幅（終了）：４．９９
イオントラップ出力電圧（開始）：−１２５．６８Ｖ
イオントラップ出力電圧（終了）：−１０８．８０Ｖ
カーテンガス：３０．００ｐｓｉ
コーン電圧：５５００．００Ｖ
源温度：常温
噴霧ガス：１８．００ｐｓｉ
加熱ガス：常温
衝突セル充填：高
クラスタ分離電位：１００．００Ｖ
Ｑ０前の入力電位：１０．００Ｖ
衝突エネルギー：５〜６０ｅＶ
【０１５９】
衝突エネルギーを４０ｅＶとする場合（図５Ａ）、衝突エネルギーが３５又は３０ｅＶ（それぞれ図５Ｂ及び５Ｃ）での断片化と比較して、Ｎ末端の位置にプロリンを有する二価一次フラグメントに相当するフラグメント４１７．２の強度があまり強くないことがわかる。一次フラグメント４１７．２の強度が低下すると、他のフラグメントの強度は増加する。従って、最も強度の強い一次フラグメント、すなわち一価一次フラグメントに相当する６４９．５Ｄａのものを選択し、衝突エネルギーを４０ｅＶとすることが好ましい。しかしながら、図５Ｄに見られる衝突エネルギーの最適化に示されるように、この選択が最適ではない。
【０１６０】
１０μｌ／分で投入し、衝突エネルギーのみを５から６０ｅＶに変化させることによって、衝突エネルギーの最適化を行う。前のパラメーターとの違いは、Ｑ１において質量４９６．５Ｄａを選択し、Ｑ３において質量４１７．８又は６４９．５を選択するサイクルタイム１００秒のＭＲＭタイプの走査モードとすること、及び、以下のパラメーターの調整だけである。
噴霧ガス：３５．００
クラスタ分離電位：８０．００
Ｑ０前の入力電位：３．００
【０１６１】
Ｎ末端の位置にプロリンを有する二価フラグメントに相当する遷移４９６．３／４１７．８、及び、最も強度の強い一価フラグメントに相当する遷移４９６．３／６４９．５の衝突エネルギーを最適化することによって、図５Ｄに示すように、実施例４に対応する分析において遷移４９６．３／４１７．８ではシグナルに著しい利点が得られる。
【０１６２】
このシグナルの利点は、表１２に示されるように、定量限界がより低いという特徴を有する、分析性能レベルがより高い定量分析を反映したものである。
【０１６３】
【表１２】
【０１６４】
質量分析パラメーターを最適化した場合、本発明に記載の方法に従って二価一次イオンで得られた定量限界は、一価一次イオンで得られたものよりはるかに低い。従って、二価一次イオンを用いる上記方法によって、より感度のよい定量方法を行うことが可能となる。
【０１６５】
実施例７：一次フラグメントとして二価イオンを用いたＭＲＭ３法による定量分析の性能レベルの改善
プロリンを２個有し、そのうち１個は２番目にあるＴｐ４３５タンパク質のプロテオタイピックペプチドＳＡＰＳＰＬＴＹＲ（配列番号５３）の断片化を、最も強度の強いフラグメントイオン、又はプロリンを有する一価型フラグメントイオン、又は同イオンの二価型のいずれかを一次イオンとして選択することにより比較した。
【０１６６】
最も強度の強い一価一次イオンは、ｍ／ｚ６４９．２のｙ５イオンである。プロリンを有する一価型又は二価型一次フラグメントイオンは、一価型がｍ／ｚ８３３．４の、二価型がｍ／ｚ４１７．５のｙ７イオンである。
【０１６７】
Ｔｐ４３５タンパク質５０μｌを消化し、Ｗａｔｅｒｓ社Ｏａｓｉｓ ＨＬＢカラムで脱塩し、０．１％ギ酸を添加したＡＣＮ／水の５０／５０混合物３００μｌに添加する。その後、その混合物を流量１０μｌ／分で質量分析計へ投入する。
【０１６８】
機械パラメーターは以下のとおりである。
最も強度の強い一価一次イオンのＭＳ３の場合：
走査タイプ：ＭＳ３
極性：正
走査モード：プロファイル
イオン源：Ｔｕｒｂｏ Ｖ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）
プリカーサー：４９６．３０Ｄａ
一次イオン：６４９．３０Ｄａ
Ｑ１の分解能：ユニット
走査速度：１００００Ｄａ／秒
Ｑ０でのトラッピング：有
Ｑ３での線形イオントラップ充填時間：１５０．００ミリ秒
動的充填：無
断片化：有
励起時間：２５．００ミリ秒
Ｑ３入力電圧：８．００Ｖ
Ｑ３でのイオントラップ走査増分：０．１２Ｄａ
走査開始質量（Ｄａ）：２５０．００Ｄａ
走査終了質量（Ｄａ）：６４０．００Ｄａ
トラッピング無線周波数振幅（開始）：３．０８トラッピング無線周波数振幅（終了）：４．３６
イオントラップ出力電圧（開始）：−１４４．９９Ｖイオントラップ出力電圧（終了）：−１２２．１９Ｖカーテンガス：２０．００ｐｓｉ
コーン電圧：５５００．００Ｖ
源温度：常温
噴霧ガス：３５．００ｐｓｉ
加熱ガス：常温
衝突セル充填：高
クラスタ分離電位：１１０．００Ｖ
Ｑ０前の入力電位：１０．００Ｖ
衝突エネルギー：２４ｅＶ
励起エネルギー：０．１１ｅＶ
【０１６９】
一価一次イオンｙ７のＭＳ３の場合：
走査タイプ：ＭＳ３
極性：正
走査モード：プロファイル
イオン源：Ｔｕｒｂｏ Ｖ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）
プリカーサー：４９６．３０Ｄａ
一次イオン：８３３．４０Ｄａ
Ｑ１の分解能：ユニット
走査速度：１００００Ｄａ／秒
Ｑ０でのトラッピング：有
Ｑ３での線形イオントラップ充填時間：１５０．００ミリ秒
動的充填：無
断片化：有
励起時間：２５．００ミリ秒
Ｑ３入力電圧：８．００Ｖ
Ｑ３でのイオントラップ走査増分：０．１２Ｄａ
走査開始質量（Ｄａ）：３００．００Ｄａ
走査終了質量（Ｄａ）：８２０．００Ｄａ
トラッピング無線周波数振幅（開始）：３．２４
トラッピング無線周波数振幅（終了）：４．９５
イオントラップ出力電圧（開始）：−１４２．０６Ｖ
イオントラップ出力電圧（終了）：−１１１．６６Ｖ
カーテンガス：２０．００ｐｓｉ
コーン電圧：５５００．００Ｖ
源温度：常温
噴霧ガス：３５．００ｐｓｉ
加熱ガス：常温
衝突セル充填：高
クラスタ分離電位：１１０．００Ｖ
Ｑ０前の入力電位：１０．００Ｖ
衝突エネルギー：２４ｅＶ
励起エネルギー：０．１４ｅＶ
【０１７０】
二価一次イオンｙ７のＭＳ３の場合：
走査タイプ：ＭＳ３
極性：正
走査モード：プロファイル
イオン源：Ｔｕｒｂｏ Ｖ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）
プリカーサー：４９６．３０Ｄａ
一次イオン：４１７．５０Ｄａ
Ｑ１の分解能：ユニット
走査速度：１００００Ｄａ／秒
Ｑ０でのトラッピング：有
Ｑ３での線形イオントラップ充填時間：１５０．００ミリ秒
動的充填：無
断片化：有
励起時間：２５．００ミリ秒
Ｑ３入力電圧：８．００Ｖ
Ｑ３でのイオントラップ走査増分：０．１２Ｄａ
走査開始質量（Ｄａ）：３００．００Ｄａ
走査終了質量（Ｄａ）：８５０．００Ｄａ
トラッピング無線周波数振幅（開始）：３．２４
トラッピング無線周波数振幅（終了）：５．０５
イオントラップ出力電圧（開始）：−１４２．０６Ｖ
イオントラップ出力電圧（終了）：−１０９．９１Ｖ
カーテンガス：２０．００ｐｓｉ
コーン電圧：５５００．００Ｖ
源温度：常温
噴霧ガス：３５．００ｐｓｉ
加熱ガス：常温
衝突セル充填：高
クラスタ分離電位：１１０．００Ｖ
Ｑ０前の入力電位：１０．００Ｖ
衝突エネルギー：２５ｅＶ
励起エネルギー：０．１２ｅＶ
【０１７１】
図６Ａに示すように、ｍ／ｚ＝６４９．２の最も強度の強い一価一次フラグメントイオンでは、上述の場合のようにＭＳ３で行われた断片化は非常に複雑であり、すべての二次断片化ピークにシグナルが分かれている。ＭＳ３スペクトルの最も強度の強いピークは、３．２×１０５カウントである。
【０１７２】
図６Ｂに示すように、ｍ／ｚ＝８３３．４の一価一次フラグメントイオンｙ７では、得られた断片化スペクトルは非常に複雑であり、多くの二次断片化ピークを含む。ＭＳ３スペクトルの最も強度の強いピークは、３．８×１０５カウントである。
【０１７３】
図６Ｃに示すように、ｍ／ｚ＝４１７．５の二価一次イオンｙ７では、行われた断片化がはるかに単純であり、シグナルは５つの大きなピークに集約されている。大きなピークのシグナルは、７．３×１０６カウントである。
【０１７４】
これによって、本発明に従ってペプチドを選択することにより、より感度のよい分析を行うことができ、この選択が実施例５において認められた感度の利点をもたらす要因であることが示される。
【０１７５】
ＭＲＭ３を行うために、一次フラグメントの選択は不可欠である。本実施例において示されるように、必ずしも最も強度の強い一次フラグメントを選択する必要はない。また、プリカーサーイオンの選択も重要である。本発明において、２個のプロリン、又は、１個のプロリンと１個のヒスチジンとを有する二価プリカーサーイオンが、より特異的な断片化を示し、ＭＳ３において生成される二次フラグメントがより少なくなること、及び、それらが最も有効な定量分析を行うのにはるかに適していることが実証された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の定量分析の技術分野に関する。とりわけ、本発明は質量分析によるタンパク質の新規な定量分析法に関する。
【背景技術】
【０００２】
患者から採取した血液サンプル（血清、血漿）等の複雑流体中のタンパク質の分析が、診断において極めて重要であるため、タンパク質を定量分析するための技術が多く開発されている。現在、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫吸着法）が最も広く用いられており、種々の既知のＥＬＩＳＡ法の中でも、サンドイッチ反応が最も広く用いられている。これは、標的タンパク質に対する２種の抗体を必要とし、そのうち１種を酵素と結合させる。さらに近年、ＳＲＭ（選択反応モニタリング）や、いくつかのＳＲＭ分析を同時に行う場合にはＭＲＭ（多重反応モニタリング）といった質量分析技術によって、複雑流体中でタンパク質をそのプロテオタイピック（ｐｒｏｔｅｏｔｙｐｉｃ）ペプチドから定量分析することが、出願人他によって実現された（非特許文献１、２、３）。上記質量分析による分析の前工程において、分析対象のタンパク質をペプチドに断片化するために、酵素によって消化する。そして、プロテオタイピックペプチドと呼ばれる、そのタンパク質に固有のペプチドを質量分析によって分析する。
【０００３】
ＥＬＩＳＡ法と比較した場合のＳＲＭ又はＭＲＭによる分析の利点は、分析を実現するための経費及び時間をかなり削減できることであり、特にＥＬＩＳＡ法に必要な抗体を開発する必要がある場合に顕著である。従って、このような質量分析技術は、タンパク質の分析に好適な方法であると思われる。また、上記技術によって、例えば、プロテオーム解析における研究によってマーカー候補と同定された多数のタンパク質の分析という臨床的関心事をより容易に且つより速く実行することができるであろう（非特許文献４）。
【０００４】
ＭＲＭ分析の場合、ＭＲＭモードに特に適した三連四重極型質量分析計では、以下に詳述する原理に基づいて、プロテオタイピックペプチドを定量する。最初に、分析対象のペプチドを含むサンプルをイオン源に導入する。該イオン源では、上記ペプチドが気体状態でイオン化され、本来のペプチドに１つ、２つ又は３つものプロトンが付加し、１価、２価又は３価にもなった「分子」イオンに変換される。例えば、電気スプレー型のイオン源では、上記ペプチドは液体状態から気体状態に変化するのと同時にイオン化される（非特許文献５）。逆相液体クロマトグラフィーによってペプチドが事前に分離されている場合には、この型のイオン源が特に好適である。しかしながら、ペプチドのイオン化率は、種々の含有物の濃度及び性質によって変化し得る。この現象は、当業者には周知のマトリックス効果を反映している。また、ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化法）源では、上記ペプチドを固体状態からイオン化することもできる。
【０００５】
次いで、四重極型分析器（Ｑ１）では、プロテオタイピックペプチドをその質量電荷比（ｍ／ｚ）に基づいてフィルタリングすることができる。目的とするプロテオタイピックペプチドの質量電荷比（該比を（ｍ／ｚ）１とする）を有するペプチドのみが第２の四重極（ｑ２）に送られ、次に行われる断片化のためのプリカーサーイオンとしての役割を果たす。
【０００６】
上記ｑ２分析器は、質量電荷比（ｍ／ｚ）１を有するペプチドを一次フラグメントイオンへと断片化することができる。通常、この断片化は、プリカーサーペプチドと、窒素やアルゴン等の不活性ガスとの衝突によって行われる。
【０００７】
上記一次フラグメントイオンは、特定の質量電荷比（該比を（ｍ／ｚ）２とする）に基づいて一次フラグメントイオンをフィルタリングする第３の四重極（Ｑ３）に送られる。目的とするプロテオタイピックペプチドのフラグメントの特徴である上記質量電荷比（ｍ／ｚ）２を有する一次フラグメントイオンのみが、定量のために検出器に送られる。
【０００８】
この操作モードは、一方ではプリカーサーイオンの選択に、他方では一次フラグメントイオンの選択に関しており、２重の選択性を有している。従って、ＭＲＭモードの質量分析は定量に有利である。
【０００９】
上記一次フラグメントイオンによって誘導され、検出器によって測定される電流の強度は、一次フラグメントイオンの量に比例する。一次フラグメントイオンの量自体は、プリカーサーイオンの量に比例し、プリカーサーイオンの量自体は、分析対象のタンパク質の量に比例する。従って、上記一次フラグメントイオンにより誘導され、測定される電流の量は、分析対象のタンパク質の量に正比例する。しかしながら、上記一次フラグメントイオンにより誘導された電流の量に相当する測定ピークの面積を、対応する一次フラグメントイオンの量、最終的には分析対象のタンパク質の量に相関付けできるようにするためには、較正が必要となる。遷移（トランジション）と呼ばれる（ｍ／ｚ）１及び（ｍ／ｚ）２のペアは、ＭＲＭモード又はＭＳ／ＭＳ（すなわち、ＭＳ２）モードで操作することができる種々の質量分析計のモデルで分析することができる。例として、三連四重極型のモデル（非特許文献２）、又はイオントラップ型のモデル（非特許文献６）、さらには飛行時間型のモデル（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）（非特許文献７）が挙げられる。
【００１０】
タンパク質の分析に利用する遷移は、分析対象のタンパク質に特有のものでなければならず、再現性と信頼性の点で可能な限り感度がよく、可能な限り特異的で、可能な限り頑健性の高い分析となるものでなければならない。このため、それらは十分注意して選択されなければならない。
【００１１】
プロテオタイピックペプチド（ｍ／ｚ）１及び（ｍ／ｚ）２の選択のために開発された上記方法では、該選択は本質的に応答の強度に基づく。詳細は非特許文献８を参照されたい。また、ペプチド分離の精度、分析の前工程、アミノ酸組成、存在し得る他のタンパク質に同一プリカーサーペプチドが含まれないこと、及び、プリカーサーペプチドの電荷状態も上記選択で考慮される因子である。通常、プリカーサーイオンの断片化によって生成した質量は、ＭＲＭモード又はＭＳ／ＭＳ（ＭＳ２）のモードで測定される。そして、最も強いシグナルとなる一次フラグメントイオンが選択される。次に、得られるシグナルを最大限にするために、プリカーサーイオン断片化条件及び分析条件が最適化される。Ｑ１においては、二価イオンを選択するのが好適であり、Ｑ３においては、一価一次フラグメントイオン、好ましくは上記二価プリカーサーイオンよりｍ／ｚ比が高い一価一次フラグメントイオンを選択するのが好適であることが知られている。
【００１２】
当業者であれば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＭＩＤＡＳ及びＭＲＭパイロットソフトウェアや、ＭＲＭａｉｄ（非特許文献９）等の市販のソフトウェアを利用して、考え得るすべて遷移ペアを予想できるであろう。また、当業者であれば、Ｆ．Ｄｅｓｉｅｒｅら（非特許文献１０）によって構築されたＰｅｐｔｉｄｅＡｔｌａｓと呼ばれるデータベースを利用して、科学界によって報告されたペプチドＭＲＭ遷移をすべて集めることができるであろう。このＰｅｐｔｉｄｅＡｔｌａｓデータベースは、インターネット上で無料で入手可能である。
【００１３】
上記（ｍ／ｚ）１及び（ｍ／ｚ）２プロテオタイピックペプチドを選択するための他の方法は、他の研究の際に得られたＭＳ／ＭＳ断片化スペクトルを用いることである。この研究としては、例えば、プロテオーム解析によってバイオマーカーを発見及び同定する段階であってもよい。この方法は、ユーザーの集会においてＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社によって提案された（非特許文献９）。これにより、ＳＩＥＶＥソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて、実験的に同定されたペプチドからの遷移候補のリストを作成することができる。上記（ｍ／ｚ）１及び（ｍ／ｚ）２イオンの選択のためのある基準がＪ．Ｍｅａｄら（非特許文献９）によって詳述されており、以下に詳細に説明する。
・内部切断部位、すなわち、内部リシン又はアルギニンを有するペプチドは、そのリシン又はアルギニンの次にプロリンが続くものでなければ、避けるべきである。
・アスパラギン又はグルタミンを有するペプチドは、脱アミノされることがあるので、避けるべきである。
・Ｎ末端にグルタミン又はグルタミン酸を有するペプチドは、自然に環化することがあるので、避けるべきである。
・メチオニンを有するペプチドは、酸化されることがあるので、避けるべきである。
・システインを有するペプチドは、起こり得る変性、還元、及び、チオール官能基のブロッキングといった工程中に再現不可能に修飾されることがあるので、避けるべきである。
・プロリンを有するペプチドは、通常、ＭＳ／ＭＳにおいて非常に顕著な単一ピークを示す強度の強いフラグメントを生成するので、好ましいと考えられるが、単一の非常に顕著なフラグメントでは、複雑な混合物中で遷移の同定を実行することができない。実際、特有のフラグメントがいくつか同時に存在する場合においてのみ、目的とするプリカーサーイオンが実際に検出されることを確認することができる。
・Ｃ末端の隣（ｎ−１番目）、又は、Ｃ末端から２番目（ｎ−２番目）にプロリンを有するペプチドは、通常、一次ペプチドフラグメントのサイズが十分な特異性を有するには小さすぎると考えられるので、避けるべきである。
・プリカーサーより質量が大きいフラグメントを選択することが、特異性を向上させるために好ましい。このためには、二価プリカーサーイオンを選択する必要があり、プリカーサーより質量が大きく、最も強度の強い一次フラグメントイオン、すなわち、一価一次フラグメントイオンを選択する必要がある。
【００１４】
さらに、最も一般的には、複雑流体（血液、血清、血漿、尿、糞便、唾液等）中に数ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれるタンパク質の分析に適合する感度及び特異性を確保するために、質量分析による定量分析に先立って、消化工程に加えて、該消化工程の前後に他の工程をはさむべきである。例えば：
【００１５】
第一段階：分析対象のタンパク質ではない顕著なタンパク質を除去するためのタンパク質分画、又は、任意の好適な方法（電気泳動、クロマトグラフィー、免疫捕捉（非特許文献１１））によるサンプルの精製。しかしながら、後者の方法は、分析対象のタンパク質に対する特異的な抗体の存在又は調製が必要であり、この抗体を得るためには時間及び費用がかかり得る。更に、後に続ける質量分析による分析の性能レベルが、抗体の質及び特異性にある程度影響を受けることになる。
【００１６】
第二段階：変性、還元、及び、チオール官能基のブロッキング。
【００１７】
第三段階：消化。
【００１８】
第四段階：ペプチド分画。
【００１９】
第二段階によって、消化率を向上させることができ、再現性と信頼性の点から、分析のさらに高い頑健性を確保することができる。高い感度を必要としない場合には、第一段階及び第四段階は任意である（非特許文献２）。一方、高い感度が必要な場合（数ｎｇ／ｍｌ）には、それらは不可欠である。このことは、非特許文献１、１２、１１、１３、及び特許文献１に示されている。実際は、Ｑ１及びＱ３の三連四重極の精度を考えると、多くのペプチド（同重体又は擬似的同重体（ｑｕａｓｉ−ｉｓｏｂａｒｉｃ）ペプチド）が、同一の遷移、又は装置の質量の許容誤差に含まれる遷移を生成し得る（非特許文献１４）。この場合、プロテオタイピックペプチドと、同重体又は擬似的同重体混入物とが同時に投入されると、特異性の欠如のために誤った定量が行われる。質量分析の前工程のクロマトグラフィーによるペプチドの分離では、混入したペプチドの数を減少させることにより、特異性のレベルを補強する（非特許文献１５）。しかしながら、この補強的な分画工程は十分でない場合もあり（非特許文献１２）、従って、タンパク質の定量に用いるいかなる遷移も注意深く確認する必要がある。さらに、消化工程に加えて第一、第二、及び第四段階を含む完全な分析方法は、第一又は第四段階で抗体を使用しなければならない場合は特に、時間及び費用がかかる。
【００２０】
さらに最近では、ＭＲＭ３として知られる技術が、タンパク質を検出するために用いられている。この技術は、一次フラグメントイオンを選択すること、及び、二次フラグメントイオンを生成するために、それをさらに断片化することからなる。そして、この二次フラグメントイオンが検出される。Ｊ．Ｎｉｅｓｓｅｎら（非特許文献１６）は、特に以下の三つ組を利用している：プリカーサー／一次フラグメントイオン／二次フラグメントイオン（ＭＲＭ３遷移と称する）配列番号１：ＶＬＬＱＴＬＲ（二価）／配列番号２：ＬＬＱＴＬＲ（二価）／配列番号３：ＬＱＴＬＲ（一価）。しかしながら、著者らは、特にこのＭＲＭ３遷移を選択する理由について考察しておらず、標的タンパク質を分析することなく、その標的タンパク質の存在を単に示すのみに甘んじている。さらに最近では、Ａ．Ｉｚｒａｅｌ−Ｔｏｍａｓｅｖｉｃら（非特許文献１７）が、ＩＦＮ−αの検出のためにＭＳ３を用いている。ＭＳ３は、分析したプロテオタイピックペプチドの性質を示すためにＭＳ３の全スペクトルを用いるという点でＭＲＭ３と異なる。このために、著者らは、ＩＦＮ−α４の検出のために、配列番号４：ＨＤＦＧＦＰＱＥＥＦＧＮＱＦＱＫ（三価）の分子イオンを、２回目の断片化を受ける一次フラグメントイオンとして配列番号５：ＤＦＧＦＰＱＥＥＦＧＮＱＦＱＫ（二価）のイオンｙ１５２＋を選択しており、また、すべてのＩＦＮ−α４のサブタイプに対しては、配列番号６：ＹＳＰＣＡＷＥＶＶＲ（二価）の分子イオンを、２回目の断片化を受ける一次フラグメントイオンとして配列番号７：ＰＣＡＷＥＶＶＲ（二価）のイオンｙ８２＋を選択している。ＭＲＭ３モード及びＭＳ３モードのいずれでも定量分析を行っておらず、著者らは、ＩＦＮ−αのイオントラップ定量は満足のいくものではないことを強調している。著者らは、ＭＳ３において二次フラグメントイオンのシグナル／ノイズ比が改善されるとはしても、カウント数がＦＴ−ＩＣＲよりも１０００倍以上少ないと記載しており、ＳＲＭ（ＭＳ２）法及びＡＭＴ（精密質量−保持時間（Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｍａｓｓ ａｎｄ Ｔｉｍｅ））（断片化を伴わないＭＳ）法が好ましいと結論づけている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２１】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００４／００７２２５１号明細書
【非特許文献】
【００２２】
【非特許文献１】Ｔ．Ｆｏｒｔｉｎら，ＭＣＰ，２００８，Ｅ−ｐｕｂ
【非特許文献２】Ｌ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ＆Ｃ．Ｈｕｎｔｅｒ，ＭＣＰ，２００６，５７３−５８８
【非特許文献３】Ｈ．Ｚｈａｎｇら，ＭＣＰ，２００７，６４−７１
【非特許文献４】Ｓ．Ｃａｒｒ及びＬ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｃｌｉｎ．Ｃｅｍ．２００８，１７４９−１７５２
【非特許文献５】Ｇａｓｋｅｌｌ，Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｓｅ，Ｊ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．（１９９７），３２，６７７−６８８
【非特許文献６】Ｂ．Ｈａｎ及びＲ．Ｈｉｇｇｓ，Ｂｒｉｅｆ Ｆｕｎｃｔ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ．２００８年９月；７（５）：３４０−５４
【非特許文献７】Ｋ．−Ｙ．Ｗａｎｇら，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ，２００８，８０（１６）６１５９−６１６７
【非特許文献８】Ｖ．Ｆｕｓａｒｏら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２７；２００９；１９０−１９８
【非特許文献９】Ｊ．Ｍｅａｄら，ＭＣＰ，２００８年１１月１５日，Ｅ−ｐｕｂ
【非特許文献１０】Ｆ．Ｄｅｓｉｅｒｅら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００６年１月１日；３４（ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ６５５−８
【非特許文献１１】Ｋｕｌａｓｉｎｇａｍら，Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．，２００８，６４０−６４７
【非特許文献１２】Ｈ．Ｋｅｓｈｉｓｈｉａｎら，ＭＣＰ，２００７，２２１２−２２２９
【非特許文献１３】Ｌ．Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．，２００４，２３５−２３４４
【非特許文献１４】Ｊ．Ｓｈｅｒｍａｎら，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２００８，９：１１２０−１１２３
【非特許文献１５】Ｍ．Ｄｕｎｃａｎら，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２００９，９：１１２４−１１２７
【非特許文献１６】Ｊ．Ｎｉｅｓｓｅｎら，ＭＣＰ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２３，２００９，Ｅ−Ｐｕｂ
【非特許文献１７】Ａ．Ｉｚｒａｅｌ−Ｔｏｍａｓｅｖｉｃら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ａｌｐｈａ Ｓｕｂｔｙｐｅｓ ｉｎ Ｓｅｒｕｍ：Ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｉｘｔｕｒｅｓ，インターネット公開日：２００９年４月７日
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２３】
このような現状を鑑みて、本発明は、信頼性があり、実施が容易で、低コストの質量分析法を用いる新規なタンパク質分析方法を提供する。本発明は、ＭＲＭ３を用いるタンパク質分析方法であって、一次フラグメントイオンを特異的に選択することにも基づき、上記のような良好な定量分析が可能となるタンパク質分析方法を提供する。
【００２４】
本発明は、サンプル中の標的タンパク質を定量的に検出するための方法であって、
ａ）ペプチドを生成するために上記サンプルを処理する工程と、
ｂ）上記標的タンパク質から生成した少なくとも１つのプロテオタイピックペプチドを質量分析法によって定量分析する工程とを含み、
上記質量分析法では、
ｉ）上記プロテオタイピックペプチドをイオン化してプリカーサーイオンを生成し、上記プリカーサーイオンをその質量ｍ／ｚに基づいてフィルタリングし、目的とする上記標的タンパク質に応じて所定の質量（ｍ／ｚ）１のプリカーサーイオンを選択し、
ｉｉ）その選択されたプリカーサーイオンを一次フラグメントイオンへと断片化し、
ｉｉｉ）その生成した一次フラグメントイオンをその質量ｍ／ｚに基づいてフィルタリングし、目的とする上記標的タンパク質に応じて所定の質量（ｍ／ｚ）２の一次フラグメントイオンを選択し、
ｉｖ）その選択された一次フラグメントイオンを二次フラグメントイオンへと断片化し、
ｖ）上記二次フラグメントイオンの少なくとも一部を検出し、一連の定量的測定値を得、
ｖｉ）二次フラグメントイオンに関する少なくとも１つの定量的測定値を選択し、上記生成したプロテオタイピックペプチドの量及び上記サンプル中に存在する上記標的タンパク質の量と相関付けを行い、ここで、
選択された上記質量（ｍ／ｚ）２の一次フラグメントイオンは、プロリン及び／又はヒスチジンを１番目に有する二価ペプチドであることを特徴とする、方法に関する。
【００２５】
以下の説明により、本発明のさらに明確な理解が可能となる。はじめに、使用する用語のいくつかの定義を以下に示す。
【００２６】
「ペプチド」という用語は、少なくとも２つのアミノ酸が連結したものを意味するものである。当該アミノ酸は、天然アミノ酸でもよく、酵素の作用によって修飾されたアミノ酸等の修飾された天然アミノ酸でもよい。
【００２７】
通常、「ペプチド」という用語は、２から１００個のアミノ酸が連結したものを指す。また、６個より多いアミノ酸が連結したものは「タンパク質」と呼ばれることもあり、これら二つの概念を明瞭な境界線によって区別することはできない。本発明において、「タンパク質」という用語は、サンプル中に元々存在する連結したアミノ酸を意味し、「ペプチド」という用語は、例えば消化、化学的切断、又は質量分析計で断片化されることなどによって、初期タンパク質又はそのペプチドの少なくとも１つのペプチド結合が切断された結果生じる連結したアミノ酸を意味する。「タンパク質」という用語は、核タンパク質、リポタンパク質、リンタンパク質、金属タンパク質及び糖タンパク質、酵素、受容体、抗体及び抗原等のホロタンパク質やヘテロタンパク質を包含している。
【００２８】
本発明の方法によって分析することができるタンパク質は、特に、少なくとも１個のプロリンを２番目からｎ−２番目に、及び／又は、少なくとも１個のヒスチジンを１番目からｎ−２番目に有する、ｎ個のアミノ酸からなるペプチドを少なくとも１つ含むタンパク質であり、上記ペプチドは最初のタンパク質を切断すると得られる。当該ペプチドは１から１５個のアミノ酸を含むことが好ましく、少なくとも６個のアミノ酸を含むことが好ましい。
【００２９】
「プロテオタイピックペプチド」という用語は、タンパク質をペプチドに断片化するためのタンパク質の処理によって生成するペプチドを意味し、当該タンパク質又は当該タンパク質が属する極めて類似のタンパク質群に特有のものである。
【００３０】
「サンプル」という用語は、検出対象のタンパク質を含有できる任意のサンプルを意味するものである。サンプルは生物（すなわち、動物、植物、ヒト）由来であってもよい。その場合、体液（例えば、全血、血清、血漿、尿、脳脊髄液、有機分泌物）試料、組織試料、又は単離した細胞試料であってもよい。この試料は、そのまま用いてもよく、明細書中、特に記載のない限り、分析の前に、当業者に公知の方法に従って濃縮、抽出、凝縮、精製系の処理を行ってもよい。サンプルは、工業的に得られたもの、すなわち、全てを列挙したものではないものの、空気試料、水試料、表面から採取された試料、成分又は製品、又は食物由来の製品であってもよい。上記食物由来のサンプルの中でも、例えば乳製品（ヨーグルト、チーズ）、肉、魚、卵、果実、野菜、水、又は飲料（牛乳、フルーツジュース、ソーダ等）のサンプルが挙げられるが、これらに限定されない。また、これらの食物由来サンプルは、出来上がった料理又はソース由来であってもよい。また、食物サンプルは動物飼料、特に、動物用食品等に由来してもよい。
【００３１】
上記ｍ／ｚ比は、本発明において用いられるイオン化されたペプチドの質量電荷比である。「質量電荷比」、「比」さらには「質量」という用語が、このｍ／ｚ比に対して区別することなく使用される。この比の単位はＴｈであるが、その名の「質量」から拡張してＤａであってもよい。
【００３２】
本発明に係る方法の第一工程ａ）は、標的サンプルに含まれるタンパク質の処理である。ペプチドへと断片化するために、サンプルのタンパク質すべてを、例えばタンパク質分解酵素（プロテアーゼ）による、又は化学試薬の作用による消化などによって処理する。実際、タンパク質の切断は、物理化学的処理によって、生物学的処理によって、又はこれら２つの処理の組み合わせによって実行することができる。使用可能な処理の中でも、ヒドロキシルラジカル、特にＨ２Ｏ２による処理が挙げられる。ヒドロキシルラジカルによる処理はペプチド結合の切断を引き起こす。ペプチド結合の切断はタンパク質の任意のペプチド結合に無作為に起こる。ヒドロキシルラジカルの濃度によって、切断の数、すなわち、得られるペプチドフラグメントの長さが決まる。また、例えば、メチオニル残基のカルボキシル基単位でペプチド結合を特異的に切断する臭化シアン（ＣＮＢｒ）による処理等の他の化学的処理も使用可能である。また、タンパク質のトリフルオロ酢酸溶液を１０００℃で加熱することにより、アスパラギン酸残基単位での部分的な酸性切断を行うことも可能である。
【００３３】
しかしながら、酵素消化によるタンパク質の処理が好ましい。これは、物理化学的処理と比較して、タンパク質の構造がより多く保存され、制御がより容易である。「酵素消化」という用語は、適切な反応条件下での１種又は複数の酵素の単独又は複合的作用を意味するものである。プロテアーゼと称される、タンパク質を分解する酵素は、特定部位でタンパク質を切断する。通常、プロテアーゼはそれぞれ、アミノ酸配列を認識し、その配列内で常に同様の切断を行う。あるプロテアーゼは、単一のアミノ酸、又は、その間を切断する２つのアミノ酸からなる配列を認識し；他のプロテアーゼはさらに長い配列のみを認識する。これらのプロテアーゼは、エンドプロテアーゼであってもよく、エキソプロテアーゼであってもよい。公知のプロテアーゼの中でも、国際公開第２００５／０９８０７１号に記載されている以下のものが挙げられる：
【００３４】
・Ａｒｇ及びＬｙｓ残基のカルボキシル基でペプチド結合を切断するトリプシンや、リシンの−ＣＯ基のペプチド結合を切断するエンドリシンや、芳香属残基（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ及びＴｒｐ）のカルボキシル基でペプチド結合を加水分解するキモトリプシンや、芳香属残基（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ及びＴｒｐ）のＮＨ２基で切断するペプシンや、Ｇｌｕ残基のカルボキシル基でペプチド結合を切断する、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｖ８株のＶ８プロテアーゼなどの特異的酵素；
【００３５】
・疎水性アミノ酸（Ｘａａ−Ｌｅｕ、Ｘａａ−Ｉｌｅ、Ｘａａ−Ｐｈｅ）のＮＨ２基でペプチド結合を加水分解する、細菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ由来のサーモリシンや、全ての結合を実質的に加水分解し、制御された反応条件（酵素濃度及び反応時間）下でタンパク質をオリゴペプチドに変換できる細菌プロテアーゼであるサブチリシン及びプロナーゼなどの非特異的酵素。
【００３６】
複数のプロテアーゼについて、それらの作用様式が適合する場合、それらを同時に使用することができ、あるいは、それらを連続的に使用することもできる。本発明において、サンプルの消化は、例えばトリプシンといったプロテアーゼの酵素作用によって行われるのが好ましい。
【００３７】
このような処理工程によって、サンプル中に存在する、タンパク質に代表される大きな分子をより小さな分子であるペプチドに変換することができる。従って、その後、質量分析で得られる検出の感度が向上する。さらに、上記処理工程によって、所定の標的タンパク質の、リポーターペプチドとも呼ばれるいくつかのプロテオタイピックペプチドを生成することができる。例えば、他のタンパク質が同一のペプチド配列を含まないかどうか、又は他の遷移が阻害しないかどうか、などを確認することにより、各プロテオタイピックペプチドの特異性を実証しなければならない。こうして、上記処理によって、分析対象のタンパク質に特異的なプロテオタイピックペプチドが１つ以上得られる可能性を高めることができる。プロテオタイピックペプチドはそれぞれ、独立した分析によってタンパク質を定量することを可能にする。血液サンプルのような複雑流体中のＭＲＭ分析の特異性は確固としたものではない。従って、このような場合、各タンパク質について、いくつかのプロテオタイピックペプチドを分析することによって、それぞれの独立した分析の結果が実際に同じ量となることを確認できるであろう。従って、互いに正しく相関付けられた独立した分析を行うことによって、信頼性と再現性の点から、独立した各分析の特異性及び頑健性を確認することができるであろう。
【００３８】
このように、この後の方法において、上記質量分析による分析のために選択される所定の比（ｍ／ｚ）１を有する各プリカーサーイオンとは、分析対象の標的タンパク質のプロテオタイピックペプチドに由来することとなる。
【００３９】
サンプルの複雑さ次第では、上記処理工程の前に１つ以上の任意の工程を行ってもよい。サンプルの複雑さを低減するために、標的サンプル中に存在するタンパク質の分画という第一工程を行った後に、残ったタンパク質の処理を行ってもよい。「分画」という用語は、従来通り、存在する多くのタンパク質の精製を意味するものであり、これは、サンプル中の１つ以上のタンパク質を除去すること、又は、分析対象のタンパク質を含む１つ以上のタンパク質を選択することで行い得る。このような工程は、サンプル中に存在するアルブミン、ＩｇＧ、ＩｇＡ等の、分析対象の標的タンパク質ではない顕著なタンパク質を除去（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）することで行い得る。このような除去は、例えばアフィニティークロマトグラフィーによって行うことができる。この除去により、存在するタンパク質の数を減少させることで、サンプルの複雑さを低減することができる。アルブミン除去は出願人（上記Ｔ．Ｆｏｒｔｉｎら）によって提案されている。タンパク質のより大きなパネルの除去も、他のチーム（上記Ｈ．Ｋｅｓｈｉｓｈｉａｎら、及び、上記Ｖ．Ｋｕｌａｓｉｎｇａｍら）によって採用されている。本発明において、これらの方法を用いてもよい。しかしながら、アフィニティークロマトグラフィーには、免疫親和性樹脂を含む場合には、使用するクロマトグラフ媒体が高価であるという欠点がある。更に、上記Ｔ．Ｆｏｒｔｉｎらによって示されているように、捕獲の特異性が不十分であると、分析対象のタンパク質自体が親和性樹脂により部分的に保持されてしまい、後続の分析に送られないことがある。
【００４０】
タンパク質を分画するための別の方法は、標的タンパク質を、例えばアフィニティークロマトグラフィー等によって免疫精製することからなる。この方法によれば、分析対象のタンパク質のみを含む分画（少数の混入したタンパク質も含み得る）を得ることにより、サンプルの複雑さを劇的に低減することができる。このような方法は、上記Ｋｕｌａｓｉｎｇａｍらによって記載されている。しかしながら、本発明に係る方法では、分析対象のタンパク質に対する抗体を必要とするこのような方法を用いないのが有利である。これは、本発明に係る方法は、分析対象のタンパク質に対して特異性を有するため、残存タンパク質数を非常に少なくするタンパク質の分画を必要としないからである。
【００４１】
タンパク質を分画するためのさらに別の方法は、特に上記Ｓ．Ａ．Ｇｅｒｂｅｒらによって記載されているように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって分析対象のサンプルを精製した後、分析対象のタンパク質の分子量に相当するバンドを切り取ることからなる。通常、電気泳動やクロマトグラフィー等に基づく、当業者に周知のすべてのタンパク質分画法が、サンプルの複雑さを低減するために使用可能である。
【００４２】
タンパク質の分画を行うのであれば、特に、タンパク質の切断に至る処理工程の前であって、タンパク質の分画工程の後に、変性、還元、及びその後のタンパク質のチオール官能基のブロッキングという別の任意の工程を行ってもよい。任意ではあるが、この工程によって、消化処理率を向上させることができ、後続の分析でのさらに高い頑健性を確保することができる。あるタンパク質は、その三次元構造のおかげで、プロテアーゼのタンパク質分解作用に対して元々耐性がある（Ｖ．Ｂｒｕｎら，ＭＣＰ，２００７，２１３９−２１４９）。このような場合、変性、還元、及びその後のタンパク質のチオール官能基のブロッキングという工程によって、プロテアーゼの作用が促進され、サンプル間で同様の消化処理率が確保される。標的サンプル中に存在するすべてのタンパク質は、例えば、尿素又はグアニジン、及び、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）又はトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）によって変性及び還元することができる（Ｍ．Ｓｕｎら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．２００５，１６（５）：１２８２−１２９０）。その後、生成した遊離のチオール官能基を、例えば、ヨードアセトアミド又はアクリルアミド等によってブロッキングする（Ｂ．Ｈｅｒｂｅｒｔら，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２００１，２２：２０４６−２０５７）。
【００４３】
本発明の方法によれば、上記処理工程中に生成した少なくとも１つのプロテオタイピックペプチドを質量分析によって分析する。通常、１つのタンパク質につき１つのプロテオタイピックペプチドを分析するが、１つのタンパク質につきいくつかのペプチドを分析することも可能である。また、種々のタンパク質のプロテオタイピックペプチドを連続的に分析することも可能である。上記処理工程中に生成したすべてのペプチドを、質量分析計に投入することができる。しかしながら、最も一般的には、特に標的タンパク質のプロテオタイピックペプチドに分析を集中させるために、生成したペプチドを分画する。このようなペプチドの分画は、例えば電気泳動法やクロマトグラフィー法によって実行することができる。これらの分離方法は、単独で用いることもでき、また、多次元分離ができるように互いに組み合わせて用いることもできる。例えば、上記Ｔ．Ｆｏｒｔｉｎら、及び上記Ｈ．Ｋｅｓｈｉｓｈｉａｎらにより記載されているように、イオン交換クロマトグラフィーによる分離を逆相クロマトグラフィーと組み合わせることによって、多次元クロマトグラフィーを行うことができる。これらの刊行物では、クロマトグラフ媒体はカラム中、又はカートリッジ中（固相抽出）に存在し得る。
【００４４】
プロテオタイピックペプチドの電気泳動又はクロマトグラフィーの分画（又は、一次元、若しくは多次元クロマトグラフィーの保持時間）は各ペプチドに特有であるので、これらの方法を用いることによって、分析対象のプロテオタイピックペプチドを選択することができる。生成したペプチドのこのような分画によって、後続の質量分析による分析の特異性を高めることができる。
【００４５】
電気泳動法又はクロマトグラフィー法とは別のペプチド分画のための方法は、Ｎ−糖ペプチドを特異的に精製することからなる（Ｊ．Ｓｔａｌ−Ｚｅｎｇら，ＭＣＰ，２００７，１８０９−１８１７、及び特許出願：国際公開第２００８／０６６６２９号）。しかしながら、このような精製は、Ｎ−グリコシル化型の翻訳後修飾を受けたペプチドの定量のみを可能にするだけであって、あいにく、すべてのタンパク質がグリコシル化されるとは限らないので、その使用は制限される。
【００４６】
ペプチドを分画するためのさらに別の方法は、標的ペプチドを、例えばアフィニティークロマトグラフィー等によって免疫精製することからなる。この方法によれば、分析対象のペプチドのみを含む分画（少数の混入したペプチドも含み得る）を得ることにより、サンプルの複雑さを劇的に低減することができる。ＳＩＳＣＡＰＡと呼ばれるこのような方法は、上記Ｌ．Ａｎｄｅｒｓｏｎら、及び米国特許出願公開第２００４／００７２２５１号明細書に記載されている。しかしながら、特異的な抗ペプチド抗体を得ることは困難な場合もあり、この場合、本発明に係る方法では、このような方法を用いない。更に、本発明に係る方法は、分析対象のタンパク質に対して特異性を有するため、分析対象である１つのプロテオタイピックペプチドが得られるペプチドの免疫親和性分画を必要としない。
【００４７】
結論として、本発明に係る方法において、生成されたペプチドの質量分析による定量分析（工程ｂ）に相当）よりも先に、工程ａ）で生成したペプチドのクロマトグラフィー又は電気泳動による分離を行うことが好ましい。このようなクロマトグラフィーによる分離は、逆相クロマトグラフィー、マイクロ流路クロマトグラフィー、すなわち、流量が毎分１００μｌから５００μｌのクロマトグラフィーによる分離、又は、固相抽出（ＳＰＥ）による精製を用いるのが好ましい。
【００４８】
本発明に係る方法の工程ｂ）は、これより前の工程中に生成した少なくとも１つのプロテオタイピックペプチドを質量分析法によって検出することからなる。通常、１つのタンパク質当たり１つプロテオタイピックペプチドを分析するが、２つ以上を分析することも可能であり、その送られる順番は、選択したペプチド分画法によって質量分析計の前工程で調整される。
【００４９】
本発明では、様々なモデルの質量分析計を使用することができる。これらのモデルでは、ｍ／ｚ比に基づいた３つの分離工程とこれらの分離工程間に行われる２つの連続した断片化、すなわちＭＳ／ＭＳ／ＭＳ又はＭＳ３と呼ばれるタイプの分析が可能でなけらばならない。例として、三連四重極型（Ｌ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ及びＣ．Ｈｕｎｔｅｒ，ＭＣＰ，２００６，５７３−５８８…）、又はイオントラップ型（Ｂ．Ｈａｎ及びＲ．Ｈｉｇｇｓ，Ｂｒｉｅｆ Ｆｕｎｃｔ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ．２００８，Ｓｅｐ；７（５）：３４０−５４）、あるいは飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）（Ｋ．−Ｙ．Ｗａｎｇら，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ，２００８，８０（１６），６１５９−６１６７）のモデルが挙げられる。しかしながら、イオントラップが組み込まれたハイブリッド三連四重極型モデルが好ましい。分析対象のペプチドは、最も一般的には溶液として、選択された質量分析計に投入され、分析される。
【００５０】
第一工程ｉ）では、タンパク質の切断に至るタンパク質の処理によって得られるペプチドが、質量分析計に投入され、分子イオンを生成するためにイオン化される。上記分子イオンは、フラグメントイオンを生成するためにその後、断片化されるため、プリカーサーと呼ばれる。質量分析計に投入するために、通常、ペプチドを水溶液に溶解する。従って、分析対象のサンプルは液体であることが好ましい。分子がイオン化されるイオン源としては、例えば、ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化）型、又は電気スプレー（ＥＳＩ（電気スプレーイオン化））型がある。しかしながら、穏やかな条件の下、特に、常圧及び常温で電気スプレーイオン化を行うことが好ましい。
【００５１】
その後、生成したプリカーサーイオンは、その質量ｍ／ｚに基づいてフィルタリングされ、目的とする標的タンパク質に基づいて、所定の質量（ｍ／ｚ）１のプリカーサーイオンが選択される。このために、従来通り、上記イオンを電界で加速し、その質量電荷（ｍ／ｚ）比に依存する軌道に従って電界及び／又は磁界に誘導する。印加する電界及び／又は磁界を変えることによって、プリカーサーイオンの軌道を変えることができるので、目的とする（ｍ／ｚ）１比を選択することができる。本発明の好ましい特徴によれば、選択されたプリカーサーイオンは、アミノ酸数ｎが６から１５であり、且つ、少なくとも１個のプロリンを２番目からｎ−２番目に、及び／又は、少なくとも１個のヒスチジンを１番目からｎ−２番目に有する二価ペプチドである。このような選択によって、後続の工程での良好な特異性及び選択性を達成できるとともに、シグナル／ノイズ比が改善されることとなる。好ましい一実施形態によれば、選択されたプリカーサーイオンは二価であり、少なくとも、２個のプロリン、又は、１個のプロリンと１個のヒスチジンとを有する。これは、２個のプロリン、又は、１個のプロリンと１個のヒスチジンとを有するプリカーサーイオンを用いることにより、ＭＳ３で生成される二次フラグメントがさらに少なくなり、最も有効な定量分析を行うためによりふさわしいからである。
【００５２】
「プロリン（又はヒスチジン）を２番目からｎ−２番目に有するペプチド」という表現は、プロリン（又はヒスチジン）が２、３、４、５…ｎ−５、ｎ−４、ｎ−３又はｎ−２番目に位置することを意味するものである。１番目はＮ末端部に相当し、ｎ番目はＣ末端部に相当し、ｎはペプチド中に存在するアミノ酸数である。
【００５３】
その後、目的とする標的タンパク質に応じて選択されたプリカーサーイオンが、工程ｉｉ）で一次フラグメントイオンへ断片化される。次いで、生成された一次フラグメントイオンは、その質量ｍ／ｚに基づいてフィルタリングされ、所定の質量（ｍ／ｚ）２の一次フラグメントイオンが工程ｉｉｉ）で選択される。本発明の本質的特徴によれば、上記選択された一次フラグメントイオンは、プロリン又はヒスチジンを１番目（Ｎ末端）に有する二価ペプチドである。実際、プリカーサーイオンがプロリン又はヒスチジンを含む場合、そのプロリン又はヒスチジンそれぞれに対するＮ末端部のペプチド結合が断片化したものに相当する一次フラグメントイオンが存在する。本発明に係る方法の工程ｉｖ）では、選択された一次フラグメントイオンに対して、さらなる断片化が行われる。また、プリカーサーイオン及び一次フラグメントイオンの上記特定の選択によって、良好な断片化が行われることとなり、強いピークが得られることとなる。本発明において、比（ｍ／ｚ）１を有するプリカーサーイオン、及び比（ｍ／ｚ）２を有する一次フラグメントイオンは、分析対象のタンパク質に特有なものとなるように、且つ、再現性と信頼性の点からできるだけ感度がよく、できるだけ特異的で、できるだけ頑健性の高い分析ができるように選択される。
【００５４】
従来通り、２回の連続した断片化は、電界内で、例えば窒素やアルゴン等の不活性ガスとの衝突によって、又は、単に、例えば飛行時間チューブ内などで電位差を印加することによって行われる。電界の特徴によって、断片化の強度及び性質が決まる。このように、例えば四重極では、不活性ガスの存在下に印加された電界によって、イオンに供給される衝突エネルギーが決まる。当業者であれば、分析対象の遷移の感度が高まるように、この衝突エネルギーを最適化できよう。例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（アメリカ合衆国、フォスターシティー）の質量分析計ＡＢ ＳＣＩＥＸ ＱＴＲＡＰ（登録商標）５５００のｑ２では、衝突エネルギーを５から１８０ｅＶの間で変化させることが可能である。同様に、当業者であれば、可能な限り感度のよい分析ができるように、衝突工程の継続時間と、例えばイオントラップ内などの励起エネルギーとを最適化できよう。例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社の質量分析計ＡＢ ＳＣＩＥＸ ＱＴＲＡＰ（登録商標）５５００のＱ３では、励起時間と呼ばれる上記継続時間を０．０１０から５０ミリ秒の間で変化させることが可能であり、上記励起エネルギーを０から１（任意単位）の間で変化させることが可能である。
【００５５】
工程ｉ）からｉｉｉ）は、ＭＲＭ分析に従来から用いられる工程に相当する。特に、このような工程は、三連四重極で行うことができる。三連四重極は、大抵の場合は短い方の四重極からなる衝突セル（ｑ２と呼ばれる）によって隔てられた２つの直列の四重極分析器（Ｑ１及びＱ３と呼ばれる）を含む。もちろん、一次フラグメントイオンを二次フラグメントイオンへと断片化することができる質量分析計で、本発明に係る方法を実施することが必要である。本発明において、二次フラグメントイオンへの一次フラグメントイオンの断片化、及び一次フラグメントイオンの選択は、例えば、イオントラップを備えた三連四重極のＱ３で行うことができる。四重極Ｑ３にイオントラップ性能を有するハイブリッド三連四重極を使用してもよい。このような装置は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から３２００ＱＴＲＡＰ（登録商標）、４０００ＱＴＲＡＰ（登録商標）又はＡＢ ＳＣＩＥＸ ＱＴＲＡＰ（登録商標）５５００の名称で販売されている。また、任意のイオントラップ型分析器において、ＭＳ３モードで一次フラグメントイオンを断片化することも可能である。この場合、プリカーサーイオンは上記イオントラップにおいて選択され、一次フラグメントイオンへと断片化される。今度は、同一イオントラップ装置において一次フラグメントイオンが選択され、二次フラグメントイオンへと断片化される。イオントラップから検出器へ二次イオンが連続して放出されることにより、二次イオンが最終的に検出される。
【００５６】
本発明では、従来通りに、四重極型分析器（Ｑ１）によって、選択されたプロテオタイピックペプチドに由来するプリカーサー分子イオンをその質量電荷比（ｍ／ｚ）１に基づいてフィルタリングすることができる。目的とするプリカーサーイオンの質量電荷比（ｍ／ｚ）１を有するペプチドのみが、第二の四重極（ｑ２）に送られる。ｑ２分析器によって、質量電荷比（ｍ／ｚ）１を有するプリカーサーイオンを一次フラグメントイオンへ断片化することができる。通常、上記断片化は、プリカーサーペプチドと、窒素やアルゴン等の不活性ガスとの衝突によって行われる。次いで、一次フラグメントイオンは、質量電荷比（ｍ／ｚ）に基づいて一次フラグメントイオンをフィルタリングする第三の四重極（Ｑ３）に送られる。目的とするプロテオタイピックペプチドに特有のフラグメントの質量電荷比（ｍ／ｚ）２を有する一次フラグメントイオンのみに対して、本発明に係る方法の最終工程が行われることとなる。実際には、本発明に係る方法は、さらなる断片化を含み、後続の工程ｉｖ）では、選択された質量（ｍ／ｚ）２の一次フラグメントイオンが、二次フラグメントイオンへと断片化される。目的とするプロテオタイピックペプチドのフラグメントの質量電荷比（ｍ／ｚ）２を有する一次フラグメントイオンがＱ３で選択された後、今度はこの一次フラグメントイオンが、例えばイオントラップ等によって断片化される。そして、一次フラグメントイオンの断片化によって生じた種々の二次フラグメントイオンが得られる。次いで、これらの種々の二次イオンは、例えばイオントラップや四重極などからなる質量分析計によって検出器へと放出されることとなる。上記放出は、例えば、無線周波数によって時間の関数として調整された電圧を印加することによって、イオントラップから連続的に行なわれる。
【００５７】
誘導される電流を検出するために、上記二次フラグメントイオンが検出器に向けられる。当該検出器では、ｍ／ｚ比に応じて異なる時間で到達する二次フラグメントイオンが収集され、該イオンに関するシグナルが増幅される。本発明に係る方法の実施の一変形例によれば、工程ｖ）において、上記二次フラグメントイオンによって誘導される電流の強度を時間の関数として検出し、所定期間に得られたシグナルを、存在する各種イオンの質量ｍ／ｚに応じた質量スペクトルに分解し、上記所定期間に存在する検出された二次イオンそれぞれに関する質量ピークを得、選択された少なくとも１つの二次イオンの電流に相当するシグナルを再構成し、その相当する測定電流の強度を、工程ｖｉ）で選択される上記定量的測定値とする。一般に、全シグナルは時間の分割（ｆｒａｃｔｉｏｎ）、すなわち期間ｔによって得られる。期間ｔの継続期間は、質量分析器の走査速度、及び走査する質量範囲に依存するが、通常１秒未満である。各所定期間ｔに得られた全シグナルは、存在する各種イオンの質量ｍ／ｚに応じた質量スペクトルに分解され、上記期間ｔに検出された二次イオンそれぞれに関する質量ピークが得られる。二次イオンは、連続するいくつかの期間ｔにおいて観察される。この連続するいくつかの期間ｔは、プロテオタイピックペプチドが溶出する期間Ｔに相当する。プロテオタイピックペプチドによって生成された二次フラグメントイオンのシグナルが最大である期間ｔは、プロテオタイピックペプチドの溶出時間、すなわち保持時間に相当する。プロテオタイピックペプチドの溶出時間は、精製されたプロテオタイピックペプチドの溶液、又は精製された標的タンパク質の溶液、又はどちらか一方が特に豊富な溶液を用いて、例えば従来通りＭＲＭなどによって、決定することができる。従来法では、期間Ｔの最小継続期間は５から３０秒である。しかしながら、期間Ｔの継続期間は通常、延長されるので、シグナルの測定値は、プロテオタイピックペプチドの溶出時間の微小変化に影響されない。このように、期間Ｔの継続期間を、クロマトグラフィーによる分離の総時間に達するように延長することができる。しかしながら、従来通り、期間Ｔは通常、１分から５分の間で固定され、プロテオタイピックペプチドの溶出時間を中心としたものとなっている。少なくとも１つの二次イオンの電流に相当するシグナルであって、定量するタンパク質由来のプロテオタイピックペプチドに特異的なシグナルは、期間Ｔ中、分割期間ｔ毎に選択することができる。そして、このシグナルは、全シグナルから抽出することができる。期間Ｔの各瞬間ｔ、すなわち期間Ｔの各分割期間に測定された強度の総和に相当する電流の強度が、工程ｖｉ）で選択される定量的測定値に相当することとなる。実際、実施例１に詳述するように、イオンによって生成され、時間の関数として検出された電流に相当するシグナルは、所定期間ｔ（実際は非常に短い期間）毎に分解することができ、例えば、期間Ｔを最も代表する分割期間で合算され、存在する各種イオンの質量ｍ／ｚに応じた質量スペクトルが得られる。こうして、工程ｖ）で検出され、且つ、期間Ｔを最も代表する分割期間に存在する二次イオンに関する質量ピークが得られる。そして、所定の質量を有する１つ以上の二次イオンを選択することができ、その選択されたイオンの電流に相当するシグナルを再構成することができる。こうして、各期間ｔのフラグメントイオンによって誘導された電流であって、期間Ｔを最も代表する分割期間中に生じた電流の強度の合計が、プロテオタイピックペプチドの溶出に相当する期間Ｔを最も代表する分割期間の連続する期間ｔ中に観察されたシグナルの総和を積分することよって得られる。この合計は、例えば、存在するプロテオタイピックペプチドの量の決定を可能にする定量的測定値に相当することとなる。シグナルが合算された、期間Ｔを最も代表する分割期間の最初の期間ｔ及び最後の期間ｔは、シグナルが検出器のバックグラウンドノイズより大きい最初の期間ｔ及び最後の期間ｔと一致させてもよい。このように測定された電流の強度を、存在するプロテオタイピックペプチドの量を決定するための定量的測定値としてもよい。当該定量的測定値は、国際単位系（ＳＩ単位）であるｍｏｌ／ｍ３若しくはｋｇ／ｍ３系統、又はこれらの単位の倍数若しくは約数、又はその倍数若しくは約数を含む国際単位の通常の派生物によって表されるという特徴を有する。非限定的な例として、ｎｇ／ｍｌ又はｆｍｏｌ／ｌ等の単位が、定量的測定値を特徴づける単位である。工程ｖｉ）では、最大のｍ／ｚピークを有する二次フラグメントイオンに関する定量的測定値が選択されるのが好ましい。また、各種二次フラグメントイオンの定量的測定値を合算することも可能である。この場合、工程ｖｉ）では、例えば、最大のｍ／ｚピークを有する二次フラグメントイオンに関する少なくとも２つ（特に２つ又は３つ）の定量的測定値の合計値に基づいて、相関付けが実行される。
【００５８】
データ処理コンピューターアセンブリにより、検出器によって受信された情報を質量スペクトルに変換することができる。検出器によって測定された、選択された二次フラグメントイオンによって誘導された電流の強度は、二次フラグメントイオンの量に比例する。二次フラグメントイオンの量自体は、一次フラグメントイオンの量に比例し、一次フラグメントイオンの量自体は、選択されたプロテオタイピックペプチドのイオン化によって得られるプリカーサーイオンの量に比例し、プリカーサーイオンの量自体は、分析対象のタンパク質の量に比例する。従って、二次フラグメントイオンによって誘導された電流の測定量は、分析対象のタンパク質の量に正比例する。二次イオンに関する少なくとも１つの定量的測定値を選択し、この定量的測定値を、生成されたプロテオタイピックペプチドの量、及びサンプルの中に存在するタンパク質の量と相関付けを行うことによって、定量分析を行うことが可能になる。
【００５９】
二次フラグメントイオンによって誘導された電流の強度に相当する、測定されたピークの面積を、対応する二次フラグメントイオンの量と相関付けるためには、較正が必要である。上記対応する二次フラグメントイオンの量自体は、対応する一次フラグメントイオンの量と相関付けることができ、対応する一次フラグメントイオンの量自体は、プリカーサーイオンの量と相関付けることができ、プリカーサーイオンの量自体は、標的タンパク質の量と相関付けることができる。このために、本発明において、ＭＲＭ分析に用いられる従来の較正が行われてもよい。従来、ＭＲＭ分析は外部標準を用いて較正されるか、又は好ましくは、上記Ｔ．Ｆｏｒｔｉｎらによって記載されているような内部標準を用いて較正される。定量的測定値、及びプロテオタイピックペプチドの量、延いては標的タンパク質の量の相関は、分析対象の量が公知の標準シグナルに対して、測定されたシグナルを較正することにより得られる。較正曲線により上記較正を行うことができ、当該較正曲線は、例えば、様々な濃度の標準プロテオタイピックペプチドを連続投入すること（外部較正）によって、又は好ましくは内部標準として重ペプチドを用い、例えば、以下に詳述するＡＱＵＡ法、ＱｃｏｎＣＡＴ法若しくはＰＳＡＱ法などに従った内部較正によって得られる。「重ペプチド」という用語は、プロテオタイピックペプチドに相当するペプチドを意味するものであるが、１つ以上の炭素１２（１２Ｃ）原子が炭素１３（１３Ｃ）で置換されており、且つ／又は、１つ以上の窒素１４（１４Ｎ）原子が窒素１５（１５Ｎ）で置換されている。
【００６０】
内部標準（ＡＱＵＡ）としての重ペプチドの使用も、上記Ｓ．Ａ．Ｇｅｒｂｅｒらによって、さらには米国特許出願公開第２００４／０２２９２８３号明細書に提案されている。その原理は、通常の天然同位元素より重い同位元素を含むアミノ酸でプロテオタイピックペプチドを人工的に合成することである。そのようなアミノ酸は、例えば、炭素１２（１２Ｃ）原子のうちのいくつかを炭素１３（１３Ｃ）に置換すること、又は、窒素１４（１４Ｎ）原子のうちのいくつかを窒素１５（１５Ｎ）に置換することにより得られる。このように合成された人工ペプチド（ＡＱＵＡ）は、（質量が大きい以外は）天然ペプチドと同一の物理化学的性質を厳密に有している。通常、それを所定の濃度で、質量分光法による分析の前工程、例えば、標的サンプルのタンパク質の切断に至る処理と、該処理工程後に得られたペプチドの断片化との間に、サンプルに添加する。その結果、上記ＡＱＵＡペプチドは、ペプチドの断片化中に、分析対象の天然ペプチドとともに精製される。従って、これら２つのペプチドは、分析のために、質量分析計に同時に投入される。そして、それらは、上記源で同じイオン化率を示す。天然ペプチドと、濃度既知のＡＱＵＡペプチドのピークの面積を比較することによって、天然ペプチドの濃度を算出することができ、それにより分析対象のタンパク質の濃度にもさかのぼることができる。ＡＱＵＡ法の変形例が、ＱｃｏｎＣＡＴという名でＪ．−Ｍ．Ｐｒａｔｔら（Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２００６，１：１０２９−１０４３）によって提案されている。この変形例は、特許出願：国際公開第２００６／１２８４９２号にも記載されている。それは、各種ＡＱＵＡペプチドを連結すること、及び、組換え重タンパク質として人工ポリペプチドを生成することからなる。当該組換えタンパク質は、重同位元素を含むアミノ酸で合成される。このように、いくつかのタンパク質の同時分析を較正するための標準をより低コストで得ることができる。ＱｃｏｎＣＡＴ標準は、タンパク質の切断に至る処理の前工程で、並びに、タンパク質の分画、変性、還元、及びその後のタンパク質のチオール官能基のブロッキング工程を行う場合はそれらの工程の前に、最初から添加される。従って、ＱｃｏｎＣＡＴ標準は、天然タンパク質と同様にタンパク質の切断に至る処理サイクルを受ける。これにより、タンパク質の切断に至る処理工程の収率を考慮することができる。実際は、特に消化による天然タンパク質の処理は完全ではない場合がある。この場合、ＡＱＵＡ標準を用いると、天然タンパク質の量が少なく見積もられるであろう。従って、絶対的な分析のためには、タンパク質の切断に至る処理の収率を考慮することが重要な場合もある。しかしながら、Ｖ．Ｂｒｕｎら（ＭＣＰ，２００７，２１３９−２１４９）によって、おそらくＱｃｏｎＣＡＴタンパク質の異なる三次元構造のために、ＱｃｏｎＣＡＴ標準は、特に消化による天然タンパク質の処理での収率を正確に再現しない場合があることが示されている。
【００６１】
従って、上記Ｖ．Ｂｒｕｎらは、特許出願：国際公開第２００８／１４５７６３号に記載のＰＳＡＱと呼ばれる方法の使用を提案している。この場合、内部標準は、天然タンパク質と同一配列を有するが、重アミノ酸で合成された組換えタンパク質である。この合成は、重アミノ酸を用いてｅｘ ｖｉｖｏで行われる。この標準は、（質量が大きい以外は）天然タンパク質と同一の物理化学的性質を厳密に有している。それは、タンパク質分画工程を行う場合はその前に最初から添加される。従って、それはタンパク質分画工程中に天然タンパク質とともに精製される。それは、特に消化による処理において、天然タンパク質と同じ収率を示す。ペプチド分画工程が行われる場合、切断後に得られた重ペプチドも天然ペプチドとともに精製される。従って、２つのペプチドは、質量分析計に同時に投入され、定量分析される。そして、それらは、上記源で同一イオン化率を示す。ＰＳＡＱ法での天然ペプチド及び標準ペプチドのピーク面積を比較することにより、分析方法の全工程を考慮しつつ、分析対象のタンパク質の濃度を算出することができる。
【００６２】
本発明において、上記較正を行うために、質量分析による分析、特にＭＲＭ又はＭＳ分析で用いられるこれらすべての方法、すなわちＡＱＵＡ、ＱｃｏｎＣＡＴ又はＰＳＡＱなどの較正方法を用いてもよい。
【００６３】
従って、本発明に係る方法は、特にｉｎ ｖｉｔｒｏ診断のためのタンパク質の定量・定性分析のために行ってもよい。本発明に係る方法によって分析することができるいくつかのタンパク質と、選択されたプロテオタイピックペプチドとを下記表１Ａで詳細に示す。
【００６４】
【表１Ａ】
【００６５】
調査したタンパク質は、Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔデータベースの下記番号に対応する：プラスチン−１（Ｑ１４６５１）、エズリン（Ｐ１５３１１）、アミノアシラーゼ１（Ｑ０３１５４）、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（Ｐ０７２３７）、ケラチン，１型Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ２０（Ｐ３５９００）、１４−３−３シグマタンパク質（Ｐ３１９４７）、Ｓ１００−Ａ１１タンパク質 カルギザリン（Ｐ３１９４９）。
【００６６】
プロテオタイピックペプチドの理論的な質量は、そのアミノ酸配列から求められる。ＭＲＭ Ｐｉｌｏｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｅｄｉｔｏｒ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｋ社、ドイツ、ブレーメン）等、多くのソフトウェアパッケージによってこの計算を行うことができる。表１Ａに示す計算結果は、ＭＲＭパイロットによって行われたものである。二価プリカーサーイオン（Ｍ２Ｈ＋）の理論的な質量は、プロテオタイピックペプチドの理論的な質量に２つのプロトンの質量を加え、得られた合計を２で割ることにより求められる。
【００６７】
表１Ｂに、各タンパク質についての選択された二価プリカーサーイオンに関して、存在するプロリン及びヒスチジンの位置、並びに存在するアミノ酸数を示す（ＡＡはアミノ酸を意味する）。
【００６８】
【表１Ｂ】
【００６９】
タンパク質ジスルフィドイソメラーゼのタンパク質の場合、１７個のアミノ酸を有するプロテオタイピックペプチドＨＮＱＬＰＬＶＩＥＦＴＥＱＴＡＰＫ（配列番号１４）のみでは、対応する二価プリカーサーイオンの検出には至らず、ケラチン，１型Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ２０のタンパク質の場合、１８個のアミノ酸を有するペプチドＳＬＳＳＳＬＱＡＰＶＶＳＴＶＧＭＱＲ（配列番号２３）のみでは、対応する二価プリカーサーイオンの検出には至らない。表１Ｃに、各タンパク質について、存在するプロリン及びヒスチジンの位置と共に、選択された二価一次フラグメントイオンを示す。
【００７０】
【表１Ｃ】
【００７１】
付属の図を参照した以下の実施例は、全く制限するものでなく、本発明の例示を可能にするものである。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１Ａ】全イオンクロマトグラムで時間の関数として得られたシグナルの例を示す。
【図１Ｂ】図１Ａ中、１１．７０分から１１．９０分の間に溶出した二次フラグメントイオンの質量スペクトルを示す。
【図１Ｃ】図１ＡのＰＳＡのプロテオタイピックペプチドＬＳＥＰＡＥＬＴＤＡＶＫ（配列番号５０）の二次フラグメントｙ５、ｙ６、ｙ７−Ｈ２Ｏ、ｙ７及びｙ８の質量に相当する抽出されたイオンのクロマトグラムの、３点で平滑化された総和を示す。
【図１Ｄ】較正曲線の例である。
【図２Ａ】天然ペプチドＬＳＥＰＡＥＬＴＤＡＶＫ（配列番号５０）（保持時間１１．７８分）について得られたクロマトグラムを示す。
【図２Ｂ】重ペプチドＬＳＥＰＡＥＬＴＤＡＶＫ（配列番号５０）（保持時間１１．７９分）のクロマトグラムを示す。
【図３】較正曲線の他の例である。
【図４Ａ】較正曲線の他の例である。
【図４Ｂ】較正曲線の他の例である。
【図５Ａ】図５Ａ、５Ｂ及び５Ｃは、各種衝突エネルギー４０、３５及び３０ｅＶそれぞれで得られた各種質量スペクトルである。
【図５Ｂ】図５Ａ、５Ｂ及び５Ｃは、各種衝突エネルギー４０、３５及び３０ｅＶそれぞれで得られた各種質量スペクトルである。
【図５Ｃ】図５Ａ、５Ｂ及び５Ｃは、各種衝突エネルギー４０、３５及び３０ｅＶそれぞれで得られた各種質量スペクトルである。
【図５Ｄ】誘導された電流の強度の変化を、一次フラグメントイオンの生成に用いられた衝突エネルギー（ＣＥ）の関数として示す。
【図６Ａ】図６Ａ、６Ｂ及び６Ｃは、最も強度の強い一価フラグメントイオン（図６Ａ、０．０９８分から０．３００分の間に溶出）、又は、プロリンを含む一価型フラグメントイオン（図６Ｂ、０．１０１分から０．３０６分の間に溶出）、又は、その同一イオンの二価型（図６Ｃ、０．１０２分から０．２９８分の間に溶出）のいずれかを一次フラグメントイオンとして選択した時に、Ｔｐ４３５タンパク質のプロテオタイピックペプチドＳＡＰＳＰＬＴＹＲ（配列番号５３）から得られた二次フラグメントイオンの質量スペクトルを表わす。
【図６Ｂ】図６Ａ、６Ｂ及び６Ｃは、最も強度の強い一価フラグメントイオン（図６Ａ、０．０９８分から０．３００分の間に溶出）、又は、プロリンを含む一価型フラグメントイオン（図６Ｂ、０．１０１分から０．３０６分の間に溶出）、又は、その同一イオンの二価型（図６Ｃ、０．１０２分から０．２９８分の間に溶出）のいずれかを一次フラグメントイオンとして選択した時に、Ｔｐ４３５タンパク質のプロテオタイピックペプチドＳＡＰＳＰＬＴＹＲ（配列番号５３）から得られた二次フラグメントイオンの質量スペクトルを表わす。
【図６Ｃ】図６Ａ、６Ｂ及び６Ｃは、最も強度の強い一価フラグメントイオン（図６Ａ、０．０９８分から０．３００分の間に溶出）、又は、プロリンを含む一価型フラグメントイオン（図６Ｂ、０．１０１分から０．３０６分の間に溶出）、又は、その同一イオンの二価型（図６Ｃ、０．１０２分から０．２９８分の間に溶出）のいずれかを一次フラグメントイオンとして選択した時に、Ｔｐ４３５タンパク質のプロテオタイピックペプチドＳＡＰＳＰＬＴＹＲ（配列番号５３）から得られた二次フラグメントイオンの質量スペクトルを表わす。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００７３】
実施例１：腫瘍マーカーの外部較正を用いたＭＲＭ３による定量分析の原理：前立腺特異抗原（ＰＳＡ）
ＰＳＡ（前立腺特異抗原、Ｓｃｉｐａｃ社（イギリス）製）を、以下の校正範囲のポイントを得るために、女性の血清（フランス血液銀行［Ｆｒｅｎｃｈ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋ］）中、下記濃度で使用する。
・２００μｇ／ｍｌのポイントを得るために、女性の血清１６５μｌ中、１．１４ｍｇ／ｍｌのＰＳＡを３５μｌ
・５０μｇ／ｍｌのポイントを得るために、女性の血清１５０μｌ中、上記２００μｇ／ｍｌのポイントを５０μｌ
・１０μｇ／ｍｌのポイントを得るために、女性の血清１６０μｌ中、上記５０μｇ／ｍｌのポイントを４０μｌ
・１μｇ／ｍｌのポイントを得るために、Ｈ２Ｏ１８０μｌ中、上記１０μｇ／ｍｌのポイントを２０μｌ
・１００ｎｇ／ｍｌのポイントを得るために、Ｈ２Ｏ１８０μｌ中、上記１μｇ／ｍｌのポイントを２０μｌ
・１０ｎｇ／ｍｌのポイントを得るために、Ｈ２Ｏ１８０μｌ中、上記１００ｎｇ／ｍｌのポイントを２０μｌ
・１ｎｇ／ｍｌのポイントを得るために、Ｈ２Ｏ１８０μｌ中、上記１０ｎｇ／ｍｌのポイントを２０μｌ
・５μｇ／ｍｌのポイントを得るために、Ｈ２Ｏ１８０μｌ中、上記５０μｇ／ｍｌのポイントを２０μｌ
・５００ｎｇ／ｍｌのポイントを得るために、Ｈ２Ｏ１８０μｌ中、上記５μｇ／ｍｌのポイントを２０μｌ
・５０ｎｇ／ｍｌのポイントを得るために、Ｈ２Ｏ１８０μｌ中、上記５００ｎｇ／ｍｌのポイントを２０μｌ
【００７４】
０ｎｇ／ｍｌのポイントを得るために、女性の血清２００μｌを用いる。
【００７５】
次いで、上記範囲ポイント、及び、前立腺癌又は良性前立腺肥大症に罹患した患者から採取されたサンプルである分析対象の血清サンプルを、以下のプロトコルに従って消化する。
・ｐＨ＝８．０の５０ｍＭ重炭酸塩３ｍｌで、１００μｌの血清を希釈。
・最終濃度が１５ｍＭとなるようにジチオトレイトール（ＤＴＴ）を添加。
・６０℃で４０分間還元。
・常温でチューブを冷却。
・最終濃度が２５ｍＭとなるようにヨードアセトアミドを添加。
・常温、暗所で４０分間アルキル化。
・１／３０の比でトリプシンを添加。
・３７℃で４時間消化。
・最終濃度が１０ｍＭとなるようにＤＴＴを添加。
・６０℃で４０分間還元。
・常温でチューブを冷却。
・最終濃度が１５ｍＭとなるようにヨードアセトアミドを添加し、４０分間、常温、暗所でチオール官能基をアルキル化。
・１／３０の質量比でトリプシンを添加。
・３７℃で一晩、消化。
【００７６】
次いで、以下のプロトコルに従って、血清を脱塩し、濃縮する。
・ギ酸（すなわち、最終濃度の０．１％）によるサンプルの酸性化。
・１ｍｌのメタノール、次いで１ｍｌのＨ２Ｏ／０．１％ギ酸でＷａｔｅｒｓ社のＨＬＢ Ｏａｓｉｓカラムを平衡化。
・サンプルの投入、そのサンプルは重力で流れる。
・１ｍｌのＨ２Ｏ／０．１％ギ酸で洗浄。
・Ｈ２Ｏ／０．１％ギ酸混合物中の８０％メタノール１ｍｌで溶出。
【００７７】
その後、溶出した分画をｐＨ３．００の２００ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液３ｍｌで希釈する。
【００７８】
以下のプロトコルに従ってＷａｔｅｒｓ社のＯａｓｉｓ ＭＣＸ ＳＰＥカートリッジでサンプルを分画する。
・メタノール１ｍｌ、次いでｐＨ３．００の２００ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液１ｍｌでカートリッジを調整する。
・上記ｐＨ３．００の２００ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液で希釈した血清をすべて、ＭＣＸカートリッジに投入し、重力によって流す。
・ｐＨ３．００の２００ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液１ｍｌ、次いで８０％メタノール＋ｐＨ３．００の２０％酢酸緩衝液の１ｍｌでカートリッジを洗浄する。
・２００ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．５）／メタノール（５０／５０）１ｍｌで溶出を行う。
・体積を約１００μｌにするために、ＳｐｅｅｄＶａｃ（登録商標）ＳＰＤ２０１０型エバポレータ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ社、アメリカ合衆国、マサチューセッツ州、ウォルサム）で溶出液を２時間蒸発させる。
【００７９】
その後、溶出液を１０％アセトニトリル（ＡＣＮ）／９０％Ｈ２Ｏ＋０．５％ギ酸の混合液を、２００μｌとするのに十分量（ＱＳ）用いて溶かす。
【００８０】
得られたサンプルを１００μｌ投入し、下記条件に従って分析する。
・Ｄｉｏｎｅｘ社（アメリカ合衆国、カリフォルニア州、サニーベール）製のＵｌｔｉｍａｔｅ ３０００クロマトグラフィーシステム
・Ｗａｔｅｒｓ社のＳｙｍｍｅｔｒｙＣ１８カラム（内径２．１ｍｍ、長さ１００ｍｍ、粒子径３．５μｍ）
・溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ＋０．１％ギ酸
・溶媒Ｂ：ＡＣＮ＋０．１％ギ酸
【００８１】
下記表２に定義するＨＰＬＣ勾配：
【００８２】
【表２】
【００８３】
クロマトグラフィーカラムから流出する溶出液は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（アメリカ合衆国、フォスターシティー）製のＱＴＲＡＰ（登録商標）５５００質量分析計のイオン源に直接投入される。
【００８４】
用いる機械パラメーターを以下に示す。
走査タイプ：ＭＳ／ＭＳ／ＭＳ（ＭＳ３）
極性：正
走査モード：プロファイル（Ｐｒｏｆｉｌｅ）
イオン源：Ｔｕｒｂｏ Ｖ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社）
プリカーサー：６３６．８０Ｄａ
一次イオン：４７２．３０Ｄａ
Ｑ１設定：ユニット分解能（ｕｎｉｔ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）でフィルタリング
Ｑ３設定：線形イオントラップ
走査スピード：１００００Ｄａ／秒
Ｑ０でのトラッピング：有
Ｑ３での線形イオントラップ充填時間：２００．００ミリ秒
Ｑ３入力電圧：８．００Ｖ
断片化：有
励起時間：２５．００ミリ秒
Ｑ３でのイオントラップ走査増分：０．１２Ｄａ
走査開始質量（Ｄａ）：５００．００Ｄａ
走査終了質量（Ｄａ）：８５０．００Ｄａ
時間（秒）：０．０３５０秒
トラッピング無線周波数振幅（開始）：４．３０
トラッピング無線周波数振幅（終了）：４．４８
イオントラップ出力電圧（開始）：−１３６．２４Ｖ
イオントラップ出力電圧（終了）：−１２５．０９Ｖ
カーテンガス：５０．００ｐｓｉ
コーン電圧：５５００．００Ｖ
源温度：５００．００℃
噴霧ガス：５０．００ｐｓｉ
加熱ガス：４０．００ｐｓｉ
衝突セル充填：高
クラスタ分離電位：５０．００Ｖ
Ｑ０前の入力電位：３．００Ｖ
衝突エネルギー：２８．００ｅＶ
励起エネルギー（ＡＦ２）：０．０７
【００８５】
得られたシグナルは、全イオンクロマトグラムで時間の関数として表わされる（図１Ａ）。
【００８６】
各瞬間ｔにおいて、二次イオンの質量は質量スペクトルとして観察することができる。従って、質量スペクトルは、カラムから溶出し、同時に質量分析計に投入される各種の物質の質量を測定する。１１．７０分から１１．９０分の間で溶出した二次フラグメントイオンの質量を図１Ｂに示す。これらの質量のうちのいくつかは、ＰＳＡのプロテオタイピックペプチドＬＳＥＰＡＥＬＴＤＡＶＫ（配列番号５０）の二次フラグメントの質量に相当する。従って、質量５３３．０、６４６．２、７５７．６、７７５．４及び８４６．６はそれぞれ、フラグメントｙ５、ｙ６、ｙ７−Ｈ２Ｏ、ｙ７及びｙ８に相当する。先行技術では慣例として周知であるように、「ｙ５」フラグメントは、その配列がプロテオタイピックペプチドの配列の最後の５個のアミノ酸であるフラグメントであり、「ｙ６」フラグメントは最後の６個、といったぐあいである。
【００８７】
Ａｎａｌｙｓｔ１．５ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）によって、質量窓に対応するイオン電流を時間の関数として抽出することができる。従って、例えば、標的二次フラグメントそれぞれに対応する、例えば質量単位などの窓のクロマトグラムを得ることができる。このクロマトグラムを、抽出されたイオンクロマトグラムと呼ぶ。また、Ａｎａｌｙｓｔ１．５ソフトウェアによって、いくつかの抽出されたイオンクロマトグラムを合わせることができる。さらに、Ｓａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙアルゴリズム（Ａ．Ｓａｖｉｔｚｋｙ及びＭ．Ｇｏｌａｙ（１９６４）Ｓｍｏｏｔｈｉｎｇ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄａｔａ ｂｙ Ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｌｅａｓｔ Ｓｑｕａｒｅｓ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６：１６２７−１６３９）に従って、シグナルを平滑化することができる。このように、図１Ｃに、ＰＳＡのプロテオタイピックペプチドＬＳＥＰＡＥＬＴＤＡＶＫ（配列番号５０）の二次フラグメントｙ５、ｙ６、ｙ７−Ｈ２Ｏ、ｙ７及びｙ８の質量に対応する抽出されたイオンクロマトグラムの、３点で平滑化された総和を示す。
【００８８】
そして、Ａｎａｌｙｓｔ１．５ソフトウェアによって、抽出されたイオンクロマトグラムで観察されるピーク下の面積を積分することができる。このように、ＰＳＡ量が０から１０００ｎｇ／ｍｌの範囲のポイントについて、ペプチドＬＳＥＰＡＥＬＴＤＡＶＫ（配列番号５０）のｙ５、ｙ６、ｙ７−Ｈ２Ｏ、ｙ７及びｙ８イオンの総和のシグナルを測定することにより、下記表３を得ることができた。
【００８９】
【表３】
【００９０】
これらの結果から、図１Ｄに示す較正曲線を作成することができる。この曲線は、線形回帰を用いて、方程式（ｙ＝１．９×１０５Ｘ＋２．７６×１０５）としてモデル化されている。当該方程式により、ＰＳＡ量が未知の任意のヒト血清サンプルについて、ＰＳＡ濃度を算出できる。
【００９１】
例えば、以下の患者の血清を分析し、表４に示す以下の量を得ることができる。
【００９２】
【表４】
【００９３】
実施例２：腫瘍マーカーの内部較正を用いたＭＲＭ３による定量分析の原理：前立腺特異抗原（ＰＳＡ）
Ｔ．Ｔｏｒｔｉｎら（ＭＣＰ，２００８，Ｅ−ｐｕｂ）により記載されたプロトコルに従って、ある原子の重同位元素を含むアミノ酸を用いて、内部較正の標準を合成する。
【００９４】
こうして、ＰＳＡの器官型ペプチド（ｏｒｇａｎｏｔｙｐｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ）（ＬＳＥＰＡＥＬＴＤＡＶＫ）（配列番号５０）は、３つの炭素１２（１２Ｃ）原子の代わりに３つの炭素１３（１３Ｃ）原子を含むアラニンを２個含んで化学合成される。この合成は、ＡＢＩ４３３Ａ合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、アメリカ合衆国、フォスターシティー）及びＬ−（１３Ｃ３）−アラニン−Ｎ−ＦＭＯＣ（Ｅｕｒｉｓｏ−Ｔｏｐ社、フランス、サントーバン）を用いて行われる。合成の最後に、その重ペプチドを３０個の４ｍｌ容褐色ガラスボトルに分け、凍結乾燥する。
【００９５】
質量分析器（ＬＣＱイオントラップ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、アメリカ合衆国、マサチューセッツ州、ウォルサム）に連結されたクロマトグラフィーによって、合成重ペプチドの純度を確認する。その純度は、９５％を超えることが確認される。そして、褐色ガラスボトル中の重ペプチドの量を、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（フランス、マッシー）の１１００型アミノ酸分析器により、ボトル３本のサンプルに基づいて確認する。こうして、ボトルが純度９５％を超える重ペプチドを７９０μｇ含むことがわかる。
【００９６】
重ペプチド７９０μｇのボトル１本を、０．５％ギ酸が添加された水１ｍｌに溶かす。濃度６．２×１０−１０ｍｏｌ／μｌの重ペプチド原液が得られる。
【００９７】
６．２×１０−１１ｍｏｌ／μｌの溶液を得るために、上記重ペプチド原液をアセトニトリル／水（５０／５０）に１％ギ酸を加えた混合物で１０倍に希釈する。
【００９８】
６．２×１０−１２ｍｏｌ／μｌの溶液を得るために、上記６．２×１０−１１ｍｏｌ／μｌの溶液をアセトニトリル／水（５０／５０）に１％ギ酸を加えた混合物で１０倍に希釈する。
【００９９】
３．１×１０−１３ｍｏｌ／μｌの溶液を得るために、上記６．２×１０−１２ｍｏｌ／μｌの溶液をアセトニトリル／水（５０／５０）に１％ギ酸を加えた混合物で２０倍に希釈する。
【０１００】
３．１×１０−１４ｍｏｌ／μｌの溶液を得るために、上記３．１×１０−１３ｍｏｌ／μｌの溶液をアセトニトリル／水（５０／５０）に１％ギ酸を加えた混合物で１０倍に希釈する。
【０１０１】
３．１×１０−１５ｍｏｌ／μｌの溶液を得るために、上記３．１×１０−１４ｍｏｌ／μｌの溶液をアセトニトリル／水（５０／５０）に１％ギ酸を加えた混合物で１０倍に希釈する。
【０１０２】
患者の血清サンプル及びその各範囲ポイントを、実施例１に記載のプロトコルに従って処理し、酵素による消化工程と、Ｗａｔｅｒｓ社のＯａｓｉｓ ＨＬＢカラムでの脱塩工程との間で、３．１×１０−１５ｍｏｌ／μｌの重ペプチド溶液５０μｌを添加する。
【０１０３】
その後、患者の血清サンプル及びその各範囲ポイントを実施例１に記載のプロトコルに従って分析するとともに、以下の重ペプチドに対応するイオンのモニタリングも行う。
プリカーサー：６３９．８０Ｄａ
一次イオン：４７５．３０Ｄａ
【０１０４】
重ペプチドＬＳＥＰＡＥＬＴＤＡＶＫ（配列番号５０）は天然ペプチドと同じ物理化学的性質を有しているため、クロマトグラフィーでの保持時間が同じである。従って、２つのペプチドは質量分析計に同時に投入される。このことは、図２Ａの天然ペプチドＬＳＥＰＡＥＬＴＤＡＶＫ（配列番号５０）（保持時間１１．７８分）及び図２Ｂの重ペプチドＬＳＥＰＡＥＬＴＤＡＶＫ（配列番号５０）（保持時間１１．７９分）のクロマトグラムから見て取ることができる。
【０１０５】
一方、この重ペプチドは、天然ＰＳＡペプチドよりも６質量単位多い。その質量は、天然ペプチドの１２７７．６６ｇ／ｍｏｌに対して、１２７１．６６ｇ／ｍｏｌである。
【０１０６】
重ペプチドの量は、既知であり（１．５５×１０−１３ｍｏｌ）、且つ、範囲ポイントすべてで同じである。従って、再構成されたシグナルは、全範囲にわたって一定とならなければならない。しかしながら、シグナルの変化が重ペプチドにおいて観察され、このことは、この同一の変化が天然ペプチドのシグナルにも影響を及ぼしていることを意味する。従って、軽ペプチドのシグナルを修正するために、重ペプチドのシグナルを用いることができる。これを行うために、抽出されて一緒に添加された特異的な二次天然イオン及び重イオン間のクロマトグラフィーのピーク面積比を、Ａｎａｌｙｓｔ１．５ソフトウェアで求める。
【０１０７】
こうして、ＰＳＡ量が０から１０００ｎｇ／ｍｌの範囲のポイントで、天然及び重ペプチドＬＳＥＰＡＥＬＴＤＡＶＫ（配列番号５０）のｙ５、ｙ６、ｙ７−Ｈ２Ｏ、ｙ７及びｙ８イオンの総和のシグナルを測定することにより、下記表５を得ることができる。
【０１０８】
【表５】
【０１０９】
これらの結果から、図３に示す較正曲線を作成することができる。この曲線は、線形回帰を用いて、方程式（ｙ＝０．０２０８（Ｘ天然／Ｘ重）＋０．０１５４）としてモデル化される。当該方程式により、ＰＳＡ量が未知の任意のヒト血清サンプルについてＰＳＡ濃度を算出できる。
【０１１０】
例として、以下の患者の血清を分析し、表６に示す量が得られる。
【０１１１】
【表６】
【０１１２】
実施例３：外部若しくは内部較正を用いたＭＲＭ３、又は、ＥＬＩＳＡによって得られた血清ＰＳＡの定量分析の比較
患者の血清（その外部又は内部較正を用いたＭＲＭ３による分析はそれぞれ実施例１及び２に記載済みである）を、一方ではＶｉｄａｓ（登録商標）ＴＰＳＡキット（ビオメリュー、フランス、マーシー・レトワール）及びＶｉｄａｓ（登録商標）自動分析器を用いて、他方では総ＰＳＡキット及びＭｏｄｕｌａｒ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ Ｅ１７０自動分析器（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、ドイツ、マンハイム）を用いてＥＬＩＳＡで分析する。いずれの場合も、製造業者によって記載されたプロトコルを用いる。これらの血清は、前立腺癌（ＰＣａ）又は良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）に罹患した患者に対応している。表７に示すように、これらの３つの分析方法によって得られた量の比較を行う。
【０１１３】
【表７】
【０１１４】
その結果、外部又は内部較正を用いてＭＲＭ３法により求めた量は、従来のＥＬＩＳＡ法によって求めたものに非常に近いＰＳＡ濃度となる。
【０１１５】
なお、この点において、ＥＬＩＳＡ分析では血流中に存在するすべてのＰＳＡ分子を分析しているわけではない。これは、ＰＳＡがα−１抗キモトリプシン（ＡＣＴ）及びα−２マクログロブリン（Ａ２Ｍ）等のある種の血液抗プロテアーゼとともに複合体を形成するからである。Ａ２Ｍと結合したＰＳＡをＥＬＩＳＡでは検出することができないが、Ｔ．Ｆｏｒｔｉｎら（ＭＣＰ，２００８，Ｅ−ｐｕｂ）によって確認されているように、質量分析では分析可能である。ＰＳＡ−Ａ２Ｍ複合体は、総ＰＳＡの約１０％を占めるが、患者の病的状態によってこの量は変化し得る。このＰＳＡの特有の性質が、ＥＬＩＳＡ法とＭＲＭ３法との間で認められた量の差の原因の一つである。
【０１１６】
実施例４：ヒト血清中のトレポネーマパリダム組換えタンパク質の定量分析
本実施例は、梅毒の病原菌であるトレポネーマパリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）由来のタンパク質であり、組み換えにより発現させた２種類のタンパク質（ビオメリュー、フランス、マーシー・レトワール）を用いて行う。組換えタンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏでの発現及び精製を容易にするために、トレポネーマパリダムタンパク質の天然配列は、製造業者により修飾されている。用いた２種類のタンパク質の正確な配列を以下に示す。
【０１１７】
Ｔｐ４３５梅毒の配列
配列番号５１：
ＭＲＧＳＡＣＶＳＣＴＴＶＣＰＨＡＧＫＡＫＡＥＫＶＥＣＡＬＫＧＧＩＦＲＧＴＬＰＡＡＤＣＰＧＩＤＴＴＶＴＦＮＡＤＧＴＡＱＫＶＥＬＡＬＥＫＫＳＡＰＳＰＬＴＹＲＧＴＷＭＶＲＥＤＧＩＶＥＬＳＬＶＳＳＥＱＳＫＡＰＨＥＫＥＬＹＥＬＩＤＳＮＳＶＲＹＭＧＡＰＧＡＧＫＰＳＫＥＭＡＰＦＹＶＬＫＫＴＫＫＧＳＳＫＹＫＹＨＨＨＨＨ
【０１１８】
Ｔｐ５７４梅毒の配列
配列番号５２：
ＭＲＧＳＡＨＨＥＴＨＹＧＹＡＴＬＳＹＡＤＹＷＡＧＥＬＧＱＳＲＤＶＬＬＡＧＮＡＥＡＤＲＡＧＤＬＤＡＧＭＦＤＡＶＳＲＡＴＨＧＨＧＡＦＲＱＱＦＱＹＡＶＥＶＬＧＥＫＶＬＳＫＱＥＴＥＤＳＲＧＲＫＫＷＥＹＥＴＤＰＳＶＴＫＭＶＲＡＳＡＳＦＱＤＬＧＥＤＧＥＩＫＦＥＡＶＥＧＡＶＡＬＡＤＲＡＳＳＦＭＶＤＳＥＥＹＫＩＴＮＶＫＶＨＧＭＫＦＶＰＶＡＶＰＨＥＬＫＧＩＡＫＥＫＦＨＦＶＥＤＳＲＶＴＥＮＴＮＧＬＫＴＭＬＴＥＤＳＦＳＡＲＫＶＳＳＭＥＳＰＨＤＬＶＶＤＴＶＧＴＧＹＨＳＲＦＧＳＤＡＥＡＳＶＭＬＫＲＡＤＧＳＥＬＳＨＲＥＦＩＤＹＶＭＮＦＮＴＶＲＹＤＹＹＧＤＤＡＳＹＴＮＬＭＡＳＹＧＴＫＨＳＡＤＳＷＷＫＴＧＲＶＰＲＩＳＣＧＩＮＹＧＦＤＲＦＫＧＳＧＰＧＹＹＲＬＴＬＩＡＮＧＹＲＤＶＶＡＤＶＲＦＬＰＫＹＥＧＮＩＤＩＧＬＫＧＫＶＬＴＩＧＧＡＤＡＥＴＬＭＤＡＡＶＤＶＦＡＤＧＱＰＫＬＶＳＤＱＡＶＳＬＧＱＮＶＬＳＡＤＦＴＰＧＴＥＹＴＶＥＶＲＦＫＥＦＧＳＶＲＡＫＶＶＡＱＳＳＫＹＫＴＨＨＨＨＨＨ
【０１１９】
Ｂｉｏ−Ｒａｄ社（アメリカ合衆国、カリフォルニア州、ハーキュリーズ）の「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ」試薬を用いて、ブラッドフォード法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．Ｍ．（１９７６）Ａ Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｇｒａｍ Ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｔｈｅ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｄｙｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８−２５４）に従ったタンパク質分析により、Ｔｐ４３５及びＴｐ５７４について組換えタンパク質量を求める。
【０１２０】
結果、Ｔｐ４３５タンパク質バッチの量は０．９７ｍｇ／ｍｌであり、Ｔｐ５７４タンパク質バッチの量は１．４ｍｇ／ｍｌである。
【０１２１】
Ｔｐ４３５及びＴｐ５７４組換えタンパク質を以下の方法で消化する。
・各タンパク質８０μｇをサンプリングし、ｐＨ＝８．０の５０ｍＭ重炭酸アンモニウム緩衝液を添加し、最終的に４００μｌとなるようにする。
・１５０ｍＭのＤＴＴ１００μｌを添加する。
・９５℃で２０分間培養する。
・６０℃で２０分間培養する。
・サンプルを常温に冷却する。
・１５０ｍＭヨードアセトアミド１００μｌを添加する。
・常温、暗所で４０分間培養する。
・トリプシン４μｇを添加する。
・３７℃で４時間培養する。
・消化終了時の各タンパク質消化産物の濃度は１３３．３μｇ／ｍｌである。
【０１２２】
「健康」とされる患者（フランス血液銀行［Ｆｒｅｎｃｈ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋ］）の血清１００μｌを８サンプル、以下のプロトコルに従って同時に消化する。
・１００μｌの各血清を、ｐＨ＝８．０の５０ｍＭ重炭酸アンモニウム３ｍｌで希釈する。
・ＤＴＴを最終濃度が１５ｍＭとなるように添加する。
・６０℃で４０分間還元する。
・チューブを常温に冷却する。
・ヨードアセトアミドを最終濃度が２５ｍＭとなるように添加する。
・暗所、常温で４０分間、アルキル化を行う。
・１／３０の質量比でトリプシンを添加する。
・３７℃で４時間、消化を行う。
・ＤＴＴを最終濃度が１０ｍＭとなるように再添加する。
・６０℃で４０分間還元する。
・チューブを常温に冷却する。
・ヨードアセトアミドを最終濃度が１５ｍＭとなるように再添加する。
・暗所、常温でアルキル化を行う。
・１／３０の比でトリプシンを再添加する。
・３７℃で一晩、消化を行う。
・ギ酸（すなわち最終濃度の０．１％）でサンプルを酸性化する。
・メタノール１ｍｌ、次いで「超純」水／０．１％ギ酸の１ｍｌでＷａｔｅｒｓ社Ｏａｓｉｓ ＨＬＢカラムを平衡化する。
・サンプルを投入し、重力で流す。
・１ｍｌの水／０．１％ギ酸混合物で洗浄する。
・水／０．１％ギ酸混合物中の８０％メタノール１ｍｌで溶出する。
・体積が約５００μｌになるまで、ＳｐｅｅｄＶａｃ（登録商標）ＳＰＤ２０１０型のエバポレータ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ社、アメリカ合衆国、マサチューセッツ州、ウォルサム）で１時間、チューブを乾燥させる。
・均質な消化血清プールを得るために、処理した血清のチューブ８本を混合する。
【０１２３】
以下の較正範囲を調製する。
・１３３．３μｇ／ｍｌのＴｐ５７４タンパク質５０μｌを１３３．３μｇ／ｍｌのＴｐ４３５タンパク質５０μｌに添加する。Ｔｐ５７４及びＴｐ４３５タンパク質それぞれの濃度が２６．６μｇ／ｍｌとなる原液が得られるように、０．１％ギ酸が添加された水４００μｌに上記混合物をすべて添加する（原液）。そして、各タンパク質が１００００ｎｇ／ｍｌの溶液が得られるように、上記原液７５μｌを０．１％ギ酸が添加された水１２５μｌで希釈する。
・５０００ｍｇ／ｍｌの溶液が得られるように、上記原液３７．５μｌを０．１％ギ酸が添加された水１６２．５μｌで希釈する。
・１０００ｎｇ／ｍｌの溶液が得られるように、上記１０μｇ／ｍｌの溶液２０μｌを水１８０μｌで希釈する。
・１００ｎｇ／ｍｌの溶液が得られるように、上記１μｇ／ｍｌの溶液２０μｌを水１８０μｌで希釈する。
・１０ｎｇ／ｍｌの溶液が得られるように、上記１００ｎｇ／ｍｌの溶液２０μｌを水１８０μｌで希釈する。
・５００ｎｇ／ｍｌの溶液が得られるように、上記５μｇ／ｍｌの溶液２０μｌを水１８０μｌで希釈する。
・５０ｎｇ／ｍｌの溶液が得られるように、上記５００ｎｇ／ｍｌの溶液２０μｌを水１８０μｌで希釈する。
・１、５、１０、５０、１００、５００及び１０００ｎｇ／ｍｌのポイントを含む標準範囲を得るために、消化前の血清１００μｌに相当する消化された血清サンプルの７つ分に対してそれぞれ、上記の１００００から５０ｎｇ／ｍｌの各溶液１０μｌを添加する。
・０ｎｇ／ｍｌの範囲ポイントを得るために、上記血清サンプルの最後の分に水１０μｌを添加する。
【０１２４】
上記サンプル及びその各範囲ポイントを、以下のクロマトグラフィーパラメーターを用い、質量分析計の設定が異なる２つの期間で分析する。
・Ｄｉｏｎｅｘ社（アメリカ合衆国、カリフォルニア州、サニーベール）のＵｌｔｉｍａｔｅ３０００クロマトグラフィーシステム
・Ｗａｔｅｒｓ社のＳｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ１８カラム（内径２．１ｍｍ、長さ１００ｍｍ、粒子径３．５μｍ）
・溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ＋０．１％ギ酸
・溶媒Ｂ：ＡＣＮ＋０．１％ギ酸
【０１２５】
下記表８に定義するＨＰＬＣ勾配：
【０１２６】
【表８】
【０１２７】
期間１は、Ｔｐ４３５タンパク質のプロテオタイピックペプチドＳＡＰＳＰＬＴＹＲ（配列番号５３）のモニタリングに相当する。期間２は、Ｔｐ５７４タンパク質のプロテオタイピックペプチドＦＶＰＶＡＶＰＨＥＬＫ（配列番号５４）のモニタリングに相当する。
【０１２８】
各プロテオタイピックペプチドについて、以下の機械パラメーターに従って、１番目にプロリンを有する二価一次フラグメントが選択され、断片化される。
【０１２９】
Ｔｐ４３５タンパク質のための期間１：
以下のパラメーターを除けば、機械パラメーターは実施例１と同じである。
プリカーサー：４９６．５０Ｄａ
一次イオン：４１７．５０Ｄａ
Ｑ３入力バリア：４．００Ｖ
走査開始質量（Ｄａ）：４３０．００Ｄａ
走査終了質量（Ｄａ）：７５０．００Ｄａ
時間（秒）：０．０３２０秒
トラッピング無線周波数振幅（開始）：２．８８
トラッピング無線周波数振幅（終了）：４．１０
イオントラップ出力電圧（開始）：−１４２．０７Ｖ
イオントラップ出力電圧（終了）：−１２９．１３Ｖ
源温度：４５０．００℃
加熱ガス：５０．００ｐｓｉ
クラスタ分離電位：８０．００Ｖ
衝突エネルギー：１８．００ｅＶ
励起エネルギー（ＡＦ２）：０．１２
【０１３０】
Ｔｐ５７４タンパク質のための期間２：
以下のパラメーターを除けば、機械パラメーターは期間１と同じである。
プリカーサー：６１８．４０Ｄａ
一次イオン：４９５．５０Ｄａ
走査開始質量（Ｄａ）：５００．００Ｄａ
走査終了質量（Ｄａ）：８５０．００Ｄａ
時間（秒）：０．０３５０秒
トラッピング無線周波数振幅（開始）：３．１５
トラッピング無線周波数振幅（終了）：４．４８
イオントラップ出力電圧（開始）：−１３９．２４Ｖ
イオントラップ出力電圧（終了）：−１２５．０９Ｖ
クラスタ分離電位：９０．００Ｖ
衝突エネルギー：２５．００ｅＶ
励起エネルギー（ＡＦ２）：０．０９
【０１３１】
５から５０ｎｇ／ｍｌの各範囲ポイントについて、Ｔｐ４３５タンパク質のプロテオタイピックペプチドＳＡＰＳＰＬＴＹＲ（配列番号５３）のｙ３及びｙ５イオン（ｍ／ｚ６４９．４及び４３９．４）の総和のシグナルを測定することにより、下記表９を得ることができた。
【０１３２】
【表９】
【０１３３】
５から５０ｎｇ／ｍｌの各範囲ポイントについて、Ｔｐ５７４タンパク質のプロテオタイピックペプチドＦＶＰＶＡＶＰＨＥＬＫ（配列番号５４）のｙ５及びｙ７イオン（ｍ／ｚ６２３．４及び７９３．４）の総和のシグナルを測定することにより、下記表１０を得ることができた。
【０１３４】
【表１０】
【０１３５】
これらの結果から、図４Ａ及び４Ｂにそれぞれ示すＴｐ４３５タンパク質用及びＴｐ５７４タンパク質用の較正曲線を作成することができる。
【０１３６】
これらの曲線は、線形回帰を用いて方程式としてモデル化され、当該方程式により、Ｔｐ４３５量又はＴｐ５７４量が未知の任意のヒト血清サンプルについて、Ｔｐ４３５及びＴｐ５７４濃度を算出できる。
【０１３７】
Ｔｐ４３５濃度は、次の方程式によって算出される。
ｙ＝４．１４×１０５Ｘ−１．５×１０６
【０１３８】
Ｔｐ５７４濃度は、次の方程式によって算出される。
ｙ＝４．３８×１０４Ｘ−１．５×１０５
【０１３９】
実施例５：一次フラグメントとして二価イオンを用いたＭＲＭ３法による定量分析の性能レベルの改善
同じサンプル処理条件の下で、従来のＭＲＭ分析、又は二価一次フラグメントを用いないＭＲＭ３分析で得られた性能レベルと、実施例４において得られた分析性能レベルを比較する。各タンパク質について、上記３つの方法を用いて同じプロテオタイピックペプチド、すなわち、ＰＳＡについてはペプチドＬＳＥＰＡＥＬＴＤＡＶＫ（配列番号５０）、Ｔｐ４３５タンパク質についてはペプチドＳＡＰＳＰＬＴＹＲ（配列番号５３）、Ｔｐ５７４タンパク質についてはペプチドＦＶＰＶＡＶＰＨＥＬＫ（配列番号５４）を分析する。
【０１４０】
１３３．３μｇ／ｍｌのＴｐ５７４タンパク質５０μｌと、１３３．３μｇ／ｍｌのＴｐ４３５タンパク質５０μｌと、１３３．３μｇ／ｍｌのＰＳＡタンパク質５０μｌと、０．１％ギ酸が添加された水３５０μｌとを含む原液を用いて実施例４のプロトコルに従って調製されたサンプルに対して分析を行う。
【０１４１】
上記３種のタンパク質に対して、実施例４に記載されたクロマトグラフィー法及び質量分析法を使用して、二価一次フラグメントを用いたＭＲＭ３分析を行う。質量分析計の設定は、各プロテオタイピックペプチドに適した設定にあたる３つの期間において決定される。本実施例において、この分析を方法１と呼ぶ。
【０１４２】
一価一次フラグメントを用いたＭＲＭ３分析は、ｍ／ｚが６３６．８のＰＳＡのプロテオタイピックペプチドに対してはｙ９イオン（９４３．５ｍ／ｚ）を、ｍ／ｚが４９６．８のＴｐ４３５のプロテオタイピックペプチドに対してはｙ５イオン（６４９．２ｍ／ｚ）を、ｍ／ｚが６１８．８のＴｐ５７４のプロテオタイピックペプチドに対してはｙ５イオン（６２３．３ｍ／ｚ）を用いて行う。クロマトグラフィーのピークは、以下の二次フラグメントのシグナルを足し合わせることによって得られる：ＰＳＡのプロテオタイピックペプチドに対してはｍ／ｚ６０９＋６２７＋６４６＋６９８の二次フラグメントのシグナル、Ｔｐ４３５のプロテオタイピックペプチドに対してはｍ／ｚ６３１．２＋４５７．４＋４７５．４の二次フラグメントのシグナル、Ｔｐ５７４のプロテオタイピックペプチドに対してはｍ／ｚ４７７．５＋３６４．２＋６０５．４の二次フラグメントのシグナル。本実施例において、この分析を方法２と呼ぶ。
【０１４３】
方法２では、質量分析計の操作が３つの期間に分かれる。
【０１４４】
ＰＳＡのための期間１：
以下のパラメーターを除けば、機械パラメーターは実施例１と同じである。
プリカーサー：６３６．８０Ｄａ
一次イオン：９４３．５０Ｄａ
走査開始質量（Ｄａ）：６００．００Ｄａ
走査終了質量（Ｄａ）：８００．００Ｄａ
時間（秒）：０．０２００秒
トラッピング無線周波数振幅（開始）：３．５３
トラッピング無線周波数振幅（終了）：４．２９イオントラップ出力電圧（開始）：−１３５．２０Ｖ
イオントラップ出力電圧（終了）：−１２７．１１Ｖ
源温度：４５０．００℃
加熱ガス：５０．００ｐｓｉ
クラスタ分離電位：１２０．００Ｖ
Ｑ０前の入力電位：４．００Ｖ
衝突エネルギー：２３．００ｅＶ
励起エネルギー（ＡＦ２）：０．１２
【０１４５】
Ｔｐ４３５タンパク質のための期間２：
以下のパラメーターを除けば、機械パラメーターは期間１と同じである。
プリカーサー：４９６．５０Ｄａ
一次イオン：６４９．２０Ｄａ
Ｑ３入力バリア：４．００Ｖ
走査開始質量（Ｄａ）：４３０．００Ｄａ
走査終了質量（Ｄａ）：６４０．００Ｄａ
時間（秒）：０．０２１０秒
トラッピング無線周波数振幅（開始）：２．８８
トラッピング無線周波数振幅（終了）：３．６８
イオントラップ出力電圧（開始）：−１４２．０７Ｖ
イオントラップ出力電圧（終了）：−１３３．５８Ｖ
クラスタ分離電位：８０．００Ｖ
衝突エネルギー：２３．００ｅＶ
励起エネルギー（ＡＦ２）：０．１２
【０１４６】
Ｔｐ５７４タンパク質のための期間３：
以下のパラメーターを除けば、機械パラメーターは期間１と同じである。
プリカーサー：６１８．４０Ｄａ
一次イオン：６２３．３０Ｄａ
Ｑ３入力バリア：４．００Ｖ
走査開始質量（Ｄａ）：３５０．００Ｄａ
走査終了質量（Ｄａ）：６２０．００Ｄａ
時間（秒）：０．０２７０秒
トラッピング無線周波数振幅（開始）：２．５８
トラッピング無線周波数振幅（終了）：３．６０
イオントラップ出力電圧（開始）：−１４５．３０Ｖ
イオントラップ出力電圧（終了）：−１３４．３９Ｖ
衝突エネルギー：３５．００ｅＶ
励起エネルギー（ＡＦ２）：０．１０
【０１４７】
ＭＲＭ分析は、ｍ／ｚが６３６．８のＰＳＡのプロテオタイピックペプチドに対してはｙ９イオン（９４３．５ｍ／ｚ）を、ｍ／ｚが４９６．８のＴｐ４３５のプロテオタイピックペプチドに対してはｙ５イオン（６４９．２ｍ／ｚ）を、ｍ／ｚが６１８．８のＴｐ５７４のプロテオタイピックペプチドに対してはｙ５イオン（６２３．３ｍ／ｚ）を用いて行う。本実施例において、この分析を方法３と呼ぶ。
【０１４８】
方法３において、質量分析パラメーターは以下のとおりである。
走査タイプ：ＭＲＭ（ＭＲＭ）
極性：正
イオン源：Ｔｕｒｂｏ Ｖ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社）
Ｑ１設定：ユニット分解能でフィルタリング
Ｑ３設定：ユニット分解能でフィルタリング
２回の走査間の中断：５．００７ミリ秒
Ｑ１質量（Ｄａ）：４９６．２０
Ｑ３質量（Ｄａ）：６４９．３０
走査時間：３０．００
クラスタ分離電位：１１０Ｖ
衝突エネルギー：２５ｅＶ
衝突セル出力電位：１０Ｖ
【０１４９】
Ｑ１質量（Ｄａ）：６３６．８
Ｑ３質量（Ｄａ）：９４３．５
走査時間：３５．００
クラスタ分離電位：１１５Ｖ
衝突エネルギー：２３ｅＶ
衝突セル出力電位：２２Ｖ
【０１５０】
Ｑ１質量（Ｄａ）：６１８．４
Ｑ３質量（Ｄａ）：６２３．４
走査時間：３５．００
クラスタ分離電位：１２０Ｖ
衝突エネルギー：２９ｅＶ
衝突セル出力電位：１０Ｖ
【０１５１】
カーテンガス：５０．００ｐｓｉ
コーン電圧：５５００．００Ｖ
源温度：５００．００℃
噴霧ガス：５０．００ｐｓｉ
加熱ガス：４０．００ｐｓｉ
衝突セル充填：９．００（任意単位）
Ｑ０前の入力電位：５．００Ｖ
【０１５２】
表１１に示すように、バックグラウンドノイズで割ったシグナルの比が１０となるタンパク質量を算出することによって、上記３種のタンパク質の定量限界が求められる。
【０１５３】
【表１１】
【０１５４】
本発明に記載の方法で得られた定量限界は、方法２及び３で得られたものよりはるかに低い。従って、本発明では、他の方法より感度のよい定量分析となる。
【０１５５】
実施例６：衝突エネルギー最適化
ＭＲＭ３を実施するために、プリカーサーイオン及び一次フラグメントの選択は不可欠である。必ずしも最も強度の強い一次フラグメントを選択する必要はない。本発明において、プロリン又はヒスチジンを有する二価イオンは、より特異的な断片化を示し、ＭＳ３において生成される二次フラグメントがより少なくなること、及び、それらが最も有効な定量分析を行うのにはるかに適していることが実証された。
【０１５６】
例として、Ｔｐ４３５タンパク質のプロテオタイピックペプチドＳＡＰＳＰＬＴＹＲ（配列番号５３）の衝突エネルギーを最適化した。
【０１５７】
Ｔｐ４３５タンパク質５０μｌを消化し、Ｗａｔｅｒｓ社Ｏａｓｉｓ ＨＬＢカラムで脱塩し、０．１％ギ酸を添加したＡＣＮ／水の５０／５０混合物３００μｌに添加する。そして、その混合物を流量１０μｌ／分で質量分析計へ投入する。
【０１５８】
機械パラメーターは以下のとおりである。
走査タイプ：高感度プロダクトイオン（Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｉｏｎ（ＥＰＩ））
極性：正
走査モード：プロファイル
イオン源：Ｔｕｒｂｏ Ｖ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）
プリカーサー：４９６．２０Ｄａ
Ｑ１の分解能：ユニット
走査速度：１００００Ｄａ／秒
Ｑ０でのトラッピング：無
Ｑ３での線形イオントラップ充填時間：１．００ミリ秒
動的充填：アクティブ
ＴＩＣ標的 ＥＭＳ走査：１０．００×１０７カウント
ＴＩＣ標的：１０．００×１０７カウント
最大充填時間：２５０．０００ミリ秒
最小充填時間：０．０５０ミリ秒
初期設定充填時間：１．０００ミリ秒
Ｑ３入力電圧：８．００Ｖ
Ｑ３でのイオントラップ走査増分：０．１２Ｄａ
走査開始質量（Ｄａ）：２００．００Ｄａ
走査終了質量（Ｄａ）：６６７．０１Ｄａ
時間（秒）：０．０４６７秒
トラッピング無線周波数振幅（開始）：２．１９
トラッピング無線周波数振幅（終了）：３．８２
イオントラップ出力電圧（開始）：−１４９．３５Ｖ
イオントラップ出力電圧（終了）：−１２５．６８Ｖ
走査開始質量（Ｄａ）：６６７．０１Ｄａ
走査終了質量（Ｄａ）：１０００Ｄａ
時間（秒）：０．０３３３秒
トラッピング無線周波数振幅（開始）：３．８２
トラッピング無線周波数振幅（終了）：４．９９
イオントラップ出力電圧（開始）：−１２５．６８Ｖ
イオントラップ出力電圧（終了）：−１０８．８０Ｖ
カーテンガス：３０．００ｐｓｉ
コーン電圧：５５００．００Ｖ
源温度：常温
噴霧ガス：１８．００ｐｓｉ
加熱ガス：常温
衝突セル充填：高
クラスタ分離電位：１００．００Ｖ
Ｑ０前の入力電位：１０．００Ｖ
衝突エネルギー：５〜６０ｅＶ
【０１５９】
衝突エネルギーを４０ｅＶとする場合（図５Ａ）、衝突エネルギーが３５又は３０ｅＶ（それぞれ図５Ｂ及び５Ｃ）での断片化と比較して、Ｎ末端の位置にプロリンを有する二価一次フラグメントに相当するフラグメント４１７．２の強度があまり強くないことがわかる。一次フラグメント４１７．２の強度が低下すると、他のフラグメントの強度は増加する。従って、最も強度の強い一次フラグメント、すなわち一価一次フラグメントに相当する６４９．５Ｄａのものを選択し、衝突エネルギーを４０ｅＶとすることが好ましい。しかしながら、図５Ｄに見られる衝突エネルギーの最適化に示されるように、この選択が最適ではない。
【０１６０】
１０μｌ／分で投入し、衝突エネルギーのみを５から６０ｅＶに変化させることによって、衝突エネルギーの最適化を行う。前のパラメーターとの違いは、Ｑ１において質量４９６．５Ｄａを選択し、Ｑ３において質量４１７．８又は６４９．５を選択するサイクルタイム１００秒のＭＲＭタイプの走査モードとすること、及び、以下のパラメーターの調整だけである。
噴霧ガス：３５．００
クラスタ分離電位：８０．００
Ｑ０前の入力電位：３．００
【０１６１】
Ｎ末端の位置にプロリンを有する二価フラグメントに相当する遷移４９６．３／４１７．８、及び、最も強度の強い一価フラグメントに相当する遷移４９６．３／６４９．５の衝突エネルギーを最適化することによって、図５Ｄに示すように、実施例４に対応する分析において遷移４９６．３／４１７．８ではシグナルに著しい利点が得られる。
【０１６２】
このシグナルの利点は、表１２に示されるように、定量限界がより低いという特徴を有する、分析性能レベルがより高い定量分析を反映したものである。
【０１６３】
【表１２】
【０１６４】
質量分析パラメーターを最適化した場合、本発明に記載の方法に従って二価一次イオンで得られた定量限界は、一価一次イオンで得られたものよりはるかに低い。従って、二価一次イオンを用いる上記方法によって、より感度のよい定量方法を行うことが可能となる。
【０１６５】
実施例７：一次フラグメントとして二価イオンを用いたＭＲＭ３法による定量分析の性能レベルの改善
プロリンを２個有し、そのうち１個は２番目にあるＴｐ４３５タンパク質のプロテオタイピックペプチドＳＡＰＳＰＬＴＹＲ（配列番号５３）の断片化を、最も強度の強いフラグメントイオン、又はプロリンを有する一価型フラグメントイオン、又は同イオンの二価型のいずれかを一次イオンとして選択することにより比較した。
【０１６６】
最も強度の強い一価一次イオンは、ｍ／ｚ６４９．２のｙ５イオンである。プロリンを有する一価型又は二価型一次フラグメントイオンは、一価型がｍ／ｚ８３３．４の、二価型がｍ／ｚ４１７．５のｙ７イオンである。
【０１６７】
Ｔｐ４３５タンパク質５０μｌを消化し、Ｗａｔｅｒｓ社Ｏａｓｉｓ ＨＬＢカラムで脱塩し、０．１％ギ酸を添加したＡＣＮ／水の５０／５０混合物３００μｌに添加する。その後、その混合物を流量１０μｌ／分で質量分析計へ投入する。
【０１６８】
機械パラメーターは以下のとおりである。
最も強度の強い一価一次イオンのＭＳ３の場合：
走査タイプ：ＭＳ３
極性：正
走査モード：プロファイル
イオン源：Ｔｕｒｂｏ Ｖ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）
プリカーサー：４９６．３０Ｄａ
一次イオン：６４９．３０Ｄａ
Ｑ１の分解能：ユニット
走査速度：１００００Ｄａ／秒
Ｑ０でのトラッピング：有
Ｑ３での線形イオントラップ充填時間：１５０．００ミリ秒
動的充填：無
断片化：有
励起時間：２５．００ミリ秒
Ｑ３入力電圧：８．００Ｖ
Ｑ３でのイオントラップ走査増分：０．１２Ｄａ
走査開始質量（Ｄａ）：２５０．００Ｄａ
走査終了質量（Ｄａ）：６４０．００Ｄａ
トラッピング無線周波数振幅（開始）：３．０８トラッピング無線周波数振幅（終了）：４．３６
イオントラップ出力電圧（開始）：−１４４．９９Ｖイオントラップ出力電圧（終了）：−１２２．１９Ｖカーテンガス：２０．００ｐｓｉ
コーン電圧：５５００．００Ｖ
源温度：常温
噴霧ガス：３５．００ｐｓｉ
加熱ガス：常温
衝突セル充填：高
クラスタ分離電位：１１０．００Ｖ
Ｑ０前の入力電位：１０．００Ｖ
衝突エネルギー：２４ｅＶ
励起エネルギー：０．１１ｅＶ
【０１６９】
一価一次イオンｙ７のＭＳ３の場合：
走査タイプ：ＭＳ３
極性：正
走査モード：プロファイル
イオン源：Ｔｕｒｂｏ Ｖ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）
プリカーサー：４９６．３０Ｄａ
一次イオン：８３３．４０Ｄａ
Ｑ１の分解能：ユニット
走査速度：１００００Ｄａ／秒
Ｑ０でのトラッピング：有
Ｑ３での線形イオントラップ充填時間：１５０．００ミリ秒
動的充填：無
断片化：有
励起時間：２５．００ミリ秒
Ｑ３入力電圧：８．００Ｖ
Ｑ３でのイオントラップ走査増分：０．１２Ｄａ
走査開始質量（Ｄａ）：３００．００Ｄａ
走査終了質量（Ｄａ）：８２０．００Ｄａ
トラッピング無線周波数振幅（開始）：３．２４
トラッピング無線周波数振幅（終了）：４．９５
イオントラップ出力電圧（開始）：−１４２．０６Ｖ
イオントラップ出力電圧（終了）：−１１１．６６Ｖ
カーテンガス：２０．００ｐｓｉ
コーン電圧：５５００．００Ｖ
源温度：常温
噴霧ガス：３５．００ｐｓｉ
加熱ガス：常温
衝突セル充填：高
クラスタ分離電位：１１０．００Ｖ
Ｑ０前の入力電位：１０．００Ｖ
衝突エネルギー：２４ｅＶ
励起エネルギー：０．１４ｅＶ
【０１７０】
二価一次イオンｙ７のＭＳ３の場合：
走査タイプ：ＭＳ３
極性：正
走査モード：プロファイル
イオン源：Ｔｕｒｂｏ Ｖ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）
プリカーサー：４９６．３０Ｄａ
一次イオン：４１７．５０Ｄａ
Ｑ１の分解能：ユニット
走査速度：１００００Ｄａ／秒
Ｑ０でのトラッピング：有
Ｑ３での線形イオントラップ充填時間：１５０．００ミリ秒
動的充填：無
断片化：有
励起時間：２５．００ミリ秒
Ｑ３入力電圧：８．００Ｖ
Ｑ３でのイオントラップ走査増分：０．１２Ｄａ
走査開始質量（Ｄａ）：３００．００Ｄａ
走査終了質量（Ｄａ）：８５０．００Ｄａ
トラッピング無線周波数振幅（開始）：３．２４
トラッピング無線周波数振幅（終了）：５．０５
イオントラップ出力電圧（開始）：−１４２．０６Ｖ
イオントラップ出力電圧（終了）：−１０９．９１Ｖ
カーテンガス：２０．００ｐｓｉ
コーン電圧：５５００．００Ｖ
源温度：常温
噴霧ガス：３５．００ｐｓｉ
加熱ガス：常温
衝突セル充填：高
クラスタ分離電位：１１０．００Ｖ
Ｑ０前の入力電位：１０．００Ｖ
衝突エネルギー：２５ｅＶ
励起エネルギー：０．１２ｅＶ
【０１７１】
図６Ａに示すように、ｍ／ｚ＝６４９．２の最も強度の強い一価一次フラグメントイオンでは、上述の場合のようにＭＳ３で行われた断片化は非常に複雑であり、すべての二次断片化ピークにシグナルが分かれている。ＭＳ３スペクトルの最も強度の強いピークは、３．２×１０５カウントである。
【０１７２】
図６Ｂに示すように、ｍ／ｚ＝８３３．４の一価一次フラグメントイオンｙ７では、得られた断片化スペクトルは非常に複雑であり、多くの二次断片化ピークを含む。ＭＳ３スペクトルの最も強度の強いピークは、３．８×１０５カウントである。
【０１７３】
図６Ｃに示すように、ｍ／ｚ＝４１７．５の二価一次イオンｙ７では、行われた断片化がはるかに単純であり、シグナルは５つの大きなピークに集約されている。大きなピークのシグナルは、７．３×１０６カウントである。
【０１７４】
これによって、本発明に従ってペプチドを選択することにより、より感度のよい分析を行うことができ、この選択が実施例５において認められた感度の利点をもたらす要因であることが示される。
【０１７５】
ＭＲＭ３を行うために、一次フラグメントの選択は不可欠である。本実施例において示されるように、必ずしも最も強度の強い一次フラグメントを選択する必要はない。また、プリカーサーイオンの選択も重要である。本発明において、２個のプロリン、又は、１個のプロリンと１個のヒスチジンとを有する二価プリカーサーイオンが、より特異的な断片化を示し、ＭＳ３において生成される二次フラグメントがより少なくなること、及び、それらが最も有効な定量分析を行うのにはるかに適していることが実証された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の標的タンパク質を定量的に検出するための方法であって、
ａ）ペプチドを生成するために前記サンプルを処理する工程と、
ｂ）前記標的タンパク質から生成した少なくとも１つのプロテオタイピックペプチドを質量分析法によって定量分析する工程とを含み、
前記質量分析法では、
ｉ）前記プロテオタイピックペプチドをイオン化してプリカーサーイオンを生成し、前記プリカーサーイオンをその質量ｍ／ｚに基づいてフィルタリングし、目的とする前記標的タンパク質に応じて所定の質量（ｍ／ｚ）１のプリカーサーイオンを選択し、
ｉｉ）その選択されたプリカーサーイオンを一次フラグメントイオンへと断片化し、
ｉｉｉ）その生成した一次フラグメントイオンをその質量ｍ／ｚに基づいてフィルタリングし、目的とする前記標的タンパク質に応じて所定の質量（ｍ／ｚ）２の一次フラグメントイオンを選択し、
ｉｖ）その選択された一次フラグメントイオンを二次フラグメントイオンへと断片化し、
ｖ）前記二次フラグメントイオンの少なくとも一部を検出し、一連の定量的測定値を得、
ｖｉ）二次イオンに関する少なくとも１つの定量的測定値を選択し、前記生成したプロテオタイピックペプチドの量及び前記サンプル中に存在する前記標的タンパク質の量と相関付けを行い、ここで、
選択された前記質量（ｍ／ｚ）２の一次フラグメントイオンは、プロリン及び／又はヒスチジンを１番目に有する二価ペプチドであることを特徴とする、方法。
【請求項２】
選択された前記質量（ｍ／ｚ）１のプリカーサーイオンは、アミノ酸数ｎが６から１５であり、且つ、少なくとも１個のプロリンを２番目からｎ−２番目に、及び／又は、少なくとも１個のヒスチジンを１番目からｎ−２番目に有する二価ペプチドであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
選択された前記質量（ｍ／ｚ）１のプリカーサーイオンは少なくとも、２個のプロリン、又は、１個のプロリンと１個のヒスチジンとを含むことを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記生成したペプチドの質量分析による定量分析の前に、工程ａ）で生成した前記ペプチドのクロマトグラフィー又は電気泳動による分離を行うことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記クロマトグラフィーによる分離は、逆相クロマトグラフィーによる分離を行うことを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記生成したペプチドの質量分析による定量分析は、三連四重極を備えた質量分析計を用いて行うことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記生成したペプチドの質量分析による定量分析は、イオントラップを備えた質量分析計を用いて行うことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記サンプルの処理は、プロテアーゼ酵素、例えばトリプシン等による消化によって行うことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
工程ｖ）において、前記二次フラグメントイオンの少なくとも一部によって誘導される電流の強度を時間の関数として検出し、所定期間に得られたシグナルを、存在する各種イオンの質量ｍ／ｚに応じた質量スペクトルに分解し、前記所定期間に存在する検出された二次イオンそれぞれに関する質量ピークを得、選択された少なくとも１つの二次イオンの電流に相当するシグナルを再構成し、その相当する測定電流の強度を、工程ｖｉ）で選択される前記定量的測定値とすることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
工程ｖｉ）において、前記所定期間で最大のピークｍ／ｚを有する二次フラグメントイオンに関する定量的測定値を選択することを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
工程ｖｉ）において、前記相関付けは、少なくとも２つの定量的測定値の合計値に基づいて行い、前記少なくとも２つの定量的測定値はそれぞれ、前記所定期間で最大のピークｍ／ｚを有する二次フラグメントイオンに関するものであることを特徴とする、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
工程ｖｉ）で行う前記相関付けは、較正曲線を用いて行うことを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
工程ｖｉ）で行う前記相関付けは、重ペプチドを用いた内部較正によって行うことを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１】
サンプル中の標的タンパク質を定量的に検出するための方法であって、
ａ）ペプチドを生成するために前記サンプルを処理する工程と、
ｂ）前記標的タンパク質から生成した少なくとも１つのプロテオタイピックペプチドを質量分析法によって定量分析する工程とを含み、
前記質量分析法では、
ｉ）前記プロテオタイピックペプチドをイオン化してプリカーサーイオンを生成し、前記プリカーサーイオンをその質量ｍ／ｚに基づいてフィルタリングし、目的とする前記標的タンパク質に応じて所定の質量（ｍ／ｚ）１のプリカーサーイオンを選択し、
ｉｉ）その選択されたプリカーサーイオンを一次フラグメントイオンへと断片化し、
ｉｉｉ）その生成した一次フラグメントイオンをその質量ｍ／ｚに基づいてフィルタリングし、目的とする前記標的タンパク質に応じて所定の質量（ｍ／ｚ）２の一次フラグメントイオンを選択し、
ｉｖ）その選択された一次フラグメントイオンを二次フラグメントイオンへと断片化し、
ｖ）前記二次フラグメントイオンの少なくとも一部を検出し、一連の定量的測定値を得、
ｖｉ）二次イオンに関する少なくとも１つの定量的測定値を選択し、前記生成したプロテオタイピックペプチドの量及び前記サンプル中に存在する前記標的タンパク質の量と相関付けを行い、ここで、
選択された前記質量（ｍ／ｚ）２の一次フラグメントイオンは、プロリン及び／又はヒスチジンを１番目に有する二価ペプチドであることを特徴とする、方法。
【請求項２】
選択された前記質量（ｍ／ｚ）１のプリカーサーイオンは、アミノ酸数ｎが６から１５であり、且つ、少なくとも１個のプロリンを２番目からｎ−２番目に、及び／又は、少なくとも１個のヒスチジンを１番目からｎ−２番目に有する二価ペプチドであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
選択された前記質量（ｍ／ｚ）１のプリカーサーイオンは少なくとも、２個のプロリン、又は、１個のプロリンと１個のヒスチジンとを含むことを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記生成したペプチドの質量分析による定量分析の前に、工程ａ）で生成した前記ペプチドのクロマトグラフィー又は電気泳動による分離を行うことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記クロマトグラフィーによる分離は、逆相クロマトグラフィーによる分離を行うことを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記生成したペプチドの質量分析による定量分析は、三連四重極を備えた質量分析計を用いて行うことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記生成したペプチドの質量分析による定量分析は、イオントラップを備えた質量分析計を用いて行うことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記サンプルの処理は、プロテアーゼ酵素、例えばトリプシン等による消化によって行うことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
工程ｖ）において、前記二次フラグメントイオンの少なくとも一部によって誘導される電流の強度を時間の関数として検出し、所定期間に得られたシグナルを、存在する各種イオンの質量ｍ／ｚに応じた質量スペクトルに分解し、前記所定期間に存在する検出された二次イオンそれぞれに関する質量ピークを得、選択された少なくとも１つの二次イオンの電流に相当するシグナルを再構成し、その相当する測定電流の強度を、工程ｖｉ）で選択される前記定量的測定値とすることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
工程ｖｉ）において、前記所定期間で最大のピークｍ／ｚを有する二次フラグメントイオンに関する定量的測定値を選択することを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
工程ｖｉ）において、前記相関付けは、少なくとも２つの定量的測定値の合計値に基づいて行い、前記少なくとも２つの定量的測定値はそれぞれ、前記所定期間で最大のピークｍ／ｚを有する二次フラグメントイオンに関するものであることを特徴とする、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
工程ｖｉ）で行う前記相関付けは、較正曲線を用いて行うことを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
工程ｖｉ）で行う前記相関付けは、重ペプチドを用いた内部較正によって行うことを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【公表番号】特表２０１２−５２８３１３（Ｐ２０１２−５２８３１３Ａ）
【公表日】平成２４年１１月１２日（２０１２．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１２４３１（Ｐ２０１２−５１２４３１）
【出願日】平成２２年５月２１日（２０１０．５．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２０１０／０５０９９１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１３６７０６
【国際公開日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【出願人】（５０４２３８３０１）ビオメリュー (74)
【出願人】（５０８０１９３１１）ユニヴェルシテ クロード ベルナール リヨン １ (6)
【出願人】（３０５０２３５８４）サントル・ナシオナル・ド・ラ・ルシェルシュ・シアンティフィック (8)
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ
【住所又は居所原語表記】３ ｒｕｅ Ｍｉｃｈｅｌ Ａｎｇｅ， ７５７９４ ＰＡＲＩＳ ＣＥＤＥＸ １６， Ｆｒａｎｃｅ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１１月１２日（２０１２．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年５月２１日（２０１０．５．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２０１０／０５０９９１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１３６７０６
【国際公開日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【出願人】（５０４２３８３０１）ビオメリュー (74)
【出願人】（５０８０１９３１１）ユニヴェルシテ クロード ベルナール リヨン １ (6)
【出願人】（３０５０２３５８４）サントル・ナシオナル・ド・ラ・ルシェルシュ・シアンティフィック (8)
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ
【住所又は居所原語表記】３ ｒｕｅ Ｍｉｃｈｅｌ Ａｎｇｅ， ７５７９４ ＰＡＲＩＳ ＣＥＤＥＸ １６， Ｆｒａｎｃｅ
【Ｆターム（参考）】
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