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質量分析方法
説明

質量分析方法

【課題】質量分析方法において、高分子量の物質の高感度な質量分析を可能にする。
【解決手段】基板1として、透明基板を用い、試料Sとして、マトリクス剤Mが混合されたマトリクス混合試料を用意し、試料Sを基板1の表面1aに供給し、基板1の裏面1b側から、該基板1の表面1aで全反射するように、該基板1に励起光Loを入射させることにより、該基板1の表面1aにエバネッセント光Leを生じさせ、エバネッセント光Leの照射により、被分析物質Aを基板1から脱離させ、イオン化し、該イオン化した被分析物質Aを捕捉して質量分析を行う。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、基板表面に接触された試料を、該基板表面から脱離させ、イオン化した、試料中の被分析物質を捕捉して質量分析する質量分析方法に関するものである。
【背景技術】
【0002】
物質の同定等に用いられる分析法において、基板の表面に付着した被分析物質を基板表面から脱離させ、イオン化させてその物質の質量と荷電の比によって物質を同定する、質量分析方法が知られている。例えば、飛行時間型質量分析法(Time of Flight Mass Spectroscopy : TOF-MS)は、イオン化した被分析物質を高電圧電極間で所定距離飛行させて、その飛行時間により物質の質量を分析するものである。
【0003】
このような質量分析法における被分析物質の脱離、イオン化の一つとして、レーザ照射を用いたレーザ脱離イオン化法がある。レーザ光を用いたイオン化法では、微小量の試料での分析が可能である一方、高いパワーのレーザ光を必要とする。高いパワーのレーザ光を用いた場合、被分析物質が損傷する(フラグメント化や変性などを生じる)恐れがあり、特に、高分子量の物質脱離、イオン化が困難であった。これを解決する手段として、マトリクス支援レーザ脱離イオン化法(MALDI)が提案され、広く知られている。
【0004】
MALDI法は、被分析物質を含む試料をマトリクス剤と呼ばれるシナピン酸やグリセリン等に混入したマトリクス混合試料を用い、マトリクス剤が吸収した光エネルギーを利用して被分析物質をマトリクス剤と共に気化させるとともに、被分析物質をイオン化させる方法である。MALDI法は、被分析物質に対しフラグメント化や変性等の化学的な影響の少ないソフトイオン化法として、難揮発性の物質や生体分子、合成高分子等の高分子量の物質の質量分析に幅広く用いられている(特許文献1など)。
【0005】
一方で、MALDI法では、試料中にマトリクスと被分析物質が混晶状態を作るために試料中の被分析物質の存在比率が場所によって変化してしまうこと、試料表面が粗く、光侵入長が定義できないなどの理由から、被分析物質を定量することが難しい。
【0006】
定量性を議論するためには、マトリクス剤を用いない試料の脱離、イオン化を図る方法として、基板裏面に配置されたプリズムから、レーザ光を入射させ、基板表面内側で全反射させることにより生じるエバネッセント光を用いる方法および装置が特許文献2において提案されている。
【特許文献1】特開平9−320515号公報
【特許文献2】特開2007−225395号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
既述の通り、レーザ光等の照射光を試料に直接照射することにより、試料の脱離、イオン化を図る場合、被分析物質のフラグメント化および変性が生じるという問題がある。
【0008】
図5はMALDI法による試料の基板51からの脱離、イオン化を模式的に示す図である。図5に示すように、MALDI法によれば、被分析物質Aがマトリクス剤Mと混合されており、レーザ光Lの直接照射の影響を一部和らげることはできるが、レーザ光Lはマトリクス剤Mだけでなく、同時に被分析物質Aにも照射されるため、被分析物質Aへのレーザ光直接照射によるダメージ抑制は未だ十分とは言えず、被分析物質Aの一部は、フラグメント化、変性等を生じた状態(図中符号aで示す。)で脱離、イオン化される。
【0009】
図6は、特許文献2に開示されている、エバネッセント光を用いて試料の脱離、イオン化をさせる形態を模式的に示す図である。図6に示すように、プリズム61の一面(試料面)61aに付着させた試料に対し、レーザ光Lをプリズム61の他の一面61bから、試料面61aで全反射するように入射させ、試料面61a上にエバネッセント光Leを生じさせ、このエバネッセント光Leの照射により被分析物質Aを脱離させ、イオン化させる。この方法によれば、レーザ光を直接照射する場合と比較して、被分析物質Aのフラグメント化および変性は抑制できると考えられる。しかしながら、特許文献2のように定量分析を前提とし、マトリクス剤を用いない分析方法においては、エバネッセント光Leが直接被分析物質Aに照射されることとなるために、やはり被分析物質Aの一部は、フラグメント化、変性等を生じた状態(図中aで示す。)で脱離、イオン化され、光の直接照射による被分析物質の損傷についての問題は未だ残されている。
【0010】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、被分析物質への照射光による損傷を従来以上に抑制し、高分子量の物質の質量分析が可能な質量分析方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明の質量分析方法は、質量分析用基板の表面に供給され、該基板に付着した試料に光を照射することにより、該試料中の被分析物質を前記基板から脱離させ、イオン化し、該イオン化した前記被分析物質を捕捉して質量分析を行う質量分析方法において、
前記基板として、透明基板を用い、
前記試料として、マトリクス剤が混合されたマトリクス混合試料を用意し、
前記試料を前記基板の表面に供給し、
前記基板の裏面側から、該基板の表面で全反射するように、該基板に励起光を入射させることにより、該基板の表面にエバネッセント光を生じさせ、
該エバネッセント光の照射により、前記被分析物質を前記基板から脱離させることを特徴とする。
【0012】
前記基板として、該基板の表面に、光吸収材料、電場増強材料および/または脱離促進剤を備えた基板を用いることが望ましい。特に、前記脱離促進剤としては、ニトロ化合物を用いることが望ましい。ニトロ化合物としては、例えば、ニトロセルロース、トリニトロトルエン(TNT)、ジニトロトルエン(DNT)、ニトロナフタレン、硝酸エステル、アルキルニトラトエチルニトラミン、ニトログアニジン、ヘキソゲン、3−ニトロ−1,2,4−トリアゾール−5−オンおよびヘキサニトロヘキサアザイソウルチタンなどが挙げられる。
【発明の効果】
【0013】
本発明の質量分析方法は、試料として、マトリクス剤混合試料を用いており、かつ、励起光の全反射に伴い生じるエバネッセント光により被分析物質の脱離、イオン化を行うものである。かかる構成により、レーザ光を直接、マトリクス剤混合試料に照射する場合と比較して、試料への光照射によるダメージ(被分析物質の損傷、フラグメント化など)を抑制することができ、マトリクス剤を用いずエバネッセント光を被分析物質に照射する場合と比較しても、光によるダメージをよりよく抑制することができる。本発明の質量分析方法によれば、試料への光によるダメージを従来よりも効果的に抑制することができるため、従来と比較して精度の高い測定が可能となると共に、光によるダメージが大きい分子量の大きな被測定物質の測定が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【0014】
以下、図面を参照して本発明の実施形態の質量分析方法について説明する。
【0015】
まず、図1を参照して、質量分析方法を実施するための質量分析装置の一実施形態について説明する。本実施形態の質量分析装置は飛行時間型質量分析装置(TOF−MS)である。図1は本実施形態の質量分析装置10の構成を示す概略図である。
【0016】
図示されるように、質量分析装置10は、真空に保たれたボックス11内に、質量分析用基板1の裏面1b側から、該基板1の表面1aで全反射するように、該基板1に励起光Loを入射させることにより、該基板1の表面1aにエバネッセント光Leを生じさせるためのプリズム21および光源22からなる励起光照射手段20と、エバネッセント光Leの照射により基板1から脱離した被分析物質Aを検出して被分析物質Aの質量を分析する分析手段14とを備え、質量分析用基板1と分析手段14との間に、基板1の表面1aに対向する位置に配された引き出しグリッド15と、引き出しグリッド15の質量分析用基板1側の面と反対側の面に対向して配されたエンドプレート16を備えた構成としている。
【0017】
質量分析用基板1は透光部材から構成されており、測定対象となる試料Sが表面1aに供給され、該表面1aに試料Sが付着した状態で、プリズム21の一面21a上に載置されるものである。
【0018】
励起光照射手段20において、プリズム21は、基板1と試料Sとの界面1aで励起光Loを全反射させるように基板1内に励起光Loを入射させるための導光部材であり、光源22は、プリズム21の他の一面21bから基板1の表面1a(基板と試料との界面)で励起光Loであるレーザ光が全反射するように配置構成されている。光源22としては、例えば、波長337nm、パルス幅50ps〜50ns程度のパルスレーザ光源を用いる。光源22とプリズム21との間には、必要に応じて、光源22から出射される励起光Loを導光するミラー、レンズなどの導光系を備えていてもよい。プリズム21上には、屈折率マッチングオイルが塗布されており、プリズム21と基板1とは、屈折率マッチングオイルを介して接触される。なお、プリズム21と基板1とが一体的に形成されたセンサチップとして質量分析装置に挿入出されるように構成されていてもよい。
【0019】
分析手段14は、エバネッセント光Leの照射により質量分析用基板1の表面1aから脱離され、引き出しグリッド15およびエンドプレート16の中央の孔を通過して飛行してきた被分析物質Aを検出する検出器17と、検出器17の出力を増幅させるアンプ18と、アンプ18からの出力信号を処理するデータ処理部19により概略構成されている。
【0020】
以下に上記構成の質量分析装置10を用いた、本発明の実施形態にかかる質量分析方法について説明する。
【0021】
まず、試料Sとして、被分析物質Aを含む試料とマトリクス剤Mとの混合試料を用意する。マトリクス剤Mとしては、従来のMALDI法で用いられている既知のマトリクス剤を用いることができる。具体的には、ニコチン酸、ピコリン酸、3-ヒドロキシピコリン酸、3-アミノピコリン酸、2,5-ジヒドロキシ安息香酸、α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸、シナピン酸、2-(4-ヒドロキシフェニルアゾ)安息香酸、2-メルカプトベンゾチアゾール、5-クロロ-2-メルカプトベンゾチアゾール、2,6-ジヒドロキシアセトフェノン、2,4,6-トリヒドロキシアセトフェノン、ジスラノール、ベンゾ[a]ピレン、9-ニトロアントラセン、2-[(2E)-3-(4-tret-ブチルフェニル)-2-メチルプロプ-2-エニリデン]マロノ二トリルなどをマトリクス剤Mとして用いることができる。
【0022】
試料Sが表面1aに供給された基板1を装置10のプリズム21の一面21a上に載置する。その後、質量分析用基板1に電圧Vsが印加され、所定のスタート信号により光源22から特定波長のレーザ光である励起光Loが出力され、プリズム21を介して質量分析用基板1の裏面1bから入射される。励起光Loは基板1の表面1a(基板と試料Sとの界面)に全反射以上の角度で入射し、該表面1aで全反射する。これにより、基板1の表面1a上にエバネッセント光Leが生じ、試料Sに照射される。試料S内のマトリクス剤Mがエバネッセント光Leの光エネルギーを吸収して熱エネルギーに変換し、この熱エネルギーにより、被分析物質Aはマトリクス剤Mと共に気化され、基板表面1aから脱離され、同時にイオン化される。
【0023】
脱離され、イオン化された被分析物質Aは、質量分析用基板1と引き出しグリッド15との電位差Vsにより引き出しグリッド15の方向に引き出されて加速し、中央の孔を通ってエンドプレート16の方向にほぼ直進して飛行し、更にエンドプレート16の孔を通過して検出器17に到達して検出される。
【0024】
検出器17からの出力信号は、アンプ18により所定レベルに増幅され、その後データ処理部19に入力される。データ処理部19では、上記スタート信号と同期する同期信号が入力されており、この同期信号とアンプ18からの出力信号とに基づいて被分析物質Aの飛行時間を求めることができるので、その飛行時間から質量を導出して質量スペクトルを得ることができる。
【0025】
本実施形態では、ボックス11内に、すべてが備えられた構成について説明したが、少なくとも、引き出しグリッド15、エンドプレート16および検出器17がボックス11内に配置されていれば、他はボックス外に配置されていてもよい。
【0026】
本実施形態では、質量分析装置10がTOF−MSである場合を例に説明したが、イオン化された試料イオンの質量分析を行う装置としては、TOF型のものに限らず、IT(Ion Trap;イオントラップ型)、FT(ICR)(Fourier-Transform Ion Cyclotron Resonance;フーリエ変換型)、また複数の質量分析手法を組み合わせた手法であるQqTOF(Quadrupole-TOF;四重極-TOF型)、TOF−TOF(TOF連結型)などの質量分析装置を用いることができる。
【0027】
また、本発明の質量分析法としては、上記実施形態において用いた質量分析用基板に代えて、図2〜4に示す質量分析用基板2〜4を用いてもよい。図2〜4は、本発明の質量分析方法に適用可能な、他の質量分析用基板を用いた場合の被分析物質の脱離方法を示す模式図である。
【0028】
図2に示す質量分析用基板2は、透明基板31の表面に、電場増強材料である金属薄膜32を備えたものである。金属薄膜32の材料としては、自由電子を有する任意の金属でよく、Au,Ag,Cu,Pt,Ni,Ti等が挙げられ、電場増強効果の高いAu,Ag等が特に好ましい。測定される試料Sは金属薄膜32上に供給される。図2に示す質量分析用基板2を用いる場合には、励起光Loとして、金属薄膜32に表面プラズモンが生じる特定の角度でp偏光として入射させる。このような質量分析用基板2を用いれば、励起光Loの照射により表面プラズモンSPが発生し、これに伴い基板2表面上の電場が増強されることから、光エネルギーが増強されてこれを吸収して熱変換するマトリクス剤の作用も増強されるため、被分析物質Aの脱離、イオン化を効果的に行うことができる。
【0029】
なお、電場増強材料としては、光の照射により局在プラズモンを生じる金属ナノ構造体を備えていてもよい。このような金属ナノ構造体として、金属メッシュ、金属ナノ粒子、金属ナノロッドなどが透明基板31上に固着された質量分析用基板も、基板表面上の電場増強効果を得ることができ好ましい。メッシュ、粒子、ロッドの配列はランダムなものであっても、規則的なものであってもよいが、配列ピッチは、励起光Loの波長より小さいことが好ましい。これらの金属材料としても、自由電子を有する任意の金属でよく、Au,Ag,Cu,Pt,Ni,Ti等が挙げられ、電場増強効果の高いAu,Ag等が特に好ましい。
【0030】
図3に示す質量分析用基板3は、透明基板33の表面に脱離促進剤34が塗布されてなるものである。脱離促進剤34は、エバネッセント光Leの照射により、爆発を生じてその上に付着している試料Sの脱離を補助する(促進させる)ものであればよく、具体的には、ニトロセルロース、トリニトロトルエン(TNT)、ジニトロトルエン(DNT)、ニトロナフタレン、硝酸エステル、アルキルニトラトエチルニトラミン、ニトログアニジン、ヘキソゲン、3−ニトロ−1,2,4−トリアゾール−5−オンおよびヘキサニトロヘキサアザイソウルチタンなどのニトロ化合物が挙げられる。試料S内のマトリクス剤Mがエバネッセント光Leの光エネルギーを吸収して熱エネルギーに変換し、この熱エネルギーにより、被分析物質Aはマトリクス剤Mと共に気化され、基板表面1aから脱離される際に、同時にバネッセント光の発生により、脱離促進剤34が爆発し、被分析物質の脱離を促進することができる。
【0031】
図4に示す質量分析用基板4は、透明基板35の表面に光吸収と電場増強の性質を有する金ナノ粒子36が固着され、さらに脱離促進剤37が塗布されてなるものである。このような質量分析用基板4を用いれば、エバネッセント光により局在プラズモンが生じ、局在プラズモンの発生に伴い、基板表面上の電場が増強されることから、光エネルギーが増強されてこれを吸収して熱変換するマトリクス剤の作用も増強されるため、被分析物質Aの脱離、イオン化を効果的に行うことができると共に、エバネッセント光の照射により、脱離促進剤37の爆発が生じてその上に付着している試料の脱離をさらに促進することができる。なお、光吸収材料であれば、光熱変換に伴う熱により脱離促進剤の効果をより増強させることができる。
なお、光吸収材料としては、金ナノ粒子のほか、色素(あるいは、染料、顔料)、具体的には、カーボンブラック、アゾ染料、金属錯塩アゾ染料、ピラゾロンアゾ染料、アントラキノン染料、フタロシアニン染料、カルボニウム染料、キノンイミン染料、ポリメチン染料、シアニン染料、他の金属ナノ粒子などが挙げられ、他の電場増強材料と共に、あるいは単独で基板表面に塗布あるいは固着して用いてもよい。
【0032】
本発明の質量分析方法によれば、マトリックス剤によるエバネッセント光の光エネルギーの吸収を利用して被分析物質の脱離、イオン化を行っているため、被分析物質の損傷(フラグメント化、変性など)が効果的に抑制され、被分析物質が難揮発性の物質や高分子量の物質であっても、被分析物質のフラグメント化や変性が従来と比較して抑制され、高感度に質量分析することができる。
【実施例】
【0033】
ポリペプチドの一種であるアンジオテンシン(angiotensin)を被分析物質として、以下に示す実施例1、2および比較例1の方法で質量分析を行い、それぞれのマススペクトルを測定した。それぞれのマススペクトルを図7A,図8Aおよび図9に示す。なお、図7B,図8Bはそれぞれ図7A,図8Aの一部(図中点線で囲む部分)を拡大して示した図である。各図において、横軸はm/z値(ここで、mはイオンの質量を統一原子質量単位で割って得られた無次元量、zはイオン化された被分析物質の電荷の価数である。)、縦軸はイオン量を示す信号値(a.u.)である。このマススペクトルから、アンジオテンシンイオン(フラグメント化されていないイオン化被分析物質)信号の強度(m/z≒1294.5における信号強度)を求め、その強度および割合を比較した。
実施例1、2および比較例1についてのいずれの例においても、被分析物質をマトリックス剤と混合させた混合試料を用意し、質量分析装置(BRUKER製 autoflex(TM) III MALDI-TOF-MS )を用いてマススペクトルを取得した。マトリックス剤としてはα-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸を用いた。測定サンプルである被分析物質Angiotensin Iの濃度が1μMになるようにマトリックス剤と混合し、混合試料とした。
【0034】
(実施例1)図1に示すように、透明基板上にマトリックス混合試料を供給し、裏面側から励起光を全反射条件で入射させることにより、エバネッセント光を生じさせ、混合試料にエバネッセント光を照射した。
(実施例2)図3に示すように、脱離促進剤を塗布した透明基板上にマトリックス混合試料を供給し、実施例と同様にして混合試料にエバネッセント光を照射した。
(比較例)図5に示すように、基板上にマトリックス混合試料を供給し、混合試料に直接レーザ光を照射した。
【0035】
比較例の場合、図9に示すように、アンジオテンシンイオン量が実施例1および実施例2と比較して極めて小さかった。これは試料のフラグメント化が実施例1および実施例2と比較して非常に多かったことに起因する。
図7Aおよび図8Aの横軸における領域Fはフラグメント化された成分による信号である。実施例1は比較例と比較するとアンジオテンシンイオン信号が倍増しており、フラグメント化が従来例よりも抑制されていると考えられる。実施例2は実施例1と比較してもアンジオテンシンイオン信号値が高く、フラグメント化も非常に効果的に抑制されていた。これは、脱離促進剤の付加により、フラグメント化を抑制することができることを示すものである。実施例1および2は直接レーザ光を照射する比較例と異なり、エバネセント光を照射光として用いているため、従来例と比較してフラグメント化が抑制され、さらに、実施例2は、脱離促進剤の付加により、エバネセント光のパワーも小さくすることができることからさらなるフラグメント化の抑制効果を得ることができたと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【0036】
【図1】本発明に係る実施形態の質量分析方法を実施するための質量分析装置の概略構成図
【図2】第2の質量分析用基板を用いた場合の被分析物質の脱離方法を示す模式図
【図3】第3の質量分析用基板を用いた場合の被分析物質の脱離方法を示す模式図
【図4】第4の質量分析用基板を用いた場合の被分析物質の脱離方法を示す模式図
【図5】従来のマトリクス支援レーザ脱離方法を示す模式図
【図6】従来のエバネッセント光による脱離方法を示す模式図
【図7A】実施例1のマススペクトル
【図7B】図7Aに示す実施例1のマススペクトルの一部拡大図
【図8A】実施例2のマススペクトル
【図8B】図8Aに示す実施例2のマススペクトルの一部拡大図
【図9】比較例のマススペクトル
【符号の説明】
【0037】
1、2、3、4 質量分析用基板
10 質量分析装置
11 筐体
14 分析手段
17 検出手段
31、33、35 透明基板
32 金属薄膜
34、37 脱離促進剤
36 金ナノ粒子
A 被分析物質
a フラグメント化(あるいは変性)した被分析物質
M マトリクス剤
S 試料
L レーザ光
Lo 励起光
Le エバネッセント光

【特許請求の範囲】
【請求項1】
質量分析用基板の表面に供給され、該基板に付着した試料に光を照射することにより、該試料中の被分析物質を前記基板から脱離させ、イオン化し、該イオン化した前記被分析物質を捕捉して質量分析を行う質量分析方法において、
前記基板として、透明基板を用い、
前記試料として、マトリクス剤が混合されたマトリクス混合試料を用意し、
前記試料を前記基板の表面に供給し、
前記基板の裏面側から、該基板の表面で全反射するように、該基板に励起光を入射させることにより、該基板の表面にエバネッセント光を生じさせ、
該エバネッセント光の照射により、前記被分析物質を前記基板から脱離させることを特徴とする質量分析方法。
【請求項2】
前記基板として、該基板の表面に、光吸収材料、電場増強材料および/または脱離促進剤を備えた基板を用いることを特徴とする請求項1記載の質量分析方法。
【請求項3】
前記脱離促進剤としてニトロ化合物を用いることを特徴とする請求項2記載の質量分析方法。

【図1】
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【図2】
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【図3】
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【図4】
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【図5】
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【図6】
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【図7A】
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【図7B】
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【図8A】
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【図8B】
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【図9】
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【公開番号】特開2010−117245(P2010−117245A)
【公開日】平成22年5月27日(2010.5.27)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2008−290694(P2008−290694)
【出願日】平成20年11月13日(2008.11.13)
【出願人】(306037311)富士フイルム株式会社 (25,513)
【Fターム(参考)】