質量分析法を用いたペプチドのアミノ酸配列決定方法、該方法に使用されるペプチド誘導体化試薬、及び試薬キット
【課題】本発明の目的は、質量分析法により、簡便且つ効率的にペプチドのアミノ酸配列を完全に決定できる方法、及び当該方法に使用されるペプチド誘導体化試薬及び試薬キットを提供することである。
【解決手段】質量分析法を用いたペプチドのアミノ酸配列を決定する方法において、(1)ペプチドのN末端アミノ基に下記一般式(I)で示す基を結合させることによりペプチドを誘導体化する工程、(2)前記工程(1)で誘導体化されたペプチドに対して、フラグメントイオンの質量スペクトルを取得する工程、及び(3)前記工程(2)で得られた質量スペクトルに基づいて、ペプチドのアミノ酸配列を決定する工程を順次実施する。
【解決手段】質量分析法を用いたペプチドのアミノ酸配列を決定する方法において、(1)ペプチドのN末端アミノ基に下記一般式(I)で示す基を結合させることによりペプチドを誘導体化する工程、(2)前記工程(1)で誘導体化されたペプチドに対して、フラグメントイオンの質量スペクトルを取得する工程、及び(3)前記工程(2)で得られた質量スペクトルに基づいて、ペプチドのアミノ酸配列を決定する工程を順次実施する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、質量分析法により、簡便且つ効率的にペプチドのアミノ酸配列を決定する方法に関する。更に、本発明は、当該方法に使用されるペプチド誘導体化試薬及び試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質及び生理活性ペプチドの機能を解明し、その構造を同定する上で、アミノ酸配列の決定は不可欠である。また、ガン等の疾病のバイオマーカーペプチドの探索においても、ペプチドのアミノ酸配列の決定は不可欠である。従来、ペプチドのアミノ酸配列の決定には、エドマン分解法が一般的に採用されていた。しかしながら、エドマン分解法では、測定感度や効率が低いという問題点に加えて、分析時間やコストの点でも欠点があった。そこで、近年、エドマン分解法に代わるアミノ酸配列の決定法として、質量分析法を用いる方法が注目を浴びている。
【０００３】
質量分析法によるアミノ酸配列の決定では、衝突誘起解離等の処理によってペプチドを断片化し、断片化されたペプチドの質量スペクトルを取得し、当該質量スペクトルに基づいてアミノ酸配列が同定される。しかしながら、質量分析法によるアミノ酸配列の決定では、衝突誘起解離によるペプチドの断片化が複雑に、また不完全に起こることが多く、得られる質量スペクトルの解析が不可能又は困難であるという欠点がある。そこで、ペプチドの断片化をより効率的に行う方法として、ペプチドのN末端に特定の化合物を結合させることによってペプチドを誘導化する技術が提案されている（非特許文献１〜３参照）。而るに、従来の方法でペプチドのN末端を誘導化しても、依然としてペプチドの断片化が不十分であり、アミノ酸配列を完全に決定することが困難であり、アミノ酸配列を部分的にしか決定できない。そのため、従来の質量分析法によるアミノ酸配列の決定では、得られた質量スペクトルを、データベースに登録されている公知のペプチドのスペクトルに照合することにより、当該公知のペプチドの配列に該当するか否かを決定するに止まっているのが現状であった。
【０００４】
このような従来技術を背景として、質量分析法により、簡便且つ効率的にペプチドのアミノ酸配列を完全に決定する方法の確立が望まれている。
【非特許文献１】Ademczyk, M., et al., Rapid Commun. Mass Spectrom., 13, 1413 (1999)
【非特許文献２】Bao, J., et al., J. Mass Spectrom., 40, 772 (2005)
【非特許文献３】Miyagi, M., et al., Rapid Commun. Mass Spectrom., 12, 603 (1998)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記従来技術の課題を解決することを目的とする。具体的には、本発明は、質量分析法により、簡便且つ効率的にペプチドのアミノ酸配列を完全に決定できる方法、及び当該方法に使用されるペプチド誘導体化試薬及び試薬キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討したところ、解析対象となるペプチドのN末端のアミノ基を下記一般式(I)で示す基を結合させることによりペプチドを誘導体化しておくことによって、質量分析法におけるペプチドの断片化をより完全に実施できるので、解析を容易に行える質量スペクトルを取得でき、未知のペプチドのアミノ酸配列を完全に決定可能であることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて更に検討を重ねることによって完成したものである。
【０００７】
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１． 質量分析法を用いたペプチドのアミノ酸配列を決定する方法であって、
(1)ペプチドのN末端アミノ基に下記一般式(I)で示す基を結合させることによりペプチドを誘導体化する工程、
【０００８】
【化１】
【０００９】
［式(I)中、ｍは０又は１の整数を示し、ｎ１及びｎ２は、同一又は異なって０〜５の整数を示す。また、式(I)中、Ｘは下記の基を示す。］
【００１０】
【化２】
【００１１】
(2)前記工程(1)で誘導体化されたペプチドに対して、フラグメントイオンの質量スペクトルを取得する工程、及び
(3)前記工程(2)で得られた質量スペクトルに基づいて、ペプチドのアミノ酸配列を決定する工程
を含むことを特徴とする、アミノ酸配列の決定方法。
項２． 前記工程(1)が、下記一般式(II)で示す化合物とペプチドを縮合反応させることにより、ペプチドを誘導体化する工程である、項１に記載のアミノ酸配列の決定方法。
【００１２】
【化３】
【００１３】
［式(II)中、ｍ、ｎ１及びｎ２は、前記と同じ。］
項３． 前記工程(2)において、エレクトロスプレーイオン化法によりペプチドのイオン化を行う、項１又は２に記載のアミノ酸配列の決定方法。
項４． 前記工程(2)において、衝突誘起解離法によりペプチドの断片化を行う、項１乃至３のいずれかに記載のアミノ酸配列の決定方法。
項５． 質量分析法を用いてペプチドのアミノ酸配列を決定するために使用されるペプチド誘導体化試薬であって、ペプチドのN末端アミノ基に対して下記一般式(I)で示す基を結合させることによりペプチドを誘導体化できる化合物を含有することを特徴とする、ペプチド誘導体化試薬。
【００１４】
【化４】
【００１５】
［式(I)中、ｍ、ｎ１、ｎ２及びＸは前記と同じ。］
項６． 項５に記載のペプチド誘導体化試薬を含有する、質量分析法を用いてペプチドのアミノ酸配列を決定するための試薬キット。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のアミノ酸配列の決定方法によれば、質量分析法により、ペプチドのアミノ酸配列を解析する上で指標となるｂイオン系列及びｙイオン系列を詳細に得ることができるので、未知のペプチドであってもアミノ酸配列を完全に決定することが可能である。
【００１７】
本発明は、高感度・高効率な未知タンパク質・ペプチドのアミノ酸配列決定法を提供するものであり、アミノ酸配列データベースの乏しいマイナー生物種から単離されることの多い生理活性ペプチドの単離同定研究や、迅速且つ好感度な質量分析計の利点を生かす必要のあるガン等の疾病バイオマーカーペプチドの探索研究等の分野で有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
１．アミノ酸配列の決定方法
本発明のアミノ酸配列の決定方法において、解析対象となるペプチドは、通常、分子量が2,000以下、好ましくは500〜1000のものが使用される。また、上記分子量よりも大きいペプチド及びタンパク質に対しては、上記分子量になるように断片化した後に、本発明に用いることもできる。ここで、ペプチド及びタンパク質の断片化方法としては、広く知られている手法を採用すればよく、例えば、BrCNを用いた化学的切断方法；トリプシン、キモトリプシン、エンドプロテイナーゼLys-C等のプロテアーゼを用いた酵素切断方法等が例示される。
【００１９】
以下、本発明のアミノ酸配列の決定方法は、ペプチドのN末端を誘導体化する工程（以下、工程(1)と表記する）、誘導体化されたペプチドの質量分析を行う工程（以下、工程(2)と表記する）、及び質量スペクトルからアミノ酸配列を決定する工程（以下、工程(3)と表記する）を含むものである。以下、本発明のアミノ酸配列の決定方法について、工程毎に詳述する。
工程(1)
本工程(1)では、ペプチドのN末端アミノ基に下記一般式(I)で示す基を結合させることにより、ペプチドを誘導体化する。
【００２０】
【化５】
【００２１】
式(I)中、ｍは０又は１であり、好ましくは０である。また、式(I)中、n1及びn2は、同一又は異なって、０〜５の整数、好ましくは０〜２の整数、更に好ましくは０又は１、特に好ましくは０を示す。式(I)で示す基の中でも、ｍ、n1及びn2が、全て０である場合には、質量分析法におけるペプチドの断片化を一層効率的に行うことができる。
【００２２】
式(I)中、Ｘは、下記の基を示す。
【００２３】
【化６】
【００２４】
上記Ｘの基の中でも、基−ＣＯ−が好適である。
【００２５】
また、一般式(I)で示す基において、上記Ａで示される基は、上記Ｂで示される基に対する相対位置関係で、オルト位、メタ位又はパラ位のいずれに存在していてもよいが、好ましくはパラ位である。
【００２６】
上記一般式(I)で示す基において、質量分析法におけるペプチドの断片化をより効果的に行うという観点から、好ましくは下記一般式(I')で示される基、特に好ましくは下記一般式(I'')で示される基が例示される。
【００２７】
【化７】
【００２８】
【化８】
【００２９】
本工程(1)では、ペプチドのN末端アミノ基に対して一般式(I)で示す基を結合させることによりペプチドを誘導体化できる化合物（以下、誘導体化化合物と表記する）を、ペプチドと反応させることにより実施される。本工程(1)で使用される誘導体化化合物としては、一般式(I)で示す基をペプチドのN末端アミノ基に対して結合させ得ることを限度として特に制限されないが、好適な一例として、下記の一般式(II)〜(IV)で示す化合物が挙げられる。当該一般式(II)で示す化合物によれば、当該化合物のカルボキシル基とペプチドのN末端のアミノ基とを通常のペプチド合成で用いられる簡便な縮合反応により、ペプチドのN末端のアミノ基に一般式(I)で示す基を結合させ、誘導体化できるという利点がある。
【００３０】
【化９】
【００３１】
【化１０】
【００３２】
【化１１】
【００３３】
式(II)〜(IV)中、ｍ、n1及びn2は、前記と同様である。なお、一般式(II)〜(IV)で示す化合物は、公知化合物、又は公知化合物から容易に導かれる化合物である。
【００３４】
また、上記誘導体化化合物として、一般式(I)で示す基が活性エステル化された化合物、例えば、一般式(I)で示す基にスクシンイミドが結合した化合物、一般式(I)で示す基にパラニトロフェノールが結合した化合物等を使用することもできる。
【００３５】
本工程(1)において、ペプチドのN末端アミノ基に対して一般式(I)で示す基を結合させて、誘導体化させる方法については、誘導体化化合物の種類等に応じて適宜設定される。
【００３６】
例えば、誘導体化化合物として一般式(II)で示す化合物を使用する場合であれば、次の条件が例示される。ペプチド１モルに対して、誘導体化化合物を通常5〜100モル、好ましくは10モル使用して、溶媒中で縮合反応を行う。溶媒としては、縮合反応を阻害しないものであればよく、例えば、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトニトリル等の非プロトン性極性溶媒及びこれらの混合溶媒等が使用される。これらの溶媒は、水が含まれていてもよい。また、当該反応では、4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride等の脱水縮合剤を用いることが望ましい。当該脱水縮合剤の添加量としては、ペプチド１モルに対して、例えば5〜100モル、好ましくは10モルが例示される。また、ペプチドと誘導体化化合物との反応は、通常10〜40℃、好ましくは25℃で、2〜12時間、好ましくは12時間攪拌を続けることにより行われる。
【００３７】
また、例えば、誘導体化化合物として一般式(III)及び(IV)で示す化合物を使用する場合であれば、次の条件が例示される。ペプチド１モルに対して、誘導体化化合物を通常5〜100モル、好ましくは10モル使用して、溶媒中で縮合反応を行う。溶媒としては、例えば、炭酸水素ナトリウム緩衝液（pH 9.5）とジメチルホルムアミド（DMF）、ジメチルスルホキシド（DMSO）、アセトニトリル等の非プロトン性極性溶媒との混合溶媒等が使用される。また、ペプチドと誘導体化化合物との反応は、通常10〜40℃、好ましくは25℃で、2〜12時間、好ましくは12時間攪拌を続けることにより行われる。
【００３８】
また、例えば、誘導体化化合物として一般式(I)で示す基が活性エステル化された化合物を使用する場合であれば、次の条件が例示される。ペプチド１モルに対して、一般式(I)で示す基が活性エステル化された化合物を通常5〜100モル、好ましくは10モルを添加して、通常10〜40℃、好ましくは25℃で、2〜12時間、好ましくは12時間攪拌する。当該反応は、水、リン酸ナトリウム緩衝液、アセトニトリル水溶液等の溶媒中で行うことができる。
【００３９】
工程(2)
本工程(2)では、前記(1)工程で誘導体化されたペプチドに対して、フラグメントイオンの質量スペクトルを取得する。
【００４０】
本工程(2)において、質量スペクトルの取得に使用される質量分析には、例えば、磁場偏向型、四重極型、イオントラップ型、飛行時間型、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型、及びこれらのハイブリッド型等のタイプの質量分析計を採用することができる。これらの中でも、イオントラップ−飛行時間ハイブリッド型の質量分析計は、特定の質量のイオン分子を選別した後に断片化し、生成したイオン分子を質量分析する測定を、同じ起源の分子に対して連続して行うことが可能で、且つ各々の測定精度が高いという利点があり、本発明に好適に使用される。
【００４１】
本工程(2)の質量スペクトルの取得において、前記(1)工程で誘導体化されたペプチドをイオン化する方法については、例えば、エレクトロスプレーイオン化法(ESI法)、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（MALDI法）、高速原子衝突法(FAB法)等が挙げられる。これらの中でも、ESI法は、溶液状態の試料をそのままイオン化する方法であるが故、一般的なペプチドの分離精製手段である高速液体クロマトグラフィーに直結できるという利点があり、本工程(2)において好ましいイオン化方法である。
【００４２】
また、本工程(2)の質量スペクトルの取得において、ペプチドをフラグメント化（断片化）する方法についても、特に制限されないが、例えば、衝突誘起解離法(CID法)、ポストソース分解法(PSD法)、インソース分解法(ISD法)、電子捕獲解離法（ECD法）、電子移動解離法（ETD法）等が挙げられる。これらのフラグメント化方法の内、CID法は最も汎用され、解離効率が高いという利点があり望ましい。
【００４３】
本工程(2)において、前記(1)工程で誘導体化されたペプチドに対して、MS分析、又はMSn分析を行うことにより、アミノ酸配列の解析の指標になるｂイオン及びｙイオンが顕著に増加して検出され、アミノ酸配列を容易に解析できる質量スペクトルが取得される。ここで、MSn分析とはｎ乗のMS分析を意味し、具体的には、MSn-1分析で得られたイオン分子を断片化した後に、更に特定のイオン分子をプリカーサーとして分析を行うことを意味する。例えばMS2分析はMS/MS分析に相当する。本工程(2)において、MS分析の乗数については、分析対象のペプチドの種類等に応じて適宜設定すればよいが、通常MS2分析〜MS4分析、好ましくはMS2分析〜MS3分析が採用される。
【００４４】
工程(3)
本工程(3)では、前記(2)工程で得られた質量スペクトルに基づいて、ペプチドのアミノ酸配列を決定する。
【００４５】
前記(2)工程で得られた質量スペクトルには、アミノ酸配列の解析の指標になるｂイオン系列（ペプチドのN末端を含むフラグメント）及びｙイオン系列（ペプチドのC末端を含むフラグメント）が高精度で検出されている。当該質量スペクトル上で、各々のｂイオン及びｙイオンを質量順に特定し、その質量差に基づいて該当するアミノ酸及びその配列順序を同定することにより、ペプチドのアミノ酸配列が決定される。
【００４６】
２．ペプチド誘導体化試薬、及び試薬キット
更に、本発明は、上記のアミノ酸配列の決定方法を実施するためのペプチド誘導体化試薬を提供する。当該ペプチド誘導体化試薬は、ペプチドのN末端アミノ基に対して一般式(I)で示す基を結合させることによりペプチドを誘導体化できる化合物（誘導体化化合物）を含むことを特徴とするものである。当該誘導体化化合物については、前述する通りである。
【００４７】
また、本発明は、上記のアミノ酸配列の決定方法を実施するための試薬キットを提供する。当該試薬キットは、上記ペプチド誘導体化試薬を含むことを特徴とするものである。また、当該試薬キットは、更に、上記アミノ酸配列の決定方法に使用される試薬や上記アミノ酸配列の決定方法のプロトコールを記した手順書が含まれていてもよい。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
１．アミジノ安息香酸の調製
アミジノベンズアミド・塩酸塩（1.5 g）に6N HCl（45 ml）と12N 酢酸（8 ml）を加え、110℃で6時間撹拌した。室温に戻すと白い結晶が析出した。これを濾集し、H2Oで洗浄した後、減圧乾燥させ、白色固体のアミジノ安息香酸・塩酸塩（0.45 g、収率30%）を得た。同定はNMR分析及びLC-MS分析により行った。
1H-NMR（DMSO-d6）δ 7.91 (d, J=8.4, 2H), 8.12 (d, J=8.3, 2H), 9.18 (s, 2H), 9.48 (s, 2H), 13.51 (s, 1H), ESI-MS m/z calcd for [M+H]+ : 165.1; found: 165.1
【００４９】
２．アミジノ安息香酸のペプチドへの導入法１
ペプチド１（AAGLQIA：配列番号１）（2 μmol）のDMSO溶液に、アミジノ安息香酸（10 eq）及び脱水縮合剤4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride（DMT-MM、国産化学社製、10 eq）のDMSO溶液を加え、終夜撹拌した。反応終了後、逆相HPLC（溶離液： H2O/アセトニトリル（0.1%TFAを含む）、カラム：Vydac C18, 4.6×250mm）を用いて分取・精製し、アミジノ安息香酸誘導体化ペプチド１を得た。
ESI-MS m/z calcd for [M+H]+: 789.4; found: 789.4.
【００５０】
３．アミジノ安息香酸のペプチドへの導入法２
アミジノ安息香酸（2 g）の50％ H2O/アセトニトリル溶液に1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride（10eq）とN-hydroxysuccinimide（10 eq）を加え、終夜撹拌した。反応終了後、逆相HPLC（溶離液：H2O/アセトニトリル（0.1%TFAを含む）、カラム：Vydac C18, 4.6×250mm）を用いて分取・精製し、アミジノ安息香酸スクシンイミドエステル体を得た。同定はNMR分析およびLC-MS分析により行った。
1H-NMR（DMSO-d6）δ 2.92 (s, 4H), 8.04 (d, J=8.5, 2H), 8.31 (d, J=8.5, 2H), 9.41 (s, 2H), 9.57 (s, 2H), ESI-MS m/z calcd for [M+H]+ : 262.1; found: 262.1.
次いで、50 mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH8.5）に溶解したペプチド1（2 μmol）に、H2Oに溶解したアミジノ安息香酸スクシンイミドエステル体（10 eq）を加え、終夜攪拌した。反応終了後、逆相HPLC（溶離液：H2O/アセトニトリル（0.1%TFAを含む）、カラム：Vydac C18, 4.6×250mm）を用いて分取・精製し、アミジノ安息香酸誘導体化ペプチド１を得た。
ESI-MS m/z calcd for [M+H]+: 789.4; found: 789.4.
【００５１】
４．アミジノ安息香酸導入ペプチドのアミノ酸配列解析
上記「２．アミジノ安息香酸のペプチドへの導入法１」で得られたアミジノ安息香酸誘導体化ペプチドを、イオントラップ-飛行時間ハイブリッド型質量分析計（LCMS-IT-TOF、島津製作所社製）を用いたMSn分析に供した。分析はflow-injection法又はnanospray法（溶媒：50％ H2O/アセトニトリル、0.1%ギ酸を含む）で行ない、0.5 μg(0.3-0.8 nmol) の試料を質量分析計に導入した。また、比較のためにアミジノ安息香酸によって誘導体化していないペプチドの測定も行なった。
【００５２】
５．ペプチド２〜７のアミノ酸配列解析
以下に示すペプチド２〜７についても、上記「２．アミジノ安息香酸のペプチドへの導入法１」と同様の方法によって誘導体化を行い、次いで上記「４．アミジノ安息香酸導入ペプチドのアミノ酸配列解析」と同様の方法でMSn分析を行った。
ペプチド２（DRVYIHPFHL：配列番号２）
ペプチド３（RPPGFSPFR：配列番号３）
ペプチド４（SYANGFSATSASL：配列番号４）
ペプチド５（ATQQTAAYKTLVS：配列番号５）
ペプチド６（TDVNGDGRHAL：配列番号６）
ペプチド７（DYPVDIYYLMD：配列番号７）
また、従来、ペプチドのフラグメンテーションを改善することが報告されているニコチン酸及びN-tris(2,4,6-trimethoxyphenyl)phosphine-acetic acid（TMPP）を用いてペプチド１の誘導体化を行い、そのMSnスペクトルを比較した。ニコチン酸及びTMPPのペプチドへの導入は文献記載の方法に従って実施した。なお、当該文献は以下の通りである：
Ademczyk, M., et al., Rapid Commun. Mass Spectrom., 13, 1413 (1999)
Cohen, B., et al., Biochemistry, 36, 9035 (1997)
Miyagi, M., et al., Rapid Commun. Mass Spectrom., 12, 603 (1998)
【００５３】
６．結果
図１〜１４にアミジノ安息香酸で誘導体化したペプチド、及び誘導体化していないペプチドのMS、MS2、MS3スペクトルを示す。また、スペクトル中に検出されたb系列およびy系列イオンを、表１に示す。誘導体化していないペプチドにおいては、いずれも配列解析に重要となるb系列およびy系列イオンの連続した生成が少なかったため、アミノ酸配列の決定は困難であった。一方、アミジノ安息香酸によって誘導体化したペプチドにおいては、いずれにおいても、ほぼ全てのb系列イオンと一部のy系列イオンが連続的に検出され、配列の決定が誘導体化前に比べて容易に行えることが明らかとなった。
【００５４】
【表１】
【００５５】
更に、ニコチン酸及びTMPPによって誘導体化されたペプチドとの比較においても（図15、16及び表２参照）、アミジノ安息香酸による誘導体化の方が連続したb系列イオンの生成が観測されたことから、既知誘導体化試薬と比べてもフラグメント化を促進する効果が高いことが示された。
【００５６】
【表２】
【００５７】
以上の結果から、アミジノ安息香酸による誘導体化は、質量分析法によるペプチドのアミノ酸配列解析に有用であることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】アミジノ安息香酸誘導体化ペプチド１のMS分析、MS2分析、及びMS3分析により得られた質量スペクトルを示す図である。
【図２】誘導体化していないペプチド１のMS分析、MS2分析、及びMS3分析により得られた質量スペクトルを示す図である。
【図３】アミジノ安息香酸誘導体化ペプチド２のMS分析、MS2分析、及びMS3分析により得られた質量スペクトルを示す図である。
【図４】誘導体化していないペプチド２のMS分析及びMS2分析により得られた質量スペクトルを示す図である。
【図５】アミジノ安息香酸誘導体化ペプチド３のMS分析及びMS2分析により得られた質量スペクトルを示す図である。
【図６】誘導体化していないペプチド３のMS分析及びMS2分析により得られた質量スペクトルを示す図である。
【図７】アミジノ安息香酸誘導体化ペプチド４のMS分析、MS2分析、及びMS3分析により得られた質量スペクトルを示す図である。
【図８】誘導体化していないペプチド４のMS分析及びMS2分析により得られた質量スペクトルを示す図である。
【図９】アミジノ安息香酸誘導体化ペプチド５のMS分析及びMS2分析により得られた質量スペクトルを示す図である。
【図１０】誘導体化していないペプチド５のMS分析及びMS2分析により得られた質量スペクトルを示す図である。
【図１１】アミジノ安息香酸誘導体化ペプチド６のMS分析、MS2分析、及びMS3分析により得られた質量スペクトルを示す図である。
【図１２】誘導体化していないペプチド６のMS分析及びMS2分析により得られた質量スペクトルを示す図である。
【図１３】アミジノ安息香酸誘導体化ペプチド７のMS分析、MS2分析、及びMS3分析により得られた質量スペクトルを示す図である。
【図１４】誘導体化していないペプチド７のMS分析、MS2分析、及びMS3分析により得られた質量スペクトルを示す図である。
【図１５】ニコチン酸によって誘導体化されたペプチド１のMS分析及びMS2分析により得られた質量スペクトルを示す図である。
【図１６】TMPPによって誘導体化されたペプチド１のMS分析、MS2分析、及びMS3分析により得られた質量スペクトルを示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、質量分析法により、簡便且つ効率的にペプチドのアミノ酸配列を決定する方法に関する。更に、本発明は、当該方法に使用されるペプチド誘導体化試薬及び試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質及び生理活性ペプチドの機能を解明し、その構造を同定する上で、アミノ酸配列の決定は不可欠である。また、ガン等の疾病のバイオマーカーペプチドの探索においても、ペプチドのアミノ酸配列の決定は不可欠である。従来、ペプチドのアミノ酸配列の決定には、エドマン分解法が一般的に採用されていた。しかしながら、エドマン分解法では、測定感度や効率が低いという問題点に加えて、分析時間やコストの点でも欠点があった。そこで、近年、エドマン分解法に代わるアミノ酸配列の決定法として、質量分析法を用いる方法が注目を浴びている。
【０００３】
質量分析法によるアミノ酸配列の決定では、衝突誘起解離等の処理によってペプチドを断片化し、断片化されたペプチドの質量スペクトルを取得し、当該質量スペクトルに基づいてアミノ酸配列が同定される。しかしながら、質量分析法によるアミノ酸配列の決定では、衝突誘起解離によるペプチドの断片化が複雑に、また不完全に起こることが多く、得られる質量スペクトルの解析が不可能又は困難であるという欠点がある。そこで、ペプチドの断片化をより効率的に行う方法として、ペプチドのN末端に特定の化合物を結合させることによってペプチドを誘導化する技術が提案されている（非特許文献１〜３参照）。而るに、従来の方法でペプチドのN末端を誘導化しても、依然としてペプチドの断片化が不十分であり、アミノ酸配列を完全に決定することが困難であり、アミノ酸配列を部分的にしか決定できない。そのため、従来の質量分析法によるアミノ酸配列の決定では、得られた質量スペクトルを、データベースに登録されている公知のペプチドのスペクトルに照合することにより、当該公知のペプチドの配列に該当するか否かを決定するに止まっているのが現状であった。
【０００４】
このような従来技術を背景として、質量分析法により、簡便且つ効率的にペプチドのアミノ酸配列を完全に決定する方法の確立が望まれている。
【非特許文献１】Ademczyk, M., et al., Rapid Commun. Mass Spectrom., 13, 1413 (1999)
【非特許文献２】Bao, J., et al., J. Mass Spectrom., 40, 772 (2005)
【非特許文献３】Miyagi, M., et al., Rapid Commun. Mass Spectrom., 12, 603 (1998)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記従来技術の課題を解決することを目的とする。具体的には、本発明は、質量分析法により、簡便且つ効率的にペプチドのアミノ酸配列を完全に決定できる方法、及び当該方法に使用されるペプチド誘導体化試薬及び試薬キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討したところ、解析対象となるペプチドのN末端のアミノ基を下記一般式(I)で示す基を結合させることによりペプチドを誘導体化しておくことによって、質量分析法におけるペプチドの断片化をより完全に実施できるので、解析を容易に行える質量スペクトルを取得でき、未知のペプチドのアミノ酸配列を完全に決定可能であることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて更に検討を重ねることによって完成したものである。
【０００７】
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１． 質量分析法を用いたペプチドのアミノ酸配列を決定する方法であって、
(1)ペプチドのN末端アミノ基に下記一般式(I)で示す基を結合させることによりペプチドを誘導体化する工程、
【０００８】
【化１】
【０００９】
［式(I)中、ｍは０又は１の整数を示し、ｎ１及びｎ２は、同一又は異なって０〜５の整数を示す。また、式(I)中、Ｘは下記の基を示す。］
【００１０】
【化２】
【００１１】
(2)前記工程(1)で誘導体化されたペプチドに対して、フラグメントイオンの質量スペクトルを取得する工程、及び
(3)前記工程(2)で得られた質量スペクトルに基づいて、ペプチドのアミノ酸配列を決定する工程
を含むことを特徴とする、アミノ酸配列の決定方法。
項２． 前記工程(1)が、下記一般式(II)で示す化合物とペプチドを縮合反応させることにより、ペプチドを誘導体化する工程である、項１に記載のアミノ酸配列の決定方法。
【００１２】
【化３】
【００１３】
［式(II)中、ｍ、ｎ１及びｎ２は、前記と同じ。］
項３． 前記工程(2)において、エレクトロスプレーイオン化法によりペプチドのイオン化を行う、項１又は２に記載のアミノ酸配列の決定方法。
項４． 前記工程(2)において、衝突誘起解離法によりペプチドの断片化を行う、項１乃至３のいずれかに記載のアミノ酸配列の決定方法。
項５． 質量分析法を用いてペプチドのアミノ酸配列を決定するために使用されるペプチド誘導体化試薬であって、ペプチドのN末端アミノ基に対して下記一般式(I)で示す基を結合させることによりペプチドを誘導体化できる化合物を含有することを特徴とする、ペプチド誘導体化試薬。
【００１４】
【化４】
【００１５】
［式(I)中、ｍ、ｎ１、ｎ２及びＸは前記と同じ。］
項６． 項５に記載のペプチド誘導体化試薬を含有する、質量分析法を用いてペプチドのアミノ酸配列を決定するための試薬キット。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のアミノ酸配列の決定方法によれば、質量分析法により、ペプチドのアミノ酸配列を解析する上で指標となるｂイオン系列及びｙイオン系列を詳細に得ることができるので、未知のペプチドであってもアミノ酸配列を完全に決定することが可能である。
【００１７】
本発明は、高感度・高効率な未知タンパク質・ペプチドのアミノ酸配列決定法を提供するものであり、アミノ酸配列データベースの乏しいマイナー生物種から単離されることの多い生理活性ペプチドの単離同定研究や、迅速且つ好感度な質量分析計の利点を生かす必要のあるガン等の疾病バイオマーカーペプチドの探索研究等の分野で有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
１．アミノ酸配列の決定方法
本発明のアミノ酸配列の決定方法において、解析対象となるペプチドは、通常、分子量が2,000以下、好ましくは500〜1000のものが使用される。また、上記分子量よりも大きいペプチド及びタンパク質に対しては、上記分子量になるように断片化した後に、本発明に用いることもできる。ここで、ペプチド及びタンパク質の断片化方法としては、広く知られている手法を採用すればよく、例えば、BrCNを用いた化学的切断方法；トリプシン、キモトリプシン、エンドプロテイナーゼLys-C等のプロテアーゼを用いた酵素切断方法等が例示される。
【００１９】
以下、本発明のアミノ酸配列の決定方法は、ペプチドのN末端を誘導体化する工程（以下、工程(1)と表記する）、誘導体化されたペプチドの質量分析を行う工程（以下、工程(2)と表記する）、及び質量スペクトルからアミノ酸配列を決定する工程（以下、工程(3)と表記する）を含むものである。以下、本発明のアミノ酸配列の決定方法について、工程毎に詳述する。
工程(1)
本工程(1)では、ペプチドのN末端アミノ基に下記一般式(I)で示す基を結合させることにより、ペプチドを誘導体化する。
【００２０】
【化５】
【００２１】
式(I)中、ｍは０又は１であり、好ましくは０である。また、式(I)中、n1及びn2は、同一又は異なって、０〜５の整数、好ましくは０〜２の整数、更に好ましくは０又は１、特に好ましくは０を示す。式(I)で示す基の中でも、ｍ、n1及びn2が、全て０である場合には、質量分析法におけるペプチドの断片化を一層効率的に行うことができる。
【００２２】
式(I)中、Ｘは、下記の基を示す。
【００２３】
【化６】
【００２４】
上記Ｘの基の中でも、基−ＣＯ−が好適である。
【００２５】
また、一般式(I)で示す基において、上記Ａで示される基は、上記Ｂで示される基に対する相対位置関係で、オルト位、メタ位又はパラ位のいずれに存在していてもよいが、好ましくはパラ位である。
【００２６】
上記一般式(I)で示す基において、質量分析法におけるペプチドの断片化をより効果的に行うという観点から、好ましくは下記一般式(I')で示される基、特に好ましくは下記一般式(I'')で示される基が例示される。
【００２７】
【化７】
【００２８】
【化８】
【００２９】
本工程(1)では、ペプチドのN末端アミノ基に対して一般式(I)で示す基を結合させることによりペプチドを誘導体化できる化合物（以下、誘導体化化合物と表記する）を、ペプチドと反応させることにより実施される。本工程(1)で使用される誘導体化化合物としては、一般式(I)で示す基をペプチドのN末端アミノ基に対して結合させ得ることを限度として特に制限されないが、好適な一例として、下記の一般式(II)〜(IV)で示す化合物が挙げられる。当該一般式(II)で示す化合物によれば、当該化合物のカルボキシル基とペプチドのN末端のアミノ基とを通常のペプチド合成で用いられる簡便な縮合反応により、ペプチドのN末端のアミノ基に一般式(I)で示す基を結合させ、誘導体化できるという利点がある。
【００３０】
【化９】
【００３１】
【化１０】
【００３２】
【化１１】
【００３３】
式(II)〜(IV)中、ｍ、n1及びn2は、前記と同様である。なお、一般式(II)〜(IV)で示す化合物は、公知化合物、又は公知化合物から容易に導かれる化合物である。
【００３４】
また、上記誘導体化化合物として、一般式(I)で示す基が活性エステル化された化合物、例えば、一般式(I)で示す基にスクシンイミドが結合した化合物、一般式(I)で示す基にパラニトロフェノールが結合した化合物等を使用することもできる。
【００３５】
本工程(1)において、ペプチドのN末端アミノ基に対して一般式(I)で示す基を結合させて、誘導体化させる方法については、誘導体化化合物の種類等に応じて適宜設定される。
【００３６】
例えば、誘導体化化合物として一般式(II)で示す化合物を使用する場合であれば、次の条件が例示される。ペプチド１モルに対して、誘導体化化合物を通常5〜100モル、好ましくは10モル使用して、溶媒中で縮合反応を行う。溶媒としては、縮合反応を阻害しないものであればよく、例えば、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトニトリル等の非プロトン性極性溶媒及びこれらの混合溶媒等が使用される。これらの溶媒は、水が含まれていてもよい。また、当該反応では、4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride等の脱水縮合剤を用いることが望ましい。当該脱水縮合剤の添加量としては、ペプチド１モルに対して、例えば5〜100モル、好ましくは10モルが例示される。また、ペプチドと誘導体化化合物との反応は、通常10〜40℃、好ましくは25℃で、2〜12時間、好ましくは12時間攪拌を続けることにより行われる。
【００３７】
また、例えば、誘導体化化合物として一般式(III)及び(IV)で示す化合物を使用する場合であれば、次の条件が例示される。ペプチド１モルに対して、誘導体化化合物を通常5〜100モル、好ましくは10モル使用して、溶媒中で縮合反応を行う。溶媒としては、例えば、炭酸水素ナトリウム緩衝液（pH 9.5）とジメチルホルムアミド（DMF）、ジメチルスルホキシド（DMSO）、アセトニトリル等の非プロトン性極性溶媒との混合溶媒等が使用される。また、ペプチドと誘導体化化合物との反応は、通常10〜40℃、好ましくは25℃で、2〜12時間、好ましくは12時間攪拌を続けることにより行われる。
【００３８】
また、例えば、誘導体化化合物として一般式(I)で示す基が活性エステル化された化合物を使用する場合であれば、次の条件が例示される。ペプチド１モルに対して、一般式(I)で示す基が活性エステル化された化合物を通常5〜100モル、好ましくは10モルを添加して、通常10〜40℃、好ましくは25℃で、2〜12時間、好ましくは12時間攪拌する。当該反応は、水、リン酸ナトリウム緩衝液、アセトニトリル水溶液等の溶媒中で行うことができる。
【００３９】
工程(2)
本工程(2)では、前記(1)工程で誘導体化されたペプチドに対して、フラグメントイオンの質量スペクトルを取得する。
【００４０】
本工程(2)において、質量スペクトルの取得に使用される質量分析には、例えば、磁場偏向型、四重極型、イオントラップ型、飛行時間型、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型、及びこれらのハイブリッド型等のタイプの質量分析計を採用することができる。これらの中でも、イオントラップ−飛行時間ハイブリッド型の質量分析計は、特定の質量のイオン分子を選別した後に断片化し、生成したイオン分子を質量分析する測定を、同じ起源の分子に対して連続して行うことが可能で、且つ各々の測定精度が高いという利点があり、本発明に好適に使用される。
【００４１】
本工程(2)の質量スペクトルの取得において、前記(1)工程で誘導体化されたペプチドをイオン化する方法については、例えば、エレクトロスプレーイオン化法(ESI法)、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（MALDI法）、高速原子衝突法(FAB法)等が挙げられる。これらの中でも、ESI法は、溶液状態の試料をそのままイオン化する方法であるが故、一般的なペプチドの分離精製手段である高速液体クロマトグラフィーに直結できるという利点があり、本工程(2)において好ましいイオン化方法である。
【００４２】
また、本工程(2)の質量スペクトルの取得において、ペプチドをフラグメント化（断片化）する方法についても、特に制限されないが、例えば、衝突誘起解離法(CID法)、ポストソース分解法(PSD法)、インソース分解法(ISD法)、電子捕獲解離法（ECD法）、電子移動解離法（ETD法）等が挙げられる。これらのフラグメント化方法の内、CID法は最も汎用され、解離効率が高いという利点があり望ましい。
【００４３】
本工程(2)において、前記(1)工程で誘導体化されたペプチドに対して、MS分析、又はMSn分析を行うことにより、アミノ酸配列の解析の指標になるｂイオン及びｙイオンが顕著に増加して検出され、アミノ酸配列を容易に解析できる質量スペクトルが取得される。ここで、MSn分析とはｎ乗のMS分析を意味し、具体的には、MSn-1分析で得られたイオン分子を断片化した後に、更に特定のイオン分子をプリカーサーとして分析を行うことを意味する。例えばMS2分析はMS/MS分析に相当する。本工程(2)において、MS分析の乗数については、分析対象のペプチドの種類等に応じて適宜設定すればよいが、通常MS2分析〜MS4分析、好ましくはMS2分析〜MS3分析が採用される。
【００４４】
工程(3)
本工程(3)では、前記(2)工程で得られた質量スペクトルに基づいて、ペプチドのアミノ酸配列を決定する。
【００４５】
前記(2)工程で得られた質量スペクトルには、アミノ酸配列の解析の指標になるｂイオン系列（ペプチドのN末端を含むフラグメント）及びｙイオン系列（ペプチドのC末端を含むフラグメント）が高精度で検出されている。当該質量スペクトル上で、各々のｂイオン及びｙイオンを質量順に特定し、その質量差に基づいて該当するアミノ酸及びその配列順序を同定することにより、ペプチドのアミノ酸配列が決定される。
【００４６】
２．ペプチド誘導体化試薬、及び試薬キット
更に、本発明は、上記のアミノ酸配列の決定方法を実施するためのペプチド誘導体化試薬を提供する。当該ペプチド誘導体化試薬は、ペプチドのN末端アミノ基に対して一般式(I)で示す基を結合させることによりペプチドを誘導体化できる化合物（誘導体化化合物）を含むことを特徴とするものである。当該誘導体化化合物については、前述する通りである。
【００４７】
また、本発明は、上記のアミノ酸配列の決定方法を実施するための試薬キットを提供する。当該試薬キットは、上記ペプチド誘導体化試薬を含むことを特徴とするものである。また、当該試薬キットは、更に、上記アミノ酸配列の決定方法に使用される試薬や上記アミノ酸配列の決定方法のプロトコールを記した手順書が含まれていてもよい。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
１．アミジノ安息香酸の調製
アミジノベンズアミド・塩酸塩（1.5 g）に6N HCl（45 ml）と12N 酢酸（8 ml）を加え、110℃で6時間撹拌した。室温に戻すと白い結晶が析出した。これを濾集し、H2Oで洗浄した後、減圧乾燥させ、白色固体のアミジノ安息香酸・塩酸塩（0.45 g、収率30%）を得た。同定はNMR分析及びLC-MS分析により行った。
1H-NMR（DMSO-d6）δ 7.91 (d, J=8.4, 2H), 8.12 (d, J=8.3, 2H), 9.18 (s, 2H), 9.48 (s, 2H), 13.51 (s, 1H), ESI-MS m/z calcd for [M+H]+ : 165.1; found: 165.1
【００４９】
２．アミジノ安息香酸のペプチドへの導入法１
ペプチド１（AAGLQIA：配列番号１）（2 μmol）のDMSO溶液に、アミジノ安息香酸（10 eq）及び脱水縮合剤4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride（DMT-MM、国産化学社製、10 eq）のDMSO溶液を加え、終夜撹拌した。反応終了後、逆相HPLC（溶離液： H2O/アセトニトリル（0.1%TFAを含む）、カラム：Vydac C18, 4.6×250mm）を用いて分取・精製し、アミジノ安息香酸誘導体化ペプチド１を得た。
ESI-MS m/z calcd for [M+H]+: 789.4; found: 789.4.
【００５０】
３．アミジノ安息香酸のペプチドへの導入法２
アミジノ安息香酸（2 g）の50％ H2O/アセトニトリル溶液に1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride（10eq）とN-hydroxysuccinimide（10 eq）を加え、終夜撹拌した。反応終了後、逆相HPLC（溶離液：H2O/アセトニトリル（0.1%TFAを含む）、カラム：Vydac C18, 4.6×250mm）を用いて分取・精製し、アミジノ安息香酸スクシンイミドエステル体を得た。同定はNMR分析およびLC-MS分析により行った。
1H-NMR（DMSO-d6）δ 2.92 (s, 4H), 8.04 (d, J=8.5, 2H), 8.31 (d, J=8.5, 2H), 9.41 (s, 2H), 9.57 (s, 2H), ESI-MS m/z calcd for [M+H]+ : 262.1; found: 262.1.
次いで、50 mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH8.5）に溶解したペプチド1（2 μmol）に、H2Oに溶解したアミジノ安息香酸スクシンイミドエステル体（10 eq）を加え、終夜攪拌した。反応終了後、逆相HPLC（溶離液：H2O/アセトニトリル（0.1%TFAを含む）、カラム：Vydac C18, 4.6×250mm）を用いて分取・精製し、アミジノ安息香酸誘導体化ペプチド１を得た。
ESI-MS m/z calcd for [M+H]+: 789.4; found: 789.4.
【００５１】
４．アミジノ安息香酸導入ペプチドのアミノ酸配列解析
上記「２．アミジノ安息香酸のペプチドへの導入法１」で得られたアミジノ安息香酸誘導体化ペプチドを、イオントラップ-飛行時間ハイブリッド型質量分析計（LCMS-IT-TOF、島津製作所社製）を用いたMSn分析に供した。分析はflow-injection法又はnanospray法（溶媒：50％ H2O/アセトニトリル、0.1%ギ酸を含む）で行ない、0.5 μg(0.3-0.8 nmol) の試料を質量分析計に導入した。また、比較のためにアミジノ安息香酸によって誘導体化していないペプチドの測定も行なった。
【００５２】
５．ペプチド２〜７のアミノ酸配列解析
以下に示すペプチド２〜７についても、上記「２．アミジノ安息香酸のペプチドへの導入法１」と同様の方法によって誘導体化を行い、次いで上記「４．アミジノ安息香酸導入ペプチドのアミノ酸配列解析」と同様の方法でMSn分析を行った。
ペプチド２（DRVYIHPFHL：配列番号２）
ペプチド３（RPPGFSPFR：配列番号３）
ペプチド４（SYANGFSATSASL：配列番号４）
ペプチド５（ATQQTAAYKTLVS：配列番号５）
ペプチド６（TDVNGDGRHAL：配列番号６）
ペプチド７（DYPVDIYYLMD：配列番号７）
また、従来、ペプチドのフラグメンテーションを改善することが報告されているニコチン酸及びN-tris(2,4,6-trimethoxyphenyl)phosphine-acetic acid（TMPP）を用いてペプチド１の誘導体化を行い、そのMSnスペクトルを比較した。ニコチン酸及びTMPPのペプチドへの導入は文献記載の方法に従って実施した。なお、当該文献は以下の通りである：
Ademczyk, M., et al., Rapid Commun. Mass Spectrom., 13, 1413 (1999)
Cohen, B., et al., Biochemistry, 36, 9035 (1997)
Miyagi, M., et al., Rapid Commun. Mass Spectrom., 12, 603 (1998)
【００５３】
６．結果
図１〜１４にアミジノ安息香酸で誘導体化したペプチド、及び誘導体化していないペプチドのMS、MS2、MS3スペクトルを示す。また、スペクトル中に検出されたb系列およびy系列イオンを、表１に示す。誘導体化していないペプチドにおいては、いずれも配列解析に重要となるb系列およびy系列イオンの連続した生成が少なかったため、アミノ酸配列の決定は困難であった。一方、アミジノ安息香酸によって誘導体化したペプチドにおいては、いずれにおいても、ほぼ全てのb系列イオンと一部のy系列イオンが連続的に検出され、配列の決定が誘導体化前に比べて容易に行えることが明らかとなった。
【００５４】
【表１】
【００５５】
更に、ニコチン酸及びTMPPによって誘導体化されたペプチドとの比較においても（図15、16及び表２参照）、アミジノ安息香酸による誘導体化の方が連続したb系列イオンの生成が観測されたことから、既知誘導体化試薬と比べてもフラグメント化を促進する効果が高いことが示された。
【００５６】
【表２】
【００５７】
以上の結果から、アミジノ安息香酸による誘導体化は、質量分析法によるペプチドのアミノ酸配列解析に有用であることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】アミジノ安息香酸誘導体化ペプチド１のMS分析、MS2分析、及びMS3分析により得られた質量スペクトルを示す図である。
【図２】誘導体化していないペプチド１のMS分析、MS2分析、及びMS3分析により得られた質量スペクトルを示す図である。
【図３】アミジノ安息香酸誘導体化ペプチド２のMS分析、MS2分析、及びMS3分析により得られた質量スペクトルを示す図である。
【図４】誘導体化していないペプチド２のMS分析及びMS2分析により得られた質量スペクトルを示す図である。
【図５】アミジノ安息香酸誘導体化ペプチド３のMS分析及びMS2分析により得られた質量スペクトルを示す図である。
【図６】誘導体化していないペプチド３のMS分析及びMS2分析により得られた質量スペクトルを示す図である。
【図７】アミジノ安息香酸誘導体化ペプチド４のMS分析、MS2分析、及びMS3分析により得られた質量スペクトルを示す図である。
【図８】誘導体化していないペプチド４のMS分析及びMS2分析により得られた質量スペクトルを示す図である。
【図９】アミジノ安息香酸誘導体化ペプチド５のMS分析及びMS2分析により得られた質量スペクトルを示す図である。
【図１０】誘導体化していないペプチド５のMS分析及びMS2分析により得られた質量スペクトルを示す図である。
【図１１】アミジノ安息香酸誘導体化ペプチド６のMS分析、MS2分析、及びMS3分析により得られた質量スペクトルを示す図である。
【図１２】誘導体化していないペプチド６のMS分析及びMS2分析により得られた質量スペクトルを示す図である。
【図１３】アミジノ安息香酸誘導体化ペプチド７のMS分析、MS2分析、及びMS3分析により得られた質量スペクトルを示す図である。
【図１４】誘導体化していないペプチド７のMS分析、MS2分析、及びMS3分析により得られた質量スペクトルを示す図である。
【図１５】ニコチン酸によって誘導体化されたペプチド１のMS分析及びMS2分析により得られた質量スペクトルを示す図である。
【図１６】TMPPによって誘導体化されたペプチド１のMS分析、MS2分析、及びMS3分析により得られた質量スペクトルを示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
質量分析法を用いたペプチドのアミノ酸配列を決定する方法であって、
(1)ペプチドのN末端アミノ基に下記一般式(I)で示す基を結合させることによりペプチドを誘導体化する工程、
【化１】
［式(I)中、ｍは０又は１の整数を示し、ｎ１及びｎ２は、同一又は異なって０〜５の整数を示す。また、式(I)中、Ｘは下記の基を示す。］
【化２】
(2)前記工程(1)で誘導体化されたペプチドに対して、フラグメントイオンの質量スペクトルを取得する工程、及び
(3)前記工程(2)で得られた質量スペクトルに基づいて、ペプチドのアミノ酸配列を決定する工程
を含むことを特徴とする、アミノ酸配列の決定方法。
【請求項２】
前記工程(1)が、下記一般式(II)で示す化合物とペプチドを縮合反応させることにより、ペプチドを誘導体化する工程である、請求項１に記載のアミノ酸配列の決定方法。
【化３】
［式(II)中、ｍ、ｎ１及びｎ２は、前記と同じ。］
【請求項３】
前記工程(2)において、エレクトロスプレーイオン化法によりペプチドのイオン化を行う、請求項１又は２に記載のアミノ酸配列の決定方法。
【請求項４】
前記工程(2)において、衝突誘起解離法によりペプチドの断片化を行う、請求項１乃至３のいずれかに記載のアミノ酸配列の決定方法。
【請求項５】
質量分析法を用いてペプチドのアミノ酸配列を決定するために使用されるペプチド誘導体化試薬であって、ペプチドのN末端アミノ基に対して下記一般式(I)で示す基を結合させることによりペプチドを誘導体化できる化合物を含有することを特徴とする、ペプチド誘導体化試薬。
【化４】
［式(I)中、ｍ、ｎ１、ｎ２及びＸは前記と同じ。］
【請求項６】
請求項５に記載のペプチド誘導体化試薬を含有する、質量分析法を用いてペプチドのアミノ酸配列を決定するための試薬キット。
【請求項１】
質量分析法を用いたペプチドのアミノ酸配列を決定する方法であって、
(1)ペプチドのN末端アミノ基に下記一般式(I)で示す基を結合させることによりペプチドを誘導体化する工程、
【化１】
［式(I)中、ｍは０又は１の整数を示し、ｎ１及びｎ２は、同一又は異なって０〜５の整数を示す。また、式(I)中、Ｘは下記の基を示す。］
【化２】
(2)前記工程(1)で誘導体化されたペプチドに対して、フラグメントイオンの質量スペクトルを取得する工程、及び
(3)前記工程(2)で得られた質量スペクトルに基づいて、ペプチドのアミノ酸配列を決定する工程
を含むことを特徴とする、アミノ酸配列の決定方法。
【請求項２】
前記工程(1)が、下記一般式(II)で示す化合物とペプチドを縮合反応させることにより、ペプチドを誘導体化する工程である、請求項１に記載のアミノ酸配列の決定方法。
【化３】
［式(II)中、ｍ、ｎ１及びｎ２は、前記と同じ。］
【請求項３】
前記工程(2)において、エレクトロスプレーイオン化法によりペプチドのイオン化を行う、請求項１又は２に記載のアミノ酸配列の決定方法。
【請求項４】
前記工程(2)において、衝突誘起解離法によりペプチドの断片化を行う、請求項１乃至３のいずれかに記載のアミノ酸配列の決定方法。
【請求項５】
質量分析法を用いてペプチドのアミノ酸配列を決定するために使用されるペプチド誘導体化試薬であって、ペプチドのN末端アミノ基に対して下記一般式(I)で示す基を結合させることによりペプチドを誘導体化できる化合物を含有することを特徴とする、ペプチド誘導体化試薬。
【化４】
［式(I)中、ｍ、ｎ１、ｎ２及びＸは前記と同じ。］
【請求項６】
請求項５に記載のペプチド誘導体化試薬を含有する、質量分析法を用いてペプチドのアミノ酸配列を決定するための試薬キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公開番号】特開２００８−１９６９６５（Ｐ２００８−１９６９６５Ａ）
【公開日】平成２０年８月２８日（２００８．８．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３２２０９（Ｐ２００７−３２２０９）
【出願日】平成１９年２月１３日（２００７．２．１３）
【出願人】（５０４１３２２７２）国立大学法人京都大学 (1,269)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年８月２８日（２００８．８．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月１３日（２００７．２．１３）
【出願人】（５０４１３２２７２）国立大学法人京都大学 (1,269)
【Ｆターム（参考）】
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