質量分析用マトリックス及び質量分析方法
【課題】各種試料との相性が良く、従来から質量分析用のマトリックスとして用いられている化合物を用いて試料由来のピークとマトリックス由来のピークとを分離することができ、正確な分析を行うことができる質量分析用マトリックス及び質量分析方法を提供する。
【解決手段】マトリックスとして、分子内の少なくとも1個の原子を安定同位体で標識した化合物を用いる。前記マトリックスの分子内の少なくとも1個の原子を安定同位体で標識することで、前記マトリックスに由来するピークを前記試料に由来するピークから分離してマススペクトルを取得する。
【解決手段】マトリックスとして、分子内の少なくとも1個の原子を安定同位体で標識した化合物を用いる。前記マトリックスの分子内の少なくとも1個の原子を安定同位体で標識することで、前記マトリックスに由来するピークを前記試料に由来するピークから分離してマススペクトルを取得する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、質量分析用マトリックス及び質量分析方法に関し、詳しくは、イオン化方法としてFAB(Fast Atom Bombardment:高速原子衝突)法を用いる質量分析法に使用するのに適したマトリックス及びこのマトリックスを用いた質量分析方法に関する。
【背景技術】
【0002】
熱分解性・難揮発性物質を質量分析する際のイオン化にFAB法を使用する質量分析法、すなわちFABMSが知られている。このFABMSでは、試料をグリセロール等の粘性のある有機化合物からなるマトリックスの溶液と混合し、その混合液にキセノンやアルゴン等の原子を衝突させてイオン化を行い、得られたマススペクトルに基づいて解析を行う。前記マトリックスとしては、グリセロール、チオグリセリン、3−ニトロベンジルアルコール等が実用的なものとして知られており、試料の性質に合わせてマトリックスを選定することが質の高いマススペクトルを得る上で、非常に重要な因子であると言える(例えば、非特許文献1参照。)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0003】
【非特許文献1】YOKUDEL-FAB-Matrix[FAB測定用マトリックス]〜FAB測定のノウハウ、日本電子データム株式会社、2004年7月1日(第2版)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
前記FABMSは、分子全体の情報を得るため、すなわち、分子イオンを得るためのイオン化手段として優れた方法であるものの、マトリックス由来のピークも少なからず出現するため、試料由来の分子イオンピーク及び同位体ピークとマトリックス由来のピークとが重なる場合には、同位体比の決定を正確に行なうことが困難となる。この場合、マトリックスを別の化合物に変更するなどして、試料由来のピークとマトリックス由来のピークとを分離する必要がある。
【0005】
しかし、マトリックスとする化合物を変更し、試料由来のピークとマトリックス由来のピークとの重なりを防ぐ方法は、マトリックス由来のピークの出現位置が一つの化合物に対して一通りであるため、ある試料に対しては有効であっても、別の試料に対しては有効ではないケースがある。したがって、試料と相性の良いマトリックスを選定するために多大な手間を要し、試料毎に数多くの実験を繰り返さなければならないという問題がある。さらに、マトリックスとする化合物を変更した場合には、試料とマトリックスとの混合に不可欠な溶媒の変更も必要になることが多いため、溶媒の選定にも多大な手間を要することになる。
【0006】
そこで本発明は、各種試料との相性が良く、従来から質量分析用のマトリックスとして用いられている化合物を用いて試料由来のピークとマトリックス由来のピークとを分離することができ、正確な分析を行うことができる質量分析用マトリックス及び質量分析方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【0007】
上記目的を達成するため、本発明の質量分析用マトリックスは、マトリックスとして、分子内の少なくとも1個の原子を安定同位体で標識した化合物を用いることを特徴としている。また、本発明の質量分析方法は、試料とマトリックスと溶媒とを混合した試料溶液を用いて質量分析を行う方法において、前記マトリックスの分子内の少なくとも1個の原子を安定同位体で標識することで、前記マトリックスに由来するピークを前記試料に由来するピークから分離してマススペクトルを取得することを特徴としている。特に、前記質量分析がFABMSであることを特徴としている。
【0008】
マトリックスと試料及びこれらを均一に混合するための溶媒の組み合わせは、従来からの使用経験から、マトリックス、試料及び溶媒の相性が良好で、試料の分子イオンピークが選択的に大きなピークとして出現することが確認できている組み合わせを採用することが望ましい。例えば、前記マトリックスとして用いる化合物は、従来からFAB法質量分析のマトリックス用化合物として一般に用いられているグリセロールやチオグリセロール、3−ニトロベンジルアルコールを用いることができる。
【0009】
マトリックスとして使用する化合物に対する標識の方法は、化合物の分子内に含まれる一種類の元素を均一に標識する方法であっても、特定の原子のみを選択して標識する方法のいずれであってもよい。例えば、グリセロールの場合は、一種類の元素として分子内の炭素を均一に標識するようにしても、酸素を均一に標識するようにしてもよく、分子内の特定の位置の1個又は2個の炭素のみ、あるいは、1個又は2個の酸素のみを標識するようにしてもよい。
【0010】
また、マトリックスとして用いる化合物は、有機物の炭化水素が主体となっているため、炭化水素中の炭素や水素を13C標識又は2H標識することが基本となるが、分子内に含まれる元素の種類に応じて、炭素の13C標識、窒素の15N標識、酸素の18O標識及び水素の2H標識のいずれか、あるいは、これらの2つ以上の組み合わせを採用することができる。
【0011】
ただし、試料や溶媒が交換性水素(軽水素)を含み、かつ、2H標識したマトリックスの2Hが交換性重水素である場合には、この交換性重水素が前述の交換性軽水素と同位体交換反応を起し、標識の効果を十分に発揮することができなくなることがある。例えば、試料としてアミノ酸を分析する際に、マトリックスとしてグリセロールを使用し、溶媒に水を使用した場合、グリセロールの水酸基に存在する水素を2H標識すると、試料や溶媒中の軽水素とマトリックスの2Hとが同位体交換反応を起こしてしまうため、マトリックス由来のピークの出現位置を変更できなくなることがある。したがって、このような場合に2H標識するときには、水酸基以外の水素を標識したり、13C標識又は18O標識を選択したりすることが望ましく、窒素を含む化合物の場合は、15N標識を選択することが望ましい。
【0012】
また、分子内の炭素原子が多い化合物の場合、例えば炭素原子が5個以上の化合物の場合は、13C標識以外の元素、例えば水素や酸素を標識すると、13C標識していないマトリックス由来のピークに、天然由来の13C(天然存在比:約1atom%)を分子内に含むマトリックス由来のピークが比較的大きな強度で出現する。すなわち、すべての炭素原子が12Cである分子ピークが最も大きいピークで出現するが、1つの炭素原子だけが13Cである分子ピークも比較的大きいピークとして出現するため、ピークの分裂を招くことになる。このため、マススペクトル上のマトリックス由来のピークの出現数が増加し、スペクトルが複雑になることから、試料を高精度に分析するために望ましい良質なスペクトルを得られなくなるおそれがある。したがって、分子内の炭素原子が多い化合物の場合は、13C標識を選択することが好ましい。
【0013】
一方、マトリックスとして使用される化合物の中には、グリセロールのように、ある範囲で数本のマトリックス由来のピークしか出現しない化合物も存在する。このようにマトリックス由来のピークが比較的単純な化合物を用いる場合は、そのマトリックス由来のピークと試料由来のピークとの重なりを避けることは比較的容易である。このような場合は、13C標識や非交換性水素の2H標識などでピークの重なりを容易に避けることができる。
【0014】
また、マトリックスとして使用される化合物の中には、3−ニトロベンジルアルコールのように、ある質量区間ではすべての質量数にマトリクス由来のピークが出現する化合物も存在する。このような化合物の場合には、13C標識や非交換性水素の2H標識を行うだけでは、マトリックス由来のピークと試料由来のピークとの重なりを避けることができないこともある。このような場合は、13C標識や非交換性水素の2H標識に加えて、窒素を15N標識したり、酸素を18O標識したりすることにより、マトリックス由来のピークと試料由来のピークとの重なりを避けることが可能となる。
【0015】
なお、本発明のマトリックスはFABMSに最適であるが、同様にしてマトリックスを使用するMALDI法質量分析にも利用可能である。
【発明の効果】
【0016】
本発明によれば、試料由来のピークとマトリクス由来のピークとが重なる場合であっても、マトリックスの分子内の少なくとも1個の原子を安定同位体で標識することにより、試料との相性を損なうことなく、マトリックス由来のピークの出現位置を変更することができる。これにより、試料由来のピークとマトリックス由来のピークとを分離することができ、試料の正確な分析が可能となる。
【0017】
また、本発明では、安定同位体にて標識する方法や標識する元素を選ぶことで、試料とマトリックスとの相性はそのままにマトリックス由来のピークの出現位置を広範囲に変更することが可能となる。さらに、18O標識においては、1個の原子を標識するだけで質量数を+2MASS変更することができるので、マトリックス由来のピークの出現位置を効率的に変更することができる。加えて、分子内の原子を安定同位体で標識する場合には、化学的性質が変化することはないため、試料とマトリックスとを混合するための溶媒を変更する必要もない。
【0018】
したがって、試料に対するマトリックス及び溶媒として相性の良い組み合わせを変えることなく、マトリックスとして安定同位体で標識したものを使用するだけでよいことから、余計な手間が掛からず、迅速に正確な分析を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】参考例1で得たマススペクトルである。
【図2】参考例2で得たマススペクトルである。
【図3】参考例3で得たマススペクトルである。
【図4】実施例1で得たマススペクトルである。
【図5】参考例4で得たマススペクトルである。
【図6】実施例2で得たマススペクトルである。
【図7】比較例1で得たマススペクトルである。
【図8】実施例3で得たマススペクトルである。
【図9】実施例4で得たマススペクトルである。
【図10】実施例5で得たマススペクトルである。
【図11】参考例5で得たマススペクトルである。
【図12】実施例6で得たマススペクトルである。
【図13】参考例6で得たマススペクトルである。
【図14】実施例7で得たマススペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【0020】
化合物内の原子を標識する方法は、化合物の種類や標識部位に応じて、従来から行われている適宜な標識方法を採用することができる。例えば、化合物の標識対象原子、例えば1Hを、酸、塩基、金属等の触媒及び/又は化学形の改変によって交換可能な状態とし、これを標識対象原子の同位体、例えば2H(D)に置き換える同位体交換反応による方法や、化合物の前駆体、例えば脱メチル体を安定同位体標識した官能基で置換、例えば「−H」を「−CD3」で置換する方法などを採用することができる。また、化合物内のどの元素を標識するか、同じ元素でも分子内のどの位置にある原子を標識するかは、標識の容易さ、価格、安定性などを考慮して選択すればよい。
【0021】
標識したマトリックスを用いて質量分析を行う手順は、従来から用いられている一般の質量分析装置を使用して同じ操作手順で行うことができる。例えば、FABMSの場合は、所定量の試料、標識したマトリックス及び溶媒を、十分に清浄な容器内にて混合・撹拌し、均一な試料溶液を調製した後、この試料溶液をFABMS用ホルダーに塗布して質量分析計のイオン源に挿入し、所定の条件でキセノンやアルゴン等の原子を衝突させてイオン化を行うことによりマススペクトルを取得し、得られたマススペクトルの中の特定のピークを参照するという、一般的な手順で行うことができる。
【0022】
参考例1
マトリックス溶液として標識していないグリセロール(非標識グリセロール)の10%水溶液を使用し、標識していないアラニン(非標識アラニン)を試料とし、反応ガスをXeガス、反応ガス加速電圧を1kV、イオン引出し電圧を3kVとした従来から周知のFABMSによりマススペクトルを取得した。得られたマススペクトルを図1に示す。
【0023】
図1のマススペクトルでは、分子量89の非標識アラニンの分子イオンピーク(正確にはプロトン付加分子イオンピーク。以下同様。)が大きな相対強度でM/Z=90に出現しており、M/Z=91にはアラニンの同位体ピークが出現している。また、マトリックス由来のピークとして、M/Z=57([C3H5O−]+)、M/Z=75([C3H5(OH)2−]+)、M/Z=93([C3H5(OH)3+H]+)、M/Z=185([(C3H5(OH)3)2+H]+)が出現している。
【0024】
このマススペクトルにおいては、マトリックス由来のピークが試料の分子イオンピークや同位体ピークとは分離して重ならないため、非標識アラニンの分析を正確に行うことができる。このマススペクトルから算出した試料中の13C濃度は1.09atom%となり、同じ試料を高精度同位体分析用質量分析計(IRMS)にて分析した値である1.081atom%と良い一致を示した。
【0025】
参考例2
均一に13C標識したアラニン(標識アラニン)を試料とした他は、参考例1と同じ条件でマススペクトルを取得した。得られたマススペクトルを図2に示す。標識アラニンの分子量が92であるため、この標識アラニンに由来する分子イオンピークはM/Z=93に出現し、マトリックス由来のピークのM/Z=93([C3H5(OH)3+H]+)と重なっている。このマススペクトルから算出した試料中の13C濃度は99.58atom%となり、同じ試料をIRMSにて分析した値である97.35atom%に対して2atom%以上の差が生じた。
【0026】
参考例3
試料として参考例2と同じ標識アラニンを使用し、マトリックスとして標識していないチオグリセンリン(非標識チオグリセンリン)を使用した他は、参考例2と同じ条件でマススペクトルを取得した。得られたマススペクトルを図3に示す。マトリックス由来のピークは、M/Z=73([C3H5S−]+又は[C3H5O2−]+)、M/Z=91([(HS)C3H5(OH)−]+)、M/Z=109([(HS)C3H5(OH)2+H]+)、M/Z=217([((HS)C3H5(OH)2)2+H]+))が出現している。
【0027】
これらのマトリックス由来のピークは、前述の標識アラニンの分子イオンピークや同位体ピークとは重ならず、正確な分析が可能と思われるが、図1のマススペクトルと図3のマススペクトルとにおいて、マトリックス由来のピークの内の最も大きなピークに対する試料の分子イオンのピークの割合を比較すると、参考例1では約「4」であるのに対し、参考例3では約「0.25」であり、相対強度が1/16程度に低下していることがわかる。
【0028】
図3のマススペクトルから算出した試料中の13C濃度は93.22atom%となり、IRMSでの分析値である97.35atom%に対して4atom%以上の差が生じた。このことから、マトリックス由来のピークと試料の分子イオンピークや同位体ピークとが重ならないようにマトリックスを選定した場合であっても、試料とマトリックスとの相性がよくないときには、標識率決定等の正確な分析の妨げとなることがわかる。すなわち、マトリックスとする化合物を変更してピークの重なりを単に回避しようとするだけでは、分析上重要である試料の分子イオンピークの強度低下を招くおそれがあり、必ずしも適切な方法とはいえない。
【0029】
実施例1
標識マトリックスとして13C均一標識したグリセロール(13C濃縮度98atom%以上)を使用し、超純水(軽水)で10%に希釈後、このマトリックス水溶液50μlに、13C均一標識した標識アラニン(参考例2とは異なるもの)2mgを添加し、反応ガスをXeガス、反応ガス加速電圧を1kV、イオン引出し電圧を3kVとした条件でFABMSスペクトルを取得した。得られたマススペクトルを図4に示す。
【0030】
図4のマススペクトルには、標識マトリックス由来のピークがM/Z=60、78、96、191に出現するとともに、試料分子イオンピーク及び同位体ピークがM/Z=93、92に出現し、両者のピークが分離して重なっていないことがわかる。このマススペクトルから算出した試料中の13C濃度は97.85atom%であり、同じ試料をIRMSにて分析した値である97.55atom%と良い一致を示した。
【0031】
参考例4
マトリックスとして非標識のジチオトレイトールと非標識のチオグリセリンとの1対1の混合物を使用した他は、実施例1と同じ条件でマススペクトルを取得した。得られたマススペクトルを図5に示す。図5のマススペクトルには、非標識マトリックス由来のピークがM/Z=57、73、85、91、103、109、119、135、155に出現するとともに、試料分子ピーク及び同位体ピークがM/Z=93、92に出現し、両者のピークの重なりはない。
【0032】
しかし、マトリックス由来のピークの中の最大ピークに対する試料分子ピークの割合が低く、このマススペクトルから算出した試料中の13C濃度は92.9atom%であり、IRMSの分析値である97.55atom%に対して6atom%以上の差が生じた。
【0033】
実施例2
マトリックスとして、水酸基以外の水素原子を2Hで標識したグリセロール(標識部分の2H濃縮度99atom%以上)を使用し、超純水(軽水)で10%に希釈後、このマトリックス水溶液50μlに、試料として13C及び15Nにて二重標識標識したアルギニン2mgを添加し、実施例1と同様の条件でFABMSスペクトルを取得した。得られたマススペクトルを図6に示す。
【0034】
図6のマススペクトルでは、非標識のグリセロールで出現するM/Z=57、75、93、185のピークが、グリセロールを2H標識したことによってM/Z=62、80、98、195にシフトして出現するとともに、試料分子イオンピーク及び同位体ピークがM/Z=185、184に出現し、両者のピークの重なりはないことがわかる。
【0035】
この試料のNMR測定結果から求めた13C標識率は99.30atom%であり、この値と図6の試料分子イオンピークと同位体ピークとの強度比から算出した15N濃度は97.73atom%であるため、同じ試料をIRMSにて測定した結果から算出した15N濃度の97.34atom%と良い一致を示した。
【0036】
比較例1
マトリクスとして非標識のグリセロールを使用した他は、実施例2と同じ条件でマススペクトルを取得した。得られたマススペクトルを図7に示す。図7のマススペクトルには、非標識マトリックスである非標識のグリセロールに由来するピークがM/Z=57、75、93、185に出現し、試料分子イオンピーク及び同位体ピークであるM/Z=185、184のうち、M/Z=185において両者のピークが重なっている。
【0037】
この試料のNMR測定結果から求めた13C標識率は前述の通り99.30atom%であり、図7の試料分子イオンピークと同位体ピークとの強度比から算出した15N濃度は99.6atom%で、IRMSの分析値である15N濃度97.34atom%に対して大きな差を生じている。
【0038】
実施例3
標識マトリックスとして13C均一標識のグリセロール(13C濃縮度98atom%以上)を使用し、超純水(軽水)で10%に希釈後、このマトリックス水溶液50μlに、試料として13C均一標識した標識アラニン(実施例1とは異なるもの)2mgを添加し、実施例1と同じ条件でマススペクトルを取得した。得られたマススペクトルを図8に示す。
【0039】
図8のマススペクトルには、図4のマススペクトルと同様に、13C標識マトリックス由来のピークがM/Z=60、78、96、191に出現するとともに、試料分子イオンピーク及び同位体ピークがM/Z=93、92に出現し、両者のピークが重なっていないことがわかる。このマススペクトルから算出した試料中の13C濃度は99.05atom%であり、同じ試料をIRMSにて分析した値である98.75atom%と良い一致を示した。
【0040】
実施例4
標識マトリックスとして水酸基以外の水素を2H均一標識したグリセロール(2H濃縮度98atom%以上)を使用した他は、実施例3と同じ条件でマススペクトルを取得した。得られたマススペクトルを図9に示す。図9のマススペクトルには、2H標識マトリックス由来のピークがM/Z=62、80、98、195に出現しており、試料分子ピーク及び同位体ピークとは分離している。このマススペクトルから算出した試料中の13C濃度は98.25atom%であった。
【0041】
実施例5
標識マトリックスとして18O均一標識したグリセロール(18O濃縮度98atom%以上)を使用した他は、実施例3と同じ条件でマススペクトルを取得した。得られたマススペクトルを図10に示す。図10のマススペクトルには、18O標識マトリックス由来のピークがM/Z=59、79、99、197に出現しており、試料分子ピーク及び同位体ピークとは重なっていない。このマススペクトルから算出した試料中の13C濃度は98.80atom%であった。
【0042】
実施例3〜5において、3種の標識マトリックスを用いてそれぞれ分析した試料中の13C濃度は、99.05atom%、98.25atom%及び98.80atom%であり、IRMSの分析値である98.75atom%と比較すると、3種の標識マトリックスともIRMSの結果と良い一致を示していることがわかる。さらに、試料の標識率算出に使用するピークが出現する質量数と、これに近い位置でマトリックス由来のピークが出現する質量数との差を大きくするほどIRMSの結果により近くなること、すなわち、この3種の標識マトリックスの中では、18O標識マトリックスが最適であることがわかる。
【0043】
参考例5
標識マトリックスとして実施例3で使用した13C標識グリセロールを使用し、試料として13C均一標識するとともに水酸基とアミノ基以外の水素を2H標識した二重標識のアラニンを使用した他は、実施例3と同じ条件でFABMSスペクトルを取得した。得られたマススペクトルを図11に示す。
【0044】
図11のマススペクトルには、M/Z=60、78、96、191に、図8のマススペクトルと同様の13C標識マトリックス由来のピークが出現し、試料分子イオンピーク及び同位体ピークであるM/Z=97、96に対して、M/Z=96において両者のピークが重なっている。この試料のNMR測定結果から求めた標識部位の2H標識率は99.99atom%であり、図11の試料分子イオンピークと同位体ピークとの強度比から算出した13C濃度は70.05atom%となった。同じ試料をIRMSにて測定した13C濃度は98.75atom%であった。
【0045】
実施例6
標識マトリックスとして実施例5で使用した18O均一標識グリセロールを使用した他は、参考例5と同じ条件でFABMSスペクトルを取得した。得られたマススペクトルを図12に示す。
【0046】
図12のマススペクトルでは、18O標識マトリックス由来のピークがM/Z=59、79、99、197に出現するとともに、試料分子イオンピーク及び同位体ピークがM/Z=97、96に出現しており、両者は重なっていないことがわかる。
【0047】
参考例5と同様にして図12の試料分子イオンピークと同位体ピークとの強度比から算出した13C濃度は98.70atom%となり、IRMSの分析値である98.75atom%と良い一致を示した。
【0048】
参考例6
標識マトリックスとして実施例4で使用した2H標識マトリックスを使用し、試料として、13C均一標識、水酸基とアミノ基以外の水素を2H均一標識、15N均一標識の三重標識したアラニンを使用した他は、実施例4と同じ条件でFABMSスペクトルを取得した。得られたマススペクトルを図13に示す。
【0049】
図13のマススペクトルでは、図9と同様に、2H標識マトリックス由来のピークがM/Z=62、80、98、195に出現しており、試料分子イオンピーク及び同位体ピークであるM/Z=98、97に対して、M/Z=98において両者のピークが重なっている。この試料に関しても、NMR測定により求めた標識部位の2H標識率99.99atom%及び13C標識率98.50atom%並びに図13の試料分子イオンピークと同位体ピークとの強度比から算出した15N濃度は103.05atom%となった。一方、この試料をIRMSにて測定した15N濃度は97.83atom%であった。
【0050】
実施例7
標識マトリックスとして実施例5で使用した18O均一標識グリセロールを使用した他は、参考例6と同じ条件でFABMSスペクトルを取得した。得られたマススペクトルを図14に示す。
【0051】
図14のマススペクトルでは、18O標識マトリックス由来のピークがM/Z=59、79、99、197に出現するとともに、試料分子イオンピーク及び同位体ピークがM/Z=98、97に出現しており、両者は重なっていないことがわかる。参考例6と同様にして図14の試料分子イオンピークと同位体ピークとの強度比から算出した15N濃度は97.74atom%となり、IRMSの分析値である97.83atom%と良い一致を示した。
【技術分野】
【0001】
本発明は、質量分析用マトリックス及び質量分析方法に関し、詳しくは、イオン化方法としてFAB(Fast Atom Bombardment:高速原子衝突)法を用いる質量分析法に使用するのに適したマトリックス及びこのマトリックスを用いた質量分析方法に関する。
【背景技術】
【0002】
熱分解性・難揮発性物質を質量分析する際のイオン化にFAB法を使用する質量分析法、すなわちFABMSが知られている。このFABMSでは、試料をグリセロール等の粘性のある有機化合物からなるマトリックスの溶液と混合し、その混合液にキセノンやアルゴン等の原子を衝突させてイオン化を行い、得られたマススペクトルに基づいて解析を行う。前記マトリックスとしては、グリセロール、チオグリセリン、3−ニトロベンジルアルコール等が実用的なものとして知られており、試料の性質に合わせてマトリックスを選定することが質の高いマススペクトルを得る上で、非常に重要な因子であると言える(例えば、非特許文献1参照。)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0003】
【非特許文献1】YOKUDEL-FAB-Matrix[FAB測定用マトリックス]〜FAB測定のノウハウ、日本電子データム株式会社、2004年7月1日(第2版)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
前記FABMSは、分子全体の情報を得るため、すなわち、分子イオンを得るためのイオン化手段として優れた方法であるものの、マトリックス由来のピークも少なからず出現するため、試料由来の分子イオンピーク及び同位体ピークとマトリックス由来のピークとが重なる場合には、同位体比の決定を正確に行なうことが困難となる。この場合、マトリックスを別の化合物に変更するなどして、試料由来のピークとマトリックス由来のピークとを分離する必要がある。
【0005】
しかし、マトリックスとする化合物を変更し、試料由来のピークとマトリックス由来のピークとの重なりを防ぐ方法は、マトリックス由来のピークの出現位置が一つの化合物に対して一通りであるため、ある試料に対しては有効であっても、別の試料に対しては有効ではないケースがある。したがって、試料と相性の良いマトリックスを選定するために多大な手間を要し、試料毎に数多くの実験を繰り返さなければならないという問題がある。さらに、マトリックスとする化合物を変更した場合には、試料とマトリックスとの混合に不可欠な溶媒の変更も必要になることが多いため、溶媒の選定にも多大な手間を要することになる。
【0006】
そこで本発明は、各種試料との相性が良く、従来から質量分析用のマトリックスとして用いられている化合物を用いて試料由来のピークとマトリックス由来のピークとを分離することができ、正確な分析を行うことができる質量分析用マトリックス及び質量分析方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【0007】
上記目的を達成するため、本発明の質量分析用マトリックスは、マトリックスとして、分子内の少なくとも1個の原子を安定同位体で標識した化合物を用いることを特徴としている。また、本発明の質量分析方法は、試料とマトリックスと溶媒とを混合した試料溶液を用いて質量分析を行う方法において、前記マトリックスの分子内の少なくとも1個の原子を安定同位体で標識することで、前記マトリックスに由来するピークを前記試料に由来するピークから分離してマススペクトルを取得することを特徴としている。特に、前記質量分析がFABMSであることを特徴としている。
【0008】
マトリックスと試料及びこれらを均一に混合するための溶媒の組み合わせは、従来からの使用経験から、マトリックス、試料及び溶媒の相性が良好で、試料の分子イオンピークが選択的に大きなピークとして出現することが確認できている組み合わせを採用することが望ましい。例えば、前記マトリックスとして用いる化合物は、従来からFAB法質量分析のマトリックス用化合物として一般に用いられているグリセロールやチオグリセロール、3−ニトロベンジルアルコールを用いることができる。
【0009】
マトリックスとして使用する化合物に対する標識の方法は、化合物の分子内に含まれる一種類の元素を均一に標識する方法であっても、特定の原子のみを選択して標識する方法のいずれであってもよい。例えば、グリセロールの場合は、一種類の元素として分子内の炭素を均一に標識するようにしても、酸素を均一に標識するようにしてもよく、分子内の特定の位置の1個又は2個の炭素のみ、あるいは、1個又は2個の酸素のみを標識するようにしてもよい。
【0010】
また、マトリックスとして用いる化合物は、有機物の炭化水素が主体となっているため、炭化水素中の炭素や水素を13C標識又は2H標識することが基本となるが、分子内に含まれる元素の種類に応じて、炭素の13C標識、窒素の15N標識、酸素の18O標識及び水素の2H標識のいずれか、あるいは、これらの2つ以上の組み合わせを採用することができる。
【0011】
ただし、試料や溶媒が交換性水素(軽水素)を含み、かつ、2H標識したマトリックスの2Hが交換性重水素である場合には、この交換性重水素が前述の交換性軽水素と同位体交換反応を起し、標識の効果を十分に発揮することができなくなることがある。例えば、試料としてアミノ酸を分析する際に、マトリックスとしてグリセロールを使用し、溶媒に水を使用した場合、グリセロールの水酸基に存在する水素を2H標識すると、試料や溶媒中の軽水素とマトリックスの2Hとが同位体交換反応を起こしてしまうため、マトリックス由来のピークの出現位置を変更できなくなることがある。したがって、このような場合に2H標識するときには、水酸基以外の水素を標識したり、13C標識又は18O標識を選択したりすることが望ましく、窒素を含む化合物の場合は、15N標識を選択することが望ましい。
【0012】
また、分子内の炭素原子が多い化合物の場合、例えば炭素原子が5個以上の化合物の場合は、13C標識以外の元素、例えば水素や酸素を標識すると、13C標識していないマトリックス由来のピークに、天然由来の13C(天然存在比:約1atom%)を分子内に含むマトリックス由来のピークが比較的大きな強度で出現する。すなわち、すべての炭素原子が12Cである分子ピークが最も大きいピークで出現するが、1つの炭素原子だけが13Cである分子ピークも比較的大きいピークとして出現するため、ピークの分裂を招くことになる。このため、マススペクトル上のマトリックス由来のピークの出現数が増加し、スペクトルが複雑になることから、試料を高精度に分析するために望ましい良質なスペクトルを得られなくなるおそれがある。したがって、分子内の炭素原子が多い化合物の場合は、13C標識を選択することが好ましい。
【0013】
一方、マトリックスとして使用される化合物の中には、グリセロールのように、ある範囲で数本のマトリックス由来のピークしか出現しない化合物も存在する。このようにマトリックス由来のピークが比較的単純な化合物を用いる場合は、そのマトリックス由来のピークと試料由来のピークとの重なりを避けることは比較的容易である。このような場合は、13C標識や非交換性水素の2H標識などでピークの重なりを容易に避けることができる。
【0014】
また、マトリックスとして使用される化合物の中には、3−ニトロベンジルアルコールのように、ある質量区間ではすべての質量数にマトリクス由来のピークが出現する化合物も存在する。このような化合物の場合には、13C標識や非交換性水素の2H標識を行うだけでは、マトリックス由来のピークと試料由来のピークとの重なりを避けることができないこともある。このような場合は、13C標識や非交換性水素の2H標識に加えて、窒素を15N標識したり、酸素を18O標識したりすることにより、マトリックス由来のピークと試料由来のピークとの重なりを避けることが可能となる。
【0015】
なお、本発明のマトリックスはFABMSに最適であるが、同様にしてマトリックスを使用するMALDI法質量分析にも利用可能である。
【発明の効果】
【0016】
本発明によれば、試料由来のピークとマトリクス由来のピークとが重なる場合であっても、マトリックスの分子内の少なくとも1個の原子を安定同位体で標識することにより、試料との相性を損なうことなく、マトリックス由来のピークの出現位置を変更することができる。これにより、試料由来のピークとマトリックス由来のピークとを分離することができ、試料の正確な分析が可能となる。
【0017】
また、本発明では、安定同位体にて標識する方法や標識する元素を選ぶことで、試料とマトリックスとの相性はそのままにマトリックス由来のピークの出現位置を広範囲に変更することが可能となる。さらに、18O標識においては、1個の原子を標識するだけで質量数を+2MASS変更することができるので、マトリックス由来のピークの出現位置を効率的に変更することができる。加えて、分子内の原子を安定同位体で標識する場合には、化学的性質が変化することはないため、試料とマトリックスとを混合するための溶媒を変更する必要もない。
【0018】
したがって、試料に対するマトリックス及び溶媒として相性の良い組み合わせを変えることなく、マトリックスとして安定同位体で標識したものを使用するだけでよいことから、余計な手間が掛からず、迅速に正確な分析を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】参考例1で得たマススペクトルである。
【図2】参考例2で得たマススペクトルである。
【図3】参考例3で得たマススペクトルである。
【図4】実施例1で得たマススペクトルである。
【図5】参考例4で得たマススペクトルである。
【図6】実施例2で得たマススペクトルである。
【図7】比較例1で得たマススペクトルである。
【図8】実施例3で得たマススペクトルである。
【図9】実施例4で得たマススペクトルである。
【図10】実施例5で得たマススペクトルである。
【図11】参考例5で得たマススペクトルである。
【図12】実施例6で得たマススペクトルである。
【図13】参考例6で得たマススペクトルである。
【図14】実施例7で得たマススペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【0020】
化合物内の原子を標識する方法は、化合物の種類や標識部位に応じて、従来から行われている適宜な標識方法を採用することができる。例えば、化合物の標識対象原子、例えば1Hを、酸、塩基、金属等の触媒及び/又は化学形の改変によって交換可能な状態とし、これを標識対象原子の同位体、例えば2H(D)に置き換える同位体交換反応による方法や、化合物の前駆体、例えば脱メチル体を安定同位体標識した官能基で置換、例えば「−H」を「−CD3」で置換する方法などを採用することができる。また、化合物内のどの元素を標識するか、同じ元素でも分子内のどの位置にある原子を標識するかは、標識の容易さ、価格、安定性などを考慮して選択すればよい。
【0021】
標識したマトリックスを用いて質量分析を行う手順は、従来から用いられている一般の質量分析装置を使用して同じ操作手順で行うことができる。例えば、FABMSの場合は、所定量の試料、標識したマトリックス及び溶媒を、十分に清浄な容器内にて混合・撹拌し、均一な試料溶液を調製した後、この試料溶液をFABMS用ホルダーに塗布して質量分析計のイオン源に挿入し、所定の条件でキセノンやアルゴン等の原子を衝突させてイオン化を行うことによりマススペクトルを取得し、得られたマススペクトルの中の特定のピークを参照するという、一般的な手順で行うことができる。
【0022】
参考例1
マトリックス溶液として標識していないグリセロール(非標識グリセロール)の10%水溶液を使用し、標識していないアラニン(非標識アラニン)を試料とし、反応ガスをXeガス、反応ガス加速電圧を1kV、イオン引出し電圧を3kVとした従来から周知のFABMSによりマススペクトルを取得した。得られたマススペクトルを図1に示す。
【0023】
図1のマススペクトルでは、分子量89の非標識アラニンの分子イオンピーク(正確にはプロトン付加分子イオンピーク。以下同様。)が大きな相対強度でM/Z=90に出現しており、M/Z=91にはアラニンの同位体ピークが出現している。また、マトリックス由来のピークとして、M/Z=57([C3H5O−]+)、M/Z=75([C3H5(OH)2−]+)、M/Z=93([C3H5(OH)3+H]+)、M/Z=185([(C3H5(OH)3)2+H]+)が出現している。
【0024】
このマススペクトルにおいては、マトリックス由来のピークが試料の分子イオンピークや同位体ピークとは分離して重ならないため、非標識アラニンの分析を正確に行うことができる。このマススペクトルから算出した試料中の13C濃度は1.09atom%となり、同じ試料を高精度同位体分析用質量分析計(IRMS)にて分析した値である1.081atom%と良い一致を示した。
【0025】
参考例2
均一に13C標識したアラニン(標識アラニン)を試料とした他は、参考例1と同じ条件でマススペクトルを取得した。得られたマススペクトルを図2に示す。標識アラニンの分子量が92であるため、この標識アラニンに由来する分子イオンピークはM/Z=93に出現し、マトリックス由来のピークのM/Z=93([C3H5(OH)3+H]+)と重なっている。このマススペクトルから算出した試料中の13C濃度は99.58atom%となり、同じ試料をIRMSにて分析した値である97.35atom%に対して2atom%以上の差が生じた。
【0026】
参考例3
試料として参考例2と同じ標識アラニンを使用し、マトリックスとして標識していないチオグリセンリン(非標識チオグリセンリン)を使用した他は、参考例2と同じ条件でマススペクトルを取得した。得られたマススペクトルを図3に示す。マトリックス由来のピークは、M/Z=73([C3H5S−]+又は[C3H5O2−]+)、M/Z=91([(HS)C3H5(OH)−]+)、M/Z=109([(HS)C3H5(OH)2+H]+)、M/Z=217([((HS)C3H5(OH)2)2+H]+))が出現している。
【0027】
これらのマトリックス由来のピークは、前述の標識アラニンの分子イオンピークや同位体ピークとは重ならず、正確な分析が可能と思われるが、図1のマススペクトルと図3のマススペクトルとにおいて、マトリックス由来のピークの内の最も大きなピークに対する試料の分子イオンのピークの割合を比較すると、参考例1では約「4」であるのに対し、参考例3では約「0.25」であり、相対強度が1/16程度に低下していることがわかる。
【0028】
図3のマススペクトルから算出した試料中の13C濃度は93.22atom%となり、IRMSでの分析値である97.35atom%に対して4atom%以上の差が生じた。このことから、マトリックス由来のピークと試料の分子イオンピークや同位体ピークとが重ならないようにマトリックスを選定した場合であっても、試料とマトリックスとの相性がよくないときには、標識率決定等の正確な分析の妨げとなることがわかる。すなわち、マトリックスとする化合物を変更してピークの重なりを単に回避しようとするだけでは、分析上重要である試料の分子イオンピークの強度低下を招くおそれがあり、必ずしも適切な方法とはいえない。
【0029】
実施例1
標識マトリックスとして13C均一標識したグリセロール(13C濃縮度98atom%以上)を使用し、超純水(軽水)で10%に希釈後、このマトリックス水溶液50μlに、13C均一標識した標識アラニン(参考例2とは異なるもの)2mgを添加し、反応ガスをXeガス、反応ガス加速電圧を1kV、イオン引出し電圧を3kVとした条件でFABMSスペクトルを取得した。得られたマススペクトルを図4に示す。
【0030】
図4のマススペクトルには、標識マトリックス由来のピークがM/Z=60、78、96、191に出現するとともに、試料分子イオンピーク及び同位体ピークがM/Z=93、92に出現し、両者のピークが分離して重なっていないことがわかる。このマススペクトルから算出した試料中の13C濃度は97.85atom%であり、同じ試料をIRMSにて分析した値である97.55atom%と良い一致を示した。
【0031】
参考例4
マトリックスとして非標識のジチオトレイトールと非標識のチオグリセリンとの1対1の混合物を使用した他は、実施例1と同じ条件でマススペクトルを取得した。得られたマススペクトルを図5に示す。図5のマススペクトルには、非標識マトリックス由来のピークがM/Z=57、73、85、91、103、109、119、135、155に出現するとともに、試料分子ピーク及び同位体ピークがM/Z=93、92に出現し、両者のピークの重なりはない。
【0032】
しかし、マトリックス由来のピークの中の最大ピークに対する試料分子ピークの割合が低く、このマススペクトルから算出した試料中の13C濃度は92.9atom%であり、IRMSの分析値である97.55atom%に対して6atom%以上の差が生じた。
【0033】
実施例2
マトリックスとして、水酸基以外の水素原子を2Hで標識したグリセロール(標識部分の2H濃縮度99atom%以上)を使用し、超純水(軽水)で10%に希釈後、このマトリックス水溶液50μlに、試料として13C及び15Nにて二重標識標識したアルギニン2mgを添加し、実施例1と同様の条件でFABMSスペクトルを取得した。得られたマススペクトルを図6に示す。
【0034】
図6のマススペクトルでは、非標識のグリセロールで出現するM/Z=57、75、93、185のピークが、グリセロールを2H標識したことによってM/Z=62、80、98、195にシフトして出現するとともに、試料分子イオンピーク及び同位体ピークがM/Z=185、184に出現し、両者のピークの重なりはないことがわかる。
【0035】
この試料のNMR測定結果から求めた13C標識率は99.30atom%であり、この値と図6の試料分子イオンピークと同位体ピークとの強度比から算出した15N濃度は97.73atom%であるため、同じ試料をIRMSにて測定した結果から算出した15N濃度の97.34atom%と良い一致を示した。
【0036】
比較例1
マトリクスとして非標識のグリセロールを使用した他は、実施例2と同じ条件でマススペクトルを取得した。得られたマススペクトルを図7に示す。図7のマススペクトルには、非標識マトリックスである非標識のグリセロールに由来するピークがM/Z=57、75、93、185に出現し、試料分子イオンピーク及び同位体ピークであるM/Z=185、184のうち、M/Z=185において両者のピークが重なっている。
【0037】
この試料のNMR測定結果から求めた13C標識率は前述の通り99.30atom%であり、図7の試料分子イオンピークと同位体ピークとの強度比から算出した15N濃度は99.6atom%で、IRMSの分析値である15N濃度97.34atom%に対して大きな差を生じている。
【0038】
実施例3
標識マトリックスとして13C均一標識のグリセロール(13C濃縮度98atom%以上)を使用し、超純水(軽水)で10%に希釈後、このマトリックス水溶液50μlに、試料として13C均一標識した標識アラニン(実施例1とは異なるもの)2mgを添加し、実施例1と同じ条件でマススペクトルを取得した。得られたマススペクトルを図8に示す。
【0039】
図8のマススペクトルには、図4のマススペクトルと同様に、13C標識マトリックス由来のピークがM/Z=60、78、96、191に出現するとともに、試料分子イオンピーク及び同位体ピークがM/Z=93、92に出現し、両者のピークが重なっていないことがわかる。このマススペクトルから算出した試料中の13C濃度は99.05atom%であり、同じ試料をIRMSにて分析した値である98.75atom%と良い一致を示した。
【0040】
実施例4
標識マトリックスとして水酸基以外の水素を2H均一標識したグリセロール(2H濃縮度98atom%以上)を使用した他は、実施例3と同じ条件でマススペクトルを取得した。得られたマススペクトルを図9に示す。図9のマススペクトルには、2H標識マトリックス由来のピークがM/Z=62、80、98、195に出現しており、試料分子ピーク及び同位体ピークとは分離している。このマススペクトルから算出した試料中の13C濃度は98.25atom%であった。
【0041】
実施例5
標識マトリックスとして18O均一標識したグリセロール(18O濃縮度98atom%以上)を使用した他は、実施例3と同じ条件でマススペクトルを取得した。得られたマススペクトルを図10に示す。図10のマススペクトルには、18O標識マトリックス由来のピークがM/Z=59、79、99、197に出現しており、試料分子ピーク及び同位体ピークとは重なっていない。このマススペクトルから算出した試料中の13C濃度は98.80atom%であった。
【0042】
実施例3〜5において、3種の標識マトリックスを用いてそれぞれ分析した試料中の13C濃度は、99.05atom%、98.25atom%及び98.80atom%であり、IRMSの分析値である98.75atom%と比較すると、3種の標識マトリックスともIRMSの結果と良い一致を示していることがわかる。さらに、試料の標識率算出に使用するピークが出現する質量数と、これに近い位置でマトリックス由来のピークが出現する質量数との差を大きくするほどIRMSの結果により近くなること、すなわち、この3種の標識マトリックスの中では、18O標識マトリックスが最適であることがわかる。
【0043】
参考例5
標識マトリックスとして実施例3で使用した13C標識グリセロールを使用し、試料として13C均一標識するとともに水酸基とアミノ基以外の水素を2H標識した二重標識のアラニンを使用した他は、実施例3と同じ条件でFABMSスペクトルを取得した。得られたマススペクトルを図11に示す。
【0044】
図11のマススペクトルには、M/Z=60、78、96、191に、図8のマススペクトルと同様の13C標識マトリックス由来のピークが出現し、試料分子イオンピーク及び同位体ピークであるM/Z=97、96に対して、M/Z=96において両者のピークが重なっている。この試料のNMR測定結果から求めた標識部位の2H標識率は99.99atom%であり、図11の試料分子イオンピークと同位体ピークとの強度比から算出した13C濃度は70.05atom%となった。同じ試料をIRMSにて測定した13C濃度は98.75atom%であった。
【0045】
実施例6
標識マトリックスとして実施例5で使用した18O均一標識グリセロールを使用した他は、参考例5と同じ条件でFABMSスペクトルを取得した。得られたマススペクトルを図12に示す。
【0046】
図12のマススペクトルでは、18O標識マトリックス由来のピークがM/Z=59、79、99、197に出現するとともに、試料分子イオンピーク及び同位体ピークがM/Z=97、96に出現しており、両者は重なっていないことがわかる。
【0047】
参考例5と同様にして図12の試料分子イオンピークと同位体ピークとの強度比から算出した13C濃度は98.70atom%となり、IRMSの分析値である98.75atom%と良い一致を示した。
【0048】
参考例6
標識マトリックスとして実施例4で使用した2H標識マトリックスを使用し、試料として、13C均一標識、水酸基とアミノ基以外の水素を2H均一標識、15N均一標識の三重標識したアラニンを使用した他は、実施例4と同じ条件でFABMSスペクトルを取得した。得られたマススペクトルを図13に示す。
【0049】
図13のマススペクトルでは、図9と同様に、2H標識マトリックス由来のピークがM/Z=62、80、98、195に出現しており、試料分子イオンピーク及び同位体ピークであるM/Z=98、97に対して、M/Z=98において両者のピークが重なっている。この試料に関しても、NMR測定により求めた標識部位の2H標識率99.99atom%及び13C標識率98.50atom%並びに図13の試料分子イオンピークと同位体ピークとの強度比から算出した15N濃度は103.05atom%となった。一方、この試料をIRMSにて測定した15N濃度は97.83atom%であった。
【0050】
実施例7
標識マトリックスとして実施例5で使用した18O均一標識グリセロールを使用した他は、参考例6と同じ条件でFABMSスペクトルを取得した。得られたマススペクトルを図14に示す。
【0051】
図14のマススペクトルでは、18O標識マトリックス由来のピークがM/Z=59、79、99、197に出現するとともに、試料分子イオンピーク及び同位体ピークがM/Z=98、97に出現しており、両者は重なっていないことがわかる。参考例6と同様にして図14の試料分子イオンピークと同位体ピークとの強度比から算出した15N濃度は97.74atom%となり、IRMSの分析値である97.83atom%と良い一致を示した。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
質量分析用のマトリックスであって、該マトリックスとして、分子内の少なくとも1個の原子を安定同位体で標識した化合物を用いることを特徴とする質量分析用マトリックス。
【請求項2】
前記質量分析がFAB法質量分析であることを特徴とする請求項1記載の質量分析用マトリックス。
【請求項3】
試料とマトリックスと溶媒とを混合した試料溶液を用いて質量分析を行う方法において、前記マトリックスの分子内の少なくとも1個の原子を安定同位体で標識することで、前記マトリックスに由来するピークを前記試料に由来するピークから分離してマススペクトルを取得することを特徴とする質量分析方法。
【請求項1】
質量分析用のマトリックスであって、該マトリックスとして、分子内の少なくとも1個の原子を安定同位体で標識した化合物を用いることを特徴とする質量分析用マトリックス。
【請求項2】
前記質量分析がFAB法質量分析であることを特徴とする請求項1記載の質量分析用マトリックス。
【請求項3】
試料とマトリックスと溶媒とを混合した試料溶液を用いて質量分析を行う方法において、前記マトリックスの分子内の少なくとも1個の原子を安定同位体で標識することで、前記マトリックスに由来するピークを前記試料に由来するピークから分離してマススペクトルを取得することを特徴とする質量分析方法。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図2】
【図3】
【図4】
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【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【公開番号】特開2010−160086(P2010−160086A)
【公開日】平成22年7月22日(2010.7.22)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2009−3167(P2009−3167)
【出願日】平成21年1月9日(2009.1.9)
【出願人】(000231235)大陽日酸株式会社 (642)
【Fターム(参考)】
【公開日】平成22年7月22日(2010.7.22)
【国際特許分類】
【出願日】平成21年1月9日(2009.1.9)
【出願人】(000231235)大陽日酸株式会社 (642)
【Fターム(参考)】
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