【課題】核酸結合リガンドと、求電子性基であるか、または該基を構成することができる官能基とを含む病原体不活化化合物で、赤血球組成物を処理する際の望ましくない副作用をクエンチングするための改善された方法を提供すること。
【解決手段】一部の実施形態において、該改善された方法では、求電子性基と共有結合性反応できる求核性官能基を含むクエンチャーを適切に高い濃度で用い、ここで、該処理は、充分なクエンチングをもたらすのに所望されるｐＨ範囲内で行なう。一部の該方法における使用に好ましいクエンチャーとしては、赤血球組成物への添加により、６．８〜８．５の望ましいｐＨ範囲の所望のクエンチャー濃度がもたらされるように適切に中和されたチオール（例えば、グルタチオン）が挙げられる。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本出願は、米国仮特許出願第６０／６２３，１７７号（２００４年１０月２９日出願）の優先権を主張し、この仮特許出願は、本明細書中でその全体が参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明の分野は、存在し得る病原体汚染物質を不活化するための血液製剤の処理に用いられる反応性求電子性化合物をクエンチング（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）する方法に関する。特に、チオールなどの求核性化合物を用いて、赤血球組成物中の反応性求電子性化合物をクエンチングする。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
血液製剤および他の生物学的材料による疾患の感染は、依然として深刻な健康上の問題である。血液ドナーのスクリーニングおよび血液試験は、相当進歩しているが、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）などのウイルスは、ウイルスまたはウイルス抗体のレベルが低いため、試験の際、血液製剤中での検出が見逃されることがある。ウイルスの有害性（ｈａｚａｒｄ）に加え、現在、輸血における使用が意図される血液中の非ウイルス微生物（例えば、細菌または原虫など）の存在についてスクリーニングするための適格な認可試験はない。また、これまで未知の病原体が、輸血用血液中に蔓延（ｐｒｅｖａｌｅｎｔ）した状態となり、疾患の感染の脅威を提示し得るというリスクも存在する（これは、実際、輸血によるＨＩＶ感染のリスクの認識以前に起こった）。
血液製剤の臨床使用の前に、病原体を不活化するための化学試薬が血液または血漿に導入されている。典型的には、赤血球含量をほとんどまたは全く有しない血液製剤、例えば、血小板および血漿には、光化学的に活性化された化合物（例えば、ソラレンなど）が使用される。赤血球含有血液製剤には、光活性化を必要としない化合物が、病原体の不活化のために開発されている。このような化合物は典型的には、病原体と、より詳しくは病原体の核酸と反応する求電子性基を有する。例えば、特許文献１には、アリールジオールエポキシドを用いた細胞およびタンパク質含有組成物中のウイルスの不活化が記載されている。インサイチュで求電子体を生成する他の化合物を使用してもよい。ＬｏＧｒｉｐｐｏらは、ウイルスの不活化のための窒素マスタードＣＨ_３−Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｃｌ）_２の使用を評価した。非特許文献１。より注目すべきことに米国特許第６，４１０，２１９号および同第５，６９１，１３２号（その開示は、引用により本明細書に組み込まれる）には、病原体を不活化するために、核酸標的化成分ならびに該核酸と反応する求電子性成分を有する化合物の使用が記載されている。特許文献２（その開示は、引用により本明細書に組み込まれる）にも同様の化合物が記載されており、この場合、該化合物の核酸標的化成分が、反応性求電子性成分に加水分解性リンカーによって連結されている。特許文献３および特許文献４（その開示は、引用により本明細書に組み込まれる）には、病原体の不活化のために、エチレンイミンオリゴマーおよび関連化合物を使用することが記載されている。このようなエチレンイミン誘導体化化合物は、典型的には、反応性求電子性成分を提供するアジリジン基、および該化合物の核酸標的化を提供するポリアミン成分を有する。核酸と反応性である求電子性基または同様の基を有する核酸標的化化合物の一般的類型は、血液、血液製剤および種々の生物起源の試料中の病原体を不活化するために使用される。
このような化合物は核酸と特異的に反応するように設計されるが、これらが、依然として血液の他の成分、例えばタンパク質または細胞膜などと反応し得る懸念（ｃｏｎｃｅｒｎ）がある程度ある。このような副作用は好ましくなく、免疫系によって認識され得るタンパク質および細胞膜の改変などの有害効果を引き起こし得る。かかる処理血液製剤は、反復して使用されると、該処理血液製剤に対するレシピエントの免疫応答をもたらし得る。特許文献５（その開示は、引用により本明細書に組み込まれる）には、任意のかかる有害な副作用のレベルを低下させるため、かかる病原体不活化化合物をクエンチングする方法が記載されている。しかしながら、かかる方法は、望ましくない副作用を有意に低下させるが、望ましくない免疫応答のさらなる低減が望ましい。赤血球の処理のためにかかる化合物を用いた最近の臨床試験では、かかる有害事象の可能性が示されている。Ｖ．Ｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．の２００３年１１月１７日付けのプレスリリースでは、赤血球用のＩＮＡＣＴＩＮＥ（登録商標）Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ＳｙｓｔｅｍのそのフェーズＩＩＩ長期試験を、ＩＮＡＣＴＩＮＥ（登録商標）処理赤血球に対する抗体応答の懸念のため、中止することが推奨された。Ｃｅｒｕｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの２００３年９月４日付けのプレスリリースでは、２段階の試験後、患者が、赤血球の病原体の不活化系に用いた化合物Ｓ−３０３で処理した赤血球に対する抗体を発現し、その病原体不活化赤血球プログラムのフェーズＩＩＩ臨床試験を自主的に中止することが示された。かかる抗体は、典型的には、実際の抗体の性状または均質性の詳細な知識なしで行なわれ得る間接抗グロブリン試験の使用により検出される。かかるアッセイは当業者によく知られており、非常に感度がよく、ＲＢＣあたり５００もの少ない分子の検出を可能にする。このような抗体の最も一般的な検出方法は、患者の血清を輸液の候補であるＲＢＣ調製物と混合し、凝集反応が起こるか否かを検出することによるものである。これは、患者の血清に対するＲＢＣ単位の交差適合と呼ばれる。よりよい感度は、該抗体との抗ヒト免疫グロブリン交差反応を含めることによって提供される。これにより、ＲＢＣの表面上でのＩｇＧまたは他の抗体間の反応性が増強される。最後に、さらによい検出感度は、反応媒体に、抗体のオンレート（ｏｎ−ｒａｔｅ）を互いに増強する増強因子を含めることによって得られ得る（ＡＡＢＢマニュアル第１３版）。かかるアッセイは、例えばフローサイトメトリーアッセイよりも感度がよく、他の方法ではいずれの潜在的抗体の非存在が示される場合であっても観察され得る。かかる現象は臨床試験において起こり、多くの場合で、このような抗体を発現するより高い傾向を有し得る特定の患者集団と関連している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第５，０５５，４８５号明細書
【特許文献２】米国特許第６，５１４，９８７号明細書
【特許文献３】米国特許第６，１３６，５８６号明細書
【特許文献４】米国特許第６，６１７，１５７号明細書
【特許文献５】米国特許第６，７０９，８１０号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】ＬｏＧｒｉｐｐｏら，「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｉｘｔｈ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ」，Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ編，Ｂｉｂｌｉｏｔｈｅｃａ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ，１９５８年，ｐｐ．２２５−２３０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、求電子性基を介して病原体と反応するが、有害な病原体を不活化する病原体不活化化合物の能力は保持している病原体不活化化合物の望ましくない求電子性副作用をさらに低減させるための方法の必要性が存在する。具体的には、赤血球において病原体不活化化合物をクエンチングする改善された方法の必要性が存在する。かかる新規な方法は、病原体不活化化合物での処理により、赤血球に対する有害な免疫応答のリスクを有意に低減するために必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の簡単な要旨）
本発明は、赤血球組成物を病原体不活化化合物で、赤血球との病原体不活化化合物の望ましくない副作用をクエンチングするための改善された条件下で処理する種々の方法を提供する。一部の実施形態では、クエンチングは、クエンチャー（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）のｐＨおよび／または濃度の増大の調整によって改善される。
【０００８】
一態様において、本発明は、ａ）ｉ）反応性求電子性基を含む病原体不活化化合物、ｉｉ）チオール基を含むクエンチャー、およびｉｉｉ）赤血球含有組成物であって、病原体で汚染されている可能性がある赤血球組成物を提供すること、およびｂ）病原体不活化化合物およびクエンチャーを赤血球含有組成物と混合することを含み、得られる混合物は、赤血球への病原体不活化化合物の結合の充分なクエンチングを提供するのに適したｐＨ範囲である、赤血球組成物の処理方法を提供する。さらなる実施形態では、該方法は、ｃ）赤血球含有組成物のｐＨを調整する工程を含む。一部の実施形態では、該処理により、少なくとも１ｌｏｇ、同様に少なくとも２ｌｏｇまたは少なくとも３ｌｏｇの病原体汚染物質の不活化がもたらされる。一部の実施形態では、赤血球組成物は白血球を含有し、該処理により、少なくとも１ｌｏｇ、同様に少なくとも２ｌｏｇまたは少なくとも３ｌｏｇの白血球の不活化がもたらされる。一部の実施形態では、クエンチャーを、赤血球含有組成物と、病原体不活化化合物を添加する前に混合する。一部の実施形態では、赤血球含有組成物のｐＨを、病原体不活化化合物とクエンチャーを混合する前に調整する。一部の実施形態では、赤血球含有組成物のｐＨを、病原体不活化化合物の添加後に調整する。一部の実施形態では、赤血球含有組成物のｐＨを、クエンチャーの添加によって調整する。一部の実施形態では、クエンチャー、病原体不活化化合物および赤血球含有組成物の混合物は、いったん３種類の成分すべてが混合されていると、室温で約６．８〜８．５、同様に約７．０〜８．５、同様に約７．２〜８．５または約７．２〜８．０の範囲のｐＨを有する。一部の実施形態では、クエンチャー、病原体不活化化合物および赤血球含有組成物の混合物を、適当な時間枠、例えば、約３０分間〜４８時間、同様に約２〜２４時間、同様に約８〜２４時間インキュベートする。さらなる実施形態では、インキュベーションは、約１℃〜３０℃、同様に約１８℃〜２５℃の温度範囲、またはほぼ室温である。一部の実施形態では、クエンチャーの濃度は、いったん３種類の成分すべてが混合されていると、約２ｍＭ〜約４０ｍＭ、同様に約４ｍＭ〜約４０ｍＭ、同様に約４ｍＭ〜約３０ｍＭ、同様に約５ｍＭ〜約３０ｍＭ、同様に約１０ｍＭ〜約３０ｍＭ、同様に約２０ｍＭの範囲である。一部の実施形態では、得られる混合物中のクエンチャーの濃度は、約２ｍＭ、少なくとも約４ｍＭ、少なくとも約５ｍＭ、少なくとも約１０ｍＭまたは少なくとも約１５ｍＭよりも高い。一部の実施形態では、病原体の不活化化合物に対するクエンチャーのモル比は、いったん３種類の成分すべてが混合されていると、約１０：１〜約４００：１、同様に約１０：１〜約２００：１、同様に約２０：１〜約２００：１、同様に約５０：１〜約２００：１、同様に約１００：１である。一部の実施形態では、クエンチャーがシステインまたはシステイン誘導体を含むものである。一部の実施形態では、クエンチャーが、少なくとも１個のシステインまたはシステイン誘導体を含むペプチドである。好ましい実施形態では、クエンチャーがグルタチオンである。一部の実施形態では、クエンチャーは中和されており、中和されたクエンチャーの添加によって、赤血球組成物のｐＨの調整が行なわれる。一部の実施形態では、中和されたクエンチャーがシステインまたはシステイン誘導体を含むものである。一部の実施形態では、中和されたクエンチャーが、システインまたはシステイン誘導体を含むペプチドである。一部の実施形態では、病原体不活化化合物が核酸結合基を含む。一部の実施形態では、核酸結合基が、アクリジン基などのインターカレーターである。一部の実施形態では、核酸結合基がポリアミンである。一部の実施形態では、病原体不活化化合物が、加水分解性結合を介して反応性求電子性基に連結された核酸結合基を含む。一部の実施形態では、核酸結合基がインターカレーターであり、反応性求電子性基が、マスタード、マスタード中間体およびマスタード同等物からなる群より選択される。好ましい実施形態では、クエンチャーが中和グルタチオンであり、この場合、プロトン化されたグルタチオンが約２当量の適当な塩基で中和され、病原体不活化化合物が、β−アラニン、Ｎ−（アクリジン−９−イル）、２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルである。
【０００９】
さらなる態様では、本発明は、ａ）ｉ）核酸結合基および反応性求電子性基を含む病原体不活化化合物、ｉｉ）システインまたは適当なシステイン誘導体を含むクエンチャー、およびｉｉｉ）赤血球含有組成物であって、病原体で汚染されている可能性がある赤血球組成物を提供すること、ｂ）クエンチャーを赤血球含有組成物と混合すること（ここで、クエンチャーの添加によって、混合物のｐＨが適当なｐＨに調整される）、およびｃ）病原体不活化化合物を赤血球含有組成物と混合することを含み、ここで、病原体は、赤血球含有組成物中に存在する場合には、少なくとも１ｌｏｇ、同様に少なくとも２ｌｏｇ、同様に少なくとも３ｌｏｇ不活化される、赤血球組成物の処理方法を提供する。一部の実施形態では、赤血球組成物は白血球を含有し、該処理により、少なくとも１ｌｏｇ、同様に少なくとも２ｌｏｇまたは少なくとも３ｌｏｇの白血球の不活化がもたらされる。一部の実施形態では、クエンチャーを赤血球含有組成物と、病原体不活化化合物と混合する前に混合する。一部の実施形態では、クエンチャーを赤血球含有組成物と、病原体不活化化合物との混合に続いて混合する。一部の実施形態では、クエンチャーおよび病原体不活化化合物を赤血球含有組成物と同時に、または本質的に同時に（例えば、互いに約１分間以内に）混合する。一部の実施形態では、クエンチャーと赤血球含有組成物の混合物を、病原体不活化化合物と混合する前に約１〜３０分間インキュベートする。一部の実施形態では、このインキュベーションは、約１℃〜３０℃、同様に約１８℃〜２５℃の範囲の温度、またはほぼ室温である。一部の実施形態では、クエンチャー、病原体不活化化合物および赤血球含有組成物の混合物を、適当な時間枠、例えば、約３０分〜４８時間、同様に約２〜２４時間、同様に約８〜２４時間インキュベートする。さらなる実施形態では、インキュベーションは、約１℃〜３０℃、同様に約１８℃〜２５℃の温度範囲、またはほぼ室温である。一部の実施形態では、クエンチャーを赤血球含有組成物と混合する際の適当なｐＨは、室温で測定したとき、約６．８〜８．５、同様に約７．０〜８．５、同様に約７．２〜８．５または約７．２〜８．０の範囲である。一部の実施形態では、いったん３種類の成分すべてが混合されていると、混合物のｐＨは、室温で測定したとき、約６．８〜８．５、同様に約７．０〜８．５、同様に約７．２〜８．５または約７．２〜８．０の範囲である。一部の実施形態では、クエンチャーの濃度は、いったん３種類の成分すべてが混合されていると、約２ｍＭ〜約４０ｍＭ、同様に約４ｍＭ〜約４０ｍＭ、同様に約４ｍＭ〜約３０ｍＭ、同様に約５ｍＭ〜約３０ｍＭ、同様に約１０ｍＭ〜約３０ｍＭ、同様に約２０ｍＭの範囲である。一部の実施形態では、病原体の不活化化合物に対するクエンチャーのモル比は、いったん３種類の成分すべてが混合されていると、約１０：１〜約４００：１、同様に約１０：１〜約２００：１、同様に約２０：１〜約２００：１、同様に約５０：１〜約２００：１、同様に約１００：１である。一部の実施形態では、クエンチャーが、少なくとも１個のシステインまたはシステイン誘導体を含むペプチドである。好ましい実施形態では、クエンチャーがグルタチオンである。一部の実施形態では、クエンチャーが中和されているか、または該組成物のｐＨにおいて所望の調整が行なわれる形態である。一部の実施形態では、クエンチャーは、クエンチャーへの１当量同様に約２当量の塩基の添加によって中和される。一部の実施形態では、クエンチャーは、適当な塩などの中和された形態である。一部の実施形態では、クエンチャーは中和されている。一部の実施形態では、中和されたクエンチャーは、システインまたはシステイン誘導体を含む中和されたペプチドである。好ましい実施形態では、中和されたペプチドは中和グルタチオンである。一部の実施形態では、病原体不活化化合物の核酸結合基は、アクリジン基などのインターカレーターである。一部の実施形態では、核酸結合基がポリアミンである。一部の実施形態では、核酸結合基が、加水分解性結合を介して反応性求電子性基に連結されている。一部の実施形態では、核酸結合基がインターカレーターであり、反応性求電子性基が、マスタード、マスタード中間体およびマスタード同等物からなる群より選択される。一部の実施形態では、核酸結合基がポリアミンであり、求電子性基がアジリジン基またはアジリジニウム基である。好ましい実施形態では、クエンチャーが中和グルタチオンであり、病原体不活化化合物が、β−アラニン、Ｎ−（アクリジン−９−イル）、２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルである。
【００１０】
別の態様では、本発明は、以下の順に、ａ）ｉ）β−アラニン、Ｎ−（アクリジン−９−イル）、２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステル、ｉｉ）中和グルタチオン、およびｉｉｉ）赤血球含有組成物であって、病原体で汚染されている可能性がある赤血球組成物を提供すること、ｂ）中和グルタチオンを赤血球含有組成物と混合すること、ｃ）該混合物を適切な時間インキュベートすること、およびｄ）β−アラニン、Ｎ−（アクリジン−９−イル）、２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルを、中和グルタチオンと赤血球含有組成物との混合物と混合することを含み、ここで、病原体は、赤血球含有組成物中に存在する場合には、少なくとも１ｌｏｇ、同様に少なくとも２ｌｏｇ、同様に少なくとも３ｌｏｇ不活化される、赤血球組成物の処理方法を提供する。一部の実施形態では、赤血球組成物は白血球を含有し、該処理により、少なくとも１ｌｏｇ、同様に少なくとも２ｌｏｇまたは少なくとも３ｌｏｇの白血球の不活化がもたらされる。一部の実施形態では、中和グルタチオンが適当な塩として提供される。一部の実施形態では、中和グルタチオンが、プロトン化されたグルタチオンを約１当量の塩基、同様に約２当量の塩基で中和することにより提供される。一部の実施形態では、中和グルタチオンが溶液状である。一部の実施形態では、中和グルタチオンが固形であり、例えば、凍結乾燥粉末が適当な塩である。一部の実施形態では、グルタチオンと混合された赤血球をインキュベートする時間枠は約１〜３０分間、同様に約５〜２０分間であり、この場合、インキュベーションは、約１℃〜３０℃、同様に約１８℃〜２５℃の範囲の温度、またはほぼ室温である。一部の実施形態では、β−アラニン、Ｎ−（アクリジン−９−イル）、２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルとの混合後、混合物を、適当な時間枠、例えば、約３０分〜４８時間、同様に約２〜２４時間、同様に約８〜２４時間インキュベートする。さらなる実施形態では、インキュベーションは、約１℃〜３０℃、同様に約１８℃〜２５℃の温度範囲、またはほぼ室温である。一部の実施形態では、β−アラニン、Ｎ−（アクリジン−９−イル）、２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルの混合時、混合物中のグルタチオンの濃度が約５ｍＭ〜約３０ｍＭの範囲であり、β−アラニン、Ｎ−（アクリジン−９−イル）、２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルの濃度が約０．０５ｍＭ〜約０．５ｍＭの範囲である。一部の実施形態では、β−アラニン、Ｎ−（アクリジン−９−イル）、２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルの混合時、混合物中のグルタチオンの濃度が約１０ｍＭ〜約３０ｍＭの範囲であり、β−アラニン、Ｎ−（アクリジン−９−イル）、２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルの濃度が約０．０５ｍＭ〜約０．３ｍＭの範囲である。一部の実施形態では、β−アラニン、Ｎ−（アクリジン−９−イル）、２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルの混合時、混合物中のグルタチオンの濃度が約２０ｍＭであり、β−アラニン、Ｎ−（アクリジン−９−イル）、２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルの濃度が約０．２ｍＭである。
【００１１】
別の態様では、本発明は、（ａ）ｉ）反応性求電子性基であるか、または該基を構成する官能基を含む病原体不活化化合物、ｉｉ）病原体不活化化合物の反応性求電子性基と反応することができるチオール基を含むクエンチャー、およびｉｉｉ）赤血球含有組成物であって、病原体で汚染されている可能性がある赤血球組成物提供すること；および（ｂ）病原体不活化化合物およびクエンチャーを赤血球含有組成物と混合すること（ここで、得られる混合物中のクエンチャーの濃度が２ｍＭより大きく、得られる混合物の室温でのｐＨが約６．７以上の範囲である）を含む、赤血球組成物の処理方法を提供する。一部の実施形態では、得られる混合物の室温でのｐＨが約７．０〜８．５の範囲である。
【００１２】
別の態様では、本発明は、赤血球組成物と以下のもの：（ａ）核酸結合リガンドと、核酸と反応することができる求電子性基であるか、または該基を構成する官能基とを含む病原体不活化化合物；（ｂ）該求電子性基と反応することができるチオールを含むクエンチャー；および（ｃ）適当な塩基であって、赤血球組成物、病原体不活化化合物、クエンチャーおよび該塩基を含む混合物において、該塩基を有しない混合物と比べて、病原体不活化化合物と赤血球との望ましくない反応のレベルを低下させるのに充分な量の適当な塩基を混合することを含む、赤血球組成物の処理方法を提供する。一部の実施形態では、病原体不活化化合物と赤血球との望ましくない反応が、病原体不活化化合物による赤血球の表面の改変である。
【００１３】
さらに別の実施形態では、本発明は、赤血球組成物と以下のもの：（ａ）核酸結合リガンドと、核酸と反応することができる求電子性基であるか、または該基を構成する官能基とを含む病原体不活化化合物；（ｂ）該求電子性基と反応することができるチオールを含むクエンチャー；および（ｃ）適当な塩基であって、赤血球組成物、病原体不活化化合物、クエンチャーおよび該塩基を含む混合物のｐＨを、該塩基を有しない混合物と比べて増大させるのに充分な量の適当な塩基を混合することを含む、赤血球組成物の処理方法を提供する。一部の実施形態では（例えば、クエンチャーが酸性化合物である一部の実施形態では）、充分な量の適当な塩基を添加して、混合物のｐＨを、少なくとも塩基またはクエンチャーのいずれかを有しない混合物のｐＨあたりまで増大させる。
【００１４】
さらなる態様では、本発明は、クエンチャーの存在下で病原体不活化化合物による赤血球含有組成物の処理中における、病原体不活化化合物と赤血球との望ましくない副作用のクエンチングを改善する方法であって、クエンチャーがチオールを含み、病原体不活化化合物が、クエンチャーのチオールと反応性である求電子体であるか、または該求電子体を構成する官能基を含む方法を提供し、該方法は、赤血球組成物、病原体不活化化合物およびクエンチャーを含む反応混合物のｐＨを増大させることを含む。一部の実施形態では、該方法は、反応混合物中のクエンチャーの濃度を増大させる工程をさらに含む。一部の実施形態では、病原体不活化化合物と赤血球との望ましくない反応が、病原体不活化化合物による赤血球の表面の改変である。
【００１５】
前記の方法ならびに本明細書に記載の他の方法の各々の一部の実施形態において、該方法は、混合物中の病原体不活化化合物の濃度を低下させる工程をさらに含む。
【００１６】
前記の方法ならびに本明細書に記載の他の方法の各々の一部の実施形態において、赤血球組成物は、エキソビボで処理される。前記の方法ならびに本明細書に記載の他の方法の各々の一部の他の実施形態において、赤血球組成物はインビトロで処理される。
【００１７】
前記の方法ならびに本明細書に記載の他の方法の各々によって作製される赤血球組成物もまた提供される。
【００１８】
さらなる態様では、本発明は、キット、例えば、赤血球組成物の加工処理における使用のための使い捨てキットを提供する。このようなキットは、手作業の加工処理、自動化された加工処理または手作業と自動化の両方の加工処理のいずれかに使用され得る。一部の実施形態では、キットは、反応性求電子性基を含む病原体不活化化合物（任意のその塩を含む）、チオール基を含むクエンチャー（任意のその塩を含む）、および１または２当量の適当な塩基を含み、ここで、当量は、キット内のクエンチャーのモル量に相当するモル量を意味する。好ましい実施形態では、キットは、β−アラニン、Ｎ−（アクリジン−９−イル）、２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステル（任意のその塩を含む）、グルタチオン（任意のその塩を含む）、および１または２当量の適当な塩基を含み、ここで、当量は、キット内のグルタチオンのモル量に相当するモル量を意味する。一部の実施形態では、β−アラニン、Ｎ−（アクリジン−９−イル）、２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルまたは任意のその塩が固体形態である。一部の実施形態では、β−アラニン、Ｎ−（アクリジン−９−イル）、２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルまたは任意のその塩が溶液状である。一部の実施形態では、グルタチオンまたは任意のその塩が固体形態である。一部の実施形態では、グルタチオンまたは任意のその塩が溶液状である。一部の実施形態では、１または２当量の塩基が固体形態である。一部の実施形態では、１または２当量の塩基が溶液状である。一部の実施形態では、グルタチオンまたは任意のその塩および１または２当量の塩基が混合物として存在する。一部の実施形態では、グルタチオンまたは任意のその塩と１または２当量の塩基の混合物が均質な混合物である。一部の実施形態では、この均質な混合物が固体形態である。一部の実施形態では、この均質な混合物が溶液状である。一部の実施形態では、キットは、固体形態であるβ−アラニン、Ｎ−（アクリジン−９−イル）、２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルまたは任意のその塩を溶解するための溶液を含む。一部の実施形態では、キットは、固体形態であるグルタチオンまたは任意のその塩を溶解するための溶液を含む。一部の実施形態では、キットは、固体形態である１または２当量の塩基を溶解するための溶液を含む。一部の実施形態では、キットは、固体形態であるクエンチャーまたは任意のその塩および１または２当量の塩基の両方を溶解するための溶液を含む。一部の実施形態では、キットは、クエンチャーと１または２当量の塩基の混合物を溶解するための溶液を含む。一部の実施形態では、キットの固体成分または溶液は、許容され得る賦形剤、アジュバント、希釈剤または安定化剤をさらに含む。
【００１９】
一態様において、本発明は、例えば、病原体を不活化するために赤血球組成物を処理するのに有用なキットであって、核酸結合リガンドおよび求電子性基であるか、または該基を構成する官能基を含む病原体不活化化合物（任意のその塩を含む）、チオール基を含むクエンチャー（任意のその塩を含む）、および少なくとも約１当量（ここで、当量は、キット内のクエンチャーのモル量に相当するモル量を意味する）の塩基を含むキットを提供する。一部の実施形態では、キットは、約１または約２当量の適当な塩基を含む。
【００２０】
一態様において、本発明は、核酸結合リガンド、および求電子性基であるか、または該基を構成する官能基（例えば、ＰＩＣ−１）（任意のその塩を含む）、ならびに中和されたチオール基を含むクエンチャー（例えば、中和グルタチオン）（任意のその塩を含む）を含む、病原体を不活化するための赤血球組成物を処理するためのキットを提供する。
【００２１】
またさらなる態様では、本発明は、赤血球含有組成物、反応性求電子性基を含む病原体不活化化合物、および該求電子性基と反応することができる求核性基を含むクエンチャーを含み、ここで、クエンチャーは、約２ｍＭ〜４０ｍＭ、同様に約４ｍＭ〜４０ｍＭ、同様に約５ｍＭ〜３０ｍＭ、または約１０ｍＭ〜３０ｍＭの範囲の濃度であり、該組成物のｐＨは、約６．８〜８．５、同様に約７．０〜８．５、同様に約７．２〜８．５または約７．２〜８．０の範囲である。一部の実施形態では、病原体不活化化合物が核酸結合リガンドを含み、クエンチャーがチオール基を含むものである。好ましい実施形態は、赤血球含有組成物、β−アラニン、Ｎ−（アクリジン−９−イル）、２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステル、および約２ｍＭ〜４０ｍＭの範囲の濃度のグルタチオンを含むものであり、ここで、該組成物のｐＨは、約６．８〜８．５、同様に約７．０〜８．５、同様に約７．２〜８．５または約７．２〜８．０の範囲である。一部の実施形態では、該組成物は、赤血球ヘマトクリットが約１〜１００％、同様に約１０〜９０％、同様に約３５〜８０％、または約４０〜７０％の範囲である。一部の実施形態では、β−アラニン、Ｎ−（アクリジン−９−イル）、２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルの濃度が、約０．０５ｍＭ〜４ｍＭ、同様に約０．０５ｍＭ〜２ｍＭ、同様に約０．０５ｍＭ〜０．５ｍＭ、または約０．１ｍＭ〜０．３ｍＭの範囲であり、グルタチオンが、約５ｍＭ〜４０ｍＭ、同様に約５ｍＭ〜３０ｍＭ、または約１０ｍＭ〜３０ｍＭの範囲である。
【００２２】
さらなる態様では、本発明は、赤血球含有組成物、核酸結合リガンドと反応性求電子性基とを含む病原体不活化化合物、および該求電子性基と反応することができるチオール基を含むクエンチャーを提供し、クエンチャーが２ｍＭより高い濃度であり、該組成物のｐＨが約６．７以上である。一部の実施形態では、該組成物が、約６．８〜８．５、約７．０〜８．５、約７．２〜８．５および約７．２〜８．０の範囲のｐＨを有する。例えば、一部の実施形態では、該組成物のｐＨが約７．０〜８．５の範囲である。一部の実施形態では、該組成物が、少なくとも約４ｍＭのクエンチャーまたは少なくとも約１０ｍＭのクエンチャーを含むものである。一部の実施形態では、クエンチャーは、約４〜４０ｍＭまたは約１０〜３０ｍＭの範囲の濃度である。例えば、一部の実施形態では、クエンチャーが約４ｍＭ〜４０ｍＭの範囲の濃度であり、該組成物のｐＨが約６．８〜８．５の範囲である。一部の実施形態では、クエンチャーが少なくとも約４ｍＭの濃度であり、該組成物のｐＨが約６．８〜８．５の範囲である。
さらなる態様もまた、本発明によって提供される。
本発明は、以下の項目を提供する。
（項目１）
赤血球組成物と以下のもの：
（ａ）核酸結合リガンドと、核酸と反応することができる求電子性基であるか、または該基を構成する官能基とを含む病原体不活化化合物；
（ｂ）該求電子性基と反応することができるチオールを含むクエンチャー；および
（ｃ）適当な塩基であって、該赤血球組成物、該病原体不活化化合物、該クエンチャーおよび該塩基を含む混合物において、該塩基を有しない混合物と比べて、該病原体不活化化合物と赤血球との望ましくない反応のレベルを低下させるのに充分な量の適当な塩基
を混合することを含む、赤血球組成物の処理方法。
（項目２）
前記病原体不活化化合物と赤血球との前記望ましくない反応が、該病原体不活化化合物による該赤血球の表面の改変である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記塩基および前記クエンチャーの両方が前記赤血球組成物と、前記病原体不活化化合物と該赤血球組成物との混合前、該混合と同時、または該混合後約３０分以内に混合される、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記塩基および前記クエンチャーを、該塩基または該クエンチャーのいずれかと前記赤血球組成物と混合する前に互いに混合する、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記クエンチャーおよび前記塩基がともに、該クエンチャーを構成する塩基性の塩によって提供される、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記塩基がＮａＯＨである、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記塩基が塩基性バッファーである、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記塩基が少なくとも約１当量の塩基を含み、ここで、当量は、前記混合物中のクエンチャーのモル量に相当するモル量を意味する、項目１に記載の方法。
（項目９）
得られる混合物中の前記クエンチャーの濃度が２ｍＭより高い、項目１に記載の方法。
（項目１０）
得られる混合物中の前記クエンチャーの濃度が約１０ｍＭ〜３０ｍＭの範囲内にある、項目９に記載の方法。
（項目１１）
得られる混合物が室温で約７．０〜８．５のｐＨを有する、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記クエンチャーがシステインまたはシステイン誘導体を含む、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記クエンチャーがグルタチオンである、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記官能基が、マスタード、マスタード中間体およびマスタード同等物からなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記病原体不活化化合物が、β−アラニン、Ｎ−（アクリジン−９−イル）、２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルである、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記処理が、前記赤血球組成物中の病原体汚染物質の少なくとも１ｌｏｇの不活化をもたらす、項目１に記載の方法。
（項目１７）
前記混合物中の前記病原体不活化化合物の濃度を低下させる最終工程をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１８）
項目１７に記載の方法によって作製される赤血球含有組成物。
（項目１９）
赤血球組成物と以下のもの：
（ａ）核酸結合リガンドと、核酸と反応することができる求電子性基であるか、または該基を構成する官能基とを含む病原体不活化化合物；
（ｂ）該求電子性基と反応することができるチオールを含むクエンチャー；および
（ｃ）適当な塩基であって、該赤血球組成物、該病原体不活化化合物、該クエンチャーおよび該塩基を含む混合物のｐＨを、該塩基を有しない混合物と比べて増大させるのに充分な量の適当な塩基、
を混合することを含む、赤血球組成物の処理方法。
（項目２０）
前記塩基および前記クエンチャーの両方が、前記赤血球組成物と、前記病原体不活化化合物と該赤血球組成物との混合前、該混合と同時、または該混合後約３０分以内に混合される、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記塩基および前記クエンチャーを、該塩基または該クエンチャーのいずれかと前記赤血球組成物とを混合する前に互いに混合する、項目１９に記載の方法。
（項目２２）
前記クエンチャーおよび前記塩基がともに、該クエンチャーを構成する塩基性の塩によって提供される、項目１９に記載の方法。
（項目２３）
前記塩基がＮａＯＨである、項目１９に記載の方法。
（項目２４）
前記塩基が塩基性バッファーである、項目１９に記載の方法。
（項目２５）
前記塩基が少なくとも約１当量の塩基を含み、ここで、当量は、前記混合物中のクエンチャーのモル量に相当するモル量を意味する、項目１９に記載の方法。
（項目２６）
得られる混合物中の前記クエンチャーの濃度が２ｍＭより高い、項目１９に記載の方法。
（項目２７）
得られる混合物中の前記クエンチャーの濃度が約１０ｍＭ〜３０ｍＭの範囲内にある、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
得られる混合物が室温で約７．０〜８．５のｐＨを有する、項目１９に記載の方法。
（項目２９）
前記クエンチャーがシステインまたはシステイン誘導体を含む、項目１９に記載の方法。
（項目３０）
前記クエンチャーがグルタチオンである、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記官能基が、マスタード、マスタード中間体およびマスタード同等物からなる群より選択される、項目１９に記載の方法。
（項目３２）
前記病原体不活化化合物が、β−アラニン、Ｎ−（アクリジン−９−イル）、２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルである、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記処理が、前記赤血球組成物中の病原体汚染物質の少なくとも１ｌｏｇの不活化をもたらす、項目１９に記載の方法。
（項目３４）
前記混合物中の前記病原体不活化化合物の濃度を低下させる最終工程をさらに含む、項目１９に記載の方法。
（項目３５）
項目３４に記載の方法によって作製される赤血球含有組成物。
（項目３６）
（ａ）ｉ）反応性求電子性基であるか、または該基を構成する官能基を含む病原体不活化化合物、ｉｉ）該病原体不活化化合物の該反応性求電子性基と反応することができるチオール基を含むクエンチャー、およびｉｉｉ）赤血球含有組成物であって、病原体で汚染されている可能性がある赤血球組成物を提供すること；および
（ｂ）該病原体不活化化合物および該クエンチャーを赤血球含有組成物と混合することであって、ここで、得られる混合物中の該クエンチャーの濃度が２ｍＭより高いこと、
を含み、
得られる混合物の室温でのｐＨが約７．０〜８．５の範囲内にある、
赤血球組成物の処理方法。
（項目３７）
（ｃ）赤血球含有組成物のｐＨを、得られる混合物の室温でのｐＨが約７．０〜８．５の範囲内となるように調整する工程をさらに含む、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記赤血球含有組成物のｐＨが、該赤血球組成物への少なくとも約１当量の塩基の添加によって調整され、ここで、当量は、混合物中のクエンチャーのモル量に相当するモル量を意味する、項目３６に記載の方法。
（項目３９）
前記クエンチャーが、前記赤血球組成物への該クエンチャーの添加前に少なくとも約１当量の適当な塩基で中和され、該赤血球含有組成物のｐＨが、該中和されたクエンチャーの添加によって調整される、項目３６に記載の方法。
（項目４０）
得られる混合物が室温で約７．２〜８．５の範囲内のｐＨを有する、項目３６に記載の方法。
（項目４１）
得られる混合物中のクエンチャーの濃度が約１０ｍＭ〜約３０ｍＭの範囲内にある、項目３６に記載の方法。
（項目４２）
前記クエンチャーがシステインまたは適当なシステイン誘導体を含む、項目３６に記載の方法。
（項目４３）
前記クエンチャーがグルタチオンである、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記反応性求電子性基が、マスタード、マスタード中間体およびマスタード同等物からなる群より選択される、項目３６に記載の方法。
（項目４５）
前記病原体不活化化合物が、β−アラニン、Ｎ−（アクリジン−９−イル）、２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルである、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記処理が、前記赤血球組成物中の病原体汚染物質の少なくとも１ｌｏｇの不活化をもたらす、項目３６に記載の方法。
（項目４７）
前記混合物中の前記病原体不活化化合物の濃度を低下させる最終工程をさらに含む、項目３６に記載の方法。
（項目４８）
項目４７に記載の方法によって作製される赤血球組成物。
（項目４９）
以下の順に、
（ａ）ｉ）β−アラニン、Ｎ−（アクリジン−９−イル）、２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステル、ｉｉ）中和グルタチオン、およびｉｉｉ）赤血球含有組成物であって、病原体で汚染されている可能性がある赤血球組成物を提供すること；
（ｂ）該中和グルタチオンを該赤血球含有組成物と混合すること；
（ｃ）該混合物を適切な時間枠インキュベートすること；および
（ｄ）該β−アラニン、該Ｎ−（アクリジン−９−イル）、該２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルを、中和グルタチオンと赤血球含有組成物との混合物と混合すること
を含み、ここで、病原体は、該赤血球含有組成物中に存在する場合には、少なくとも１ｌｏｇ不活化される、
赤血球組成物の処理方法。
（項目５０）
クエンチャーの存在下での病原体不活化化合物による赤血球含有組成物の処理中において、該病原体不活化化合物と該赤血球との望ましくない副作用のクエンチングを改善する方法であって、ここで、該クエンチャーがチオールを含み、そしてここで、該病原体不活化化合物が、該クエンチャーの該チオールと反応性である求電子体であるか、または該求電子体を構成する官能基を含む方法であって、該方法は、該赤血球組成物、該病原体不活化化合物および該クエンチャーを含む反応混合物のｐＨを増大させることを含む、方法。
（項目５１）
前記反応混合物中の前記クエンチャーの濃度を増大させる工程をさらに含む、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記病原体不活化化合物と赤血球との望ましくない前記反応が、該病原体不活化化合物による該赤血球の表面の改変である、項目５０に記載の方法。
（項目５３）
（ａ）赤血球；
（ｂ）核酸結合リガンドと反応性求電子性基とを含む病原体不活化化合物；および
（ｃ）該求電子性基と反応することができるチオール基を含むクエンチャー
を含む組成物であって、
該クエンチャーが２ｍＭより高い濃度であり、該組成物のｐＨが約７．０〜８．５の範囲内にある、
組成物。
（項目５４）
核酸結合リガンドと、求電子性基であるか、または該基を構成する官能基とを含む病原体不活化化合物、チオール基を含むクエンチャー、および少なくとも約１当量の塩基を含むキットであって、当量は、該キット内のクエンチャーのモル量に相当するモル量を意味する、キット。
（項目５５）
項目１に記載の方法によって作製される赤血球組成物。
（項目５６）
項目１９に記載の方法によって作製される赤血球組成物。
（項目５７）
項目３６に記載の方法によって作製される赤血球組成物。
（項目５８）
項目４９に記載の方法によって作製される赤血球組成物。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、実施例１２の第１段階での反復輸血中における血清抗体力価を示す。明確にするために、エラーバーは、ＫＬＨ−アクリジン免疫処置についてのみ示す。ＲＢＣ輸液群でのエラーバーはおよそ±１であった。
【図２】図２は、実施例１２の第２段階での第４Ａ、４Ｂおよび６群におけるオリジナル（Ｏｒｉｇｉｎａｌ）Ｓ−２２０ ＲＢＣの寿命を示す。寿命は、初期の時点を第０日の１００％に外挿することにより測定した。第１群の動物にはビオチン化対照ＲＢＣを与えた。明確にするために、エラーバーは、第４Ａ、４Ｂおよび６群についてのみ示す。
【図３】図３は、実施例１２の第２段階での第２Ａ、２Ｂおよび５群におけるオリジナルＳ−３０３（ＰＩＣ−１）ＲＢＣの寿命を示す。寿命は、初期の時点を第０日の１００％に外挿することにより測定した。第１群の動物にはビオチン化対照ＲＢＣを与えた。明確にするために、エラーバーは、第２Ｂおよび５群についてのみ示す。
【図４】図４は、実施例１２の第２段階での第４Ａ、４Ｂおよび６群における改変Ｓ−２２０ ＲＢＣの寿命を示す。寿命は、初期の時点を第０日の１００％に外挿することにより測定した。第１群の動物にはビオチン化対照ＲＢＣを与えた。明確にするために、エラーバーは、第１、４Ｂおよび６群についてのみ示す。
【図５】図５は、実施例１２の第２段階での第２Ａ、２Ｂおよび５群における改変Ｓ−３０３ ＲＢＣの寿命を示す。寿命は、初期の時点を第０日の１００％に外挿することにより測定した。第１群の動物にはビオチン化対照ＲＢＣを与えた。明確にするために、エラーバーは、第２Ｂおよび５群についてのみ示す。
【図６】図６は、Ｓ−３０３処理ＲＢＣのＦＡＣＳｃａｎ解析の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
（発明の詳細な説明）
赤血球組成物中の反応性求電子性種のクエンチングのための既存の方法は、例えば、米国特許第６，７０９，８１０号に示されている。このような方法の非限定的な例として、グルタチオンが、β−アラニン、Ｎ−（アクリジン−９−イル）、２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステル（本明細書において以下、択一的に、「病原体不活化化合物Ｉ」、「ＰＩＣ−１」または「Ｓ−３０３」という）と組み合わせて使用される。グルタチオンは、典型的には、酸性形態で単離され（すなわち、プロトン化されている）、これは、これらの公知の方法において使用されている形態である。したがって、公知のクエンチング方法に言及する場合、グルタチオンは、酸性またはプロトン化されたグルタチオンをいう。本明細書で用いる場合、赤血球（組成物）中の病原体の不活化のための標準的な条件は、赤血球組成物を、２ｍＭのプロトン化されたグルタチオンおよび０．２ｍＭのＰＩＣ−１で処理することを伴う。プロトン化されたグルタチオン濃度は、望ましくない副作用のより良好なクエンチングを提供する試みにおいて、増大することがあり得、病原体不活化化合物に対するクエンチャーの比率が高くなる。しかしながら、プロトン化されたグルタチオン濃度が増大すると、赤血球組成物全体としてのｐＨは、グルタチオンの酸性度のため減少する。このｐＨの低下により、病原体不活化化合物と赤血球（特に赤血球の表面）との反応のクエンチングが不充分になることが測定されている。また、この標準的な条件では、赤血球表面の改変の充分なクエンチングがもたらされないことが測定された。したがって、本発明は、病原体不活化化合物およびクエンチャーを含む赤血球組成物のｐＨを、改善されたクエンチングがもたらされる適当な範囲に調整し、使用するクエンチャーの濃度が２ｍＭより高い（例えば、約５〜４０ｍＭ、同様に約１０〜３０ｍＭ、または約２０ｍＭ）、改善されたクエンチング方法を提供する。例えば、赤血球含有組成物を病原体不活化化合物およびクエンチャーと混合すると、ｐＨが適当な範囲内（例えば、約６．８〜８．５、同様に約７．０〜８．５、同様に約７．２〜８．５、または約７．２〜８．０のｐＨ）であり、クエンチャー濃度が約５〜４０ｍＭの範囲であるような方法が提供される。
【００２５】
本明細書に記載の方法の各々の一部の実施形態では、病原体不活化化合物と赤血球との望ましくない（また、本明細書では、「不必要な」ともいう）副作用が低減される。一部の実施形態では、低減される望ましくない副作用は、病原体不活化化合物による赤血球表面の改変である。一部の実施形態では、副作用のレベルは、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約９０％低減される。副作用の低減（第２の方法と比べて）は、例えば、病原体不活化化合物に特異的な抗体の処理済み赤血球への結合の量を測定および／またはインビボでの該処理済み赤血球の寿命を測定し、これらの測定値を第２の異なる方法で処理した赤血球と比較することにより実証され得る。例えば、該改善された方法の一部の実施形態では、処理された血球に対する抗病原体不活化化合物への抗体結合のレベルは、改善なしの方法と比べて少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約９０％減少する。
【００２６】
本明細書に記載の本発明の態様の各々の一部の実施形態では、赤血球への病原体不活化化合物の結合の充分なクエンチングを提供するのに適当なｐＨ範囲は、２ｍＭのプロトン化されたグルタチオンおよび０．２ｍＭのＰＩＣ−１による赤血球組成物の標準的な処理と比べて改善された赤血球への病原体不活化化合物の結合のクエンチングを提供するｐＨ範囲である。一部の実施形態では、クエンチングにおける改善は、標準的な方法で処理したものと比べたときの該処理済み赤血球の免疫原性の減少によって実証される。一部の実施形態では、標準的な方法と比べたときの所与の方法によってもたらされるクエンチングにおける改善は、インビトロでの該処理済み赤血球への病原体不活化化合物に特異的な抗体の結合の量の減少によって、および／またはインビボでの該処理済み赤血球の寿命の増大によって実証される。
【００２７】
一態様において、本発明は、ａ）ｉ）反応性求電子性基を含む病原体不活化化合物、ｉｉ）チオール基を含むクエンチャー、およびｉｉｉ）赤血球含有組成物であって、病原体で汚染されている可能性がある赤血球組成物を提供すること；およびｂ）病原体不活化化合物およびクエンチャーを赤血球含有組成物と混合すること（ここで、得られる混合物は、赤血球への病原体不活化化合物の結合の充分なクエンチングを提供するのに適当なｐＨ範囲である）を含む、赤血球組成物の処理方法を提供する。一部の実施形態では、該方法は、赤血球含有組成物のｐＨを調整する工程をさらに含む。一部の実施形態では、赤血球含有組成物のｐＨを、病原体不活化化合物とクエンチャーを混合する前に調整する。一部の実施形態では、赤血球含有組成物のｐＨを、クエンチャーの添加によって調整する。一部の実施形態では、クエンチャーを、赤血球組成物へのクエンチャーの添加前に少なくとも約１当量の適当な塩基で中和する。一部の実施形態では、クエンチャーを赤血球含有組成物と、病原体不活化化合物を添加する前に混合する。該方法の一部の実施形態では、室温での適当なｐＨ範囲は、約６．８〜８．５、約７．０〜８．５、約７．２〜８．５、または約７．２〜８．０である。一部の実施形態では、得られる混合物中のクエンチャーの濃度が約２ｍＭ〜約４０ｍＭの範囲である。一部の実施形態では、得られる混合物中のクエンチャーの濃度が約４ｍＭ〜約４０ｍＭ、約１０〜約３０ｍＭの範囲である。該方法の一部の実施形態では、得られる混合物中のクエンチャーの濃度が少なくとも約４ｍＭまたは少なくとも約１０ｍＭである。一部の実施形態では、該方法において使用されるクエンチャーがシステインまたはシステイン誘導体を含むものである。例えば、一部の実施形態では、クエンチャーがグルタチオンである。反応性求電子性基は、一部の実施形態では、マスタード、マスタード中間体およびマスタード同等物からなる群より選択される。一部の実施形態では、病原体不活化化合物が、β−アラニン、Ｎ−（アクリジン−９−イル）、２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルである。一部の実施形態では、該処理により、赤血球組成物において少なくとも１ｌｏｇの病原体汚染物質の不活化がもたらされる。
【００２８】
別の態様では、本発明は、（ａ）ｉ）反応性求電子性基であるか、または該基を構成する官能基を含む病原体不活化化合物、ｉｉ）病原体不活化化合物の反応性求電子性基と反応することができるチオール基を含むクエンチャー、およびｉｉｉ）赤血球含有組成物であって、病原体で汚染されている可能性がある赤血球組成物提供すること；および（ｂ）病原体不活化化合物およびクエンチャーを赤血球含有組成物と混合すること（ここで、得られる混合物中のクエンチャーの濃度が２ｍＭより大きく、得られる混合物の室温でのｐＨが約６．７以上の範囲である）を含む、赤血球組成物の処理方法を提供する。一部の実施形態では、得られる混合物が、室温で約７．０以上または約７．２以上のｐＨを有する。一部の実施形態では、得られる混合物のｐＨが、約６．８〜８．５、約７．０〜８．５、約７．２〜８．５、または約７．２〜８．０の範囲である。例えば、一部の実施形態では、得られる混合物の室温でのｐＨが約７．０〜８．５の範囲である。一部の実施形態では、該方法は、（ｃ）赤血球含有組成物のｐＨを、得られる混合物のｐＨが室温で、表示した範囲（例えば、約７．０〜８．５の範囲）となるように調整する工程をさらに含む。一部の実施形態では、赤血球含有組成物のｐＨを、赤血球組成物への少なくとも約０．５当量、少なくとも約１当量、または少なくとも約２当量の塩基の添加によって調整し、ここで、当量は、混合物中のクエンチャーのモル量に相当するモル量を意味する。一部の実施形態では、クエンチャーが、赤血球組成物へのクエンチャーの添加前に少なくとも約１当量の適当な塩基で中和され、赤血球含有組成物のｐＨが、中和されたクエンチャーの添加によって調整される。一部の実施形態では、得られる混合物中のクエンチャーの濃度が少なくとも約４ｍＭまたは少なくとも約１０ｍＭである。一部の実施形態では、得られる混合物中のクエンチャーの濃度が約４〜４０ｍＭまたは約１０〜３０ｍＭである。例えば、一部の実施形態では、クエンチャーの濃度が少なくとも約４ｍＭであり、ここで、混合物が室温で約６．８〜８．５の範囲のｐＨを有する。一部の実施形態では、クエンチャーの濃度が約４〜４０ｍＭであり、ｐＨが室温で約７．２〜８．５の範囲である。一部の実施形態では、クエンチャーを、赤血球組成物へのクエンチャーの添加前に少なくとも約１当量の適当な塩基で中和する。一部の実施形態では、クエンチャーを赤血球含有組成物と、病原体不活化化合物の添加前に混合する。一部の実施形態では、クエンチャー化合物が酸性である。一部の実施形態では、クエンチャーがシステインまたはシステイン誘導体を含むものである。例えば、一部の実施形態では、クエンチャーがグルタチオンである。一部の実施形態では、該官能基が、マスタード、マスタード中間体およびマスタード同等物からなる群より選択される。一部の実施形態では、病原体不活化化合物が、β−アラニン、Ｎ−（アクリジン−９−イル）、２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルである。一部の実施形態では、該処理により、赤血球組成物において少なくとも１ｌｏｇの病原体汚染物質の不活化がもたらされる。一部の実施形態では、該処理により、赤血球組成物において少なくとも１ｌｏｇ、少なくとも約（ａｏｂｕｔ）２ｌｏｇ、または少なくとも約３ｌｏｇの病原体汚染物質の不活化がもたらされる。
【００２９】
別の態様では、本発明は、赤血球組成物と以下のもの：（ａ）核酸結合リガンドと、核酸と反応することができる求電子性基であるか、または該基を構成する官能基とを含む病原体不活化化合物；（ｂ）該求電子性基と反応することができるチオールを含むクエンチャー；および（ｃ）適当な塩基であって、赤血球組成物、病原体不活化化合物、クエンチャーおよび該塩基を含む混合物において、該塩基を有しない混合物（すなわち、（ｃ）の塩基が添加されていない以外は第１のものと同じ成分を含む第２の混合物）と比べて、該混合物において病原体不活化化合物と赤血球とのの望ましくない副作用のレベルを低下させるのに充分な量の適当な塩基を含む、赤血球組成物の処理方法を提供する。一部の実施形態では、病原体不活化化合物と赤血球との望ましくない反応が、病原体不活化化合物による赤血球の表面の改変である。一部の実施形態では、該塩基およびクエンチャーを赤血球組成物と、病原体不活化化合物を赤血球組成物と合わせる前、合わせるのと同時、または合わせた後１時間、約３０分、約２０分、約１０分、約５分、約２分、または約１分以内に合わせる。一部の実施形態では、該塩基およびクエンチャーを赤血球組成物と、病原体不活化化合物と赤血球組成物との混合前に混合する。一部の実施形態では、該塩基およびクエンチャーを、該塩基またはクエンチャーのいずれかと赤血球組成物と混合する前に互いに混合する。一部の実施形態では、該クエンチャーを構成する塩基性の塩は、クエンチャーおよび該塩基の両方を提供し、これらは、ともに、該クエンチャーを構成する塩基性の塩によって提供される。一部の実施形態では、該塩基がＮａＯＨである。一部の実施形態では、該塩基が塩基性バッファーである。一部の実施形態では、少なくとも約０．５当量、少なくとも約１．０、または少なくとも約２当量の塩基が添加され、ここで、当量は、混合物中のクエンチャーのモル量に相当するモル量を意味する。一部の実施形態では、該塩基が少なくとも約１当量の塩基を構成する。該方法の一部の実施形態では、室温での適当なｐＨ範囲は、約６．８〜８．５、約７．０〜８．５、約７．２〜８．５、または約７．２〜８．０である。一部の実施形態では、得られる混合物が室温で約７．０〜８．５のｐＨを有する。一部の実施形態では、得られる混合物中のクエンチャーの濃度が２ｍＭより大きく、約４ｍＭより大きく、または約１０ｍＭより大きい。一部の実施形態では、得られる混合物中のクエンチャーの濃度が約２ｍＭ〜約４０ｍＭの範囲である。一部の実施形態では、得られる混合物中のクエンチャーの濃度が約４ｍＭ〜約４０ｍＭ、約１０〜約３０ｍＭの範囲である。例えば、一部の実施形態では、得られる混合物中のクエンチャーの濃度が約１０ｍＭ〜３０ｍＭの範囲である。一部の実施形態では、クエンチャーが酸性である。一部の実施形態では、クエンチャーが、システインまたはシステイン誘導体、例えばグルタチオンなどを含むものである。一部の実施形態では、該官能基が、マスタード、マスタード中間体およびマスタード同等物からなる群より選択される。例えば、一部の実施形態（請求項１４に記載の方法）では、病原体不活化化合物が、β−アラニン、Ｎ−（アクリジン−９−イル）、２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルである。一部の実施形態では、該処理により、赤血球組成物において少なくとも１ｌｏｇの病原体汚染物質の不活化がもたらされる。
【００３０】
さらに別の実施形態では、本発明は、赤血球組成物と以下のもの：（ａ）核酸結合リガンドと、核酸と反応することができる求電子性基であるか、または該基を構成する官能基とを含む病原体不活化化合物；（ｂ）該求電子性基と反応することができるチオールを含むクエンチャー；および（ｃ）適当な塩基であって、赤血球組成物、病原体不活化化合物、クエンチャーおよび該塩基を含む混合物のｐＨを、該塩基を有しない混合物（すなわち、該混合物に（ｃ）の塩基が添加されていない以外は第１のものと同じ成分を含む第２の混合物）と比べて増大させるのに充分な量の適当な塩基を混合することを含む、赤血球組成物の処理方法を提供する。一部の実施形態では、（例えば、クエンチャーが酸性化合物である一部の実施形態では）、充分な量の適当な塩基を添加して、混合物のｐＨを、少なくとも塩基またはクエンチャーのいずれかを有しない混合物のｐＨあたりまで増大させる。一部の実施形態では、該塩基およびクエンチャーを赤血球組成物と、病原体不活化化合物を赤血球組成物と合わせる前、合わせるのと同時、または合わせた後１時間、約３０分、約２０分、約１０分、約５分、約２分、または約１分以内に合わせる。一部の実施形態では、該塩基およびクエンチャーを赤血球組成物と、病原体不活化化合物と赤血球組成物との混合前に混合する。一部の実施形態では、該塩基およびクエンチャーを、該塩基またはクエンチャーのいずれかと赤血球組成物と混合する前に互いに混合する。一部の実施形態では、該クエンチャーを構成する塩基性の塩は、クエンチャーおよび該塩基の両方を提供し、これらは、ともに、該クエンチャーを構成する塩基性の塩によって提供される。一部の実施形態では、該塩基がＮａＯＨである。一部の実施形態では、該塩基が塩基性バッファーである。一部の実施形態では、少なくとも約０．５当量、少なくとも約１．０、または少なくとも約２当量の塩基が添加され、ここで、当量は、混合物中のクエンチャーのモル量に相当するモル量を意味する。一部の実施形態では、該塩基が少なくとも約１当量の塩基を構成する。該方法の一部の実施形態では、室温での適当なｐＨ範囲は、約６．８〜８．５、約７．０〜８．５、約７．２〜８．５、または約７．２〜８．０である。一部の実施形態では、得られる混合物が室温で約７．０〜８．５のｐＨを有する。一部の実施形態では、得られる混合物中のクエンチャーの濃度が２ｍＭより大きく、約４ｍＭより大きく、または約１０ｍＭより大きい。一部の実施形態では、得られる混合物中のクエンチャーの濃度が約２ｍＭ〜約４０ｍＭの範囲である。一部の実施形態では、得られる混合物中のクエンチャーの濃度が約４ｍＭ〜約４０ｍＭ、約１０〜約３０ｍＭの範囲である。例えば、一部の実施形態では、得られる混合物中のクエンチャーの濃度が約１０ｍＭ〜３０ｍＭの範囲である。一部の実施形態では、クエンチャーが酸性である。一部の実施形態では、クエンチャーが、システインまたはシステイン誘導体、例えばグルタチオンなどを含むものである。一部の実施形態では、該官能基が、マスタード、マスタード中間体およびマスタード同等物からなる群より選択される。例えば、一部の実施形態（請求項１４に記載の方法）では、病原体不活化化合物が、β−アラニン、Ｎ−（アクリジン−９−イル）、２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルである。一部の実施形態では、該処理により、赤血球組成物において少なくとも１ｌｏｇの病原体汚染物質の不活化がもたらされる。
【００３１】
さらなる態様では、本発明は、クエンチャーの存在下で病原体不活化化合物による赤血球含有組成物の処理中において、病原体不活化化合物と赤血球との望ましくない副作用のクエンチングを改善する方法であって、クエンチャーがチオールを含み、病原体不活化化合物が、クエンチャーのチオールと反応性である求電子体であるか、または該求電子体を構成する官能基を含む方法を提供し、該方法は、赤血球組成物、病原体不活化化合物およびクエンチャーを含む反応混合物のｐＨを増大させることを含む。一部の実施形態では、該方法は、反応混合物中のクエンチャーの濃度を増大させる工程をさらに含む。一部の実施形態では、クエンチャーが酸性である。一部の実施形態では、病原体不活化化合物と赤血球との望ましくない反応が、病原体不活化化合物による赤血球の表面の改変である。
【００３２】
さらなる態様では、本発明は、以下の順に、ａ）ｉ）β−アラニン、Ｎ−（アクリジン−９−イル）、２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステル、ｉｉ）中和グルタチオン、およびｉｉｉ）赤血球含有組成物であって、病原体で汚染されている可能性がある赤血球組成物を提供すること；ｂ）中和グルタチオンを赤血球含有組成物と混合すること；ｃ）該混合物を適切な時間インキュベートすること；およびｄ）β−アラニン、Ｎ−（アクリジン−９−イル）、２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルを、中和グルタチオンと赤血球含有組成物との混合物と混合すること（ここで、病原体は、赤血球含有組成物中に存在する場合には、少なくとも１ｌｏｇ不活化される）を含む、赤血球組成物の処理方法を提供する。一部の実施形態では、中和グルタチオンは、少なくとも約１当量の塩基が添加されているグルタチオンを構成し、ここで、当量は、クエンチャーのモル量に相当するモル量を意味する。一部の実施形態では、中和グルタチオンは、約２当量の塩基が添加されているグルタチオン（例えば、グルタチオンの遊離酸）を構成する。
【００３３】
本明細書に記載の方法の各々によって作製される赤血球組成物もまた提供される。一部の実施形態では、赤血球組成物は、病原体不活化化合物での処理を伴う他の方法によって作製される赤血球と比べたとき、病原体不活化化合物による赤血球の表面の改変のレベルが低減されている。一部の実施形態では、該処理方法によって作製される赤血球組成物は、病原体不活化化合物の分解生成物（例えば、クエンチャーと病原体不活化化合物との反応生成物）を含むものである。一部の実施形態では、本明細書に記載の処理方法によって作製される赤血球組成物は、処理の完了後、病原体不活化化合物での処理を伴う別の方法によって作製される赤血球組成物と比べたとき、反応性求電子性基を含む病原体不活化化合物の量が低減されている。一部の実施形態では、該組成物中の反応性求電子性基を含む病原体不活化化合物の量は、病原体不活化化合物を伴う別の方法（例えば、クエンチャーおよび／または塩基を反応混合物に添加していない方法、または低ｐＨでの処理）で処理した組成物と比べたとき、約１０％、約２５％、約５０％、約７５％、約９０％、約９５％、または約９９％低減されている。
【００３４】
さらなる態様では、本発明は、赤血球含有組成物、核酸結合リガンドと反応性求電子性基とを含む病原体不活化化合物、および該求電子性基と反応することができるチオール基を含むクエンチャーを提供し、該クエンチャーは２ｍＭより高い濃度であり、該組成物のｐＨは約６．７以上である。一部の実施形態では、該組成物が、約６．８〜８．５、約７．０〜８．５および約７．２〜８．０の範囲のｐＨを有する。一部の実施形態では、該組成物が、少なくとも約４ｍＭのクエンチャーまたは少なくとも約１０ｍＭのクエンチャーを含むものである。一部の実施形態では、クエンチャーは、約４〜４０ｍＭまたは約１０〜３０ｍＭの範囲の濃度である。例えば、一部の実施形態では、クエンチャーが約４ｍＭ〜４０ｍＭの範囲の濃度であり、該組成物のｐＨが約６．８〜８．５の範囲である。一部の実施形態では、クエンチャーが少なくとも約４ｍＭの濃度であり、該組成物のｐＨが約６．８〜８．５の範囲である。
【００３５】
アミノ酸置換基を含む本明細書における配列に関し、当業者には自明のように、各アミノ酸置換基は独立して選択され得る。本発明はまた、アミノ酸置換基の１個以上が除去されたアミノ酸置換基を含む配列を提供する。
【００３６】
本発明の方法において不活化される病原体汚染物質としては、ヒト、他の哺乳動物または脊椎動物において疾患を引き起こし得る任意の核酸含有因子が挙げられる。病原性因子は、単細胞性または多細胞性であり得る。病原体の例は、ヒト、他の哺乳動物または脊椎動物において疾患を引き起こす細菌、ウイルス、原虫、真菌、酵母、かび、およびマイコプラズマである。病原体の一般的な物質は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、該一般的な物質は、単鎖または二本鎖核酸として存在し得る。表１に、ウイルスの例を挙げるが、本発明をなんら限定することを意図しない。
【００３７】
（表１．ウイルスの非限定的な例）
【００３８】
【表１】

存在し得る病原体汚染物質の不活化に加え、本発明の方法はまた、赤血球組成物中に存在し得る白血球を不活化する。白血球低減処理（ｌｅｕｋｏｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）方法は、白血球がレシピエントにおいて望ましくない免疫応答をもたらし得るため、好ましくは、ほとんどの白血球を輸液が意図される赤血球組成物から除去するために使用され得る。しかしながら、すべての血液が白血球低減処理されるわけではないか、または白血球低減処理方法により、すべての白血球が除去されるのではない。したがって、本発明の方法による残留（あれば）白血球の不活化により、かかる免疫応答のリスクがさらに低減され得る。
【００３９】
本発明の方法は、病原体不活化化合物およびクエンチャーのエキソビボ使用を含む。該エキソビボ使用は、該化合物を赤血球組成物の処理のために、ヒト、哺乳動物または脊椎動物の生体外で使用することを伴い、ここで、処理された生物学的材料は、ヒト、哺乳動物または脊椎動物の生体内での使用が意図される。例えば、ヒトからの血液の採取、および病原体を不活化するための血中への化合物の導入は、該血液が、該ヒトまたは別のヒト内への再導入が意図される場合、該化合物のエキソビボ使用と規定される。かかるヒト血液の該ヒトまたは別のヒト内への再導入は、該化合物のエキソビボ使用とは対照的に、かかる血液のインビボ使用であり得る。ヒトに再導入したとき、該化合物が該血液中になお存在する場合、該化合物はまた、そのエキソビボ使用に加えて、インビボで導入される。本発明の一部の実施形態は、クエンチャーのエキソビボ使用を伴い、ここで、赤血球組成物はインビボ使用が意図される。場合によっては、クエンチャーもまたインビボで導入されるように、ある程度のレベルのクエンチャーを赤血球組成物中に残留させる。材料または化合物のインビトロ使用は、該材料または化合物をヒト、哺乳動物または脊椎動物の生体外で使用することを伴い、ここで、該材料または化合物は、ヒト、哺乳動物または脊椎動物の生体への再導入が意図されない。インビトロ使用の一例は、赤血球試料の諸成分の診断用解析であり得る。本発明の方法は、赤血球または他の構成成分の改変により血液試料の成分のインビトロ解析がなされ得るため、赤血球組成物のインビトロ使用に適用され得る。したがって、本発明の方法は、クエンチングしなければ試料の診断用試験を妨げ得る試料の改変の充分なクエンチングを伴うかかるインビトロ試料の取り扱いにおける安全性を提供し得る。
【００４０】
本発明の赤血球組成物としては、限定されないが、赤血球を含む任意の血液製剤であって、ヒト使用、例えば輸液に適した赤血球を提供するか、または該赤血球を提供するように加工処理された血液製剤が挙げられる。赤血球組成物としては、例えば、全血および赤血球濃縮物（例えば、パッケージングされた赤血球）が挙げられる。赤血球組成物は、該組成物中の赤血球濃度の測定値であるそのヘマトクリットによって表示され得る。赤血球組成物は、約１〜１００％、さらに好適には約１０〜９０％、同様に約３５〜８０％、または約４０〜７０％の範囲のヘマトクリットを有するものであり得る。かかる赤血球組成物は、化学薬品、例えば、病原体不活化化合物およびクエンチャーなどを含み得る。これはまた、バッファーおよび他の溶液、例えば、赤血球添加剤溶液（塩または緩衝溶液が挙げられる）などを含み得る。ヒト、哺乳動物または脊椎動物の生体と接触するか、または該生体内に導入される任意の赤血球組成物（この場合、かかる接触は、混入病原体による疾患の感染のリスクを有する）が、本明細書に開示するようにして処理され得る。
【００４１】
病原体の不活化は、病原体を、再生能をもたない物質にすることを伴う。不活化は、再生能を有する残留病原体の割合の負のｌｏｇ値（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｌｏｇａｒｉｔｈｍ）で示す。したがって、ある一定の濃度の化合物が、病原体の９０％を、再生能をもたない物質にする場合、病原体の１０％または１０分の１（０．１）が依然として再生能を有する。０．１の負のｌｏｇ値は１であり、この濃度の化合物を、存在する病原体を１ｌｏｇ不活化したという。あるいはまた、該化合物は、１ｌｏｇの不活化または該濃度の低減を有するという。１％または０．１％以外すべての病原体の不活化は、それぞれ、該化合物のその濃度における２ｌｏｇまたは３ｌｏｇの病原体の低減に相当し得る。赤血球含有組成物などの材料中の特定の病原体のレベルの測定方法は、よく知られており、かかる方法の例を実施例に提供する。
【００４２】
本明細書に記載の方法および組成物の各々の一部の実施形態では、赤血球組成物の処理は、赤血球組成物中の病原体汚染物質（もし存在する場合）の少なくとも約１ｌｏｇ、少なくとも約２ｌｏｇ、または少なくとも約３ｌｏｇの不活化をもたらす。一部の実施形態では、病原体が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓまたはＹｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａなどの細菌である。一部の他の実施形態では、病原体が、水疱性口内炎ウイルスなどのウイルスである。他の実施形態では、赤血球組成物の処理が、該組成物中の病原体汚染物質の少なくとも約１ｌｏｇ、少なくとも約２ｌｏｇ、または少なくとも約３ｌｏｇの不活化をもたらす。
【００４３】
赤血球組成物中の病原体の不活化は、赤血球組成物中の病原体を病原体不活化化合物と接触させることにより行なわれる。本発明の方法によってクエンチングされ得る病原体不活化化合物としては、例えばインサイチュで、求電子性基などの反応性基であるか、または該反応性基を形成し得、該反応性基を形成している官能基を含む化合物が挙げられる。本発明の病原体不活化化合物は、反応性とするための光活性化を必要としない。例えば、該官能基は、マスタード基、マスタード基中間体、マスタード基同等物、エポキシド、ホルムアルデヒドまたはホルムアルデヒド合成物（ｓｙｎｔｈｏｎ）であり得る。かかる官能基は、インサイチュで、反応性基、例えば、求電子性アジリジン、アジリジニウム、チイランまたはチイラニウム（ｔｈｉｉｒａｎｉｕｍ）イオンなどを形成することができるものである。マスタード基は、モノ−またはビス−（ハロエチル）アミン基またはモノ（ハロエチル）スルフィド基であり得る。マスタード同等物は、マスタードと同様の機構によって、例えば、アジリジニウムおよびアジリジン基またはチイランおよびチイラニウム基などの反応性中間体を形成することにより反応する基である。例としては、アジリジン誘導体、モノまたはビス（メシルエチル）アミン基、モノ−（メシルエチル）スルフィド基、モノまたはビス（トシルエチル）アミン基およびモノ−（トシルエチル）スルフィド基が挙げられる。ホルムアルデヒドシンソンは、ホルムアルデヒドに分解される任意の化合物であり、ヒドロキシメチルグリシンなどのヒドロキシルアミンが挙げられる。病原体不活化化合物の反応性基は、病原体の核酸と（例えば、核酸上の求核性基と）反応することができるものである。反応性基はまた、クエンチャーの求核性基と反応することができるものである。病原体不活化化合物はまた、該化合物を核酸に標的化する成分、例えばアンカー部分などを含み得る。アンカー部分は、核酸生体高分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなど）に非共有結合することができる部分を含み、また、核酸結合リガンド、核酸結合基、または核酸結合部分ともいう。かかる化合物の例は、米国特許第５，６９１，１３２号、同第６，４１０，２１９号、同第６，１３６，５８６号、同第６，６１７，１５７号、および同第６，７０９，８１０号（各々は、引用により本明細書に組み込まれる）に記載されている。本発明の方法によってクエンチングされ得る病原体不活化化合物の別の類型は、米国特許第６，５１４，９８７号（引用により本明細書に組み込まれる）に記載されているような、加水分解性リンカーによって核酸結合基に連結された上記の反応性基を含むものである。病原体不活化化合物のアンカー部分は、核酸に対する親和性を有する。この親和性は、核酸とのいくつかの非共有結合様式（限定されないが、インターカレーション、副溝結合、主溝結合、静電結合（すなわち、リン酸主鎖結合が挙げられる）、および配列特異的結合のいずれかによるものであり得る。かかる核酸結合部分の詳細な例は、上記の特許を見るとよい。
【００４４】
本明細書に記載の方法、組成物およびキットの各々の一部の実施形態では、病原体不活化化合物は、求核試薬である選択したクエンチャーと反応性である反応性求電子性基であるか、または該基を構成する官能基を含む。一部の実施形態では、病原体不活化基は、核酸結合リガンドと、求電子性基であるか、または該基を構成する官能基とを含む。
【００４５】
本発明における使用のための適当な病原体不活化化合物の特定の例は、β−アラニン、Ｎ−（アクリジン−９−イル）、２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステル（あるいはまた、本明細書において「ＰＩＣ−１」または「Ｓ−３０３」ともいう）であり、その構造は以下の通りであり、その塩も含む。
【００４６】
【化１】

一部の実施形態では、赤血球組成物およびクエンチャーを含む混合物中のＰＩＣ−１などの病原体不活化化合物の濃度は、約０．０５ｍＭ〜４ｍＭ、約０．０５ｍＭ〜２ｍＭ、約０．０５ｍＭ〜０．５ｍＭ、または約０．１ｍＭ〜０．３ｍＭの範囲である。一部の実施形態では、病原体の不活化化合物に対するクエンチャーのモル比は、いったん両成分が赤血球組成物と混合されていると、約１０：１〜約４００：１、同様に約１０：１〜約２００：１、同様に約２０：１〜約２００：１、同様に約５０：１〜約２００：１、同様に約１００：１である。
【００４７】
本発明の方法における使用のためのクエンチャーは、病原体を不活化するために用いる反応性求電子性種の望ましくない副作用を低減することが意図される。好適なクエンチャーは、病原体不活化化合物の該求電子性基と反応することができる求核性基を含むものであり、米国特許第６，７０９，８１０号（引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に詳細に記載されている。クエンチャーは、赤血球組成物における望ましくない副作用を有意に低減させることができると同時に、病原体不活化化合物が、赤血球組成物を汚染状態であり得る病原体を充分に不活化するのを可能にする。改善された本発明の方法は、望ましくない副作用の最適な低減と充分な病原体の不活化を同時にもたらす条件下で、有効量の病原体不活化化合物との組み合わせでの有効量のクエンチャーを提供する。多種種々の望ましくない副作用（例えば、タンパク質および赤血球成分による反応）が低減され得る。一部の実施形態では、クエンチャーは、赤血球の改変、例えば、赤血球へのＩｇＧの結合または赤血球への病原体不活化化合物の結合の最適な低減を提供する。本発明の方法は、エキソビボ赤血球の処理組成物を伴うが、一部のクエンチャーは、個体内への導入時に該組成物中に残留する。したがって、本発明のクエンチャーは、輸液に適したものである必要がある。好適なクエンチャーとしては、限定されないが、チオール基を含む化合物、例えば、アミノ酸であるシステインまたは適当なシステイン誘導体（例えば、Ｎ−アセチルシステインなど）を含むクエンチャーなどが挙げられる。かかるクエンチャーの例としては、システイン、および少なくとも１個のシステインを含むペプチド、例えばグルタチオンなどが挙げられる。一部の実施形態では、適当なクエンチャーは、さらなる化学薬品または添加酵素の使用を伴って、または該使用なしでインサイチュでチオール基を形成し得るシステイン誘導体、例えば、Ｓ−アセチルシステインまたは他の適当なシステインのチオール由来プロドラッグ、またはＳ−アセチルシステインもしくは他の適当なシステインのチオール由来プロドラッグを含むペプチドなどを含むものである。好適なシステイン誘導体は、病原体不活化化合物の該求電子性基と反応することができるシステイニルチオールを含むもの、または該システイニルチオールをインサイチュで形成することができるもののいずれかである。
【００４８】
一般的に、核酸への病原体不活化化合物の標的化により、充分な量の病原体不活化化合物が、クエンチングされる前に、病原体内に浸透して病原体の核酸と反応することができる。しかしながら、細胞外環境内に残留する病原体不活化化合物は、充分にクエンチングされ、望ましくない副作用が低減される。したがって、有効量の病原体不活化化合物との組み合わせでの有効量のクエンチャーが、本発明の方法によって提供される。一部の実施形態では、クエンチャーは、赤血球組成物の細胞外環境において望ましくない副作用をクエンチングすることができるが、細胞（例えば赤血球、ウイルスおよび細菌）内に有意に侵入しない。したがって、有効量の病原体不活化化合物は、充分な病原体不活化化合物が、細胞外環境内でクエンチングされる前に病原体内に浸透するように提供され得る。一部の実施形態では、クエンチャーは、システインまたは適当なシステイン誘導体を含むものであり、病原体（例えば、ウイルスまたは細菌）内に有意に浸透しない。かかるクエンチャーとしては、そのアミノ酸の少なくとも１個が、システイン、Ｎ−アセチルシステイン、Ｓ−アセチルシステインまたは他の適当なシステイン誘導体であるペプチドが挙げられる。一部の実施形態では、クエンチャーは、システインを含むペプチド（例えば、２〜１０個のアミノ酸）を含むものである。
【００４９】
一部の実施形態では、クエンチャーは、２〜１０個のアミノ酸のペプチドであり、該アミノ酸の少なくとも１個が、システイン、Ｎ−アセチルシステイン、Ｓ−アセチルシステインまたは他の適当なシステイン誘導体である。一部の実施形態では、クエンチャーは、少なくとも３個のアミノ酸、例えば約３〜１０個のアミノ酸、同様に約３〜６個のアミノ酸のペプチドであり、該アミノ酸の少なくとも１個が、システイン、Ｎ−アセチルシステイン、Ｓ−アセチルシステインまたは他の適当なシステイン誘導体である。一部の実施形態では、クエンチャーは、少なくとも３個のアミノ酸、例えば約３〜１０個のアミノ酸、同様に約３〜６個のアミノ酸のペプチドであり、該アミノ酸の少なくとも１個が、システイン、Ｎ−アセチルシステイン、Ｓ−アセチルシステインまたは他の適当なシステイン誘導体であり、同様に、該アミノ酸の少なくとも２個または少なくとも３個が、システイン、Ｎ−アセチルシステイン、Ｓ−アセチルシステインまたは他の適当なシステイン誘導体である。好ましいクエンチャーはグルタチオン（また、Ｌ−グルタチオンおよびγ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システイニル−グリシンとして知られる）である。
【００５０】
一部の実施形態では、クエンチャーが、その還元された形態においてグルタチオンである。グルタチオンの酸化された形態であるグルタチオンジスルフィドもまた、グルタチオンジスルフィドが溶液中で、該溶液を赤血球組成物を含む混合物に添加する前に溶液中で充分還元されるか、または赤血球組成物を含む混合物に添加した後に充分に還元される限り使用され得る。
【００５１】
一部の実施形態では、クエンチャーは、グルタチオンの誘導体、例えば、グルタチオンモノアルキルエステルまたはジアルキルエステルなどであり、このとき、該アルキル基は、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖基である。該アルキル基の具体例としては、限定されないが、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基、１−メチルブチル基、ヘキシル基、イソヘキシル基、２−メチルペンチル基、１−エチルブチル基、ペプチル基、オクチル基、ノニル基、およびデシル基が挙げられる。例えば、グルタチオン誘導体の非限定的な例としては、グルタチオンメチルエステル、グルタチオンモノエチルエステル、およびグルタチオンモノイソプロピルエステルが挙げられる。一部の実施形態では、グルタチオン酸化ジエチルエステル（ＧＳＳＧ−（グリシル）−ジエチルエステル）が使用される。一部の実施形態では、グルタチオンのチオエステルを、赤血球組成物への添加後に加水分解してチオールを形成する。
【００５２】
一部の実施形態では、クエンチャーが遊離の酸または塩基の形態で提供されるのに対し、他の実施形態では、クエンチャーが塩の形態で提供されることを理解されたい。クエンチャーが塩の形態である場合、該塩は、好ましくは、薬学的に許容され得る塩である。化合物の薬学的に許容され得る塩（水溶性もしくは油溶性または分散性生成物の形態）としては、例えば、無機系または有機系の酸または塩基から形成される慣用的な非毒性の塩または第４級アンモニウム塩が挙げられる。かかる酸付加塩の例としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、ショウノウ酸塩、カンフルスルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバリン酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩、およびウンデカン酸塩が挙げられる。塩基塩としては、アンモニウム塩、アルカリ金属塩（ナトリウム塩およびカリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩およびマグネシウム塩など）、有機塩基との塩（ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミンなど）、ならびにアルギニン、リシンなどのアミノ酸との塩などが挙げられる。また、塩基性窒素含有基を、低級アルキルハロゲン化物、例えば、メチル、エチル、プロピル、およびブチルの塩化物、臭化物およびヨウ化物；ジアルキル硫酸塩（ジメチル、ジエチル、ジ（ｄｉｄ）ブチルなど）；ならびにジアミル硫酸塩、長鎖のハロゲン化物（例えば、デシル、ラウリル、ミリスチルおよびステアリルの塩化物、臭化物およびヨウ化物、アラルキルハロゲン化物（例えば、ベンジルおよびフェネチル臭化物）などの薬剤で第４級化してもよい。他の薬学的に許容され得る塩としては、硫酸塩エタノレート（ｅｔｈａｎｏｌａｔｅ）および硫酸塩が挙げられる。
【００５３】
例えば、一部の実施形態では、クエンチャーが、グルタチオンから形成された薬学的に許容され得る塩の形態である。一部の実施形態では、クエンチャーが、グルタチオンおよび１種類以上のカチオン（例えば、ナトリウム、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、亜鉛、またはテトラメチルアンモニウムなど）から形成された薬学的に許容され得る塩の形態である。一部の実施形態では、クエンチャーが、グルタチオン（還元型）であり、グルタチオン一ナトリウム塩（例えば、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ Ｆｏｓｃａｍａ（イタリア）から入手可能である）の形態で提供される。一部の他の実施形態では、グルタチオン（還元型）が、グルタチオン塩酸塩の形態で提供される。一部の他の実施形態では、グルタチオンが、グルタチオン（還元型）二ナトリウム塩の形態で提供される。さらなる実施形態では、グルタチオンモノアルキルエステル硫酸塩が使用される。一部の実施形態では、グルタチオンが、グルタチオン酸化二ナトリウム塩の形態で提供される。
【００５４】
一部の実施形態では、クエンチャーを、そのままの形態の赤血球組成物および／または病原体不活化化合物と混合する。一部の実施形態では、赤血球組成物および／または病原体不活化化合物と混合されたクエンチャーは、水溶液状である。一部の実施形態では、クエンチャーは、水溶液状の中和されたクエンチャーである。例えば、一部の実施形態では、クエンチャーは、少なくとも１当量（例えば、約１または２当量）の塩基が添加されている水溶液状の酸性化合物であり得る。
【００５５】
本発明のクエンチング方法は、赤血球組成物と、病原体不活化化合物およびクエンチャーとを、該組成物を病原体不活化化合物およびクエンチャーと混合すると、得られる組成物のｐＨが、充分な病原体の不活化を提供するのに適当な範囲内であり、赤血球の改変などの望ましくない副作用の低減が改善される条件下で組み合わせることを伴う。該改善された方法は、該クエンチング方法に重要であり得る３つの特徴を含む。第１の特徴は、チオール基または他の適当な求核性基である。第２は、溶液のｐＨの調整である。単に溶液のｐＨを適当に調整することにより、ある程度のレベルのクエンチングを提供することが可能である。したがって、本発明のクエンチャーは、赤血球含有組成物にある程度の緩衝能を提供し、この場合、緩衝能それ自体が、改善されたクエンチングを提供する。例えば、メチオニンなどのシステイン類似体をクエンチャーとして用いることは、赤血球組成物において適当なｐＨ変化がもたらされるように適切に改変した場合、赤血球への病原体不活化化合物の結合のある程度のレベルのクエンチングをもたらす。メチオニンのイオウ原子は求核性でないため、メチオニンは、必要な溶液のｐＨを提供する以外は、なんらクエンチングをもたらさない。したがって、ｐＨ調整とチオール基との組合せにより、本発明のクエンチング方法に対してさらなる改善が提供される。一部の実施形態における改善されたクエンチングを提供するのに重要であり得る第３の特徴は、ウイルスおよび細菌などの病原体内部に実質的に浸透しない好ましいクエンチャーである。かかるクエンチャーは、いったん病原体内部に浸透している病原体不活化化合物をさらにクエンチングすることなく、赤血球表面への結合などの有害な反応が起こる細胞外環境に充分なクエンチングを提供する。
【００５６】
赤血球組成物のｐＨを調整する特徴に関して、既存のかかる病原体不活化化合物のクエンチング方法では、得られる混合物のｐＨの該重要性を実現することができない。公知の方法において、より多くの量のクエンチャーが、充分な病原体の不活化を提供することが示されているが、これらの方法では、プロトン化されたグルタチオンなどのクエンチャーをより多くの量で使用した場合での赤血球の改変に対する効果が充分に報告されていない。本明細書の実施例で示されるように、酸性グルタチオンなどのクエンチャーをより多くの量で使用することは、赤血球改変のレベルを充分に低下させない。グルタチオンは酸性であるため、レベルが高くなると、赤血球組成物のｐＨが許容され得ない低レベルに至り、この場合、病原体不活化化合物の望ましくない副作用のクエンチングが無効になる。したがって、本発明の一態様は、病原体不活化化合物およびクエンチャーの添加時、赤血球組成物のｐＨが適当なレベルに維持されるのを確保することを伴う。一部の実施形態では、病原体不活化化合物およびクエンチャーを赤血球組成物と混合したとき、混合物のｐＨは、約６．８〜８．５、同様に約７．０〜８．５、同様に約７．２〜８．５または約７．２〜８．０の範囲である。赤血球組成物のｐＨは経時的に変化し得るが、クエンチャーを赤血球組成物に添加したとき、病原体不活化化合物が既に含有されているか否かに関わらず、ｐＨが所望の範囲内にあることが望ましい。本発明の方法は、病原体不活化化合物およびクエンチャーを赤血球組成物に添加することを伴う。該所望のｐＨ範囲は、病原体不活化化合物およびクエンチャーの両方の添加時に、赤血球組成物への病原体不活化化合物および／または（ａｎ／ｏｒ）クエンチャーの添加順とは無関係に必要である。換言すると、いったん３種類の成分すべてが混合されていると、ｐＨは該所望の範囲内にある。一部の実施形態では、クエンチャーが病原体不活化化合物の前に添加される。一部の実施形態では、病原体不活化化合物がクエンチャーの前に添加される。一部の実施形態では、クエンチャーと病原体不活化化合物が、本質的に同時に添加される。したがって、病原体不活化化合物およびクエンチャーの添加時は、クエンチャーと病原体不活化化合物の両方が赤血球組成物と混合された時点を意味する。所望のｐＨは、いくつかの手段によって達成され得、赤血球組成物のｐＨが調整されているときに関して限定されず、または一部の実施形態では、血液製剤の通常のｐＨから有意に調整されない。例えば、赤血球組成物の所望のｐＨは、ｐＨを調整することにより達成され得る。ｐＨ調整は、例えば、病原体不活化化合物およびクエンチャーを添加する前に、適当な添加剤溶液、例えば緩衝溶液を添加することによって行なわれ得る。一部の実施形態では、赤血球組成物を、１回以上、適当なバッファーで洗浄した後、同じまたは他の適当なバッファー中に懸濁してもよい。あるいはまた、赤血球組成物のｐＨは、病原体不活化化合物、クエンチャーのいずれか、または両方の添加と同時に調整され得る。一部の実施形態では、ｐＨを、クエンチャーの添加と同時に調整する。好ましい実施形態では、クエンチャーを中和し、中和されたクエンチャーの添加によって赤血球組成物に所望のｐＨ範囲がもたらされるようにする。一例として、必要なｐＨ調整を行なうために、グルタチオンの中和が使用され得る。グルタチオンはグルタミン酸を含むため、プロトン化された形態のｐＨは酸性である。持論に拘束されないが、推定されるプロトン化されたグルタチオンの中和を以下のスキームに示す。
【００５７】
【化２】

したがって、適切なレベルのグルタチオンの中和は、例えば、２当量の塩基の添加によって、赤血球組成物に添加すると必要な該組成物のｐＨ調整をもたらすクエンチャーを提供するために使用され得る。適切な中和は、使用するクエンチャーに依存する。例えば、ペプチドが使用される場合、該ペプチドのアミノ酸成分に依存する。一部の実施形態では、赤血球組成物のｐＨに有意に影響を与えないクエンチャーが使用され得る。例えば、システインを含有し、自然状態で（ｎａｔｕｒａｌｌｙ）単離されたペプチドの溶液に対してより中性のｐＨをもたらし得るアミノ酸をさらに１個以上含み得るペプチドの使用。一部の実施形態では、該ペプチドは、少なくとも１個の塩基性アミノ酸（例えば、アルギニンまたはリシンなど）をさらに含む。
【００５８】
塩基を赤血球組成物と、病原体不活化化合物およびクエンチャーとともに混合して、混合物のｐＨを所望のレベルまで増大および／または望ましくない副作用のクエンチングを改善する本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、塩基は塩基性の塩である。塩基性の塩は、赤血球組成物と混合する前に最初に水溶液中に溶解させてもよく、または固体形態の赤血球組成物に直接添加してもよい。一部の実施形態では、塩基性の塩がクエンチャーを含み、クエンチャーおよび該塩基の両方を混合物に提供する。一部の実施形態では、該方法において使用される塩基は、ＮａＯＨなどの強塩基である。典型的には、ＮａＯＨなどの強塩基は、赤血球組成物と混合する前に最初に水溶液中に溶解させる。一部の実施形態では、強塩基（溶液状または固体形態）を、クエンチャーを赤血球組成物と混合する前にクエンチャーと混合する。一部の実施形態では、塩基は塩基性バッファーである（充分な量で添加され、適切なｐＫａを有し、混合物が所望のｐＨ範囲に至る）。塩基性バッファーが使用される場合、バッファーは、一部の実施形態では、薬学的に許容され得るバッファーである。一部の実施形態では、バッファーは、滴定可能なプロトンを有し、ｐＫａが約７〜８の範囲である。塩基性バッファーとして使用され得るバッファーの例としては、限定されないが、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、およびリン酸ナトリウムバッファーが挙げられる。他の適当な塩基性バッファーは、当業者によって容易に特定され得よう。
【００５９】
本明細書に記載の方法および組成物の各々の一部の実施形態では、赤血球、クエンチャー、病原体不活化化合物および任意の添加塩基の混合物のｐＨは、約６．７より高いか、約７．０より高いか、または約７．２より高い。本明細書に記載の方法および組成物の各々の一部の実施形態では、赤血球、クエンチャー、病原体不活化化合物および塩基（もし、添加されていれば）の混合物のｐＨは、約６．８〜８．５、同様に約７．０〜８．５、同様に約７．２〜８．５または約７．２〜８．０の範囲である。一部の好ましい実施形態では、表示したｐＨは室温でのｐＨである。例えば、一部の実施形態では、赤血球を含む該組成物を病原体不活化化合物で、クエンチャーおよび任意の添加塩基の存在下で処理し、このとき、混合物のｐＨは、約７．２〜約８．０の範囲である。
【００６０】
一部の実施形態では、赤血球、クエンチャーおよび塩基（該方法の一部として塩基が添加される場合）の混合物のｐＨが、病原体不活化化合物と赤血球組成物との混合前で、約６．８〜８．５、約７．０〜８．５、約７．２〜８．５、または約７．２〜８．０の範囲である。一部の他の実施形態では、該ｐＨは、病原体不活化化合物と赤血球を含む該組成物との混合と同時、または約１時間以内、約３０分以内、約２０分以内、約１０分以内、約５分以内、または約２分以内に達成される。ｐＨを調整する方法の一部の実施形態では、ｐＨを、病原体不活化化合物と赤血球を含む該組成物との混合の前、混合と同時、混合の約１時間以内、約３０分以内、約２０分以内、約１０分以内、約５分以内、または約２分以内に、所望のｐＨ範囲に調整する。クエンチャーがグルタチオンであり、病原体不活化化合物がＰＩＣ−１である実施形態では、赤血球組成物およびクエンチャーを含む混合物のｐＨは、好ましくは、ＰＩＣ−１を赤血球組成物と混合する前に、所望のｐＨ範囲（例えば、ｐＨ７．２〜８．０）に調整される。
【００６１】
一部の実施形態では、最終組成物で得られるｐＨは、必ずしも、最初の赤血球組成物のｐＨが調整されたものではない。例えば、赤血球組成物が、６．８〜８．５の所望の範囲のｐＨを有し得、該組成物のｐＨは、クエンチャー、続く病原体不活化化合物の添加によって有意に変化しない。かかる実施形態では、クエンチャーは、自然状態で所望のｐＨを提供するか、または所望のｐＨが提供されるようにしかるべく中和されるかのいずれかである。重要なのは、約５ｍＭ〜約４０ｍＭなどの高量のクエンチャーを添加することと、所望の範囲のｐＨがもたらされることとの組合せである。例えばグルタチオンをかかる濃度で用いる公知の方法は、本発明の所望のｐＨ範囲では使用されていない。したがって、ペプチドでは、どのペプチドクエンチャーであるかにかかわらず、赤血球組成物に添加されると必要に応じて適当なｐＨ範囲をもたらすように効果的に中和され得、さらに、所望のｐＨ範囲で適当な量の緩衝がもたらされるように選択され得る。したがって、中和されたクエンチャーとは、クエンチャーが、赤血球組成物に添加されると、得られる混合物が、より良好な望ましくない副作用のクエンチングを提供するｐＨ、例えば、約６．８〜８．５、同様に約７．０〜８．５、同様に約７．２〜８．５、または約７．２〜８．０の範囲ｐＨを有するように、必要に応じて酸または塩基により適当に滴定されていることを意味する。一部の実施形態では、自然状態で単離されたペプチドが適当に中和される、すなわち、最終混合物に所望のｐＨをもたらすための酸または塩基の添加を必要としない。さらに、好ましいクエンチャーは、ｐＨを所望の範囲内に、望ましくない副作用をクエンチングするのに必要な時間、維持するための緩衝能を提供する。
【００６２】
本明細書に記載の方法および組成物の各々の一部の実施形態では、クエンチャーが中和されている。クエンチャーは、充分な量の塩基がクエンチャーと合わされており、その結果、病原体不活化化合物と赤血球間の望ましくない副作用のクエンチングが、赤血球を含む該組成物、病原体不活化化合物およびクエンチャーを含む混合物において改善される場合、塩基によって「中和されている」という。「中和されたクエンチャー」は、必ずしも中性ｐＨを有するとは限らない。一部の実施形態では、クエンチャーの酸性が高い場合であっても、中和されたクエンチャーのｐＨは、７．０未満となり得る。一部の実施形態では、中和されたクエンチャーの溶液のｐＨは、７．０より高い場合もあり得る。一部の実施形態では、中和されたクエンチャーの溶液のｐＨは、塩基の添加前のクエンチャーのものより検出可能に高い。一部の実施形態では、クエンチャーを、少なくとも約０．２５当量、少なくとも約０．５当量、少なくとも約０．７５当量、少なくとも約１当量、または少なくとも約２当量の塩基で中和する。一部の実施形態では、クエンチャーを約１〜約２当量の塩基で中和する。一部の実施形態では、クエンチャーを約１当量の塩基で中和する。他の実施形態では、クエンチャーを約２当量の塩基で中和する。例えば、本発明の一部の実施形態では、グルタチオンを、約２当量の適当な塩基（例えば、水酸化ナトリウムなど）で中和する。この場合、プロトン化されたグルタチオンの溶液は、およそ３のｐＨを有するが、２当量の水酸化ナトリウムで中和された溶液は、およそ９．５のｐＨを有する。少なくとも１個のシステインを含む任意の適切なペプチドクエンチャーが、赤血球組成物に添加されると所望のｐＨがもたらされるように、適当に調整され得る。適当にｐＨ調整または中和されたクエンチャーを提供することに加え、一部の実施形態では、好ましいクエンチャーは、病原体内に有意に侵入し得ず、その結果、細胞外環境において望ましくない反応を最適にクエンチングするが、いったん病原体不活化化合物が病原体内部に浸透すると、病原体の不活化を妨げない。
【００６３】
本明細書に記載の方法の各々の一部の実施形態では、クエンチャーが酸性化合物である。一部の実施形態では、クエンチャーが遊離の酸の形態で提供される。一部の実施形態では、クエンチャーが酸性であり、クエンチャーを中和するのに少なくとも約１当量の塩基が添加される。かかる中和されたクエンチャーを含む溶液は、場合によっては、塩基性、中性またはさらに高い酸性であり得る。一部の実施形態では、クエンチャーを中和するのに、約１当量の塩基が添加される。一部の実施形態では、約２当量の塩基が添加される。一部の実施形態では、クエンチャーが酸性であり、クエンチャーを中和するのに、約１〜約２当量の塩基が使用される。一部の実施形態では、約１または約２当量の塩基が使用される。
【００６４】
一部の実施形態では、クエンチャーを、赤血球組成物および／または病原体不活化化合物への添加前に中和する。他の実施形態では、クエンチャーを、クエンチャーを、赤血球組成物および／または病原体不活化化合物のいずれかと合わせた後に中和する。
【００６５】
一部の実施形態では、クエンチャーがグルタチオンであり、グルタチオン一ナトリウム塩の形態で提供され、約１当量の塩基で中和する。一部の他の実施形態では、クエンチャーがグルタチオンであり、グルタチオン塩酸塩の形態で提供され、約２当量の塩基で中和する。
【００６６】
一部の実施形態では、赤血球組成物、クエンチャー、病原体不活化化合物および任意の添加塩基を含む混合物中のクエンチャーの濃度が、２ｍＭより高いか、約４ｍＭより高いか、または約１０ｍＭより高い。一部の実施形態では、混合物中のクエンチャー濃度が、約２ｍＭ〜１００ｍＭ、約２ｍＭ〜４０ｍＭ、約４ｍＭ〜４０ｍＭ、約５ｍＭ〜４０ｍＭ、約５ｍＭ〜３０ｍＭ、または約１０ｍＭ〜３０ｍＭの範囲である。一部の実施形態では、混合物中のクエンチャー濃度が約２０ｍＭである。本明細書に記載の方法および組成物の各々の一部の実施形態では、混合物中のクエンチャーの濃度が２ｍＭより高いか、約４ｍＭより高いか、または約１０ｍＭより高く、赤血球、クエンチャーおよび病原体不活化化合物の濃度の混合物のｐＨが、約６．７より高いか、約７．０より高いか、または 約７．２より高い。本明細書に記載の方法および組成物の各々の一部の実施形態では、一部の実施形態では、混合物中のクエンチャーの濃度が、約２ｍＭ〜４０ｍＭ、約４ｍＭ〜４０ｍＭ、約５ｍＭ〜４０ｍＭ、約５ｍＭ〜３０ｍＭ、または約１０ｍＭ〜３０ｍＭの範囲であり、赤血球、クエンチャーおよび病原体不活化化合物の混合物のｐＨは、約６．８〜８．５、同様に約７．０〜８．５、同様に約７．２〜８．５または約７．２〜８．０の範囲である。本明細書に記載の方法および組成物の各々の一部の実施形態では、混合物中のクエンチャーの濃度が、２ｍＭより高いか、約４ｍＭより高いか、または約１０ｍＭより高く、赤血球、クエンチャーおよび病原体不活化化合物混合物のｐＨが、約６．８〜８．５、同様に約７．０〜８．５、同様に約７．２〜８．５または約７．２〜８．０の範囲である。一部の実施形態では、混合物中のクエンチャー（例えば、グルタチオン）の濃度が、約４ｍＭ〜約４０ｍＭの範囲であり、混合物のｐＨが、約７．２〜８．０の範囲である。一部の実施形態では、混合物中のクエンチャーの濃度が約１０ｍＭ〜約３０ｍＭの範囲であり、混合物のｐＨが、約６．８〜８．５の範囲である。
【００６７】
好ましい実施形態では、クエンチャーが中和グルタチオンである。グルタチオンは、自身をクエンチャーとして特に有用なものとする多くの性質を有する。グルタチオンは、通常、あらゆる細胞型に存在する。細菌および脂質エンベロープを有するウイルスの細胞膜または脂質外被（ｃｏａｔ）を通過すること、またはエンベロープを有しないウイルスのウイルスキャプシドを通過することなどにより、病原体内に受動的に浸透することができるとは考えられない。ｐＨ７では、グルタチオンは電荷を有し、能動輸送の非存在下では、有意な程度まで脂質二重層に浸透しない。これは、グルタチオン（中和グルタチオンの２ｍＭより高い濃度での使用を含む）によって実質的に影響を受けない脂質エンベロープを有するウイルス（例えば、ＨＩＶおよびＶＳＶ）の不活化と一致する。グルタチオンの使用は、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓおよびＳｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓの不活化に対していくらかの効果を有する。しかしながら、これは、有効量の中和グルタチオンおよび病原体不活化化合物を用いることにより対処され得る。したがって、ウイルス系または細菌系病原体による赤血球組成物の汚染が少なくとも２ｌｏｇ、好ましくは少なくとも３ｌｏｇ不活化される好ましいクエンチング方法が提供される。一部の実施形態では、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓが、少なくとも３ｌｏｇ、同様に約４ｌｏｇ、または約５ｌｏｇまで不活化され得、ＶＳＶが、少なくとも４ｌｏｇ、同様に約５ｌｏｇ、または約６ｌｏｇまで不活化され得る。さらに、不活化は、２ｍＭの酸性グルタチオンおよび０．２ｍＭのＰＩＣ−１による赤血球組成物の標準的な処理のものの約３ｌｏｇ、同様に約２ｌｏｇ、好ましくは約１ｌｏｇ以内である。一部の実施形態では、ＰＩＣ−１によるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの不活化は、２ｍＭの酸性グルタチオンおよび０．２ｍＭのＰＩＣ−１で不活化された同様の組成物のものの約３ｌｏｇ、同様に約２ｌｏｇ、または約１ｌｏｇ以内である。一部の実施形態では、ＰＩＣ−１によるＶＳＶの不活化は、２ｍＭの酸性グルタチオンおよび０．２ｍＭのＰＩＣ−１で不活化された同様の組成物のものの約２ｌｏｇもしくは約１ｌｏｇ以内であるか、または本質的に同等である。グルタチオンはまた、赤血球のインビトロ保存に適合性であり、その後の赤血球組成物はインビボ導入に適当である。
【００６８】
グルタチオンおよび他のクエンチャーを中和するのに適切な方法は、当業者には容易にわかる。一部の実施形態では、水酸化ナトリウムを用いてクエンチャーを中和する。一部の実施形態では、固形ペレットのＮａＯＨをまず水に溶解し、濃縮塩基溶液、例えば、１Ｎ、５Ｎ、１０Ｎまたは２０ＮのＮａＯＨ溶液を作製する。一部の実施形態では、次いで、適当な量の該ＮａＯＨ溶液をクエンチャーに、混合物へのクエンチャーの添加前、添加と同時または添加後のいずれかで添加する。あるいはまた、このＮａＯＨを、混合物へのクエンチャーの添加前に、赤血球組成物もしくは病原体不活化化合物または両者を合わせたものに添加する。
【００６９】
本明細書に記載の方法において使用されるクエンチャーおよび／または添加塩基（すなわち中和されたクエンチャー）は赤血球組成物と、赤血球組成物への病原体不活化化合物の添加前、添加と同時または添加後に混合され得る。クエンチャーおよび塩基（すなわち中和されたクエンチャー）を赤血球組成物と、病原体不活化溶液を赤血球組成物と混合した後に混合する場合、クエンチャーおよび／または塩基（すなわち中和されたクエンチャー）は、好ましくは、病原体不活化化合物と赤血球との有意な量の副作用が起こる前に赤血球組成物に添加され、その結果、充分な望ましくない副作用のクエンチングが達成され得る。一部の実施形態では、クエンチャーおよび／または塩基（すなわち中和されたクエンチャー）を赤血球組成物と、病原体不活化化合物を赤血球組成物と混合した後、約１時間以内、約３０分以内、約２０分以内、約１０（ｍｉｎｔｕｅ）以内、約５分以内、約２分以内または約１分以内に混合する。一部の実施形態では、クエンチャーおよび／または塩基（すなわち中和されたクエンチャー）を赤血球組成物と、病原体不活化化合物と赤血球組成物との混合前に混合する。例えば、中和グルタチオンおよびＰＩＣ−１が該方法において使用される一部の実施形態では、中和グルタチオンを赤血球と、ＰＩＣ−１を赤血球組成物と混合する前、混合と同時または混合後約１０分以内に混合する。
【００７０】
一部の実施形態では、クエンチャーおよび／または塩基（すなわち中和されたクエンチャー）を赤血球組成物と、病原体不活化化合物と赤血球組成物との混合前に混合する。
【００７１】
本明細書に記載の方法の各々の一部の実施形態では、クエンチャーおよび添加塩基（すなわち中和されたクエンチャー）を赤血球組成物とともに、病原体不活化化合物の添加前に適当な時間枠、例えば、約３０分〜４８時間、同様に約２〜２４時間、同様に約８〜２４時間インキュベートする。一部のさらなる実施形態では、インキュベーションは、約１℃〜３０℃、同様に約１８℃〜２５℃の温度範囲、またはほぼ室温である。
【００７２】
本明細書に記載の方法の各々の一部の実施形態では、病原体不活化化合物を赤血球組成物とともに、クエンチャーおよび添加塩基（すなわち中和されたクエンチャー）の存在下で適当な時間枠、例えば、約３０分〜４８時間、同様に約２〜２４時間、同様に約８〜２４時間インキュベートする。一部のさらなる実施形態では、インキュベーションは、約１℃〜３０℃、同様に約１８℃〜２５℃の温度範囲、またはほぼ室温である。
【００７３】
上記のように不活化ｌｏｇを比較することに加え、改善されたクエンチング方法の有効性は、いくつかの他の方法によって評価され得る。クエンチング方法は、赤血球の機能の観点、および該処理済み赤血球と免疫系（例えば、抗体など）との反応性の観点の両方において、赤血球組成物の改変を評価することにより評価され得る。該処理済み赤血球組成物が、輸液などのヒトへの使用を目的とする場合、クエンチング方法は、赤血球機能を実質的に損傷しないものでなければならない。赤血球機能に対する損傷性の影響が実質的にないことは、当該技術分野で知られた赤血球機能試験方法によって測定され得る。例えば、細胞内ＡＴＰ（アデノシン５’−三リン酸塩）、細胞内２，３−ＤＰＧ（２，３−ジホスホグリセロール）または細胞外カリウムなどのインジケーターのレベルを測定し、未処理対照と比較し得る。さらに、溶血、細胞内および細胞外のｐＨ、ヘマトクリット、ヘモグロビン、浸透圧ぜい弱性、グルコース消費および乳酸塩生成が測定され得る。改善された本発明の方法を、２ｍＭの酸性グルタチオンを０．２ｍＭのＰＩＣ−１と組み合わせた標準的な条件や、米国特許第６，７０９，８１０号に記載のようなグルタチオン増加を伴う条件（この場合、該公知法では、酸性グルタチオンが使用される）と比較してもよい。本発明においてグルタチオン濃度を増加させると、一部の病原体の不活化レベルの若干の低下がもたらされ得るが、依然として充分なレベルの不活化が得られ、赤血球の機能を充分維持したまま赤血球改変の低減が改善されることにより、全体としてより良好な生成物がもたらされる。
【００７４】
ＡＴＰ、２，３−ＤＰＧ、グルコース、ヘモグロビン、溶血およびカリウムを測定するための方法は、当該技術分野において利用可能なものである。例えば、Ｄａｖｅｙら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，３２：５２５−５２８（１９９２）（その開示は、本明細書に組み込まれる）を参照のこと。また、赤血球機能の測定方法は、Ｇｒｅｅｎｗａｌｔら、Ｖｏｘ Ｓａｎｇ，５８：９４−９９（１９９０）；Ｈｏｇｍａｎら、Ｖｏｘ Ｓａｎｇ，６５：２７１−２７８（１９９３）；およびＢｅｕｔｌｅｒら、Ｂｌｏｏｄ，第５９巻（１９８２）（その開示は、引用により本明細書に組み込まれる）に記載されている。例えば、細胞内ＡＴＰおよび細胞内２，３−ＤＰＧは、Ｓｉｇｍａ ＡＴＰキットまたは２，３−ＤＰＧキット（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）を用いて測定される。該ＡＴＰキットは、Ｓｉｇｍａ手順番号３６６−ＵＶ（その開示は、引用により本明細書に組み込まれる）に従って使用される。細胞外カリウムレベルは、Ｃｉｂａ Ｃｏｒｎｉｎｇ
Ｍｏｄｅｌ ６１４ Ｋ^＋／Ｎａ^＋ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｃｉｂａ Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．，Ｍｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いて測定され得る。細胞外ｐＨは、細胞を４℃で１５分間１２，０００×ｇにて遠心分離し、上清みを取り出し、そのｐＨを、室温で標準的なｐＨメーター（例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ，Ｅｐｏｘｙ Ｃａｌｏｍｅｌ電極）を用いて測定することにより測定される。細胞内ｐＨは、残留ペレットを遠心チューブ内に封入し、約−８０℃で少なくとも２時間保存する。次いで、これを脱イオン水の添加によって溶解する。溶解された試料を充分混合し、溶液のｐＨを、室温で標準的なｐＨメーターを用いるか、または室温でＣｉｂａ Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｍｏｄｅｌ ２３８ Ｂｌｏｏｄ Ｇａｓ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｃｉｂａ Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．，Ｍｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いるかのいずれかにより測定する。測定は、処理の直後、処理後保存（例えば、４２日間までの保存）の関数として行なわれ得る。本発明の方法は、該処理済み赤血球の溶血が、２８日間の保存後３％未満、より好ましくは４２日間の保存後２％未満、および最も好ましくは、４℃で４２日間の保存後に約１％以下である赤血球組成物を提供する。好ましい方法は、細胞内ＡＴＰレベルが、２ｍＭの酸性グルタチオンおよび０．２ｍＭのＰＩＣ−１の標準的な条件で処理された同様の組成物のものより高い赤血球組成物を提供する。一部の実施形態では、本発明のクエンチング方法は、２ｍＭの酸性グルタチオンおよび０．２ｍＭのＰＩＣ−１で処理した組成物より約２０％、また３０％、また４０％または約５０％高いＡＴＰレベルを提供し、この高レベルのＡＴＰは、７、１４、２１、２８、３５または４２日間の保存後、維持されている。
【００７５】
本発明の方法での赤血球改変の低減は、いくつかのアッセイによって評価され得る。アッセイの一例では、アクリジンと反応性であるウサギポリクローナル血清を、ＫＬＨにコンジュゲートさせたアクリジン化合物をＮｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｗｈｉｔｅウサギに注射することによってを生成させる。アクリジン化合物Ｓ−１９７を使用し、これは以下の構造：
【００７６】
【化３】

を有する。これをＫＬＨに、１０μＬの該化合物（脱イオン水中１０ｍＭ）を９９０μＬのＫＬＨの緩衝溶液（５０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ＰＢＳ（ｐＨ＝７．２）中１０ｍｇ／ｍＬ、特許品（ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ）安定化剤、Ｐｉｅｒｃｅカタログ番号７７６００を含有する）に添加し、室温で２０時間にわたってインキュベートすることによりコンジュゲートさせる。このインキュベーション後、コンジュゲートされたＫＬＨを未反応Ｓ−１９７およびＳ−１９７副生成物から、脱塩カラム（例えば、Ｄ−塩カラム、Ｐｉｅｒｃｅ）に通し、ＰＢＳバッファー中で溶出することにより単離する。次いで、着色した溶液画分を合わせ、ＫＬＨコンジュゲートを、２１０と４１０ｎｍでの吸光度の比によってキャラクタライズする。アクリジン−ＫＬＨコンジュゲート溶液を完全フロイントアジュバントと混合し、ウサギの多数の部位に筋肉内注射し、このウサギを免疫処置する。得られたウサギ血清は、アクリジン構造と反応性である高力価のポリクローナル抗体を有する。ウサギ血清を、例えば、ＰＩＣ−１およびグルタチオンで処理している赤血球組成物とともにインキュベートしてもよい。非結合ウサギ抗体を洗浄除去し、溶液をヤギ抗ウサギ抗体と反応させる。得られた溶液を凝集について、Ｂｕｆｆｅｒ Ｇｅｌ
Ｃａｒｄ（Ｍｉｃｒｏ Ｔｙｐｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｐｏｍｐａｎｏ Ｂｅａｃｈ，Ｆｌｏｒｉｄａ）に通すことによりアッセイし得る。ゲルカードは、非凝集赤血球の通過は許容するが、ウサギ血清との反応および抗ウサギ抗体との交差反応によって凝集した細胞はゲル上部に残留するように設計されている。該カードを０、１＋、２＋、３＋、または４＋としてスコア付けし、ここで、０は、すべての細胞がインタクトであり、ゲル下部にあることを示し、一方、４＋は、完全に凝集し、すべての細胞がゲル上部にあることを示す。本発明のクエンチング方法は、１：１００希釈度のウサギ血清を用いてアッセイした場合、１＋以下、好ましくは０のスコアをもたらすが、２ｍＭの酸性グルタチオンおよび０．２ｍＭのＰＩＣ−１で処理した同様の組成物は、２＋以上のスコアをもたらす。
【００７７】
さらに、本発明のクエンチング方法は、好ましいクエンチング方法と同じクエンチャー濃度の酸性グルタチオンおよび同じ濃度の病原体不活化化合物で処理した同様の組成物と比べた場合、より低いスコアをもたらす。例えば、１０ｍＭの中和グルタチオンおよび０．２ｍＭのＰＩＣ−１で処理した赤血球組成物は、１０ｍＭの酸性グルタチオンおよび０．２ｍＭのＰＩＣ−１で処理した赤血球組成物より低いスコア、好ましくは１＋または０のスコアをもたらす。
【００７８】
別のアッセイでは、ウサギポリクローナル血清を処理済み赤血球と反応させ得る。非結合抗体を洗浄除去した後、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ウサギＦａｂ’_２断片（抗Ｈ＋Ｌ鎖、Ｃａｌｔａｇ）を添加する。赤血球へのＦＩＴＣ標識の結合は、赤血球表面に結合したアクリジンの量と相関し、ＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）解析（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ＮＪ）によって評価する。赤血球の相対的な改変は、ＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）平均蛍光値で測定される。本発明のクエンチング方法は、２ｍＭの酸性グルタチオンおよび０．２ｍＭのＰＩＣ−１を用いる処理と比べた場合、少なくとも５０％、同様に少なくとも７５％、または少なくとも９０％の平均蛍光の低減をもたらす。さらに、本発明のクエンチング方法は、好ましいクエンチング方法と同じクエンチャー濃度の酸性グルタチオンおよび同じ濃度の病原体不活化化合物で処理した同様の組成物と比べた場合、より低いレベルの平均蛍光をもたらす。例えば、１０ｍＭの中和グルタチオンおよび０．２ｍＭのＰＩＣ−１で処理した赤血球組成物は、１０ｍＭの酸性グルタチオンおよび０．２ｍＭのＰＩＣ−１で処理した赤血球組成物より低いレベルの平均蛍光をもたらす。本発明のクエンチング方法は、酸性グルタチオンでのかかる同様の処理と比べた場合、該酸性グルタチオン処理と比べ、少なくとも１０％、同様に少なくとも２５％、同様に少なくとも５０％、同様に少なくとも７５％、または少なくとも９０％の平均蛍光の低減をもたらす。
【００７９】
最後に、２ｍＭのグルタチオンおよび０．２ｍＭのＰＩＣ−１で処理されている赤血球を輸液され、抗ＰＩＣ−１抗体を発現したと思われる患者由来の血清試料を用いて、本発明の処理済み赤血球組成物との交差反応性が評価され得る。このアッセイは、ウサギポリクローナル血清を用いるＧｅｌ Ｃａｒｄアッセイと同様のものである。このアッセイでは、ゲルが、ウサギ抗ヒトＩｇＧを含有し、その結果、患者の血清と反応性の赤血球はゲル上部で凝集する。カードを上記のとおりにスコア付けする。本発明のクエンチング方法は、このアッセイでは１＋以下、好ましくは０のスコアをもたらすが、２ｍＭの酸性グルタチオンおよび０．２ｍＭのＰＩＣ−１で処理した同様の組成物は、２＋以上のスコアをもたらす。さらに、本発明のクエンチング方法は、好ましいクエンチング方法と同じクエンチャー濃度の酸性グルタチオンおよび同じ濃度の病原体不活化化合物で処理した同様の組成物と比べた場合、より低いスコアをもたらす。例えば、１０ｍＭの中和グルタチオンおよび０．２ｍＭのＰＩＣ−１で処理した赤血球組成物は、１０ｍＭの酸性グルタチオンおよび０．２ｍＭのＰＩＣ−１で処理した赤血球組成物より低いスコア、好ましくは１＋または０のスコアをもたらす。
【００８０】
また、本発明のクエンチング方法を、試料中の核酸改変のレベルを測定することにより既存の方法と比較してもよい。典型的には、赤血球組成物は白血球を含有するものであり得、白血球由来の核酸を単離してもよい。該化合物と核酸との反応時に核酸に結合したままである放射性同位体を有する病原体不活化化合物。これは、種々のクエンチング方法で、核酸と反応した化合物の量を評価するために使用され得、予測される白血球不活化と直接相関し得る指標を提供する。１，０００核酸塩基対あたりに形成された付加物の数が、病原体の不活化に対する種々の方法の予測される影響を評価するためのモデルとして使用され得る。あるいはまた、適当な量の病原体を赤血球組成物に添加してもよく、処理後に病原体の核酸を単離してもよい。しかしながら、この場合、任意の残留白血球のレベルが病原体の核酸の測定を妨げないように、試料を白血球低減処理する必要がある。
【００８１】
望ましくない副作用のレベルを低下させるとともに充分な病原体の不活化を提供することに加え、本発明のクエンチング方法また、少なくとも一部の実施形態において、病原体の不活化後の反応性求電子性種の濃度の低下を提供する。赤血球組成物が輸液を目的とするものである場合、反応性求電子性種のレベルは、できる限り低いこと、好ましくは、本質的にもはや検出され得ないことが重要である。反応性求電子性種の存在は、当該技術分野において利用可能な方法、例えば、クロマトグラフィー法（液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）を含む）などを用いて測定され得る。また、試料の残留活性を、例えば、Ｍａｔｔｉｅｓによって記載された一般的なアルキル化剤アッセイ（Ｍａｔｔｉｅｓ，ＷＲ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９２ Ｏｃｔ；２０６（ｌ）：１６１−７）などを用い、核酸のグアニン残基と反応するその能力を評価することにより評価してもよい。このアッセイでは、ＲＢＣは、病原体不活化化合物およびクエンチャーとの適当なインキュベーション時間後に抽出する。任意の残留病原体不活化化合物、ならびにクエンチャーおよび他の低分子種は、該タンパク質から分離する。次いで、これらの種を、８−^３Ｈグアニン残基を用いて合成したｄｓ ＤＮＡとともにインキュベートする。残留病原体不活化化合物はｄｓ ＤＮＡとＮ７位のグアニンにて反応し、８−Ｈ残基（ｒｅｓｉｄｅ）が酸性化されて^３Ｈを溶液中に放出し、これを単離し測定してもよい。放出されたトリチウムの量は定量され得、抽出された被験試料中に存在する残留アルキル化剤の量と１：１相関を有する。このような方法によって測定される求電子性種のレベルを、本発明の改善された方法を用いて評価し、公知の方法と比較してもよい。
【００８２】
本明細書に記載の方法の各々の一部の実施形態では、該方法は、病原体不活化化合物または病原体不活化化合物の分解生成物からなる群より選択される化合物の混合物中での濃度を低下させる工程をさらに含む。一部の実施形態では、該方法が、混合物中の病原体不活化化合物の濃度を低下させる工程を含む。一部の実施形態では、該方法が、混合物中の求電子性種の濃度を低下させる工程を含む。一部の実施形態では、該方法が、混合物中のクエンチャーの濃度を低下させる工程を含む。生物学的材料（例えば、血液製剤）中の病原体不活化化合物および／またはクエンチャー（および関連生成物）中の濃度は、処理後、例えば、バッチ式または流動除去プロセスにおける吸着によって低減され得る。使用され得る方法およびデバイスは、米国特許第６，５４４，７２７号および同第６，３３１，３８７号ならびに米国特許公開公報第２００２／０１９２６３２号、同第２００５／０１４２５４２号、同第２００４／０１８５５４４号、および同第２００１／０００９７５６号（その各々の開示は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。したがって、一部の実施形態では、病原体不活化化合物の濃度は、混合物を、病原体不活化化合物に対する親和性を有する吸着剤粒子を含む吸着媒体と接触させることにより低減される。一部の実施形態では、吸着系は、バッチ式プロセスで病原体不活化化合物が除去されるように構成されたものであり得る。一部の実施形態では、混合物中の病原体不活化化合物の濃度は、赤血球を洗浄することにより低減される。
【００８３】
本発明の方法は、赤血球組成物中に存在し得る病原体汚染物質の充分な不活化をもたらし、公知の方法と比べ、クエンチングは改善されている。好ましい方法では、上記のように、病原体不活化化合物は、核酸標的化部分および反応性求電子性基を含み、クエンチャーはシステインを含み、ここで、クエンチャーは、赤血球組成物に添加されたとき、適当なｐＨを提供するものである。一部の実施形態では、クエンチャーが酸性であり、１〜２当量の適当な塩基、例えば水酸化ナトリウムなどで中和する。好ましい実施形態では、クエンチャーが、２当量の塩基で中和したグルタチオンである。好ましい実施形態では、病原体不活化化合物が、エステル結合を介してマスタード基に連結されたアクリジン基を含む。好ましい実施形態では、病原体不活化化合物が、β−アラニン、Ｎ−（アクリジン−９−イル）、２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルおよびその塩であり、クエンチャーが２当量の塩基で中和したグルタチオンである。クエンチャーは赤血球組成物に、病原体不活化化合物の前、後または該化合物と同時に添加され得る。一部の実施形態では、クエンチャーが、病原体不活化化合物の約３０分前から病原体不活化化合物の約１０分後までの時間範囲内で添加される。一部の実施形態では、クエンチャーおよび病原体不活化化合物は、本質的に同時であるが、別々に添加され得る。例えば、病原体不活化化合物がβ−アラニン、Ｎ−（アクリジン−９−イル）、２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルであり、クエンチャーが、中和グルタチオンである好ましい実施形態では、これらは、赤血球組成物に一緒に添加するための溶液に容易に配合され得ない。充分なクエンチングに必要とされるグルタチオンが高濃度であるため、病原体不活化化合物は、これらが同じ溶液中に高濃度で存在する場合、沈殿する。いったん赤血球組成物に添加したら、両者が完全に可溶性となるように、これらを充分に希釈および緩衝化する。
【００８４】
本発明の好ましい実施形態では、赤血球組成物をβ−アラニン、Ｎ−（アクリジン−９−イル）、２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステル、および２当量の塩基で中和したグルタチオンと混合する。さらなる実施形態では、中和グルタチオンを赤血球組成物と混合し、続いて、β−アラニン、Ｎ−（アクリジン−９−イル）、２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルをグルタチオンの約３０分以内、好ましくは約１０分以内に添加する。別の実施形態では、β−アラニン、Ｎ−（アクリジン−９−イル）、２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルおよび中和グルタチオンを赤血球組成物と、本質的に同時に、または互いに約１分以内に混合する。別の実施形態では、β−アラニン、Ｎ−（アクリジン−９−イル）、２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルをまず赤血球組成物に添加し、中和グルタチオンを、約３０分以内、また約１０分以内、また約５分以内、また約１分以内に添加する。一部の実施形態では、３種類すべての成分の混合時、例えば、混合の約１〜５分以内に、グルタチオンは、約５ｍＭ〜３０ｍＭ、好ましくは約１０ｍＭ〜３０ｍＭ、好ましくは約２０ｍＭの範囲の濃度になり、β−アラニン、Ｎ−（アクリジン−９−イル）、２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルは、約０．０５ｍＭ〜０．５ｍＭ、好ましくは約０．１ｍＭ〜０．３ｍＭ、好ましくは約０．２ｍＭの範囲の濃度になり、混合物のｐＨは、約７．２〜８．０の範囲になる。
【００８５】
本発明はまた、本明細書に記載された処理方法の各々から得られる赤血球組成物を提供する。
【００８６】
本明細書に記載の方法および組成物の各々の一部の実施形態では、赤血球組成物中の赤血球が、哺乳動物の血球である。例えば、赤血球は、齧歯類（例えば、マウスもしくはラットもしくはウサギ）、類人猿（例えば、チンパンジー）、またはヒトの赤血球であり得る。例えば、一部の実施形態では、赤血球がヒトのものである。一部の実施形態では、赤血球が白血球低減処理されているものである。一部の他の実施形態では、赤血球が白血球低減処理されていないものである。一部の実施形態では、赤血球含有組成物が病原体に汚染されたものである可能性がある。一部の実施形態では、赤血球組成物が病原体に汚染されたものである。
【００８７】
改善されたクエンチング方法に加え、本発明は、赤血球組成物の加工処理のための使い捨てキットを提供し、ここで、該加工処理は手作業または自動で行なわれ得る。一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の方法の各々で使用される、病原体不活化化合物、クエンチャーおよび／または塩基を含むキットを提供する。
【００８８】
一部の実施形態では、キットは、β−アラニン、Ｎ−（アクリジン−９−イル）、２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステル（任意のその塩を含む）および中和グルタチオン（任意のその塩を含む）を含む。β−アラニン、Ｎ−（アクリジン−９−イル）、２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルは、固体形態または溶液状であり得る。同様に、中和グルタチオンも固体形態または溶液状であり得る。このような固体または溶液は、許容され得る賦形剤、アジュバント、希釈剤または安定化剤をさらに含み得る。一部の実施形態では、β−アラニン、Ｎ−（アクリジン−９−イル）、２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルが塩酸塩であり、中和グルタチオンが、約２当量の水酸化ナトリウムで中和されている。一部の実施形態では、β−アラニン、Ｎ−（アクリジン−９−イル）、２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルおよび中和グルタチオンが固体形態であり、キットが、β−アラニン、Ｎ−（アクリジン−９−イル）、２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルを溶解するための適当な溶液、および中和グルタチオンを溶解するための適当な溶液をさらに含むものである。一部の実施形態では、本発明は、病原体不活化化合物、クエンチャー、およびクエンチャーを溶解するための溶液を含むキットを提供し、ここで、該溶液はクエンチャーを中和するものである。本明細書において論考された方法およびキットは、病原体不活化化合物およびクエンチャー（これらは、混合物として、または別々に製剤化され得る）の任意の適当な医薬用製剤を包含する。薬学的に許容され得る製剤は当業者に知られており、適当な賦形剤、アジュバント、希釈剤または安定化剤の例は、例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，第２０版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓを見るとよい。本発明はまた、上記の方法で得られる組成物であって、上記の赤血球、病原体不活化化合物およびクエンチャーを含む組成物を包含し、ここで、該組成物は、病原体不活化化合物の改善されたクエンチングが行なわれるのに適当なｐＨ範囲内にある。
【００８９】
別の態様では、本発明は、例えば、病原体を不活化するために赤血球組成物を処理するのに有用なキットであって、核酸結合リガンドと、求電子性基であるか、または該基を構成する官能基を含む病原体不活化化合物（任意のその塩を含む）、チオール基を含むクエンチャー（任意のその塩を含む）、および少なくとも約１当量（ここで、当量は、キット内のクエンチャーのモル量に相当するモル量を意味する）の塩基を含むキットを提供する。一部の実施形態では、キットは、約１当量または約２当量の適当な塩基を含む。
【００９０】
さらに別の態様では、本発明は、病原体を不活化するために赤血球組成物を処理するためのキットであって、核酸結合リガンドと、求電子性基であるか、または該基を構成する官能基（例えば、ＰＩＣ−１）（任意のその塩を含む）、および中和されたチオール基を含むクエンチャー（例えば、中和グルタチオン）（任意のその塩を含む）を含むキットを提供する。
【００９１】
本発明を、以下の非限定的な実施例によってさらに説明する。これら実施例において、細菌およびウイルスはすべて、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＡＴＣＣ），Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから入手したもの、または臨床分離株である。
【実施例】
【００９２】
実施例１
標準的な条件とのＳｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓおよびＹｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａの不活化の比較
細菌Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓを、マスタープレート由来の単一のコロニーを３７℃で５００ｍＬのＬＢ培地に添加することにより一晩成長させた。一夜培養物を新たな培地中で１：１０００に希釈した。３７℃での成長を、６００ｎｍでの懸濁液のＯＤによってモニターした。懸濁液が０．５ＯＤに達した調製物を使用した。全血液（Ｂｌｏｏｄ Ｓｏｕｒｃｅ，Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ）を用い、遠心分離して充填ＲＢＣ（およそ９０％のヘマトクリットの３４ｍＬ）を得、次いで、１７ｍＬのＥｒｙｔｈｒｏｓｏｌをおよそ６０％のヘマトクリットまで添加することにより、赤血球（ＲＢＣ）組成物を調製した。Ｅｒｙｔｈｒｏｓｏｌは、赤血球添加剤（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐ．，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）であり、これは、クエン酸ナトリウム二水和物（７．８２ｇ）；過リン酸ナトリウム二水和物（０．７３ｇ）；リン酸ナトリウム二水和物（３．０３ｇ）；アデニン（０．２２ｇ）；マンニトール（７．７４ｇ）；およびグルコース（９ｇ）を１リットルの蒸留水中で合わせることにより調製されたものであり得る。次いで、該細菌調製物（全容量の１／１００）をＲＢＣ／Ｅｒｙｔｈｒｏｓｏｌに添加し、汚染ＲＢＣを得た。この汚染ＲＢＣをいくつかの試料に分割し、表２に従って処理した。ここで、ＰＩＣ−１は、β−アラニン、Ｎ−（アクリジン−９−イル）、２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルである。ＰＩＣ−１およびグルタチオン（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）を８％デキストロース一水和物の溶液に、一緒に添加する場合は最終赤血球組成物に所望される濃度の約１５倍で、または別々に添加する場合は３０倍で溶解した。また、グルタチオンは、表示した当量の水酸化ナトリウムで中和し、適当な量の５Ｎ ＮａＯＨをグルタチオンに添加することにより調製した。各試料について、４．６７ｍＬのＲＢＣを、３３０μＬのＰＩＣ−１／グルタチオンまたは１６５μＬの別々の各ＰＩＣ−１およびグルタチオンのいずれかと混合した。例えば、２ｍＭのグルタチオンおよび０．２ｍＭのＰＩＣ−１の標準処理物は、７．６ｍｇのＰＩＣ−１および４６ｍｇのグルタチオンを５ｍＬの８％デキストロースに溶解し、このうち３３０μＬを４．６７ｍＬのＲＢＣに添加することにより調製した。２０ｍＭの中和グルタチオンおよび０．２ｍＭのＰＩＣ−１の試料を、７．６ｍｇのＰＩＣ−１および４６０ｍｇのグルタチオンを４．４ｍＬの８％デキストロースに溶解し、０．６ｍＬの５Ｎ ＮａＯＨと混合し、次いで、このうち３３０μＬを４．６７ｍＬのＲＢＣに添加することにより調製した。２０ｍＭの中和グルタチオンを用いて別々に添加する場合、ＰＩＣ−１は、７．６ｍｇを２．５ｍＬの８％デキストロースに溶解することにより調製し、グルタチオンは、４６０ｍｇを１．９ｍＬの８％デキストロースに溶解し、０．６ｍＬの５Ｎ ＮａＯＨと混合することにより調製し、次いで、１６５μＬの各溶液を４．６７ｍＬのＲＢＣに適切な順序で添加する。種々の成分の容量は、表に示した適切な試料が提供されるように、しかるべく調整する。処理後、試料を２時間インキュベートし、各々１００μＬを連続希釈し、ＬＢプレート上にプレーティングした。細菌の成長を評価するため、これらを一晩３７℃でインキュベートした。細菌力価は、プレート上のコロニーを計測することにより測定し、プレートの希釈度に対してその力価を測定した。例えば、１０倍連続希釈では、最初の溶液の５番目の希釈物（この場合、０．１ｍＬがプレーティングされる）で３０個のコロニーが計測されることは、（３０×１０^５）／０．１＝３×１０^７あるいは７．４７ｌｏｇの初期力価を示し得る。未処理の対照試料（すなわち、ＰＩＣ−１またはグルタチオンの添加なし）を、処理後の力価のｌｏｇ低減を評価するためのベースラインとして用いる。表２Ａおよび２Ｂは、種々の試料に関するｌｏｇ力価およびｌｏｇ低減の両方を示す。表２Ａのほとんどの試料では、ＰＩＣ−１およびグルタチオンを一緒に製剤化したことに留意されたい。グルタチオンを種々の量の水酸化ナトリウムで中和した試料４〜６では、ＰＩＣ−１が溶液から析出し、塩基の添加量が増加するにつれて、沈殿は増加した。したがって、これらの結果は、溶液中のＰＩＣ−１実際の濃度がわからないので、不活化レベルの充分な表示を提供しない。表２Ｂに示すような、この２つの成分の逐次添加によって試験を繰返した（時間遅延０は、これらを同じ溶液中に添加したことを示す）。表２Ａにおける標準的な条件との比較では（試料１および１０）、該成分を別々に添加した試料７のみが、妥当な比較を提供する。この場合、表２Ｂでも示されるように、２０ｍＭの２当量の塩基で中和したグルタチオンによるクエンチングでは、標準的な条件（２ｍＭの酸性グルタチオンおよび０．２ｍＭのＰＩＣ−１）と比べ、約１〜１．５ｌｏｇ少ないｌｏｇ低減がもたらされる。
【００９３】
Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓを使用し、その一夜培養物を希釈なしで用いて、さらなる試験を行なった。この試験では、ＰＩＣ−１およびグルタチオンを、表３に示す順序で添加した。結果をこの表に示す。Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの不活化は、２０ｍＭの中和グルタチオンをクエンチャーとして使用した場合、有意に低減されない。ＰＩＣ−１は、すべての試料で０．２ｍＭである。
【００９４】
Ｙ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａを使用し、同様の試験を行なった。ここでは、中和グルタチオンに加えて、中和システインをクエンチャーとして使用し、このシステイン（Ａｌｄｒｉｃｈ）は、１当量または２当量いずれかの水酸化ナトリウムで中和した。この試験では、２ｍＭの酸性グルタチオンを、２０ｍＭの中和グルタチオンまたは２０ｍＭの中和システインと比較し、すべての試料で０．２ｍＭのＰＩＣ−１とする。結果を表４に示す。結果は、適切に中和されたシステインは、中和グルタチオンと同程度に有効であることを示し、標準的な条件と比べて約２．５ｌｏｇの不活化の低減を示す。
【００９５】
（表２Ａ 種々のクエンチング条件下でのＲＢＣにおけるＳｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓの不活化）
【００９６】
【表２Ａ】

＊この試料では、まずＰＩＣ−１を添加し、直後にグルタチオンを添加した。
他のすべての試料では、ＰＩＣ−１およびグルタチオンを一緒に配合し、ＲＢＣに添加した。
【００９７】
（表２Ｂ ＰＩＣ−１およびグルタチオンの逐次添加を含むＲＢＣにおけるＳｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓの不活化（ＰＩＣ−１は、すべての試料で０．２ｍＭ））
【００９８】
【表２Ｂ】

（表３ ＰＩＣ−１およびグルタチオンの逐次添加を含むＲＢＣにおけるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの不活化（ＰＩＣ−１は、すべての試料で０．２ｍＭ））
【００９９】
【表３】

（表４ ＰＩＣ−１およびグルタチオンの逐次添加を含むＲＢＣにおけるＹｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａの不活化（ＰＩＣ−１は、すべての試料で０．２ｍＭ））
【０１００】
【表４】

システインをクエンチャーとして用い、さらなる試験を行なった。試料を上記のようにして調製および評価し、システイン（Ｃｙｓ）は、１当量または２当量いずれかの水酸化ナトリウムで中和した。これらの試料のため、１０ＮのＮａＯＨ原液を調製し、適切な容量の種々の成分を上記の手順に従って使用した。標準的な条件および／または２０ｍＭの中和グルタチオン（ＧＳＨ）で比較を行なった。また、表５Ａに示す試験では、システインとグルタチオンの組合せも使用した。表５Ａ、５Ｂおよび５Ｃに示す結果は、すべての条件下で少なくとも約３ｌｏｇの不活化を示す。一般的に、システインおよびグルタチオンは、標準的な条件と比べ、同様の病原体の不活化の低減をもたらし、この場合、不活化は標準的な条件の約１〜１．５ｌｏｇ以内である。両者の組合せは、システインは、細胞内に侵入することができるが、グルタチオンは、実質的な量では細胞内に侵入しないという点で重要である。これは、細胞の内部および外部の両方で、適切なクエンチング条件下では同様の不活化の結果が観察されることを示す。
【０１０１】
（表５Ａ ＰＩＣ−１およびグルタチオンもしくはシステインまたは両者の組合せを用いたＲＢＣにおけるＳｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓの不活化（ＰＩＣ−１は、すべての試料で０．２ｍＭ））
【０１０２】
【表５Ａ】

（表５Ｂ ＰＩＣ−１およびグルタチオンまたはシステインを用いたＲＢＣにおけるＳｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓの不活化（ＰＩＣ−１は、すべての試料で０．２ｍＭ））
【０１０３】
【表５Ｂ】

（表５Ｃ ＰＩＣ−１およびグルタチオンまたはシステインを用いたＲＢＣにおけるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの不活化（ＰＩＣ−１は、すべての試料で０．２ｍＭ））
【０１０４】
【表５Ｃ】

実施例２
標準的な条件との水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）の不活化の比較
ＶＳＶの１００倍原液（およそ１．７８×１０^８力価）を用い、実施例１のようにして調製した赤血球組成物を汚染する。汚染ＲＢＣを、表５Ａ〜Ｂに示すようにして処理し、２時間インキュベートした。成分は、上記の同様の実験で示したようにして添加した。各試料に対して、５ｍＬ容量の汚染ＲＢＣを処理した。インキュベーションの終了後、ＲＢＣを液体Ｎ_２中で凍結し、後のある時点で解析した。残留ＶＳＶの力価を、１０％ウシ胎仔血清および他の必須成分を加えたＥＭＥＭ中で成長させたアフリカミドリザル細胞Ｖｅｒｏ ７６において、プラークアッセイによって測定した。力価は、既報（Ｈｓｉｕｎｇ
ＧＤ ａｎｄ Ｍｅｌｎｉｃｋ ＪＬ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
７８，１２８−１３６．１９５７）のコンフルエント細胞調製物に対して希釈試料を適用したときに得られたプラークの数の測定によって計算した。結果を表６Ａに示す。これは、該クエンチング方法はすべて、高力価のＶＳＶの本質的に完全な不活化をもたらすことを示す。２当量の水酸化ナトリウムで中和した、または中和していないシステインをクエンチャーとして用い、さらなる試験を行なった。結果を、比較のための標準的な条件および２０ｍＭの中和グルタチオンとともに表６Ｂに示す。酸性、または中和されたいずれかの２０ｍＭのシステインは、不活化レベルを約２〜３ｌｏｇ低下させ、中和された試料が最も低い不活化レベルを示す。また、２０ｍＭのグルタチオン試料も不活化レベルを約２ｌｏｇ低下させる。結果はすべて、細胞外ウイルスＶＳＶの不活化がクエンチング条件に対してあまり感受性でないことを示す。
【０１０５】
（表６Ａ ＰＩＣ−１およびグルタチオンの逐次添加を含む、ＲＢＣにおけるＶＳＶの不活化（ＰＩＣ−１は、すべての試料で０．２ｍＭ））
【０１０６】
【表６Ａ】

＊中和グルタチオンとの同時添加によってＰＩＣ−１が溶液から析出する。
【０１０７】
（表６Ｂ ＰＩＣ−１およびグルタチオンまたはシステインを用いたＲＢＣにおけるＶＳＶの不活化（ＰＩＣ−１は、すべての試料で０．２ｍＭ））
【０１０８】
【表６Ｂ】

実施例３
ＰＩＣ−１およびグルタチオンまたはシステインでのＲＢＣの処理後のヒト白血球ゲノムＤＮＡにおけるＰＩＣ−１付加物頻度（ａｄｄｕｃｔ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）の測定
白血球低減処理されていない全血を用い、実施例１に記載のようにして、Ｅｒｙｔｈｒｏｓｏｌを加えたＲＢＣを調製した。各々２０ｍＬのアリコートを、０．２ｍＭのＰＩＣ−１、０．２ｍＭのＰＩＣ−１および２ｍＭの酸性グルタチオン、２０ｍＭの中和グルタチオン（２当量の塩基）および１０分後に０．２ｍＭまで添加するＰＩＣ−１、または各々２０ｍＭの中和グルタチオン（２当量のＮａＯＨ）および中和システイン（１当量のＮａＯＨ）ならびに１０分後に０．２ｍＭまで添加するＰＩＣ−１のいずれかで処理した。使用したＰＩＣ−１は放射能標識ＰＩＣ−１を含むものであり、その反応性基は、^１４Ｃ標識を含むものであった（ＶｉＴｒａｘ，Ｉｎｃ．，Ｐｌａｃｅｎｔｉａ，ＣＡ）。使用したＰＩＣ−１の比活性は、１．０８μＣｉ／μモルであった。すべての試料を室温で２０時間インキュベートした。インキュベーション後、２０ｍＬのＲＢＣを、２０ｍＬ容量のＰＢＳで希釈し、２０ｍＬの混合物を１０ｍＬのＦｉｃｏｌｌを入れた２つのチューブの各々に添加した。次いで、この懸濁液を４００×ｇで３０分間遠心分離した。白血球部分を分離し、さらに２０ｍＬのＰＢＳを添加後、遠心分離機工程を繰返した。得られたペレットを合わせ、合わせたペレットを５ｍＬの溶解バッファー（１００ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ，２５ｍＭ ＥＤＴＡ，５％ＳＤＳ，０．１ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）中に再懸濁し、５０℃で少なくとも２時間インキュベートした。次いで、得られた溶液を５ｍＬのフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール２４：２５：１、続いて５ｍＬのクロロホルム、次いで５ｍＬのエーテルで抽出した。ゲノムＤＮＡが水層中に単離され、０．５ｍＬの３Ｍ ＮａＯＡｃ、１０ｍＬの１００％エタノールの添加後、ドライアイス／エタノール浴中での最終混合物のインキュベーションによって沈殿させた。ＤＮＡは、６，０００×ｇで１０分間の遠心分離によって単離した。上清みを除去し、ペレットを風乾し、１ｍＬのＴＥバッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ＝７．４）中に再懸濁した。単離されたＤＮＡの量は、２６０ｎｍでのＵＶ吸収によって定量し、ＰＩＣ−１付加物の量は、ＤＮＡ塩基対に対するＰＩＣ−１モル比を評価するためのＰＩＣ−１の比活性を用い、該ＤＮＡ溶液の液体シンチレーション計測（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ−Ｗａｌｌａｃ，Ｗｉｎｓｐｅｃｔｒａｌ １４１４ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ
Ｃｏｕｎｔｅｒ，Ｓｈｅｌｔｏｎ，ＣＴ）によって定量した。１０００ｂｐ（ｋｂｐ）あたりの付加物の数を以下の表７に示す。これは、標準的な条件または非クエンチング試料と比べ、２０ｍＭの中和グルタチオンを用いてクエンチングした試料において、白血球核酸の改変が同等であることを示す。表中ならびに本明細書の他の部分において、グルタチオンを「ＧＳＨ」で、システインを「Ｃｙｓ」で示す。付加物頻度の測定は、白血球の不活化の代替的（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）測定として用いた。標準的な病原体の不活化条件では、白血球は、限界希釈アッセイの検出レベルまで不活化されることが知られており、これは、５．３ｌｏｇの不活化に相当する。不活化の機構は、ゲノム核酸上への付加物の形成によるものである。したがって、結果は、該改善されたクエンチング方法は、白血球の不活化に有意に影響を与えないはずであることを示す。種々の条件下での病原体核酸に対する結合を評価するため、白血球低減処理された赤血球を用いて、適当な病原体で同様の試験を行ない得る。
【０１０９】
（表７ 種々の処理条件後のゲノムＤＮＡにおけるＰＩＣ−１付加物頻度）
【０１１０】
【表７】

＊付加物間の塩基対の平均数
＊＊２当量で中和
実施例４
赤血球への抗アクリジン抗体結合によって評価されるクエンチングに対するＲＢＣのｐＨ調整の効果
グルタチオンの添加前に、この実施例に示すようにして、異なるｐＨの種々の溶液を用いてＲＢＣを洗浄することにより、ＲＢＣ組成物のｐＨを調整することが可能である。白血球低減処理された全血（Ｂｌｏｏｄ Ｓｏｕｒｃｅ，Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ）の２０ｍＬの試料を、４本の５０ｍＬ容遠心チューブの各々において、室温にて、４，１００×ｇで５分間、遠心分離した。上清みを各チューブから取り出し、赤血球濃縮物（ＲＣＣ）を得た。試料１には、５ｍＬのＥｒｙｔｈｒｏｓｏｌ（ｐＨ７．３）を１０ｍＬのＲＣＣに添加した。試料２〜４は、ＲＣＣを、表示した溶液１０ｍＬで３回洗浄し、上記のようにして遠心分離し、各洗浄後の上清みを取り出した。各洗浄ＲＣＣについて、細胞を、洗浄に用いた溶液５ｍＬ中に再懸濁した。これを、以下、ＲＢＣ試験試料という。試料２〜４に用いた溶液は、それぞれ、Ｅｒｙｔｈｒｏｓｏｌ（ｐＨ７．３）、ＰＢＳ ｐＨ８（５０ｍＭリン酸塩，１００ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ８．０）、およびＣＨＥＳ ｐＨ９（５０ｍＭ ＣＨＥＳ（Ａｌｄｒｉｃｈ），１００ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ９．０）であった。各ＲＢＣ試験試料について、１．５ｍＬを、１００μＬのＰＩＣ−１＋グルタチオン（２ｍＭの酸性のもの、または２０ｍＭの０．９、１．５もしくは２当量の水酸化ナトリウムで中和されたもの）と混合し、最終濃度が０．２ｍＭのＰＩＣ−１および２ｍＭまたは２０ｍＭのグルタチオンを得た。これらの試料を２０時間、室温でインキュベートした。インキュベーション後、ＲＢＣをＢＢＳ（Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋ Ｓａｌｉｎｅ、０．９％生理食塩水、非緩衝、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で洗浄し、最終ヘマトクリット４％まで希釈した。２５μＬの各アリコートを、ＢＢＳ中で１：１００に希釈したウサギポリクローナル抗アクリジン血清１５μＬと混合し、混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。続いて、細胞を１．５ｍＬのＢＢＳで洗浄した。洗浄を終了した後、細胞を、５０μＬのＦＩＴＣ標識ヤギ抗ウサギＦａｂ’_２断片（ＢＢＳ中、１：６４希釈度）と混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を、３×１．５ｍＬのＢＢＳで再度洗浄した。次いで、赤血球をＦＡＣＳｃａｎによって解析した。各試料で観察された平均蛍光を表８に示す。この値は赤血球表面に対するＰＩＣ−１アクリジンの結合と、値が小さいほど、ＰＩＣ−１とＲＢＣとの副作用のクエンチングの改善を示すように相関する。ＲＢＣに対するＰＩＣ−１の結合は、単に、細胞を高ｐＨバッファー中で洗浄することによって有意に低減され、中和グルタチオンは、さらにより良好なクエンチングを提供した。グルタチオンを中和する水酸化ナトリウムの量を増加させると、クエンチングが改善されることに留意されたい。この実施例は、改善されたクエンチングを提供するために赤血球組成物のｐＨを調整することの重要性を示す。ＣＨＥＳ（ｐＨ９）での洗浄と１．５または２当量の水酸化ナトリウムで中和されたグルタチオンとの組み合わせにより、ＰＩＣ−１の結合がほぼバックグラウンドレベルまで低下される。
【０１１１】
（表８ 種々のクエンチング条件下での０．２ｍＭのＰＩＣ−１によるＲＢＣの処理、抗アクリジン抗体結合のＦＡＣＳｃａｎ解析）
【０１１２】
【表８】

実施例５
赤血球への抗アクリジン抗体結合の結合に関する種々のクエンチング条件の比較
処理済み赤血球に対するウサギ抗アクリジン血清の結合のＦＡＣＳｃａｎ解析を用い、種々のクエンチング条件を評価した。ＲＢＣ試料は、実施例１に記載のようにして調製し、クエンチャーは、上記の実施例に記載のようにして調製した。ＲＢＣとの混合時の成分の添加順および最終化合物濃度を表９Ａおよび９Ｂに示す。これらの表は、各々、試料を標準的な条件下または２０ｍＭの中和グルタチオンで処理した２つの異なる実験のデータを示す。ＰＩＣ−１は、すべての試料で０．２ｍＭである。実験のデータは、種々の処理の相対的な有効性を提供する。アッセイは、用いる赤血球のロット（ｌｏｔ）に依存し得るため、平均蛍光の絶対値は、ある試験と次のものとで異なり得、そのため、相対値は、所与の実験内のみで比較するのがよい。例えば、標準的な条件では、表９Ａでは１１４で、表９Ｂでは１５１〜１８２の平均蛍光が得られていることに留意されたい。中和システインは、１５または２０ｍＭで、本質的にバックグラウンドシグナル（すなわち、本質的に結合なし）まで効果的にクエンチングする。２０ｍＭの中和グルタチオンでは、バックグラウンドレベルに近くなる。表９Ｂから、システインに関する結果は、クエンチャー濃度を増加させると、ＲＢＣとの反応のより良好なクエンチングが提供されるが、システイン濃度が増加したとき、システインを中和すると、望ましくない副作用の最適なクエンチングが提供されることを示す。２．５ｍＭシステインでは、中和システインと酸性システインとでほとんど差はないが、５ｍＭ以上では、同じ濃度の酸性システイン試料と比べ、１当量のＮａＯＨにより、シグナルがさらに低減されることに留意されたい。
【０１１３】
（表９Ａ ＦＡＣＳｃａｎ平均蛍光として測定された処理ＲＢＣに対する相対抗アクリジン抗体結合（ＰＩＣ−１は、すべての試料で０．２ｍＭ））
【０１１４】
【表９Ａ】

（表９Ｂ ＦＡＣＳｃａｎ平均蛍光として測定された処理ＲＢＣに対する相対抗アクリジン抗体結合（ＰＩＣ−１は、すべての試料で０．２ｍＭ））
【０１１５】
【表９Ｂ】

実施例６
ＰＩＣ−１および種々のクエンチャーの添加時の赤血球組成物のｐＨの評価
赤血球組成物のｐＨに対する種々のクエンチング条件の効果を、種々の処理条件で調べた。クエンチャー溶液は、８％デキストロース一水和物中６００ｍＭの濃度に調製した。システインでは、溶液の一部を１または２当量いずれかの水酸化ナトリウムと混合した。グルタチオンは、２ｍＭ（酸性）または２０ｍＭ（２当量の塩基）で評価した。Ｎ−アセチルシステイン、メチオニンおよびペプチドダイマーであるシステイン−グリシン（ＣｙｓＧｌｙ）もまた評価し、ここで、Ｎ−アセチルシステインは、１当量の水酸化ナトリウムで中和し、メチオニンは、１または２当量の水酸化ナトリウムで中和し、ＣｙｓＧｌｙは、２当量の水酸化ナトリウムで中和した。クエンチャー溶液（非改変または中和のいずれか）のｐＨは、室温で、標準的なＥｐｏｘｙ Ｃａｌｏｍｅｌ電極（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて測定した。ＰＩＣ−１の溶液は、８％デキストロース一水和物中、６ｍＭに調製した。赤血球組成物を実施例１のようにして調製した。各試料に対し、１６７μＬのクエンチャーおよび１６７μＬのＰＩＣ−１を４．６７ｍＬのＲＢＣに逐次添加し、クエンチャーの添加後、室温で１０分間インキュベートし、次いでＰＩＣ−１を添加した。試料を混合し、ｐＨを室温で、上記のものと同じ電極を用いて測定した。種々の試験の結果を表１０に示す。
【０１１６】
（表１０ ＲＢＣにおける０．２ｍＭのＰＩＣ−１での種々のクエンチャー条件を用いたｐＨ測定）
【０１１７】
【表１０】

実施例７
グルタチオン濃度と中和の関数としてのクエンチング；抗アクリジン抗体結合およびＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの不活化の評価
これらにおいて、適当な量の６００ｍＭの原液を添加し、適切な容量の８％デキストロースと混合し、各ＲＢＣ試料に対して同じ容量添加を提供した。ここで、試験の１つでは、グルタチオン濃度を変化させ、ｐＨを、グルタチオンの添加後およびＰＩＣ−１の添加後に測定した。ＰＩＣ−１の添加によって、クエンチャーの添加後、高ｐＨ値を有する一部の溶液のｐＨが低下するが、最終ｐＨは依然として、改善されたクエンチングに好ましい範囲内にあり、中和していない同じ濃度のグルタチオンのｐＨ値の充分上であることに留意されたい。種々の濃度のグルタチオン（表１１Ａ）を用いて実施例６と同様にして調製した試料を、抗アクリジンウサギ血清に対する結合について、ゲルカードまたはＦＡＣＳｃａｎ解析のいずれかによって評価した。また、同様の試料を、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの不活化について評価した。各ＲＢＣ試料をグルタチオンで、続いて１０分後にＰＩＣ−１で処理し、次いで、ＰＩＣ−１の混合後に室温で２０時間インキュベートした。ゲルカード解析では、インキュベーション後、ＲＢＣをＢＢＳ中で洗浄し、ＢＢＳ中で最終ヘマトクリット４％まで希釈した。２５μＬの各アリコートを、ＢＢＳ中で１：４または１：１００のいずれかに希釈した１５μＬのウサギポリクローナル抗アクリジン血清と混合し、混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。続いて、細胞を１．５ｍＬのＢＢＳで洗浄した。洗浄を終了した後、細胞をヤギ抗ウサギＦａｂ’_２断片の抗Ｈ＋Ｌ鎖（ＰＢＳ中、１：４希釈度）と混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を３×１．５ｍＬのＢＢＳで再度洗浄し、ゲルカード上に負荷し、該カードを、ＭＴＳ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（登録商標）（Ｏｒｔｈｏ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｐｏｍｐａｎｏ Ｂｅａｃｈ，Ｆｌ）において、製造業者の設定に従って１０分間９００×ｇで遠心分離した。カードを、凝集の相対量を等級分けする０、１＋、２＋、３＋、４＋の段階でスコア付けする。ここで、０は、凝集なし（すべての細胞がゲルを通過する）を示し、４＋は、完全な凝集（すべての細胞がゲル上部にある）を示す。これらの結果は、グルタチオン濃度が増加するにつれて、中和グルタチオンを用いることなどで、ＲＢＣ組成物のｐＨを調整することが必要であることを示す。５ｍＭであっても、２当量の塩基で中和したグルタチオンは、１または０当量の塩基で中和した５ｍＭのものより良好なクエンチングするを提供する。中和グルタチオンは、濃度が増加するにつれて抗体結合の低減を示すが、酸性グルタチオンは、２ｍＭの標準的な条件と比べ、より高い濃度では改善は、あったとしても、ほんのわずかである。このアッセイの感度は、この試験において、１：４希釈度では、すべての試料で完全な凝集を示す（未処理の対照は、凝集を示さない）ため、クエンチング方法における差を調べるには、１：１００希釈度のウサギ血清が必要であるようなものである。したがって、１：１００に希釈した試料のみを表１１Ｂに示す。試験間の結果は、用いる血液試料によって異なる。例えば、この試験では、１：４に希釈した抗アクリジンウサギ血清では、すべての試料で４＋スコアがもたらされたが、別の試験は、１０、１５および２０ｍＭの中和グルタチオン（２当量の塩基）を用いて行ない、この場合、１：４に希釈した試料において差が観察されたが、１：１００に希釈した試料はすべて、スコア０を示した。１：４希釈度のウサギ血清を用いて試験したこれらの試料は、標準的な条件、１０ｍＭ、１５ｍＭおよび２０ｍＭの中和（２当量または塩基）グルタチオンで、それぞれ、４＋、４＋、３＋および１＋のスコアを示した。また、中和グルタチオン（２当量の塩基）と中和システイン（１当量の塩基）の組合せも使用し、この場合、全クエンチャー濃度を２０ｍＭとし、すべてのかかる試料で、１＋または０のスコアがもたらされた（すなわち、これらは、２０ｍＭの中和グルタチオンと少なくとも同程度に有効であった）。
【０１１８】
（表１１Ａ ＲＢＣにおける０．２ｍＭのＰＩＣ−１での種々のクエンチャー条件を用いたｐＨ測定）
【０１１９】
【表１１Ａ】

（表１１Ｂ 種々の濃度のグルタチオンおよび０．２ｍＭのＰＩＣ−１で処理したＲＢＣにおける抗アクリジン抗体結合。１：１００希釈度の抗アクリジンウサギ血清および１：４希釈度の二次抗ウサギＩｇＧのゲルカードスコア）
【０１２０】
【表１１Ｂ】

表１１Ａに示すような別の組の試料を、上記のようにして、異なる単位のＲＢＣを用いて調製し、ＦＡＣＳｃａｎ解析によって評価した。これらの試料は、２０時間のインキュベーション後、実施例４のようにして処理し、ＦＡＣＳｃａｎによって解析した。未処理対照試料ならびに標準的な試料（２ｍＭの酸性グルタチオンと０．２ｍＭのＰＩＣ−１との同時添加）もまた評価した。結果を表１１Ｃに示す。
【０１２１】
（表１１Ｃ 種々の濃度のグルタチオンおよび０．２ｍＭのＰＩＣ−１で処理したＲＢＣにおける抗アクリジン抗体（ウサギポリクローナル；１：１００希釈度）結合。ＦＩＴＣ標識抗ウサギＦａｂ’_２（１：６４希釈度）を用いたＦＡＣＳｃａｎ解析により評価。）
【０１２２】
【表１１Ｃ】

表１１Ａに示すような別の組の試料を、上記のようにして、同じ単位のＲＢＣを用いて調製し、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓを摂取（ｓｐｉｋｅ）し、実施例１のようにして力価について評価した。結果を表１１Ｄに示す。抗体結合の結果とＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの不活化の結果を合わせると、より高濃度での中和グルタチオンの使用で、改善されたクエンチングが示される。
【０１２３】
（表１１Ｄ 種々の濃度のグルタチオンおよび０．２ｍＭのＰＩＣ−１で処理したＲＢＣにおけるＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの不活化）
【０１２４】
【表１１Ｄ】

実施例８
種々のクエンチャーでクエンチングした試料におけるゲルカード解析による抗アクリジン抗体結合の評価
ゲルカードアッセイを用いた同様の試験を、他のクエンチング条件で、例えば、システイン、システイン−グリシンジペプチドまたはシステインとグルタチオンの組合せなどを用いて行なった。また、試料を、１：４または１：１００いずれかの希釈度のウサギ血清を用いて、および二次抗体なしで試験し、この場合、２ｍＭのグルタチオンおよび０．２ｍＭのＰＩＣ−１の標準的な条件で処理した試料、またはクエンチャーなしでＰＩＣ−１で処理した試料で、一部凝集がもたらされた。濃縮した１：４希釈度のウサギ血清を二次抗ウサギ抗体（表１２および１３）と用いたほとんどすべての試料で観察された凝集は、一部、異好性（ｈｅｔｅｒｏｐｈｉｌｅ）反応によるものと考えられる。異好性抗体は、天然に存在する抗体であり、ＲＢＣを別の種から非特異的様式で認識する。表１２〜１３は、１：４または１：１００いずれかの希釈度のウサギ血清および１：４希釈度の抗ウサギ抗体に関する種々の実験の結果を示す。未処理の対照のデータは、すべての試料でスコア０であったため、示していない。試料はすべて、まずクエンチャーと、次いで０．２ｍＭのＰＩＣ−１と混合した。クエンチャーの具体名、濃度、および当量の塩基を表に示す。これらの結果は、グルタチオンおよびシステインまたはシステイン単独の組合せにより、いくぶんより良好なＲＢＣに対するＰＩＣ−１の結合のクエンチングが提供され得ることを示唆する。
【０１２５】
（表１２ 種々の濃度のグルタチオンおよびシステインおよび０．２ｍＭのＰＩＣ−１で処理したＲＢＣにおける抗アクリジン抗体結合）
【０１２６】
【表１２】

＊ゲル上部にごくわずかな着色
（表１３ 種々の濃度のグルタチオンおよびシステインおよび０．２ｍＭのＰＩＣ−１で処理したＲＢＣにおける抗アクリジン抗体結合）
【０１２７】
【表１３】

また、ジペプチドであるシステイン−グリシン（ＣｙｓＧｌｙ）をクエンチャーとして使用した。標準的な条件ならびに２０ｍＭの中和システイン（２当量の塩基）を、１当量の塩基を用いた、または用いていない種々の濃度のＣｙｓＧｌｙと比較した。結果を表１４に示す。結果は、クエンチャーの量が増加するにつれて、改善されたクエンチングのために、例えばクエンチャーの中和によるｐＨの調整が必要とされるというグルタチオンおよびシステインの両方で見られたものと一致する。
【０１２８】
（表１４ 中和ありまたはなしのＣｙｓＧｌｙと２０ｍＭの中和システインまたは標準的な条件とのクエンチングの比較。抗アクリジン抗体結合のゲルカード解析。）
【０１２９】
【表１４】

実施例９
本発明の方法の処理による標準処理済み赤血球で見られた交差反応性の排除
２ｍＭのグルタチオンおよび０．２ｍＭのＰＩＣ−１で処理されているＲＢＣと交差反応する抗体を発現した患者由来の血清を用い、改善された方法との交差反応性を評価した。Ｏ陰性血液（Ｂｌｏｏｄ Ｓｏｕｒｃｅ，Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ）を用いた試料を実施例１に記載のようにして調製し、２ｍＭのグルタチオンおよび０．２ｍＭのＰＩＣ−１、０．２ｍＭのＰＩＣ−１に続いて１分後に２０ｍＭの中和グルタチオン（２当量の塩基）、または２０ｍＭの中和グルタチオンに続いて１０分後に０．２ｍＭのＰＩＣ−１のいずれかで処理した。また、未処理の対照ＲＢＣ試料も調製した。各試料をＢＢＳで３回洗浄し、次いで、低イオン強度の生理食塩水（ＡＡＢＢマニュアル，第１４版）中にヘマトクリット８％まで懸濁した。５０μＬの各アリコートをゲルカードに、２５μＬの患者血清とともに添加し、混合物を３７℃で１５分間インキュベートした。ゲルカードは、患者血清由来の抗体が結合したＲＢＣを凝集させるウサギ抗ヒトＩｇＧを含有するものである。カードを実施例７のように遠心分離した。カードは、実施例７記載のものと同じ目盛りで読む。３種類の異なる血清を用いて試験した試料は、標準処理したＲＢＣで３＋、および対照未処理または２０ｍＭ（２当量）の中和グルタチオン処理試料で０のスコアを示した。
【０１３０】
実施例１０
チオールのクエンチングと独立したｐＨ調整によるクエンチングを評価するためのモデルとしてのメチオニンの使用
メチオニン（Ｍｅｔ）は、イオウ原子上にメチル置換基を有するが、それ以外は、非常にシステインと類似するため、これを、クエンチングに対するｐＨ調整単独の効果を評価するためのモデルアミノ酸として使用した。メチル基の存在はイオウ原子の求核特性を排除するため、クエンチングは、溶液のｐＨの増加によるものであり得る（例えば、高濃度の水酸化物は、ある程度のクエンチングをもたらし得る）。メチオニン（Ａｌｄｒｉｃｈ）を、１または２当量の塩基の添加を伴って２０ｍＭで用い、システイン（１または２当量）およびグルタチオン（２当量）（すべて、クエンチャーの１０分後に０．２ｍＭのＰＩＣ−１の添加を伴う）と比較する。標準的な条件、すなわち、０．２ｍＭのＰＩＣ−１および２ｍＭの酸性グルタチオンの同時添加を含めた。試料は、ゲルカード解析用の試料を３７℃または室温でインキュベートした以外は実施例７のようにして、抗アクリジンウサギ血清結合のゲルカード解析によって評価する。結果を表１５に示す。結果は、２当量の塩基で中和されたメチオニンは、標準的な条件と比べて改善されたクエンチングを提供することを示す。
【０１３１】
（表１５ 抗アクリジンウサギ血清結合のゲルカード解析によって評価したメチオニン、システインまたはグルタチオンを用いたクエンチング）
【０１３２】
【表１５】

実施例１１
２０ｍＭの中和グルタチオンおよび０．２ｍＭのＰＩＣ−１で処理した完全体単位（ｗｈｏｌｅ ｕｎｉｔ）に関するインビトロ機能試験
赤血球濃縮物（Ｉｎｔｅｒｓｔａｔｅ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｍｐｈｉｓ，ＴＮ）の完全体単位を白血球低減処理した。２００ｍＬ容量のこのＲＣＣ（８０％ヘマトクリット）を９４ｍＬのＥｒｙｔｈｒｏｓｏｌまたは１００ｍＬのＡｄｓｏｌ（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐ．，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）（対照として）（単位１）と混合した。２０ｍＬ容量の８％デキストロースを用いてＰＩＣ−１（ｍｇ）および酸性グルタチオン（ｍｇ）を溶解し、１単位にに添加して０．２ｍＭのＰＩＣ−１および２ｍＭのグルタチオン（単位２）を得た。単位３および４では、ＰＩＣ−１（ｍｇ）およびグルタチオン（ｍｇ）を、それぞれ、１０ｍＬまたは８．８ｍＬの８％デキストロースに別々に溶解した。グルタチオンには、１．２ｍＬの１０Ｎ ＮａＯＨを添加した（２当量）。ＰＩＣ−１をこの単位と、続いて１分後（単位３）または５分後（単位４）にグルタチオンと混合した。単位５では、まず中和グルタチオンを、続いて１０分後にＰＩＣ−１を混合した。単位６では、グルタチオンを１８．８ｍＬの８％デキストロースに溶解し、１．２ｍＬの１０Ｎ ＮａＯＨと混合し、次いでＲＢＣ（ＰＩＣ−１なし）と混合した。すべての単位は、血液バッグの両端をつかみ、８の字の動きを３０回で混合することにより混合した。次いで、これらを室温で合計２０時間インキュベートした。対照試料以外はすべて、メッシュポーチ内に入れたポリマー樹脂で構成された化合物吸着デバイス（ＣＡＤ）を使用した。このデバイスは、残留ＰＩＣ−１、ＰＩＣ−１分解生成物および試料由来のグルタチオンを除去することを目的とするものである。試料を８時間インキュベートし、次いで、ＣＡＤを入れた第２の血液バッグに移した。さらに１２時間インキュベートした。室温でインキュベーション後、試料を冷蔵庫（４℃）に移し、４３日間まで保存した。アリコートを各単位から、混合の１２時間および２０時間後に、その後は１週間毎に取り出した。アリコートを、全ヘモグロビン、ｐＨ、細胞内ＡＴＰ、血漿ヘモグロビン、カリウム、細胞外グルコースおよび細胞外乳酸について解析した。また、抗ウサギ血清結合を、実施例４に記載のようにして、ＦＡＣＳｃａｎ解析によって評価した。ＣＡＤで処理した、または処理していないＰＩＣ−１処理単位を用いて、試験を繰り返した。ＡＴＰ、溶血および抗ウサギ血清結合の結果を表１６Ａ〜Ｃおよび１７Ａ〜Ｃに示す。
表１６Ａ〜Ｃ 試料の具体名：
１：未処理対照
２：標準処理 ０．２ｍＭ ＰＩＣ １＋２ｍＭのＧＳＨ
３：０．２ｍＭのＰＩＣ−１、１分間遅延、２０ｍＭのＧＳＨ＋２当量の塩基
４：０．２ｍＭのＰＩＣ−１、５分間遅延、２０ｍＭのＧＳＨ＋２当量の塩基
５：２０ｍＭのＧＳＨ＋２当量の塩基、１０分間遅延、０．２ｍＭのＰＩＣ−１
６：０．２ｍＭのＧＳＨ＋２当量の塩基
（表１６Ａ ４２日間にわたる保存のＡＴＰデータ）
【０１３３】
【表１６Ａ】

（表１６Ｂ ４２日間にわたる保存の溶血パーセント）
【０１３４】
【表１６Ｂ】

（表１６Ｃ ４２日間にわたる保存の抗アクリジン抗体結合（ＦＡＣＳｃａｎ）によって測定されたＲＢＣ改変）
【０１３５】
【表１６Ｃ】

表１７Ａ〜Ｃ 試料の具体名：
１：標準処理、０．２ｍＭのＰＩＣ−１、２ｍＭのＧＳＨ＋ＣＡＤ
２：標準処理、０．２ｍＭのＰＩＣ−１、２ｍＭのＧＳＨ
３：０．２ｍＭのＰＩＣ−１、１分間遅延、２０ｍＭの中和ＧＳＨ＋ＣＡＤ
４：０．２ｍＭのＰＩＣ−１、１分間遅延、２０ｍＭの中和ＧＳＨ
５：２０ｍＭの中和ＧＳＨ、１０分間遅延、０．２ｍＭのＰＩＣ−１＋ＣＡＤ
６：２０ｍＭ ｎＧＳＨ、１０分間遅延、０．２ｍＭのＰＩＣ−１
７：２０ｍＭの中和ＧＳＨ
８：未処理対照
（表１７Ａ ４２日間にわたる保存の細胞内ＡＴＰ値）
【０１３６】
【表１７Ａ】

（表１７Ｂ ４２日間にわたる保存の溶血パーセント）
【０１３７】
【表１７Ｂ】

（表１７Ｃ ４２日間にわたる保存の抗アクリジン抗体結合（ＦＡＣＳｃａｎ）によって測定されたＲＢＣ改変）
【０１３８】
【表１７Ｃ】

実施例１２
ウサギモデルにおける処理済み赤血球の免疫反応性のインビボ評価
非限定的な一例の改善されたクエンチング方法を用いてＳ−３０３で処理している赤血球（ＲＢＣ）（この実施例では、「改変Ｓ−３０３ ＲＢＣ」という）の免疫反応性のインビボ評価を、同種（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）輸血モデルを用いて行なった。（改変Ｓ−３０３ ＲＢＣのプロトコルの記載については下記参照。）使用した同種輸血モデルは、遅延型溶血性輸血反応の機構を調べるためのＮｅｓｓらによって記載されたウサギモデル（Ｔｒａｎｓ Ｍｅｄ Ｒｅｖ，２００１，１５：３０５−１７）に基づくものであった。該モデルにおいて、ＨｇＤ−陽性赤血球を用いて、ＨｇＤ−陰性レシピエント動物を免疫処置した。しかしながら、ＨｇＤ−ミスマッチＲＢＣのみが稀に（ｉｎｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ）抗体形成を引き起こすという文献と一致して、Ｎｅｓｓらは、検出可能な力価の抗ＨｇＤ抗体を生成させるために、アジュバントと組み合わせたＨｇＤ−陽性ＲＢＣの皮下投与を報告した。
【０１３９】
評価は、２段階で行なった。第１段階では、ウサギに、ＨｇＤ遺伝子座がミスマッチの同種ウサギＲＢＣを反復的に輸血し、オリジナルＳ−３０３プロセス（下記参照）で処理した。第１段階の評価項目は、長期同種輸血の状況のオリジナルＳ−３０３ ＲＢＣに対して抗体応答が生じるか否かを調べることであった。第２段階では、抗アクリジン抗体の形成を刺激するため、ウサギを、アジュバント中のＫＬＨ−アクリジンコンジュゲートで慣用的に免疫処置した。これらの免疫処置動物に、次いで、Ｓ−３０３ ＲＢＣを輸血した。第２段階の評価項目は、オリジナルおよび改変Ｓ−３０３ ＲＢＣプロセスによって調製されたＲＢＣの回収および寿命を比較することことであった。第１段階および第２段階の実験の対照試料は、オリジナルおよび改良プロセスによって調製したＳ−２２０ ＲＢＣを含むものであった。Ｓ−２２０は、各処理プロセスで、ＲＢＣに対するアクリジン結合の観点で最悪のケースを表すものであろうＳ−３０３の非不安定型である。これらの試験の結果は、改変Ｓ−３０３が、インビボで高力価の抗体の存在によって影響を受けないことを示す。
【０１４０】
Ａ．材料および方法
動物飼育（ｈｕｓｂａｎｄｒｙ）：Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｗｈｉｔｅウサギの雄および雌は、試験の開始時、およそ５〜７月齢であり、体重は３．５〜４．５ｋｇであった。ドナー動物は、ＨｇＤ−陽性；レシピエントはＨｇＤ−陰性であった。
【０１４１】
試薬：デキストロースなしのＥｒｙｔｈｒｏｓｏｌは、Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製であり、表１８の配合に従うものであった。８％デキストロース一水和物の溶液もまた、Ｂａｘｔｅｒ製であった。
【０１４２】
（表１８．Ｅｒｙｔｈｒｏｓｏｌの組成（デキストロースなし））
【０１４３】
【表１８】

この実施例で使用した病原体不活化化合物はＰＩＣ−１であり、これを、この実施例ではＳ−３０３という。Ｓ−３０３・２ＨＣｌをγ線照射によって滅菌した。Ｓ−２２０と呼ばれるＳ−３０３の非崩壊性（ｆｒａｎｇｉｂｌｅ）類似体を対照として用いた。Ｓ−３０３（また、本明細書において「ＰＩＣ−１」ともいう）およびＳ−２２０の化学構造は以下の通りである。
【０１４４】
【化４】

この２つの化合物は、Ｓ−３０３にのみ崩壊性のエステル結合が存在すること以外は、非常に類似した構造を有する。本明細書において、Ｓ−３０３を、崩壊性アンカーリンカーエフェクター（Ｆｒａｎｇｉｂｌｅ Ａｎｃｈｏｒ Ｌｉｎｋｅｒ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ）化合物（ＦＲＡＬＥ）と、Ｓ２２０を、アンカーリンカーエフェクター化合物（ＡＬＥ）とよぶことがある。
【０１４５】
ＧＳＨは、２つの様式：γ線照射（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって滅菌した予め計量した１８４ｍｇの粉末として、またはＲＢＣ処理時に計量および製剤化するバルク物質（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）としての一方で提供した。
【０１４６】
ＲＢＣ処理：ＲＢＣを、調製して２４〜３６時間以内に輸血した。血液は無菌的に、ＡＣＤ−ＡのＨｇＤ−陽性ドナーから採取した。およそ４１０〜５００ｍＬの全血をプラスチック容器内にプールし、４２００×ｇで６分間遠心分離した。血漿を除去した後、９４ｍＬのＥｒｙｔｈｒｏｓｏｌをデキストロースなしで添加し、およそ６０％のヘマトクリットを有する充填赤血球調製物を得た。充填赤血球を図２に示し、以下に記載する３つの様式のうちの１つで処理した。
【０１４７】
対照ＲＢＣ：充填赤血球を２０ｍＬの８％デキストロースと混合し、次いで、輸液前に４℃で保存した（２日間まで）。
【０１４８】
オリジナルＳ−３０３ ＲＢＣ：ＧＳＨ（１８４ｍｇ）を２０ｍＬの８％デキストロースに溶解した。次いで、このＧＳＨ溶液（ｐＨ２．８〜３．０）を用いてＳ−３０３・２ＨＣ１（３３ｍｇ）を溶解した。続いて、Ｓ−３０３／ＧＳＨ溶液を充填赤血球に添加し、手作業で混合した。ＲＢＣを１２時間室温でインキュベートし、次いで、化合物吸着デバイス（ＣＡＤ）に、混合しながらさらに８時間曝露した。オリジナルプロセスにおけるＳ−３０３およびＧＳＨの最終濃度は、それぞれ、０．２ｍＭおよび２．０ｍＭであった。次いで、オリジナルＳ−３０３ ＲＢＣを、輸液前に４℃で保存した。オリジナルプロセスでの処理は、ヒト臨床試験で使用されるものと同じ使い捨てキットを用いて行なった。
【０１４９】
改変Ｓ−３０３ ＲＢＣ：ＧＳＨ・ＨＣｌ（２０２６ｍｇ）を滅菌プラスチックチューブ内に秤量し、９．３２ｍＬの８％デキストロースに溶解させた。次いで、酸性ＧＳＨを１．３２ｍＬの１０Ｎ ＮａＯＨ（これは２当量の塩基を表す）と合わせた。１０ｍＬの滅菌濾過した塩基性ＧＳＨ含有デキストロース（ｐＨ９）を充填赤血球に添加し、手作業で混合した。１０分以内に、Ｓ−３０３・２ＨＣｌ（３３ｍｇ）を、別途、１０ｍＬの８％デキストロースに溶解させ、充填赤血球含有ＧＳＨに添加し、手作業で混合した。改変Ｓ−３０３ ＲＢＣを室温でインキュベートし、オリジナルプロセスと同一の様式でＣＡＤに曝露した。改良プロセスにおけるＳ−３０３およびＧＳＨの最終濃度は、それぞれ、０．２ｍＭおよび２０ｍＭであった。
【０１５０】
Ｓ−２２０ ＲＢＣ：Ｓ−２２０は、不安定性エステルを欠くＳ−３０３の類似体であり、したがって、アクリジンは、ＲＢＣ処理中、加水分解によって分子の残部から切断され得ない。Ｓ−２２０ ＲＢＣは、Ｓ−３０３について記載したオリジナルまたは改良プロセスと同様の方法を用いて調製し、可能であればいつでも、オリジナルプロセスの使い捨てキットを使用した。オリジナルＳ−２２０ ＲＢＣでは、Ｓ−２２０およびＧＳＨの最終濃度は、それぞれ、０．２ｍＭおよび２．０ｍＭであった。改変Ｓ−２２０ ＲＢＣでは、Ｓ−２２０およびＧＳＨの最終濃度は、それぞれ、０．２ｍＭおよび２０ｍＭであった。
【０１５１】
アクリジン免疫処置：高力価の抗アクリジン抗体を惹起するため、第２段階において、ウサギをＫＬＨ−アクリジンコンジュゲートで免疫処置した。ＫＬＨ−アクリジンは、２〜５ｍＬの規模で、等モル量（４７６μＭ）のＫＬＨ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＩＬ）およびＳ−２２０をリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中で４８時間、室温にて反応させることにより調製した。Ｓ−２２０の低分子分解生成物をＫＬＨ−アクリジンから、脱塩カラムに通すことにより分離した。ＫＬＨ−アクリジンコンジュゲートは、その吸収が２１０および４１０ｍｎであることを特徴とし、ＫＬＨに対するアクリジンの比を、Ｓ−２２０の吸光率を用いて測定した。典型的には、１分子のＫＬＨに対して２００〜４００個のアクリジン付加物が形成された。ＫＬＨ−アクリジン溶液を使用まで冷蔵した。第１日に、ウサギを、完全フロイントアジュバント（０．５ｍｇ／ｍＬ）とともにＫＬＨ−アクリジンで、膝窩、肩甲骨前部および大腿前部のリンパ節上部の１０ヶ所の部位（およそ０．１ｍＬ／部位）の皮下に免疫処置した。第８、１５、３６および６４日に動物にフロイント不完全アジュバント（０．２５ｍｇ／ｍＬ）とともにＫＬＨ−アクリジンで、同じ部位（およそ０．１ｍＬ／部位）に追加免疫した。ウサギ血清試料を、抗体の形成について隔週で試験した。
【０１５２】
アクリジンに対する抗体の検出（第１段階）：アクリジンに対する抗体を、フローサイトメトリーアッセイを用いて検出した。ヒトＳ−３０３ ＲＢＣを、オリジナル処理プロセスを用いて試験試薬として調製した。ウサギ血清を１：４に希釈し、２５μＬの希釈血清を５０μＬのヒトＳ−３０３ ＲＢＣ（０．８％ヘマトクリット）と混合した。予備免疫処置血清を陰性対照として試験した。試料を３０分間３７℃でインキュベートし、次いで、５０μＬの血液バンク生理食塩水中で洗浄および再懸濁した。ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（供給業者）を１：６４に希釈し、２５μＬをＲＢＣ試料とともに３０分間３７℃でインキュベートした。試料を、再度洗浄し、結合抗体複合体を検出するためのＦＬ１チャネルを用いてＦＡＣＳによって解析した。いったん陽性血清が同定されたら、複数の希釈度のウサギ血清を用いて、同じ手順を行ない、終点力価を測定した。
【０１５３】
アクリジンに対する抗体の検出（第２段階）：ヒトＳ−３０３ ＲＢＣを、オリジナル処理プロセス（０．２μＭ Ｓ−３０３、２ｍＭのＧＳＨ）を用いて試験試薬として調製した。ＲＢＣを血液バンク生理食塩水（ＢＢＳ，Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で３回洗浄し、ＢＢＳ中でおよそ４％ヘマトクリットまで希釈した。第ＶおよびＶＩ群のウサギ由来の血清をＢＢＳ中で連続希釈した。２５μｌの４％ＲＢＣを１５μｌのウサギ血清と合わせ、３０分間３７℃でインキュベートさせた。陰性対照には、血清の代わりにＢＢＳを使用した。インキュベーション後、ＲＢＣをＢＢＳ中で３回洗浄し、次いで、ＢＢＳ中で１：６４に希釈したＦＩＴＣ コンジュゲートヤギＦ（ａｂ’）_２抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）（Ｃａｌｔａｇ）５０μｌ中に再懸濁した。ＲＢＣを３０分間３７度（ｏＣ）でインキュベートし、ＢＢＳで３回洗浄した。次いで、試料を１ｍｌのＨａｅｍａＬｉｎｅ−２（ＨＬ２，Ｓｅｒｅｎｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）に再懸濁した。試料を、結合抗体複合体を検出するＦＬ１チャネルを用いてＦＡＣＳによって解析した。
【０１５４】
ＲＢＣ輸液およびＲＢＣ寿命の測定：ＲＢＣを、耳の静脈から１ｍＬ／分で、輸血ポンプを用いて静脈内投与した。第１段階では、ウサギに１０ｍＬのＲＢＣ／ｋｇを投与したが、第２段階では、ウサギに４ｍＬのＲＢＣ／ｋｇを投与した。１０ｍＬ／ｋｇ用量は、鎌状赤血球およびサラセミア（ｔｈａｌｌａｓｅｍｉａ）患者のためのレジメンで１ヶ月に輸血される血液のおよその量に相当する。
【０１５５】
Ｓ−３０３またはＳ−２２０いずれかでの処理後、ＲＢＣのビオチン化を行なった。ＲＢＣ（３００ｍＬ）を、２００ｍＬのＰＢＳＧ（１２ｍＭリン酸塩，１３８ｍＭ ＮａＣｌ，２．７ｍＭ ＫＣｌ，５ｍＭグルコース，ｐＨ７．４）で２回洗浄し、同じ培地中に再懸濁した。次いで、これを６０μＭ ＮＨＳ−ビオチン（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）を含有する等容量のＰＢＳＧと混合し、１時間３７℃でインキュベートした。インキュベーション後、これを２００ｍＬのＰＢＳＧで３回洗浄し、最後に、ＰＢＳＧ中に５０％ヘマトクリットで再懸濁し、輸血まで冷蔵保存した。
【０１５６】
ＲＢＣの寿命をＦＡＣＳｃａｎ解析によって評価した。輸血後、一定間隔（１、３、７、１５、２１および２８日間）ですべての動物からウサギ血液を採取した。試料を８０ミクロンフィルターに通して微小物質（ｍｉｃｒｏｃｌｏｔ）を除去し、ＰＢＳＧ中０．０７％ＨＣＴに希釈した。フィコエリトリン標識ストレプトアビジン（１：１００希釈度，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）とともに暗所で室温にて２０分間インキュベートした。５倍希釈した試料に対してＦＡＣＳ解析を行ない、正確な細胞定量を可能にするため、４００事象／秒の速度で合計５０，０００事象を収集した。ビオチン化ＲＢＣの寿命を、第０日の１００％回収に外挿することにより算出した。次いで、以降の日の値を第０日の値のパーセントで示した。適宜、寿命の差の統計的有意性を、Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ−検定を不均一分散（ｈｅｔｅｒｏｓｋｅｄａｓｔｉｃ）解析とともに用いて解析した。
【０１５７】
Ｂ．第１段階：ミスマッチＲＢＣの反復輸液
第１段階において、Ｓ−３０３ ＲＢＣに対する応答が検出され得るか否かを調べるため、動物に、ＨｇＤ遺伝子座がミスマッチの同種ＲＢＣを１０ｍＬ／ｋｇで、隔週で２４週間輸血した。動物のコホートを表１９に記載する。
【０１５８】
（表１９．第１段階における動物のコホート）
【０１５９】
【表１９】

血清試料を、１週間隔で採取し、フローサイトメトリー系アッセイにおいて抗アクリジン抗体の存在について試験した。簡単には、オリジナルプロセス（０．２ｍＭのＳ−３０３および２ｍＭのＧＳＨ）によって調製したヒトＳ−３０３ ＲＢＣを、１：４希釈度のウサギ血清とともにインキュベートした。洗浄後、結合したウサギ抗体の存在を、ＦＩＴＣで標識したヤギ抗ウサギＩｇＧを用いて検出した。陽性結果のみが１：４希釈度の第３群において検出された。２４週間にわたる輸液の結果を図１に示す。ＫＬＨ−アクリジンで免疫処置した動物は、ロバストな抗アクリジン抗体応答を示した。対照的に、オリジナルプロセスによって調製したＳ−３０３またはＳ−２２０ ＲＢＣで反復輸血した動物では、有意な抗体応答はなかった。
【０１６０】
図１に示す結果を、ほとんどの血清試料について、オリジナルプロセスで処理したヒトＳ−３０３ ＲＢＣを用いた凝集アッセイを行なうことにより確認した。ＫＬＨ−アクリジンで免疫処置した第３群動物由来の血清のみ、ヒトＳ−３０３ ＲＢＣを凝集させることが示された。また、本発明者らには、いずれのレシピエント動物でも抗ＨｇＤ応答は観察されなかった。
【０１６１】
Ｃ．第２段階：ＫＬＨ−アクリジンで免疫処置したウサギにおけるＲＢＣ寿命の測定
Ｓ−３０３またはＳ−２２０で処理した抗原−ミスマッチＲＢＣ調製物の反復輸液では、抗アクリジン免疫応答が生じなかったため、第２段階では、よりストリンジェントなアプローチを採用して抗アクリジン抗体を惹起した。アジュバントを含めた慣用的な初回免疫刺激／追加免疫レジメンを用いて、動物をＫＬＨ−アクリジンで免疫処置し、次いで、ウサギにおける種々の処理済みＲＢＣ調製物のインビボ寿命または高力価抗体を測定した。第１段階の結果は、ＫＬＨ−アクリジンでの皮下免疫処置によりウサギを免疫処置し、高い抗体力価を得ることは実現可能であることを示した。
【０１６２】
また、第２段階では、第１、２および４群における動物を用いた。これらの群をさらに群分けし、亜群の動物をＫＬＨ−アクリジンで免疫処置し、残りは、その既存の輸血レジメンで維持した。いずれの型のＲＢＣ輸液も受けていないＨｇＤ−陰性ウサギの２つのさらなるコホートを第２段階で加えた。第２段階の実験コホートについて表２０に記載する。
【０１６３】
（表２０．第２段階における動物のコホート）
【０１６４】
【表２０】

免疫処置中、第２段階では、抗体産生を、第１段階で用いたものと同じＦＡＣＳおよび凝集アッセイによって毎週追跡した。およそ８週間後、ＫＬＨ−アクリジンで免疫処置したウサギはすべて、ヒトＳ−３０３ ＲＢＣに特異的な強い抗体応答を示したが、種々のＲＢＣ調製物で免疫処置した動物由来の血清は非反応性状態が継続された。
【０１６５】
第ＶおよびＶＩ群由来の血清における抗アクリジン抗体力価を測定した。フローサイトメトリー解析を用い、第ＶおよびＶＩ群の第１回輸血前（オリジナルプロセスでのＲＢＣ）および第２回輸血前（改良プロセスでのＲＢＣ）動物由来の血清試料を滴定した。第Ｖ群動物にはＳ−３０３で処理したＲＢＣを与え、一方、第ＶＩ群の動物には、Ｓ−２２０処理ＲＢＣを輸血した。
【０１６６】
力価を、平均蛍光がバックグラウンドより上である希釈度の血清と定義した。すべてのウサギが高力価の抗アクリジン抗体を有した。第Ｖ群の力価は、第１回輸血前（「Ｐｒｅ−Ｔ１」）に採取した血清において、第２回輸血前（「Ｐｒｅ−Ｔ２」）と比べてわずかに低かった。第ＶＩ群での力価は、どちらの輸血前でも同じであった。
【０１６７】
（表２１．第１回輸血および第２回輸血前の平均終点力価／群）
【０１６８】
【表２１】

いったんＫＬＨ−アクリジン免疫処置による血清抗体が確認されたら、種々のＲＢＣ調製物のインビボ寿命を調べるために各動物に輸血した。ビオチン標識を用い、ＲＢＣのインビボ循環を追跡した（ＳｕｚｕｋｉおよびＤａｌｅ（１９８７）Ｂｌｏｏｄ ７０：７９１−５）。ＮＨＳ−ビオチンは、ＲＢＣ膜タンパク質に対する共有結合を形成し、蛍光標識されたストレプトアビジンを用いて検出され得る。ウサギには、表２２のスキームに従って、およそ４ｍＬのＲＢＣ／ｋｇを与えた。第０日の輸血後、第１、３、７、１５、２１および２８日に血液を採取し、第０日と比べたときの循環ビオチン標識細胞の割合を測定した。試験ＲＢＣは、表２２に示すように、未処理対照ＲＢＣ、オリジナルもしくは改良手順を用いて調製したＳ−３０３ ＲＢＣ、またはオリジナルまたは改良手順を用いて調製したＳ−２２０ ＲＢＣのいずれかであった。
【０１６９】
（表２２．動物のコホートのＲＢＣ寿命を測定するための輸血）
【０１７０】
【表２２】

＊ すべてのＲＢＣ調製物は、輸液前にビオチン標識した
オリジナルプロセスによって調製されたＲＢＣの寿命：対照ＲＢＣの生存を、非免疫ウサギおよびアクリジン免疫ウサギ（それぞれ、亜群ＩＡおよびＩＢ、表２１）において測定した。これらの亜群間でＲＢＣの寿命に差が無かったため、データを、以下にグラフにより、４匹すべての動物を合わせて平均回収パーセントとして示す。対照ＲＢＣを与えた動物を、その他のすべての群に対する比較対象として使用した。
【０１７１】
第４および６群には、オリジナルプロセスによって調製したＳ−２２０ ＲＢＣを第１回輸血で与えた。Ｓ−２２０は、ハプテン形成の「最悪ケース」であるため使用した。アクリジンは、インビトロ処理中または後のインビボ循環中のいずれにおいても加水分解され得ない。第４Ａおよび４Ｂ群には、試験の第１段階でオリジナルＳ−２２０ ＲＢＣを輸血しているが、第６群は、Ｓ−２２０ ＲＢＣ未処理とした（表２０）。動物の免疫処置履歴に依存して、オリジナルＳ−２２０ ＲＢＣの寿命に著しい差があった（図２）。対照ＲＢＣを与えた第１群の動物は最も長いＲＢＣ寿命を有し、ビオチン化ＲＢＣが第５７日に循環中に検出され得た。対照ＲＢＣクリアランスは、時間とともにほぼ線形であった。対照的に、ＫＬＨ−アクリジンで免疫処置し、Ｓ−２２０ ＲＢＣを一度も輸血していない第６群は、オリジナルＳ−２２０ ＲＢＣの急速なクリアランスを示した。本質的に、Ｓ−２２０ ＲＢＣは、第２０日に検出可能でなかった。これは、ＫＬＨ−アクリジン手順によって免疫処置したが、第６群とは異なり、第１段階でオリジナルＳ−２２０ ＲＢＣも反復的に輸血した第４Ｂ群のウサギが、有意に長いＲＢＣ生存を示したことを示す。それにもかかわらず、第４Ｂ群でのオリジナルＳ−２２０の寿命は、第４Ａ群（ＫＬＨ−アクリジンで免疫処置しなかった）と比べて短かった。第１群（対照ＲＢＣを与えた）および第４Ａ群（オリジナルＳ−２２０ ＲＢＣを与えた）で測定されたＲＢＣ寿命は同程度であったが、第１群において、より多くの割合の対照ＲＢＣが、３週間を超えて循環していた。
【０１７２】
第２Ａ、２Ｂおよび５群において、オリジナルＳ−３０３ ＲＢＣの寿命を測定することにより同様の比較を行なった（図３）。最も短い寿命は、ＫＬＨ−アクリジンに対して免疫処置し、Ｓ−３０３ ＲＢＣ未処理とした第５群のウサギのＳ−３０３ ＲＢＣで観察された。しかしながら、第６群とは異なり、オリジナルＳ−３０３ ＲＢＣは、第２０日までにクリアランスされず、ビオチン化Ｓ−３０３ ＲＢＣが第５７日まで検出され得た。興味深いことに、高レベル循環抗アクリジン抗体を有した第２Ｂ群のウサギでのオリジナルＳ−３０３ ＲＢＣの寿命は、対照ＲＢＣを与えた第１群と、測定され得る程度には異ならなかった。第２Ｂ群と第５群のウサギの結果の比較において、オリジナルＳ−３０３ ＲＢＣへの事前曝露によって、ＲＢＣクリアランスに対する抗アクリジン抗体の効果が改善されたと思われる。この予期しない結果は、オリジナルＳ−２２０ ＲＢＣを用いた第４Ｂおよび６群で観察されたものと類似する（図２）。
【０１７３】
改良プロセスによって調製されたＲＢＣの寿命：改良プロセスは、多数のパラメータを変更することにより、ＧＳＨによるクエンチングを改善するために開発した。第１に、ＧＳＨの量を１０倍増加させた。第２に、ＧＳＨを、ＲＢＣへの添加前にＮａＯＨで滴定した。これにより、−ＳＨ基の求核性が改善される。このような変更により、ＲＢＣ表面に結合したＳ−３０３の有意な低減がもたらされる（例えば、実施例５および実施例１３を参照）。改変Ｓ−２２０ ＲＢＣを、同じアプローチを用いて調製した。
【０１７４】
改変Ｓ−２２０ ＲＢＣの寿命を、第４Ａ、４Ｂおよび６群において評価した（図４）。オリジナルプロセスにより調製したＳ−２２０ ＲＢＣで先に観察されたように、第６群動物での改変Ｓ−２２０ ＲＢＣの寿命は、第１群の動物に輸血された対照ＲＢＣと比べ、有意に低減された。しかしながら、経時的な改変Ｓ−２２０ ＲＢＣの循環の減少は、オリジナルＳ−２２０ ＲＢＣを用いた同じ動物で観察されたものより有意に少なかった。例えば、改変ＲＢＣは平均１８パーセントが第１４日に循環していたが、オリジナルＲＢＣは、同じ時点で１．４％のみが観察された。また、第４Ａ群（抗体なし）および第４Ｂ群（ＫＬＨ−アクリジン誘導抗体）における改変Ｓ−２２０ ＲＢＣの寿命は、第１群の対照ＲＢＣと同等またはより良好であった。先のデータ（図３）と一致して、オリジナルＳ−２２０ ＲＢＣに対する事前曝露により、高力価抗体の存在下であっても、Ｓ−２２０ ＲＢＣの寿命が延長されたと思われる。
【０１７５】
最後に、第２Ａ、２Ｂおよび５群における改変Ｓ−３０３ ＲＢＣの寿命を図５に示す。すべての場合で、改変Ｓ−３０３ ＲＢＣの寿命は対照ＲＢＣと同等であった。これは、オリジナルＳ−３０３ ＲＢＣのクリアランスの増大を示した第５群の動物であってもそうであった。この重要なデータは、改良プロセスによって調製されたＳ−３０３−処理済みＲＢＣが、いくつかの供給源から誘導された抗アクリジン抗体とインビトロで免疫反応性でないというインビトロ所見を支持する。これには、患者血清、マウスモノクローナル抗体、およびウサギポリクローナル抗血清が挙げられる。
【０１７６】
実施例１３
Ｓ−３０３処理ＲＢＣのさらなるＦＡＣＳｃａｎ解析
ＲＢＣをＳ−３０３（ＰＩＣ−１）結合について試験するフローサイトメトリーのため、５０μＬの血液を１．２ｍＬの０．９％生理食塩水中で３回洗浄し、次いで、０．７５ｍＬ生理食塩水中におよそ４％ヘマトクリットまで再懸濁した。２５μＬのＲＢＣを、１：１００に希釈した抗アクリジンウサギ血清１５μＬと合わせた。３０分間３７℃でインキュベーション後、試料を上記のようにして３回洗浄した。次いで、ＲＢＣペレットを、０．１％ウシ血清アルブミン中１：６４の希釈度で調製したＦＩＴＣ標識ヤギ抗ウサギ抗体（Ｃａｌｔａｇ）５０μＬ容量中に再懸濁した。試料を暗所で３０分間３７℃にてインキュベートした。さらに３回洗浄後、ＲＢＣを１ｍＬのＨａｅｍａＬｉｎｅ−２（Ｓｅｒｏｎｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）中に再懸濁した。０．０１％ヘマトクリットに希釈後、２０，０００事象を収集し、６００ｎｍでの蛍光について解析した。
【０１７７】
改良プロセスでは、フローサイトメトリーアッセイを用いて検出したとき、ＲＢＣ表面に対するＳ−３０３結合が有意により低いレベルになる。ＲＢＣに結合されたＳ−３０３は、ウサギをアジュバントとともにＫＬＨ−アクリジンコンジュゲートで免疫処置することにより作製したポリクローナルウサギ抗血清を用いて検出した。次いで、結合ウサギＩｇＧを、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧを用いて検出した。ＦＡＣＳｃａｎの結果を、オリジナルおよび改良プロセスを用いて調製した９個の個々のＲＢＣプールについて図６に示す。各プールについて、ＦＡＣＳｃａｎアッセイを用いてＣ−ＲＢＣ、Ｏ−ＲＢＣおよびＭ−ＲＢＣに対するＳ−３０３結合を検出した。ＲＢＣ表面に対するＳ−３０３の結合は、オリジナルプロセスと比べ、改良プロセスによって１５〜３５倍低減された。
【０１７８】
本明細書に記載した実施例および実施形態は、例示の目的にすぎないこと、およびこれに鑑みた種々の修正または変更は、当業者に示唆され、本出願の精神および範囲内に含まれるものとすることを理解されたい。
【０１７９】
本明細書で挙げたすべての刊行物、特許、特許出願および受託番号（ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの両方の配列を含む）は、引用によりその全体が、個々の各刊行物、特許、特許出願または受託番号が引用により組み込まれて具体的かつ個々に示されているのと同程度に、あらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【公開番号】特開２０１２−１０７０６８（Ｐ２０１２−１０７０６８Ａ）
【公開日】平成２４年６月７日（２０１２．６．７）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１２−５０８３７（Ｐ２０１２−５０８３７）
【出願日】平成２４年３月７日（２０１２．３．７）
【分割の表示】特願２００７−５３９２８１（Ｐ２００７−５３９２８１）の分割
【原出願日】平成１７年１０月３１日（２００５．１０．３１）
【出願人】（５０５２９７０２４）シーラス　コーポレイション (10)
【Ｆターム（参考）】