赤血球生成の強化に係わる化合物とその方法
本発明は、赤血球生成を強化する化合物と、その方法とに関する。化合物は、下記式（Ｉ）で表される化学構造を有し、式中、Ｒは、グリコシル基を示す。
【化１】
又、式（Ｉ）で表される化合物は、赤血球生成を強化する効果を有することに加え、エリトロポイエチン生成を強化し、腎機能と肝細胞増殖因子の発現を増強する。更に、本発明は、有効量の式（Ｉ）で表される化合物を、それを必要とする対象に投与することで、赤血球生成を強化する方法に関する。
【化１】
又、式（Ｉ）で表される化合物は、赤血球生成を強化する効果を有することに加え、エリトロポイエチン生成を強化し、腎機能と肝細胞増殖因子の発現を増強する。更に、本発明は、有効量の式（Ｉ）で表される化合物を、それを必要とする対象に投与することで、赤血球生成を強化する方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、赤血球生成に係わるものであり、特に、赤血球生成の強化に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、慢性進行性腎障害（Chronic Kidney Disease、以下ＣＫＤと略称する）は、世界規模の公衆衛生問題の一つであり、腎不全、心血管疾患及び早期死亡などの不利益を結果的にもたらすことが知られている（Levey、２００５年）。ＣＫＤ患者は、腎臓病の末期に進行する非常に高いリスクを抱え、生命を長く維持するためには、腎臓透析や腎臓移植などを行う必要がある。ＣＫＤの初期症状の一つとして貧血（Anemia）が挙げられるが、それは腎臓の内因性エリトロポイエチン（erythropoietin、以下Ｅｐｏと略称する）の生産不足によることが報告されている（Zarzeckiら、２００４年）。更に、ＣＫＤに加え、貧血は、例えば、ガン、急性及び慢性感染症、自己免疫症、炎症、そして臓器移植後の慢性拒絶反応などのその他の疾患をも伴うことが知られている（Weiss及びGoodnough、２００５年）。
【０００３】
Ｅｐｏは、主として成人の腎臓と胎児の肝臓において生成される糖たんぱくホルモンであり、細胞表面のエリトロポイエチンレセプタ（以下Ｅｐｏレセプタと略称する）と結合することによって、その効果を発揮するものである。細胞が相対的に低い酸素レベルを感じた場合（例えば、低酸素症）、Ｅｐｏが生産・放出され、赤血球系細胞の増殖、分化、成熟、生存などを調整する（Moritzら、１９９７年。Fisher、２００３年）。血流中におけるＥｐｏレベルの異常は、恐らくは骨髄症及び腎臓病の指標であると言われている。相対的に低いＥｐｏレベルを示すことが、ＣＫＤ、原発性真性赤血球増加症及び化学療法誘発性貧血症の患者に見られ、又、相対的に高いＥｐｏレベルを示すことが、続発性赤血球増加症及び腎臓ガンの患者に見られることが報告されている（EckardtとKurtz、２００５年。Hodgesら、２００７年）。
【０００４】
腎臓と肝臓組織において生産される以外に、Ｅｐｏとそのレセプタは、脳、目、心臓、肺臓、腸、膵臓、筋肉、子宮及び生殖腺を含む非赤血球系の組織及び器官中において発見されている（Eckardt及びKurtz、１９９２年）。Ｅｐｏ−Ｅｐｏレセプタシグナル伝達は、創傷癒合反応、脈管形成、そして例えば神経保護、心臓血管保護、並びに組織虚血及び虚血／再潅流傷害などに係わる局所性組織保護機能に貢献することが知られている（Paschosら、２００８年。Arcasoy、２００８年）。又、Ｅｐｏは、腎機能障害の程度を軽減し、シスプラチン誘発性急性腎不全からの回復を促進するという腎臓保護効果を有することが報告されている（Ｓepodesら、２００６年。Arcasoy、２００８年）。
【０００５】
赤血球生成促進剤（Erythropoiesis-stimulating agents、以下ESAsと略称する）は、治療反応性の貧血を抱える患者におけるＣＫＤの貧血に対する治療薬として、米国国立腎臓財団のガイドライン「Kidney Disease Outcomes Quality Initiative」により推奨されている。遺伝子組換えヒトＥｐｏ（Recombinant human Epo（rHuEpo））は、ＣＫＤの貧血症、化学療法を受けたガン患者の貧血症の治療、手術中の輸液需要の低減、及びヒト免疫不全ウイルスに感染したジドブジン治療患者の貧血症の治療のために使用されることが認められている。新規な赤血球生成刺激タンパク質（novel erythropoiesis-stimulating protein（NESP））は、比較的長いプラズマ半減期を有するＥｐｏによりデザインされ、慢性腎不全の貧血症の治療のために使用されることが認められている（Fisher、2003年）。これらのＥＳＡｓは、維持療法のために、週に１回以上静脈内（i.v.）又は皮下（s.c.）投薬することが推奨されているが、痛み、頻回注射の不便性、ｒＨｕＥｐｏを伴う固有の抗原性による抗Ｅｐｏ抗体の発生などが大きな関心を呼んでいる（Bunn、2007年）。それのみならず、ＥＳＡｓは、比較的高いヘモグロビンレベルの患者に安全上のリスクをもたらし、例えば、高血圧症、血栓塞栓症、鉄缺乏症、重度の赤芽球癆などの合併症の誘因となる可能性がある（Wish及びCoyne、2007年）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、上述した欠陥や不備に対処するというこれまで対処されてこなかった必要性が、当技術分野に、特に赤血球生成と腎機能に関する技術分野において存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一つの態様において、本発明は、下記式（Ｉ）で表される化合物を用いて、エリトロポイエチンの生成を強化する薬剤の製造に使用することに関し、
【化１】
【０００８】
[式中、Ｒは、グリコシル基を示す。]その使用法として、治療上有効な量の当該薬剤を投与することが含まれる。
【０００９】
前記グリコシル基は、ジヒドロキシアセトン、グルコース、ガラクトース、グリセリンアルデヒド、トレオース、キシロース、マンノース、リボース、リブロース、キシルロース、タガトース、プシコース（アルロース）、フラクトース、ソルボース、ラムノース、エリトロース、エリトルロース、アラビノース、リキソース、アロース、アルトロース、グロース、イドース及びタロースからなる群より選ばれる一つのモノサッカリド（単糖）である。
【００１０】
上記式（Ｉ）で表される化合物は、骨髄、肝臓、腎臓及びその任意の組合せからなる群より選ばれる組織及び／又は器官に、エリトロポイエチン生成を強化するために投与される。
【００１１】
他の態様において、本発明は、上記式（Ｉ）で表される化合物を、エリトロポイエチン治療が有効な疾患及び／又は障害の治療に用いる薬剤の製造に使用することに関する。その使用法として、治療上有効な量の当該薬剤を、それを必要とする対象に投与することが含まれる。
【００１２】
前記疾患及び／又は障害として、貧血症、腎不全及び赤血球生成欠損関連疾患からなる群より選ばれる少なくとも一つである。
【００１３】
前記疾患及び／又は障害は、エリトロポイエチン関連保護効果が有効なものである。
【００１４】
前記エリトロポイエチン関連保護効果としては、神経保護、心血管保護及び腎臓保護効果、並びに組織虚血及び虚血／再潅流障害からの保護からなる群より選ばれる少なくとも一つである。
【００１５】
さらに他の態様において、本発明は、上記式（Ｉ）で表される化合物を、赤血球生成を強化する薬剤の製造に使用することに関する。その使用法として、治療上有効な量の当該薬剤を、それを必要とする対象に投与することが含まれる。
【００１６】
さらに態様において、本発明は、上記式（Ｉ）で表される化合物を、腎機能を強化する薬剤の製造に使用することに関する。その使用法として、治療上有効な量の当該薬剤を、それを必要とする対象に投与することが含まれる。
【００１７】
さらに他の態様において、本発明は、上記式（Ｉ）で表される化合物を、肝細胞増殖因子の発現を増強する薬剤の製造に使用することに関する。その使用法として、治療上有効な量の当該薬剤を、それを必要とする対象に投与することが含まれる。
【００１８】
さらに他の態様において、本発明は、上記式（Ｉ）で表される化合物を、肝細胞増殖因子治療が有効な対象における疾患及び／又は障害を治療する薬剤の製造に使用することに関する。その使用法として、治療上有効な量の当該薬剤を、それを必要とする対象に投与することが含まれる。
【００１９】
態様において、本発明は、上記式（Ｉ）で表される化合物を、肝細胞増殖因子の発現を調整することにより疾患及び／又は障害を治療する薬剤の製造に使用することに関する。その使用法として、治療上有効な量の当該薬剤を、それを必要とする対象に投与することが含まれる。
【００２０】
前記疾患及び／又は障害としては、肝疾患、腎疾患、肺疾患、心血管疾患、消化器疾患、神経疾患、骨疾患、関節疾患、筋疾患、皮膚疾患、圧挫症候群、アレルギー性炎症及びこれらの任意の組合せからなる群より選ばれる少なくとも一つである。
【００２１】
前記肝疾患としては、急性肝炎、肝硬変、劇症肝炎及び脂肪肝、並びに肝臓移植、局部切除及び虚血のための外科処置からなる群より選ばれる少なくとも一つである。
【００２２】
前記腎疾患としては、腎線維症、急性腎不全、慢性腎不全及び糖尿病性ネフロパシー、並びに腎臓移植及び虚血のための外科処置からなる群より選ばれる少なくとも一つである。
【００２３】
前記慢性腎不全としては、腎炎症候群及び閉塞性ネフロパシーより選ばれる少なくとも一つである。
【００２４】
前記肺疾患としては、急性肺炎及び肺線維症、並びに肺臓移植、局所切除及び虚血のための外科処置からなる群より選ばれる少なくとも一つである。
【００２５】
前記心血管疾患としては、炎症媒介性心臓疾患、狹心症、心筋梗塞症、心筋症及び閉塞性動脈硬化症からなる群より選ばれる少なくとも一つである。
【００２６】
前記炎症媒介性心臓疾患としては、心臓同種移植片拒絶反応及び心筋炎が含まれる。
【００２７】
前記消化器疾患としては、腸粘膜障害、炎症性腸疾患、胃潰瘍及び真性糖尿病からなる群より選ばれる少なくとも一つである。
【００２８】
前記神経疾患としては、脳血管性疾患、神経変性疾患、脊髄障害、糖尿病性網膜障害、末梢神経障害、脊柱管挟窄症及び聴覚消失症（難聴）からなる群より選ばれる少なくとも一つである。
【００２９】
前記脳血管性疾患としては、一過性脳虚血発作及び脳卒中の少なくとも一つである。
【００３０】
前記神経変性疾患としては、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー症及びパーキンソン症からなる群より選ばれる少なくとも一つである。
【００３１】
前記骨疾患及び関節疾患としては、変形性関節症及び／又はリウマチ性関節炎が含まれる。
【００３２】
前記筋疾患としては、筋ジストロフィー及び／又は筋萎縮症が挙げられる。
【００３３】
前記皮膚疾患としては、皮膚潰瘍、熱傷及び強皮症からなる群より選ばれる少なくとも一つである。
【００３４】
本発明の上記及びその他の態様は、添付図面を含む下記の好ましい実施形態の説明から更に明瞭となる。本発明の新規な概念の主旨と範囲から逸脱しないかぎり、更に種々の変更や修正を行うことができる。
【００３５】
添付図面は、本発明の一つ又は一つ以上の実施形態を説明するものであり、そこに書かれた説明と共に本発明の原理を説明する。又、ある実施形態の同一または同様の構成要素を示すために、できる限り同じ参照番号を図面を通して使用する。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１は、化合物Ａによる骨髄細胞中のヘモグロビンレベルの強化を示す。
【図２】図２は、骨髄細胞のバースト形成ユニット−赤血球（ＢＦＵ−Ｅと略称する）分析を用いた、化合物Ａによる赤血球前駆細胞増殖の活性化を示す。
【図３】図３は、腎臓組織内における化合物Ａによるエリトロポイエチン（Ｅｐｏ）発現の増大を示す。
【図４】図４は、肝細胞内における化合物Ａによるエリトロポイエチン（Ｅｐｏ）の発現の増大を示す。
【図５】図５は、シスプラチン誘発急性腎不全動物モデルにおける化合物Ａによる赤血球数の増大を示す。
【図６】図６は、シスプラチン誘発急性腎不全動物モデルにおける化合物Ａによる血液の尿素態窒素レベルの減少を示す。
【図７】図７は、シスプラチン誘発急性腎不全動物モデルの第２３日目における化合物Ａによる赤血球数の増大を示す。図面中、水平方向の矢印は、化合物Ａ治療（ｍｇ／Ｋｇ／ｄａｙ）を示す。
【図８】図８は、シスプラチン誘発急性腎不全動物モデルの第２３日目における化合物Ａによる血液の尿素態窒素レベルの減少を示す。図面中、水平方向の矢印は、化合物Ａ治療（ｍｇ／Ｋｇ／ｄａｙ）を示す。
【図９】図９は、シスプラチン誘発急性腎不全動物モデルにおける化合物Ａによるエリトロポイエチン（Ｅｐｏ）の発現の増大を示す。図面中、水平方向の矢印は、化合物Ａ治療（ｍｇ／Ｋｇ／ｄａｙ）を示す。
【図１０】図１０は、シスプラチン誘発急性腎不全動物モデルにおける化合物Ａによる肝組織内の肝細胞増殖因子（hepatocyte growth factor、以下、ＨＧＦと略称する）の発現の増大を示す。図面中、水平方向の矢印は、化合物Ａ治療（ｍｇ／Ｋｇ／ｄａｙ）を示す。
【図１１】図１１は、シスプラチン誘発急性腎不全動物モデルにおける、骨髄細胞のバースト形成ユニット−赤血球（ＢＦＵ−Ｅ）分析により測定した、化合物Ａによる赤血球前駆細胞増殖の活性化を示す。図面中、水平方向の矢印は、化合物Ａ治療（ｍｇ／Ｋｇ／ｄａｙ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
［定義］
本明細書に使用された術語は、通常、本発明の明細書の文脈と、それぞれの術語が用いられた特殊な文脈とにおいて、本発明の技芸における一般的な語義を有する。本発明の説明に使用された若干の術語について、以下又は本明細書中の他の箇所において、当業者のために本発明の記述に係わる追加的な説明が行われる。便宜上、若干の術語は、例えばイタリック体及び／又は括弧を使用して強調することも有り得る。しかし、そのことはその術語の範囲や語義に何ら影響を与えるものではない、即ち、同様の文脈においては、強調の有無に関わらず、同様の範囲や語義を示すものである。同様のことが一つ以上の方法により表現され得ることが理解できるであろう。その結果、代替言語と同義語が、本発明において論述される任意の一つ又は多くの術語として使用され、そしてまた、ある術語が本明細書において詳述または論述されたかどうかに応じて特別な意味を付与されることもない。若干の術語について同義語が用意される。一つ又は一つ以上の同義語が多用されることは、他の同義語を用いることを排除することを意味しない。本明細書において論述される任意の術語の実例を含む本明細書の全ての実例は、例示的に用いられるものに過ぎず、本発明または任意の実例による術語の意義と範囲を限定するものではない。同様に、本発明は本明細書中に示された様々な実施形態に限定されない。
【００３８】
特に定義されない限り、本明細書中に使用されるすべての科学的、技術的用語は、本発明が属する技術分野において、通常の知識を有する者によって一般的に理解されているものと同様の語義を示すものである。もし競合がある場合、与えられる語義については本明細書において統制される。
【００３９】
本明細書において使用される「ぐらい」、「ほぼ」又は「おおよそ」の語義は、通常、示された値の２０％範囲内、好ましくは１０％範囲内、更に好ましくは、５％範囲内を表わすものである。本明細書中、特に説明のない限り、示される数値はおおよその値であり、その語義は上記の「ぐらい」、「ほぼ」又は「おおよそ」の値として推定すべき値を示す。
【実施例】
【００４０】
以下、本発明の実施形態により模範的な器具、装置、方法及びそれに関連する結果を示すが、本発明はそれらに限定されるものではない。又、実施例において、読者のために便宜上、表題又は副題を記載しているが、これも本発明を制約するものではない。さらに、本発明においていくらかの理論を提議且つ開示しているが、それらが正しいか否かを問わず、本発明が特定の理論あるいは処置の仕組みを考慮せずに本発明の開示内容に従って実施されるかぎり、そうした理論は本発明の範囲を限定するものではない。
【００４１】
実施例１
化合物Ａの精製
乾燥したPolygonum multiflorumを２Ｋｇ用い、粉砕機で粉砕し、その粉砕物を２Ｌの８５％（ｖ／ｖ）エタノールに一夜浸漬し、反応液を調製する。反応液を収集し、残渣に上記の操作に従って、更に別の２Ｌの８５％（ｖ／ｖ）エタノールを加えて抽出を３回くり返す。これら反応液を収集し、ガス抽出器（ワットマン＃１濾紙を使用）により、収集された溶液を濾過し、次に、ロータリーエバポレーター（Ｂｕｃｈｉ社）を用い、４０℃下、容積計６分之１迄濃縮する。濃縮した濾液を集め、ｎ−ヘキサン／水＝１：１を用いて５回分液する（総量５L）。水相を集め、酢酸エチル溶液（ＥｔＯＡＣ／水＝１．１）を用いて、更に６回分液して（総量６．５L）、酢酸エチル溶液層を得る。これら６回分の酢酸エチル層を合併し濃縮する。これにより得た濃縮物を凍結乾燥機（台湾Kingmech社）により乾燥して酢酸エチル抽出物を得る（以下、PoMuEPeと称する）。このPoMuEPeを、ダイヤイオンＨＰ−２００のカラム（４．８×６０ｃｍ、日本三菱化学社）を用い、メタノール／水＝５０：５０の溶媒系により、流速２ｍｌ／ｍｉｎ下で、クロマトグラフィを行う。この分画液を集め、濃縮、乾燥、分析することにより、そのヘモグロビン生成強化能力を調べる。その活性を有する分画を集め、ＰｏＭｕＥＰｅＤ９と命名する。更に、ＰｏＭｕＥＰｅＤ９を、セファデクスTMＬＨ２０のカラム（２．６×１００ｃｍ、GE Healthcare Life Science社）を用い、メタノール／水＝１００：０溶媒系により、１ｍｌ／ｍｉｎの流速下で、クロマトグラフィを行う。これらの分画を集め、濃縮、乾燥、分析し、ヘモグロビン生成強化能力を調べ、生物活性を示す分画を集め、ＰｏＭｕＥＰｅＤ９Ｌ１１と命名した。
【００４２】
上記ＰｏＭｕＥＰｅＤ９Ｌ１１の主要成分について、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法（Bruker社）と液体クロマトグラフィ／質量分析法（ＬＣ／ＭＳ、Bruker社）によりその化学構造を決定した。上記主成分は、２，３，５，４'−テトラヒドロキシスチルベン２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドであることが確認され、化合物Ａと命名され、下記一般式（Ｉ）により表される。
【化２】
[式中、Ｒは、グルコシル基を示す。]
【００４３】
実施例２
化合物Ａはヘモグロビン生成を強化する
先ず、国立実験動物センター（ＮＬＡＣ、台湾）より試験用動物のＣ５７ＢＬ／６ＪＮａｒｌマウス（８〜１０週齢）を購入し、投与量１００ｍｇ／ｋｇで、フェニルヒドラジン塩酸塩（シグマアルドリッチ社）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳと略称する）を単回の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射で投与することにより急性溶血性の貧血症を誘発する。注射後６日目に、骨髄細胞をマウスより分離し、Worthingtonら（１９８７年）とRosenthalら（１９８７年）記載の方法を若干修正した方法により培養した。細胞懸濁液は、１％（ｖ／ｖ）ボビン血清アルブミン（ＢＳＡ、シグマアルドリッチ社）、７．５μｍの２−メルカプトエタノール（シグマアルドリッチ社）、１．４ｍＭのＬ−グルタミン（シグマアルドリッチ社）、１０μｍの塩化鉄（ＦｅＣｌ3、シグマアルドリッチ社）及び５０ｍＵ／ｍｌのＥＰＯ（レコーモンエポエチン、ロシュ社）を含むＭＥＭアルファ培地（α−ＭＥＭ、ギブコ社）中、ほぼ６×１０5細胞／ｍｌの濃度に調整される。この細胞を９６穴プレート（コスター社）におおよそ１．５×１０5細胞／ｗｅｌｌで播種し、５％炭酸ガスと９５％空気を含む加湿した培養器中、３７℃下で培養する。
【００４４】
次の日に、異なる濃度の化合物Ａ（０、０．１、０．５、２．５、１２．５及び２０μｇ／ｍｌ）を、前記細胞にそれぞれ添加し、更に４日間培養を続ける。次に、Ｋａｉｈｏ及びMizuno（１９８５年）並びにWorthington（１９８７年）らの方法に若干の修正を加えた方法により、ＤＡＦベースヘモグロビン比色法を用いて、相対的なヘモグロビンレベルを測定した。簡潔に説明すると、細胞をＰＢＳで洗淨し、ノニデットTMＰ４０（ＮＰ−４０、シグマアルドリッチ社）（０．０１％（ｖ／ｖ）、５０μｌ／ｗｅｌｌ）で、溶解させる。その後、細胞を４，５−ジアミノフルオレスセイン（ＤＡＦ、シグマアルドリッチ社）（１００μｇ／ｍｌ、１００μｌ／ｗｅｌｌ）と、３０％の過酸化水素（シグマアルドリッチ社）（６μｌ／ｗｅｌｌ）と共に５〜１０分間培養する。次に、ビクター２ １４２０マルチラベルカンター（ワラック、パーキンエルマー社）を用いて波長６１０ｎｍの吸光度を測定した。その結果を相対指数±標準誤差（ｎ＝６）で表示した。統計学的有意性は、スチューデントテスト（＊＊Ｐ＜０．０１ｖｓ対照群（０μｇ／ｍｌ））により評価した。この結果、化合物Ａは、ほぼ０．１〜２０μｇ／ｍｌの濃度でヘモグロビン生成を著しく強化することが明らかに示された（図１を参照）。
【００４５】
実施例３
化合物Ａは細胞培養中の赤血球前駆細胞を活性化する
赤血球前駆細胞における化合物Ａの効果を調べるために、Corazzaら（２００４年）とJinら（２００３年）の文献に記載の方法を若干修正して、バースト形成ユニット−赤血球（ＢＦＵ−Ｅ）分析を行った。簡潔に説明すると、国立実験動物センター（ＮＬＡＣ、台湾）より試験用動物のＣ５７ＢＬ／６ＪＮａｒｌマウス（６週齢）を購入し、このマウスより骨髄細胞を分離し、１５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（牛胎児血清、ギブコ社）、１％（ｖ／ｖ）ＢＳＡ（シグマアルドリッチ社）、０．８％（ｗ／ｖ）メチルセルロース（シグマアルドリッチ社）、１０μＭの２−メルカプトエタノール（シグマアルドリッチ社）、２Ｕ／ｍｌＥｐｏ（レコーモンエポエチン、ロシュ社）及び１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−３（シグマアルドリッチ社）を含有するα−ＭＥＭ中に、上記細胞を懸濁し、ほぼ８．３×１０4細胞／ｍｌ濃度の細胞懸濁液を調製する。この細胞を２４穴プレート（Ｆａｌｃｏｎ社）におおよそ７．５×１０4細胞／ｗｅｌｌで播種し、異なる濃度の化合物Ａ（０、０．１、０．５、２．５、１２．５μｇ／ｍｌ）をそれぞれ添加した後、５％炭酸ガス−９５％空気中、加湿した培養器において、３７℃下で９日間培養を続けた。コロニーは、３−（４，５−ジメチルチアゾル−２−イル）−２，５−ジフェニル−テトラゾリウムブロミド（５０μｇ／５０μｌ／ｗｅｌｌ）（ＭＴＴ；シグマアルドリッチ社）を用いて染色し、５０個以上の細胞群のコロニーが計上された際に、プレートの写真をとり、その結果を平均値±標準誤差（ｎ＝３）で表示した。統計学的有意性は、スチューデントテスト（＊Ｐ＜０．０５と**Ｐ＜０．０１ｖｓ対照群（即ち、濃度：０））により評価した。化合物Ａは、０．５〜１２.５μｇ／ｍｌの濃度範囲内において著しく骨髄細胞のＢＦＵ−Ｅコロニー数を増加させることが明らかになった（図２を参照）。この結果は、化合物Ａがヘモグロビン生成と赤血球前駆細胞を活性化することにより赤血球生成を強化することを示している。
【００４６】
実施例４
化合物Ａは腎臓のＥｐｏ発現を強化する
先ず、国立実験動物センター（ＮＬＡＣ、台湾）より試験用動物のＣ５７ＢＬ／６ＪＮａｒｌマウス（８〜１０週齢）を購入し、上記の方法を若干修正した方法（Parrishら、１９９５年。Obatomiら、１９９８年。De Kanterら、１９９９年）に基づき、マウスの腎スライスを準備する。簡潔に説明すると、マウスを頸椎脱臼により死亡させ、腎臓を摘出し、直ちに、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ＵＳＢ社）、１２８ｍＭ塩化ナトリウム（シグマアルドリッチ社）、２．５ｍＭ塩化ポタシウム（シグマアルドリッチ社）、２．７ｍＭ塩化カルシウム（シグマアルドリッチ社）、１ｍＭ塩化マグネシウム（シグマアルドリッチ社）及び１６ｍＭ Ｄ-グルコース（シグマアルドリッチ社）を含み且つ９５％の酸素と５％の炭酸ガスを充気した氷冷の無菌のKrebs-HEPES緩衝液（ｐＨ７．４）中に保存する。この腎臓はその被膜を皮質乳頭軸に対して垂直に剥離し、芯を抜く。次に、９５％の酸素と５％の炭酸ガスを充填した氷冷の無菌のＫｒｅｂｓ−ＨＥＰＥＳ緩衝液で満たしたミクロスライサー（D.S.K、microslicer、DRK1000、Dosaka ＥＭ社）において、腎スライス（２５０μｍ）を調製する。この腎スライスを集め、ガス（９５％の酸素と５％の炭酸ガス）を充填した氷冷の無菌のＫｒｅｂｓ−ＨＥＰＥＳ緩衝液中に氷上で保存する。この腎スライスは、調製後１０分間以内で実験に使用される。
【００４７】
腎スライスは、１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ＵＳＢ社）、２０ｍＭ炭酸水素ナトリウム（シグマアルドリッチ社）と５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（ギブコ社）を含むガス（９５％の酸素と５％の炭酸ガス）を充填した新鮮な培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ギブコ社／インビトロゲン社）を、１．０ｍｌ／ｗｅｌｌ当り、２４穴プレート（Falcon社）用いて、３７℃下、９５％の酸素と５％の炭酸ガスの雰囲気下の培養器中、９０〜１２０分間前培養を行った。その後、腎スライスを、異なる濃度の化合物Ａ（０、０．６、２．５、１０、４０及び１００μｇ／ｍｌ）と共にそれぞれ３７℃下、５０％の酸素、５％の炭酸ガス及び４５％の窒素ガス雰囲気下の培養器中で培養した。ＲＮＡ−ＢｅｅTMＲＮＡ分離溶媒（テルテスト社）を用いて腎スライスのリボ核酸（ＲＮＡ）を抽出し、総ＲＮＡ（５μｇ）を、ＭＭＬＶ逆転写酵素（プロメガ社）を用いた相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）の調製に供した。上記の逆転写したｃＤＮＡ試料を、ＡＢＩ−プリズム７７００の塩基配列検出システム（アプライドバイオシステム社）とＳＹＢＲグリーンマスターミックスキット（アプライドバイオシステム社）を用いて、リアルタイムＰＣＲにより分析した。リアルタイムＰＣＲのプライマーは、マウスβ−アクチン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１と２）とエリトロポイエチン（Ｅｐｏ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：３と４）を標的とするものを使用した（表１を参照）。リアルタイムＰＣＲの条件は、９５℃で１０分間変性させ、次に、９５℃で３０秒間、５８℃で３５秒間、７２℃で４０秒間のサイクルを４０回くり返すこと、とした。内部標準としてβ−アクチンの発現レベルを使用した。相対的な遺伝子発現レベルは、２−△△CTにより算出する。この結果を、対照群（即ち、０μｇ／ｍｌ）と比較し、相対指数で表示した。その結果、化合物Ａは腎臓組織中のＥｐｏの発現を増強することが明らかとなった（図３を参照）。
【表１】
【００４８】
実施例５
化合物Ａは肝細胞のＥｐｏ発現を強化する
先ず、国立実験動物センター（ＮＬＡＣ、台湾）よりＣ５７ＢＬ／６ＪＮａｒｌマウス（８〜１０週齢）を購入する。次に、先に説明した方法（Kreamerら、１９８６年）に修正を加え、これに基づいて肝細胞を分離した。簡潔に説明すると、マウスをアバチン（２％（ｗ／ｖ）２，２，２−トリブロモエタノール、i.p.、４００ｍｇ／Ｋｇ体重）により麻酔し、０．５ｍＭエチレングリコール−ビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラ酢酸（ＥＧＴＡ；シグマアルドリッチ社）を含むカルシウムフリーのハンクス液（ＨＢＳＳ）により下大静脈を通して肝臓に原位置潅流した。潅流液は、切断された門静脈を経由して１ｍｌ／ｍｉｎの流速で流出する。１０分間潅流した後、０．０５％（ｗ／ｖ）コラゲナーゼ（II、ワージントンバイオケミカル社）と１ｍＭ塩化カルシウム（シグマアルドリッチ社）を含むＨＢＳＳを潅流装置に導入し、上記の流速で、更に１０分間継続して潅流を行う。部分的に消化された肝臓を移動させ、ＨＢＳＳを含む６０ｍｍの培養皿（ＢＤファルコン社）に放置し、緩やかに細かくきざんで、肝臓の被膜を切り開く。細かくきざんだ肝臓の懸濁液をナイロンメッシュ（孔サイズはほぼ３００μｍ）により濾過し、５０×ｇの遠心力で３分間遠心分離を行い細胞ペレットを得る。密度１．０６ｇ／ｍｌのパーコール（ＧＥヘルスケアー社）培地を調製する。上記の細胞ペレットをＤＭＥＭ培地（ギブコ／インビトロゲン社）に懸濁し、先のパーコール培地と共に５０×ｇで１０分間４℃下で遠心分離を行い、次にＤＭＥＭ培地で１回洗って、続いて５０×ｇで２分間遠心分離を行い、肝細胞を得る。
【００４９】
このようにして分離された肝細胞を、５％の炭酸ガスと９５％の空気含む加湿した培養器内で３７℃にて、１０％ＦＢＳ（ギブコ社）を含むＤＭＥＭ培地（ギブコ／インビトローゲン社）中、おおよそ６×１０5細胞／ｗｅｌｌ（２ｍｌ／ｗｅｌｌ）当りの量を６穴プレート（コスター社）に播種培養する。３時間後、培地を除き、その細胞を異なる濃度の化合物Ａ（０、０．１、０．５、２．５及び１２．５μｇ／ｍｌ）と共にそれぞれ２４時間培養する。肝細胞のＲＮＡを、逆転写のため、ＲＮＡ−ＢｅｅTMＲＮＡ分離液（テルテスト社）により抽出し、先の説明の通りＰＣＲにより転写産物を分析する。この結果、化合物Ａは肝細胞中のＥｐｏの発現を強化することが明らかとなった（図４を参照）。
【００５０】
実施例６
化合物Ａはシスプラチン−誘発急性腎不全動物モデルにおける腎機能を強化する
シスプラチン−誘発急性腎不全動物モデルにおける化合物Ａの治療効果を調べた。先ず、国立実験動物センター（ＮＬＡＣ、台湾）よりＣ５７ＢＬ／６ＪＮａｒｌマウス（８週齢）を購入する。次に、シスプラチン（シス−ジアミンプラチナム（II）ジクロリド、シグマアルドリッチ社）を生理食塩水（０．９％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム、シグマアルドリッチ社）に溶解して１ｍｇ／ｍｌ濃度に調整し、以下のスケジュールに基づきマウスの腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を行う。即ち、第１日目に７ｍｇ／ｋｇ；第５日目に６ｍｇ／ｋｇ；第９日目に６ｍｇ／ｋｇ量をそれぞれ投与する。シスプラチン未処置の正常マウス群には、平行して上記の量の生理食塩水を腹腔内に注射投与する。第１３日目に血清の試料を集め、血液中の尿素窒素（ＢＵＮ）含量を分析する。更に、１００ｍｇ／ｄｌ以上のＢＵＮレベルを示すシスプラチンを注射したマウスと、シスプラチン未処置の正常マウスを１群当り６匹、計５群に分けて２週間飼育した。この５群は、即ち、（１）正常群：生理食塩水を注射し、その後、標準飼料（LabDiet（登録商標））を与えて飼育したマウス群；（２）対照群：シスプラチンを注射し、その後、標準飼料を与えて飼育したマウス群；（３）化合物Ａ１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ投与群：シスプラチンを注射し、その後１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ剤量の化合物Ａを与えて飼育したマウス群；（４）化合物Ａ３０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ投与群：シスプラチンを注射し、その後３０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ剤量の化合物Ａを与えて飼育したマウス群；（５）化合物Ａ９０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ投与群：シスプラチンを注射し、その後９０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ剤量の化合物Ａを与えて飼育したマウス群。
【００５１】
マウスの後眼窩洞より、第０、５、１０、１３、１８、２３及び２８日目に血液試料を採集し、シスメクス（登録商標）Ｋｘ−２１血液分析計を用いて、完全血液細胞計数により赤血球（Ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ、以下ＲＢＣと略称する）濃度を測定した。血液尿素窒素（ＢＵＮ）レベルを、ウレアーゼＧＬＤＨ法（ウレアＦＳ、ダイヤシス社）により測定した。その結果を、平均値±標準誤差（ｎ＝５〜６）で表示した。統計学的有意性は、スチューデントテスト（＃＃Ｐ＜０．０１ｖｓ正常群と**Ｐ＜０．０１ｖｓ対照群）により評価した。この結果、化合物Ａ治療は、濃度が３０〜９０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ範囲内において、赤血球（ＲＢＣｓ）数を増加させ、血清ＢＵＮレベルを低下させることが明らかとなった（図５を参照）。第２３日目に、濃度が３０〜９０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ範囲内にある化合物Ａは、ＲＢＣｓ数を顕著に増加させ（図７を参照）、同時に血清ＢＵＮレベルを低下させる（図８を参照）。図７と図８において、水平方向の矢印は化合物Ａ治療（ｍｇ／Ｋｇ／ｄａｙ）を示す。このデータから、シスプラチン誘発急性腎不全動物モデルにおいて、化合物Ａ治療は、腎機能を強化し、貧血を減少させることが判った。この結果は、化合物Ａが赤血球生成を強化する能力を有することと一致するものである。
【００５２】
実施例７
化合物Ａはシスプラチン誘発急性腎不全動物モデルにおける肝臓のＥｐｏと肝細胞増殖因子の発現を増強する
実施例６において、最後に（即ち、第２８日目）マウスを殺し、その腎臓と肝臓の組織を取り出し、骨髄細胞を分離する。次に、これらの組織と骨髄細胞よりＲＮＡ−ＢｅｅTMＲＮＡ分離溶液（テル−テスト社）を用いてＲＮＡを抽出する。更に、ＭＭＬＶ逆転写酵素（プロメガ社）を用いて、総ＲＮＡ（５μｇ）からｃＤＮＡを調製した。この逆転写ｃＤＮＡ試料は、ABIGeneAmpTMシステム２７００（アプライドバイオシステム社）と、マウスグリセリンアルデヒド３−ホスフェイト脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：５と６を参照）、エリトロポイエチン（Ｅｐｏ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：３と４を参照）及び肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：７と８を参照）（表１を参照）を標的としたプライマーを使用したＳＹＢＲグリーンマスターミックスキット（アプライドバイオシステム社）とを用いるＰＣＲにより分析した。上記のリアルタイムＰＣＲの条件は、９５℃で１０分間変性させ、次に、９５℃で３０秒間、５８℃で３５秒間及び７２℃で４０秒間のサイクルを４０回繰り返すこと、とした。内部標準としてＧＡＰＤＨの発現レベルを使用した。相対的な遺伝子発現レベルを２−△△CTにより算出する。この結果を、相対指数±標準誤差（ｎ＝５〜６）で表示した。統計学的有意性は、スチューデントテスト（＃＃Ｐ＜０．０１ｖｓ正常群と*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１ｖｓ対照群）により評価した。
【００５３】
その結果、３０〜９０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ濃度において、化合物Ａは、シスプラチン誘発急性腎不全動物モデルの肝臓のＥｐｏ発現を、未処置対照群と比較した場合、顕著に増大させることが明らかとなった（図９を参照）。肝臓と腎臓は、Ｅｐｏを製造する二つの主要な器官である。化合物Ａは、腎臓組織（図３を参照）、肝細胞（図４を参照）及び肝臓組織（図９を参照）におけるＥｐｏの発現を強化することをも見出した。この結果は、化合物ＡがＥｐｏの発現を強化する能力を有することと符合する。更に、化合物Ａ（１０〜９０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）治療は、肝臓組織中のＨＧＦの発現をも増強する（図１０を参照）。図９と図１０において、水平方向の矢印は、化合物Ａ治療（ｍｇ／Ｋｇ／ｄａｙ）を示すものである。
【００５４】
実施例８
化合物Ａはシスプラチン誘発急性腎不全動物モデルにおける赤血球前駆細胞を活性化する
実施例７に基づいて、上述した通り、バースト形成ユニット−赤血球（ＢＦＵ−Ｅ）分析を行うために、５％炭酸ガスと９５％空気を含む加湿した培養器中、３７℃下で、分離した骨髄細胞を１２日間培養した。その結果を、相対指数±標準誤差（ｎ＝５〜６）で表わす。統計学的有意性は、スチューデントテスト（＃＃Ｐ＜０．０１ｖｓ正常群と*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１ｖｓ対照群）により評価した。この結果、１０〜９０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ濃度において、化合物Ａは、骨髄細胞中のＢＦＵ−Ｅコロニー数を顕著に増大させることが見出された（図１１を参照）。図１１において、水平方向の矢印は、化合物Ａ治療（ｍｇ／Ｋｇ／ｄａｙ）を示す。この結果より、化合物Ａは、赤血球前駆細胞を活性化し、赤血球生成を強化することが明らかとなった。
【００５５】
化合物２，３，５，４'−テトラヒドロキシスチルベン２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド、即ち、化合物Ａは、いくつかの植物で見出されている。文献によると、化合物Ａは以下の薬物学的効果を有する。例えば、チロシナーゼを活性化してメラニン産生を促す（Guanら、２００８年）；脂質の過酸化作用を阻害する（Kimuraら、１９８３年）；酸素と窒素のフリーラジカルレベルを軽減し、誘起される一酸化窒素合成酵素の発現を低く調整することにより、大腸炎、結腸炎に対する保護効果を発揮する（Ｗａｎｇら、２００８年）；リポタンパクの酸化に対する拮抗性効果、増殖及び冠状動脈平滑筋細胞の酸化窒素含量の低減によって、抗アテローム性動脈硬化症効果を発揮する（Liuら、２００７年）；シクロオキシゲナーゼ‐２の酵素活性と発現を阻害することに関連する抗炎症機能を有する（Zhangら、２００７年）と、アルツハイマー症と認知障害に有益である（Wangら、２００７年）などが報告されている。
【００５６】
米国特許公開第２００５００４２３１４号公報（標題：Polygonum multiflorum Thunb．の抽出物とその製造過程及びその用途）において、Polygonum multiflorum Thunb.からの抽出物は、肝細胞と骨髄細胞の増殖、生長及び／又は分化を増大させる生物学的活性を有することが開示されている。この羊毛花の根（Fleeceflower，即ちPolygonum multiflorum Thunb.,漢方薬の何首烏）には、多くの植物化学成分が含まれている。例えば、エモジン（emodin）、クリソファノール（chrysophanol）、フィシィオン（physcion）、レイン（rhein）、クリソファノールアントロン（chrysophanol anthrone）、レスベラトロール（resveratrol）、ピセイド（piceid）、２，３，５，４’−テトラヒドロキシスチルベン−２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド、２，３，５，４’−テトラヒドロキシスチルベン−２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド−２''−Ｏ−モノガロイルエステル、２，３，５，４’−テトラヒドロキシスチルベン−２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド−３''−Ｏ−モノガロイルエステル、没食子酸（gallic acid）、カテキン（catechin）、エピカテキン（epicatechin）、３−Ｏ−ガロイル（−）−カテキン、３−Ｏ−ガロイル（−）−エピカテキン、３−Ｏ−ガロイル−プロシアニジンβ−２，３，３’−ジ−Ｏ−ガロイル−プロシアニジンＢ−２及びβ−シトステロール（β−sitosterol）が挙げられる。しかし、この米国特許公開第２００５００４２３１４号公報においては、どの化学成分に活性があるかについては触れられていない。
【００５７】
上記の通り、化合物Ａについては、赤血球生成と腎機能を強化し、Ｅｐｏ産生を増大する生物学的活性を有することが立証された。化合物Ａのグリコシル基は、例えば、ジヒドロキシアセトン、ガラクトース、グリセリンアルデヒド、トレオース、キシロース、マンノース、リボース、リブロース、キシルロース、タガトース、プシコース（アルロース）、フラクトース、ソルボース、ラムノース、エリトロース、エリトルロース、アラビノース、リキソース、アロース、アルトロース、グロース、イドース及びタロースからなる群より選ばれるモノサッカリドによって置換されても良い。
【００５８】
Ｅｐｏが赤血球生成を刺激し、赤血球生成にはＥｐｏが必要であることは良く知られている（Moritzら、１９９７年）。更に、Ｅｐｏは腎臓保護効果を有することが報告されている（Sepodesら、２００６年。Arcasoy、２００８年）。Ｅｐｏ産生の増大に加えて、化合物Ａは赤血球生成と腎機能をも強化する。
【００５９】
ＨＧＦは、多機能性のシトキン（cytokine）であり、細胞の生存、生長、運動性と、形態発生、組織再生、保護と修復に係わる。Ｅｐｏレセプタからのシグナルの導入が、ＨＧＦにより活性化されることが報告されている（Ｉｇｕｃｈｉら、１９９９年。Isobeら、２００６年）。すでに、ＨＧＦは、アレルギー性炎症（Ｉｔｏら、２００８年）、変形性関節症、リウマチ性関節炎、筋ジストロフィー、筋萎縮症、皮膚潰瘍、熱傷、強皮症、挫傷症候群（Funakoshi及びNakamura、２００３年）、又、例えば一過性虚血性発作及び血栓症といった脳血管性疾患、例えば筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー症、パーキンソン症、脊髄障害、糖尿病性網膜症、末梢性神経障害、脊柱管狭窄症、難聴などの神経変性疾患（Funakoshi及びNakamura、２００３年。Ｔａｋｅｏら、２００７年）、更に、急性肝炎、肝硬変、激症肝炎及び脂肪肝、並びに、肝臓移植、局部切除及び虚血のための外科処置（Funakoshi及びNakamura、２００３年。Mizuno及びNakamura、２００７年）、腎臓腺維症、急性腎不全、例えば腎炎症候群及び閉塞性ネフロパシーといった慢性腎不全、腎臓移植及び虚血のための外科処置、糖尿病性ネフロパシー（Matsumoto及びNakamura、２００１年。Funakoshi及びNakamura、２００３年。Ｌｉｕ、２００４年）、又、急性肺炎、肺腺維症、並びに肺臓移植、局部切除及び虚血のための外科処置（Funakoshi及びNakamura、２００３年）、例えば心臓同種移植片拒絶及び心筋炎などの炎症媒介性心臓疾患、例えば狭心症、心筋梗塞症、心筋症及び閉塞性動脈硬化症などの心血管疾患（Funakoshi及びNakamura、２００３年。Isobeら、２００６年）、又、腸粘膜障害、炎症性腸疾患（Ｉｄｏら、２００５年）、更に、胃潰瘍及び真性糖尿病（Funakoshi及びNakamura、２００３年）などを治療する潜在能力があると報告されている。
【００６０】
化合物Ａは、３，４’，５−トリヒドロキシ−トランス−スチルベンの基本化学構造を示し、酸化窒素依存性及び／又は抗酸化剤メカニズムを経由して腎臓保護機能を含む多くの生物学的活性を有する天然化学成分である（Sharmaら、２００６年。Shankarら、２００７年。Do Amaralら、２００８年。Orallo、２００８年）。又、化合物Ａは、腎機能の強化と虚血の改善において、３，４’，５−トリヒドロキシ−トランス−スチルベンに比較して優れていることが知られている（データは提示されず）。
【００６１】
ジドブジン（zidovudine）処置したヒト免疫不全ウイルスに感染された患者の貧血、化学治療を受けたガン患者の貧血、ＣＫＤの貧血の治療として、静脈内（i.v.）又は皮下（s.c.）注射により、ｒＨｕＥｐｏとＮＥＳＰが使用されたが（Fisher、２００３年）、治療を維持するためには、週１回以上投薬することが好ましいとされている。そのコスト、頻回注射（非経口投与）による不便性、及びｒＨｕＥｐｏの固有の抗原性による抗Ｅｐｏ抗体の産生などすべてを考慮した場合、この治療剤の更なる改良が必要であることが判る。３，４’，５−トリヒドロキシ−トランス−スチルベン類似物の一つの化合物Ａの経口投与は、Ｅｐｏ生成の増大、赤血球生成と腎機能の強化、及び貧血の低減を可能にする。
【００６２】
酸化窒素依存及び／又は抗酸化剤メカニズム経由による腎臓保護効果を、３，４’，５−トリヒドロキシ−トランス−スチルベン化合物が保有することは、すでに報告されている。又、化合物Ａが赤血球生成と腎機能を強化する能力は、３，４’，５−トリヒドロキシ−トランス−スチルベンより優れることも示されている。更に、化合物Ａは、組み換えＥｐｏには無い有益性を有する。例えば、化合物Ａの経口投与は、組み換えＥｐｏが有する固有の抗原性を招来せず、更に、ｒＥｐｏの投与ルートは、頻回注射を要する不便性を有し、この点でも化合物Ａの経口投与は有利性を示す。例えば、ＣＫＤ、ガン、急性及び慢性感染症、自己免疫症、炎症、臓器移植後の慢性拒絶反応、化学療法が誘発する貧血症及び組織虚血症などの貧血関連疾患に対し、化合物Ａは有用であろう。
【００６３】
本発明における上述の実施形態は、本発明の説明と記述を目的とするに過ぎず、本発明を制約するものではない。更に多くの修正と変更の可能性が存在することは言うまでもない。
【００６４】
実施形態と実施例は、本発明の原則と実際の応用を説明し、それによって本発明と異なる修正を伴う特別な意図を通した種々の実施形態などを、当業者が有効に利用できるようにするためになされた例示である。又、当業者は、本発明の主旨と範囲を逸脱しない限り、その他の実施形態を採用することができる。従って、本発明の具体的な保護請求の範囲は、上述の内容と実施例よりむしろ、特許請求の範囲に定義される。
【００６５】
本発明では、特許、特許出願及び種々の刊行物を含む若干の文献を引用し、議論に用いたが、これら引用及び／又は議論に用いた文献は、単に本発明を明瞭に説明するためのものに過ぎず、本発明の「先行技術」とは見なされるものではない。又、本明細書において引用され、議論がなされたすべての文献は、各文献が個別に参考文献に組み込まれるのと同等の範囲でその文献全体が参考文献として本明細書に組み込まれる。
【００６６】
参考文献のリスト
【技術分野】
【０００１】
本発明は、赤血球生成に係わるものであり、特に、赤血球生成の強化に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、慢性進行性腎障害（Chronic Kidney Disease、以下ＣＫＤと略称する）は、世界規模の公衆衛生問題の一つであり、腎不全、心血管疾患及び早期死亡などの不利益を結果的にもたらすことが知られている（Levey、２００５年）。ＣＫＤ患者は、腎臓病の末期に進行する非常に高いリスクを抱え、生命を長く維持するためには、腎臓透析や腎臓移植などを行う必要がある。ＣＫＤの初期症状の一つとして貧血（Anemia）が挙げられるが、それは腎臓の内因性エリトロポイエチン（erythropoietin、以下Ｅｐｏと略称する）の生産不足によることが報告されている（Zarzeckiら、２００４年）。更に、ＣＫＤに加え、貧血は、例えば、ガン、急性及び慢性感染症、自己免疫症、炎症、そして臓器移植後の慢性拒絶反応などのその他の疾患をも伴うことが知られている（Weiss及びGoodnough、２００５年）。
【０００３】
Ｅｐｏは、主として成人の腎臓と胎児の肝臓において生成される糖たんぱくホルモンであり、細胞表面のエリトロポイエチンレセプタ（以下Ｅｐｏレセプタと略称する）と結合することによって、その効果を発揮するものである。細胞が相対的に低い酸素レベルを感じた場合（例えば、低酸素症）、Ｅｐｏが生産・放出され、赤血球系細胞の増殖、分化、成熟、生存などを調整する（Moritzら、１９９７年。Fisher、２００３年）。血流中におけるＥｐｏレベルの異常は、恐らくは骨髄症及び腎臓病の指標であると言われている。相対的に低いＥｐｏレベルを示すことが、ＣＫＤ、原発性真性赤血球増加症及び化学療法誘発性貧血症の患者に見られ、又、相対的に高いＥｐｏレベルを示すことが、続発性赤血球増加症及び腎臓ガンの患者に見られることが報告されている（EckardtとKurtz、２００５年。Hodgesら、２００７年）。
【０００４】
腎臓と肝臓組織において生産される以外に、Ｅｐｏとそのレセプタは、脳、目、心臓、肺臓、腸、膵臓、筋肉、子宮及び生殖腺を含む非赤血球系の組織及び器官中において発見されている（Eckardt及びKurtz、１９９２年）。Ｅｐｏ−Ｅｐｏレセプタシグナル伝達は、創傷癒合反応、脈管形成、そして例えば神経保護、心臓血管保護、並びに組織虚血及び虚血／再潅流傷害などに係わる局所性組織保護機能に貢献することが知られている（Paschosら、２００８年。Arcasoy、２００８年）。又、Ｅｐｏは、腎機能障害の程度を軽減し、シスプラチン誘発性急性腎不全からの回復を促進するという腎臓保護効果を有することが報告されている（Ｓepodesら、２００６年。Arcasoy、２００８年）。
【０００５】
赤血球生成促進剤（Erythropoiesis-stimulating agents、以下ESAsと略称する）は、治療反応性の貧血を抱える患者におけるＣＫＤの貧血に対する治療薬として、米国国立腎臓財団のガイドライン「Kidney Disease Outcomes Quality Initiative」により推奨されている。遺伝子組換えヒトＥｐｏ（Recombinant human Epo（rHuEpo））は、ＣＫＤの貧血症、化学療法を受けたガン患者の貧血症の治療、手術中の輸液需要の低減、及びヒト免疫不全ウイルスに感染したジドブジン治療患者の貧血症の治療のために使用されることが認められている。新規な赤血球生成刺激タンパク質（novel erythropoiesis-stimulating protein（NESP））は、比較的長いプラズマ半減期を有するＥｐｏによりデザインされ、慢性腎不全の貧血症の治療のために使用されることが認められている（Fisher、2003年）。これらのＥＳＡｓは、維持療法のために、週に１回以上静脈内（i.v.）又は皮下（s.c.）投薬することが推奨されているが、痛み、頻回注射の不便性、ｒＨｕＥｐｏを伴う固有の抗原性による抗Ｅｐｏ抗体の発生などが大きな関心を呼んでいる（Bunn、2007年）。それのみならず、ＥＳＡｓは、比較的高いヘモグロビンレベルの患者に安全上のリスクをもたらし、例えば、高血圧症、血栓塞栓症、鉄缺乏症、重度の赤芽球癆などの合併症の誘因となる可能性がある（Wish及びCoyne、2007年）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、上述した欠陥や不備に対処するというこれまで対処されてこなかった必要性が、当技術分野に、特に赤血球生成と腎機能に関する技術分野において存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一つの態様において、本発明は、下記式（Ｉ）で表される化合物を用いて、エリトロポイエチンの生成を強化する薬剤の製造に使用することに関し、
【化１】
【０００８】
[式中、Ｒは、グリコシル基を示す。]その使用法として、治療上有効な量の当該薬剤を投与することが含まれる。
【０００９】
前記グリコシル基は、ジヒドロキシアセトン、グルコース、ガラクトース、グリセリンアルデヒド、トレオース、キシロース、マンノース、リボース、リブロース、キシルロース、タガトース、プシコース（アルロース）、フラクトース、ソルボース、ラムノース、エリトロース、エリトルロース、アラビノース、リキソース、アロース、アルトロース、グロース、イドース及びタロースからなる群より選ばれる一つのモノサッカリド（単糖）である。
【００１０】
上記式（Ｉ）で表される化合物は、骨髄、肝臓、腎臓及びその任意の組合せからなる群より選ばれる組織及び／又は器官に、エリトロポイエチン生成を強化するために投与される。
【００１１】
他の態様において、本発明は、上記式（Ｉ）で表される化合物を、エリトロポイエチン治療が有効な疾患及び／又は障害の治療に用いる薬剤の製造に使用することに関する。その使用法として、治療上有効な量の当該薬剤を、それを必要とする対象に投与することが含まれる。
【００１２】
前記疾患及び／又は障害として、貧血症、腎不全及び赤血球生成欠損関連疾患からなる群より選ばれる少なくとも一つである。
【００１３】
前記疾患及び／又は障害は、エリトロポイエチン関連保護効果が有効なものである。
【００１４】
前記エリトロポイエチン関連保護効果としては、神経保護、心血管保護及び腎臓保護効果、並びに組織虚血及び虚血／再潅流障害からの保護からなる群より選ばれる少なくとも一つである。
【００１５】
さらに他の態様において、本発明は、上記式（Ｉ）で表される化合物を、赤血球生成を強化する薬剤の製造に使用することに関する。その使用法として、治療上有効な量の当該薬剤を、それを必要とする対象に投与することが含まれる。
【００１６】
さらに態様において、本発明は、上記式（Ｉ）で表される化合物を、腎機能を強化する薬剤の製造に使用することに関する。その使用法として、治療上有効な量の当該薬剤を、それを必要とする対象に投与することが含まれる。
【００１７】
さらに他の態様において、本発明は、上記式（Ｉ）で表される化合物を、肝細胞増殖因子の発現を増強する薬剤の製造に使用することに関する。その使用法として、治療上有効な量の当該薬剤を、それを必要とする対象に投与することが含まれる。
【００１８】
さらに他の態様において、本発明は、上記式（Ｉ）で表される化合物を、肝細胞増殖因子治療が有効な対象における疾患及び／又は障害を治療する薬剤の製造に使用することに関する。その使用法として、治療上有効な量の当該薬剤を、それを必要とする対象に投与することが含まれる。
【００１９】
態様において、本発明は、上記式（Ｉ）で表される化合物を、肝細胞増殖因子の発現を調整することにより疾患及び／又は障害を治療する薬剤の製造に使用することに関する。その使用法として、治療上有効な量の当該薬剤を、それを必要とする対象に投与することが含まれる。
【００２０】
前記疾患及び／又は障害としては、肝疾患、腎疾患、肺疾患、心血管疾患、消化器疾患、神経疾患、骨疾患、関節疾患、筋疾患、皮膚疾患、圧挫症候群、アレルギー性炎症及びこれらの任意の組合せからなる群より選ばれる少なくとも一つである。
【００２１】
前記肝疾患としては、急性肝炎、肝硬変、劇症肝炎及び脂肪肝、並びに肝臓移植、局部切除及び虚血のための外科処置からなる群より選ばれる少なくとも一つである。
【００２２】
前記腎疾患としては、腎線維症、急性腎不全、慢性腎不全及び糖尿病性ネフロパシー、並びに腎臓移植及び虚血のための外科処置からなる群より選ばれる少なくとも一つである。
【００２３】
前記慢性腎不全としては、腎炎症候群及び閉塞性ネフロパシーより選ばれる少なくとも一つである。
【００２４】
前記肺疾患としては、急性肺炎及び肺線維症、並びに肺臓移植、局所切除及び虚血のための外科処置からなる群より選ばれる少なくとも一つである。
【００２５】
前記心血管疾患としては、炎症媒介性心臓疾患、狹心症、心筋梗塞症、心筋症及び閉塞性動脈硬化症からなる群より選ばれる少なくとも一つである。
【００２６】
前記炎症媒介性心臓疾患としては、心臓同種移植片拒絶反応及び心筋炎が含まれる。
【００２７】
前記消化器疾患としては、腸粘膜障害、炎症性腸疾患、胃潰瘍及び真性糖尿病からなる群より選ばれる少なくとも一つである。
【００２８】
前記神経疾患としては、脳血管性疾患、神経変性疾患、脊髄障害、糖尿病性網膜障害、末梢神経障害、脊柱管挟窄症及び聴覚消失症（難聴）からなる群より選ばれる少なくとも一つである。
【００２９】
前記脳血管性疾患としては、一過性脳虚血発作及び脳卒中の少なくとも一つである。
【００３０】
前記神経変性疾患としては、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー症及びパーキンソン症からなる群より選ばれる少なくとも一つである。
【００３１】
前記骨疾患及び関節疾患としては、変形性関節症及び／又はリウマチ性関節炎が含まれる。
【００３２】
前記筋疾患としては、筋ジストロフィー及び／又は筋萎縮症が挙げられる。
【００３３】
前記皮膚疾患としては、皮膚潰瘍、熱傷及び強皮症からなる群より選ばれる少なくとも一つである。
【００３４】
本発明の上記及びその他の態様は、添付図面を含む下記の好ましい実施形態の説明から更に明瞭となる。本発明の新規な概念の主旨と範囲から逸脱しないかぎり、更に種々の変更や修正を行うことができる。
【００３５】
添付図面は、本発明の一つ又は一つ以上の実施形態を説明するものであり、そこに書かれた説明と共に本発明の原理を説明する。又、ある実施形態の同一または同様の構成要素を示すために、できる限り同じ参照番号を図面を通して使用する。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１は、化合物Ａによる骨髄細胞中のヘモグロビンレベルの強化を示す。
【図２】図２は、骨髄細胞のバースト形成ユニット−赤血球（ＢＦＵ−Ｅと略称する）分析を用いた、化合物Ａによる赤血球前駆細胞増殖の活性化を示す。
【図３】図３は、腎臓組織内における化合物Ａによるエリトロポイエチン（Ｅｐｏ）発現の増大を示す。
【図４】図４は、肝細胞内における化合物Ａによるエリトロポイエチン（Ｅｐｏ）の発現の増大を示す。
【図５】図５は、シスプラチン誘発急性腎不全動物モデルにおける化合物Ａによる赤血球数の増大を示す。
【図６】図６は、シスプラチン誘発急性腎不全動物モデルにおける化合物Ａによる血液の尿素態窒素レベルの減少を示す。
【図７】図７は、シスプラチン誘発急性腎不全動物モデルの第２３日目における化合物Ａによる赤血球数の増大を示す。図面中、水平方向の矢印は、化合物Ａ治療（ｍｇ／Ｋｇ／ｄａｙ）を示す。
【図８】図８は、シスプラチン誘発急性腎不全動物モデルの第２３日目における化合物Ａによる血液の尿素態窒素レベルの減少を示す。図面中、水平方向の矢印は、化合物Ａ治療（ｍｇ／Ｋｇ／ｄａｙ）を示す。
【図９】図９は、シスプラチン誘発急性腎不全動物モデルにおける化合物Ａによるエリトロポイエチン（Ｅｐｏ）の発現の増大を示す。図面中、水平方向の矢印は、化合物Ａ治療（ｍｇ／Ｋｇ／ｄａｙ）を示す。
【図１０】図１０は、シスプラチン誘発急性腎不全動物モデルにおける化合物Ａによる肝組織内の肝細胞増殖因子（hepatocyte growth factor、以下、ＨＧＦと略称する）の発現の増大を示す。図面中、水平方向の矢印は、化合物Ａ治療（ｍｇ／Ｋｇ／ｄａｙ）を示す。
【図１１】図１１は、シスプラチン誘発急性腎不全動物モデルにおける、骨髄細胞のバースト形成ユニット−赤血球（ＢＦＵ−Ｅ）分析により測定した、化合物Ａによる赤血球前駆細胞増殖の活性化を示す。図面中、水平方向の矢印は、化合物Ａ治療（ｍｇ／Ｋｇ／ｄａｙ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
［定義］
本明細書に使用された術語は、通常、本発明の明細書の文脈と、それぞれの術語が用いられた特殊な文脈とにおいて、本発明の技芸における一般的な語義を有する。本発明の説明に使用された若干の術語について、以下又は本明細書中の他の箇所において、当業者のために本発明の記述に係わる追加的な説明が行われる。便宜上、若干の術語は、例えばイタリック体及び／又は括弧を使用して強調することも有り得る。しかし、そのことはその術語の範囲や語義に何ら影響を与えるものではない、即ち、同様の文脈においては、強調の有無に関わらず、同様の範囲や語義を示すものである。同様のことが一つ以上の方法により表現され得ることが理解できるであろう。その結果、代替言語と同義語が、本発明において論述される任意の一つ又は多くの術語として使用され、そしてまた、ある術語が本明細書において詳述または論述されたかどうかに応じて特別な意味を付与されることもない。若干の術語について同義語が用意される。一つ又は一つ以上の同義語が多用されることは、他の同義語を用いることを排除することを意味しない。本明細書において論述される任意の術語の実例を含む本明細書の全ての実例は、例示的に用いられるものに過ぎず、本発明または任意の実例による術語の意義と範囲を限定するものではない。同様に、本発明は本明細書中に示された様々な実施形態に限定されない。
【００３８】
特に定義されない限り、本明細書中に使用されるすべての科学的、技術的用語は、本発明が属する技術分野において、通常の知識を有する者によって一般的に理解されているものと同様の語義を示すものである。もし競合がある場合、与えられる語義については本明細書において統制される。
【００３９】
本明細書において使用される「ぐらい」、「ほぼ」又は「おおよそ」の語義は、通常、示された値の２０％範囲内、好ましくは１０％範囲内、更に好ましくは、５％範囲内を表わすものである。本明細書中、特に説明のない限り、示される数値はおおよその値であり、その語義は上記の「ぐらい」、「ほぼ」又は「おおよそ」の値として推定すべき値を示す。
【実施例】
【００４０】
以下、本発明の実施形態により模範的な器具、装置、方法及びそれに関連する結果を示すが、本発明はそれらに限定されるものではない。又、実施例において、読者のために便宜上、表題又は副題を記載しているが、これも本発明を制約するものではない。さらに、本発明においていくらかの理論を提議且つ開示しているが、それらが正しいか否かを問わず、本発明が特定の理論あるいは処置の仕組みを考慮せずに本発明の開示内容に従って実施されるかぎり、そうした理論は本発明の範囲を限定するものではない。
【００４１】
実施例１
化合物Ａの精製
乾燥したPolygonum multiflorumを２Ｋｇ用い、粉砕機で粉砕し、その粉砕物を２Ｌの８５％（ｖ／ｖ）エタノールに一夜浸漬し、反応液を調製する。反応液を収集し、残渣に上記の操作に従って、更に別の２Ｌの８５％（ｖ／ｖ）エタノールを加えて抽出を３回くり返す。これら反応液を収集し、ガス抽出器（ワットマン＃１濾紙を使用）により、収集された溶液を濾過し、次に、ロータリーエバポレーター（Ｂｕｃｈｉ社）を用い、４０℃下、容積計６分之１迄濃縮する。濃縮した濾液を集め、ｎ−ヘキサン／水＝１：１を用いて５回分液する（総量５L）。水相を集め、酢酸エチル溶液（ＥｔＯＡＣ／水＝１．１）を用いて、更に６回分液して（総量６．５L）、酢酸エチル溶液層を得る。これら６回分の酢酸エチル層を合併し濃縮する。これにより得た濃縮物を凍結乾燥機（台湾Kingmech社）により乾燥して酢酸エチル抽出物を得る（以下、PoMuEPeと称する）。このPoMuEPeを、ダイヤイオンＨＰ−２００のカラム（４．８×６０ｃｍ、日本三菱化学社）を用い、メタノール／水＝５０：５０の溶媒系により、流速２ｍｌ／ｍｉｎ下で、クロマトグラフィを行う。この分画液を集め、濃縮、乾燥、分析することにより、そのヘモグロビン生成強化能力を調べる。その活性を有する分画を集め、ＰｏＭｕＥＰｅＤ９と命名する。更に、ＰｏＭｕＥＰｅＤ９を、セファデクスTMＬＨ２０のカラム（２．６×１００ｃｍ、GE Healthcare Life Science社）を用い、メタノール／水＝１００：０溶媒系により、１ｍｌ／ｍｉｎの流速下で、クロマトグラフィを行う。これらの分画を集め、濃縮、乾燥、分析し、ヘモグロビン生成強化能力を調べ、生物活性を示す分画を集め、ＰｏＭｕＥＰｅＤ９Ｌ１１と命名した。
【００４２】
上記ＰｏＭｕＥＰｅＤ９Ｌ１１の主要成分について、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法（Bruker社）と液体クロマトグラフィ／質量分析法（ＬＣ／ＭＳ、Bruker社）によりその化学構造を決定した。上記主成分は、２，３，５，４'−テトラヒドロキシスチルベン２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドであることが確認され、化合物Ａと命名され、下記一般式（Ｉ）により表される。
【化２】
[式中、Ｒは、グルコシル基を示す。]
【００４３】
実施例２
化合物Ａはヘモグロビン生成を強化する
先ず、国立実験動物センター（ＮＬＡＣ、台湾）より試験用動物のＣ５７ＢＬ／６ＪＮａｒｌマウス（８〜１０週齢）を購入し、投与量１００ｍｇ／ｋｇで、フェニルヒドラジン塩酸塩（シグマアルドリッチ社）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳと略称する）を単回の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射で投与することにより急性溶血性の貧血症を誘発する。注射後６日目に、骨髄細胞をマウスより分離し、Worthingtonら（１９８７年）とRosenthalら（１９８７年）記載の方法を若干修正した方法により培養した。細胞懸濁液は、１％（ｖ／ｖ）ボビン血清アルブミン（ＢＳＡ、シグマアルドリッチ社）、７．５μｍの２−メルカプトエタノール（シグマアルドリッチ社）、１．４ｍＭのＬ−グルタミン（シグマアルドリッチ社）、１０μｍの塩化鉄（ＦｅＣｌ3、シグマアルドリッチ社）及び５０ｍＵ／ｍｌのＥＰＯ（レコーモンエポエチン、ロシュ社）を含むＭＥＭアルファ培地（α−ＭＥＭ、ギブコ社）中、ほぼ６×１０5細胞／ｍｌの濃度に調整される。この細胞を９６穴プレート（コスター社）におおよそ１．５×１０5細胞／ｗｅｌｌで播種し、５％炭酸ガスと９５％空気を含む加湿した培養器中、３７℃下で培養する。
【００４４】
次の日に、異なる濃度の化合物Ａ（０、０．１、０．５、２．５、１２．５及び２０μｇ／ｍｌ）を、前記細胞にそれぞれ添加し、更に４日間培養を続ける。次に、Ｋａｉｈｏ及びMizuno（１９８５年）並びにWorthington（１９８７年）らの方法に若干の修正を加えた方法により、ＤＡＦベースヘモグロビン比色法を用いて、相対的なヘモグロビンレベルを測定した。簡潔に説明すると、細胞をＰＢＳで洗淨し、ノニデットTMＰ４０（ＮＰ−４０、シグマアルドリッチ社）（０．０１％（ｖ／ｖ）、５０μｌ／ｗｅｌｌ）で、溶解させる。その後、細胞を４，５−ジアミノフルオレスセイン（ＤＡＦ、シグマアルドリッチ社）（１００μｇ／ｍｌ、１００μｌ／ｗｅｌｌ）と、３０％の過酸化水素（シグマアルドリッチ社）（６μｌ／ｗｅｌｌ）と共に５〜１０分間培養する。次に、ビクター２ １４２０マルチラベルカンター（ワラック、パーキンエルマー社）を用いて波長６１０ｎｍの吸光度を測定した。その結果を相対指数±標準誤差（ｎ＝６）で表示した。統計学的有意性は、スチューデントテスト（＊＊Ｐ＜０．０１ｖｓ対照群（０μｇ／ｍｌ））により評価した。この結果、化合物Ａは、ほぼ０．１〜２０μｇ／ｍｌの濃度でヘモグロビン生成を著しく強化することが明らかに示された（図１を参照）。
【００４５】
実施例３
化合物Ａは細胞培養中の赤血球前駆細胞を活性化する
赤血球前駆細胞における化合物Ａの効果を調べるために、Corazzaら（２００４年）とJinら（２００３年）の文献に記載の方法を若干修正して、バースト形成ユニット−赤血球（ＢＦＵ−Ｅ）分析を行った。簡潔に説明すると、国立実験動物センター（ＮＬＡＣ、台湾）より試験用動物のＣ５７ＢＬ／６ＪＮａｒｌマウス（６週齢）を購入し、このマウスより骨髄細胞を分離し、１５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（牛胎児血清、ギブコ社）、１％（ｖ／ｖ）ＢＳＡ（シグマアルドリッチ社）、０．８％（ｗ／ｖ）メチルセルロース（シグマアルドリッチ社）、１０μＭの２−メルカプトエタノール（シグマアルドリッチ社）、２Ｕ／ｍｌＥｐｏ（レコーモンエポエチン、ロシュ社）及び１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−３（シグマアルドリッチ社）を含有するα−ＭＥＭ中に、上記細胞を懸濁し、ほぼ８．３×１０4細胞／ｍｌ濃度の細胞懸濁液を調製する。この細胞を２４穴プレート（Ｆａｌｃｏｎ社）におおよそ７．５×１０4細胞／ｗｅｌｌで播種し、異なる濃度の化合物Ａ（０、０．１、０．５、２．５、１２．５μｇ／ｍｌ）をそれぞれ添加した後、５％炭酸ガス−９５％空気中、加湿した培養器において、３７℃下で９日間培養を続けた。コロニーは、３−（４，５−ジメチルチアゾル−２−イル）−２，５−ジフェニル−テトラゾリウムブロミド（５０μｇ／５０μｌ／ｗｅｌｌ）（ＭＴＴ；シグマアルドリッチ社）を用いて染色し、５０個以上の細胞群のコロニーが計上された際に、プレートの写真をとり、その結果を平均値±標準誤差（ｎ＝３）で表示した。統計学的有意性は、スチューデントテスト（＊Ｐ＜０．０５と**Ｐ＜０．０１ｖｓ対照群（即ち、濃度：０））により評価した。化合物Ａは、０．５〜１２.５μｇ／ｍｌの濃度範囲内において著しく骨髄細胞のＢＦＵ−Ｅコロニー数を増加させることが明らかになった（図２を参照）。この結果は、化合物Ａがヘモグロビン生成と赤血球前駆細胞を活性化することにより赤血球生成を強化することを示している。
【００４６】
実施例４
化合物Ａは腎臓のＥｐｏ発現を強化する
先ず、国立実験動物センター（ＮＬＡＣ、台湾）より試験用動物のＣ５７ＢＬ／６ＪＮａｒｌマウス（８〜１０週齢）を購入し、上記の方法を若干修正した方法（Parrishら、１９９５年。Obatomiら、１９９８年。De Kanterら、１９９９年）に基づき、マウスの腎スライスを準備する。簡潔に説明すると、マウスを頸椎脱臼により死亡させ、腎臓を摘出し、直ちに、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ＵＳＢ社）、１２８ｍＭ塩化ナトリウム（シグマアルドリッチ社）、２．５ｍＭ塩化ポタシウム（シグマアルドリッチ社）、２．７ｍＭ塩化カルシウム（シグマアルドリッチ社）、１ｍＭ塩化マグネシウム（シグマアルドリッチ社）及び１６ｍＭ Ｄ-グルコース（シグマアルドリッチ社）を含み且つ９５％の酸素と５％の炭酸ガスを充気した氷冷の無菌のKrebs-HEPES緩衝液（ｐＨ７．４）中に保存する。この腎臓はその被膜を皮質乳頭軸に対して垂直に剥離し、芯を抜く。次に、９５％の酸素と５％の炭酸ガスを充填した氷冷の無菌のＫｒｅｂｓ−ＨＥＰＥＳ緩衝液で満たしたミクロスライサー（D.S.K、microslicer、DRK1000、Dosaka ＥＭ社）において、腎スライス（２５０μｍ）を調製する。この腎スライスを集め、ガス（９５％の酸素と５％の炭酸ガス）を充填した氷冷の無菌のＫｒｅｂｓ−ＨＥＰＥＳ緩衝液中に氷上で保存する。この腎スライスは、調製後１０分間以内で実験に使用される。
【００４７】
腎スライスは、１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ＵＳＢ社）、２０ｍＭ炭酸水素ナトリウム（シグマアルドリッチ社）と５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（ギブコ社）を含むガス（９５％の酸素と５％の炭酸ガス）を充填した新鮮な培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ギブコ社／インビトロゲン社）を、１．０ｍｌ／ｗｅｌｌ当り、２４穴プレート（Falcon社）用いて、３７℃下、９５％の酸素と５％の炭酸ガスの雰囲気下の培養器中、９０〜１２０分間前培養を行った。その後、腎スライスを、異なる濃度の化合物Ａ（０、０．６、２．５、１０、４０及び１００μｇ／ｍｌ）と共にそれぞれ３７℃下、５０％の酸素、５％の炭酸ガス及び４５％の窒素ガス雰囲気下の培養器中で培養した。ＲＮＡ−ＢｅｅTMＲＮＡ分離溶媒（テルテスト社）を用いて腎スライスのリボ核酸（ＲＮＡ）を抽出し、総ＲＮＡ（５μｇ）を、ＭＭＬＶ逆転写酵素（プロメガ社）を用いた相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）の調製に供した。上記の逆転写したｃＤＮＡ試料を、ＡＢＩ−プリズム７７００の塩基配列検出システム（アプライドバイオシステム社）とＳＹＢＲグリーンマスターミックスキット（アプライドバイオシステム社）を用いて、リアルタイムＰＣＲにより分析した。リアルタイムＰＣＲのプライマーは、マウスβ−アクチン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１と２）とエリトロポイエチン（Ｅｐｏ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：３と４）を標的とするものを使用した（表１を参照）。リアルタイムＰＣＲの条件は、９５℃で１０分間変性させ、次に、９５℃で３０秒間、５８℃で３５秒間、７２℃で４０秒間のサイクルを４０回くり返すこと、とした。内部標準としてβ−アクチンの発現レベルを使用した。相対的な遺伝子発現レベルは、２−△△CTにより算出する。この結果を、対照群（即ち、０μｇ／ｍｌ）と比較し、相対指数で表示した。その結果、化合物Ａは腎臓組織中のＥｐｏの発現を増強することが明らかとなった（図３を参照）。
【表１】
【００４８】
実施例５
化合物Ａは肝細胞のＥｐｏ発現を強化する
先ず、国立実験動物センター（ＮＬＡＣ、台湾）よりＣ５７ＢＬ／６ＪＮａｒｌマウス（８〜１０週齢）を購入する。次に、先に説明した方法（Kreamerら、１９８６年）に修正を加え、これに基づいて肝細胞を分離した。簡潔に説明すると、マウスをアバチン（２％（ｗ／ｖ）２，２，２−トリブロモエタノール、i.p.、４００ｍｇ／Ｋｇ体重）により麻酔し、０．５ｍＭエチレングリコール−ビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラ酢酸（ＥＧＴＡ；シグマアルドリッチ社）を含むカルシウムフリーのハンクス液（ＨＢＳＳ）により下大静脈を通して肝臓に原位置潅流した。潅流液は、切断された門静脈を経由して１ｍｌ／ｍｉｎの流速で流出する。１０分間潅流した後、０．０５％（ｗ／ｖ）コラゲナーゼ（II、ワージントンバイオケミカル社）と１ｍＭ塩化カルシウム（シグマアルドリッチ社）を含むＨＢＳＳを潅流装置に導入し、上記の流速で、更に１０分間継続して潅流を行う。部分的に消化された肝臓を移動させ、ＨＢＳＳを含む６０ｍｍの培養皿（ＢＤファルコン社）に放置し、緩やかに細かくきざんで、肝臓の被膜を切り開く。細かくきざんだ肝臓の懸濁液をナイロンメッシュ（孔サイズはほぼ３００μｍ）により濾過し、５０×ｇの遠心力で３分間遠心分離を行い細胞ペレットを得る。密度１．０６ｇ／ｍｌのパーコール（ＧＥヘルスケアー社）培地を調製する。上記の細胞ペレットをＤＭＥＭ培地（ギブコ／インビトロゲン社）に懸濁し、先のパーコール培地と共に５０×ｇで１０分間４℃下で遠心分離を行い、次にＤＭＥＭ培地で１回洗って、続いて５０×ｇで２分間遠心分離を行い、肝細胞を得る。
【００４９】
このようにして分離された肝細胞を、５％の炭酸ガスと９５％の空気含む加湿した培養器内で３７℃にて、１０％ＦＢＳ（ギブコ社）を含むＤＭＥＭ培地（ギブコ／インビトローゲン社）中、おおよそ６×１０5細胞／ｗｅｌｌ（２ｍｌ／ｗｅｌｌ）当りの量を６穴プレート（コスター社）に播種培養する。３時間後、培地を除き、その細胞を異なる濃度の化合物Ａ（０、０．１、０．５、２．５及び１２．５μｇ／ｍｌ）と共にそれぞれ２４時間培養する。肝細胞のＲＮＡを、逆転写のため、ＲＮＡ−ＢｅｅTMＲＮＡ分離液（テルテスト社）により抽出し、先の説明の通りＰＣＲにより転写産物を分析する。この結果、化合物Ａは肝細胞中のＥｐｏの発現を強化することが明らかとなった（図４を参照）。
【００５０】
実施例６
化合物Ａはシスプラチン−誘発急性腎不全動物モデルにおける腎機能を強化する
シスプラチン−誘発急性腎不全動物モデルにおける化合物Ａの治療効果を調べた。先ず、国立実験動物センター（ＮＬＡＣ、台湾）よりＣ５７ＢＬ／６ＪＮａｒｌマウス（８週齢）を購入する。次に、シスプラチン（シス−ジアミンプラチナム（II）ジクロリド、シグマアルドリッチ社）を生理食塩水（０．９％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム、シグマアルドリッチ社）に溶解して１ｍｇ／ｍｌ濃度に調整し、以下のスケジュールに基づきマウスの腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を行う。即ち、第１日目に７ｍｇ／ｋｇ；第５日目に６ｍｇ／ｋｇ；第９日目に６ｍｇ／ｋｇ量をそれぞれ投与する。シスプラチン未処置の正常マウス群には、平行して上記の量の生理食塩水を腹腔内に注射投与する。第１３日目に血清の試料を集め、血液中の尿素窒素（ＢＵＮ）含量を分析する。更に、１００ｍｇ／ｄｌ以上のＢＵＮレベルを示すシスプラチンを注射したマウスと、シスプラチン未処置の正常マウスを１群当り６匹、計５群に分けて２週間飼育した。この５群は、即ち、（１）正常群：生理食塩水を注射し、その後、標準飼料（LabDiet（登録商標））を与えて飼育したマウス群；（２）対照群：シスプラチンを注射し、その後、標準飼料を与えて飼育したマウス群；（３）化合物Ａ１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ投与群：シスプラチンを注射し、その後１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ剤量の化合物Ａを与えて飼育したマウス群；（４）化合物Ａ３０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ投与群：シスプラチンを注射し、その後３０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ剤量の化合物Ａを与えて飼育したマウス群；（５）化合物Ａ９０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ投与群：シスプラチンを注射し、その後９０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ剤量の化合物Ａを与えて飼育したマウス群。
【００５１】
マウスの後眼窩洞より、第０、５、１０、１３、１８、２３及び２８日目に血液試料を採集し、シスメクス（登録商標）Ｋｘ−２１血液分析計を用いて、完全血液細胞計数により赤血球（Ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ、以下ＲＢＣと略称する）濃度を測定した。血液尿素窒素（ＢＵＮ）レベルを、ウレアーゼＧＬＤＨ法（ウレアＦＳ、ダイヤシス社）により測定した。その結果を、平均値±標準誤差（ｎ＝５〜６）で表示した。統計学的有意性は、スチューデントテスト（＃＃Ｐ＜０．０１ｖｓ正常群と**Ｐ＜０．０１ｖｓ対照群）により評価した。この結果、化合物Ａ治療は、濃度が３０〜９０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ範囲内において、赤血球（ＲＢＣｓ）数を増加させ、血清ＢＵＮレベルを低下させることが明らかとなった（図５を参照）。第２３日目に、濃度が３０〜９０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ範囲内にある化合物Ａは、ＲＢＣｓ数を顕著に増加させ（図７を参照）、同時に血清ＢＵＮレベルを低下させる（図８を参照）。図７と図８において、水平方向の矢印は化合物Ａ治療（ｍｇ／Ｋｇ／ｄａｙ）を示す。このデータから、シスプラチン誘発急性腎不全動物モデルにおいて、化合物Ａ治療は、腎機能を強化し、貧血を減少させることが判った。この結果は、化合物Ａが赤血球生成を強化する能力を有することと一致するものである。
【００５２】
実施例７
化合物Ａはシスプラチン誘発急性腎不全動物モデルにおける肝臓のＥｐｏと肝細胞増殖因子の発現を増強する
実施例６において、最後に（即ち、第２８日目）マウスを殺し、その腎臓と肝臓の組織を取り出し、骨髄細胞を分離する。次に、これらの組織と骨髄細胞よりＲＮＡ−ＢｅｅTMＲＮＡ分離溶液（テル−テスト社）を用いてＲＮＡを抽出する。更に、ＭＭＬＶ逆転写酵素（プロメガ社）を用いて、総ＲＮＡ（５μｇ）からｃＤＮＡを調製した。この逆転写ｃＤＮＡ試料は、ABIGeneAmpTMシステム２７００（アプライドバイオシステム社）と、マウスグリセリンアルデヒド３−ホスフェイト脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：５と６を参照）、エリトロポイエチン（Ｅｐｏ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：３と４を参照）及び肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：７と８を参照）（表１を参照）を標的としたプライマーを使用したＳＹＢＲグリーンマスターミックスキット（アプライドバイオシステム社）とを用いるＰＣＲにより分析した。上記のリアルタイムＰＣＲの条件は、９５℃で１０分間変性させ、次に、９５℃で３０秒間、５８℃で３５秒間及び７２℃で４０秒間のサイクルを４０回繰り返すこと、とした。内部標準としてＧＡＰＤＨの発現レベルを使用した。相対的な遺伝子発現レベルを２−△△CTにより算出する。この結果を、相対指数±標準誤差（ｎ＝５〜６）で表示した。統計学的有意性は、スチューデントテスト（＃＃Ｐ＜０．０１ｖｓ正常群と*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１ｖｓ対照群）により評価した。
【００５３】
その結果、３０〜９０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ濃度において、化合物Ａは、シスプラチン誘発急性腎不全動物モデルの肝臓のＥｐｏ発現を、未処置対照群と比較した場合、顕著に増大させることが明らかとなった（図９を参照）。肝臓と腎臓は、Ｅｐｏを製造する二つの主要な器官である。化合物Ａは、腎臓組織（図３を参照）、肝細胞（図４を参照）及び肝臓組織（図９を参照）におけるＥｐｏの発現を強化することをも見出した。この結果は、化合物ＡがＥｐｏの発現を強化する能力を有することと符合する。更に、化合物Ａ（１０〜９０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）治療は、肝臓組織中のＨＧＦの発現をも増強する（図１０を参照）。図９と図１０において、水平方向の矢印は、化合物Ａ治療（ｍｇ／Ｋｇ／ｄａｙ）を示すものである。
【００５４】
実施例８
化合物Ａはシスプラチン誘発急性腎不全動物モデルにおける赤血球前駆細胞を活性化する
実施例７に基づいて、上述した通り、バースト形成ユニット−赤血球（ＢＦＵ−Ｅ）分析を行うために、５％炭酸ガスと９５％空気を含む加湿した培養器中、３７℃下で、分離した骨髄細胞を１２日間培養した。その結果を、相対指数±標準誤差（ｎ＝５〜６）で表わす。統計学的有意性は、スチューデントテスト（＃＃Ｐ＜０．０１ｖｓ正常群と*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１ｖｓ対照群）により評価した。この結果、１０〜９０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ濃度において、化合物Ａは、骨髄細胞中のＢＦＵ−Ｅコロニー数を顕著に増大させることが見出された（図１１を参照）。図１１において、水平方向の矢印は、化合物Ａ治療（ｍｇ／Ｋｇ／ｄａｙ）を示す。この結果より、化合物Ａは、赤血球前駆細胞を活性化し、赤血球生成を強化することが明らかとなった。
【００５５】
化合物２，３，５，４'−テトラヒドロキシスチルベン２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド、即ち、化合物Ａは、いくつかの植物で見出されている。文献によると、化合物Ａは以下の薬物学的効果を有する。例えば、チロシナーゼを活性化してメラニン産生を促す（Guanら、２００８年）；脂質の過酸化作用を阻害する（Kimuraら、１９８３年）；酸素と窒素のフリーラジカルレベルを軽減し、誘起される一酸化窒素合成酵素の発現を低く調整することにより、大腸炎、結腸炎に対する保護効果を発揮する（Ｗａｎｇら、２００８年）；リポタンパクの酸化に対する拮抗性効果、増殖及び冠状動脈平滑筋細胞の酸化窒素含量の低減によって、抗アテローム性動脈硬化症効果を発揮する（Liuら、２００７年）；シクロオキシゲナーゼ‐２の酵素活性と発現を阻害することに関連する抗炎症機能を有する（Zhangら、２００７年）と、アルツハイマー症と認知障害に有益である（Wangら、２００７年）などが報告されている。
【００５６】
米国特許公開第２００５００４２３１４号公報（標題：Polygonum multiflorum Thunb．の抽出物とその製造過程及びその用途）において、Polygonum multiflorum Thunb.からの抽出物は、肝細胞と骨髄細胞の増殖、生長及び／又は分化を増大させる生物学的活性を有することが開示されている。この羊毛花の根（Fleeceflower，即ちPolygonum multiflorum Thunb.,漢方薬の何首烏）には、多くの植物化学成分が含まれている。例えば、エモジン（emodin）、クリソファノール（chrysophanol）、フィシィオン（physcion）、レイン（rhein）、クリソファノールアントロン（chrysophanol anthrone）、レスベラトロール（resveratrol）、ピセイド（piceid）、２，３，５，４’−テトラヒドロキシスチルベン−２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド、２，３，５，４’−テトラヒドロキシスチルベン−２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド−２''−Ｏ−モノガロイルエステル、２，３，５，４’−テトラヒドロキシスチルベン−２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド−３''−Ｏ−モノガロイルエステル、没食子酸（gallic acid）、カテキン（catechin）、エピカテキン（epicatechin）、３−Ｏ−ガロイル（−）−カテキン、３−Ｏ−ガロイル（−）−エピカテキン、３−Ｏ−ガロイル−プロシアニジンβ−２，３，３’−ジ−Ｏ−ガロイル−プロシアニジンＢ−２及びβ−シトステロール（β−sitosterol）が挙げられる。しかし、この米国特許公開第２００５００４２３１４号公報においては、どの化学成分に活性があるかについては触れられていない。
【００５７】
上記の通り、化合物Ａについては、赤血球生成と腎機能を強化し、Ｅｐｏ産生を増大する生物学的活性を有することが立証された。化合物Ａのグリコシル基は、例えば、ジヒドロキシアセトン、ガラクトース、グリセリンアルデヒド、トレオース、キシロース、マンノース、リボース、リブロース、キシルロース、タガトース、プシコース（アルロース）、フラクトース、ソルボース、ラムノース、エリトロース、エリトルロース、アラビノース、リキソース、アロース、アルトロース、グロース、イドース及びタロースからなる群より選ばれるモノサッカリドによって置換されても良い。
【００５８】
Ｅｐｏが赤血球生成を刺激し、赤血球生成にはＥｐｏが必要であることは良く知られている（Moritzら、１９９７年）。更に、Ｅｐｏは腎臓保護効果を有することが報告されている（Sepodesら、２００６年。Arcasoy、２００８年）。Ｅｐｏ産生の増大に加えて、化合物Ａは赤血球生成と腎機能をも強化する。
【００５９】
ＨＧＦは、多機能性のシトキン（cytokine）であり、細胞の生存、生長、運動性と、形態発生、組織再生、保護と修復に係わる。Ｅｐｏレセプタからのシグナルの導入が、ＨＧＦにより活性化されることが報告されている（Ｉｇｕｃｈｉら、１９９９年。Isobeら、２００６年）。すでに、ＨＧＦは、アレルギー性炎症（Ｉｔｏら、２００８年）、変形性関節症、リウマチ性関節炎、筋ジストロフィー、筋萎縮症、皮膚潰瘍、熱傷、強皮症、挫傷症候群（Funakoshi及びNakamura、２００３年）、又、例えば一過性虚血性発作及び血栓症といった脳血管性疾患、例えば筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー症、パーキンソン症、脊髄障害、糖尿病性網膜症、末梢性神経障害、脊柱管狭窄症、難聴などの神経変性疾患（Funakoshi及びNakamura、２００３年。Ｔａｋｅｏら、２００７年）、更に、急性肝炎、肝硬変、激症肝炎及び脂肪肝、並びに、肝臓移植、局部切除及び虚血のための外科処置（Funakoshi及びNakamura、２００３年。Mizuno及びNakamura、２００７年）、腎臓腺維症、急性腎不全、例えば腎炎症候群及び閉塞性ネフロパシーといった慢性腎不全、腎臓移植及び虚血のための外科処置、糖尿病性ネフロパシー（Matsumoto及びNakamura、２００１年。Funakoshi及びNakamura、２００３年。Ｌｉｕ、２００４年）、又、急性肺炎、肺腺維症、並びに肺臓移植、局部切除及び虚血のための外科処置（Funakoshi及びNakamura、２００３年）、例えば心臓同種移植片拒絶及び心筋炎などの炎症媒介性心臓疾患、例えば狭心症、心筋梗塞症、心筋症及び閉塞性動脈硬化症などの心血管疾患（Funakoshi及びNakamura、２００３年。Isobeら、２００６年）、又、腸粘膜障害、炎症性腸疾患（Ｉｄｏら、２００５年）、更に、胃潰瘍及び真性糖尿病（Funakoshi及びNakamura、２００３年）などを治療する潜在能力があると報告されている。
【００６０】
化合物Ａは、３，４’，５−トリヒドロキシ−トランス−スチルベンの基本化学構造を示し、酸化窒素依存性及び／又は抗酸化剤メカニズムを経由して腎臓保護機能を含む多くの生物学的活性を有する天然化学成分である（Sharmaら、２００６年。Shankarら、２００７年。Do Amaralら、２００８年。Orallo、２００８年）。又、化合物Ａは、腎機能の強化と虚血の改善において、３，４’，５−トリヒドロキシ−トランス−スチルベンに比較して優れていることが知られている（データは提示されず）。
【００６１】
ジドブジン（zidovudine）処置したヒト免疫不全ウイルスに感染された患者の貧血、化学治療を受けたガン患者の貧血、ＣＫＤの貧血の治療として、静脈内（i.v.）又は皮下（s.c.）注射により、ｒＨｕＥｐｏとＮＥＳＰが使用されたが（Fisher、２００３年）、治療を維持するためには、週１回以上投薬することが好ましいとされている。そのコスト、頻回注射（非経口投与）による不便性、及びｒＨｕＥｐｏの固有の抗原性による抗Ｅｐｏ抗体の産生などすべてを考慮した場合、この治療剤の更なる改良が必要であることが判る。３，４’，５−トリヒドロキシ−トランス−スチルベン類似物の一つの化合物Ａの経口投与は、Ｅｐｏ生成の増大、赤血球生成と腎機能の強化、及び貧血の低減を可能にする。
【００６２】
酸化窒素依存及び／又は抗酸化剤メカニズム経由による腎臓保護効果を、３，４’，５−トリヒドロキシ−トランス−スチルベン化合物が保有することは、すでに報告されている。又、化合物Ａが赤血球生成と腎機能を強化する能力は、３，４’，５−トリヒドロキシ−トランス−スチルベンより優れることも示されている。更に、化合物Ａは、組み換えＥｐｏには無い有益性を有する。例えば、化合物Ａの経口投与は、組み換えＥｐｏが有する固有の抗原性を招来せず、更に、ｒＥｐｏの投与ルートは、頻回注射を要する不便性を有し、この点でも化合物Ａの経口投与は有利性を示す。例えば、ＣＫＤ、ガン、急性及び慢性感染症、自己免疫症、炎症、臓器移植後の慢性拒絶反応、化学療法が誘発する貧血症及び組織虚血症などの貧血関連疾患に対し、化合物Ａは有用であろう。
【００６３】
本発明における上述の実施形態は、本発明の説明と記述を目的とするに過ぎず、本発明を制約するものではない。更に多くの修正と変更の可能性が存在することは言うまでもない。
【００６４】
実施形態と実施例は、本発明の原則と実際の応用を説明し、それによって本発明と異なる修正を伴う特別な意図を通した種々の実施形態などを、当業者が有効に利用できるようにするためになされた例示である。又、当業者は、本発明の主旨と範囲を逸脱しない限り、その他の実施形態を採用することができる。従って、本発明の具体的な保護請求の範囲は、上述の内容と実施例よりむしろ、特許請求の範囲に定義される。
【００６５】
本発明では、特許、特許出願及び種々の刊行物を含む若干の文献を引用し、議論に用いたが、これら引用及び／又は議論に用いた文献は、単に本発明を明瞭に説明するためのものに過ぎず、本発明の「先行技術」とは見なされるものではない。又、本明細書において引用され、議論がなされたすべての文献は、各文献が個別に参考文献に組み込まれるのと同等の範囲でその文献全体が参考文献として本明細書に組み込まれる。
【００６６】
参考文献のリスト
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エリトロポイエチン生成を強化する薬剤の製造のための、下記式（Ｉ）、
【化１】
[式中、Ｒは、グリコシル基を示す。]
で表される化合物の使用であって、前記薬剤が、それを必要とする対象に治療上有効な量で投与されることを特徴とする使用。
【請求項２】
前記グリコシル基が、ジヒドロキシアセトン、グルコース、ガラクトース、グリセルアルデヒド、トレオース、キシロース、マンノース、リボース、リブロース、キシルロース、タガトース、プシコース（アルロース）、フラクトース、ソルボース、ラムノース、エリトロース、エリトルロース、アラビノース、リキソース、アロース、アルトロース、グロース、イドース及びタロースからなる群より選ばれるモノサッカライドである請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記式（Ｉ）で表される化合物が、骨髄、肝臓、腎臓及びその任意の組み合せからなる群より選ばれる組織及び／又は器官にエリトロポイエチン生成の強化のために投与される請求項１に記載の使用。
【請求項４】
エリトロポイエチン治療が有効な疾患及び／又は障害の治療に用いられる薬剤の製造のための、下記式（Ｉ）、
【化２】
[式中、Ｒは、グリコシル基を示す。]
で表される化合物の使用であって、前記薬剤が、治療上有効な量が投与されることを特徴とする使用。
【請求項５】
前記グリコシル基が、ジヒドロキシアセトン、グルコース、ガラクトース、グリセルアルデヒド、トレオース、キシロース、マンノース、リボース、リブロース、キシルロース、タガトース、プシコース（アルロース）、フラクトース、ソルボース、ラムノース、エリトロース、エリトルロース、アラビノース、リキソース、アロース、アルトロース、グロース、イドース及びタロースからなる群より選ばれるモノサッカリドである請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記疾患及び／又は障害が、貧血症、腎不全及び赤血球生成缺損関連疾患からなる群より選ばれる少なくとも一つである請求項４に記載の使用。
【請求項７】
前記疾患及び／又は障害が、エリトロポイエチン関連保護効果から利益を得る請求項４に記載の化合物の使用。
【請求項８】
前記エリトロポイエチン関連保護効果が、神経保護、心血管保護及び腎臓保護効果、並びに組織虚血及び虚血／再潅流障害からの保護からなる群より選ばれる少なくとも一つである請求項７に記載の使用。
【請求項９】
赤血球生成を強化する薬剤の製造のための、下記式（Ｉ）、
【化３】
[式中、Ｒは、グリコシル基を示す。]
で表される化合物の使用であって、前記薬剤が、それを必要とする対象に治療上有効な量が投与されることを特徴とする使用。
【請求項１０】
前記グリコシル基が、ジヒドロキシアセトン、グルコース、ガラクトース、グリセルアルデヒド、トレオース、キシロース、マンノース、リボース、リブロース、キシルロース、タガトース、プシコース（アルロース）、フラクトース、ソルボース、ラムノース、エリトロース、エリトルロース、アラビノース、リキソース、アロース、アルトロース、グロース、イドース及びタロースからなる群より選ばれるモノサッカリドである請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
腎機能を強化する薬剤の製造のための、下記式（Ｉ）、
【化４】
[式中、Ｒは、グリコシル基を示す。]
で表される化合物の使用であって、前記薬剤が、それを必要とする対象に治療上有効な量が投与されることを特徴とする使用。
【請求項１２】
前記グリコシル基としては、ジヒドロキシアセトン、グルコース、ガラクトース、グリセリンアルデヒド、トレオース、キシロース、マンノース、リボース、リブロース、キシルロース、タガトース、プシコース（アルロース）、フラクトース、ソルボース、ラムノース、エリトロース、エリトルロース、アラビノース、リキソース、アロース、アルトロース、グロース、イドース及びタロースからなる群より選ばれる一つのモノサッカリドである請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
肝細胞増殖因子の発現を強化する薬剤の製造ための、下記式（Ｉ）、
【化５】
[式中、Ｒは、グリコシル基を示す。]
で表される化合物の使用であって、前記薬剤が、それを必要とする対象に治療上有効な量が投与されることを特徴とする使用。
【請求項１４】
前記グリコシル基が、ジヒドロキシアセトン、グルコース、ガラクトース、グリセルアルデヒド、トレオース、キシロース、マンノース、リボース、リブロース、キシルロース、タガトース、プシコース（アルロース）、フラクトース、ソルボース、ラムノース、エリトロース、エリトルロース、アラビノース、リキソース、アロース、アルトロース、グロース、イドース及びタロースからなる群より選ばれるモノサッカリドである請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
肝細胞増殖因子治療から利益が得られる患者における疾患及び／又は障害を治療する薬剤の製造のための、下記式（Ｉ）、
【化６】
[式中、Ｒはグリコシル基を示す。]
で表される化合物の使用であって、前記薬剤が、治療上有効な量が投与されることを特徴とする使用。
【請求項１６】
前記グリコシル基が、ジヒドロキシアセトン、グルコース、ガラクトース、グリセルアルデヒド、トレオース、キシロース、マンノース、リボース、リブロース、キシルロース、タガトース、プシコース（アルロース）、フラクトース、ソルボース、ラムノース、エリトロース、エリトルロース、アラビノース、リキソース、アロース、アルトロース、グロース、イドース及びタロースからなる群より選ばれるモノサッカリドである請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記疾患及び／又は障害が、肝疾患、腎疾患、肺疾患、心血管疾患、消化器疾患、神経疾患、骨疾患、関節疾患、筋疾患、皮膚疾患、圧挫症候群、アレルギー性炎症及びこれらの任意の組み合せからなる群より選ばれる少なくとも一つである請求項１５に記載の使用。
【請求項１】
エリトロポイエチン生成を強化する薬剤の製造のための、下記式（Ｉ）、
【化１】
[式中、Ｒは、グリコシル基を示す。]
で表される化合物の使用であって、前記薬剤が、それを必要とする対象に治療上有効な量で投与されることを特徴とする使用。
【請求項２】
前記グリコシル基が、ジヒドロキシアセトン、グルコース、ガラクトース、グリセルアルデヒド、トレオース、キシロース、マンノース、リボース、リブロース、キシルロース、タガトース、プシコース（アルロース）、フラクトース、ソルボース、ラムノース、エリトロース、エリトルロース、アラビノース、リキソース、アロース、アルトロース、グロース、イドース及びタロースからなる群より選ばれるモノサッカライドである請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記式（Ｉ）で表される化合物が、骨髄、肝臓、腎臓及びその任意の組み合せからなる群より選ばれる組織及び／又は器官にエリトロポイエチン生成の強化のために投与される請求項１に記載の使用。
【請求項４】
エリトロポイエチン治療が有効な疾患及び／又は障害の治療に用いられる薬剤の製造のための、下記式（Ｉ）、
【化２】
[式中、Ｒは、グリコシル基を示す。]
で表される化合物の使用であって、前記薬剤が、治療上有効な量が投与されることを特徴とする使用。
【請求項５】
前記グリコシル基が、ジヒドロキシアセトン、グルコース、ガラクトース、グリセルアルデヒド、トレオース、キシロース、マンノース、リボース、リブロース、キシルロース、タガトース、プシコース（アルロース）、フラクトース、ソルボース、ラムノース、エリトロース、エリトルロース、アラビノース、リキソース、アロース、アルトロース、グロース、イドース及びタロースからなる群より選ばれるモノサッカリドである請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記疾患及び／又は障害が、貧血症、腎不全及び赤血球生成缺損関連疾患からなる群より選ばれる少なくとも一つである請求項４に記載の使用。
【請求項７】
前記疾患及び／又は障害が、エリトロポイエチン関連保護効果から利益を得る請求項４に記載の化合物の使用。
【請求項８】
前記エリトロポイエチン関連保護効果が、神経保護、心血管保護及び腎臓保護効果、並びに組織虚血及び虚血／再潅流障害からの保護からなる群より選ばれる少なくとも一つである請求項７に記載の使用。
【請求項９】
赤血球生成を強化する薬剤の製造のための、下記式（Ｉ）、
【化３】
[式中、Ｒは、グリコシル基を示す。]
で表される化合物の使用であって、前記薬剤が、それを必要とする対象に治療上有効な量が投与されることを特徴とする使用。
【請求項１０】
前記グリコシル基が、ジヒドロキシアセトン、グルコース、ガラクトース、グリセルアルデヒド、トレオース、キシロース、マンノース、リボース、リブロース、キシルロース、タガトース、プシコース（アルロース）、フラクトース、ソルボース、ラムノース、エリトロース、エリトルロース、アラビノース、リキソース、アロース、アルトロース、グロース、イドース及びタロースからなる群より選ばれるモノサッカリドである請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
腎機能を強化する薬剤の製造のための、下記式（Ｉ）、
【化４】
[式中、Ｒは、グリコシル基を示す。]
で表される化合物の使用であって、前記薬剤が、それを必要とする対象に治療上有効な量が投与されることを特徴とする使用。
【請求項１２】
前記グリコシル基としては、ジヒドロキシアセトン、グルコース、ガラクトース、グリセリンアルデヒド、トレオース、キシロース、マンノース、リボース、リブロース、キシルロース、タガトース、プシコース（アルロース）、フラクトース、ソルボース、ラムノース、エリトロース、エリトルロース、アラビノース、リキソース、アロース、アルトロース、グロース、イドース及びタロースからなる群より選ばれる一つのモノサッカリドである請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
肝細胞増殖因子の発現を強化する薬剤の製造ための、下記式（Ｉ）、
【化５】
[式中、Ｒは、グリコシル基を示す。]
で表される化合物の使用であって、前記薬剤が、それを必要とする対象に治療上有効な量が投与されることを特徴とする使用。
【請求項１４】
前記グリコシル基が、ジヒドロキシアセトン、グルコース、ガラクトース、グリセルアルデヒド、トレオース、キシロース、マンノース、リボース、リブロース、キシルロース、タガトース、プシコース（アルロース）、フラクトース、ソルボース、ラムノース、エリトロース、エリトルロース、アラビノース、リキソース、アロース、アルトロース、グロース、イドース及びタロースからなる群より選ばれるモノサッカリドである請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
肝細胞増殖因子治療から利益が得られる患者における疾患及び／又は障害を治療する薬剤の製造のための、下記式（Ｉ）、
【化６】
[式中、Ｒはグリコシル基を示す。]
で表される化合物の使用であって、前記薬剤が、治療上有効な量が投与されることを特徴とする使用。
【請求項１６】
前記グリコシル基が、ジヒドロキシアセトン、グルコース、ガラクトース、グリセルアルデヒド、トレオース、キシロース、マンノース、リボース、リブロース、キシルロース、タガトース、プシコース（アルロース）、フラクトース、ソルボース、ラムノース、エリトロース、エリトルロース、アラビノース、リキソース、アロース、アルトロース、グロース、イドース及びタロースからなる群より選ばれるモノサッカリドである請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記疾患及び／又は障害が、肝疾患、腎疾患、肺疾患、心血管疾患、消化器疾患、神経疾患、骨疾患、関節疾患、筋疾患、皮膚疾患、圧挫症候群、アレルギー性炎症及びこれらの任意の組み合せからなる群より選ばれる少なくとも一つである請求項１５に記載の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２０１２−５１４０００（Ｐ２０１２−５１４０００Ａ）
【公表日】平成２４年６月２１日（２０１２．６．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４３６１１（Ｐ２０１１−５４３６１１）
【出願日】平成２１年１２月２１日（２００９．１２．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６８９５７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７５２６３
【国際公開日】平成２２年７月１日（２０１０．７．１）
【出願人】（５１０１４３３５４）
【出願人】（５１０１４３３６５）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年６月２１日（２０１２．６．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月２１日（２００９．１２．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６８９５７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７５２６３
【国際公開日】平成２２年７月１日（２０１０．７．１）
【出願人】（５１０１４３３５４）
【出願人】（５１０１４３３６５）
【Ｆターム（参考）】
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