走査型顕微鏡および走査型顕微鏡システム
【課題】走査型顕微鏡において、低ノイズの画像を高速で取得する。
【解決手段】走査型顕微鏡は、光源ユニット１２０、対物レンズ１１５、スキャナユニット１１４、ピンホールアレイ１１３、光学的分離器１１２、光量検出器１１６、および位置検出システム１１７を有する。光源ユニット１２０は光パルスを複数の出射点から順番に繰返し出射する。対物レンズ１５は光パルスを試料上に結像させる。スキャナユニット１１４は対物レンズにより結像された光パルスを試料に走査させる。ピンホールアレイ１１３は試料に反射された反射光および蛍光の少なくとも一方の結像位置にピンホールが形成される。光学的分離器１１２は反射光および蛍光の少なくとも一方を偏向させることにより透過光の光路から分離する。光量検出器１１６は反射光または蛍光の光量を検出する。位置検出システム１１７は照射光の照射位置を検出する。
【解決手段】走査型顕微鏡は、光源ユニット１２０、対物レンズ１１５、スキャナユニット１１４、ピンホールアレイ１１３、光学的分離器１１２、光量検出器１１６、および位置検出システム１１７を有する。光源ユニット１２０は光パルスを複数の出射点から順番に繰返し出射する。対物レンズ１５は光パルスを試料上に結像させる。スキャナユニット１１４は対物レンズにより結像された光パルスを試料に走査させる。ピンホールアレイ１１３は試料に反射された反射光および蛍光の少なくとも一方の結像位置にピンホールが形成される。光学的分離器１１２は反射光および蛍光の少なくとも一方を偏向させることにより透過光の光路から分離する。光量検出器１１６は反射光または蛍光の光量を検出する。位置検出システム１１７は照射光の照射位置を検出する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、共焦点走査を行う走査型顕微鏡および走査型顕微鏡システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、数多くの種類の共焦点走査型顕微鏡が提案され（非特許文献１参照）、製品化されている。これらの共焦点走査型顕微鏡は、大きく分けて、シングルビーム走査装置を用いた顕微鏡と、マルチビーム走査装置を用いた顕微鏡（特許文献１〜特許文献３参照）の２種類に分類される。以下に、２種類の顕微鏡の基本構成を簡単に説明する。
【０００３】
まず、シングルビーム走査装置を用いた走査型顕微鏡（以下、シングルビーム走査型顕微鏡と呼ぶ）の基本構成を説明する。シングルビーム走査型顕微鏡において、光源より発した光束は、集光レンズによって一点に集光される。集光位置に配置された第１の微小開口の透過像が、第１のリレーレンズと対物レンズを介して標本上に結像される。標本によって反射された光束は、対物レンズと第１のリレーレンズとの間に配置されたビームスプリッタによって、第１の微小開口の方向とは異なる方向に偏向される。偏向された光束は、第２のリレーレンズによって、第１の微小開口の共役位置にある第２の微小開口に集光される。第２の微小開口を通過した光の強度が、例えばフォトマルチプライアなどの検出器によって検出される。
【０００４】
また、対物レンズとビームスプリッタの間には走査装置が配置されている。この走査装置は、例えばガルバノミラーやポリゴンミラーを有していて、第１の微小開口の像を標本面上で走査する。この走査装置と検出器に接続されているコントローラは、走査装置による光束の偏向量から、標本上での第１の微小開口の結像位置を検出する。検出位置と検出器により検出された光の強度とに基づいて、広い領域における標本像が再構成され、テレビモニタなどの画像表示装置に表示される。なお、光源としてシングルモード発振レーザを用いた場合には、上述の第１の微小開口が省略されることもある。
【０００５】
次に、マルチビーム走査装置を用いた走査型顕微鏡（以下、マルチビーム走査型顕微鏡と呼ぶ）の一例としてニポーディスクを用いた走査型顕微鏡の基本構成を説明する。マルチビーム走査型顕微鏡において、光源より発した光束は、コンデンサレンズによってニポーディスク上に照射される。ニポーディスクに設けられた複数の小開口を透過することによって分割された複数の光束は、夫々、リレーレンズと対物レンズを介して標本上の一点に集光される。標本から反射した光束は、対物レンズとリレーレンズとを介して再びニポーディスクの小開口上に集光される。
【０００６】
ニポーディスクとコンデンサレンズとの間に配置されたビームスプリッタは、ニポーディスクからの透過光を、光源とは異なる方向へ偏向させる。偏向された透過光が撮影レンズによってイメージセンサ上に集光される。このような構成により、イメージセンサ上には、標本の反射率に比例した像が形成される。形成された像がイメージセンサにより検出され、画像表示装置に表示される。ニポーディスクに設けられた複数の小開口は所定の間隔を空けて設けられるので、標本上に一度に当たる照明は多重スポット照明となる。しかし、ニポーディスクをモータによって高速に回転させているので、短時間ですべての標本面上を走査でき、肉眼による共焦点の観察が可能になる。
【０００７】
このように、両者の基本構成の差異から理解されるように、シングルビーム走査型顕微鏡においては、光源の照明効率などが良いが、顕微鏡の視野全体の走査時間はマルチビーム走査型顕微鏡より長い。近年、試料の外観などの高速な時間変化を観察することが求められている。例えば、ビデオレート以上の１００ｆｐｓで画像を取得するためには、走査装置に数十ＫＨｚ相当の高速性能が必要である。しかし、走査装置に備えられる反射部のサイズを大きく保ったまま高速性能を満たすことは困難である。一方、上述のようにニポーディスクを用いているものを含めたマルチビーム走査型顕微鏡においては、走査時間が非常に短いので、１０００ｆｐｓで高速に画像を取得可能であり、試料外観の高速な時間変化を観察するのに適している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表平１−５０３４９３号公報
【特許文献２】特開平５−６０９８０号公報
【特許文献３】特開平８−２１１２９６号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】T.R.Corle and G.S.Kino, “Confocal Scanning Optical Microscopy and Related Imaging Systems”, Academic Press (1966)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ところで、このような高速観察に好適なマルチビーム走査型顕微鏡においても、散乱を伴う試料の観察において問題点がある。走査型顕微鏡は、資料中に集光したレーザのスポットと共役な位置にピンホールを配置することにより、レーザのスポット近傍のみの信号光（例えば、蛍光）を選択して取得することを可能足らしめることを特徴としている。それゆえ、試料による光の散乱が大きくないとみなせる場合には、その効力が発揮される。しかし、特に生体組織を試料とする場合には、生体組織の強散乱性によってレーザスポット近傍の信号光はたちまち散乱される。従って、ニポーディスクによって生成された多数のマルチビームが標本上に集光されても、マルチビームで発生した信号光は強く散乱し、対応する小開口とは別の小開口に信号光が染出すクロストークが発生する。小開口は光学的に共役な微小領域以外の微小領域における信号光も透過するため、ノイズ成分が増加する。クロストークを減少させるためにはマルチビームの空間的な間隔を広げることが考えられる。しかし、散乱の影響が非常に大きい場合には、マルチビームの本数が２本であったとしても、クロストークが発生し得る。
【００１１】
従って、上記のような問題点に鑑みてなされた本発明では、マルチビームによって発生する信号光に空間的なクロストークが生じても、ノイズの少ない画像を取得可能な走査型顕微鏡および操作型顕微鏡システムの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上述した諸課題を解決すべく、第１の発明による走査型顕微鏡は、
光パルスを、複数の出射点から順番に繰返し出射する光源ユニットと、
複数の出射点から出射される前記光パルスを試料上に別々に集光させる対物レンズと、
対物レンズにより集光された複数の光パルスの走査点を試料に対して相対的に移動させるスキャナユニットと、
対物レンズにより集光された光パルスの集光点と共役な位置にピンホールが形成されたピンホールアレイと、
光源ユニットから対物レンズまでの間の光パルスの光路上に設けられ、光パルスの照射により試料から発する信号光を光パルスから分離する光学的分離器と、
光学的分離器により分離された信号光の光量を検出する光量検出器と、
光量検出器による光量の検出時点における走査点を検出する位置検出システムと、
光量と走査点に基づいて試料の画像を再構成する画像再構成装置に、光量と照射位置とを出力する出力器とを備える
ことを特徴とするものである。
【００１３】
本発明の第１の発明による操作型顕微鏡システムは、
光パルスを、複数の出射点から順番に繰返し出射する光源ユニットと、
複数の出射点から出射される光パルスを試料上に別々に集光させる対物レンズと、
対物レンズにより集光された複数の光パルスの走査点を試料に対して相対的に移動させるスキャナユニットと、
対物レンズにより集光された光パルスの集光点と共役な位置にピンホールが形成されたピンホールアレイと、
光源ユニットから対物レンズまでの間の光パルスの光路上に設けられ、光パルスの照射により試料から発する信号光を光パルスから分離する光学的分離器と、
光学的分離器により分離された信号光の光量を検出する光量検出器と、
光量検出器による光量の検出時点における走査点を検出する位置検出システムと、
光量と走査点とに基づいて試料の画像を再構成する画像再構成装置と、
画像再構成装置が再構成した試料の画像を表示するモニタとを備える
ことを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１４】
上記のように構成された本発明に係る走査型顕微鏡によれば、マルチビームを用いながら、ノイズの少ない画像を取得可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る走査型顕微鏡を含む走査型顕微鏡システムの光学的な概略構成および電気的な概略構成を示す構成図である。
【図２】図１の光源ユニットの構成を概略的に図示するブロック図である。
【図３】第１〜第４の光導波路に入射した励起光パルスの出射時期を示すタイミングチャートである。
【図４】走査型顕微鏡により観察される試料の走査範囲を示す図である。
【図５】励起光パルスの照射位置の時間変化を示すタイミングチャートである。
【図６】第１〜第４の出射端を直線上に並べない場合の試料の走査範囲を示す図である。
【図７】本発明の第２の実施形態に係る走査型顕微鏡を含む走査型顕微鏡システムの光学的な概略構成および電気的な概略構成を示す構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明の適用した走査型顕微鏡の実施形態について、図面を参照して説明する。
【００１７】
図１は、本発明の第１の実施形態に係る走査型顕微鏡を含む走査型顕微鏡システムの光学的な構成および電気的な概略構成を示す構成図である。
【００１８】
走査型顕微鏡システム１００は、走査型顕微鏡１１０、画像処理装置１０１、モニタ１０２によって構成される。後に詳述するように、走査型顕微鏡１１０は、スポット状の励起光で試料Ｓを走査する。また、試料Ｓに照射された励起光による蛍光の光量が、走査型顕微鏡１１０により検出される。また、走査型顕微鏡１１０によりスポット状の励起光の照射位置が検出される。蛍光の光量および照射位置が、走査型顕微鏡１１０から画像処理装置１０１に伝達される。画像処理装置１０１では、蛍光の光量と照射位置に基づいて、試料Ｓの画像を再構成する。再構成された画像はモニタ１０２に送信され、表示される。
【００１９】
次に、走査型顕微鏡１１０の構成について、説明する。走査型顕微鏡１１０は、光源ユニット１２０、第１〜第５のレンズ１１１ａ〜１１１ｅ、ダイクロイックミラー１１２、ピンホールアレイ１１３、スキャナユニット１１４、対物レンズ１１５、ＰＭＴ１１６（光量検出器、出力器）、位置検出部１１７（出力器）、および制御部１１８などによって構成される。
【００２０】
光源ユニット１２０は、図２に示すように、ＬＤ１２１、変調器１２２、分岐器１２３、遅延器１２４、および位置規制体１２５によって構成される。
【００２１】
生体に照射すると蛍光を発光させる励起光がＬＤ１２１から出射される。励起光は、変調器１２２により（１）式を満たす繰返し周波数Ｒ、パルス幅Ｔの励起光パルスに変換される。
【００２２】
Ｎ×（Ｔ＋τ）＜１／Ｒ （１）
なお（１）式において、τは励起光が照射された生体から発光され発光が停止するまでの蛍光寿命である。また、Ｎは分岐器１２３により分岐される光の列数であり、本実施形態では４である。
【００２３】
励起光パルスは、分岐器１２３により強度および位相が実質的に等しくなるように４列に分岐され、遅延器１２４に入射される。なお、分岐器１２３は、例えばハーフミラー（図示せず）およびミラー（図示せず）の組合せ、ファイバカプラ（図示せず）の組合せ、および回折格子などにより形成可能である。
【００２４】
遅延器１２４には、第１〜第４の遅延路１２４ａ〜１２４ｄが設けられる。分岐器１２３により分岐された４列の励起光パルスは、別々の遅延路１２４ａ〜１２４に入射される。繰返し周波数Ｒの励起光パルスが各遅延路１２４ａ〜１２４ｄから出射される時期がずれるように、各遅延路１２４ａ〜１２４ｄの長さが調整される。例えば、第２、第３、および第４の遅延路１２４ｂ、１２４ｃ、１２４ｄは、それぞれ第１の遅延路１２４ａよりもΔ（＝ｃ／（４ｎＲ）、ｃは光速、ｎは第１〜第４の光導波路１２４ａ〜１２４ｄの屈折率とする）、２Δ、３Δだけ長くなるように形成される。
【００２５】
このような構成により、図３に示すように、同時に第１〜第４の遅延路１２４ａ〜１２４ｄの入射端に繰返し周波数Ｒで入射する励起光パルスは、互いに隣合う遅延路とは繰返し周波数が４Ｒとなるように、第１〜第４の遅延路１２４ａ〜１２４ｄの第１〜第４の出射端ｔ１〜ｔ４から順番に繰返し、出射される。第１〜第４の出射端ｔ１〜ｔ４は、一定の間隔で直線上に並び且つ出射する励起光パルスの主光線が互いに平行となるように、位置規制体１２５により固定される。
【００２６】
図１において、第１〜第４の出射端ｔ１〜ｔ４から出射される励起光パルスは、第１、第２のレンズ１１１ａ、１１１ｂによってテレセントリックな状態でピンホールアレイ１１３に形成される４つのピンホールに別々に集光される。ピンホールに集光された励起光パルスは、ピンホールを通過し、第３のレンズ１１１ｃ、スキャナユニット１１４、第４、第５のレンズ１１１ｄ、１１１ｅ、および対物レンズ１１５を介して試料表面乃至試料内部に集光される。
【００２７】
なお、第３、第４のレンズ１１１ｃ、１１１ｄはリレー光学系を形成する。また、第４のレンズ１１１ｄによりスキャナユニット１１４と対物レンズ１１５の瞳位置とが共役位置に配置される。第４のレンズ１１１ｄを用いることにより、ピンホールを通過した励起光パルスを正しい位置および角度で対物レンズ１１５に入射させることが可能である。なお、後述するように、スキャナユニット１１４は互いに直交する軸に回動する第１、第２のガルバノミラー１１４ａ、１１４ｂを有しており、第１、第２のガルバノミラー１１４ａ、１１４ｂを瞳位置の共役位置近傍に配置することにより、スキャナユニット１１４と瞳位置とを共役位置に配置することが可能である。また、第１、第２のガルバノミラー１１４ａ、１１４ｂと瞳位置とが共役となるように、第１、第２のガルバノミラー１１４ａ、１１４ｂ間にリレーレンズを設けることにより、スキャナユニット１１４と瞳位置とを共役位置に配置する構成であってもよい。
【００２８】
スキャナユニット１１４は、光軸と直交する２次元面内において試料表面乃至試料内部を励起光パルスによって走査する。なお、前述のように、励起光パルスは第１〜第４の出射端ｔ１〜ｔ４から出射され、試料上にスポット状に照射される。したがって、スキャナユニット１１４は、試料表面乃至試料内部を４列の励起光パルスによって順次走査する。図４に示すように、走査により、走査型顕微鏡１００の視野範囲全域ｅａ（以後、全照射領域と呼ぶ）が４列の励起光パルスによって照射される。
【００２９】
第１のガルバノミラー１１４ａにより、第１の走査方向に沿って試料表面乃至試料内部が走査される。また、第２のガルバノミラー１１４ｂにより、第１の走査方向に垂直な第２の走査方向に沿って試料表面乃至試料内部が走査される。第１の出射端ｔ１に対応する第１列の励起光パルスｅｐ１によって、全照射領域ｅａを第２の走査方向に沿って４分割した第１の部分領域ｕａ１がラスタ走査される。同様に、第２〜第４の出射端ｔ２〜ｔ４に対応する第２〜第４列の励起光パルスｅｐ２〜ｅｐ４によって、第１の部分領域ｕａ１と別の第２〜第４の部分領域ｕａ２〜ｕａ４がラスタ走査される。例えば、全照射領域ｅａを５１２本の走査線によって走査する場合には、第１〜第１２８の走査線を第１列の励起光パルスｅｐ１によって走査させ、第１２９〜第２５６の走査線を第２列の励起光パルスによって走査させ、第２５７〜第３８４の走査線を第３列の励起光パルスによって走査させ、第３８５〜第５１２の走査線を第４列の励起光パルスによって走査させる。
【００３０】
前述のように、隣り合う列の励起光パルスは１／（４×Ｒ）のずれを有するので、図５に示すように、各部分領域ｕａ１〜ｕａ４には、同時にではなく時間をずらしながら励起光パルス（符号ｅｐ参照）が順番に繰返し照射される。
【００３１】
なお、上述のように、第１〜第４列の励起光パルスにより、それぞれ第１〜第４の部分領域ｕａ１〜ｕａ４が走査されるように、第１〜第４の出射端ｔ１〜ｔ４の間隔が定められる。すなわち、第１〜第４の出射端ｔ１〜ｔ４における励起光パルスの光軸に垂直な仮想平面において、第１の走査方向に対応する第１の対応方向に垂直な直線上に等間隔になるように第１〜第４の出射端ｔ１〜ｔ４の位置が決められる。
【００３２】
励起光パルスが照射されると、照射された励起光パルスの集光点近傍において試料が励起されて蛍光（信号光）が発生する。対物レンズ１１５による集光点とピンホールとが共役位置となるように、対物レンズ１１５およびピンホールアレイ１１３が配置されており、集光点において発生する蛍光成分のみがピンホールアレイ１１３の各ピンホールに結像する。集光点近傍において発生する蛍光成分はピンホールの周りにはみ出して結像するため、通過が制限される。したがって、集光点における蛍光成分のみがピンホールを通過する。
【００３３】
ピンホールアレイ１１３を通過した蛍光は、第２のレンズ１１１ｂを透過してダイクロイックミラー１１２に到達する。蛍光はダイクロイックミラー１１２により反射され、ダイクロイックミラー１１２を透過する励起光の試料Ｓによる反射光から分離される。反射された蛍光はＰＭＴ１１６によって受光される。ＰＭＴ１１６により受光量に応じた画素信号が生成され、画像処理装置１０１に伝達される。
【００３４】
なお、各列の励起光パルスに対応する蛍光は第２のレンズ１１１ｂ、ダイクロイックミラー１１２を介して、ＰＭＴ１１６の受光部上に広く分布する。蛍光の入射範囲より広い受光部を有するＰＭＴ１１６が選択され、用いられる。
【００３５】
なお、画像処理装置１０１には画素信号だけでなく、以下に説明するように位置検出部１１７において検知される励起光パルスの走査点の位置が位置情報として伝達される。位置検出部１１７は、第１、第２のガルバノミラー１１４ａ、１１４ｂに設けられる回転速度メータ（図示せず）により検出される第１、第２のガルバノミラー１１４ａ、１１４ｂの回転速度に基づいて第１、第２のガルバノミラー１１４ａ、１１４ｂによる各列の励起光パルスの偏向方向を算出する。また、位置検出部１１７には、制御部１１８によって検知される励起光パルスを出射中の出射端が伝達される。なお、出射中の出射端は、いかなる方法で検知してもよい。例えば、制御部１１８により励起光パルスを出射開始時期と出射開始後の経過時間とに基づいて、いずれの出射端から励起光パルスが出射されているかを検知可能である。位置検出部１１７は、偏向方向および出射中の出射端に基づいて、励起光パルスが照射されている走査点の位置を検出する。
【００３６】
光源ユニット１２０、スキャナユニット１１４、および位置検出部１１７は、制御部１１８の制御に基づいて、それぞれ励起光パルスを出射し、第１、第２のガルバノミラー１１４ａ、１１４ｂによる走査を実行し、励起光パルスの照射位置を検出する。
【００３７】
画像処理装置１０１は、画素信号と位置信号とに基づいて２次元状の試料の画像を再構成する。再構成された、２次元画像はモニタ１０２に送信され、表示される。
【００３８】
以上のような構成の第１の実施形態の走査型顕微鏡によれば、低ノイズの画像を高速に取得可能である。前述のように、本実施形態においても、試料Ｓにおける蛍光は散乱により対応するピンホール以外のピンホールにも入射し得る、すなわち空間的なクロストークが発生し得る。しかし、本実施形態の走査型顕微鏡によれば、複数の出射端から出射されるマルチビームの試料Ｓへの照射時期および試料Ｓからの蛍光の発生時期を分離させることが可能である。蛍光の発生時期を分離することにより、空間的なクロストークが発生しても別の照射位置における蛍光の検出が防止されるので、低ノイズの試料画像を再構成可能である。また、４本のマルチビームにより試料を走査するので、既存のガルバノミラーを用いながら走査速度を向上させることが可能である。したがって、高速で試料画像を採取可能である。
【００３９】
また、第１の実施形態の走査型顕微鏡によれば、上述のように第１〜第４の出射端ｔ１〜ｔ４を配置することにより、照射時期を分離させた構成においてスキャナユニット１１４の制御の簡素化を図りながら、フレームレートの最速化を図ることが可能である。例えば本実施形態と異なる構成として、第１、第２、第３、第４の出射端ｔ１、ｔ２、ｔ３、ｔ４から出射される励起光パルスが、第（４ｎ−３）、第（４ｎ−２）、第（４ｎ−１）、第４ｎの走査線（１≦ｎ≦１２８）に沿って走査される構成が考えられる。このような構成においてフレームレートを最速化するためには、第１の走査方向に沿った端部に走査点が達したときに、高速で第２の走査方向に４本の走査線に相当する距離だけ走査点を移動させる必要がある。したがって、第１のガルバノミラー１１４ａによる偏向方向に応じて第２のガルバノミラー１１４ｂによる走査速度を変える必要がある。一方、本実施形態の構成によれば、第１のガルバノミラー１１４ａの偏向方向に拠らず、第２のガルバノミラー１１４の走査速度を一定に保つことが可能なので、スキャナユニット１１４の制御が簡素化される。
【００４０】
また、第１の実施形態の走査型顕微鏡によれば、上述のように第１〜第４の出射端ｔ１〜ｔ４を配置することにより、ＰＭＴ１１６により受光した蛍光を有効に活用することが可能である。第１〜第４の出射端ｔ１〜ｔ４が第１の対応方向に垂直な直線上に配置されない場合には、図６に示すように、第１の走査方向に沿った各列の励起光パルスの走査範囲が変わる。それゆえ、矩形の画像として再現する場合には、画像の再現に用いられない領域（斜線部参照）も走査され、用いられない蛍光を受光することがある。一方、本実施形態の構成によれば、画像の再現に用いられる領域のみが走査されるので、受光する蛍光を有効に活用することが可能である。
【００４１】
また、第１の実施形態の走査型顕微鏡によれば、上述のように第２のレンズ１１１ｂとスキャナユニット１１４との間にピンホールアレイ１１３を設けることにより、試料Ｓに照射する励起光パルスを制限するためのピンホールと共焦点効果を得るためのピンホールを共用することが可能である。ピンホールを共用することにより構成の簡素化が可能である。
【００４２】
次に本発明の第２の実施形態に係る走査型顕微鏡について説明する。第２の実施形態は、光源ユニット１２０とピンホールアレイ１１３間およびダイクロイックミラー１１２とＰＭＴ１１６間の構成において第１の実施形態と異なっている。以下に、第１の実施形態と異なる点を中心に第２の実施形態について説明する。なお、第１の実施形態と同じ機能および構成を有する部位には同じ符号を付す。
【００４３】
図７に示すように、第２の実施形態を適用した走査型顕微鏡２００における光源ユニット１２０、第３〜第５のレンズ１１１ｃ〜１１１ｅ、ダイクロイックミラー１１２、ピンホールアレイ１１３、スキャナユニット１１４、対物レンズ１１５、位置検出部１１７、および制御部１１８の機能および構成は第１の実施形態と同じである。また、画像処理装置１０１およびモニタ１０２の機能および構成も第１の実施形態と同じである。
【００４４】
第２の実施形態では、第１、第２のレンズ１１１ａ、１１１ｂの代わりに、第１、第２のレンズアレイ２１１ａ、２１１ｂが設けられる。第１、第２のレンズアレイ２１１ａ、２１１ｂには４つのレンズが設けられる。各列の励起光パルスが第１のレンズアレイ２１１ａにおける４つのレンズを透過することにより平行光に変換される。平行光はダイクロイックミラー１１２を透過して、第２のレンズアレイ２１１ｂにおける４つのレンズを透過することによって、ピンホールアレイ１１３に形成されるピンホールに集光される。
【００４５】
第１の実施形態と同じく、ピンホールを通過した各列の励起光パルスにより試料Ｓにおいて発生する蛍光がピンホールアレイ１１３に到達する。第１の実施形態と異なり、ピンホールを通過した蛍光は第２のレンズアレイ２１１ｂによって平行光に変換される。変換された平行光はダイクロイックミラー１１２により分離され、ＰＭＴ１１６に向かって反射される。ダイクロイックミラー１１２とＰＭＴ１１６との間には、集光レンズ１１９が設けられる。集光レンズ１１９により、各列に対応する蛍光はＰＭＴ１１６の一点に集光される。
【００４６】
第１の実施形態と同じく、ＰＭＴ１１６おいて受光量に応じた画素信号が生成され、画像処理装置１０１に伝達される。また、第１の実施形態と同じく、画像処理装置１０１は、画素信号と位置検出部１１７から伝達された位置信号に基づいて、２次元状の試料の画像を再構成する。
【００４７】
以上のような構成の第２の実施形態の走査型顕微鏡によっても、低ノイズの画像を高速に取得可能である。また、第１の実施形態と同じく、第２の実施形態の走査型顕微鏡によってもフレームレートの最速化、蛍光の有効活用、構成の簡素化を図ることが可能である。
【００４８】
さらに、第１の実施形態と異なり、ピンホールアレイ１１３から出射され第２のレンズアレイ２１１ｂを透過した蛍光は、励起光パルスを出射した出射端によらず平行な方向に出射される。平行な方向に出射されるので集光レンズ１１９を用いることによりＰＭＴ１１６の１点に集光させることが可能である。したがって、第１の実施形態と異なり、検出部の小さなＰＭＴ１１６を用いることが可能となる。
【００４９】
本発明を諸図面や実施例に基づき説明してきたが、当業者であれば本開示に基づき種々の変形や修正を行うことが容易であることに注意されたい。従って、これらの変形や修正は本発明の範囲に含まれることに留意されたい。
【００５０】
例えば、上記の第１、第２の実施形態において、蛍光を分離するためにダイクロイックミラー１１２を用いたが、偏光ビームスプリッタとλ／４板とを組合わせた構成を用いて、試料の反射光を分離してＰＭＴ１１６で受光してもよい。光源から出射された光を透過し、反射光および蛍光の少なくとも一方を光源から出射された光から分離するいかなる光学的分離器を用いてもよい。
【００５１】
また、第１、第２の実施形態において、スキャナユニット１１４が励起光パルスを偏向させることによって試料が走査される構成であるが、試料を変位させるステージスキャナを用いて複数の励起光パルスを試料に対して相対的に移動させることにより走査される構成であってもよい。
【００５２】
また、第１、第２の実施形態において、光源ユニット１２０において光導波路の長さを変えることにより遅延器１２４が形成されるが、従来公知のいかなる遅延器を用いてもよい。例えば、ミラーとハーフミラーとを組合わせることによっても、本実施形態と同様の機能を有する遅延器を形成可能である。
【００５３】
また、第１、第２の実施形態において、ＬＤ１２１から出射した励起光を変調させることにより励起光パルスを生成する構成であるが、励起光パルスを発光するように励起光源を駆動する構成であってもよい。また、第１、第２の実施形態において、分岐器１２３を用いて励起光パルスを４列に分岐する構成であるが、分岐器１２３を用いずに直接４つの光源を設けて、励起光パルスを発する構成であってもよい。光源を別々に設けるのであれば、遅延器１２３を省いて、励起光パルスの発光時期をずらす構成であっても第１、第２の実施形態と同様の効果を得ることが可能である。
【００５４】
また、第１、第２の実施形態において、第１、第２のガルバノミラー１１４ａ、１１４ｂの回転速度に基づいて励起光パルスの走査点を検出する構成であるが、他の方法により走査点を検出する構成であってもよい。例えば、エンコーダを用いて回転位置を検出して、回転位置に基づいて走査点を検出する構成であってもよい。
【００５５】
また、第１、第２の実施形態において、ＬＤ１２１は励起光を出射する構成であるが、通常の可視光を出射する光源を用いて反射光に基づいて試料の２次元画像を再構成する構成であってもよい。
【００５６】
また、第１の実施形態において、ダイクロイックミラー１１２は第１、第２のレンズ１１１ａ、１１１ｂの間に設けられる構成であるが、第１のレンズ１１１ａから対物レンズ１１５の間のいかなる位置に設けられてもよい。ただし、ＰＭＴ１１６に検出される蛍光がピンホールにより制限されることが必要であり、ダイクロイックミラー１１２によりＰＭＴ１１６に受光される蛍光をピンホールに通過させる必要がある。したがって、ピンホールアレイ１１３よりも対物レンズ１１５側にダイクロイックミラー１１２を設ける場合には、ダイクロイックミラー１１２の反射方向において対物レンズ１１５の焦点と共役な位置にピンホールアレイ１１３を設けることが必要である。
【符号の説明】
【００５７】
１００、２００ 走査型顕微鏡システム
１０１ 画像処理装置
１０２ モニタ
１１０ 走査型顕微鏡
１１１ａ〜１１１ｄ 第１〜第４のレンズ
１１２ ダイクロイックミラー
１１３ ピンホールアレイ
１１４ スキャナユニット
１１４ａ、１１４ｂ 第１、第２のガルバノミラー
１１５ 対物レンズ
１１６ ＰＭＴ
１１７ 位置検出部
１１９ 集光レンズ
１２０ 光源ユニット
１２１ ＬＤ
１２２ 変調器
１２３ 分岐器
１２４ 遅延器
１２４ａ〜１２４ｄ 第１〜第４の光導波路
１２５ 位置規制体
２１１ａ、２１１ｂ 第１、第２のレンズアレイ
ｓ 試料
ｔ１〜ｔ４ 第１〜第４の出射端
【技術分野】
【０００１】
本発明は、共焦点走査を行う走査型顕微鏡および走査型顕微鏡システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、数多くの種類の共焦点走査型顕微鏡が提案され（非特許文献１参照）、製品化されている。これらの共焦点走査型顕微鏡は、大きく分けて、シングルビーム走査装置を用いた顕微鏡と、マルチビーム走査装置を用いた顕微鏡（特許文献１〜特許文献３参照）の２種類に分類される。以下に、２種類の顕微鏡の基本構成を簡単に説明する。
【０００３】
まず、シングルビーム走査装置を用いた走査型顕微鏡（以下、シングルビーム走査型顕微鏡と呼ぶ）の基本構成を説明する。シングルビーム走査型顕微鏡において、光源より発した光束は、集光レンズによって一点に集光される。集光位置に配置された第１の微小開口の透過像が、第１のリレーレンズと対物レンズを介して標本上に結像される。標本によって反射された光束は、対物レンズと第１のリレーレンズとの間に配置されたビームスプリッタによって、第１の微小開口の方向とは異なる方向に偏向される。偏向された光束は、第２のリレーレンズによって、第１の微小開口の共役位置にある第２の微小開口に集光される。第２の微小開口を通過した光の強度が、例えばフォトマルチプライアなどの検出器によって検出される。
【０００４】
また、対物レンズとビームスプリッタの間には走査装置が配置されている。この走査装置は、例えばガルバノミラーやポリゴンミラーを有していて、第１の微小開口の像を標本面上で走査する。この走査装置と検出器に接続されているコントローラは、走査装置による光束の偏向量から、標本上での第１の微小開口の結像位置を検出する。検出位置と検出器により検出された光の強度とに基づいて、広い領域における標本像が再構成され、テレビモニタなどの画像表示装置に表示される。なお、光源としてシングルモード発振レーザを用いた場合には、上述の第１の微小開口が省略されることもある。
【０００５】
次に、マルチビーム走査装置を用いた走査型顕微鏡（以下、マルチビーム走査型顕微鏡と呼ぶ）の一例としてニポーディスクを用いた走査型顕微鏡の基本構成を説明する。マルチビーム走査型顕微鏡において、光源より発した光束は、コンデンサレンズによってニポーディスク上に照射される。ニポーディスクに設けられた複数の小開口を透過することによって分割された複数の光束は、夫々、リレーレンズと対物レンズを介して標本上の一点に集光される。標本から反射した光束は、対物レンズとリレーレンズとを介して再びニポーディスクの小開口上に集光される。
【０００６】
ニポーディスクとコンデンサレンズとの間に配置されたビームスプリッタは、ニポーディスクからの透過光を、光源とは異なる方向へ偏向させる。偏向された透過光が撮影レンズによってイメージセンサ上に集光される。このような構成により、イメージセンサ上には、標本の反射率に比例した像が形成される。形成された像がイメージセンサにより検出され、画像表示装置に表示される。ニポーディスクに設けられた複数の小開口は所定の間隔を空けて設けられるので、標本上に一度に当たる照明は多重スポット照明となる。しかし、ニポーディスクをモータによって高速に回転させているので、短時間ですべての標本面上を走査でき、肉眼による共焦点の観察が可能になる。
【０００７】
このように、両者の基本構成の差異から理解されるように、シングルビーム走査型顕微鏡においては、光源の照明効率などが良いが、顕微鏡の視野全体の走査時間はマルチビーム走査型顕微鏡より長い。近年、試料の外観などの高速な時間変化を観察することが求められている。例えば、ビデオレート以上の１００ｆｐｓで画像を取得するためには、走査装置に数十ＫＨｚ相当の高速性能が必要である。しかし、走査装置に備えられる反射部のサイズを大きく保ったまま高速性能を満たすことは困難である。一方、上述のようにニポーディスクを用いているものを含めたマルチビーム走査型顕微鏡においては、走査時間が非常に短いので、１０００ｆｐｓで高速に画像を取得可能であり、試料外観の高速な時間変化を観察するのに適している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表平１−５０３４９３号公報
【特許文献２】特開平５−６０９８０号公報
【特許文献３】特開平８−２１１２９６号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】T.R.Corle and G.S.Kino, “Confocal Scanning Optical Microscopy and Related Imaging Systems”, Academic Press (1966)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ところで、このような高速観察に好適なマルチビーム走査型顕微鏡においても、散乱を伴う試料の観察において問題点がある。走査型顕微鏡は、資料中に集光したレーザのスポットと共役な位置にピンホールを配置することにより、レーザのスポット近傍のみの信号光（例えば、蛍光）を選択して取得することを可能足らしめることを特徴としている。それゆえ、試料による光の散乱が大きくないとみなせる場合には、その効力が発揮される。しかし、特に生体組織を試料とする場合には、生体組織の強散乱性によってレーザスポット近傍の信号光はたちまち散乱される。従って、ニポーディスクによって生成された多数のマルチビームが標本上に集光されても、マルチビームで発生した信号光は強く散乱し、対応する小開口とは別の小開口に信号光が染出すクロストークが発生する。小開口は光学的に共役な微小領域以外の微小領域における信号光も透過するため、ノイズ成分が増加する。クロストークを減少させるためにはマルチビームの空間的な間隔を広げることが考えられる。しかし、散乱の影響が非常に大きい場合には、マルチビームの本数が２本であったとしても、クロストークが発生し得る。
【００１１】
従って、上記のような問題点に鑑みてなされた本発明では、マルチビームによって発生する信号光に空間的なクロストークが生じても、ノイズの少ない画像を取得可能な走査型顕微鏡および操作型顕微鏡システムの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上述した諸課題を解決すべく、第１の発明による走査型顕微鏡は、
光パルスを、複数の出射点から順番に繰返し出射する光源ユニットと、
複数の出射点から出射される前記光パルスを試料上に別々に集光させる対物レンズと、
対物レンズにより集光された複数の光パルスの走査点を試料に対して相対的に移動させるスキャナユニットと、
対物レンズにより集光された光パルスの集光点と共役な位置にピンホールが形成されたピンホールアレイと、
光源ユニットから対物レンズまでの間の光パルスの光路上に設けられ、光パルスの照射により試料から発する信号光を光パルスから分離する光学的分離器と、
光学的分離器により分離された信号光の光量を検出する光量検出器と、
光量検出器による光量の検出時点における走査点を検出する位置検出システムと、
光量と走査点に基づいて試料の画像を再構成する画像再構成装置に、光量と照射位置とを出力する出力器とを備える
ことを特徴とするものである。
【００１３】
本発明の第１の発明による操作型顕微鏡システムは、
光パルスを、複数の出射点から順番に繰返し出射する光源ユニットと、
複数の出射点から出射される光パルスを試料上に別々に集光させる対物レンズと、
対物レンズにより集光された複数の光パルスの走査点を試料に対して相対的に移動させるスキャナユニットと、
対物レンズにより集光された光パルスの集光点と共役な位置にピンホールが形成されたピンホールアレイと、
光源ユニットから対物レンズまでの間の光パルスの光路上に設けられ、光パルスの照射により試料から発する信号光を光パルスから分離する光学的分離器と、
光学的分離器により分離された信号光の光量を検出する光量検出器と、
光量検出器による光量の検出時点における走査点を検出する位置検出システムと、
光量と走査点とに基づいて試料の画像を再構成する画像再構成装置と、
画像再構成装置が再構成した試料の画像を表示するモニタとを備える
ことを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１４】
上記のように構成された本発明に係る走査型顕微鏡によれば、マルチビームを用いながら、ノイズの少ない画像を取得可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る走査型顕微鏡を含む走査型顕微鏡システムの光学的な概略構成および電気的な概略構成を示す構成図である。
【図２】図１の光源ユニットの構成を概略的に図示するブロック図である。
【図３】第１〜第４の光導波路に入射した励起光パルスの出射時期を示すタイミングチャートである。
【図４】走査型顕微鏡により観察される試料の走査範囲を示す図である。
【図５】励起光パルスの照射位置の時間変化を示すタイミングチャートである。
【図６】第１〜第４の出射端を直線上に並べない場合の試料の走査範囲を示す図である。
【図７】本発明の第２の実施形態に係る走査型顕微鏡を含む走査型顕微鏡システムの光学的な概略構成および電気的な概略構成を示す構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明の適用した走査型顕微鏡の実施形態について、図面を参照して説明する。
【００１７】
図１は、本発明の第１の実施形態に係る走査型顕微鏡を含む走査型顕微鏡システムの光学的な構成および電気的な概略構成を示す構成図である。
【００１８】
走査型顕微鏡システム１００は、走査型顕微鏡１１０、画像処理装置１０１、モニタ１０２によって構成される。後に詳述するように、走査型顕微鏡１１０は、スポット状の励起光で試料Ｓを走査する。また、試料Ｓに照射された励起光による蛍光の光量が、走査型顕微鏡１１０により検出される。また、走査型顕微鏡１１０によりスポット状の励起光の照射位置が検出される。蛍光の光量および照射位置が、走査型顕微鏡１１０から画像処理装置１０１に伝達される。画像処理装置１０１では、蛍光の光量と照射位置に基づいて、試料Ｓの画像を再構成する。再構成された画像はモニタ１０２に送信され、表示される。
【００１９】
次に、走査型顕微鏡１１０の構成について、説明する。走査型顕微鏡１１０は、光源ユニット１２０、第１〜第５のレンズ１１１ａ〜１１１ｅ、ダイクロイックミラー１１２、ピンホールアレイ１１３、スキャナユニット１１４、対物レンズ１１５、ＰＭＴ１１６（光量検出器、出力器）、位置検出部１１７（出力器）、および制御部１１８などによって構成される。
【００２０】
光源ユニット１２０は、図２に示すように、ＬＤ１２１、変調器１２２、分岐器１２３、遅延器１２４、および位置規制体１２５によって構成される。
【００２１】
生体に照射すると蛍光を発光させる励起光がＬＤ１２１から出射される。励起光は、変調器１２２により（１）式を満たす繰返し周波数Ｒ、パルス幅Ｔの励起光パルスに変換される。
【００２２】
Ｎ×（Ｔ＋τ）＜１／Ｒ （１）
なお（１）式において、τは励起光が照射された生体から発光され発光が停止するまでの蛍光寿命である。また、Ｎは分岐器１２３により分岐される光の列数であり、本実施形態では４である。
【００２３】
励起光パルスは、分岐器１２３により強度および位相が実質的に等しくなるように４列に分岐され、遅延器１２４に入射される。なお、分岐器１２３は、例えばハーフミラー（図示せず）およびミラー（図示せず）の組合せ、ファイバカプラ（図示せず）の組合せ、および回折格子などにより形成可能である。
【００２４】
遅延器１２４には、第１〜第４の遅延路１２４ａ〜１２４ｄが設けられる。分岐器１２３により分岐された４列の励起光パルスは、別々の遅延路１２４ａ〜１２４に入射される。繰返し周波数Ｒの励起光パルスが各遅延路１２４ａ〜１２４ｄから出射される時期がずれるように、各遅延路１２４ａ〜１２４ｄの長さが調整される。例えば、第２、第３、および第４の遅延路１２４ｂ、１２４ｃ、１２４ｄは、それぞれ第１の遅延路１２４ａよりもΔ（＝ｃ／（４ｎＲ）、ｃは光速、ｎは第１〜第４の光導波路１２４ａ〜１２４ｄの屈折率とする）、２Δ、３Δだけ長くなるように形成される。
【００２５】
このような構成により、図３に示すように、同時に第１〜第４の遅延路１２４ａ〜１２４ｄの入射端に繰返し周波数Ｒで入射する励起光パルスは、互いに隣合う遅延路とは繰返し周波数が４Ｒとなるように、第１〜第４の遅延路１２４ａ〜１２４ｄの第１〜第４の出射端ｔ１〜ｔ４から順番に繰返し、出射される。第１〜第４の出射端ｔ１〜ｔ４は、一定の間隔で直線上に並び且つ出射する励起光パルスの主光線が互いに平行となるように、位置規制体１２５により固定される。
【００２６】
図１において、第１〜第４の出射端ｔ１〜ｔ４から出射される励起光パルスは、第１、第２のレンズ１１１ａ、１１１ｂによってテレセントリックな状態でピンホールアレイ１１３に形成される４つのピンホールに別々に集光される。ピンホールに集光された励起光パルスは、ピンホールを通過し、第３のレンズ１１１ｃ、スキャナユニット１１４、第４、第５のレンズ１１１ｄ、１１１ｅ、および対物レンズ１１５を介して試料表面乃至試料内部に集光される。
【００２７】
なお、第３、第４のレンズ１１１ｃ、１１１ｄはリレー光学系を形成する。また、第４のレンズ１１１ｄによりスキャナユニット１１４と対物レンズ１１５の瞳位置とが共役位置に配置される。第４のレンズ１１１ｄを用いることにより、ピンホールを通過した励起光パルスを正しい位置および角度で対物レンズ１１５に入射させることが可能である。なお、後述するように、スキャナユニット１１４は互いに直交する軸に回動する第１、第２のガルバノミラー１１４ａ、１１４ｂを有しており、第１、第２のガルバノミラー１１４ａ、１１４ｂを瞳位置の共役位置近傍に配置することにより、スキャナユニット１１４と瞳位置とを共役位置に配置することが可能である。また、第１、第２のガルバノミラー１１４ａ、１１４ｂと瞳位置とが共役となるように、第１、第２のガルバノミラー１１４ａ、１１４ｂ間にリレーレンズを設けることにより、スキャナユニット１１４と瞳位置とを共役位置に配置する構成であってもよい。
【００２８】
スキャナユニット１１４は、光軸と直交する２次元面内において試料表面乃至試料内部を励起光パルスによって走査する。なお、前述のように、励起光パルスは第１〜第４の出射端ｔ１〜ｔ４から出射され、試料上にスポット状に照射される。したがって、スキャナユニット１１４は、試料表面乃至試料内部を４列の励起光パルスによって順次走査する。図４に示すように、走査により、走査型顕微鏡１００の視野範囲全域ｅａ（以後、全照射領域と呼ぶ）が４列の励起光パルスによって照射される。
【００２９】
第１のガルバノミラー１１４ａにより、第１の走査方向に沿って試料表面乃至試料内部が走査される。また、第２のガルバノミラー１１４ｂにより、第１の走査方向に垂直な第２の走査方向に沿って試料表面乃至試料内部が走査される。第１の出射端ｔ１に対応する第１列の励起光パルスｅｐ１によって、全照射領域ｅａを第２の走査方向に沿って４分割した第１の部分領域ｕａ１がラスタ走査される。同様に、第２〜第４の出射端ｔ２〜ｔ４に対応する第２〜第４列の励起光パルスｅｐ２〜ｅｐ４によって、第１の部分領域ｕａ１と別の第２〜第４の部分領域ｕａ２〜ｕａ４がラスタ走査される。例えば、全照射領域ｅａを５１２本の走査線によって走査する場合には、第１〜第１２８の走査線を第１列の励起光パルスｅｐ１によって走査させ、第１２９〜第２５６の走査線を第２列の励起光パルスによって走査させ、第２５７〜第３８４の走査線を第３列の励起光パルスによって走査させ、第３８５〜第５１２の走査線を第４列の励起光パルスによって走査させる。
【００３０】
前述のように、隣り合う列の励起光パルスは１／（４×Ｒ）のずれを有するので、図５に示すように、各部分領域ｕａ１〜ｕａ４には、同時にではなく時間をずらしながら励起光パルス（符号ｅｐ参照）が順番に繰返し照射される。
【００３１】
なお、上述のように、第１〜第４列の励起光パルスにより、それぞれ第１〜第４の部分領域ｕａ１〜ｕａ４が走査されるように、第１〜第４の出射端ｔ１〜ｔ４の間隔が定められる。すなわち、第１〜第４の出射端ｔ１〜ｔ４における励起光パルスの光軸に垂直な仮想平面において、第１の走査方向に対応する第１の対応方向に垂直な直線上に等間隔になるように第１〜第４の出射端ｔ１〜ｔ４の位置が決められる。
【００３２】
励起光パルスが照射されると、照射された励起光パルスの集光点近傍において試料が励起されて蛍光（信号光）が発生する。対物レンズ１１５による集光点とピンホールとが共役位置となるように、対物レンズ１１５およびピンホールアレイ１１３が配置されており、集光点において発生する蛍光成分のみがピンホールアレイ１１３の各ピンホールに結像する。集光点近傍において発生する蛍光成分はピンホールの周りにはみ出して結像するため、通過が制限される。したがって、集光点における蛍光成分のみがピンホールを通過する。
【００３３】
ピンホールアレイ１１３を通過した蛍光は、第２のレンズ１１１ｂを透過してダイクロイックミラー１１２に到達する。蛍光はダイクロイックミラー１１２により反射され、ダイクロイックミラー１１２を透過する励起光の試料Ｓによる反射光から分離される。反射された蛍光はＰＭＴ１１６によって受光される。ＰＭＴ１１６により受光量に応じた画素信号が生成され、画像処理装置１０１に伝達される。
【００３４】
なお、各列の励起光パルスに対応する蛍光は第２のレンズ１１１ｂ、ダイクロイックミラー１１２を介して、ＰＭＴ１１６の受光部上に広く分布する。蛍光の入射範囲より広い受光部を有するＰＭＴ１１６が選択され、用いられる。
【００３５】
なお、画像処理装置１０１には画素信号だけでなく、以下に説明するように位置検出部１１７において検知される励起光パルスの走査点の位置が位置情報として伝達される。位置検出部１１７は、第１、第２のガルバノミラー１１４ａ、１１４ｂに設けられる回転速度メータ（図示せず）により検出される第１、第２のガルバノミラー１１４ａ、１１４ｂの回転速度に基づいて第１、第２のガルバノミラー１１４ａ、１１４ｂによる各列の励起光パルスの偏向方向を算出する。また、位置検出部１１７には、制御部１１８によって検知される励起光パルスを出射中の出射端が伝達される。なお、出射中の出射端は、いかなる方法で検知してもよい。例えば、制御部１１８により励起光パルスを出射開始時期と出射開始後の経過時間とに基づいて、いずれの出射端から励起光パルスが出射されているかを検知可能である。位置検出部１１７は、偏向方向および出射中の出射端に基づいて、励起光パルスが照射されている走査点の位置を検出する。
【００３６】
光源ユニット１２０、スキャナユニット１１４、および位置検出部１１７は、制御部１１８の制御に基づいて、それぞれ励起光パルスを出射し、第１、第２のガルバノミラー１１４ａ、１１４ｂによる走査を実行し、励起光パルスの照射位置を検出する。
【００３７】
画像処理装置１０１は、画素信号と位置信号とに基づいて２次元状の試料の画像を再構成する。再構成された、２次元画像はモニタ１０２に送信され、表示される。
【００３８】
以上のような構成の第１の実施形態の走査型顕微鏡によれば、低ノイズの画像を高速に取得可能である。前述のように、本実施形態においても、試料Ｓにおける蛍光は散乱により対応するピンホール以外のピンホールにも入射し得る、すなわち空間的なクロストークが発生し得る。しかし、本実施形態の走査型顕微鏡によれば、複数の出射端から出射されるマルチビームの試料Ｓへの照射時期および試料Ｓからの蛍光の発生時期を分離させることが可能である。蛍光の発生時期を分離することにより、空間的なクロストークが発生しても別の照射位置における蛍光の検出が防止されるので、低ノイズの試料画像を再構成可能である。また、４本のマルチビームにより試料を走査するので、既存のガルバノミラーを用いながら走査速度を向上させることが可能である。したがって、高速で試料画像を採取可能である。
【００３９】
また、第１の実施形態の走査型顕微鏡によれば、上述のように第１〜第４の出射端ｔ１〜ｔ４を配置することにより、照射時期を分離させた構成においてスキャナユニット１１４の制御の簡素化を図りながら、フレームレートの最速化を図ることが可能である。例えば本実施形態と異なる構成として、第１、第２、第３、第４の出射端ｔ１、ｔ２、ｔ３、ｔ４から出射される励起光パルスが、第（４ｎ−３）、第（４ｎ−２）、第（４ｎ−１）、第４ｎの走査線（１≦ｎ≦１２８）に沿って走査される構成が考えられる。このような構成においてフレームレートを最速化するためには、第１の走査方向に沿った端部に走査点が達したときに、高速で第２の走査方向に４本の走査線に相当する距離だけ走査点を移動させる必要がある。したがって、第１のガルバノミラー１１４ａによる偏向方向に応じて第２のガルバノミラー１１４ｂによる走査速度を変える必要がある。一方、本実施形態の構成によれば、第１のガルバノミラー１１４ａの偏向方向に拠らず、第２のガルバノミラー１１４の走査速度を一定に保つことが可能なので、スキャナユニット１１４の制御が簡素化される。
【００４０】
また、第１の実施形態の走査型顕微鏡によれば、上述のように第１〜第４の出射端ｔ１〜ｔ４を配置することにより、ＰＭＴ１１６により受光した蛍光を有効に活用することが可能である。第１〜第４の出射端ｔ１〜ｔ４が第１の対応方向に垂直な直線上に配置されない場合には、図６に示すように、第１の走査方向に沿った各列の励起光パルスの走査範囲が変わる。それゆえ、矩形の画像として再現する場合には、画像の再現に用いられない領域（斜線部参照）も走査され、用いられない蛍光を受光することがある。一方、本実施形態の構成によれば、画像の再現に用いられる領域のみが走査されるので、受光する蛍光を有効に活用することが可能である。
【００４１】
また、第１の実施形態の走査型顕微鏡によれば、上述のように第２のレンズ１１１ｂとスキャナユニット１１４との間にピンホールアレイ１１３を設けることにより、試料Ｓに照射する励起光パルスを制限するためのピンホールと共焦点効果を得るためのピンホールを共用することが可能である。ピンホールを共用することにより構成の簡素化が可能である。
【００４２】
次に本発明の第２の実施形態に係る走査型顕微鏡について説明する。第２の実施形態は、光源ユニット１２０とピンホールアレイ１１３間およびダイクロイックミラー１１２とＰＭＴ１１６間の構成において第１の実施形態と異なっている。以下に、第１の実施形態と異なる点を中心に第２の実施形態について説明する。なお、第１の実施形態と同じ機能および構成を有する部位には同じ符号を付す。
【００４３】
図７に示すように、第２の実施形態を適用した走査型顕微鏡２００における光源ユニット１２０、第３〜第５のレンズ１１１ｃ〜１１１ｅ、ダイクロイックミラー１１２、ピンホールアレイ１１３、スキャナユニット１１４、対物レンズ１１５、位置検出部１１７、および制御部１１８の機能および構成は第１の実施形態と同じである。また、画像処理装置１０１およびモニタ１０２の機能および構成も第１の実施形態と同じである。
【００４４】
第２の実施形態では、第１、第２のレンズ１１１ａ、１１１ｂの代わりに、第１、第２のレンズアレイ２１１ａ、２１１ｂが設けられる。第１、第２のレンズアレイ２１１ａ、２１１ｂには４つのレンズが設けられる。各列の励起光パルスが第１のレンズアレイ２１１ａにおける４つのレンズを透過することにより平行光に変換される。平行光はダイクロイックミラー１１２を透過して、第２のレンズアレイ２１１ｂにおける４つのレンズを透過することによって、ピンホールアレイ１１３に形成されるピンホールに集光される。
【００４５】
第１の実施形態と同じく、ピンホールを通過した各列の励起光パルスにより試料Ｓにおいて発生する蛍光がピンホールアレイ１１３に到達する。第１の実施形態と異なり、ピンホールを通過した蛍光は第２のレンズアレイ２１１ｂによって平行光に変換される。変換された平行光はダイクロイックミラー１１２により分離され、ＰＭＴ１１６に向かって反射される。ダイクロイックミラー１１２とＰＭＴ１１６との間には、集光レンズ１１９が設けられる。集光レンズ１１９により、各列に対応する蛍光はＰＭＴ１１６の一点に集光される。
【００４６】
第１の実施形態と同じく、ＰＭＴ１１６おいて受光量に応じた画素信号が生成され、画像処理装置１０１に伝達される。また、第１の実施形態と同じく、画像処理装置１０１は、画素信号と位置検出部１１７から伝達された位置信号に基づいて、２次元状の試料の画像を再構成する。
【００４７】
以上のような構成の第２の実施形態の走査型顕微鏡によっても、低ノイズの画像を高速に取得可能である。また、第１の実施形態と同じく、第２の実施形態の走査型顕微鏡によってもフレームレートの最速化、蛍光の有効活用、構成の簡素化を図ることが可能である。
【００４８】
さらに、第１の実施形態と異なり、ピンホールアレイ１１３から出射され第２のレンズアレイ２１１ｂを透過した蛍光は、励起光パルスを出射した出射端によらず平行な方向に出射される。平行な方向に出射されるので集光レンズ１１９を用いることによりＰＭＴ１１６の１点に集光させることが可能である。したがって、第１の実施形態と異なり、検出部の小さなＰＭＴ１１６を用いることが可能となる。
【００４９】
本発明を諸図面や実施例に基づき説明してきたが、当業者であれば本開示に基づき種々の変形や修正を行うことが容易であることに注意されたい。従って、これらの変形や修正は本発明の範囲に含まれることに留意されたい。
【００５０】
例えば、上記の第１、第２の実施形態において、蛍光を分離するためにダイクロイックミラー１１２を用いたが、偏光ビームスプリッタとλ／４板とを組合わせた構成を用いて、試料の反射光を分離してＰＭＴ１１６で受光してもよい。光源から出射された光を透過し、反射光および蛍光の少なくとも一方を光源から出射された光から分離するいかなる光学的分離器を用いてもよい。
【００５１】
また、第１、第２の実施形態において、スキャナユニット１１４が励起光パルスを偏向させることによって試料が走査される構成であるが、試料を変位させるステージスキャナを用いて複数の励起光パルスを試料に対して相対的に移動させることにより走査される構成であってもよい。
【００５２】
また、第１、第２の実施形態において、光源ユニット１２０において光導波路の長さを変えることにより遅延器１２４が形成されるが、従来公知のいかなる遅延器を用いてもよい。例えば、ミラーとハーフミラーとを組合わせることによっても、本実施形態と同様の機能を有する遅延器を形成可能である。
【００５３】
また、第１、第２の実施形態において、ＬＤ１２１から出射した励起光を変調させることにより励起光パルスを生成する構成であるが、励起光パルスを発光するように励起光源を駆動する構成であってもよい。また、第１、第２の実施形態において、分岐器１２３を用いて励起光パルスを４列に分岐する構成であるが、分岐器１２３を用いずに直接４つの光源を設けて、励起光パルスを発する構成であってもよい。光源を別々に設けるのであれば、遅延器１２３を省いて、励起光パルスの発光時期をずらす構成であっても第１、第２の実施形態と同様の効果を得ることが可能である。
【００５４】
また、第１、第２の実施形態において、第１、第２のガルバノミラー１１４ａ、１１４ｂの回転速度に基づいて励起光パルスの走査点を検出する構成であるが、他の方法により走査点を検出する構成であってもよい。例えば、エンコーダを用いて回転位置を検出して、回転位置に基づいて走査点を検出する構成であってもよい。
【００５５】
また、第１、第２の実施形態において、ＬＤ１２１は励起光を出射する構成であるが、通常の可視光を出射する光源を用いて反射光に基づいて試料の２次元画像を再構成する構成であってもよい。
【００５６】
また、第１の実施形態において、ダイクロイックミラー１１２は第１、第２のレンズ１１１ａ、１１１ｂの間に設けられる構成であるが、第１のレンズ１１１ａから対物レンズ１１５の間のいかなる位置に設けられてもよい。ただし、ＰＭＴ１１６に検出される蛍光がピンホールにより制限されることが必要であり、ダイクロイックミラー１１２によりＰＭＴ１１６に受光される蛍光をピンホールに通過させる必要がある。したがって、ピンホールアレイ１１３よりも対物レンズ１１５側にダイクロイックミラー１１２を設ける場合には、ダイクロイックミラー１１２の反射方向において対物レンズ１１５の焦点と共役な位置にピンホールアレイ１１３を設けることが必要である。
【符号の説明】
【００５７】
１００、２００ 走査型顕微鏡システム
１０１ 画像処理装置
１０２ モニタ
１１０ 走査型顕微鏡
１１１ａ〜１１１ｄ 第１〜第４のレンズ
１１２ ダイクロイックミラー
１１３ ピンホールアレイ
１１４ スキャナユニット
１１４ａ、１１４ｂ 第１、第２のガルバノミラー
１１５ 対物レンズ
１１６ ＰＭＴ
１１７ 位置検出部
１１９ 集光レンズ
１２０ 光源ユニット
１２１ ＬＤ
１２２ 変調器
１２３ 分岐器
１２４ 遅延器
１２４ａ〜１２４ｄ 第１〜第４の光導波路
１２５ 位置規制体
２１１ａ、２１１ｂ 第１、第２のレンズアレイ
ｓ 試料
ｔ１〜ｔ４ 第１〜第４の出射端
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光パルスを、複数の出射点から順番に繰返し出射する光源ユニットと、
前記複数の出射点から出射される前記光パルスを試料上に別々に集光させる対物レンズと、
前記対物レンズにより集光された複数の前記光パルスの走査点を前記試料に対して相対的に移動させるスキャナユニットと、
前記対物レンズにより集光された前記光パルスの集光点と共役な位置にピンホールが形成されたピンホールアレイと、
前記光源ユニットから前記対物レンズまでの間の前記光パルスの光路上に設けられ、前記光パルスの照射により前記試料から発する信号光を前記光パルスから分離する光学的分離器と、
前記光学的分離器により分離された前記信号光の光量を検出する光量検出器と、
前記光量検出器による光量の検出時点における前記走査点を検出する位置検出システムと、
前記光量と前記走査点に基づいて前記試料の画像を再構成する画像再構成装置に、前記光量と前記照射位置とを出力する出力器とを備える
ことを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項２】
請求項１に記載の走査型顕微鏡において、前記スキャナユニットは前記光源ユニットと前記対物レンズとの間に設けられ、前記光パルスの偏向方向を変える偏向器を備えることを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の走査型顕微鏡において、前記光源ユニットは、主光線が相互に平行となるように、前記複数の出射点から前記光パルスを出射することを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項４】
請求項３に記載の走査型顕微鏡において、前記複数の出射点から出射される前記光パルスの主光線を平行に保つように出射する第１の光学系を備えることを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項５】
請求項４に記載の走査型顕微鏡において、前記ピンホールアレイは前記第１の光学系から出射される前記複数の出射点に対応する前記光パルスの入射位置それぞれと前記ピンホールの位置とが一致するように、配置されることを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項６】
請求項４または請求項５に記載の走査型顕微鏡において、
前記光学的分離器により分離された前記信号光を前記光量検出器の一点に集光させる集光レンズを備え、
前記第１の光学系は、前記複数の出射点から出射される前記光パルスそれぞれの入射位置に設けられ前記光パルスをコリメートする第１のレンズ群と、前記第１のレンズ群によってコリメートされたそれぞれの光パルスを前記ピンホールに集光させる第２のレンズ群とを有し、
前記光学的分離器は、前記第１、第２のレンズ群の間に設けられる
ことを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項７】
請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の走査型顕微鏡において、
前記スキャナユニットは前記光パルスにより前記試料上を少なくとも第１の走査方向に沿って走査可能であり、
前記複数の出射点の任意の２つの前記出射点を結ぶ線分が、前記第１の走査方向に前記出射点上において対応する第１の対応方向から傾斜するように前記出射点が配置される
ことを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項８】
請求項７に記載の走査型顕微鏡において、前記複数の出射点は前記第１の対応方向に垂直に並べられることを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項９】
請求項８に記載の走査型顕微鏡において、
前記スキャナユニットは、前記第１の走査方向と非平行である第２の走査方向に沿って前記光パルスを走査可能であり、
前記複数の出射点は、すべての前記出射点から出射される前記光パルスの前記第２の走査方向に沿った走査範囲が、各々の前記出射点から出射される前記光パルスの前記第２の走査方向に沿った走査範囲により等分割されるように、等間隔に並べられる
ことを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項１０】
請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載の走査型顕微鏡において、
前記光源ユニットは、
前記光パルスを出射する単一の光源と、
前記光源から出射する光パルスを複数の光パルスに分岐する分岐器と、
前記分岐器により分岐された前記光パルスを前記複数の出射点に別々に伝達する複数の光導波路を有し、前記複数の光導波路毎に伝播時間が異なるように光路長差が設けられる遅延器と、
前記複数の出射点からの出射される前記光パルスの主光線が相互に平行となり、且つ前記複数の出射点が前記出射方向に垂直な平面上に配置されるように前記出射点の位置を規定する位置規定体とを有する
ことを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項１１】
光パルスを、複数の出射点から順番に繰返し出射する光源ユニットと、
前記複数の出射点から出射される前記光パルスを試料上に別々に集光させる対物レンズと、
前記対物レンズにより集光された複数の前記光パルスの走査点を前記試料に対して相対的に移動させるスキャナユニットと、
前記対物レンズにより集光された前記光パルスの集光点と共役な位置にピンホールが形成されたピンホールアレイと、
前記光源ユニットから前記対物レンズまでの間の前記光パルスの光路上に設けられ、前記光パルスの照射により前記試料から発する信号光を前記光パルスから分離する光学的分離器と、
前記光学的分離器により分離された前記信号光の光量を検出する光量検出器と、
前記光量検出器による光量の検出時点における前記走査点を検出する位置検出システムと、
前記光量と前記走査点とに基づいて前記試料の画像を再構成する画像再構成装置と、
前記画像再構成装置が再構成した前記試料の画像を表示するモニタとを備える
ことを特徴とする走査型顕微鏡システム。
【請求項１】
光パルスを、複数の出射点から順番に繰返し出射する光源ユニットと、
前記複数の出射点から出射される前記光パルスを試料上に別々に集光させる対物レンズと、
前記対物レンズにより集光された複数の前記光パルスの走査点を前記試料に対して相対的に移動させるスキャナユニットと、
前記対物レンズにより集光された前記光パルスの集光点と共役な位置にピンホールが形成されたピンホールアレイと、
前記光源ユニットから前記対物レンズまでの間の前記光パルスの光路上に設けられ、前記光パルスの照射により前記試料から発する信号光を前記光パルスから分離する光学的分離器と、
前記光学的分離器により分離された前記信号光の光量を検出する光量検出器と、
前記光量検出器による光量の検出時点における前記走査点を検出する位置検出システムと、
前記光量と前記走査点に基づいて前記試料の画像を再構成する画像再構成装置に、前記光量と前記照射位置とを出力する出力器とを備える
ことを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項２】
請求項１に記載の走査型顕微鏡において、前記スキャナユニットは前記光源ユニットと前記対物レンズとの間に設けられ、前記光パルスの偏向方向を変える偏向器を備えることを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の走査型顕微鏡において、前記光源ユニットは、主光線が相互に平行となるように、前記複数の出射点から前記光パルスを出射することを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項４】
請求項３に記載の走査型顕微鏡において、前記複数の出射点から出射される前記光パルスの主光線を平行に保つように出射する第１の光学系を備えることを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項５】
請求項４に記載の走査型顕微鏡において、前記ピンホールアレイは前記第１の光学系から出射される前記複数の出射点に対応する前記光パルスの入射位置それぞれと前記ピンホールの位置とが一致するように、配置されることを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項６】
請求項４または請求項５に記載の走査型顕微鏡において、
前記光学的分離器により分離された前記信号光を前記光量検出器の一点に集光させる集光レンズを備え、
前記第１の光学系は、前記複数の出射点から出射される前記光パルスそれぞれの入射位置に設けられ前記光パルスをコリメートする第１のレンズ群と、前記第１のレンズ群によってコリメートされたそれぞれの光パルスを前記ピンホールに集光させる第２のレンズ群とを有し、
前記光学的分離器は、前記第１、第２のレンズ群の間に設けられる
ことを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項７】
請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の走査型顕微鏡において、
前記スキャナユニットは前記光パルスにより前記試料上を少なくとも第１の走査方向に沿って走査可能であり、
前記複数の出射点の任意の２つの前記出射点を結ぶ線分が、前記第１の走査方向に前記出射点上において対応する第１の対応方向から傾斜するように前記出射点が配置される
ことを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項８】
請求項７に記載の走査型顕微鏡において、前記複数の出射点は前記第１の対応方向に垂直に並べられることを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項９】
請求項８に記載の走査型顕微鏡において、
前記スキャナユニットは、前記第１の走査方向と非平行である第２の走査方向に沿って前記光パルスを走査可能であり、
前記複数の出射点は、すべての前記出射点から出射される前記光パルスの前記第２の走査方向に沿った走査範囲が、各々の前記出射点から出射される前記光パルスの前記第２の走査方向に沿った走査範囲により等分割されるように、等間隔に並べられる
ことを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項１０】
請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載の走査型顕微鏡において、
前記光源ユニットは、
前記光パルスを出射する単一の光源と、
前記光源から出射する光パルスを複数の光パルスに分岐する分岐器と、
前記分岐器により分岐された前記光パルスを前記複数の出射点に別々に伝達する複数の光導波路を有し、前記複数の光導波路毎に伝播時間が異なるように光路長差が設けられる遅延器と、
前記複数の出射点からの出射される前記光パルスの主光線が相互に平行となり、且つ前記複数の出射点が前記出射方向に垂直な平面上に配置されるように前記出射点の位置を規定する位置規定体とを有する
ことを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項１１】
光パルスを、複数の出射点から順番に繰返し出射する光源ユニットと、
前記複数の出射点から出射される前記光パルスを試料上に別々に集光させる対物レンズと、
前記対物レンズにより集光された複数の前記光パルスの走査点を前記試料に対して相対的に移動させるスキャナユニットと、
前記対物レンズにより集光された前記光パルスの集光点と共役な位置にピンホールが形成されたピンホールアレイと、
前記光源ユニットから前記対物レンズまでの間の前記光パルスの光路上に設けられ、前記光パルスの照射により前記試料から発する信号光を前記光パルスから分離する光学的分離器と、
前記光学的分離器により分離された前記信号光の光量を検出する光量検出器と、
前記光量検出器による光量の検出時点における前記走査点を検出する位置検出システムと、
前記光量と前記走査点とに基づいて前記試料の画像を再構成する画像再構成装置と、
前記画像再構成装置が再構成した前記試料の画像を表示するモニタとを備える
ことを特徴とする走査型顕微鏡システム。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１２−２０８４４２（Ｐ２０１２−２０８４４２Ａ）
【公開日】平成２４年１０月２５日（２０１２．１０．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−７６０４６（Ｐ２０１１−７６０４６）
【出願日】平成２３年３月３０日（２０１１．３．３０）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１０月２５日（２０１２．１０．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月３０日（２０１１．３．３０）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
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