説明

超低密度リポ蛋白レムナント(VLDLレムナント)中のコレステロールの定量方法、試薬およびキット

試料を含有する水性媒体中、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素もしくはコレステロール脱水素酵素を超低密度リポ蛋白レムナント中のエステル型および遊離型コレステロール(以下総称して超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールという)に特異的に作用させる(a)ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルおよび(b)ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤の組み合わせの存在下、試料中の超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールを定量する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、試料中の超低密度リポ蛋白レムナント(VLDLレムナント)中のコレステロールの定量方法、試薬およびキットに関する。
【背景技術】
血液中には、種々のリポ蛋白が含有されている。これらのリポ蛋白は比重の違いにより、カイロミクロン(以下、CMと略記する)、超低密度リポ蛋白(以下、VLDLと略記する)、低密度リポ蛋白(以下、LDLと略記する)、高密度リポ蛋白(以下、HDLと略記する)に分類されている。各リポ蛋白は、コレステロール、トリグリセライド、リン脂質、蛋白質等の構成成分の割合が異なっており、生体内で異なる作用を有する。
これらのリポ蛋白以外に、リポ蛋白がリポ蛋白リパーゼによって代謝・分解される過程で生じるレムナントリポ蛋白がある。レムナントリポ蛋白は、カイロミクロンレムナント(以下、CMレムナントと略記する)および超低密度リポ蛋白レムナント(以下、VLDLレムナントと略記する)に分類される。中間密度リポ蛋白(以下、IDLと略記する)は、VLDLレムナントに包含される、比重1.006〜1.019のリポ蛋白であり狭義のVLDLレムナントと呼ばれる。
レムナントリポ蛋白は、トリグリセライド(TG)が豊富なリポ蛋白であり、アポEとコレステロールが比較的豊富なリポ蛋白である。CMレムナントはアポB−48とアポEとを主要アポ蛋白として有し、VLDLレムナントはアポB−100とアポEとを主要アポ蛋白として有する。
レムナントリポ蛋白は、健常人においては速やかに代謝され、速やかに肝臓のレセプターに取り込まれるが、代謝異常や過食・運動不足等の日常の悪い生活習慣により、血液中に停滞するレムナントリポ蛋白が増加し、この血液中に停滞したレムナントリポ蛋白によりIII型高脂血症などが引き起こされ、動脈硬化が高い割合で発症する。動脈硬化の発症に際しては、血液中に停滞したレムナントリポ蛋白が動脈壁のマクロファージに容易に取り込まれ、動脈硬化の初期病変を形成すると考えられている。このように、レムナントリポ蛋白は動脈硬化性疾患の危険因子の一つと考えられている。
CMレムナントは、アポB−48を主要アポ蛋白として有するため、肝臓のLDL受容体関連蛋白(LDL Receptor−related Protein:LRP)を介して取り込まれると考えられており、VLDLレムナントは、アポB−100を主要アポ蛋白として有するため、肝臓のLDL受容体を介して取り込まれると考えられている。また、最近、新しいレムナントリポ蛋白のマクロファージ泡沫化経路の一つとして、VLDL受容体経路が報告されている。すなわち、単球からマクロファージへの分化過程においてVLDL受容体の発現が増大し、レムナントリポ蛋白がVLDL受容体を介してマクロファージの泡沫化を引き起こすことが報告されている。
レムナントリポ蛋白またはレムナントリポ蛋白中のコレステロールの定量法としては、これまでに、電気泳動法、超遠心法、液体クロマトグラフィ(HPLC)法、免疫吸着法等が報告されている。電気泳動法としては、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)法やアガロースゲル電気泳動法等が報告されている。ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)法は、レムナントリポ蛋白の定性分析に使用される方法であり、VLDLとLDLとの間に認められる異常バンドである中間帯(Mid−band)を検出する方法である。アガロースゲル電気泳動法も、レムナントリポ蛋白の定性分析に使用される方法であり、特にIII型高脂血症の診断に有効に使用される。III型高脂血症においては、β位に移動するβ−VLDLが確認される。
超遠心法としては、比重が1.006から1.019の間のリポ蛋白である中間密度リポ蛋白(以下、IDLと略記する)を超遠心分離により分離し、得られたIDL中のコレステロール(以下、IDL−Cと略記する)を定量する方法が挙げられる。しかしながら、この超遠心法は操作が非常に煩雑である。
HPLC法としては、血清中のCM及びVLDLをHPLCで分離し、分離されたCM中のコレステロール量及び分離されたVLDL中のコレステロール量を分析することからなる血清試料中のレムナント様リポ蛋白(以下、RLPと略記する)の分析方法(特開平8−105876号公報)や、ヒト血清試料中のRLP以外のリポ蛋白を、アポB−48を認識しない抗ヒトアポA−Iモノクローナル抗体及びアポB−48を認識しない抗ヒトアポB−100モノクローナル抗体を非多孔性不溶性支持体に固定化したリポ蛋白分離用充填剤を充填してなるリポ蛋白分離用抗体カラムで分離し、分離されなかったリポ蛋白をRLPとして、該RLP中のコレステロール量を分析することからなる、血清試料中のRLPの分析方法が挙げられる(特開平8−105875号公報)。前者の方法は、CMコレステロールとVLDLコレステロールの総和が免疫吸着法によって測定されるRLP中のコレステロールと高い相関関係にあることに基づく方法である。これらの公開特許公報においては、RLPという用語は、CMやVLDL等がリポ蛋白リパーゼによって分解された異常リポ蛋白という意味で使用されている。
最近、免疫吸着法によるRLP中のコレステロールの定量法が開発された。ここでいうRLPとは、トリグリセライドに富むリポ蛋白を意味する。本定量法においては、抗アポA−Iモノクローナル抗体およびアポB−48を認識しない特異的抗アポB−100モノクローナル抗体を含有するアフィニティーゲルを用いたイムノアフィニティークロマトグラフィにより血清からRLPを分離し、この分離したRLPに含まれるコレステロールが定量される。本定量法に適用されるRLP中のコレステロール定量用試薬が、(株)日本抗体研究所から販売されている[製品名:RLP−コレステロール「JIMRO」II](「クリニカル ケミストリー(Clinical Chemistry)」,アメリカ臨床化学会,2002年,第48巻,p.217−219)。
RLP中のコレステロールの定量法としては、ポリオキシアルキレン誘導体およびポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体の共存下、試料にコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロール脱水素酵素ならびにリン脂質を加水分解する酵素を作用させ、生成する過酸化水素または還元性補酵素を定量することを特徴とする方法も報告されている(特開2001−231597号公報)。本公開特許公報の実施例1の定量用試薬を用いて得られる試料中のコレステロール定量値と日本抗体研究所社製の定量用試薬であるRLP−コレステロール「JIMRO」IIを用いて得られる試料のRLP中のコレステロール定量値との間に良好な相関関係が認められる。しかしながら、RLP−コレステロール「JIMRO」IIは、試料中の、レムナントリポ蛋白に分類されない、VLDL中のコレステロールにも反応することが報告されている。
近年、超遠心法とゲルろ過法とを組み合わせたレムナントリポ蛋白の分析が報告されている。(「動脈硬化」,日本動脈硬化学会,2001年,第29巻,p.235(演題番号:98))。
【発明の開示】
本発明の目的は、動脈硬化性疾患の危険因子の一つであるVLDLレムナント中のコレステロール(以下VLDLレムナントコレステロールといい、VLDLレムナント−Cと略記する)を簡便かつ迅速に定量する方法、試薬およびキットを提供することにある。
本発明は、以下の(1)〜(23)に関する。
(1) 試料を含有する水性媒体中、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素もしくはコレステロール脱水素酵素を超低密度リポ蛋白レムナント中のエステル型および遊離型コレステロール(以下総称して超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールという)に特異的に作用させる(a)ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルおよび(b)ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤の組み合わせの存在下、試料中の超低密度リポ蛋白レムナント中のコレステロールに、(c)コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素または(d)酸化型補酵素の存在下にコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を作用させ、過酸化水素または還元型補酵素を生成させ、生成した過酸化水素または還元型補酵素を定量することを特徴とする試料中の超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールの定量方法。
(2) 超低密度リポ蛋白レムナントが、中間密度リポ蛋白である(1)記載の方法。
(3) 該酵素反応が、さらにシクロデキストリンまたはその誘導体および/またはアルブミンの存在下に行われる(1)または(2)記載の方法。
(4) シクロデキストリンまたはその誘導体が、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、ジメチル−α−シクロデキストリン、ジメチル−β−シクロデキストリン、ジメチル−γ−シクロデキストリン、トリメチル−α−シクロデキストリン、トリメチル−β−シクロデキストリン、トリメチル−γ−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−γ−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン、カルボキシメチル−α−シクロデキストリン、カルボキシメチル−β−シクロデキストリン、カルボキシメチル−γ−シクロデキストリン、グリコシル−α−シクロデキストリン、グリコシル−β−シクロデキストリン、グリコシル−γ−シクロデキストリン、マルトシル−α−シクロデキストリン、マルトシル−β−シクロデキストリン、マルトシル−γ−シクロデキストリン、α−シクロデキストリンスルフェート、β−シクロデキストリンスルフェート、γ−シクロデキストリンスルフェート、β−シクロデキストリンポリマーからなる群より選ばれる化合物である(3)記載の方法。
(5) ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルが、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルフェニルエーテルである(1)〜(4)のいずれかに記載の方法。
(6) 過酸化水素の定量が、パーオキシダーゼの存在下生成した過酸化水素と色原体とを反応させて色素を生成させ、生成した色素を定量することによって行われる(1)〜(5)のいずれかに記載の方法。
(7) 還元型補酵素の定量が反応液の吸光度を測定することによって行われる(1)〜(5)のいずれかに記載の方法。
(8) コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールに特異的に作用させる(a)ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルおよび(b)ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤の組み合わせ、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を含有する試料中の超低密度リポ蛋白レムナントコレステロール定量用試薬。
(9) 該試薬がさらに過酸化水素定量用試薬を含有する(8)記載の試薬。
(10) コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールに特異的に作用させる(a)ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルおよび(b)ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤の組み合わせ、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素および酸化型補酵素を含有する超低密度リポ蛋白レムナントコレステロール定量用試薬。
(11) 該試薬がさらに還元型補酵素定量用試薬を含有する(10)記載の試薬。
(12) 超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールが、中間密度リポ蛋白である(8)〜(11)のいずれかに記載の試薬。
(13) さらに、シクロデキストリンまたはその誘導体および/またはアルブミンを含有する(8)〜(12)のいずれかに記載の試薬。
(14) シクロデキストリンまたはその誘導体が、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、ジメチル−α−シクロデキストリン、ジメチル−β−シクロデキストリン、ジメチル−γ−シクロデキストリン、トリメチル−α−シクロデキストリン、トリメチル−β−シクロデキストリン、トリメチル−γ−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−γ−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン、カルボキシメチル−α−シクロデキストリン、カルボキシメチル−β−シクロデキストリン、カルボキシメチル−γ−シクロデキストリン、グリコシル−α−シクロデキストリン、グリコシル−β−シクロデキストリン、グリコシル−γ−シクロデキストリン、マルトシル−α−シクロデキストリン、マルトシル−β−シクロデキストリン、マルトシル−γ−シクロデキストリン、α−シクロデキストリンスルフェート、β−シクロデキストリンスルフェート、γ−シクロデキストリンスルフェート、β−シクロデキストリンポリマーからなる群より選ばれる化合物である(13)記載の試薬。
(15) ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルが、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルフェニルエーテルである(8)〜(14)のいずれかに記載の試薬。
(16) ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルと組み合わさってコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールに特異的に作用させるポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤を含有する第1試薬と、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を含有する第2試薬とを含有し、かつ、該ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤と組み合わさってコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールに特異的に作用させるポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルを第1試薬および第2試薬の少なくとも一方に含有し、過酸化水素定量用試薬を第1試薬および第2試薬の少なくとも一方に含有する試料中の超低密度リポ蛋白レムナントコレステロール定量用キット。
(17) コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールに特異的に作用させる(a)ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルおよび(b)ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤の組み合わせを含有する第1試薬と、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を含有する第2試薬を含有し、かつ、過酸化水素定量用試薬を第1試薬、第2試薬の少なくとも一方に含有する試料中の超低密度リポ蛋白レムナントコレステロール定量用キット。
(18) ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルと組み合わさってコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールに特異的に作用させるポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤を含有する第1試薬と、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する第2試薬とを含有し、かつ、酸化型補酵素を第1試薬、第2試薬の少なくとも一方に含有し、該該ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤と組み合わさってコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素をレムナントコレステロールに特異的に作用させるポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルを第1試薬、第2試薬の少なくとも一方に含有する試料中の超低密度リポ蛋白レムナントコレステロール定量用キット。
(19) コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールに特異的に作用させる(a)ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルおよび(b)ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤の組み合わせを含有する第1試薬と、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する第2試薬とを含有し、かつ、酸化型補酵素を第1試薬、第2試薬の少なくとも一方に含有する試料中の超低密度リポ蛋白レムナントコレステロール定量用キット。
(20) 超低密度リポ蛋白レムナントが中間密度リポ蛋白である(16)〜(19)のいずれかに記載のキット。
(21) さらに、シクロデキストリンまたはその誘導体および/またはアルブミンを第1試薬、第2試薬の少なくとも一方に含有する(16)〜(20)のいずれかに記載のキット。
(22) シクロデキストリンまたはその誘導体が、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、ジメチル−α−シクロデキストリン、ジメチル−β−シクロデキストリン、ジメチル−γ−シクロデキストリン、トリメチル−α−シクロデキストリン、トリメチル−β−シクロデキストリン、トリメチル−γ−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−γ−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン、カルボキシメチル−α−シクロデキストリン、カルボキシメチル−β−シクロデキストリン、カルボキシメチル−γ−シクロデキストリン、グリコシル−α−シクロデキストリン、グリコシル−β−シクロデキストリン、グリコシル−γ−シクロデキストリン、マルトシル−α−シクロデキストリン、マルトシル−β−シクロデキストリン、マルトシル−γ−シクロデキストリン、α−シクロデキストリンスルフェート、β−シクロデキストリンスルフェート、γ−シクロデキストリンスルフェート、β−シクロデキストリンポリマーからなる群より選ばれる化合物である(21)記載のキット。
(23) ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルが、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルである(16)〜(22)のいずれかに記載のキット。
本発明方法を詳細に説明する。
本発明の特徴は、コレステロール定量反応に用いられる酵素をVLDLレムナント−Cに特異的に作用させる界面活性剤として、(a)ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルおよび(b)ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群からなる群から選択される一種の界面活性剤の組み合わせが優れた効果を奏することにある。即ち、これらの2種の界面活性剤は組み合わさって、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素もしくはコレステロール脱水素酵素をVLDLレムナント−Cに特異的に作用させる。
さらにこれらの酵素反応において水性媒体中にシクロデキストリンおよびその誘導体および/またはアルブミンを存在させることによって、VLDLレムナント−C以外のリポ蛋白中のコレステロール、特にLDL中のコレステロールに前記酵素が作用するのを抑制することを特徴とする。
本発明方法によれば試料中のVLDLレムナント−Cは、水性媒体中、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素もしくはコレステロール脱水素酵素を試料中のVLDLレムナント−Cに特異的に作用させる(a)ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルおよび(b)ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤の組み合わせの存在下、試料中のRLP中のエステル型コレステロールをコレステロールエステル加水分解酵素の作用によって遊離型コレステロールに変換し、該遊離型コレステロールおよびVLDLレムナント中の遊離型コレステロールから(c)コレステロール酸化酵素の作用によって過酸化水素を生成させまたは(d)酸化型補酵素の存在下コレステロール脱水素酵素の作用によって還元型補酵素を生成させ、生成した過酸化水素または還元型補酵素を定量することによって定量できる。
この方法において、酵素反応をシクロデキストリンおよびその誘導体および/またはアルブミンの存在下に行うことによってVLDLレムナント以外のリポ蛋白のコレステロールに酵素が作用するのを抑制することができるので好ましい。
本発明の定量方法によって全血、血漿、血清等、好ましくは、血漿、血清等の試料中のVLDLレムナントコレステロールを定量できる。
酵素反応は、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素もしくはコレステロール脱水素酵素を試料中のVLDLレムナント−Cに特異的に作用させる(a)ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルおよび(b)ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤の少なくとも2種類の界面活性剤の組み合わせ、コレステロールの定量に必要なコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素もしくはコレステロール脱水素酵素(コレステロール脱水素酵素を用いる場合には酸化型補酵素が必要)、ならびに、要すればシクロデキストリンおよび/またはアルブミンを含有する緩衝液等の水溶液中で行われる。反応によって生成する過酸化水素または還元型補酵素の定量はそれ自体公知の方法によって行われる。
該水溶液には、必要に応じてVLDLレムナント−Cの定量反応の特異性に影響を及ぼさない範囲でコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼを活性化するためによく使用される酵素活性化剤、安定化剤、防腐剤、干渉物抑制剤、生体試料中のグロブリンなどの蛋白質を可溶化するための種々の塩類を使用することもできる。
コレステロールエステル加水分解反応、遊離コレステロールの酸化または脱水素反応は該2種類の界面活性剤の存在下に順次行ってもよい。また試料と界面活性剤とを水性液中接触させ、ついで酵素を添加して反応させてもよいが、通常必要な成分を全てまたは必要に応じて2〜3のグループに分けて水性媒体に添加して反応させる。より便利には、後述のVLDLレムナント−Cの定量用キットが用いられる。
水性媒体中、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素またはコレステロール脱水素酵素は、通常0.001〜400U/mLで、好ましくは0.01〜200U/mL、より好ましくは0.05〜100U/mLの濃度で用いられる。
水性媒体中、該2種類の界面活性剤の濃度は、それぞれに、0.001〜5(w/v)%が好ましく、0.005〜2.5(w/v)%がより好ましく、0.05〜1(w/v)%が特に好ましい。
水性媒体中、シクロデキストリンまたはその誘導体の濃度は、0.001〜5(w/v)%が好ましく、0.005〜2.5(w/v)%がより好ましく、0.01〜1(w/v)%が特に好ましい。
水性媒体中、アルブミンの濃度は、0.001〜5(w/v)%が好ましく、0.005〜2.5(w/v)%がより好ましく、0.01〜1(w/v)%が特に好ましい。
酵素反応は通常10〜50℃、好ましくは20〜40℃の温度で行われ、通常2〜30分間で完了する。
生成した過酸化水素は例えばペルオキシダーゼの存在下過酸化水素と酸化によって色素に変換される色原体との反応によって色素を生成させ、生成した色素の吸収極大波長で反応液の吸光度の変化を測定することによって定量される。また化学発光物質、例えばルミノール、イソルミノール、ルシゲニン、アクリジニウムエステル等と過酸化水素とを反応させてフォトンを生成させ、生成したフォトンを定量することにより過酸化水素は定量される。
還元型補酵素は酵素反応によって生成した還元型補酵素含有液の吸光度を300〜500nm、好ましくは330〜400nm、より好ましくは340nm付近で測定することによって定量できる。また、還元型補酵素と色原体とを反応させて色素を生成させ、生成した色素を定量することによって定量できる。例えば還元型補酵素とジアホラーゼ、電子キャリアー例えば1−メトキシ−5−メチルフェナジウムメチルサルフェートおよび色原体とを反応させて色素を生成させ、色素の吸収極大波長で反応液の吸光度を測定することによって定量できる。色原体としては還元されて色素に変換される色原体が用いられる。
試料中のVLDLレムナント−C濃度は、予め既知の濃度のVLDLレムナント−Cを含有する試料を用いて、コレステロール濃度と過酸化水素または還元型補酵素の量との関係を示す検量線を作成し、この検量線から求めることができる。
コレステロールエステル加水分解酵素はコレステロールエステルを加水分解できる酵素、例えばコレステロールエステラーゼ、リポプロテインリパーゼ等が用いられ、動物、植物または微生物由来または、遺伝子工学的な手法により製造される酵素、化学的に修飾された酵素等を使用することができる。化学的に修飾された酵素としては、例えばポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールとポリエチレングリコールの共重合体を有する基、水溶性多糖類を含有する基、スルホプロピル基、スルホブチル基、ポリウレタン基、キレート機能を有する基等の化学修飾基で修飾された酵素が含まれる。特にポリエチレングリコールを主成分とする基で修飾された酵素が好ましい。水溶性多糖類としては、例えばデキストラン、プルラン、可溶性デンプン等が含まれる。
化学的に修飾するための試薬(化学修飾剤)は、上記の化学修飾基と、酵素のアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基等と反応し得る官能基または構造とを併せ持つ化合物等が含まれる。酵素中のアミノ基と反応し得る官能基または構造は、例えばカルボキシル基、活性エステル基(N−ヒドロキシサクシンイミド基等)、酸無水物、酸塩化物、アルデヒド、エポキシド基、1,3−プロパンスルトン、1,4−ブタンスルトン等が含まれる。酵素中のカルボキシル基と反応し得る官能基または構造は、例えばアミノ基を含む。酵素中のスルフヒドリル基と反応性がある基または構造は、例えばマレイミド基、ジスルフィド、α−ハロエステル(α−ヨードエステル等)等を含む。
化学修飾剤の例は、ポリエチレングリコールを主成分とする基とN−ヒドロキシサクシンイミド基とを有するサンブライトVFM−4101、サンブライトMEAC−50HS、サンブライトMEC−50HS(いずれも日本油脂社製)、ポリアルキレングリコールを主成分とする基と酸無水物構造とを有するサンブライトAKMシリーズ(例えば、サンブライトAKM−1510等)、サンブライトADMシリーズ、サンブライトACMシリーズ(いずれも日本油脂社製)、ポリエチレングリコールを主成分とする基とエポキシド基とを有するEPOX−3400、M−EPOX−5000(いずれもSheawater Polymers社製)、キレート機能を有する基と酸無水物構造とを有するジエチレントリアミン−N,N,N’,N’’,N’’−ペンタ無水酢酸(DTPA anhydride;同仁化学社製)、ポリウレタン修飾用の活性化ポリウレタンP4000(ベーリンガーマンハイム社製)、デキストラン修飾用のデキストランT40、活性化TCT(ベーリンガーマンハイム社製)等を含む。
酵素の化学修飾は、例えば以下の方法で行うことができる。
まず、コレステロールエステル加水分解酵素をpH8.0以上の緩衝液、例えばHEPES緩衝液に溶解し、0〜55℃で0.01〜500倍モル量の化学修飾剤を添加し、5分〜5時間攪拌する。実際の酵素反応においては、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素として、この反応液そのもののみならず、必要に応じて限外濾過膜等により未反応の化学修飾剤等を除去したものも、使用することもできる。
コレステロール酸化酵素は動物、植物または微生物由来酵素、遺伝子工学的な手法により製造される酵素、化学的に修飾された酵素等を用いることができる。
化学修飾酵素は、前述の化学修飾方法により作製することができる。
コレステロール脱水素酵素は、酸化型補酵素の存在下にコレステロールを酸化して還元型補酵素を生成する能力を有する酵素であれば、動物、植物または微生物由来の酵素、遺伝子工学的な手法により製造される酵素、化学的に修飾された酵素を用いることができる。化学的に修飾された酵素は、例えば前述の化学修飾剤を用いて、前述の化学修飾方法により作製することができる。
本発明のコレステロール脱水素酵素を用いる定量法において使用される酸化型補酵素の例は、NAD、NADP、チオ−NAD、チオ−NADPである。
本発明において使用されるポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルは、本発明において使用されるポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤と組み合わさって、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素もしくはコレステロール脱水素酵素をVLDLレムナント−Cに特異的に作用させる機能を有し、単独で使用された場合には、必ずしも、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素もしくはコレステロール脱水素酵素をVLDLレムナント−Cに特異的に作用させる機能を有する必要はない。以下、本発明において使用されるポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルを、「界面活性剤1」とよぶ。
本発明において使用されるポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤は、本発明において使用されるポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルと組み合わさって、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素もしくはコレステロール脱水素酵素をVLDLレムナント−Cに特異的に作用させる機能を有し、単独で使用された場合には、必ずしも、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素もしくはコレステロール脱水素酵素をVLDLレムナント−Cに特異的に作用させる機能を有する必要はない。以下、本発明において使用されるポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤を、「界面活性剤2」とよぶ。
ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルの例はポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシプロピレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルフェニルエーテルを含み、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルフェニルエーテルが好ましい。
ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルにおけるアルキルは、直鎖または分岐状の炭素数6〜15の、例えばヘキシル、イソヘキシル、ヘプチル、イソヘプチル、オクチル、イソオクチル、ノニル、イソノニル、デシル、イソデシル、ウンデシル、イソウンデシル、ドデシル、イソドデシル、トリデシル、イソトリデシル、テトラデシル、イソテトラデシル、ペンタデシル、イソペンタデシルを含む。ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルの具体例は、エマルゲンL−40(ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルフェニルエーテル)、エマルゲン911(ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル)、エマルゲン810(ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル)(以上、花王社製)、ノニオンHS−210(ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル)、ノニオンHS−215(ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル)、ノニオンNS−208.5(ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル)、ノニオンHS−208(ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル)(以上、日本油脂社製)で、中でもエマルゲンL−40が好ましい。
ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物は、ポリオキシエチレンとポリオキシブチレンとのランダム重合体、ブロック重合体を含み、例えば一般式(I)
RO−(CO)−(CO)−(CO)−H (I)
(式中、A、BおよびCは同一または異なって1〜200の整数を表し、Rは水素原子、直鎖または分岐のアルキルを表す)で表される化合物[以下、化合物(I)と称する]等が挙げられる。化合物(I)におけるアルキルは、炭素数が1〜30の、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、ヘプチル、イソヘプチル、オクチル、イソオクチル、ノニル、イソノニル、デシル、イソデシル、ウンデシル、イソウンデシル、ドデシル、イソドデシル、トリデシル、イソトリデシル、テトラデシル、イソテトラデシル、ペンタデシル、イソペンタデシル、ヘキサデシル、イソヘキサデシル、ヘプタデシル、イソヘプタデシル、オクタデシル、イソオクタデシル、ノナデシル、イソノナデシル、イコシル、ヘネイコシル、ドコシル(ベヘニル)、トリコシル、テトラコシル、ペンタコシル、ヘキサコシル、ヘプタコシル、オクタコシル、ノナコシル、トリアコンチル等を含む。
化合物(I)の具体例は、プロノンB−204、プロノンB−208(以上、日本油脂社製)を含む。ポリオキシブチレン部分の分子量としては、700以上が好ましく、1,000以上がより好ましく、1,500以上が特に好ましい。
ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルの例は、BLAUNON DSP−9、BLAUNON DSP−12.5、BLAUNON DSP−20、BLAUNON DSP−10、BLAUNON TSP−5、BLAUNONTSP−7.5、BLAUNON TSP−16、BLAUNON TSP−20、BLAUNON TSP−50(以上、青木油脂社製)等であって、市販されている。
ポリオキシアルキレン長鎖分岐アルキルエーテルの例はユニルーブMT−0620B(日本油脂社製)であり市販されている。
シクロデキストリンまたはその誘導体の例はシクロデキストリン、ジメチルシクロデキストリン、トリメチルシクロデキストリン、ヒドロキシエチルシクロデキストリン、ヒドロキシプロピルシクロデキストリン、カルボキシメチルシクロデキストリン、グリコシルシクロデキストリン、マルトシルシクロデキストリン、シクロデキスロリンスルフェート、シクロデキストリンポリマーであり、ヒドロキシエチルシクロデキストリンおよびヒドロキシプロピルシクロデキストリンが好ましい。
シクロデキストリンの例はα−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリンである。
ジメチルシクロデキストリンの例はジメチル−α−シクロデキストリン、ジメチル−β−シクロデキストリン、ジメチル−γ−シクロデキストリンである。
トリメチルシクロデキストリンの例はトリメチル−α−シクロデキストリン、トリメチル−β−シクロデキストリン、トリメチル−γ−シクロデキストリンである。
ヒドロキシエチルシクロデキストリンの例はヒドロキシエチル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−γ−シクロデキストリンである。
ヒドロキシプロピルシクロデキストリンの例はヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリンである。
カルボキシメチルシクロデキストリンの例はカルボキシメチル−α−シクロデキストリン、カルボキシメチル−β−シクロデキストリン、カルボキシメチル−γ−シクロデキストリンである。
グリコシルシクロデキストリンの例はグリコシル−α−シクロデキストリン、グリコシル−β−シクロデキストリン、グリコシル−γ−シクロデキストリンである。
マルトシルシクロデキストリンの例はマルトシル−α−シクロデキストリン、マルトシル−β−シクロデキストリン、マルトシル−γ−シクロデキストリンである。
シクロデキストリンスルフェートの例はα−シクロデキストリンスルフェート、β−シクロデキストリンスルフェート、γ−シクロデキストリンスルフェートである。
シクロデキストリンポリマーの例はβ−シクロデキストリンポリマーである。2種類以上のシクロデキストリンまたはその誘導体を組み合わせて使用することもできる。
アルブミンの例はウシ、ウマ、ヒツジ、ヒト由来のアルブミンを含み、ウシ血清アルブミン(BSA)が好ましい。遺伝子工学的な手法により製造されたアルブミンも用いることができる。2種類以上のアルブミンを組み合わせて使用することもできる。
水性媒体は、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等を含み、緩衝液が好ましい。緩衝液に用いる緩衝剤の例はトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝剤、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッドの緩衝剤等があげられる。グッドの緩衝剤としては、例えば2−モルホリノエタンスルホン酸(MES)、ビス(2−ヒドロキシエチル)イミノトリス(ヒドロキシメチル)メタン(Bis−Tris)、N−(2−アセトアミド)イミノ二酢酸(ADA)、ピペラジン−N,N’−ビス(2−エタンスルホン酸)(PIPES)、N−(2−アセトアミド)−2−アミノエタンスルホン酸(ACES)、3−モルホリノ−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸(MOPSO)、N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)−2−アミノエタンスルホン酸(BES)、3−モルホリノプロパンスルホン酸(MOPS)、N−〔トリス(ヒドロキシメチル)メチル〕−2−アミノエタンスルホン酸(TES)、2−〔4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル〕エタンスルホン酸(HEPES)、3−〔N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)アミノ〕−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸(DIPSO)、N−〔トリス(ヒドロキシメチル)メチル〕−2−ヒドロキシ−3−アミノプロパンスルホン酸(TAPSO)、ピペラジン−N,N’−ビス(2−ヒドロキシプロパンスルホン酸)(POPSO)、3−〔4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル〕−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸(HEPPSO)、3−〔4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸〔(H)EPPS〕、N−〔トリス(ヒドロキシメチル)メチル〕グリシン(Tricine)、N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)グリシン(Bicine)、N−トリス(ヒドロキシメチル)メチル−3−アミノプロパンスルホン酸(TAPS)、N−シクロヘキシル−2−アミノエタンスルホン酸(CHES)、N−シクロヘキシル−3−アミノ−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸(CAPSO)、N−シクロヘキシル−3−アミノプロパンスルホン酸(CAPS)を含む。
緩衝液は通常pH4〜10、好ましくは5〜9で、通常0.001〜0.5mol/L、好ましくは0.005〜0.2mol/L、より好ましくは0.01〜0.1mol/Lの濃度で用いられる。
過酸化水素定量に用いられる色原体として、酸化によって色素に変換される色原体が用いられる、その例はロイコ型色原体、酸化カップリング型色原体を含む。ロイコ型色原体は、過酸化水素およびペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、単独で色素へ変換される物質である。ロイコ型色原体の例は10−N−カルボキシメチルカルバモイル−3,7−ビス(ジメチルアミノ)−10H−フェノチアジン(CCAP)、10−(N−メチルカルバモイル)−3,7−ビス(ジメチルアミノ)−10H−フェノチアジン(MCDP)、N−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−4,4’−ビス(ジメチルアミノ)ジフェニルアミン ナトリウム塩(DA−64)、4,4’−ビス(ジメチルアミノ)ジフェニルアミン、ビス〔3−ビス(4−クロロフェニル)メチル−4−ジメチルアミノフェニル〕アミン(BCMA)である。
酸化カップリング型色原体は、過酸化水素およびパーオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、2つの化合物が酸化によってカップリングして色素に変換される色原体である。2つの化合物の組み合わせの例はカプラーとアニリン類との組み合わせ、カプラーとフェノール類との組み合わせを含む。カプラーの例は4−アミノアンチピリン(4−AA)、3−メチル−2−ベンゾチアゾリノンヒドラジンである。アニリン類の例はN−(3−スルホプロピル)アニリン、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3−メチルアニリン(TOOS)、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3,5−ジメチルアニリン(MAOS)、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニリン(DAOS)、N−エチル−N−(3−スルホプロピル)−3−メチルアニリン(TOPS)、N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニリン(HDAOS)、N,N−ジメチル−3−メチルアニリン、N,N−ジ(3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニリン、N−エチル−N−(3−スルホプロピル)−3−メトキシアニリン、N−エチル−N−(3−スルホプロピル)アニリン、N−エチル−N−(3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニリン、N−(3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニリン、N−エチル−N−(3−スルホプロピル)−3,5−ジメチルアニリン、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3−メトキシアニリン、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)アニリン、N−エチル−N−(3−メチルフェニル)−N’−サクシニルエチレンジアミン(EMSE)、N−エチル−N−(3−メチルフェニル)−N’−アセチルエチレンジアミン、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−4−フルオロ−3,5−ジメトキシアニリン(F−DAOS)を含む。フェノール類の例はフェノール、4−クロロフェノール、3−メチルフェノール、3−ヒドロキシ−2,4,6−トリヨード安息香酸(HTIB)を含む。
パーオキシダーゼは、1〜100kU/Lの濃度で用いられる。色原体は、0.01〜10g/Lで用いられる。
還元型補酵素の定量に用いられる色原体の例は、3−(4,5−ジメチル−2−チアゾリル)−2,5−ジフェニル−2H−テトラゾリウム ブロミド(MTT)、2−(4−ヨードフェニル)−3−(4−ニトロフェニル)−5−(2,4−ジスルホフェニル)−2H−テトラゾリウム モノナトリウム塩(WST−1)、2−(4−ヨードフェニル)−3−(2,4−ジニトロフェニル)−5−(2,4−ジスルホフェニル)−2H−テトラゾリウム モノナトリウム塩(WST−3)を含む。
酵素活性化剤の例は胆汁酸類、アルキルスルホン酸塩等のアニオン性界面活性剤を含む。胆汁酸類の例はコール酸、デオキシコール酸、タウロコール酸、ケノデオキシコール酸を含む。アルキルスルホン酸塩の例は1−ペンタスルホン酸塩、1−ヘキサスルホン酸塩、1−ヘプタスルホン酸塩、1−オクタスルホン酸塩を含む。アルキルスルホン酸塩における塩の例はアンモニウム塩、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩を含む。
安定化剤の例はエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、シュークロース、塩化カルシウムである。
防腐剤の例はアジ化ナトリウム、抗生物質を含む。
干渉抑制剤の例はアスコルビン酸の影響を抑制するためのアスコルビン酸オキシダーゼ、ビリルビンの影響を抑制するためのフェロシアン化カリウムを含む。
塩類の例は塩化リチウム、硫酸リチウム、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウム、塩化アンモニウム、硫酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、硝酸カルシウムの塩類を含む。
本発明のVLDLレムナント−Cの定量方法として、以下の具体的態様を例示することができる。
定量方法1
(1)水性媒体中、検体、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素、界面活性剤1および界面活性剤2の存在下、酵素反応を行い、
(2)生成する過酸化水素を測定し、
(3)(2)で測定した値と、予め作成した検量線とから、検体中のVLDLレムナント−C濃度を決定する方法。
定量方法2
(1)水性媒体中、検体、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、界面活性剤1および界面活性剤2の存在下、酵素反応を行い、
(2)生成する還元型補酵素を測定し、
(3)(2)で測定した値と、予め作成した検量線とから、検体中のVLDLレムナント−C濃度を決定することができる。
定量方法3
(1)水性媒体中、検体、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、界面活性剤1および界面活性剤2、ならびに、シクロデキストリン誘導体および/またはアルブミンの存在下、酵素反応を行い、
(2)生成する過酸化水素を測定し、
(3)(2)で測定した値と、予め作成した検量線とから、検体中のVLDLレムナント−C濃度を決定することができる。
定量方法4
(1)水性媒体中、検体、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、界面活性剤1および界面活性剤2、ならびに、シクロデキストリン誘導体および/またはアルブミンの存在下、酵素反応を行い、
(2)生成する還元型補酵素を測定し、
(3)(2)で測定した値と、予め作成した検量線とから、検体中のVLDLレムナント−C濃度を決定することができる。
定量方法5
(1)水性媒体中、検体と界面活性剤2とを予め混合した後、
(2)(1)の混合物、界面活性剤1、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素の存在下、酵素反応を行い、
(3)生成する過酸化水素を測定し、
(4)(3)で測定した値と、予め作成した検量線とから、検体中のVLDLレムナント−C濃度を決定することができる。
定量方法6
(1)水性媒体中、検体と界面活性剤2とを予め混合した後、
(2)(1)の混合物、界面活性剤1、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素の存在下、酵素反応を行い、
(3)生成する還元型補酵素を測定し、
(4)(3)で測定した値と、予め作成した検量線とから、検体中のVLDLレムナント−C濃度を決定することができる。
定量方法7
(1)水性媒体中、検体と界面活性剤2、ならびに、シクロデキストリン誘導体および/またはアルブミンとを予め混合した後、
(2)(1)の混合物、界面活性剤1、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素の存在下、酵素反応を行い、
(3)生成する過酸化水素を測定し、
(4)(3)で測定した値と、予め作成した検量線とから、検体中のVLDLレムナント−C濃度を決定することができる。
定量方法8
(1)水性媒体中、検体と界面活性剤2、ならびに、シクロデキストリン誘導体および/またはアルブミンとを予め混合した後、
(2)(1)の混合物、界面活性剤1、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素の存在下、酵素反応を行い、
(3)生成する還元型補酵素を測定し、
(4)(3)で測定した値と、予め作成した検量線とから、検体中のVLDLレムナント−C濃度を決定することができる。
定量方法9
(1)水性媒体中、検体と界面活性剤1および界面活性剤2とを予め混合した後、
(2)(1)の混合物、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素の存在下、酵素反応を行い、
(3)生成する過酸化水素を測定し、
(4)(3)で測定した値と、予め作成した検量線とから、検体中のVLDLレムナント−C濃度を決定することができる。
定量方法10
(1)水性媒体中、検体と界面活性剤1および界面活性剤2とを予め混合した後、
(2)(1)の混合物、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素の存在下、酵素反応を行い、
(3)生成する還元型補酵素を測定し、
(4)(3)で測定した値と、予め作成した検量線とから、検体中のVLDLレムナント−C濃度を決定することができる。
定量方法11
(1)水性媒体中、検体と界面活性剤1および界面活性剤2、ならびに、シクロデキストリン誘導体および/またはアルブミンとを予め混合した後、
(2)(1)の混合物、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素の存在下、酵素反応を行い、
(3)生成する過酸化水素を測定し、
(4)(3)で測定した値と、予め作成した検量線とから、検体中のVLDLレムナント−C濃度を決定することができる。
定量方法12
(1)水性媒体中、検体と界面活性剤1および界面活性剤2、ならびに、シクロデキストリン誘導体および/またはアルブミンとを予め混合した後、
(2)(1)の混合物、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素の存在下、酵素反応を行い、
(3)生成する還元型補酵素を測定し、
(4)(3)で測定した値と、予め作成した検量線とから、検体中のVLDLレムナント−C濃度を決定することができる。
(VLDLレムナント−Cの定量用試薬)
本発明のVLDLレムナント−Cの定量用試薬は、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素およびコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素をVLDLレムナント中のエステル型および遊離型コレステロールに特異的に作用させる(a)ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル(界面活性剤1)および(b)ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤(界面活性剤2)を含有する。
上記試薬は、過酸化水素定量用試薬を含有できる。過酸化水素定量用試薬の例はペルオキシダーゼ及び酸化によって色素に変換される色原体を含有する。
また、本発明の他のVLDLレムナント−Cの定量用試薬は、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素およびコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素をVLDLレムナント中のエステル型および遊離型コレステロールに特異的に作用させる(a)ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル(界面活性剤1)および(b)ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤(界面活性剤2)を含有する。
この試薬は還元型補酵素定量用試薬を含有できる。還元型補酵素定量用試薬の例はジアホラーゼ、電子キャリヤーおよび還元によって色素に変換される色原体を含有する。
これらの試薬はいずれもシクロデキストリンまたはその誘導体および/またはアルブミンを含有することができる。
本発明のVLDLレムナント−Cの定量用試薬として、以下の具体的態様を例示することができる。
試薬1
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、界面活性剤1、界面活性剤2および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
試薬2
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、界面活性剤1および界面活性剤2を含有する試薬。
試薬3
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、界面活性剤1、界面活性剤2および還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬。
試薬4
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、界面活性剤1、界面活性剤2、過酸化水素測定用試薬、ならびに、シクロデキストリン誘導体および/またはアルブミンを含有する試薬。
試薬5
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、界面活性剤1、界面活性剤2、ならびに、シクロデキストリン誘導体および/またはアルブミンを含有する試薬。
試薬6
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、界面活性剤1、界面活性剤2、還元型補酵素測定用試薬、ならびに、シクロデキストリン誘導体および/またはアルブミンを含有する試薬。
(VLDLレムナント−Cの定量用キット)
本発明のVLDLレムナント−C定量用試薬は、キットの形態で保存、流通および使用される。キットの形態は、2試薬および3試薬が用いられるが、2試薬系が好ましい。
第1試薬と第2試薬の2試薬系のキットにおいて、コレステロールエステル加水分解酵素と、コレステロール酸化酵素またはコレステロール脱水素酵素とは別々の試薬に含有されてもよいが、同一試薬に含有されるキットが好ましく、特に、第2試薬に含有されるキットが好ましい。これらの酵素が別々の試薬に含有される場合には、コレステロールエステル加水分解酵素が第1試薬に、コレステロール酸化酵素またはコレステロール脱水素酵素が第2試薬に含有される。
ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤は、第1試薬、第2試薬の何れかの試薬に含有されるが、第1試薬に含有されるキットが好ましい。
ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルは、第1試薬、第2試薬の何れかの試薬に含有される。シクロデキストリンまたはその誘導体および/またはアルブミンは、第1試薬、第2試薬の少なくとも一方にに含有されるが、好ましくは第1試薬に含有される。酸化型補酵素は、第1試薬、第2試薬の少なくとも一方に含有される。過酸化水素定量用試薬は、第1試薬、第2試薬の少なくとも一方に含有されるが、当該試薬が酸化カップリング型色原体を含有する場合には、酸化カップリング型色原体のそれぞれの化合物は好ましくは別々の試薬に含有される。還元型補酵素定量用試薬は、第1試薬、第2試薬の少なくとも一方に含有される。
具体的には、例えば以下の態様のキットがあげられる。
キット1
第1試薬
界面活性剤2および過酸化水素定量用試薬を含有する試薬。
第2試薬
界面活性剤1、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素および過酸化水素定量用試薬を含有する試薬。
キット2
第1試薬
界面活性剤2を含有する試薬。
第2試薬
界面活性剤1、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する試薬。
キット3
第1試薬
界面活性剤2を含有する試薬。
第2試薬
界面活性剤1、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素および還元型補酵素定量用試薬を含有する試薬。
キット4
第1試薬
界面活性剤2、過酸化水素定量用試薬、ならびに、シクロデキストリンまたはその誘導体および/またはアルブミンを含有する試薬。
第2試薬
界面活性剤1、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素および過酸化水素定量用試薬を含有する試薬。
キット5
第1試薬
界面活性剤2、ならびに、シクロデキストリンまたはその誘導体および/またはアルブミンを含有する試薬。
第2試薬
界面活性剤1、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する試薬。
キット6
第1試薬
界面活性剤2、ならびに、シクロデキストリンまたはその誘導体および/またはアルブミンを含有する試薬。
第2試薬
界面活性剤1、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素および還元型補酵素定量用試薬を含有する試薬。
キット7
第1試薬
界面活性剤1、界面活性剤2および過酸化水素定量用試薬を含有する試薬。
第2試薬
界面活性剤1、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素および過酸化水素定量用試薬を含有する試薬。
キット8
第1試薬
界面活性剤1および界面活性剤2を含有する試薬。
第2試薬
界面活性剤1、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する試薬。
キット9
第1試薬
界面活性剤1および界面活性剤2を含有する試薬。
第2試薬
界面活性剤1、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素および還元型補酵素定量用試薬を含有する試薬。
キット10
第1試薬
界面活性剤1、界面活性剤2、過酸化水素定量用試薬、ならびに、シクロデキストリンまたはその誘導体および/またはアルブミンを含有する試薬。
第2試薬
界面活性剤1、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素および過酸化水素定量用試薬を含有する試薬。
キット11
第1試薬
界面活性剤1、界面活性剤2、ならびに、シクロデキストリンまたはその誘導体および/またはアルブミンを含有する試薬。
第2試薬
界面活性剤1、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する試薬。
キット12
第1試薬
界面活性剤1、界面活性剤2、ならびに、シクロデキストリンまたはその誘導体および/またはアルブミンを含有する試薬。
第2試薬
界面活性剤1、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素および還元型補酵素定量用試薬を含有する試薬。
キット13
第1試薬
界面活性剤1、界面活性剤2および過酸化水素定量用試薬を含有する試薬。
第2試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素および過酸化水素定量用試薬を含有する試薬。
キット14
第1試薬
界面活性剤1および界面活性剤2を含有する試薬。
第2試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する試薬。
キット15
第1試薬
界面活性剤1および界面活性剤2を含有する試薬。
第2試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素および還元型補酵素定量用試薬を含有する試薬。
キット16
第1試薬
界面活性剤1、界面活性剤2、過酸化水素定量用試薬、ならびに、シクロデキストリンまたはその誘導体および/またはアルブミンを含有する試薬。
第2試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素および過酸化水素定量用試薬を含有する試薬。
キット17
第1試薬
界面活性剤1、界面活性剤2、ならびに、シクロデキストリンまたはその誘導体および/またはアルブミンを含有する試薬。
第2試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する試薬。
キット18
第1試薬
界面活性剤1、界面活性剤2、ならびに、シクロデキストリンまたはその誘導体および/またはアルブミンを含有する試薬。
第2試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素および還元型補酵素定量用試薬を含有する試薬。
本発明のVLDLレムナント−C定量用試薬およびキットは、VLDLレムナント−Cの定量およびIDL−Cの定量に使用することができる。
本発明のVLDLレムナント−C定量用試薬およびキットにおける各成分は、前述のVLDLレムナント−C定量方法または試薬に記載のコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、シクロデキストリンまたはその誘導体、アルブミン、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤、過酸化水素定量用試薬および還元型補酵素定量用試薬を用いることができる。
本発明のVLDLレムナント−C定量用試薬およびキットには、必要に応じて、前述の水性媒体、酵素活性化剤、安定化剤、防腐剤、干渉物抑制剤、生体試料中のグロブリンなどの蛋白質を可溶化するための種々の塩類が含有されてもよい。
本発明のVLDLレムナント−C定量用試薬およびキットにおける酵素、2種の界面活性剤、シクロデキストリンまたはその誘導体および/またはアルブミンは、水性媒体で溶解された状態でVLDLレムナント−C定量方法の項に記載の濃度となる含量で構成される。
以下、実施例により本発明をより詳細に説明する。尚、本実施例においては、下記メーカーの試薬および機器を使用した。
MOPS(グッド緩衝剤;同仁化学社製)、TOOS(トリンダー試薬;同仁化学社製)、硫酸ナトリウム(和光純薬社製)、エマルゲンL−40(ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルフェニルエーテル;花王社製)、プロノンB−208(ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物;日本油脂社製)、ペルオキシダーゼ(POD)(東洋紡績社製)、アスコルビン酸オキシダーゼ(AOD)(旭化成社製)、4−アミノアンチピリン(半井化学社製)、リポプロテインリパーゼ(LPL)(東洋紡績社製)、コレステロールオキシダーゼ(CHOD)(協和発酵工業社製)、BLAUNON TSP−50(ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテル;青木油脂社製)、ウシ血清アルブミン(BSA)(オリエンタル酵母社製)、ユニルーブMT−0620B(ポリオキシアルキレン長鎖分岐アルキルエーテル;日本油脂社製)、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン(日本食品化工社製)。
【図面の簡単な説明】
図1 超遠心分離により調製した比重1.019以下の分画をゲルろ過カラムクロマトグラフィーにより分析した際のクロマトグラムである。
図2 超遠心分離とゲルろ過とを組み合わせたVLDLレムナント−Cの定量法(参考例1の定量法)と実施例9の定量法との相関関係を表す図である。
図3 超遠心分離を用いたIDL−Cの定量法(参考例2の定量法)と実施例9の定量法との相関関係を表す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【実施例1】
VLDLレムナント−C定量用キット
以下の第1試薬および第2試薬からなるVLDLレムナント−C定量用キットを作製した。
第1試薬
MOPS(pH6.5) 20mmol/L
TOOS 0.3g/L
硫酸ナトリウム 1g/L
エマルゲンL−40 5g/L
プロノンB−208 6g/L
ペルオキシダーゼ(POD) 10U/mL
アスコルビン酸オキシダーゼ(AOD) 2U/mL
第2試薬
MOPS(pH6.8) 20mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.5g/L
エマルゲンL−40 2g/L
ペルオキシダーゼ(POD) 10U/mL
リポプロテインリパーゼ(LPL) 2U/mL
コレステロールオキシダーゼ 2U/mL
【実施例2】
VLDLレムナント−C定量用キット
以下の第1試薬および第2試薬からなるVLDLレムナント−C定量用キットを作製した。
第1試薬
MOPS(pH6.5) 20mmol/L
TOOS 0.3g/L
硫酸ナトリウム 1g/L
BLAUNON TSP−50 7g/L
BSA 1g/L
ペルオキシダーゼ(POD) 10U/mL
アスコルビン酸オキシダーゼ(AOD) 2U/mL
第2試薬
MOPS(pH6.8) 20mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.5g/L
エマルゲンL−40 2g/L
ペルオキシダーゼ(POD) 10U/mL
リポプロテインリパーゼ(LPL) 2U/mL
コレステロールオキシダーゼ 2U/mL
【実施例3】
VLDLレムナント−C定量用キット
以下の第1試薬および第2試薬からなるVLDLレムナント−C定量用キットを作製した。
第1試薬
MOPS(pH6.8) 20mmol/L
TOOS 0.3g/L
硫酸ナトリウム 1g/L
ユニルーブMT−0620B 6g/L
ペルオキシダーゼ(POD) 10U/mL
アスコルビン酸オキシダーゼ(AOD) 2U/mL
第2試薬
MOPS(pH6.8) 20mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.5g/L
エマルゲンL−40 2g/L
ペルオキシダーゼ(POD) 10U/mL
リポプロテインリパーゼ(LPL) 2U/mL
コレステロールオキシダーゼ 2U/mL
【実施例4】
VLDLレムナント−C定量用キット
以下の第1試薬および第2試薬からなるVLDLレムナント−C定量用キットを作製した。
第1試薬
MOPS(pH6.5) 20mmol/L
TOOS 0.3g/L
硫酸ナトリウム 1g/L
エマルゲンL−40 5g/L
プロノンB−208 6g/L
ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン 3g/L
ペルオキシダーゼ(POD) 10U/mL
アスコルビン酸オキシダーゼ(AOD) 2U/mL
第2試薬
MOPS(pH6.8) 20mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.5g/L
エマルゲンL−40 2g/L
ペルオキシダーゼ(POD) 10U/mL
リポプロテインリパーゼ(LPL) 2U/mL
コレステロールオキシダーゼ 2U/mL
【実施例5】
VLDLレムナント−C定量用キット
以下の第1試薬および第2試薬からなるVLDLレムナント−C定量用キットを作製した。
第1試薬
MOPS(pH6.5) 20mmol/L
TOOS 0.3g/L
硫酸ナトリウム 1g/L
エマルゲンL−40 5g/L
プロノンB−208 6g/L
BSA 3g/L
ペルオキシダーゼ(POD) 10U/mL
アスコルビン酸オキシダーゼ(AOD) 2U/mL
第2試薬
MOPS(pH6.8) 20mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.5g/L
エマルゲンL−40 2g/L
ペルオキシダーゼ(POD) 10U/mL
リポプロテインリパーゼ(LPL) 2U/mL
コレステロールオキシダーゼ 2U/mL
【実施例6】
VLDLレムナント−Cの定量
新鮮血清40試料それぞれについて、実施例1のキットを用いて日立7170型自動分析装置により、試料中のVLDLレムナント−Cを以下の様にして定量した。
(1)検量線の作成
標準液として、生理食塩水(VLDLレムナント−C濃度:0.0mg/dL)、ならびに、VLDLレムナント−C濃度が45mg/dLである血清{山村らの方法[「動脈硬化」,日本動脈硬化学会,2001年,第29巻,p.235(演題番号:No.98)]により濃度を決定}および当該血清を適宜希釈して調製した希釈血清を用いた。
実施例1のキットを用いて、以下の様にして日立7170型自動分析装置によりVLDLレムナント−C濃度を定量し、検量線を作成した。
反応セルへ標準液(6μL)と第1試薬(0.18mL)とを添加し37℃で5分間加温し、反応液の吸光度(E1)を主波長546nm、副波長700nmで定量し、次いで、この反応液に第2試薬(0.05mL)を添加しさらに37℃で5分間加温し、反応液の吸光度(E2)を主波長546nm、副波長700nmで測定した。
(2)ヒト新鮮血清試料(40試料)に含まれるVLDLレムナント−Cの定量
標準液の代わりにヒト新鮮血清40試料を用いて、(1)と同様の方法により、当該40試料各々について反応を行い、反応後の反応液の吸光度と(1)で作成した検量線とから、当該40試料各々に含まれるVLDLレムナント−Cを定量した。
【実施例7】
VLDLレムナント−Cの定量
実施例1のキットの代わりに実施例2のキットを用いる以外は実施例6の定量法と同様にして、日立7170型自動分析装置により、実施例6の定量において使用したヒト新鮮血清試料(40試料)各々に含まれるVLDLレムナント−Cを定量した。
【実施例8】
VLDLレムナント−Cの定量
実施例1のキットの代わりに実施例3のキットを用いる以外は実施例6の定量法と同様にして、日立7170型自動分析装置により、実施例6の定量において使用したヒト新鮮血清試料(40試料)各々に含まれるVLDLレムナント−Cを定量した。
【実施例9】
VLDLレムナント−Cの定量
実施例1のキットの代わりに実施例4のキットを用いる以外は実施例6の定量法と同様にして、日立7170型自動分析装置により、実施例6の定量において使用したヒト新鮮血清試料(40試料)各々に含まれるVLDLレムナント−Cを定量した。
【実施例10】
VLDLレムナント−Cの定量
実施例1のキットの代わりに実施例5のキットを用いる以外は実施例6の定量法と同様にして、日立7170型自動分析装置により、実施例6の定量において使用したヒト新鮮血清試料(40試料)各々に含まれるVLDLレムナント−Cを定量した。
(参考例1) 山村らの方法によるVLDLレムナント−Cの定量
実施例6の定量において使用した新鮮血清(40試料)それぞれについて、山村らの方法[「動脈硬化」,日本動脈硬化学会,2001年,第29巻,p.235(演題番号:No.98)]により、超遠心分離とゲルろ過とを組み合わせて、以下の様に試料中のVLDLレムナント−Cを定量した。
まず、それぞれの試料を超遠心分離により、比重が1.019よりも小さい上清画分を分離した。すなわち、超遠心分離用チューブに試料を2mL添加し、比重が1.019になるように比重調整液[KBr(37.9g/L)を含有する生理食塩水]を2mL添加した後、このチューブを日立ローター50.4 TIローターにセットし、35,000rpmで20時間、超遠心分離を行い、遠心分離終了後、チューブスライサーを用いて分離した上清を取得した。
当該上清は、CM、VLDLおよびVLDLレムナントを含有する(当該VLDLレムナントは、IDLを含有する)。
上記で得たCM、VLDLおよびVLDLレムナントを含有する上清を、以下の条件により、発色反応系を伴うゲルろ過カラムクロマトグラフィーにより分離しコレステロールを定量した。
HPLCシステム:東ソーのシステム
カラム:Superose HR6カラム(ファルマシア社製)
溶出溶媒:EDTA(1mmol/L)を含有する0.15mol/L塩化ナトリウム水溶液(pH7.4)
発色試薬:デタミナーL TC(R1+R2;協和メデックス社製)
流速:0.5mL/分(溶出溶媒);0.25mL/分(発色試薬)
発色反応温度:37℃
検出波長:550nm
サンプル量:3μL
当該上清中のコレステロール濃度は、デタミナーL TC(総コレステロール定量用キット;協和メデックス社製)を用いて決定した。
本ゲルろ過カラムクロマトグラフィーにおける溶出パターン(クロマトグラム)を図1に示す。図1に示されているように、最初にVLDLおよびCMが溶出され、次いでVLDLレムナントが溶出された。
【実施例11】
先に定量した超遠心分離により調製した上清中のコレステロール濃度に、当該上清の容量および図1のクロマトグラムのVLDLレムナント部分の相対面積比を乗ずることにより、当該上清中のVLDLレムナント−C量を算出し、最終的に試料中のVLDLレムナント−C濃度を決定した。
これらの試料の超遠心分離による比重1.019未満の上清の調製から、当該試料中のVLDLレムナント−C濃度の決定に至る一連の操作を40試料の各々について行った。参考例1の定量方法と実施例6〜10の定量法との間の相関関係を調べたところ、両定量法の間に第1表に示すような相関係数が得られた。また、参考例1の定量方法と実施例9の定量法との間には、図2に示すような相関図が得られた(相関式:Y=0.83X+4.7;相関係数:r=0.91)。このように、両定量法の間に良好な相関関係があることから、本発明の定量法により、試料中のVLDLレムナント−Cが定量できることが判明した。
(参考例2) 超遠心法によるIDL−Cの定量
実施例6の定量において使用した新鮮血清(40試料)それぞれについて、超遠心分離操作により、比重が1.006から1.019の画分(IDL画分)を得た。得られたIDL画分中のコレステロール濃度をデタミナーL TC(総コレステロール定量用キット;協和メデックス社製)を用いて定量した。
【実施例12】
標準液として、比重が1.006から1.019の画分中のコレステロールが23mg/dLである血清を用いて検量線を作成する以外は、実施例6と同様の方法により、実施例1〜5の試薬を用いて測定を行い、参考例2の定量方法と実施例6〜10の定量方法との間の相関関係を調べたところ、両定量法の間に第1表に示すような相関係数が得られた。また、参考例2の定量方法と実施例9の定量法との間には、図3に示すような相関図が得られた(相関式:Y=1.20X+5.6;相関係数:r=0.83)。このように、両定量法の間に良好な相関関係があることから、本発明の定量法により、試料中のIDL−Cが定量され得ることが判明した。

実施例11および実施例12の結果、本発明の定量法により、試料中のVLDLレムナント−Cおよび試料中のIDL−Cが定量できることが判明した。
(参考例3) シクロデキストリンまたはその誘導体、アルブミンのLDLに対する反応抑制効果
実施例1、実施例4、実施例5のキットおよび超遠心分離により調製したLDL分画を用いて、各キットにおけるLDLに対する反応性を検討した。標準液の代わりにLDL分画を、第1試薬および第2試薬として、実施例1、実施例4、実施例5のキットを構成する第1試薬および第2試薬を用いる以外は実施例6に記載の方法と同様の方法より反応を行った。その結果を第2表に示す。

第2表中、LDL反応率とは、LDL分画とデタミナーL TC(総コレステロール定量用キット;協和メデックス社製)との反応により定量したLDL分画中のコレステロール量に対する、LDL分画と各キットとの反応により定量したコレステロール量の割合を表す。また、第2表中、吸光度とは、既知濃度のコレステロール標準液と各キットとの反応により得られた反応液の吸光度を表す。第2表から判るように、シクロデキストリンまたはその誘導体またはアルブミンを添加することにより、LDL中のコレステロールに対する反応が抑制された。また、アルブミンを添加することにより吸光度が上昇したことから、感度も向上することが判明した。
【産業上の利用可能性】
本発明によれば、動脈硬化性疾患の診断に有用なVLDLレムナント−Cの定量方法、試薬およびキットが提供される。
【図1】

【図2】

【図3】


【特許請求の範囲】
【請求項1】
試料を含有する水性媒体中、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素もしくはコレステロール脱水素酵素を超低密度リポ蛋白レムナント中のエステル型および遊離型コレステロール(以下総称して超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールという)に特異的に作用させる(a)ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルおよび(b)ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤の組み合わせの存在下、試料中の超低密度リポ蛋白レムナント中のコレステロールに、(c)コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素または(d)酸化型補酵素の存在下にコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を作用させ、過酸化水素または還元型補酵素を生成させ、生成した過酸化水素または還元型補酵素を定量することを特徴とする試料中の超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールの定量方法。
【請求項2】
超低密度リポ蛋白レムナントが、中間密度リポ蛋白である請求項1記載の方法。
【請求項3】
該酵素反応が、さらにシクロデキストリンまたはその誘導体および/またはアルブミンの存在下に行われる請求項1または2記載の方法。
【請求項4】
シクロデキストリンまたはその誘導体が、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、ジメチル−α−シクロデキストリン、ジメチル−β−シクロデキストリン、ジメチル−γ−シクロデキストリン、トリメチル−α−シクロデキストリン、トリメチル−β−シクロデキストリン、トリメチル−γ−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−γ−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン、カルボキシメチル−α−シクロデキストリン、カルボキシメチル−β−シクロデキストリン、カルボキシメチル−γ−シクロデキストリン、グリコシル−α−シクロデキストリン、グリコシル−β−シクロデキストリン、グリコシル−γ−シクロデキストリン、マルトシル−α−シクロデキストリン、マルトシル−β−シクロデキストリン、マルトシル−γ−シクロデキストリン、α−シクロデキストリンスルフェート、β−シクロデキストリンスルフェート、γ−シクロデキストリンスルフェート、β−シクロデキストリンポリマーからなる群より選ばれる化合物である請求項3記載の方法。
【請求項5】
ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルが、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルフェニルエーテルである請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
【請求項6】
過酸化水素の定量が、パーオキシダーゼの存在下生成した過酸化水素と色原体とを反応させて色素を生成させ、生成した色素を定量することによって行われる請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
【請求項7】
還元型補酵素の定量が反応液の吸光度を測定することによって行われる請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
【請求項8】
コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールに特異的に作用させる(a)ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルおよび(b)ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤の組み合わせ、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を含有する試料中の超低密度リポ蛋白レムナントコレステロール定量用試薬。
【請求項9】
該試薬がさらに過酸化水素定量用試薬を含有する請求項8記載の試薬。
【請求項10】
コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールに特異的に作用させる(a)ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルおよび(b)ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤の組み合わせ、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素および酸化型補酵素を含有する超低密度リポ蛋白レムナントコレステロール定量用試薬。
【請求項11】
該試薬がさらに還元型補酵素定量用試薬を含有する請求項10記載の試薬。
【請求項12】
超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールが、中間密度リポ蛋白である請求項8〜11のいずれかに記載の試薬。
【請求項13】
さらに、シクロデキストリンまたはその誘導体および/またはアルブミンを含有する請求項8〜12のいずれかに記載の試薬。
【請求項14】
シクロデキストリンまたはその誘導体が、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、ジメチル−α−シクロデキストリン、ジメチル−β−シクロデキストリン、ジメチル−γ−シクロデキストリン、トリメチル−α−シクロデキストリン、トリメチル−β−シクロデキストリン、トリメチル−γ−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−γ−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン、カルボキシメチル−α−シクロデキストリン、カルボキシメチル−β−シクロデキストリン、カルボキシメチル−γ−シクロデキストリン、グリコシル−α−シクロデキストリン、グリコシル−β−シクロデキストリン、グリコシル−γ−シクロデキストリン、マルトシル−α−シクロデキストリン、マルトシル−β−シクロデキストリン、マルトシル−γ−シクロデキストリン、α−シクロデキストリンスルフェート、β−シクロデキストリンスルフェート、γ−シクロデキストリンスルフェート、β−シクロデキストリンポリマーからなる群より選ばれる化合物である請求項13記載の試薬。
【請求項15】
ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルが、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルフェニルエーテルである請求項8〜14のいずれかに記載の試薬。
【請求項16】
ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルと組み合わさってコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールに特異的に作用させるポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤を含有する第1試薬と、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を含有する第2試薬とを含有し、かつ、該ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤と組み合わさってコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールに特異的に作用させるポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルを第1試薬および第2試薬の少なくとも一方に含有し、過酸化水素定量用試薬を第1試薬および第2試薬の少なくとも一方に含有する試料中の超低密度リポ蛋白レムナントコレステロール定量用キット。
【請求項17】
コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールに特異的に作用させる(a)ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルおよび(b)ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤の組み合わせを含有する第1試薬と、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を含有する第2試薬を含有し、かつ、過酸化水素定量用試薬を第1試薬、第2試薬の少なくとも一方に含有する試料中の超低密度リポ蛋白レムナントコレステロール定量用キット。
【請求項18】
ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルと組み合わさってコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールに特異的に作用させるポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤を含有する第1試薬と、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する第2試薬とを含有し、かつ、酸化型補酵素を第1試薬、第2試薬の少なくとも一方に含有し、該該ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤と組み合わさってコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素をレムナントコレステロールに特異的に作用させるポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルを第1試薬、第2試薬の少なくとも一方に含有する試料中の超低密度リポ蛋白レムナントコレステロール定量用キット。
【請求項19】
コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を超低密度リポ蛋白レムナントコレステロールに特異的に作用させる(a)ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルおよび(b)ポリオキシエチレンポリオキシブチレン縮合物、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシアルキレン長鎖アルキルエーテルからなる群から選択される一種の界面活性剤の組み合わせを含有する第1試薬と、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する第2試薬とを含有し、かつ、酸化型補酵素を第1試薬、第2試薬の少なくとも一方に含有する試料中の超低密度リポ蛋白レムナントコレステロール定量用キット。
【請求項20】
超低密度リポ蛋白レムナントが中間密度リポ蛋白である請求項16〜19のいずれかに記載のキット。
【請求項21】
さらに、シクロデキストリンまたはその誘導体および/またはアルブミンを第1試薬、第2試薬の少なくとも一方に含有する請求項16〜20のいずれかに記載のキット。
【請求項22】
シクロデキストリンまたはその誘導体が、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、ジメチル−α−シクロデキストリン、ジメチル−β−シクロデキストリン、ジメチル−γ−シクロデキストリン、トリメチル−α−シクロデキストリン、トリメチル−β−シクロデキストリン、トリメチル−γ−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−γ−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン、カルボキシメチル−α−シクロデキストリン、カルボキシメチル−β−シクロデキストリン、カルボキシメチル−γ−シクロデキストリン、グリコシル−α−シクロデキストリン、グリコシル−β−シクロデキストリン、グリコシル−γ−シクロデキストリン、マルトシル−α−シクロデキストリン、マルトシル−β−シクロデキストリン、マルトシル−γ−シクロデキストリン、α−シクロデキストリンスルフェート、β−シクロデキストリンスルフェート、γ−シクロデキストリンスルフェート、β−シクロデキストリンポリマーからなる群より選ばれる化合物である請求項21記載のキット。
【請求項23】
ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルが、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルである請求項16〜22のいずれかに記載のキット。

【国際公開番号】WO2005/073401
【国際公開日】平成17年8月11日(2005.8.11)
【発行日】平成19年9月13日(2007.9.13)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2005−517575(P2005−517575)
【国際出願番号】PCT/JP2005/001626
【国際出願日】平成17年1月28日(2005.1.28)
【出願人】(000162478)協和メデックス株式会社 (42)
【Fターム(参考)】