超音波癌治療促進剤
【課題】高い安全性を確保しながら、超音波による癌の治療効果を著しく向上できる超音
波癌治療促進剤の提供。
【解決手段】この超音波癌治療促進剤は、金属半導体粒子を含んでなり、超音波の照射に
より活性化して癌細胞を死滅ないし破壊することができる。
波癌治療促進剤の提供。
【解決手段】この超音波癌治療促進剤は、金属半導体粒子を含んでなり、超音波の照射に
より活性化して癌細胞を死滅ないし破壊することができる。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、患部に超音波を照射することにより行われる超音波癌治療を促進するための、超音波癌治療促進剤に関するものである。
【０００２】
背景技術
近年、癌治療において、治療効果と患者のＱＯＬ（生活の質）の両方の向上を図るために、非侵襲で効率的に患部を治療することができる音響化学療法が提案されている。これは、超音波の照射により、投与した薬剤（超音波併用剤）の抗腫瘍活性化を行い、腫瘍の治療を行なうというものである。超音波治療用併用剤として、フラーレンを用いる方法が知られている（例えば、特許文献１（特開２００２−２４１３０７号公報）および特許文献２（国際公開第２００２／６６０６１号パンフレット）参照）。また、超音波治療用併用剤として、色素を用いる方法も知られている（特許文献３（特開２００１−２５３８３６号公報）、特許文献４（国際公開第９８／１１３１号パンフレット）、および特許文献５（特開２００３−２２６６５４号公報）を参照）。このような方法にあっては、光によりラジカル種を発生する有機物またはフラーレンを超音波の効果により励起させることによって、治療が行われる。
【０００３】
一方、酸化チタンの光触媒活性を癌治療に利用する提案もなされている。例えば、酸化チタンの医療用具としての利用や（特許文献６（特開平４−３５７９４１号公報）参照）、ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）の担体としての利用が提案されている（特許文献７（特開２００１−２０００５０号公報）および特許文献８（米国特許第６６７７６０６号明細書）参照）。
【０００４】
更に、酸化チタンに超音波照射を行い、ヒドロキシラジカルを発生させることにより有機物を分解させる技術も提案されている（例えば、特許文献９（特開２００３−２６４０６号公報）および特許文献１０（特開２００５−７３９２号公報）参照）。
【０００５】
【特許文献１】特開２００２−２４１３０７号公報
【特許文献２】国際公開第２００２／６６０６１号パンフレット
【特許文献３】特開２００１−２５３８３６号公報
【特許文献４】国際公開第９８／１１３１号パンフレット
【特許文献５】特開２００３−２２６６５４号公報
【特許文献６】特開平４−３５７９４１号公報
【特許文献７】特開２００１−２０００５０号公報
【特許文献８】米国特許第６６７７６０６号明細書
【特許文献９】特開２００３−２６４０６号公報
【特許文献１０】特開２００５−７３９２号公報
【発明の概要】
【０００６】
本発明者らは、今般、ある種の金属半導体粒子に超音波を照射することにより、高い安全性を確保しながら、超音波による癌の治療効果を著しく向上できるとの知見を得た。また、本発明者らは、上記金属半導体粒子を患者の体内に投与して癌細胞に到達させた上で超音波を患部に照射するといった、ドラッグデリバリーシステムの使用によって、癌の治療効果を更に向上できるとの知見も得た。
【０００７】
したがって、本発明は、高い安全性を確保しながら、超音波による癌の治療効果を著しく向上できる超音波癌治療促進剤の提供をその目的としている。
【０００８】
そして、本発明による、超音波癌治療促進剤は、金属半導体粒子を含んでなるものである。
【発明の具体的説明】
【０００９】
本発明による超音波癌治療促進剤は、金属半導体粒子を含んでなるものである。本発明において使用可能な金属半導体粒子は、超音波の照射により活性化して癌細胞を死滅ないし破壊することができる金属半導体を含んでなる粒子であれば限定されず、種々の金属半導体粒子であることができる。ある種の金属半導体粒子が超音波の照射により活性化して細胞を死滅ないし破壊する機構の全容は定かではないが、少なくとも超音波照射によりラジカル種を生成可能な金属半導体粒子であれば上記効果が期待できる。
【００１０】
すなわち、金属半導体粒子が与える生物的殺傷効果は、超音波照射によりラジカル種を生成させることにより得ることができる。すなわち、これらの半導体粒子が与える生物的殺傷効果はラジカル種の質的・量的な増加にあると考えられる。その理由は以下の通り推察されるが、以下の理由はあくまで仮説であって、本発明は何ら下記説明に限定されるものではない。すなわち、超音波照射のみでは系中には過酸化水素とヒドロキシルラジカルが発生するが、本発明者らの知見によれば、酸化チタンなどの半導体粒子の存在下では、過酸化水素及びヒドロキシルラジカルの生成が促進される。また、これら半導体粒子の存在下、特に酸化チタンの存在下では、スーパーオキサイドアニオンと一重項酸素の生成が促進されるように見受けられる。これらラジカル種の特異的生成は、ナノメートルオーダーの微粒子を用いた場合、超音波照射時に観察される現象である。このような効果が金属半導体微粒子存在下での超音波による特異的な現象であると考えられる。
【００１１】
本発明の好ましい態様によれば、金属半導体粒子として光感応特性を有する金属半導体粒子を用いるのが好ましく、より好ましくは、光触媒活性を有する金属半導体粒子、および量子効果により発光を示す量子ドットである。ここで、光触媒活性を有する金属半導体粒子とは光エネルギーを受けて電荷分離を起こす光金属半導体の粒子である。また、量子ドットとは、電子キャリアのエネルギー分布が離散的なため室温等の熱的励起が存在するような状態にあってもキャリアの遷移が量子準位間で不連続に生じ、結果として鋭い発光を示す特徴をもつ構造である。このような粒子によれば、超音波の照射により十分に活性化して細胞を死滅させることができる。これらの金属半導体粒子の具体例としては、ＴｉＯ２、ＺｎＯ、ＷＯ３、ＳｎＯ２、Ｆｅ２Ｏ３、Ｉｎ２Ｏ３、ＢａＴｉＯ３、ＴｉＯ３、ＳｒＴｉＯ３、Ｎｂ２Ｏ５、Ｔａ２Ｏ５等の金属酸化物；ＣｄＳ、ＭｏＳ２、ＺｎＳ等の金属硫化物；およびＳｉＣ、ＣｄＳｅ、ＩｎＧａＰ等の複合金属半導体が挙げられる。これらの金属半導体粒子は光感応特性を有するが、フラーレンや色素等の光増感剤ではないため、患者に投与後の治療段階において光過敏症の問題を生じることがなく、安全性が極めて高い。
【００１２】
本発明の好ましい態様によれば、金属半導体粒子として光触媒活性を有する金属半導体粒子を用いることができ、好ましい例として、ＴｉＯ２、ＺｎＯ、ＳｎＯ２、ＷＯ３、Ｉｎ２Ｏ３、ＳｒＴｉＯ３、Ｎｂ２Ｏ５、Ｔａ２Ｏ５が挙げられ、より好ましくはＴｉＯ２である。
【００１３】
本発明の好ましい態様によれば、金属半導体粒子として量子ドットを用いることができ、好ましい例として、ＣｄＳｅ、Ｃｄｓ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＩｎＧａＰ、ＺｎＴｅ、およびそれらの混合物が挙げられる。
【００１４】
本発明の好ましい態様によれば、金属半導体粒子は２０〜２００ｎｍの粒子径を有し、より好ましくは５０〜２００ｎｍであり、さらに好ましくは５０〜１５０ｎｍである。この粒径範囲であると、腫瘍への到達を目的として患者の体内に投与されると、ドラッグデリバリーシステムのように、ＥＰＲ効果により癌組織に効率的に到達して蓄積される。したがって、超音波の照射により高い効率で癌組織を死滅ないし破壊することができる。
【００１５】
本発明の別の好ましい態様によれば、金属半導体粒子が５０ｎｍ未満（例えば数ｎｍ）の粒子径を有する場合、金属半導体粒子同士を多官能リンカーで連結し、見かけ上のサイズを大きくしてＥＰＲ効果を得ることもできる。特に、この態様は、金属半導体粒子として量子ドットを使用する場合に有効である。すなわち、量子ドットは一般的に２ｎｍ〜１０ｎｍの粒径を有するが、５０〜１５０ｎｍの粒子径を有する二次粒子の形態を有するように複数個の量子ドットを凝集または結合されることで、ＥＰＲ効果により高い癌治療効果を実現することができる。本発明の更に別の好ましい態様によれば、ＥＰＲ効果を利用するため、リポソームのような薬剤封入体の中に、金属半導体粒子を包摂させることもできる。また、このようにして得られる複合粒子に更に抗体等の生体素子を付与すれば、ＥＰＲ効果以上の、腫瘍へのターゲッティングも可能である。
【００１６】
本発明に使用可能な金属半導体粒子は、単一種類の金属半導体粒子のみならず、複数種類の金属半導体粒子の混合物あるいは複合物も包含する。具体例としては、酸化チタンナノ粒子と酸化鉄ナノ粒子との複合物、酸化チタンナノ粒子と白金との複合物、およびシリカ被覆された酸化チタン等が挙げられる。
【００１７】
本発明の好ましい態様によれば、金属半導体粒子の表面に、ポリマーまたは生体由来高分子が結合されてなるのが好ましい。これにより、もともと固体中性であるような半導体を用いる場合においても、半導体粒子を主成分とする超音波癌治療用促進剤の分散化が達成され、生体環境において、安全な投与を可能とすることができる。ここで、金属半導体粒子表面に結合するポリマーとしては、親水性高分子であればよい。半導体粒子とポリマーおよび／または生体由来高分子との結合形態としては、血中滞留性を確保する観点から、体内への投与後24〜72時間後に分散性が確保されている程度の結合形態であれば特に限定されないが、生理条件での分散安定性に優れ、かつ超音波照射後もポリマーの遊離が無く正常細胞へのダメージが少ない点で、共有結合が望ましい。
【００１８】
本発明の好ましい態様によれば、金属半導体粒子表面に結合されるポリマーとして、カルボキシル基を有するポリマー、例えば、カルボキシメチルデンプン、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルセルロース、ポリカルボン酸類、およびカルボキシル基単位を有する共重合体（コポリマー）を用いるのが好ましく、より好ましくは、親水性高分子の加水分解性および溶解度の観点から、ポリアクリル酸、ポリマレイン酸等のポリカルボン酸類、およびアクリル酸／マレイン酸やアクリル酸／スルフォン酸系モノマーの共重合体（コポリマー）であり、さらに好ましくはポリアクリル酸である。カルボキシル基を有するポリマーが金属半導体粒子表面に結合すると、粒子が負に帯電するため、高度に分散するとともに、生体分子や薬剤を固定化させやすく、点滴等による全身投与にも適する。このため、ポリアクリル酸が表面に結合した金属半導体粒子は、臓器内部の癌の治療に適し、特定の細胞とのアフィニティが高い（生体）分子や薬剤を固定化した場合には、よりアフィニティの高い金属半導体粒子として患部へのターゲッティング療法へ用いることに特に適する。アニオン性ポリマーを固定した半導体粒子複合体の好ましいゼータ電位は、−５０〜−２０mVである。この範囲内であると、負電荷の反発により粒子の分散性を確保しやすくなり、凝集隗を形成しにくくなるため、投与後に血管の閉塞などの二次的弊害を招くおそれが無い。
【００１９】
本発明の好ましい態様によれば、金属半導体粒子表面に結合されるポリマーとして、カチオン性ポリマー、例えば、重量平均分子量が１０００〜１０００００の範囲にあるアミンを用いるのが好ましく、より好ましくは、ポリアミノ酸、ポリペプチド、ポリアミン類、およびアミン単位を有する共重合体（コポリマー）であり、さらに好ましくは、水溶性高分子の加水分解性および溶解度の観点から、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、ポリアリルアミン等のポリアミン類であり、最も好ましくはポリエチレンイミンである。カチオン性ポリマーが金属半導体粒子表面に結合すると、粒子が正に帯電するため、高度に分散するとともに、急速に細胞内に吸着し取り込まれやすく、注射あるいは塗布による局所投与に適する。このため、ポリエチレンイミンが表面に結合した金属半導体粒子は、皮膚癌や初期癌等の表層の癌の治療に特に適する。カチオン性ポリマーを固定した半導体粒子複合体の好ましいゼータ電位は、＋２０〜＋５０mVである。この範囲内であると、正電荷の反発により粒子の分散性を確保しやすくなり、局所投与に好適に用いることができる。
【００２０】
本発明の好ましい態様によれば、金属半導体粒子表面に結合されるポリマーとして、ノニオン性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド、デキストランあるいはそれらのコポリマーを用いるのが好ましく、より好ましくはポリエチレングリコールである。ノニオン性ポリマーが金属半導体粒子表面に結合すると、粒子は帯電することなく水和により分散するため、体内（血中）で長期間安定し、癌組織へ集積させやすく、全身投与にも適する。このため、ポリエチレングリコールで被覆した金属半導体粒子は、表層から深部に至るまでの広範囲の癌の治療に特に適する。ノニオン性の親水性基を有するポリマーを固定した半導体粒子複合体の好ましいゼータ電位は、−２０〜＋２０mVである。この範囲内であると、血中タンパク質が静電気的に吸着しにくくなるので、細網内皮系への取り込み、腎排泄、肝臓取り込み等を回避しやすくなり、目的部位（腫瘍）に到達できるに足る血中滞留性を確保することができる。
【００２１】
本発明の好ましい態様によれば、金属半導体粒子が、溶媒に分散されてなるのが好ましい。これにより、金属半導体粒子を、点滴、注射、塗布等の種々の方法により、患者の体内に効率的に投与することができる。なお、安全性の観点から、分散液は、中性の液性を有するのが好ましく、より好ましくは生理食塩水である。半導体粒子は分散体に対して、０．００１〜１質量％以下含有されることが好ましく、より好ましくは０．００１〜０．１質量％である。この範囲内であれば、投与後、２４〜７２時間後に患部（腫瘍）に効果的に粒子を蓄積させることが可能となる。すなわち、患部（腫瘍）に粒子濃度が蓄積しやすくなるとともに、血中での粒子の分散性も確保されて凝集隗が形成しにくくなるため、投与後に血管の閉塞などの二次的弊害を招くおそれも無い。
【００２２】
本発明の別の態様によれば、金属半導体粒子を含んでなり、超音波照射を受け、該照射により細胞毒となる、殺細胞剤が提供される。この殺細胞剤は、体内に投与され、超音波照射を受け、該照射により細胞毒となることで、細胞を破壊ないし死滅させることができるが、体内に限らず、試験管内においても殺対象である細胞を破壊ないし死滅させることができる。この態様において、殺対象は特に限定されないが、癌細胞であるのが好ましい。本態様において、細胞毒は、超音波照射により前記半導体粒子が発生するラジカル種により生じるものであるのが好ましい。
【００２３】
本発明の超音波癌治療促進剤は、点滴、注射、塗布等の種々の方法により、患者の体内に投与することができる。そして、体内に投与された超音波癌治療促進剤は、ドラッグデリバリーシステムのように、癌組織に到達して蓄積される。そして、超音波癌治療促進剤が蓄積された癌組織に超音波処理が行われる。本発明の好ましい態様によれば、使用する超音波の周波数は、細胞を殺傷する効果および安全性の観点から、２０ｋＨｚ〜２０ＭＨｚが好ましく、４００ｋＨｚ〜２０ＭＨｚがより好ましく、さらに好ましくは６００ｋＨｚ〜１０ＭＨｚ、最も好ましくは１ＭＨｚ〜１０ＭＨｚである。超音波の照射時間は治療対象である癌組織の位置および大きさを考慮して適宜決定されるべきであり、特に限定されない。こうして、患者の癌組織を超音波により高い効率で死滅ないし破壊して、高い癌治療効果を実現することができる。超音波は生体内の深部に外部より到達させることが可能で、本発明の促進剤と併せて用いることにより、非侵襲の状態で生体内深部に存在するような患部やターゲット部位の治療が実現できる。さらに、患部やターゲット部位に本発明の促進剤が集積することにより、周辺の正常細胞に悪影響を及ぼさない程度の微弱な超音波で本発明の促進剤を集積させた局所のみに作用させることができる。
【００２４】
本発明の好ましい態様によれば、金属半導体粒子としてより好ましくはＴｉＯ２であるが、該金属半導体粒子の光触媒活性を癌治療に利用する提案もなされている。この際、紫外線を用いた照射によって患部やターゲット部位の治療を行うことが可能であり、その照射到達深度は生体表層部より２ｍｍである。一方で、超音波を用いた照射によって生体内の診断等を行う際は、生体表層部より２ｍｍ以上の内部においても可能である。従って超音波を用いることで、より生体内の深部に外部より到達させることが可能で、本発明の促進剤と併せて用いることにより、非侵襲の状態で生体内深部に存在するような患部やターゲット部位の治療が実現できる。
【００２５】
本発明の好ましい態様によれば、好ましい適用部位として、切除術が困難な臓器が考えられ、具体的には膵臓癌、膀胱癌、肝臓癌、脳腫瘍があげられる。
【００２６】
超音波照射部については特に限定されるべきではないが、本発明の好ましい態様によれば、より効果を得るためには超音波照射部を内視鏡やカテーテル等の患部やターゲット部位に到達可能な器具に設置し、直接的に照射することができる。また、切除術が困難な臓器に対して、あるいは患者のQOLの観点から体外より非侵襲の状態で照射することができる。具体的には消化器の表層癌に対して、腹部より超音波照射を行い患部に超音波を到達させ、癌組織を殺傷できる。
【実施例】
【００２７】
例１：ポリアクリル酸結合型酸化チタン（ＴｉＯ２/ＰＡＡ）粒子の作製
チタンテトライソプロポキシド３．６ｇとイソプロパノール３．６ｇを混合し、氷冷下で６０ｍｌの超純水に滴下して加水分解を行った。滴下後に室温で３０分間攪拌した。攪拌後、１２Ｎ硝酸を１ｍｌ滴下して８０℃で８時間攪拌を行い、ペプチゼーションした。ペプチゼーション終了後、０．４５μｍのフィルターで濾過し、脱塩カラム（ＰＤ１０、アマシャム・ファルマシア・バイオサイエンス社）を用いて溶液交換して固形成分１％のアナターゼ型二酸化チタンゾルを調製した。この分散液を容量１００ｍｌのバイアル瓶に入れ、２００Ｈｚで３０分間超音波処理を行った。超音波処理を行う前と後での平均分散粒経は、それぞれ、３６．４ｎｍ、２０．２ｎｍであった。超音波処理後、溶液を濃縮して固形成分２０％の二酸化チタンゾル（アナターゼ型）を調製した。
【００２８】
得られた二酸化チタンゾル０．７５ｍｌを２０ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に分散させ、ポリアクリル酸（平均分子量：５０００、和光純薬）０．２ｇを溶解したＤＭＦを１０ｍｌ添加後、攪拌して混合した。水熱反応容器に溶液を移し変え、１５０℃で６時間水熱合成を行った。反応終了後、反応容器温度が５０℃以下になるまで冷却し、溶液を取り出した後に水８０ｍｌを添加して攪拌混合した。エバポレータでＤＭＦおよび水を除去した後に、再度、水２０ｍｌを添加してポリアクリル酸修飾二酸化チタン水溶液とした。２Ｎ塩酸１ｍｌを添加して二酸化チタン粒子を沈殿させて、遠心後に上清を除去することにより未反応のポリアクリル酸を分離した。再度水を添加して洗浄を行い、遠心後に水を除去した。５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を１０ｍｌ添加後、２００Ｈｚで３０分間超音波処理を行い、二酸化チタン粒子を分散させた。超音波処理後、０．４５μｍのフィルターで濾過し、固形成分１．５％のポリアクリル酸修飾二酸化チタンゾルを得た。作製したポリアクリル酸修飾二酸化チタン微粒子（アナターゼ型）の分散粒径をゼータサイザーナノＺＳ（シスメックス社製）を用いて測定したところ、キュムラント法解析から平均分散粒径は４５．５ｎｍであった。この測定は、ゼータ電位測定セルにポリエチレンイミン結合二酸化チタン微粒子を含む分散液０．7５ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて動的光散乱法により行った。
【００２９】
例２：ポリエチレンイミン結合型酸化チタン（ＴｉＯ２/ＰＥＩ）粒子の作製
チタンテトライソプロポキシド３．６ｇとイソプロパノール３．６ｇを混合し、氷冷下で６０ｍｌの超純水に滴下して加水分解を行った。滴下後に室温で３０分間攪拌した。攪拌後、１２Ｎ硝酸１ｍｌを滴下して８０℃で８時間攪拌を行い、ペプチゼーションした。ペプチゼーション終了後、０．４５μｍのフィルターで濾過し、さらに脱塩カラム（ＰＤ−１０、アマシャム・ファルマシア・バイオサイエンス社製）を用いて溶液交換して固形成分１％の酸性二酸化チタンゾルを調製した。この分散液を容量１００ｍｌのバイアル瓶に入れ、２００Ｈｚで３０分間超音波処理を行った。超音波処理を行う前後の平均分散粒経は、それぞれ、３６．４ｎｍ、２０．２ｎｍであった。超音波処理後、溶液を濃縮して固形成分２０％の二酸化チタンゾルを調製した。
【００３０】
得られた二酸化チタンゾル０．７５ｍｌを２０ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に分散させ、ポリエチレンイミン（平均分子量：１００００、和光純薬社製）４５０ｍｇを溶解したＤＭＦ１０ｍｌを添加後、攪拌して混合した。水熱反応容器（ＨＵ−５０、三愛科学社製）に溶液を移し変え、１５０℃で６時間合成を行った。反応終了後、反応容器温度が５０℃以下になるまで冷却し、２倍量のイソプロパノールを添加し、ポリエチレンイミン結合二酸化チタン微粒子を沈殿させ、遠心後に上清を除去することにより未反応のポリエチレンイミンを分離した。７０％エタノールを添加して洗浄を行い、遠心後にエタノールを除去した。蒸留水を１０ｍｌ添加後、２００Ｈｚで３０分間超音波処理を行い、ポリエチレンイミン結合二酸化チタン微粒子を分散させた。超音波処理後、０．４５μｍのフィルターで濾過して、固形成分１．５％のポリエチレンイミン結合二酸化チタン微粒子の分散液を得た。作製したポリエチレンイミン結合二酸化チタン微粒子の分散粒径を、ゼータサイザーナノＺＳ（シスメックス社製）を用いて測定したところ、ポリエチレンイミン結合二酸化チタン微粒子の平均粒径は６７．７ｎｍであった。この測定は、ゼータ電位測定セルにポリエチレンイミン結合二酸化チタン微粒子の分散液０．7５ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて動的光散乱法により行った。
【００３１】
例３：ポリエチレングリコール結合型酸化チタン（ＴｉＯ２/ＰＥＧ）粒子の作製
チタンテトライソプロポキシド３．６ｇとイソプロパノール３．６ｇを混合し、氷冷下で６０ｍｌの超純水に滴下して加水分解を行った。滴下後に室温で３０分間攪拌した。攪拌後、１２Ｎ硝酸１ｍｌを滴下して８０℃で８時間攪拌を行い、ペプチゼーションした。ペプチゼーション終了後、０．４５μｍのフィルターで濾過し、さらに脱塩カラム（ＰＤ−１０、アマシャム・バイオサイエンス社製）を用いて溶液交換して固形成分１％の酸性二酸化チタンゾルを調製した。この二酸化チタンゾルを１００ｍｌ容のバイアル瓶に入れ、超音波発生器ＭＩＤＳＯＮＩＣ２００（カイジョー社製）を用いて２００Ｈｚで３０分間超音波処理を行った。超音波処理を行った後の平均分散粒経は、１２Ｎの硝酸で１０００倍に希釈した後、ゼータサイザーナノＺＳ（シスメックス社製）を用いて、石英測定セルに分散液０．１ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて動的光散乱法により測定した。その結果、分散粒径は２０．２ｎｍであった。この二酸化チタンゾルを蒸発皿を用いて、５０℃下で溶液の濃縮を行い、最終的に固形成分２０％の酸性二酸化チタンゾルを調整した。
【００３２】
次に、ポリオキシエチレン−モノアリル−モノメチルエーテルと無水マレイン酸の共重合体（平均分子量；３３，６５９−日本油脂製）１ｇに水５ｍｌを添加して、加水分解後凍結乾燥を行った。反応終了後、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液５ｍｌに溶解させポリエチレングリコール溶液２００ｍｇ／ｍｌを調整した。得られたポリエチレングリコール溶液１．８７５ｍｌを、２７．７２５ｍｌのＤＭＦに溶液に加え、先に調整したアナタ−ゼ型二酸化チタンゾル０．９ｍｌを添加後、攪拌して混合した。水熱反応容器のＨＵ−５０（三愛科学社製）に溶液を移し変え、１５０℃で５時間水熱合成を行った。反応終了後、反応容器温度が５０ ℃以下になるまで冷却し、エバポレータでＤＭＦを除去した後に、蒸留水１０ｍｌを添加してポリエチレングリコール結合二酸化チタン水溶液とした。さらに、下記の条件でＨＰＬＣに付したところ、素通り画分にＵＶ吸収のピークが確認され、この画分を回収した。
ＨＰＬＣ：ＡＫＴＡ ｐｕｒｉｆｉｅｒ、アマシャム・バイオサイエンス社製
カラム：ＨｉＰｒｅｐ １６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００ＨＲ、アマシャム・バイオサイエンス社製
移動相：リン酸塩緩衝溶液（ｐＨ７．４）
流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎ
【００３３】
この分散液を蒸留水で０．０１％水溶液に希釈し、動的光散乱法による分散粒径およびゼータ電位の測定したところ、分散粒径は４５．４ｎｍ、ゼータ電位は１．１ｍＶであった。この測定は、ゼータサイザーナノＺＳを用いて、ゼータ電位測定セルにポリエチレングリコール結合二酸化チタン水溶液０．７５ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定することにより、２５℃にて行った。
【００３４】
例４：超音波照射による細胞殺傷試験
まず、以下の半導体粒子を用意した。
ＴｉＯ２／ＰＡＡ粒子（例１で作製されたもの）
ＳｎＯ２粒子（シーアイ化成製、ＳＮＷ１５ＷＴ％-Ｇ０２、中性分散体、分散粒径：３９ｎｍ）
ＺｎＯ粒子（シーアイ化成製、Ｚｎミズ１５ＷＴ％-Ｇ０１、中性分散体、分散粒径：６７ｎｍ）
ＣｄＳｅ粒子（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔ社製、Ｑｄｏｔ６５５プロテインＡ標識、中性分散体、分散粒径：８ｎｍ）
ここで、上述した各種粒子の分散粒径は、例１で示した動的光散乱法により得られたものである。
【００３５】
次に、上記半導体粒子を、ＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ６．８）に分散させ、この溶液を、１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌのＪｕｒｋａｔ細胞を含む、１０％血清入りＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に１／１０量添加して、終濃度０．０５％となるように試験溶液を調整した。
【００３６】
また、比較例として、以下の金属半導体ではない粒子を用意して、上記同様に試験溶液を調製した。
ＳｉＯ２粒子（シーアイ化成製、Ｓｉミズ１０ＷＴ％−Ｇ３６０、Ｌｏｔ＃０５０４２０−１、分散粒径：１０５ｎｍ）
Ａｕ粒子（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ製、ＰｒｏｔｅｉｎＡ ２０ｎｍ、Ｇｏｌｄ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、分散粒径：４０ｎｍ）
ここで、上述した各種粒子の分散粒径は、例１で示した動的光散乱法により得られたものである。
【００３７】
上記得られた各試験溶液に、超音波照射装置（オージー技研（株）製、ＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣ ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ ＥＳ−２：１ＭＨｚ）により、０．５Ｗ／ｃｍ２で５０％ｄｕｔｙ ｃｙｃｌｅ運転で１分間超音波を照射して、細胞の殺傷試験を行なった。その結果は、図１に示される通りであった。図１に示されるように、金属半導体粒子を添加した溶液はいずれも細胞の殺傷率が高かったことから、超音波照射により細胞を殺傷できることが確認された。一方、比較例として使用したＳｉＯ２粒子やＡｕ粒子にはこの細胞殺傷効果は確認されなかった。
【００３８】
例５：金属半導体粒子濃度の依存性
金属半導体粒子として、例１で作製されたＴｉＯ２粒子（ＴｉＯ２/ＰＡＡ）を用いて、超音波照射による細胞殺傷濃度依存性試験を行なった。酸化チタン粒子を終濃度で、０．００１％、０．０１％、０．０５％、および０．１％となるように、ＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ６．８）で調整し、１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌのＪｕｒｋａｔ細胞を含む、１０％血清入りＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に１／１０量添加して試験溶液を調整した。この試験溶液に、超音波照射装置（オージー技研（株）製、ＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣ ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ ＥＳ−２：１ＭＨｚ）により、０．５Ｗ／ｃｍ２で５０％ｄｕｔｙ ｃｙｃｌｅ運転で１分間超音波を照射して、細胞の殺傷試験を行ない、金属半導体粒子濃度の依存性を検討した。その結果は、図２に示される通りであった。酸化チタン粒子を添加した全ての溶液濃度において細胞の生存率が低下していることが確認された。特に、終濃度０．０５％溶液において細胞の生存率が低下していることから、細胞殺傷効果の高い終濃度は０．０５％であることが分かった。
【００３９】
例６：超音波照射によるスーパーオキサイドアニオン生成能の評価
まず、以下の金属半導体粒子を用意した。
ＴｉＯ２粒子（テイカ製、アナタース型酸化チタン、ＴＫＳ−２０３、分散粒径１２０ｎｍ）
ＳｎＯ２粒子（シーアイ化成製、ＳＮＷ１５ＷＴ％−Ｇ０２、Ｌｏｔ＃０５０５２６、分散粒径；３９ｎｍ）
ＺｎＯ粒子（シーアイ化成製、Ｚｎミズ１５ＷＴ％−Ｇ０１、Ｌｏｔ＃０５０５２３−０１、分散粒径：６７ｎｍ）
【００４０】
次に、上記金属半導体粒子を、固形分が終濃度で０．１％となるようにＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ６．８）に分散させ、スーパーオキサイドアニオンの発生試薬である還元系発色試薬ＷＳＴ−１（同仁化学製）を０．５％溶液となるように水溶液に添加して、試験溶液を調整した。
【００４１】
また、比較例として、金属半導体ではない粒子としてＳｉＯ２粒子（シーアイ化成製、Ｓｉミズ１０ＷＴ％−Ｇ３６０、Ｌｏｔ＃０５０４２０−１、分散粒径：１０５ｎｍ）を用意して、上記同様に試験溶液を調製した。
【００４２】
上記得られた各試験溶液に、超音波照射装置（オージー技研（株）製、ＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣ ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ ＥＳ−２：１ＭＨｚ）により、０．５Ｗ／ｃｍ２で５０％ｄｕｔｙ ｃｙｃｌｅ運転で５分間超音波を照射して、４５０ｎｍにおける波長の吸収を紫外−可視光分光光度計により測定した。その結果は、図３に示される通りであった。図３に示されるように、金属半導体粒子である全ての粒子においてＷＳＴ−１の分解に伴い黄色ホルマザンを生成することにより吸光度の上昇が認められた。すなわち、ＴｉＯ２粒子、ＳｎＯ２粒子、およびＺｎＯ粒子は超音波照射によりスーパーオキサイドアニオンを生成することが確認された。
【００４３】
例７：超音波照射によるヒドロキシラジカル生成能の評価
まず、以下の金属半導体粒子を用意した。
ＴｉＯ２粒子（テイカ製、アナタース型酸化チタン、ＴＫＳ−２０３、分散粒径：１２０ｎｍ）
ＳｎＯ２粒子（シーアイ化成製、ＳＮＷ１５ＷＴ％−Ｇ０２、Ｌｏｔ＃０５０５２６、分散粒径：３９ｎｍ）
ＺｎＯ粒子（シーアイ化成製、Ｚｎミズ１５ＷＴ％−Ｇ０１、Ｌｏｔ＃０５０５２３−０１、分散粒径：６７ｎｍ）、
【００４４】
次に、上記金属半導体粒子を、固形分が終濃度で０．１％となるようにＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ６．８）で調整し、ヒドロキシラジカルの生成試薬として活性酸素検出用蛍光試薬ヒドロキシフェニルフルオレセイン（ＨＰＦ、第一化学薬品製）を５μＭとなるように先の金属酸化物粒子を含む溶液に添加して、試験溶液を調整した。
【００４５】
また、比較例として、ＳｉＯ２粒子（シーアイ化成製、Ｓｉミズ１０ＷＴ％−Ｇ３６０、Ｌｏｔ＃０５０４２０−１、分散粒径：１０５ｎｍ）を用意して、上記同様に試験溶液を調製した。
【００４６】
上記得られた各試験溶液に、超音波照射装置（オージー技研（株）製、ＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣ ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ ＥＳ−２：１ＭＨｚ）により、０．５Ｗ／ｃｍ２で５０％ｄｕｔｙ ｃｙｃｌｅ運転で５分間超音波を照射して、Ｅｘ＝４９０ｎｍ、Ｅｍ＝５１５ｎｍにおける波長を蛍光蛍光光度計により測定した。その結果は、図４に示される通りであった。図４に示されるように、金属半導体粒子である全ての粒子において、ＨＰＦが反応しフルオレセインを生成し蛍光強度の上昇が認められた。すなわち、ＴｉＯ２粒子、ＳｎＯ２粒子、ＺｎＯ粒子は超音波照射によってヒドロキシラジカルを生成することが確認された。
【００４７】
例８：超音波照射による過酸化水素生成能の評価
まず、以下の金属半導体粒子を用意した。
ＴｉＯ２粒子（テイカ製、アナタース型酸化チタン、ＴＫＳ−２０３、分散粒径：１２０ｎｍ）
ＳｎＯ２粒子（シーアイ化成製、ＳＮＷ１５ＷＴ％−Ｇ０２、Ｌｏｔ＃０５０５２６、分散粒径：３９ｎｍ）
ＺｎＯ粒子（シーアイ化成製、Ｚｎミズ１５ＷＴ％−Ｇ０１、Ｌｏｔ＃０５０５２３−０１、分散粒径：６７ｎｍ）
【００４８】
次に、上記金属半導体粒子を、固形分が終濃度で０．１％となるようにＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ６．８）で調整し、過酸化水素測定用試薬ＴＰＭ−ＰＳ（同仁化学製）を１０μＭとなるように水溶液に添加して、試験溶液を調整した。
【００４９】
また、比較例として、ＳｉＯ２粒子（シーアイ化成製、Ｓｉミズ１０ＷＴ％−Ｇ３６０、Ｌｏｔ＃０５０４２０−１、分散粒径１０５ｎｍ）を用意して、上記同様に試験溶液を調製した。
【００５０】
上記得られた各試験溶液に、超音波照射装置（オージー技研（株）製、ＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣ ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ ＥＳ-２：１ＭＨｚ）により、０．５Ｗ／ｃｍ２で５０％ ｄｕｔｙ ｃｙｃｌｅ運転で５分間超音波を照射して、１００μｌを採取し、Amplex Red Hydrogen Peroxide/Peroxidase Assay Kit （Molecular Probes 社）のマニュアルに従い、同キットで測定を行った。その結果は、図５に示される通りであった。図５に示されるように、ＴｉＯ２粒子は超音波照射により過酸化水素をより効率的に生成することが確認された。
【００５１】
例９：超音波照射による一重項酸素生成能の評価
まず、以下の半導体粒子を用意した。
ＴｉＯ２粒子(A)（石原産業製、アナターゼ型酸化チタン、ＳＴＳ-２４０、中性分散体、分散粒径：５２ｎｍ）
ＳｎＯ２粒子（シーアイ化成製、ＳＮＷ１５ＷＴ％-Ｇ０２、中性分散体、分散粒径：３９ｎｍ）
ＺｎＯ粒子（シーアイ化成製、Ｚｎミズ１５ＷＴ％-Ｇ０１、中性分散体、分散粒径：６７ｎｍ）
ＴｉＯ２／ＰＡＡ（例１により作成したもの）
ＴｉＯ２／ＰＥＧ（例３により作成したもの）
【００５２】
次に、上記半導体粒子を、固形分が終濃度で０．０５％となるようにＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ６．８）で調整し試験溶液を調整した。
【００５３】
また、比較例として、ＳｉＯ２粒子（シーアイ化成製、Ｓｉミズ１０ＷＴ％-Ｇ３６０、中性分散体、分散粒径１０５ｎｍ）を用意して、上記同様に試験溶液を調製した。
【００５４】
上記得られた各試験溶液に、超音波照射装置（オージー技研（株）製、ＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣ ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ ＥＳ-２：１ＭＨｚ）により、０．５Ｗ／ｃｍ２で５０％ ｄｕｔｙ ｃｙｃｌｅ運転で５分間超音波を照射して、１００μｌを採取し、Singlet Oxygen Sensor Green Reagent（Molecular Probes社）のマニュアルに従い、同社のキットで、一重項酸素に起因する、Ｅｘ＝４８８ｎｍ、Ｅｍ＝５２５ｎｍにおける蛍光強度を蛍光光度計により測定した。その結果は、図６に示される通りであった。図６に示されるように、ＴｉＯ２粒子は超音波照射により一重項酸素をより効率的に生成することが確認された。
【００５５】
例１０：周波数への依存性
２ｍｌのマイクロチューブ中で、PBS緩衝液：８５０μｌ、還元系発色試薬ＷＳＴ-１（同仁化学製）：５０μｌ、０．１％酸化チタン粒子：１００μｌの組成の溶液を調製した。酸化チタン粒子としては、ＴｉＯ２粒子(A)（石原産業製、アナターゼ型酸化チタン、ＳＴＳ-２４０、中性分散体、分散粒径：５２ｎｍ）を用いた。
【００５６】
得られたマイクロチューブを、水浴中、超音波振動子から３ｃｍの距離で、多周波数超音波発生装置（MODEL４０２１｛KAIJYO｝、出力：２００W）により超音波を同強度になるように照射した。照射後０、３、６分毎に２００μｌずつサンプリングを行い 例６と同様の測定方法でスーパーオキサイドアニオンを測定した。測定は、２８、５０、１００、２００、および６００ｋＨｚの各照射周波数について行った。また、コントロールとして、酸化チタン粒子を添加しない場合についても上記同様の測定を行った。それらの結果は、図７に示される通りであった。図７に示されるように、スーパーオキサイドアニオンはチタンが存在することによって生産され、さらにその効果は、照射周波数が最も高い６００ｋＨｚの場合において、顕著であった。
【００５７】
例１１：粒子の安定性
水、ＰＢＳ緩衝液（pH 7.4）、および１０％血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地のそれぞれに以下の粒子を最終濃度 が０．０１％ になるように分散して、サンプルを得た。
【００５８】
酸化チタン（C）（Ｐ２５粒子；日本エアロジル製をＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ６．８）で分散させたもの、分散粒径：５００ｎｍ）
例１により作成したＴｉＯ２／ＰＡＡ粒子
例３により作成したＴｉＯ２／ＰＥＧ粒子
酸化チタン（A）（ＳＴＳ２４０、石原産業製、中性分散体、分散粒径：５２ｎｍ）
酸化チタン（B）（TKS-203、テイカ製、アナターゼ型酸化チタン、中性分散体、分散粒径：１２０ｎｍ）
ＳｎＯ２粒子（シーアイ化成製、ＳＮＷ１５ＷＴ％-Ｇ０２、中性分散体、分散粒径：３９ｎｍ）
ＺｎＯ粒子（シーアイ化成製、Ｚｎミズ１５ＷＴ％-Ｇ０１、中性分散体、分散粒径：６７ｎｍ）
【００５９】
各粒子の安定性の指標として、各分散液における平均分散粒子径の変化を測定した。この測定は、石英測定セルに分散液０．１ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、ゼータサイザーナノＺＳ（シスメックス社製）を用いて、1時間後と24時間後に２５℃にて動的光散乱法により行った。
各分散液について測定された平均分散粒子径を表１に示す。表１に示されるように、中性分散体として市販されている酸化チタン(A)や酸化チタン(B)と比較して、本例で作成した ＴｉＯ２／ＰＡＡおよびＴｉＯ２／ＰＥＧは平均分散粒子径の変化が少なく、それ故優れた安定性を有することが分かる。
【表１】
【００６０】
例１２：超音波照射による細胞殺傷試験
まず、ＴｉＯ２／ＰＡＡ粒子（例１で作製されたもの 中性分散体、分散粒径：４５．５ｎｍ）をＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ６．８）に分散させ、この溶液を、１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌのＪｕｒｋａｔ細胞を含む、１０％血清入りＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に１／１０量添加して、ＴｉＯ２／ＰＡＡ粒子の終濃度０．０１％および０．００１％となるように試験溶液を調整した。
【００６１】
また、比較例として、ＴｉＯ２粒子（Ｃ）（Ｐ２５粒子；日本エアロジル製をＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ６．８）で分散させたもの、分散粒径：５００ｎｍ）を用意して、上記同様に試験溶液を調製した。ここで、上述した各種粒子の分散粒径は、例１で示した動的光散乱法により得られたものである。
【００６２】
上記得られた各試験溶液に、超音波照射装置（オージー技研（株）製、ＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣ ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ ＥＳ-２：１ＭＨｚ）により、０．５Ｗ／ｃｍ２で５０％ｄｕｔｙ ｃｙｃｌｅ運転で１分間超音波を照射して、細胞の殺傷試験を行なった。その結果は、図８に示される通りであった。図８に示されるように、分散粒径４５．５ｎｍのＴｉＯ２／ＰＡＡ粒子を添加した溶液はいずれも腫瘍細胞殺傷効果が高いことが確認された。一方、比較例として使用した分散粒径５００ｎｍのＴｉＯ２粒子（Ｃ）においてはこの細胞殺傷効果は確認されなかった。
【００６３】
例１３：超音波照射によるヒドロキシラジカル生成能の評価
まず、以下の半導体粒子を用意した。
ＴｉＯ２粒子（Ａ）（石原産業製、アナターゼ型酸化チタン、ＳＴＳ-２４０、中性分散体、分散粒径：５２ｎｍ）
ＴｉＯ２粒子（Ｄ）（石原産業製、アナターゼ型酸化チタン、ＳＴＳ-２３０、中性分散体、分散粒径：１５ｎｍ）
ＴｉＯ２粒子（Ｃ）（Ｐ２５粒子；日本エアロジル製をＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ６．８）で分散させたもの、分散粒径：５００ｎｍ）
【００６４】
次に、上記半導体粒子を、固形分が終濃度で０．０５％となるようにＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ６．８）で調整し、ヒドロキシラジカルの生成試薬として活性酸素検出用蛍光試薬ヒドロキシフェニルフルオレセイン（ＨＰＦ、第一化学薬品製）を５μＭとなるように先の金属酸化物粒子を含む溶液に添加して、試験溶液を調整した。
【００６５】
また、コントロールとしてＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ６．８）を用意して、上記同様に試験溶液を調製した。
【００６６】
上記得られた各試験溶液に、超音波照射装置（オージー技研（株）製、ＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣ ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ ＥＳ-２：１ＭＨｚ）により、０．５Ｗ／ｃｍ２で５０％ ｄｕｔｙ ｃｙｃｌｅ運転で５分間超音波を照射して、ヒドロキシラジカルに起因する、Ｅｘ＝４９０ｎｍ、Ｅｍ＝５１５ｎｍにおける蛍光強度を蛍光光度計により測定した。その結果は、図９に示される通りであった。図９に示されるように、分散粒径５２ｎｍのＴｉＯ２粒子（A）および分散粒径の１５ｎｍのＴｉＯ２粒子（Ｄ）においてコントロールよりも顕著なヒドロキシラジカル生成が確認された。しかしながら、分散粒径５００ｎｍのＴｉＯ２粒子（Ｃ）においてはヒドロキシラジカル生成が確認されなかった。
【００６７】
例１４：粒子の安全性
まず、ＴｉＯ２／ＰＡＡ粒子（例１で作製されたもの 中性分散体、分散粒径：４５．５ｎｍ）、ＴｉＯ２／ＰＥＩ粒子（例２で作製されたもの 中性分散体、分散粒径：６７．７ｎｍ）、およびＴｉＯ２／ＰＥＧ粒子（例３で作製されたもの 中性分散体、分散粒径：４５．４ｎｍ）をＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ６．８）に分散させて、各種分散液を得た。これらの分散液を、１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌのＪｕｒｋａｔ細胞を含む、１０％血清入りＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に１／１０量添加して、ＴｉＯ２系複合体粒子の終濃度が０．１、０．０１、および０．００１質量％となるように試料液を調整した。また、対照実験として、ＰＢＳ緩衝液のみを同様に添加して対照試料液を調整した。調整後、ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で２４時間培養し、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｒｏ Ｋｉｔ（バイオラッド社製）により生細胞数を測定した。対照試料液の生存率を１００％として各試験液を比較した結果を図１０に示す。図１０に示される通り、０．１〜０．００１質量％の全試料液において、高い細胞生存率、すなわち高い安全性を示した。
【００６８】
例１５：ポリマーが結合されたＴｉＯ２粒子を用いた超音波照射による細胞殺傷試験
ＴｉＯ２／ＰＡＡ粒子（例１で作製されたもの）、ＴｉＯ２／ＰＥＩ粒子（例２で作製されたもの）およびＴｉＯ２／ＰＥＧ粒子（例３で作製されたもの）を、ＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ６．８）に分散させ、この溶液を、１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌのＪｕｒｋａｔ細胞を含む、１０％血清入りＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に１／１０量添加して、終濃度０．０５％となるように試験溶液を調整した。
【００６９】
上記得られた各試験溶液に、超音波照射装置（オージー技研（株）製、ＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣ ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ ＥＳ-２：１ＭＨｚ）により、０．５Ｗ／ｃｍ２で５０％ｄｕｔｙ ｃｙｃｌｅ運転で１分間超音波を照射して、細胞の殺傷試験を行なった。その結果は、図１１に示される通りであった。図１１に示されるように、ＴｉＯ２／ＰＡＡ粒子、ＴｉＯ２／ＰＥＩ粒子およびＴｉＯ２／ＰＥＧ粒子のいずれの粒子を添加した溶液も細胞生存率が低い、すなわち殺傷率が高かった。特に、ＴｉＯ２／ＰＥＧ粒子を添加した溶液は細胞生存率が極めて低かったことから、このＴｉＯ２／ＰＥＧ粒子は超音波照射により細胞を殺傷できる効果が特に高いことが確認された。
【００７０】
例１６：超音波照射による細胞殺傷試験２
まず、ＴｉＯ２／ＰＡＡ粒子（例１で作製されたもの 中性分散体、分散粒径：４５．５ｎｍ）をＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ６．８）に分散させ、この溶液を、５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌのＪｕｒｋａｔ細胞を含む、１０％血清入りＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に１／１０量添加して、ＴｉＯ２／ＰＡＡ粒子の終濃度０．０５％となるように試験溶液を３ｍｌ調整した。
【００７１】
また、コントロールとしてＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ６．８）を用意して、上記同様に試験溶液を調製した。
【００７２】
上記得られた各試験溶液に、超音波照射装置（松下電工（株）製、ＥＨ２４３５：５ＭＨｚ）により、最大出力で２分間超音波を連続照射して、細胞の殺傷試験を行なった。その結果は、図１１に示される通りであった。ＰＢＳ緩衝溶液を添加し、超音波照射を行わなかった生細胞の数を１００％として生存率で示した。図１１に示されるように、分散粒径４５．５ｎｍのＴｉＯ２／ＰＡＡ粒子を添加した溶液は腫瘍細胞殺傷効果が高いことが確認された。
【００７３】
例１７：抗腫瘍効果試験
ヌードマウス Balb/c、雄、3週齢）にヒト膀胱癌由来株化細胞（Ｔ−２４）を皮下接種し、腫瘍を形成させ、約０．６３ｍｍ３程度の腫瘍を形成させた。実施例１で作成したＰＡＡ―ＴｉＯ２をＰＢＳ緩衝液にて０．５ ％に希釈し、腫瘍に１００μｌ局所注射した。投与より２４時間後に、時間１分 出力１Ｗ パルス５０％で１ＭＨｚの超音波を超音波照射装置（オージー技研（株）製、ＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣ ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ ＥＳ-２：１ＭＨｚ； プローブ径 １０ｍｍ）を用いて照射した。照射は、水溶性高分子ゲルを皮膚に塗布し、その上にプローブ（超音波照射部）を密着させた後に行った。マウス数は１群あたり６匹とし、ＰＢＳのみ投与又は無処置動物を対照群とした。超音波照射後、各個体の腫瘍体積を測定し、各個体の超音波照射施工日（０日）におけるＰＡＡ−ＴｉＯ２投与前のｓ腫瘍体積を１とした時の各測定時点の腫瘍体積（相対腫瘍増殖率）を求めた。
【００７４】
結果を図１３に示す。
図１３に示されるとおり、酸化チタン＋超音波照射の存在時のみ、腫瘍の大幅な増殖抑制効果が確認された。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】例４において各種粒子について測定された、超音波を１分間照射した際の細胞の殺傷率を示す図である。
【図２】例５において各種濃度のＴｉＯ２粒子（ＴｉＯ２／ＰＡＡ）含有試験溶液について測定された、細胞の生存率を示す図である。
【図３】例６において各種粒子について測定された、超音波の照射によるスーパーオキサイドアニオンの発生に起因する、還元系発色試薬を介した吸光度の上昇を示す図である。
【図４】例７において各種粒子について測定された、超音波の照射によるヒドロキシラジカルの発生に起因する、活性酸素検出用蛍光試薬を介した蛍光の強度を示す図である。
【図５】例８において各種粒子について測定された、超音波の照射による過酸化水素の発生に起因する、ＴＰＭ-ＰＳの酸化を介した吸光度の上昇を示す図である。
【図６】例９において各種粒子について測定された、超音波照射による一重項酸素の発生に起因する、一重項酸素検出用蛍光試薬を介した蛍光強度を示す図である。
【図７】例１０においてＴｉＯ２（A）について測定された、超音波の照射によるスーパーオキサイドアニオンの発生に起因する、還元系発色試薬を介した吸光度の上昇を示す図である。
【図８】例１２において各種粒子について測定された、超音波を１分間照射した際の細胞の生存率を示す図である。
【図９】例１３において各種粒子について測定された、超音波の照射によるヒドロキシラジカルの発生に起因する、活性酸素検出用蛍光試薬を介した蛍光強度を示す図である。
【図１０】例１４において各種濃度のＴｉＯ２粒子含有試験溶液について測定された、細胞の生存率を示す図である。
【図１１】例１５において各種粒子について測定された、超音波を１分間照射した際の細胞の殺傷率を示す図である。
【図１２】例１６においてＴｉＯ２／ＰＡＡ粒子およびＰＢＳ緩衝溶液について測定された、超音波を２分間照射した際（超音波あり）、および照射なし（超音波なし）の細胞の生存率を示す図である。
【図１３】例１７において測定された、マウスの相対腫瘍増殖率の経時変化を示す図である。
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、患部に超音波を照射することにより行われる超音波癌治療を促進するための、超音波癌治療促進剤に関するものである。
【０００２】
背景技術
近年、癌治療において、治療効果と患者のＱＯＬ（生活の質）の両方の向上を図るために、非侵襲で効率的に患部を治療することができる音響化学療法が提案されている。これは、超音波の照射により、投与した薬剤（超音波併用剤）の抗腫瘍活性化を行い、腫瘍の治療を行なうというものである。超音波治療用併用剤として、フラーレンを用いる方法が知られている（例えば、特許文献１（特開２００２−２４１３０７号公報）および特許文献２（国際公開第２００２／６６０６１号パンフレット）参照）。また、超音波治療用併用剤として、色素を用いる方法も知られている（特許文献３（特開２００１−２５３８３６号公報）、特許文献４（国際公開第９８／１１３１号パンフレット）、および特許文献５（特開２００３−２２６６５４号公報）を参照）。このような方法にあっては、光によりラジカル種を発生する有機物またはフラーレンを超音波の効果により励起させることによって、治療が行われる。
【０００３】
一方、酸化チタンの光触媒活性を癌治療に利用する提案もなされている。例えば、酸化チタンの医療用具としての利用や（特許文献６（特開平４−３５７９４１号公報）参照）、ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）の担体としての利用が提案されている（特許文献７（特開２００１−２０００５０号公報）および特許文献８（米国特許第６６７７６０６号明細書）参照）。
【０００４】
更に、酸化チタンに超音波照射を行い、ヒドロキシラジカルを発生させることにより有機物を分解させる技術も提案されている（例えば、特許文献９（特開２００３−２６４０６号公報）および特許文献１０（特開２００５−７３９２号公報）参照）。
【０００５】
【特許文献１】特開２００２−２４１３０７号公報
【特許文献２】国際公開第２００２／６６０６１号パンフレット
【特許文献３】特開２００１−２５３８３６号公報
【特許文献４】国際公開第９８／１１３１号パンフレット
【特許文献５】特開２００３−２２６６５４号公報
【特許文献６】特開平４−３５７９４１号公報
【特許文献７】特開２００１−２０００５０号公報
【特許文献８】米国特許第６６７７６０６号明細書
【特許文献９】特開２００３−２６４０６号公報
【特許文献１０】特開２００５−７３９２号公報
【発明の概要】
【０００６】
本発明者らは、今般、ある種の金属半導体粒子に超音波を照射することにより、高い安全性を確保しながら、超音波による癌の治療効果を著しく向上できるとの知見を得た。また、本発明者らは、上記金属半導体粒子を患者の体内に投与して癌細胞に到達させた上で超音波を患部に照射するといった、ドラッグデリバリーシステムの使用によって、癌の治療効果を更に向上できるとの知見も得た。
【０００７】
したがって、本発明は、高い安全性を確保しながら、超音波による癌の治療効果を著しく向上できる超音波癌治療促進剤の提供をその目的としている。
【０００８】
そして、本発明による、超音波癌治療促進剤は、金属半導体粒子を含んでなるものである。
【発明の具体的説明】
【０００９】
本発明による超音波癌治療促進剤は、金属半導体粒子を含んでなるものである。本発明において使用可能な金属半導体粒子は、超音波の照射により活性化して癌細胞を死滅ないし破壊することができる金属半導体を含んでなる粒子であれば限定されず、種々の金属半導体粒子であることができる。ある種の金属半導体粒子が超音波の照射により活性化して細胞を死滅ないし破壊する機構の全容は定かではないが、少なくとも超音波照射によりラジカル種を生成可能な金属半導体粒子であれば上記効果が期待できる。
【００１０】
すなわち、金属半導体粒子が与える生物的殺傷効果は、超音波照射によりラジカル種を生成させることにより得ることができる。すなわち、これらの半導体粒子が与える生物的殺傷効果はラジカル種の質的・量的な増加にあると考えられる。その理由は以下の通り推察されるが、以下の理由はあくまで仮説であって、本発明は何ら下記説明に限定されるものではない。すなわち、超音波照射のみでは系中には過酸化水素とヒドロキシルラジカルが発生するが、本発明者らの知見によれば、酸化チタンなどの半導体粒子の存在下では、過酸化水素及びヒドロキシルラジカルの生成が促進される。また、これら半導体粒子の存在下、特に酸化チタンの存在下では、スーパーオキサイドアニオンと一重項酸素の生成が促進されるように見受けられる。これらラジカル種の特異的生成は、ナノメートルオーダーの微粒子を用いた場合、超音波照射時に観察される現象である。このような効果が金属半導体微粒子存在下での超音波による特異的な現象であると考えられる。
【００１１】
本発明の好ましい態様によれば、金属半導体粒子として光感応特性を有する金属半導体粒子を用いるのが好ましく、より好ましくは、光触媒活性を有する金属半導体粒子、および量子効果により発光を示す量子ドットである。ここで、光触媒活性を有する金属半導体粒子とは光エネルギーを受けて電荷分離を起こす光金属半導体の粒子である。また、量子ドットとは、電子キャリアのエネルギー分布が離散的なため室温等の熱的励起が存在するような状態にあってもキャリアの遷移が量子準位間で不連続に生じ、結果として鋭い発光を示す特徴をもつ構造である。このような粒子によれば、超音波の照射により十分に活性化して細胞を死滅させることができる。これらの金属半導体粒子の具体例としては、ＴｉＯ２、ＺｎＯ、ＷＯ３、ＳｎＯ２、Ｆｅ２Ｏ３、Ｉｎ２Ｏ３、ＢａＴｉＯ３、ＴｉＯ３、ＳｒＴｉＯ３、Ｎｂ２Ｏ５、Ｔａ２Ｏ５等の金属酸化物；ＣｄＳ、ＭｏＳ２、ＺｎＳ等の金属硫化物；およびＳｉＣ、ＣｄＳｅ、ＩｎＧａＰ等の複合金属半導体が挙げられる。これらの金属半導体粒子は光感応特性を有するが、フラーレンや色素等の光増感剤ではないため、患者に投与後の治療段階において光過敏症の問題を生じることがなく、安全性が極めて高い。
【００１２】
本発明の好ましい態様によれば、金属半導体粒子として光触媒活性を有する金属半導体粒子を用いることができ、好ましい例として、ＴｉＯ２、ＺｎＯ、ＳｎＯ２、ＷＯ３、Ｉｎ２Ｏ３、ＳｒＴｉＯ３、Ｎｂ２Ｏ５、Ｔａ２Ｏ５が挙げられ、より好ましくはＴｉＯ２である。
【００１３】
本発明の好ましい態様によれば、金属半導体粒子として量子ドットを用いることができ、好ましい例として、ＣｄＳｅ、Ｃｄｓ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＩｎＧａＰ、ＺｎＴｅ、およびそれらの混合物が挙げられる。
【００１４】
本発明の好ましい態様によれば、金属半導体粒子は２０〜２００ｎｍの粒子径を有し、より好ましくは５０〜２００ｎｍであり、さらに好ましくは５０〜１５０ｎｍである。この粒径範囲であると、腫瘍への到達を目的として患者の体内に投与されると、ドラッグデリバリーシステムのように、ＥＰＲ効果により癌組織に効率的に到達して蓄積される。したがって、超音波の照射により高い効率で癌組織を死滅ないし破壊することができる。
【００１５】
本発明の別の好ましい態様によれば、金属半導体粒子が５０ｎｍ未満（例えば数ｎｍ）の粒子径を有する場合、金属半導体粒子同士を多官能リンカーで連結し、見かけ上のサイズを大きくしてＥＰＲ効果を得ることもできる。特に、この態様は、金属半導体粒子として量子ドットを使用する場合に有効である。すなわち、量子ドットは一般的に２ｎｍ〜１０ｎｍの粒径を有するが、５０〜１５０ｎｍの粒子径を有する二次粒子の形態を有するように複数個の量子ドットを凝集または結合されることで、ＥＰＲ効果により高い癌治療効果を実現することができる。本発明の更に別の好ましい態様によれば、ＥＰＲ効果を利用するため、リポソームのような薬剤封入体の中に、金属半導体粒子を包摂させることもできる。また、このようにして得られる複合粒子に更に抗体等の生体素子を付与すれば、ＥＰＲ効果以上の、腫瘍へのターゲッティングも可能である。
【００１６】
本発明に使用可能な金属半導体粒子は、単一種類の金属半導体粒子のみならず、複数種類の金属半導体粒子の混合物あるいは複合物も包含する。具体例としては、酸化チタンナノ粒子と酸化鉄ナノ粒子との複合物、酸化チタンナノ粒子と白金との複合物、およびシリカ被覆された酸化チタン等が挙げられる。
【００１７】
本発明の好ましい態様によれば、金属半導体粒子の表面に、ポリマーまたは生体由来高分子が結合されてなるのが好ましい。これにより、もともと固体中性であるような半導体を用いる場合においても、半導体粒子を主成分とする超音波癌治療用促進剤の分散化が達成され、生体環境において、安全な投与を可能とすることができる。ここで、金属半導体粒子表面に結合するポリマーとしては、親水性高分子であればよい。半導体粒子とポリマーおよび／または生体由来高分子との結合形態としては、血中滞留性を確保する観点から、体内への投与後24〜72時間後に分散性が確保されている程度の結合形態であれば特に限定されないが、生理条件での分散安定性に優れ、かつ超音波照射後もポリマーの遊離が無く正常細胞へのダメージが少ない点で、共有結合が望ましい。
【００１８】
本発明の好ましい態様によれば、金属半導体粒子表面に結合されるポリマーとして、カルボキシル基を有するポリマー、例えば、カルボキシメチルデンプン、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルセルロース、ポリカルボン酸類、およびカルボキシル基単位を有する共重合体（コポリマー）を用いるのが好ましく、より好ましくは、親水性高分子の加水分解性および溶解度の観点から、ポリアクリル酸、ポリマレイン酸等のポリカルボン酸類、およびアクリル酸／マレイン酸やアクリル酸／スルフォン酸系モノマーの共重合体（コポリマー）であり、さらに好ましくはポリアクリル酸である。カルボキシル基を有するポリマーが金属半導体粒子表面に結合すると、粒子が負に帯電するため、高度に分散するとともに、生体分子や薬剤を固定化させやすく、点滴等による全身投与にも適する。このため、ポリアクリル酸が表面に結合した金属半導体粒子は、臓器内部の癌の治療に適し、特定の細胞とのアフィニティが高い（生体）分子や薬剤を固定化した場合には、よりアフィニティの高い金属半導体粒子として患部へのターゲッティング療法へ用いることに特に適する。アニオン性ポリマーを固定した半導体粒子複合体の好ましいゼータ電位は、−５０〜−２０mVである。この範囲内であると、負電荷の反発により粒子の分散性を確保しやすくなり、凝集隗を形成しにくくなるため、投与後に血管の閉塞などの二次的弊害を招くおそれが無い。
【００１９】
本発明の好ましい態様によれば、金属半導体粒子表面に結合されるポリマーとして、カチオン性ポリマー、例えば、重量平均分子量が１０００〜１０００００の範囲にあるアミンを用いるのが好ましく、より好ましくは、ポリアミノ酸、ポリペプチド、ポリアミン類、およびアミン単位を有する共重合体（コポリマー）であり、さらに好ましくは、水溶性高分子の加水分解性および溶解度の観点から、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、ポリアリルアミン等のポリアミン類であり、最も好ましくはポリエチレンイミンである。カチオン性ポリマーが金属半導体粒子表面に結合すると、粒子が正に帯電するため、高度に分散するとともに、急速に細胞内に吸着し取り込まれやすく、注射あるいは塗布による局所投与に適する。このため、ポリエチレンイミンが表面に結合した金属半導体粒子は、皮膚癌や初期癌等の表層の癌の治療に特に適する。カチオン性ポリマーを固定した半導体粒子複合体の好ましいゼータ電位は、＋２０〜＋５０mVである。この範囲内であると、正電荷の反発により粒子の分散性を確保しやすくなり、局所投与に好適に用いることができる。
【００２０】
本発明の好ましい態様によれば、金属半導体粒子表面に結合されるポリマーとして、ノニオン性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド、デキストランあるいはそれらのコポリマーを用いるのが好ましく、より好ましくはポリエチレングリコールである。ノニオン性ポリマーが金属半導体粒子表面に結合すると、粒子は帯電することなく水和により分散するため、体内（血中）で長期間安定し、癌組織へ集積させやすく、全身投与にも適する。このため、ポリエチレングリコールで被覆した金属半導体粒子は、表層から深部に至るまでの広範囲の癌の治療に特に適する。ノニオン性の親水性基を有するポリマーを固定した半導体粒子複合体の好ましいゼータ電位は、−２０〜＋２０mVである。この範囲内であると、血中タンパク質が静電気的に吸着しにくくなるので、細網内皮系への取り込み、腎排泄、肝臓取り込み等を回避しやすくなり、目的部位（腫瘍）に到達できるに足る血中滞留性を確保することができる。
【００２１】
本発明の好ましい態様によれば、金属半導体粒子が、溶媒に分散されてなるのが好ましい。これにより、金属半導体粒子を、点滴、注射、塗布等の種々の方法により、患者の体内に効率的に投与することができる。なお、安全性の観点から、分散液は、中性の液性を有するのが好ましく、より好ましくは生理食塩水である。半導体粒子は分散体に対して、０．００１〜１質量％以下含有されることが好ましく、より好ましくは０．００１〜０．１質量％である。この範囲内であれば、投与後、２４〜７２時間後に患部（腫瘍）に効果的に粒子を蓄積させることが可能となる。すなわち、患部（腫瘍）に粒子濃度が蓄積しやすくなるとともに、血中での粒子の分散性も確保されて凝集隗が形成しにくくなるため、投与後に血管の閉塞などの二次的弊害を招くおそれも無い。
【００２２】
本発明の別の態様によれば、金属半導体粒子を含んでなり、超音波照射を受け、該照射により細胞毒となる、殺細胞剤が提供される。この殺細胞剤は、体内に投与され、超音波照射を受け、該照射により細胞毒となることで、細胞を破壊ないし死滅させることができるが、体内に限らず、試験管内においても殺対象である細胞を破壊ないし死滅させることができる。この態様において、殺対象は特に限定されないが、癌細胞であるのが好ましい。本態様において、細胞毒は、超音波照射により前記半導体粒子が発生するラジカル種により生じるものであるのが好ましい。
【００２３】
本発明の超音波癌治療促進剤は、点滴、注射、塗布等の種々の方法により、患者の体内に投与することができる。そして、体内に投与された超音波癌治療促進剤は、ドラッグデリバリーシステムのように、癌組織に到達して蓄積される。そして、超音波癌治療促進剤が蓄積された癌組織に超音波処理が行われる。本発明の好ましい態様によれば、使用する超音波の周波数は、細胞を殺傷する効果および安全性の観点から、２０ｋＨｚ〜２０ＭＨｚが好ましく、４００ｋＨｚ〜２０ＭＨｚがより好ましく、さらに好ましくは６００ｋＨｚ〜１０ＭＨｚ、最も好ましくは１ＭＨｚ〜１０ＭＨｚである。超音波の照射時間は治療対象である癌組織の位置および大きさを考慮して適宜決定されるべきであり、特に限定されない。こうして、患者の癌組織を超音波により高い効率で死滅ないし破壊して、高い癌治療効果を実現することができる。超音波は生体内の深部に外部より到達させることが可能で、本発明の促進剤と併せて用いることにより、非侵襲の状態で生体内深部に存在するような患部やターゲット部位の治療が実現できる。さらに、患部やターゲット部位に本発明の促進剤が集積することにより、周辺の正常細胞に悪影響を及ぼさない程度の微弱な超音波で本発明の促進剤を集積させた局所のみに作用させることができる。
【００２４】
本発明の好ましい態様によれば、金属半導体粒子としてより好ましくはＴｉＯ２であるが、該金属半導体粒子の光触媒活性を癌治療に利用する提案もなされている。この際、紫外線を用いた照射によって患部やターゲット部位の治療を行うことが可能であり、その照射到達深度は生体表層部より２ｍｍである。一方で、超音波を用いた照射によって生体内の診断等を行う際は、生体表層部より２ｍｍ以上の内部においても可能である。従って超音波を用いることで、より生体内の深部に外部より到達させることが可能で、本発明の促進剤と併せて用いることにより、非侵襲の状態で生体内深部に存在するような患部やターゲット部位の治療が実現できる。
【００２５】
本発明の好ましい態様によれば、好ましい適用部位として、切除術が困難な臓器が考えられ、具体的には膵臓癌、膀胱癌、肝臓癌、脳腫瘍があげられる。
【００２６】
超音波照射部については特に限定されるべきではないが、本発明の好ましい態様によれば、より効果を得るためには超音波照射部を内視鏡やカテーテル等の患部やターゲット部位に到達可能な器具に設置し、直接的に照射することができる。また、切除術が困難な臓器に対して、あるいは患者のQOLの観点から体外より非侵襲の状態で照射することができる。具体的には消化器の表層癌に対して、腹部より超音波照射を行い患部に超音波を到達させ、癌組織を殺傷できる。
【実施例】
【００２７】
例１：ポリアクリル酸結合型酸化チタン（ＴｉＯ２/ＰＡＡ）粒子の作製
チタンテトライソプロポキシド３．６ｇとイソプロパノール３．６ｇを混合し、氷冷下で６０ｍｌの超純水に滴下して加水分解を行った。滴下後に室温で３０分間攪拌した。攪拌後、１２Ｎ硝酸を１ｍｌ滴下して８０℃で８時間攪拌を行い、ペプチゼーションした。ペプチゼーション終了後、０．４５μｍのフィルターで濾過し、脱塩カラム（ＰＤ１０、アマシャム・ファルマシア・バイオサイエンス社）を用いて溶液交換して固形成分１％のアナターゼ型二酸化チタンゾルを調製した。この分散液を容量１００ｍｌのバイアル瓶に入れ、２００Ｈｚで３０分間超音波処理を行った。超音波処理を行う前と後での平均分散粒経は、それぞれ、３６．４ｎｍ、２０．２ｎｍであった。超音波処理後、溶液を濃縮して固形成分２０％の二酸化チタンゾル（アナターゼ型）を調製した。
【００２８】
得られた二酸化チタンゾル０．７５ｍｌを２０ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に分散させ、ポリアクリル酸（平均分子量：５０００、和光純薬）０．２ｇを溶解したＤＭＦを１０ｍｌ添加後、攪拌して混合した。水熱反応容器に溶液を移し変え、１５０℃で６時間水熱合成を行った。反応終了後、反応容器温度が５０℃以下になるまで冷却し、溶液を取り出した後に水８０ｍｌを添加して攪拌混合した。エバポレータでＤＭＦおよび水を除去した後に、再度、水２０ｍｌを添加してポリアクリル酸修飾二酸化チタン水溶液とした。２Ｎ塩酸１ｍｌを添加して二酸化チタン粒子を沈殿させて、遠心後に上清を除去することにより未反応のポリアクリル酸を分離した。再度水を添加して洗浄を行い、遠心後に水を除去した。５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を１０ｍｌ添加後、２００Ｈｚで３０分間超音波処理を行い、二酸化チタン粒子を分散させた。超音波処理後、０．４５μｍのフィルターで濾過し、固形成分１．５％のポリアクリル酸修飾二酸化チタンゾルを得た。作製したポリアクリル酸修飾二酸化チタン微粒子（アナターゼ型）の分散粒径をゼータサイザーナノＺＳ（シスメックス社製）を用いて測定したところ、キュムラント法解析から平均分散粒径は４５．５ｎｍであった。この測定は、ゼータ電位測定セルにポリエチレンイミン結合二酸化チタン微粒子を含む分散液０．7５ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて動的光散乱法により行った。
【００２９】
例２：ポリエチレンイミン結合型酸化チタン（ＴｉＯ２/ＰＥＩ）粒子の作製
チタンテトライソプロポキシド３．６ｇとイソプロパノール３．６ｇを混合し、氷冷下で６０ｍｌの超純水に滴下して加水分解を行った。滴下後に室温で３０分間攪拌した。攪拌後、１２Ｎ硝酸１ｍｌを滴下して８０℃で８時間攪拌を行い、ペプチゼーションした。ペプチゼーション終了後、０．４５μｍのフィルターで濾過し、さらに脱塩カラム（ＰＤ−１０、アマシャム・ファルマシア・バイオサイエンス社製）を用いて溶液交換して固形成分１％の酸性二酸化チタンゾルを調製した。この分散液を容量１００ｍｌのバイアル瓶に入れ、２００Ｈｚで３０分間超音波処理を行った。超音波処理を行う前後の平均分散粒経は、それぞれ、３６．４ｎｍ、２０．２ｎｍであった。超音波処理後、溶液を濃縮して固形成分２０％の二酸化チタンゾルを調製した。
【００３０】
得られた二酸化チタンゾル０．７５ｍｌを２０ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に分散させ、ポリエチレンイミン（平均分子量：１００００、和光純薬社製）４５０ｍｇを溶解したＤＭＦ１０ｍｌを添加後、攪拌して混合した。水熱反応容器（ＨＵ−５０、三愛科学社製）に溶液を移し変え、１５０℃で６時間合成を行った。反応終了後、反応容器温度が５０℃以下になるまで冷却し、２倍量のイソプロパノールを添加し、ポリエチレンイミン結合二酸化チタン微粒子を沈殿させ、遠心後に上清を除去することにより未反応のポリエチレンイミンを分離した。７０％エタノールを添加して洗浄を行い、遠心後にエタノールを除去した。蒸留水を１０ｍｌ添加後、２００Ｈｚで３０分間超音波処理を行い、ポリエチレンイミン結合二酸化チタン微粒子を分散させた。超音波処理後、０．４５μｍのフィルターで濾過して、固形成分１．５％のポリエチレンイミン結合二酸化チタン微粒子の分散液を得た。作製したポリエチレンイミン結合二酸化チタン微粒子の分散粒径を、ゼータサイザーナノＺＳ（シスメックス社製）を用いて測定したところ、ポリエチレンイミン結合二酸化チタン微粒子の平均粒径は６７．７ｎｍであった。この測定は、ゼータ電位測定セルにポリエチレンイミン結合二酸化チタン微粒子の分散液０．7５ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて動的光散乱法により行った。
【００３１】
例３：ポリエチレングリコール結合型酸化チタン（ＴｉＯ２/ＰＥＧ）粒子の作製
チタンテトライソプロポキシド３．６ｇとイソプロパノール３．６ｇを混合し、氷冷下で６０ｍｌの超純水に滴下して加水分解を行った。滴下後に室温で３０分間攪拌した。攪拌後、１２Ｎ硝酸１ｍｌを滴下して８０℃で８時間攪拌を行い、ペプチゼーションした。ペプチゼーション終了後、０．４５μｍのフィルターで濾過し、さらに脱塩カラム（ＰＤ−１０、アマシャム・バイオサイエンス社製）を用いて溶液交換して固形成分１％の酸性二酸化チタンゾルを調製した。この二酸化チタンゾルを１００ｍｌ容のバイアル瓶に入れ、超音波発生器ＭＩＤＳＯＮＩＣ２００（カイジョー社製）を用いて２００Ｈｚで３０分間超音波処理を行った。超音波処理を行った後の平均分散粒経は、１２Ｎの硝酸で１０００倍に希釈した後、ゼータサイザーナノＺＳ（シスメックス社製）を用いて、石英測定セルに分散液０．１ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて動的光散乱法により測定した。その結果、分散粒径は２０．２ｎｍであった。この二酸化チタンゾルを蒸発皿を用いて、５０℃下で溶液の濃縮を行い、最終的に固形成分２０％の酸性二酸化チタンゾルを調整した。
【００３２】
次に、ポリオキシエチレン−モノアリル−モノメチルエーテルと無水マレイン酸の共重合体（平均分子量；３３，６５９−日本油脂製）１ｇに水５ｍｌを添加して、加水分解後凍結乾燥を行った。反応終了後、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液５ｍｌに溶解させポリエチレングリコール溶液２００ｍｇ／ｍｌを調整した。得られたポリエチレングリコール溶液１．８７５ｍｌを、２７．７２５ｍｌのＤＭＦに溶液に加え、先に調整したアナタ−ゼ型二酸化チタンゾル０．９ｍｌを添加後、攪拌して混合した。水熱反応容器のＨＵ−５０（三愛科学社製）に溶液を移し変え、１５０℃で５時間水熱合成を行った。反応終了後、反応容器温度が５０ ℃以下になるまで冷却し、エバポレータでＤＭＦを除去した後に、蒸留水１０ｍｌを添加してポリエチレングリコール結合二酸化チタン水溶液とした。さらに、下記の条件でＨＰＬＣに付したところ、素通り画分にＵＶ吸収のピークが確認され、この画分を回収した。
ＨＰＬＣ：ＡＫＴＡ ｐｕｒｉｆｉｅｒ、アマシャム・バイオサイエンス社製
カラム：ＨｉＰｒｅｐ １６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００ＨＲ、アマシャム・バイオサイエンス社製
移動相：リン酸塩緩衝溶液（ｐＨ７．４）
流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎ
【００３３】
この分散液を蒸留水で０．０１％水溶液に希釈し、動的光散乱法による分散粒径およびゼータ電位の測定したところ、分散粒径は４５．４ｎｍ、ゼータ電位は１．１ｍＶであった。この測定は、ゼータサイザーナノＺＳを用いて、ゼータ電位測定セルにポリエチレングリコール結合二酸化チタン水溶液０．７５ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定することにより、２５℃にて行った。
【００３４】
例４：超音波照射による細胞殺傷試験
まず、以下の半導体粒子を用意した。
ＴｉＯ２／ＰＡＡ粒子（例１で作製されたもの）
ＳｎＯ２粒子（シーアイ化成製、ＳＮＷ１５ＷＴ％-Ｇ０２、中性分散体、分散粒径：３９ｎｍ）
ＺｎＯ粒子（シーアイ化成製、Ｚｎミズ１５ＷＴ％-Ｇ０１、中性分散体、分散粒径：６７ｎｍ）
ＣｄＳｅ粒子（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔ社製、Ｑｄｏｔ６５５プロテインＡ標識、中性分散体、分散粒径：８ｎｍ）
ここで、上述した各種粒子の分散粒径は、例１で示した動的光散乱法により得られたものである。
【００３５】
次に、上記半導体粒子を、ＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ６．８）に分散させ、この溶液を、１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌのＪｕｒｋａｔ細胞を含む、１０％血清入りＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に１／１０量添加して、終濃度０．０５％となるように試験溶液を調整した。
【００３６】
また、比較例として、以下の金属半導体ではない粒子を用意して、上記同様に試験溶液を調製した。
ＳｉＯ２粒子（シーアイ化成製、Ｓｉミズ１０ＷＴ％−Ｇ３６０、Ｌｏｔ＃０５０４２０−１、分散粒径：１０５ｎｍ）
Ａｕ粒子（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ製、ＰｒｏｔｅｉｎＡ ２０ｎｍ、Ｇｏｌｄ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、分散粒径：４０ｎｍ）
ここで、上述した各種粒子の分散粒径は、例１で示した動的光散乱法により得られたものである。
【００３７】
上記得られた各試験溶液に、超音波照射装置（オージー技研（株）製、ＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣ ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ ＥＳ−２：１ＭＨｚ）により、０．５Ｗ／ｃｍ２で５０％ｄｕｔｙ ｃｙｃｌｅ運転で１分間超音波を照射して、細胞の殺傷試験を行なった。その結果は、図１に示される通りであった。図１に示されるように、金属半導体粒子を添加した溶液はいずれも細胞の殺傷率が高かったことから、超音波照射により細胞を殺傷できることが確認された。一方、比較例として使用したＳｉＯ２粒子やＡｕ粒子にはこの細胞殺傷効果は確認されなかった。
【００３８】
例５：金属半導体粒子濃度の依存性
金属半導体粒子として、例１で作製されたＴｉＯ２粒子（ＴｉＯ２/ＰＡＡ）を用いて、超音波照射による細胞殺傷濃度依存性試験を行なった。酸化チタン粒子を終濃度で、０．００１％、０．０１％、０．０５％、および０．１％となるように、ＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ６．８）で調整し、１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌのＪｕｒｋａｔ細胞を含む、１０％血清入りＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に１／１０量添加して試験溶液を調整した。この試験溶液に、超音波照射装置（オージー技研（株）製、ＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣ ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ ＥＳ−２：１ＭＨｚ）により、０．５Ｗ／ｃｍ２で５０％ｄｕｔｙ ｃｙｃｌｅ運転で１分間超音波を照射して、細胞の殺傷試験を行ない、金属半導体粒子濃度の依存性を検討した。その結果は、図２に示される通りであった。酸化チタン粒子を添加した全ての溶液濃度において細胞の生存率が低下していることが確認された。特に、終濃度０．０５％溶液において細胞の生存率が低下していることから、細胞殺傷効果の高い終濃度は０．０５％であることが分かった。
【００３９】
例６：超音波照射によるスーパーオキサイドアニオン生成能の評価
まず、以下の金属半導体粒子を用意した。
ＴｉＯ２粒子（テイカ製、アナタース型酸化チタン、ＴＫＳ−２０３、分散粒径１２０ｎｍ）
ＳｎＯ２粒子（シーアイ化成製、ＳＮＷ１５ＷＴ％−Ｇ０２、Ｌｏｔ＃０５０５２６、分散粒径；３９ｎｍ）
ＺｎＯ粒子（シーアイ化成製、Ｚｎミズ１５ＷＴ％−Ｇ０１、Ｌｏｔ＃０５０５２３−０１、分散粒径：６７ｎｍ）
【００４０】
次に、上記金属半導体粒子を、固形分が終濃度で０．１％となるようにＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ６．８）に分散させ、スーパーオキサイドアニオンの発生試薬である還元系発色試薬ＷＳＴ−１（同仁化学製）を０．５％溶液となるように水溶液に添加して、試験溶液を調整した。
【００４１】
また、比較例として、金属半導体ではない粒子としてＳｉＯ２粒子（シーアイ化成製、Ｓｉミズ１０ＷＴ％−Ｇ３６０、Ｌｏｔ＃０５０４２０−１、分散粒径：１０５ｎｍ）を用意して、上記同様に試験溶液を調製した。
【００４２】
上記得られた各試験溶液に、超音波照射装置（オージー技研（株）製、ＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣ ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ ＥＳ−２：１ＭＨｚ）により、０．５Ｗ／ｃｍ２で５０％ｄｕｔｙ ｃｙｃｌｅ運転で５分間超音波を照射して、４５０ｎｍにおける波長の吸収を紫外−可視光分光光度計により測定した。その結果は、図３に示される通りであった。図３に示されるように、金属半導体粒子である全ての粒子においてＷＳＴ−１の分解に伴い黄色ホルマザンを生成することにより吸光度の上昇が認められた。すなわち、ＴｉＯ２粒子、ＳｎＯ２粒子、およびＺｎＯ粒子は超音波照射によりスーパーオキサイドアニオンを生成することが確認された。
【００４３】
例７：超音波照射によるヒドロキシラジカル生成能の評価
まず、以下の金属半導体粒子を用意した。
ＴｉＯ２粒子（テイカ製、アナタース型酸化チタン、ＴＫＳ−２０３、分散粒径：１２０ｎｍ）
ＳｎＯ２粒子（シーアイ化成製、ＳＮＷ１５ＷＴ％−Ｇ０２、Ｌｏｔ＃０５０５２６、分散粒径：３９ｎｍ）
ＺｎＯ粒子（シーアイ化成製、Ｚｎミズ１５ＷＴ％−Ｇ０１、Ｌｏｔ＃０５０５２３−０１、分散粒径：６７ｎｍ）、
【００４４】
次に、上記金属半導体粒子を、固形分が終濃度で０．１％となるようにＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ６．８）で調整し、ヒドロキシラジカルの生成試薬として活性酸素検出用蛍光試薬ヒドロキシフェニルフルオレセイン（ＨＰＦ、第一化学薬品製）を５μＭとなるように先の金属酸化物粒子を含む溶液に添加して、試験溶液を調整した。
【００４５】
また、比較例として、ＳｉＯ２粒子（シーアイ化成製、Ｓｉミズ１０ＷＴ％−Ｇ３６０、Ｌｏｔ＃０５０４２０−１、分散粒径：１０５ｎｍ）を用意して、上記同様に試験溶液を調製した。
【００４６】
上記得られた各試験溶液に、超音波照射装置（オージー技研（株）製、ＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣ ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ ＥＳ−２：１ＭＨｚ）により、０．５Ｗ／ｃｍ２で５０％ｄｕｔｙ ｃｙｃｌｅ運転で５分間超音波を照射して、Ｅｘ＝４９０ｎｍ、Ｅｍ＝５１５ｎｍにおける波長を蛍光蛍光光度計により測定した。その結果は、図４に示される通りであった。図４に示されるように、金属半導体粒子である全ての粒子において、ＨＰＦが反応しフルオレセインを生成し蛍光強度の上昇が認められた。すなわち、ＴｉＯ２粒子、ＳｎＯ２粒子、ＺｎＯ粒子は超音波照射によってヒドロキシラジカルを生成することが確認された。
【００４７】
例８：超音波照射による過酸化水素生成能の評価
まず、以下の金属半導体粒子を用意した。
ＴｉＯ２粒子（テイカ製、アナタース型酸化チタン、ＴＫＳ−２０３、分散粒径：１２０ｎｍ）
ＳｎＯ２粒子（シーアイ化成製、ＳＮＷ１５ＷＴ％−Ｇ０２、Ｌｏｔ＃０５０５２６、分散粒径：３９ｎｍ）
ＺｎＯ粒子（シーアイ化成製、Ｚｎミズ１５ＷＴ％−Ｇ０１、Ｌｏｔ＃０５０５２３−０１、分散粒径：６７ｎｍ）
【００４８】
次に、上記金属半導体粒子を、固形分が終濃度で０．１％となるようにＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ６．８）で調整し、過酸化水素測定用試薬ＴＰＭ−ＰＳ（同仁化学製）を１０μＭとなるように水溶液に添加して、試験溶液を調整した。
【００４９】
また、比較例として、ＳｉＯ２粒子（シーアイ化成製、Ｓｉミズ１０ＷＴ％−Ｇ３６０、Ｌｏｔ＃０５０４２０−１、分散粒径１０５ｎｍ）を用意して、上記同様に試験溶液を調製した。
【００５０】
上記得られた各試験溶液に、超音波照射装置（オージー技研（株）製、ＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣ ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ ＥＳ-２：１ＭＨｚ）により、０．５Ｗ／ｃｍ２で５０％ ｄｕｔｙ ｃｙｃｌｅ運転で５分間超音波を照射して、１００μｌを採取し、Amplex Red Hydrogen Peroxide/Peroxidase Assay Kit （Molecular Probes 社）のマニュアルに従い、同キットで測定を行った。その結果は、図５に示される通りであった。図５に示されるように、ＴｉＯ２粒子は超音波照射により過酸化水素をより効率的に生成することが確認された。
【００５１】
例９：超音波照射による一重項酸素生成能の評価
まず、以下の半導体粒子を用意した。
ＴｉＯ２粒子(A)（石原産業製、アナターゼ型酸化チタン、ＳＴＳ-２４０、中性分散体、分散粒径：５２ｎｍ）
ＳｎＯ２粒子（シーアイ化成製、ＳＮＷ１５ＷＴ％-Ｇ０２、中性分散体、分散粒径：３９ｎｍ）
ＺｎＯ粒子（シーアイ化成製、Ｚｎミズ１５ＷＴ％-Ｇ０１、中性分散体、分散粒径：６７ｎｍ）
ＴｉＯ２／ＰＡＡ（例１により作成したもの）
ＴｉＯ２／ＰＥＧ（例３により作成したもの）
【００５２】
次に、上記半導体粒子を、固形分が終濃度で０．０５％となるようにＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ６．８）で調整し試験溶液を調整した。
【００５３】
また、比較例として、ＳｉＯ２粒子（シーアイ化成製、Ｓｉミズ１０ＷＴ％-Ｇ３６０、中性分散体、分散粒径１０５ｎｍ）を用意して、上記同様に試験溶液を調製した。
【００５４】
上記得られた各試験溶液に、超音波照射装置（オージー技研（株）製、ＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣ ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ ＥＳ-２：１ＭＨｚ）により、０．５Ｗ／ｃｍ２で５０％ ｄｕｔｙ ｃｙｃｌｅ運転で５分間超音波を照射して、１００μｌを採取し、Singlet Oxygen Sensor Green Reagent（Molecular Probes社）のマニュアルに従い、同社のキットで、一重項酸素に起因する、Ｅｘ＝４８８ｎｍ、Ｅｍ＝５２５ｎｍにおける蛍光強度を蛍光光度計により測定した。その結果は、図６に示される通りであった。図６に示されるように、ＴｉＯ２粒子は超音波照射により一重項酸素をより効率的に生成することが確認された。
【００５５】
例１０：周波数への依存性
２ｍｌのマイクロチューブ中で、PBS緩衝液：８５０μｌ、還元系発色試薬ＷＳＴ-１（同仁化学製）：５０μｌ、０．１％酸化チタン粒子：１００μｌの組成の溶液を調製した。酸化チタン粒子としては、ＴｉＯ２粒子(A)（石原産業製、アナターゼ型酸化チタン、ＳＴＳ-２４０、中性分散体、分散粒径：５２ｎｍ）を用いた。
【００５６】
得られたマイクロチューブを、水浴中、超音波振動子から３ｃｍの距離で、多周波数超音波発生装置（MODEL４０２１｛KAIJYO｝、出力：２００W）により超音波を同強度になるように照射した。照射後０、３、６分毎に２００μｌずつサンプリングを行い 例６と同様の測定方法でスーパーオキサイドアニオンを測定した。測定は、２８、５０、１００、２００、および６００ｋＨｚの各照射周波数について行った。また、コントロールとして、酸化チタン粒子を添加しない場合についても上記同様の測定を行った。それらの結果は、図７に示される通りであった。図７に示されるように、スーパーオキサイドアニオンはチタンが存在することによって生産され、さらにその効果は、照射周波数が最も高い６００ｋＨｚの場合において、顕著であった。
【００５７】
例１１：粒子の安定性
水、ＰＢＳ緩衝液（pH 7.4）、および１０％血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地のそれぞれに以下の粒子を最終濃度 が０．０１％ になるように分散して、サンプルを得た。
【００５８】
酸化チタン（C）（Ｐ２５粒子；日本エアロジル製をＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ６．８）で分散させたもの、分散粒径：５００ｎｍ）
例１により作成したＴｉＯ２／ＰＡＡ粒子
例３により作成したＴｉＯ２／ＰＥＧ粒子
酸化チタン（A）（ＳＴＳ２４０、石原産業製、中性分散体、分散粒径：５２ｎｍ）
酸化チタン（B）（TKS-203、テイカ製、アナターゼ型酸化チタン、中性分散体、分散粒径：１２０ｎｍ）
ＳｎＯ２粒子（シーアイ化成製、ＳＮＷ１５ＷＴ％-Ｇ０２、中性分散体、分散粒径：３９ｎｍ）
ＺｎＯ粒子（シーアイ化成製、Ｚｎミズ１５ＷＴ％-Ｇ０１、中性分散体、分散粒径：６７ｎｍ）
【００５９】
各粒子の安定性の指標として、各分散液における平均分散粒子径の変化を測定した。この測定は、石英測定セルに分散液０．１ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、ゼータサイザーナノＺＳ（シスメックス社製）を用いて、1時間後と24時間後に２５℃にて動的光散乱法により行った。
各分散液について測定された平均分散粒子径を表１に示す。表１に示されるように、中性分散体として市販されている酸化チタン(A)や酸化チタン(B)と比較して、本例で作成した ＴｉＯ２／ＰＡＡおよびＴｉＯ２／ＰＥＧは平均分散粒子径の変化が少なく、それ故優れた安定性を有することが分かる。
【表１】
【００６０】
例１２：超音波照射による細胞殺傷試験
まず、ＴｉＯ２／ＰＡＡ粒子（例１で作製されたもの 中性分散体、分散粒径：４５．５ｎｍ）をＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ６．８）に分散させ、この溶液を、１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌのＪｕｒｋａｔ細胞を含む、１０％血清入りＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に１／１０量添加して、ＴｉＯ２／ＰＡＡ粒子の終濃度０．０１％および０．００１％となるように試験溶液を調整した。
【００６１】
また、比較例として、ＴｉＯ２粒子（Ｃ）（Ｐ２５粒子；日本エアロジル製をＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ６．８）で分散させたもの、分散粒径：５００ｎｍ）を用意して、上記同様に試験溶液を調製した。ここで、上述した各種粒子の分散粒径は、例１で示した動的光散乱法により得られたものである。
【００６２】
上記得られた各試験溶液に、超音波照射装置（オージー技研（株）製、ＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣ ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ ＥＳ-２：１ＭＨｚ）により、０．５Ｗ／ｃｍ２で５０％ｄｕｔｙ ｃｙｃｌｅ運転で１分間超音波を照射して、細胞の殺傷試験を行なった。その結果は、図８に示される通りであった。図８に示されるように、分散粒径４５．５ｎｍのＴｉＯ２／ＰＡＡ粒子を添加した溶液はいずれも腫瘍細胞殺傷効果が高いことが確認された。一方、比較例として使用した分散粒径５００ｎｍのＴｉＯ２粒子（Ｃ）においてはこの細胞殺傷効果は確認されなかった。
【００６３】
例１３：超音波照射によるヒドロキシラジカル生成能の評価
まず、以下の半導体粒子を用意した。
ＴｉＯ２粒子（Ａ）（石原産業製、アナターゼ型酸化チタン、ＳＴＳ-２４０、中性分散体、分散粒径：５２ｎｍ）
ＴｉＯ２粒子（Ｄ）（石原産業製、アナターゼ型酸化チタン、ＳＴＳ-２３０、中性分散体、分散粒径：１５ｎｍ）
ＴｉＯ２粒子（Ｃ）（Ｐ２５粒子；日本エアロジル製をＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ６．８）で分散させたもの、分散粒径：５００ｎｍ）
【００６４】
次に、上記半導体粒子を、固形分が終濃度で０．０５％となるようにＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ６．８）で調整し、ヒドロキシラジカルの生成試薬として活性酸素検出用蛍光試薬ヒドロキシフェニルフルオレセイン（ＨＰＦ、第一化学薬品製）を５μＭとなるように先の金属酸化物粒子を含む溶液に添加して、試験溶液を調整した。
【００６５】
また、コントロールとしてＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ６．８）を用意して、上記同様に試験溶液を調製した。
【００６６】
上記得られた各試験溶液に、超音波照射装置（オージー技研（株）製、ＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣ ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ ＥＳ-２：１ＭＨｚ）により、０．５Ｗ／ｃｍ２で５０％ ｄｕｔｙ ｃｙｃｌｅ運転で５分間超音波を照射して、ヒドロキシラジカルに起因する、Ｅｘ＝４９０ｎｍ、Ｅｍ＝５１５ｎｍにおける蛍光強度を蛍光光度計により測定した。その結果は、図９に示される通りであった。図９に示されるように、分散粒径５２ｎｍのＴｉＯ２粒子（A）および分散粒径の１５ｎｍのＴｉＯ２粒子（Ｄ）においてコントロールよりも顕著なヒドロキシラジカル生成が確認された。しかしながら、分散粒径５００ｎｍのＴｉＯ２粒子（Ｃ）においてはヒドロキシラジカル生成が確認されなかった。
【００６７】
例１４：粒子の安全性
まず、ＴｉＯ２／ＰＡＡ粒子（例１で作製されたもの 中性分散体、分散粒径：４５．５ｎｍ）、ＴｉＯ２／ＰＥＩ粒子（例２で作製されたもの 中性分散体、分散粒径：６７．７ｎｍ）、およびＴｉＯ２／ＰＥＧ粒子（例３で作製されたもの 中性分散体、分散粒径：４５．４ｎｍ）をＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ６．８）に分散させて、各種分散液を得た。これらの分散液を、１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌのＪｕｒｋａｔ細胞を含む、１０％血清入りＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に１／１０量添加して、ＴｉＯ２系複合体粒子の終濃度が０．１、０．０１、および０．００１質量％となるように試料液を調整した。また、対照実験として、ＰＢＳ緩衝液のみを同様に添加して対照試料液を調整した。調整後、ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で２４時間培養し、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｒｏ Ｋｉｔ（バイオラッド社製）により生細胞数を測定した。対照試料液の生存率を１００％として各試験液を比較した結果を図１０に示す。図１０に示される通り、０．１〜０．００１質量％の全試料液において、高い細胞生存率、すなわち高い安全性を示した。
【００６８】
例１５：ポリマーが結合されたＴｉＯ２粒子を用いた超音波照射による細胞殺傷試験
ＴｉＯ２／ＰＡＡ粒子（例１で作製されたもの）、ＴｉＯ２／ＰＥＩ粒子（例２で作製されたもの）およびＴｉＯ２／ＰＥＧ粒子（例３で作製されたもの）を、ＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ６．８）に分散させ、この溶液を、１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌのＪｕｒｋａｔ細胞を含む、１０％血清入りＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に１／１０量添加して、終濃度０．０５％となるように試験溶液を調整した。
【００６９】
上記得られた各試験溶液に、超音波照射装置（オージー技研（株）製、ＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣ ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ ＥＳ-２：１ＭＨｚ）により、０．５Ｗ／ｃｍ２で５０％ｄｕｔｙ ｃｙｃｌｅ運転で１分間超音波を照射して、細胞の殺傷試験を行なった。その結果は、図１１に示される通りであった。図１１に示されるように、ＴｉＯ２／ＰＡＡ粒子、ＴｉＯ２／ＰＥＩ粒子およびＴｉＯ２／ＰＥＧ粒子のいずれの粒子を添加した溶液も細胞生存率が低い、すなわち殺傷率が高かった。特に、ＴｉＯ２／ＰＥＧ粒子を添加した溶液は細胞生存率が極めて低かったことから、このＴｉＯ２／ＰＥＧ粒子は超音波照射により細胞を殺傷できる効果が特に高いことが確認された。
【００７０】
例１６：超音波照射による細胞殺傷試験２
まず、ＴｉＯ２／ＰＡＡ粒子（例１で作製されたもの 中性分散体、分散粒径：４５．５ｎｍ）をＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ６．８）に分散させ、この溶液を、５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌのＪｕｒｋａｔ細胞を含む、１０％血清入りＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に１／１０量添加して、ＴｉＯ２／ＰＡＡ粒子の終濃度０．０５％となるように試験溶液を３ｍｌ調整した。
【００７１】
また、コントロールとしてＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ６．８）を用意して、上記同様に試験溶液を調製した。
【００７２】
上記得られた各試験溶液に、超音波照射装置（松下電工（株）製、ＥＨ２４３５：５ＭＨｚ）により、最大出力で２分間超音波を連続照射して、細胞の殺傷試験を行なった。その結果は、図１１に示される通りであった。ＰＢＳ緩衝溶液を添加し、超音波照射を行わなかった生細胞の数を１００％として生存率で示した。図１１に示されるように、分散粒径４５．５ｎｍのＴｉＯ２／ＰＡＡ粒子を添加した溶液は腫瘍細胞殺傷効果が高いことが確認された。
【００７３】
例１７：抗腫瘍効果試験
ヌードマウス Balb/c、雄、3週齢）にヒト膀胱癌由来株化細胞（Ｔ−２４）を皮下接種し、腫瘍を形成させ、約０．６３ｍｍ３程度の腫瘍を形成させた。実施例１で作成したＰＡＡ―ＴｉＯ２をＰＢＳ緩衝液にて０．５ ％に希釈し、腫瘍に１００μｌ局所注射した。投与より２４時間後に、時間１分 出力１Ｗ パルス５０％で１ＭＨｚの超音波を超音波照射装置（オージー技研（株）製、ＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣ ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ ＥＳ-２：１ＭＨｚ； プローブ径 １０ｍｍ）を用いて照射した。照射は、水溶性高分子ゲルを皮膚に塗布し、その上にプローブ（超音波照射部）を密着させた後に行った。マウス数は１群あたり６匹とし、ＰＢＳのみ投与又は無処置動物を対照群とした。超音波照射後、各個体の腫瘍体積を測定し、各個体の超音波照射施工日（０日）におけるＰＡＡ−ＴｉＯ２投与前のｓ腫瘍体積を１とした時の各測定時点の腫瘍体積（相対腫瘍増殖率）を求めた。
【００７４】
結果を図１３に示す。
図１３に示されるとおり、酸化チタン＋超音波照射の存在時のみ、腫瘍の大幅な増殖抑制効果が確認された。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】例４において各種粒子について測定された、超音波を１分間照射した際の細胞の殺傷率を示す図である。
【図２】例５において各種濃度のＴｉＯ２粒子（ＴｉＯ２／ＰＡＡ）含有試験溶液について測定された、細胞の生存率を示す図である。
【図３】例６において各種粒子について測定された、超音波の照射によるスーパーオキサイドアニオンの発生に起因する、還元系発色試薬を介した吸光度の上昇を示す図である。
【図４】例７において各種粒子について測定された、超音波の照射によるヒドロキシラジカルの発生に起因する、活性酸素検出用蛍光試薬を介した蛍光の強度を示す図である。
【図５】例８において各種粒子について測定された、超音波の照射による過酸化水素の発生に起因する、ＴＰＭ-ＰＳの酸化を介した吸光度の上昇を示す図である。
【図６】例９において各種粒子について測定された、超音波照射による一重項酸素の発生に起因する、一重項酸素検出用蛍光試薬を介した蛍光強度を示す図である。
【図７】例１０においてＴｉＯ２（A）について測定された、超音波の照射によるスーパーオキサイドアニオンの発生に起因する、還元系発色試薬を介した吸光度の上昇を示す図である。
【図８】例１２において各種粒子について測定された、超音波を１分間照射した際の細胞の生存率を示す図である。
【図９】例１３において各種粒子について測定された、超音波の照射によるヒドロキシラジカルの発生に起因する、活性酸素検出用蛍光試薬を介した蛍光強度を示す図である。
【図１０】例１４において各種濃度のＴｉＯ２粒子含有試験溶液について測定された、細胞の生存率を示す図である。
【図１１】例１５において各種粒子について測定された、超音波を１分間照射した際の細胞の殺傷率を示す図である。
【図１２】例１６においてＴｉＯ２／ＰＡＡ粒子およびＰＢＳ緩衝溶液について測定された、超音波を２分間照射した際（超音波あり）、および照射なし（超音波なし）の細胞の生存率を示す図である。
【図１３】例１７において測定された、マウスの相対腫瘍増殖率の経時変化を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属半導体粒子を含んでなる、超音波癌治療促進剤。
【請求項２】
前記金属半導体粒子が、超音波照射によりラジカル種を生成可能である、請求項１に記載の超音波癌治療促進剤。
【請求項３】
前記金属半導体粒子が、光感応特性を有する、請求項１または２に記載の超音波癌治療促進剤。
【請求項４】
前記金属半導体粒子が、光触媒活性を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の超音波癌治療促進剤。
【請求項５】
前記光触媒活性を有する金属半導体粒子が、ＴｉＯ２、ＺｎＯ、ＳｎＯ２、ＷＯ３、Ｉｎ２Ｏ３、ＳｒＴｉＯ３、Ｎｂ２Ｏ５、およびＴａ２Ｏ５からなる群から選択される、請求項４に記載の超音波癌治療促進剤。
【請求項６】
前記金属半導体粒子が、ＴｉＯ２である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の超音波癌治療促進剤。
【請求項７】
前記金属半導体粒子が、５０〜２００ｎｍの粒子径を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の超音波癌治療促進剤。
【請求項８】
前記金属半導体粒子が、量子ドットである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の超音波癌治療促進剤。
【請求項９】
前記量子ドットが、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＩｎＧａＰおよびＺｎＴｅからなる群から選択される少なくとも一種である、請求項８に記載の超音波癌治療促進剤。
【請求項１０】
前記金属半導体粒子が、凝集または結合されてなる、５０〜２００ｎｍの粒子径を有する二次粒子の形態を有する、請求項１〜６、８、および９のいずれか一項に記載の超音波癌治療促進剤。
【請求項１１】
前記金属半導体粒子が、複数種類の金属半導体粒子の混合物または複合体である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の超音波癌治療促進剤。
【請求項１２】
前記金属半導体粒子の表面に、ポリマーまたは生体由来高分子が結合されてなる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の超音波癌治療促進剤。
【請求項１３】
前記ポリマーが、カルボキシル基を有するポリマーである、請求項１２に記載の超音波癌治療促進剤。
【請求項１４】
前記ポリマーが、カチオン性ポリマーである、請求項１２に記載の超音波癌治療促進剤。
【請求項１５】
前記ポリマーが、ノニオン性ポリマーである、請求項１２に記載の超音波癌治療促進剤。
【請求項１６】
前記金属半導体粒子が、溶媒に分散されてなる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の超音波癌治療促進剤。
【請求項１７】
前記分散液が中性の液性を有する、請求項１６に記載の超音波癌治療促進剤。
【請求項１８】
前記分散液が、生理食塩水である、請求項１６または１７に記載の超音波癌治療促進剤。
【請求項１９】
金属半導体粒子を含んでなり、超音波照射を受け、該照射により細胞毒となる、殺細胞剤。
【請求項２０】
体内に投与され、超音波照射を受け、該照射により細胞毒となる、請求項１９に記載の殺細胞剤。
【請求項２１】
殺対象が癌細胞である、請求項１９または２０に記載の殺細胞剤。
【請求項２２】
前記細胞毒が、超音波照射により前記半導体粒子が発生するラジカル種により生じる、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の殺細胞剤。
【請求項１】
金属半導体粒子を含んでなる、超音波癌治療促進剤。
【請求項２】
前記金属半導体粒子が、超音波照射によりラジカル種を生成可能である、請求項１に記載の超音波癌治療促進剤。
【請求項３】
前記金属半導体粒子が、光感応特性を有する、請求項１または２に記載の超音波癌治療促進剤。
【請求項４】
前記金属半導体粒子が、光触媒活性を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の超音波癌治療促進剤。
【請求項５】
前記光触媒活性を有する金属半導体粒子が、ＴｉＯ２、ＺｎＯ、ＳｎＯ２、ＷＯ３、Ｉｎ２Ｏ３、ＳｒＴｉＯ３、Ｎｂ２Ｏ５、およびＴａ２Ｏ５からなる群から選択される、請求項４に記載の超音波癌治療促進剤。
【請求項６】
前記金属半導体粒子が、ＴｉＯ２である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の超音波癌治療促進剤。
【請求項７】
前記金属半導体粒子が、５０〜２００ｎｍの粒子径を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の超音波癌治療促進剤。
【請求項８】
前記金属半導体粒子が、量子ドットである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の超音波癌治療促進剤。
【請求項９】
前記量子ドットが、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＩｎＧａＰおよびＺｎＴｅからなる群から選択される少なくとも一種である、請求項８に記載の超音波癌治療促進剤。
【請求項１０】
前記金属半導体粒子が、凝集または結合されてなる、５０〜２００ｎｍの粒子径を有する二次粒子の形態を有する、請求項１〜６、８、および９のいずれか一項に記載の超音波癌治療促進剤。
【請求項１１】
前記金属半導体粒子が、複数種類の金属半導体粒子の混合物または複合体である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の超音波癌治療促進剤。
【請求項１２】
前記金属半導体粒子の表面に、ポリマーまたは生体由来高分子が結合されてなる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の超音波癌治療促進剤。
【請求項１３】
前記ポリマーが、カルボキシル基を有するポリマーである、請求項１２に記載の超音波癌治療促進剤。
【請求項１４】
前記ポリマーが、カチオン性ポリマーである、請求項１２に記載の超音波癌治療促進剤。
【請求項１５】
前記ポリマーが、ノニオン性ポリマーである、請求項１２に記載の超音波癌治療促進剤。
【請求項１６】
前記金属半導体粒子が、溶媒に分散されてなる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の超音波癌治療促進剤。
【請求項１７】
前記分散液が中性の液性を有する、請求項１６に記載の超音波癌治療促進剤。
【請求項１８】
前記分散液が、生理食塩水である、請求項１６または１７に記載の超音波癌治療促進剤。
【請求項１９】
金属半導体粒子を含んでなり、超音波照射を受け、該照射により細胞毒となる、殺細胞剤。
【請求項２０】
体内に投与され、超音波照射を受け、該照射により細胞毒となる、請求項１９に記載の殺細胞剤。
【請求項２１】
殺対象が癌細胞である、請求項１９または２０に記載の殺細胞剤。
【請求項２２】
前記細胞毒が、超音波照射により前記半導体粒子が発生するラジカル種により生じる、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の殺細胞剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公開番号】特開２００８−９４８１６（Ｐ２００８−９４８１６Ａ）
【公開日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２９１５４２（Ｐ２００６−２９１５４２）
【出願日】平成１８年１０月２６日（２００６．１０．２６）
【出願人】（００００１００８７）ＴＯＴＯ株式会社 (3,889)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１０月２６日（２００６．１０．２６）
【出願人】（００００１００８７）ＴＯＴＯ株式会社 (3,889)
【Ｆターム（参考）】
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