軟骨の劣化の治療のための医薬
【課題】軟骨の劣化の治療のための医薬の提供。
【解決手段】軟骨細胞の増殖の刺激を介して軟骨の成長又は修復を刺激することを含む軟骨の劣化の治療のための、Ｂｉｏｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓからの抽出物を有効成分として含む医薬。
【解決手段】軟骨細胞の増殖の刺激を介して軟骨の成長又は修復を刺激することを含む軟骨の劣化の治療のための、Ｂｉｏｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓからの抽出物を有効成分として含む医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は軟骨の劣化の治療のための医薬に関する。また、本発明は一般に、栄養補給組成物、並びに既存の炎症、又は炎症に関連した障害及び特に既存の軟骨損傷の治療におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
知識についての文書、活動又は項目が参照され、議論される本明細書では、この参照又は議論は、知識についての文書、活動又は項目又はそれらの組み合わせが、優先日に、共通する一般的知識の一部であった、又は本明細書が関係する課題を解決する試みに関連すると知られていたという承認ではない。
【０００３】
軟骨の劣化はすべての脊椎動物を悩ませる問題である。
【０００４】
軟骨は骨の関節表面に位置する滑らかな結合組織であり、骨を支え、保護する。軟骨が損傷を受けると、関節はもはや正常には機能できず、軟骨の表面は薄化し、水を保持する能力を失い、軟骨自体に現れる亀裂によって劣化する。時間をかけて軟骨の弾性は低下し、負傷や損傷にさらに感受性になる。進行性の喪失は結果的に特定の点での骨と骨の接触を生じることができ、それは、極めて痛く、関節を成す関節が正常に機能するのを妨げる。
【０００５】
ＮＳＡＩＤは、鎮痛の形態として関節の炎症の治療に長い間使用されている。しかしながら、報告されている合併症及び有害反応のために、多数のＮＳＡＩＤの連続した使用に対する抵抗がある。
【０００６】
今まで、軟骨劣化の治療のための医薬の調製におけるコノテガシワ（ＢＯ［Ｂｉｏｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ］）の種子抽出物の使用は完全には割り出されていなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は軟骨の劣化の治療のための医薬を提供することである。また、本発明の目的は、既存の炎症又は炎症に関連した障害の治療のための、Ｂｉｏｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓからの抽出物の使用を提供することである。
【０００８】
本発明のさらなる目的は、既存の炎症又は炎症に関連した障害の治療における軟骨形成の刺激のために栄養補給組成物を提供することである。
【０００９】
本発明の目的は、従来技術の短所及び欠点を克服すること、又は少なくとも実質的に改善することである。
【００１０】
本発明のそのほかの目的及び利点は、添付の図面と関連して以下の記載から明らかになるであろうが、その際、説明及び例示の目的で、本発明の実施態様が開示される。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の第１の態様では、これは決して本発明を限定すると理解されるべきではないが、軟骨の劣化の治療に使用される医薬の製造におけるＢｉｏｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓからの抽出物の使用であって、前記の治療における使用が前記医薬による軟骨細胞の増殖の刺激を介して軟骨の成長又は修復を刺激することを含むことを特徴とする使用が提供される。
【００１２】
好ましくは、前記の軟骨の劣化は、滑液のＰＧＥ2（プロスタグランジンＥ2）のレベルの上昇を特徴とし、それは軟骨劣化の既存の症状と関連する。
【００１３】
実施態様の１つでは、前記医薬は、治療上の量のＢ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓからの抽出物を含み、さらに、たとえば、ペルナイガイ抽出物、アワビ抽出物又は粉末、サメ軟骨粉末、コンドロイチン又はこれらの組み合わせのような追加の抽出物を含むことができる。
【００１４】
好ましくは、前記抽出物は、Ｂ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓの種子からの抽出物である。
【００１５】
好ましくは、前記使用はさらに、前記治療が予防的治療であることを特徴とする。
【００１６】
好ましくは、前記使用はさらに、前記の軟骨の劣化が滑液のＰＧＥ2のレベルの上昇を特徴とすることを特徴とする。
【００１７】
好ましくは、前記使用はさらに、前記医薬がペルナイガイ抽出物、アワビ抽出物又は粉末又はこれらの組み合わせのような追加の抽出物を含むことを特徴とする。
【００１８】
好ましくは、前記使用はさらに、前記医薬がサメ軟骨粉末を含むことを特徴とする。
【００１９】
好ましくは、前記使用はさらに、前記医薬がコンドロイチンを含むことを特徴とする。
【００２０】
好ましくは、前記使用はさらに、前記コンドロイチンが硫酸コンドロイチンであることを特徴とする。
【００２１】
好ましくは、前記使用はさらに、前記コンドロイチンが海洋性のコンドロイチンであることを特徴とする。
【００２２】
好ましくは、前記使用はさらに、Ｂｉｏｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓからの前記抽出物がＢｉｏｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓの種子からの抽出物であることを特徴とする。
【００２３】
さらなる実施態様では、Ｂｉｏｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓからの抽出物を含む、滑液のＰＧＥ2のレベルの上昇に特徴付けられる既存の軟骨劣化を治療するための薬剤が記載される。
【００２４】
好ましくは、前記抽出物は軟骨細胞の増殖を刺激する。
【００２５】
好ましくは、前記抽出物は、Ｂｉｏｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓの種子からの抽出物である。
【００２６】
例証として、添付の図面を参照して、以下で本発明の運用がさらに完全に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、対照（ｎ＝５）とＳａｓｈａ’ｓＥＱ（ＳＥＱ；ｎ＝１０）のウマにおける滑液ＰＧＥ2（ｐｇ／ｍＬ）である。ウマは０日目に手根骨間の及び／又は橈骨手根骨の断片の外科的除去を受け、手術後４２日間、割り振られた栄養補助食品を服用した。＊はベースラインからの有意な変化を示す。
【図２】図２は、対照（ｎ＝５）とＳａｓｈａ’ｓＥＱ（ＳＥＱ；ｎ＝１０）のウマにおける滑液ＧＡＧ（μｇ／ｍＬ）である。ウマは０日目に手根骨間の及び／又は橈骨手根骨の断片の外科的除去を受け、手術後４２日間、割り振られた栄養補助食品を服用した。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明の理解を円滑にするために、種々の用語及び略語を使用し、以下で定義する。
【００２９】
「ＳＥＱ」は、ニュージーランド緑イガイ又はペルナイガイと、アワビと、サメ軟骨粉末とコノテガシワ油の混合物を意味する。
【００３０】
「ＢＯ」は、Ｂｉｏｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓの種子から抽出されたコノテガシワ油を意味する。
【００３１】
「ＮＺＧＬＭ」は、ニュージーランド緑イガイ又はペルナイガイを意味する。
【００３２】
Ｂｉｏｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ（「コノテガシワ」）は、中国西部及び北朝鮮に自生するハーブであり、Ｔｈｕｊａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ、Ｐｌａｔｙｃｌａｄｕｓ ｓｔｒｉｃｔａ及びＰｌａｔｙｃｌａｄｕｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓのような多数の別名で知られている。コノテガシワは、５０の基本的なハーブの１つとして漢方では非常に価値がある（Duke and Ayensu 1985：Duke JA, Ayensu ES. Medicinal plants of China. Algonac, Mich: Reference Publications Inc, 1985）。従来からそれは、下剤、鎮痛剤及び鎮静剤として使用されている（Duke and Ayensu 1985）。
【００３３】
サメ軟骨とＮＺＧＬＭとアワビの擬似消化物は、ＰＧＥ2（プロスタグランジンＥ2）、ＧＡＧ及び／又は一酸化窒素を低下させることによって関節炎の軟骨外植モデルにて抗炎症効果を有することが以前報告されている（Pearson et al., 2007： Pearson W. in vitro and in vivo methods to evaluate putative anti-inflammatory nutraceuticals. PhD Thesis, Department of Biomedical Science, Ontario Veterinary College, University of Guelph, Guelph, ON Canada, 2007）。
【００３４】
方法
ＡＨ手順は、グェルフ（Ｇｕｅｌｐｈ）大学動物管理委員会によって評価され、認可され、カナダ動物管理協議会の指針に従った。
【００３５】
包含基準
ウマ所有者のインフォームドコンセント：オス又は非妊娠メス；３〜１５歳の間；体重４５０〜５５０ｋｇの間；関節鏡視下手術にて判定された手根骨間の、橈骨手根骨の及び／又は中手指節の関節に位置する軽い〜中程度の関節炎；試験に入る前２週間以内に非ステロイド性抗炎症剤又はコルチコステロイド（全身性又は関節内）を日常的に服用していない。
【００３６】
除外基準
３を超える歩行困難等級（ＡＡＥＰ尺度）；滑液ＰＥＧ2濃度＜２００ｐｇ／ｍＬ；日常的な非ステロイド性抗炎症剤を止めるのに気乗りしないウマ所有者；冒された手根骨間の、橈骨手根骨の及び／又は中手指節の関節における関節炎のＸ線による又は肉眼での手術の証拠がないこと、又は手術中に確認される破片骨折片がないこと。骨軟骨破片とその後の関節炎病変の発症の間の関係のために、関節炎の外科的又はＸ線による兆候のない破片骨折片のあるウマは保持された。
【００３７】
包含評価
包含基準を満たすウマの所有者のインフォームドコンセントを受け取った際、包含評価を行った。主治医である獣医によって歩行困難等級と屈曲試験が評価された。少なくとも２つの視野から冒された関節のＸ線写真を撮った。手術中にベースラインの滑液試料を取った。経過観察中の滑液試料は無菌関節穿刺によって得た。簡単に言えば、冒された関節の表面を無菌的に準備し、無菌の２１ゲージの１インチの針を冒された関節に挿入し、無菌の３ｃｃの注射筒を針基に取り付け、およそ１．５ｃｃの滑液を吸引した。１０μｇのインドメタシンを含有する無菌のバキュテナーに滑液試料を直ちに注入し、氷上に置いた。次いで滑液を遠心（１５００×ｇ、１５分間）し、細胞残渣を除いた。細胞沈殿物を取り除き、ＰＧＥ2（ＥＬＩＳＡ）、一酸化窒素（ＮＯ；グリース反応）及びグリコサミノグリカン（ＧＡＧ；ジメチルメチレンブルー分光分析アッセイ）についての分析まで残りの上清を−８０℃で保存した。
【００３８】
無作為化及びブラインディング
偽薬（６容器）又はＳＥＱ（９容器）を含有する１５の同一の容器をＡ−１、Ａ−２、Ａ−３、Ｂ−１、Ｂ−２、Ｂ−３、Ｃ−１、Ｃ−２、Ｃ−３、Ｄ−１、Ｄ−２、Ｄ−３、Ｅ−１、Ｅ−２又はＥ−３と標識した；包含評価を上手く完了しているウマを無作為に割り振って、ＳＥＱ（４２日間１日当たり２１ｇの仕上げ産物；ｎ＝９）又は活性のない偽薬（キイチゴと糖蜜の味をつけた米糠；４２日間１日当たり２１ｇの仕上げ産物；ｎ＝６）のいずれかを服用させた。
【００３９】
同時薬物療法
主治医である獣医の推奨でのみ、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）による試験ウマの歩行困難の治療が許可された。ウマに投与された薬剤の詳細をすべて記録した。主治医である獣医の推奨でのみ、試験に関係ない病気又は負傷の治療が許可された。使用した薬剤の抗炎症性はないという条件で、治療持続時間に限定はなかった。
【００４０】
プロトコール
１４１ｐｇ／ｍＬのＰＧＥ2についての標準偏差を用いた分析試験の検出力を用いて動物の数を計算した。高い測定精度の感度の高いマーカーであることから、他のマーカーを使用する際につきものの測定の変動性を減らすので、測定された炎症マーカーの中からＰＧＥ2を選択した。さらに、我々の以前のＳＥＱによる試験管内及び生体内での試験において我々は、ＰＧＥ2の有意な阻害を経験している。一次従属変数としてのＰＧＥ2の使用は、０．８の検出力でｐ＜０．０５にて平均値間のｓ２５０ｐｇ／ｍＬの最小差異の検出を可能にする。この実験には群当たり最低６頭の動物が必要とされる。
【００４１】
６頭のウマを偽薬対照群に入れ、９頭のウマをＳＥＱ処理群に入れて合計ウマは１５頭であった。
【００４２】
包含評価（上記包含評価を参照のこと）を上手く完了している１５頭のウマを動員した。９頭は、ＳＥＱ（２１ｇ／日）（分析は３．３ｇ／１００ｇのω３脂肪酸、２０９３ｍｇ／１００ｇのＡＬＡ、６０５ｍｇ／１００ｇのＥＰＡ、３９７ｍｇ／１００ｇのＤＨＡを示す）を１日１回投与され、６頭は、活性のない偽薬（２１ｇ／日）を４２日間投与された（上記の無作為化及びブラインディングを参照のこと）。ウマは試験全体を通してその名前で識別された。参加者の機密保持を保護するために報告目的で名前を番号に変換した。
【００４３】
ベースラインデータの収集：全米馬臨床獣医協会のプロトコール（ＡＡＥＰ）を利用して早足での歩行困難をスコア化し、屈曲試験を行った。伸縮テープによって関節周囲を測定した。
【００４４】
一般麻酔のもとでの破片骨折の外科的除去の間に滑液を無菌的に吸引し、ヘパリンを被覆したバキュテナーに入れ、直ちに冷蔵した（４℃）。その後、前に記載したように滑液を遠心し、分析まで上清を−８０℃で凍結した。
【００４５】
４２日目にコンプライアンスを判定し、少なくとも２つの視野から冒された関節のＸ線写真を撮った。早足での歩行困難（ＡＡＥＰ）とその後の屈曲試験を等級化し、伸縮テープを用いて関節周囲を測定した。冒された関節の表面を無菌的に準備し、無菌の２２ゲージの針を挿入した。無菌の３ｃｃの注射筒を針基に取り付け、およそ１ｍＬの滑液を吸引し、無菌のヘパリン被覆のバキュテナー管に回収した。バキュテナーを氷上に置いた。その後、滑液を遠心し、ＰＧＥ2、ＮＯ及びＧＡＧの分析まで−８０℃に保存した。
【００４６】
滑液の生体マーカー
ＰＧＥ2
ＥＬＩＳＡキット（カナダ、オンタリオ州、バーリントンのＲ＆Ｄシステムズ、セデリアンラボラトリーズ）の一部として提供された希釈緩衝液で滑液を１：５に希釈した。次いで、キットのプロトコールに従ってＰＧＥ2を定量した。ヒツジ抗マウスＰＧＥ2抗体でＥＬＩＳＡキットのマイクロタイタープレートを被覆した。アラキドン酸誘導体の構造には種間の差異は知られていないので、ウマ試料にもアッセイを適宜応用することができる。ＥＬＸ８００ユニバーサルマイクロプレートリーダー（バーモント州、ウイヌスキのバイオテックインスツルメンツ社）を用いて４５０ｎｍに設定した吸収でプレートを読み取った。各プレート（Ｒ2”０．９９）について最もよく適合する３次多項式曲線を作製し、その方程式を用いて各プレートの試料についてＰＧＥ2の濃度を算出した。
【００４７】
ＧＡＧ（グリコサミノグリカン）
１，９−ジメチルメチレンブルー（ＤＭＢ）分光光度アッセイを用いて滑液のＧＡＧ濃度を直接決定した。１，９−ＤＭＢ（４ｍｇ）を１００％のエタノール（１．２５ｍＬ）に溶解し、蟻酸ナトリウム（０．５ｇ）及び蟻酸（０．５ｍＬ）と混ぜ合わせ、次いで２回蒸留した水（ｄｄＨ2Ｏ）で２５０ｍＬにした（ｐＨ６．５；ＤＭＢ試薬）。希釈緩衝液（４．１ｍｇの酢酸ナトリウムと０．５μＬのツイーン２０／ｍＬｄｄＨ2Ｏ）で試料を１：３に希釈し、９６穴マイクロタイタープレートに入れた。各ウエルに塩酸グアニジン（ｄｄＨ2Ｏ中２７５ｇ／Ｌ）を加え、その後直ちに１５０μＬのＤＭＢ試薬を加えた。プレートを暗所で１０分間インキュベートし、５３０ｎｍで吸収を読み取った。ウシの硫酸コンドロイチンの標準と試料の吸収を比較した。最も適合する線形の検量線を各プレート（Ｒ2＞０．９９）について生成し、その方程式を用いて各プレートの試料についてＧＡＧの濃度を算出した。
【００４８】
ＮＯ
ＮＯの安定な酸化生成物である亜硝酸塩（ＮＯ2-）をグリース反応によって分析した。未希釈の滑液試料を９６穴プレートに加えた。リン酸（０．０８５ｇ／Ｌ）に溶解したスルファニルアミド（０．０１ｇ／ｍＬ）とＮ−（１）−ナフチルエチレンジアミン塩酸塩（１ｍｇ／ｍＬ）を全ウエルに加え、５分以内に５３０ｎｍで吸収を読み取った。試料の吸収を亜硝酸ナトリウム標準と比較した。
【００４９】
統計学
実験単位は冒された関節なので、ウマが複数の関節で関節炎を呈する場合、各関節からの試料を別個の単位として分析し、処理した。データは平均値±ＳＥＭで表す。データの統計学的解析は、反復測定二元配置分散分析(ANOVA)（時間と処理に関して）を用いて行い、有意性はｐ＜０．０５に設定した。結果は統計学的に検出力を設定して（０．８）、１４１ｐｇ／ｍＬの集団標準偏差を想定して２５０ｐｇ／ｍＬのＰＧＥ2の最小差異を検出した。
【００５０】
結果
実験コホート
試験は２００８年１１月から２０１０年１月にかけて行われた。１３頭のウマが試験を完了した（ｎ＝７がＳＥＱ；ｎ＝６がＣＯＮ）（「ＣＯＮ」は対照の、活性のない偽薬を意味する）。表１は実験用ウマの説明を提供する。１１頭は競技用のアメリカクオーターホース（（ｎ＝６がＳＥＱ；ｎ＝５がＣＯＮ）であり、２頭は競技用スタンダードブレッドであった（ｎ＝１がＳＥＱ；ｎ＝１がＣＯＮ）。経過観察中に失われたウマのデータは分析に含めなかった。分析は、７頭のＳＥＱウマ（関節：ｎ＝１４）及び６頭の対照ウマ（関節：ｎ＝１０）で行った。
【００５１】
【表１】
【００５２】
同時薬物療法
試験中のいかなるときも、又は試験に加わる前２週間でも全身性、又は関節内での薬物療法を受けた試験ウマはいなかった。試験中、又は試験に加わる前２週間に「ほかの薬剤」又は栄養補給／ハーブ補完物は与えなかった。
【００５３】
手術前、７頭は、パドックで休憩中であり（ｎ＝４がＳＥＱ；ｎ＝３がＣＯＮ）、５頭は通常の訓練スケジュールを維持し（ｎ＝３がＳＥＱ；ｎ＝２がＣＯＮ）、１頭は馬小屋で休憩中だった（ｎ＝１がＣＯＮ）。術後、ウマはすべて１２日間馬小屋で休み、その後４〜６週間、手綱を持って歩かせた。
【００５４】
管理及び食事
試験を完了している１３頭のうち１０頭は２人の調教師によって提示された。調教師Ａは３頭（ｎ＝２がＳＥＱ；ｎ＝１がＣＯＮ）を提供し、調教師Ｂは７頭（ｎ＝４がＳＥＱ；ｎ＝３がＣＯＮ）を提供した。これは、ウマが管理される条件を標準化するのに役立った。これらのウマの飼料は、穀物餌なしで調教師Ｂから干し草のみを与えられた２頭（ｎ＝１がＳＥＱ；ｎ＝１がＣＯＮ）を除いて、各訓練場で一貫していた。
【００５５】
滑液の生体マーカー
ＰＧＥ2の濃度はベースラインではＣＯＮとＳＥＱの間で差異はなかった（ＣＯＮ：５６３．２±５８．６ｐｇ／ｍＬ；ＳＥＱ：６４７．７±８１．９ｐｇ／ｍＬ;ｐ＝０．４）。４２日目では、ＣＯＮのＰＧＥ2は変化しなかった（４８０．３±６６．９ｐｇ／ｍＬ；ｐ＝０．３）が、ＳＥＱのウマはＰＧＥ2の有意な低下を示した（４１８．０±３１．９ｐｇ／ｍＬ；ｐ＝０．０３）（図１）。
【００５６】
ＧＡＧ
滑液ＧＡＧは、ベースラインにてＣＯＮのウマの方が（２６．２±１．４μｇ／ｍＬ）ＳＥＱのウマ（２２．７±１．０μｇ／ｍＬ）よりも有意に高かった（ｐ＝０．０５）。２元分析は、４２日目までの滑液ＧＡＧにおける有意な低下を検出した（ｐ＝０．０２）が、２つの処理群は互いに差異はなかった（ｐ＝０．３）（図２）。
【００５７】
臨床的な転帰の測定
動員された１５頭のウマはすべて、Ｘ線写真又は手術又はその両方によって、橈骨手根骨の、手根骨間の及び／又は中手指節の関節表面での破片骨折片と診断された。ベースライン又は経過観察中の外科的な及びＸ線写真による知見を表１に提供する。
【００５８】
軽い関節炎は１１の関節で外科的に診断され（ＣＯＮ：ｎ＝５；ＳＥＱ：ｎ＝６）、中程度の関節炎は２つの関節で外科的に診断された（ＣＯＮ：ｎ＝２）。関節炎の外科的知見には５つにすぎない関節のＸ線での兆候が伴った（ＣＯＮ：ｎ＝２；ＳＥＱ：ｎ＝３）。経過観察で破片骨折片の持続する証拠がないことを除いて、４２日の経過観察でＣＯＮ又はＳＥＱのいずれかでの関節炎のＸ線による兆候に有意な変化はなかった(表１）。
【００５９】
関節周囲の平均値はベースラインでＣＯＮ（２７．７±０．９８ｃｍ）とＳＥＱ（２７．６±０．８０ｃｍ）の間に差異はなかった。ベースラインに比べて４２日では、関節周囲はＣＯＮ（２９．０±０．１０ｃｍ）及びＳＥＱ（２９．９±０．６８ｃｍ）の双方で有意に増大したが、群は互いに差異はなかった（ｐ＝０．９）。
【００６０】
歩行困難（すなわち、ＡＡＥＰ歩行困難等級＞０）は６つの関節で検出された（ＣＯＮ：ｎ＝３；ＳＥＱ：ｎ＝３）。経過観察でのウマすべてで歩行困難は完全に解消した。３つの関節が経過観察で屈曲試験陽性とスコア化した（ＣＯＮ：ｎ＝１；ＳＥＱ：ｎ＝２）。
【００６１】
考察
上記の実験は、今まで認められていない、または知られていない変形性関節症のウマで炎症性の生体マーカーを調節するＳＥＱの能力について新しい情報を提供した。これは、ＳＥＱが滑液ＰＧＥ2の既存の上昇に対して治療効果も有することを明らかにした。この仕事の結果は、全く卓越しているとみなされる。また、ＢＯの種子からの抽出物である既知の化合物の新しい使用を結果的に生じる。
【００６２】
関節炎の発症の間に、及び既存の関節炎の進行の間にＰＧＥ2が産生されるメカニズムは多角的であるが、高度に保存されている。
【００６３】
ＳＥＱでのＢＯの使用は、滑液ＰＧＥ2の阻害を介して関節炎の発症からの保護を提供し、同じ過程を介して既存の関節炎に対して治療効果を提供するということが、おそらく予測できる。記載したようなこの方法でのＢＯの使用は、ＳＥＱで治療されたウマにおいて骨軟骨破片の外科的除去後４２日で、この使用が無ければ期待できなかった滑液ＰＧＥ2の有意な低下を生じ；低下は、手術のみで治療された対照ウマでは見られなかった。
【００６４】
滑液ＮＯは、手術のみによっても、又は手術に次いでＳＥＱによる補完によっても現在の試験では低下しなかった。これは、ＩＬ−１（インターロイキン−１）誘導のＮＯ産生に対するＳＥＱの阻害効果を明瞭に明らかにした以前の試験管内の研究とは矛盾する。このことは、試験管内のＮＯのピーク濃度（約１．３μｇ／ｍＬ）が現在の試験のＮＯのピーク濃度（約０．６μｇ／ｍＬ）より２倍より多いからかも知れない。ＳＥＱは試験管内で、ＩＬ−１誘導のＮＯを現在の試験のＮＯのピーク濃度に類似する約０．６μｇ／ｍＬに低下させた。
【００６５】
ＳＥＱは、主として関節内のＰＧＥ2の高いレベルの抑制を介して関節炎に罹ったウマに対して有効な治療活性を提供すると、本試験から結論付けられる。
【００６６】
以降の記載において、以下の略称が用いられる。
ＢＬsim ：ブランク擬似消化物
ＢＯsim ：Ｂｉｏｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓの擬似消化物
ＤＮsim ：Ｂｉｏｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ栄養補助食品の擬似消化物
ＩＮＤＯsim：インドメタシンの擬似消化物
【００６７】
研究のため、７２時間培養時点で集められたサンプルを予備刺激ベースラインサンプルと考えた。移植片のＩＬ−１での処理を開始し、媒体のサンプルは２４時間（培養時間９６時間）および４８時間（培養時間１２０時間）に評価のため集めた。これらの時点を、サンプルを10 ng/mLまたは0 ng/mL（すなわち、刺激なし）のいずれで処理したかにかかわらず、刺激後、２４時間および４８時間と呼んだ。
【００６８】
ｍＰＧＥ2 濃度
刺激されていない対照サンプルでの知見と比較して、ＩＬ−１（10 ng/mL）での刺激はＢＬsim で処理された移植片で、２４時間後(419.4 ± 68.1 pg/mL vs 844.2 + 102.Tpg/mL;)および４８時間後(363.0 ± 43.5 pg/mL vs 600.4 + 36.8 pg/ mL)、ｍＰＧＥ2 濃度を顕著に増加させた。刺激されていない移植片ではＢＯsim のｍＰＧＥ2 濃度に対する効果はなかった。ＩＬ−１で刺激された移植片では、ＢＯsim (0.06 and 0.18 mg/mL)はｍＰＧＥ2 濃度を刺激された対照の移植片と比較して、２４時間の時点で減少させた(それぞれ398.8 ± 207.8 pg/ mL および427.5 ± 91.5 pg/mL)。
【００６９】
移植片をＩＮＤＯsimで調整すると、全ての時点で刺激された移植片と刺激されていない移植片とにおいて、mPGE2の放出が顕著に阻害された。ＤＮsim (0.06および 0.18 mg/mL)で処理すると、ＩＬ−１に誘導されたＰＧＥ2の放出は全ての時点で顕著に阻害された；ｍＰＧＥ2 濃度は刺激されていない移植片においてＤＮsim (0.06および 0.18 mg/mL)で調整された移植片において、顕著に低かった。ＩＬ−１で処理された、ベースラインならびに刺激後２４時間および４８時間の移植片において、ＤＮsimによるＰＧＥ2の放出の阻害は、ＩＮＤＯsimに関連する阻害と同程度であった。 0.06 mgのDNsim /mLで調整された刺激されていない移植片のｍＰＧＥ2 濃度は２４時間および４８時間の時点でＩＮＤＯsimで調整した移植片での濃度と異ならなかった。0.18 mgのDNsim /mLで調整された刺激されていない移植片でのｍＰＧＥ2 濃度は全ての時点で、ＩＮＤＯsimで調整した移植片での濃度と異ならなかった。
【００７０】
ｍＧＡＧ 濃度
刺激されていない対照サンプルおよび刺激された対照サンプル（すなわち、ＢＬsim で調整されたサンプル）での予備刺激ベースラインｍＧＡＧ濃度（培養72時間）は異ならなかった(126.3 ± 9.3 μg/mL vs 142.1 ± 15.8 (μg/mL)。ＢＬsimで処理された刺激されていない移植片における知見と比較して、ＩＬ−１(10μg/mL)での刺激は24時間 (75.5 ± 6.5 (μg/mL vs 169.9 + 18.6μg/mL)および48時間(55.65 ± 2.9μg/ mL vs 120.1 ± 9.8μg/mL)において、ｍＧＡＧ濃度を顕著に増加させた。ＢＯsim および ＤＮsim (0.06 mg/mL)で、ＩＬ−１で刺激された移植片を調整すると、対応する予備刺激ベースライン値と比較して、ｍＧＡＧ濃度が顕著に増加する結果となった（刺激された対照移植片では見られなかった増加）。しかし、これら２つの処理群におけるｍＧＡＧ濃度はどの時点においても、刺激された対照移植片における濃度と異ならなかった。ＢＯsim 、ＩＮＤＯsim、または0.18 mgのDNsim /mLでの処理の、ＩＬ−１で刺激された移植片からのmGAG 濃度への効果はなかった。
【００７１】
刺激されていない移植片のＩＮＤＯsimでの調整により、刺激されていない対照移植片における知見と比較して、ｍＧＡＧ濃度が、刺激期間の開始後24時間(175.7 + 15.5μg/mL)および48時間(133.1 ± 18.1μg/mL)で顕著に高くなる結果となった。ＢＯsim、またはＤＮsim(0.06 and 0.18 mg/mL)の、刺激されていない移植片におけるｍＧＡＧ濃度への効果はなかった。
【００７２】
ｍＮＯ濃度
刺激されていない対照移植片での知見と比較して、ｍＮＯ濃度は、24時間 (0.28 ± 0.04μg/mL vs 1.26 ± 0.13(μg/mL)および48時間(0.19 ± 0.04μg/mL vs 1.04 ± 0.08μg/mL)の間ＩＬ−１(10 ng/mL)で刺激した後の対照移植片において顕著に増加していた。
【００７３】
対照移植片での知見と比較して、移植片をＩＮＤＯsimで調整することにより、刺激条件および無刺激条件の双方で、ベースライン、および、刺激期間の開始後24時間でｍＮＯ濃度が顕著に増加する結果となった。刺激された対照移植片と比較して、ＤＮsimはＩＬ−１で刺激された移植片のmNO 濃度を、24時間(0.06 および 0.18 mg のDNsim/mLそれぞれにつ、 0.91 +0.11μg/mL および 0.92 + 0.10μg/mL)および48時間(0.06 および 0.18 mg の DNsim/mLそれぞれにつき、0.61 ± 0.10μg/mL and 0.58 + 0.09μg/mL)で顕著に減少させた。
刺激されていない移植片をＤＮsimで調整すると24時間刺激時点(0.06 および 0.18 mg の DNsim/mLそれぞれにつき、0.66 ± 0.18μg/mL および0.67 + 0.14μg/mL)においてｍＮＯ濃度を刺激されていない対照での知見と比較して、顕著に増加させた。ＢＯBim (0.06 or 0.18 mg/mL)での調整は、ＩＬ−１で刺激されたまたは刺激されていない移植片でのＮＯ産生に影を与えなかった。
【００７４】
細胞生存
ＩＮＤＯsimの存在下または非存在下で、ＩＬ−１刺激(10 ng/mL)の細胞生存に対する刺激として顕著なものはなかった。濃度0.18 mg/mLで、ＤＮsim および ＢＯsim のそれぞれは、刺激された対照移植片での効果と比較して、ＩＬ−１で刺激された移植片で細胞生存において顕著な増加という結果をもたらした。濃度0.06 mg/mLで、細胞生存に対するＤＮsim またはＢＯsimの効果はなかった。
【００７５】
考察
上記の結果はＢＯsimおよびＤＮsimが、細胞生存や軟骨細胞の代謝に悪影響を与えることなく、関節軟骨移植片の外因性ＩＬ−１への応答を調節していることを示しており、ＢＯ種子からの油は軟骨移植片によるＩＬ−１依存性ＰＧＥ2産生を部分的に阻害する。
ＤＮsim (すなわち、ＮＺＧＬＭ, サメ軟骨, アワビ, および ＢＯ)の不均一な組成は、同容量での個々の成分のみの効果と比較して、ＮＯ−およびＰＧＥ2-阻害特性を顕著に改善するという結果となった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は軟骨の劣化の治療のための医薬に関する。また、本発明は一般に、栄養補給組成物、並びに既存の炎症、又は炎症に関連した障害及び特に既存の軟骨損傷の治療におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
知識についての文書、活動又は項目が参照され、議論される本明細書では、この参照又は議論は、知識についての文書、活動又は項目又はそれらの組み合わせが、優先日に、共通する一般的知識の一部であった、又は本明細書が関係する課題を解決する試みに関連すると知られていたという承認ではない。
【０００３】
軟骨の劣化はすべての脊椎動物を悩ませる問題である。
【０００４】
軟骨は骨の関節表面に位置する滑らかな結合組織であり、骨を支え、保護する。軟骨が損傷を受けると、関節はもはや正常には機能できず、軟骨の表面は薄化し、水を保持する能力を失い、軟骨自体に現れる亀裂によって劣化する。時間をかけて軟骨の弾性は低下し、負傷や損傷にさらに感受性になる。進行性の喪失は結果的に特定の点での骨と骨の接触を生じることができ、それは、極めて痛く、関節を成す関節が正常に機能するのを妨げる。
【０００５】
ＮＳＡＩＤは、鎮痛の形態として関節の炎症の治療に長い間使用されている。しかしながら、報告されている合併症及び有害反応のために、多数のＮＳＡＩＤの連続した使用に対する抵抗がある。
【０００６】
今まで、軟骨劣化の治療のための医薬の調製におけるコノテガシワ（ＢＯ［Ｂｉｏｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ］）の種子抽出物の使用は完全には割り出されていなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は軟骨の劣化の治療のための医薬を提供することである。また、本発明の目的は、既存の炎症又は炎症に関連した障害の治療のための、Ｂｉｏｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓからの抽出物の使用を提供することである。
【０００８】
本発明のさらなる目的は、既存の炎症又は炎症に関連した障害の治療における軟骨形成の刺激のために栄養補給組成物を提供することである。
【０００９】
本発明の目的は、従来技術の短所及び欠点を克服すること、又は少なくとも実質的に改善することである。
【００１０】
本発明のそのほかの目的及び利点は、添付の図面と関連して以下の記載から明らかになるであろうが、その際、説明及び例示の目的で、本発明の実施態様が開示される。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の第１の態様では、これは決して本発明を限定すると理解されるべきではないが、軟骨の劣化の治療に使用される医薬の製造におけるＢｉｏｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓからの抽出物の使用であって、前記の治療における使用が前記医薬による軟骨細胞の増殖の刺激を介して軟骨の成長又は修復を刺激することを含むことを特徴とする使用が提供される。
【００１２】
好ましくは、前記の軟骨の劣化は、滑液のＰＧＥ2（プロスタグランジンＥ2）のレベルの上昇を特徴とし、それは軟骨劣化の既存の症状と関連する。
【００１３】
実施態様の１つでは、前記医薬は、治療上の量のＢ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓからの抽出物を含み、さらに、たとえば、ペルナイガイ抽出物、アワビ抽出物又は粉末、サメ軟骨粉末、コンドロイチン又はこれらの組み合わせのような追加の抽出物を含むことができる。
【００１４】
好ましくは、前記抽出物は、Ｂ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓの種子からの抽出物である。
【００１５】
好ましくは、前記使用はさらに、前記治療が予防的治療であることを特徴とする。
【００１６】
好ましくは、前記使用はさらに、前記の軟骨の劣化が滑液のＰＧＥ2のレベルの上昇を特徴とすることを特徴とする。
【００１７】
好ましくは、前記使用はさらに、前記医薬がペルナイガイ抽出物、アワビ抽出物又は粉末又はこれらの組み合わせのような追加の抽出物を含むことを特徴とする。
【００１８】
好ましくは、前記使用はさらに、前記医薬がサメ軟骨粉末を含むことを特徴とする。
【００１９】
好ましくは、前記使用はさらに、前記医薬がコンドロイチンを含むことを特徴とする。
【００２０】
好ましくは、前記使用はさらに、前記コンドロイチンが硫酸コンドロイチンであることを特徴とする。
【００２１】
好ましくは、前記使用はさらに、前記コンドロイチンが海洋性のコンドロイチンであることを特徴とする。
【００２２】
好ましくは、前記使用はさらに、Ｂｉｏｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓからの前記抽出物がＢｉｏｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓの種子からの抽出物であることを特徴とする。
【００２３】
さらなる実施態様では、Ｂｉｏｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓからの抽出物を含む、滑液のＰＧＥ2のレベルの上昇に特徴付けられる既存の軟骨劣化を治療するための薬剤が記載される。
【００２４】
好ましくは、前記抽出物は軟骨細胞の増殖を刺激する。
【００２５】
好ましくは、前記抽出物は、Ｂｉｏｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓの種子からの抽出物である。
【００２６】
例証として、添付の図面を参照して、以下で本発明の運用がさらに完全に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、対照（ｎ＝５）とＳａｓｈａ’ｓＥＱ（ＳＥＱ；ｎ＝１０）のウマにおける滑液ＰＧＥ2（ｐｇ／ｍＬ）である。ウマは０日目に手根骨間の及び／又は橈骨手根骨の断片の外科的除去を受け、手術後４２日間、割り振られた栄養補助食品を服用した。＊はベースラインからの有意な変化を示す。
【図２】図２は、対照（ｎ＝５）とＳａｓｈａ’ｓＥＱ（ＳＥＱ；ｎ＝１０）のウマにおける滑液ＧＡＧ（μｇ／ｍＬ）である。ウマは０日目に手根骨間の及び／又は橈骨手根骨の断片の外科的除去を受け、手術後４２日間、割り振られた栄養補助食品を服用した。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明の理解を円滑にするために、種々の用語及び略語を使用し、以下で定義する。
【００２９】
「ＳＥＱ」は、ニュージーランド緑イガイ又はペルナイガイと、アワビと、サメ軟骨粉末とコノテガシワ油の混合物を意味する。
【００３０】
「ＢＯ」は、Ｂｉｏｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓの種子から抽出されたコノテガシワ油を意味する。
【００３１】
「ＮＺＧＬＭ」は、ニュージーランド緑イガイ又はペルナイガイを意味する。
【００３２】
Ｂｉｏｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ（「コノテガシワ」）は、中国西部及び北朝鮮に自生するハーブであり、Ｔｈｕｊａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ、Ｐｌａｔｙｃｌａｄｕｓ ｓｔｒｉｃｔａ及びＰｌａｔｙｃｌａｄｕｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓのような多数の別名で知られている。コノテガシワは、５０の基本的なハーブの１つとして漢方では非常に価値がある（Duke and Ayensu 1985：Duke JA, Ayensu ES. Medicinal plants of China. Algonac, Mich: Reference Publications Inc, 1985）。従来からそれは、下剤、鎮痛剤及び鎮静剤として使用されている（Duke and Ayensu 1985）。
【００３３】
サメ軟骨とＮＺＧＬＭとアワビの擬似消化物は、ＰＧＥ2（プロスタグランジンＥ2）、ＧＡＧ及び／又は一酸化窒素を低下させることによって関節炎の軟骨外植モデルにて抗炎症効果を有することが以前報告されている（Pearson et al., 2007： Pearson W. in vitro and in vivo methods to evaluate putative anti-inflammatory nutraceuticals. PhD Thesis, Department of Biomedical Science, Ontario Veterinary College, University of Guelph, Guelph, ON Canada, 2007）。
【００３４】
方法
ＡＨ手順は、グェルフ（Ｇｕｅｌｐｈ）大学動物管理委員会によって評価され、認可され、カナダ動物管理協議会の指針に従った。
【００３５】
包含基準
ウマ所有者のインフォームドコンセント：オス又は非妊娠メス；３〜１５歳の間；体重４５０〜５５０ｋｇの間；関節鏡視下手術にて判定された手根骨間の、橈骨手根骨の及び／又は中手指節の関節に位置する軽い〜中程度の関節炎；試験に入る前２週間以内に非ステロイド性抗炎症剤又はコルチコステロイド（全身性又は関節内）を日常的に服用していない。
【００３６】
除外基準
３を超える歩行困難等級（ＡＡＥＰ尺度）；滑液ＰＥＧ2濃度＜２００ｐｇ／ｍＬ；日常的な非ステロイド性抗炎症剤を止めるのに気乗りしないウマ所有者；冒された手根骨間の、橈骨手根骨の及び／又は中手指節の関節における関節炎のＸ線による又は肉眼での手術の証拠がないこと、又は手術中に確認される破片骨折片がないこと。骨軟骨破片とその後の関節炎病変の発症の間の関係のために、関節炎の外科的又はＸ線による兆候のない破片骨折片のあるウマは保持された。
【００３７】
包含評価
包含基準を満たすウマの所有者のインフォームドコンセントを受け取った際、包含評価を行った。主治医である獣医によって歩行困難等級と屈曲試験が評価された。少なくとも２つの視野から冒された関節のＸ線写真を撮った。手術中にベースラインの滑液試料を取った。経過観察中の滑液試料は無菌関節穿刺によって得た。簡単に言えば、冒された関節の表面を無菌的に準備し、無菌の２１ゲージの１インチの針を冒された関節に挿入し、無菌の３ｃｃの注射筒を針基に取り付け、およそ１．５ｃｃの滑液を吸引した。１０μｇのインドメタシンを含有する無菌のバキュテナーに滑液試料を直ちに注入し、氷上に置いた。次いで滑液を遠心（１５００×ｇ、１５分間）し、細胞残渣を除いた。細胞沈殿物を取り除き、ＰＧＥ2（ＥＬＩＳＡ）、一酸化窒素（ＮＯ；グリース反応）及びグリコサミノグリカン（ＧＡＧ；ジメチルメチレンブルー分光分析アッセイ）についての分析まで残りの上清を−８０℃で保存した。
【００３８】
無作為化及びブラインディング
偽薬（６容器）又はＳＥＱ（９容器）を含有する１５の同一の容器をＡ−１、Ａ−２、Ａ−３、Ｂ−１、Ｂ−２、Ｂ−３、Ｃ−１、Ｃ−２、Ｃ−３、Ｄ−１、Ｄ−２、Ｄ−３、Ｅ−１、Ｅ−２又はＥ−３と標識した；包含評価を上手く完了しているウマを無作為に割り振って、ＳＥＱ（４２日間１日当たり２１ｇの仕上げ産物；ｎ＝９）又は活性のない偽薬（キイチゴと糖蜜の味をつけた米糠；４２日間１日当たり２１ｇの仕上げ産物；ｎ＝６）のいずれかを服用させた。
【００３９】
同時薬物療法
主治医である獣医の推奨でのみ、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）による試験ウマの歩行困難の治療が許可された。ウマに投与された薬剤の詳細をすべて記録した。主治医である獣医の推奨でのみ、試験に関係ない病気又は負傷の治療が許可された。使用した薬剤の抗炎症性はないという条件で、治療持続時間に限定はなかった。
【００４０】
プロトコール
１４１ｐｇ／ｍＬのＰＧＥ2についての標準偏差を用いた分析試験の検出力を用いて動物の数を計算した。高い測定精度の感度の高いマーカーであることから、他のマーカーを使用する際につきものの測定の変動性を減らすので、測定された炎症マーカーの中からＰＧＥ2を選択した。さらに、我々の以前のＳＥＱによる試験管内及び生体内での試験において我々は、ＰＧＥ2の有意な阻害を経験している。一次従属変数としてのＰＧＥ2の使用は、０．８の検出力でｐ＜０．０５にて平均値間のｓ２５０ｐｇ／ｍＬの最小差異の検出を可能にする。この実験には群当たり最低６頭の動物が必要とされる。
【００４１】
６頭のウマを偽薬対照群に入れ、９頭のウマをＳＥＱ処理群に入れて合計ウマは１５頭であった。
【００４２】
包含評価（上記包含評価を参照のこと）を上手く完了している１５頭のウマを動員した。９頭は、ＳＥＱ（２１ｇ／日）（分析は３．３ｇ／１００ｇのω３脂肪酸、２０９３ｍｇ／１００ｇのＡＬＡ、６０５ｍｇ／１００ｇのＥＰＡ、３９７ｍｇ／１００ｇのＤＨＡを示す）を１日１回投与され、６頭は、活性のない偽薬（２１ｇ／日）を４２日間投与された（上記の無作為化及びブラインディングを参照のこと）。ウマは試験全体を通してその名前で識別された。参加者の機密保持を保護するために報告目的で名前を番号に変換した。
【００４３】
ベースラインデータの収集：全米馬臨床獣医協会のプロトコール（ＡＡＥＰ）を利用して早足での歩行困難をスコア化し、屈曲試験を行った。伸縮テープによって関節周囲を測定した。
【００４４】
一般麻酔のもとでの破片骨折の外科的除去の間に滑液を無菌的に吸引し、ヘパリンを被覆したバキュテナーに入れ、直ちに冷蔵した（４℃）。その後、前に記載したように滑液を遠心し、分析まで上清を−８０℃で凍結した。
【００４５】
４２日目にコンプライアンスを判定し、少なくとも２つの視野から冒された関節のＸ線写真を撮った。早足での歩行困難（ＡＡＥＰ）とその後の屈曲試験を等級化し、伸縮テープを用いて関節周囲を測定した。冒された関節の表面を無菌的に準備し、無菌の２２ゲージの針を挿入した。無菌の３ｃｃの注射筒を針基に取り付け、およそ１ｍＬの滑液を吸引し、無菌のヘパリン被覆のバキュテナー管に回収した。バキュテナーを氷上に置いた。その後、滑液を遠心し、ＰＧＥ2、ＮＯ及びＧＡＧの分析まで−８０℃に保存した。
【００４６】
滑液の生体マーカー
ＰＧＥ2
ＥＬＩＳＡキット（カナダ、オンタリオ州、バーリントンのＲ＆Ｄシステムズ、セデリアンラボラトリーズ）の一部として提供された希釈緩衝液で滑液を１：５に希釈した。次いで、キットのプロトコールに従ってＰＧＥ2を定量した。ヒツジ抗マウスＰＧＥ2抗体でＥＬＩＳＡキットのマイクロタイタープレートを被覆した。アラキドン酸誘導体の構造には種間の差異は知られていないので、ウマ試料にもアッセイを適宜応用することができる。ＥＬＸ８００ユニバーサルマイクロプレートリーダー（バーモント州、ウイヌスキのバイオテックインスツルメンツ社）を用いて４５０ｎｍに設定した吸収でプレートを読み取った。各プレート（Ｒ2”０．９９）について最もよく適合する３次多項式曲線を作製し、その方程式を用いて各プレートの試料についてＰＧＥ2の濃度を算出した。
【００４７】
ＧＡＧ（グリコサミノグリカン）
１，９−ジメチルメチレンブルー（ＤＭＢ）分光光度アッセイを用いて滑液のＧＡＧ濃度を直接決定した。１，９−ＤＭＢ（４ｍｇ）を１００％のエタノール（１．２５ｍＬ）に溶解し、蟻酸ナトリウム（０．５ｇ）及び蟻酸（０．５ｍＬ）と混ぜ合わせ、次いで２回蒸留した水（ｄｄＨ2Ｏ）で２５０ｍＬにした（ｐＨ６．５；ＤＭＢ試薬）。希釈緩衝液（４．１ｍｇの酢酸ナトリウムと０．５μＬのツイーン２０／ｍＬｄｄＨ2Ｏ）で試料を１：３に希釈し、９６穴マイクロタイタープレートに入れた。各ウエルに塩酸グアニジン（ｄｄＨ2Ｏ中２７５ｇ／Ｌ）を加え、その後直ちに１５０μＬのＤＭＢ試薬を加えた。プレートを暗所で１０分間インキュベートし、５３０ｎｍで吸収を読み取った。ウシの硫酸コンドロイチンの標準と試料の吸収を比較した。最も適合する線形の検量線を各プレート（Ｒ2＞０．９９）について生成し、その方程式を用いて各プレートの試料についてＧＡＧの濃度を算出した。
【００４８】
ＮＯ
ＮＯの安定な酸化生成物である亜硝酸塩（ＮＯ2-）をグリース反応によって分析した。未希釈の滑液試料を９６穴プレートに加えた。リン酸（０．０８５ｇ／Ｌ）に溶解したスルファニルアミド（０．０１ｇ／ｍＬ）とＮ−（１）−ナフチルエチレンジアミン塩酸塩（１ｍｇ／ｍＬ）を全ウエルに加え、５分以内に５３０ｎｍで吸収を読み取った。試料の吸収を亜硝酸ナトリウム標準と比較した。
【００４９】
統計学
実験単位は冒された関節なので、ウマが複数の関節で関節炎を呈する場合、各関節からの試料を別個の単位として分析し、処理した。データは平均値±ＳＥＭで表す。データの統計学的解析は、反復測定二元配置分散分析(ANOVA)（時間と処理に関して）を用いて行い、有意性はｐ＜０．０５に設定した。結果は統計学的に検出力を設定して（０．８）、１４１ｐｇ／ｍＬの集団標準偏差を想定して２５０ｐｇ／ｍＬのＰＧＥ2の最小差異を検出した。
【００５０】
結果
実験コホート
試験は２００８年１１月から２０１０年１月にかけて行われた。１３頭のウマが試験を完了した（ｎ＝７がＳＥＱ；ｎ＝６がＣＯＮ）（「ＣＯＮ」は対照の、活性のない偽薬を意味する）。表１は実験用ウマの説明を提供する。１１頭は競技用のアメリカクオーターホース（（ｎ＝６がＳＥＱ；ｎ＝５がＣＯＮ）であり、２頭は競技用スタンダードブレッドであった（ｎ＝１がＳＥＱ；ｎ＝１がＣＯＮ）。経過観察中に失われたウマのデータは分析に含めなかった。分析は、７頭のＳＥＱウマ（関節：ｎ＝１４）及び６頭の対照ウマ（関節：ｎ＝１０）で行った。
【００５１】
【表１】
【００５２】
同時薬物療法
試験中のいかなるときも、又は試験に加わる前２週間でも全身性、又は関節内での薬物療法を受けた試験ウマはいなかった。試験中、又は試験に加わる前２週間に「ほかの薬剤」又は栄養補給／ハーブ補完物は与えなかった。
【００５３】
手術前、７頭は、パドックで休憩中であり（ｎ＝４がＳＥＱ；ｎ＝３がＣＯＮ）、５頭は通常の訓練スケジュールを維持し（ｎ＝３がＳＥＱ；ｎ＝２がＣＯＮ）、１頭は馬小屋で休憩中だった（ｎ＝１がＣＯＮ）。術後、ウマはすべて１２日間馬小屋で休み、その後４〜６週間、手綱を持って歩かせた。
【００５４】
管理及び食事
試験を完了している１３頭のうち１０頭は２人の調教師によって提示された。調教師Ａは３頭（ｎ＝２がＳＥＱ；ｎ＝１がＣＯＮ）を提供し、調教師Ｂは７頭（ｎ＝４がＳＥＱ；ｎ＝３がＣＯＮ）を提供した。これは、ウマが管理される条件を標準化するのに役立った。これらのウマの飼料は、穀物餌なしで調教師Ｂから干し草のみを与えられた２頭（ｎ＝１がＳＥＱ；ｎ＝１がＣＯＮ）を除いて、各訓練場で一貫していた。
【００５５】
滑液の生体マーカー
ＰＧＥ2の濃度はベースラインではＣＯＮとＳＥＱの間で差異はなかった（ＣＯＮ：５６３．２±５８．６ｐｇ／ｍＬ；ＳＥＱ：６４７．７±８１．９ｐｇ／ｍＬ;ｐ＝０．４）。４２日目では、ＣＯＮのＰＧＥ2は変化しなかった（４８０．３±６６．９ｐｇ／ｍＬ；ｐ＝０．３）が、ＳＥＱのウマはＰＧＥ2の有意な低下を示した（４１８．０±３１．９ｐｇ／ｍＬ；ｐ＝０．０３）（図１）。
【００５６】
ＧＡＧ
滑液ＧＡＧは、ベースラインにてＣＯＮのウマの方が（２６．２±１．４μｇ／ｍＬ）ＳＥＱのウマ（２２．７±１．０μｇ／ｍＬ）よりも有意に高かった（ｐ＝０．０５）。２元分析は、４２日目までの滑液ＧＡＧにおける有意な低下を検出した（ｐ＝０．０２）が、２つの処理群は互いに差異はなかった（ｐ＝０．３）（図２）。
【００５７】
臨床的な転帰の測定
動員された１５頭のウマはすべて、Ｘ線写真又は手術又はその両方によって、橈骨手根骨の、手根骨間の及び／又は中手指節の関節表面での破片骨折片と診断された。ベースライン又は経過観察中の外科的な及びＸ線写真による知見を表１に提供する。
【００５８】
軽い関節炎は１１の関節で外科的に診断され（ＣＯＮ：ｎ＝５；ＳＥＱ：ｎ＝６）、中程度の関節炎は２つの関節で外科的に診断された（ＣＯＮ：ｎ＝２）。関節炎の外科的知見には５つにすぎない関節のＸ線での兆候が伴った（ＣＯＮ：ｎ＝２；ＳＥＱ：ｎ＝３）。経過観察で破片骨折片の持続する証拠がないことを除いて、４２日の経過観察でＣＯＮ又はＳＥＱのいずれかでの関節炎のＸ線による兆候に有意な変化はなかった(表１）。
【００５９】
関節周囲の平均値はベースラインでＣＯＮ（２７．７±０．９８ｃｍ）とＳＥＱ（２７．６±０．８０ｃｍ）の間に差異はなかった。ベースラインに比べて４２日では、関節周囲はＣＯＮ（２９．０±０．１０ｃｍ）及びＳＥＱ（２９．９±０．６８ｃｍ）の双方で有意に増大したが、群は互いに差異はなかった（ｐ＝０．９）。
【００６０】
歩行困難（すなわち、ＡＡＥＰ歩行困難等級＞０）は６つの関節で検出された（ＣＯＮ：ｎ＝３；ＳＥＱ：ｎ＝３）。経過観察でのウマすべてで歩行困難は完全に解消した。３つの関節が経過観察で屈曲試験陽性とスコア化した（ＣＯＮ：ｎ＝１；ＳＥＱ：ｎ＝２）。
【００６１】
考察
上記の実験は、今まで認められていない、または知られていない変形性関節症のウマで炎症性の生体マーカーを調節するＳＥＱの能力について新しい情報を提供した。これは、ＳＥＱが滑液ＰＧＥ2の既存の上昇に対して治療効果も有することを明らかにした。この仕事の結果は、全く卓越しているとみなされる。また、ＢＯの種子からの抽出物である既知の化合物の新しい使用を結果的に生じる。
【００６２】
関節炎の発症の間に、及び既存の関節炎の進行の間にＰＧＥ2が産生されるメカニズムは多角的であるが、高度に保存されている。
【００６３】
ＳＥＱでのＢＯの使用は、滑液ＰＧＥ2の阻害を介して関節炎の発症からの保護を提供し、同じ過程を介して既存の関節炎に対して治療効果を提供するということが、おそらく予測できる。記載したようなこの方法でのＢＯの使用は、ＳＥＱで治療されたウマにおいて骨軟骨破片の外科的除去後４２日で、この使用が無ければ期待できなかった滑液ＰＧＥ2の有意な低下を生じ；低下は、手術のみで治療された対照ウマでは見られなかった。
【００６４】
滑液ＮＯは、手術のみによっても、又は手術に次いでＳＥＱによる補完によっても現在の試験では低下しなかった。これは、ＩＬ−１（インターロイキン−１）誘導のＮＯ産生に対するＳＥＱの阻害効果を明瞭に明らかにした以前の試験管内の研究とは矛盾する。このことは、試験管内のＮＯのピーク濃度（約１．３μｇ／ｍＬ）が現在の試験のＮＯのピーク濃度（約０．６μｇ／ｍＬ）より２倍より多いからかも知れない。ＳＥＱは試験管内で、ＩＬ−１誘導のＮＯを現在の試験のＮＯのピーク濃度に類似する約０．６μｇ／ｍＬに低下させた。
【００６５】
ＳＥＱは、主として関節内のＰＧＥ2の高いレベルの抑制を介して関節炎に罹ったウマに対して有効な治療活性を提供すると、本試験から結論付けられる。
【００６６】
以降の記載において、以下の略称が用いられる。
ＢＬsim ：ブランク擬似消化物
ＢＯsim ：Ｂｉｏｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓの擬似消化物
ＤＮsim ：Ｂｉｏｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ栄養補助食品の擬似消化物
ＩＮＤＯsim：インドメタシンの擬似消化物
【００６７】
研究のため、７２時間培養時点で集められたサンプルを予備刺激ベースラインサンプルと考えた。移植片のＩＬ−１での処理を開始し、媒体のサンプルは２４時間（培養時間９６時間）および４８時間（培養時間１２０時間）に評価のため集めた。これらの時点を、サンプルを10 ng/mLまたは0 ng/mL（すなわち、刺激なし）のいずれで処理したかにかかわらず、刺激後、２４時間および４８時間と呼んだ。
【００６８】
ｍＰＧＥ2 濃度
刺激されていない対照サンプルでの知見と比較して、ＩＬ−１（10 ng/mL）での刺激はＢＬsim で処理された移植片で、２４時間後(419.4 ± 68.1 pg/mL vs 844.2 + 102.Tpg/mL;)および４８時間後(363.0 ± 43.5 pg/mL vs 600.4 + 36.8 pg/ mL)、ｍＰＧＥ2 濃度を顕著に増加させた。刺激されていない移植片ではＢＯsim のｍＰＧＥ2 濃度に対する効果はなかった。ＩＬ−１で刺激された移植片では、ＢＯsim (0.06 and 0.18 mg/mL)はｍＰＧＥ2 濃度を刺激された対照の移植片と比較して、２４時間の時点で減少させた(それぞれ398.8 ± 207.8 pg/ mL および427.5 ± 91.5 pg/mL)。
【００６９】
移植片をＩＮＤＯsimで調整すると、全ての時点で刺激された移植片と刺激されていない移植片とにおいて、mPGE2の放出が顕著に阻害された。ＤＮsim (0.06および 0.18 mg/mL)で処理すると、ＩＬ−１に誘導されたＰＧＥ2の放出は全ての時点で顕著に阻害された；ｍＰＧＥ2 濃度は刺激されていない移植片においてＤＮsim (0.06および 0.18 mg/mL)で調整された移植片において、顕著に低かった。ＩＬ−１で処理された、ベースラインならびに刺激後２４時間および４８時間の移植片において、ＤＮsimによるＰＧＥ2の放出の阻害は、ＩＮＤＯsimに関連する阻害と同程度であった。 0.06 mgのDNsim /mLで調整された刺激されていない移植片のｍＰＧＥ2 濃度は２４時間および４８時間の時点でＩＮＤＯsimで調整した移植片での濃度と異ならなかった。0.18 mgのDNsim /mLで調整された刺激されていない移植片でのｍＰＧＥ2 濃度は全ての時点で、ＩＮＤＯsimで調整した移植片での濃度と異ならなかった。
【００７０】
ｍＧＡＧ 濃度
刺激されていない対照サンプルおよび刺激された対照サンプル（すなわち、ＢＬsim で調整されたサンプル）での予備刺激ベースラインｍＧＡＧ濃度（培養72時間）は異ならなかった(126.3 ± 9.3 μg/mL vs 142.1 ± 15.8 (μg/mL)。ＢＬsimで処理された刺激されていない移植片における知見と比較して、ＩＬ−１(10μg/mL)での刺激は24時間 (75.5 ± 6.5 (μg/mL vs 169.9 + 18.6μg/mL)および48時間(55.65 ± 2.9μg/ mL vs 120.1 ± 9.8μg/mL)において、ｍＧＡＧ濃度を顕著に増加させた。ＢＯsim および ＤＮsim (0.06 mg/mL)で、ＩＬ−１で刺激された移植片を調整すると、対応する予備刺激ベースライン値と比較して、ｍＧＡＧ濃度が顕著に増加する結果となった（刺激された対照移植片では見られなかった増加）。しかし、これら２つの処理群におけるｍＧＡＧ濃度はどの時点においても、刺激された対照移植片における濃度と異ならなかった。ＢＯsim 、ＩＮＤＯsim、または0.18 mgのDNsim /mLでの処理の、ＩＬ−１で刺激された移植片からのmGAG 濃度への効果はなかった。
【００７１】
刺激されていない移植片のＩＮＤＯsimでの調整により、刺激されていない対照移植片における知見と比較して、ｍＧＡＧ濃度が、刺激期間の開始後24時間(175.7 + 15.5μg/mL)および48時間(133.1 ± 18.1μg/mL)で顕著に高くなる結果となった。ＢＯsim、またはＤＮsim(0.06 and 0.18 mg/mL)の、刺激されていない移植片におけるｍＧＡＧ濃度への効果はなかった。
【００７２】
ｍＮＯ濃度
刺激されていない対照移植片での知見と比較して、ｍＮＯ濃度は、24時間 (0.28 ± 0.04μg/mL vs 1.26 ± 0.13(μg/mL)および48時間(0.19 ± 0.04μg/mL vs 1.04 ± 0.08μg/mL)の間ＩＬ−１(10 ng/mL)で刺激した後の対照移植片において顕著に増加していた。
【００７３】
対照移植片での知見と比較して、移植片をＩＮＤＯsimで調整することにより、刺激条件および無刺激条件の双方で、ベースライン、および、刺激期間の開始後24時間でｍＮＯ濃度が顕著に増加する結果となった。刺激された対照移植片と比較して、ＤＮsimはＩＬ−１で刺激された移植片のmNO 濃度を、24時間(0.06 および 0.18 mg のDNsim/mLそれぞれにつ、 0.91 +0.11μg/mL および 0.92 + 0.10μg/mL)および48時間(0.06 および 0.18 mg の DNsim/mLそれぞれにつき、0.61 ± 0.10μg/mL and 0.58 + 0.09μg/mL)で顕著に減少させた。
刺激されていない移植片をＤＮsimで調整すると24時間刺激時点(0.06 および 0.18 mg の DNsim/mLそれぞれにつき、0.66 ± 0.18μg/mL および0.67 + 0.14μg/mL)においてｍＮＯ濃度を刺激されていない対照での知見と比較して、顕著に増加させた。ＢＯBim (0.06 or 0.18 mg/mL)での調整は、ＩＬ−１で刺激されたまたは刺激されていない移植片でのＮＯ産生に影を与えなかった。
【００７４】
細胞生存
ＩＮＤＯsimの存在下または非存在下で、ＩＬ−１刺激(10 ng/mL)の細胞生存に対する刺激として顕著なものはなかった。濃度0.18 mg/mLで、ＤＮsim および ＢＯsim のそれぞれは、刺激された対照移植片での効果と比較して、ＩＬ−１で刺激された移植片で細胞生存において顕著な増加という結果をもたらした。濃度0.06 mg/mLで、細胞生存に対するＤＮsim またはＢＯsimの効果はなかった。
【００７５】
考察
上記の結果はＢＯsimおよびＤＮsimが、細胞生存や軟骨細胞の代謝に悪影響を与えることなく、関節軟骨移植片の外因性ＩＬ−１への応答を調節していることを示しており、ＢＯ種子からの油は軟骨移植片によるＩＬ−１依存性ＰＧＥ2産生を部分的に阻害する。
ＤＮsim (すなわち、ＮＺＧＬＭ, サメ軟骨, アワビ, および ＢＯ)の不均一な組成は、同容量での個々の成分のみの効果と比較して、ＮＯ−およびＰＧＥ2-阻害特性を顕著に改善するという結果となった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
軟骨細胞の増殖の刺激を介して軟骨の成長又は修復を刺激することを含む軟骨の劣化の治療のための、Ｂｉｏｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓからの抽出物を有効成分として含む医薬。
【請求項２】
前記治療が予防的治療である請求項１の医薬。
【請求項３】
前記の軟骨の劣化が滑液のＰＧＥ2のレベルの上昇で特徴づけられる請求項１または２の医薬。
【請求項４】
ペルナイガイ抽出物、アワビ抽出物もしくは粉末、およびこれらの組み合わせから選択される追加の抽出物を含む請求項１〜３のいずれかの医薬。
【請求項５】
サメ軟骨粉末を含む請求項１〜４のいずれかの医薬。
【請求項６】
コンドロイチンを含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれかの医薬。
【請求項７】
前記コンドロイチンが硫酸コンドロイチンである請求項６の医薬。
【請求項８】
前記コンドロイチンが海洋性のコンドロイチンであることを特徴とする請求項７の医薬。
【請求項９】
前記のＢｉｏｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓからの抽出物がＢｉｏｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓの種子からの抽出物である請求項１〜８のいずれかの医薬。
【請求項１】
軟骨細胞の増殖の刺激を介して軟骨の成長又は修復を刺激することを含む軟骨の劣化の治療のための、Ｂｉｏｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓからの抽出物を有効成分として含む医薬。
【請求項２】
前記治療が予防的治療である請求項１の医薬。
【請求項３】
前記の軟骨の劣化が滑液のＰＧＥ2のレベルの上昇で特徴づけられる請求項１または２の医薬。
【請求項４】
ペルナイガイ抽出物、アワビ抽出物もしくは粉末、およびこれらの組み合わせから選択される追加の抽出物を含む請求項１〜３のいずれかの医薬。
【請求項５】
サメ軟骨粉末を含む請求項１〜４のいずれかの医薬。
【請求項６】
コンドロイチンを含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれかの医薬。
【請求項７】
前記コンドロイチンが硫酸コンドロイチンである請求項６の医薬。
【請求項８】
前記コンドロイチンが海洋性のコンドロイチンであることを特徴とする請求項７の医薬。
【請求項９】
前記のＢｉｏｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓからの抽出物がＢｉｏｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓの種子からの抽出物である請求項１〜８のいずれかの医薬。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１２−２０９９９（Ｐ２０１２−２０９９９Ａ）
【公開日】平成２４年２月２日（２０１２．２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１５３４５７（Ｐ２０１１−１５３４５７）
【出願日】平成２３年７月１２日（２０１１．７．１２）
【出願人】（５１１１６９６４５）デイシー テック プロプライエタリー リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年２月２日（２０１２．２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年７月１２日（２０１１．７．１２）
【出願人】（５１１１６９６４５）デイシー テック プロプライエタリー リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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