軟骨の欠損を処置するための可溶性形態形成タンパク質の使用
【課題】軟骨の欠損を処置するための可溶性形態形成タンパク質の使用の提供。
【解決手段】本発明は、可溶性形態形成タンパク質複合体を使用して、軟骨組織を修復および再生する方法であって、（ａ）形態形成タンパク質、および（ｂ）形態形成タンパク質から単離された形態形成タンパク質のプロ領域、あるいはこのプロ領域の保存的置換改変体またはフラグメントを含み、このプロ領域または改変体またはフラグメントが、形態形成タンパク質に非共有結合され、この複合体が、水性溶媒中で、形態形成タンパク質単独より水溶性である方法を提供する。
【解決手段】本発明は、可溶性形態形成タンパク質複合体を使用して、軟骨組織を修復および再生する方法であって、（ａ）形態形成タンパク質、および（ｂ）形態形成タンパク質から単離された形態形成タンパク質のプロ領域、あるいはこのプロ領域の保存的置換改変体またはフラグメントを含み、このプロ領域または改変体またはフラグメントが、形態形成タンパク質に非共有結合され、この複合体が、水性溶媒中で、形態形成タンパク質単独より水溶性である方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、整形外科的組織の修復に関する。より詳細には、本発明は、軟骨の修復または再生方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
軟骨の修復および再生は、現代の整形外科における大きい支障の１つである。変形性関節症、椎間板変性、および半月板破裂などの軟骨の損傷および変性疾患は、米国における成人人口中の能力障害の主な原因であるため、この重要性は非常に大きい。
【０００３】
軟骨は、コラーゲン線維、プロテオグリカン、およびその他の非コラーゲンタンパク質の細胞外マトリクス中に埋め込まれた軟骨細胞から成る結合組織である。軟骨には、関節状および非関節状の２つの形式がある。関節軟骨は、関節内の骨端を被覆する結合組織の薄い層である。非関節軟骨は、線維軟骨および弾性軟骨を含み、椎間板、半月板、気管、咽頭、鼻、耳、および肋骨を含む。
【０００４】
軟骨の機能は、耐荷重性、耐磨耗性を緩和し、関節の殆ど摩擦のない運動を可能にする。多くの場合、外傷、異常な磨耗、または疾病によって生じる軟骨組織の欠損は、疼痛および凝りの原因になる可能性があり、未治療で放置した場合は進行し、最終的に関節全体を交換する必要が生じ得る。たとえば、関節軟骨の欠損は、多くの場合、関節面の早期の変性の原因になり、最終的に骨軟骨の欠損、変形性関節症、またはこの両方を生じ得る。
【０００５】
変形性関節症は、マトリクス成分の合成および破壊間の平衡が妨げられ、異化に向かって変化する際に、損傷した軟骨細胞外マトリクスが修復しようとしているが、徐々に衰えつつあるプロセスであると考えられる。
【０００６】
軟骨組織が自然に再生する能力は、その血液が供給されない性質のために著しく制限される。軟骨組織および下にある骨の両方を含む骨軟骨の欠損の修復は、限られた範囲で行われ、血液および／または髄質によって欠損内にもたらされる幹細胞並びに成長および分化因子の存在によって促進される。動物実験では、これらの欠損は、骨および軟骨の新しい層が形成されて、ある程度修復するが、軟骨マトリクスの巨大分子構成および生化学的性質は不完全である。ＩＩ型コラーゲンではなくＩ型コラーゲン、および軟骨に特有ではないプロテオグリカン、たとえばプロテオグリカンを含むデルマタン硫酸は、修復組織を構成し、時間が経過するにつれて、フィブリル化および退行性変化を生じる。また、軟骨下骨中に浸透しない軟骨の欠損の修復は、たとえ限られた程度でも生じない。
【０００７】
さらに、軟骨欠損の外科的処置は複雑であり、成功はごく限られていることが証明されている。たとえば、関節軟骨の欠損は、関節鏡による方法で処置され、遊離体は創傷清拭されて、線維領域は平滑化される。しかし、この方法だけでは、多くの場合、症状を長期にわたって持続的に緩和することはない。膝代替手術は、相当量の骨を切除する必要があることが多く、複数回の手術を要する場合が多い。
【０００８】
半月板は、緩衝装置として作用する膝関節の内部の骨端間に位置する小さい馬蹄形組織である。各々の膝の内部には、膝の両側に２つの半月板がある。これらの半月板は、一般に、若者の場合は強力であり、加齢とともに脆弱になり、容易に破裂しやすくなる。破裂は、前十字靭帯（ＡＣＬ）の傷害ではきわめて一般的である。関節ヒアリン軟骨などの半月板線維軟骨は、特に中間および血液が供給されない領域では治癒能力は限られている。小さい破裂に対する現在の処置は、大きい問題を生じない場合は破裂を放置することである。半月板破裂に対する外科的処置は、傷害の性質および程度、そして最も重要なことだが、その位置を含む多くの要素によって決まる。高度に血管新生した滑膜と一体化した血管新生領域における破裂は、縫合によって完全に修復されてきた。部分的または全体的な半月板切除は、半月板の血管がない３分の２の範囲内における症候的な破裂には一般的な外科処置である。後者の半月板領域における破裂は、臨床的に最も一般的なタイプである。開放するか、関節鏡を使用するか、全体または部分的な半月板切除を使用するかどうかに関わらず、変形性関節症は、これらの患者の場合、手術後数年以内に再発することが多い。したがって、一般的な修復形式は、破裂部分をごく部分的に除去し、ステープリングによって軟骨を修復することである。残念ながら、この手順の後の治癒過程は遅い。さらに、修復が成功しない場合、全体的に破裂した半月板は、その後除去しなければならない。
【０００９】
持続的で、多くの場合は消耗性の背痛の主な原因は、椎間板（ＩＶＤ）の変性である。椎間板が変性すると、隣接する脊椎が圧迫され、激しい疼痛を生じる場合が多い。
【００１０】
靭帯結合としてのＩＶＤは、隣接する椎体間に関節を提供し、軸方向に加わる脊椎負荷を散逸させる体重負荷クッションとして作用する。これらの生体力学的機能は、中心の水和プロテオグリカン豊富な髄核を囲む外側のコラーゲン豊富な線維輪から成るＩＶＤ特有の構造によって可能になる。上部および下部軟骨性運動終板、つまりヒアリン状軟骨の薄い層は、椎間板内の椎体の接触部分を覆う。
【００１１】
椎間板の変性は、主に腰痛（ＬＢＰ）として顕在する公衆にとって、著しい社会的および経済的負担になる。８０％もの人々が、人生の間にＬＢＰの少なくとも１つの重要な症状を発症し、労働人口の約２．５％が、ＬＢＰの結果、１年間に何日かの病気休暇を取るであろうと概算される。現代の西欧諸国におけるＬＢＰの直接費は、９０億ドルと概算されており、その殆どは、一般開業医、理学療法士、およびその他の従来の施術者の診断に費やされる（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＤＡ等、（１９９８年）Ｈｅａｌｔｈ ｃａｒｅ ａｎｄ ｉｎｄｅｍｎｉｔｙ ｃｏｓｔｓ ａｃｒｏｓｓ ｔｈｅ ｎａｔｕｒａｌ ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｏｃｃｕｐａｔｉｏｎａｌ ｌｏｗ ｂａｃｋ ｐａｉｎ，Ｓｐｉｎｅ ２３：２３２９−３６）。外科的管理を含む全体の間接費は、１０倍高くなり得る（ＭａｅｔｚｅｌおよびＬｉ（２００２年）Ｔｈｅ ｅｃｏｎｏｍｉｃ ｂｕｒｄｅｎ ｏｆ ｂａｃｋ ｐａｉｎ：１９９６年〜２００１年に発行された調査報告書、Ｂｅｓｔ Ｐｒａｃ Ｒｅｓ Ｃｌｉｎ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ １６：２３−３０；Ｗａｌｋｅｒ等、（２００３年）Ｔｈｅ ｅｃｏｎｏｍｉｃ ｂｕｒｄｅｎ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｐｉｎｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ａｕｓｔｒａｌｉａ Ａｎｎｕａｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｍｅｅｔｉｎｇ、オーストラリア、キャンベラ）。
【００１２】
椎間板の変性は、殆どの場合、骨格の成熟から生じる自然現象である（Ｖｅｒｎｏｎ−Ｒｏｂｅｒｔｓ（１９９２）Ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ａｎｄ ｄｅｇｅｎｅｒａｉｖｅ
ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｏｆ ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ ｄｉｓｃｓ ａｎｄ ａｐｏｐｈｙｓｅａｌ ｊｏｉｎｔｓ，Ｉｎ：Ｔｈｅ ｌｕｍｂａｒ ｓｐｉｎｅ ａｎｄ
ｂａｃｋ ｐａｉｎ．Ｆｏｕｒｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊａｙｓｏｎ ＭＦＶ，Ｅｄ．
Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ，Ｃｈａｐｔｅｒ
２，１７−４１）。これは、加齢と一致するが、多くの場合、疼痛、特に腰痛にも関連し、運動性が限られる。ＬＢＰの症状は、患者が、限られた運動性に適応するように自身の生活様式を変えると、時間の経過とともに自然に解消する場合が多い。しかし、多くの場合、外科的介入を要する重要な要素は依然として残る。慢性的なＬＢＰの外科的処置の従来の「判断基準」は、１つまたは複数の疼痛レベルを不動にするための脊椎融合術だった。融合術は、長期間の入院、および専門的な外科的専門技術が必要なため高価であり、これらの患者の殆どは、短期の疼痛緩和を行うと思われるが、現在、融合術が最善の結果を提供しないという証拠はある。長期間の研究では、脊椎融合術は、融合部位に隣接するレベルで実際に変性を促進することが示唆されている（Ｌｅｅ（１９８８年）Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｇｍｅｎｔ ａｄｊａｃｅｎｔ ｔｏ ａ ｌｕｍｂａｒ ｆｕｓｉｏｎ，Ｓｐｉｎｅ １３：３７５−７）。関節炎および骨折した腰および膝の機能を回復するために、５０年前から人工的な補綴が開発されてきたように、現在、慢性的な変性によって疼痛および関節炎を生じるようになった椎間板の完全な機械的機能を回復することを目的として、補綴が開発されている（Ｓｚｐａａｌｓｋｉ等（２００２年）Ｖ Ｓｐｉｎｅ ａｒｔｈｒｏｐｌａｓｔｙ：ａ ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗ，Ｅｕｒ Ｓｐｉｎｅ Ｊ １１：Ｓ６５−Ｓ８４）。しかし、試験中の無数のモデルのどれかが、長期にわたって利益を提供するかを知るには、未だ早すぎる。
【００１３】
「骨形成タンパク質」または「形態形成タンパク質」または「モルフォゲン」として公知のクラスのタンパク質は、単独で前駆物質の増殖および分化を機能的な骨、軟骨、腱、および／または靭帯組織中に導入することが可能な真の骨および軟骨組織モルフォゲンとして作用する能力を有する。これらのタンパク質としては、最初は異所性の軟骨内骨形成を誘発する能力によって識別された骨形成タンパク質（ＢＭＰ）の族の要素が挙げられる。骨形成タンパク質は、一般に、先行技術では、増殖因子のＴＧＦ−β上科の亜群として分類される（Ｈｏｇａｎ（１９９６）Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １０：１５８０−１５９４）。タンパク質のモルフォゲン族の要素としては、哺乳類の骨形成タンパク質−１（ＢＭＰ−７としても公知のＯＰ−１、およびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ同族体６０Ａ）、骨形成タンパク質−２（ＢＭＰ−８ａとしても公知のＯＰ−２）、骨形成タンパク質−３（ＢＭＰ−８ｂとしても公知のＯＰ−３）、ＢＭＰ−２（ＢＭＰ−２ＡまたはＣＢＭＰ−２Ａ、およびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ同族体ＤＰＰとしても公知）、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４（ＢＭＰ−２ＢまたはＣＢＭＰ−２Ｂとしても公知）、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびそのマウス科の同族体Ｖｇｒ−１、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＧＤＦ３（Ｖｇｒ２としても公知）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９、ＧＤＦ１０、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＧＤＦ−５（ＣＤＭＰ−１またはＭＰ５２としても公知）、ＧＤＦ−６（ＣＤＭＰ−２としても公知）、ＧＤＦ−７（ＣＤＭＰ−３としても公知）、Ｘｅｎｏｐｕｓ同族体Ｖｇ１、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、およびＮＥＵＲＡＬが挙げられる。この族の要素は、共通の構造特徴を共用する分泌ポリペプチド鎖をコードし、たとえば、前駆物質の「代用形」から処理して、二量体化することが可能な成熟したポリペプチド鎖を生成し、約９７〜１０６個のアミノ酸のカルボキシ末端活性領域を含む。すべての要素は、この領域のシステインの保存パターンを共用し、これらのタンパク質の活性形式は、単一族の要素のジスルフィド結合同質二量体、または２つの異なる要素の異質二量体でよい（たとえば、Ｍａｓｓａｇｕｅ（１９９０年）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．６：５９７；Ｓａｍｐａｔｈ等（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６５：１３１９８参照）。また、米国特許第５，０１１，６９１号；米国特許第５，２６６，６８３号、Ｏｚｋａｙｎａｋ等（１９９０年）ＥＭＢＯ Ｊ．９：２０８５−２０９３、Ｗｈａｒｔｏｎ等（１９９１年）ＰＮＡＳ ８８：９２１４−９２１８、Ｏｚｋａｙｎａｋ（１９９２年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２５２２０−２５２２７および米国特許第５，２６６，６８３号；Ｃｅｌｅｓｔｅ等（１９９１年）ＰＮＡＳ ８７：９８４３−９８４７；Ｌｙｏｎｓ等（１９８９年）ＰＮＡＳ ８６：４５５４−４５５８；Ｗｏｚｎｅｙ等（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１５２８−１５３４；国際公開第９３／００４３２号；Ｐａｄｇｅｔｔ等（１９８７年）Ｎａｔｕｒｅ ３２５：８１−８４；Ｗｅｅｋｓ（１９８７年）Ｃｅｌｌ ５１：８６１−８６７参照）。
【００１４】
成熟した二量体形式では、形態形成タンパク質は、一般に、生理学的条件下でかなり不溶性である。哺乳類細胞発現系から培養された媒体中に分泌された形態形成タンパク質は、分泌タンパク質の相当部分として、可溶性形式のタンパク質を含むことが発見された。この可溶性形式は、「可溶性形態形成タンパク質複合体」とも呼ばれ、成熟した二量体種、およびその切断型を含み、切断型は、少なくとも１つ、好ましくは２つのプロ領域に共有結合している。特許文献１参照。
【００１５】
軟骨の欠損を修復するために現在好ましい方法としては、創傷清拭、微小破壊、自己移植、自家軟骨移植術、および関節置換術が挙げられる。しかし、これらの方法のどれも、軟骨組織を実際に修復および置換することにならない。これらの方法は、瘢痕様の特徴を持つ不完全な修復組織を生じる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】米国特許第６，３９５，８８３号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
したがって、軟骨の欠損を修復および再生し、現在利用可能な方法および組成物に関連する問題を克服するための組成物および方法の必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
（発明の要旨）
本発明は、可溶性形態形成タンパク質複合体を使用して、軟骨組織を修復および再生する方法を提供する。実施態様によっては、本発明は、患者の軟骨の欠損を修復する方法であって、軟骨内、軟骨を囲む領域内に、（ａ）形態形成タンパク質、および（ｂ）形態形成タンパク質から単離された形態形成タンパク質のプロ領域、あるいはこのプロ領域の保存的置換改変体またはフラグメントを含む治療有効量の単離可溶性形態形成タンパク質複合体を含む組成物であって、このプロ領域または改変体またはフラグメントが、形態形成タンパク質に非共有結合され、この複合体が、水性溶媒中で、形態形成タンパク質単独より水溶性である組成物を投与するステップを含む方法を提供する。
【００１９】
実施態様によっては、本発明は、患者の体内に軟骨を再生または生成する方法であって、軟骨、または軟骨を囲む領域に、（ａ）形態形成タンパク質、および（ｂ）形態形成タンパク質から単離された形態形成タンパク質のプロ領域、あるいはこのプロ領域の保存的置換改変体またはフラグメントを含む治療有効量の単離可溶性形態形成タンパク質複合体を含む組成物であって、このプロ領域または改変体またはフラグメントが、形態形成タンパク質に非共有結合され、この複合体が、水性溶媒中で、形態形成タンパク質単独より水溶性である組成物を投与するステップを含む方法を提供する。
【００２０】
他の実施態様では、本発明は、患者の体内の軟骨の成長を促進するか、または患者の体内の軟骨の形成を促進する方法であって、軟骨内、または軟骨を囲む領域内に、（ａ）形態形成タンパク質、および（ｂ）形態形成タンパク質から単離された形態形成タンパク質のプロ領域、あるいはこのプロ領域の保存的置換改変体またはフラグメントを含む治療有効量の単離可溶性形態形成タンパク質複合体を含む組成物であって、このプロ領域または改変体またはフラグメントが、形態形成タンパク質に非共有結合され、およびこの複合体が、水性溶媒中で、形態形成タンパク質単独より水溶性である組成物を投与するステップを含む方法を提供する。
【００２１】
さらに他の実施態様では、本発明は、患者の軟骨の変性を防止するか、軟骨の損傷、あるいは変性疾病または疾患を処置する方法であって、（ａ）形態形成タンパク質、および（ｂ）形態形成タンパク質から単離された形態形成タンパク質のプロ領域、またはこのプロ領域の保存的置換改変体またはフラグメントを含む、治療有効量の単離可溶性形態形成タンパク質複合体を含む組成物であって、このプロ領域または改変体またはフラグメントが、形態形成タンパク質に非共有結合され、この複合体が、水性溶媒中で、形態形成タンパク質単独より水溶性である組成物を投与するステップを含む方法を提供する。
【００２２】
本発明は、患者の軟骨組織の損傷を処置する方法であって、（ａ）形態形成タンパク質、および（ｂ）形態形成タンパク質から単離された形態形成タンパク質のプロ領域、またはこのプロ領域の保存的置換改変体またはフラグメントを含む、治療有効量の単離可溶性形態形成タンパク質複合体を含む組成物であって、このプロ領域または改変体またはフラグメントが、形態形成タンパク質に非共有結合され、この複合体が、水性溶媒中で、形態形成タンパク質単独より水溶性である組成物を患者に投与するステップを含む方法を提供する。実施態様によっては、この組織の損傷は、半月板の破裂、軟骨の空隙または欠損、骨軟骨の空隙または欠損、あるいはＡＣＬ損傷があるが、これらだけに限らない。
【００２３】
本発明は、患者の体内の軟骨組織の変性疾病または疾患を処置する方法であって、（ａ）形態形成タンパク質、および（ｂ）形態形成タンパク質から単離された形態形成タンパク質のプロ領域、またはこのプロ領域の保存的置換改変体またはフラグメントを含む、治療有効量の単離可溶性形態形成タンパク質複合体を含む組成物であって、このプロ領域または改変体またはフラグメントが、形態形成タンパク質に非共有結合され、この複合体が、水性溶媒中で、形態形成タンパク質単独より水溶性である組成物を患者に投与するステップを含む方法を提供する。実施態様によっては、軟骨組織の変性疾病または疾患としては、変形性関節症および椎間板変性があるが、これらだけに限らない。実施態様によっては、本発明の組成物は、骨関節炎または椎間板変性欠損部位、あるいは骨関節炎または椎間板変性欠損部位を囲む領域に投与される。
【００２４】
実施態様によっては、軟骨は関節軟骨である。実施態様によっては、関節軟骨は関節接合部内にある。他の実施態様では、軟骨は、非関節軟骨である。実施態様によっては、非関節軟骨は、半月板または椎間板である。
【００２５】
実施態様によっては、組成物は軟骨内に投与される。実施態様によっては、組成物は、半月板または椎間板内に投与される。実施態様によっては、組成物は、軟骨を囲む領域に投与される。実施態様によっては、軟骨を囲む領域は滑液である。
【００２６】
実施態様によっては、形態形成タンパク質は、本発明の方法に使用される組成物であって、たとえば、ＯＰ−Ｉ、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＤＰＰ、Ｖｇｌ、Ｖｇｒ、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、並びにこれらの保存的置換改変体、およびフラグメントが挙げられるが、これらだけに限らない。好ましい実施態様では、形態形成タンパク質は、ＯＰ−１、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＢＭＰ−１２、およびＢＭＰ−１３から選択される。より好ましい実施態様では、形態形成タンパク質はＯＰ−１である。他の実施態様では、形態形成タンパク質は、ヒトＯＰ−１の保存７システイン領域を含むＣ末端１０２〜１０６のアミノ酸に対して少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、この形態形成タンパク質は、軟骨の欠損の修復を誘発することが可能である。実施態様によっては、本発明の方法に使用する組成物中の形態形成タンパク質は二量体である。実施態様によっては、本発明の組成物中の形態形成タンパク質は非共有二量体であり、たとえば、鎖間ジスルフィド結合に関わるシステイン残基が、別のアミノ酸残基と置換されたモノマーが挙げられる。
【００２７】
実施態様によっては、形態形成タンパク質のプロ領域は、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＤＰＰ、Ｖｇｌ、Ｖｇｒ、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、あるいはこれらの保存的置換改変体、またはフラグメントのプロ領域のアミノ酸配列を含む。他の実施態様では、形態形成タンパク質のプロ領域は、ＯＰ−１、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、あるいはこれらの保存的置換改変体、またはフラグメントのプロ領域のアミノ酸配列を含む。さらに別の実施態様では、形態形成タンパク質のプロ領域は、ＯＰ−１、あるいはその保存的置換改変体、またはフラグメントのプロ領域のアミノ酸配列を含む。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
患者の体内の軟骨の欠損を修復する方法であって、前記軟骨内、または前記軟骨を囲む領域内に、治療有効量の単離可溶性形態形成タンパク質複合体を含む組成物を投与するステップを含み、前記組成物は、
（ａ）形態形成タンパク質と、
（ｂ）形態形成タンパク質から単離された形態形成タンパク質のプロ領域、あるいは前記プロ領域の保存的置換改変体またはフラグメントであって、前記プロ領域または改変体またはフラグメントが、前記形態形成タンパク質に非共有結合され、前記複合体が、水性溶媒中で、前記形態形成タンパク質単独より水溶性であるものと
を含む、方法。
（項目２）
前記軟骨が、関節および非関節軟骨から選択される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記非関節軟骨が、半月板および椎間板から成る群から選択される、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記軟骨を囲む領域が滑液である、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記形態形成タンパク質が二量体である、項目１〜４の何れか１項に記載の方法。
（項目６）
前記形態形成タンパク質が、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＤＰＰ、Ｖｇｌ、Ｖｇｒ−１、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、およびこれらの保存的置換改変体およびフラグメントから成る群から選択される、項目１〜５の何れか１項に記載の方法。
（項目７）
前記形態形成タンパク質が、ＯＰ−１、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＢＭＰ−１２、およびＢＭＰ−１３から成る群から選択される、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記形態形成タンパク質がＯＰ−１である、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記形態形成タンパク質が、ヒトＯＰ−１の前記保存７システイン領域を含む前記Ｃ末端１０２〜１０６のアミノ酸に対して少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、前記形態形成タンパク質が、前記軟骨の欠損の修復を誘発することが可能な、項目１〜５の何れか１項に記載の方法。
（項目１０）
前記形態形成タンパク質のプロ領域が、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＤＰＰ、Ｖｇｌ、Ｖｇｒ、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、並びにこれらの保存的置換改変体およびフラグメントから成る群から選択されるプロ領域のアミノ酸配列を含む、項目１〜９の何れか１項に記載の方法。
（項目１１）
前記形態形成タンパク質のプロ領域が、ＯＰ−１、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＢＭＰ−１２、およびＢＭＰ−１３、並びにこれらの保存的置換改変体およびフラグメントから成る群から選択されるプロ領域のアミノ酸配列を含む、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記形態形成タンパク質のプロ領域が、ＯＰ−１またはその保存的置換改変体およびフラグメントのプロ領域のアミノ酸配列を含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
患者の体内に軟骨を再生または生成する方法であって、前記軟骨内、または前記軟骨を囲む領域内に、治療有効量の単離可溶性形態形成タンパク質複合体を含む組成物を投与するステップを含み、前記組成物は、
（ａ）形態形成タンパク質と、
（ｂ）形態形成タンパク質から単離された形態形成タンパク質のプロ領域、あるいは前記プロ領域の保存的置換改変体、またはフラグメントであって、前記プロ領域または改変体またはフラグメントが、前記形態形成タンパク質に非共有結合され、前記複合体が、水性溶媒中で、前記形態形成タンパク質単独より水溶性であるものと
を含む、方法。
（項目１４）
前記軟骨が関節および非関節軟骨から選択される、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記非関節軟骨が、半月板および椎間板から成る群から選択される、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記軟骨を囲む前記領域が滑液である、項目１３に記載の方法。
（項目１７）
前記形態形成タンパク質が二量体である、項目１３〜１６の何れか１項に記載の方法。
（項目１８）
前記形態形成タンパク質が、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＤＰＰ、Ｖｇｌ、Ｖｇｒ−１、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、並びにこれらの保存的置換改変体およびフラグメントから成る群から選択される、項目１３〜１７の何れか１項に記載の方法。
（項目１９）
前記形態形成タンパク質が、ＯＰ−１、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＢＭＰ−１２、およびＢＭＰ−１３から成る群から選択される、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記形態形成タンパク質がＯＰ−１である、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記形態形成タンパク質が、ヒトＯＰ−１の前記保存７システイン領域を含む前記Ｃ末端１０２〜１０６のアミノ酸に対して少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、前記形態形成タンパク質が、前記軟骨の欠損の修復を誘発することが可能である、項目１３〜１７の何れか１項に記載の方法。
（項目２２）
前記形態形成タンパク質のプロ領域が、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＤＰＰ、Ｖｇｌ、Ｖｇｒ、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、並びにこれらの保存的置換改変体およびフラグメントから成る群から選択されるプロ領域のアミノ酸配列を含む、項目１３〜２１の何れか１項に記載の方法。
（項目２３）
前記形態形成タンパク質のプロ領域が、ＯＰ−１、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＢＭＰ−１２、およびＢＭＰ−１３、並びにこれらの保存的置換改変体およびフラグメントから成る群から選択されるプロ領域のアミノ酸配列を含む、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記形態形成タンパク質のプロ領域が、ＯＰ−１またはその保存的置換改変体およびフラグメントのプロ領域のアミノ酸配列を含む、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
患者の体内における軟骨の成長を促進するか、軟骨の形成を加速する方法であって、前記軟骨内、または前記軟骨を囲む領域内に、治療有効量の単離可溶性形態形成タンパク質複合体を含む組成物を投与するステップを含み、前記組成物は、
（ａ）形態形成タンパク質と、
（ｂ）形態形成タンパク質から単離された形態形成タンパク質のプロ領域、あるいは前記プロ領域の保存的置換改変体、またはフラグメントであって、前記プロ領域または改変体またはフラグメントが、前記形態形成タンパク質に非共有結合され、前記複合体が、水性溶媒中で、前記形態形成タンパク質単独より水溶性であるものと
を含む、方法。
（項目２６）
前記軟骨が関節および非関節軟骨から選択される、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記非関節軟骨が、半月板および椎間板から成る群から選択される、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記軟骨を囲む前記領域が滑液である、項目２５に記載の方法。
（項目２９）
前記形態形成タンパク質が二量体である、項目２５〜２８の何れか１項に記載の方法。
（項目３０）
前記形態形成タンパク質が、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＤＰＰ、Ｖｇｌ、Ｖｇｒ−１、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、並びにこれらの保存的置換改変体およびフラグメントから成る群から選択される、項目２５〜２９の何れか１項に記載の方法。
（項目３１）
前記形態形成タンパク質が、ＯＰ−１、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＢＭＰ−１２、およびＢＭＰ−１３から成る群から選択される、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記形態形成タンパク質がＯＰ−１である、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記形態形成タンパク質が、ヒトＯＰ−１の前記保存７システイン領域を含む前記Ｃ末端１０２〜１０６のアミノ酸に対して少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、前記形態形成タンパク質が、前記軟骨の欠損の修復を誘発することが可能である、項目２５〜２９の何れか１項に記載の方法。
（項目３４）
前記形態形成タンパク質のプロ領域が、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＤＰＰ、Ｖｇｌ、Ｖｇｒ、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、並びにこれらの保存的置換改変体およびフラグメントから成る群から選択されるプロ領域のアミノ酸配列を含む、項目２５〜３３の何れか１項に記載の方法。
（項目３５）
前記形態形成タンパク質のプロ領域が、ＯＰ−１、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＢＭＰ−１２、およびＢＭＰ−１３、並びにこれらの保存的置換改変体およびフラグメントから成る群から選択されるプロ領域のアミノ酸配列を含む、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記形態形成タンパク質のプロ領域が、ＯＰ−１またはその保存的置換改変体およびフラグメントのプロ領域のアミノ酸配列を含む、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
患者の軟骨の変性を防止するか、軟骨の損傷、あるいは変性疾病または疾患を処置する方法であって、前記軟骨内、または前記軟骨を囲む領域内に、治療有効量の単離可溶性形態形成タンパク質複合体を含む組成物を投与するステップを含み、前記組成物は、
（ａ）形態形成タンパク質と、
（ｂ）形態形成タンパク質から単離された形態形成タンパク質のプロ領域、あるいは前記プロ領域の保存的置換改変体、またはフラグメントであって、前記プロ領域または改変体またはフラグメントが、前記形態形成タンパク質に非共有結合され、前記複合体が、水性溶媒中で、前記形態形成タンパク質単独より水溶性であるものと
を含む、方法。
（項目３８）
前記軟骨が関節および非関節軟骨から選択される、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記非関節軟骨が、半月板および椎間板から成る群から選択される、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記軟骨を囲む前記領域が滑液である、項目３７に記載の方法。
（項目４１）
前記形態形成タンパク質が二量体である、項目３７〜４０の何れか１項に記載の方法。
（項目４２）
前記形態形成タンパク質が、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＤＰＰ、Ｖｇｌ、Ｖｇｒ−１、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、並びにこれらの保存的置換改変体およびフラグメントから成る群から選択される、項目３７〜４１の何れか１項に記載の方法。
（項目４３）
前記形態形成タンパク質が、ＯＰ−１、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＢＭＰ−１２、およびＢＭＰ−１３から成る群から選択される、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記形態形成タンパク質がＯＰ−１である、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記形態形成タンパク質が、ヒトＯＰ−１の前記保存７システイン領域を含む前記Ｃ末端１０２〜１０６のアミノ酸に対して少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、前記形態形成タンパク質が、前記軟骨の欠損の修復を誘発することが可能である、項目３７〜４１の何れか１項に記載の方法。
（項目４６）
前記形態形成タンパク質のプロ領域が、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＤＰＰ、Ｖｇｌ、Ｖｇｒ、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、並びにこれらの保存的置換改変体およびフラグメントから成る群から選択されるプロ領域のアミノ酸配列を含む、項目３７〜４５の何れか１項に記載の方法。
（項目４７）
前記形態形成タンパク質のプロ領域が、ＯＰ−１、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＢＭＰ−１２、およびＢＭＰ−１３、並びにこれらの保存的置換改変体およびフラグメントから成る群から選択されるプロ領域のアミノ酸配列を含む、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記形態形成タンパク質のプロ領域が、ＯＰ−１またはその保存的置換改変体およびフラグメントのプロ領域のアミノ酸配列を含む、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
患者の体内の軟骨組織の損傷、あるいは変性疾病または疾患を処置する方法であって、治療有効量の単離可溶性形態形成タンパク質複合体を含む組成物を前記患者に投与するステップを含み、前記組成物は、
（ａ）形態形成タンパク質と、
（ｂ）形態形成タンパク質から単離された形態形成タンパク質のプロ領域、あるいは前記プロ領域の保存的置換改変体またはフラグメントであって、前記プロ領域あるいは改変体またはフラグメントが、前記形態形成タンパク質に非共有結合され、前記複合体が、水性溶媒中で、前記形態形成タンパク質単独より水溶性であるものと
を含む、方法。
（項目５０）
前記軟骨組織の損傷が、単数の半月板破裂、複数の半月板破裂、軟骨の空隙および欠損、骨軟骨の空隙および欠損、並びにＡＣＬ損傷から成る群から選択される、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記軟骨の変性疾病または疾患が、変形性関節症および椎間板変性から成る群から選択される、項目４９に記載の方法。
（項目５２）
前記形態形成タンパク質が二量体である、項目４９〜５１の何れか１項に記載の方法。
（項目５３）
前記形態形成タンパク質が、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＤＰＰ、Ｖｇｌ、Ｖｇｒ−１、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、並びにこれらの保存的置換改変体およびフラグメントから成る群から選択される、項目４９〜５２の何れか１項に記載の方法。
（項目５４）
前記形態形成タンパク質が、ＯＰ−１、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＢＭＰ−１２、およびＢＭＰ−１３から成る群から選択される、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記形態形成タンパク質がＯＰ−１である、項目１６に記載の方法。
（項目５６）
前記形態形成タンパク質が、ヒトＯＰ−１の前記保存７システイン領域を含む前記Ｃ末端１０２〜１０６のアミノ酸に対して少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、前記形態形成タンパク質が、前記軟骨の欠損の修復を誘発することが可能である、項目４９〜５２の何れか１項に記載の方法。
（項目５７）
前記形態形成タンパク質のプロ領域が、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＤＰＰ、Ｖｇｌ、Ｖｇｒ、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、並びにこれらの保存的置換改変体およびフラグメントから成る群から選択されるプロ領域のアミノ酸配列を含む、項目４９〜５６の何れか１項に記載の方法。
（項目５８）
前記形態形成タンパク質のプロ領域が、ＯＰ−１、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＢＭＰ−１２、およびＢＭＰ−１３、並びにこれらの保存的置換改変体およびフラグメントから成る群から選択されるプロ領域のアミノ酸配列を含む、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
前記形態形成タンパク質のプロ領域が、ＯＰ−１またはその保存的置換改変体およびフラグメントのプロ領域のアミノ酸配列を含む、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
前記組成物が、前記骨関節炎の欠損部位、または前記骨関節炎の欠損部位を囲む領域内に投与される、項目５１に記載の方法。
（項目６１）
前記組成物が、前記椎間板変性の欠損部位、または前記椎間板変性の欠損部位を囲む領域に投与される、項目５１に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】配列をコードする核酸から発現したモルフォゲンポリペプチド鎖の略図であり、斜影領域はシグナル配列を表し、点描領域はプロ領域を表し、斜線領域は、Ｎ末端（「Ｎ末端伸張」）を表し、開放領域は、保存７システイン領域を規定する成熟タンパク質配列のＣ末端領域を表し、保存システインは、縦の点線によって指示される。
【図２】成熟形態の様々なモルフォゲン、それぞれＯＰ−２、ＯＰ−１、Ｖｇｒ−１、ＢＭＰ−５、６０Ａ、ＤＰＰ、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、Ｖｇ−１、ＢＭＰ−３のＮ末端伸張の配列を示す。
【図３】ＴＢＳ（トリス緩衝食塩水）中のＩＭＡＣ、Ｓ−セファロース、およびＳ−２００ＨＲクロマトグラフィによる哺乳類細胞の培養から生成および精製された可溶性モルフォゲン（ＯＰ−１）のゲル濾過カラム溶出プロファイルであり、この場合、Ｖ０は空隙容量、ＡＤＨはアルコール脱水素酵素（ＭＷ１５０ｋＤａ）、ＢＳＡはウシ血清アルブミン（ＭＷ６７ｋＤａ）、ＣＡは炭酸脱水酵素（ＭＷ２９ｋＤａ）、およびＣｙｔＣはシトクロムＣ（ＭＷ１２．５ｋＤａ）である。
【図４】相互衝突損傷部位を示す関節の略図である。
【図５】椎間板を線維輪（ＡＦ）四分円および髄核（ＮＰ）に分割する帯状切開スキーム、並びに腰部ヒツジ椎間板を通る水平および垂直断面内の四分円における前外側環状病巣の位置および程度を示す。
【図６】ヒトＯＰ−１のｃＤＮＡ、およびタンパク質配列（配列番号１）を示す。
【図７】ヒトＯＰ−１のタンパク質配列（配列番号２）を示す。
【図８−１】マウスＯＰ−１のｃＤＮＡ、およびタンパク質配列（配列番号３）を示す。
【図８−２】マウスＯＰ−１のｃＤＮＡ、およびタンパク質配列（配列番号３）を示す。
【図９】マウスのタンパク質配列（配列番号４）を示す。
【図１０−１】ヒトＯＰ−２のｃＤＮＡ、およびタンパク質配列（配列番号５）を示す。
【図１０−２】ヒトＯＰ−２のｃＤＮＡ、およびタンパク質配列（配列番号５）を示す。
【図１１】ヒトＯＰ−２のタンパク質配列（配列番号６）を示す。
【図１２−１】マウスＯＰ−２のｃＤＮＡ、およびタンパク質配列（配列番号７）を示す。
【図１２−２】マウスＯＰ−２のｃＤＮＡ、およびタンパク質配列（配列番号７）を示す。
【図１３】マウスＯＰ−２のタンパク質配列（配列番号８）を示す。
【図１４】マウスＯＰ−３のタンパク質配列（配列番号９）を示す。
【図１５】ＢＭＰ−２のタンパク質配列（配列番号１０）を示す。
【図１６】ＢＭＰ−４のタンパク質配列（配列番号１１）を示す。
【図１７】ＢＭＰ−３のタンパク質配列（配列番号１２）を示す。
【図１８】ＢＭＰ−５のタンパク質配列（配列番号１３）を示す。
【図１９】ＢＭＰ−６のタンパク質配列（配列番号１４）を示す。
【図２０】ＢＭＰ−１０のタンパク質配列（配列番号１５）を示す。
【図２１】ＢＭＰ−１５のタンパク質配列（配列番号１６）を示す。
【図２２】ＢＭＰ−１６のタンパク質配列（配列番号１７）を示す。
【図２３】ＢＭＰ−１７のタンパク質配列（配列番号１８）を示す。
【図２４】ＢＭＰ−１８のタンパク質配列（配列番号１９）を示す。
【図２５】ＮＯＤＡＬのタンパク質配列（配列番号２０）を示す。
【図２６】ＵＮＩＶＩＮのタンパク質配列（配列番号２１）を示す。
【図２７】ＡＤＭＰのタンパク質配列（配列番号２２）を示す。
【図２８−１】ＤＰＰのタンパク質配列（配列番号２３）を示す。
【図２８−２】ＤＰＰのタンパク質配列（配列番号２３）を示す。
【図２９】ＶＧ−１のタンパク質配列（配列番号２４）を示す。
【図３０】Ｖｇｒ−１のタンパク質配列（配列番号２５）を示す。
【図３１】６０Ａのタンパク質配列（配列番号２６）を示す。
【図３２】ＧＤＦ−１のタンパク質配列（配列番号２７）を示す。
【図３３】ＧＤＦ−２のタンパク質配列（配列番号２８）を示す。
【図３４】ＧＤＦ−３のタンパク質配列（配列番号２９）を示す。
【図３５】ＧＤＦ−５のタンパク質配列（配列番号３０）を示す。
【図３６】ＧＤＦ−６のタンパク質配列（配列番号３１）を示す。
【図３７】ＧＤＦ−７のタンパク質配列（配列番号３２）を示す。
【図３８】ＧＤＦ−８のタンパク質配列（配列番号３３）を示す。
【図３９】ＧＤＦ−９のタンパク質配列（配列番号３４）を示す。
【図４０】ＧＤＦ−１０のタンパク質配列（配列番号３５）を示す。
【図４１】ＧＤＦ−１１のタンパク質配列（配列番号３６）を示す。
【図４２】ＧＤＦ−１２のタンパク質配列（配列番号３７）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
（発明の詳細な説明）
本明細書で説明する発明を完全に理解することができるように、以下の詳細な説明を記載する。
【００３０】
特に定義しない限り、本明細書で使用する技術および科学用語は、本発明が属する技術の当業者が一般的に理解する意味と同じ意味を有する。本明細書に記載する方法および材料、またはこれらと等価なものは、本発明の実施またはテストに使用することができるが、適切な方法および材料について以下で説明する。材料、方法、および例は単に具体的に示すためであり、制限することを意図するものではない。本明細書に記載するすべての出版物、特許、およびその他の文書は、引用することにより全体的に本明細書に援用する。
【００３１】
本明細書を通して、「含む」（複数現在形）という用語、または「含む」（単数現在形）または「含んでいる」などの変形は、記載されている整数または整数群を含むことを意味するが、その他の何らかの整数または整数群を排除しないと考えられる。
【００３２】
本発明についてさらに定義するため、以下の用語および定義をここに記載する。
【００３３】
「軟骨」という用語は、軟骨細胞または軟骨細胞状細胞（すべてではないが、多くの軟骨細胞の特徴を有する）、および細胞間質（たとえば、タイプＩ、ＩＩ、ＩＸおよびＸＩコラーゲン）、プロテオグリカン（たとえば、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、およびデルマタン硫酸プロテオグリカン）、およびその他のタンパク質を含む１つのタイプの結合組織を意味する。軟骨は、関節および非関節軟骨を含む。
【００３４】
ヒアリン軟骨とも呼ばれる「関節軟骨」は、血液が供給されない非鉱化結合組織を意味し、これは、関節の骨の関節表面を被覆し、対向する２つの骨表面間の摩擦減少接触部分として機能する。関節軟骨は、骨と骨とが接触しないように、関節における運動を可能にする。関節軟骨には、骨化する傾向がない。軟骨表面は、肉眼で滑らかかつパール状に見え、高倍率で拡大した状態で、微細な粒状である。関節軟骨は、栄養物を一部には隣接する滑膜の血管から、一部には、滑膜を被覆する骨の血管から誘導する。関節軟骨は、タイプＩＩおよびタイプＩＸコラーゲン、および十分に特徴付けられた様々なプロテオグリカンの存在、および軟骨内の骨の形成に関連するタイプＸコラーゲンの欠如に関連する。関節軟骨の微細構造の詳細な説明は、たとえばＡｙｄｅｌｏｔｔｅ ａｎｄ Ｋｕｅｔｔｎｅｒ，Ｃｏｎｎ．Ｔｉｓｓ．Ｒｅｓ．，１８，ｐ．２０５（１９８８年）；Ｚａｎｅｔｔｉ等、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１０１，ｐ．５３（１９８５年）；およびＰｏｏｌｅ等、Ｊ．Ａｎａｔ．，１３８，ｐ．１３（１９８４年）参照。
【００３５】
「非関節軟骨」は、関節面を被覆しない軟骨を意味し、線維軟骨（関節間線維軟骨、線維軟骨性椎間板、骨間線維軟骨、周辺の線維軟骨を含む）および弾性軟骨を含む。線維軟骨では、微細多糖網は、突出したコラーゲン束と絡み合い、軟骨細胞は、ヒアリンまたは関節軟骨の場合より広く散乱する。関節間線維軟骨は、激しい運動にさらされ、頻繁に運動が行われる関節、たとえば膝の半月板内に見られる。こうした関節の例としては、側頭下顎骨、胸鎖、肩峰鎖骨、手首、および膝関節が挙げられるが、これらだけに限らない。二次軟骨性関節は、線維軟骨の椎間板によって形成される。このような線維軟骨性椎間板は、対向する表面の両方に密接に付着し、軟骨性薄層が挿置された線維組織の同心円状リングから成る。このような線維軟骨性椎間板の例は、脊椎の椎間板である。骨間線維軟骨は、こうした関節の骨表面間に挿置され、脊椎本体間、および恥骨間などのわずかな可動性を可能にする。周辺の線維軟骨は、腰の寛骨臼、および肩の関節窩など、いくつかの関節腔の縁を囲む。
【００３６】
弾性軟骨は、組織学的にエラスチン線維に類似するコラーゲンの線維を含む。このような軟骨は、外耳の耳介、エウスタキー管、ｃｏｒｎｉｃｕｌａ ｌａｒｙｎｇｉｓ、喉頭蓋に見られる。すべての軟骨と同様、弾性軟骨は、軟骨細胞およびマトリクスも含み、後者は、黄色弾性繊維網によってすべての方向に広がり、可変量の非線維状ヒアリン細胞間物質が存在する各々の細胞のすぐ周囲を除いてすべての方向に分岐および吻合する。
【００３７】
「滑液」という用語は、関節内の摩擦を減少させる滑液腔内にある薄い潤滑物質を意味する。
【００３８】
「欠損」または「欠損部位」という用語は、軟骨または骨軟骨組織の破裂を意味する。欠損は、「空隙」の形態を取る可能性があり、軟骨または骨軟骨組織の構造上の完全性における三次元の欠損、たとえば隙間、空洞、穴またはその他の著しい破壊を意味すると考えられる。欠損は、軟骨が骨または人体に対する連結点から剥離することである可能性もある。特定の実施態様では、欠損は、内因性または自発的修復が不可能な状態である。欠損は、事故、疾病、および／または外科的手技の結果である場合がある。たとえば、軟骨の欠損は、破裂した半月板組織が関節内に変位するなど、関節に対する外傷の結果であり得る。軟骨の欠損は、変形性関節症などの変性関節疾病の結果でもあり得る。
【００３９】
「修復」という用語は、欠損部位における空隙または構造上の断絶を少なくとも部分的に充填するのに十分な新しい軟骨の形成を意味する。しかし、修復は、欠損をその欠損前の物理的／構造的／機械的状態に回復する際に１００％効果的な完全な治癒または処置のプロセスを意味するか、あるいは伴う。
【００４０】
「治療有効量」という用語は、軟骨組織を修復、再生、促進、加速、変性を防止、あるいは形成するのに効果的な量を意味する。
【００４１】
「患者」という用語は、哺乳類（たとえば、ヒト）を含む動物を意味する。
【００４２】
「補助剤の薬学的に許容可能な担体」は、本発明の可溶性形態形成タンパク質複合体とともに患者に投与することができ、その薬理学的活性を無効にしない非毒性担体または補助剤を意味する。
【００４３】
「形態形成タンパク質」は、モルフォゲン活性を有するタンパク質を意味する。好ましくは、本発明の形態形成タンパク質は、ＢＭＰタンパク質族に属する少なくとも１つのポリペプチドを含む。形態形成タンパク質は、骨形成タンパク質を含む。形態形成タンパク質は、局所的な環境上のきかっけに応じて、軟骨、骨、腱、靭帯、またはその他のタイプの組織形成につながる分化経路を増殖および／または開始する前駆物質を含む可能性があり得るため、形態形成タンパク質は、様々な環境で様々に挙動し得る。たとえば、形態形成タンパク質は、少なくとも１つの処置部位における骨組織、および様々な処置部位における軟骨組織を含み得る。
【００４４】
「骨形成タンパク質（ＢＭＰ）」という用語は、ＤＮＡおよびアミノ酸配列の相同性に基づいて、タンパク質のＴＧＦ−β上科のＢＭＰ族に属するタンパク質（ＢＭＰ族）を意味する。タンパク質は、ＢＭＰタンパク質族を特徴とする保存Ｃ末端システイン豊富領域内の少なくとも１つの公知のＢＭＰ族要素に対して、少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有する場合、本発明に従ってＢＭＰ族に属する。好ましくは、タンパク質は、保存Ｃ末端システイン豊富領域内の少なくとも１つの公知のＢＭＰ族要素に対して、少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有する。ＢＭＰ族の要素は、全体に５０％未満のＤＮＡまたはアミノ酸配列同一性を有し得る。本明細書で定義する骨形成タンパク質も、適切なインビボの血液が供給されない遺伝子座において、関節軟骨の形成を誘発する能力を有する。
【００４５】
「アミノ酸配列の相同性」という用語は、アミノ酸配列同一性および類似性の両方を含むと考えられる。相同配列は、類似残基が、整列した参照配列内の対応するアミノ酸残基の同類置換、または「許容された点変異」である場合、同じか、および／または類似するアミノ酸残基を共用する。したがって、参照配列と７０％のアミノ酸相同性を共用する候補ポリペプチド配列は、整列残基の任意の７０％が、参照配列内の対応する残基と同じであるか、あるいは同類置換である配列である。特定の特に好ましい形態発生ポリペプチドは、ヒトＯＰ−１および関連タンパク質の保存７システイン領域を規定するＣ末端１０２〜１０６のアミノ酸と、少なくとも６０％、好ましくは７０％のアミノ酸配列同一性を共用する。
【００４６】
アミノ酸配列の相同性は、先行技術で十分に公知の方法で判断することができる。たとえば、候補アミノ酸配列の相同率を判断するには、先ず２つの配列を整列させる。整列は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ等、Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．，４８，ｐｐ．４４３（１９７０年）に記載されている動的プログラミングアルゴリズム、およびＤＮＡｓｔａｒ，Ｉｎｃ．が製造する市販ソフトウェアパッケージのＡｌｉｇｎ Ｐｒｏｇｒａｍを使用して行うことができる。これらの発行元による教示は、引用することにより本明細書に援用する。最初の整列は、関連するタンパク質の族の多重配列整列と比較することによって精製することができる。整列が行われて精製された後、相同率の点数が計算される。２つの配列の整列したアミノ酸残基は、順次それぞれの類似性を互いに比較される。類似性の要素としては、類似のサイズ、形状、および電荷が挙げられる。アミノ酸の類似性を判断するのに特に好ましい１つの方法は、引用することにより本明細書に援用するＤａｙｈｏｆｆ等、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，５，ｐｐ．３４５−３５２（１９７８＆Ｓｕｐｐ．）に記載されているＰＡＭ２５０マトリクスである。類似性の点数は、最初に、整列した対状のアミノ酸類似性点数の合計として計算される。相同率および同一性の目的上、挿入および欠損は無視する。したがって、ギャップペナルティは、この計算では使用しない。次に、実際の点数は、候補配列および７つのシステイン領域の点数の幾何平均で除算して正規化される。幾何平均は、これらの点数の積の平方根である。正規化された実際の点数は相同率である。
【００４７】
「同類置換」という用語は、対応する参照残基に物理的または機能的に類似する残基を意味する。つまり、同類置換およびその参照残基は、類似するサイズ、形状、電荷、共有結合または水素結合などを形成する能力を含む化学特性を有する。好ましい同類置換は、上記のＤａｙｈｏｆｆ等の許容点変異に関して定義された基準に適合する置換である。同類置換の例は、以下の群内の置換である：（ａ）バリン、グリシン；（ｂ）グリシン、アラニン；（ｃ）バリン、イソロイシン、ロイシン；（ｄ）アスパラ銀酸、グルタミン酸；（ｅ）アスパラ銀、グルタミン；（ｆ）セリン、スレオニン；（ｇ）リジン、アルギニン、メチオニン；および
（ｈ）フェニルアラニン、チロシン。「同類改変体」または「同類変形」という用語は、親の配列に特有の抗体が、結果として得られる置換ポリペプチド配列にも特有である、つまり「交差反応」するかまたは「免疫反応」する場合、特定の親アミノ酸配列内のアミノ酸残基の代わりに、置換アミノ酸残基を使用することも含む。
【００４８】
「骨形成タンパク質（ＯＰ）」という用語は、前駆物質を導入して、軟骨および／または骨を形成することができる形態形成タンパク質を意味する。骨は、膜内の骨または軟骨内の骨でよい。殆どの骨形成タンパク質は、ＢＭＰタンパク質族の要素であり、したがってＢＭＰでもある。本明細書に特記しない限り、このタンパク質類は、一般に、ヒトの骨形成タンパク質（ｈＯＰ−１）によって類型化される。本発明の実施に有用なその他の骨形成タンパク質としては、骨形成的に活性の形態のＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＤＰＰ、Ｖｇｌ、Ｖｇｒ−１、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＵＮＩＶＩＮ、ＮＯＤＡＬ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰまたはＮＥＵＲＡＬ、あるいはこれらの保存的置換改変体、またはフラグメントが挙げられる。本願の出願人の発明に使用するのに適する骨形成タンパク質は、Ｒｅｄｄｉ ａｎｄ Ｓａｍｐａｔｈ（Ｓａｍｐａｔｈ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８４，ｐｐ．７１０９−１３、引用することにより本明細書に援用する）に記載されている先行技術で認められた生体検定を使用して、一般的な実験によって識別することができる。
【００４９】
軟骨の成長および修復のための方法および組成物
本発明の形態発生組成物は、軟骨の修復（たとえば、関節、半月板、または椎間板における）に使用し得る。本明細書に開示する可溶性形態形成タンパク質複合体を含む形態発生組成物は、医師が、局所的な、刺激を受けた組織の再生または修復によって改善または矯正可能な様々な組織傷害、組織変性または疾病の症状、および疾患を処置することを可能にする。
【００５０】
本発明は、変形性関節症、軟骨の欠損、骨軟骨の欠損、半月板破裂、ＡＣＬ傷害、および椎間板変性を含むが、これらだけに限らない軟骨組織傷害および軟骨変性疾病または疾患を処置するための方法および組成物を提供する。
【００５１】
実施態様によっては、本発明は、患者の体内の軟骨を修復または再生するための方法および組成物を提供する。本発明は、軟骨を生成し、軟骨の成長を促進し、軟骨の形成を加速し、軟骨の変性を防止するための方法および組成物を提供する。
【００５２】
実施態様によっては、本発明の方法は、治療有効量の可溶性形態形成タンパク質複合体を含む組成物を軟骨内に投与するステップを含む。この方法は、軟骨組織を可溶性形態形成タンパク質複合体に接触させることを含む。たとえば、一実施態様では、可溶性形態形成タンパク質複合体の組成物は、軟骨組織内に直接投与される（たとえば、軟骨組織内に注入される）。たとえば、可溶性形態形成タンパク質複合体の組成物は、半月板または椎間板内に注入し得る。実施態様によっては、本発明の方法は、可溶性形態形成タンパク質複合体の組成物を関節、たとえば、膝、腰、肩、足首、肘、または指関節などの関節接合部内に直接投与するステップを含む。たとえば、治療有効量の可溶性形態形成タンパク質複合体は、関節内で軟骨を囲む滑液中に投与することができる。実施態様によっては、軟骨は関節軟骨である。実施態様によっては、軟骨は非関節軟骨である。実施態様によっては、非関節軟骨としては、椎間板、関節間半月板、器官、耳、鼻、肋骨、および咽頭が挙げられるが、これらだけに限らない。好ましい実施態様では、非関節軟骨は椎間板である。別の好ましい実施態様では、非関節軟骨は半月板である。実施態様によっては、軟骨を囲む領域は滑液である。
【００５３】
実施態様によっては、本発明の方法に使用される組成物中の形態形成タンパク質としては、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＤＰＰ、Ｖｇｌ、Ｖｇｒ、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、あるいはこれらの保存的置換改変体、またはフラグメントが挙げられるが、これらだけに限らない。好ましい実施態様では、形態形成タンパク質は、ＯＰ−１、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２またはＣＤＭＰ−３である。より好ましい実施態様では、形態形成タンパク質はＯＰ−１である。
【００５４】
他の実施態様では、形態形成タンパク質は、ヒトＯＰ−１の保存７システイン領域を含むＣ末端１０２〜１０６のアミノ酸に対して少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、この形態形成タンパク質は、軟骨の欠損の修復を誘発することが可能である。
【００５５】
有用な可溶性モルフォゲンタンパク質複合体−−タンパク質の考察
本発明に有用な形態形成タンパク質は、最初に配列の相同性に基づいて単離されたＢＭＰ（ＢＭＰ−１〜ＢＭＰ−１８）である。ＢＭＰ−１以外のすべては、依然、形態形成タンパク質のＢＭＰ族の要素として分類される（Ｏｚｋａｙｎａｋ等、ＥＭＢＯ Ｊ．，９，ｐｐ．２０８５−９３（１９９０年））。その他の有用な形態形成タンパク質は、アミノ酸配列関連のタンパク質、たとえばＤＰＰ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ由来）、Ｖｇｌ（Ｘｅｎｏｐｕｓ由来）、Ｖｇｒ−１（マウス由来、Ｏｐｐｅｒｍａｎｎ等に付与された米国特許第５，０１１，６９１号参照）、ＧＤＦ−１（マウス由来、Ｌｅｅ（１９９１年）ＰＮＡＳ ８８：４２５０−４２５４）、６０Ａタンパク質（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ由来、配列番号２４、Ｗｈａｒｔｏｎ等（１９９１年）ＰＮＡＳ ８８：９２１４−９２１８参照）、およびＯＰ−３である。（たとえば、Ｍａｓｓａｇｕｅ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，６，ｐｐ．５９７−６４１（１９９０年）参照、引用することにより本明細書に援用する）。
【００５６】
ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、およびＯＰ−１（ＢＭＰ−７）のＣ末端領域は、ＢＭＰ−２の領域と約６０％同じであり、ＢＭＰ−６およびＯＰ−１のＣ末端領域は８７％同じである。ＢＭＰ−６は、マウスＶｇｒ−１のト相同体と思われ、２つのタンパク質は、アミノ酸配列レベル全体で９２％同じである（米国特許第５，４５９，０４７号、本明細書に援用する）。ＢＭＰ−６は、Ｘｅｎｏｐｕｓ Ｖｇ−１の生成物と同じである。
【００５７】
タンパク質のＴＧＦ−β上科のサブクラスであるこの族の要素は、図１に大まかに示す構造上の特徴、および７つの保存システイン構造を含むＣ末端領域内の実質的なアミノ酸配列の相同性を共有する。図示のとおり、タンパク質は、一般に約３０残基未満のＮ末端シグナルペプチド配列１２（斜影で図示される「プレプロ」領域、）、次に、点描で図示される「プロ」領域１４を有する前駆ポリペプチド配列１０として翻訳され、この領域は、裂開されて成熟配列１６を形成する。成熟配列は、７つの保存Ｃ末端システイン領域２０、および本明細書ではＮ末端伸張とも呼び、様々な形態形成タンパク質間で配列が著しく異なるＮ末端配列１８の両方を含む。システインは、縦の点線２２で図示される。ポリペプチド鎖は二量体化し、これらの二量体は、一般に、２つのポリペプチド鎖のサブユニットを連結する少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合によって安定化される。
【００５８】
シグナルペプチドは、翻訳後、Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ（（１９８６年）Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １４：４６８３−４６９１）の方法を使用して、特定の配列内で予測可能な裂開部位で迅速に裂開される。図１のタンパク質サブユニット２４の「プロ」形式は、プロ領域および成熟領域、一緒に結合するペプチドを含む。一般に、このプロ形式は、タンパク質が未だ細胞中に存在し、プロ領域が、サブユニットの成熟形式と非共有結合している間に裂開され、培養された哺乳類細胞から分泌される一次形式であると思われる可溶性種を形成する。一般に、従来の精製技術は、複合体を分離する変性状態を使用した。
【００５９】
ＢＭＰタンパク質族の要素のもう１つの特性は、二量体化の明らかな能力である。いくつかの骨由来の骨形成タンパク質（ＯＰ）およびＢＭＰは、その活性形式の同質および異質二量体として見られる。ＯＰおよびＢＭＰが異質二量体を形成する能力は、形態発生誘発能力を形態形成タンパク質に与え得る。異質二量体は、ＯＰおよびＢＭＰ受容体分子の同質二量体とは定量的または定性的に異なる結合親和性を示す。変更された結合親和性は、その結果、異なるシグナル経路を媒介する受容体の活性化差異を生じることができ、最終的に、異なる生物学的活性または結果を生じ得る。変更された結合親和性は、組織または細胞タイプに特有の方法で顕在化され、それによって、特定の前駆物質タイプのみが、増殖および／または分化を生じることが可能である。
【００６０】
哺乳類細胞から分泌された他の可溶性形式の形態形成タンパク質としては、これらのプロ形式の二量体であって、プロ領域が成熟領域から裂開されない二量体、および１つのサブユニットが、プロ形式のポリペプチド鎖サブユニットを含み、他のサブユニットが、裂開された成熟形式のポリペプチド鎖サブユニット（切断型自体を含む）を含み、好ましくは裂開されたプロ領域と非共有結合する「半二量体」がある。
【００６１】
単離されたプロ領域は、一般に、配列の分析、および溶液中の特性の特徴付けによって判断されるように、実質的な疎水性を有する。単離されたプロ領域単独では、水溶液中で著しく可溶性ではなく、変性剤、たとえば浄化剤、尿素、グアニジンＨＣＬなど、および／または１つまたは複数の担体タンパク質の存在を必要とする。したがって、何らかの特定の理論に限定するものではないが、裂開されたプロ領域と、成熟形態形成タンパク質の二量体種との非共有結合会合は、プロ領域の疎水性部分と、二量体種上の対応する疎水性領域との相互作用を伴うと思われ、その相互作用は、さもなければ露出される成熟二量体の疎水性領域を水性の環境に対する暴露から効果的に保護するか、あるいは「隠し」、水溶液に対する成熟二量体の親和性を強化する。
【００６２】
有用なプロ領域は、以下に記載する全長のプロ領域、その様々な切断型、特に、タンパク質分解Ａｒｇ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ裂開部位で裂開された切断型を含む。たとえば、ＯＰ−１では、可能なプロ配列は、残基３０〜２９２（全長形式）；４８〜２９２；および１５８〜２９２によって規定される配列を含む。可溶性ＯＰ−１複合体の安定性は、プロ領域が４８〜２９２切断型などの切断型ではなく、残基３０〜４７が、他の形態形成タンパク質のＮ末端部分に対して配列相同性を示し、すべての形態形成タンパク質に対する複合体の安定性を強化する上で、特定の有用性を有すると考えられる全長形式を含む場合に強化される。したがって、現在好ましいプロ配列は、特定の形態形成タンパク質の全長形式のプロ領域をコードするプロ配列である（以下参照）。有用であると思われるその他のプロ配列としては、生合成プロ配列、特に、１つまたは複数の形態形成タンパク質プロ配列のＮ末端部分から導かれた配列を含むプロ配列がある。
【００６３】
以下の表１は、現在確認されている様々な好ましい形態形成タンパク質について説明し、本明細書で使用するそれぞれの学名、サブユニット配列の様々な領域を規定する配列、それぞれの配列識別参照、それぞれの核酸およびアミノ酸配列に関する出版物の発行元を記述する。これらの出版物の開示事項は、引用することにより本明細書に援用する。規定された成熟タンパク質の配列は、以前から予想されていたこれらの配列の形式である。規定された成熟タンパク質配列は、これらの成熟タンパク質配列は、以前から予想されていたこれらの配列の形式である。上記のとおり、これらの配列の比較的短い切断型も考えられる。好ましくは、切断型の成熟配列は、Ｎ末端伸張の少なくとも１０個のアミノ酸を含む。図２は、以下に記載する多くの好ましい形態形成タンパク質配列のＮ末端伸張を示す。Ａｒｇ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇは、図中で枠に入っているか、あるいは下線が引かれている成熟サブユニット形式の切断型配列を生じ得る。
【００６４】
【表１−１】
【００６５】
【表１−２】
【００６６】
【表１−３】
【００６７】
【表１−４】
【００６８】
【表１−５】
【００６９】
【表１−６】
【００７０】
【表１−７】
ＯＰ−２およびＯＰ−３タンパク質は、この族の他のタンパク質と同様、保存システイン骨格のほかに、追加のシステイン残基をＣ末端領域に有する（たとえば、これらの配列の残基３３８参照）。ＧＤＦ−１タンパク質は、保存骨格（「Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ」）内に４つのアミノ酸挿入を有するが、この挿入は、おそらく折り畳み構造内のシステインの関係を妨げない。さらに、ＣＢＭＰ２タンパク質には、システイン骨格内の１つのアミノ酸残基が欠落している。
【００７１】
二量体形態形成タンパク質種は、還元されると不活性だが、酸化同質二量体として活性であり、本発明の他の形態形成タンパク質と組み合わせて酸化すると活性である。したがって、一実施態様では、可溶性形態形成タンパク質複合体に有用な形態形成タンパク質は、一対のポリペプチド鎖を含む二量体タンパク質であり、各々のポリペプチド鎖は、２００未満のアミノ酸を有し、ＯＰ−１配列番号２の残基３３５〜４３１によって規定された少なくともＣ末端６、好ましくは７システイン骨格から成り、機能的に等価な配置（たとえば、配列中のシステインの線状配置を変更するが、折り畳み構造におけるその関係は変更しないアミノ酸の挿入または除去）を含み、その結果、ポリペプチド鎖が折り畳まれると、ポリペプチド鎖の対を含む二量体タンパク質種は、タンパク質が、本明細書に規定するようにモルフォゲンとして作用することが可能であるように、鎖内または鎖間ジスルフィド結合を含む適切な３次元構造を有する。これらの構造の可溶性は、成熟した二量体形式のモルフォゲンが、本発明に従って、少なくとも１つ、好ましくは２つのプロ領域と複合されると改善される。
【００７２】
機能的に等価な配置としては、参照配列内に配置されたシステイン残基の機能的に等価な配置があり、これらのシステインの線状配置を変更するが、形態発生活動に必要な鎖内または鎖間ジスルフィド結合を形成する能力を有する二量体形態形成タンパク質の折り畳み構造におけるそれぞれの関係を著しく損なわないアミノ酸挿入または除去を含む。機能的に等価な配列としては、さらに、１つまたは複数のアミノ酸残基が、参照配列の対応する残基、たとえば、違いが骨の形態発生活動を損なわないことを条件として、ヒトＯＰ−１のＣ末端７システイン領域（保存７システイン骨格とも呼ばれる）とは異なる配列がある。したがって、参照配列内の対応するアミノ酸の同類置換が好ましい。参照配列内の対応する残基の同類置換であるアミノ酸残基は、対応する参照残基に物理的または機能的に類似する残基、たとえば、類似するサイズ、形状、電荷、共有結合または水素結合などを形成する能力を含む化学特性を有する残基である。特に好ましい同類置換は、引用することにより本明細書に援用される上記の Ｄａｙｈｏｆｆ等で認められている点変異で規定されている基準を満たす同類置換である。
【００７３】
骨形成タンパク質ＯＰ−１は、説明されている（たとえば、Ｏｐｐｅｒｍａｎｎ等、米国特許第５，３５４，５５７号参照。引用することにより、本明細書に援用する）。成熟した天然型の天然由来の骨形成タンパク質は、一般に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで決定された約３０〜３６ｋＤａという明白な分子量を有するグリコシル化二量体である。３０ｋＤａのタンパク質は、還元されると、見かけの分子量約１６ｋＤａおよび１８ｋＤａを有する２つのグリコシル化ペプチドサブユニットを生じる。還元状態では、タンパク質は、検出可能な骨形成活性を示さない。骨形成活性も有するグリコシル化タンパク質は、見かけの分子量約２７ｋＤａを有する。還元されると、２７ｋＤａのタンパク質は、哺乳類で軟骨内骨形成を誘発することが可能な分子量約１４〜１６ｋＤａを有する２つの非グリコシル化ポリペプチドを生じる。骨形成タンパク質は、異なるグリコシル化パターン、異なるＮ末端、および活性切断型または突然変異型の天然のタンパク質を含み得る。上記のとおり、特に有用な配列としては、ＤＰＰ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ由来）、Ｖｇ（Ｘｅｎｏｐｕｓ由来）、Ｖｇｒ−１（マウス由来）、ＯＰ−１およびＯＰ−２タンパク質、（米国特許第５，０１１，６９１号、およびＯｐｐｅｒｍａｎｎ等参照、引用することにより本明細書に援用する）、並びにＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４と呼ばれるタンパク質（国際公開第８８／００２０５号、米国特許第５，０１３，６４９号、および国際公開第９１／１８０９８号参照、引用することにより本明細書に援用する）、ＢＭＰ−５およびＢＭＰ−６（国際公開第Ｏ９０／１１３６６号、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９０／０１６３０明細書、引用することにより本明細書に援用する）、ＢＭＰ−８およびＢＭＰ−９のＣ末端９６または１０２アミノ酸配列を含む配列がある。
【００７４】
本発明の好ましい形態発生および骨形成タンパク質は、少なくとも１つのポリペプチドを含み、たとえば、ＯＰ−１（ＢＭＰ−７）、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＣＯＰ−１、ＣＯＰ−３、ＣＯＰ−４、ＣＯＰ−５、ＣＯＰ−７、ＣＯＰ−１６、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−３ｂ，ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＭＰ１２１、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ドルサリン−１、ＤＰＰ、Ｖｇ−１、Ｖｇｒ−１、６０Ａタンパク質、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、並びにこれらのアミノ酸配列改変体および相同体、たとえばその種相同体があるが、これらだけに限らない。詳細には、形態形成タンパク質としては、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＤＰＰ、Ｖｇｌ、Ｖｇｒ、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、およびそのアミノ酸配列改変体があるが、これらだけに限らない。さらに好ましくは、形態形成タンパク質としては、ＯＰ−１（ＢＭＰ−７）、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２またはＣＤＭＰ−３；より好ましくはＯＰ−１（ＢＭＰ−７）ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２またはＣＤＭＰ−３；および最も好ましくはＯＰ−１（ＢＭＰ−７）から選択された少なくとも１つのポリペプチドがある。
【００７５】
実施態様によっては、骨形成タンパク質は、ヒトＯＰ−１の７保存システイン領域を含むＣ末端１０２〜１０６アミノ酸に対して少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列から成り、この骨形成タンパク質は、軟骨の欠損の修復を誘発することができる。
【００７６】
これらの配列、並びにそれぞれの化学的および物理的特性を開示している出版物としては、ＯＰ−１ ａｎｄ ＯＰ−２（米国特許第５，０１１，６９１号；米国特許第５，２６６，６８３号；Ｏｚｋａｙｎａｋ等、ＥＭＢＯ Ｊ．，９，ｐｐ．２０８５−２０９３（１９９０年）；ＯＰ−３（国際公開第９４／１０２０３号（国際出願ＰＣＴＵＳ９３／１０５２０明細書））；ＢＭＰ−２，ＭＰ−３，ＢＭＰ−４，（国際公開第８８／００２０５号；Ｗｏｚｎｅｙ等Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，ｐｐ．１５２８−１５３４（１９８８年））；ＢＭＰ−５ ａｎｄ ＢＭＰ−６、（Ｃｅｌｅｓｔｅ等、ＰＮＡＳ，８７，９８４３−９８４７（１９９１年））；Ｖｇｒ−１（Ｌｙｏｎｓ等、ＰＮＡＳ，８６，ｐｐ．４５５４−４５５８（１９８９年））；ＤＰＰ（Ｐａｄｇｅｔｔ等、Ｎａｔｕｒｅ，３２５，ｐｐ．８１−８４（１９８７年））；Ｖｇ−１（Ｗｅｅｋｓ，Ｃｅｌｌ，５１，ｐｐ．８６１−８６７（１９８７年））；ＢＭＰ−９（国際公開第９５／３３８３０号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／０７０８４明細書）；ＢＭＰ−１０（国際公開第９４／２６８９３号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５２９０明細書）；ＢＭＰ−１１（国際公開第９４／２６８９２号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５２８８明細書）；ＢＭＰ−１２（国際公開第９５／１６０３５号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／１４０３０明細書）；ＢＭＰ−１３（国際公開第９５／１６０３５号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／１４０３０明細書）；ＧＤＦ−１（国際公開第９２／００３８２号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９１／０４０９６明細書）およびＬｅｅ等、ＰＮＡＳ，８８，ｐｐ．４２５０−４２５４（１９９１年）；ＧＤＦ−８（国際公開第９４／２１６８１号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／０３０１９明細書）；ＧＤＦ−９（国際公開第９４／１５９６６号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／００６８５明細書）；ＧＤＦ−１０（国際公開第９５／１０５３９号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／１１４４０明細書）；ＧＤＦ−１１（国際公開第９６／０１８４５号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／０８５４３明細書）；ＢＭＰ−１５（国際公開第９６／３６７１０号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／０６５４０明細書）；ＭＰ−１２１（国際公開第９６／０１３１６号（国際出願ＰＣＴ／ＥＰ９５／０２５５２明細書）；ＧＤＦ−５（ＣＤＭＰ−１，ＭＰ５２）（国際公開第９４／１５９４９号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／００６５７明細書）および国際公開第９６／１４３３５号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／１２８１４明細書）および国際公開第９３／１６０９９号（国際出願ＰＣＴ／ＥＰ９３／００３５０明細書））；ＧＤＦ−６（ＣＤＭＰ−２，ＢＭＰ１３）（国際公開第９５／０１８０１号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／０７７６２明細書）および国際公開第９６／１４３３５号および国際公開第９５／１０６３５号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／１４０３０明細書））；ＧＤＦ−７（ＣＤＭＰ−３，ＢＭＰ１２）（国際公開第９５／１０８０２号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／０７７９９明細書）および国際公開第９５／１０６３５号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／１４０３０明細書））；ＢＭＰ−１７およびＢＭＰ−１８（米国特許第６，０２７，９１７号）が挙げられる。上記の出版物は、本明細書に援用する。
【００７７】
本発明に有用な骨形成ポリペプチド族、およびその要素は、一般的なアミノ酸配列によって規定することができる。たとえば、一般配列７（配列番号５）および一般配列８（配列番号６）は、それぞれ９６または１０２アミノ酸配列であり、現在までに識別されている好ましいタンパク質族の要素間で共用される相同体を含み、これらのタンパク質族としては、少なくともＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＣＢＭＰ−２Ａ、ＣＢＭＰ−２Ｂ、ＢＭＰ−３、６０Ａ、ＤＰＰ、Ｖｇｌ、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、Ｖｇｒ−１、およびＧＤＦ−１を含む。これらのタンパク質のアミノ酸配列は、上記で概略を述べたとおり、本明細書および／または先行技術に記載されている。この一般配列は、６および７システイン骨格（それぞれ一般配列７および８）によって規定されるＣ末端領域内のこれらの配列によって共用されるアミノ酸同一性、および配列内の可変位置の代替残基の両方を含む。この一般配列は、分子内または分子間ジスルフィド結合が、折り畳み構造の三次構造に影響すると思われる特定の臨界アミノ酸を形成し、含むことが可能な適切なシステイン骨格を提供する。さらに、一般配列は、位置３６（一般配列７）または位置４１（一般配列８）に追加のシステインを可能にし、それによって、ＯＰ−２およびＯＰ−３の形態形成的に活性の配列を含む。
【００７８】
一般配列７（配列番号３８）
【００７９】
【数１】
ここで、各々のＸａａは、以下のように規定される１つまたは複数の特異的アミノ酸群から選択される：「ｒｅｓ．」は「残基」を意味し、ｒｅｓ．２のＸａａ＝（ＴｙｒまたはＬｙｓ）；ｒｅｓ．３のＸａａ＝ＶａｌまたはＩｌｅ）；ｒｅｓ．４のＸａａ＝（Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕ）；ｒｅｓ．６のＸａａ＝（Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、ＬｙｓまたはＡｌａ）；ｒｅｓ．７のＸａａ＝（ＡｓｐまたはＧｌｕ）；ｒｅｓ．８のＸａａ＝（Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＩｌｅ）；ｒｅｓ．１１のＸａａ＝（Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、ＡｓｎまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．１２のＸａａ＝（Ａｓｐ、Ａｒｇ、ＡｓｎまたはＧｌｕ）；ｒｅｓ．１３のＸａａ＝（ＴｒｐまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．１４のＸａａ＝（ＩｌｅまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．１５のＸａａ＝（ＩｌｅまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．１６のＸａａ＝（ＡｌａまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．１８のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、ＰｒｏまたはＡｒｇ）；ｒｅｓ．１９のＸａａ＝（ＧｌｙまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．２０のＸａａ＝（ＴｙｒまたはＰｈｅ）；ｒｅｓ．２１のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｍｅｔ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、ＬｅｕまたはＧｌｙ）；ｒｅｓ．２３のＸａａ＝（Ｔｙｒ、ＡｓｎまたはＰｈｅ）；ｒｅｓ．２６のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、ＡｌａまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．２８のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、ＧｌｎまたはＡｌａ）；ｒｅｓ．３０のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、ＩｌｅまたはＡｓｎ）；ｒｅｓ．３１のＸａａ＝（Ｐｈｅ、ＬｅｕまたはＴｙｒ）；ｒｅｓ．３３のＸａａ＝（Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＭｅｔ）；ｒｅｓ．３４のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｌａ、ＴｈｒまたはＰｒｏ）；ｒｅｓ．３５のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、ＡｌａまたはＬｙｓ）；ｒｅｓ．３６のＸａａ＝（Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、ＳｅｒまたはＩｌｅ）；ｒｅｓ．３７のＸａａ＝（Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、ＧｌｙまたはＬｅｕ）；ｒｅｓ．３８のＸａａ＝（Ａｓｎ、ＳｅｒまたはＬｙｓ）；ｒｅｓ．３９のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｓｅｒ、ＧｌｙまたはＰｒｏ）；ｒｅｓ．４０のＸａａ＝（Ｔｈｒ、ＬｅｕまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．４４のＸａａ＝（Ｉｌｅ、ＶａｌまたはＴｈｒ）；ｒｅｓ．４５のＸａａ＝（Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＭｅｔまたはＩｌｅ）；ｒｅｓ．４６のＸａａ＝（ＧｌｎまたはＡｒｇ）；ｒｅｓ．４７のＸａａ＝（Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．４８のＸａａ＝（ＬｅｕまたはＩｌｅ）；ｒｅｓ．４９のＸａａ＝（ＶａｌまたはＭｅｔ）；ｒｅｓ．５０のＸａａ＝（Ｈｉｓ、ＡｓｎまたはＡｒｇ）；ｒｅｓ．５１のＸａａ＝（Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｌａまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．５２のＸａａ＝（Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＧｌｙまたはＬｅｕ）；ｒｅｓ．５３のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、ＧｌｙまたはＰｈｅ）；ｒｅｓ．５４のＸａａ＝（Ｐｒｏ、ＳｅｒまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．５５のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、ＰｒｏまたはＬｙｓ）；ｒｅｓ．５６のＸａａ＝（Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、ＩｌｅまたはＨｉｓ）；ｒｅｓ．５７のＸａａ＝（Ｖａｌ、ＡｌａまたはＩｌｅ）；ｒｅｓ．５８のＸａａ＝（ＰｒｏまたはＡｓｐ）；ｒｅｓ．５９のＸａａ＝（Ｌｙｓ、ＬｅｕまたはＧｌｕ）；ｒｅｓ．６０のＸａａ＝（Ｐｒｏ、ＶａｌまたはＡｌａ）；ｒｅｓ．６３のＸａａ＝（ＡｌａまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．６５のＸａａ＝（Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＧｌｕ）；ｒｅｓ．６６のＸａａ＝（Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＧｌｕ）；ｒｅｓ．６７のＸａａ＝（Ｌｅｕ、ＭｅｔまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．６８のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｙ）；ｒｅｓ．６９のＸａａ＝（Ａｌａ、ＰｒｏまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．７０のＸａａ＝（Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、ＶａｌまたはＬｅｕ）；ｒｅｓ．７１のＸａａ＝（Ｓｅｒ、ＡｌａまたはＰｒｏ）；ｒｅｓ．７２のＸａａ＝（Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＭｅｔまたはＩｌｅ）；ｒｅｓ．７４のＸａａ＝（ＴｙｒまたはＰｈｅ）；ｒｅｓ．７５のＸａａ＝（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ＬｅｕまたはＨｉｓ）；ｒｅｓ．７６のＸａａ＝（Ａｓｐ、ＡｓｎまたはＬｅｕ）；ｒｅｓ．７７のＸａａ＝（Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、ＡｒｇまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．７８のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、ＴｙｒまたはＡｓｐ）；ｒｅｓ．７９のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、ＧｌｕまたはＬｙｓ）；ｒｅｓ．８０のＸａａ＝（Ａｓｎ、ＴｈｒまたはＬｙｓ）；ｒｅｓ．８２のＸａａ＝（Ｉｌｅ、ＶａｌまたはＡｓｎ）；ｒｅｓ．８４のＸａａ＝（ＬｙｓまたはＡｒｇ）；ｒｅｓ．８５のＸａａ＝（Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、ＡｒｇまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．８６のＸａａ＝（Ｔｙｒ、ＧｌｕまたはＨｉｓ）；ｒｅｓ．８７のＸａａ＝（Ａｒｇ、Ｇｌｎ、ＧｌｕまたはＰｒｏ）；ｒｅｓ．８８のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ｇｌｕ、ＴｉｐまたはＡｓｐ）；ｒｅｓ．９０のＸａａ＝（Ｖａｌ、Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＩｌｅ）；ｒｅｓ．９２のＸａａ＝（Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ａｓｐ、ＧｌｎまたはＧｌｕ）；ｒｅｓ．９３のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｇｌｙ、ＧｌｕまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．９５のＸａａ＝（ＧｌｙまたはＡｌａ）、ｒｅｓ．９７のＸａａ＝（ＨｉｓまたはＡｒｇ）である。
【００８０】
一般配列８（配列番号３９）は、さらに以下の配列（配列番号４０）をそのＮ末端に含む：
配列番号４０
【００８１】
【数２】
したがって、残基７から開始して、一般配列８内の「Ｘａａ」は、一般配列７に関して規定された特異的アミノ酸であり、これは、一般配列７に関して記載された各々の残基番号は、一般配列８において５だけ変位するという特徴を有する。したがって、一般配列７の「ｒｅｓ．２におけるＸａａ＝（ＴｙｒまたはＬｙｓ）」は、一般配列８のｒｅｓ．７におけるＸａａを指示する。一般配列８では、ｒｅｓ．２におけるＸａａ＝（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ＡｌａまたはＧｌｎ）；ｒｅｓ．３におけるＸａａ＝（Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＭｅｔ）；ｒｅｓ．４におけるＸａａ＝（Ｈｉｓ、ＡｒｇまたはＧｌｎ）；およびｒｅｓ． ５におけるＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、ＧＩｙ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、またはＴｙｒ）である。
【００８２】
別の実施態様では、有用な骨形成タンパク質は、以下に規定する一般配列９および１０を含む。
【００８３】
特に、一般配列９および１０は、以下のタンパク質の複合アミノ酸配列である：ヒトＯＰ−１、ヒトＯＰ−２、ヒトＯＰ−３、ヒトＢＭＰ−２、ヒトＢＭＰ−３、ヒトＢＭＰ−４、ヒトＢＭＰ−５、ヒトＢＭＰ−６、ヒトＢＭＰ−８、ヒトＢＭＰ−９、ヒトＢＭＰ １０、ヒトＢＭＰ−１１、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ６０Ａ、Ｘｅｎｏｐｕｓ Ｖｇ−１、ｓｅａ ｕｒｃｈｉｎ ＵＮＩＶＩＮ、ヒトＣＤＭＰ−１（マウスＧＤＦ−５）、ヒトＣＤＭＰ−２（マウスＧＤＦ−６、ヒトＢＭＰ−１３）、ヒトＣＤＭＰ−３（マウスＧＤＦ−７、ヒトＢＭＰ−１２）、マウスＧＤＦ−３、ヒトＧＤＦ−１、マウスＧＤＦ−１、ニワトリＤＯＲＳＡＬＩＮ、ｄｐｐ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＳＣＲＥＷ、マウスＮＯＤＡＬ、マウスＧＤＦ−８、ヒトＧＤＦ−８、マウスＧＤＦ−９、マウスＧＤＦ−１０、ヒトＧＤＦ−１ｌ、マウスＧＤＦ−１１、ヒトＢＭＰ−１５、およびラットＢＭＰ３ｂ。一般配列７と同様、一般配列９は、Ｃ末端６システイン骨格を含む９６アミノ酸配列であり、一般配列８と同様、一般配列１０は、７システイン骨格を含む１０２アミノ酸配列である。
【００８４】
一般配列９（配列番号４１）
【００８５】
【数３】
ここで、Ｘａａは、以下に規定される１つまたは複数の特異的アミノ酸群から個々に選択される：「ｒｅｓ．」は、「残基」を含み、ｒｅｓ．１のＸａａ＝（Ｐｈｅ、ＬｅｕまたはＧｌｕ）；ｒｅｓ．２のＸａａ＝（Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、ＶａｌまたはＧｌｕ）；ｒｅｓ．３のＸａａ＝（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＡｓｐ）；ｒｅｓ．４のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＡｓｎまたはＰｈｅ）；ｒｅｓ．５のＸａａ＝（ＰｈｅまたはＧｌｕ）；ｒｅｓ．６のＸａａ＝（Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、ＡｌａまたはＡｓｎ）；ｒｅｓ．７のＸａａ＝（Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、ＡｌａまたはＧｌｎ）；ｒｅｓ．８のＸａａ＝（Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、ＩｌｅまたはＰｈｅ）；ｒｅｓ．９のＸａａ＝（Ｇｌｙ、ＨｉｓまたはＬｙｓ）；ｒｅｓ．１０のＸａａ＝（ＴｒｐまたはＭｅｔ）；ｒｅｓ．１１のＸａａ＝（Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、ＳｅｒまたはＧｌｙ）；ｒｅｓ．１２のＸａａ＝（Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ＧｌｕまたはＨｉｓ）；ｒｅｓ．１３のＸａａ＝（ＴｒｐまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．１４のＸａａ＝（ＩｌｅまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．１５のＸａａ＝（ＩｌｅまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．１６のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｓｅｒ、ＴｙｒまたはＴｒｐ）；ｒｅｓ．１８のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、ＨｉｓまたはＬｙｓ）；ｒｅｓ．１９のＸａａ＝（Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、ＡｒｇまたはＰｈｅ）；ｒｅｓ．２０のＸａａ＝（ＴｙｒまたはＰｈｅ）；ｒｅｓ．２１のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、ＬｙｓまたはＴｈｒ）；ｒｅｓ．２２のＸａａ＝（ＡｌａまたはＰｒｏ）；ｒｅｓ．２３のＸａａ＝（Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、ＡｌａまたはＡｒｇ）；ｒｅｓ．２４のＸａａ＝（Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、ＰｈｅまたはＡｒｇ）；ｒｅｓ．２６のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ＧｌｎまたはＧｌｙ）；ｒｅｓ．２８のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＧｌｎ）；ｒｅｓ．３０のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、ＧｌｎまたはＬｅｕ）；ｒｅｓ．３１のＸａａ＝（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、ＧｌｙまたはＡｒｇ）；ｒｅｓ．３２のＸａａ＝（Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＡｌａまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．３３のＸａａ＝（Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｇｌｕ、ＰｈｅまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．３４のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ａｒｇ、ＬｅｕまたはＰｒｏ）；ｒｅｓ．３５のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、ＧｌｎまたはＨｉｓ）；ｒｅｓ．３６のＸａａ＝（Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｃｙｓ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、ＧｌｕまたはＧｌｙ）；ｒｅｓ．３７のＸａａ＝（Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、ＧｌｙまたはＴｙｒ）；ｒｅｓ．３８のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、ＶａｌまたはＡｒｇ）；ｒｅｓ．３９のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、ＰｒｏまたはＰｈｅ）；ｒｅｓ．４０のＸａａ＝（Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、ＨｉｓまたはＭｅｔ）；ｒｅｓ．４１のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、ＴｈｒまたはＧｌｎ）；ｒｅｓ．４２のＸａａ＝（Ｈｉｓ、ＴｙｒまたはＬｙｓ）；ｒｅｓ．４３のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＬｅｕまたはＴｙｒ）；ｒｅｓ．４４のＸａａ＝（Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ＭｅｔまたはＰｒｏ）；ｒｅｓ．４５のＸａａ＝（Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、ＩｌｅまたはＨｉｓ）；ｒｅｓ．４６のＸａａ＝（Ｇｌｎ、ＡｒｇまたはＴｈｒ）；ｒｅｓ．４７のＸａａ＝（Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、ＡｓｎまたはＨｉｓ）；ｒｅｓ．４８のＸａａ＝（Ｌｅｕ、ＡｓｎまたはＩｌｅ）；ｒｅｓ．４９のＸａａ＝（Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＰｒｏまたはＩｌｅ）；ｒｅｓ．５０のＸａａ＝（Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、ＴｙｒまたはＧｌｎ）；ｒｅｓ．５１のＸａａ＝（Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、ＧｌｙまたはＧｌｎ）；ｒｅｓ．５２のＸａａ＝（Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、ＡｌａまたはＴｙｒ）；ｒｅｓ．５３のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、ＬｅｕまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．５４のＸａａ＝（Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＶａｌまたはＡｓｐ）；ｒｅｓ．５５のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、ＰｒｏまたはＨｉｓ）；ｒｅｓ．５６のＸａａ＝（Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、ＧｌｙまたはＡｒｇ）；ｒｅｓ．５７のＸａａ＝（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、ＬｅｕまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．５８のＸａａ＝（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＡｌａ）；ｒｅｓ．５９のＸａａ＝（Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、ＡｒｇまたはＧｌｙ）；ｒｅｓ．６０のＸａａ＝（Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＴｈｒまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．６１のＸａａ＝（Ｃｙｓ、ＶａｌまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．６３のＸａａ＝（Ａｌａ、ＶａｌまたはＴｈｒ）；ｒｅｓ．６５のＸａａ＝（Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、ＡｓｐまたはＴｙｒ）；ｒｅｓ．６６のＸａａ＝（Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、ＡｒｇまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．６７のＸａａ＝（Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、ＴｈｒまたはＴｙｒ）；ｒｅｓ．６８のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＬｙｓまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．６９のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｐｒｏ、ＧｌｙまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．７０のＸａａ＝（Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、ＬｅｕまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．７１のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＡｓｎまたはＧｌｙ）；ｒｅｓ．２のＸａａ＝（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＭｅｔ）；ｒｅｓ．７４のＸａａ＝（Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、ＴｙｒまたはＭｅｔ）；ｒｅｓ．７５のＸａａ＝（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、ＧｌｎまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．７６のＸａａ＝（Ａｓｐ、Ｌｅｕ、ＡｓｎまたはＧｌｕ）；ｒｅｓ．７７のＸａａ＝（Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、ＧｌｙまたはＰｒｏ）；ｒｅｓ．７８のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ｍｅｔ、Ｇｌｕ、ＡｓｎまたはＬｙｓ）；ｒｅｓ．７９のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、ＧｌｎまたはＡｒｇ）；ｒｅｓ．８０のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、ＳｅｒまたはＧｌｎ）；ｒｅｓ．８１のＸａａ＝（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、ＴｈｒまたはＡｌａ）；ｒｅｓ．８２のＸａａ＝（Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、ＡｓｐまたはＡｌａ）；ｒｅｓ．８３のＸａａ＝（Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、ＬｙｓまたはＩｌｅ）；ｒｅｓ．８４のＸａａ＝（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、ＧｌｕまたはＧｌｙ）；ｒｅｓ．８５のＸａａ＝（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、ＧｌｕまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．８６のＸａａ＝（Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、ＧｌｕまたはＩｌｅ）；ｒｅｓ．８７のＸａａ＝（Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＰｒｏまたはＬｙｓ）；ｒｅｓ．８８のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、ＧｌｙまたはＬｙｓ）；ｒｅｓ．８９のＸａａ＝（ＭｅｔまたはＡｌａ）；ｒｅｓ．９０のＸａａ＝（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＬｙｓ）； のＸａａｒｅｓ ９１＝（ＶａｌまたはＡｌａ）；ｒｅｓ．９２のＸａａ＝（Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｖａｌ、Ａｌａ、ＳｅｒまたはＴｈｒ）；ｒｅｓ．９３のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、ＡｒｇまたはＴｈｒ）；ｒｅｓ．９５のＸａａ＝（Ｇｌｙ、ＡｌａまたはＴｈｒ）；ｒｅｓ．９７のＸａａ＝（Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、ＬｅｕまたはＳｅｒ）である。さらに、ｒＢＭＰ３ｂおよびｍＧＤＦ−１０のｒｅｓ．５３後、Ｈｅが存在し；ＧＤＦ−１のｒｅｓ．５４後、Ｔが存在し；ＢＭＰ３のｒｅｓ．５４、Ｖが存在し；ＢＭＰ−８およびＤｏｒｓａｌｉｎのｒｅｓ．７８後、Ｇが存在し；ｈＧＤＦ−１のｒｅｓ．３７後、Ｐｒｏ、ＧＩｙ、ＧＩｙ、Ｐｒｏが存在する。
【００８６】
一般配列１０（配列番号４２）は、すべての一般配列９（配列番号４１）を含み、さらに、次の配列（配列番号４０）をＮ末端に含む：
配列番号４０
【００８７】
【数４】
したがって、残基６から開始して、一般配列１０の各々の「Ｘａａ」は、一般配列９に関して規定される特異的アミノ酸であり、一般配列９に関して記載される各々の残基番号は、一般配列１０において５だけ変位するという特徴を有する。したがって、一般配列９における「ｒｅｓ．１の Ｘａａ＝（Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、ＶａＩまたはＧｌｕ）」は、一般配列１０のｒｅｓ．６を指示する。一般配列１０では、ｒｅｓ．２のＸａａ＝（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、ｏｒ Ｃｙｓ）；ｒｅｓ．３のＸａａ＝（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、またはＡｌａ）；ｒｅｓ．４のＸａａ＝（Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、ＶａＩ、Ｐｒｏ、またはＴｙｒ）；およびｒｅｓ．５のＸａａ＝（Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、またはＬｅｕ）である。
【００８８】
非天然骨形成タンパク質は、一連のコンセンサスＤＮＡ配列を使用して合成された（米国特許第５，３２４，８１９号、本明細書に援用する）。これらのコンセンサス配列は、天然の骨形成生成物から得られた部分アミノ酸配列、および文献に記載されており、予想または実証された展開機能を有するその他の遺伝子との、観察された相同性に基づいて設計された。
【００８９】
生合成されたコンセンサス配列（コンセンサス骨形成タンパク質、または「ＣＯＰ」と呼ばれる）のいくつかは、原核生成物中に融合タンパク質として発現された（たとえば、米国特許第５，０１１，６９１号参照、引用することにより、本明細書に援用する。）このようなタンパク質としては、ＣＯＰ−１、ＣＯＰ−３、ＣＯＰ−４、ＣＯＰ−５、ＣＯＰ−７、およびＣＯＰ−１６、並びに先行技術で公知のタンパク質がある。精製タンパク質は、裂開し、再度折り重ね、確立されている動物モデル中に移植し、骨および／または軟骨誘発活動を有することを実証し得る。現在好ましい合成骨形成タンパク質は、ＣＯＰ−５（配列番号４３）およびＣＯＰ−７（配列番号４４）として指示される２つの合成アミノ酸配列を含む。
【００９０】
Ｏｐｐｅｒｍａｎｎ等、米国特許第５，０１１，６９１号および第５，３２４，８１９号は、以下に示すＣＯＰ−５およびＣＯＰ−７のアミノ酸配列を記載しており、これらの特許は、引用することにより本明細書に援用する。
【００９１】
【数５】
これらのアミノ酸配列では、ダッシュ（−）は、関連タンパク質の類似配列を列挙するためにのみ、フィラーとして使用される。整列されたアミノ酸配列間の差が強調される。
【００９２】
上記のＤＮＡおよびアミノ酸配列、並びに他のＢＭＰ族の要素については発行されており、新たに特定されるタンパク質がＢＭＰ族に属するかどうかを判断するために、当業者によって使用され得る。新たなＢＭＰ関連のその対立遺伝子の遺伝子生成物は、少なくとも１つの形態形成活動を有することが類推によって予想され、その結果ＢＭＰとして分類される。
【００９３】
本発明の好ましい一実施態様では、形態形成タンパク質は、ジスルフィド結合して二量体種を生成する一対のサブユニットを含み、少なくとも１つのサブユニットは、ＢＭＰタンパク質族に属する組換え型ペプチドを含む。本発明のもう１つの好ましい実施態様では、形態形成タンパク質は、非共有相互作用によって形成される二量体種を生成する一対のサブユニットであって、少なくとも一方のサブユニットが、ＢＭＰタンパク質族に属する組換え型ペプチドを含むサブユニットを含む。非共有相互作用としては、Ｖａｎ ｄｅｒ
Ｗａａｌｓ、水素結合、および疎水性および静電気的相互作用がある。二量体種は、同質二量体または異質二量体でよく、細胞の増殖および／または組織の形成を誘発することが可能である。
【００９４】
一定の好ましい実施態様では、本明細書で有用な形態形成タンパク質として、アミノ酸配列が、上記の自然に発生するタンパク質から選択される参照形態形成タンパク質に対して、少なくとも７０％のアミノ酸配列の相同性または「類似性」、および好ましくは７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％ノ相同性または類似性を共用する配列を含むタンパク質が挙げられる。好ましくは、参照タンパク質はヒトＯＰ−１であり、その参照配列は、骨形成的に活性の形式の配列番号２のヒトＯＰ−１、残基３３０−４３１に存在するＣ末端７システイン領域である。一定の実施態様では、参照モルフォゲンポリペプチドと機能的に等価であると思われるポリペプチドは、Ａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）などのコンピュータプログラムにより便利に実施される上記のＮｅｅｄｌｅｍａｎ等の方法を使用して、それらのポリペプチドと整列される。上記のとおり、候補配列内の内部の隙間およびアミノ酸挿入は、規定の関係を計算する目的上無視され、この関係は、候補配列および参照配列間のアミノ酸配列の相同性または同一性のレベルとして従来表現される。「アミノ酸配列の相同性」は、本明細書では、アミノ酸配列同一性および類似性の両方を含むと考えられる。相同配列は、同じかおよび／または類似のアミノ酸残基を共用し、この場合、類似残基は、整列した参照配列内の対応するアミノ酸残基の保存置換、または「許容される点変異」である。したがって、参照配列と７０％のアミノ酸相同性を共用する候補ポリペプチド配列は、任意の７０％の整列残基が、参照配列内の対応する残基と同じであるか、あるいは同類置換である配列である。現在好ましい実施態様では、参照配列はＯＰ−１である。したがって、本明細書で有用な形態形成タンパク質としては、自然に発生するか、あるいは生合成的に生成されるかに関わらず、対立遺伝子、系統発生学的な対照物、および好ましい参照配列の改変体（（たとえば、「突然変異タンパク質」または「変異タンパク質」を含む）、並びに上記に記載および特定されるタンパク質を含む一般的な形態形成族のタンパク質の新規な要素がある。一定の特に好ましい形態形成ポリペプチドは、ヒトＯＰ−１の好ましい参照配列に対して少なくとも６０％のアミノ酸同一性、より好ましくはこの配列に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％のアミノ酸同一性を共用する。
【００９５】
もう１つの実施態様では、有用な骨形成タンパク質として、本明細書で定義するとおり、保存７システイン領域を共用し、Ｃ末端活性領域内で、少なくとも７０％のアミノ酸配列の相同性（類似性）を共用するタンパク質がある。さらに別の実施態様では、本発明の骨形成タンパク質は、ＯＰＸ（配列番号４５）および一般配列７（配列番号３８）および８（配列番号３９）、または一般配列９（配列番号４１）および１０（配列番号４２）を含む、本明細書に規定される一般配列の任意の１つを有する骨形成的に活性のタンパク質として定義される。
【００９６】
上記のとおり、本発明に有用であり、現在好ましい一定の骨形成ポリペプチド配列は、ｈＯＰ−１の好ましい参照配列を規定するアミノ酸配列に対して、６０％を超える同一性、好ましくは６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％を超える同一性を有する。これらの特に好ましい配列としては、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ６０Ａタンパク質を含む、ＯＰ−１およびＯＰ−２タンパク質の対立遺伝子および系統発生学的な対照物の改変体がある。したがって、特に好ましい実施態様では、有用な形態形成タンパク質としては、本明細書で「ＯＰＸ」（配列番号４５）と呼ぶ一般アミノ酸配列内のポリペプチド鎖の対を含む活性タンパク質があり、ＯＰＸは、７つのシステイン骨格を規定し、ＯＰ−１およびＯＰ−２の特定されたいくつかの改変体間の相同性を提供する。そこに記載されているとおり、一定の位置におけるＸａａは個々に、マウスまたはヒトＯＰ−１またはＯＰ−２内の対応する位置に生じる残基から選択される。
【００９７】
【数６】
【００９８】
【数７】
ここで、ｒｅｓ．２のＸａａ＝（ＬｙｓまたはＡｒｇ）；ｒｅｓ．３のＸａａ＝（ＬｙｓまたはＡｒｇ）；ｒｅｓ．１１のＸａａ＝（ＡｒｇまたはＧｌｎ）；ｒｅｓ．１６のＸａａ＝（ＧｌｎまたはＬｅｕ）；ｒｅｓ．１９のＸａａ＝（ＩｌｅまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．２３のＸａａ＝（ＧｌｕまたはＧｌｎ）；ｒｅｓ．２６のＸａａ＝（ＡｌａまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．３５のＸａａ＝（ＡｌａまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．３９のＸａａ＝（ＡｓｎまたはＡｓｐ）；ｒｅｓ．４１のＸａａ＝（ＴｙｒまたはＣｙｓ）；ｒｅｓ．５０のＸａａ＝（ＶａｌまたはＬｅｕ）；ｒｅｓ．５２のＸａａ＝（ＳｅｒまたはＴｈｒ）；ｒｅｓ．５６のＸａａ＝（ＰｈｅまたはＬｅｕ）；ｒｅｓ．５７のＸａａ＝（ＩｌｅまたはＭｅｔ）；ｒｅｓ．５８のＸａａ＝（ＡｓｎまたはＬｙｓ）；ｒｅｓ．６０のＸａａ＝（Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＡｓｎ）；ｒｅｓ．６１のＸａａ＝（Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．６５のＸａａ＝（ＰｒｏまたはＡｌａ）；ｒｅｓ．７１のＸａａ＝（ＧｌｎまたはＬｙｓ）；ｒｅｓ．７３のＸａａ＝（ＡｓｎまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．７５のＸａａ＝（ＩｌｅまたはＴｈｒ）；ｒｅｓ．８０のＸａａ＝（ＰｈｅまたはＴｙｒ）；ｒｅｓ．８２のＸａａ＝（ＡｓｐまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．８４のＸａａ＝（ＳｅｒまたはＡｓｎ）；ｒｅｓ．８９のＸａａ＝（ＬｙｓまたはＡｒｇ）；ｒｅｓ．９１のＸａａ＝（ＴｙｒまたはＨｉｓ）；ｒｅｓ．９７のＸａａ＝（ＡｒｇまたはＬｙｓ）である。
【００９９】
ＩＩ．可溶性モルフォゲンタンパク質複合体の組換え型生成物
可溶性形態形成タンパク質複合体は、真核生物宿主細胞、好ましくは哺乳類細胞から、米国特許第６，３９５，８８３号に記載されているような標準の組換え型発現技術を使用して、生成することができ、この特許は、引用することにより、本明細書に援用する。現在好ましい例示的なプロトコルは、特定のベクター構造体およびチャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）由来の細胞株を使用して以下に記載する。当業者は、その他の発現系は、その他のベクターおよびその他の細胞系を含めて有用であり、本発明は、以下に詳細に記載する方法によってのみ生成される可溶性形態形成タンパク質複合体に限定することを意図するものではないことを理解するであろう。本明細書に記載する結果に類似する結果は、ＣＯＳおよびＢＳＣ細胞に関して開発された組換え型発現系を使用して観察された。
【０１００】
前駆配列をコードする形態形成タンパク質ＤＮＡは、市販の適切なｐＵＣ型ベクター（たとえば、ｐＵＣ−１９、ＡＴＣＣ＃３７２５４、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．、並びに適切なプロモータ／エンハンサ配列および３’末端配列の挿入部位にサブクローニングされる。有用なＤＮＡ配列は、これらのタンパク質、および／または合成構造体をコードする発行済み配列を含む。現在好ましいプロモータ／エンハンサ配列は、ラウス肉腫ウィルスＬＴＲエンハンサ配列（たとえば、パロアルトのＣｌｏｎｅｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．から市販）によってブースとされるＣＭＶプロモータ（ヒトサイトメガロウィルス主要中間体−早期プロモータ）、およびマウス乳癌ウィルスプロモータ（ｍＭＴＶ）である。発現は、転写活性化するエンハンサ配列を使用してさらに強化され得る。プラスミドは、ＳＶ４０早期プロモータコントロール（ＡＴＣＣ ＃３７１４８）下で、増幅可能なマーカーとしてＤＨＦＲも含む。トランスフェクション、細胞培養、遺伝子増幅、およびタンパク質発現条件は、たとえばＡｕｓｕｂｅｌ等、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ニューヨーク州、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８９年）に記載されているような先行技術で公知の標準の条件である。簡潔に述べるなら、トランスフェクト細胞は、０．１〜０．５％の透析されたウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含む媒体中で培養され、安定してトランスフェクトされる高発現細胞株は、サブクローニングによって得られ、標準のウェスタンまたはノーザンブロットによって評価される。サザンブロットは、統合配列の状態、およびそのコピー数増幅の程度を評価するためにも使用される。
【０１０１】
現在好ましい発現ベクターは、ＳＶ４０早期プロモータコントロール下で、選択マーカーおよび誘導遺伝子増幅用因子の両方としてＤＨＦＲ遺伝子を含む。ＤＨＦＲのＤＮＡ配列は、先行技術で十分に特徴付けられており、市販されている。たとえば、適切なベクターは、ネオ遺伝子（ＢａｍＨＩ ｄｉｇｅｓｔ）をＳｐｈｌ−ＢａｍＨＩ、またはＳＶ４０早期プロジェクタコントロール下でＤＨＦＲ遺伝子を含むｐＳＶ５−ＤＨＦＲ（ＡＴＣＣ ＃３７１４８）からのＰｖｕＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントと置換することによって、ｐＭＡＭ−ｎｅｏ（カリフォルニア州、パロアルトのＣｌｏｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）から生成され得る。ＢａｍＨＩ部位は、標準の技術（たとえば、リンカーの挿入または部位特異的突然変異誘発法）を使用して、ＳｐｈｌまたはＰｖｕＩＩ部位においてエンジニアリングして、フラグメントをベクターバックボーンに挿入することを可能にすることができる。形態形成タンパク質ＤＮＡは、ＭＭＴＶ−ＬＴＲ配列（マウス乳癌ウィルスＬＴＲ）の下流のポリリンカー部位に挿入することができる。次に、ＣＭＶプロモータ配列は、発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．のｐＣＤＭ８）中に挿入され得る。ＤＨＦＲ発現を促進するＳＶ４０早期プロモータは、好ましくは、生成されるＤＨＦＲ ｍＲＮＡのレベルを減少させるために、これらのベクター内で変更される。
【０１０２】
現在好ましい哺乳類細胞株は、ＣＨＯチャイニーズハムスターの卵巣、細胞株であり、安定した形態形成タンパク質の生成細胞株を高発現レベルで確立するのに好ましい手順は、上記の発現ベクターを使って安定ＣＨＯ細胞株、好ましくはＣＨＯ−ＤＸＢ１１をトランスフェクトし、高形態形成タンパク質発現レベルでクローンを単離し、以下に記載する限定希釈法を使用して、これらのクローンにサブクローニングを施し、高発現クローンの母集団を取得することを含む。サブクローニングは、好ましくは、形態形成タンパク質を生成するための成長媒体にＭＴＸを追加する必要のない安定した高発現クローンを識別するために、ＭＴＸが存在しない状態で行われる。
【０１０３】
サブクローニングプロトコルでは、細胞は、１０個の１００ｍｍペトリ皿上に、一皿当たり５０または１００個の細胞という細胞密度で、培地中にＭＴＸを含むか、または好ましくは含まない状態で播種される。１４日間の成長後、クローンは、クローニングシリンダーおよび標準の手順を使用して単離し、２４ウェルプレート内で培養される。クローンは、次に、標準手順を使用してウェスタン免疫部ロットにより、および親株に匹敵する形態形成タンパク質発現レベルで、形態形成タンパク質発現に関してスクリーニングされる。高発現サブクローニングの細胞株の安定性は、次に、複数の細胞通過全体で（たとえば、４回または５回）、形態形成タンパク質発現を監視することによって判断される。
【０１０４】
ＩＩＩ．馴化培地または体液からの可溶性モルフォゲンタンパク質複合体の単離
形態形成タンパク質は、哺乳類細胞から、可溶性複合体として発現される。しかし、一般に、複合体は、一般に、精製溶液、たとえば浄化剤、アルコール、有機溶剤、カオトロピック剤、および溶液のｐＨを低下させるために添加される化合物に添加されることが多い変性剤に暴露することによって精製時に分離される。非変性状態で、可溶性タンパク質を馴化培地（または任意に、血清、脳脊髄液、または腹水などの体液）から精製するために現在好ましいプロトコルについて、以下に記載する。この方法は、迅速で再現可能であり、実質的に純粋な形式で単離可溶性形態形成タンパク質複合体を生じる。
【０１０５】
可溶性形態形成タンパク質複合体は、変性剤が存在しない状態で行われる単純な３段階の式層分析プロトコルを使用して、馴化培地から単離することができる。このプロトコルは、親和カラム上に媒体（または体液）を流し、次にイオン交換およびゲル濾過クロマトグラフィを行うことを含む。以下に記載する親和カラムは、Ｚｎ−ＩＭＡＣカラムである。このプロトコルは、多様な形態形成タンパク質の精製に対する一般的な適用性を有し、これらのタンパク質のすべては、以下に記載するプロトコルをごくわずかに変更して使用することで単離可能であると予想される。代替プロトコルは、標準の手順、たとえば一定の形態形成タンパク質のプロ領域に特有の抗体を使用して形成される（たとえば、タンパク質Ａ共役セファロースカラムに合成される）有用な免疫親和カラムを有することも考えられる。免疫親和カラムを展開するためのプロトコルは、先行技術で十分に説明されている（たとえば、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｍ． Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ等、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９０年、特にＶＩＩおよびＸＩ項参照）。
【０１０６】
この実験では、ＯＰ−１は、上記のとおりＣＨＯ細胞中で発現した。０．５％ＦＢＳを含むＣＨＯ細胞の馴化培地は、先ず、固定化金属−イオン親和性クロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）を使用して精製した。馴化培地からの可溶性ＯＰ−１複合体は、Ｚｎ−ＩＭＡＣ樹脂に非常に選択的に結合し、高濃度のイミダゾール（５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）は、結合複合体の効果的な溶出のために必要である。Ｚｎ−ＩＭＡＣステップは、貫流および３５ｍＭのイミダゾール洗浄画分中に溶出する不純血清タンパク質から可溶性ＯＰ−１を分離する。Ｚｎ−ＩＭＡＣ精製可溶性ＯＰ−１は、次に、５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのＮａＰＯ４（ｐＨ７．０）中で平衡させたＳ−セファロース陽イオン交換カラムに適用した。このＳ−セファロースステップは、次のゲル濾過ステップに備えて、可溶性ＯＰ−１複合体をさらに精製して濃縮する役割を果たす。このタンパク質は、ＴＢＳ中で平衡されるＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−２００ＨＲカラムに適用された。ほぼ同じプロトコルを使用すると、可溶性形態形成タンパク質も、血清、脳脊髄液、または腹水を含む１つまたは複数の体液から単離し得る。
【０１０７】
ＩＭＡＣは、３カラム容量部の０．２ＭのＺｎＳＯ４を充填したＣｈｅｌａｔｉｎｇセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して実施した。この馴化培地は、ｐＨ７．０までて滴定し、５００ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）中で平衡したＺＮ−ＩＭＡＣ樹脂に直接適用した。Ｚｎ−ＩＭＡＣ樹脂には、１ｍＬの樹脂あたり８０ｍＬの開始馴化培地が装填された。装填後、カラムは、平衡緩衝液で洗浄し、殆どの不純タンパク質は、３５ｍＭのイミダゾール（ｐＨ７．０）を使って平衡緩衝液中に溶出させた。可溶性ＯＰ−１複合体は、次に、５０ｍＭのイミダゾール（ｐＨ８．０）を使って２０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび５００ｍＭのＮａＣｌ中に溶出させた。
【０１０８】
可溶性ＯＰ−１複合体を含む５０ｍＭのイミダゾール溶出液は、９容量部の２０ｍＭのＮａＰＯ４（ｐＨ７．０）で希釈し、５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのＮａＰＯ４（ｐＨ７．０）中で平衡させたＳ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムに適用した。Ｓ−セファロース樹脂には、１ｍｌの樹脂当たり８００ｍＬの開始馴化培地の等価物を装填した。装填後、Ｓ−セファロースカラムは、平衡緩衝液で洗浄し、１００ｍＭのＮａＣｌ、次に３００ｍＭおよび５００ｍＭのＮａＣｌを使って、２０ｍＭのＮａＰＯ４（ｐＨ７．０）中に溶出させた。３００ｍＭのＮａＣプールは、ゲル濾過クロマトグラフィを使ってさらに精製した。３００ｍｍのＮａＣｌ溶出液５０ｍｌｓは、トリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）、５０ ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）中で平衡させた５．０×９０ｃｍのＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ＨＲ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に適用した。カラムは、４ｍＬ／分の流量で溶出させて１０ｍＬの部分を収集した。可溶性ＯＰ−１の見かけの分子量は、タンパク質分子量基準（アルコール脱水素酵素（ＡＤＨ、１５０ｋＤａ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、６８ｋＤａ）、炭酸脱水酵素（ＣＡ、３０ｋＤａ）およびシトクロムＣ（ｃｙｔ Ｃ、１２．５ｋＤａ）（図３参照）と比較して判断した。Ｓ−２００カラム部分の純度は、クマシーブルーで染色した標準の１５％ポリアクリルアミドＳＤＳゲル上の分離により判断した。成熟ＯＰ−１およびプロ領域の同一性は、標準の逆相Ｃｌ８ ＨＰＬＣを使用して、成熟ＯＰ−１をプロ領域から分離した後、Ｎ末端配列分析により判断した。
【０１０９】
図３は、２８０ｎｍにおける吸収プロファイルを示す。可溶性ＯＰ−１複合体は、見かけの分子量１１０ｋＤａで溶出する。これは、２つのプロ領域（各３９ｋＤａ）に関連する１つの成熟二量体（３５−３６ｋＤａ）を含む可溶性ＯＰ−１複合体の予想組成物と完全に一致する。最終的な複合体の純度は、還元した１５％ポリアクリルアミドゲル中に適切な部分を流すことにより検証することができる。
【０１１０】
複合体の構成要素は、標準の手順を使用して、複合体を含む部分をＳ−２００またはＳ−２００ＨＲカラムから逆相Ｃｌ８ＨＰＬＣカラム上に流し、アセトニトリル勾配（０．１％ＴＦＡ中）において溶出させることによって検証することができる。複合体は、このステップにより分離され、プロ領域および成熟種は別の種を溶出する。これらの分離種は、次に、標準の手順、並びにそれぞれ、成熟形態形成タンパク質として確認された単離３６ｋＤ、３９ｋＤａタンパク質、および単離および裂開されたプロ領域の同一性を使用して、Ｎ末端配列を決定することができ（たとえば、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｍ．Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ等、サンディエゴのＡｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９０年、特にｐｐ．６０２〜６１３参照）。哺乳類細胞から単離されたプロ領域のＮ末端配列決定はＯＰ−１を生成し、２つの形式、つまり無傷型（配列番号１の残基３０から開始）、および切断型（配列番号１の残基４８から開始）のプロ領域を明らかにした。単離成熟種のポリペプチドサブユニットのＮ末端配列決定は、配列番号１の残基２９３、３００、３１３、３１５、３１６、および３１８で開始する成熟配列に関するある範囲のＮ末端を明らかにし、これらのすべては、標準の骨誘導検定によって実証されるように活性である。
【０１１１】
Ｖ．インビトロ可溶性モルフォゲンタンパク質複合体の形成
可溶性複合体を媒体または体液から精製する代わりに、可溶性複合体は、精製プロ領域および成熟二量体種から調製し得る。複合体の形成を満足に行うには、明らかに、ジスルフィド結合に影響しないように、これらの分子の折り畳み構造を緩和させるのに十分な変性状態で、構成要素を関連付ける必要がある。好ましくは、この変性状態は、裂開されたプロ領域が、緩和折り畳み状態で成熟二量体種に結合する機会を有するように、細胞内小胞の環境を十分に模倣する。溶液中の変性剤の濃度は、次に、プロ領域と二量体との関連を維持しつつ、二量体およびプロ領域の適切な再折り畳みを可能にするように、制御された、好ましくは段階的な方法で減少させる。有用な変性剤としては、ｐＨ４〜１０、好ましくはｐＨ６〜８の緩衝溶液中に、４〜６Ｍ尿素またはグアニジンヒドロクロリド（ＧｕＨＣｌ）を含む。可溶性複合体は、次に、制御された透析または希釈によって、０．１〜２Ｍ未満の尿素またはＧｕＨＣｌ、好ましくは１〜２Ｍの尿素またはＧｕＨＣｌの最終変性剤濃度を有する溶液中に形成され、次に、好ましくは、生理学的緩衝液中に希釈することが可能である。タンパク質の精製／復元手順、および考察は先行技術に記載されており、適切な復元プロトコルを容易に開発するための詳細は、当業者が判断することができる。この主題に関して有用な１つのテキストは、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｍ． Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ等、サンディエゴ、Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ、１９９０年、特にＶ項である。複合体の形成は、１つまたは複数のシャペロンタンパク質を追加することによって支援し得る。
【０１１２】
ＶＩ．可溶性モルフォゲンタンパク質複合体の安定性
生理学的緩衝液、たとえばトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）、およびリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中における高度に精製された可溶性形態形成タンパク質複合体の安定性は、任意のある数の手段で強化することができる。現在好ましい手段は、プロ配列の少なくとも最初の１８アミノ酸（たとえば、ＯＰ−１の配列番号２の残基３０〜４７）を含むプロ領域、および好ましくは全長プロ領域によるものである。残基３０〜４７は、他の形態形成タンパク質のＮ末端部分に対する配列相同性を示し、すべての形態形成タンパク質の複合体安定性を強化する際に特に有用であると考えられる。可溶性形態形成タンパク質複合体の安定性を強化するその他の有用な手段には、３種類の添加剤がある。これらの添加剤としては、塩基性アミノ酸（たとえば、Ｌ−アルギニン、リジン、およびベタイン）；非イオン浄化剤（たとえば、Ｔｗｅｅｎ８０またはＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ−１２０）；および担体タンパク質（たとえば、血清アルブミンおよびカゼイン）がある。これらの添加剤は、１〜１００ｒａＭ、好ましくは１０〜７０ｍＭ、５０ｍＭの塩基性アミノ酸；０．０１〜１．０％、好ましくは０．０５〜０．２％、０．１％（ｖ／ｖ）の非イオン浄化剤；および０．０１〜１．０％、好ましくは０．０５〜０．２％、０．１％（ｗ／ｖ）担体タンパク質がある。
【０１１３】
ＶＩＩ．可溶性モルフォゲンタンパク質複合体の活性
プロ領域と成熟との関連は、異なる活性検定によって実証されるように、インビボでのタンパク質の形態形成活動を妨げない。特に、標準のラットオステオペニアモデルで提供される可溶性ＯＰ−１複合体は、成熟形態形成タンパク質を使用して得られる結果と同様、骨の成長およびオステオカルシンの生成（以下の表２参照）に著しい増加を誘発する。
【０１１４】
この検定は、現在放棄されている米国特許継続出願第０８／４３２，８８３号に関連して現在放棄されている米国特許第９２３，７８０号に記載されている骨粗鬆症モデルに類似しているが、卵巣切除した動物ではなく、高齢のメスのラットを使用する。簡潔に述べるなら、若年または高齢のメスのラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ、それぞれ１１５〜１４５および３３５〜４６０ｇ）は、毎日７日間にわたって尾部静脈注射することにより、体重１Ｋｇ当たり２０μｇの可溶性ＯＰ−１、または体重１Ｋｇ当たり１００μｇの可溶性ＯＰ−１を投与した。若年および高齢メスラットの対照群には、トリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）のみを投与した。水および食物は、すべての動物に随時与えた。１４日後、動物を屠殺して、新しい骨の成長を標準のヒストメトリックな手順によって測定した。血清中のオステオカルシン濃度も測定した。動物の体重または組織重量の変化、あるいは血液学的なプロファイルで判断した結果、形態形成タンパク質の投与の不利な影響は検出されなかった。
【０１１５】
【表２】
卵巣切除したラットを使用して、現在放棄されており、引用することにより上記で援用された米国特許継続出願第０８／４３２，８８３号に関連して、現在放棄されている米国特許第９２３，７８０号に記載されている骨粗鬆症モデルにおいて、可溶性ＯＰ−１複合体を使用して実施された類似の実験も、複合体形式を使用して不利な影響は示していない。
【０１１６】
成熟および可溶性形態形成タンパク質はともに、開示事項を引用することにより上記で援用される係属中の米国特許継続出願第０８／２６０，６７５号に関連して現在放棄されている、１９９２年７月３１日に出願された同時係属米国特許出願第０７／９２２，８１３号に記載されているように、ＣＡＭ（細胞接着分子）の発現を誘発することが可能である。
【０１１７】
簡潔に、それらに記載されているように述べると、Ｎ−ＣＡＭアイソタイプ（Ｎ−ＣＡＭ−１８０、Ｎ−ＣＡＭ−１４０およびＮ−ＣＡＭ−１２０）の導入は、市販の抗体ｍＡｂ Ｈ２８．１２３（セントルイス、Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．）との反応、および標準のウェスタンブロット分析によって監視することができる（たとえば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ編集者等、ニューヨーク、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１９８９年、特に１８項参照）。成熟形態形成タンパク質二量体、または可溶性形態形成タンパク質複合体（１０〜１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも４０ｎｇ／ｍｌ）による神経系の形質転換細胞、ＮＧｌ０８−１５細胞（メリーランド州、ロックビル、ＡＴＣＣ）の成長培地の培養は、形質転換されていない神経細胞の形態学的特徴に対するこれらの細胞の再分化を誘発し、誘発には、すべての３Ｎ−ＣＡＭアイソタイプの特定の誘発および／または強化された発現を含む。この実験では、細胞は、ポリ−Ｌ−リジン塗布６−ウェルプレート上で二次培養され、化学的に規定された媒体中で、２日間にわたって成長させてから実験した。形態形成タンパク質のフレッシュなアリコートは、毎日添加した（２．５μｌ）。
【０１１８】
医薬組成物
可溶性形態形成タンパク質複合体を含む医薬組成物は、様々な形態でよい。これらは、たとえば、固体、半固体、および液体投薬形態、たとえば粉末、錠剤、丸薬、座薬、液体溶液、懸濁液、ゲル、パテ、ペースト、乳濁液、および不溶性溶液が挙げられる。好ましい形式は、意図された投与方法および治療用途によって決まり、当業者が選択することができる。投与方法としては、経口、非経口、筋肉内、腹腔内、関節内、皮下、静脈、病巣内、外科的移植、または局所性投与が挙げられる。組成物は、各々の投与経路に適する投与形式で処方し得る。実施態様によっては、本発明の医薬組成物は、組織の再生または修復を必要とする部位に（つまり、軟骨内に直接）投与される。他の実施態様では、本発明の医薬組成物は、組織の再生または修復を必要とする部位の付近に投与される。たとえば、実施態様によっては、本発明の医薬組成物は、修復（つまり、接合）を必要としている軟骨を囲む領域（たとえば、滑液）に投与し得る。他の実施態様では、本発明の医薬組成物は、軟骨組織内（たとえば、半月板または椎間板）内に直接投与し得る。
【０１１９】
好ましい実施態様では、可溶性形態形成タンパク質複合体組成物は、軟骨の損傷または変性の部位、たとえば関節接合部または関節嚢に直接、許容可能な流体担体で投与される。組成物は、先行技術で公知のとおり、組織の治癒または修復を最適にする投与頻度で、１回または複数回投与することができる。組成物は、たとえば、毎日、毎週、毎月、月に２回、２ヶ月に１回、年に４回、半年に１回、または毎年投与することができる。
【０１２０】
可溶性形態形成タンパク質複合体を含む医薬組成物は、たとえば、摂取または安定性を刺激する共同因子の有無に関わらず、殺菌浸透圧製剤中入れることができる。製剤は、好ましくは液体であるか、凍結乾燥粉末でよい。たとえば、可溶性形態形成タンパク質複合体は、処方用緩衝液で希釈し得る。溶液は、凍結乾燥して、凍結状態で保存して還元した後、殺菌した注射用蒸留水（ＵＳＰ）とともに投与することができる。
【０１２１】
組成物は、好ましくは、先行技術で公知の従来の薬学的に許容可能な担体も含む（たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ Ｅｄ．，Ｍａｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９８０年）参照）。このような薬学的許容可能な担体は、その他の薬剤、担体、遺伝子担体、補助剤、賦形剤など、たとえばヒト結成アルブミン、または血漿製剤を含み得る。好ましくは、担体は、患者の血液または滑液と浸透圧が等しい。このような担体媒体としては、水、食塩水、リンガー溶液、緩衝水溶液、ヒアルロナン、ヒアルロン酸、およびデキストロース溶液が挙げられる。固定油およびオレイン酸エチルなどの非水性媒体も、この場合有用である。組成物は、好ましくは、単位用量の形式であり、特定の組織の処置によって決まる用法のとおりに投与される。
【０１２２】
実施態様によっては、本発明の組成物は、徐放性製剤、遅延送達製剤、または可溶性形態形成タンパク質複合体の除去が遅延する薬剤である。これらの組成物の調製に使用可能な多くの送達材料がある。これらの材料としては、ポリ乳酸／ポリグリコール酸ポリマーの微小球、リポソーム、コラーゲン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒアルロン酸／線維素マトリクス、ヒアルロン酸、線維素、キトサン、ゼラチン、ＳＡＢＥＲ（商標）系（ショ糖酢酸イソ酪酸エステル（ＳＡＩＢ））、ＤＵＲＩＮ（商標）（薬物負荷インプラント用の生物分解性ポリマー）、ＭＩＣＲＯＤＵＲ（商標）（生物分解性ポリマー／マイクロカプセル化）、およびＤＵＲＯＳ（商標）（小型浸透圧ポンプ）が挙げられるが、これらだけに限らない。実施態様によっては、可溶性形態形成タンパク質複合体は、送達材料に共役結合される。
【０１２３】
本発明の組成物は、化合物の適切な送達系として機能する生体適合性担体材料中に分散する可溶性形態形成タンパク質複合体を含む。徐放性担体の適切な例としては、半透性ポリマーマトリクスがある。インプラント可能またはマイクロカプセル状徐放性マトリクスとしては、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，３１９号；欧州特許第５８，４８１号）、Ｌ−グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタミン酸塩のコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ等、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２，ｐｐ．５４７−５６（１９８５年））；ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、エチレンビニレンアセテート（Ｌａｎｇｅｒ等、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５，ｐｐ．１６７〜２７７（１９８１年）；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２，ｐｐ．９８〜１０５（１９８２年））またはポリ−Ｄ−（−）−３ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３，９８８号）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、または上記のポリマーが挙げられる。
【０１２４】
本発明の医薬組成物は、たとえば、微小球、リポソーム、その他の微小球送達系、または罹患組織内、その付近、あるいは罹患組織と連通して配置される徐放性製剤、これらの組織を浸す流体（たとえば、滑液）、またはこれらの組織を浸す血流を使用して投与することもできる。
【０１２５】
本発明の可溶性形態形成タンパク質複合体を含むリポソームは、十分に公知の方法で使用することができる（たとえば、ドイツ特許第３，２１８，１２１号；Ｅｐｓｔｅｉｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２，ｐｐ．３６８８〜９２（１９８５年）；Ｈｗａｎｇ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７７，ｐｐ．４０３０〜３４（１９８０年）；米国特許第４，４８５，０４５号および第４，５４４，５４５号参照）。一般に、リポソームは、小さい（約２００〜８００Å）単層型であり、その脂質含量は約３０モル％のコレステロールより大きい。コレステロールの割合は、可溶性形態形成タンパク質複合体放出の最適速度を制御するように選択される。
【０１２６】
本発明の可溶性形態形成タンパク質複合体は、組織誘導速度および特性を調節するために、生物学的に活性の分子、たとえば免疫抑制剤、サイトカインを含むリポソームに付着させてもよい。リポソームに対する可溶性形態形成タンパク質複合体の付着は、任意の公知の架橋剤、たとえば、毒素または化学療法剤を抗体に結合して、目標とされた送達を行うために広く使用されてきたヘテロ二官能基架橋剤によって行うことができる。リポソームとの共役は、糖質指向性架橋試薬４−（４−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド（ＭＰＢＨ）（ＭＰＢＨ）（Ｄｕｚｇｕｎｅｓ等、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ａｂｓｔ． Ｓｕｐｐｌ．１６Ｅ ７７（１９９２年））を使用して行うことも可能である。
【０１２７】
本発明の可溶性形態形成タンパク質複合体は、グリコシル化してもよい。グリコシル化は、１つまたは複数のオリゴ糖質基を添加することによってタンパク質を変性させることである。一般に、２種類のグリコシル化がある：Ｏ−結合オリゴ糖は、セリンまたはスレオニン残基に付着し、Ｎ−結合オリゴ糖は、配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒの一部である場合、アスパラ銀残基に付着し、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸でよい。グリコシル化は、タンパク質の物理的特性に著しく影響する可能性があり、タンパク質の安定性、分泌、半減期、および細胞内局在性にも重要である。実施態様によっては、本発明の可溶性形態形成タンパク質複合体は、Ｎ−結合オリゴ糖を含む。他の実施態様では、本発明の可溶性形態形成タンパク質複合体は、Ｏ−結合オリゴ糖を含む。他の実施態様では、本発明の可溶性形態形成タンパク質複合体は、Ｏ−結合オリゴ糖を含む。さらに他の実施態様では、本発明の可溶性形態形成タンパク質複合体は、Ｎ−結合およびＯ−結合オリゴ糖の両方を含む。実施態様によっては、可溶性形態形成タンパク質複合体のグリコシル化パターンは、糖タンパク質の糖組成物を調節するように変更し得る。
【０１２８】
当業者は、組織の誘導を促進するのに最適な生体適合性および／または生物分解性製剤を生成し得る。
【０１２９】
可溶性形態形成タンパク質複合体の正常な担体は、いくつかの重要な機能を果たすべきである。担体は、可溶性形態形成タンパク質複合体の遅延送達系、または可溶性形態形成タンパク質複合体の遅延除去として機能し、可溶性形態形成タンパク質複合体を非特異的タンパク質分解から保護するべきである。
【０１３０】
さらに、選択された材料は、インビボで生体適合性であり、好ましくは生物分解性でなければならない。ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、および様々な組合せは、インビボで異なる溶出速度を有する。
【０１３１】
担体は、ヒドロゲルの形態を取っても良い。担体材料は、ヒドロゲルを含む場合、実質的に水から成るゲルの形態の架橋親水性ポリマーの三次元網目構造を意味し、水は、９０％を超えるゲルが好ましいが、これだけに限らない。ヒドロゲルは、正味正または正味負電荷を支持することが可能であるか、あるいは中立でよい。代表的な正味負電荷を持つヒドロゲルは、アルギン酸塩である。正味正電荷を支持するヒドロゲルは、コラーゲンおよびラミニンなどの細胞外マトリクス成分によって類型化することができる。市販されている細胞外マトリクス成分の例としては、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）およびＶｉｔｒｏｇｅｎ（商標）が挙げられる。正味中立ヒドロゲルの例は、高度に架橋した酸化ポリエチレンまたはポリビニルアルコールである。
【０１３２】
抗生物質および化学療法薬剤、酵素、酵素阻害薬、並びにその他の生物活性剤を含む様々な増殖因子、サイトカイン、ホルモン、栄養剤、および治療用組成物も、可溶性形態形成タンパク質複合体を含む担体材料上に吸着または分散させることができ、やはり長期にわたって放出され、徐々に吸収される。
【０１３３】
可溶性形態形成タンパク質複合体の１日当たり約１μｇ〜約１０００μｇ、好ましくは３μｇ〜５０μｇの投与レベルは、軟骨の修復および再生に有用である。当業者は理解するように、上記より少ないかまたは多い投与量が必要な場合がある。任意の特定の患者に対する特定の投与量および処置領域は、使用する特定の可溶性形態形成タンパク質複合体の活性、年齢、体重、全体的な健康状態、性別、食習慣、投与時間、排泄速度、組織の損傷の重症度、担当医師の判断など、様々な要素によって決まる。
【実施例】
【０１３４】
（実施例１ 骨軟骨の欠損のイヌモデルの修復）
目的のために飼育された１２匹の成犬に外科処置を施した。両方の後肢は、殺菌状態で準備して覆った。約４ｃｍ長の内側傍膝蓋骨の切開（ｐａｒａｐａｔｅｌｌａｒ ｉｎｃｉｓｉｏｎ）を作成する。膝蓋骨を側方に引っ込めて、大腿顆を露出させる。右の内側顆では、軟骨層を通って延在し、軟骨下骨を深さ６ｍｍまで貫通する５．０ｍｍ径の欠損は、特別に設計または変更された５．０ｍｍのドリルビットを使って、大腿顆の耐荷重領域に形成する。動物は、各々６匹の動物の２つの群に分割する。第１群では、食塩水を大量に灌注して、破片および流出した髄質細胞を除去した後、欠損を囲む滑液に、適切な持続放出可溶性ＯＰ−１複合体を適用する。６匹の動物の第１群では、右の欠損は、持続放出可溶性ＯＰ−１複合体を受領する。すべての動物の左肢は、コントロールビード（０％ＯＰ−１）を受領するコントロールとして機能する。
【０１３５】
６匹の動物の第２群は、外科処置の時点ではＯＰ−１処置を受けない。外科処置から３日後、適切な持続放出可溶性ＯＰ−１複合体製剤を、欠損を含む関節を囲む滑液中に注入する。６匹の動物において、持続放出可溶性ＯＰ−１複合体は、右の欠損の周囲の滑液中に注入する。すべての動物の左肢は、コントロールビード（０％ＯＰ−１）を受領するコントロールとして機能する。
【０１３６】
動物は、外科処置から１６週後に屠殺する。屠殺する際、大腿遠位を全体として回収し、欠損部位は、従来の検査で使用されてきたＭｏｒａｎ等（Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ．７４Ｂ：６５９−６６７，１９９２年）のスキームに基づいて、組織学的に、肉眼で見て評価する。
【０１３７】
後肢のＸ線写真は、手術前、手術直後、および手術後６週間に撮影する。手術前のＸ線写真は、既存の異常が存在しないことを確認し、骨格の成熟を検証するために使用する。述語のＸ線写真は、欠損の位置を評価するために使用する。屠殺した動物のＸ線写真は、軟骨下骨および関節面の治癒および回復の速度を評価するために使用する。Ｘ線写真は、評価日から１週間以内に撮影する。
【０１３８】
死骸の肉眼的な病理学検査は、屠殺直後に行う。大腿遠位は、直後に全体的に収穫し、食塩水に浸したタオルで保存し、ラベルを付けたプラスチックの袋に入れる。欠損部位の高倍率写真を撮影し、注意してラベルを付ける。
【０１３９】
軟組織は、欠損部位から細心の注意を払って切り離し、大腿の近位端を除去する。水冷ダイヤモンドカットソー上で、各々の欠損部位を単離して、組織学的評価を行う。
【０１４０】
標本は、４％パラホルムアルデヒド溶液中に浸漬して固定し、脱灰組織学的処理のために準備する。３つのレベルからの３つの部分を、各々のブロックから切断する。レベル１および３は、欠損の周囲に最も近い。レベル２は、欠損の中心に位置する。各々のレベルの部分は、トルイジンブルー、サフラニンＯ、およびファストグリーンで着色した。各部分は、Ｍｏｒａｎ等（Ｊ． Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ． ７４Ｂ：６５９−６６７、１９９２年）のスキームに基づいて等級を付ける。
【０１４１】
（実施例２ 持続放出微小球におけるＯＰ−１の関節内投与による軟骨欠損再生のヒツジモデル）
目的のために飼育された１８匹の成体のヒツジに、外科的処置を施した。特に設計された器具を使って、１０ｍｍの軟骨の欠損は、１８匹のヒツジの左後肢膝において、体重を支持する顆表面に石灰化層まで２ｍｍ深さまで形成する（血液の露出は、失敗とされる）。すべての動物の右膝は、コントロールとして使用するために処置しない。
【０１４２】
１群（６匹の動物）：手術の３日後、各動物の左膝は、可溶性ＯＰ−１複合体を含まない５７ｍｇのコントロール０．３％微小球を含む２５０μｌの懸濁液の関節内注射を受ける。
【０１４３】
２群（６匹の動物）：手術の３日後、各動物の左膝は、１７０μｇの可溶性ＯＰ−１複合体を含む５７ｍｇの０．３％微小球を含む２５０μｌの懸濁液の関節内注射を受ける。
【０１４４】
３群（６匹の動物）：手術の３日後、および手術の６週間後、各動物の左膝は、１７０μｇの可溶性ＯＰ−１複合体を含む５７ｍｇの０．３％微小球を含む２５０μｌの懸濁液の関節内注射を受ける。
【０１４５】
膝の関節鏡評価は、すべての動物について、手術の３週間および６週間後に行う。ＮＭＲ／ＭＲＩ走査は、手術の３週間および６週間後に行う。膝の機械的テストも、定期的に行う。
【０１４６】
すべての動物は、手術の３ヶ月後に屠殺する。屠殺後、特定の関節軟骨細胞マーカーに関して、組織学、組織形態計測、免疫染色、およびインシチュでのハイブリッド化を行う。
【０１４７】
（実施例３ 変形性関節症の予防のためのヒツジモデル）
変形性関節症のモデルとしてヒツジを使用するが、それは、これらの動物は、１回の損傷の衝撃を受けた後に、進行性の変形性関節症を発症するためである。この研究では、１４日間にわたって順応させた１２匹の成体のメスの異種交配ヒツジを使用する。すべてのヒツジは、全身麻酔を施され、無菌技術を用いて、３ｃｍの関節切開術を使用して、両方の大腿頚骨関節に接近することを可能にする。ばね荷重の機械的デバイスは、中央大腿顆の体重支持領域に相互衝突損傷（３０Ｍｐａ、６ｍｍ径×２）を形成するために使用する（図４参照）。これらの切開部分を一般的な方法で閉じた後、ヒツジには、媒体中の可溶性ＯＰ−１複合体、または媒体のみを各々の膝に関節内注射を施す。２つの実験群（Ｎ＝６）を使用する。Ａ群は、外科手術の時点（０日）および手術後１週間（７日）に、０．３ｍｌの可溶性ＯＰ−１複合体を膝関節内に受領する。０日の注射は、外科的な切開部分を閉鎖した直後に投与した。Ｂ群は、０日、７日、１４日、２１日、２８日、および３５日に、片方の膝に可溶性ＯＰ−１複合体を受領する。滑液は、可溶性ＯＰ−１複合体および媒体を注射する前に吸引し、炎症の指標として、白血球数および総タンパク量を測定することを可能にする。
【０１４８】
ヒツジは、手術の１２週後に屠殺して、関節組織の詳細な評価（パラ生体染色、ＴＵＮＥＬ染色、組織病理学、軟骨、硫酸塩ＧＡＧ分析、生体力学的圧痕テスト）を行う。
【０１４９】
（実施例４ 関節内注射後のＯＰ−１の治療効果に関するヒツジモデル）
この研究は、研究を開始する前に１４日間順応させて、健康状態評価に合格したＮ＝１２の生体メスの１．５〜２．５歳の異種交配ヒツジを使用する。全身麻酔を行って、無菌技術を使用して、すべてのヒツジは、３ｃｍの最小限に侵襲的な関節切開術によって、両方（左右）の内側大腿顆に標準の３０ＭＰａ衝突損傷を受ける。手術の３週間後、ヒツジは、ジアゼパム（１０ｍｇ／ｋｇ）およびケタミン（３〜５ｍｇ／ｋｇ）で沈静状態にして、表３に従って滑膜細胞穿刺、および内側大腿頚骨関節内への被験物質、偽薬、または生理食塩水の注入のために膝を無菌状態で準備することを可能にする。
【０１５０】
【表３】
すべてのヒツジは、両方の内側大腿顆傷害を受ける。第１群の９匹のヒツジでは、一方の膝は被験物質を受領し、反対側の膝は、媒体のみから成る偽薬を受領する。膝の処置は、完全なブロック構造によって配置される。第２群の３匹のヒツジは、偽薬の効果のコントロールとして、生理食塩水ＵＳＰを受領する。
【０１５１】
この調査の次に、表４に記載する次の手順を行う。
【０１５２】
【表４】
（実施例５ 変形性関節症のテンジクマウスおよびウサギモデル）
ハートリーテンジクマウス（自発的）、およびウサギＡＣＬ−切除（誘発）変形性関節症モデルを使用する。年齢３か月、６ヶ月または９ヶ月の１４匹のテンジクマウスの左膝に、５０μｇの可溶性ＯＰ−１複合体を含むリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液を１２週間にわたって３週間ごとに注入する。左膝は、未処理コントロールとして使用される。
【０１５３】
ニュージーランドホワイトウサギにおいて、左ＡＣＬは切除され、ＰＢＳ溶液中の１００μｇ可溶性ＯＰ−１複合体、またはコントロール溶液を１２週間の評価期間にわたって３週間ごとに受領するか、または注入される。右膝は、すべての動物において、非ＡＣＬ切除未処理コントロールとして使用される。
【０１５４】
両方のモデルのすべての動物は、改良されたＭａｎｋｉｎスケールを使用して、関節炎の変化を肉眼で見た外観、および組織学的証拠を評価し、変性の重症度を等級付けする。
【０１５５】
（実施例６ 半月板の治癒のヒツジモデル）
再吸収不能なより糸で縫合された孔（６ｍｍ径）および長手方向の破裂（２ｃｍ長）は、ヒツジの両膝の各々の内側半月板に形成する。２つの処置群がある：可溶性ＯＰ−１複合体、および外科手術で形成された欠損以外に未処置のコントロール群。処置群では、可溶性ＯＰ−１複合体は、切開部位を閉鎖する直前に、関節空間内に注入され、次に、外科手術の７日後に関節空間７内に注入される。
【０１５６】
処置から６週、１２週、および２６週後、動物を安楽死させる。安楽死後、半月板を除去し、前部の長手方向に縫合した破裂部分、および後部の孔のある部分の２つの部分に切断する。これらの部分は、マッソントリクロームおよびサフラニンＯを使って染色する。半月板の免疫組織化学も、コラーゲンＩ、ＩＩ、ＶＩ、Ｓ１００、プロテアーゼＭＭＰ１を検出するために、特定の抗体を使用して実施することができる。
【０１５７】
半月板の部分を分離し、ＯＣＴ内に埋め込み、液体窒素中で凍結させる。低温保持装置を使って得た部分を収集して均質化し、Ｔｒｉｚｏｌ試薬を使用してＲＮＡ調製する。ＲＴ−ＰＣＲは、様々なマーカー、たとえば、細胞外マトリクスのマーカーとしてのＩ型、ＩＩ型、ＩＩ型コラーゲン、およびアグリカン、増殖因子としてのＴＧＦ−βおよびＩＧＦ−２、マトリクス分解酵素としてのＭＭＰ−Ｉ、ＭＭＰ−３およびＴＩＭＰ−Ｉ、最後に、細胞増殖および自然死に関するマーカーとしてのサイクリンＡ、Ｂｃｌ−２、ＢＡＸおよびカスパーゼ３の遺伝子発現を調査するために実行される。その他の関節組織も検査し、可溶性ＯＰ−１複合体によって生じ得る任意の肉眼的な相違のコントロールと比較する。
【０１５８】
（実施例７ 椎間板の修復および再生のヒツジモデル）
制御された外側環状欠損をヒツジの体内に実験的に導入すると、ヒトにおける椎間板変性の発症を病理学的および生化学的に厳密に再現する一連の事象が開始する。組成物の変化としては、損傷部位の細胞によって合成されるコラーゲンの量、および型の変化がある（Ｋａａｐａ等、１９９４ａ，ｂ，１９９５，Ｋａａｐａ Ｅ．等（１９９５年）椎間板変性の動物モデルにおけるコラーゲン合成、およびＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、およびＶＩ型コラーゲン、Ｓｐｉｎｅ ２０，５９−６７；Ｋａａｐａ Ｅ等、（１９９４年）損傷したブタの椎間板におけるコラーゲン、Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ． Ｒｅｓ．１２．９３−１０２；およびＫａａｐａ Ｅ等、（１９９４年）実験的に損傷したブタの椎間板におけるプロテオグリカンの化学作用、Ｊ．Ｓｐｉｎ．Ｄｉｓ．７，２９６−３０６）損傷した椎間板における大きい高浮遊密度アグリカン型プロテオグリカンの損失、および小さいＤＳ置換プロテオグリカンデコリンおよびビグリカンのレベルの上昇（Ｍｅｌｒｏｓｅ Ｊ．等、（１９９２年）線維輪に対する外科的損傷により椎間板内に誘発されるマトリクスの変化の長期にわたる研究、Ｊ Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｓ １０：６６５−６７６；Ｍｅｌｒｏｓｅ Ｊ．等、（１９９７年）実験的な椎間板変性のヒツジの環状病巣モデルにおけるアグリカンの異化の局所的変化、Ｊ Ｓｐｉｎａｌ Ｄｉｓｏｒｄ １０：５５−６７；およびＭｅｌｒｏｓｅ Ｊ．等、（１９９７年）実験的な椎間板変性のヒツジの環状病巣モデルにおけるビグリカンおよびデコリンの合成の増加、Ｅｕｒ Ｓｐｉｎｅ Ｊ ６：３７６−８４）。椎間板変性の結果として、軟骨終板（ＣＥＰ）に対する血管供給の変化（Ｍｏｏｒｅ ＲＪ等、（１９９２）、ヒツジにおける外側の環状破裂後の運動終板の血管の変化、Ｓｐｉｎｅ １７：８７４−８７８）、および実験的な環状欠損に隣接する椎間板の改造（Ｍｏｏｒｅ ＲＪ，等（１９９６）、ヒツジにおける外側の環状損傷後の椎骨の改造、Ｓｐｉｎｅ ２１ ：９３６−９４０．）、「修復された」損傷の影響を受けた椎間板の生体力学的変化（Ｌａｔｈａｍ ＪＭ等、（１９９４）、環状破裂およびその後椎間板変性の機械的結果、Ｊ ＣＨｎ Ｂｉｏｍｅｃｈ ９：２１１−９）、および脊髄面関節における骨関節炎の変化（Ｍｏｏｒｅ ＲＪ等（１９９９）、ヒツジの椎間板における環状縁の損傷から生じる面関節の変形性関節症、Ｓｐｉｎｅ，２４：５１９−５２５）にも注目した。
【０１５９】
Ａ．ヒツジの環状病巣モデル
ヒツジは、外科手術前の２４時間にわたって絶食させて、１ｇのチオペントンを静脈注射して全身麻酔を行った。水平の単純なＸ線フィルムは、通常の腰椎の解剖学的構造を検証するために撮影する。一般的な全身麻酔は、気管支内挿管後、２．５％のハロタンによって維持し、パルス濃度計および呼気終末ＣＯ２測定によって監視する。肋骨から腸骨稜までの左脇腹は、無菌外科手術のために準備する。ヒツジは、１２００ｍｇのペニシリンの筋肉注射を受ける。皮膚の切開は、脊椎の横突起の直前の左側に行い、腰椎は、前面筋肉分割技術を使用して、ブラント切開によって露出させる。血管および神経解剖学を遵守し、出血は、必要に応じて直接圧力または電気灼熱器により制御する。
【０１６０】
全部で１２匹の２歳のヒツジは、＃１手術用メス刃を使用して、頭蓋運動終板に平行および隣接して左前外側線維輪を貫通して切開することにより、それぞれのＬ１−Ｌ２、Ｌ３−Ｌ４およびＬ５−Ｌ６椎間板に、制御された環状病巣を施され、４ｍｍ長×５ｍｍ深さの損傷を形成される。介在する椎間板（Ｌ２〜Ｌ３、Ｌ４〜Ｌ５）は、切開しない。
【０１６１】
切開された椎間板は、３種類の治療の１つを受ける、（Ｉ）治療しない、（ＩＩ）媒体、または（ＩＩＩ）媒体中の可溶性ＯＰ−１複合体。すべてのヒツジにおいて、Ｌ３〜Ｌ４椎間板は、治療を行わない環状病巣を施される。４匹のヒツジでは、Ｌ１〜Ｌ２椎間板は、媒体のみで処置し、Ｌ５〜Ｌ６椎間板は、可溶性ＯＰ−１複合体および媒体で処置する。他の４匹のヒツジでは、Ｌ１〜Ｌ２およびＬ５〜Ｌ６椎間板の処置を逆にして、脊髄レベルに関連して可能性のある結果のバイアスを防止する。手術を行わない椎間板は、治療された椎間板間に維持し、後続の機械的テストにおいてＦＳＵの適切な固定を可能にする（以下参照）。針金縫合は、Ｘ線および形態学的同定の両方で、その後頭側の手術レベルを特定するために使用される。これらの追加の非手術動物は、生体力学的調査のコントロールとしても使用される。
【０１６２】
環状切開後の変性は、ヒツジにおいて十分に確立されており（Ｏｓｔｉ ＯＬ等、（１９９０年）Ｖｏｌｖｏ Ａｗａｒｄ ｆｏｒ Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｎｎｕｌｕｓ ｔｅａｒｓ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ ｄｉｓｃ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ。動物モデルを使用する実験的な研究Ｓｐｉｎｅ １５：７６２−７）は、１２週後に、最も早いＸ線および組織化学的証拠を示すと予想することができる。環状病巣を導入して３ヶ月後に、ヒツジは、６．５ｇのペントバルビタールナトリウムを静脈注射して殺され、腰椎のＸ線写真を撮影して、椎間板の石灰化を評価し、生体力学的（ｎ＝８）および組織額的（ｎ＝４）分析のために切除して処理し、生体力学的テスト後、同じ椎間板を帯状に切開して、組成物の分析を行う。
【０１６３】
Ｂ．椎間板組織の組成物の分析
椎間板組織は、図５に示すように、帯状に切開して環状四分円および髄核状にする。
【０１６４】
Ｃ．椎間板組織のプロテオグリカンおよびコラーゲン成分の判定
線維輪および髄核のサンプルは、氷の上で細かくさいころ状に切り、既知の湿重量の各々の組織帯の代表的な部分を、一定の重量まで凍結乾燥させる。組織の開始と終了重量との差は、それぞれの水分を示す。乾燥組織の３つの部分（１〜２ｍｇ）は、１１０℃の６Ｍ ＨＣＬ中で１６時間にわたって加水分解し、中和された消化物のアリコートは、組織のコラーゲン分の指標としてヒドロキシプロリンの測定を行う（Ｍｅｌｒｏｓｅ Ｊ等、（１９９２年）線維輪に対する外科的損傷により椎間板内に誘発されるマトリクスの変化の長期にわたる研究、Ｊ Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｓ １０：６６５−６７６；Ｍｅｌｒｏｓｅ Ｊ等、（１９９４ａ）、正常な成体ヒツジの椎間板、マトリクスにおけるプロテオグリカンの異質性、１４：６１−７５；Ｍｅｌｒｏｓｅ Ｊ等、（１９９４ｂ）脊髄レベルによるヒツジ椎間板の組成物、およびその成分のプロテオグリカンの変化、Ｖｅｔ Ｃｏｍｐ Ｏｒｔｈｏｐ Ｔｒａｕｍ ７：７０−７６；Ｍｅｌｒｏｓｅ Ｊ等、（１９９１年）ヒトの椎間板におけるプロテオグリカン異質性に対する脊柱側湾症および加齢の影響Ｊ Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｓ ９：６８−７７；およびＭｅｌｒｏｓｅ Ｊ等、（１９９６年）キモパパインによる化学的髄核融解術後の椎間板の再構成は、用量によって決まる：ビーグル犬における実験調査 Ｓｐｉｎｅ ２１：９−１７）。乾燥組織（約２ｍｇ）の３つの部分も、パパインにより消化され、溶解した組織のアリコートは、異染性染料１，９−ジメチルメチレンブルーを組織プロテオグリカンの指標として使用して、硫酸化グリコサミノグリカンを測定する（上記のＭｅｌｒｏｓｅ等、１９９１年、１９９２年、１９９４年、１９９６））。
【０１６５】
Ｄ．組織化学的および免疫組織化学的分析
組織化学的分析に指定される背骨運動部分は、骨鋸を使用して、頭蓋および尾側椎体を軟骨性運動終板付近で切断して単離される。隣接する椎体部分を含む全体の椎間板標本は、全体的に、１０％中性緩衝ホルマリンまたはＨｉｓｔｏｃｈｏｉｃｅ（登録商標）中で、５６時間にわたって定着させ、５％ＮＢＦ中の１０％ギ酸を数回変えて、一定に攪拌しながら２週間にわたって、Ｆａｘｉｔｒｏｎ ＨＰ４３８５５ＡＸ線キャビネット（米国、マクミンビルのＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ）を使用して、完全な脱灰が確認されるまで脱灰する。
【０１６６】
脱灰した椎間板−椎体標本の矢状スライス（５ｍｍ厚）は、標準の組織学的方法により段階的エタノール溶液を通して脱水し、パラフィン蝋中に埋め込む。パラフィン部分４μｍ厚は、組織化学的染色の準備をして、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ Ｐｌｕｓガラス顕微鏡のスライド（Ｍｅｎｚｅｌ−Ｇｌａｓｅｒ）上に８５℃で３０分間、次に５５℃で一晩配置する。これらの部分は、キシレン中で脱パラフィンし（４回変更×２分）、水に対する段階的エタノール洗浄（１００〜７０％ｖ／ｖ）を通して再水和される。
【０１６７】
すべてのブロックからの３つの部分は、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色する。これらの部分は、環状切開のみを施されるレベルの組織学的特性と、切開され、可溶性ＯＰ−１複合体を受領するレベルの組織学的特性を比較する個々の組織病理学者によって検査される。４点半定量的等級付けシステムを使用して、顕微鏡的な特徴を評価する。コラーゲン構造も、偏光顕微鏡法を使用して、マッソントリクロームおよびピクロシリウスレッドで染色した部分で検査される。
【０１６８】
免疫組織化学的手順は、上記のとおり、Ｓｅｑｕｅｎｚａカセット、および使い捨て式のカバープレート免疫染色システムを使用して行われる（Ｍｅｌｒｏｓｅ Ｊ等、（２００２年）パーリカン、基底膜のマルチ領域プロテオグリカンは、ヒツジの脊椎成長プレートの異常肥大軟骨細胞、および軟骨性終板軟骨の突出した細胞周囲の要素でもある、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１８，２６９−２８０；Ｍｅｌｒｏｓｅ Ｊ等、（２００２年）実験的な椎間板変性のヒツジ環状病巣モデルにおけるプロテオグリカンの減少に関連する神経および血管の内殖の増加、Ｓｐｉｎｅ ２７，１２７８−８５；Ｍｅｌｒｏｓｅ Ｊ等、（２００２年）、単分子層およびアルギン酸塩ビード培地における椎間板細胞、滑液線維芽細胞および関節軟骨細胞の形態および成長特性、Ｅｕｒ．Ｓｐｉｎｅ Ｊ．１２，５７−６５；Ｍｅｌｒｏｓｅ Ｊ等（２００１）プロテオグリカンエピトープの差別的発現、およびアルギン酸塩ビード中のヒツジ椎間板細胞成長の成長特性、Ｃｅｌｌｓ Ｔｉｓｓｕｅｓ Ｏｒｇａｎｓ １６８：１３７−１４６；Ｍｅｌｒｏｓｅ Ｊ等、（２００３）パーリカン、基底膜のマルチ領域ＨＳ−プロテオグリカンは、発現するヒトの脊柱の軟骨性椎体原基、脊椎成長プレートおよび椎間板の突出した細胞外および細胞周囲の要素である、Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ ５１：１３３１−１３４１；Ｍｅｌｒｏｓｅ Ｊ等、（２０００年）アルギン酸塩ビード培地におけるヒツジ椎間板によるプロテオグリカンエピトープの差別的発現、Ｊ．Ａｎａｔ．１９７：１８９−１９８；Ｍｅｌｒｏｓｅ Ｊ等、（２００２年）腫瘍増殖因子−β、線維芽細胞増殖因子−２、オステオネクチンの空間および時間的局在化、並びに損傷した線維輪においてα平滑筋アクチンを発現する細胞の特定：細胞外マトリクスの修復の意味、Ｓｐｉｎｅ ２７：１７５６−１７６４；およびＫｎｏｘ Ｓ等、（２００２年）すべてのパールカンが、等しく生成されるわけではい：線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２）およびＦＧＦ受容体との相互作用、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１４６５７−１４６６５）、内因性ペロオキシダーゼ活動は、最初に、組織部分を３％Ｈ２Ｏ２で培養することによって遮断される。次に、２０ｍＭのトリスアセテート緩衝液ｐＨ８．０中において１時間にわたって３７℃でコンドロイチナーゼＡＢＣ（０．２５Ｕ／ｍｌ）を使用し、および１時間にわたって３７℃で、リン酸緩衝液ｐＨ５．０中でウシ睾丸ヒアルロニダーゼ１０００Ｕ／ｍｌを使用するという組合せで、この組織部分の前消化を行い、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．２ ０．５Ｍ ＮａＣｌ（ＴＢＳ）またはプロテイナーゼ−Ｋ（ＤＡＫＯ Ｓ３０２０）中において６分間室温で３回洗浄して、抗原エピトープを露出させる。この組織は、次に、１時間にわたって２０％の正常ブタ血清中で遮断し、大きいプロテオグリカンおよび小さいプロテオグリカン並びにコラーゲンに対するある数の一次抗体を使って精査する（表５）。負のコントロール部分も、一次抗体を除外するか、あるいは無関係なアイソタイプの適合一次抗体を該当する真の一次抗体と置換することによって処理される。西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリ性ホスファターゼ共役二次抗体は、ＴＢＳまたはＮｏｖａ ＲＥＤ担体中の０．０５％の３，３’−ジアミノベンジジンジヒドロクロリド、および０．０３％の Ｈ２Ｏ２を使用する検出に使用される。染色スライドは、Ｌｅｉｃａ ＭＰＳ６０顕微鏡写真機デジタルカメラシステムを使用して、明視野顕微鏡検査により検査し、写真を撮影する。
【０１６９】
【表５】
Ｅ．背骨運動部分の生体力学的評価
非破壊的な生体力学的運動範囲（ＲＯＭ）分析は、各々の機能的脊柱単位（ＦＳＵ）に関して、様々な運動平面内で（屈曲−伸張、側方屈曲、圧縮、および捻転）行われる。各々のＦＳＵは、２つの隣接する脊椎、介在する椎間板、および関連する靭帯を含む。
【０１７０】
Ｃａｌｌａｇｈａｎ ａｎｄ ＭｃＧｉＩｌが開発した治具に基づいて特別に設計された治具は、一定の軸荷重を維持しつつ、純粋な捻転および屈曲モーメントを各々のＦＳＵに適用することを可能にする。この結合荷重は、インビボで脊柱に生じる生理的負荷の厳密なシミュレーションである。
【０１７１】
４つのＦＳＵをテストする：手術しないコントロールレベル；切開されるレベル；切開され、可溶性ＯＰ−１複合体および媒体で処置されるレベル、および切開されており、媒体のみ処置されるレベル。各々のＦＳＵは、２つのアルミニウム合金カップ内に実装し、低温硬化セメントで固定する。椎間板がカップに整列するようにように注意を要する。テストを開始する前に、各々のＦＳＵは、水和作用の再現可能な状態が達成されるまで、０．５ＭＰａの応力まで予荷重を与える。これは、各々のテストの前の基準として使用される。０．５ＭＰａの予荷重応力は、リラックスして立っている状態をシミュレートしており、椎間板内圧力のインビボの測定結果に基づいている（Ｗｉｌｋｅ Ｈ−Ｊ等、（１９９９年）日常生活における椎間板内の圧力のインビボでの測定結果、Ｓｐｉｎｅ ２４：７５５−６２）。±５Ｎｍの捻転荷重および±１Ｎｍの屈曲−伸張、側方屈曲荷重を１０回より多く繰り返して、一定の０．５ＭＰａ軸方向負荷状態で加える。繰り返し軸方向荷重（０回を超える０〜１０００Ｎ）を加えて、ＩＶＤの軸方向圧縮反応を調査する。
【０１７２】
（実施例８ ヤギモデルにおける軟骨、および微小破壊を処置された軟骨欠損に対するＯＰ−１の効果）
この調査は、ヤギモデルにおける微小破壊手順によって誘発される修復組織の量および組成物に対する可溶性ＯＰ−１複合体の影響を評価する。全部で２４匹の成体のオスヤギ（年齢１．５〜３歳）体重約２５ｋｇを使用する。外科手術前に、膝関節を検査して、変性関節疾病またはその他の注目すべき整形外科的問題を持つ動物を排除する。１つの８ｍｍ（１辺）角の軟骨の欠損（最高到達点−石灰化軟骨層まで軟骨を除去する）は、すべての動物の右膝（後膝関節）の滑車溝内に形成する。１２匹のヤギの場合、軟骨欠損は、処置部位として役立つであろう（ＩＡ群およびＩＩＢ群（以下の表６参照））。次に、１２匹の動物の右膝関節に微小破壊の処置を施す（ＩＩＡおよびＩＩＢ群）。約１ｍｍ径のピックを使用して、１６個の微小破壊孔を形成する。
【０１７３】
手術直後、可溶性ＯＰ−１複合体（Ｓｏｌ．ＯＰ−１ Ｃｍｐｌｘ）を関節の滑液内に注射する。７日後に、第２の注射薬を投与する。軟骨の欠損群（ＩＢ）の６匹の動物、および微小破壊群（ＩＩＢ）の６匹の動物の場合、媒体のみを送達する。
【０１７４】
【表６】
すべての動物は、外科処置から１６週後に屠殺する。すべての部位は、組織形態計測による評価のために準備する。各々の欠損の中心部分の１つの組織学的部分を評価する。元の軟骨の欠損領域を充填する特定の組織の種類（関節軟骨、ヒアリン軟骨、線維軟骨、および線維組織）は、顕微鏡の接眼レンズのグリッドを使用して決定する。組織の型に関して十分に認められている組織学的基準（たとえば、Ｗａｎｇ Ｑ．等、イヌの関節軟骨内の欠損の治癒；血管のないα平滑筋アクチンの分布−細胞を含む、Ｗｏｕｎｄ Ｒｅｐａｉｒ Ｒｅｇｅｎ．８，ｐｐ．１４５−１５８（２０００年）；Ｂｒｅｉｎａｎ ＨＡ，等、微小破壊で処置したイヌの関節軟骨の欠損の治癒、ＩＩ型コラーゲンマトリクス、または培養された自己由来の軟骨細胞、Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．１８，ｐｐ．７８１−７８９（２０００）；およびＢｒｅｉｎａｎ，ＨＡ，等、イヌモデルにおける軟骨の欠損の修復に対する培養された自己由来の軟骨細胞の効果Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ．７９Ａ，ｐｐ．１４３９−１４５１（１９９７年））。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、整形外科的組織の修復に関する。より詳細には、本発明は、軟骨の修復または再生方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
軟骨の修復および再生は、現代の整形外科における大きい支障の１つである。変形性関節症、椎間板変性、および半月板破裂などの軟骨の損傷および変性疾患は、米国における成人人口中の能力障害の主な原因であるため、この重要性は非常に大きい。
【０００３】
軟骨は、コラーゲン線維、プロテオグリカン、およびその他の非コラーゲンタンパク質の細胞外マトリクス中に埋め込まれた軟骨細胞から成る結合組織である。軟骨には、関節状および非関節状の２つの形式がある。関節軟骨は、関節内の骨端を被覆する結合組織の薄い層である。非関節軟骨は、線維軟骨および弾性軟骨を含み、椎間板、半月板、気管、咽頭、鼻、耳、および肋骨を含む。
【０００４】
軟骨の機能は、耐荷重性、耐磨耗性を緩和し、関節の殆ど摩擦のない運動を可能にする。多くの場合、外傷、異常な磨耗、または疾病によって生じる軟骨組織の欠損は、疼痛および凝りの原因になる可能性があり、未治療で放置した場合は進行し、最終的に関節全体を交換する必要が生じ得る。たとえば、関節軟骨の欠損は、多くの場合、関節面の早期の変性の原因になり、最終的に骨軟骨の欠損、変形性関節症、またはこの両方を生じ得る。
【０００５】
変形性関節症は、マトリクス成分の合成および破壊間の平衡が妨げられ、異化に向かって変化する際に、損傷した軟骨細胞外マトリクスが修復しようとしているが、徐々に衰えつつあるプロセスであると考えられる。
【０００６】
軟骨組織が自然に再生する能力は、その血液が供給されない性質のために著しく制限される。軟骨組織および下にある骨の両方を含む骨軟骨の欠損の修復は、限られた範囲で行われ、血液および／または髄質によって欠損内にもたらされる幹細胞並びに成長および分化因子の存在によって促進される。動物実験では、これらの欠損は、骨および軟骨の新しい層が形成されて、ある程度修復するが、軟骨マトリクスの巨大分子構成および生化学的性質は不完全である。ＩＩ型コラーゲンではなくＩ型コラーゲン、および軟骨に特有ではないプロテオグリカン、たとえばプロテオグリカンを含むデルマタン硫酸は、修復組織を構成し、時間が経過するにつれて、フィブリル化および退行性変化を生じる。また、軟骨下骨中に浸透しない軟骨の欠損の修復は、たとえ限られた程度でも生じない。
【０００７】
さらに、軟骨欠損の外科的処置は複雑であり、成功はごく限られていることが証明されている。たとえば、関節軟骨の欠損は、関節鏡による方法で処置され、遊離体は創傷清拭されて、線維領域は平滑化される。しかし、この方法だけでは、多くの場合、症状を長期にわたって持続的に緩和することはない。膝代替手術は、相当量の骨を切除する必要があることが多く、複数回の手術を要する場合が多い。
【０００８】
半月板は、緩衝装置として作用する膝関節の内部の骨端間に位置する小さい馬蹄形組織である。各々の膝の内部には、膝の両側に２つの半月板がある。これらの半月板は、一般に、若者の場合は強力であり、加齢とともに脆弱になり、容易に破裂しやすくなる。破裂は、前十字靭帯（ＡＣＬ）の傷害ではきわめて一般的である。関節ヒアリン軟骨などの半月板線維軟骨は、特に中間および血液が供給されない領域では治癒能力は限られている。小さい破裂に対する現在の処置は、大きい問題を生じない場合は破裂を放置することである。半月板破裂に対する外科的処置は、傷害の性質および程度、そして最も重要なことだが、その位置を含む多くの要素によって決まる。高度に血管新生した滑膜と一体化した血管新生領域における破裂は、縫合によって完全に修復されてきた。部分的または全体的な半月板切除は、半月板の血管がない３分の２の範囲内における症候的な破裂には一般的な外科処置である。後者の半月板領域における破裂は、臨床的に最も一般的なタイプである。開放するか、関節鏡を使用するか、全体または部分的な半月板切除を使用するかどうかに関わらず、変形性関節症は、これらの患者の場合、手術後数年以内に再発することが多い。したがって、一般的な修復形式は、破裂部分をごく部分的に除去し、ステープリングによって軟骨を修復することである。残念ながら、この手順の後の治癒過程は遅い。さらに、修復が成功しない場合、全体的に破裂した半月板は、その後除去しなければならない。
【０００９】
持続的で、多くの場合は消耗性の背痛の主な原因は、椎間板（ＩＶＤ）の変性である。椎間板が変性すると、隣接する脊椎が圧迫され、激しい疼痛を生じる場合が多い。
【００１０】
靭帯結合としてのＩＶＤは、隣接する椎体間に関節を提供し、軸方向に加わる脊椎負荷を散逸させる体重負荷クッションとして作用する。これらの生体力学的機能は、中心の水和プロテオグリカン豊富な髄核を囲む外側のコラーゲン豊富な線維輪から成るＩＶＤ特有の構造によって可能になる。上部および下部軟骨性運動終板、つまりヒアリン状軟骨の薄い層は、椎間板内の椎体の接触部分を覆う。
【００１１】
椎間板の変性は、主に腰痛（ＬＢＰ）として顕在する公衆にとって、著しい社会的および経済的負担になる。８０％もの人々が、人生の間にＬＢＰの少なくとも１つの重要な症状を発症し、労働人口の約２．５％が、ＬＢＰの結果、１年間に何日かの病気休暇を取るであろうと概算される。現代の西欧諸国におけるＬＢＰの直接費は、９０億ドルと概算されており、その殆どは、一般開業医、理学療法士、およびその他の従来の施術者の診断に費やされる（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＤＡ等、（１９９８年）Ｈｅａｌｔｈ ｃａｒｅ ａｎｄ ｉｎｄｅｍｎｉｔｙ ｃｏｓｔｓ ａｃｒｏｓｓ ｔｈｅ ｎａｔｕｒａｌ ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｏｃｃｕｐａｔｉｏｎａｌ ｌｏｗ ｂａｃｋ ｐａｉｎ，Ｓｐｉｎｅ ２３：２３２９−３６）。外科的管理を含む全体の間接費は、１０倍高くなり得る（ＭａｅｔｚｅｌおよびＬｉ（２００２年）Ｔｈｅ ｅｃｏｎｏｍｉｃ ｂｕｒｄｅｎ ｏｆ ｂａｃｋ ｐａｉｎ：１９９６年〜２００１年に発行された調査報告書、Ｂｅｓｔ Ｐｒａｃ Ｒｅｓ Ｃｌｉｎ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ １６：２３−３０；Ｗａｌｋｅｒ等、（２００３年）Ｔｈｅ ｅｃｏｎｏｍｉｃ ｂｕｒｄｅｎ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｐｉｎｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ａｕｓｔｒａｌｉａ Ａｎｎｕａｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｍｅｅｔｉｎｇ、オーストラリア、キャンベラ）。
【００１２】
椎間板の変性は、殆どの場合、骨格の成熟から生じる自然現象である（Ｖｅｒｎｏｎ−Ｒｏｂｅｒｔｓ（１９９２）Ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ａｎｄ ｄｅｇｅｎｅｒａｉｖｅ
ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｏｆ ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ ｄｉｓｃｓ ａｎｄ ａｐｏｐｈｙｓｅａｌ ｊｏｉｎｔｓ，Ｉｎ：Ｔｈｅ ｌｕｍｂａｒ ｓｐｉｎｅ ａｎｄ
ｂａｃｋ ｐａｉｎ．Ｆｏｕｒｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊａｙｓｏｎ ＭＦＶ，Ｅｄ．
Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ，Ｃｈａｐｔｅｒ
２，１７−４１）。これは、加齢と一致するが、多くの場合、疼痛、特に腰痛にも関連し、運動性が限られる。ＬＢＰの症状は、患者が、限られた運動性に適応するように自身の生活様式を変えると、時間の経過とともに自然に解消する場合が多い。しかし、多くの場合、外科的介入を要する重要な要素は依然として残る。慢性的なＬＢＰの外科的処置の従来の「判断基準」は、１つまたは複数の疼痛レベルを不動にするための脊椎融合術だった。融合術は、長期間の入院、および専門的な外科的専門技術が必要なため高価であり、これらの患者の殆どは、短期の疼痛緩和を行うと思われるが、現在、融合術が最善の結果を提供しないという証拠はある。長期間の研究では、脊椎融合術は、融合部位に隣接するレベルで実際に変性を促進することが示唆されている（Ｌｅｅ（１９８８年）Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｇｍｅｎｔ ａｄｊａｃｅｎｔ ｔｏ ａ ｌｕｍｂａｒ ｆｕｓｉｏｎ，Ｓｐｉｎｅ １３：３７５−７）。関節炎および骨折した腰および膝の機能を回復するために、５０年前から人工的な補綴が開発されてきたように、現在、慢性的な変性によって疼痛および関節炎を生じるようになった椎間板の完全な機械的機能を回復することを目的として、補綴が開発されている（Ｓｚｐａａｌｓｋｉ等（２００２年）Ｖ Ｓｐｉｎｅ ａｒｔｈｒｏｐｌａｓｔｙ：ａ ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗ，Ｅｕｒ Ｓｐｉｎｅ Ｊ １１：Ｓ６５−Ｓ８４）。しかし、試験中の無数のモデルのどれかが、長期にわたって利益を提供するかを知るには、未だ早すぎる。
【００１３】
「骨形成タンパク質」または「形態形成タンパク質」または「モルフォゲン」として公知のクラスのタンパク質は、単独で前駆物質の増殖および分化を機能的な骨、軟骨、腱、および／または靭帯組織中に導入することが可能な真の骨および軟骨組織モルフォゲンとして作用する能力を有する。これらのタンパク質としては、最初は異所性の軟骨内骨形成を誘発する能力によって識別された骨形成タンパク質（ＢＭＰ）の族の要素が挙げられる。骨形成タンパク質は、一般に、先行技術では、増殖因子のＴＧＦ−β上科の亜群として分類される（Ｈｏｇａｎ（１９９６）Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １０：１５８０−１５９４）。タンパク質のモルフォゲン族の要素としては、哺乳類の骨形成タンパク質−１（ＢＭＰ−７としても公知のＯＰ−１、およびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ同族体６０Ａ）、骨形成タンパク質−２（ＢＭＰ−８ａとしても公知のＯＰ−２）、骨形成タンパク質−３（ＢＭＰ−８ｂとしても公知のＯＰ−３）、ＢＭＰ−２（ＢＭＰ−２ＡまたはＣＢＭＰ−２Ａ、およびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ同族体ＤＰＰとしても公知）、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４（ＢＭＰ−２ＢまたはＣＢＭＰ−２Ｂとしても公知）、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびそのマウス科の同族体Ｖｇｒ−１、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＧＤＦ３（Ｖｇｒ２としても公知）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９、ＧＤＦ１０、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＧＤＦ−５（ＣＤＭＰ−１またはＭＰ５２としても公知）、ＧＤＦ−６（ＣＤＭＰ−２としても公知）、ＧＤＦ−７（ＣＤＭＰ−３としても公知）、Ｘｅｎｏｐｕｓ同族体Ｖｇ１、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、およびＮＥＵＲＡＬが挙げられる。この族の要素は、共通の構造特徴を共用する分泌ポリペプチド鎖をコードし、たとえば、前駆物質の「代用形」から処理して、二量体化することが可能な成熟したポリペプチド鎖を生成し、約９７〜１０６個のアミノ酸のカルボキシ末端活性領域を含む。すべての要素は、この領域のシステインの保存パターンを共用し、これらのタンパク質の活性形式は、単一族の要素のジスルフィド結合同質二量体、または２つの異なる要素の異質二量体でよい（たとえば、Ｍａｓｓａｇｕｅ（１９９０年）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．６：５９７；Ｓａｍｐａｔｈ等（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６５：１３１９８参照）。また、米国特許第５，０１１，６９１号；米国特許第５，２６６，６８３号、Ｏｚｋａｙｎａｋ等（１９９０年）ＥＭＢＯ Ｊ．９：２０８５−２０９３、Ｗｈａｒｔｏｎ等（１９９１年）ＰＮＡＳ ８８：９２１４−９２１８、Ｏｚｋａｙｎａｋ（１９９２年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２５２２０−２５２２７および米国特許第５，２６６，６８３号；Ｃｅｌｅｓｔｅ等（１９９１年）ＰＮＡＳ ８７：９８４３−９８４７；Ｌｙｏｎｓ等（１９８９年）ＰＮＡＳ ８６：４５５４−４５５８；Ｗｏｚｎｅｙ等（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１５２８−１５３４；国際公開第９３／００４３２号；Ｐａｄｇｅｔｔ等（１９８７年）Ｎａｔｕｒｅ ３２５：８１−８４；Ｗｅｅｋｓ（１９８７年）Ｃｅｌｌ ５１：８６１−８６７参照）。
【００１４】
成熟した二量体形式では、形態形成タンパク質は、一般に、生理学的条件下でかなり不溶性である。哺乳類細胞発現系から培養された媒体中に分泌された形態形成タンパク質は、分泌タンパク質の相当部分として、可溶性形式のタンパク質を含むことが発見された。この可溶性形式は、「可溶性形態形成タンパク質複合体」とも呼ばれ、成熟した二量体種、およびその切断型を含み、切断型は、少なくとも１つ、好ましくは２つのプロ領域に共有結合している。特許文献１参照。
【００１５】
軟骨の欠損を修復するために現在好ましい方法としては、創傷清拭、微小破壊、自己移植、自家軟骨移植術、および関節置換術が挙げられる。しかし、これらの方法のどれも、軟骨組織を実際に修復および置換することにならない。これらの方法は、瘢痕様の特徴を持つ不完全な修復組織を生じる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】米国特許第６，３９５，８８３号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
したがって、軟骨の欠損を修復および再生し、現在利用可能な方法および組成物に関連する問題を克服するための組成物および方法の必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
（発明の要旨）
本発明は、可溶性形態形成タンパク質複合体を使用して、軟骨組織を修復および再生する方法を提供する。実施態様によっては、本発明は、患者の軟骨の欠損を修復する方法であって、軟骨内、軟骨を囲む領域内に、（ａ）形態形成タンパク質、および（ｂ）形態形成タンパク質から単離された形態形成タンパク質のプロ領域、あるいはこのプロ領域の保存的置換改変体またはフラグメントを含む治療有効量の単離可溶性形態形成タンパク質複合体を含む組成物であって、このプロ領域または改変体またはフラグメントが、形態形成タンパク質に非共有結合され、この複合体が、水性溶媒中で、形態形成タンパク質単独より水溶性である組成物を投与するステップを含む方法を提供する。
【００１９】
実施態様によっては、本発明は、患者の体内に軟骨を再生または生成する方法であって、軟骨、または軟骨を囲む領域に、（ａ）形態形成タンパク質、および（ｂ）形態形成タンパク質から単離された形態形成タンパク質のプロ領域、あるいはこのプロ領域の保存的置換改変体またはフラグメントを含む治療有効量の単離可溶性形態形成タンパク質複合体を含む組成物であって、このプロ領域または改変体またはフラグメントが、形態形成タンパク質に非共有結合され、この複合体が、水性溶媒中で、形態形成タンパク質単独より水溶性である組成物を投与するステップを含む方法を提供する。
【００２０】
他の実施態様では、本発明は、患者の体内の軟骨の成長を促進するか、または患者の体内の軟骨の形成を促進する方法であって、軟骨内、または軟骨を囲む領域内に、（ａ）形態形成タンパク質、および（ｂ）形態形成タンパク質から単離された形態形成タンパク質のプロ領域、あるいはこのプロ領域の保存的置換改変体またはフラグメントを含む治療有効量の単離可溶性形態形成タンパク質複合体を含む組成物であって、このプロ領域または改変体またはフラグメントが、形態形成タンパク質に非共有結合され、およびこの複合体が、水性溶媒中で、形態形成タンパク質単独より水溶性である組成物を投与するステップを含む方法を提供する。
【００２１】
さらに他の実施態様では、本発明は、患者の軟骨の変性を防止するか、軟骨の損傷、あるいは変性疾病または疾患を処置する方法であって、（ａ）形態形成タンパク質、および（ｂ）形態形成タンパク質から単離された形態形成タンパク質のプロ領域、またはこのプロ領域の保存的置換改変体またはフラグメントを含む、治療有効量の単離可溶性形態形成タンパク質複合体を含む組成物であって、このプロ領域または改変体またはフラグメントが、形態形成タンパク質に非共有結合され、この複合体が、水性溶媒中で、形態形成タンパク質単独より水溶性である組成物を投与するステップを含む方法を提供する。
【００２２】
本発明は、患者の軟骨組織の損傷を処置する方法であって、（ａ）形態形成タンパク質、および（ｂ）形態形成タンパク質から単離された形態形成タンパク質のプロ領域、またはこのプロ領域の保存的置換改変体またはフラグメントを含む、治療有効量の単離可溶性形態形成タンパク質複合体を含む組成物であって、このプロ領域または改変体またはフラグメントが、形態形成タンパク質に非共有結合され、この複合体が、水性溶媒中で、形態形成タンパク質単独より水溶性である組成物を患者に投与するステップを含む方法を提供する。実施態様によっては、この組織の損傷は、半月板の破裂、軟骨の空隙または欠損、骨軟骨の空隙または欠損、あるいはＡＣＬ損傷があるが、これらだけに限らない。
【００２３】
本発明は、患者の体内の軟骨組織の変性疾病または疾患を処置する方法であって、（ａ）形態形成タンパク質、および（ｂ）形態形成タンパク質から単離された形態形成タンパク質のプロ領域、またはこのプロ領域の保存的置換改変体またはフラグメントを含む、治療有効量の単離可溶性形態形成タンパク質複合体を含む組成物であって、このプロ領域または改変体またはフラグメントが、形態形成タンパク質に非共有結合され、この複合体が、水性溶媒中で、形態形成タンパク質単独より水溶性である組成物を患者に投与するステップを含む方法を提供する。実施態様によっては、軟骨組織の変性疾病または疾患としては、変形性関節症および椎間板変性があるが、これらだけに限らない。実施態様によっては、本発明の組成物は、骨関節炎または椎間板変性欠損部位、あるいは骨関節炎または椎間板変性欠損部位を囲む領域に投与される。
【００２４】
実施態様によっては、軟骨は関節軟骨である。実施態様によっては、関節軟骨は関節接合部内にある。他の実施態様では、軟骨は、非関節軟骨である。実施態様によっては、非関節軟骨は、半月板または椎間板である。
【００２５】
実施態様によっては、組成物は軟骨内に投与される。実施態様によっては、組成物は、半月板または椎間板内に投与される。実施態様によっては、組成物は、軟骨を囲む領域に投与される。実施態様によっては、軟骨を囲む領域は滑液である。
【００２６】
実施態様によっては、形態形成タンパク質は、本発明の方法に使用される組成物であって、たとえば、ＯＰ−Ｉ、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＤＰＰ、Ｖｇｌ、Ｖｇｒ、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、並びにこれらの保存的置換改変体、およびフラグメントが挙げられるが、これらだけに限らない。好ましい実施態様では、形態形成タンパク質は、ＯＰ−１、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＢＭＰ−１２、およびＢＭＰ−１３から選択される。より好ましい実施態様では、形態形成タンパク質はＯＰ−１である。他の実施態様では、形態形成タンパク質は、ヒトＯＰ−１の保存７システイン領域を含むＣ末端１０２〜１０６のアミノ酸に対して少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、この形態形成タンパク質は、軟骨の欠損の修復を誘発することが可能である。実施態様によっては、本発明の方法に使用する組成物中の形態形成タンパク質は二量体である。実施態様によっては、本発明の組成物中の形態形成タンパク質は非共有二量体であり、たとえば、鎖間ジスルフィド結合に関わるシステイン残基が、別のアミノ酸残基と置換されたモノマーが挙げられる。
【００２７】
実施態様によっては、形態形成タンパク質のプロ領域は、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＤＰＰ、Ｖｇｌ、Ｖｇｒ、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、あるいはこれらの保存的置換改変体、またはフラグメントのプロ領域のアミノ酸配列を含む。他の実施態様では、形態形成タンパク質のプロ領域は、ＯＰ−１、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、あるいはこれらの保存的置換改変体、またはフラグメントのプロ領域のアミノ酸配列を含む。さらに別の実施態様では、形態形成タンパク質のプロ領域は、ＯＰ−１、あるいはその保存的置換改変体、またはフラグメントのプロ領域のアミノ酸配列を含む。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
患者の体内の軟骨の欠損を修復する方法であって、前記軟骨内、または前記軟骨を囲む領域内に、治療有効量の単離可溶性形態形成タンパク質複合体を含む組成物を投与するステップを含み、前記組成物は、
（ａ）形態形成タンパク質と、
（ｂ）形態形成タンパク質から単離された形態形成タンパク質のプロ領域、あるいは前記プロ領域の保存的置換改変体またはフラグメントであって、前記プロ領域または改変体またはフラグメントが、前記形態形成タンパク質に非共有結合され、前記複合体が、水性溶媒中で、前記形態形成タンパク質単独より水溶性であるものと
を含む、方法。
（項目２）
前記軟骨が、関節および非関節軟骨から選択される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記非関節軟骨が、半月板および椎間板から成る群から選択される、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記軟骨を囲む領域が滑液である、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記形態形成タンパク質が二量体である、項目１〜４の何れか１項に記載の方法。
（項目６）
前記形態形成タンパク質が、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＤＰＰ、Ｖｇｌ、Ｖｇｒ−１、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、およびこれらの保存的置換改変体およびフラグメントから成る群から選択される、項目１〜５の何れか１項に記載の方法。
（項目７）
前記形態形成タンパク質が、ＯＰ−１、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＢＭＰ−１２、およびＢＭＰ−１３から成る群から選択される、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記形態形成タンパク質がＯＰ−１である、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記形態形成タンパク質が、ヒトＯＰ−１の前記保存７システイン領域を含む前記Ｃ末端１０２〜１０６のアミノ酸に対して少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、前記形態形成タンパク質が、前記軟骨の欠損の修復を誘発することが可能な、項目１〜５の何れか１項に記載の方法。
（項目１０）
前記形態形成タンパク質のプロ領域が、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＤＰＰ、Ｖｇｌ、Ｖｇｒ、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、並びにこれらの保存的置換改変体およびフラグメントから成る群から選択されるプロ領域のアミノ酸配列を含む、項目１〜９の何れか１項に記載の方法。
（項目１１）
前記形態形成タンパク質のプロ領域が、ＯＰ−１、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＢＭＰ−１２、およびＢＭＰ−１３、並びにこれらの保存的置換改変体およびフラグメントから成る群から選択されるプロ領域のアミノ酸配列を含む、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記形態形成タンパク質のプロ領域が、ＯＰ−１またはその保存的置換改変体およびフラグメントのプロ領域のアミノ酸配列を含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
患者の体内に軟骨を再生または生成する方法であって、前記軟骨内、または前記軟骨を囲む領域内に、治療有効量の単離可溶性形態形成タンパク質複合体を含む組成物を投与するステップを含み、前記組成物は、
（ａ）形態形成タンパク質と、
（ｂ）形態形成タンパク質から単離された形態形成タンパク質のプロ領域、あるいは前記プロ領域の保存的置換改変体、またはフラグメントであって、前記プロ領域または改変体またはフラグメントが、前記形態形成タンパク質に非共有結合され、前記複合体が、水性溶媒中で、前記形態形成タンパク質単独より水溶性であるものと
を含む、方法。
（項目１４）
前記軟骨が関節および非関節軟骨から選択される、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記非関節軟骨が、半月板および椎間板から成る群から選択される、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記軟骨を囲む前記領域が滑液である、項目１３に記載の方法。
（項目１７）
前記形態形成タンパク質が二量体である、項目１３〜１６の何れか１項に記載の方法。
（項目１８）
前記形態形成タンパク質が、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＤＰＰ、Ｖｇｌ、Ｖｇｒ−１、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、並びにこれらの保存的置換改変体およびフラグメントから成る群から選択される、項目１３〜１７の何れか１項に記載の方法。
（項目１９）
前記形態形成タンパク質が、ＯＰ−１、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＢＭＰ−１２、およびＢＭＰ−１３から成る群から選択される、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記形態形成タンパク質がＯＰ−１である、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記形態形成タンパク質が、ヒトＯＰ−１の前記保存７システイン領域を含む前記Ｃ末端１０２〜１０６のアミノ酸に対して少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、前記形態形成タンパク質が、前記軟骨の欠損の修復を誘発することが可能である、項目１３〜１７の何れか１項に記載の方法。
（項目２２）
前記形態形成タンパク質のプロ領域が、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＤＰＰ、Ｖｇｌ、Ｖｇｒ、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、並びにこれらの保存的置換改変体およびフラグメントから成る群から選択されるプロ領域のアミノ酸配列を含む、項目１３〜２１の何れか１項に記載の方法。
（項目２３）
前記形態形成タンパク質のプロ領域が、ＯＰ−１、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＢＭＰ−１２、およびＢＭＰ−１３、並びにこれらの保存的置換改変体およびフラグメントから成る群から選択されるプロ領域のアミノ酸配列を含む、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記形態形成タンパク質のプロ領域が、ＯＰ−１またはその保存的置換改変体およびフラグメントのプロ領域のアミノ酸配列を含む、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
患者の体内における軟骨の成長を促進するか、軟骨の形成を加速する方法であって、前記軟骨内、または前記軟骨を囲む領域内に、治療有効量の単離可溶性形態形成タンパク質複合体を含む組成物を投与するステップを含み、前記組成物は、
（ａ）形態形成タンパク質と、
（ｂ）形態形成タンパク質から単離された形態形成タンパク質のプロ領域、あるいは前記プロ領域の保存的置換改変体、またはフラグメントであって、前記プロ領域または改変体またはフラグメントが、前記形態形成タンパク質に非共有結合され、前記複合体が、水性溶媒中で、前記形態形成タンパク質単独より水溶性であるものと
を含む、方法。
（項目２６）
前記軟骨が関節および非関節軟骨から選択される、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記非関節軟骨が、半月板および椎間板から成る群から選択される、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記軟骨を囲む前記領域が滑液である、項目２５に記載の方法。
（項目２９）
前記形態形成タンパク質が二量体である、項目２５〜２８の何れか１項に記載の方法。
（項目３０）
前記形態形成タンパク質が、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＤＰＰ、Ｖｇｌ、Ｖｇｒ−１、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、並びにこれらの保存的置換改変体およびフラグメントから成る群から選択される、項目２５〜２９の何れか１項に記載の方法。
（項目３１）
前記形態形成タンパク質が、ＯＰ−１、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＢＭＰ−１２、およびＢＭＰ−１３から成る群から選択される、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記形態形成タンパク質がＯＰ−１である、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記形態形成タンパク質が、ヒトＯＰ−１の前記保存７システイン領域を含む前記Ｃ末端１０２〜１０６のアミノ酸に対して少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、前記形態形成タンパク質が、前記軟骨の欠損の修復を誘発することが可能である、項目２５〜２９の何れか１項に記載の方法。
（項目３４）
前記形態形成タンパク質のプロ領域が、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＤＰＰ、Ｖｇｌ、Ｖｇｒ、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、並びにこれらの保存的置換改変体およびフラグメントから成る群から選択されるプロ領域のアミノ酸配列を含む、項目２５〜３３の何れか１項に記載の方法。
（項目３５）
前記形態形成タンパク質のプロ領域が、ＯＰ−１、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＢＭＰ−１２、およびＢＭＰ−１３、並びにこれらの保存的置換改変体およびフラグメントから成る群から選択されるプロ領域のアミノ酸配列を含む、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記形態形成タンパク質のプロ領域が、ＯＰ−１またはその保存的置換改変体およびフラグメントのプロ領域のアミノ酸配列を含む、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
患者の軟骨の変性を防止するか、軟骨の損傷、あるいは変性疾病または疾患を処置する方法であって、前記軟骨内、または前記軟骨を囲む領域内に、治療有効量の単離可溶性形態形成タンパク質複合体を含む組成物を投与するステップを含み、前記組成物は、
（ａ）形態形成タンパク質と、
（ｂ）形態形成タンパク質から単離された形態形成タンパク質のプロ領域、あるいは前記プロ領域の保存的置換改変体、またはフラグメントであって、前記プロ領域または改変体またはフラグメントが、前記形態形成タンパク質に非共有結合され、前記複合体が、水性溶媒中で、前記形態形成タンパク質単独より水溶性であるものと
を含む、方法。
（項目３８）
前記軟骨が関節および非関節軟骨から選択される、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記非関節軟骨が、半月板および椎間板から成る群から選択される、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記軟骨を囲む前記領域が滑液である、項目３７に記載の方法。
（項目４１）
前記形態形成タンパク質が二量体である、項目３７〜４０の何れか１項に記載の方法。
（項目４２）
前記形態形成タンパク質が、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＤＰＰ、Ｖｇｌ、Ｖｇｒ−１、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、並びにこれらの保存的置換改変体およびフラグメントから成る群から選択される、項目３７〜４１の何れか１項に記載の方法。
（項目４３）
前記形態形成タンパク質が、ＯＰ−１、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＢＭＰ−１２、およびＢＭＰ−１３から成る群から選択される、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記形態形成タンパク質がＯＰ−１である、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記形態形成タンパク質が、ヒトＯＰ−１の前記保存７システイン領域を含む前記Ｃ末端１０２〜１０６のアミノ酸に対して少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、前記形態形成タンパク質が、前記軟骨の欠損の修復を誘発することが可能である、項目３７〜４１の何れか１項に記載の方法。
（項目４６）
前記形態形成タンパク質のプロ領域が、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＤＰＰ、Ｖｇｌ、Ｖｇｒ、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、並びにこれらの保存的置換改変体およびフラグメントから成る群から選択されるプロ領域のアミノ酸配列を含む、項目３７〜４５の何れか１項に記載の方法。
（項目４７）
前記形態形成タンパク質のプロ領域が、ＯＰ−１、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＢＭＰ−１２、およびＢＭＰ−１３、並びにこれらの保存的置換改変体およびフラグメントから成る群から選択されるプロ領域のアミノ酸配列を含む、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記形態形成タンパク質のプロ領域が、ＯＰ−１またはその保存的置換改変体およびフラグメントのプロ領域のアミノ酸配列を含む、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
患者の体内の軟骨組織の損傷、あるいは変性疾病または疾患を処置する方法であって、治療有効量の単離可溶性形態形成タンパク質複合体を含む組成物を前記患者に投与するステップを含み、前記組成物は、
（ａ）形態形成タンパク質と、
（ｂ）形態形成タンパク質から単離された形態形成タンパク質のプロ領域、あるいは前記プロ領域の保存的置換改変体またはフラグメントであって、前記プロ領域あるいは改変体またはフラグメントが、前記形態形成タンパク質に非共有結合され、前記複合体が、水性溶媒中で、前記形態形成タンパク質単独より水溶性であるものと
を含む、方法。
（項目５０）
前記軟骨組織の損傷が、単数の半月板破裂、複数の半月板破裂、軟骨の空隙および欠損、骨軟骨の空隙および欠損、並びにＡＣＬ損傷から成る群から選択される、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記軟骨の変性疾病または疾患が、変形性関節症および椎間板変性から成る群から選択される、項目４９に記載の方法。
（項目５２）
前記形態形成タンパク質が二量体である、項目４９〜５１の何れか１項に記載の方法。
（項目５３）
前記形態形成タンパク質が、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＤＰＰ、Ｖｇｌ、Ｖｇｒ−１、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、並びにこれらの保存的置換改変体およびフラグメントから成る群から選択される、項目４９〜５２の何れか１項に記載の方法。
（項目５４）
前記形態形成タンパク質が、ＯＰ−１、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＢＭＰ−１２、およびＢＭＰ−１３から成る群から選択される、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記形態形成タンパク質がＯＰ−１である、項目１６に記載の方法。
（項目５６）
前記形態形成タンパク質が、ヒトＯＰ−１の前記保存７システイン領域を含む前記Ｃ末端１０２〜１０６のアミノ酸に対して少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、前記形態形成タンパク質が、前記軟骨の欠損の修復を誘発することが可能である、項目４９〜５２の何れか１項に記載の方法。
（項目５７）
前記形態形成タンパク質のプロ領域が、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＤＰＰ、Ｖｇｌ、Ｖｇｒ、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、並びにこれらの保存的置換改変体およびフラグメントから成る群から選択されるプロ領域のアミノ酸配列を含む、項目４９〜５６の何れか１項に記載の方法。
（項目５８）
前記形態形成タンパク質のプロ領域が、ＯＰ−１、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＢＭＰ−１２、およびＢＭＰ−１３、並びにこれらの保存的置換改変体およびフラグメントから成る群から選択されるプロ領域のアミノ酸配列を含む、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
前記形態形成タンパク質のプロ領域が、ＯＰ−１またはその保存的置換改変体およびフラグメントのプロ領域のアミノ酸配列を含む、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
前記組成物が、前記骨関節炎の欠損部位、または前記骨関節炎の欠損部位を囲む領域内に投与される、項目５１に記載の方法。
（項目６１）
前記組成物が、前記椎間板変性の欠損部位、または前記椎間板変性の欠損部位を囲む領域に投与される、項目５１に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】配列をコードする核酸から発現したモルフォゲンポリペプチド鎖の略図であり、斜影領域はシグナル配列を表し、点描領域はプロ領域を表し、斜線領域は、Ｎ末端（「Ｎ末端伸張」）を表し、開放領域は、保存７システイン領域を規定する成熟タンパク質配列のＣ末端領域を表し、保存システインは、縦の点線によって指示される。
【図２】成熟形態の様々なモルフォゲン、それぞれＯＰ−２、ＯＰ−１、Ｖｇｒ−１、ＢＭＰ−５、６０Ａ、ＤＰＰ、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、Ｖｇ−１、ＢＭＰ−３のＮ末端伸張の配列を示す。
【図３】ＴＢＳ（トリス緩衝食塩水）中のＩＭＡＣ、Ｓ−セファロース、およびＳ−２００ＨＲクロマトグラフィによる哺乳類細胞の培養から生成および精製された可溶性モルフォゲン（ＯＰ−１）のゲル濾過カラム溶出プロファイルであり、この場合、Ｖ０は空隙容量、ＡＤＨはアルコール脱水素酵素（ＭＷ１５０ｋＤａ）、ＢＳＡはウシ血清アルブミン（ＭＷ６７ｋＤａ）、ＣＡは炭酸脱水酵素（ＭＷ２９ｋＤａ）、およびＣｙｔＣはシトクロムＣ（ＭＷ１２．５ｋＤａ）である。
【図４】相互衝突損傷部位を示す関節の略図である。
【図５】椎間板を線維輪（ＡＦ）四分円および髄核（ＮＰ）に分割する帯状切開スキーム、並びに腰部ヒツジ椎間板を通る水平および垂直断面内の四分円における前外側環状病巣の位置および程度を示す。
【図６】ヒトＯＰ−１のｃＤＮＡ、およびタンパク質配列（配列番号１）を示す。
【図７】ヒトＯＰ−１のタンパク質配列（配列番号２）を示す。
【図８−１】マウスＯＰ−１のｃＤＮＡ、およびタンパク質配列（配列番号３）を示す。
【図８−２】マウスＯＰ−１のｃＤＮＡ、およびタンパク質配列（配列番号３）を示す。
【図９】マウスのタンパク質配列（配列番号４）を示す。
【図１０−１】ヒトＯＰ−２のｃＤＮＡ、およびタンパク質配列（配列番号５）を示す。
【図１０−２】ヒトＯＰ−２のｃＤＮＡ、およびタンパク質配列（配列番号５）を示す。
【図１１】ヒトＯＰ−２のタンパク質配列（配列番号６）を示す。
【図１２−１】マウスＯＰ−２のｃＤＮＡ、およびタンパク質配列（配列番号７）を示す。
【図１２−２】マウスＯＰ−２のｃＤＮＡ、およびタンパク質配列（配列番号７）を示す。
【図１３】マウスＯＰ−２のタンパク質配列（配列番号８）を示す。
【図１４】マウスＯＰ−３のタンパク質配列（配列番号９）を示す。
【図１５】ＢＭＰ−２のタンパク質配列（配列番号１０）を示す。
【図１６】ＢＭＰ−４のタンパク質配列（配列番号１１）を示す。
【図１７】ＢＭＰ−３のタンパク質配列（配列番号１２）を示す。
【図１８】ＢＭＰ−５のタンパク質配列（配列番号１３）を示す。
【図１９】ＢＭＰ−６のタンパク質配列（配列番号１４）を示す。
【図２０】ＢＭＰ−１０のタンパク質配列（配列番号１５）を示す。
【図２１】ＢＭＰ−１５のタンパク質配列（配列番号１６）を示す。
【図２２】ＢＭＰ−１６のタンパク質配列（配列番号１７）を示す。
【図２３】ＢＭＰ−１７のタンパク質配列（配列番号１８）を示す。
【図２４】ＢＭＰ−１８のタンパク質配列（配列番号１９）を示す。
【図２５】ＮＯＤＡＬのタンパク質配列（配列番号２０）を示す。
【図２６】ＵＮＩＶＩＮのタンパク質配列（配列番号２１）を示す。
【図２７】ＡＤＭＰのタンパク質配列（配列番号２２）を示す。
【図２８−１】ＤＰＰのタンパク質配列（配列番号２３）を示す。
【図２８−２】ＤＰＰのタンパク質配列（配列番号２３）を示す。
【図２９】ＶＧ−１のタンパク質配列（配列番号２４）を示す。
【図３０】Ｖｇｒ−１のタンパク質配列（配列番号２５）を示す。
【図３１】６０Ａのタンパク質配列（配列番号２６）を示す。
【図３２】ＧＤＦ−１のタンパク質配列（配列番号２７）を示す。
【図３３】ＧＤＦ−２のタンパク質配列（配列番号２８）を示す。
【図３４】ＧＤＦ−３のタンパク質配列（配列番号２９）を示す。
【図３５】ＧＤＦ−５のタンパク質配列（配列番号３０）を示す。
【図３６】ＧＤＦ−６のタンパク質配列（配列番号３１）を示す。
【図３７】ＧＤＦ−７のタンパク質配列（配列番号３２）を示す。
【図３８】ＧＤＦ−８のタンパク質配列（配列番号３３）を示す。
【図３９】ＧＤＦ−９のタンパク質配列（配列番号３４）を示す。
【図４０】ＧＤＦ−１０のタンパク質配列（配列番号３５）を示す。
【図４１】ＧＤＦ−１１のタンパク質配列（配列番号３６）を示す。
【図４２】ＧＤＦ−１２のタンパク質配列（配列番号３７）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
（発明の詳細な説明）
本明細書で説明する発明を完全に理解することができるように、以下の詳細な説明を記載する。
【００３０】
特に定義しない限り、本明細書で使用する技術および科学用語は、本発明が属する技術の当業者が一般的に理解する意味と同じ意味を有する。本明細書に記載する方法および材料、またはこれらと等価なものは、本発明の実施またはテストに使用することができるが、適切な方法および材料について以下で説明する。材料、方法、および例は単に具体的に示すためであり、制限することを意図するものではない。本明細書に記載するすべての出版物、特許、およびその他の文書は、引用することにより全体的に本明細書に援用する。
【００３１】
本明細書を通して、「含む」（複数現在形）という用語、または「含む」（単数現在形）または「含んでいる」などの変形は、記載されている整数または整数群を含むことを意味するが、その他の何らかの整数または整数群を排除しないと考えられる。
【００３２】
本発明についてさらに定義するため、以下の用語および定義をここに記載する。
【００３３】
「軟骨」という用語は、軟骨細胞または軟骨細胞状細胞（すべてではないが、多くの軟骨細胞の特徴を有する）、および細胞間質（たとえば、タイプＩ、ＩＩ、ＩＸおよびＸＩコラーゲン）、プロテオグリカン（たとえば、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、およびデルマタン硫酸プロテオグリカン）、およびその他のタンパク質を含む１つのタイプの結合組織を意味する。軟骨は、関節および非関節軟骨を含む。
【００３４】
ヒアリン軟骨とも呼ばれる「関節軟骨」は、血液が供給されない非鉱化結合組織を意味し、これは、関節の骨の関節表面を被覆し、対向する２つの骨表面間の摩擦減少接触部分として機能する。関節軟骨は、骨と骨とが接触しないように、関節における運動を可能にする。関節軟骨には、骨化する傾向がない。軟骨表面は、肉眼で滑らかかつパール状に見え、高倍率で拡大した状態で、微細な粒状である。関節軟骨は、栄養物を一部には隣接する滑膜の血管から、一部には、滑膜を被覆する骨の血管から誘導する。関節軟骨は、タイプＩＩおよびタイプＩＸコラーゲン、および十分に特徴付けられた様々なプロテオグリカンの存在、および軟骨内の骨の形成に関連するタイプＸコラーゲンの欠如に関連する。関節軟骨の微細構造の詳細な説明は、たとえばＡｙｄｅｌｏｔｔｅ ａｎｄ Ｋｕｅｔｔｎｅｒ，Ｃｏｎｎ．Ｔｉｓｓ．Ｒｅｓ．，１８，ｐ．２０５（１９８８年）；Ｚａｎｅｔｔｉ等、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１０１，ｐ．５３（１９８５年）；およびＰｏｏｌｅ等、Ｊ．Ａｎａｔ．，１３８，ｐ．１３（１９８４年）参照。
【００３５】
「非関節軟骨」は、関節面を被覆しない軟骨を意味し、線維軟骨（関節間線維軟骨、線維軟骨性椎間板、骨間線維軟骨、周辺の線維軟骨を含む）および弾性軟骨を含む。線維軟骨では、微細多糖網は、突出したコラーゲン束と絡み合い、軟骨細胞は、ヒアリンまたは関節軟骨の場合より広く散乱する。関節間線維軟骨は、激しい運動にさらされ、頻繁に運動が行われる関節、たとえば膝の半月板内に見られる。こうした関節の例としては、側頭下顎骨、胸鎖、肩峰鎖骨、手首、および膝関節が挙げられるが、これらだけに限らない。二次軟骨性関節は、線維軟骨の椎間板によって形成される。このような線維軟骨性椎間板は、対向する表面の両方に密接に付着し、軟骨性薄層が挿置された線維組織の同心円状リングから成る。このような線維軟骨性椎間板の例は、脊椎の椎間板である。骨間線維軟骨は、こうした関節の骨表面間に挿置され、脊椎本体間、および恥骨間などのわずかな可動性を可能にする。周辺の線維軟骨は、腰の寛骨臼、および肩の関節窩など、いくつかの関節腔の縁を囲む。
【００３６】
弾性軟骨は、組織学的にエラスチン線維に類似するコラーゲンの線維を含む。このような軟骨は、外耳の耳介、エウスタキー管、ｃｏｒｎｉｃｕｌａ ｌａｒｙｎｇｉｓ、喉頭蓋に見られる。すべての軟骨と同様、弾性軟骨は、軟骨細胞およびマトリクスも含み、後者は、黄色弾性繊維網によってすべての方向に広がり、可変量の非線維状ヒアリン細胞間物質が存在する各々の細胞のすぐ周囲を除いてすべての方向に分岐および吻合する。
【００３７】
「滑液」という用語は、関節内の摩擦を減少させる滑液腔内にある薄い潤滑物質を意味する。
【００３８】
「欠損」または「欠損部位」という用語は、軟骨または骨軟骨組織の破裂を意味する。欠損は、「空隙」の形態を取る可能性があり、軟骨または骨軟骨組織の構造上の完全性における三次元の欠損、たとえば隙間、空洞、穴またはその他の著しい破壊を意味すると考えられる。欠損は、軟骨が骨または人体に対する連結点から剥離することである可能性もある。特定の実施態様では、欠損は、内因性または自発的修復が不可能な状態である。欠損は、事故、疾病、および／または外科的手技の結果である場合がある。たとえば、軟骨の欠損は、破裂した半月板組織が関節内に変位するなど、関節に対する外傷の結果であり得る。軟骨の欠損は、変形性関節症などの変性関節疾病の結果でもあり得る。
【００３９】
「修復」という用語は、欠損部位における空隙または構造上の断絶を少なくとも部分的に充填するのに十分な新しい軟骨の形成を意味する。しかし、修復は、欠損をその欠損前の物理的／構造的／機械的状態に回復する際に１００％効果的な完全な治癒または処置のプロセスを意味するか、あるいは伴う。
【００４０】
「治療有効量」という用語は、軟骨組織を修復、再生、促進、加速、変性を防止、あるいは形成するのに効果的な量を意味する。
【００４１】
「患者」という用語は、哺乳類（たとえば、ヒト）を含む動物を意味する。
【００４２】
「補助剤の薬学的に許容可能な担体」は、本発明の可溶性形態形成タンパク質複合体とともに患者に投与することができ、その薬理学的活性を無効にしない非毒性担体または補助剤を意味する。
【００４３】
「形態形成タンパク質」は、モルフォゲン活性を有するタンパク質を意味する。好ましくは、本発明の形態形成タンパク質は、ＢＭＰタンパク質族に属する少なくとも１つのポリペプチドを含む。形態形成タンパク質は、骨形成タンパク質を含む。形態形成タンパク質は、局所的な環境上のきかっけに応じて、軟骨、骨、腱、靭帯、またはその他のタイプの組織形成につながる分化経路を増殖および／または開始する前駆物質を含む可能性があり得るため、形態形成タンパク質は、様々な環境で様々に挙動し得る。たとえば、形態形成タンパク質は、少なくとも１つの処置部位における骨組織、および様々な処置部位における軟骨組織を含み得る。
【００４４】
「骨形成タンパク質（ＢＭＰ）」という用語は、ＤＮＡおよびアミノ酸配列の相同性に基づいて、タンパク質のＴＧＦ−β上科のＢＭＰ族に属するタンパク質（ＢＭＰ族）を意味する。タンパク質は、ＢＭＰタンパク質族を特徴とする保存Ｃ末端システイン豊富領域内の少なくとも１つの公知のＢＭＰ族要素に対して、少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有する場合、本発明に従ってＢＭＰ族に属する。好ましくは、タンパク質は、保存Ｃ末端システイン豊富領域内の少なくとも１つの公知のＢＭＰ族要素に対して、少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有する。ＢＭＰ族の要素は、全体に５０％未満のＤＮＡまたはアミノ酸配列同一性を有し得る。本明細書で定義する骨形成タンパク質も、適切なインビボの血液が供給されない遺伝子座において、関節軟骨の形成を誘発する能力を有する。
【００４５】
「アミノ酸配列の相同性」という用語は、アミノ酸配列同一性および類似性の両方を含むと考えられる。相同配列は、類似残基が、整列した参照配列内の対応するアミノ酸残基の同類置換、または「許容された点変異」である場合、同じか、および／または類似するアミノ酸残基を共用する。したがって、参照配列と７０％のアミノ酸相同性を共用する候補ポリペプチド配列は、整列残基の任意の７０％が、参照配列内の対応する残基と同じであるか、あるいは同類置換である配列である。特定の特に好ましい形態発生ポリペプチドは、ヒトＯＰ−１および関連タンパク質の保存７システイン領域を規定するＣ末端１０２〜１０６のアミノ酸と、少なくとも６０％、好ましくは７０％のアミノ酸配列同一性を共用する。
【００４６】
アミノ酸配列の相同性は、先行技術で十分に公知の方法で判断することができる。たとえば、候補アミノ酸配列の相同率を判断するには、先ず２つの配列を整列させる。整列は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ等、Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．，４８，ｐｐ．４４３（１９７０年）に記載されている動的プログラミングアルゴリズム、およびＤＮＡｓｔａｒ，Ｉｎｃ．が製造する市販ソフトウェアパッケージのＡｌｉｇｎ Ｐｒｏｇｒａｍを使用して行うことができる。これらの発行元による教示は、引用することにより本明細書に援用する。最初の整列は、関連するタンパク質の族の多重配列整列と比較することによって精製することができる。整列が行われて精製された後、相同率の点数が計算される。２つの配列の整列したアミノ酸残基は、順次それぞれの類似性を互いに比較される。類似性の要素としては、類似のサイズ、形状、および電荷が挙げられる。アミノ酸の類似性を判断するのに特に好ましい１つの方法は、引用することにより本明細書に援用するＤａｙｈｏｆｆ等、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，５，ｐｐ．３４５−３５２（１９７８＆Ｓｕｐｐ．）に記載されているＰＡＭ２５０マトリクスである。類似性の点数は、最初に、整列した対状のアミノ酸類似性点数の合計として計算される。相同率および同一性の目的上、挿入および欠損は無視する。したがって、ギャップペナルティは、この計算では使用しない。次に、実際の点数は、候補配列および７つのシステイン領域の点数の幾何平均で除算して正規化される。幾何平均は、これらの点数の積の平方根である。正規化された実際の点数は相同率である。
【００４７】
「同類置換」という用語は、対応する参照残基に物理的または機能的に類似する残基を意味する。つまり、同類置換およびその参照残基は、類似するサイズ、形状、電荷、共有結合または水素結合などを形成する能力を含む化学特性を有する。好ましい同類置換は、上記のＤａｙｈｏｆｆ等の許容点変異に関して定義された基準に適合する置換である。同類置換の例は、以下の群内の置換である：（ａ）バリン、グリシン；（ｂ）グリシン、アラニン；（ｃ）バリン、イソロイシン、ロイシン；（ｄ）アスパラ銀酸、グルタミン酸；（ｅ）アスパラ銀、グルタミン；（ｆ）セリン、スレオニン；（ｇ）リジン、アルギニン、メチオニン；および
（ｈ）フェニルアラニン、チロシン。「同類改変体」または「同類変形」という用語は、親の配列に特有の抗体が、結果として得られる置換ポリペプチド配列にも特有である、つまり「交差反応」するかまたは「免疫反応」する場合、特定の親アミノ酸配列内のアミノ酸残基の代わりに、置換アミノ酸残基を使用することも含む。
【００４８】
「骨形成タンパク質（ＯＰ）」という用語は、前駆物質を導入して、軟骨および／または骨を形成することができる形態形成タンパク質を意味する。骨は、膜内の骨または軟骨内の骨でよい。殆どの骨形成タンパク質は、ＢＭＰタンパク質族の要素であり、したがってＢＭＰでもある。本明細書に特記しない限り、このタンパク質類は、一般に、ヒトの骨形成タンパク質（ｈＯＰ−１）によって類型化される。本発明の実施に有用なその他の骨形成タンパク質としては、骨形成的に活性の形態のＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＤＰＰ、Ｖｇｌ、Ｖｇｒ−１、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＵＮＩＶＩＮ、ＮＯＤＡＬ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰまたはＮＥＵＲＡＬ、あるいはこれらの保存的置換改変体、またはフラグメントが挙げられる。本願の出願人の発明に使用するのに適する骨形成タンパク質は、Ｒｅｄｄｉ ａｎｄ Ｓａｍｐａｔｈ（Ｓａｍｐａｔｈ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８４，ｐｐ．７１０９−１３、引用することにより本明細書に援用する）に記載されている先行技術で認められた生体検定を使用して、一般的な実験によって識別することができる。
【００４９】
軟骨の成長および修復のための方法および組成物
本発明の形態発生組成物は、軟骨の修復（たとえば、関節、半月板、または椎間板における）に使用し得る。本明細書に開示する可溶性形態形成タンパク質複合体を含む形態発生組成物は、医師が、局所的な、刺激を受けた組織の再生または修復によって改善または矯正可能な様々な組織傷害、組織変性または疾病の症状、および疾患を処置することを可能にする。
【００５０】
本発明は、変形性関節症、軟骨の欠損、骨軟骨の欠損、半月板破裂、ＡＣＬ傷害、および椎間板変性を含むが、これらだけに限らない軟骨組織傷害および軟骨変性疾病または疾患を処置するための方法および組成物を提供する。
【００５１】
実施態様によっては、本発明は、患者の体内の軟骨を修復または再生するための方法および組成物を提供する。本発明は、軟骨を生成し、軟骨の成長を促進し、軟骨の形成を加速し、軟骨の変性を防止するための方法および組成物を提供する。
【００５２】
実施態様によっては、本発明の方法は、治療有効量の可溶性形態形成タンパク質複合体を含む組成物を軟骨内に投与するステップを含む。この方法は、軟骨組織を可溶性形態形成タンパク質複合体に接触させることを含む。たとえば、一実施態様では、可溶性形態形成タンパク質複合体の組成物は、軟骨組織内に直接投与される（たとえば、軟骨組織内に注入される）。たとえば、可溶性形態形成タンパク質複合体の組成物は、半月板または椎間板内に注入し得る。実施態様によっては、本発明の方法は、可溶性形態形成タンパク質複合体の組成物を関節、たとえば、膝、腰、肩、足首、肘、または指関節などの関節接合部内に直接投与するステップを含む。たとえば、治療有効量の可溶性形態形成タンパク質複合体は、関節内で軟骨を囲む滑液中に投与することができる。実施態様によっては、軟骨は関節軟骨である。実施態様によっては、軟骨は非関節軟骨である。実施態様によっては、非関節軟骨としては、椎間板、関節間半月板、器官、耳、鼻、肋骨、および咽頭が挙げられるが、これらだけに限らない。好ましい実施態様では、非関節軟骨は椎間板である。別の好ましい実施態様では、非関節軟骨は半月板である。実施態様によっては、軟骨を囲む領域は滑液である。
【００５３】
実施態様によっては、本発明の方法に使用される組成物中の形態形成タンパク質としては、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＤＰＰ、Ｖｇｌ、Ｖｇｒ、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、あるいはこれらの保存的置換改変体、またはフラグメントが挙げられるが、これらだけに限らない。好ましい実施態様では、形態形成タンパク質は、ＯＰ−１、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２またはＣＤＭＰ−３である。より好ましい実施態様では、形態形成タンパク質はＯＰ−１である。
【００５４】
他の実施態様では、形態形成タンパク質は、ヒトＯＰ−１の保存７システイン領域を含むＣ末端１０２〜１０６のアミノ酸に対して少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、この形態形成タンパク質は、軟骨の欠損の修復を誘発することが可能である。
【００５５】
有用な可溶性モルフォゲンタンパク質複合体−−タンパク質の考察
本発明に有用な形態形成タンパク質は、最初に配列の相同性に基づいて単離されたＢＭＰ（ＢＭＰ−１〜ＢＭＰ−１８）である。ＢＭＰ−１以外のすべては、依然、形態形成タンパク質のＢＭＰ族の要素として分類される（Ｏｚｋａｙｎａｋ等、ＥＭＢＯ Ｊ．，９，ｐｐ．２０８５−９３（１９９０年））。その他の有用な形態形成タンパク質は、アミノ酸配列関連のタンパク質、たとえばＤＰＰ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ由来）、Ｖｇｌ（Ｘｅｎｏｐｕｓ由来）、Ｖｇｒ−１（マウス由来、Ｏｐｐｅｒｍａｎｎ等に付与された米国特許第５，０１１，６９１号参照）、ＧＤＦ−１（マウス由来、Ｌｅｅ（１９９１年）ＰＮＡＳ ８８：４２５０−４２５４）、６０Ａタンパク質（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ由来、配列番号２４、Ｗｈａｒｔｏｎ等（１９９１年）ＰＮＡＳ ８８：９２１４−９２１８参照）、およびＯＰ−３である。（たとえば、Ｍａｓｓａｇｕｅ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，６，ｐｐ．５９７−６４１（１９９０年）参照、引用することにより本明細書に援用する）。
【００５６】
ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、およびＯＰ−１（ＢＭＰ−７）のＣ末端領域は、ＢＭＰ−２の領域と約６０％同じであり、ＢＭＰ−６およびＯＰ−１のＣ末端領域は８７％同じである。ＢＭＰ−６は、マウスＶｇｒ−１のト相同体と思われ、２つのタンパク質は、アミノ酸配列レベル全体で９２％同じである（米国特許第５，４５９，０４７号、本明細書に援用する）。ＢＭＰ−６は、Ｘｅｎｏｐｕｓ Ｖｇ−１の生成物と同じである。
【００５７】
タンパク質のＴＧＦ−β上科のサブクラスであるこの族の要素は、図１に大まかに示す構造上の特徴、および７つの保存システイン構造を含むＣ末端領域内の実質的なアミノ酸配列の相同性を共有する。図示のとおり、タンパク質は、一般に約３０残基未満のＮ末端シグナルペプチド配列１２（斜影で図示される「プレプロ」領域、）、次に、点描で図示される「プロ」領域１４を有する前駆ポリペプチド配列１０として翻訳され、この領域は、裂開されて成熟配列１６を形成する。成熟配列は、７つの保存Ｃ末端システイン領域２０、および本明細書ではＮ末端伸張とも呼び、様々な形態形成タンパク質間で配列が著しく異なるＮ末端配列１８の両方を含む。システインは、縦の点線２２で図示される。ポリペプチド鎖は二量体化し、これらの二量体は、一般に、２つのポリペプチド鎖のサブユニットを連結する少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合によって安定化される。
【００５８】
シグナルペプチドは、翻訳後、Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ（（１９８６年）Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １４：４６８３−４６９１）の方法を使用して、特定の配列内で予測可能な裂開部位で迅速に裂開される。図１のタンパク質サブユニット２４の「プロ」形式は、プロ領域および成熟領域、一緒に結合するペプチドを含む。一般に、このプロ形式は、タンパク質が未だ細胞中に存在し、プロ領域が、サブユニットの成熟形式と非共有結合している間に裂開され、培養された哺乳類細胞から分泌される一次形式であると思われる可溶性種を形成する。一般に、従来の精製技術は、複合体を分離する変性状態を使用した。
【００５９】
ＢＭＰタンパク質族の要素のもう１つの特性は、二量体化の明らかな能力である。いくつかの骨由来の骨形成タンパク質（ＯＰ）およびＢＭＰは、その活性形式の同質および異質二量体として見られる。ＯＰおよびＢＭＰが異質二量体を形成する能力は、形態発生誘発能力を形態形成タンパク質に与え得る。異質二量体は、ＯＰおよびＢＭＰ受容体分子の同質二量体とは定量的または定性的に異なる結合親和性を示す。変更された結合親和性は、その結果、異なるシグナル経路を媒介する受容体の活性化差異を生じることができ、最終的に、異なる生物学的活性または結果を生じ得る。変更された結合親和性は、組織または細胞タイプに特有の方法で顕在化され、それによって、特定の前駆物質タイプのみが、増殖および／または分化を生じることが可能である。
【００６０】
哺乳類細胞から分泌された他の可溶性形式の形態形成タンパク質としては、これらのプロ形式の二量体であって、プロ領域が成熟領域から裂開されない二量体、および１つのサブユニットが、プロ形式のポリペプチド鎖サブユニットを含み、他のサブユニットが、裂開された成熟形式のポリペプチド鎖サブユニット（切断型自体を含む）を含み、好ましくは裂開されたプロ領域と非共有結合する「半二量体」がある。
【００６１】
単離されたプロ領域は、一般に、配列の分析、および溶液中の特性の特徴付けによって判断されるように、実質的な疎水性を有する。単離されたプロ領域単独では、水溶液中で著しく可溶性ではなく、変性剤、たとえば浄化剤、尿素、グアニジンＨＣＬなど、および／または１つまたは複数の担体タンパク質の存在を必要とする。したがって、何らかの特定の理論に限定するものではないが、裂開されたプロ領域と、成熟形態形成タンパク質の二量体種との非共有結合会合は、プロ領域の疎水性部分と、二量体種上の対応する疎水性領域との相互作用を伴うと思われ、その相互作用は、さもなければ露出される成熟二量体の疎水性領域を水性の環境に対する暴露から効果的に保護するか、あるいは「隠し」、水溶液に対する成熟二量体の親和性を強化する。
【００６２】
有用なプロ領域は、以下に記載する全長のプロ領域、その様々な切断型、特に、タンパク質分解Ａｒｇ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ裂開部位で裂開された切断型を含む。たとえば、ＯＰ−１では、可能なプロ配列は、残基３０〜２９２（全長形式）；４８〜２９２；および１５８〜２９２によって規定される配列を含む。可溶性ＯＰ−１複合体の安定性は、プロ領域が４８〜２９２切断型などの切断型ではなく、残基３０〜４７が、他の形態形成タンパク質のＮ末端部分に対して配列相同性を示し、すべての形態形成タンパク質に対する複合体の安定性を強化する上で、特定の有用性を有すると考えられる全長形式を含む場合に強化される。したがって、現在好ましいプロ配列は、特定の形態形成タンパク質の全長形式のプロ領域をコードするプロ配列である（以下参照）。有用であると思われるその他のプロ配列としては、生合成プロ配列、特に、１つまたは複数の形態形成タンパク質プロ配列のＮ末端部分から導かれた配列を含むプロ配列がある。
【００６３】
以下の表１は、現在確認されている様々な好ましい形態形成タンパク質について説明し、本明細書で使用するそれぞれの学名、サブユニット配列の様々な領域を規定する配列、それぞれの配列識別参照、それぞれの核酸およびアミノ酸配列に関する出版物の発行元を記述する。これらの出版物の開示事項は、引用することにより本明細書に援用する。規定された成熟タンパク質の配列は、以前から予想されていたこれらの配列の形式である。規定された成熟タンパク質配列は、これらの成熟タンパク質配列は、以前から予想されていたこれらの配列の形式である。上記のとおり、これらの配列の比較的短い切断型も考えられる。好ましくは、切断型の成熟配列は、Ｎ末端伸張の少なくとも１０個のアミノ酸を含む。図２は、以下に記載する多くの好ましい形態形成タンパク質配列のＮ末端伸張を示す。Ａｒｇ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇは、図中で枠に入っているか、あるいは下線が引かれている成熟サブユニット形式の切断型配列を生じ得る。
【００６４】
【表１−１】
【００６５】
【表１−２】
【００６６】
【表１−３】
【００６７】
【表１−４】
【００６８】
【表１−５】
【００６９】
【表１−６】
【００７０】
【表１−７】
ＯＰ−２およびＯＰ−３タンパク質は、この族の他のタンパク質と同様、保存システイン骨格のほかに、追加のシステイン残基をＣ末端領域に有する（たとえば、これらの配列の残基３３８参照）。ＧＤＦ−１タンパク質は、保存骨格（「Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ」）内に４つのアミノ酸挿入を有するが、この挿入は、おそらく折り畳み構造内のシステインの関係を妨げない。さらに、ＣＢＭＰ２タンパク質には、システイン骨格内の１つのアミノ酸残基が欠落している。
【００７１】
二量体形態形成タンパク質種は、還元されると不活性だが、酸化同質二量体として活性であり、本発明の他の形態形成タンパク質と組み合わせて酸化すると活性である。したがって、一実施態様では、可溶性形態形成タンパク質複合体に有用な形態形成タンパク質は、一対のポリペプチド鎖を含む二量体タンパク質であり、各々のポリペプチド鎖は、２００未満のアミノ酸を有し、ＯＰ−１配列番号２の残基３３５〜４３１によって規定された少なくともＣ末端６、好ましくは７システイン骨格から成り、機能的に等価な配置（たとえば、配列中のシステインの線状配置を変更するが、折り畳み構造におけるその関係は変更しないアミノ酸の挿入または除去）を含み、その結果、ポリペプチド鎖が折り畳まれると、ポリペプチド鎖の対を含む二量体タンパク質種は、タンパク質が、本明細書に規定するようにモルフォゲンとして作用することが可能であるように、鎖内または鎖間ジスルフィド結合を含む適切な３次元構造を有する。これらの構造の可溶性は、成熟した二量体形式のモルフォゲンが、本発明に従って、少なくとも１つ、好ましくは２つのプロ領域と複合されると改善される。
【００７２】
機能的に等価な配置としては、参照配列内に配置されたシステイン残基の機能的に等価な配置があり、これらのシステインの線状配置を変更するが、形態発生活動に必要な鎖内または鎖間ジスルフィド結合を形成する能力を有する二量体形態形成タンパク質の折り畳み構造におけるそれぞれの関係を著しく損なわないアミノ酸挿入または除去を含む。機能的に等価な配列としては、さらに、１つまたは複数のアミノ酸残基が、参照配列の対応する残基、たとえば、違いが骨の形態発生活動を損なわないことを条件として、ヒトＯＰ−１のＣ末端７システイン領域（保存７システイン骨格とも呼ばれる）とは異なる配列がある。したがって、参照配列内の対応するアミノ酸の同類置換が好ましい。参照配列内の対応する残基の同類置換であるアミノ酸残基は、対応する参照残基に物理的または機能的に類似する残基、たとえば、類似するサイズ、形状、電荷、共有結合または水素結合などを形成する能力を含む化学特性を有する残基である。特に好ましい同類置換は、引用することにより本明細書に援用される上記の Ｄａｙｈｏｆｆ等で認められている点変異で規定されている基準を満たす同類置換である。
【００７３】
骨形成タンパク質ＯＰ−１は、説明されている（たとえば、Ｏｐｐｅｒｍａｎｎ等、米国特許第５，３５４，５５７号参照。引用することにより、本明細書に援用する）。成熟した天然型の天然由来の骨形成タンパク質は、一般に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで決定された約３０〜３６ｋＤａという明白な分子量を有するグリコシル化二量体である。３０ｋＤａのタンパク質は、還元されると、見かけの分子量約１６ｋＤａおよび１８ｋＤａを有する２つのグリコシル化ペプチドサブユニットを生じる。還元状態では、タンパク質は、検出可能な骨形成活性を示さない。骨形成活性も有するグリコシル化タンパク質は、見かけの分子量約２７ｋＤａを有する。還元されると、２７ｋＤａのタンパク質は、哺乳類で軟骨内骨形成を誘発することが可能な分子量約１４〜１６ｋＤａを有する２つの非グリコシル化ポリペプチドを生じる。骨形成タンパク質は、異なるグリコシル化パターン、異なるＮ末端、および活性切断型または突然変異型の天然のタンパク質を含み得る。上記のとおり、特に有用な配列としては、ＤＰＰ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ由来）、Ｖｇ（Ｘｅｎｏｐｕｓ由来）、Ｖｇｒ−１（マウス由来）、ＯＰ−１およびＯＰ−２タンパク質、（米国特許第５，０１１，６９１号、およびＯｐｐｅｒｍａｎｎ等参照、引用することにより本明細書に援用する）、並びにＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４と呼ばれるタンパク質（国際公開第８８／００２０５号、米国特許第５，０１３，６４９号、および国際公開第９１／１８０９８号参照、引用することにより本明細書に援用する）、ＢＭＰ−５およびＢＭＰ−６（国際公開第Ｏ９０／１１３６６号、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９０／０１６３０明細書、引用することにより本明細書に援用する）、ＢＭＰ−８およびＢＭＰ−９のＣ末端９６または１０２アミノ酸配列を含む配列がある。
【００７４】
本発明の好ましい形態発生および骨形成タンパク質は、少なくとも１つのポリペプチドを含み、たとえば、ＯＰ−１（ＢＭＰ−７）、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＣＯＰ−１、ＣＯＰ−３、ＣＯＰ−４、ＣＯＰ−５、ＣＯＰ−７、ＣＯＰ−１６、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−３ｂ，ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＭＰ１２１、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ドルサリン−１、ＤＰＰ、Ｖｇ−１、Ｖｇｒ−１、６０Ａタンパク質、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、並びにこれらのアミノ酸配列改変体および相同体、たとえばその種相同体があるが、これらだけに限らない。詳細には、形態形成タンパク質としては、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＤＰＰ、Ｖｇｌ、Ｖｇｒ、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、およびそのアミノ酸配列改変体があるが、これらだけに限らない。さらに好ましくは、形態形成タンパク質としては、ＯＰ−１（ＢＭＰ−７）、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２またはＣＤＭＰ−３；より好ましくはＯＰ−１（ＢＭＰ−７）ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２またはＣＤＭＰ−３；および最も好ましくはＯＰ−１（ＢＭＰ−７）から選択された少なくとも１つのポリペプチドがある。
【００７５】
実施態様によっては、骨形成タンパク質は、ヒトＯＰ−１の７保存システイン領域を含むＣ末端１０２〜１０６アミノ酸に対して少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列から成り、この骨形成タンパク質は、軟骨の欠損の修復を誘発することができる。
【００７６】
これらの配列、並びにそれぞれの化学的および物理的特性を開示している出版物としては、ＯＰ−１ ａｎｄ ＯＰ−２（米国特許第５，０１１，６９１号；米国特許第５，２６６，６８３号；Ｏｚｋａｙｎａｋ等、ＥＭＢＯ Ｊ．，９，ｐｐ．２０８５−２０９３（１９９０年）；ＯＰ−３（国際公開第９４／１０２０３号（国際出願ＰＣＴＵＳ９３／１０５２０明細書））；ＢＭＰ−２，ＭＰ−３，ＢＭＰ−４，（国際公開第８８／００２０５号；Ｗｏｚｎｅｙ等Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，ｐｐ．１５２８−１５３４（１９８８年））；ＢＭＰ−５ ａｎｄ ＢＭＰ−６、（Ｃｅｌｅｓｔｅ等、ＰＮＡＳ，８７，９８４３−９８４７（１９９１年））；Ｖｇｒ−１（Ｌｙｏｎｓ等、ＰＮＡＳ，８６，ｐｐ．４５５４−４５５８（１９８９年））；ＤＰＰ（Ｐａｄｇｅｔｔ等、Ｎａｔｕｒｅ，３２５，ｐｐ．８１−８４（１９８７年））；Ｖｇ−１（Ｗｅｅｋｓ，Ｃｅｌｌ，５１，ｐｐ．８６１−８６７（１９８７年））；ＢＭＰ−９（国際公開第９５／３３８３０号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／０７０８４明細書）；ＢＭＰ−１０（国際公開第９４／２６８９３号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５２９０明細書）；ＢＭＰ−１１（国際公開第９４／２６８９２号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５２８８明細書）；ＢＭＰ−１２（国際公開第９５／１６０３５号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／１４０３０明細書）；ＢＭＰ−１３（国際公開第９５／１６０３５号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／１４０３０明細書）；ＧＤＦ−１（国際公開第９２／００３８２号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９１／０４０９６明細書）およびＬｅｅ等、ＰＮＡＳ，８８，ｐｐ．４２５０−４２５４（１９９１年）；ＧＤＦ−８（国際公開第９４／２１６８１号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／０３０１９明細書）；ＧＤＦ−９（国際公開第９４／１５９６６号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／００６８５明細書）；ＧＤＦ−１０（国際公開第９５／１０５３９号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／１１４４０明細書）；ＧＤＦ−１１（国際公開第９６／０１８４５号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／０８５４３明細書）；ＢＭＰ−１５（国際公開第９６／３６７１０号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／０６５４０明細書）；ＭＰ−１２１（国際公開第９６／０１３１６号（国際出願ＰＣＴ／ＥＰ９５／０２５５２明細書）；ＧＤＦ−５（ＣＤＭＰ−１，ＭＰ５２）（国際公開第９４／１５９４９号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／００６５７明細書）および国際公開第９６／１４３３５号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／１２８１４明細書）および国際公開第９３／１６０９９号（国際出願ＰＣＴ／ＥＰ９３／００３５０明細書））；ＧＤＦ−６（ＣＤＭＰ−２，ＢＭＰ１３）（国際公開第９５／０１８０１号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／０７７６２明細書）および国際公開第９６／１４３３５号および国際公開第９５／１０６３５号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／１４０３０明細書））；ＧＤＦ−７（ＣＤＭＰ−３，ＢＭＰ１２）（国際公開第９５／１０８０２号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／０７７９９明細書）および国際公開第９５／１０６３５号（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／１４０３０明細書））；ＢＭＰ−１７およびＢＭＰ−１８（米国特許第６，０２７，９１７号）が挙げられる。上記の出版物は、本明細書に援用する。
【００７７】
本発明に有用な骨形成ポリペプチド族、およびその要素は、一般的なアミノ酸配列によって規定することができる。たとえば、一般配列７（配列番号５）および一般配列８（配列番号６）は、それぞれ９６または１０２アミノ酸配列であり、現在までに識別されている好ましいタンパク質族の要素間で共用される相同体を含み、これらのタンパク質族としては、少なくともＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＣＢＭＰ−２Ａ、ＣＢＭＰ−２Ｂ、ＢＭＰ−３、６０Ａ、ＤＰＰ、Ｖｇｌ、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、Ｖｇｒ−１、およびＧＤＦ−１を含む。これらのタンパク質のアミノ酸配列は、上記で概略を述べたとおり、本明細書および／または先行技術に記載されている。この一般配列は、６および７システイン骨格（それぞれ一般配列７および８）によって規定されるＣ末端領域内のこれらの配列によって共用されるアミノ酸同一性、および配列内の可変位置の代替残基の両方を含む。この一般配列は、分子内または分子間ジスルフィド結合が、折り畳み構造の三次構造に影響すると思われる特定の臨界アミノ酸を形成し、含むことが可能な適切なシステイン骨格を提供する。さらに、一般配列は、位置３６（一般配列７）または位置４１（一般配列８）に追加のシステインを可能にし、それによって、ＯＰ−２およびＯＰ−３の形態形成的に活性の配列を含む。
【００７８】
一般配列７（配列番号３８）
【００７９】
【数１】
ここで、各々のＸａａは、以下のように規定される１つまたは複数の特異的アミノ酸群から選択される：「ｒｅｓ．」は「残基」を意味し、ｒｅｓ．２のＸａａ＝（ＴｙｒまたはＬｙｓ）；ｒｅｓ．３のＸａａ＝ＶａｌまたはＩｌｅ）；ｒｅｓ．４のＸａａ＝（Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕ）；ｒｅｓ．６のＸａａ＝（Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、ＬｙｓまたはＡｌａ）；ｒｅｓ．７のＸａａ＝（ＡｓｐまたはＧｌｕ）；ｒｅｓ．８のＸａａ＝（Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＩｌｅ）；ｒｅｓ．１１のＸａａ＝（Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、ＡｓｎまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．１２のＸａａ＝（Ａｓｐ、Ａｒｇ、ＡｓｎまたはＧｌｕ）；ｒｅｓ．１３のＸａａ＝（ＴｒｐまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．１４のＸａａ＝（ＩｌｅまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．１５のＸａａ＝（ＩｌｅまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．１６のＸａａ＝（ＡｌａまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．１８のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、ＰｒｏまたはＡｒｇ）；ｒｅｓ．１９のＸａａ＝（ＧｌｙまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．２０のＸａａ＝（ＴｙｒまたはＰｈｅ）；ｒｅｓ．２１のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｍｅｔ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、ＬｅｕまたはＧｌｙ）；ｒｅｓ．２３のＸａａ＝（Ｔｙｒ、ＡｓｎまたはＰｈｅ）；ｒｅｓ．２６のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、ＡｌａまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．２８のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、ＧｌｎまたはＡｌａ）；ｒｅｓ．３０のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、ＩｌｅまたはＡｓｎ）；ｒｅｓ．３１のＸａａ＝（Ｐｈｅ、ＬｅｕまたはＴｙｒ）；ｒｅｓ．３３のＸａａ＝（Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＭｅｔ）；ｒｅｓ．３４のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｌａ、ＴｈｒまたはＰｒｏ）；ｒｅｓ．３５のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、ＡｌａまたはＬｙｓ）；ｒｅｓ．３６のＸａａ＝（Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、ＳｅｒまたはＩｌｅ）；ｒｅｓ．３７のＸａａ＝（Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、ＧｌｙまたはＬｅｕ）；ｒｅｓ．３８のＸａａ＝（Ａｓｎ、ＳｅｒまたはＬｙｓ）；ｒｅｓ．３９のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｓｅｒ、ＧｌｙまたはＰｒｏ）；ｒｅｓ．４０のＸａａ＝（Ｔｈｒ、ＬｅｕまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．４４のＸａａ＝（Ｉｌｅ、ＶａｌまたはＴｈｒ）；ｒｅｓ．４５のＸａａ＝（Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＭｅｔまたはＩｌｅ）；ｒｅｓ．４６のＸａａ＝（ＧｌｎまたはＡｒｇ）；ｒｅｓ．４７のＸａａ＝（Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．４８のＸａａ＝（ＬｅｕまたはＩｌｅ）；ｒｅｓ．４９のＸａａ＝（ＶａｌまたはＭｅｔ）；ｒｅｓ．５０のＸａａ＝（Ｈｉｓ、ＡｓｎまたはＡｒｇ）；ｒｅｓ．５１のＸａａ＝（Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｌａまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．５２のＸａａ＝（Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＧｌｙまたはＬｅｕ）；ｒｅｓ．５３のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、ＧｌｙまたはＰｈｅ）；ｒｅｓ．５４のＸａａ＝（Ｐｒｏ、ＳｅｒまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．５５のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、ＰｒｏまたはＬｙｓ）；ｒｅｓ．５６のＸａａ＝（Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、ＩｌｅまたはＨｉｓ）；ｒｅｓ．５７のＸａａ＝（Ｖａｌ、ＡｌａまたはＩｌｅ）；ｒｅｓ．５８のＸａａ＝（ＰｒｏまたはＡｓｐ）；ｒｅｓ．５９のＸａａ＝（Ｌｙｓ、ＬｅｕまたはＧｌｕ）；ｒｅｓ．６０のＸａａ＝（Ｐｒｏ、ＶａｌまたはＡｌａ）；ｒｅｓ．６３のＸａａ＝（ＡｌａまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．６５のＸａａ＝（Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＧｌｕ）；ｒｅｓ．６６のＸａａ＝（Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＧｌｕ）；ｒｅｓ．６７のＸａａ＝（Ｌｅｕ、ＭｅｔまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．６８のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｙ）；ｒｅｓ．６９のＸａａ＝（Ａｌａ、ＰｒｏまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．７０のＸａａ＝（Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、ＶａｌまたはＬｅｕ）；ｒｅｓ．７１のＸａａ＝（Ｓｅｒ、ＡｌａまたはＰｒｏ）；ｒｅｓ．７２のＸａａ＝（Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＭｅｔまたはＩｌｅ）；ｒｅｓ．７４のＸａａ＝（ＴｙｒまたはＰｈｅ）；ｒｅｓ．７５のＸａａ＝（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ＬｅｕまたはＨｉｓ）；ｒｅｓ．７６のＸａａ＝（Ａｓｐ、ＡｓｎまたはＬｅｕ）；ｒｅｓ．７７のＸａａ＝（Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、ＡｒｇまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．７８のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、ＴｙｒまたはＡｓｐ）；ｒｅｓ．７９のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、ＧｌｕまたはＬｙｓ）；ｒｅｓ．８０のＸａａ＝（Ａｓｎ、ＴｈｒまたはＬｙｓ）；ｒｅｓ．８２のＸａａ＝（Ｉｌｅ、ＶａｌまたはＡｓｎ）；ｒｅｓ．８４のＸａａ＝（ＬｙｓまたはＡｒｇ）；ｒｅｓ．８５のＸａａ＝（Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、ＡｒｇまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．８６のＸａａ＝（Ｔｙｒ、ＧｌｕまたはＨｉｓ）；ｒｅｓ．８７のＸａａ＝（Ａｒｇ、Ｇｌｎ、ＧｌｕまたはＰｒｏ）；ｒｅｓ．８８のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ｇｌｕ、ＴｉｐまたはＡｓｐ）；ｒｅｓ．９０のＸａａ＝（Ｖａｌ、Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＩｌｅ）；ｒｅｓ．９２のＸａａ＝（Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ａｓｐ、ＧｌｎまたはＧｌｕ）；ｒｅｓ．９３のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｇｌｙ、ＧｌｕまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．９５のＸａａ＝（ＧｌｙまたはＡｌａ）、ｒｅｓ．９７のＸａａ＝（ＨｉｓまたはＡｒｇ）である。
【００８０】
一般配列８（配列番号３９）は、さらに以下の配列（配列番号４０）をそのＮ末端に含む：
配列番号４０
【００８１】
【数２】
したがって、残基７から開始して、一般配列８内の「Ｘａａ」は、一般配列７に関して規定された特異的アミノ酸であり、これは、一般配列７に関して記載された各々の残基番号は、一般配列８において５だけ変位するという特徴を有する。したがって、一般配列７の「ｒｅｓ．２におけるＸａａ＝（ＴｙｒまたはＬｙｓ）」は、一般配列８のｒｅｓ．７におけるＸａａを指示する。一般配列８では、ｒｅｓ．２におけるＸａａ＝（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ＡｌａまたはＧｌｎ）；ｒｅｓ．３におけるＸａａ＝（Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＭｅｔ）；ｒｅｓ．４におけるＸａａ＝（Ｈｉｓ、ＡｒｇまたはＧｌｎ）；およびｒｅｓ． ５におけるＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、ＧＩｙ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、またはＴｙｒ）である。
【００８２】
別の実施態様では、有用な骨形成タンパク質は、以下に規定する一般配列９および１０を含む。
【００８３】
特に、一般配列９および１０は、以下のタンパク質の複合アミノ酸配列である：ヒトＯＰ−１、ヒトＯＰ−２、ヒトＯＰ−３、ヒトＢＭＰ−２、ヒトＢＭＰ−３、ヒトＢＭＰ−４、ヒトＢＭＰ−５、ヒトＢＭＰ−６、ヒトＢＭＰ−８、ヒトＢＭＰ−９、ヒトＢＭＰ １０、ヒトＢＭＰ−１１、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ６０Ａ、Ｘｅｎｏｐｕｓ Ｖｇ−１、ｓｅａ ｕｒｃｈｉｎ ＵＮＩＶＩＮ、ヒトＣＤＭＰ−１（マウスＧＤＦ−５）、ヒトＣＤＭＰ−２（マウスＧＤＦ−６、ヒトＢＭＰ−１３）、ヒトＣＤＭＰ−３（マウスＧＤＦ−７、ヒトＢＭＰ−１２）、マウスＧＤＦ−３、ヒトＧＤＦ−１、マウスＧＤＦ−１、ニワトリＤＯＲＳＡＬＩＮ、ｄｐｐ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＳＣＲＥＷ、マウスＮＯＤＡＬ、マウスＧＤＦ−８、ヒトＧＤＦ−８、マウスＧＤＦ−９、マウスＧＤＦ−１０、ヒトＧＤＦ−１ｌ、マウスＧＤＦ−１１、ヒトＢＭＰ−１５、およびラットＢＭＰ３ｂ。一般配列７と同様、一般配列９は、Ｃ末端６システイン骨格を含む９６アミノ酸配列であり、一般配列８と同様、一般配列１０は、７システイン骨格を含む１０２アミノ酸配列である。
【００８４】
一般配列９（配列番号４１）
【００８５】
【数３】
ここで、Ｘａａは、以下に規定される１つまたは複数の特異的アミノ酸群から個々に選択される：「ｒｅｓ．」は、「残基」を含み、ｒｅｓ．１のＸａａ＝（Ｐｈｅ、ＬｅｕまたはＧｌｕ）；ｒｅｓ．２のＸａａ＝（Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、ＶａｌまたはＧｌｕ）；ｒｅｓ．３のＸａａ＝（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＡｓｐ）；ｒｅｓ．４のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＡｓｎまたはＰｈｅ）；ｒｅｓ．５のＸａａ＝（ＰｈｅまたはＧｌｕ）；ｒｅｓ．６のＸａａ＝（Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、ＡｌａまたはＡｓｎ）；ｒｅｓ．７のＸａａ＝（Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、ＡｌａまたはＧｌｎ）；ｒｅｓ．８のＸａａ＝（Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、ＩｌｅまたはＰｈｅ）；ｒｅｓ．９のＸａａ＝（Ｇｌｙ、ＨｉｓまたはＬｙｓ）；ｒｅｓ．１０のＸａａ＝（ＴｒｐまたはＭｅｔ）；ｒｅｓ．１１のＸａａ＝（Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、ＳｅｒまたはＧｌｙ）；ｒｅｓ．１２のＸａａ＝（Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ＧｌｕまたはＨｉｓ）；ｒｅｓ．１３のＸａａ＝（ＴｒｐまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．１４のＸａａ＝（ＩｌｅまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．１５のＸａａ＝（ＩｌｅまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．１６のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｓｅｒ、ＴｙｒまたはＴｒｐ）；ｒｅｓ．１８のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、ＨｉｓまたはＬｙｓ）；ｒｅｓ．１９のＸａａ＝（Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、ＡｒｇまたはＰｈｅ）；ｒｅｓ．２０のＸａａ＝（ＴｙｒまたはＰｈｅ）；ｒｅｓ．２１のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、ＬｙｓまたはＴｈｒ）；ｒｅｓ．２２のＸａａ＝（ＡｌａまたはＰｒｏ）；ｒｅｓ．２３のＸａａ＝（Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、ＡｌａまたはＡｒｇ）；ｒｅｓ．２４のＸａａ＝（Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、ＰｈｅまたはＡｒｇ）；ｒｅｓ．２６のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ＧｌｎまたはＧｌｙ）；ｒｅｓ．２８のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＧｌｎ）；ｒｅｓ．３０のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、ＧｌｎまたはＬｅｕ）；ｒｅｓ．３１のＸａａ＝（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、ＧｌｙまたはＡｒｇ）；ｒｅｓ．３２のＸａａ＝（Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＡｌａまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．３３のＸａａ＝（Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｇｌｕ、ＰｈｅまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．３４のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ａｒｇ、ＬｅｕまたはＰｒｏ）；ｒｅｓ．３５のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、ＧｌｎまたはＨｉｓ）；ｒｅｓ．３６のＸａａ＝（Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｃｙｓ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、ＧｌｕまたはＧｌｙ）；ｒｅｓ．３７のＸａａ＝（Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、ＧｌｙまたはＴｙｒ）；ｒｅｓ．３８のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、ＶａｌまたはＡｒｇ）；ｒｅｓ．３９のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、ＰｒｏまたはＰｈｅ）；ｒｅｓ．４０のＸａａ＝（Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、ＨｉｓまたはＭｅｔ）；ｒｅｓ．４１のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、ＴｈｒまたはＧｌｎ）；ｒｅｓ．４２のＸａａ＝（Ｈｉｓ、ＴｙｒまたはＬｙｓ）；ｒｅｓ．４３のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＬｅｕまたはＴｙｒ）；ｒｅｓ．４４のＸａａ＝（Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ＭｅｔまたはＰｒｏ）；ｒｅｓ．４５のＸａａ＝（Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、ＩｌｅまたはＨｉｓ）；ｒｅｓ．４６のＸａａ＝（Ｇｌｎ、ＡｒｇまたはＴｈｒ）；ｒｅｓ．４７のＸａａ＝（Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、ＡｓｎまたはＨｉｓ）；ｒｅｓ．４８のＸａａ＝（Ｌｅｕ、ＡｓｎまたはＩｌｅ）；ｒｅｓ．４９のＸａａ＝（Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＰｒｏまたはＩｌｅ）；ｒｅｓ．５０のＸａａ＝（Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、ＴｙｒまたはＧｌｎ）；ｒｅｓ．５１のＸａａ＝（Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、ＧｌｙまたはＧｌｎ）；ｒｅｓ．５２のＸａａ＝（Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、ＡｌａまたはＴｙｒ）；ｒｅｓ．５３のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、ＬｅｕまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．５４のＸａａ＝（Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＶａｌまたはＡｓｐ）；ｒｅｓ．５５のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、ＰｒｏまたはＨｉｓ）；ｒｅｓ．５６のＸａａ＝（Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、ＧｌｙまたはＡｒｇ）；ｒｅｓ．５７のＸａａ＝（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、ＬｅｕまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．５８のＸａａ＝（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＡｌａ）；ｒｅｓ．５９のＸａａ＝（Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、ＡｒｇまたはＧｌｙ）；ｒｅｓ．６０のＸａａ＝（Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＴｈｒまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．６１のＸａａ＝（Ｃｙｓ、ＶａｌまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．６３のＸａａ＝（Ａｌａ、ＶａｌまたはＴｈｒ）；ｒｅｓ．６５のＸａａ＝（Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、ＡｓｐまたはＴｙｒ）；ｒｅｓ．６６のＸａａ＝（Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、ＡｒｇまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．６７のＸａａ＝（Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、ＴｈｒまたはＴｙｒ）；ｒｅｓ．６８のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＬｙｓまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．６９のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｐｒｏ、ＧｌｙまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．７０のＸａａ＝（Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、ＬｅｕまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．７１のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＡｓｎまたはＧｌｙ）；ｒｅｓ．２のＸａａ＝（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＭｅｔ）；ｒｅｓ．７４のＸａａ＝（Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、ＴｙｒまたはＭｅｔ）；ｒｅｓ．７５のＸａａ＝（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、ＧｌｎまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．７６のＸａａ＝（Ａｓｐ、Ｌｅｕ、ＡｓｎまたはＧｌｕ）；ｒｅｓ．７７のＸａａ＝（Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、ＧｌｙまたはＰｒｏ）；ｒｅｓ．７８のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ｍｅｔ、Ｇｌｕ、ＡｓｎまたはＬｙｓ）；ｒｅｓ．７９のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、ＧｌｎまたはＡｒｇ）；ｒｅｓ．８０のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、ＳｅｒまたはＧｌｎ）；ｒｅｓ．８１のＸａａ＝（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、ＴｈｒまたはＡｌａ）；ｒｅｓ．８２のＸａａ＝（Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、ＡｓｐまたはＡｌａ）；ｒｅｓ．８３のＸａａ＝（Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、ＬｙｓまたはＩｌｅ）；ｒｅｓ．８４のＸａａ＝（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、ＧｌｕまたはＧｌｙ）；ｒｅｓ．８５のＸａａ＝（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、ＧｌｕまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．８６のＸａａ＝（Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、ＧｌｕまたはＩｌｅ）；ｒｅｓ．８７のＸａａ＝（Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＰｒｏまたはＬｙｓ）；ｒｅｓ．８８のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、ＧｌｙまたはＬｙｓ）；ｒｅｓ．８９のＸａａ＝（ＭｅｔまたはＡｌａ）；ｒｅｓ．９０のＸａａ＝（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＬｙｓ）； のＸａａｒｅｓ ９１＝（ＶａｌまたはＡｌａ）；ｒｅｓ．９２のＸａａ＝（Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｖａｌ、Ａｌａ、ＳｅｒまたはＴｈｒ）；ｒｅｓ．９３のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、ＡｒｇまたはＴｈｒ）；ｒｅｓ．９５のＸａａ＝（Ｇｌｙ、ＡｌａまたはＴｈｒ）；ｒｅｓ．９７のＸａａ＝（Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、ＬｅｕまたはＳｅｒ）である。さらに、ｒＢＭＰ３ｂおよびｍＧＤＦ−１０のｒｅｓ．５３後、Ｈｅが存在し；ＧＤＦ−１のｒｅｓ．５４後、Ｔが存在し；ＢＭＰ３のｒｅｓ．５４、Ｖが存在し；ＢＭＰ−８およびＤｏｒｓａｌｉｎのｒｅｓ．７８後、Ｇが存在し；ｈＧＤＦ−１のｒｅｓ．３７後、Ｐｒｏ、ＧＩｙ、ＧＩｙ、Ｐｒｏが存在する。
【００８６】
一般配列１０（配列番号４２）は、すべての一般配列９（配列番号４１）を含み、さらに、次の配列（配列番号４０）をＮ末端に含む：
配列番号４０
【００８７】
【数４】
したがって、残基６から開始して、一般配列１０の各々の「Ｘａａ」は、一般配列９に関して規定される特異的アミノ酸であり、一般配列９に関して記載される各々の残基番号は、一般配列１０において５だけ変位するという特徴を有する。したがって、一般配列９における「ｒｅｓ．１の Ｘａａ＝（Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、ＶａＩまたはＧｌｕ）」は、一般配列１０のｒｅｓ．６を指示する。一般配列１０では、ｒｅｓ．２のＸａａ＝（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、ｏｒ Ｃｙｓ）；ｒｅｓ．３のＸａａ＝（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、またはＡｌａ）；ｒｅｓ．４のＸａａ＝（Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、ＶａＩ、Ｐｒｏ、またはＴｙｒ）；およびｒｅｓ．５のＸａａ＝（Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、またはＬｅｕ）である。
【００８８】
非天然骨形成タンパク質は、一連のコンセンサスＤＮＡ配列を使用して合成された（米国特許第５，３２４，８１９号、本明細書に援用する）。これらのコンセンサス配列は、天然の骨形成生成物から得られた部分アミノ酸配列、および文献に記載されており、予想または実証された展開機能を有するその他の遺伝子との、観察された相同性に基づいて設計された。
【００８９】
生合成されたコンセンサス配列（コンセンサス骨形成タンパク質、または「ＣＯＰ」と呼ばれる）のいくつかは、原核生成物中に融合タンパク質として発現された（たとえば、米国特許第５，０１１，６９１号参照、引用することにより、本明細書に援用する。）このようなタンパク質としては、ＣＯＰ−１、ＣＯＰ−３、ＣＯＰ−４、ＣＯＰ−５、ＣＯＰ−７、およびＣＯＰ−１６、並びに先行技術で公知のタンパク質がある。精製タンパク質は、裂開し、再度折り重ね、確立されている動物モデル中に移植し、骨および／または軟骨誘発活動を有することを実証し得る。現在好ましい合成骨形成タンパク質は、ＣＯＰ−５（配列番号４３）およびＣＯＰ−７（配列番号４４）として指示される２つの合成アミノ酸配列を含む。
【００９０】
Ｏｐｐｅｒｍａｎｎ等、米国特許第５，０１１，６９１号および第５，３２４，８１９号は、以下に示すＣＯＰ−５およびＣＯＰ−７のアミノ酸配列を記載しており、これらの特許は、引用することにより本明細書に援用する。
【００９１】
【数５】
これらのアミノ酸配列では、ダッシュ（−）は、関連タンパク質の類似配列を列挙するためにのみ、フィラーとして使用される。整列されたアミノ酸配列間の差が強調される。
【００９２】
上記のＤＮＡおよびアミノ酸配列、並びに他のＢＭＰ族の要素については発行されており、新たに特定されるタンパク質がＢＭＰ族に属するかどうかを判断するために、当業者によって使用され得る。新たなＢＭＰ関連のその対立遺伝子の遺伝子生成物は、少なくとも１つの形態形成活動を有することが類推によって予想され、その結果ＢＭＰとして分類される。
【００９３】
本発明の好ましい一実施態様では、形態形成タンパク質は、ジスルフィド結合して二量体種を生成する一対のサブユニットを含み、少なくとも１つのサブユニットは、ＢＭＰタンパク質族に属する組換え型ペプチドを含む。本発明のもう１つの好ましい実施態様では、形態形成タンパク質は、非共有相互作用によって形成される二量体種を生成する一対のサブユニットであって、少なくとも一方のサブユニットが、ＢＭＰタンパク質族に属する組換え型ペプチドを含むサブユニットを含む。非共有相互作用としては、Ｖａｎ ｄｅｒ
Ｗａａｌｓ、水素結合、および疎水性および静電気的相互作用がある。二量体種は、同質二量体または異質二量体でよく、細胞の増殖および／または組織の形成を誘発することが可能である。
【００９４】
一定の好ましい実施態様では、本明細書で有用な形態形成タンパク質として、アミノ酸配列が、上記の自然に発生するタンパク質から選択される参照形態形成タンパク質に対して、少なくとも７０％のアミノ酸配列の相同性または「類似性」、および好ましくは７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％ノ相同性または類似性を共用する配列を含むタンパク質が挙げられる。好ましくは、参照タンパク質はヒトＯＰ−１であり、その参照配列は、骨形成的に活性の形式の配列番号２のヒトＯＰ−１、残基３３０−４３１に存在するＣ末端７システイン領域である。一定の実施態様では、参照モルフォゲンポリペプチドと機能的に等価であると思われるポリペプチドは、Ａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）などのコンピュータプログラムにより便利に実施される上記のＮｅｅｄｌｅｍａｎ等の方法を使用して、それらのポリペプチドと整列される。上記のとおり、候補配列内の内部の隙間およびアミノ酸挿入は、規定の関係を計算する目的上無視され、この関係は、候補配列および参照配列間のアミノ酸配列の相同性または同一性のレベルとして従来表現される。「アミノ酸配列の相同性」は、本明細書では、アミノ酸配列同一性および類似性の両方を含むと考えられる。相同配列は、同じかおよび／または類似のアミノ酸残基を共用し、この場合、類似残基は、整列した参照配列内の対応するアミノ酸残基の保存置換、または「許容される点変異」である。したがって、参照配列と７０％のアミノ酸相同性を共用する候補ポリペプチド配列は、任意の７０％の整列残基が、参照配列内の対応する残基と同じであるか、あるいは同類置換である配列である。現在好ましい実施態様では、参照配列はＯＰ−１である。したがって、本明細書で有用な形態形成タンパク質としては、自然に発生するか、あるいは生合成的に生成されるかに関わらず、対立遺伝子、系統発生学的な対照物、および好ましい参照配列の改変体（（たとえば、「突然変異タンパク質」または「変異タンパク質」を含む）、並びに上記に記載および特定されるタンパク質を含む一般的な形態形成族のタンパク質の新規な要素がある。一定の特に好ましい形態形成ポリペプチドは、ヒトＯＰ−１の好ましい参照配列に対して少なくとも６０％のアミノ酸同一性、より好ましくはこの配列に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％のアミノ酸同一性を共用する。
【００９５】
もう１つの実施態様では、有用な骨形成タンパク質として、本明細書で定義するとおり、保存７システイン領域を共用し、Ｃ末端活性領域内で、少なくとも７０％のアミノ酸配列の相同性（類似性）を共用するタンパク質がある。さらに別の実施態様では、本発明の骨形成タンパク質は、ＯＰＸ（配列番号４５）および一般配列７（配列番号３８）および８（配列番号３９）、または一般配列９（配列番号４１）および１０（配列番号４２）を含む、本明細書に規定される一般配列の任意の１つを有する骨形成的に活性のタンパク質として定義される。
【００９６】
上記のとおり、本発明に有用であり、現在好ましい一定の骨形成ポリペプチド配列は、ｈＯＰ−１の好ましい参照配列を規定するアミノ酸配列に対して、６０％を超える同一性、好ましくは６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％を超える同一性を有する。これらの特に好ましい配列としては、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ６０Ａタンパク質を含む、ＯＰ−１およびＯＰ−２タンパク質の対立遺伝子および系統発生学的な対照物の改変体がある。したがって、特に好ましい実施態様では、有用な形態形成タンパク質としては、本明細書で「ＯＰＸ」（配列番号４５）と呼ぶ一般アミノ酸配列内のポリペプチド鎖の対を含む活性タンパク質があり、ＯＰＸは、７つのシステイン骨格を規定し、ＯＰ−１およびＯＰ−２の特定されたいくつかの改変体間の相同性を提供する。そこに記載されているとおり、一定の位置におけるＸａａは個々に、マウスまたはヒトＯＰ−１またはＯＰ−２内の対応する位置に生じる残基から選択される。
【００９７】
【数６】
【００９８】
【数７】
ここで、ｒｅｓ．２のＸａａ＝（ＬｙｓまたはＡｒｇ）；ｒｅｓ．３のＸａａ＝（ＬｙｓまたはＡｒｇ）；ｒｅｓ．１１のＸａａ＝（ＡｒｇまたはＧｌｎ）；ｒｅｓ．１６のＸａａ＝（ＧｌｎまたはＬｅｕ）；ｒｅｓ．１９のＸａａ＝（ＩｌｅまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．２３のＸａａ＝（ＧｌｕまたはＧｌｎ）；ｒｅｓ．２６のＸａａ＝（ＡｌａまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．３５のＸａａ＝（ＡｌａまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．３９のＸａａ＝（ＡｓｎまたはＡｓｐ）；ｒｅｓ．４１のＸａａ＝（ＴｙｒまたはＣｙｓ）；ｒｅｓ．５０のＸａａ＝（ＶａｌまたはＬｅｕ）；ｒｅｓ．５２のＸａａ＝（ＳｅｒまたはＴｈｒ）；ｒｅｓ．５６のＸａａ＝（ＰｈｅまたはＬｅｕ）；ｒｅｓ．５７のＸａａ＝（ＩｌｅまたはＭｅｔ）；ｒｅｓ．５８のＸａａ＝（ＡｓｎまたはＬｙｓ）；ｒｅｓ．６０のＸａａ＝（Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＡｓｎ）；ｒｅｓ．６１のＸａａ＝（Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．６５のＸａａ＝（ＰｒｏまたはＡｌａ）；ｒｅｓ．７１のＸａａ＝（ＧｌｎまたはＬｙｓ）；ｒｅｓ．７３のＸａａ＝（ＡｓｎまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．７５のＸａａ＝（ＩｌｅまたはＴｈｒ）；ｒｅｓ．８０のＸａａ＝（ＰｈｅまたはＴｙｒ）；ｒｅｓ．８２のＸａａ＝（ＡｓｐまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．８４のＸａａ＝（ＳｅｒまたはＡｓｎ）；ｒｅｓ．８９のＸａａ＝（ＬｙｓまたはＡｒｇ）；ｒｅｓ．９１のＸａａ＝（ＴｙｒまたはＨｉｓ）；ｒｅｓ．９７のＸａａ＝（ＡｒｇまたはＬｙｓ）である。
【００９９】
ＩＩ．可溶性モルフォゲンタンパク質複合体の組換え型生成物
可溶性形態形成タンパク質複合体は、真核生物宿主細胞、好ましくは哺乳類細胞から、米国特許第６，３９５，８８３号に記載されているような標準の組換え型発現技術を使用して、生成することができ、この特許は、引用することにより、本明細書に援用する。現在好ましい例示的なプロトコルは、特定のベクター構造体およびチャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）由来の細胞株を使用して以下に記載する。当業者は、その他の発現系は、その他のベクターおよびその他の細胞系を含めて有用であり、本発明は、以下に詳細に記載する方法によってのみ生成される可溶性形態形成タンパク質複合体に限定することを意図するものではないことを理解するであろう。本明細書に記載する結果に類似する結果は、ＣＯＳおよびＢＳＣ細胞に関して開発された組換え型発現系を使用して観察された。
【０１００】
前駆配列をコードする形態形成タンパク質ＤＮＡは、市販の適切なｐＵＣ型ベクター（たとえば、ｐＵＣ−１９、ＡＴＣＣ＃３７２５４、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．、並びに適切なプロモータ／エンハンサ配列および３’末端配列の挿入部位にサブクローニングされる。有用なＤＮＡ配列は、これらのタンパク質、および／または合成構造体をコードする発行済み配列を含む。現在好ましいプロモータ／エンハンサ配列は、ラウス肉腫ウィルスＬＴＲエンハンサ配列（たとえば、パロアルトのＣｌｏｎｅｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．から市販）によってブースとされるＣＭＶプロモータ（ヒトサイトメガロウィルス主要中間体−早期プロモータ）、およびマウス乳癌ウィルスプロモータ（ｍＭＴＶ）である。発現は、転写活性化するエンハンサ配列を使用してさらに強化され得る。プラスミドは、ＳＶ４０早期プロモータコントロール（ＡＴＣＣ ＃３７１４８）下で、増幅可能なマーカーとしてＤＨＦＲも含む。トランスフェクション、細胞培養、遺伝子増幅、およびタンパク質発現条件は、たとえばＡｕｓｕｂｅｌ等、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ニューヨーク州、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８９年）に記載されているような先行技術で公知の標準の条件である。簡潔に述べるなら、トランスフェクト細胞は、０．１〜０．５％の透析されたウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含む媒体中で培養され、安定してトランスフェクトされる高発現細胞株は、サブクローニングによって得られ、標準のウェスタンまたはノーザンブロットによって評価される。サザンブロットは、統合配列の状態、およびそのコピー数増幅の程度を評価するためにも使用される。
【０１０１】
現在好ましい発現ベクターは、ＳＶ４０早期プロモータコントロール下で、選択マーカーおよび誘導遺伝子増幅用因子の両方としてＤＨＦＲ遺伝子を含む。ＤＨＦＲのＤＮＡ配列は、先行技術で十分に特徴付けられており、市販されている。たとえば、適切なベクターは、ネオ遺伝子（ＢａｍＨＩ ｄｉｇｅｓｔ）をＳｐｈｌ−ＢａｍＨＩ、またはＳＶ４０早期プロジェクタコントロール下でＤＨＦＲ遺伝子を含むｐＳＶ５−ＤＨＦＲ（ＡＴＣＣ ＃３７１４８）からのＰｖｕＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントと置換することによって、ｐＭＡＭ−ｎｅｏ（カリフォルニア州、パロアルトのＣｌｏｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）から生成され得る。ＢａｍＨＩ部位は、標準の技術（たとえば、リンカーの挿入または部位特異的突然変異誘発法）を使用して、ＳｐｈｌまたはＰｖｕＩＩ部位においてエンジニアリングして、フラグメントをベクターバックボーンに挿入することを可能にすることができる。形態形成タンパク質ＤＮＡは、ＭＭＴＶ−ＬＴＲ配列（マウス乳癌ウィルスＬＴＲ）の下流のポリリンカー部位に挿入することができる。次に、ＣＭＶプロモータ配列は、発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．のｐＣＤＭ８）中に挿入され得る。ＤＨＦＲ発現を促進するＳＶ４０早期プロモータは、好ましくは、生成されるＤＨＦＲ ｍＲＮＡのレベルを減少させるために、これらのベクター内で変更される。
【０１０２】
現在好ましい哺乳類細胞株は、ＣＨＯチャイニーズハムスターの卵巣、細胞株であり、安定した形態形成タンパク質の生成細胞株を高発現レベルで確立するのに好ましい手順は、上記の発現ベクターを使って安定ＣＨＯ細胞株、好ましくはＣＨＯ−ＤＸＢ１１をトランスフェクトし、高形態形成タンパク質発現レベルでクローンを単離し、以下に記載する限定希釈法を使用して、これらのクローンにサブクローニングを施し、高発現クローンの母集団を取得することを含む。サブクローニングは、好ましくは、形態形成タンパク質を生成するための成長媒体にＭＴＸを追加する必要のない安定した高発現クローンを識別するために、ＭＴＸが存在しない状態で行われる。
【０１０３】
サブクローニングプロトコルでは、細胞は、１０個の１００ｍｍペトリ皿上に、一皿当たり５０または１００個の細胞という細胞密度で、培地中にＭＴＸを含むか、または好ましくは含まない状態で播種される。１４日間の成長後、クローンは、クローニングシリンダーおよび標準の手順を使用して単離し、２４ウェルプレート内で培養される。クローンは、次に、標準手順を使用してウェスタン免疫部ロットにより、および親株に匹敵する形態形成タンパク質発現レベルで、形態形成タンパク質発現に関してスクリーニングされる。高発現サブクローニングの細胞株の安定性は、次に、複数の細胞通過全体で（たとえば、４回または５回）、形態形成タンパク質発現を監視することによって判断される。
【０１０４】
ＩＩＩ．馴化培地または体液からの可溶性モルフォゲンタンパク質複合体の単離
形態形成タンパク質は、哺乳類細胞から、可溶性複合体として発現される。しかし、一般に、複合体は、一般に、精製溶液、たとえば浄化剤、アルコール、有機溶剤、カオトロピック剤、および溶液のｐＨを低下させるために添加される化合物に添加されることが多い変性剤に暴露することによって精製時に分離される。非変性状態で、可溶性タンパク質を馴化培地（または任意に、血清、脳脊髄液、または腹水などの体液）から精製するために現在好ましいプロトコルについて、以下に記載する。この方法は、迅速で再現可能であり、実質的に純粋な形式で単離可溶性形態形成タンパク質複合体を生じる。
【０１０５】
可溶性形態形成タンパク質複合体は、変性剤が存在しない状態で行われる単純な３段階の式層分析プロトコルを使用して、馴化培地から単離することができる。このプロトコルは、親和カラム上に媒体（または体液）を流し、次にイオン交換およびゲル濾過クロマトグラフィを行うことを含む。以下に記載する親和カラムは、Ｚｎ−ＩＭＡＣカラムである。このプロトコルは、多様な形態形成タンパク質の精製に対する一般的な適用性を有し、これらのタンパク質のすべては、以下に記載するプロトコルをごくわずかに変更して使用することで単離可能であると予想される。代替プロトコルは、標準の手順、たとえば一定の形態形成タンパク質のプロ領域に特有の抗体を使用して形成される（たとえば、タンパク質Ａ共役セファロースカラムに合成される）有用な免疫親和カラムを有することも考えられる。免疫親和カラムを展開するためのプロトコルは、先行技術で十分に説明されている（たとえば、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｍ． Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ等、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９０年、特にＶＩＩおよびＸＩ項参照）。
【０１０６】
この実験では、ＯＰ−１は、上記のとおりＣＨＯ細胞中で発現した。０．５％ＦＢＳを含むＣＨＯ細胞の馴化培地は、先ず、固定化金属−イオン親和性クロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）を使用して精製した。馴化培地からの可溶性ＯＰ−１複合体は、Ｚｎ−ＩＭＡＣ樹脂に非常に選択的に結合し、高濃度のイミダゾール（５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）は、結合複合体の効果的な溶出のために必要である。Ｚｎ−ＩＭＡＣステップは、貫流および３５ｍＭのイミダゾール洗浄画分中に溶出する不純血清タンパク質から可溶性ＯＰ−１を分離する。Ｚｎ−ＩＭＡＣ精製可溶性ＯＰ−１は、次に、５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのＮａＰＯ４（ｐＨ７．０）中で平衡させたＳ−セファロース陽イオン交換カラムに適用した。このＳ−セファロースステップは、次のゲル濾過ステップに備えて、可溶性ＯＰ−１複合体をさらに精製して濃縮する役割を果たす。このタンパク質は、ＴＢＳ中で平衡されるＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−２００ＨＲカラムに適用された。ほぼ同じプロトコルを使用すると、可溶性形態形成タンパク質も、血清、脳脊髄液、または腹水を含む１つまたは複数の体液から単離し得る。
【０１０７】
ＩＭＡＣは、３カラム容量部の０．２ＭのＺｎＳＯ４を充填したＣｈｅｌａｔｉｎｇセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して実施した。この馴化培地は、ｐＨ７．０までて滴定し、５００ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）中で平衡したＺＮ−ＩＭＡＣ樹脂に直接適用した。Ｚｎ−ＩＭＡＣ樹脂には、１ｍＬの樹脂あたり８０ｍＬの開始馴化培地が装填された。装填後、カラムは、平衡緩衝液で洗浄し、殆どの不純タンパク質は、３５ｍＭのイミダゾール（ｐＨ７．０）を使って平衡緩衝液中に溶出させた。可溶性ＯＰ−１複合体は、次に、５０ｍＭのイミダゾール（ｐＨ８．０）を使って２０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび５００ｍＭのＮａＣｌ中に溶出させた。
【０１０８】
可溶性ＯＰ−１複合体を含む５０ｍＭのイミダゾール溶出液は、９容量部の２０ｍＭのＮａＰＯ４（ｐＨ７．０）で希釈し、５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのＮａＰＯ４（ｐＨ７．０）中で平衡させたＳ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムに適用した。Ｓ−セファロース樹脂には、１ｍｌの樹脂当たり８００ｍＬの開始馴化培地の等価物を装填した。装填後、Ｓ−セファロースカラムは、平衡緩衝液で洗浄し、１００ｍＭのＮａＣｌ、次に３００ｍＭおよび５００ｍＭのＮａＣｌを使って、２０ｍＭのＮａＰＯ４（ｐＨ７．０）中に溶出させた。３００ｍＭのＮａＣプールは、ゲル濾過クロマトグラフィを使ってさらに精製した。３００ｍｍのＮａＣｌ溶出液５０ｍｌｓは、トリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）、５０ ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）中で平衡させた５．０×９０ｃｍのＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ＨＲ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に適用した。カラムは、４ｍＬ／分の流量で溶出させて１０ｍＬの部分を収集した。可溶性ＯＰ−１の見かけの分子量は、タンパク質分子量基準（アルコール脱水素酵素（ＡＤＨ、１５０ｋＤａ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、６８ｋＤａ）、炭酸脱水酵素（ＣＡ、３０ｋＤａ）およびシトクロムＣ（ｃｙｔ Ｃ、１２．５ｋＤａ）（図３参照）と比較して判断した。Ｓ−２００カラム部分の純度は、クマシーブルーで染色した標準の１５％ポリアクリルアミドＳＤＳゲル上の分離により判断した。成熟ＯＰ−１およびプロ領域の同一性は、標準の逆相Ｃｌ８ ＨＰＬＣを使用して、成熟ＯＰ−１をプロ領域から分離した後、Ｎ末端配列分析により判断した。
【０１０９】
図３は、２８０ｎｍにおける吸収プロファイルを示す。可溶性ＯＰ−１複合体は、見かけの分子量１１０ｋＤａで溶出する。これは、２つのプロ領域（各３９ｋＤａ）に関連する１つの成熟二量体（３５−３６ｋＤａ）を含む可溶性ＯＰ−１複合体の予想組成物と完全に一致する。最終的な複合体の純度は、還元した１５％ポリアクリルアミドゲル中に適切な部分を流すことにより検証することができる。
【０１１０】
複合体の構成要素は、標準の手順を使用して、複合体を含む部分をＳ−２００またはＳ−２００ＨＲカラムから逆相Ｃｌ８ＨＰＬＣカラム上に流し、アセトニトリル勾配（０．１％ＴＦＡ中）において溶出させることによって検証することができる。複合体は、このステップにより分離され、プロ領域および成熟種は別の種を溶出する。これらの分離種は、次に、標準の手順、並びにそれぞれ、成熟形態形成タンパク質として確認された単離３６ｋＤ、３９ｋＤａタンパク質、および単離および裂開されたプロ領域の同一性を使用して、Ｎ末端配列を決定することができ（たとえば、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｍ．Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ等、サンディエゴのＡｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９０年、特にｐｐ．６０２〜６１３参照）。哺乳類細胞から単離されたプロ領域のＮ末端配列決定はＯＰ−１を生成し、２つの形式、つまり無傷型（配列番号１の残基３０から開始）、および切断型（配列番号１の残基４８から開始）のプロ領域を明らかにした。単離成熟種のポリペプチドサブユニットのＮ末端配列決定は、配列番号１の残基２９３、３００、３１３、３１５、３１６、および３１８で開始する成熟配列に関するある範囲のＮ末端を明らかにし、これらのすべては、標準の骨誘導検定によって実証されるように活性である。
【０１１１】
Ｖ．インビトロ可溶性モルフォゲンタンパク質複合体の形成
可溶性複合体を媒体または体液から精製する代わりに、可溶性複合体は、精製プロ領域および成熟二量体種から調製し得る。複合体の形成を満足に行うには、明らかに、ジスルフィド結合に影響しないように、これらの分子の折り畳み構造を緩和させるのに十分な変性状態で、構成要素を関連付ける必要がある。好ましくは、この変性状態は、裂開されたプロ領域が、緩和折り畳み状態で成熟二量体種に結合する機会を有するように、細胞内小胞の環境を十分に模倣する。溶液中の変性剤の濃度は、次に、プロ領域と二量体との関連を維持しつつ、二量体およびプロ領域の適切な再折り畳みを可能にするように、制御された、好ましくは段階的な方法で減少させる。有用な変性剤としては、ｐＨ４〜１０、好ましくはｐＨ６〜８の緩衝溶液中に、４〜６Ｍ尿素またはグアニジンヒドロクロリド（ＧｕＨＣｌ）を含む。可溶性複合体は、次に、制御された透析または希釈によって、０．１〜２Ｍ未満の尿素またはＧｕＨＣｌ、好ましくは１〜２Ｍの尿素またはＧｕＨＣｌの最終変性剤濃度を有する溶液中に形成され、次に、好ましくは、生理学的緩衝液中に希釈することが可能である。タンパク質の精製／復元手順、および考察は先行技術に記載されており、適切な復元プロトコルを容易に開発するための詳細は、当業者が判断することができる。この主題に関して有用な１つのテキストは、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｍ． Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ等、サンディエゴ、Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ、１９９０年、特にＶ項である。複合体の形成は、１つまたは複数のシャペロンタンパク質を追加することによって支援し得る。
【０１１２】
ＶＩ．可溶性モルフォゲンタンパク質複合体の安定性
生理学的緩衝液、たとえばトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）、およびリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中における高度に精製された可溶性形態形成タンパク質複合体の安定性は、任意のある数の手段で強化することができる。現在好ましい手段は、プロ配列の少なくとも最初の１８アミノ酸（たとえば、ＯＰ−１の配列番号２の残基３０〜４７）を含むプロ領域、および好ましくは全長プロ領域によるものである。残基３０〜４７は、他の形態形成タンパク質のＮ末端部分に対する配列相同性を示し、すべての形態形成タンパク質の複合体安定性を強化する際に特に有用であると考えられる。可溶性形態形成タンパク質複合体の安定性を強化するその他の有用な手段には、３種類の添加剤がある。これらの添加剤としては、塩基性アミノ酸（たとえば、Ｌ−アルギニン、リジン、およびベタイン）；非イオン浄化剤（たとえば、Ｔｗｅｅｎ８０またはＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ−１２０）；および担体タンパク質（たとえば、血清アルブミンおよびカゼイン）がある。これらの添加剤は、１〜１００ｒａＭ、好ましくは１０〜７０ｍＭ、５０ｍＭの塩基性アミノ酸；０．０１〜１．０％、好ましくは０．０５〜０．２％、０．１％（ｖ／ｖ）の非イオン浄化剤；および０．０１〜１．０％、好ましくは０．０５〜０．２％、０．１％（ｗ／ｖ）担体タンパク質がある。
【０１１３】
ＶＩＩ．可溶性モルフォゲンタンパク質複合体の活性
プロ領域と成熟との関連は、異なる活性検定によって実証されるように、インビボでのタンパク質の形態形成活動を妨げない。特に、標準のラットオステオペニアモデルで提供される可溶性ＯＰ−１複合体は、成熟形態形成タンパク質を使用して得られる結果と同様、骨の成長およびオステオカルシンの生成（以下の表２参照）に著しい増加を誘発する。
【０１１４】
この検定は、現在放棄されている米国特許継続出願第０８／４３２，８８３号に関連して現在放棄されている米国特許第９２３，７８０号に記載されている骨粗鬆症モデルに類似しているが、卵巣切除した動物ではなく、高齢のメスのラットを使用する。簡潔に述べるなら、若年または高齢のメスのラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ、それぞれ１１５〜１４５および３３５〜４６０ｇ）は、毎日７日間にわたって尾部静脈注射することにより、体重１Ｋｇ当たり２０μｇの可溶性ＯＰ−１、または体重１Ｋｇ当たり１００μｇの可溶性ＯＰ−１を投与した。若年および高齢メスラットの対照群には、トリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）のみを投与した。水および食物は、すべての動物に随時与えた。１４日後、動物を屠殺して、新しい骨の成長を標準のヒストメトリックな手順によって測定した。血清中のオステオカルシン濃度も測定した。動物の体重または組織重量の変化、あるいは血液学的なプロファイルで判断した結果、形態形成タンパク質の投与の不利な影響は検出されなかった。
【０１１５】
【表２】
卵巣切除したラットを使用して、現在放棄されており、引用することにより上記で援用された米国特許継続出願第０８／４３２，８８３号に関連して、現在放棄されている米国特許第９２３，７８０号に記載されている骨粗鬆症モデルにおいて、可溶性ＯＰ−１複合体を使用して実施された類似の実験も、複合体形式を使用して不利な影響は示していない。
【０１１６】
成熟および可溶性形態形成タンパク質はともに、開示事項を引用することにより上記で援用される係属中の米国特許継続出願第０８／２６０，６７５号に関連して現在放棄されている、１９９２年７月３１日に出願された同時係属米国特許出願第０７／９２２，８１３号に記載されているように、ＣＡＭ（細胞接着分子）の発現を誘発することが可能である。
【０１１７】
簡潔に、それらに記載されているように述べると、Ｎ−ＣＡＭアイソタイプ（Ｎ−ＣＡＭ−１８０、Ｎ−ＣＡＭ−１４０およびＮ−ＣＡＭ−１２０）の導入は、市販の抗体ｍＡｂ Ｈ２８．１２３（セントルイス、Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．）との反応、および標準のウェスタンブロット分析によって監視することができる（たとえば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ編集者等、ニューヨーク、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１９８９年、特に１８項参照）。成熟形態形成タンパク質二量体、または可溶性形態形成タンパク質複合体（１０〜１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも４０ｎｇ／ｍｌ）による神経系の形質転換細胞、ＮＧｌ０８−１５細胞（メリーランド州、ロックビル、ＡＴＣＣ）の成長培地の培養は、形質転換されていない神経細胞の形態学的特徴に対するこれらの細胞の再分化を誘発し、誘発には、すべての３Ｎ−ＣＡＭアイソタイプの特定の誘発および／または強化された発現を含む。この実験では、細胞は、ポリ−Ｌ−リジン塗布６−ウェルプレート上で二次培養され、化学的に規定された媒体中で、２日間にわたって成長させてから実験した。形態形成タンパク質のフレッシュなアリコートは、毎日添加した（２．５μｌ）。
【０１１８】
医薬組成物
可溶性形態形成タンパク質複合体を含む医薬組成物は、様々な形態でよい。これらは、たとえば、固体、半固体、および液体投薬形態、たとえば粉末、錠剤、丸薬、座薬、液体溶液、懸濁液、ゲル、パテ、ペースト、乳濁液、および不溶性溶液が挙げられる。好ましい形式は、意図された投与方法および治療用途によって決まり、当業者が選択することができる。投与方法としては、経口、非経口、筋肉内、腹腔内、関節内、皮下、静脈、病巣内、外科的移植、または局所性投与が挙げられる。組成物は、各々の投与経路に適する投与形式で処方し得る。実施態様によっては、本発明の医薬組成物は、組織の再生または修復を必要とする部位に（つまり、軟骨内に直接）投与される。他の実施態様では、本発明の医薬組成物は、組織の再生または修復を必要とする部位の付近に投与される。たとえば、実施態様によっては、本発明の医薬組成物は、修復（つまり、接合）を必要としている軟骨を囲む領域（たとえば、滑液）に投与し得る。他の実施態様では、本発明の医薬組成物は、軟骨組織内（たとえば、半月板または椎間板）内に直接投与し得る。
【０１１９】
好ましい実施態様では、可溶性形態形成タンパク質複合体組成物は、軟骨の損傷または変性の部位、たとえば関節接合部または関節嚢に直接、許容可能な流体担体で投与される。組成物は、先行技術で公知のとおり、組織の治癒または修復を最適にする投与頻度で、１回または複数回投与することができる。組成物は、たとえば、毎日、毎週、毎月、月に２回、２ヶ月に１回、年に４回、半年に１回、または毎年投与することができる。
【０１２０】
可溶性形態形成タンパク質複合体を含む医薬組成物は、たとえば、摂取または安定性を刺激する共同因子の有無に関わらず、殺菌浸透圧製剤中入れることができる。製剤は、好ましくは液体であるか、凍結乾燥粉末でよい。たとえば、可溶性形態形成タンパク質複合体は、処方用緩衝液で希釈し得る。溶液は、凍結乾燥して、凍結状態で保存して還元した後、殺菌した注射用蒸留水（ＵＳＰ）とともに投与することができる。
【０１２１】
組成物は、好ましくは、先行技術で公知の従来の薬学的に許容可能な担体も含む（たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ Ｅｄ．，Ｍａｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９８０年）参照）。このような薬学的許容可能な担体は、その他の薬剤、担体、遺伝子担体、補助剤、賦形剤など、たとえばヒト結成アルブミン、または血漿製剤を含み得る。好ましくは、担体は、患者の血液または滑液と浸透圧が等しい。このような担体媒体としては、水、食塩水、リンガー溶液、緩衝水溶液、ヒアルロナン、ヒアルロン酸、およびデキストロース溶液が挙げられる。固定油およびオレイン酸エチルなどの非水性媒体も、この場合有用である。組成物は、好ましくは、単位用量の形式であり、特定の組織の処置によって決まる用法のとおりに投与される。
【０１２２】
実施態様によっては、本発明の組成物は、徐放性製剤、遅延送達製剤、または可溶性形態形成タンパク質複合体の除去が遅延する薬剤である。これらの組成物の調製に使用可能な多くの送達材料がある。これらの材料としては、ポリ乳酸／ポリグリコール酸ポリマーの微小球、リポソーム、コラーゲン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒアルロン酸／線維素マトリクス、ヒアルロン酸、線維素、キトサン、ゼラチン、ＳＡＢＥＲ（商標）系（ショ糖酢酸イソ酪酸エステル（ＳＡＩＢ））、ＤＵＲＩＮ（商標）（薬物負荷インプラント用の生物分解性ポリマー）、ＭＩＣＲＯＤＵＲ（商標）（生物分解性ポリマー／マイクロカプセル化）、およびＤＵＲＯＳ（商標）（小型浸透圧ポンプ）が挙げられるが、これらだけに限らない。実施態様によっては、可溶性形態形成タンパク質複合体は、送達材料に共役結合される。
【０１２３】
本発明の組成物は、化合物の適切な送達系として機能する生体適合性担体材料中に分散する可溶性形態形成タンパク質複合体を含む。徐放性担体の適切な例としては、半透性ポリマーマトリクスがある。インプラント可能またはマイクロカプセル状徐放性マトリクスとしては、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，３１９号；欧州特許第５８，４８１号）、Ｌ−グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタミン酸塩のコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ等、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２，ｐｐ．５４７−５６（１９８５年））；ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、エチレンビニレンアセテート（Ｌａｎｇｅｒ等、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５，ｐｐ．１６７〜２７７（１９８１年）；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２，ｐｐ．９８〜１０５（１９８２年））またはポリ−Ｄ−（−）−３ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３，９８８号）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、または上記のポリマーが挙げられる。
【０１２４】
本発明の医薬組成物は、たとえば、微小球、リポソーム、その他の微小球送達系、または罹患組織内、その付近、あるいは罹患組織と連通して配置される徐放性製剤、これらの組織を浸す流体（たとえば、滑液）、またはこれらの組織を浸す血流を使用して投与することもできる。
【０１２５】
本発明の可溶性形態形成タンパク質複合体を含むリポソームは、十分に公知の方法で使用することができる（たとえば、ドイツ特許第３，２１８，１２１号；Ｅｐｓｔｅｉｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２，ｐｐ．３６８８〜９２（１９８５年）；Ｈｗａｎｇ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７７，ｐｐ．４０３０〜３４（１９８０年）；米国特許第４，４８５，０４５号および第４，５４４，５４５号参照）。一般に、リポソームは、小さい（約２００〜８００Å）単層型であり、その脂質含量は約３０モル％のコレステロールより大きい。コレステロールの割合は、可溶性形態形成タンパク質複合体放出の最適速度を制御するように選択される。
【０１２６】
本発明の可溶性形態形成タンパク質複合体は、組織誘導速度および特性を調節するために、生物学的に活性の分子、たとえば免疫抑制剤、サイトカインを含むリポソームに付着させてもよい。リポソームに対する可溶性形態形成タンパク質複合体の付着は、任意の公知の架橋剤、たとえば、毒素または化学療法剤を抗体に結合して、目標とされた送達を行うために広く使用されてきたヘテロ二官能基架橋剤によって行うことができる。リポソームとの共役は、糖質指向性架橋試薬４−（４−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド（ＭＰＢＨ）（ＭＰＢＨ）（Ｄｕｚｇｕｎｅｓ等、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ａｂｓｔ． Ｓｕｐｐｌ．１６Ｅ ７７（１９９２年））を使用して行うことも可能である。
【０１２７】
本発明の可溶性形態形成タンパク質複合体は、グリコシル化してもよい。グリコシル化は、１つまたは複数のオリゴ糖質基を添加することによってタンパク質を変性させることである。一般に、２種類のグリコシル化がある：Ｏ−結合オリゴ糖は、セリンまたはスレオニン残基に付着し、Ｎ−結合オリゴ糖は、配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒの一部である場合、アスパラ銀残基に付着し、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸でよい。グリコシル化は、タンパク質の物理的特性に著しく影響する可能性があり、タンパク質の安定性、分泌、半減期、および細胞内局在性にも重要である。実施態様によっては、本発明の可溶性形態形成タンパク質複合体は、Ｎ−結合オリゴ糖を含む。他の実施態様では、本発明の可溶性形態形成タンパク質複合体は、Ｏ−結合オリゴ糖を含む。他の実施態様では、本発明の可溶性形態形成タンパク質複合体は、Ｏ−結合オリゴ糖を含む。さらに他の実施態様では、本発明の可溶性形態形成タンパク質複合体は、Ｎ−結合およびＯ−結合オリゴ糖の両方を含む。実施態様によっては、可溶性形態形成タンパク質複合体のグリコシル化パターンは、糖タンパク質の糖組成物を調節するように変更し得る。
【０１２８】
当業者は、組織の誘導を促進するのに最適な生体適合性および／または生物分解性製剤を生成し得る。
【０１２９】
可溶性形態形成タンパク質複合体の正常な担体は、いくつかの重要な機能を果たすべきである。担体は、可溶性形態形成タンパク質複合体の遅延送達系、または可溶性形態形成タンパク質複合体の遅延除去として機能し、可溶性形態形成タンパク質複合体を非特異的タンパク質分解から保護するべきである。
【０１３０】
さらに、選択された材料は、インビボで生体適合性であり、好ましくは生物分解性でなければならない。ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、および様々な組合せは、インビボで異なる溶出速度を有する。
【０１３１】
担体は、ヒドロゲルの形態を取っても良い。担体材料は、ヒドロゲルを含む場合、実質的に水から成るゲルの形態の架橋親水性ポリマーの三次元網目構造を意味し、水は、９０％を超えるゲルが好ましいが、これだけに限らない。ヒドロゲルは、正味正または正味負電荷を支持することが可能であるか、あるいは中立でよい。代表的な正味負電荷を持つヒドロゲルは、アルギン酸塩である。正味正電荷を支持するヒドロゲルは、コラーゲンおよびラミニンなどの細胞外マトリクス成分によって類型化することができる。市販されている細胞外マトリクス成分の例としては、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）およびＶｉｔｒｏｇｅｎ（商標）が挙げられる。正味中立ヒドロゲルの例は、高度に架橋した酸化ポリエチレンまたはポリビニルアルコールである。
【０１３２】
抗生物質および化学療法薬剤、酵素、酵素阻害薬、並びにその他の生物活性剤を含む様々な増殖因子、サイトカイン、ホルモン、栄養剤、および治療用組成物も、可溶性形態形成タンパク質複合体を含む担体材料上に吸着または分散させることができ、やはり長期にわたって放出され、徐々に吸収される。
【０１３３】
可溶性形態形成タンパク質複合体の１日当たり約１μｇ〜約１０００μｇ、好ましくは３μｇ〜５０μｇの投与レベルは、軟骨の修復および再生に有用である。当業者は理解するように、上記より少ないかまたは多い投与量が必要な場合がある。任意の特定の患者に対する特定の投与量および処置領域は、使用する特定の可溶性形態形成タンパク質複合体の活性、年齢、体重、全体的な健康状態、性別、食習慣、投与時間、排泄速度、組織の損傷の重症度、担当医師の判断など、様々な要素によって決まる。
【実施例】
【０１３４】
（実施例１ 骨軟骨の欠損のイヌモデルの修復）
目的のために飼育された１２匹の成犬に外科処置を施した。両方の後肢は、殺菌状態で準備して覆った。約４ｃｍ長の内側傍膝蓋骨の切開（ｐａｒａｐａｔｅｌｌａｒ ｉｎｃｉｓｉｏｎ）を作成する。膝蓋骨を側方に引っ込めて、大腿顆を露出させる。右の内側顆では、軟骨層を通って延在し、軟骨下骨を深さ６ｍｍまで貫通する５．０ｍｍ径の欠損は、特別に設計または変更された５．０ｍｍのドリルビットを使って、大腿顆の耐荷重領域に形成する。動物は、各々６匹の動物の２つの群に分割する。第１群では、食塩水を大量に灌注して、破片および流出した髄質細胞を除去した後、欠損を囲む滑液に、適切な持続放出可溶性ＯＰ−１複合体を適用する。６匹の動物の第１群では、右の欠損は、持続放出可溶性ＯＰ−１複合体を受領する。すべての動物の左肢は、コントロールビード（０％ＯＰ−１）を受領するコントロールとして機能する。
【０１３５】
６匹の動物の第２群は、外科処置の時点ではＯＰ−１処置を受けない。外科処置から３日後、適切な持続放出可溶性ＯＰ−１複合体製剤を、欠損を含む関節を囲む滑液中に注入する。６匹の動物において、持続放出可溶性ＯＰ−１複合体は、右の欠損の周囲の滑液中に注入する。すべての動物の左肢は、コントロールビード（０％ＯＰ−１）を受領するコントロールとして機能する。
【０１３６】
動物は、外科処置から１６週後に屠殺する。屠殺する際、大腿遠位を全体として回収し、欠損部位は、従来の検査で使用されてきたＭｏｒａｎ等（Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ．７４Ｂ：６５９−６６７，１９９２年）のスキームに基づいて、組織学的に、肉眼で見て評価する。
【０１３７】
後肢のＸ線写真は、手術前、手術直後、および手術後６週間に撮影する。手術前のＸ線写真は、既存の異常が存在しないことを確認し、骨格の成熟を検証するために使用する。述語のＸ線写真は、欠損の位置を評価するために使用する。屠殺した動物のＸ線写真は、軟骨下骨および関節面の治癒および回復の速度を評価するために使用する。Ｘ線写真は、評価日から１週間以内に撮影する。
【０１３８】
死骸の肉眼的な病理学検査は、屠殺直後に行う。大腿遠位は、直後に全体的に収穫し、食塩水に浸したタオルで保存し、ラベルを付けたプラスチックの袋に入れる。欠損部位の高倍率写真を撮影し、注意してラベルを付ける。
【０１３９】
軟組織は、欠損部位から細心の注意を払って切り離し、大腿の近位端を除去する。水冷ダイヤモンドカットソー上で、各々の欠損部位を単離して、組織学的評価を行う。
【０１４０】
標本は、４％パラホルムアルデヒド溶液中に浸漬して固定し、脱灰組織学的処理のために準備する。３つのレベルからの３つの部分を、各々のブロックから切断する。レベル１および３は、欠損の周囲に最も近い。レベル２は、欠損の中心に位置する。各々のレベルの部分は、トルイジンブルー、サフラニンＯ、およびファストグリーンで着色した。各部分は、Ｍｏｒａｎ等（Ｊ． Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ． ７４Ｂ：６５９−６６７、１９９２年）のスキームに基づいて等級を付ける。
【０１４１】
（実施例２ 持続放出微小球におけるＯＰ−１の関節内投与による軟骨欠損再生のヒツジモデル）
目的のために飼育された１８匹の成体のヒツジに、外科的処置を施した。特に設計された器具を使って、１０ｍｍの軟骨の欠損は、１８匹のヒツジの左後肢膝において、体重を支持する顆表面に石灰化層まで２ｍｍ深さまで形成する（血液の露出は、失敗とされる）。すべての動物の右膝は、コントロールとして使用するために処置しない。
【０１４２】
１群（６匹の動物）：手術の３日後、各動物の左膝は、可溶性ＯＰ−１複合体を含まない５７ｍｇのコントロール０．３％微小球を含む２５０μｌの懸濁液の関節内注射を受ける。
【０１４３】
２群（６匹の動物）：手術の３日後、各動物の左膝は、１７０μｇの可溶性ＯＰ−１複合体を含む５７ｍｇの０．３％微小球を含む２５０μｌの懸濁液の関節内注射を受ける。
【０１４４】
３群（６匹の動物）：手術の３日後、および手術の６週間後、各動物の左膝は、１７０μｇの可溶性ＯＰ−１複合体を含む５７ｍｇの０．３％微小球を含む２５０μｌの懸濁液の関節内注射を受ける。
【０１４５】
膝の関節鏡評価は、すべての動物について、手術の３週間および６週間後に行う。ＮＭＲ／ＭＲＩ走査は、手術の３週間および６週間後に行う。膝の機械的テストも、定期的に行う。
【０１４６】
すべての動物は、手術の３ヶ月後に屠殺する。屠殺後、特定の関節軟骨細胞マーカーに関して、組織学、組織形態計測、免疫染色、およびインシチュでのハイブリッド化を行う。
【０１４７】
（実施例３ 変形性関節症の予防のためのヒツジモデル）
変形性関節症のモデルとしてヒツジを使用するが、それは、これらの動物は、１回の損傷の衝撃を受けた後に、進行性の変形性関節症を発症するためである。この研究では、１４日間にわたって順応させた１２匹の成体のメスの異種交配ヒツジを使用する。すべてのヒツジは、全身麻酔を施され、無菌技術を用いて、３ｃｍの関節切開術を使用して、両方の大腿頚骨関節に接近することを可能にする。ばね荷重の機械的デバイスは、中央大腿顆の体重支持領域に相互衝突損傷（３０Ｍｐａ、６ｍｍ径×２）を形成するために使用する（図４参照）。これらの切開部分を一般的な方法で閉じた後、ヒツジには、媒体中の可溶性ＯＰ−１複合体、または媒体のみを各々の膝に関節内注射を施す。２つの実験群（Ｎ＝６）を使用する。Ａ群は、外科手術の時点（０日）および手術後１週間（７日）に、０．３ｍｌの可溶性ＯＰ−１複合体を膝関節内に受領する。０日の注射は、外科的な切開部分を閉鎖した直後に投与した。Ｂ群は、０日、７日、１４日、２１日、２８日、および３５日に、片方の膝に可溶性ＯＰ−１複合体を受領する。滑液は、可溶性ＯＰ−１複合体および媒体を注射する前に吸引し、炎症の指標として、白血球数および総タンパク量を測定することを可能にする。
【０１４８】
ヒツジは、手術の１２週後に屠殺して、関節組織の詳細な評価（パラ生体染色、ＴＵＮＥＬ染色、組織病理学、軟骨、硫酸塩ＧＡＧ分析、生体力学的圧痕テスト）を行う。
【０１４９】
（実施例４ 関節内注射後のＯＰ−１の治療効果に関するヒツジモデル）
この研究は、研究を開始する前に１４日間順応させて、健康状態評価に合格したＮ＝１２の生体メスの１．５〜２．５歳の異種交配ヒツジを使用する。全身麻酔を行って、無菌技術を使用して、すべてのヒツジは、３ｃｍの最小限に侵襲的な関節切開術によって、両方（左右）の内側大腿顆に標準の３０ＭＰａ衝突損傷を受ける。手術の３週間後、ヒツジは、ジアゼパム（１０ｍｇ／ｋｇ）およびケタミン（３〜５ｍｇ／ｋｇ）で沈静状態にして、表３に従って滑膜細胞穿刺、および内側大腿頚骨関節内への被験物質、偽薬、または生理食塩水の注入のために膝を無菌状態で準備することを可能にする。
【０１５０】
【表３】
すべてのヒツジは、両方の内側大腿顆傷害を受ける。第１群の９匹のヒツジでは、一方の膝は被験物質を受領し、反対側の膝は、媒体のみから成る偽薬を受領する。膝の処置は、完全なブロック構造によって配置される。第２群の３匹のヒツジは、偽薬の効果のコントロールとして、生理食塩水ＵＳＰを受領する。
【０１５１】
この調査の次に、表４に記載する次の手順を行う。
【０１５２】
【表４】
（実施例５ 変形性関節症のテンジクマウスおよびウサギモデル）
ハートリーテンジクマウス（自発的）、およびウサギＡＣＬ−切除（誘発）変形性関節症モデルを使用する。年齢３か月、６ヶ月または９ヶ月の１４匹のテンジクマウスの左膝に、５０μｇの可溶性ＯＰ−１複合体を含むリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液を１２週間にわたって３週間ごとに注入する。左膝は、未処理コントロールとして使用される。
【０１５３】
ニュージーランドホワイトウサギにおいて、左ＡＣＬは切除され、ＰＢＳ溶液中の１００μｇ可溶性ＯＰ−１複合体、またはコントロール溶液を１２週間の評価期間にわたって３週間ごとに受領するか、または注入される。右膝は、すべての動物において、非ＡＣＬ切除未処理コントロールとして使用される。
【０１５４】
両方のモデルのすべての動物は、改良されたＭａｎｋｉｎスケールを使用して、関節炎の変化を肉眼で見た外観、および組織学的証拠を評価し、変性の重症度を等級付けする。
【０１５５】
（実施例６ 半月板の治癒のヒツジモデル）
再吸収不能なより糸で縫合された孔（６ｍｍ径）および長手方向の破裂（２ｃｍ長）は、ヒツジの両膝の各々の内側半月板に形成する。２つの処置群がある：可溶性ＯＰ−１複合体、および外科手術で形成された欠損以外に未処置のコントロール群。処置群では、可溶性ＯＰ−１複合体は、切開部位を閉鎖する直前に、関節空間内に注入され、次に、外科手術の７日後に関節空間７内に注入される。
【０１５６】
処置から６週、１２週、および２６週後、動物を安楽死させる。安楽死後、半月板を除去し、前部の長手方向に縫合した破裂部分、および後部の孔のある部分の２つの部分に切断する。これらの部分は、マッソントリクロームおよびサフラニンＯを使って染色する。半月板の免疫組織化学も、コラーゲンＩ、ＩＩ、ＶＩ、Ｓ１００、プロテアーゼＭＭＰ１を検出するために、特定の抗体を使用して実施することができる。
【０１５７】
半月板の部分を分離し、ＯＣＴ内に埋め込み、液体窒素中で凍結させる。低温保持装置を使って得た部分を収集して均質化し、Ｔｒｉｚｏｌ試薬を使用してＲＮＡ調製する。ＲＴ−ＰＣＲは、様々なマーカー、たとえば、細胞外マトリクスのマーカーとしてのＩ型、ＩＩ型、ＩＩ型コラーゲン、およびアグリカン、増殖因子としてのＴＧＦ−βおよびＩＧＦ−２、マトリクス分解酵素としてのＭＭＰ−Ｉ、ＭＭＰ−３およびＴＩＭＰ−Ｉ、最後に、細胞増殖および自然死に関するマーカーとしてのサイクリンＡ、Ｂｃｌ−２、ＢＡＸおよびカスパーゼ３の遺伝子発現を調査するために実行される。その他の関節組織も検査し、可溶性ＯＰ−１複合体によって生じ得る任意の肉眼的な相違のコントロールと比較する。
【０１５８】
（実施例７ 椎間板の修復および再生のヒツジモデル）
制御された外側環状欠損をヒツジの体内に実験的に導入すると、ヒトにおける椎間板変性の発症を病理学的および生化学的に厳密に再現する一連の事象が開始する。組成物の変化としては、損傷部位の細胞によって合成されるコラーゲンの量、および型の変化がある（Ｋａａｐａ等、１９９４ａ，ｂ，１９９５，Ｋａａｐａ Ｅ．等（１９９５年）椎間板変性の動物モデルにおけるコラーゲン合成、およびＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、およびＶＩ型コラーゲン、Ｓｐｉｎｅ ２０，５９−６７；Ｋａａｐａ Ｅ等、（１９９４年）損傷したブタの椎間板におけるコラーゲン、Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ． Ｒｅｓ．１２．９３−１０２；およびＫａａｐａ Ｅ等、（１９９４年）実験的に損傷したブタの椎間板におけるプロテオグリカンの化学作用、Ｊ．Ｓｐｉｎ．Ｄｉｓ．７，２９６−３０６）損傷した椎間板における大きい高浮遊密度アグリカン型プロテオグリカンの損失、および小さいＤＳ置換プロテオグリカンデコリンおよびビグリカンのレベルの上昇（Ｍｅｌｒｏｓｅ Ｊ．等、（１９９２年）線維輪に対する外科的損傷により椎間板内に誘発されるマトリクスの変化の長期にわたる研究、Ｊ Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｓ １０：６６５−６７６；Ｍｅｌｒｏｓｅ Ｊ．等、（１９９７年）実験的な椎間板変性のヒツジの環状病巣モデルにおけるアグリカンの異化の局所的変化、Ｊ Ｓｐｉｎａｌ Ｄｉｓｏｒｄ １０：５５−６７；およびＭｅｌｒｏｓｅ Ｊ．等、（１９９７年）実験的な椎間板変性のヒツジの環状病巣モデルにおけるビグリカンおよびデコリンの合成の増加、Ｅｕｒ Ｓｐｉｎｅ Ｊ ６：３７６−８４）。椎間板変性の結果として、軟骨終板（ＣＥＰ）に対する血管供給の変化（Ｍｏｏｒｅ ＲＪ等、（１９９２）、ヒツジにおける外側の環状破裂後の運動終板の血管の変化、Ｓｐｉｎｅ １７：８７４−８７８）、および実験的な環状欠損に隣接する椎間板の改造（Ｍｏｏｒｅ ＲＪ，等（１９９６）、ヒツジにおける外側の環状損傷後の椎骨の改造、Ｓｐｉｎｅ ２１ ：９３６−９４０．）、「修復された」損傷の影響を受けた椎間板の生体力学的変化（Ｌａｔｈａｍ ＪＭ等、（１９９４）、環状破裂およびその後椎間板変性の機械的結果、Ｊ ＣＨｎ Ｂｉｏｍｅｃｈ ９：２１１−９）、および脊髄面関節における骨関節炎の変化（Ｍｏｏｒｅ ＲＪ等（１９９９）、ヒツジの椎間板における環状縁の損傷から生じる面関節の変形性関節症、Ｓｐｉｎｅ，２４：５１９−５２５）にも注目した。
【０１５９】
Ａ．ヒツジの環状病巣モデル
ヒツジは、外科手術前の２４時間にわたって絶食させて、１ｇのチオペントンを静脈注射して全身麻酔を行った。水平の単純なＸ線フィルムは、通常の腰椎の解剖学的構造を検証するために撮影する。一般的な全身麻酔は、気管支内挿管後、２．５％のハロタンによって維持し、パルス濃度計および呼気終末ＣＯ２測定によって監視する。肋骨から腸骨稜までの左脇腹は、無菌外科手術のために準備する。ヒツジは、１２００ｍｇのペニシリンの筋肉注射を受ける。皮膚の切開は、脊椎の横突起の直前の左側に行い、腰椎は、前面筋肉分割技術を使用して、ブラント切開によって露出させる。血管および神経解剖学を遵守し、出血は、必要に応じて直接圧力または電気灼熱器により制御する。
【０１６０】
全部で１２匹の２歳のヒツジは、＃１手術用メス刃を使用して、頭蓋運動終板に平行および隣接して左前外側線維輪を貫通して切開することにより、それぞれのＬ１−Ｌ２、Ｌ３−Ｌ４およびＬ５−Ｌ６椎間板に、制御された環状病巣を施され、４ｍｍ長×５ｍｍ深さの損傷を形成される。介在する椎間板（Ｌ２〜Ｌ３、Ｌ４〜Ｌ５）は、切開しない。
【０１６１】
切開された椎間板は、３種類の治療の１つを受ける、（Ｉ）治療しない、（ＩＩ）媒体、または（ＩＩＩ）媒体中の可溶性ＯＰ−１複合体。すべてのヒツジにおいて、Ｌ３〜Ｌ４椎間板は、治療を行わない環状病巣を施される。４匹のヒツジでは、Ｌ１〜Ｌ２椎間板は、媒体のみで処置し、Ｌ５〜Ｌ６椎間板は、可溶性ＯＰ−１複合体および媒体で処置する。他の４匹のヒツジでは、Ｌ１〜Ｌ２およびＬ５〜Ｌ６椎間板の処置を逆にして、脊髄レベルに関連して可能性のある結果のバイアスを防止する。手術を行わない椎間板は、治療された椎間板間に維持し、後続の機械的テストにおいてＦＳＵの適切な固定を可能にする（以下参照）。針金縫合は、Ｘ線および形態学的同定の両方で、その後頭側の手術レベルを特定するために使用される。これらの追加の非手術動物は、生体力学的調査のコントロールとしても使用される。
【０１６２】
環状切開後の変性は、ヒツジにおいて十分に確立されており（Ｏｓｔｉ ＯＬ等、（１９９０年）Ｖｏｌｖｏ Ａｗａｒｄ ｆｏｒ Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｎｎｕｌｕｓ ｔｅａｒｓ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ ｄｉｓｃ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ。動物モデルを使用する実験的な研究Ｓｐｉｎｅ １５：７６２−７）は、１２週後に、最も早いＸ線および組織化学的証拠を示すと予想することができる。環状病巣を導入して３ヶ月後に、ヒツジは、６．５ｇのペントバルビタールナトリウムを静脈注射して殺され、腰椎のＸ線写真を撮影して、椎間板の石灰化を評価し、生体力学的（ｎ＝８）および組織額的（ｎ＝４）分析のために切除して処理し、生体力学的テスト後、同じ椎間板を帯状に切開して、組成物の分析を行う。
【０１６３】
Ｂ．椎間板組織の組成物の分析
椎間板組織は、図５に示すように、帯状に切開して環状四分円および髄核状にする。
【０１６４】
Ｃ．椎間板組織のプロテオグリカンおよびコラーゲン成分の判定
線維輪および髄核のサンプルは、氷の上で細かくさいころ状に切り、既知の湿重量の各々の組織帯の代表的な部分を、一定の重量まで凍結乾燥させる。組織の開始と終了重量との差は、それぞれの水分を示す。乾燥組織の３つの部分（１〜２ｍｇ）は、１１０℃の６Ｍ ＨＣＬ中で１６時間にわたって加水分解し、中和された消化物のアリコートは、組織のコラーゲン分の指標としてヒドロキシプロリンの測定を行う（Ｍｅｌｒｏｓｅ Ｊ等、（１９９２年）線維輪に対する外科的損傷により椎間板内に誘発されるマトリクスの変化の長期にわたる研究、Ｊ Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｓ １０：６６５−６７６；Ｍｅｌｒｏｓｅ Ｊ等、（１９９４ａ）、正常な成体ヒツジの椎間板、マトリクスにおけるプロテオグリカンの異質性、１４：６１−７５；Ｍｅｌｒｏｓｅ Ｊ等、（１９９４ｂ）脊髄レベルによるヒツジ椎間板の組成物、およびその成分のプロテオグリカンの変化、Ｖｅｔ Ｃｏｍｐ Ｏｒｔｈｏｐ Ｔｒａｕｍ ７：７０−７６；Ｍｅｌｒｏｓｅ Ｊ等、（１９９１年）ヒトの椎間板におけるプロテオグリカン異質性に対する脊柱側湾症および加齢の影響Ｊ Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｓ ９：６８−７７；およびＭｅｌｒｏｓｅ Ｊ等、（１９９６年）キモパパインによる化学的髄核融解術後の椎間板の再構成は、用量によって決まる：ビーグル犬における実験調査 Ｓｐｉｎｅ ２１：９−１７）。乾燥組織（約２ｍｇ）の３つの部分も、パパインにより消化され、溶解した組織のアリコートは、異染性染料１，９−ジメチルメチレンブルーを組織プロテオグリカンの指標として使用して、硫酸化グリコサミノグリカンを測定する（上記のＭｅｌｒｏｓｅ等、１９９１年、１９９２年、１９９４年、１９９６））。
【０１６５】
Ｄ．組織化学的および免疫組織化学的分析
組織化学的分析に指定される背骨運動部分は、骨鋸を使用して、頭蓋および尾側椎体を軟骨性運動終板付近で切断して単離される。隣接する椎体部分を含む全体の椎間板標本は、全体的に、１０％中性緩衝ホルマリンまたはＨｉｓｔｏｃｈｏｉｃｅ（登録商標）中で、５６時間にわたって定着させ、５％ＮＢＦ中の１０％ギ酸を数回変えて、一定に攪拌しながら２週間にわたって、Ｆａｘｉｔｒｏｎ ＨＰ４３８５５ＡＸ線キャビネット（米国、マクミンビルのＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ）を使用して、完全な脱灰が確認されるまで脱灰する。
【０１６６】
脱灰した椎間板−椎体標本の矢状スライス（５ｍｍ厚）は、標準の組織学的方法により段階的エタノール溶液を通して脱水し、パラフィン蝋中に埋め込む。パラフィン部分４μｍ厚は、組織化学的染色の準備をして、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ Ｐｌｕｓガラス顕微鏡のスライド（Ｍｅｎｚｅｌ−Ｇｌａｓｅｒ）上に８５℃で３０分間、次に５５℃で一晩配置する。これらの部分は、キシレン中で脱パラフィンし（４回変更×２分）、水に対する段階的エタノール洗浄（１００〜７０％ｖ／ｖ）を通して再水和される。
【０１６７】
すべてのブロックからの３つの部分は、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色する。これらの部分は、環状切開のみを施されるレベルの組織学的特性と、切開され、可溶性ＯＰ−１複合体を受領するレベルの組織学的特性を比較する個々の組織病理学者によって検査される。４点半定量的等級付けシステムを使用して、顕微鏡的な特徴を評価する。コラーゲン構造も、偏光顕微鏡法を使用して、マッソントリクロームおよびピクロシリウスレッドで染色した部分で検査される。
【０１６８】
免疫組織化学的手順は、上記のとおり、Ｓｅｑｕｅｎｚａカセット、および使い捨て式のカバープレート免疫染色システムを使用して行われる（Ｍｅｌｒｏｓｅ Ｊ等、（２００２年）パーリカン、基底膜のマルチ領域プロテオグリカンは、ヒツジの脊椎成長プレートの異常肥大軟骨細胞、および軟骨性終板軟骨の突出した細胞周囲の要素でもある、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１８，２６９−２８０；Ｍｅｌｒｏｓｅ Ｊ等、（２００２年）実験的な椎間板変性のヒツジ環状病巣モデルにおけるプロテオグリカンの減少に関連する神経および血管の内殖の増加、Ｓｐｉｎｅ ２７，１２７８−８５；Ｍｅｌｒｏｓｅ Ｊ等、（２００２年）、単分子層およびアルギン酸塩ビード培地における椎間板細胞、滑液線維芽細胞および関節軟骨細胞の形態および成長特性、Ｅｕｒ．Ｓｐｉｎｅ Ｊ．１２，５７−６５；Ｍｅｌｒｏｓｅ Ｊ等（２００１）プロテオグリカンエピトープの差別的発現、およびアルギン酸塩ビード中のヒツジ椎間板細胞成長の成長特性、Ｃｅｌｌｓ Ｔｉｓｓｕｅｓ Ｏｒｇａｎｓ １６８：１３７−１４６；Ｍｅｌｒｏｓｅ Ｊ等、（２００３）パーリカン、基底膜のマルチ領域ＨＳ−プロテオグリカンは、発現するヒトの脊柱の軟骨性椎体原基、脊椎成長プレートおよび椎間板の突出した細胞外および細胞周囲の要素である、Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ ５１：１３３１−１３４１；Ｍｅｌｒｏｓｅ Ｊ等、（２０００年）アルギン酸塩ビード培地におけるヒツジ椎間板によるプロテオグリカンエピトープの差別的発現、Ｊ．Ａｎａｔ．１９７：１８９−１９８；Ｍｅｌｒｏｓｅ Ｊ等、（２００２年）腫瘍増殖因子−β、線維芽細胞増殖因子−２、オステオネクチンの空間および時間的局在化、並びに損傷した線維輪においてα平滑筋アクチンを発現する細胞の特定：細胞外マトリクスの修復の意味、Ｓｐｉｎｅ ２７：１７５６−１７６４；およびＫｎｏｘ Ｓ等、（２００２年）すべてのパールカンが、等しく生成されるわけではい：線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２）およびＦＧＦ受容体との相互作用、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１４６５７−１４６６５）、内因性ペロオキシダーゼ活動は、最初に、組織部分を３％Ｈ２Ｏ２で培養することによって遮断される。次に、２０ｍＭのトリスアセテート緩衝液ｐＨ８．０中において１時間にわたって３７℃でコンドロイチナーゼＡＢＣ（０．２５Ｕ／ｍｌ）を使用し、および１時間にわたって３７℃で、リン酸緩衝液ｐＨ５．０中でウシ睾丸ヒアルロニダーゼ１０００Ｕ／ｍｌを使用するという組合せで、この組織部分の前消化を行い、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．２ ０．５Ｍ ＮａＣｌ（ＴＢＳ）またはプロテイナーゼ−Ｋ（ＤＡＫＯ Ｓ３０２０）中において６分間室温で３回洗浄して、抗原エピトープを露出させる。この組織は、次に、１時間にわたって２０％の正常ブタ血清中で遮断し、大きいプロテオグリカンおよび小さいプロテオグリカン並びにコラーゲンに対するある数の一次抗体を使って精査する（表５）。負のコントロール部分も、一次抗体を除外するか、あるいは無関係なアイソタイプの適合一次抗体を該当する真の一次抗体と置換することによって処理される。西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリ性ホスファターゼ共役二次抗体は、ＴＢＳまたはＮｏｖａ ＲＥＤ担体中の０．０５％の３，３’−ジアミノベンジジンジヒドロクロリド、および０．０３％の Ｈ２Ｏ２を使用する検出に使用される。染色スライドは、Ｌｅｉｃａ ＭＰＳ６０顕微鏡写真機デジタルカメラシステムを使用して、明視野顕微鏡検査により検査し、写真を撮影する。
【０１６９】
【表５】
Ｅ．背骨運動部分の生体力学的評価
非破壊的な生体力学的運動範囲（ＲＯＭ）分析は、各々の機能的脊柱単位（ＦＳＵ）に関して、様々な運動平面内で（屈曲−伸張、側方屈曲、圧縮、および捻転）行われる。各々のＦＳＵは、２つの隣接する脊椎、介在する椎間板、および関連する靭帯を含む。
【０１７０】
Ｃａｌｌａｇｈａｎ ａｎｄ ＭｃＧｉＩｌが開発した治具に基づいて特別に設計された治具は、一定の軸荷重を維持しつつ、純粋な捻転および屈曲モーメントを各々のＦＳＵに適用することを可能にする。この結合荷重は、インビボで脊柱に生じる生理的負荷の厳密なシミュレーションである。
【０１７１】
４つのＦＳＵをテストする：手術しないコントロールレベル；切開されるレベル；切開され、可溶性ＯＰ−１複合体および媒体で処置されるレベル、および切開されており、媒体のみ処置されるレベル。各々のＦＳＵは、２つのアルミニウム合金カップ内に実装し、低温硬化セメントで固定する。椎間板がカップに整列するようにように注意を要する。テストを開始する前に、各々のＦＳＵは、水和作用の再現可能な状態が達成されるまで、０．５ＭＰａの応力まで予荷重を与える。これは、各々のテストの前の基準として使用される。０．５ＭＰａの予荷重応力は、リラックスして立っている状態をシミュレートしており、椎間板内圧力のインビボの測定結果に基づいている（Ｗｉｌｋｅ Ｈ−Ｊ等、（１９９９年）日常生活における椎間板内の圧力のインビボでの測定結果、Ｓｐｉｎｅ ２４：７５５−６２）。±５Ｎｍの捻転荷重および±１Ｎｍの屈曲−伸張、側方屈曲荷重を１０回より多く繰り返して、一定の０．５ＭＰａ軸方向負荷状態で加える。繰り返し軸方向荷重（０回を超える０〜１０００Ｎ）を加えて、ＩＶＤの軸方向圧縮反応を調査する。
【０１７２】
（実施例８ ヤギモデルにおける軟骨、および微小破壊を処置された軟骨欠損に対するＯＰ−１の効果）
この調査は、ヤギモデルにおける微小破壊手順によって誘発される修復組織の量および組成物に対する可溶性ＯＰ−１複合体の影響を評価する。全部で２４匹の成体のオスヤギ（年齢１．５〜３歳）体重約２５ｋｇを使用する。外科手術前に、膝関節を検査して、変性関節疾病またはその他の注目すべき整形外科的問題を持つ動物を排除する。１つの８ｍｍ（１辺）角の軟骨の欠損（最高到達点−石灰化軟骨層まで軟骨を除去する）は、すべての動物の右膝（後膝関節）の滑車溝内に形成する。１２匹のヤギの場合、軟骨欠損は、処置部位として役立つであろう（ＩＡ群およびＩＩＢ群（以下の表６参照））。次に、１２匹の動物の右膝関節に微小破壊の処置を施す（ＩＩＡおよびＩＩＢ群）。約１ｍｍ径のピックを使用して、１６個の微小破壊孔を形成する。
【０１７３】
手術直後、可溶性ＯＰ−１複合体（Ｓｏｌ．ＯＰ−１ Ｃｍｐｌｘ）を関節の滑液内に注射する。７日後に、第２の注射薬を投与する。軟骨の欠損群（ＩＢ）の６匹の動物、および微小破壊群（ＩＩＢ）の６匹の動物の場合、媒体のみを送達する。
【０１７４】
【表６】
すべての動物は、外科処置から１６週後に屠殺する。すべての部位は、組織形態計測による評価のために準備する。各々の欠損の中心部分の１つの組織学的部分を評価する。元の軟骨の欠損領域を充填する特定の組織の種類（関節軟骨、ヒアリン軟骨、線維軟骨、および線維組織）は、顕微鏡の接眼レンズのグリッドを使用して決定する。組織の型に関して十分に認められている組織学的基準（たとえば、Ｗａｎｇ Ｑ．等、イヌの関節軟骨内の欠損の治癒；血管のないα平滑筋アクチンの分布−細胞を含む、Ｗｏｕｎｄ Ｒｅｐａｉｒ Ｒｅｇｅｎ．８，ｐｐ．１４５−１５８（２０００年）；Ｂｒｅｉｎａｎ ＨＡ，等、微小破壊で処置したイヌの関節軟骨の欠損の治癒、ＩＩ型コラーゲンマトリクス、または培養された自己由来の軟骨細胞、Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．１８，ｐｐ．７８１−７８９（２０００）；およびＢｒｅｉｎａｎ，ＨＡ，等、イヌモデルにおける軟骨の欠損の修復に対する培養された自己由来の軟骨細胞の効果Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ．７９Ａ，ｐｐ．１４３９−１４５１（１９９７年））。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８−１】
【図８−２】
【図９】
【図１０−１】
【図１０−２】
【図１１】
【図１２−１】
【図１２−２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８−１】
【図２８−２】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８−１】
【図８−２】
【図９】
【図１０−１】
【図１０−２】
【図１１】
【図１２−１】
【図１２−２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８−１】
【図２８−２】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【公開番号】特開２０１３−４９７１６（Ｐ２０１３−４９７１６Ａ）
【公開日】平成２５年３月１４日（２０１３．３．１４）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１２−２６７０４７（Ｐ２０１２−２６７０４７）
【出願日】平成２４年１２月６日（２０１２．１２．６）
【分割の表示】特願２００９−５１１１１６（Ｐ２００９−５１１１１６）の分割
【原出願日】平成１９年５月１７日（２００７．５．１７）
【出願人】（５９５１４８８８８）ストライカー コーポレイション (52)
【氏名又は名称原語表記】ＳＴＲＹＫＥＲ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年３月１４日（２０１３．３．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−２６７０４７（Ｐ２０１２−２６７０４７）
【出願日】平成２４年１２月６日（２０１２．１２．６）
【分割の表示】特願２００９−５１１１１６（Ｐ２００９−５１１１１６）の分割
【原出願日】平成１９年５月１７日（２００７．５．１７）
【出願人】（５９５１４８８８８）ストライカー コーポレイション (52)
【氏名又は名称原語表記】ＳＴＲＹＫＥＲ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
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