軟骨疾患修復治療用組成物
【課題】再生能力が極めて低く、一度損傷するとその修復は殆ど不可能に近いと考えられている軟骨の疾患の修復治療を可能にする薬物療法および／または医薬品を提供する。
【解決手段】ホスホジエステラーゼ(ＰＤＥ)４阻害作用を有するＰＤＥ４阻害剤(例えば下式の化合物）を有効成分とする軟骨疾患修復治療用組成物。
【解決手段】ホスホジエステラーゼ(ＰＤＥ)４阻害作用を有するＰＤＥ４阻害剤(例えば下式の化合物）を有効成分とする軟骨疾患修復治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、軟骨疾患修復治療用組成物、さらに詳しくは、ホスホジエステラーゼ(ＰＤＥ)４阻害作用を有する化合物を有効成分とする、変形性関節症、軟骨形成異常症、変形性椎間板症、半月板損傷等の軟骨疾患を修復治療するための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
軟骨は、骨と共に骨格を形成したり、内臓を保護する役目を持つ、弾性力に富む組織であり、軟骨組織は軟骨細胞とそれを取り囲む軟骨基質とからなる。
軟骨は間葉由来の軟骨芽細胞が分裂増殖しながら周囲に基質を産生したものである。一方、軟骨基質は無定形基質と繊維成分とからなり、それらの組成比率の違いにより、(1)硝子軟骨(関節軟骨、肋軟骨、甲状軟骨等)、(2)線維軟骨(椎間円板、恥骨結合)、(3)弾性軟骨(咽頭蓋軟骨、外耳道軟骨、耳介軟骨等)の３種に分類される[医学大辞典(18版；南山堂発行)第１５４２頁]。
【０００３】
軟骨基質の主成分は、プロテオグリカンおよびコラーゲン(ＩＩ型、ＩＸ型等)であり、プロテオグリカンは軟骨組織特有の膨潤性に関与し、コラーゲン線維は軟骨の張力および剪断力に対する剛性に関与することが知られている。
軟骨基質中のプロテオグリカンでは、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸等のグルコサミノグリカンが分子量約２２万のコア蛋白に結合して巨大分子を形成したものとなっており、グルコサミノグリカンが多くの水分子を水和していることが、軟骨の膨潤性に寄与していると考えられている[ザ・ボーン(The Bone)第４巻第８頁(１９９４年)］。
【０００４】
このうち、関節軟骨は骨組織との移行部に石灰化層を有し、成長が完了した後には、血液の直接的な供給を殆ど受けることなく、軟骨細胞の栄養は関節液から供給される。また、関節軟骨は細胞分化度の高い硝子軟骨から形成されており、再生能力の極度に低いデリケートな組織である。
この関節軟骨の表面を粘稠性の高い滑液が覆い、ヒアルロン酸・蛋白複合体を主役とした潤滑液による潤滑機構が働き、滑らかな関節運動が維持されているが、関節軟骨には所謂耐用年数が存在すると考えられており、老化に伴う関節変化は必発する避けがたい生理的現象である。
【０００５】
軟骨の障害に起因する疾患としては、例えば、変形性関節症をはじめとして、軟骨形成異常症、変形性椎間板症、半月板損傷等が知られている。
このうち、変形性関節症は、関節を構成する組織、主に、関節軟骨の退行性変化を基に、骨・軟骨の増殖性変化を来し、最終的には関節の形態が著明に変化するに至る疾患であるが、人口の高齢化に伴って増加しており、中でも膝関節症は病態の進行と共に、立位保持、歩行動作が障害されて日常動作能力(Ability of Daily Life; ＡＤＬ)の著しい低下を引き起こし、寝たきり状態の原因となることもある。
【０００６】
変形性関節症の治療は大きく、保存的治療と手術療法に分けられており、保存的治療として、(1)非ステロイド性消炎鎮痛剤の投与、(2)温熱療法、(3)体重のコントロール、(4)装具療法、(5)ステロイド性消炎鎮痛剤の関節内注入、(6)ヒアルロン酸製剤の関節内注入等が行われている。また、保存療法が奏効しない症例や進行例、末期例に対しては、手術療法として、(1)関節鏡視下洗浄、(2)脛骨高位骨切り術、(3)人工関節置換等が行われている［老化と疾患第１０巻、第２号、６１〜６９頁(１９９７年)＆第６号、第６６〜７７頁(１９９７年)］。
一方、ＰＤＥ４阻害作用を有する化合物は種々知られており、ＰＤＥ４の作用を阻害することにより、炎症性メディエイターの放出を阻害できる[ジャーナル・オブ・モレキュラー・アンド・セルラー・カーディオロジー(J. Mol. Cell. Cardiol.)12(Suppl. II), S61 (1989年)]。
【０００７】
また、ＰＤＥ４阻害作用を有する化合物が、免疫刺激剤に応答して単核食細胞により放出されるサイトカインであるＴＮＦ-αの産生を抑制し、ＴＮＦ−αによって引き起こされる各種炎症性疾患の治療に有用であることが記載されている〔特表２０００−５０３６７８号、特表２０００−５０２７２４号、特表２０００−５１０１０５号、特表２０００−５１４８０４号、特表２０００−５０２３５０号、特表２０００−５０１７４１号〕。しかし、ＰＤＥ４阻害剤が軟骨疾患の修復治療に有効であることは全く知られていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述したように、軟骨は再生能力が極めて低く、一度損傷するとその修復は殆ど不可能に近いと考えられており、従来の薬物療法はその進行を抑制する保存的治療に過ぎなかった。従って、その軟骨疾患の修復治療を可能にする薬物療法および／または医薬品の開発が永年求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、軟骨細胞においてＰＤＥ４が産生されていることを見出し、ＰＤＥ４阻害作用を有する化合物が、軟骨疾患に対して活性を示すことを知り、研究を重ねたところ、該ＰＤＥ４阻害作用を有する化合物が軟骨疾患の修復治療に有用であることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、ＰＤＥ４阻害剤を有効成分とする軟骨疾患修復治療用組成物を提供するものである。本発明は、特に、軟骨疾患部位に局所的に適用するのに適した製剤、特にマイクロスフェア形態の、軟骨疾患修復治療用組成物を提供するものである。
【００１０】
本発明の軟骨疾患修復治療用組成物は、軟骨、とりわけ、再生能力が極度に低い関節軟骨に対し、軟骨基質蛋白の遺伝子発現を増大させることにより、優れた基質産生促進作用を有し、軟骨の修復により、軟骨の疾患を治療することができる。
ここに、軟骨疾患の修復治療とは、軟骨疾患の悪化を抑制するのみならず、疾患、傷害等により、変形・磨耗した軟骨を元の形に修復する治療を意味するものである。
【００１１】
本発明の医薬組成物は、ＰＤＥ４阻害剤を有効成分とし、これに通常の医薬用賦形剤または希釈剤を配合して調製される。好ましい医薬組成物は、ＰＤＥ４阻害剤と生体内適合性かつ生体内分解性ポリマーとを含有する徐放性の局所投与用の組成物である。該局所投与性組成物は、デポ剤(depot formulation)の形態とするのが好ましく、さらに、マイクロスフェア形態とすることが好ましく、そのマイクロスフェアは注射剤の形態とすることもできる。
【００１２】
本発明の医薬組成物において、活性成分として用いられるＰＤＥ４阻害剤としては、ＰＤＥ４阻害活性を有する化合物がすべて含まれ、例えば、特開平５−２２９９８７号、特開平９−５９２５５号、特開平１０−２２６６８５号、欧州公開Ｎｏ.１５８３８０、国際公開Ｎｏ.９４／２５４３７、米国特許Ｎｏ.５２２３５０４、国際公開Ｎｏ.９５／４０４５、欧州公開Ｎｏ.４９７５６４、欧州公開Ｎｏ.５６９４１４、欧州公開Ｎｏ.６２３６０７、欧州公開Ｎｏ.１６３９６５、米国特許Ｎｏ.５６０５９１４、国際公開Ｎｏ.９５／３５２８２、国際公開Ｎｏ.９６／２１５、米国特許Ｎｏ.５８０４５８８、米国特許Ｎｏ.５５５２４３８、国際公開Ｎｏ.９３／９１１８、国際公開Ｎｏ.９６／３１４８５、欧州公開Ｎｏ.４５９５０５、国際公開Ｎｏ.９７／２２５８５、欧州公開Ｎｏ.７３８７１５、国際公開Ｎｏ.９１／１６３１４、国際公開Ｎｏ.９６／２１８、国際公開Ｎｏ.９７／１８２０８、欧州公開Ｎｏ.１５８３８０、国際公開Ｎｏ.９９／５０２７０、欧州公開Ｎｏ.２６０８１７、国際公開Ｎｏ.９８／１１１１３、国際公開Ｎｏ.９４／２２８５２、欧州公開Ｎｏ.４３２８５６、米国特許Ｎｏ.４１９３９２６、国際公開Ｎｏ.９８／１３３４８、国際公開Ｎｏ.９６／６８４３、特表２０００−５０３６７８号(＝国際公開Ｎｏ.９８／１４４３２)、特表２０００−５０２７２４号(＝国際公開Ｎｏ.９８／９９６１)、特表２０００−５１０１０５号(＝国際公開Ｎｏ.９７／４００３２)、特表２０００−５１４８０４号(＝国際公開Ｎｏ.９８／２４４０)、特表２０００−５０２３５０号(＝国際公開Ｎｏ.９７／２３４５７)、特表２０００−５０１７４１号(＝国際公開Ｎｏ.９７／２５８５)等に記載の化合物が挙げられる。
【００１３】
本発明の軟骨疾患修復治療用組成物に適したＰＤＥ４阻害剤は、トレンズ・イン・ファーマコロジカル・サイエンシーズ(Trends in Pharmacological Sciences)１１巻１５０〜１５５頁の記載に従って分類したＰＤＥ１〜５のうち、ＰＤＥ４に対して他のＰＤＥ(ＰＤＥ１〜３および５)に対するよりもより強い阻害作用を有する選択的ＰＤＥ４阻害剤が好ましく、ＰＤＥ４に対する阻害作用が他のＰＤＥに対するよりも１０倍以上強いものが好ましい。より好ましいものは、他のＰＤＥに対するよりも５０倍以上、さらに好ましくは１００倍以上の阻害作用を有するものである。
好ましいＰＤＥ４阻害剤は、アドバンシーズ・イン・サイクリック・ヌクレオチド・リサーチ(Advances in Cyclic Nucleotide Research)１０巻、６９〜９２頁[１９７９年レイベン・プレス(Raven Press)発行]記載の方法に準じて測定したＰＤＥ４阻害活性のＩＣ５０が０.１〜１０００ｎＭ、好ましくは０.１〜１００ｎＭの化合物である。より好ましくは、ＩＣ５０は１００ｎＭ未満である。
【００１４】
選択的ＰＤＥ４阻害剤の具体例としては、下記構造で示される化合物番号(１)〜(５７）の化合物またはその薬理的に許容し得る塩が挙げられる。
【化１】
【化２】
【化３】
【化４】
【化５】
【化６】
【化７】
【化８】
【化９】
【化１０】
【化１１】
【化１２】
【化１３】
【化１４】
【化１５】
【化１６】
【化１７】
【化１８】
【化１９】
【化２０】
【化２１】
【化２２】
【化２３】
【化２４】
【化２５】
【化２６】
【化２７】
【化２８】
【化２９】
【００１５】
ＰＤＥ４阻害活性を有する化合物は、化学構造上から、次の(Ａ)〜(Ｄ)に分けることが出来、それらのうちから適宜選択されるが、本発明におけるＰＤＥ４阻害剤としては、(Ａ)および(Ｂ)の化合物が好ましく、(Ａ)の化合物がとりわけ好ましい。
(Ａ) ナフタレン骨格またはこれに類似する部分構造を有する化合物[例えば、化合物番号(１)、(２)、(３８)、(４７)、(５２)〜(５７)]、
(Ｂ) ３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシフェニル構造またはこれに類似する部分構造を有する化合物[例えば、化合物番号(６)、(９)、(１１)、(１２)、(１４)、(１７)、(１９)、(２０)、(２１)、(２４)、(２５)、(２６)、(２７)、(３３)、(３４)、(３５)、(３９)、(４０)、(４４)、(４９)、(５０)、(５１)]、
(Ｃ) キサンチン骨格またはこれに類似する部分構造を有する化合物[例えば、化合物番号(５)、(７)、(２８)、(２９)、(３０)、(３１)、(３２)、(３６)、(３７)、(４１)、(４３)、(４６)]、および
(Ｄ) 上記(Ａ)〜(Ｃ)以外の構造を有する化合物[例えば、化合物番号(３)、(４)、(８)、(１０)、(１３)、(１５)、(１６)、(１８)、(２２)、(２３)、(４２)、(４５)、(４８)]
【００１６】
上記(Ａ)の化合物としては、例えば、下記一般式(Ｉ)〜(ＩＩＩ)で示される化合物およびそれらの薬理的に許容し得る塩を挙げることができる。
【化３０】
(式中、Ｒ1およびＲ２は同一または異なって、水素原子、水酸基、シクロ低級アルキルオキシ基、または置換基を有していてもよい低級アルコキシ基を表すか、或いは、互いに末端で結合して低級アルキレンジオキシ基を形成し、Ｒ３は置換基を有していてもよい含窒素複素６員環式基、−ＯＲ４およびＯＲ５は同一または異なって、保護されていてもよい水酸基を表す)(特開平５−２２９９８７号)
【００１７】
【化３１】
(式中、Ｒ1'およびＲ２'は同一または異なって水素原子または保護されていてもよい水酸基を表し、Ｒ３'およびＲ４'のいずれか一方が、保護されていてもよい水酸基置換メチル基、他方が水素原子、低級アルキル基または保護されていてもよい水酸基置換メチル基であり、Ｒ５'およびＲ６'は同一または異なって、水素原子、置換されていてもよい低級アルキル基、置換されていてもよいフェニル基または保護されていてもよいアミノ基を表すか、あるいは互いに末端で結合して隣接する窒素原子とともに置換されていてもよい複素環式基を形成している)(特開平９−５９２５５号)
【００１８】
【化３２】
(式中、Ａは式：
【化３３】
から選ばれるいずれか１つの基[但し、Ｒ1”およびＲ２”は同一または異なって、水素原子または保護されていてもよいヒドロキシ基、Ｒ３１は保護されていてもよいヒドロキシメチル基、Ｒ３２は水素原子、低級アルキル基または保護されていてもよいヒドロキシメチル基、Ｒ３３は置換基を有していてもよい低級アルキル基、Ｒ４１は保護されていてもよいヒドロキシメチル基、Ｒ４２は保護されていてもよいヒドロキシメチル基、点線は二重結合の存在または非存在を表す]を表し、Ｒ５”およびＲ６”は同一または異なって、水素原子または保護されていてもよいアミノ基を表すか、あるいは互いに末端で結合して隣接する窒素原子と共に置換されていてもよい複素環式基を形成している。)(特開平１０−２２６６８５号)
【００１９】
本発明の軟骨疾患修復治療用組成物の有効成分であるＰＤＥ４阻害剤としては、(Ａ)の化合物のうち、ナフタレン骨格またはイソキノリン骨格を有する化合物またはその薬理的に許容し得る塩がとりわけ好ましく、化合物番号(１)および(２)の化合物またはその薬理的に許容し得る塩がとりわけ好ましい。
ＰＤＥ４阻害剤が全身的に作用した場合には、投与量によっては嘔吐や胃酸分泌を引き起こすこともあるため[セルラー・シグナリング(Cellular Signaling)９(３−４)２２７〜２３６頁(１９９７年)]、本発明の軟骨疾患修復治療用組成物は疾患部位の近傍(とりわけ、関節軟骨の近傍)に、局所投与され、全身的な薬物の血中濃度を上昇させず、軟骨疾患部位での薬物濃度を維持するようにするのが望ましい。また、このような目的を達成するためには、徐放性とするのが望ましく、徐放性とすることにより、投与回数を少なくし、患者負担の軽減を図ることもできる。
【００２０】
本発明の組成物の好ましい形態としては、局所投与で薬物を徐々に放出するデポ剤(例えばペレット製剤、ゲル製剤、マトリックス製剤、マイクロスフェア製剤、生体内適合性かつ生体内分解性ポリマーの水溶液に薬物を添加して徐放化した製剤、投与時には溶液であるが、生体内に投与されることによってゲルを形成するように設計された製剤、一般に整形外科の領域での使用が報告されている種々基剤に封入した製剤等)が挙げられる。
ペレット剤としては、例えば、末端カルボキシル基がアルコールによりエステル化された乳酸−グリコール酸共重合体微粒子と薬物とを圧縮成型して得られる長期徐放性製剤(特開２００１−１８７７４９号）等を挙げることができる。
【００２１】
ゲル製剤としては、例えば、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース(Journal of Controlled Release) 59 (1999) 77-86記載の、ポリエチレングリコールを化学的に結合させたヒアルロン酸と薬物とをリン酸緩衝液に溶解させたゲル製剤等を挙げることができる。
マトリックス製剤としては、例えば、コラーゲンの粒状物質中または繊維膜中に薬物を含浸した製剤、コラーゲンの粒状物質中または繊維膜の調製中に薬物を添加して含有させた製剤(特開平１０−１８２４９９号、特開平６−３０５９８３号)等を挙げることが出来る。
【００２２】
生体内適合性かつ生体内分解性ポリマーの水溶液に薬物を添加して徐放化した製剤としては、例えば、ヒアルロン酸ナトリウムの水溶液に薬物を添加して徐放化した製剤等が考えられる。
投与時には溶液であるが、生体内に投与されることによってゲルを形成するように設計された製剤としては、例えば、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース(Journal of Controlled Release)33 (1995) 237-243 記載の、乳酸−グリコール酸共重合体と薬物とをＮ−メチル−２−ピロリドンに溶解させた製剤、同 27 (1993) 139-147 記載の、乳酸−グリコール酸共重合体とポリエチレングリコールとのブロック共重合体等の低温では溶液状態で存在するが、体温ではゲルとなる高分子と薬物を含有する製剤を挙げることができる。
【００２３】
一般に整形外科の領域で報告されている種々の基剤に封入した製剤としては、例えば、基剤(例えば、水難溶性の生体内適合性かつ生体内分解性ポリマー、ポリメチルメタクリレート、ヒドロキシアパタイト、トリカルシウムホスフェート等)と薬物とを混合して製造される製剤[バイオマテリアルズ(Biomaterials)２１巻、２４０５−２４１２頁(２０００年)、インターナショナル・ジャーナル・オブ・ファーマシューティクス(International Journal of Pharmaceutics）２０６巻１−１２頁(２０００年)]を挙げることができる。
軟骨疾患修復治療に要する期間における投与回数を少なくする上からは、局所投与により、有効量のＰＤＥ４阻害剤を徐々に障害を有する軟骨の近傍(とりわけ、関節軟骨の近傍)に放出するものが好ましい。
【００２４】
デポ剤の内、注射剤の形で局所に投与し易いマイクロスフェアの場合、注射針を通過する粒径であるのが好ましく、粒子径が０.０１〜１５０μｍ、とりわけ０.１〜１００μｍの範囲であるものが疾患部位への刺激を抑制できる点では好ましい。
本発明のＰＤＥ４阻害剤を有効成分とする軟骨疾患修復治療用組成物は、障害を有する軟骨の近傍(とりわけ、関節軟骨の近傍)に、局所的に投与することを考えれば、投与量を小さくするのが好ましく、組成物（例えばマイクロスフェア製剤）中のＰＤＥ４阻害剤の量は０.０００１〜８０％重量％とするのが好ましく、さらに好ましくは０.００１〜５０％重量、さらに好ましくは０.０１〜５０％重量である。有効成分としてのＰＤＥ４の投与量は、用いるＰＤＥ４阻害剤の種類、対象の体重、年齢、症状、適用部位等に応じて医師により適宜決定されるが、局所適用の場合、通常、疾患部位あたり１nｇ〜１gの範囲である。
【００２５】
本発明の軟骨疾患修復治療用組成物は、ＰＤＥ４阻害剤と薬理的に許容される賦形剤または希釈剤とから、常法に従って調製されるが、好ましい組成物は、ＰＤＥ４阻害剤と生体内適合性かつ生体内分解性ポリマーとを配合して調製される。
このうち、水難溶性の生体内適合性かつ生体内分解性ポリマーは、１ｇを溶解するのに、水(２５℃)が１０００ｍｌ以上必要となるような生体内適合性かつ生体内分解性ポリマーであり、具体的には、ヒドロキシ脂肪酸ポリエステルおよびその誘導体(例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリクエン酸、ポリリンゴ酸、ポリ−β−ヒドロキシ酪酸、ε−カプロラクトン開環重合体、乳酸−グリコール酸共重合体、２−ヒドロキシ酪酸−グリコール酸共重合体、ポリ乳酸とポリエチレングリコールとのブロック共重合体、ポリグリコール酸とポリエチレングリコールとのブロック共重合体、乳酸−グリコール酸共重合体とポリエチレングリコールとのブロック共重合体など)、α−シアノアクリル酸アルキルエステルのポリマー(例えば、ポリブチル−２−シアノアクリレートなど)、ポリアルキレンオキサレート(例えば、ポリトリメチレンオキサレート、ポリテトラメチレンオキサレートなど)、ポリオルソエステル、ポリカーボネート(例えば、ポリエチレンカーボネート、ポリエチレンプロピレンカーボネートなど)、ポリオルソカーボネート、ポリアミノ酸(例えば、ポリ−γ−Ｌ−アラニン、ポリ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸、ポリ−γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸など)、ヒアルロン酸エステルなどが挙げられ、これらの１種または２種以上を用いることができる。他の使用可能な生体内適合性かつ生体内分解性ポリマーとしては、ヒアルロン酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン等が挙げられる。
【００２６】
水難溶性の生体内適合性かつ生体内分解性ポリマーのうち、特に好ましいものはヒドロキシ脂肪酸のポリエステルである。それらは平均分子量が２０００〜約８０００００の範囲内、より好ましくは２０００〜約２０００００の範囲内のものが特に好適であり、平均分子量が５０００〜５００００の範囲のものが最も好適である。
また、上記ヒドロキシ脂肪酸のポリエステルのうち、更に好ましいのは、ポリ乳酸、乳酸−グリコール酸共重合体、２−ヒドロキシ酪酸−グリコール酸共重合体である。乳酸−グリコール酸共重合体における乳酸／グリコール酸のモル比は、好ましくは９０／１０〜３０／７０、より好ましくは８０／２０〜４０／６０であり、２−ヒドロキシ酪酸−グリコール酸共重合体における２−ヒドロキシ酪酸／グリコール酸のモル比は、好ましくは９０／１０〜３０／７０、より好ましくは８０／２０〜４０／６０である。
【００２７】
前記ＰＤＥ４阻害剤をデポ剤とするには、その形態に応じて、適宜製剤化することができ、必要に応じて、製剤化に先立ち、予めＰＤＥ４阻害剤を微粒子化してもよい。
ＰＤＥ４阻害剤を微粒子化するには、慣用の微粒子製法を適宜使用することができ、ジェットミル粉砕、ハンマーミル粉砕、回転ボールミル粉砕、振動ボールミル粉砕、ビーズミル粉砕、シェーカーミル粉砕、ロッドミル粉砕、チューブミル粉砕等により、物理的に粉砕する粉砕法や、薬物を一旦溶媒に溶解後、ｐＨ調整、温度変化、溶媒組成の変更等を行って、晶析させ、遠心分離あるいは濾過等の方法で回収するいわゆる晶析法を採用することができる。
【００２８】
本発明の医薬組成物の上記各種製剤を製造するには、ＰＤＥ４阻害剤に合わせて、既知の製法を適宜適用することができる。
例えば、マイクロスフェア製剤を製造するには次の方法が用いられる。また、ＰＤＥ４阻害剤が塩を形成しているために、マイクロスフェアへの取り込み率が悪い場合には、酸または塩基を用いて遊離の形に変換した後、マイクロスフェア化してもよい。
【００２９】
(１)水中乾燥法：
沸点が水より低く水と非混和性である有機溶媒に水難溶性の生体内適合性かつ生体内分解性ポリマーを溶解させた溶液(水難溶性ポリマー溶液)に薬物を含有させ、かくして得られる有機相を水相中に分散してＯ／Ｗ型エマルションを調製後に、該有機溶媒を除去する方法であり、例えば、特公昭５６−１９３２４号、特開昭６３−９１３２５号、特開平８−１５１３２１号、ジャインらの文献(Kajeev Jainら、"Controlled Drug Delivery by Biodegradable Poly(Ester) Devices: Different Preparative Approaches", Drug Development and Industrial Pharmacy、２４(８)巻、７０３−７２７頁、１９９８年)、特開昭６０−１００５１６号、特開昭６２−２０１８１６号、特開平９−２２１４１７号、および特開平６−２１１６４８号に記載の方法と同様にして行われる。
【００３０】
(２)相分離法：
水難溶性の生体内適合性かつ生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液に、薬物もしくは薬物水溶液を溶解・分散させ、これに硬化剤を撹拌下徐々に加え、析出固化させる方法であり、例えば特開昭６０−６７４１７号、米国特許第５５０３８５１号、米国特許第５０００８８６号、Eur. J. Pharm. Biopharm. ４２(１)巻、１６〜２４頁(１９９６年)および前記ジャインらの文献に記載の方法と同様にして行われる。
【００３１】
(３)噴霧乾燥法：
水難溶性の生体内適合性かつ生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液に、薬物を溶解・分散させるか、または薬物水溶液を分散させ、これをスプレーノズルでスプレードライヤー(噴霧乾燥器)の乾燥室内へ噴霧し、きわめて短時間に噴霧液滴内の有機溶媒を揮発させる方法であり、例えば、特開平１−１５５９４２号、特開平５−１９４２００号、特開平５−７０３６３号、特開平８−１５１３２１号、特開平９−２２１４１７号、米国特許第５９２２２５３号、「Spray Drying Handbook」(John Wiley & Sons, New York 1984)、ディージィの文献［Partick B. Deasy、「Microcapsulation and Related Drug Processes」(Marcel Dekker, Inc.、New York 1984)］、および前記ジャインらの文献などに記載の方法と同様にして行われる。
【００３２】
(４)溶媒拡散法：
薬物および水難溶解性の生体内適合性かつ生体内分解性ポリマーを溶解させた水混和性有機溶媒の溶液を、保護コロイド剤の水溶液に添加し、攪拌乳化して微粒子を得る方法であり、例えば、特開平５−５８８８２号、特開平９−１１０６７８号、インターナショナル・ジャーナル・オブ・ファーマシューティクス(International Journal of Pharmaceutics)１８７巻、１４３〜１５２(１９９９)に記載の方法と同様にして行われる。
上記「水中乾燥法」では、有機相の形態によって調製法が異なるが、いずれも常法にしたがって行うことができる。該有機相の形態としては以下のものが含まれる。
【００３３】
(ａ)水難溶性の生体内適合性かつ生体内分解性ポリマー溶液に、薬物が直接溶解もしくは分散されている有機相。これを水相中に分散するとＯ／Ｗ型エマルションとなる(特公昭５６−１９３２４号、特開昭６３−９１３２５号、特開平６−３２７３２号、特開平８−１５１３２１号、特開平６−３２７３２号、前記ジャインらの文献など)。
(ｂ)水難溶性の生体内適合性かつ生体内分解性ポリマー溶液に、薬物水溶液が分散されているＷ／Ｏ型エマルションからなる有機相。そのＷ／Ｏ型エマルションを水相中に分散すると、(Ｗ／Ｏ)／Ｗ型エマルションとなる(特開昭６０−１００５１６号、特開昭６２−２０１８１６号、特開平９−２２１４１７号、前記ジャインらの文献など)。
【００３４】
(ｃ)２種以上の水難溶性の生体内適合性かつ生体内分解性ポリマーを用い、一方のポリマー溶液中に分散されている他方のポリマー溶液中に、薬物が溶解もしくは分散しているＯ／Ｏ型エマルションからなる有機相。そのＯ／Ｏ型エマルションを水相中に分散すると(Ｏ／Ｏ)／Ｗ型エマルションとなる(特開平６−２１１６４８号)。
上記いずれの形態の有機相においても常法により、例えば、断続振盪法、プロペラ型またはタービン型撹拌機を用いる混和法、コロイドミル法、ホモジナイザーを用いる方法、超音波照射法などによって、エマルションを形成させる。
【００３５】
これらの方法において用いられる有機溶媒としては、ハロゲン化炭化水素系溶媒(塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素、クロロエタン、ジクロロエタン、トリクロロエタンなど)、脂肪酸エステル系溶媒(酢酸エチル、酢酸ブチルなど)、芳香族炭化水素系溶媒(ベンゼン)、脂肪族炭化水素(ｎ−ヘキサン、ｎ−ペンタン、シクロヘキサンなど)、ケトン系溶媒(メチルエチルケトンなど)、エーテル系溶媒(ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、メチルイソブチルエーテルなど)が挙げられる。
上記のエマルションを形成させる際、エマルションを安定化するために乳化剤、例えばアニオン性界面活性剤(オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム等)、非イオン性界面活性剤(ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル［Ｔｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ６０(日光ケミカルズ製)等］、ポリエチレンヒマシ油誘導体［ＨＣＯ−６０、ＨＣＯ−５０(日光ケミカルズ製)］、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、レシチン、ゼラチン等)を水相に添加してもよい。
【００３６】
また、ＰＤＥ４阻害剤に加えて、他の成分を配合する場合は、上記Ｏ／Ｗ型エマルションを形成する際に、有機溶媒相にそれらを添加するのが好ましい。なお、薬効成分含量の高いマイクロスフェア製剤を得るためには、有機相の調製に際して薬効成分濃度を高くしておく必要があり、この場合、薬効成分の水相への流出を防ぐために、水相中に浸透圧調節剤を添加することもできる(日本特許第２６０８２４５号を参照)。
上記のようにして得られるＯ／Ｗ型エマルションを水中乾燥法に付すことにより、エマルションに含まれる有機溶媒を除去してマイクロスフェアを製造する。
【００３７】
有機溶媒を除去するには、そのエマルション系を加温したり、減圧下に置くか、または気体を吹きつける方法などの慣用の方法が採用され、たとえば、開放系で溶媒を留去する方法(特公昭５６−１９３２４号、特開昭６３−９１３２５号、特開平８−１５１３２１号、特開平６−２１１６４８号)、閉鎖系で溶媒留去する方法(特開平９−２２１４１８号)などが採用され得る。また、多量の外水相を用いて溶媒を抽出・除去する方法(日本特許第２５８２１８６号)によっても行うことができる。
また次の方法も、ＰＤＥ４阻害剤の種類に応じて、適宜適用することができる。
【００３８】
薬物、生体内分解性ポリマーおよび水と混和する前記ポリマーの良溶媒(溶媒Ａ：アセトン、テトラヒドロフラン等)を含む溶液を、溶媒Ａと混和する前記ポリマーの貧溶媒(溶媒Ｂ：水、エタノール等)および溶媒Ａと混和しない前記ポリマーの貧溶媒(溶媒Ｃ：グリセリン等)を含む均一混合液中に添加して乳化することにより、ポリマー溶液が分散相、均一混合液が連続相を形成するエマルションを調製し、分散相から溶媒Ａを除去する方法(国際公開Ｎｏ.０１／８０８３５ )。
水より沸点の低い有機溶媒(塩化メチレン、酢酸エチル等)および水難溶性ポリマーを含む有機相が水相に乳化したエマルションから水中乾燥法でマイクロスフェアを製造するにあたり、(１)気体分離膜(浸透気化膜、多孔性膜等)を備えた装置を用い、(２)水中乾燥に付されるエマルションを気体分離膜の一方の側に供給し、(３)気体分離膜の他方の側へエマルションに含まれる有機溶媒を留去する方法(国際公開Ｎｏ.０１／８３５９４)。
【００３９】
さらに、マイクロスフェアを水相中で有機溶媒の沸点以上に加温し(特開２０００−２３９１５２号)、または高融点添加物でマイクロスフェアを覆った後、加温乾燥する(特開平９−２２１４１７号)ことにより、マイクロスフェアに残存する有機溶媒を除去することもできる。
このようにして得られるマイクロスフェアは遠心分離、濾過或いは篩などで回収し、その表面に付着した水相添加物等を洗浄除去し、所望により、マイクロスフェア同士の凝集を防止するために糖あるいは糖アルコール、無機塩等、好ましくは、ラクトース、マンニトール、ソルビトールなどの凝集防止剤を添加した後、凍結乾燥に付す。この際、所望の粒子径のマイクロスフェアを得るために、篩にかけることが好ましく、特にマイクロスフェア製剤を注射剤として用いる場合に、通針性を向上させるために、例えば１５０μｍまたはそれ以下の径で篩過を行うのが好ましい。
【００４０】
「相分離法」によってマイクロスフェアを製造するためには、前記水中乾燥法で用いたものと同様の有機溶媒の他、アセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジオキサンなどの両親媒性溶媒を使用することもできる。これらの有機溶媒を用いた水難溶性ポリマーの有機溶媒溶液にＰＤＥ４阻害剤および所望により他の成分、またはそれらの水溶液を加えて溶解または分散させ、有機相を形成させる。この有機相を上記有機溶媒と混和しない溶媒(分散媒)、たとえばシリコンオイル類、流動パラフィン、ゴマ油、大豆油、コーン油、綿実油、ココナッツ油、アマニ油などに撹拌下徐々に添加してＯ／Ｏ型エマルションを形成させる。所望により分散媒には界面活性剤を添加してもよい。このエマルションを冷却して水難溶性ポリマーを固化させる、もしくは加熱して有機相中の溶媒を蒸発させることで水難溶性ポリマーを固化させる。または攪拌下このエマルションに硬化剤、たとえばヘキサン、シクロヘキサン、メチルエチルケトン、オクタメチルシクロテトラシロキサン等を徐々に添加する、もしくは硬化剤にエマルションを徐々に添加することによって、水難溶性ポリマーを析出させることでマイクロスフェアを形成させる。
【００４１】
このようにして形成されたマイクロスフェアは遠心分離、濾過あるいは篩などで回収し、その表面に付着した溶媒や添加剤をヘキサンや精製水などで洗浄除去し、所望により通風乾燥、減圧乾燥、凍結乾燥などに付す。あるいは前記水中乾燥法の場合と同様に、凝集防止剤などを添加した後、凍結乾燥に付す。
なお、相分離法における内部有機相の形態としては以下のものが含まれる。
(ａ)水難溶性の生体内適合性かつ生体内分解性ポリマー溶液に、薬物が直接溶解もしくは分散されている有機相。
(ｂ)水難溶性の生体内適合性かつ生体内分解性ポリマー溶液に、薬物水溶液が分散されているＷ／Ｏ型エマルションからなる有機相。
(ｃ)２種以上の水難溶性の生体内適合性かつ生体内分解性ポリマーを用い、一方のポリマー溶液中に分散されている他方のポリマー溶液中に、薬物が溶解もしくは分散もしくは薬物溶液が分散しているＯ／Ｏ型エマルションからなる有機相。
【００４２】
また「噴霧乾燥法」によってマイクロスフェアを製造するには、前記相分離法で用いたものと同様の有機溶媒を用い、これに水難溶性の生体内適合性かつ生体内分解性ポリマーを溶かし、その有機溶媒溶液に、ＰＤＥ４阻害剤および所望により他の成分を溶解、分散させるか、またはそれら薬物の水溶液を分散させ、その分散液をスプレーノズルを通して噴霧乾燥器内に噴霧して有機溶媒を揮発させてマイクロスフェアを形成させる。
用いられる噴霧乾燥器は市販の製品、例えばパルビス・ミニ・スプレイ(Pulvis Mini Spray)ＧＳ３１(ヤマト製)、ミニスプレードライヤー(柴田科学製)などがいずれも使用され得る。
【００４３】
このようにして得られるマイクロスフェアは水中乾燥法で得られるものと同様に後処理に付されて所望のマイクロスフェア製剤が得られる。
「溶媒拡散法」において、水混和性有機溶媒としてはアセトン、メタノール、エタノール、これらの混合溶媒が挙げることができ、必要に応じて薬物を溶解し得る揮発性溶媒(塩化メチレン、クロロホルム)を加えてもよい。保護コロイド剤としてはポリビニルアルコールを挙げることが出来る。
【００４４】
本発明のＰＤＥ４阻害剤を有効成分とする軟骨疾患修復治療用組成物をマイクロスフェアの形で疾患部位またはその近傍に投与する場合には、局所的に投与するのが好ましく、局所、とりわけ関節内への注射または埋め込みが好ましい。
マイクロスフェアを注射剤とするには、分散剤を含有する水溶液に本発明で得られるマイクロスフェアを、０.０００１〜１０００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０.０００５〜８００ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは０.００１〜５００ｍｇ／ｍｌの濃度となるように分散して調製することができる。
【００４５】
用いられる分散剤としては、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル(Ｔｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ６０(日光ケミカルズ製)など)、ポリエチレンヒマシ油(ＨＣＯ−６０、ＨＣＯ−５０(日光ケミカルズ製)など)等の非イオン界面活性剤、カルボキシメチルセルロースナトリウム等のセルロース系分散剤、アルギン酸ナトリウム、デキストラン、ヒアルロン酸ナトリウムが挙げられる。これらの分散剤は、マイクロスフェアの分散性を向上させ、薬効成分の溶出を安定化させる働きがあり、通常、０.０１〜２重量％、好ましくは０.０５〜１重量％で添加される。
上記注射剤には、適宜、保存剤(メチルパラベン、プロピルパラベン、ベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビン酸、ホウ酸、アミノ酸、ポリエチレングリコール類など)、等張化剤(塩化ナトリウム、グリセリン、ソルビトール、ブドウ糖、マンニトールなど)、ｐＨ調節剤(水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、塩酸、リン酸、クエン酸、シュウ酸、炭酸、酢酸、アルギニン、リジンなど)、緩衝剤(リン酸水素ナトリウム、リン酸水素カリウムなど)が配合される。
【００４６】
注射剤には、更に、必要に応じて、ステロイド系消炎鎮痛剤、非ステロイド系消炎鎮痛剤を溶解・分散してもよい。ステロイド系消炎鎮痛剤としては、例えば、デキサメタゾン、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、ハロプレドン、パラメタゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ベタメタゾン等をあげることができる。また、非ステロイド系消炎鎮痛剤としては、イブプロフェン、ケトプロフェン、インドメタシン、ナプロキセン、ピロキシカム等を挙げることができる。
また、ＰＤＥ４阻害剤を含有するマイクロスフェアの注射剤は、上記懸濁液のほか、用時調製用に、凝集防止剤およびマイクロスフェアを含有する固形製剤と分散剤および注射用蒸留水を組み合わせた注射剤キットとすることもできる。
【００４７】
キットに使用する固形製剤は、凝集防止剤を含む水溶液にマイクロスフェアを懸濁後、凍結乾燥、減圧乾燥、噴霧乾燥等することにより、調製することができ、とりわけ、凍結乾燥で調製するのが好ましい。
固形製剤の製造に際しては、注射用蒸留水への再分散性を向上させるために、凝集防止剤(マンニトール、ソルビトール、ラクトース、ブドウ糖、キシリトール、マルトース、ガラクトース、シュクロース等)を含む水溶液に分散剤を添加することもでき、分散性のよい固形剤とすることができる。必要に応じて、分散剤と共に、ステロイド系消炎鎮痛剤、非ステロイド系消炎鎮痛剤を組合わせた注射剤キットとすることもできる。
【００４８】
本発明のＰＤＥ４阻害剤を有効成分とする軟骨疾患修復治療用組成物は、各種温血哺乳動物、例えば、ヒト、家畜動物(ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ)、愛玩動物(イヌ、ネコ)等に用いることができ、軟骨疾患修復治療用組成物は、これらの動物における変形性関節症、軟骨形成異常症、変形性椎間板症、半月板損傷等の各種軟骨疾患の修復治療に使用することができ、とりわけ、変形性関節症の修復治療に好適に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】ウサギ関節軟骨細胞抽出液をＭｏｎｏＱセファロースカラムクロマトグラフィーで分離した各画分におけるｃＡＭＰ加水分解活性を示すグラフである(化合物番号(４４)存在下：○；化合物番号(４４)非存在下：●)。
【図２】化合物番号(１)含有マイクロスフェアまたは非含有マイクロスフェアの存在下での、老齢ウサギ関節軟骨の修復を観察した顕微鏡写真の模写図である。
【図３】ヒト関節軟骨細胞抽出液をＭｏｎｏＱセファロースカラムクロマトグラフィーで分離した各画分におけるｃＡＭＰまたはｃＧＭＰ加水分解活性を示すグラフである。
【図４】図３においてｃＡＭＰに対し強い加水分解活性を示した画分（フラクション番号２８〜３０ に対するＰＤＥ４阻害剤の阻害活性（ＩＣ５０）を示すグラフである。
【図５】実施例１、実施例２および実施例３のマイクロスフェアのインビトロでの薬物溶出特性を示すグラフである。
【図６】化合物番号(１)をラットに静脈内投与した場合の、血漿中濃度の経時変化を示すグラフである。データは平均値±標準偏差(例数：３)で示した。
【図７】実施例１−(５)、実施例２−(２)および実施例３−(２)で得られたマイクロスフェア分散液をラットに皮下注射した場合の血漿中濃度の経時変化を示すグラフである。データは平均値±標準偏差(例数：５)で示した。
【図８】実施例２−(２)で得られたマイクロスフェア分散液をラットに皮下注射した場合の製剤中に残存している化合物番号(１)の経時変化を示すグラフである。データは平均値±標準偏差(例数：５)で示した。
【図９】実施例６−(５)および実施例７−(２)で得られたマイクロスフェア分散液をラットに皮下注射した場合の製剤中に残存している化合物番号(２)の経時変化を示すグラフである。データは平均値±標準偏差(例数：４)で示した。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００５０】
つぎに、実験例、実施例および試験例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。なお、以下の実施例等において用いる化合物番号は前記化学構造式で示した好ましいＰＤＥ４阻害剤の具体例の化合物番号を意味する。
実験例１(関節軟骨細胞の基質産生増加)
(試験化合物)
化合物番号(１)(１０−５Ｍまたは１０−４Ｍ)；
化合物番号(２)(１０−６Ｍまたは１０−５Ｍ)；
化合物番号(９)(１０−６Ｍまたは１０−５Ｍ)；
化合物番号(１１)(１０−６Ｍ)；
化合物番号(２１)(１０−６Ｍまたは１０−５Ｍ)；
化合物番号(２７)(１０−６Ｍまたは１０−５Ｍ)；
化合物番号(４４)(１０−５Ｍまたは１０−４Ｍ)；
【００５１】
(関節軟骨細胞の分離・維持)
ＮＺＷ系ウサギ(北山ラベス；雄性；４週齡)４羽をエーテル麻酔後、放血致死させ、無菌的に大腿骨側の膝関節を得た。これをグルコース０.２％含有リン酸緩衝液(ｐＨ７.２)中に保存し、膝関節部の表層のみをメスで削り取り、グルコース０.２％含有リン酸緩衝液(ｐＨ７.２)を入れた５０ｍｌチューブに集めた。集められた関節表層をシャーレ上でカミソリを用いてできるだけ細かく切り刻み、１０ｘトリプシン−エチレンジアミンテトラ酢酸(ＥＤＴＡ)・４Ｎａ(ＧＩＢＣＯ製；カタログ番号１５４００−０５４)を含むグルコース０.２％含有リン酸緩衝液(５０ｍｌ、トリプシン１００ｍｇ含有、ＥＤＴＡ・４Ｎａ ４０ｍｇ含有；ｐＨ７.２)中、３７℃で１５分間振盪した。振盪後、遠心分離(１,４００ｒｐｍ)により、沈殿物を分取後、グルコース０.２％含有リン酸緩衝液４０ｍｌで２回洗浄した。洗浄後の沈殿物に細胞分散用コラゲナーゼ(和光純薬製；カタログ番号０３４−１０５３３)６０ｍｇを溶解した無血清α最小必須培地(ＭＥＭ：minimum essential medium)(ＧＩＢＣＯ製；カタログ番号１２５７１−０６３)４０ｍｌを添加し、これを滅菌済スターラー・バー入りの１００ｍｌビーカーに移した。スターラー・バーを回転させながら、３７℃のＣＯ２インキュベーターで約１時間コラゲナーゼ処理した。コラゲナーゼ処理物から４０μＭセルストレーナー（ＦＡＬＣＯＮ製；カタログ番号２３４０)により軟骨片を除去し、除去後の処理物に１０％ウシ胎仔血清(ＦＣＳ：fetal calf serum)含有αＭＥＭ培地１０ｍｌを添加し、遠心分離(１,４００ｒｐｍ)した。沈殿物を１０％ＦＣＳ−αＭＥＭ培地で２回洗浄し、同培地で適当な容量に懸濁し、この懸濁液を１ウェル当たり細胞数２万個となるようにコラーゲンタイプＩＩ(和光純薬製；カタログ番号０３３−１３９０１)コートプレート(４８ウェル)に播種した。翌日１０％ＦＣＳ−αＭＥＭ培地で培地交換した。
【００５２】
(基質産生増加)
上記操作で培地交換後、細胞がコンフルエントになった段階で、検体添加群には試験化合物含有培地(ビヒクルとしてジメチルスルホキシドを０.１％含有)で培地交換した。試験化合物を添加する際に用いる培地には、０.２ｍＭアスコルビン酸含有１０％ＦＣＳ−αＭＥＭ培地を用いた。最初の検体含有培地添加日をｄａｙ１とし、ｄａｙ３に再度同培地で培地交換し、ｄａｙ５まで培養を継続した。一方、検体非添加群には、試験化合物を含有しないこと(ビヒクルのみ含有)以外は全く同一の培地を同時期に添加し、同様に培養を行った。培養終了後、培養物から上清を除去し、パラホルムアルデヒドを４％の濃度に溶解した中性緩衝液０.２５ｍｌを添加して２時間細胞を固定した。リン酸緩衝液(ｐＨ７.２)１ｍｌで３回洗浄後、軟骨基質(プロテオグリカン)を選択的に着色するアルシアンブルー８ＧＸ(シグマ製；カタログ番号Ａ３１５７)を０.１％濃度に溶解した０.１Ｍ塩酸で４時間染色した。染色後、リン酸緩衝液(ｐＨ７.２)１ｍｌで３回洗浄し、６Ｍ塩酸グアニジン水溶液０.２５ｍｌで、軟骨基質を染色したアルシアンブルーを溶解し、その一部を用いて６２０ｎｍでの吸光度を測定した。この吸光度から染色に用いられたアルシアンブルー量を算出し、この量から基質(プロテオグリカン)の量を推定した。その結果を表１に示す。
【表１】
【００５３】
上記表１に示すとおり、ＰＤＥ４阻害活性を有する試験化合物(１)、(２)、(９)、(１１)、(２１)、(２７)および(４４)のすべてに基質産生増加作用が認められた。
実験例２(関節軟骨中に発現するｃＡＭＰ分解性ＰＤＥの分画)
ＮＺＷ系ウサギ(北山ラベス；雄性；４週齢)４羽をエーテル麻酔後、放血致死させ、無菌的に大腿骨側の膝関節を得た。これをグルコース０.２％含有リン酸緩衝液(ｐＨ７.２)中に保存し、膝関節部の表層のみをメスで削り取り、グルコース０.２％含有リン酸緩衝液(ｐＨ７.２)を入れた５０ｍｌチューブに集めた。集められた関節表層をシャーレ上でカミソリを用いてできるだけ細かく切り刻み、氷冷したリン酸塩緩衝液で洗浄した後、氷冷ホモジナイズ用緩衝液(２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.４、２ｍＭ酢酸マグネシウム、０.３ｍＭ塩化カルシウム、１ｍＭジチオスレイトール、４０μＭロイペプチン、１.３ｍＭベンズアミジン、０.２ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド、１ｍＭアジ化ナトリウム)中でホモジナイザー(Polytoron, Kinematica製)を用いて破砕した。得られたホモジネートを遠心(１０００００×ｇ、６０分間)し、上清を分取した。
【００５４】
溶出緩衝液(２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.４、１ｍＭ塩化カルシウム、１ｍＭジチオトレイトール、２μＭロイペプチン、５ｍＭベンズアミジン)で平衡化したＭｏｎｏＱセファロース高速カラム(Amersham Pharmacia Biotech社製)に、前記で得た上清を供した。カラムを溶出緩衝液２０ｍｌで洗浄した後、塩化ナトリウム勾配で蛋白を溶出し、氷冷下１ｍｌずつ分画した。各画分について、ｃＡＭＰを基質とする加水分解活性(ＰＤＥ活性)を測定した。
ＰＤＥ活性の測定は、ラジオラベル核酸法により行った。すなわち、１μＭの非標識ｃＡＭＰおよび２２ｎＭの［３Ｈ］−ｃＡＭＰ(Amersham Pharmacia Biotech社製)を含むアッセイ用緩衝液(５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８.０、５ｍＭ塩化マグネシウム、４ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０.３３ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン(脂肪酸不含、シグマ社製)、１ｍＭエチレングリコールビス(β−アミノエチルエーテル)−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−４酢酸)５００μｌ中に１０〜３０μｌの溶出画分を添加して反応を開始した。薬物非投与群は薬物を添加せず、薬物投与群には１×１０−５Ｍになるように化合物番号(４４)を添加した。３７℃で３０分間保温して反応を行った後、１.５分間煮沸して反応を停止させ、さらに１ｍｇ／ｍｌのヘビ毒(Crtalus atrox snake venom)１００μｌを添加して３７℃で３０分間保温した。ついで、５００μｌのメタノールを添加し、反応液をＤｏｗｅｘカラム(１ｘ８−４００)で処理した後、各溶出液に液体シンチレーションカクテルを加え、ラジオ活性を測定した。その結果を図１に示す。
【００５５】
図１に示されるとおり、ｃＡＭＰに対する強い加水分解活性の４つのピークが認められた。これらの４つのピークは、(１)ｃＡＭＰを選択的に加水分解すること、(２)そのｃＡＭＰ加水分解活性がｃＧＭＰによる影響を受けないこと、(３)選択的ＰＤＥ４阻害薬である化合物番号(４４)により強く阻害されること、という性質をみたすことから、ＰＤＥ４に由来するピークであると考えられた。ＰＤＥ４にはＰＤＥ４Ａ、ＰＤＥ４Ｂ、ＰＤＥ４Ｃ、ＰＤＥ４Ｄの４つのサブタイプが報告されており(サルドウら、セルラー・シグナリング［Cellular Signaling］、１０巻、４２７〜４４０頁、１９９８年)、４つのピークはこれらのサブタイプあるいはそれらから由来するスプラシンング変異体であると考えられた。
【００５６】
実験例３(軟骨基質タンパク遺伝子の発現)
最終濃度１×１０−４および１×１０−５Ｍの化合物番号(１)の存在下で実験例１と同じ方法によって４日間培養したウサギ膝関節軟骨細胞より、ＩＳＯＧＥＮ(ニッポンジーン社製)によって抽出した全ＲＮＡ１５μｇを４.５μｌの滅菌水に溶解した。この溶液と２μｌの５×ＭＯＰＳ緩衝液、３.５μｌのホルムアルデヒド、１０μｌのホルムアミドとを混合し、９０℃、１５分間熱変性した後、ホルムアルデヒド存在下で１％アガロースゲル上で電気泳動した。電気泳動終了後、ＲＮＡをナイロン膜(アマシャムファルマシア社製)へキャピラリー法にて一晩トランスファーを行った。ＵＶ架橋によりＲＮＡをナイロン膜に固定した後、５０ｍｌのハイブリダイゼーション溶液(６×ＳＳＣ、５×Denhardt's溶液、(５０％ホルムアミドはなし)、０.５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ熱変性サケ精子ＤＮＡ)中にて６０℃、２時間プレハイブリダイゼーションを行った。
【００５７】
次いでマウスＩＩ型コラーゲン遺伝子、ヒトアグリカン(プロテオグリカンを構成する代表的な蛋白)遺伝子のＤＮＡプローブを各々、α［３２Ｐ］ｄＣＴＰを用い、ランダムプライムラベリングキットＶｅｒ.２(アマシャムファルマシア社製)によって放射性標識した。各プローブ１×１０８ｄｐｍを各々、５ｍｌのハイブリダイゼーション溶液と共にプレハイブリダイゼーション処理したナイロン膜に加え、密封した後、６０℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。ナイロン膜の洗浄は０.２×ＳＳＣ、０.２％硫酸ドデシルナトリウムを含む溶液中で、６０℃、４０分間の洗浄操作を３回繰り返し行った。ナイロン膜オートラジオグラフィーに供し、Ｘ線フィルムをＬＡＳ−１０００(富士写真フィルム社製)によって撮影した。各ＲＮＡの相対量をImage Gause(富士写真フィルム社製)によって測定した後、２８ＳＲＮＡ(内因性ＲＮＡ：内部標準)によって補正し、非投与群の遺伝子発現の量を１００(％)として、試験化合物投与群の遺伝子発現の量を算出した。その結果を表２に示す。
【表２】
【００５８】
上記表２に示すとおり、ＰＤＥ４阻害薬である試験化合物(１)の添加群においては、ＩＩ型コラーゲン、アグリカン遺伝子の発現量は濃度依存的に増大していたことから、ＰＤＥ４阻害薬は関節軟骨細胞に作用し、関節軟骨基質の主要な成分であるＩＩ型コラーゲン、アグリカンの遺伝子発現を増大させることにより、軟骨基質の産生を促進することがわかった。
【００５９】
実験例４(老齢ウサギ膝関節軟骨基質増加)
(予備飼育)
老齢のＪＷ系ウサギ(北山ラベス；雄性；３７週齢)を室温(２３±２℃)、湿度(５０±２０％)で飼育した。市販の餌(オリエンタルバイオ製；ＣＥ−２)を自由摂取させた。
(関節軟骨基質増加)
上記ウサギをネンブタール(ダイナボット社製；５０ｍｇ／ｋｇ／ｍｌ)を耳静脈に注射し、麻酔した。左膝関節部の毛を剃り、７０％水性エタノールで消毒後、検体投与群には、関節内に、実施例２−(３)で製造した検体含有マイクロスフェア分散液２５０μｌ(薬物量：２.５ｍｇ)を１８ゲージの注射針(テルモ製)を用いて注入した。一方、検体非投与群には、関節内に、対照例１−(２)で製造した検体非含有マイクロスフェア分散液２５０μｌを注入した。投与から１４日後に、ウサギをネンブタール麻酔下で放血致死させ、膝関節を摘出し、ホルムアルデヒドを１０％の濃度に溶解した中性緩衝液で固定後、０.５Ｍ ＥＤＴＡ−４Ｎａ水溶液による脱灰処理を施し、切片を作成した。切片に軟骨基質(プロテオグリカン)を選択的に着色するアルシアンブルー８ＧＸ(シグマ製；Ａ３１５７)を０.１０％濃度に溶解した０.１Ｍ塩酸で染色し、検体投与群と検体非投与群の間の染色性を顕微鏡にて比較した。その結果、アルシアンブルーで染色される基質(プロテオグリカン)の層の厚さが検体投与群では検体非投与群の層の厚さの３倍以上となっていた。
【００６０】
実験例５(老齢ウサギ膝関節軟骨修復)
(予備飼育)
老齢のＪＷ系ウサギ(北山ラベス；雄性；３７週齢)を、ウサギ専用ケージ(Ｃ ｔｙｐｅ：Ｗ３７０×Ｄ５２０×Ｈ３３０)中、室温(２３±２℃)、湿度(５０±２０％)で飼育した。市販の餌(オリエンタルバイオ製；ＣＥ−２)を自由摂取させた。
(関節軟骨修復)
上記ウサギをネンブタール(アボット社製；５０ｍｇ／ｋｇ／ｍｌ)を耳静脈に注射し、麻酔した。左膝関節部の毛を剃り、７０％水性エタノールで消毒後、左膝正中靭帯を切開し、大腿骨頭および半月板を露出させ、周囲の血液は滅菌綿で止血した。大腿骨骨頭中間部の窪み(非荷重部)に直径２ｍｍ、深さ３ｍｍの穴をドリル(東洋アソシエイツ製；ミスターマイスター)を用いてあけた。滅菌生理食塩水で穿孔中に生じた骨片などを洗浄除去後、関節包、正中靭帯を絹糸で縫合し、滅菌綿で止血、消毒した。９日後、検体投与群には、関節内に、実施例２−(３)で製造した検体含有マイクロスフェア分散液２５０μｌ(薬物量：２.５ｍｇ)を１８ゲージの注射針(テルモ製)を用いて注入した。一方、検体非投与群には、関節内に、対照例１−(２)で製造した検体非含有マイクロスフェア分散液２５０μｌを注入した。投与から１４日後に、ウサギをネンブタール麻酔下で放血致死させ、膝関節を摘出し、ホルムアルデヒドを１０％の濃度に溶解した中性緩衝液で固定後、０.５Ｍ ＥＤＴＡ−４Ｎａ水溶液による脱灰処理を施し、切片を作成した。孔の修復度を顕微鏡で観察した。その結果を図２に示す。図２に示されるとおり、検体投与群は検体非投与群に比べ明らかに孔の修復が進んでいることが確認された。
【００６１】
実験例６(パパイン誘発変形性膝関節症に対する修復治癒効果)
(予備飼育)
日本白色種ウサギ(北山ラベス；雄性；１３週齡)を室温(２３±２℃)、湿度(５０±２０％)で８日間飼育した。飼育期間中、市販の餌(ＲＣ４ オリエンタル酵母)を１日約１４０ｇの割合で摂取させた。
(修復治癒効果)
上記ウサギにネンブタール(アボット：ｌｏｔ ７９１１０２)を耳静脈から注射し、麻酔した。ウサギの両膝部分の毛をかり、７０％エタノールで消毒した。両膝に０.８％パパイン(Ｍｅｒｃｋ ＥＣ３.４.２２.２ ｌｏｔ ５８７６４４ ０１９)生理食塩水溶液０.５ｍｌを５日間隔で２回注射した。二回目の注射から１週間後、検体投与群(左膝；１群４〜６匹)には、実施例２−(３)で製造したマイクロスフェア分散液(化合物番号(１)の化合物を０.２ｍｇまたは２ｍｇ含有)を関節内に注射した。一方、検体非投与群(右膝；１群４〜６匹)には対照例１−(２)で製造した薬物非含有マイクロスフェア分散液を検体投与群の分散液と同量関節内に注射した。また、アルツ投与群(左膝；１群２匹)には、１％ヒアルロン酸ナトリウム水溶液(科研製薬製アルツ)０.３ｍｌを関節内に注射した。一方、アルツ非投与群(右膝；１群２匹)には、０.３ｍｌの生理食塩水を関節内に注射した。アルツ投与群およびアルツ非投与群には、同様の関節内注射を１週間毎に、計４回ずつ行った。最終の注射から４週間後、ウサギをエーテル麻酔下で放血により安楽死させ、膝を摘出し、ホルムアルデヒドを１０％の濃度に溶解した中性緩衝液にて固定した。その結果、パパイン処置によって、関節軟骨表面の不整化、ヘマトキシリン・エオジン染色性の低下、軟骨基質の繊維化、関節軟骨細胞の消失などを特徴とする関節軟骨の変性が見られた。アルツ処理では、ヘマトキシリン・エオジン染色で若干の染色性低下の抑制はみられたものの、大幅な回復効果は見られなかった。一方、化合物番号(１)含有マイクロスフェア投与では、上記病理症状が著しく改善した。なお、検体非投与群およびアルツ非投与群のいずれにおいても回復効果は全く認められなかった。
【００６２】
実験例７（ヒト関節軟骨中に発現するｃＡＭＰ分解性ＰＤＥの分画）
ヒト変形性関節症患者の手術の際に摘出した膝関節軟骨から軟骨部分をメスで削り取り、氷冷したリン酸緩衝液で洗浄した後、−８０℃で保存した。軟骨を−８０℃で粉砕後、氷冷ホモジナイド緩衝液［２０ｍＭ Ｔris-ＨＣｌ、ｐＨ８.０、１ｍＭ エチレングリコールビス（β−アミノエチルエーテル）―Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ’−テトラ酢酸、１ｍＭ ジチオスレイトール、１０μｇ／ｍｌ ロイペプチン、５ｍＭ ベンズアミジン、０.２ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルオリド、１ｍＭ アジ化ナトリウム、５ｍＭ メルカプトエタノール］中で、ホモジナイザー（Kinematica製、Ｐｏｌｙｔｏrｏｎ）を用いて粉砕した。得られたホモジネートを遠心分離（１０００００×ｇ；３０分）して、上清を分取した。
溶出緩衝液［２０ｍＭ Ｔris-ＨＣｌ、ｐＨ８.０、１ｍＭ エチレングリコールビス（β−アミノエチルエーテル）―Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ’−テトラ酢酸、１ｍＭ ジチオスレイトール、２μｇ／ｍｌ ロイペプチン、５ｍＭ ベンズアミジン］で平衡化したＭｏnoＱセファロース高速カラム（Amasham Pharmacia Biotech社製）に、上記上清を導通した。カラムを溶出緩衝液２０ｍｌで洗浄後、塩化ナトリウム水溶液（濃度勾配：０〜１０００ｍＭ、７０ｍｌ）でタンパクを溶出し、氷冷下で１ｍｌずつ分画した。各分画について、ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰを基質とする加水分解活性（ＰＤＥ活性）を測定した。
【００６３】
ＰＤＥ活性の測定は、ラジオラベル核酸法により行った。すなわち、１μＭの非標識ｃＡＭＰおよび２２ｎＭの［３Ｈ］−ｃＡＭＰ（Amasham Pharmacia Biotech製）を含むアッセイ用緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８.０、５ｍＭ塩化マグネシウム、４ｍＭ ２−メルカプトエタノール）５００μｌ中に１０〜５０μｌの溶出画分を添加して反応を開始した。
３７℃で３０分間保温した後、１.５分間煮沸して反応を停止させ、更に、１ｍｇ／ｍｌのヘビ毒（Crtalus atrox snake venom）１００μｌを添加して、３７℃で３０分間保温した。ついで、５００μｌのメタノールを添加し、反応液をＤｏｗｅｘカラム（１×８−４００）で処理した後、溶液に液体シンチレーションカクテルを加え、ラジオ活性を測定した。結果を図３に示す。
【００６４】
図３に示されるように、ヒト変形性関節症患者の軟骨の処理液には、ｃＧＭＰに対する加水分解活性を有する画分は含まれていないが、ｃＡＭＰに対する強い加水分解活性を有する画分が含まれていることが判明した。
ｃＡＭＰに対する強い加水分解活性を有する画分（フラクション番号：２８〜３０に対するＰＤＥ４阻害剤の阻害活性を、前述のラジオラベル核酸法で測定した。試験化合物は、化合物番号（１）、化合物番号（２）、化合物番号（１１）、化合物番号（４４）、化合物番号（２７）である。
実験の結果、該画分の加水分解活性は化合物番号（１）および（２）、特に化合物番号（２）により強く阻害を受けることが確認された。また、Journal of Medicinal Chemistry vol. 42, 1088-1099 (1999)記載の方法で測定した、この画分に対する化合物番号（１）および（２）のＩＣ５０は同文献に記載されたＰＤＥ４阻害作用のＩＣ５０と一致した。結果を図４に示す。
【００６５】
実験例８（ヒト関節軟骨細胞における細胞内ｃＡＭＰ上昇）
（関節軟骨細胞の分離）
ヒト関節軟骨（変形性股関節症患者の関節軟骨）をリン酸緩衝液（ｐＨ７.２）中に浸し、関節部の表層のみをメスで削り取り、同緩衝液を入れた５０ｍｌチューブに集めた。集められた関節表層をシャーレ上でカミソリを用いてできるだけ細かく切り刻み、遠心管に移した。
【００６６】
ヒアルロニダーゼ（シグマ社製；カタログ番号Ｈ−３５０６）を１ｍｇ／ｍｌの濃度で含むリン酸緩衝液（ｐＨ７.２）を遠心管に入れ、３７℃で１５分間振盪した。遠心分離（２０００ｒｐｍ、５分間）により沈殿物を分取後、トリプシンを０.２５％の濃度で含むHank’s balanced salt solution（ＧＩＢＣＯ社製；カタログ番号１５０５０−０６５）に入れ、３７℃で３０分間振盪した。
遠心分離（２０００ｒｐｍ、５分間）により沈殿物を分取後、沈殿物に細胞分散用コラーゲナーゼ（和光純薬製；カタログ番号０３４−１０５３３）を０.２５％の濃度で、ウシ胎仔血清（ＧＩＢＣＯ社製；fetal calf serum；カタログ番号１００９９−１４１）を１０％の濃度で含有するα最小必須培地（ＧＩＢＣＯ社製；カタログ番号１２５７１−０６３）を添加し、３７℃で１晩振盪した。
【００６７】
４０μｍセルストレーナー（ＦＡＬＣＯＮ社製；カタログ番号２３４０）により軟骨片を除去し、除去後のコラーゲナーゼ処理物に、ウシ胎仔血清を１０％の濃度で含有するα最小必須培地を添加して遠心分離（１４００ｒｐｍ、１０分間）した。
ウシ胎仔血清を１０％の濃度で含有するα最小必須培地で沈殿物を３回洗浄後、同培地で適当な容量に懸濁し、この懸濁液を１ウエル当たり細胞数５００００個となるようにプレート（４８ウエル）に播種した。翌日、ウシ胎仔血清を１０％の濃度で含有するα最小必須培地で培地交換した。α最小必須培地は、抗生物質（１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧ、１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン）、抗真菌剤（０.２５μｇ／ｍｌアンフォテリシンＢ）（ＧIＢＣＯ社製；カタログ番号１５２４０−０６２）を添加したものを用いた。
【００６８】
（細胞内ｃＡＭＰ濃度上昇）
培地の交換後、細胞がコンフルエントになった段階で、検体添加群では、ＰＧＥ２（シグマ社製、カタログ番号Ｐ−０４０９）を１μＭの濃度で、検体化合物を１０−６Ｍ又は１０−５Ｍ濃度で添加した、ウシ胎仔血清を１０％の濃度で含有するα最小必須培地（ジメチルスルホキシド０.１％を含有）で培地交換した。一方、検体非添加群では、ＰＧＥ２（シグマ社製、カタログ番号Ｐ−０４０９）を１μＭの濃度で添加した、ウシ胎仔血清を１０％の濃度で含有するα最小必須培地（ジメチルスルホキシド０.１％を含有）で培地交換した。
３０分間培養後、培地を捨て、リン酸緩衝液（ｐＨ７.２）で洗浄し、５０％エタノール水溶液で３０分間処理後、エタノールを回収し、エタノール抽出物を蒸発乾固した。これをｃＡＭＰ ＥＩＡシステム（Amasham Pharmacia Biotech社製；カタログ番号ＲＰＮ２２５）に添付されたアッセイ用緩衝液に溶解し、同システムでｃＡＭＰ濃度を測定した。その結果を表３に示す。
【表３】
【００６９】
実験例９（ウサギ関節軟骨細胞のＩＬ−１存在下での基質産生）
ＮＺＷ系ウサギ（北山ラベス；雄性；４週齢）４羽をエーテル麻酔後、放血致死させ、無菌的に大腿骨側の膝関節を得た。これから、グルコースを０.２％含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７.２）中で、膝関節部の表層のみをメスで削り取り、グルコースを０.２％含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７.２）を入れたチューブに集めた。集められた関節表層をシャーレ上でカミソリを用いてできるだけ細かく切り刻み、１０ｘトリプシン−エチレンジアミンテトラ酢酸４ナトリウム（ＥＤＴＡ・４Ｎａ）（ＧＩＢＣＯ社製；カタログ番号１５４００−０５４）を添加した、グルコースを０.２％の濃度で含有するリン酸緩衝液（トリプシン１００ｍｇ、ＥＤＴＡ・４Ｎａ４０ｍｇ含有；ｐＨ７.２）５０ｍｌに加えて、３７℃で１５分間振盪した。
振盪後、遠心分離（１４００ｒｐｍ）して沈殿物を分取し、これをグルコースを０.２％含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７.２）４０ｍｌで２回洗浄した。
【００７０】
洗浄後の沈殿物に細胞分散用コラーゲナーゼ（和光純薬製；カタログ番号０３４−１０５３３）６０ｍｇを溶解した、抗生物質（２００Ｕ／ｍｌペニシリンＧ、２００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン）（ＧＩＢＣＯ社製；カタログ番号１５１４０−１２２）を含有するα最小必須培地（ＧＩＢＣＯ社製；カタログ番号１２５７１−０６３）４０ｍｌを添加し、これを滅菌済スターラー・バー入りの１００ｍｌビーカーに移した。
スターラー・バーを回転させながら、３７℃のＣＯ２インキュベーターで約３０分間培養後、デオキシリボヌクレアーゼＩ（宝酒造製；カタログ番号２２１０Ａ）を７０Ｕ／ｍｌとなるように添加し、同条件で、更に３０分間培養した。
培養物の上清を別容器に移し取り、残った軟骨片を新たに調製した、コラーゲナーゼ６０ｍｇを含み、デオキシリボヌクレアーゼＩを７０Ｕ／ｍｌの濃度で含有するα最小必須培地で、約３０分間培養した。
【００７１】
先に移し取った培養物上清及び最終培養物から４０μｍセルストレーナー（Falcon製；カタログ番号２３４０）で軟骨片を除去し、除去後の培養物に、ウシ胎仔血清（ＧＩＢＣＯ社製；fetal calf serum；カタログ番号１００９９−１４１）を１０％の濃度で含み、抗生物質（２００Ｕ／ｍｌペニシリンＧ、２００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン）（ＧＩＢＣＯ社製；カタログ番号１５１４０−１２２）を含有するα最小必須培地（ＧＩＢＣＯ社製；カタログ番号１２５７１−０６３）１０ｍｌを添加し、遠心分離（１４００ｒｐｍ，１０分間）を行った。
沈殿物を同様のウシ胎仔血清、抗生物質含有α最小必須培地で２回洗浄し、同培地で適当な容量に懸濁し、この懸濁液を１ウエル当たり細胞数２００００個となるようにプレート（４８ウエル）に播種した。翌日、同培地で培地交換を行った。
【００７２】
（基質産生増加）
上記培地交換後、細胞がコンフルエントになった段階で、検体投与群には、１ｎｇ／ｍｌのリコンビナントヒトIL−1β（PEPRO TECH製；カタログ番号２００−０１B）と検体化合物を含有した培地（ジメチルスルホキシドを０.１％の濃度で含有）で培地交換した。この培地にはアスコルビン酸を０.２ｍＭの濃度で含む、前記ウシ胎仔血清、抗生物質含有α最小必須培地を用いた。一方、検体非投与群は、検体化合物を含有しない以外は検体投与群と同様の培地で培地交換した。
最初のIL−１β含有培地添加日をｄａｙ１とし、ｄａｙ３まで培養した。
【００７３】
培養後、培養物から上清を除去し、１０％中性緩衝ホルマリン液（和光純薬製；カタログ番号０６０−０１６６７）０.２５ｍｌを添加して３０分間細胞を固定した。
固定した細胞をリン酸緩衝液（ｐＨ７.２）１ｍｌで３回洗浄後、基質（プロテオグリカン）を選択的に染色するアルシアンブルー８ＧＸ（シグマ社製；カタログ番号Ａ３１５７）を０.１％の濃度で含む０.１Ｍ塩酸で４時間染色した。
染色後、リン酸緩衝液（ｐＨ７.２）１ｍｌで３回洗浄し、６Ｍ塩酸グアニジン水溶液０.２５ｍｌで、軟骨基質を染色したアルシアンブルーを溶解した。その一部を用いて、６２０ｎｍでの吸光度を測定し、この吸光度から染色に用いられたアルシアンブルー量を算出した。このアルシアンブルー量から基質（プロテオグリカン）量を推定した。検体を添加しない場合のプロテオグリカン産生量を１００％として、相対比率を示した。結果を表４に示す。
【表４】
【００７４】
表４に示すとおり、ＩＬ−１の存在下、ＰＤＥ４阻害作用を有する試験化合物は基質産生を促進した。ＩＬ−１は、変形性関節症の滑液や軟骨細胞に発現していること、および軟骨基質であるプロテオグリカン等の基質分解酵素であるＭＭＰ（matrix metalloproteinase）の産生や合成を誘導することなどから、軟骨基質分解に重要な役割を果たしていると考えられている(The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, vol 277, p1672-1675 (1996)；Journal of Biochemistry, vol 123, p431-439 (1998); Arthritis & Rheumatism, vol 44, p585-594 (2001)。従って、上記の結果は本発明組成物の有効成分であるＰＤＥ４阻害剤が、ＩＬ−１が関与する軟骨基質分解を阻害しうることを示唆している。
【００７５】
実験例１０(内側半月板部分切除／両側側副靭帯切除により誘発される変形性膝関節症に対する修復治療効果)
(予備飼育)
日本白色ウサギ(雄性；１０週齢；１群７匹)を、室温(２３±２℃)、湿度(５５±１５％)で１６日間飼育した。飼育期間中、市販の餌(オリエンタルバイオ製；LRC4)を自由摂取させた。
【００７６】
(変形性膝関節症治癒)
エーテル麻酔下で、上記ウサギ右膝関節を切開し、内側半月板の1/2部分を両鋭小直剪刀を用いて切除した。同時に両側側副靭帯を切断した。術後筋肉と表皮を縫合し、消毒を行った。施術後2週間後に、エーテル麻酔下、検体投与群（１群：７匹）には、それぞれ，化合物番号（２）１μｇを含む実施例７−（１）で製造したマイクロスフェアを関節腔内に投与した。検体非投与群（１群：７匹）には、対照例２で製造した薬物非含有マイクロスフェアを同量投与した。術後６週間後に、もう一度、上記薬物含有及び非含有マイクロスフェアを投与した。施術後、１０週間後にエーテル麻酔下で開腹、放血により安楽死させ脛骨近位端を摘出した。摘出した脛骨近位端に墨汁を塗布して１０％中性緩衝ホルマリン溶液に浸漬固定した。
【００７７】
（実験結果）
ホルマリンで固定した脛骨近位端の余分な墨汁を抜き取り、真上方向から実体顕微鏡（オリンパス社製、モデルSZX12-3111)を用いて脛骨表面の画像を画像解析装置（IMAGING RESEARCH 社製 MCIDイメージングアナライザー）に取込んだ。同解析装置を用いて、内側の墨汁が残存している部分の面積（変性部面積）を測定した。同時に、内側全体の面積を測定し、変性部面積の内側全体の面積に対する割合（変性部面積率）を百分率で算出した。
結果を表５に示す。
【表５】
【００７８】
実施例１
(１)化合物番号(１)０.１ｇおよび乳酸−グリコール酸共重合体(乳酸／グリコール酸＝５０／５０；平均分子量２００００；ＰＬＧＡ５０２０：和光純薬製)１.９ｇに塩化メチレン４.０ｇを添加し、３０分間振盪溶解することにより油相(Ｏ)を形成した。
(２)油相を０.５％ポリビニルアルコール(ポバールＰＶＡ−２２０Ｃ：クラレ製)水溶液８ｍｌに加え、ホモジナイザー(Polytoron:Kinematica製)を用いて２５℃で５分間乳化することにより、水相に油相が分散した乳化液(Ｏ／Ｗ)を製造した。
(３)この乳化液を精製水１０００ｍｌに添加し、スリーワンモーター(新東科学製)を用いて４００ｒｐｍで攪拌しながら、２５℃で３時間液中乾燥することにより塩化メチレンを除去した。
(４)生成するマイクロスフェア懸濁液から、目開き１５０μｍのフィルターを通して凝集物を除去し、目開き２０μｍのフィルターで吸引濾過することにより水相を除去した。得られたマイクロスフェアに少量の精製水を添加し、凍結乾燥することにより、マイクロスフェア１.６ｇを得た。
【００７９】
得られたマイクロスフェア１０ｍｇをアセトニトリル３ｍｌに溶解し、０.５Ｍ塩化ナトリウム水溶液７ｍｌを加えてミキサー(Touch mixer MT-51:Yamato製)にて攪拌後、２０００ｒｐｍで５分遠心分離し、上清を分取した。上清の一部をＦＬ−ＨＰＬＣ(カラム；Hypersil 5-ODS 直径４ｍｍ、長さ３００ｍｍ：ジーエルサイエンス製、励起波長：３１５ｎｍ、蛍光波長：４６５ｎｍ)にかけ、別途作成した薬物溶液の検量線からこれに含まれる薬物量を測定し、これと上清量とからマイクロスフェア中の薬物含有量を算出した。その結果、薬物の含有量は４.２１％であった。
また、得られたマイクロスフェアをポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル(Ｔｗｅｅｎ８０：日光ケミカルズ製)の希薄溶液に適量分散させ、粒度分布測定装置ＳＡＬＤ−１１００(島津製)にて粒度分布を測定し、平均粒子径を算出した。その結果、平均粒子径は５７μｍであった。
【００８０】
(５)上記(４)で得られたマイクロスフェアを、カルボキシメチルセルロースナトリウム(ニチリン化学工業製)を０.５％、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル(Ｔｗｅｅｎ８０：日光ケミカルズ製)を０.１％含む生理食塩水(分散媒)に２.５ｍｇ／ｍｌの薬物割合となるように添加し、ミキサー(Touch mixer MT-51:Yamato製)にて、十分攪拌することにより、マイクロスフェア分散液を調製した。
【００８１】
実施例２
(１)乳酸−グリコール酸共重合体(乳酸／グリコール酸＝５０／５０；平均分子量２００００；ＰＬＧＡ５０２０：和光純薬)０.５７ｇと乳酸重合体(平均分子量２００００；ＰＬＡ００２０：和光純薬製)１.３３ｇを混合して用いること以外は、実施例１−(１)〜(４)と同様にして、マイクロスフェア１.６ｇを得た。
実施例１−(４)と同様にしてマイクロスフェア中の薬物含有量および平均粒子径を測定した。その結果、薬物含有量は３.７０％、平均粒子径は４７.７μｍであった。
(２)上記(１)で得られたマイクロスフェアを実施例１−(５)と同様に処理してマイクロスフェア分散液(薬物割合：２.５ｍｇ／ｍｌ)を調製した。
(３)上記(１)で得られたマイクロスフェアを実施例１−(５)と同様にしてマイクロスフェア分散液(薬物割合：１０.０ｍｇ／ｍｌ)を調製した。
【００８２】
実施例３
(１)乳酸重合体(平均分子量２００００；ＰＬＡ００２０：和光純薬製))を用いること以外は、実施例１−(１)〜(４)と同様にして、マイクロスフェア１.５ｇを得た。
実施例１−(４)と同様にしてマイクロスフェア中の薬物含有量および平均粒子径を測定した。その結果、薬物含有量は３.７３％、平均粒子径は５２.２μｍであった。
(２)上記(１)で得られたマイクロスフェアを実施例１−(５)と同様に処理してマイクロスフェア分散液(薬物割合：２.５ｍｇ／ｍｌ)を調製した。
【００８３】
実施例４
(１)化合物番号(１)０.２ｇおよび乳酸重合体(平均分子量２００００；ＰＬＡ００２０：和光純薬製)０.３ｇに塩化メチレン１.０ｇを添加し、ミキサー(Touch mixer MT-51:Yamato製)にて十分攪拌、溶解することにより、油相(Ｏ)を形成した。
(２)油相を０.２５％メチルセルロース(メトローズ：信越化学社製)水溶液４ｍｌに加え、ホモジナイザー(Polytoron:Kinematica製)を用いて２５℃で５分間乳化することにより、水相に油相が分散した乳化液(Ｏ／Ｗ)を製造した。
(３)この乳化液を精製水４００ｍｌに添加し、スリーワンモーター(新東科学製)を用いて４００ｒｐｍで攪拌しながら、２５℃で３時間液中乾燥することにより塩化メチレンを除去した。
(４)生成するマイクロスフェア懸濁液から、目開き１５０μｍのフィルターを通して凝集物を除去し、目開き２０μｍのフィルターで吸引濾過することにより水相を除去した。得られたマイクロスフェアに少量の精製水を添加して凍結乾燥することでマイクロスフェアを得た。実施例１−(４)と同様にしてマイクロスフェア中の薬物含有量および平均粒子径を測定した。その結果、薬物含有量は３９.６％、平均粒子径は３３.４μｍであった。
【００８４】
実施例５
(１)化合物番号(１)０.０５ｇおよび乳酸−グリコール酸共重合体(乳酸／グリコール酸＝５０／５０；平均分子量２００００；Ｒ２０２Ｈ：ベーリンガーインゲルハイム社製)０.４５ｇに塩化メチレン１.０ｇを添加し、ミキサー(Touch mixer MT-51:Yamato製)にて十分攪拌、溶解することにより、油相(Ｏ)を形成した。
(２)油相を０.５％ポリビニルアルコール(ゴセノールＥＧ−４０：日本合成化学工業製)水溶液４０ｍｌに加え、ホモジナイザー(Polytoron:Kinematica製)を用いて２５℃で４分間乳化することにより、水相に油相が分散した乳化液(Ｏ／Ｗ)を製造した。
(３)この乳化液を予め４００ｍｌの精製水を入れた円筒状密閉容器(内径１１０ｍｍ；内容積１０００ｍｌ)に注ぎ、スリーワンモーター(BL-600;HEIDON社製)に装着した直径５０ｍｍの４枚攪拌羽根(プロペラＲ型；HEIDON社製)により２５℃、４００ｒｐｍで攪拌すると同時に、容器内に挿入した円筒型シリコーンゴム製中空糸膜モジュール(永柳工業株式会社製)を用い、中空糸の内側に窒素ガスを通気して容器内から塩化メチレンを除去した。この際の窒素ガス通気速度は２Ｌ／分とした。この操作を１時間行った。
【００８５】
なお、円筒型シリコーンゴム製中空膜糸モジュールとしては、次の仕様を有するNAGASEP M60-1800円筒型を使用した。
円筒の直径 ：１００ｍｍ
円筒の長さ ：１２０ｍｍ×１２０ｍｍ
中空糸膜の膜厚 ：６０μｍ
中空糸膜の内径 ：２００μｍ
中空糸膜の外径 ：３２０μｍ
中空糸の本数 ：１８００
中空糸膜の有効膜面積：０.１５ｍ２
【００８６】
(４)生成するマイクロスフェア懸濁液から、目開き１５０μｍのフィルターを通して凝集物を除去し、目開き２０μｍのフィルターで吸引濾過することにより水相を除去した。得られたマイクロスフェアに少量の精製水を添加して凍結乾燥することでマイクロスフェアを０.２６ｇ得た。実施例１−(４)と同様にしてマイクロスフェア中の薬物含有量および平均粒子径を測定した。その結果、薬物含有量は３.０７％、平均粒子径は７１.７μｍであった。
【００８７】
実施例６
(１)化合物番号(２)０.０５ｇおよび乳酸−グリコール酸共重合体(乳酸／グリコール酸＝５０／５０；平均分子量２００００；ＲＧ５０２Ｈ：ベーリンガーインゲルハイム社製)０.４５ｇに塩化メチレン２.５ｇを添加し、ミキサー(Touch mixer MT-51：Yamato製)にて十分攪拌、溶解することにより、油相(Ｏ)を形成した。
(２)油相を０.５％ポリビニルアルコール(ポバールＰＶＡ−２２０Ｃ：クラレ製)水溶液３ｍｌに加え、ホモジナイザー(Polytoron:Kinematica製)を用いて２２℃で５分間乳化することにより、水相に油相が分散した乳化液(Ｏ／Ｗ)を製造した。
(３)上記(１)および(２)の操作を５回繰り返し、得られた乳化液(５回分)を併せた上で、精製水１０００ｍｌに添加し、スリーワンモーター(新東科学製)を用いて４００ｒｐｍで攪拌しながら、２５℃で１時間３０分、次いで４０℃で１時間、２５℃で３０分間液中乾燥することにより塩化メチレンを除去した。
(４)生成するマイクロスフェア懸濁液から、目開き１５０μｍのフィルターを通して凝集物を除去し、目開き２０μｍのフィルターで吸引濾過することにより水相を除去した。得られたマイクロスフェアに少量の精製水を添加して凍結乾燥することでマイクロスフェア２.３ｇを採取した。
【００８８】
得られたマイクロスフェア１０ｍｇをアセトニトリル３ｍｌに溶解し、０.５Ｍ塩化ナトリウム水溶液６ｍｌを加えてミキサー(Touch mixer MT-51:Yamato製)にて攪拌後、２０００ｒｐｍで５分遠心分離し、上清を分取した。上清の一部をＵＶ−ＨＰＬＣ(カラム；Hypersil 5-ODS 直径４ｍｍ、長さ３００ｍｍ：ジーエルサイエンス製、測定波長：２４０ｎｍ)にかけ、別途作成した薬物溶液の検量線からこれに含まれる薬物量を測定し、これと上清量とからマイクロスフェア中の薬物含有量を算出した。また、実施例１−(４)と同様にして平均粒子径を測定した。その結果、薬物含有量は９.９％、平均粒子径は２６.４μｍであった。
(５)上記(４)で得られたマイクロスフェアを実施例１−(５)と同様に処理してマイクロスフェア分散液(薬物割合：０.１ｍｇ／ｍｌ)を調製した。
【００８９】
実施例７
(１)乳酸−グリコール酸共重合体(乳酸／グリコール酸＝７５／２５；平均分子量２００００；ＰＬＧＡ７５２０：和光純薬製)を用いること、ならびに塩化メチレンの添加量を２.０ｇとする以外は、実施例６−(１)〜(４)と同様にして、マイクロスフェア２.２ｇを得た。
実施例６−(４)と同様にしてマイクロスフェア中の薬物含有量および平均粒子径を測定した。その結果、薬物含有量は１０.１％、平均粒子径は２７.０μｍであった。
(２)上記(１)で得られたマイクロスフェアを実施例６−(５)と同様に処理してマイクロスフェア分散液(薬物割合：０.１ｍｇ／ｍｌ)を調製した。
【００９０】
対照例１(実施例２の対照)
(１) 乳酸−グリコール酸共重合体(乳酸／グリコール酸＝５０／５０；平均分子量２００００；ＰＬＧＡ５０２０：和光純薬)０.６ｇと乳酸重合体(平均分子量２００００)１.４ｇに塩化メチレン４.０ｇを添加し、３０分間振盪溶解することにより油相(Ｏ)を形成する。以下、実施例１−(１)〜(４)と同様にして、薬物を含まないマイクロスフェア１.７ｇを得た。
(２)上記(１)で得られたマイクロスフェアを実施例１−(５)と同様にして、マイクロスフェア分散液(分散液中のマイクロスフェア分散濃度は実施例２−(３)と同一)を調製した。
対照例２(実施例７の対照)
乳酸−グリコール酸共重合体(乳酸／グリコール酸＝７５／２５；平均分子量２００００；ＰＬＧＡ７５２０：和光純薬製)０.４５ｇに塩化メチレン２.０ｇを添加し、ミキサー(Touch mixer MT-51:Yamato製)にて十分攪拌、溶解することにより、油相を形成した。以下、実施例６−(２)〜(４)と同様にして、薬物を含まないマイクロスフェア２.２ｇを得た。
【００９１】
試験例１
試験管にマイクロスフェア１０ｍｇを入れ、０.０５％ Ｔｗｅｅｎ８０含有リン酸緩衝液(ｐＨ７.４)の１０ｍｌを添加し、３７℃の空気恒温庫中の回転培養機にて２５ｒｐｍで攪拌した。攪拌開始時から一定時間後に、溶出液を遠心分離(２０００ｒｐｍ、５分)し、上清から９ｍｌをサンプリングして、ＦＬ−ＨＰＬＣ(カラム；Hypersil 5-ODS 直径４ｍｍ、長さ３００ｍｍ：ジーエルサイエンス製、励起波長：３１５ｎｍ、蛍光波長：４６５ｎｍ)にかけ、別途作成した薬物溶液の検量線からこれに含まれる薬物量を測定し、これとサンプリングの量とから薬物溶出量を算出した。
また、サンプリング後の試験管に、ｐＨ７.４リン酸緩衝液９ｍｌを添加し、同様の条件で攪拌、サンプリングして薬物溶出量を算出する操作を経時的に繰り返した。
【００９２】
最終のサンプリング後、試験管から残りの溶出液を除去し、残存するマイクロスフェア中に含まれる薬物量を実施例１−(４)の方法で測定した。
この操作を実施例１、実施例２ならびに実施例３で得られたマイクロスフェアについて行った。その結果を図５に示す。
なお、溶出した薬物量とマイクロスフェアに残存した薬物量の合計を１００％として、溶出率を算出した。
【００９３】
試験例２
ＳＤ系雄性ラット(７週令、１群３匹、日本ＳＬＣ)を１２時間照明、室温：２３±２℃、自由摂水・摂餌の条件下で１週間の馴化期間後、ポリエチレングリコール４００(和光純薬社製)を１０％含んだ生理食塩水に溶解した化合物番号(１)(１ｍｇ／ｍｌ)を１匹当たり０.５ｍｌ(総薬物投与量：０.５ｍｇ／ラット)の割合で大腿静脈から急速投与した。
薬物投与後、経時的にエーテル麻酔下で頚静脈よりヘパリンを添加した注射筒で血液を採取し遠心分離により血漿を得た。血漿０.１ｍｌに内部標準溶液と１Ｍのリン酸水素２カリウム０.２ｍｌを添加し、クロロホルム７.０ｍｌを添加後、１０分間振とう、５分間遠心分離して５ｍｌの有機相を分取した。採取した有機相を窒素気流下、４０℃で蒸発乾固し、移動相の０.５ｍｌで再溶解後にＦＬ−ＨＰＬＣ(カラム；Hypersil 5-ODS 直径４ｍｍ、長さ３００ｍｍ：ジーエルサイエンス製、励起波長：３１５ｎｍ、蛍光波長：４６５ｎｍ)により血漿中濃度を測定した。その結果を図６に示す。
【００９４】
試験例３
ＳＤ系雄性ラット(７週令、１群５匹、日本ＳＬＣ)を１２時間照明、室温：２３±２℃、自由摂水・摂餌の条件下で１週間の馴化期間後、実施例１−(５)、実施例２−(２)、実施例３−(２)で得られたマイクロスフェア分散液を１匹当たり２ｍｌ(総薬物投与量：５ｍｇ／ラット)の割合で背部皮下に投与した。薬物投与後、経時的にエーテル麻酔下で頚静脈よりヘパリンを添加した注射筒で血液を採取し遠心分離により血漿を得た。血漿中の化合物濃度は試験例２と同様の方法で測定した。ＰＤＥ４阻害剤をマイクロスフェア化することにより、ＰＤＥ４阻害剤を１／１０量しか含まない生理食塩水溶液を静脈注射した場合(試験例２)と比べても、ＰＤＥ４阻害剤の最高血漿中濃度を１／２５の１〜１／１００に抑制することが出来た。その結果を図７に示す。
【００９５】
試験例４
ＳＤ系雄性ラット(７週令、１群５匹、日本ＳＬＣ)を１２時間照明、室温：２３±２℃、自由摂水・摂餌の条件下で１週間の馴化期間後、実施例２−(２)で得られたマイクロスフェア分散液を１匹当たり２ｍｌ(総薬物投与量：５ｍｇ／ラット)の割合で背部皮下に投与した。
薬物投与３、７、１０、１４、２１、３５日後、投与部位よりマイクロスフェアを回収した。回収したマイクロスフェアに内部標準物質を含有したアセトニトリル５ｍｌを添加して、ホモジナイザー(Polytoron:Kinematica製)で溶解した。３０００ｒｐｍ、５分間遠心分離後の上清３ｍｌを採取し、０.５Ｍ塩化ナトリウム水溶液７ｍｌを加えてミキサー(Touch mixer MT-51:Yamato製)にて攪拌後、２０００ｒｐｍで５分遠心分離し、上清を分取した。上清の一部をＫＣプレップオムニ１３(片山化学社製)で濾過してＦＬ−ＨＰＬＣ(カラム；Hypersil 5-ODS 直径４ｍｍ、長さ３００ｍｍ：ジーエルサイエンス製、励起波長：３１５ｎｍ、蛍光波長：４６５ｎｍ)にかけ、別途作成した薬物溶液の検量線からこれに含まれる薬物量を測定し、これと上清量とからマイクロスフェア中の薬物残存量を算出した。その結果を図８に示す。
【００９６】
試験例５
ＳＤ系雄性ラット(７週令、日本ＳＬＣ)を１２時間照明、室温：２３±２℃、自由摂水・摂餌の条件下で１週間の馴化期間後、実施例６−(５)ならびに７−(２)で得られた化合物番号(２)含有マイクロスフェア分散液を１匹当たり１ｍｌ(総薬物投与量：０.１ｍｇ／ラット)の割合で背部皮下に投与した。
経時的に投与部位よりマイクロスフェアを回収し、アセトニトリル１０ｍｌを添加してホモジナイザー(Polytoron:Kinematica製)で溶解した。３０００ｒｐｍ、５分間遠心分離後の上清３ｍｌを採取し、０.５Ｍ塩化ナトリウム水溶液６ｍｌを加えてミキサー(Touch mixer MT-51:Yamato製)にて攪拌後、２０００ｒｐｍで５分遠心分離し、上清を分取した。上清の一部をＫＣプレップオムニ１３(片山化学社製)で濾過してＵＶ−ＨＰＬＣ(カラム；Hypersil 5-ODS 直径４ｍｍ、長さ３００ｍｍ：ジーエルサイエンス製、測定波長：２４０ｎｍ)にかけ、別途作成した薬物溶液の検量線からこれに含まれる薬物量を測定し、これと上清量とからマイクロスフェア中の薬物残存量を算出した。その結果を図９に示す。
【産業上の利用可能性】
【００９７】
従来、軟骨疾患については薬物療法では保存的治療しか行えないと考えられていたにも拘わらず、本発明の軟骨疾患修復治療用組成物は、ＰＤＥ４阻害剤を有効成分とし、特に、軟骨疾患部位に局所投与することにより、ＰＤＥ４阻害剤の全身作用による副作用を伴うことなく、軟骨を修復することができ、軟骨疾患、特に変形性関節症に修復治療効果を発揮する。また、ＰＤＥ４阻害剤と生体内適合性かつ生体内分解性ポリマーを含有する組成物をデポ剤の形とし、特にマイクロスフェア形態で注射剤として軟骨疾患部位に局所的に注射することにより持続的に効果を発揮することができ、さらに優れた効果が得られる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、軟骨疾患修復治療用組成物、さらに詳しくは、ホスホジエステラーゼ(ＰＤＥ)４阻害作用を有する化合物を有効成分とする、変形性関節症、軟骨形成異常症、変形性椎間板症、半月板損傷等の軟骨疾患を修復治療するための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
軟骨は、骨と共に骨格を形成したり、内臓を保護する役目を持つ、弾性力に富む組織であり、軟骨組織は軟骨細胞とそれを取り囲む軟骨基質とからなる。
軟骨は間葉由来の軟骨芽細胞が分裂増殖しながら周囲に基質を産生したものである。一方、軟骨基質は無定形基質と繊維成分とからなり、それらの組成比率の違いにより、(1)硝子軟骨(関節軟骨、肋軟骨、甲状軟骨等)、(2)線維軟骨(椎間円板、恥骨結合)、(3)弾性軟骨(咽頭蓋軟骨、外耳道軟骨、耳介軟骨等)の３種に分類される[医学大辞典(18版；南山堂発行)第１５４２頁]。
【０００３】
軟骨基質の主成分は、プロテオグリカンおよびコラーゲン(ＩＩ型、ＩＸ型等)であり、プロテオグリカンは軟骨組織特有の膨潤性に関与し、コラーゲン線維は軟骨の張力および剪断力に対する剛性に関与することが知られている。
軟骨基質中のプロテオグリカンでは、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸等のグルコサミノグリカンが分子量約２２万のコア蛋白に結合して巨大分子を形成したものとなっており、グルコサミノグリカンが多くの水分子を水和していることが、軟骨の膨潤性に寄与していると考えられている[ザ・ボーン(The Bone)第４巻第８頁(１９９４年)］。
【０００４】
このうち、関節軟骨は骨組織との移行部に石灰化層を有し、成長が完了した後には、血液の直接的な供給を殆ど受けることなく、軟骨細胞の栄養は関節液から供給される。また、関節軟骨は細胞分化度の高い硝子軟骨から形成されており、再生能力の極度に低いデリケートな組織である。
この関節軟骨の表面を粘稠性の高い滑液が覆い、ヒアルロン酸・蛋白複合体を主役とした潤滑液による潤滑機構が働き、滑らかな関節運動が維持されているが、関節軟骨には所謂耐用年数が存在すると考えられており、老化に伴う関節変化は必発する避けがたい生理的現象である。
【０００５】
軟骨の障害に起因する疾患としては、例えば、変形性関節症をはじめとして、軟骨形成異常症、変形性椎間板症、半月板損傷等が知られている。
このうち、変形性関節症は、関節を構成する組織、主に、関節軟骨の退行性変化を基に、骨・軟骨の増殖性変化を来し、最終的には関節の形態が著明に変化するに至る疾患であるが、人口の高齢化に伴って増加しており、中でも膝関節症は病態の進行と共に、立位保持、歩行動作が障害されて日常動作能力(Ability of Daily Life; ＡＤＬ)の著しい低下を引き起こし、寝たきり状態の原因となることもある。
【０００６】
変形性関節症の治療は大きく、保存的治療と手術療法に分けられており、保存的治療として、(1)非ステロイド性消炎鎮痛剤の投与、(2)温熱療法、(3)体重のコントロール、(4)装具療法、(5)ステロイド性消炎鎮痛剤の関節内注入、(6)ヒアルロン酸製剤の関節内注入等が行われている。また、保存療法が奏効しない症例や進行例、末期例に対しては、手術療法として、(1)関節鏡視下洗浄、(2)脛骨高位骨切り術、(3)人工関節置換等が行われている［老化と疾患第１０巻、第２号、６１〜６９頁(１９９７年)＆第６号、第６６〜７７頁(１９９７年)］。
一方、ＰＤＥ４阻害作用を有する化合物は種々知られており、ＰＤＥ４の作用を阻害することにより、炎症性メディエイターの放出を阻害できる[ジャーナル・オブ・モレキュラー・アンド・セルラー・カーディオロジー(J. Mol. Cell. Cardiol.)12(Suppl. II), S61 (1989年)]。
【０００７】
また、ＰＤＥ４阻害作用を有する化合物が、免疫刺激剤に応答して単核食細胞により放出されるサイトカインであるＴＮＦ-αの産生を抑制し、ＴＮＦ−αによって引き起こされる各種炎症性疾患の治療に有用であることが記載されている〔特表２０００−５０３６７８号、特表２０００−５０２７２４号、特表２０００−５１０１０５号、特表２０００−５１４８０４号、特表２０００−５０２３５０号、特表２０００−５０１７４１号〕。しかし、ＰＤＥ４阻害剤が軟骨疾患の修復治療に有効であることは全く知られていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述したように、軟骨は再生能力が極めて低く、一度損傷するとその修復は殆ど不可能に近いと考えられており、従来の薬物療法はその進行を抑制する保存的治療に過ぎなかった。従って、その軟骨疾患の修復治療を可能にする薬物療法および／または医薬品の開発が永年求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、軟骨細胞においてＰＤＥ４が産生されていることを見出し、ＰＤＥ４阻害作用を有する化合物が、軟骨疾患に対して活性を示すことを知り、研究を重ねたところ、該ＰＤＥ４阻害作用を有する化合物が軟骨疾患の修復治療に有用であることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、ＰＤＥ４阻害剤を有効成分とする軟骨疾患修復治療用組成物を提供するものである。本発明は、特に、軟骨疾患部位に局所的に適用するのに適した製剤、特にマイクロスフェア形態の、軟骨疾患修復治療用組成物を提供するものである。
【００１０】
本発明の軟骨疾患修復治療用組成物は、軟骨、とりわけ、再生能力が極度に低い関節軟骨に対し、軟骨基質蛋白の遺伝子発現を増大させることにより、優れた基質産生促進作用を有し、軟骨の修復により、軟骨の疾患を治療することができる。
ここに、軟骨疾患の修復治療とは、軟骨疾患の悪化を抑制するのみならず、疾患、傷害等により、変形・磨耗した軟骨を元の形に修復する治療を意味するものである。
【００１１】
本発明の医薬組成物は、ＰＤＥ４阻害剤を有効成分とし、これに通常の医薬用賦形剤または希釈剤を配合して調製される。好ましい医薬組成物は、ＰＤＥ４阻害剤と生体内適合性かつ生体内分解性ポリマーとを含有する徐放性の局所投与用の組成物である。該局所投与性組成物は、デポ剤(depot formulation)の形態とするのが好ましく、さらに、マイクロスフェア形態とすることが好ましく、そのマイクロスフェアは注射剤の形態とすることもできる。
【００１２】
本発明の医薬組成物において、活性成分として用いられるＰＤＥ４阻害剤としては、ＰＤＥ４阻害活性を有する化合物がすべて含まれ、例えば、特開平５−２２９９８７号、特開平９−５９２５５号、特開平１０−２２６６８５号、欧州公開Ｎｏ.１５８３８０、国際公開Ｎｏ.９４／２５４３７、米国特許Ｎｏ.５２２３５０４、国際公開Ｎｏ.９５／４０４５、欧州公開Ｎｏ.４９７５６４、欧州公開Ｎｏ.５６９４１４、欧州公開Ｎｏ.６２３６０７、欧州公開Ｎｏ.１６３９６５、米国特許Ｎｏ.５６０５９１４、国際公開Ｎｏ.９５／３５２８２、国際公開Ｎｏ.９６／２１５、米国特許Ｎｏ.５８０４５８８、米国特許Ｎｏ.５５５２４３８、国際公開Ｎｏ.９３／９１１８、国際公開Ｎｏ.９６／３１４８５、欧州公開Ｎｏ.４５９５０５、国際公開Ｎｏ.９７／２２５８５、欧州公開Ｎｏ.７３８７１５、国際公開Ｎｏ.９１／１６３１４、国際公開Ｎｏ.９６／２１８、国際公開Ｎｏ.９７／１８２０８、欧州公開Ｎｏ.１５８３８０、国際公開Ｎｏ.９９／５０２７０、欧州公開Ｎｏ.２６０８１７、国際公開Ｎｏ.９８／１１１１３、国際公開Ｎｏ.９４／２２８５２、欧州公開Ｎｏ.４３２８５６、米国特許Ｎｏ.４１９３９２６、国際公開Ｎｏ.９８／１３３４８、国際公開Ｎｏ.９６／６８４３、特表２０００−５０３６７８号(＝国際公開Ｎｏ.９８／１４４３２)、特表２０００−５０２７２４号(＝国際公開Ｎｏ.９８／９９６１)、特表２０００−５１０１０５号(＝国際公開Ｎｏ.９７／４００３２)、特表２０００−５１４８０４号(＝国際公開Ｎｏ.９８／２４４０)、特表２０００−５０２３５０号(＝国際公開Ｎｏ.９７／２３４５７)、特表２０００−５０１７４１号(＝国際公開Ｎｏ.９７／２５８５)等に記載の化合物が挙げられる。
【００１３】
本発明の軟骨疾患修復治療用組成物に適したＰＤＥ４阻害剤は、トレンズ・イン・ファーマコロジカル・サイエンシーズ(Trends in Pharmacological Sciences)１１巻１５０〜１５５頁の記載に従って分類したＰＤＥ１〜５のうち、ＰＤＥ４に対して他のＰＤＥ(ＰＤＥ１〜３および５)に対するよりもより強い阻害作用を有する選択的ＰＤＥ４阻害剤が好ましく、ＰＤＥ４に対する阻害作用が他のＰＤＥに対するよりも１０倍以上強いものが好ましい。より好ましいものは、他のＰＤＥに対するよりも５０倍以上、さらに好ましくは１００倍以上の阻害作用を有するものである。
好ましいＰＤＥ４阻害剤は、アドバンシーズ・イン・サイクリック・ヌクレオチド・リサーチ(Advances in Cyclic Nucleotide Research)１０巻、６９〜９２頁[１９７９年レイベン・プレス(Raven Press)発行]記載の方法に準じて測定したＰＤＥ４阻害活性のＩＣ５０が０.１〜１０００ｎＭ、好ましくは０.１〜１００ｎＭの化合物である。より好ましくは、ＩＣ５０は１００ｎＭ未満である。
【００１４】
選択的ＰＤＥ４阻害剤の具体例としては、下記構造で示される化合物番号(１)〜(５７）の化合物またはその薬理的に許容し得る塩が挙げられる。
【化１】
【化２】
【化３】
【化４】
【化５】
【化６】
【化７】
【化８】
【化９】
【化１０】
【化１１】
【化１２】
【化１３】
【化１４】
【化１５】
【化１６】
【化１７】
【化１８】
【化１９】
【化２０】
【化２１】
【化２２】
【化２３】
【化２４】
【化２５】
【化２６】
【化２７】
【化２８】
【化２９】
【００１５】
ＰＤＥ４阻害活性を有する化合物は、化学構造上から、次の(Ａ)〜(Ｄ)に分けることが出来、それらのうちから適宜選択されるが、本発明におけるＰＤＥ４阻害剤としては、(Ａ)および(Ｂ)の化合物が好ましく、(Ａ)の化合物がとりわけ好ましい。
(Ａ) ナフタレン骨格またはこれに類似する部分構造を有する化合物[例えば、化合物番号(１)、(２)、(３８)、(４７)、(５２)〜(５７)]、
(Ｂ) ３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシフェニル構造またはこれに類似する部分構造を有する化合物[例えば、化合物番号(６)、(９)、(１１)、(１２)、(１４)、(１７)、(１９)、(２０)、(２１)、(２４)、(２５)、(２６)、(２７)、(３３)、(３４)、(３５)、(３９)、(４０)、(４４)、(４９)、(５０)、(５１)]、
(Ｃ) キサンチン骨格またはこれに類似する部分構造を有する化合物[例えば、化合物番号(５)、(７)、(２８)、(２９)、(３０)、(３１)、(３２)、(３６)、(３７)、(４１)、(４３)、(４６)]、および
(Ｄ) 上記(Ａ)〜(Ｃ)以外の構造を有する化合物[例えば、化合物番号(３)、(４)、(８)、(１０)、(１３)、(１５)、(１６)、(１８)、(２２)、(２３)、(４２)、(４５)、(４８)]
【００１６】
上記(Ａ)の化合物としては、例えば、下記一般式(Ｉ)〜(ＩＩＩ)で示される化合物およびそれらの薬理的に許容し得る塩を挙げることができる。
【化３０】
(式中、Ｒ1およびＲ２は同一または異なって、水素原子、水酸基、シクロ低級アルキルオキシ基、または置換基を有していてもよい低級アルコキシ基を表すか、或いは、互いに末端で結合して低級アルキレンジオキシ基を形成し、Ｒ３は置換基を有していてもよい含窒素複素６員環式基、−ＯＲ４およびＯＲ５は同一または異なって、保護されていてもよい水酸基を表す)(特開平５−２２９９８７号)
【００１７】
【化３１】
(式中、Ｒ1'およびＲ２'は同一または異なって水素原子または保護されていてもよい水酸基を表し、Ｒ３'およびＲ４'のいずれか一方が、保護されていてもよい水酸基置換メチル基、他方が水素原子、低級アルキル基または保護されていてもよい水酸基置換メチル基であり、Ｒ５'およびＲ６'は同一または異なって、水素原子、置換されていてもよい低級アルキル基、置換されていてもよいフェニル基または保護されていてもよいアミノ基を表すか、あるいは互いに末端で結合して隣接する窒素原子とともに置換されていてもよい複素環式基を形成している)(特開平９−５９２５５号)
【００１８】
【化３２】
(式中、Ａは式：
【化３３】
から選ばれるいずれか１つの基[但し、Ｒ1”およびＲ２”は同一または異なって、水素原子または保護されていてもよいヒドロキシ基、Ｒ３１は保護されていてもよいヒドロキシメチル基、Ｒ３２は水素原子、低級アルキル基または保護されていてもよいヒドロキシメチル基、Ｒ３３は置換基を有していてもよい低級アルキル基、Ｒ４１は保護されていてもよいヒドロキシメチル基、Ｒ４２は保護されていてもよいヒドロキシメチル基、点線は二重結合の存在または非存在を表す]を表し、Ｒ５”およびＲ６”は同一または異なって、水素原子または保護されていてもよいアミノ基を表すか、あるいは互いに末端で結合して隣接する窒素原子と共に置換されていてもよい複素環式基を形成している。)(特開平１０−２２６６８５号)
【００１９】
本発明の軟骨疾患修復治療用組成物の有効成分であるＰＤＥ４阻害剤としては、(Ａ)の化合物のうち、ナフタレン骨格またはイソキノリン骨格を有する化合物またはその薬理的に許容し得る塩がとりわけ好ましく、化合物番号(１)および(２)の化合物またはその薬理的に許容し得る塩がとりわけ好ましい。
ＰＤＥ４阻害剤が全身的に作用した場合には、投与量によっては嘔吐や胃酸分泌を引き起こすこともあるため[セルラー・シグナリング(Cellular Signaling)９(３−４)２２７〜２３６頁(１９９７年)]、本発明の軟骨疾患修復治療用組成物は疾患部位の近傍(とりわけ、関節軟骨の近傍)に、局所投与され、全身的な薬物の血中濃度を上昇させず、軟骨疾患部位での薬物濃度を維持するようにするのが望ましい。また、このような目的を達成するためには、徐放性とするのが望ましく、徐放性とすることにより、投与回数を少なくし、患者負担の軽減を図ることもできる。
【００２０】
本発明の組成物の好ましい形態としては、局所投与で薬物を徐々に放出するデポ剤(例えばペレット製剤、ゲル製剤、マトリックス製剤、マイクロスフェア製剤、生体内適合性かつ生体内分解性ポリマーの水溶液に薬物を添加して徐放化した製剤、投与時には溶液であるが、生体内に投与されることによってゲルを形成するように設計された製剤、一般に整形外科の領域での使用が報告されている種々基剤に封入した製剤等)が挙げられる。
ペレット剤としては、例えば、末端カルボキシル基がアルコールによりエステル化された乳酸−グリコール酸共重合体微粒子と薬物とを圧縮成型して得られる長期徐放性製剤(特開２００１−１８７７４９号）等を挙げることができる。
【００２１】
ゲル製剤としては、例えば、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース(Journal of Controlled Release) 59 (1999) 77-86記載の、ポリエチレングリコールを化学的に結合させたヒアルロン酸と薬物とをリン酸緩衝液に溶解させたゲル製剤等を挙げることができる。
マトリックス製剤としては、例えば、コラーゲンの粒状物質中または繊維膜中に薬物を含浸した製剤、コラーゲンの粒状物質中または繊維膜の調製中に薬物を添加して含有させた製剤(特開平１０−１８２４９９号、特開平６−３０５９８３号)等を挙げることが出来る。
【００２２】
生体内適合性かつ生体内分解性ポリマーの水溶液に薬物を添加して徐放化した製剤としては、例えば、ヒアルロン酸ナトリウムの水溶液に薬物を添加して徐放化した製剤等が考えられる。
投与時には溶液であるが、生体内に投与されることによってゲルを形成するように設計された製剤としては、例えば、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース(Journal of Controlled Release)33 (1995) 237-243 記載の、乳酸−グリコール酸共重合体と薬物とをＮ−メチル−２−ピロリドンに溶解させた製剤、同 27 (1993) 139-147 記載の、乳酸−グリコール酸共重合体とポリエチレングリコールとのブロック共重合体等の低温では溶液状態で存在するが、体温ではゲルとなる高分子と薬物を含有する製剤を挙げることができる。
【００２３】
一般に整形外科の領域で報告されている種々の基剤に封入した製剤としては、例えば、基剤(例えば、水難溶性の生体内適合性かつ生体内分解性ポリマー、ポリメチルメタクリレート、ヒドロキシアパタイト、トリカルシウムホスフェート等)と薬物とを混合して製造される製剤[バイオマテリアルズ(Biomaterials)２１巻、２４０５−２４１２頁(２０００年)、インターナショナル・ジャーナル・オブ・ファーマシューティクス(International Journal of Pharmaceutics）２０６巻１−１２頁(２０００年)]を挙げることができる。
軟骨疾患修復治療に要する期間における投与回数を少なくする上からは、局所投与により、有効量のＰＤＥ４阻害剤を徐々に障害を有する軟骨の近傍(とりわけ、関節軟骨の近傍)に放出するものが好ましい。
【００２４】
デポ剤の内、注射剤の形で局所に投与し易いマイクロスフェアの場合、注射針を通過する粒径であるのが好ましく、粒子径が０.０１〜１５０μｍ、とりわけ０.１〜１００μｍの範囲であるものが疾患部位への刺激を抑制できる点では好ましい。
本発明のＰＤＥ４阻害剤を有効成分とする軟骨疾患修復治療用組成物は、障害を有する軟骨の近傍(とりわけ、関節軟骨の近傍)に、局所的に投与することを考えれば、投与量を小さくするのが好ましく、組成物（例えばマイクロスフェア製剤）中のＰＤＥ４阻害剤の量は０.０００１〜８０％重量％とするのが好ましく、さらに好ましくは０.００１〜５０％重量、さらに好ましくは０.０１〜５０％重量である。有効成分としてのＰＤＥ４の投与量は、用いるＰＤＥ４阻害剤の種類、対象の体重、年齢、症状、適用部位等に応じて医師により適宜決定されるが、局所適用の場合、通常、疾患部位あたり１nｇ〜１gの範囲である。
【００２５】
本発明の軟骨疾患修復治療用組成物は、ＰＤＥ４阻害剤と薬理的に許容される賦形剤または希釈剤とから、常法に従って調製されるが、好ましい組成物は、ＰＤＥ４阻害剤と生体内適合性かつ生体内分解性ポリマーとを配合して調製される。
このうち、水難溶性の生体内適合性かつ生体内分解性ポリマーは、１ｇを溶解するのに、水(２５℃)が１０００ｍｌ以上必要となるような生体内適合性かつ生体内分解性ポリマーであり、具体的には、ヒドロキシ脂肪酸ポリエステルおよびその誘導体(例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリクエン酸、ポリリンゴ酸、ポリ−β−ヒドロキシ酪酸、ε−カプロラクトン開環重合体、乳酸−グリコール酸共重合体、２−ヒドロキシ酪酸−グリコール酸共重合体、ポリ乳酸とポリエチレングリコールとのブロック共重合体、ポリグリコール酸とポリエチレングリコールとのブロック共重合体、乳酸−グリコール酸共重合体とポリエチレングリコールとのブロック共重合体など)、α−シアノアクリル酸アルキルエステルのポリマー(例えば、ポリブチル−２−シアノアクリレートなど)、ポリアルキレンオキサレート(例えば、ポリトリメチレンオキサレート、ポリテトラメチレンオキサレートなど)、ポリオルソエステル、ポリカーボネート(例えば、ポリエチレンカーボネート、ポリエチレンプロピレンカーボネートなど)、ポリオルソカーボネート、ポリアミノ酸(例えば、ポリ−γ−Ｌ−アラニン、ポリ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸、ポリ−γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸など)、ヒアルロン酸エステルなどが挙げられ、これらの１種または２種以上を用いることができる。他の使用可能な生体内適合性かつ生体内分解性ポリマーとしては、ヒアルロン酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン等が挙げられる。
【００２６】
水難溶性の生体内適合性かつ生体内分解性ポリマーのうち、特に好ましいものはヒドロキシ脂肪酸のポリエステルである。それらは平均分子量が２０００〜約８０００００の範囲内、より好ましくは２０００〜約２０００００の範囲内のものが特に好適であり、平均分子量が５０００〜５００００の範囲のものが最も好適である。
また、上記ヒドロキシ脂肪酸のポリエステルのうち、更に好ましいのは、ポリ乳酸、乳酸−グリコール酸共重合体、２−ヒドロキシ酪酸−グリコール酸共重合体である。乳酸−グリコール酸共重合体における乳酸／グリコール酸のモル比は、好ましくは９０／１０〜３０／７０、より好ましくは８０／２０〜４０／６０であり、２−ヒドロキシ酪酸−グリコール酸共重合体における２−ヒドロキシ酪酸／グリコール酸のモル比は、好ましくは９０／１０〜３０／７０、より好ましくは８０／２０〜４０／６０である。
【００２７】
前記ＰＤＥ４阻害剤をデポ剤とするには、その形態に応じて、適宜製剤化することができ、必要に応じて、製剤化に先立ち、予めＰＤＥ４阻害剤を微粒子化してもよい。
ＰＤＥ４阻害剤を微粒子化するには、慣用の微粒子製法を適宜使用することができ、ジェットミル粉砕、ハンマーミル粉砕、回転ボールミル粉砕、振動ボールミル粉砕、ビーズミル粉砕、シェーカーミル粉砕、ロッドミル粉砕、チューブミル粉砕等により、物理的に粉砕する粉砕法や、薬物を一旦溶媒に溶解後、ｐＨ調整、温度変化、溶媒組成の変更等を行って、晶析させ、遠心分離あるいは濾過等の方法で回収するいわゆる晶析法を採用することができる。
【００２８】
本発明の医薬組成物の上記各種製剤を製造するには、ＰＤＥ４阻害剤に合わせて、既知の製法を適宜適用することができる。
例えば、マイクロスフェア製剤を製造するには次の方法が用いられる。また、ＰＤＥ４阻害剤が塩を形成しているために、マイクロスフェアへの取り込み率が悪い場合には、酸または塩基を用いて遊離の形に変換した後、マイクロスフェア化してもよい。
【００２９】
(１)水中乾燥法：
沸点が水より低く水と非混和性である有機溶媒に水難溶性の生体内適合性かつ生体内分解性ポリマーを溶解させた溶液(水難溶性ポリマー溶液)に薬物を含有させ、かくして得られる有機相を水相中に分散してＯ／Ｗ型エマルションを調製後に、該有機溶媒を除去する方法であり、例えば、特公昭５６−１９３２４号、特開昭６３−９１３２５号、特開平８−１５１３２１号、ジャインらの文献(Kajeev Jainら、"Controlled Drug Delivery by Biodegradable Poly(Ester) Devices: Different Preparative Approaches", Drug Development and Industrial Pharmacy、２４(８)巻、７０３−７２７頁、１９９８年)、特開昭６０−１００５１６号、特開昭６２−２０１８１６号、特開平９−２２１４１７号、および特開平６−２１１６４８号に記載の方法と同様にして行われる。
【００３０】
(２)相分離法：
水難溶性の生体内適合性かつ生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液に、薬物もしくは薬物水溶液を溶解・分散させ、これに硬化剤を撹拌下徐々に加え、析出固化させる方法であり、例えば特開昭６０−６７４１７号、米国特許第５５０３８５１号、米国特許第５０００８８６号、Eur. J. Pharm. Biopharm. ４２(１)巻、１６〜２４頁(１９９６年)および前記ジャインらの文献に記載の方法と同様にして行われる。
【００３１】
(３)噴霧乾燥法：
水難溶性の生体内適合性かつ生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液に、薬物を溶解・分散させるか、または薬物水溶液を分散させ、これをスプレーノズルでスプレードライヤー(噴霧乾燥器)の乾燥室内へ噴霧し、きわめて短時間に噴霧液滴内の有機溶媒を揮発させる方法であり、例えば、特開平１−１５５９４２号、特開平５−１９４２００号、特開平５−７０３６３号、特開平８−１５１３２１号、特開平９−２２１４１７号、米国特許第５９２２２５３号、「Spray Drying Handbook」(John Wiley & Sons, New York 1984)、ディージィの文献［Partick B. Deasy、「Microcapsulation and Related Drug Processes」(Marcel Dekker, Inc.、New York 1984)］、および前記ジャインらの文献などに記載の方法と同様にして行われる。
【００３２】
(４)溶媒拡散法：
薬物および水難溶解性の生体内適合性かつ生体内分解性ポリマーを溶解させた水混和性有機溶媒の溶液を、保護コロイド剤の水溶液に添加し、攪拌乳化して微粒子を得る方法であり、例えば、特開平５−５８８８２号、特開平９−１１０６７８号、インターナショナル・ジャーナル・オブ・ファーマシューティクス(International Journal of Pharmaceutics)１８７巻、１４３〜１５２(１９９９)に記載の方法と同様にして行われる。
上記「水中乾燥法」では、有機相の形態によって調製法が異なるが、いずれも常法にしたがって行うことができる。該有機相の形態としては以下のものが含まれる。
【００３３】
(ａ)水難溶性の生体内適合性かつ生体内分解性ポリマー溶液に、薬物が直接溶解もしくは分散されている有機相。これを水相中に分散するとＯ／Ｗ型エマルションとなる(特公昭５６−１９３２４号、特開昭６３−９１３２５号、特開平６−３２７３２号、特開平８−１５１３２１号、特開平６−３２７３２号、前記ジャインらの文献など)。
(ｂ)水難溶性の生体内適合性かつ生体内分解性ポリマー溶液に、薬物水溶液が分散されているＷ／Ｏ型エマルションからなる有機相。そのＷ／Ｏ型エマルションを水相中に分散すると、(Ｗ／Ｏ)／Ｗ型エマルションとなる(特開昭６０−１００５１６号、特開昭６２−２０１８１６号、特開平９−２２１４１７号、前記ジャインらの文献など)。
【００３４】
(ｃ)２種以上の水難溶性の生体内適合性かつ生体内分解性ポリマーを用い、一方のポリマー溶液中に分散されている他方のポリマー溶液中に、薬物が溶解もしくは分散しているＯ／Ｏ型エマルションからなる有機相。そのＯ／Ｏ型エマルションを水相中に分散すると(Ｏ／Ｏ)／Ｗ型エマルションとなる(特開平６−２１１６４８号)。
上記いずれの形態の有機相においても常法により、例えば、断続振盪法、プロペラ型またはタービン型撹拌機を用いる混和法、コロイドミル法、ホモジナイザーを用いる方法、超音波照射法などによって、エマルションを形成させる。
【００３５】
これらの方法において用いられる有機溶媒としては、ハロゲン化炭化水素系溶媒(塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素、クロロエタン、ジクロロエタン、トリクロロエタンなど)、脂肪酸エステル系溶媒(酢酸エチル、酢酸ブチルなど)、芳香族炭化水素系溶媒(ベンゼン)、脂肪族炭化水素(ｎ−ヘキサン、ｎ−ペンタン、シクロヘキサンなど)、ケトン系溶媒(メチルエチルケトンなど)、エーテル系溶媒(ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、メチルイソブチルエーテルなど)が挙げられる。
上記のエマルションを形成させる際、エマルションを安定化するために乳化剤、例えばアニオン性界面活性剤(オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム等)、非イオン性界面活性剤(ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル［Ｔｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ６０(日光ケミカルズ製)等］、ポリエチレンヒマシ油誘導体［ＨＣＯ−６０、ＨＣＯ−５０(日光ケミカルズ製)］、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、レシチン、ゼラチン等)を水相に添加してもよい。
【００３６】
また、ＰＤＥ４阻害剤に加えて、他の成分を配合する場合は、上記Ｏ／Ｗ型エマルションを形成する際に、有機溶媒相にそれらを添加するのが好ましい。なお、薬効成分含量の高いマイクロスフェア製剤を得るためには、有機相の調製に際して薬効成分濃度を高くしておく必要があり、この場合、薬効成分の水相への流出を防ぐために、水相中に浸透圧調節剤を添加することもできる(日本特許第２６０８２４５号を参照)。
上記のようにして得られるＯ／Ｗ型エマルションを水中乾燥法に付すことにより、エマルションに含まれる有機溶媒を除去してマイクロスフェアを製造する。
【００３７】
有機溶媒を除去するには、そのエマルション系を加温したり、減圧下に置くか、または気体を吹きつける方法などの慣用の方法が採用され、たとえば、開放系で溶媒を留去する方法(特公昭５６−１９３２４号、特開昭６３−９１３２５号、特開平８−１５１３２１号、特開平６−２１１６４８号)、閉鎖系で溶媒留去する方法(特開平９−２２１４１８号)などが採用され得る。また、多量の外水相を用いて溶媒を抽出・除去する方法(日本特許第２５８２１８６号)によっても行うことができる。
また次の方法も、ＰＤＥ４阻害剤の種類に応じて、適宜適用することができる。
【００３８】
薬物、生体内分解性ポリマーおよび水と混和する前記ポリマーの良溶媒(溶媒Ａ：アセトン、テトラヒドロフラン等)を含む溶液を、溶媒Ａと混和する前記ポリマーの貧溶媒(溶媒Ｂ：水、エタノール等)および溶媒Ａと混和しない前記ポリマーの貧溶媒(溶媒Ｃ：グリセリン等)を含む均一混合液中に添加して乳化することにより、ポリマー溶液が分散相、均一混合液が連続相を形成するエマルションを調製し、分散相から溶媒Ａを除去する方法(国際公開Ｎｏ.０１／８０８３５ )。
水より沸点の低い有機溶媒(塩化メチレン、酢酸エチル等)および水難溶性ポリマーを含む有機相が水相に乳化したエマルションから水中乾燥法でマイクロスフェアを製造するにあたり、(１)気体分離膜(浸透気化膜、多孔性膜等)を備えた装置を用い、(２)水中乾燥に付されるエマルションを気体分離膜の一方の側に供給し、(３)気体分離膜の他方の側へエマルションに含まれる有機溶媒を留去する方法(国際公開Ｎｏ.０１／８３５９４)。
【００３９】
さらに、マイクロスフェアを水相中で有機溶媒の沸点以上に加温し(特開２０００−２３９１５２号)、または高融点添加物でマイクロスフェアを覆った後、加温乾燥する(特開平９−２２１４１７号)ことにより、マイクロスフェアに残存する有機溶媒を除去することもできる。
このようにして得られるマイクロスフェアは遠心分離、濾過或いは篩などで回収し、その表面に付着した水相添加物等を洗浄除去し、所望により、マイクロスフェア同士の凝集を防止するために糖あるいは糖アルコール、無機塩等、好ましくは、ラクトース、マンニトール、ソルビトールなどの凝集防止剤を添加した後、凍結乾燥に付す。この際、所望の粒子径のマイクロスフェアを得るために、篩にかけることが好ましく、特にマイクロスフェア製剤を注射剤として用いる場合に、通針性を向上させるために、例えば１５０μｍまたはそれ以下の径で篩過を行うのが好ましい。
【００４０】
「相分離法」によってマイクロスフェアを製造するためには、前記水中乾燥法で用いたものと同様の有機溶媒の他、アセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジオキサンなどの両親媒性溶媒を使用することもできる。これらの有機溶媒を用いた水難溶性ポリマーの有機溶媒溶液にＰＤＥ４阻害剤および所望により他の成分、またはそれらの水溶液を加えて溶解または分散させ、有機相を形成させる。この有機相を上記有機溶媒と混和しない溶媒(分散媒)、たとえばシリコンオイル類、流動パラフィン、ゴマ油、大豆油、コーン油、綿実油、ココナッツ油、アマニ油などに撹拌下徐々に添加してＯ／Ｏ型エマルションを形成させる。所望により分散媒には界面活性剤を添加してもよい。このエマルションを冷却して水難溶性ポリマーを固化させる、もしくは加熱して有機相中の溶媒を蒸発させることで水難溶性ポリマーを固化させる。または攪拌下このエマルションに硬化剤、たとえばヘキサン、シクロヘキサン、メチルエチルケトン、オクタメチルシクロテトラシロキサン等を徐々に添加する、もしくは硬化剤にエマルションを徐々に添加することによって、水難溶性ポリマーを析出させることでマイクロスフェアを形成させる。
【００４１】
このようにして形成されたマイクロスフェアは遠心分離、濾過あるいは篩などで回収し、その表面に付着した溶媒や添加剤をヘキサンや精製水などで洗浄除去し、所望により通風乾燥、減圧乾燥、凍結乾燥などに付す。あるいは前記水中乾燥法の場合と同様に、凝集防止剤などを添加した後、凍結乾燥に付す。
なお、相分離法における内部有機相の形態としては以下のものが含まれる。
(ａ)水難溶性の生体内適合性かつ生体内分解性ポリマー溶液に、薬物が直接溶解もしくは分散されている有機相。
(ｂ)水難溶性の生体内適合性かつ生体内分解性ポリマー溶液に、薬物水溶液が分散されているＷ／Ｏ型エマルションからなる有機相。
(ｃ)２種以上の水難溶性の生体内適合性かつ生体内分解性ポリマーを用い、一方のポリマー溶液中に分散されている他方のポリマー溶液中に、薬物が溶解もしくは分散もしくは薬物溶液が分散しているＯ／Ｏ型エマルションからなる有機相。
【００４２】
また「噴霧乾燥法」によってマイクロスフェアを製造するには、前記相分離法で用いたものと同様の有機溶媒を用い、これに水難溶性の生体内適合性かつ生体内分解性ポリマーを溶かし、その有機溶媒溶液に、ＰＤＥ４阻害剤および所望により他の成分を溶解、分散させるか、またはそれら薬物の水溶液を分散させ、その分散液をスプレーノズルを通して噴霧乾燥器内に噴霧して有機溶媒を揮発させてマイクロスフェアを形成させる。
用いられる噴霧乾燥器は市販の製品、例えばパルビス・ミニ・スプレイ(Pulvis Mini Spray)ＧＳ３１(ヤマト製)、ミニスプレードライヤー(柴田科学製)などがいずれも使用され得る。
【００４３】
このようにして得られるマイクロスフェアは水中乾燥法で得られるものと同様に後処理に付されて所望のマイクロスフェア製剤が得られる。
「溶媒拡散法」において、水混和性有機溶媒としてはアセトン、メタノール、エタノール、これらの混合溶媒が挙げることができ、必要に応じて薬物を溶解し得る揮発性溶媒(塩化メチレン、クロロホルム)を加えてもよい。保護コロイド剤としてはポリビニルアルコールを挙げることが出来る。
【００４４】
本発明のＰＤＥ４阻害剤を有効成分とする軟骨疾患修復治療用組成物をマイクロスフェアの形で疾患部位またはその近傍に投与する場合には、局所的に投与するのが好ましく、局所、とりわけ関節内への注射または埋め込みが好ましい。
マイクロスフェアを注射剤とするには、分散剤を含有する水溶液に本発明で得られるマイクロスフェアを、０.０００１〜１０００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０.０００５〜８００ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは０.００１〜５００ｍｇ／ｍｌの濃度となるように分散して調製することができる。
【００４５】
用いられる分散剤としては、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル(Ｔｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ６０(日光ケミカルズ製)など)、ポリエチレンヒマシ油(ＨＣＯ−６０、ＨＣＯ−５０(日光ケミカルズ製)など)等の非イオン界面活性剤、カルボキシメチルセルロースナトリウム等のセルロース系分散剤、アルギン酸ナトリウム、デキストラン、ヒアルロン酸ナトリウムが挙げられる。これらの分散剤は、マイクロスフェアの分散性を向上させ、薬効成分の溶出を安定化させる働きがあり、通常、０.０１〜２重量％、好ましくは０.０５〜１重量％で添加される。
上記注射剤には、適宜、保存剤(メチルパラベン、プロピルパラベン、ベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビン酸、ホウ酸、アミノ酸、ポリエチレングリコール類など)、等張化剤(塩化ナトリウム、グリセリン、ソルビトール、ブドウ糖、マンニトールなど)、ｐＨ調節剤(水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、塩酸、リン酸、クエン酸、シュウ酸、炭酸、酢酸、アルギニン、リジンなど)、緩衝剤(リン酸水素ナトリウム、リン酸水素カリウムなど)が配合される。
【００４６】
注射剤には、更に、必要に応じて、ステロイド系消炎鎮痛剤、非ステロイド系消炎鎮痛剤を溶解・分散してもよい。ステロイド系消炎鎮痛剤としては、例えば、デキサメタゾン、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、ハロプレドン、パラメタゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ベタメタゾン等をあげることができる。また、非ステロイド系消炎鎮痛剤としては、イブプロフェン、ケトプロフェン、インドメタシン、ナプロキセン、ピロキシカム等を挙げることができる。
また、ＰＤＥ４阻害剤を含有するマイクロスフェアの注射剤は、上記懸濁液のほか、用時調製用に、凝集防止剤およびマイクロスフェアを含有する固形製剤と分散剤および注射用蒸留水を組み合わせた注射剤キットとすることもできる。
【００４７】
キットに使用する固形製剤は、凝集防止剤を含む水溶液にマイクロスフェアを懸濁後、凍結乾燥、減圧乾燥、噴霧乾燥等することにより、調製することができ、とりわけ、凍結乾燥で調製するのが好ましい。
固形製剤の製造に際しては、注射用蒸留水への再分散性を向上させるために、凝集防止剤(マンニトール、ソルビトール、ラクトース、ブドウ糖、キシリトール、マルトース、ガラクトース、シュクロース等)を含む水溶液に分散剤を添加することもでき、分散性のよい固形剤とすることができる。必要に応じて、分散剤と共に、ステロイド系消炎鎮痛剤、非ステロイド系消炎鎮痛剤を組合わせた注射剤キットとすることもできる。
【００４８】
本発明のＰＤＥ４阻害剤を有効成分とする軟骨疾患修復治療用組成物は、各種温血哺乳動物、例えば、ヒト、家畜動物(ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ)、愛玩動物(イヌ、ネコ)等に用いることができ、軟骨疾患修復治療用組成物は、これらの動物における変形性関節症、軟骨形成異常症、変形性椎間板症、半月板損傷等の各種軟骨疾患の修復治療に使用することができ、とりわけ、変形性関節症の修復治療に好適に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】ウサギ関節軟骨細胞抽出液をＭｏｎｏＱセファロースカラムクロマトグラフィーで分離した各画分におけるｃＡＭＰ加水分解活性を示すグラフである(化合物番号(４４)存在下：○；化合物番号(４４)非存在下：●)。
【図２】化合物番号(１)含有マイクロスフェアまたは非含有マイクロスフェアの存在下での、老齢ウサギ関節軟骨の修復を観察した顕微鏡写真の模写図である。
【図３】ヒト関節軟骨細胞抽出液をＭｏｎｏＱセファロースカラムクロマトグラフィーで分離した各画分におけるｃＡＭＰまたはｃＧＭＰ加水分解活性を示すグラフである。
【図４】図３においてｃＡＭＰに対し強い加水分解活性を示した画分（フラクション番号２８〜３０ に対するＰＤＥ４阻害剤の阻害活性（ＩＣ５０）を示すグラフである。
【図５】実施例１、実施例２および実施例３のマイクロスフェアのインビトロでの薬物溶出特性を示すグラフである。
【図６】化合物番号(１)をラットに静脈内投与した場合の、血漿中濃度の経時変化を示すグラフである。データは平均値±標準偏差(例数：３)で示した。
【図７】実施例１−(５)、実施例２−(２)および実施例３−(２)で得られたマイクロスフェア分散液をラットに皮下注射した場合の血漿中濃度の経時変化を示すグラフである。データは平均値±標準偏差(例数：５)で示した。
【図８】実施例２−(２)で得られたマイクロスフェア分散液をラットに皮下注射した場合の製剤中に残存している化合物番号(１)の経時変化を示すグラフである。データは平均値±標準偏差(例数：５)で示した。
【図９】実施例６−(５)および実施例７−(２)で得られたマイクロスフェア分散液をラットに皮下注射した場合の製剤中に残存している化合物番号(２)の経時変化を示すグラフである。データは平均値±標準偏差(例数：４)で示した。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００５０】
つぎに、実験例、実施例および試験例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。なお、以下の実施例等において用いる化合物番号は前記化学構造式で示した好ましいＰＤＥ４阻害剤の具体例の化合物番号を意味する。
実験例１(関節軟骨細胞の基質産生増加)
(試験化合物)
化合物番号(１)(１０−５Ｍまたは１０−４Ｍ)；
化合物番号(２)(１０−６Ｍまたは１０−５Ｍ)；
化合物番号(９)(１０−６Ｍまたは１０−５Ｍ)；
化合物番号(１１)(１０−６Ｍ)；
化合物番号(２１)(１０−６Ｍまたは１０−５Ｍ)；
化合物番号(２７)(１０−６Ｍまたは１０−５Ｍ)；
化合物番号(４４)(１０−５Ｍまたは１０−４Ｍ)；
【００５１】
(関節軟骨細胞の分離・維持)
ＮＺＷ系ウサギ(北山ラベス；雄性；４週齡)４羽をエーテル麻酔後、放血致死させ、無菌的に大腿骨側の膝関節を得た。これをグルコース０.２％含有リン酸緩衝液(ｐＨ７.２)中に保存し、膝関節部の表層のみをメスで削り取り、グルコース０.２％含有リン酸緩衝液(ｐＨ７.２)を入れた５０ｍｌチューブに集めた。集められた関節表層をシャーレ上でカミソリを用いてできるだけ細かく切り刻み、１０ｘトリプシン−エチレンジアミンテトラ酢酸(ＥＤＴＡ)・４Ｎａ(ＧＩＢＣＯ製；カタログ番号１５４００−０５４)を含むグルコース０.２％含有リン酸緩衝液(５０ｍｌ、トリプシン１００ｍｇ含有、ＥＤＴＡ・４Ｎａ ４０ｍｇ含有；ｐＨ７.２)中、３７℃で１５分間振盪した。振盪後、遠心分離(１,４００ｒｐｍ)により、沈殿物を分取後、グルコース０.２％含有リン酸緩衝液４０ｍｌで２回洗浄した。洗浄後の沈殿物に細胞分散用コラゲナーゼ(和光純薬製；カタログ番号０３４−１０５３３)６０ｍｇを溶解した無血清α最小必須培地(ＭＥＭ：minimum essential medium)(ＧＩＢＣＯ製；カタログ番号１２５７１−０６３)４０ｍｌを添加し、これを滅菌済スターラー・バー入りの１００ｍｌビーカーに移した。スターラー・バーを回転させながら、３７℃のＣＯ２インキュベーターで約１時間コラゲナーゼ処理した。コラゲナーゼ処理物から４０μＭセルストレーナー（ＦＡＬＣＯＮ製；カタログ番号２３４０)により軟骨片を除去し、除去後の処理物に１０％ウシ胎仔血清(ＦＣＳ：fetal calf serum)含有αＭＥＭ培地１０ｍｌを添加し、遠心分離(１,４００ｒｐｍ)した。沈殿物を１０％ＦＣＳ−αＭＥＭ培地で２回洗浄し、同培地で適当な容量に懸濁し、この懸濁液を１ウェル当たり細胞数２万個となるようにコラーゲンタイプＩＩ(和光純薬製；カタログ番号０３３−１３９０１)コートプレート(４８ウェル)に播種した。翌日１０％ＦＣＳ−αＭＥＭ培地で培地交換した。
【００５２】
(基質産生増加)
上記操作で培地交換後、細胞がコンフルエントになった段階で、検体添加群には試験化合物含有培地(ビヒクルとしてジメチルスルホキシドを０.１％含有)で培地交換した。試験化合物を添加する際に用いる培地には、０.２ｍＭアスコルビン酸含有１０％ＦＣＳ−αＭＥＭ培地を用いた。最初の検体含有培地添加日をｄａｙ１とし、ｄａｙ３に再度同培地で培地交換し、ｄａｙ５まで培養を継続した。一方、検体非添加群には、試験化合物を含有しないこと(ビヒクルのみ含有)以外は全く同一の培地を同時期に添加し、同様に培養を行った。培養終了後、培養物から上清を除去し、パラホルムアルデヒドを４％の濃度に溶解した中性緩衝液０.２５ｍｌを添加して２時間細胞を固定した。リン酸緩衝液(ｐＨ７.２)１ｍｌで３回洗浄後、軟骨基質(プロテオグリカン)を選択的に着色するアルシアンブルー８ＧＸ(シグマ製；カタログ番号Ａ３１５７)を０.１％濃度に溶解した０.１Ｍ塩酸で４時間染色した。染色後、リン酸緩衝液(ｐＨ７.２)１ｍｌで３回洗浄し、６Ｍ塩酸グアニジン水溶液０.２５ｍｌで、軟骨基質を染色したアルシアンブルーを溶解し、その一部を用いて６２０ｎｍでの吸光度を測定した。この吸光度から染色に用いられたアルシアンブルー量を算出し、この量から基質(プロテオグリカン)の量を推定した。その結果を表１に示す。
【表１】
【００５３】
上記表１に示すとおり、ＰＤＥ４阻害活性を有する試験化合物(１)、(２)、(９)、(１１)、(２１)、(２７)および(４４)のすべてに基質産生増加作用が認められた。
実験例２(関節軟骨中に発現するｃＡＭＰ分解性ＰＤＥの分画)
ＮＺＷ系ウサギ(北山ラベス；雄性；４週齢)４羽をエーテル麻酔後、放血致死させ、無菌的に大腿骨側の膝関節を得た。これをグルコース０.２％含有リン酸緩衝液(ｐＨ７.２)中に保存し、膝関節部の表層のみをメスで削り取り、グルコース０.２％含有リン酸緩衝液(ｐＨ７.２)を入れた５０ｍｌチューブに集めた。集められた関節表層をシャーレ上でカミソリを用いてできるだけ細かく切り刻み、氷冷したリン酸塩緩衝液で洗浄した後、氷冷ホモジナイズ用緩衝液(２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.４、２ｍＭ酢酸マグネシウム、０.３ｍＭ塩化カルシウム、１ｍＭジチオスレイトール、４０μＭロイペプチン、１.３ｍＭベンズアミジン、０.２ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド、１ｍＭアジ化ナトリウム)中でホモジナイザー(Polytoron, Kinematica製)を用いて破砕した。得られたホモジネートを遠心(１０００００×ｇ、６０分間)し、上清を分取した。
【００５４】
溶出緩衝液(２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.４、１ｍＭ塩化カルシウム、１ｍＭジチオトレイトール、２μＭロイペプチン、５ｍＭベンズアミジン)で平衡化したＭｏｎｏＱセファロース高速カラム(Amersham Pharmacia Biotech社製)に、前記で得た上清を供した。カラムを溶出緩衝液２０ｍｌで洗浄した後、塩化ナトリウム勾配で蛋白を溶出し、氷冷下１ｍｌずつ分画した。各画分について、ｃＡＭＰを基質とする加水分解活性(ＰＤＥ活性)を測定した。
ＰＤＥ活性の測定は、ラジオラベル核酸法により行った。すなわち、１μＭの非標識ｃＡＭＰおよび２２ｎＭの［３Ｈ］−ｃＡＭＰ(Amersham Pharmacia Biotech社製)を含むアッセイ用緩衝液(５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８.０、５ｍＭ塩化マグネシウム、４ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０.３３ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン(脂肪酸不含、シグマ社製)、１ｍＭエチレングリコールビス(β−アミノエチルエーテル)−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−４酢酸)５００μｌ中に１０〜３０μｌの溶出画分を添加して反応を開始した。薬物非投与群は薬物を添加せず、薬物投与群には１×１０−５Ｍになるように化合物番号(４４)を添加した。３７℃で３０分間保温して反応を行った後、１.５分間煮沸して反応を停止させ、さらに１ｍｇ／ｍｌのヘビ毒(Crtalus atrox snake venom)１００μｌを添加して３７℃で３０分間保温した。ついで、５００μｌのメタノールを添加し、反応液をＤｏｗｅｘカラム(１ｘ８−４００)で処理した後、各溶出液に液体シンチレーションカクテルを加え、ラジオ活性を測定した。その結果を図１に示す。
【００５５】
図１に示されるとおり、ｃＡＭＰに対する強い加水分解活性の４つのピークが認められた。これらの４つのピークは、(１)ｃＡＭＰを選択的に加水分解すること、(２)そのｃＡＭＰ加水分解活性がｃＧＭＰによる影響を受けないこと、(３)選択的ＰＤＥ４阻害薬である化合物番号(４４)により強く阻害されること、という性質をみたすことから、ＰＤＥ４に由来するピークであると考えられた。ＰＤＥ４にはＰＤＥ４Ａ、ＰＤＥ４Ｂ、ＰＤＥ４Ｃ、ＰＤＥ４Ｄの４つのサブタイプが報告されており(サルドウら、セルラー・シグナリング［Cellular Signaling］、１０巻、４２７〜４４０頁、１９９８年)、４つのピークはこれらのサブタイプあるいはそれらから由来するスプラシンング変異体であると考えられた。
【００５６】
実験例３(軟骨基質タンパク遺伝子の発現)
最終濃度１×１０−４および１×１０−５Ｍの化合物番号(１)の存在下で実験例１と同じ方法によって４日間培養したウサギ膝関節軟骨細胞より、ＩＳＯＧＥＮ(ニッポンジーン社製)によって抽出した全ＲＮＡ１５μｇを４.５μｌの滅菌水に溶解した。この溶液と２μｌの５×ＭＯＰＳ緩衝液、３.５μｌのホルムアルデヒド、１０μｌのホルムアミドとを混合し、９０℃、１５分間熱変性した後、ホルムアルデヒド存在下で１％アガロースゲル上で電気泳動した。電気泳動終了後、ＲＮＡをナイロン膜(アマシャムファルマシア社製)へキャピラリー法にて一晩トランスファーを行った。ＵＶ架橋によりＲＮＡをナイロン膜に固定した後、５０ｍｌのハイブリダイゼーション溶液(６×ＳＳＣ、５×Denhardt's溶液、(５０％ホルムアミドはなし)、０.５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ熱変性サケ精子ＤＮＡ)中にて６０℃、２時間プレハイブリダイゼーションを行った。
【００５７】
次いでマウスＩＩ型コラーゲン遺伝子、ヒトアグリカン(プロテオグリカンを構成する代表的な蛋白)遺伝子のＤＮＡプローブを各々、α［３２Ｐ］ｄＣＴＰを用い、ランダムプライムラベリングキットＶｅｒ.２(アマシャムファルマシア社製)によって放射性標識した。各プローブ１×１０８ｄｐｍを各々、５ｍｌのハイブリダイゼーション溶液と共にプレハイブリダイゼーション処理したナイロン膜に加え、密封した後、６０℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。ナイロン膜の洗浄は０.２×ＳＳＣ、０.２％硫酸ドデシルナトリウムを含む溶液中で、６０℃、４０分間の洗浄操作を３回繰り返し行った。ナイロン膜オートラジオグラフィーに供し、Ｘ線フィルムをＬＡＳ−１０００(富士写真フィルム社製)によって撮影した。各ＲＮＡの相対量をImage Gause(富士写真フィルム社製)によって測定した後、２８ＳＲＮＡ(内因性ＲＮＡ：内部標準)によって補正し、非投与群の遺伝子発現の量を１００(％)として、試験化合物投与群の遺伝子発現の量を算出した。その結果を表２に示す。
【表２】
【００５８】
上記表２に示すとおり、ＰＤＥ４阻害薬である試験化合物(１)の添加群においては、ＩＩ型コラーゲン、アグリカン遺伝子の発現量は濃度依存的に増大していたことから、ＰＤＥ４阻害薬は関節軟骨細胞に作用し、関節軟骨基質の主要な成分であるＩＩ型コラーゲン、アグリカンの遺伝子発現を増大させることにより、軟骨基質の産生を促進することがわかった。
【００５９】
実験例４(老齢ウサギ膝関節軟骨基質増加)
(予備飼育)
老齢のＪＷ系ウサギ(北山ラベス；雄性；３７週齢)を室温(２３±２℃)、湿度(５０±２０％)で飼育した。市販の餌(オリエンタルバイオ製；ＣＥ−２)を自由摂取させた。
(関節軟骨基質増加)
上記ウサギをネンブタール(ダイナボット社製；５０ｍｇ／ｋｇ／ｍｌ)を耳静脈に注射し、麻酔した。左膝関節部の毛を剃り、７０％水性エタノールで消毒後、検体投与群には、関節内に、実施例２−(３)で製造した検体含有マイクロスフェア分散液２５０μｌ(薬物量：２.５ｍｇ)を１８ゲージの注射針(テルモ製)を用いて注入した。一方、検体非投与群には、関節内に、対照例１−(２)で製造した検体非含有マイクロスフェア分散液２５０μｌを注入した。投与から１４日後に、ウサギをネンブタール麻酔下で放血致死させ、膝関節を摘出し、ホルムアルデヒドを１０％の濃度に溶解した中性緩衝液で固定後、０.５Ｍ ＥＤＴＡ−４Ｎａ水溶液による脱灰処理を施し、切片を作成した。切片に軟骨基質(プロテオグリカン)を選択的に着色するアルシアンブルー８ＧＸ(シグマ製；Ａ３１５７)を０.１０％濃度に溶解した０.１Ｍ塩酸で染色し、検体投与群と検体非投与群の間の染色性を顕微鏡にて比較した。その結果、アルシアンブルーで染色される基質(プロテオグリカン)の層の厚さが検体投与群では検体非投与群の層の厚さの３倍以上となっていた。
【００６０】
実験例５(老齢ウサギ膝関節軟骨修復)
(予備飼育)
老齢のＪＷ系ウサギ(北山ラベス；雄性；３７週齢)を、ウサギ専用ケージ(Ｃ ｔｙｐｅ：Ｗ３７０×Ｄ５２０×Ｈ３３０)中、室温(２３±２℃)、湿度(５０±２０％)で飼育した。市販の餌(オリエンタルバイオ製；ＣＥ−２)を自由摂取させた。
(関節軟骨修復)
上記ウサギをネンブタール(アボット社製；５０ｍｇ／ｋｇ／ｍｌ)を耳静脈に注射し、麻酔した。左膝関節部の毛を剃り、７０％水性エタノールで消毒後、左膝正中靭帯を切開し、大腿骨頭および半月板を露出させ、周囲の血液は滅菌綿で止血した。大腿骨骨頭中間部の窪み(非荷重部)に直径２ｍｍ、深さ３ｍｍの穴をドリル(東洋アソシエイツ製；ミスターマイスター)を用いてあけた。滅菌生理食塩水で穿孔中に生じた骨片などを洗浄除去後、関節包、正中靭帯を絹糸で縫合し、滅菌綿で止血、消毒した。９日後、検体投与群には、関節内に、実施例２−(３)で製造した検体含有マイクロスフェア分散液２５０μｌ(薬物量：２.５ｍｇ)を１８ゲージの注射針(テルモ製)を用いて注入した。一方、検体非投与群には、関節内に、対照例１−(２)で製造した検体非含有マイクロスフェア分散液２５０μｌを注入した。投与から１４日後に、ウサギをネンブタール麻酔下で放血致死させ、膝関節を摘出し、ホルムアルデヒドを１０％の濃度に溶解した中性緩衝液で固定後、０.５Ｍ ＥＤＴＡ−４Ｎａ水溶液による脱灰処理を施し、切片を作成した。孔の修復度を顕微鏡で観察した。その結果を図２に示す。図２に示されるとおり、検体投与群は検体非投与群に比べ明らかに孔の修復が進んでいることが確認された。
【００６１】
実験例６(パパイン誘発変形性膝関節症に対する修復治癒効果)
(予備飼育)
日本白色種ウサギ(北山ラベス；雄性；１３週齡)を室温(２３±２℃)、湿度(５０±２０％)で８日間飼育した。飼育期間中、市販の餌(ＲＣ４ オリエンタル酵母)を１日約１４０ｇの割合で摂取させた。
(修復治癒効果)
上記ウサギにネンブタール(アボット：ｌｏｔ ７９１１０２)を耳静脈から注射し、麻酔した。ウサギの両膝部分の毛をかり、７０％エタノールで消毒した。両膝に０.８％パパイン(Ｍｅｒｃｋ ＥＣ３.４.２２.２ ｌｏｔ ５８７６４４ ０１９)生理食塩水溶液０.５ｍｌを５日間隔で２回注射した。二回目の注射から１週間後、検体投与群(左膝；１群４〜６匹)には、実施例２−(３)で製造したマイクロスフェア分散液(化合物番号(１)の化合物を０.２ｍｇまたは２ｍｇ含有)を関節内に注射した。一方、検体非投与群(右膝；１群４〜６匹)には対照例１−(２)で製造した薬物非含有マイクロスフェア分散液を検体投与群の分散液と同量関節内に注射した。また、アルツ投与群(左膝；１群２匹)には、１％ヒアルロン酸ナトリウム水溶液(科研製薬製アルツ)０.３ｍｌを関節内に注射した。一方、アルツ非投与群(右膝；１群２匹)には、０.３ｍｌの生理食塩水を関節内に注射した。アルツ投与群およびアルツ非投与群には、同様の関節内注射を１週間毎に、計４回ずつ行った。最終の注射から４週間後、ウサギをエーテル麻酔下で放血により安楽死させ、膝を摘出し、ホルムアルデヒドを１０％の濃度に溶解した中性緩衝液にて固定した。その結果、パパイン処置によって、関節軟骨表面の不整化、ヘマトキシリン・エオジン染色性の低下、軟骨基質の繊維化、関節軟骨細胞の消失などを特徴とする関節軟骨の変性が見られた。アルツ処理では、ヘマトキシリン・エオジン染色で若干の染色性低下の抑制はみられたものの、大幅な回復効果は見られなかった。一方、化合物番号(１)含有マイクロスフェア投与では、上記病理症状が著しく改善した。なお、検体非投与群およびアルツ非投与群のいずれにおいても回復効果は全く認められなかった。
【００６２】
実験例７（ヒト関節軟骨中に発現するｃＡＭＰ分解性ＰＤＥの分画）
ヒト変形性関節症患者の手術の際に摘出した膝関節軟骨から軟骨部分をメスで削り取り、氷冷したリン酸緩衝液で洗浄した後、−８０℃で保存した。軟骨を−８０℃で粉砕後、氷冷ホモジナイド緩衝液［２０ｍＭ Ｔris-ＨＣｌ、ｐＨ８.０、１ｍＭ エチレングリコールビス（β−アミノエチルエーテル）―Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ’−テトラ酢酸、１ｍＭ ジチオスレイトール、１０μｇ／ｍｌ ロイペプチン、５ｍＭ ベンズアミジン、０.２ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルオリド、１ｍＭ アジ化ナトリウム、５ｍＭ メルカプトエタノール］中で、ホモジナイザー（Kinematica製、Ｐｏｌｙｔｏrｏｎ）を用いて粉砕した。得られたホモジネートを遠心分離（１０００００×ｇ；３０分）して、上清を分取した。
溶出緩衝液［２０ｍＭ Ｔris-ＨＣｌ、ｐＨ８.０、１ｍＭ エチレングリコールビス（β−アミノエチルエーテル）―Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ’−テトラ酢酸、１ｍＭ ジチオスレイトール、２μｇ／ｍｌ ロイペプチン、５ｍＭ ベンズアミジン］で平衡化したＭｏnoＱセファロース高速カラム（Amasham Pharmacia Biotech社製）に、上記上清を導通した。カラムを溶出緩衝液２０ｍｌで洗浄後、塩化ナトリウム水溶液（濃度勾配：０〜１０００ｍＭ、７０ｍｌ）でタンパクを溶出し、氷冷下で１ｍｌずつ分画した。各分画について、ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰを基質とする加水分解活性（ＰＤＥ活性）を測定した。
【００６３】
ＰＤＥ活性の測定は、ラジオラベル核酸法により行った。すなわち、１μＭの非標識ｃＡＭＰおよび２２ｎＭの［３Ｈ］−ｃＡＭＰ（Amasham Pharmacia Biotech製）を含むアッセイ用緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８.０、５ｍＭ塩化マグネシウム、４ｍＭ ２−メルカプトエタノール）５００μｌ中に１０〜５０μｌの溶出画分を添加して反応を開始した。
３７℃で３０分間保温した後、１.５分間煮沸して反応を停止させ、更に、１ｍｇ／ｍｌのヘビ毒（Crtalus atrox snake venom）１００μｌを添加して、３７℃で３０分間保温した。ついで、５００μｌのメタノールを添加し、反応液をＤｏｗｅｘカラム（１×８−４００）で処理した後、溶液に液体シンチレーションカクテルを加え、ラジオ活性を測定した。結果を図３に示す。
【００６４】
図３に示されるように、ヒト変形性関節症患者の軟骨の処理液には、ｃＧＭＰに対する加水分解活性を有する画分は含まれていないが、ｃＡＭＰに対する強い加水分解活性を有する画分が含まれていることが判明した。
ｃＡＭＰに対する強い加水分解活性を有する画分（フラクション番号：２８〜３０に対するＰＤＥ４阻害剤の阻害活性を、前述のラジオラベル核酸法で測定した。試験化合物は、化合物番号（１）、化合物番号（２）、化合物番号（１１）、化合物番号（４４）、化合物番号（２７）である。
実験の結果、該画分の加水分解活性は化合物番号（１）および（２）、特に化合物番号（２）により強く阻害を受けることが確認された。また、Journal of Medicinal Chemistry vol. 42, 1088-1099 (1999)記載の方法で測定した、この画分に対する化合物番号（１）および（２）のＩＣ５０は同文献に記載されたＰＤＥ４阻害作用のＩＣ５０と一致した。結果を図４に示す。
【００６５】
実験例８（ヒト関節軟骨細胞における細胞内ｃＡＭＰ上昇）
（関節軟骨細胞の分離）
ヒト関節軟骨（変形性股関節症患者の関節軟骨）をリン酸緩衝液（ｐＨ７.２）中に浸し、関節部の表層のみをメスで削り取り、同緩衝液を入れた５０ｍｌチューブに集めた。集められた関節表層をシャーレ上でカミソリを用いてできるだけ細かく切り刻み、遠心管に移した。
【００６６】
ヒアルロニダーゼ（シグマ社製；カタログ番号Ｈ−３５０６）を１ｍｇ／ｍｌの濃度で含むリン酸緩衝液（ｐＨ７.２）を遠心管に入れ、３７℃で１５分間振盪した。遠心分離（２０００ｒｐｍ、５分間）により沈殿物を分取後、トリプシンを０.２５％の濃度で含むHank’s balanced salt solution（ＧＩＢＣＯ社製；カタログ番号１５０５０−０６５）に入れ、３７℃で３０分間振盪した。
遠心分離（２０００ｒｐｍ、５分間）により沈殿物を分取後、沈殿物に細胞分散用コラーゲナーゼ（和光純薬製；カタログ番号０３４−１０５３３）を０.２５％の濃度で、ウシ胎仔血清（ＧＩＢＣＯ社製；fetal calf serum；カタログ番号１００９９−１４１）を１０％の濃度で含有するα最小必須培地（ＧＩＢＣＯ社製；カタログ番号１２５７１−０６３）を添加し、３７℃で１晩振盪した。
【００６７】
４０μｍセルストレーナー（ＦＡＬＣＯＮ社製；カタログ番号２３４０）により軟骨片を除去し、除去後のコラーゲナーゼ処理物に、ウシ胎仔血清を１０％の濃度で含有するα最小必須培地を添加して遠心分離（１４００ｒｐｍ、１０分間）した。
ウシ胎仔血清を１０％の濃度で含有するα最小必須培地で沈殿物を３回洗浄後、同培地で適当な容量に懸濁し、この懸濁液を１ウエル当たり細胞数５００００個となるようにプレート（４８ウエル）に播種した。翌日、ウシ胎仔血清を１０％の濃度で含有するα最小必須培地で培地交換した。α最小必須培地は、抗生物質（１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧ、１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン）、抗真菌剤（０.２５μｇ／ｍｌアンフォテリシンＢ）（ＧIＢＣＯ社製；カタログ番号１５２４０−０６２）を添加したものを用いた。
【００６８】
（細胞内ｃＡＭＰ濃度上昇）
培地の交換後、細胞がコンフルエントになった段階で、検体添加群では、ＰＧＥ２（シグマ社製、カタログ番号Ｐ−０４０９）を１μＭの濃度で、検体化合物を１０−６Ｍ又は１０−５Ｍ濃度で添加した、ウシ胎仔血清を１０％の濃度で含有するα最小必須培地（ジメチルスルホキシド０.１％を含有）で培地交換した。一方、検体非添加群では、ＰＧＥ２（シグマ社製、カタログ番号Ｐ−０４０９）を１μＭの濃度で添加した、ウシ胎仔血清を１０％の濃度で含有するα最小必須培地（ジメチルスルホキシド０.１％を含有）で培地交換した。
３０分間培養後、培地を捨て、リン酸緩衝液（ｐＨ７.２）で洗浄し、５０％エタノール水溶液で３０分間処理後、エタノールを回収し、エタノール抽出物を蒸発乾固した。これをｃＡＭＰ ＥＩＡシステム（Amasham Pharmacia Biotech社製；カタログ番号ＲＰＮ２２５）に添付されたアッセイ用緩衝液に溶解し、同システムでｃＡＭＰ濃度を測定した。その結果を表３に示す。
【表３】
【００６９】
実験例９（ウサギ関節軟骨細胞のＩＬ−１存在下での基質産生）
ＮＺＷ系ウサギ（北山ラベス；雄性；４週齢）４羽をエーテル麻酔後、放血致死させ、無菌的に大腿骨側の膝関節を得た。これから、グルコースを０.２％含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７.２）中で、膝関節部の表層のみをメスで削り取り、グルコースを０.２％含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７.２）を入れたチューブに集めた。集められた関節表層をシャーレ上でカミソリを用いてできるだけ細かく切り刻み、１０ｘトリプシン−エチレンジアミンテトラ酢酸４ナトリウム（ＥＤＴＡ・４Ｎａ）（ＧＩＢＣＯ社製；カタログ番号１５４００−０５４）を添加した、グルコースを０.２％の濃度で含有するリン酸緩衝液（トリプシン１００ｍｇ、ＥＤＴＡ・４Ｎａ４０ｍｇ含有；ｐＨ７.２）５０ｍｌに加えて、３７℃で１５分間振盪した。
振盪後、遠心分離（１４００ｒｐｍ）して沈殿物を分取し、これをグルコースを０.２％含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７.２）４０ｍｌで２回洗浄した。
【００７０】
洗浄後の沈殿物に細胞分散用コラーゲナーゼ（和光純薬製；カタログ番号０３４−１０５３３）６０ｍｇを溶解した、抗生物質（２００Ｕ／ｍｌペニシリンＧ、２００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン）（ＧＩＢＣＯ社製；カタログ番号１５１４０−１２２）を含有するα最小必須培地（ＧＩＢＣＯ社製；カタログ番号１２５７１−０６３）４０ｍｌを添加し、これを滅菌済スターラー・バー入りの１００ｍｌビーカーに移した。
スターラー・バーを回転させながら、３７℃のＣＯ２インキュベーターで約３０分間培養後、デオキシリボヌクレアーゼＩ（宝酒造製；カタログ番号２２１０Ａ）を７０Ｕ／ｍｌとなるように添加し、同条件で、更に３０分間培養した。
培養物の上清を別容器に移し取り、残った軟骨片を新たに調製した、コラーゲナーゼ６０ｍｇを含み、デオキシリボヌクレアーゼＩを７０Ｕ／ｍｌの濃度で含有するα最小必須培地で、約３０分間培養した。
【００７１】
先に移し取った培養物上清及び最終培養物から４０μｍセルストレーナー（Falcon製；カタログ番号２３４０）で軟骨片を除去し、除去後の培養物に、ウシ胎仔血清（ＧＩＢＣＯ社製；fetal calf serum；カタログ番号１００９９−１４１）を１０％の濃度で含み、抗生物質（２００Ｕ／ｍｌペニシリンＧ、２００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン）（ＧＩＢＣＯ社製；カタログ番号１５１４０−１２２）を含有するα最小必須培地（ＧＩＢＣＯ社製；カタログ番号１２５７１−０６３）１０ｍｌを添加し、遠心分離（１４００ｒｐｍ，１０分間）を行った。
沈殿物を同様のウシ胎仔血清、抗生物質含有α最小必須培地で２回洗浄し、同培地で適当な容量に懸濁し、この懸濁液を１ウエル当たり細胞数２００００個となるようにプレート（４８ウエル）に播種した。翌日、同培地で培地交換を行った。
【００７２】
（基質産生増加）
上記培地交換後、細胞がコンフルエントになった段階で、検体投与群には、１ｎｇ／ｍｌのリコンビナントヒトIL−1β（PEPRO TECH製；カタログ番号２００−０１B）と検体化合物を含有した培地（ジメチルスルホキシドを０.１％の濃度で含有）で培地交換した。この培地にはアスコルビン酸を０.２ｍＭの濃度で含む、前記ウシ胎仔血清、抗生物質含有α最小必須培地を用いた。一方、検体非投与群は、検体化合物を含有しない以外は検体投与群と同様の培地で培地交換した。
最初のIL−１β含有培地添加日をｄａｙ１とし、ｄａｙ３まで培養した。
【００７３】
培養後、培養物から上清を除去し、１０％中性緩衝ホルマリン液（和光純薬製；カタログ番号０６０−０１６６７）０.２５ｍｌを添加して３０分間細胞を固定した。
固定した細胞をリン酸緩衝液（ｐＨ７.２）１ｍｌで３回洗浄後、基質（プロテオグリカン）を選択的に染色するアルシアンブルー８ＧＸ（シグマ社製；カタログ番号Ａ３１５７）を０.１％の濃度で含む０.１Ｍ塩酸で４時間染色した。
染色後、リン酸緩衝液（ｐＨ７.２）１ｍｌで３回洗浄し、６Ｍ塩酸グアニジン水溶液０.２５ｍｌで、軟骨基質を染色したアルシアンブルーを溶解した。その一部を用いて、６２０ｎｍでの吸光度を測定し、この吸光度から染色に用いられたアルシアンブルー量を算出した。このアルシアンブルー量から基質（プロテオグリカン）量を推定した。検体を添加しない場合のプロテオグリカン産生量を１００％として、相対比率を示した。結果を表４に示す。
【表４】
【００７４】
表４に示すとおり、ＩＬ−１の存在下、ＰＤＥ４阻害作用を有する試験化合物は基質産生を促進した。ＩＬ−１は、変形性関節症の滑液や軟骨細胞に発現していること、および軟骨基質であるプロテオグリカン等の基質分解酵素であるＭＭＰ（matrix metalloproteinase）の産生や合成を誘導することなどから、軟骨基質分解に重要な役割を果たしていると考えられている(The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, vol 277, p1672-1675 (1996)；Journal of Biochemistry, vol 123, p431-439 (1998); Arthritis & Rheumatism, vol 44, p585-594 (2001)。従って、上記の結果は本発明組成物の有効成分であるＰＤＥ４阻害剤が、ＩＬ−１が関与する軟骨基質分解を阻害しうることを示唆している。
【００７５】
実験例１０(内側半月板部分切除／両側側副靭帯切除により誘発される変形性膝関節症に対する修復治療効果)
(予備飼育)
日本白色ウサギ(雄性；１０週齢；１群７匹)を、室温(２３±２℃)、湿度(５５±１５％)で１６日間飼育した。飼育期間中、市販の餌(オリエンタルバイオ製；LRC4)を自由摂取させた。
【００７６】
(変形性膝関節症治癒)
エーテル麻酔下で、上記ウサギ右膝関節を切開し、内側半月板の1/2部分を両鋭小直剪刀を用いて切除した。同時に両側側副靭帯を切断した。術後筋肉と表皮を縫合し、消毒を行った。施術後2週間後に、エーテル麻酔下、検体投与群（１群：７匹）には、それぞれ，化合物番号（２）１μｇを含む実施例７−（１）で製造したマイクロスフェアを関節腔内に投与した。検体非投与群（１群：７匹）には、対照例２で製造した薬物非含有マイクロスフェアを同量投与した。術後６週間後に、もう一度、上記薬物含有及び非含有マイクロスフェアを投与した。施術後、１０週間後にエーテル麻酔下で開腹、放血により安楽死させ脛骨近位端を摘出した。摘出した脛骨近位端に墨汁を塗布して１０％中性緩衝ホルマリン溶液に浸漬固定した。
【００７７】
（実験結果）
ホルマリンで固定した脛骨近位端の余分な墨汁を抜き取り、真上方向から実体顕微鏡（オリンパス社製、モデルSZX12-3111)を用いて脛骨表面の画像を画像解析装置（IMAGING RESEARCH 社製 MCIDイメージングアナライザー）に取込んだ。同解析装置を用いて、内側の墨汁が残存している部分の面積（変性部面積）を測定した。同時に、内側全体の面積を測定し、変性部面積の内側全体の面積に対する割合（変性部面積率）を百分率で算出した。
結果を表５に示す。
【表５】
【００７８】
実施例１
(１)化合物番号(１)０.１ｇおよび乳酸−グリコール酸共重合体(乳酸／グリコール酸＝５０／５０；平均分子量２００００；ＰＬＧＡ５０２０：和光純薬製)１.９ｇに塩化メチレン４.０ｇを添加し、３０分間振盪溶解することにより油相(Ｏ)を形成した。
(２)油相を０.５％ポリビニルアルコール(ポバールＰＶＡ−２２０Ｃ：クラレ製)水溶液８ｍｌに加え、ホモジナイザー(Polytoron:Kinematica製)を用いて２５℃で５分間乳化することにより、水相に油相が分散した乳化液(Ｏ／Ｗ)を製造した。
(３)この乳化液を精製水１０００ｍｌに添加し、スリーワンモーター(新東科学製)を用いて４００ｒｐｍで攪拌しながら、２５℃で３時間液中乾燥することにより塩化メチレンを除去した。
(４)生成するマイクロスフェア懸濁液から、目開き１５０μｍのフィルターを通して凝集物を除去し、目開き２０μｍのフィルターで吸引濾過することにより水相を除去した。得られたマイクロスフェアに少量の精製水を添加し、凍結乾燥することにより、マイクロスフェア１.６ｇを得た。
【００７９】
得られたマイクロスフェア１０ｍｇをアセトニトリル３ｍｌに溶解し、０.５Ｍ塩化ナトリウム水溶液７ｍｌを加えてミキサー(Touch mixer MT-51:Yamato製)にて攪拌後、２０００ｒｐｍで５分遠心分離し、上清を分取した。上清の一部をＦＬ−ＨＰＬＣ(カラム；Hypersil 5-ODS 直径４ｍｍ、長さ３００ｍｍ：ジーエルサイエンス製、励起波長：３１５ｎｍ、蛍光波長：４６５ｎｍ)にかけ、別途作成した薬物溶液の検量線からこれに含まれる薬物量を測定し、これと上清量とからマイクロスフェア中の薬物含有量を算出した。その結果、薬物の含有量は４.２１％であった。
また、得られたマイクロスフェアをポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル(Ｔｗｅｅｎ８０：日光ケミカルズ製)の希薄溶液に適量分散させ、粒度分布測定装置ＳＡＬＤ−１１００(島津製)にて粒度分布を測定し、平均粒子径を算出した。その結果、平均粒子径は５７μｍであった。
【００８０】
(５)上記(４)で得られたマイクロスフェアを、カルボキシメチルセルロースナトリウム(ニチリン化学工業製)を０.５％、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル(Ｔｗｅｅｎ８０：日光ケミカルズ製)を０.１％含む生理食塩水(分散媒)に２.５ｍｇ／ｍｌの薬物割合となるように添加し、ミキサー(Touch mixer MT-51:Yamato製)にて、十分攪拌することにより、マイクロスフェア分散液を調製した。
【００８１】
実施例２
(１)乳酸−グリコール酸共重合体(乳酸／グリコール酸＝５０／５０；平均分子量２００００；ＰＬＧＡ５０２０：和光純薬)０.５７ｇと乳酸重合体(平均分子量２００００；ＰＬＡ００２０：和光純薬製)１.３３ｇを混合して用いること以外は、実施例１−(１)〜(４)と同様にして、マイクロスフェア１.６ｇを得た。
実施例１−(４)と同様にしてマイクロスフェア中の薬物含有量および平均粒子径を測定した。その結果、薬物含有量は３.７０％、平均粒子径は４７.７μｍであった。
(２)上記(１)で得られたマイクロスフェアを実施例１−(５)と同様に処理してマイクロスフェア分散液(薬物割合：２.５ｍｇ／ｍｌ)を調製した。
(３)上記(１)で得られたマイクロスフェアを実施例１−(５)と同様にしてマイクロスフェア分散液(薬物割合：１０.０ｍｇ／ｍｌ)を調製した。
【００８２】
実施例３
(１)乳酸重合体(平均分子量２００００；ＰＬＡ００２０：和光純薬製))を用いること以外は、実施例１−(１)〜(４)と同様にして、マイクロスフェア１.５ｇを得た。
実施例１−(４)と同様にしてマイクロスフェア中の薬物含有量および平均粒子径を測定した。その結果、薬物含有量は３.７３％、平均粒子径は５２.２μｍであった。
(２)上記(１)で得られたマイクロスフェアを実施例１−(５)と同様に処理してマイクロスフェア分散液(薬物割合：２.５ｍｇ／ｍｌ)を調製した。
【００８３】
実施例４
(１)化合物番号(１)０.２ｇおよび乳酸重合体(平均分子量２００００；ＰＬＡ００２０：和光純薬製)０.３ｇに塩化メチレン１.０ｇを添加し、ミキサー(Touch mixer MT-51:Yamato製)にて十分攪拌、溶解することにより、油相(Ｏ)を形成した。
(２)油相を０.２５％メチルセルロース(メトローズ：信越化学社製)水溶液４ｍｌに加え、ホモジナイザー(Polytoron:Kinematica製)を用いて２５℃で５分間乳化することにより、水相に油相が分散した乳化液(Ｏ／Ｗ)を製造した。
(３)この乳化液を精製水４００ｍｌに添加し、スリーワンモーター(新東科学製)を用いて４００ｒｐｍで攪拌しながら、２５℃で３時間液中乾燥することにより塩化メチレンを除去した。
(４)生成するマイクロスフェア懸濁液から、目開き１５０μｍのフィルターを通して凝集物を除去し、目開き２０μｍのフィルターで吸引濾過することにより水相を除去した。得られたマイクロスフェアに少量の精製水を添加して凍結乾燥することでマイクロスフェアを得た。実施例１−(４)と同様にしてマイクロスフェア中の薬物含有量および平均粒子径を測定した。その結果、薬物含有量は３９.６％、平均粒子径は３３.４μｍであった。
【００８４】
実施例５
(１)化合物番号(１)０.０５ｇおよび乳酸−グリコール酸共重合体(乳酸／グリコール酸＝５０／５０；平均分子量２００００；Ｒ２０２Ｈ：ベーリンガーインゲルハイム社製)０.４５ｇに塩化メチレン１.０ｇを添加し、ミキサー(Touch mixer MT-51:Yamato製)にて十分攪拌、溶解することにより、油相(Ｏ)を形成した。
(２)油相を０.５％ポリビニルアルコール(ゴセノールＥＧ−４０：日本合成化学工業製)水溶液４０ｍｌに加え、ホモジナイザー(Polytoron:Kinematica製)を用いて２５℃で４分間乳化することにより、水相に油相が分散した乳化液(Ｏ／Ｗ)を製造した。
(３)この乳化液を予め４００ｍｌの精製水を入れた円筒状密閉容器(内径１１０ｍｍ；内容積１０００ｍｌ)に注ぎ、スリーワンモーター(BL-600;HEIDON社製)に装着した直径５０ｍｍの４枚攪拌羽根(プロペラＲ型；HEIDON社製)により２５℃、４００ｒｐｍで攪拌すると同時に、容器内に挿入した円筒型シリコーンゴム製中空糸膜モジュール(永柳工業株式会社製)を用い、中空糸の内側に窒素ガスを通気して容器内から塩化メチレンを除去した。この際の窒素ガス通気速度は２Ｌ／分とした。この操作を１時間行った。
【００８５】
なお、円筒型シリコーンゴム製中空膜糸モジュールとしては、次の仕様を有するNAGASEP M60-1800円筒型を使用した。
円筒の直径 ：１００ｍｍ
円筒の長さ ：１２０ｍｍ×１２０ｍｍ
中空糸膜の膜厚 ：６０μｍ
中空糸膜の内径 ：２００μｍ
中空糸膜の外径 ：３２０μｍ
中空糸の本数 ：１８００
中空糸膜の有効膜面積：０.１５ｍ２
【００８６】
(４)生成するマイクロスフェア懸濁液から、目開き１５０μｍのフィルターを通して凝集物を除去し、目開き２０μｍのフィルターで吸引濾過することにより水相を除去した。得られたマイクロスフェアに少量の精製水を添加して凍結乾燥することでマイクロスフェアを０.２６ｇ得た。実施例１−(４)と同様にしてマイクロスフェア中の薬物含有量および平均粒子径を測定した。その結果、薬物含有量は３.０７％、平均粒子径は７１.７μｍであった。
【００８７】
実施例６
(１)化合物番号(２)０.０５ｇおよび乳酸−グリコール酸共重合体(乳酸／グリコール酸＝５０／５０；平均分子量２００００；ＲＧ５０２Ｈ：ベーリンガーインゲルハイム社製)０.４５ｇに塩化メチレン２.５ｇを添加し、ミキサー(Touch mixer MT-51：Yamato製)にて十分攪拌、溶解することにより、油相(Ｏ)を形成した。
(２)油相を０.５％ポリビニルアルコール(ポバールＰＶＡ−２２０Ｃ：クラレ製)水溶液３ｍｌに加え、ホモジナイザー(Polytoron:Kinematica製)を用いて２２℃で５分間乳化することにより、水相に油相が分散した乳化液(Ｏ／Ｗ)を製造した。
(３)上記(１)および(２)の操作を５回繰り返し、得られた乳化液(５回分)を併せた上で、精製水１０００ｍｌに添加し、スリーワンモーター(新東科学製)を用いて４００ｒｐｍで攪拌しながら、２５℃で１時間３０分、次いで４０℃で１時間、２５℃で３０分間液中乾燥することにより塩化メチレンを除去した。
(４)生成するマイクロスフェア懸濁液から、目開き１５０μｍのフィルターを通して凝集物を除去し、目開き２０μｍのフィルターで吸引濾過することにより水相を除去した。得られたマイクロスフェアに少量の精製水を添加して凍結乾燥することでマイクロスフェア２.３ｇを採取した。
【００８８】
得られたマイクロスフェア１０ｍｇをアセトニトリル３ｍｌに溶解し、０.５Ｍ塩化ナトリウム水溶液６ｍｌを加えてミキサー(Touch mixer MT-51:Yamato製)にて攪拌後、２０００ｒｐｍで５分遠心分離し、上清を分取した。上清の一部をＵＶ−ＨＰＬＣ(カラム；Hypersil 5-ODS 直径４ｍｍ、長さ３００ｍｍ：ジーエルサイエンス製、測定波長：２４０ｎｍ)にかけ、別途作成した薬物溶液の検量線からこれに含まれる薬物量を測定し、これと上清量とからマイクロスフェア中の薬物含有量を算出した。また、実施例１−(４)と同様にして平均粒子径を測定した。その結果、薬物含有量は９.９％、平均粒子径は２６.４μｍであった。
(５)上記(４)で得られたマイクロスフェアを実施例１−(５)と同様に処理してマイクロスフェア分散液(薬物割合：０.１ｍｇ／ｍｌ)を調製した。
【００８９】
実施例７
(１)乳酸−グリコール酸共重合体(乳酸／グリコール酸＝７５／２５；平均分子量２００００；ＰＬＧＡ７５２０：和光純薬製)を用いること、ならびに塩化メチレンの添加量を２.０ｇとする以外は、実施例６−(１)〜(４)と同様にして、マイクロスフェア２.２ｇを得た。
実施例６−(４)と同様にしてマイクロスフェア中の薬物含有量および平均粒子径を測定した。その結果、薬物含有量は１０.１％、平均粒子径は２７.０μｍであった。
(２)上記(１)で得られたマイクロスフェアを実施例６−(５)と同様に処理してマイクロスフェア分散液(薬物割合：０.１ｍｇ／ｍｌ)を調製した。
【００９０】
対照例１(実施例２の対照)
(１) 乳酸−グリコール酸共重合体(乳酸／グリコール酸＝５０／５０；平均分子量２００００；ＰＬＧＡ５０２０：和光純薬)０.６ｇと乳酸重合体(平均分子量２００００)１.４ｇに塩化メチレン４.０ｇを添加し、３０分間振盪溶解することにより油相(Ｏ)を形成する。以下、実施例１−(１)〜(４)と同様にして、薬物を含まないマイクロスフェア１.７ｇを得た。
(２)上記(１)で得られたマイクロスフェアを実施例１−(５)と同様にして、マイクロスフェア分散液(分散液中のマイクロスフェア分散濃度は実施例２−(３)と同一)を調製した。
対照例２(実施例７の対照)
乳酸−グリコール酸共重合体(乳酸／グリコール酸＝７５／２５；平均分子量２００００；ＰＬＧＡ７５２０：和光純薬製)０.４５ｇに塩化メチレン２.０ｇを添加し、ミキサー(Touch mixer MT-51:Yamato製)にて十分攪拌、溶解することにより、油相を形成した。以下、実施例６−(２)〜(４)と同様にして、薬物を含まないマイクロスフェア２.２ｇを得た。
【００９１】
試験例１
試験管にマイクロスフェア１０ｍｇを入れ、０.０５％ Ｔｗｅｅｎ８０含有リン酸緩衝液(ｐＨ７.４)の１０ｍｌを添加し、３７℃の空気恒温庫中の回転培養機にて２５ｒｐｍで攪拌した。攪拌開始時から一定時間後に、溶出液を遠心分離(２０００ｒｐｍ、５分)し、上清から９ｍｌをサンプリングして、ＦＬ−ＨＰＬＣ(カラム；Hypersil 5-ODS 直径４ｍｍ、長さ３００ｍｍ：ジーエルサイエンス製、励起波長：３１５ｎｍ、蛍光波長：４６５ｎｍ)にかけ、別途作成した薬物溶液の検量線からこれに含まれる薬物量を測定し、これとサンプリングの量とから薬物溶出量を算出した。
また、サンプリング後の試験管に、ｐＨ７.４リン酸緩衝液９ｍｌを添加し、同様の条件で攪拌、サンプリングして薬物溶出量を算出する操作を経時的に繰り返した。
【００９２】
最終のサンプリング後、試験管から残りの溶出液を除去し、残存するマイクロスフェア中に含まれる薬物量を実施例１−(４)の方法で測定した。
この操作を実施例１、実施例２ならびに実施例３で得られたマイクロスフェアについて行った。その結果を図５に示す。
なお、溶出した薬物量とマイクロスフェアに残存した薬物量の合計を１００％として、溶出率を算出した。
【００９３】
試験例２
ＳＤ系雄性ラット(７週令、１群３匹、日本ＳＬＣ)を１２時間照明、室温：２３±２℃、自由摂水・摂餌の条件下で１週間の馴化期間後、ポリエチレングリコール４００(和光純薬社製)を１０％含んだ生理食塩水に溶解した化合物番号(１)(１ｍｇ／ｍｌ)を１匹当たり０.５ｍｌ(総薬物投与量：０.５ｍｇ／ラット)の割合で大腿静脈から急速投与した。
薬物投与後、経時的にエーテル麻酔下で頚静脈よりヘパリンを添加した注射筒で血液を採取し遠心分離により血漿を得た。血漿０.１ｍｌに内部標準溶液と１Ｍのリン酸水素２カリウム０.２ｍｌを添加し、クロロホルム７.０ｍｌを添加後、１０分間振とう、５分間遠心分離して５ｍｌの有機相を分取した。採取した有機相を窒素気流下、４０℃で蒸発乾固し、移動相の０.５ｍｌで再溶解後にＦＬ−ＨＰＬＣ(カラム；Hypersil 5-ODS 直径４ｍｍ、長さ３００ｍｍ：ジーエルサイエンス製、励起波長：３１５ｎｍ、蛍光波長：４６５ｎｍ)により血漿中濃度を測定した。その結果を図６に示す。
【００９４】
試験例３
ＳＤ系雄性ラット(７週令、１群５匹、日本ＳＬＣ)を１２時間照明、室温：２３±２℃、自由摂水・摂餌の条件下で１週間の馴化期間後、実施例１−(５)、実施例２−(２)、実施例３−(２)で得られたマイクロスフェア分散液を１匹当たり２ｍｌ(総薬物投与量：５ｍｇ／ラット)の割合で背部皮下に投与した。薬物投与後、経時的にエーテル麻酔下で頚静脈よりヘパリンを添加した注射筒で血液を採取し遠心分離により血漿を得た。血漿中の化合物濃度は試験例２と同様の方法で測定した。ＰＤＥ４阻害剤をマイクロスフェア化することにより、ＰＤＥ４阻害剤を１／１０量しか含まない生理食塩水溶液を静脈注射した場合(試験例２)と比べても、ＰＤＥ４阻害剤の最高血漿中濃度を１／２５の１〜１／１００に抑制することが出来た。その結果を図７に示す。
【００９５】
試験例４
ＳＤ系雄性ラット(７週令、１群５匹、日本ＳＬＣ)を１２時間照明、室温：２３±２℃、自由摂水・摂餌の条件下で１週間の馴化期間後、実施例２−(２)で得られたマイクロスフェア分散液を１匹当たり２ｍｌ(総薬物投与量：５ｍｇ／ラット)の割合で背部皮下に投与した。
薬物投与３、７、１０、１４、２１、３５日後、投与部位よりマイクロスフェアを回収した。回収したマイクロスフェアに内部標準物質を含有したアセトニトリル５ｍｌを添加して、ホモジナイザー(Polytoron:Kinematica製)で溶解した。３０００ｒｐｍ、５分間遠心分離後の上清３ｍｌを採取し、０.５Ｍ塩化ナトリウム水溶液７ｍｌを加えてミキサー(Touch mixer MT-51:Yamato製)にて攪拌後、２０００ｒｐｍで５分遠心分離し、上清を分取した。上清の一部をＫＣプレップオムニ１３(片山化学社製)で濾過してＦＬ−ＨＰＬＣ(カラム；Hypersil 5-ODS 直径４ｍｍ、長さ３００ｍｍ：ジーエルサイエンス製、励起波長：３１５ｎｍ、蛍光波長：４６５ｎｍ)にかけ、別途作成した薬物溶液の検量線からこれに含まれる薬物量を測定し、これと上清量とからマイクロスフェア中の薬物残存量を算出した。その結果を図８に示す。
【００９６】
試験例５
ＳＤ系雄性ラット(７週令、日本ＳＬＣ)を１２時間照明、室温：２３±２℃、自由摂水・摂餌の条件下で１週間の馴化期間後、実施例６−(５)ならびに７−(２)で得られた化合物番号(２)含有マイクロスフェア分散液を１匹当たり１ｍｌ(総薬物投与量：０.１ｍｇ／ラット)の割合で背部皮下に投与した。
経時的に投与部位よりマイクロスフェアを回収し、アセトニトリル１０ｍｌを添加してホモジナイザー(Polytoron:Kinematica製)で溶解した。３０００ｒｐｍ、５分間遠心分離後の上清３ｍｌを採取し、０.５Ｍ塩化ナトリウム水溶液６ｍｌを加えてミキサー(Touch mixer MT-51:Yamato製)にて攪拌後、２０００ｒｐｍで５分遠心分離し、上清を分取した。上清の一部をＫＣプレップオムニ１３(片山化学社製)で濾過してＵＶ−ＨＰＬＣ(カラム；Hypersil 5-ODS 直径４ｍｍ、長さ３００ｍｍ：ジーエルサイエンス製、測定波長：２４０ｎｍ)にかけ、別途作成した薬物溶液の検量線からこれに含まれる薬物量を測定し、これと上清量とからマイクロスフェア中の薬物残存量を算出した。その結果を図９に示す。
【産業上の利用可能性】
【００９７】
従来、軟骨疾患については薬物療法では保存的治療しか行えないと考えられていたにも拘わらず、本発明の軟骨疾患修復治療用組成物は、ＰＤＥ４阻害剤を有効成分とし、特に、軟骨疾患部位に局所投与することにより、ＰＤＥ４阻害剤の全身作用による副作用を伴うことなく、軟骨を修復することができ、軟骨疾患、特に変形性関節症に修復治療効果を発揮する。また、ＰＤＥ４阻害剤と生体内適合性かつ生体内分解性ポリマーを含有する組成物をデポ剤の形とし、特にマイクロスフェア形態で注射剤として軟骨疾患部位に局所的に注射することにより持続的に効果を発揮することができ、さらに優れた効果が得られる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化合物番号（１）、（２）、（９）、（１１）、（２１）、（２７）、（４４）、（５２）、（５３）、（５６）または（５７）またはその薬理的に許容しうる塩から選ばれる１種または２種以上のＰＤＥ４阻害剤を有効成分とする軟骨疾患修復治療用組成物。
【化１】
【化２】
【化３】
【化４】
【化５】
【化６】
【化７】
【化８】
【化９】
【化１０】
【請求項２】
ＰＤＥ４阻害剤が、下記化合物番号（１）、（２）、（５２）、（５３）、（５６）または（５７）またはその薬理的に許容しうる塩から選ばれる１種または２種以上である請求項１に記載の組成物。
【化１１】
【化１２】
【化１３】
【化１４】
【化１５】
【請求項３】
ＰＤＥ４阻害剤が、下記化合物番号（１）または（２）から選ばれる化合物またはその薬理的に許容しうる塩である請求項１記載の組成物。
【化１６】
【請求項４】
ＰＤＥ４阻害剤が、下記化合物番号（１）またはその薬理的に許容しうる塩である請求項２記載の組成物。
【化１７】
【請求項５】
ＰＤＥ４阻害剤が、下記化合物番号（２）またはその薬理的に許容しうる塩である請求項２記載の組成物。
【化１８】
【請求項６】
局所投与用である請求項１〜５のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１】
下記化合物番号（１）、（２）、（９）、（１１）、（２１）、（２７）、（４４）、（５２）、（５３）、（５６）または（５７）またはその薬理的に許容しうる塩から選ばれる１種または２種以上のＰＤＥ４阻害剤を有効成分とする軟骨疾患修復治療用組成物。
【化１】
【化２】
【化３】
【化４】
【化５】
【化６】
【化７】
【化８】
【化９】
【化１０】
【請求項２】
ＰＤＥ４阻害剤が、下記化合物番号（１）、（２）、（５２）、（５３）、（５６）または（５７）またはその薬理的に許容しうる塩から選ばれる１種または２種以上である請求項１に記載の組成物。
【化１１】
【化１２】
【化１３】
【化１４】
【化１５】
【請求項３】
ＰＤＥ４阻害剤が、下記化合物番号（１）または（２）から選ばれる化合物またはその薬理的に許容しうる塩である請求項１記載の組成物。
【化１６】
【請求項４】
ＰＤＥ４阻害剤が、下記化合物番号（１）またはその薬理的に許容しうる塩である請求項２記載の組成物。
【化１７】
【請求項５】
ＰＤＥ４阻害剤が、下記化合物番号（２）またはその薬理的に許容しうる塩である請求項２記載の組成物。
【化１８】
【請求項６】
局所投与用である請求項１〜５のいずれか１項記載の組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１０−１５５８５０（Ｐ２０１０−１５５８５０Ａ）
【公開日】平成２２年７月１５日（２０１０．７．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−３２７４８（Ｐ２０１０−３２７４８）
【出願日】平成２２年２月１７日（２０１０．２．１７）
【分割の表示】特願２００２−５９１０３６（Ｐ２００２−５９１０３６）の分割
【原出願日】平成１４年５月２２日（２００２．５．２２）
【出願人】（０００００２９５６）田辺三菱製薬株式会社 (225)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年７月１５日（２０１０．７．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月１７日（２０１０．２．１７）
【分割の表示】特願２００２−５９１０３６（Ｐ２００２−５９１０３６）の分割
【原出願日】平成１４年５月２２日（２００２．５．２２）
【出願人】（０００００２９５６）田辺三菱製薬株式会社 (225)
【Ｆターム（参考）】
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