転写産物の安定性と翻訳効率の向上をもたらすＲＮＡの修飾
【課題】ＲＮＡに基づくワクチンなど、免疫療法に適用可能な、安定性および翻訳効率が向上されたＲＮＡおよびこのようなＲＮＡを得るための手段を提供する。
【解決手段】プロモーター、転写可能な核酸配列、及び連続するＡヌクレオチド配列を含む、制限切断によって直鎖化された後、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写可能な前記配列を有する閉館分子。宿主細胞をトランスフェクトするための前記転写されたＲＮＡの使用。前記トランスフェクトされた抗原提示細胞、特に、樹状細胞、単球またはマクロファージ。
【解決手段】プロモーター、転写可能な核酸配列、及び連続するＡヌクレオチド配列を含む、制限切断によって直鎖化された後、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写可能な前記配列を有する閉館分子。宿主細胞をトランスフェクトするための前記転写されたＲＮＡの使用。前記トランスフェクトされた抗原提示細胞、特に、樹状細胞、単球またはマクロファージ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
弱毒または不活性化された病原体を含む従来のワクチンは多くの分野で有効であるものの、いくつかの感染性病原体や腫瘍に対しては有効な防御免疫を付与しない。これには有効で、用途が広く、生産が容易かつコスト効果があり、保存が容易なワクチンが必要である。
【背景技術】
【０００２】
プラスミドＤＮＡを直接筋肉注射した後では、コードされている遺伝子の細胞表面での発現が持続することが示されており（Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ．， １９９０）、ＤＮＡに基づくワクチンが新たな有望な免疫戦略としてみなされている。これは核酸に基づくワクチンを開発するための重要な動機となった。当初、感染性病原体に対するＤＮＡに基づくワクチンが試験されたが（Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．， １９９３； Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９９３； Ｕｌｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９３； Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９３）、すぐに、特異的抗腫瘍免疫を誘導することを目的とする対腫瘍遺伝子療法においてさらに詳細に研究されるようになった（Ｃｏｎｒｙ ｅｔ ａｌ．， １９９４； Ｃｏｎｒｙ ｅｔ ａｌ．， １９９５ａ； Ｓｐｏｏｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９５； Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９５）。この腫瘍免疫の戦略には重要な利点がいくつかある。核酸に基づくワクチンは製造が容易で、比較的安価である。さらに、この核酸に基づくワクチンは少数の細胞から増幅させることができる。
【０００３】
ＤＮＡはＲＮＡよりも安定であるが、抗ＤＮＡ抗体の誘導（Ｇｉｌｋｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９５）および宿主ゲノムへの導入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎ）の組込みなど、安全性に対する潜在的なリスクがいくつかある。これは細胞の遺伝子を不活性化し、該導入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎ）の制御できない長期的発現または発癌を招き、従って、例えばｅｒｂ−Ｂ２（Ｂａｒｇｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９８６）やｐ５３（Ｇｒｅｅｎｂｌａｔｔ ｅｔ ａｌ．， １９９４）などの発癌能を有する腫瘍関連抗原には通常適用できない。ＲＮＡの使用はこれらの潜在的リスクを回避するための魅力的な代替法となる。
【０００４】
可逆的な遺伝子療法の一種としてＲＮＡを用いることの利点には、一時的発現および非形質転換特性が含まれる。ＲＮＡはトランスジェニック的に発現させるために核に入る必要がなく、もっと言えば、宿主ゲノムに組み込まれることはなく、それにより発癌のリスクがなくなる。ＤＮＡを用いる場合 （Ｃｏｎｄｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９６； Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９２）と同様、ＲＮＡの注射もまた、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞性免疫応答と体液性免疫応答の双方を誘導し得る（Ｈｏｅｒｒ ｅｔ ａｌ．， ２０００； Ｙｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。
【０００５】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡ（ＩＶＴ−ＲＮＡ）による免疫療法は、双方とも種々の動物モデルにおいて引き続いて試験されている２つの異なる戦略の使用に至らせる。ＲＮＡは種々の免疫経路を介して直接注入される（Ｈｏｅｒｒ ｅｔ ａｌ．， ２０００）か、または樹状細胞（ＤＣ）がリポフェクションもしくはエレクトロポレーションにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡでトランスフェクトされ、その後投与される（Ｈｅｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０００）。最近発表された研究では、ＲＮＡでトランスフェクトされたＤＣによる免疫化は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を誘導ことが示されている（Ｓｕ ｅｔ ａｌ．， ２００３； Ｈｅｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００２）。Ｔ細胞介在性の免疫応答の最適な誘導の中枢的に重要な因子はとりわけ用量、すなわち、ＤＣに対する抗原提示の密度である。導入されたＩＶＴ−ＲＮＡの長期発現を達成するためには、種々の修飾によりＩＶＴ−ＲＮＡを安定化させる、それにより、ＤＣに対する抗原提示を高めることが試みられている。翻訳の基本要件は、その翻訳効率がポリ（Ａ）の長さに相関する３’ポリ（Ａ）配列が存在することである（Ｐｒｅｉｓｓ ａｎｄ Ｈｅｎｔｚｅ， １９９８）。５’キャップおよび３’ポリ（Ａ）配列は相乗作用的にｉｎ ｖｉｖｏ翻訳を活性化する（Ｇａｌｌｉｅ， １９９１）。グロビン遺伝子の非翻訳領域（ＵＴＲ）は、ＲＮＡの安定化および翻訳効率の増強に寄与し得る他の公知のエレメントである（Ｍａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．， １９８９）。
【０００６】
いくつかのＩＶＴベクターは文献で知られ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写の鋳型として標準的な方法で使用され、安定化されたＲＮＡ転写産物が生成されるように遺伝的に修飾されている。これまでに文献に記載されているプロトコール（Ｃｏｎｒｙ ｅｔ ａｌ．， １９９５ｂ； Ｔｅｕｆｅｌ ｅｔ ａｌ．， ２００５； Ｓｔｒｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９７； Ｃａｒｒａｌｏｔ ｅｔ ａｌ．， ２００４； Ｂｏｃｚｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， ２０００）は、次の構造：ＲＮＡ転写を可能とする５’ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、それに続く、３’および／または５’のいずれかで非翻訳領域（ＵＴＲ）にフランキングされた目的遺伝子、および５０〜７０Ａヌクレオチドを含む３’ポリアデニルカセットを有するプラスミドベクターに基づく。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写前に、この環状プラスミドは、ＩＩ型制限酵素（認識配列は切断部位に相当する）によりポリアデニルカセットの下流で線状化される。よって、このポリアデニルカセットは、その転写産物において後期ポリ（Ａ）配列に相当する。この手順の結果として、いくつかのヌクレオチドが線状化後に酵素切断部位の一部として残り、その３’末端においてポリ（Ａ）配列を延長するか、またはマスクする。この非生理学的オーバーハングがこのような構築物から細胞内で産生されるタンパク質の量に影響を及ぼすかどうかは明らかでない。
【０００７】
よって、ＲＮＡは臨床適用に特に好適であると思われる。しかしながら、遺伝子療法におけるＲＮＡの利用は、特に細胞質ではＲＮＡの短い半減期により著しく制限され、その結果、タンパク質発現は低くなる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、安定性および翻訳効率が向上されたＲＮＡおよびこのようなＲＮＡを得るための手段を提供することである。該ＲＮＡを遺伝子療法アプローチに用いることで、高いグレードの発現が得られるに違いない。
【０００９】
この目的は特許請求の範囲の主題により本発明に従い達成される。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡの安定化およびｍＲＮＡ翻訳の増強に関する。本発明は特に、転写産物の安定性および翻訳効率の向上をもたらすＲＮＡ、特にｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡの３つの修飾に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、オープンエンド型ポリ（Ａ）配列を有するＲＮＡは、末端がマスクされたポリ（Ａ）配列を有するＲＮＡより効率的に翻訳されることが分かった。特に約１２０ ｂｐの長いポリ（Ａ）配列は最適なＲＮＡ転写産物の安定性と翻訳効率をもたらすことが分かった。本発明はまた、ＲＮＡ分子において、特にヒトβ−グロビン遺伝子の二重の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）が、個々の２つのＵＴＲを用いた場合に予測されるトータル効果を明らかに超えるほどに翻訳効率を向上させることが実証された。本発明によれば、上記の修飾の組合せは、ＲＮＡの安定化および翻訳の増強に相乗作用を有することが分かった。
【００１２】
転写産物の量およびタンパク質収量を測定するための定量的ＲＴ−ＰＣＲおよびｅＧＦＰ変異体を用い、本発明は、本発明のＲＮＡ修飾が樹状細胞（ＤＣ）のトランスフェクションにおいて独立にＲＮＡの安定性と翻訳効率増強することを実証した。よって、トランスフェクトされた細胞上での抗原特異的ペプチド／ＭＨＣ複合体の密度ならびに抗原特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激および拡大するそれらの能力を増強することができた。よって、本発明は、本発明に記載のＲＮＡ修飾により修飾されたＲＮＡを用いることでＲＮＡトランスフェクトＤＣワクチンを至適化するための戦略に関する。
【００１３】
本発明によれば、修飾、およびそれによるＲＮＡの安定化および／または翻訳効率の向上は好ましくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＲＮＡ転写の鋳型として好ましく働く発現ベクターを遺伝的に修飾することにより達成される。
【００１４】
この種のベクターは特に、好ましくは該ＲＮＡにオープンエンドを有する、すなわち、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドが該ポリ（Ａ）配列の３’末端にフランキングしていないポリ（Ａ）配列を有するＲＮＡを転写させることを意図する。該ＲＮＡにおけるオープンエンド型ポリ（Ａ）配列は、５’ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御下でＲＮＡを転写させ、ポリアデニルカセット（ポリ（Ａ）配列）を含む発現ベクターにＩＩＳ型制限切断部位を導入することにより達成することができ、この認識配列はポリ（Ａ）配列の３’に位置し、切断部位は上流、従ってポリ（Ａ）配列内に位置する。このＩＩＳ型制限切断部位における制限切断により、プラスミドをポリ（Ａ）配列内で線状化することができる（図２）。その後、線状化プラスミドをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のための鋳型として用い、マスクされていないポリ（Ａ）配列で終わる転写産物を得ることができる。
【００１５】
その上、またはその代わりに、修飾、ならびにそれによるＲＮＡの安定化および／または翻訳効率の向上は、本発明に従い、その３’末端に、好ましくはペプチドまたはタンパク質をコードする配列（オープンリーディングフレーム）とポリ（Ａ）配列との間に２以上の３’非翻訳領域を有するＲＮＡを転写させるように発現ベクターを遺伝的に修飾することで達成することができる。
【００１６】
一態様では、本発明は、５’→３’転写方向に、（ａ）プロモーター；（ｂ）転写可能な核酸配列または転写可能な核酸配列を導入するための核酸配列；（ｃ−１）遺伝子の３’非翻訳領域に相当する、またはそれに由来する第一の核酸配列；および（ｃ−２）遺伝子の３’非翻訳領域に相当する、またはそれに由来する第二の核酸配列を含む核酸分子に関する。
【００１７】
一実施形態では、本発明の核酸分子は、（ｃ−３）遺伝子の３’ 非翻訳領域に相当する、またはそれに由来する少なくとも１つのさらなる核酸配列をさらに含む。
【００１８】
本発明の核酸分子では、プロモーター（ａ）の制御下の核酸配列（ｂ）、（ｃ−１）、（ｃ−２）および適当であれば（ｃ−３）は転写されて、核酸配列（ｃ−１）および／または（ｃ−２）および／または適当であれば（ｃ−３）から転写された核酸配列に、好ましくは転写可能な核酸配列（ｂ）から転写された核酸配列の翻訳効率および／または安定性を高めるような活性がある共通転写産物を生じ得ることが好ましい。
【００１９】
核酸配列（ｃ−１）、（ｃ−２）および適当であれば（ｃ−３）は同一であっても異なっていてもよい。
【００２０】
一実施形態では、該核酸配列は、（ｄ）プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする核酸配列をさらに含む。
【００２１】
プロモーター（ａ）の制御下の核酸配列（ｂ）、（ｃ−１）、（ｃ−２）、適当であれば（ｃ−３）および（ｄ）は転写されて、核酸配列（ｃ−１）および／または（ｃ−２）および／または適当であれば（ｃ−３）および／または（ｄ）から転写された核酸配列に、好ましくは転写可能な核酸配列（ｂ）から転写された核酸配列の翻訳効率および／または安定性を高めるような活性がある共通転写産物を生じ得ることが好ましい。
【００２２】
特定の実施形態では、核酸配列（ｄ）は、プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に少なくとも４０、好ましくは少なくとも８０、好ましくは少なくとも１００、特に約１２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする。核酸配列（ｄ）は、プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に５００まで、好ましくは４００まで、好ましくは３００まで、好ましくは２００まで、特に１５０までの連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードするのが好ましい。
【００２３】
一実施形態では、該核酸分子は、切断が５’→３’転写方向に、プロモーター（ａ）、核酸配列（ｂ）、核酸配列（ｃ−１）、（ｃ−２）および適当であれば（ｃ−３）、ならびに核酸配列（ｄ）の少なくとも一部（この核酸配列（ｄ）の少なくとも一部は、プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードし、その転写産物において３’末端ヌクレオチドは少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドの該ヌクレオチド配列のＡヌクレオチドである）を含む核酸分子を生じるように、核酸配列（ｄ）内で、好ましくは酵素的にまたは別の生化学的方法で切断され得ることを特徴とする。
【００２４】
好ましくは、切断後、該核酸分子は、少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列の鋳型として働く鎖の末端に、その転写産物において少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列の鋳型として働くヌクレオチド配列の一部であるＴヌクレオチドを有する。
【００２５】
特定の実施形態では、核酸配列（ｄ）の少なくとも一部は、プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に少なくとも４０、好ましくは少なくとも８０、好ましくは少なくとも１００、特に約１２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする。核酸配列（ｄ）は、プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に５００まで、好ましくは４００まで、好ましくは３００まで、好ましくは２００まで、特に１５０までの連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードするのが好ましい。
【００２６】
本発明の核酸分子は好ましくは、切断前には閉環分子であり、切断後には直鎖分子である。
【００２７】
好ましくはＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの制限切断部位である制限切断部位の助けで切断が行われるのが好ましい。
【００２８】
一実施形態では、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの認識配列は核酸配列（ｄ）の３’末端の５〜２６塩基対、好ましくは２４〜２６塩基対下流に位置する。
【００２９】
好ましい実施形態では、核酸配列（ｃ−１）、（ｃ−２）および適当であれば（ｃ−３）は互いに独立にα２−グロビン、α１−グロビン、β−グロビンおよび成長ホルモン、好ましくは、ヒトβ−グロビンなどのグロビン遺伝子からなる群から選択される遺伝子に由来し、特に好ましい実施形態では、配列表の配列番号１の核酸配列またはそれに由来する核酸配列に相当する。
【００３０】
さらなる態様において、本発明は、５’→３’転写方向に、（ａ）プロモーター；（ｂ）転写可能な核酸配列または転写可能な核酸配列を導入するための核酸配列；および（ｃ）プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする核酸配列を含む核酸分子に関する。
【００３１】
プロモーター（ａ）の制御下の核酸配列（ｂ）および（ｃ）は転写されて、核酸配列（ｃ）から転写された核酸配列に、好ましくは転写可能な核酸配列（ｂ）から転写された核酸配列の翻訳効率および／または安定性を高めるような活性がある共通転写産物を生じ得ることが好ましい。
【００３２】
特定の実施形態では、核酸配列（ｃ）は、プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に少なくとも４０、好ましくは少なくとも８０、好ましくは少なくとも１００、特に約１２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする。核酸配列（ｃ）は、プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に５００まで、好ましくは４００まで、好ましくは３００まで、好ましくは２００まで、特に１５０までの連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードするのが好ましい。
【００３３】
一実施形態では、該核酸分子は、切断が５’→３’転写方向に、プロモーター（ａ）、核酸配列（ｂ）、および核酸配列（ｃ）の少なくとも一部（この核酸配列（ｃ）の少なくとも一部は、プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードし、その転写産物において３’末端ヌクレオチドは少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドの該ヌクレオチド配列のＡヌクレオチドである）を含む核酸分子を生じるように、核酸配列（ｃ）内で、好ましくは酵素的にまたは別の生化学的方法で切断され得る。
【００３４】
好ましくは、切断後、該核酸分子は、少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列の鋳型として働く鎖の末端に、その転写産物において少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列の鋳型として働くヌクレオチド配列の一部であるＴヌクレオチドを有する。
【００３５】
特定の実施形態では、核酸配列（ｃ）の少なくとも一部は、プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に少なくとも４０、好ましくは少なくとも８０、好ましくは少なくとも１００、特に約１２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする。核酸配列（ｃ）は、プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に５００まで、好ましくは４００まで、好ましくは３００まで、好ましくは２００まで、特に１５０までの連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードするのが好ましい。
【００３６】
該核酸分子は好ましくは、切断前には閉環分子であり、切断後には直鎖分子である。
【００３７】
好ましくはＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの制限切断部位である制限切断部位の助けで切断が行われるのが好ましい。
【００３８】
一実施形態では、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの認識配列は核酸配列（ｃ）の３’末端の５〜２６塩基対、好ましくは２４〜２６塩基対下流に位置する。
【００３９】
本発明の１つの核酸分子では、転写可能な核酸配列は好ましくはペプチドまたはタンパク質をコードする核酸配列を含み、転写可能な核酸配列を導入するための核酸配列は好ましくは多重クローニング部位である。
【００４０】
本発明の核酸分子は、（ｉ）レポーター遺伝子；（ｉｉ）選択マーカー；および（ｉｉｉ）複製起点からなる群から選択される１以上のメンバーをさらに含み得る。
【００４１】
一実施形態では、本発明の核酸分子は閉環コンフォメーションであり、特に線状化後に、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写に好適であるのが好ましい。
【００４２】
さらなる態様では、本発明は、上記の核酸分子の線状化により、好ましくは少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする核酸配列内での切断により得られる核酸分子、ならびにプロモーター（ａ）の制御下、上記の核酸分子との転写、好ましくはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により得られるＲＮＡに関する。
【００４３】
さらなる態様では、本発明は、その安定性および／または翻訳効率を高めるよう選択されたＲＮＡ分子をｉｎ ｖｉｔｒｏで転写させる方法であって、（ｉ）遺伝子の３’非翻訳領域に相当する、またはそれに由来する第一の核酸配列（ｂ−１）を、転写されて該ＲＮＡ分子を生じ得る核酸配列（ａ）の３’末端に結合させること、（ｉｉ）遺伝子の３’非翻訳領域に相当する、またはそれに由来する第二の核酸配列（ｂ−２）を、該第一の核酸配列（ｂ−１）の３’末端に結合させること、および（ｉｉｉ）得られた核酸をｉｎ ｖｉｔｒｏで転写させることを含む方法に関する。
【００４４】
さらなる態様において、本発明は、その発現を増強するよう選択されたｍＲＮＡ分子を転写させる方法であって、（ｉ）遺伝子の３’非翻訳領域に相当する、またはそれに由来する第一の核酸配列（ｂ−１）を、転写されて該ＲＮＡ分子を生じ得る核酸配列（ａ）の３’末端に結合させること、（ｉｉ）遺伝子の３’非翻訳領域に相当する、またはそれに由来する第二の核酸配列（ｂ−２）を、該第一の核酸配列（ｂ−１）の３’末端に結合させること、および（ｉｉｉ）得られた核酸を転写させることにより得ることができるｍＲＮＡを翻訳することを含む方法に関する。転写は好ましくはｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる。
【００４５】
本発明おいて「核酸配列を核酸配列の３’末端に結合させる」とは、第一の核酸配列が第二の核酸配列の下流になり、付加的核酸配列により後者から離されてもよいような、２つの核酸配列の共有結合に関していう。
【００４６】
一実施形態では、本発明の方法は、遺伝子の３’非翻訳領域に相当する、またはそれに由来する少なくとも１つのさらなる核酸配列（ｂ−３）を第二の核酸配列（ｂ−２）の３’末端に結合させることをさらに含む。
【００４７】
核酸配列（ａ）、（ｂ−１）、（ｂ−２）および適当であれば（ｂ−３）は転写されて、核酸配列（ｂ−１）および／または（ｂ−２）および／または適当であれば（ｂ−３）から転写された核酸配列に、好ましくは核酸配列（ａ）により転写された核酸配列の翻訳効率および／または安定性を高めるような活性がある共通転写産物を生じ得ることが好ましい。
【００４８】
さらなる実施形態では、本発明の方法は、転写された際に、少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする核酸配列（ｃ）を核酸配列（ｂ−２）の、または適当であれば核酸配列（ｂ−３）の３’末端に結合させることをさらに含む。
【００４９】
核酸配列（ａ）、（ｂ−１）、（ｂ−２）および適当であれば（ｂ−３）ならびに（ｃ）は転写されて、核酸配列（ｂ−１）および／または（ｂ−２）および／または適当であれば（ｂ−３）および／または（ｃ）から転写された核酸配列に、好ましくは核酸配列（ａ）から転写された核酸配列の翻訳効率および／または安定性を高めるような活性がある共通転写産物を生じ得ることが好ましい。
【００５０】
特定の実施形態では、核酸配列（ｃ）は、その転写産物に少なくとも４０、好ましくは少なくとも８０、好ましくは少なくとも１００、特に約１２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする。核酸配列（ｃ）は、転写された際に、その転写産物に５００まで、好ましくは４００まで、好ましくは３００まで、好ましくは２００まで、特に１５０までの連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードするのが好ましい。
【００５１】
特定の実施形態では、本発明の方法は、得られた核酸の転写の前に、このようにして得られた核酸の転写が、核酸配列（ａ）、（ｂ−１）、（ｂ−２）および適当であれば（ｂ−３）ならびに少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドの３’末端ヌクレオチド配列から転写された核酸配列を有する転写産物（該転写産物の３’末端ヌクレオチドは少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列のＡヌクレオチドである）を生じるように核酸配列（ｃ）内で切断することをさらに含む。
【００５２】
特定の実施形態では、該転写産物は、その３’末端に少なくとも４０、好ましくは少なくとも８０、好ましくは少なくとも１００、特に約１２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する。該転写産物は、その３’末端に５００まで、好ましくは４００まで、好ましくは３００まで、好ましくは２００まで、特に１５０までの連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列を有するのが好ましい。
【００５３】
好ましい実施形態では、核酸配列（ｂ−１）、（ｂ−２）および適当であれば（ｂ−３）は互いに独立にα２−グロビン、α１−グロビン、β−グロビンおよび成長ホルモン、好ましくはヒトβ−グロビンなどのグロビン遺伝子からなる群から選択される遺伝子に由来し、特に好ましい実施形態では、配列表の配列番号１の核酸配列またはそれに由来する核酸配列に相当する。
【００５４】
さらなる態様において、本発明は、その安定性および／または翻訳効率を高めるよう選択されたＲＮＡ分子をｉｎ ｖｉｔｒｏで転写させる方法であって、（ｉ）転写された際に、少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする核酸配列（ｂ）を、転写されて前記ＲＮＡ分子を生じ得る核酸配列（ａ）の３’末端に結合させること、および（ｉｉ）得られた核酸をｉｎ ｖｉｔｒｏで転写させることを含む方法に関する。
【００５５】
さらなる態様において、本発明は、その発現を増強するよう選択されたｍＲＮＡ分子を翻訳する方法であって、（ｉ）転写された際に、少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする核酸配列（ｂ）を、転写されて前記ｍＲＮＡ分子を生じ得る核酸配列（ａ）の３’末端に結合させること、および（ｉｉ）得られた核酸を転写させることにより得ることができるｍＲＮＡを翻訳することを含む方法に関する。転写はｉｎ ｖｉｔｒｏで行われるのが好ましい。
【００５６】
核酸配列（ａ）および（ｂ）は転写されて、核酸配列（ｂ）から転写された核酸配列に、好ましくは核酸配列（ａ）から転写された核酸配列の翻訳効率および／または安定性を高めるような活性がある共通転写産物を生じ得ることが好ましい。
【００５７】
特定の実施形態では、核酸配列（ｂ）は、その転写産物に少なくとも４０、好ましくは少なくとも８０、好ましくは少なくとも１００、特に約１２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする。核酸配列（ｂ）は、転写された際に、その転写産物に５００まで、好ましくは４００まで、好ましくは３００まで、好ましくは２００まで、特に１５０までの連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードするのが好ましい。
【００５８】
特定の実施形態では、本発明の方法は、得られた核酸の転写の前に、このようにして得られた核酸の転写が、核酸配列（ａ）および少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドの３’末端ヌクレオチド配列から転写された核酸配列を有する転写産物（該転写産物の３’末端ヌクレオチドは少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列のＡヌクレオチドである）を生じるように核酸配列（ｂ）内で切断することをさらに含む。
【００５９】
特定の実施形態では、該転写産物は、その３’末端に少なくとも４０、好ましくは少なくとも８０、好ましくは少なくとも１００、特に約１２０の連続するＡヌクレオチドを有する。該転写産物は、その３’末端に５００まで、好ましくは４００まで、好ましくは３００まで、好ましくは２００まで、特に１５０までの連続するＡヌクレオチドを有するのが好ましい。
【００６０】
本発明の方法の全ての態様において、切断は、好ましくはＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの制限切断部位である制限切断部位の助けで行われるのが好ましい。
【００６１】
一実施形態では、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの認識配列は、転写された際に、少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする核酸配列の３’末端の５〜２６塩基対、好ましくは２４〜２６塩基対下流に位置する。
【００６２】
本発明はまた、選択されたＲＮＡ分子をｉｎ ｖｉｔｒｏで転写させる本発明の方法により得ることができるＲＮＡに関する。本発明の核酸分子から、選択されたＲＮＡ分子をｉｎ ｖｉｔｒｏで転写させる本発明の方法により得ることができる、鋳型としてのＲＮＡ調製物は、そのＲＮＡのポリ（Ａ）配列の長さに関して好ましくは均質または本質的に均質であり、すなわち、このポリ（Ａ）配列の長さは、１０個だけ、好ましくは５個、４個、３個、２個または１個のＡヌクレオチドだけ異なるＲＮＡ分子が調製物中に９０％以下、好ましくは９５％以下、好ましくは９８％または９９％以下である。
【００６３】
本発明は例えば、細胞内での転写および発現において組換えタンパク質の発現を増強するために利用可能である。より具体的には、組換えタンパク質を産生する場合、本発明に記載の修飾およびその組合せを発現ベクターに導入し、細胞系において組換え核酸の転写および組換えタンパク質の発現を増強する目的でそれらを利用することができる。これには例えば、組換え抗体、ホルモン、サイトカインおよび酵素などの生産が含まれる。これによりとりわけ生産コストの低減が可能となる。
【００６４】
また、遺伝子療法適用で、本発明に記載の修飾およびその組合せを利用することもできる。該修飾は遺伝子療法ベクターに導入し、それにより導入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎ）の発現を増強させるために利用することができる。この目的で、いずれの核酸（ＤＮＡ／ＲＮＡ）に基づくベクター系（例えば、プラスミド、アデノウイルス、ポックスウイルスベクター、インフルエンザウイルスベクター、およびαウイルスベクターなど）も使用可能である。例えばリンパ球または樹状細胞では、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて細胞をこれらのベクターでトランスフェクトすることができ、あるいは直接ｉｎ ｖｉｖｏに投与することもできる。
【００６５】
さらに、本発明に記載の修飾およびその組合せは、リボ核酸の安定性および／または発現を、そしてそれにより該リボ核酸によりコードされるペプチドまたはタンパク質の量を増強させることができる。コードリボ核酸は例えば遺伝子の一時的発現ために利用可能であり、可能性のある適用分野としては、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて細胞にトランスフェクトされる、または直接ｉｎ ｖｉｖｏに投与されるＲＮＡに基づくワクチン、例えば細胞において分化プロセスを開始させるため、またはタンパク質の機能を研究するためのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける機能的組換えタンパク質の一時的発現、ならびにｉｎ ｖｉｖｏにおける、特に医薬としての、エリスロポエチン、ホルモン、血液凝固阻害剤などのような機能的組換えタンパク質の一時的発現がある。
【００６６】
本発明に記載の修飾により修飾されたＲＮＡ、特にｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡは特に抗原提示細胞をトラスフェクトするために、従って提示されるべき抗原を送達するため、また、抗原提示細胞に、該ＲＮＡから発現されたまたはそれに由来するペプチドまたはタンパク質に相当する該提示抗原を、特に切断などの細胞内プロセシングにより付加するため（すなわち、この提示抗原は例えばＲＮＡから発現されたペプチドまたはタンパク質の断片である）のツールとして使用することができる。このような抗原提示細胞はＴ細胞、特にＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激するために使用可能である。
【００６７】
発明の詳細な説明
本発明によれば、組換え核酸の作製、細胞の培養および核酸、特にＲＮＡの細胞への導入、特にエレクトロポレーションおよびリポフェクションには、標準的な方法が使用可能である。酵素反応は製造業者の使用説明書に従い、またはそれ自体公知の方法で行われる。
【００６８】
本発明によれば、核酸分子または核酸配列とは、好ましくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）である核酸を指す。本発明によれば、核酸はゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、組換え生産された分子、および化学的に合成された分子を含む。本発明によれば、核酸は一本鎖または二本鎖、および直鎖または共有結合的に閉環した分子の形態であってよい。
【００６９】
「ｍＲＮＡ」とは「メッセンジャーＲＮＡ」を意味し、ＤＮＡを鋳型として生産され、それ自体ペプチドまたはタンパク質をコードする「転写産物」を指す。ｍＲＮＡは一般に５’非翻訳領域、タンパク質コード領域および３’非翻訳領域を含む。ｍＲＮＡは、細胞内でもｉｎ ｖｉｔｒｏでも限られた半減期を有する。本発明によれば、ｍＲＮＡはＤＮＡ鋳型からｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により作製することができる。このｍＲＮＡは、本発明の修飾に加え、さらなる安定化修飾およびキャッピングにより修飾してもよい。
【００７０】
「核酸」とはさらにまた、ヌクレオチド塩基、糖またはリン酸基に対する核酸の化学誘導体、ならびに非天然ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含有する核酸を含む。
【００７１】
本発明によれば「核酸配列に由来する核酸配列」とは、それが由来する核酸に比べて、単一または複数のヌクレオチド置換、欠失および／または付加を含み、好ましくはそれが由来する核酸と相補的である、すなわち、該核酸間にある程度の相同性があり、該核酸のヌクレオチド配列が有意な直接的または相補的様式で一致する、核酸配列を指す。本発明によれば、核酸に由来する核酸は、それが由来する核酸の機能的特性を有している。このような機能的特性としては、特に、ＲＮＡへと転写し得る核酸（転写可能な核酸配列）との機能的連結において、完全なＲＮＡ分子においてこの核酸から産生されるＲＮＡの安定性および／または翻訳効率を高める能力が含まれる。
【００７２】
本発明によれば「機能的連結」または「機能的に連結された」とは、機能的関係の範囲内の連結に関していう。核酸は、別の核酸配列と機能的に関連している場合に、「機能的に連結されている」という。例えば、プロモーターは、コード配列の転写に影響を及ぼす場合に、該コード配列に機能的に連結されているという。機能的に連結されている核酸は一般に、別の核酸と、適当であればさらなる核酸配列により離されて隣接しており、特定の実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼにより転写されて、単一のＲＮＡ分子（共通転写産物）が得られる。
【００７３】
本発明に記載される核酸は単離されていることが好ましい。「単離された核酸」とは、本発明によれば、その核酸が（ｉ）例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりｉｎ ｖｉｔｒｏで増幅されたものであるか、（ｉｉ）クローニングにより組換え生産されたものであるか、（ｉｉｉ）例えば切断およびゲル濾過分画により精製されたものであるか、または（ｉｖ）例えば化学合成により合成されたものであることを意味する。単離された核酸は組換えＤＮＡ技術による操作に利用可能な核酸である。
【００７４】
核酸は、その２つの配列が互いにハイブリダイズして安定な二重らせんを形成するこができる場合に別の核酸と「相補的」であるといい、該ハイブリダイゼーションは好ましくはポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能とする条件（ストリンジェント条件）下で行われる。ストリンジェント条件は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８９ ｏｒ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されており、例えば、６５℃、ハイブリダイゼーションバッファー（３．５×ＳＳＣ、０．０２％フィコール、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ウシ血清アルブミン、２．５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）、０．５％ＳＤＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）中でのハイブリダイゼーションを指す。ＳＳＣは０．１５Ｍ塩化ナトリウム／０．１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ ７である。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡを写し取ったメンブランを、例えば２×ＳＳＣ中、室温で洗浄した後、０．１〜０．５×ＳＳＣ／０．１×ＳＤＳ中、６８℃までの温度で洗浄する。
【００７５】
本発明によれば、相補的核酸は、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるヌクレオチドを有する。
【００７６】
「同一性％」とは、比較する２つの配列間で最適なアライメントにおいて同一であるヌクレオチドのパーセンテージを指し、該パーセンテージは単に統計学的なものであり、この２配列間の違いは、配列の全長にわたってランダムに分布している場合もあるし、また、２配列間の最適アライメントを得るために、比較配列は参照配列に対して付加もしくは欠失を含んでいる場合もある。２配列の比較は通常、対応する配列の局部領域を特定するために、最適アライメントの後にこれらの配列をセグメントまたは「比較枠」に関して比較することにより行う。比較のための最適アライメントは手動で、またはＳｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ， １９８１， Ａｄｓ Ａｐｐ． Ｍａｔｈ． ２， ４８２によるローカルホモロジーアルゴリズム、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， １９７０， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８， ４４３によるローカルホモロジーアルゴリズム、およびＰｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５， ２４４４による類似性検索アルゴリズムまたは前記アルゴリズムを用いたコンピュータープログラム（ＧＡＰ， ＢＥＳＴＦＩＴ， ＦＡＳＴＡ， ＢＬＡＳＴ Ｐ， ＢＬＡＳＴ Ｎ ａｎｄ ＴＦＡＳＴＡ ｉｎ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ．）の助けで行うことができる。
【００７７】
同一性パーセンテージは、比較配列が一致する位置の数を求め、この数を比較した位置の数で割り、この解に１００を掛けることにより得られる。
【００７８】
例えば、ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｗｂｌａｓｔ２．ｃｇｉで入手できるＢＬＡＳＴプログラム「ＢＬＡＳＴ２配列」が使用可能である。
【００７９】
「核酸の３’末端」とは、本発明では、遊離ヒドロキシ基を有する末端を指す。二本鎖核酸、特にＤＮＡの模式図では、３’末端は常に右側にある。「核酸の５’末端」とは、本発明では、遊離リン酸基を有する末端を指す。二本鎖核酸、特にＤＮＡの模式図では、５’末端は常に左側にある。
５’末端 ５’−−Ｐ−ＮＮＮＮＮＮＮ−ＯＨ−３’
３’末端 ３’−ＨＯ−ＮＮＮＮＮＮＮ−Ｐ−−５’
【００８０】
特定の実施形態では、核酸は、本発明に従い、その核酸に対して同種であっても異種であってもよい発現制御配列と機能的に連結されている。
【００８１】
転写可能な核酸、特にペプチドまたはタンパク質をコードする核酸および発現制御配列は、それらが、転写可能な、特にコード核酸の転写または発現がその発現制御配列の制御下または影響下にあるように互いに共有結合されている場合に、互いに「機能的に」連結されているという。この核酸が機能的ペプチドまたはタンパク質に翻訳されるならば、そのコード配列に機能的に連結されている発現制御配列の誘導は、コード配列にフレームシフトを起こすことなく、またはコード配列が所望のペプチドまたはタンパク質の翻訳不能となることなく、コード配列の転写を起こす。
【００８２】
「発現制御配列」は、本発明によれば、プロモーター、リボソーム結合配列および遺伝子の転写または誘導されるＲＮＡの翻訳を制御する他の制御エレメントを含む。本発明の特定の実施形態では、発現制御配列は調節可能である。発現制御配列の厳密な構造は、種または細胞種によって異なるが、通常、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列およびＣＡＡＴ配列など、それぞれ転写および翻訳の開始に関与する５’非転写配列ならびに５’および３’非翻訳配列を含む。より具体的には、５’非転写発現制御配列は、機能的に連結された遺伝子の転写制御のためのプロモーター配列を包含するプロモーター領域を含む。発現制御配列はまたエンハンサー配列または上流アクチベーター配列も含み得る。
【００８３】
本明細書に明示される核酸、特に転写可能なコード核酸は、その核酸に対して同種であっても異種であってもよい発現制御配列、特にプロモーターのいずれと組み合わせてもよく、「同種」とは、核酸がまた発現制御配列に天然状態で機能的に連結されているということを表し、「異種」とは、核酸が発現制御配列に天然状態では機能的に連結されていないということを表す。
【００８４】
「プロモーター」または「プロモーター領域」とは、ＲＮＡポリメラーゼの認識および結合部位を提供することでコード配列の発現を制御する、遺伝子のコード配列の上流（５’）ＤＮＡ配列を指す。このプロモーター領域は、該遺伝子の転写の調節に関与するさらなる因子のためのさらなる認識または結合部位を含んでいてもよい。プロモーターは原核生物または真核生物の遺伝子の転写を制御し得る。プロモーターはインデューサーに応答して転写を開始する「誘導型」であるか、転写がインデューサーによって制御されなければ「構成型」である。誘導型プロモーターは、インデューサーが存在しなければ、極めて小さな程度でしか発現しないか、または全く発現しない。インデューサーの存在下では、この遺伝子は「スイッチオン」となるか、または転写レベルが高まる。これは通常、特定の転写因子の結合によって媒介される。
【００８５】
本発明に従う好ましいプロモーターの例としては、ＳＰ６、Ｔ３またはＴ７ポリメラーゼのプロモーターがある。
【００８６】
本発明によれば、「発現」とは、その最も一般的に意味で用いられ、ＲＮＡまたはＲＮＡとタンパク質の産生を含む。また、核酸の部分的発現も含まれる。さらに、発現は一時的なものであっても安定したものであってもよい。ＲＮＡに関して「発現」または「翻訳」とは、特にペプチドまたはタンパク質の産生を指す。
【００８７】
「転写されて共通転写産物を生じ得る核酸」とは、その核酸が、適当であれば該核酸を含む核酸分子の、特に、閉環核酸分子の制限酵素切断などの線状化の後、プロモーターの制御下での転写が、適当であればその間に位置する配列により離されて、互いに共有結合された該核酸の転写産物を含むＲＮＡ分子を生じるように、互いに機能的に連結されていることを意味する。
【００８８】
本発明によれば、「転写」には「ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写」が含まれ、この「ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写」とは、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡが無細胞様式で、すなわち、好ましくは適宜調製された細胞抽出液を用いることでｉｎ ｖｉｔｒｏ合成される方法に関していう。転写産物の調製には、一般に転写ベクターと呼ばれ、本発明によれば「ベクター」という用語に含まれる、クローニングベクターを用いるのが好ましい。
【００８９】
「核酸配列から転写された核酸配列」とは、適当であれば後者の核酸配列の転写産物である完全ＲＮＡ分子の一部としてのＲＮＡを指す。
【００９０】
「核酸配列の翻訳効率および／または安定性を高めるために活性である核酸配列」とは、第一の核酸が第二の核酸との共通転写産物において、第二の核酸の翻訳効率および／または安定性を、その翻訳効率および／または安定性が第一の核酸を用いない場合の第二の核酸の翻訳効率および／または安定性に比べて高まるように修飾することができることを意味する。これに関して、「翻訳効率」とは、特定の時間内にＲＮＡ分子がもたらす翻訳産物の量に関し、「安定性」とは、ＲＮＡ分子の半減期に関していう。
【００９１】
３’非翻訳領域は、タンパク質コード領域の末端コドンの下流の、遺伝子の３’末端に位置し、転写されるがアミノ酸配列へ翻訳されない領域に関していう。
【００９２】
本発明によれば、第一のポリヌクレオチド領域の５’末端が第二のポリヌクレオチド領域の３’末端に最も近い第一のポリヌクレオチド領域の一部である場合に、第一のポリヌクレオチド領域は、第二のポリヌクレオチドの下流に位置するとみなされる。
【００９３】
３’非翻訳領域は一般に、翻訳産物の末端コドンから、通常転写工程後に付着されるポリ（Ａ）配列へと伸びる。哺乳類ｍＲＮＡの３’非翻訳領域は一般に、ＡＡＵＡＡＡヘキサヌクレオチド配列として知られる相同性領域を有する。この配列はおそらくポリ（Ａ）付着シグナルであり、ポリ（Ａ）付着部位の１０〜３０塩基上流に位置している場合が多い。
【００９４】
３’非翻訳領域は、エキソリボヌクレアーゼに対するバリアとして働く、またはＲＮＡの安定性を高めることが知られているタンパク質（例えば、ＲＮＡ結合タンパク質）と相互作用するステム−ループ構造が得られるように折り畳み可能な１以上の逆方向反復を含み得る。
【００９５】
本発明によれば５’および／または３’非翻訳領域は転写可能な、特にコード核酸と機能的に連結させることができ、これによりこれらの領域を、転写可能な核酸から転写されたＲＮＡの安定性および／または翻訳効率が高まるように核酸と結合させる。
【００９６】
免疫グロブリンｍＲＮＡの３’非翻訳領域は比較的短く（約３００ヌクレオチドより短い）が、他の遺伝子の３’非翻訳領域は比較的長い。例えば、ｔＰＡの３’非翻訳領域は約８００ヌクレオチドの長さであり、第ＶＩＩＩ因子の３’非翻訳領域は約１８００ヌクレオチドの長さであり、エリスロポエチンの３’非翻訳領域は約５６０ヌクレオチドの長さである。
【００９７】
本発明によれば、３’非翻訳領域またはそれに由来する核酸配列がＲＮＡの安定性および／または翻訳効率を高めるかどうかは、その３’非翻訳領域またはそれに由来する核酸配列を遺伝子の３’非翻訳領域に組み込み、その組み込みによりタンパク質の合成量が高まるかどうかを測定することによって判定することができる。
【００９８】
上記のことは本発明において核酸が２以上の３’非翻訳領域を含む場合にも適用され、この場合には、間に好ましくは「ヘッド・トゥ・テール関係」（すなわち、これらの３’非翻訳領域は同じ配向、好ましくは核酸において天然の配向を持つ）のリンカーを用いて、または用いずに順次結合されていることが好ましい。
【００９９】
本発明によれば「遺伝子」とは、１以上の細胞産物の産生および／または１以上の細胞間もしくは細胞内機能の達成を担う特定の核酸配列に関していう。より具体的には、この用語は、特定のタンパク質または機能的もしくは構造的ＲＮＡ分子をコードする核酸を含むＤＮＡ部分に関する。
【０１００】
「ポリアデニルカセット」または「ポリ（Ａ）配列」は、一般にＲＮＡ分子の３’末端に位置するアデニル残基の配列を指す。本発明は、コード鎖に相補的な鎖中の反復チミジル残基に基づくＤＮＡ鋳型を介したＲＮＡ転写中に付着されるこのような配列を提供するが、このような配列は通常そのＤＮＡにはコードされておらず、核内で転写後に鋳型依存性のＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡの空いている３’末端に付着される。本発明によれば、この種のポリ（Ａ）配列は少なくとも２０、好ましくは少なくとも４０、好ましくは少なくとも８０、好ましくは少なくとも１００で、好ましくは５００まで、好ましくは４００まで、好ましくは３００まで、好ましくは２００まで、特に１５０までの連続するＡヌクレオチド、特には約１２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列を意味するものと理解され、「Ａヌクレオチド」とはアデニル残基を指す。
【０１０１】
好ましい実施形態では、本発明の核酸分子はベクターである。「ベクター」とは、ここではその最も一般的な意味で用いられ、例えば核酸を原核生物および／または真核生物の宿主細胞へ導入可能とし、および適当であればゲノムへ導入可能とする核酸のいずれの中間ビヒクルも含む。このようなベクターは細胞内で複製および／または発現されることが好ましい。ベクターはプラスミド、ファージミドまたはウイルスゲノムを含む。「プラスミド」とは本明細書において一般に、染色体ＤＮＡとは独立に複製可能な染色体外遺伝物質の構築物、通常、環状ＤＮＡ二重らせんに関していう。
【０１０２】
本発明によれば、「宿主細胞」とは、外来核酸で形質転換またはトランスフェクション可能ないずれの細胞も指す。「宿主細胞」とは、本発明によれば、原核生物（例えば、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ））または真核細胞（例えば、酵母細胞および昆虫細胞）を含む。ヒト、マウス、ハムスター、ブタ、ヤギ、霊長類などの哺乳類細胞が特に好ましい。これらの細胞は多数の細胞種に由来し、一次細胞と細胞系統を含む。特定の例としては、ケラチノサイト、末梢血白血球、骨髄幹細胞および胚幹細胞が挙げられる。他の実施形態では、宿主細胞は抗原提示細胞、特に樹状細胞、単球またはマクロファージである。核酸は一コピーまたは数個ピーで宿主細胞に存在してもよく、一実施形態では宿主細胞内で発現される。
【０１０３】
本発明によれば、核酸によりコードされるペプチドまたはタンパク質は、細胞質、核、膜、オルガネラに存在するペプチドまたはタンパク質であってもよいし、あるいは分泌されるものでもよい。これらのものとして構造タンパク質、調節タンパク質、ホルモン、神経伝達物質、成長調節因子、分化因子、遺伝子発現調節因子、ＤＮＡ会合タンパク質、酵素、血清タンパク質、受容体、薬剤、免疫調節剤、癌遺伝子、毒素、腫瘍抗原または抗原が挙げられる。これらのペプチドまたはタンパク質は天然配列を持っていてもよいし、あるいはそれらの生物活性を増強、阻害、調節または排除するために変異された配列を持っていてもよい。
【０１０４】
「ペプチド」とは、ペプチド結合を介して互いに連結された２以上、好ましくは３以上、好ましくは４以上、好ましくは６以上、好ましくは８以上、好ましくは１０以上、好ましくは１３以上、好ましくは１６以上、好ましくは２０以上で、好ましくは５０まで、好ましくは１００までまたは好ましくは１５０までの連続するアミノ酸を含む物質を指す。「タンパク質」とは、大きなペプチド、好ましくは少なくとも１５１のアミノ酸を有するペプチドを指すが、本明細書では「ペプチド」と「タンパク質」は通常同義で用いる。本発明において「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸成分だけでなく、糖およびリン酸構造などの非アミノ酸成分も含む物質を含み、またエステル、チオエーテルまたはジスルフィド結合などの結合を含む物質も含む。
【０１０５】
本発明は、患者に投与する核酸、特にＲＮＡを提供する。一実施形態では、核酸はｅｘ ｖｉｖｏ法、すなわち、患者から細胞を取り出し、それらの細胞を遺伝的に修飾し、修飾された細胞を患者に再び導入することにより投与される。トランスフェクションおよび形質導入法は当業者に公知である。本発明はまた、ｉｎ ｖｉｖｏ投与される核酸も提供する。
【０１０６】
本発明によれば、「トランスフェクション」とは、１以上の核酸を生物体または宿主細胞に導入することを指す。本発明に従いｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで核酸を細胞に導入するためには、様々な方法が使用できる。このような方法としては、核酸 ＣａＰＯ４沈降物のトランスフェクション、ＤＥＡＥと会合した核酸のトランスフェクション、目的の核酸を運ぶウイルスによるトランスフェクションまたは感染、およびリポソームに媒介されるトランスフェクションなどが挙げられる。特定の実施形態では、核酸を特定の細胞に向けることが好ましい。このような実施形態では、核酸を細胞へ投与するために用いる担体（例えば、レトロウイルスまたはリポソーム）にターゲティング分子を結合させてもよい。例えば、標的細胞上の表面膜タンパク質に特異的な抗体または標的細胞上の受容体に対するリガンドなどの分子を、核酸担体に組み込むか結合させればよい。リポソームによる核酸の投与が望ましければ、ターゲティングおよび／または吸収を可能とするためにエンドサイトーシスに関連する表面膜タンパク質に結合するタンパク質をリポソーム製剤に組み込めばよい。このようなタンパク質としては、特定の細胞種に特異的なキャプシドタンパク質またはその断片、インターナライズされるタンパク質に対する抗体、および細胞内部位をターゲティングするタンパク質などが挙げられる。
【０１０７】
「レポーター」とは、レポーター遺伝子によりコードされ、レポーターアッセイで測定される分子、一般にペプチドまたはタンパク質に関していう。慣例の系としては、通常、酵素レポーターを用い、そのレポーターの活性を測定する。
【０１０８】
「多重クローニング部位」とは、そのいずれか１つが例えばベクターの切断および核酸の挿入に使用できる制限酵素部位を含む核酸領域に関していう。
【０１０９】
本発明によれば、ヌクレオチドまたはアミノ酸などの２つのエレメントは、互いに直接隣接していれば連続のものである。例えば、ｘ個の連続するヌクレオチドＮの配列は、配列（Ｎ）ｘと表す。
【０１１０】
「制限エンドヌクレアーゼ」または「制限酵素」とは、ＤＮＡ分子の両鎖のホスホジエステル結合を特定の塩基配列内で切断する酵素種を指す。これらの酵素は、二本鎖ＤＮＡ分子上の、認識配列と呼ばれる特定の結合部位を認識する。ＤＮＡ中のホスホジエステル結合がこのような酵素により切断される部位は切断部位と呼ばれる。ＩＩＳ型酵素の場合、この切断部位はＤＮＡ結合部位から所定の距離離れたところに存在する。本発明によれば、「制限エンドヌクレアーゼ」には、例えば、酵素ＳａｐＩ、ＥｃｉＩ、ＢｐｉＩ、ＡａｒＩ、ＡｌｏＩ、ＢａｅＩ、ＢｂｖＣＩ、ＰｐｉＩおよびＰｓｒＩ、ＢｓｒＤ１、ＢｔｓＩ、ＥａｒＩ、ＢｍｒＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｍＢＩ、ＦａｕＩ、ＢｂｓＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｅＲＩ、ＥｃｉＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓｇＩ、ＭｍｅＩ、ＣｓｐＣＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＭＩ、Ｍｖａ１２６９Ｉ、ＰｃｔＩ、Ｂｓｅ３ＤＩ、ＢｓｅＭＩ、Ｂｓｔ６Ｉ、Ｅａｍ１１０４Ｉ、Ｋｓｐ６３２Ｉ、ＢｆｉＩ、Ｂｓｏ３１Ｉ、ＢｓｐＴＮＩ、Ｅｃｏ３１Ｉ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＢｆｕＩ、Ａｃｃ３６Ｉ、ＡａｒＩ、Ｅｃｏ５７Ｉ、Ｅｃｏ５７ＭＩ、ＧｓｕＩ、ＡｌｏＩ、Ｈｉｎ４Ｉ、ＰｐｉＩ、およびＰｓｒＩが含まれる。
【０１１１】
「半減期」とは、分子の活性、量または数の半分が消失するのにかかる時間を指す。
【０１１２】
以下、本発明を図面および実施例により詳しく説明するが、これらは単に例示であって、限定を示すものではない。これらの説明および実施例に基づいて当業者ならばさらなる実施例を利用することができるが、それらも同様に本発明の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】図１：さらなるクローニングのため本発明に従って用いられる基本ベクター これらのベクターはＲＮＡポリメラーゼ５’プロモーターの制御下でＲＮＡ転写が可能であり、ポリアデニルカセットを含む。
【０１１４】
【図２】図２：ＩＩ型制限酵素（例えば、ＳｐｅＩ）とＩＩＳ型制限酵素（例えば、ＳａｐＩ）とによるベクター線状化の比較 その認識配列がポリ（Ａ）配列の３’にあり、切断部位が２４〜２６ ｂｐ上流、従ってポリ（Ａ）配列内にあるＩＩＳ型制限切断部位を導入することにより、プラスミドをポリ（Ａ）配列内で線状化することができる。
【０１１５】
【図３】図３：ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のための鋳型として本発明に従って作製されるベクター 発現のレベルおよび持続時間に対する本発明のＲＮＡ修飾の効果を研究するため、いくつかのベクターを作製し、その後、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のための鋳型として用いた。ａ．マスクされたポリ（Ａ）配列とマスクされていないポリ（Ａ）配列を有するベクター；ｂ．長さの異なるポリ（Ａ）配列を有するベクター；ｃ．ヒトβ−グロビンの３’非翻訳領域を有するベクター；ｄ．ＳＩＩＮＦＥＫＬおよびｐｐ６５ベクター；Ｃａｐ−５’−キャッピング；ｅＧＦＰ−ＧＦＰレポーター遺伝子；β−グロビンの３’βｇ−３’非翻訳領域。Ａ（ｘ）−ｘは、ポリ（Ａ）配列中のＡヌクレオチドの数を表す。
【０１１６】
【図４】図４：示された表面マスクによる未成熟樹状細胞と成熟樹状細胞の成熟状態の決定 本発明のＲＮＡ修飾の効果をヒト樹状細胞（ＤＣ）にて、ＤＣ成熟プロセスを誘導する免疫刺激を用いて調べた。これらのＤＣを、特異的ＤＣ成熟マーカーを認識する抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８３抗体、抗ＣＤ８６抗体および抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体で染色し、フローサイトメトリーで分析した。
【０１１７】
【図５】図５：翻訳効率および転写産物の安定性に対する遊離型およびマスク型のポリ（Ａ）配列の影響 ａ．ＦＡＣＳ−Ｋａｌｉｂｕｒにて平均蛍光強度［ＭＦＩ］を測定することによる、Ｋ５６２細胞および樹状細胞におけるｅＧＦＰ ＲＮＡの翻訳効率に対する遊離型およびマスク型のポリ（Ａ）配列の影響。ｂ．４８時間後の未成熟樹状細胞におけるｅＧＦＰ ＲＮＡの転写産物安定性に対する遊離型およびマスク型のポリ（Ａ）配列の影響。腫瘍細胞系統および未成熟ＤＣの双方で、オープンエンド型ポリ（Ａ）配列を有するＲＮＡはマスクエンド型ポリ（Ａ）配列を有するＲＮＡよりも有効かつ長期間翻訳される。ＤＣにおける非マスクエンド型ポリ（Ａ）配列の翻訳効率は、同じ長さのポリ（Ａ）配列の１．５倍高い。さらにオープンエンド型ポリ（Ａ）配列は、より高いＲＮＡ安定性をもたらす。
【０１１８】
【図６】図６：翻訳効率および転写産物の安定性に対するポリ（Ａ）配列長の影響 ａ．Ｋ５６２細胞および樹状細胞におけるｅＧＦＰ ＲＮＡの翻訳効率に対するポリ（Ａ）配列長の影響。ｂ．Ｋ５６２細胞および樹状細胞におけるｄ２ｅＧＦＰ ＲＮＡの翻訳効率に対するポリ（Ａ）配列長の影響。ｃ．エレクトロポレーション４８時間後のＫ５６２細胞におけるｅＧＦＰ ＲＮＡの転写産物安定性に対するポリ（Ａ）配列長の影響。ポリ（Ａ）配列を１２０Ａヌクレオチドまで延長すると、転写産物の安定性および翻訳が高まる。これを超える延長に有効な効果は見られない。ポリ（Ａ）配列を５１〜１２０Ａヌクレオチド延長すると、翻訳効率が１．５〜２倍高まる。この効果はＲＮＡの安定性にも反映される。
【０１１９】
【図７】図７：未成熟および成熟ＤＣにおける翻訳効率に対するヒトβ−グロビンの３’非翻訳領域（ＢｇＵＴＲ）の影響 ヒトβ−グロビンの３’非翻訳領域を導入すると、ＲＮＡ転写産物の発現が増強する。ヒトβ−グロビンの３’非翻訳領域が二重にあると、２４時間後の発現レベルが高まり、このレベルは個々の２つのヒトβ−グロビンの３’非翻訳領域を合わせた効果を著しく超える。
【０１２０】
【図８】図８：未成熟および成熟ＤＣにおける翻訳効率に対する本発明の修飾を組み合わせた効果 未成熟および成熟ＤＣにおけるｅＧＦＰの翻訳効率は、本発明に記載のＲＮＡ転写産物修飾を組み合わせることで、５倍を上回る増強が可能である。
【０１２１】
【図９】図９：ＥＬ４細胞上のＭＨＣ分子によるペプチド提示に対する本発明の修飾を組み合わせた効果 本発明に従って修飾されたＲＮＡ構築物を用いると、高い翻訳効率のために細胞表面上でのペプチド−ＭＨＣ複合体の提示が高まる。記載されているＩＶＴベクターでは、ｅＧＦＰをＯＶＡ２５７−２６４エピトープ（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）に置換し、ＥＬ４細胞（ネズミ、Ｔ細胞リンパ腫）をトランスフェクションの標的細胞として用いた。
【０１２２】
【図１０】図１０：本発明に従って安定化されたＩＶＴ ＲＮＡ構築物を用いることによる、抗原特異的ペプチド／ＭＨＣ複合体の増加 細胞にＳｅｃ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ−Ａ６７−ＡＣＵＡＧ ＲＮＡまたはＳｅｃ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ−２ＢｇＵＴＲ−Ａ１２０ ＲＮＡ（ＥＬ４細胞：１０ｐｍｏｌ、５０ｐｍｏｌ；Ｃ５７Ｂ１／Ｊ６未成熟ＢＭＤＣ１５０ｐｍｏｌ３反復）でエレクトロポレーションを行った。バッファーだけを用いるエレクトロポレーションを対照として用いた。細胞をＳＩＩＮＦＥＫＬ／Ｋｂ複合体に対する２５Ｄ１．１６抗体で染色した。ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド濃度を生細胞の平均蛍光値から、検量曲線としてペプチド滴定を用いて算出した。ＢＭＤＣデータは３回の実験の平均値±ＳＥＭとして示す。
【０１２３】
【図１１】図１１：ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴ細胞刺激に対する、本発明に従って安定化されたＩＶＴ ＲＮＡ構築物の効果 （Ａ）安定化されたＩＶＴ ＲＮＡ構築物の使用によるｉｎ ｖｉｖｏＴ細胞増殖の向上。１×１０５個のＴＣＲ−トランスジェニックＣＤ８＋ ＯＴ−Ｉ細胞をＣ５７Ｂ１／Ｊ６マウスに養子免疫伝達した。Ｃ５７Ｂ１／Ｊ６マウスのＢＭＤＣを５０ｐｍｏｌのＲＮＡ（Ｓｅｃ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ−Ａ６７−ＡＣＵＡＧ、Ｓｅｃ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ−２ＢｇＵＴＲ−Ａ１２０または対照ＲＮＡ）でトランスフェクトし、ポリ（Ｉ：Ｃ）（５０μｇ／ｍｌ）を用いて１６時間成熟させ、Ｔ細胞移入の１日前に腹腔内注射した（ｎ＝３）。４日目に末梢血を採取し、ＳＩＩＮＦＥＫＬ四量体陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞を染色した。ドットブロットはＣＤ８＋Ｔ細胞を表し、示されている数値は四量体陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを表す。 （Ｂ）安定化されたＩＶＴ ＲＮＡ構築物を含むヒトＴ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖の向上。ＨＣＭＶ血清反応陽性健常ドナーからのＣＤ８＋およびＣＤ４＋リンパ球をＳｅｃ−ｐｐ６５−Ａ６７−ＡＣＵＡＧ ＲＮＡ、Ｓｅｃ−ｐｐ６５−２ＢＧＵＴＲ−Ａ１２０ ＲＮＡ、または対照ＲＮＡ（データは示されていない）でトランスフェクトされたか、あるいは陽性対照としてｐｐ６５ペプチドプール（１．７５μｇ／ｍｌ）で刺激した自己ＤＣと同時培養した。７日間増殖させた後、各エフェクター細胞集団（４×１０４／ウェル）を、ｐｐ６５ペプチドプールか無関連のペプチドプール（１．７５μｇ／ｍｌ）のいずれかを付加した自己ＤＣ（３×１０４／ウェル）を用い、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔにてアッセイした。グラフは３回測定したスポットの平均値±ＳＥＭを表す。
【実施例１】
【０１２４】
実施例１：ベクターの作製とＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写
発現のレベルおよび持続時間に対する本発明のＲＮＡ修飾の効果を検討するため、いくつかのＩＶＴベクターを作製した後、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のための鋳型として用いた（図３）。
【０１２５】
半減期（ＨＬ）の異なる２つの分子ｅＧＦＰとｄ２ｅＧＦＰのレポーター遺伝子をベクターに挿入し、これにより本発明のＲＮＡ修飾の影響を分析可能とした。蛍光は減少し、平均ＨＬはｅＧＦＰでは１７．３時間、ｄ２ｅＧＦＰでは２時間であった。これらの構築物をそれぞれｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ｅＧＦＰ ＲＮＡおよびｄ２ｅＧＦＰ ＲＮＡの作製に用いた。
【実施例２】
【０１２６】
実施例２：本発明に従って修飾されたｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡによる細胞のトランスフェクションおよびＲＮＡ翻訳と安定性に対する効果
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ｅＧＦＰ ＲＮＡおよびｄ２ｅＧＦＰ ＲＮＡを用い、エレクトロポレーションによりＫ５６２細胞（ヒト白血病）をトランスフェクトした。トランスフェクション効率はＫ５６２細胞で９０％を超えた。
【０１２７】
その後、免疫系の最も重要なモジュレーターであるヒト樹状細胞（ＤＣ）において、記載のＲＮＡ修飾の作用をアッセイした。このアプローチは、ＲＮＡでトランスフェクトされたＤＣが予防接種として意図され得ることから、免疫関連のものである。未成熟ＤＣを皮膚および末梢器官に付加する。ここで、これらは、十分研究されている表面マーカーにより特徴付けられ、また、高いエンドサイトーシス活性により機能的に識別される未成熟状態にある。例えば病原体の感染などの免疫刺激はＤＣの成熟プロセスを誘導する。それと同時に、この刺激は局部リンパ節へのＤＣの移動を開始させるが、ここでＤＣはＴ細胞およびＢ細胞免疫応答の最も有効なインデューサーである。また、これらのＤＣの成熟状態は表面マーカー発現および詳細に研究されているサイトカインの発現によっても、また、ＤＣ形態の特徴によっても特徴付けられる。血液単球から未成熟ヒトＤＣを分化させるための培養系が確立されている。これらは種々の刺激により成熟が起こり得る。
【０１２８】
一次樹状細胞のトランスフェクション効率は７０〜８０％であった。これらのＤＣを、特異的ＤＣ成熟マーカーを認識する抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８３抗体、抗ＣＤ８６抗体および抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体で染色し、フローサイトメトリーで分析した（図４）。
【０１２９】
発現のレベルおよび持続時間を、ＦＡＣＳ−Ｋａｌｉｂｕｒを用い、ｅＧＦＰの蛍光強度を測定することで測定した。細胞のＲＮＡ量は、定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて測定した。
【０１３０】
ａ．ＲＮＡの翻訳および安定性に対するオープンエンド型ポリ（Ａ）配列の効果
腫瘍細胞系統Ｋ５６２と未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）は双方とも、オープンエンド型ポリ（Ａ）配列を有するＲＮＡを、マスクエンド型ポリ（Ａ）配列を有するＲＮＡよりも効率的にかつ長期間翻訳することが示された（図５ａ）。未成熟ＤＣにおける非マスクエンド型ポリ（Ａ）配列の翻訳効率は、同じ長さのポリ（Ａ）配列では１．５倍高くなる。さらに、この修飾から、より高いＲＮＡ安定性が得られる（図５ｂ）。非マスクポリ（Ａ）配列を有するＲＮＡでトランスフェクトされた未成熟ＤＣでは、エレクトロポレーション４８時間後に４〜５倍量のＲＮＡを検出することができる。
【０１３１】
ｂ．ＲＮＡの翻訳および安定性に対するポリ（Ａ）配列長の効果
１６ｂｐ、４２ｂｐ、５１ｂｐ、６７ｂｐ、１２０ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐおよび６００ｂｐの長さのポリ（Ａ）配列を有するＲＮＡを分析したところ、１２０Ａヌクレオチドまでのポリ（Ａ）配列の延長が転写産物の安定性と翻訳を高めること、また、それを超える延長には有効な効果がないことが明らかになった。この効果はＫ５６２細胞と未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）の双方に見られる（図６ａおよび６ｂ）。ポリ（Ａ）配列を５１〜１２０Ａヌクレオチド延長すると、翻訳効率が１．５〜２倍高まる。この効果はＲＮＡの安定性にも反映される（図６ｃ）。
【０１３２】
ｃ．ＲＮＡの翻訳および安定性に対する３’非翻訳領域の存在の効果
Ｋ５６２細胞および未成熟ＤＣを用いた経時的推移により、ヒトβ−グロビンの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の導入がＲＮＡ転写産物の発現の増強をもたらすことが確認された。さらに、ヒトβ−グロビンの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）が二重にあると、２４時間後に高い発現レベルが得られ、個々の２つのＵＴＲを合わせた効果を大きく超えることが実証された（図７）。
【０１３３】
ｄ．ＲＮＡの翻訳および安定性に対する上記修飾の組合せの効果
本発明によれば、ＲＮＡ転写産物における上記修飾の組合せは、未成熟ＤＣまた成熟ＤＣでも、ｅＧＦＰの翻訳効率を５倍を超えて高めることが示された（図８）。
【実施例３】
【０１３４】
実施例３：安定性および翻訳効率の高められたｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡを介して発現されたペプチドの、ＭＨＣ分子による提示
本発明によれば、本発明に従って修飾されたＲＮＡ構築物を用いると、細胞表面でのペプチド−ＭＨＣの提示が高まることが示された。この目的で、記載のベクター中のｅＧＦＰをコードする核酸配列を、ＯＶＡ２５７−２６４エピトープ（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）をコードする核酸配列に置換し、これらの構築物を互いに比較した。トランスフェクションに用いた標的細胞はＥＬ４細胞（マウス、Ｔ細胞リンパ腫）であった。
【０１３５】
ＭＨＣ分子により提示されたＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドを定量するため、これらの細胞を、エレクトロポレーション後種々の時点で、抗Ｈ２−Ｋｂ ＯＶＡ２５７−２６４抗体で染色し、二次抗体の蛍光強度を、ＦＡＣＳ−Ｋａｌｉｂｕｒを用いて測定した（図９）。
【０１３６】
さらに、このＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドを、あらゆる最適化を反映したベクター（ｐＳＴ１−Ｓｅｃ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ−２ＢｇＵＴＲ−Ａ１２０−Ｓａｐ１）に、また、標準的な特徴を有するベクター（ｐＳＴ１−Ｓｅｃ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ−Ａ６７−Ｓｐｅ１）にクローニングした。両ベクターに由来するＩＶＴ ＲＮＡで、ＥＬ４細胞およびＢＭＤＣに対してエレクトロポレーションを行った。ＯＶＡ−ペプチド／Ｋｂ複合体は細胞表面実質的に多数見られ、本発明に従って修飾されたＲＮＡ、Ｓｅｃ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ−２−ＢｇＵＴＲ−Ａ１２０のエレクトロポレーション後、長期間維持された（図１０）。
【実施例４】
【０１３７】
実施例４：抗原特異的Ｔ細胞の発現に対する、提示されるペプチドをコードするｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡによる細胞のトランスフェクションの効果
刺激能に対する効果を評価するため、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドのＭＨＣクラスＩ提示を検出するためのＣ５７ＢＬ／Ｊ６（Ｂ６）バックグラウンドに集中的に用いられてきたＯＴ−Ｉ−ＴＣＲを用いた。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に関してトランスジェニックであり、ニワトリＯＶＡ由来のＫｂ−特異的ペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＯＶＡ２５７−２６４）を認識するＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞はＨ． Ｓｃｈｉｌｄ （Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｉｎｚ， Ｇｅｒｍａｎｙ）から厚意により提供されたものである。
【０１３８】
０日目、ＯＴ−Ｉ−ＣＤ８＋Ｔ細胞を用いて、動物に養子免疫伝達を行った。この目的で、ＴＣＲ ｔｇ ＯＴ−Ｉマウスから脾細胞を調製し、Ｃ５７ＢＬ／Ｊ６レシピエントマウスの尾の静脈に導入した。細胞数は１×１０５ ＴＣＲ ｔｇ ＣＤ８＋Ｔ細胞に調整した。翌日、５０ｐｍｏｌのＳＩＩＮＦＥＫＬコードＲＮＡ構築物変異体でエレクトロポレーションを行い、ポリ（Ｉ：Ｃ）で１６時間成熟させたＣ５７ＢＬ／Ｊ６マウスの１×１０６ ＢＭＤＣをマウスに腹腔内投与した。４日目、四量体法を用い、末梢血においてＯＴ−Ｉ−ＣＤ８＋Ｔ細胞を測定した。この目的で、眼窩後方の血液サンプルを採取し、抗ＣＤ８（Ｃａｌｔａｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， ＵＳＡ）およびＳＩＩＮＦＥＫＬ四量体（Ｈ−２Ｋｂ／ＳＩＩＮＦＥＫＬ ２５７−２６４； Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ， Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ， ＵＳＡ）で染色した。
【０１３９】
抗原特異的ＴＣＲ−トランスジェニックＣＤ８＋Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ増殖は、抗原供給源としてＳｅｃ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ−２ＢｇＵＴＲ−Ａ１２０ ＲＮＡを用いた場合には、Ｓｅｃ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ−Ａ６７−ＡＣＵＡＧ ＲＮＡの場合と比べて実質的に向上することが分かった（図１１Ａ）。
【０１４０】
抗原供給源として安定されたＩＶＴ ＲＮＡ構築物が、ヒトＴ細胞の抗原特異的刺激も向上させるかどうか評価するため、ポリエピトープ性のＴ細胞反応の自己刺激をバリデートするために用いられることが多いヒトサイトメガロウイルスの免疫優性抗原であるＨＣＭＶ−ｐｐ６５を用いた。抗体をコーティングしたマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ， Ｂｅｒｇｉｓｃｈ−Ｇｌａｄｂａｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた正磁場セルソーティングにより、ＨＣＭＶ血清反応陽性健常ドナーから精製されたＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、ｐｐ６５をコードする対応するＩＶＴ ＲＮＡ変異体でマイクロポレーションを行った自己ＤＣ２×１０５個とともに同時培養した。Ｔ細胞の増殖を、全ｐｐ６５タンパク質配列にわたる重複ペプチドのプールで、または対照タンパク質で刺激した自己ＤＣを用いたＩＦＮ−γ−ＥＬＩＳｐｏｔで７日目に測定したところ、Ｓｅｃ−ｐｐ６５−２ＢｇＵＴＲ−Ａ１２０が優れていることが実証され、ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖に対する効果が最も顕著であった（図１１Ｂ）。
【０１４１】
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Ｇｉｌｋｅｓｏｎ， Ｇ．Ｓ．， Ｐｉｐｐｅｎ， Ａ．Ｍ．， ａｎｄ Ｐｉｓｅｔｓｋｙ， Ｄ．Ｓ． （１９９５）． Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｅ ａｎｔｉ−ｄｓＤＮＡ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｐｒｅａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ＮＺＢ／ＮＺＷ ｍｉｃｅ ｂｙ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ＤＮＡ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９５， １３９８−１４０２．
Ｇｒｅｅｎｂｌａｔｔ， Ｍ．Ｓ．， Ｂｅｎｎｅｔｔ， Ｗ．Ｐ．， Ｈｏｌｌｓｔｅｉｎ， Ｍ．， ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓ， Ｃ．Ｃ． （１９９４）． Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐ５３ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅ： ｃｌｕｅｓ ｔｏ ｃａｎｃｅｒ ｅｔｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５４， ４８５５−４８７８．
Ｈｅｉｓｅｒ， Ａ．， Ｃｏｌｅｍａｎ， Ｄ．， Ｄａｎｎｕｌｌ， Ｊ．， Ｙａｎｃｅｙ， Ｄ．， Ｍａｕｒｉｃｅ， Ｍ．Ａ．， Ｌａｌｌａｓ， Ｃ．Ｄ．， Ｄａｈｍ， Ｐ．， Ｎｉｅｄｚｗｉｅｃｋｉ， Ｄ．， Ｇｉｌｂｏａ， Ｅ．， ａｎｄ Ｖｉｅｗｅｇ， Ｊ． （２００２）． Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ＲＮＡ ｓｔｉｍｕｌａｔｅ ＣＴＬ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｔｕｍｏｒｓ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ １０９， ４０９−４１７．
Ｈｅｉｓｅｒ， Ａ．， Ｄａｈｍ， Ｐ．， Ｙａｎｃｅｙ， Ｄ．Ｒ．， Ｍａｕｒｉｃｅ， Ｍ．Ａ．， Ｂｏｃｚｋｏｗｓｋｉ， Ｄ．， Ｎａｉｒ， Ｓ．Ｋ．， Ｇｉｌｂｏａ， Ｅ．， ａｎｄ Ｖｉｅｗｅｇ， Ｊ． （２０００）． Ｈｕｍａｎ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ＲＮＡ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｓｔｉｍｕｌａｔｅ ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＴＬ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６４， ５５０８−５５１４．
Ｈｏｅｒｒ， Ｉ．， Ｏｂｓｔ， Ｒ．， Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ， Ｈ．Ｇ．， ａｎｄ Ｊｕｎｇ， Ｇ． （２０００）． Ｉｎ ｖｉｖｏ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３０， １−７．
Ｍａｌｏｎｅ， Ｒ．Ｗ．， Ｆｅｌｇｎｅｒ， Ｐ．Ｌ．， ａｎｄ Ｖｅｒｍａ， Ｉ．Ｍ． （１９８９）． Ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ＲＮＡ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６， ６０７７−６０８１．
Ｐｒｅｉｓｓ， Ｔ． ａｎｄ Ｈｅｎｔｚｅ， Ｍ．Ｗ． （１９９８）． Ｄｕａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ ｃａｐ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎ ｐｏｌｙ（Ａ）−ｔａｉｌ ｐｒｏｍｏｔｅｄ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｙｅａｓｔ． Ｎａｔｕｒｅ ３９２， ５１６−５２０．
Ｓｐｏｏｎｅｒ， Ｒ．Ａ．， Ｄｅｏｎａｒａｉｎ， Ｍ．Ｐ．， ａｎｄ Ｅｐｅｎｅｔｏｓ， Ａ．Ａ． （１９９５）． ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２， １７３−１８０．
Ｓｔｒｏｎｇ， Ｔ．Ｖ．， Ｈａｍｐｔｏｎ， Ｔ．Ａ．， Ｌｏｕｒｏ， Ｉ．， Ｂｉｌｂａｏ， Ｇ．， Ｃｏｎｒｙ， Ｒ．Ｍ．， ａｎｄ Ｃｕｒｉｅｌ， Ｄ．Ｔ． （１９９７）． Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎｔｏ ａ Ｓｉｎｄｂｉｓ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ４， ６２４−６２７．
Ｓｕ， Ｚ．， Ｄａｎｎｕｌｌ， Ｊ．， Ｈｅｉｓｅｒ， Ａ．， Ｙａｎｃｅｙ， Ｄ．， Ｐｒｕｉｔｔ， Ｓ．， Ｍａｄｄｅｎ， Ｊ．， Ｃｏｌｅｍａｎ， Ｄ．， Ｎｉｅｄｚｗｉｅｃｋｉ， Ｄ．， Ｇｉｌｂｏａ， Ｅ．， ａｎｄ Ｖｉｅｗｅｇ， Ｊ． （２００３）． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｒｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｖａｃｃｉｎａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｕｍｏｒ ＲＮＡ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６３， ２１２７−２１３３．
Ｔａｎｇ， Ｄ．Ｃ．， ＤｅＶｉｔ， Ｍ．， ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｔｏｎ， Ｓ．Ａ． （１９９２）． Ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｉｓ ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｅｌｉｃｉｔｉｎｇ ａｎ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ． Ｎａｔｕｒｅ ３５６， １５２−１５４．
Ｔｅｕｆｅｌ， Ｒ．， Ｃａｒｒａｌｏｔ， Ｊ．Ｐ．， Ｓｃｈｅｅｌ， Ｂ．， Ｐｒｏｂｓｔ， Ｊ．， Ｗａｌｔｅｒ， Ｓ．， Ｊｕｎｇ， Ｇ．， Ｈｏｅｒｒ， Ｉ．， Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ， Ｈ．Ｇ．， ａｎｄ Ｐａｓｃｏｌｏ， Ｓ． （２００５）． Ｈｕｍａｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ ｓｔｉｍｕｌａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ． Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ． Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． ６２， １７５５−１７６２．
Ｕｌｍｅｒ， Ｊ．Ｂ．， Ｄｏｎｎｅｌｌｙ， Ｊ．Ｊ．， Ｐａｒｋｅｒ， Ｓ．Ｅ．， Ｒｈｏｄｅｓ， Ｇ．Ｈ．， Ｆｅｌｇｎｅｒ， Ｐ．Ｌ．， Ｄｗａｒｋｉ， Ｖ．Ｊ．， Ｇｒｏｍｓｋｏｗｓｋｉ， Ｓ．Ｈ．， Ｄｅｃｋ， Ｒ．Ｒ．， ＤｅＷｉｔｔ， Ｃ．Ｍ．， Ｆｒｉｅｄｍａｎ， Ａ．， ｅｔ ａｌ． （１９９３）． Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｂｙ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ ｖｉｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９， １７４５−１７４９．
Ｗａｎｇ， Ｂ．， Ｍｅｒｖａ， Ｍ．， Ｄａｎｇ， Ｋ．， Ｕｇｅｎ， Ｋ．Ｅ．， Ｗｉｌｌｉａｍｓ， Ｗ．Ｖ．， ａｎｄ Ｗｅｉｎｅｒ， Ｄ．Ｂ． （１９９５）． Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｄｉｒｅｃｔ ＤＮＡ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ６， ４０７−４１８．
Ｗａｎｇ， Ｂ．， Ｕｇｅｎ， Ｋ．Ｅ．， Ｓｒｉｋａｎｔａｎ， Ｖ．， Ａｇａｄｊａｎｙａｎ， Ｍ．Ｇ．， Ｄａｎｇ， Ｋ．， Ｒｅｆａｅｌｉ， Ｙ．， Ｓａｔｏ， Ａ．Ｉ．， Ｂｏｙｅｒ， Ｊ．， Ｗｉｌｌｉａｍｓ， Ｗ．Ｖ．， ａｎｄ Ｗｅｉｎｅｒ， Ｄ．Ｂ． （１９９３）． Ｇｅｎｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｇｅｎｅｒａｔｅｓ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０， ４１５６−４１６０．
Ｗｏｌｆｆ， Ｊ．Ａ．， Ｍａｌｏｎｅ， Ｒ．Ｗ．， Ｗｉｌｌｉａｍｓ， Ｐ．， Ｃｈｏｎｇ， Ｗ．， Ａｃｓａｄｉ， Ｇ．， Ｊａｎｉ， Ａ．， ａｎｄ Ｆｅｌｇｎｅｒ， Ｐ．Ｌ． （１９９０）． Ｄｉｒｅｃｔ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ ｍｏｕｓｅ ｍｕｓｃｌｅ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７， １４６５−１４６８．
Ｙｉｎｇ， Ｈ．， Ｚａｋｓ， Ｔ．Ｚ．， Ｗａｎｇ， Ｒ．Ｆ．， Ｉｒｖｉｎｅ， Ｋ．Ｒ．， Ｋａｍｍｕｌａ， Ｕ．Ｓ．， Ｍａｒｉｎｃｏｌａ， Ｆ．Ｍ．， Ｌｅｉｔｎｅｒ， Ｗ．Ｗ．， ａｎｄ Ｒｅｓｔｉｆｏ， Ｎ．Ｐ． （１９９９）． Ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ ｕｓｉｎｇ ａ ｓｅｌｆ−ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ＲＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ． Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ５， ８２３−８２７．
【技術分野】
【０００１】
弱毒または不活性化された病原体を含む従来のワクチンは多くの分野で有効であるものの、いくつかの感染性病原体や腫瘍に対しては有効な防御免疫を付与しない。これには有効で、用途が広く、生産が容易かつコスト効果があり、保存が容易なワクチンが必要である。
【背景技術】
【０００２】
プラスミドＤＮＡを直接筋肉注射した後では、コードされている遺伝子の細胞表面での発現が持続することが示されており（Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ．， １９９０）、ＤＮＡに基づくワクチンが新たな有望な免疫戦略としてみなされている。これは核酸に基づくワクチンを開発するための重要な動機となった。当初、感染性病原体に対するＤＮＡに基づくワクチンが試験されたが（Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．， １９９３； Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９９３； Ｕｌｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９３； Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９３）、すぐに、特異的抗腫瘍免疫を誘導することを目的とする対腫瘍遺伝子療法においてさらに詳細に研究されるようになった（Ｃｏｎｒｙ ｅｔ ａｌ．， １９９４； Ｃｏｎｒｙ ｅｔ ａｌ．， １９９５ａ； Ｓｐｏｏｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９５； Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９５）。この腫瘍免疫の戦略には重要な利点がいくつかある。核酸に基づくワクチンは製造が容易で、比較的安価である。さらに、この核酸に基づくワクチンは少数の細胞から増幅させることができる。
【０００３】
ＤＮＡはＲＮＡよりも安定であるが、抗ＤＮＡ抗体の誘導（Ｇｉｌｋｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９５）および宿主ゲノムへの導入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎ）の組込みなど、安全性に対する潜在的なリスクがいくつかある。これは細胞の遺伝子を不活性化し、該導入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎ）の制御できない長期的発現または発癌を招き、従って、例えばｅｒｂ−Ｂ２（Ｂａｒｇｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９８６）やｐ５３（Ｇｒｅｅｎｂｌａｔｔ ｅｔ ａｌ．， １９９４）などの発癌能を有する腫瘍関連抗原には通常適用できない。ＲＮＡの使用はこれらの潜在的リスクを回避するための魅力的な代替法となる。
【０００４】
可逆的な遺伝子療法の一種としてＲＮＡを用いることの利点には、一時的発現および非形質転換特性が含まれる。ＲＮＡはトランスジェニック的に発現させるために核に入る必要がなく、もっと言えば、宿主ゲノムに組み込まれることはなく、それにより発癌のリスクがなくなる。ＤＮＡを用いる場合 （Ｃｏｎｄｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９６； Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９２）と同様、ＲＮＡの注射もまた、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞性免疫応答と体液性免疫応答の双方を誘導し得る（Ｈｏｅｒｒ ｅｔ ａｌ．， ２０００； Ｙｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。
【０００５】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡ（ＩＶＴ−ＲＮＡ）による免疫療法は、双方とも種々の動物モデルにおいて引き続いて試験されている２つの異なる戦略の使用に至らせる。ＲＮＡは種々の免疫経路を介して直接注入される（Ｈｏｅｒｒ ｅｔ ａｌ．， ２０００）か、または樹状細胞（ＤＣ）がリポフェクションもしくはエレクトロポレーションにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡでトランスフェクトされ、その後投与される（Ｈｅｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０００）。最近発表された研究では、ＲＮＡでトランスフェクトされたＤＣによる免疫化は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を誘導ことが示されている（Ｓｕ ｅｔ ａｌ．， ２００３； Ｈｅｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００２）。Ｔ細胞介在性の免疫応答の最適な誘導の中枢的に重要な因子はとりわけ用量、すなわち、ＤＣに対する抗原提示の密度である。導入されたＩＶＴ−ＲＮＡの長期発現を達成するためには、種々の修飾によりＩＶＴ−ＲＮＡを安定化させる、それにより、ＤＣに対する抗原提示を高めることが試みられている。翻訳の基本要件は、その翻訳効率がポリ（Ａ）の長さに相関する３’ポリ（Ａ）配列が存在することである（Ｐｒｅｉｓｓ ａｎｄ Ｈｅｎｔｚｅ， １９９８）。５’キャップおよび３’ポリ（Ａ）配列は相乗作用的にｉｎ ｖｉｖｏ翻訳を活性化する（Ｇａｌｌｉｅ， １９９１）。グロビン遺伝子の非翻訳領域（ＵＴＲ）は、ＲＮＡの安定化および翻訳効率の増強に寄与し得る他の公知のエレメントである（Ｍａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．， １９８９）。
【０００６】
いくつかのＩＶＴベクターは文献で知られ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写の鋳型として標準的な方法で使用され、安定化されたＲＮＡ転写産物が生成されるように遺伝的に修飾されている。これまでに文献に記載されているプロトコール（Ｃｏｎｒｙ ｅｔ ａｌ．， １９９５ｂ； Ｔｅｕｆｅｌ ｅｔ ａｌ．， ２００５； Ｓｔｒｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９７； Ｃａｒｒａｌｏｔ ｅｔ ａｌ．， ２００４； Ｂｏｃｚｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， ２０００）は、次の構造：ＲＮＡ転写を可能とする５’ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、それに続く、３’および／または５’のいずれかで非翻訳領域（ＵＴＲ）にフランキングされた目的遺伝子、および５０〜７０Ａヌクレオチドを含む３’ポリアデニルカセットを有するプラスミドベクターに基づく。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写前に、この環状プラスミドは、ＩＩ型制限酵素（認識配列は切断部位に相当する）によりポリアデニルカセットの下流で線状化される。よって、このポリアデニルカセットは、その転写産物において後期ポリ（Ａ）配列に相当する。この手順の結果として、いくつかのヌクレオチドが線状化後に酵素切断部位の一部として残り、その３’末端においてポリ（Ａ）配列を延長するか、またはマスクする。この非生理学的オーバーハングがこのような構築物から細胞内で産生されるタンパク質の量に影響を及ぼすかどうかは明らかでない。
【０００７】
よって、ＲＮＡは臨床適用に特に好適であると思われる。しかしながら、遺伝子療法におけるＲＮＡの利用は、特に細胞質ではＲＮＡの短い半減期により著しく制限され、その結果、タンパク質発現は低くなる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、安定性および翻訳効率が向上されたＲＮＡおよびこのようなＲＮＡを得るための手段を提供することである。該ＲＮＡを遺伝子療法アプローチに用いることで、高いグレードの発現が得られるに違いない。
【０００９】
この目的は特許請求の範囲の主題により本発明に従い達成される。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡの安定化およびｍＲＮＡ翻訳の増強に関する。本発明は特に、転写産物の安定性および翻訳効率の向上をもたらすＲＮＡ、特にｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡの３つの修飾に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、オープンエンド型ポリ（Ａ）配列を有するＲＮＡは、末端がマスクされたポリ（Ａ）配列を有するＲＮＡより効率的に翻訳されることが分かった。特に約１２０ ｂｐの長いポリ（Ａ）配列は最適なＲＮＡ転写産物の安定性と翻訳効率をもたらすことが分かった。本発明はまた、ＲＮＡ分子において、特にヒトβ−グロビン遺伝子の二重の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）が、個々の２つのＵＴＲを用いた場合に予測されるトータル効果を明らかに超えるほどに翻訳効率を向上させることが実証された。本発明によれば、上記の修飾の組合せは、ＲＮＡの安定化および翻訳の増強に相乗作用を有することが分かった。
【００１２】
転写産物の量およびタンパク質収量を測定するための定量的ＲＴ−ＰＣＲおよびｅＧＦＰ変異体を用い、本発明は、本発明のＲＮＡ修飾が樹状細胞（ＤＣ）のトランスフェクションにおいて独立にＲＮＡの安定性と翻訳効率増強することを実証した。よって、トランスフェクトされた細胞上での抗原特異的ペプチド／ＭＨＣ複合体の密度ならびに抗原特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激および拡大するそれらの能力を増強することができた。よって、本発明は、本発明に記載のＲＮＡ修飾により修飾されたＲＮＡを用いることでＲＮＡトランスフェクトＤＣワクチンを至適化するための戦略に関する。
【００１３】
本発明によれば、修飾、およびそれによるＲＮＡの安定化および／または翻訳効率の向上は好ましくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＲＮＡ転写の鋳型として好ましく働く発現ベクターを遺伝的に修飾することにより達成される。
【００１４】
この種のベクターは特に、好ましくは該ＲＮＡにオープンエンドを有する、すなわち、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドが該ポリ（Ａ）配列の３’末端にフランキングしていないポリ（Ａ）配列を有するＲＮＡを転写させることを意図する。該ＲＮＡにおけるオープンエンド型ポリ（Ａ）配列は、５’ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御下でＲＮＡを転写させ、ポリアデニルカセット（ポリ（Ａ）配列）を含む発現ベクターにＩＩＳ型制限切断部位を導入することにより達成することができ、この認識配列はポリ（Ａ）配列の３’に位置し、切断部位は上流、従ってポリ（Ａ）配列内に位置する。このＩＩＳ型制限切断部位における制限切断により、プラスミドをポリ（Ａ）配列内で線状化することができる（図２）。その後、線状化プラスミドをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のための鋳型として用い、マスクされていないポリ（Ａ）配列で終わる転写産物を得ることができる。
【００１５】
その上、またはその代わりに、修飾、ならびにそれによるＲＮＡの安定化および／または翻訳効率の向上は、本発明に従い、その３’末端に、好ましくはペプチドまたはタンパク質をコードする配列（オープンリーディングフレーム）とポリ（Ａ）配列との間に２以上の３’非翻訳領域を有するＲＮＡを転写させるように発現ベクターを遺伝的に修飾することで達成することができる。
【００１６】
一態様では、本発明は、５’→３’転写方向に、（ａ）プロモーター；（ｂ）転写可能な核酸配列または転写可能な核酸配列を導入するための核酸配列；（ｃ−１）遺伝子の３’非翻訳領域に相当する、またはそれに由来する第一の核酸配列；および（ｃ−２）遺伝子の３’非翻訳領域に相当する、またはそれに由来する第二の核酸配列を含む核酸分子に関する。
【００１７】
一実施形態では、本発明の核酸分子は、（ｃ−３）遺伝子の３’ 非翻訳領域に相当する、またはそれに由来する少なくとも１つのさらなる核酸配列をさらに含む。
【００１８】
本発明の核酸分子では、プロモーター（ａ）の制御下の核酸配列（ｂ）、（ｃ−１）、（ｃ−２）および適当であれば（ｃ−３）は転写されて、核酸配列（ｃ−１）および／または（ｃ−２）および／または適当であれば（ｃ−３）から転写された核酸配列に、好ましくは転写可能な核酸配列（ｂ）から転写された核酸配列の翻訳効率および／または安定性を高めるような活性がある共通転写産物を生じ得ることが好ましい。
【００１９】
核酸配列（ｃ−１）、（ｃ−２）および適当であれば（ｃ−３）は同一であっても異なっていてもよい。
【００２０】
一実施形態では、該核酸配列は、（ｄ）プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする核酸配列をさらに含む。
【００２１】
プロモーター（ａ）の制御下の核酸配列（ｂ）、（ｃ−１）、（ｃ−２）、適当であれば（ｃ−３）および（ｄ）は転写されて、核酸配列（ｃ−１）および／または（ｃ−２）および／または適当であれば（ｃ−３）および／または（ｄ）から転写された核酸配列に、好ましくは転写可能な核酸配列（ｂ）から転写された核酸配列の翻訳効率および／または安定性を高めるような活性がある共通転写産物を生じ得ることが好ましい。
【００２２】
特定の実施形態では、核酸配列（ｄ）は、プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に少なくとも４０、好ましくは少なくとも８０、好ましくは少なくとも１００、特に約１２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする。核酸配列（ｄ）は、プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に５００まで、好ましくは４００まで、好ましくは３００まで、好ましくは２００まで、特に１５０までの連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードするのが好ましい。
【００２３】
一実施形態では、該核酸分子は、切断が５’→３’転写方向に、プロモーター（ａ）、核酸配列（ｂ）、核酸配列（ｃ−１）、（ｃ−２）および適当であれば（ｃ−３）、ならびに核酸配列（ｄ）の少なくとも一部（この核酸配列（ｄ）の少なくとも一部は、プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードし、その転写産物において３’末端ヌクレオチドは少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドの該ヌクレオチド配列のＡヌクレオチドである）を含む核酸分子を生じるように、核酸配列（ｄ）内で、好ましくは酵素的にまたは別の生化学的方法で切断され得ることを特徴とする。
【００２４】
好ましくは、切断後、該核酸分子は、少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列の鋳型として働く鎖の末端に、その転写産物において少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列の鋳型として働くヌクレオチド配列の一部であるＴヌクレオチドを有する。
【００２５】
特定の実施形態では、核酸配列（ｄ）の少なくとも一部は、プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に少なくとも４０、好ましくは少なくとも８０、好ましくは少なくとも１００、特に約１２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする。核酸配列（ｄ）は、プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に５００まで、好ましくは４００まで、好ましくは３００まで、好ましくは２００まで、特に１５０までの連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードするのが好ましい。
【００２６】
本発明の核酸分子は好ましくは、切断前には閉環分子であり、切断後には直鎖分子である。
【００２７】
好ましくはＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの制限切断部位である制限切断部位の助けで切断が行われるのが好ましい。
【００２８】
一実施形態では、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの認識配列は核酸配列（ｄ）の３’末端の５〜２６塩基対、好ましくは２４〜２６塩基対下流に位置する。
【００２９】
好ましい実施形態では、核酸配列（ｃ−１）、（ｃ−２）および適当であれば（ｃ−３）は互いに独立にα２−グロビン、α１−グロビン、β−グロビンおよび成長ホルモン、好ましくは、ヒトβ−グロビンなどのグロビン遺伝子からなる群から選択される遺伝子に由来し、特に好ましい実施形態では、配列表の配列番号１の核酸配列またはそれに由来する核酸配列に相当する。
【００３０】
さらなる態様において、本発明は、５’→３’転写方向に、（ａ）プロモーター；（ｂ）転写可能な核酸配列または転写可能な核酸配列を導入するための核酸配列；および（ｃ）プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする核酸配列を含む核酸分子に関する。
【００３１】
プロモーター（ａ）の制御下の核酸配列（ｂ）および（ｃ）は転写されて、核酸配列（ｃ）から転写された核酸配列に、好ましくは転写可能な核酸配列（ｂ）から転写された核酸配列の翻訳効率および／または安定性を高めるような活性がある共通転写産物を生じ得ることが好ましい。
【００３２】
特定の実施形態では、核酸配列（ｃ）は、プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に少なくとも４０、好ましくは少なくとも８０、好ましくは少なくとも１００、特に約１２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする。核酸配列（ｃ）は、プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に５００まで、好ましくは４００まで、好ましくは３００まで、好ましくは２００まで、特に１５０までの連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードするのが好ましい。
【００３３】
一実施形態では、該核酸分子は、切断が５’→３’転写方向に、プロモーター（ａ）、核酸配列（ｂ）、および核酸配列（ｃ）の少なくとも一部（この核酸配列（ｃ）の少なくとも一部は、プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードし、その転写産物において３’末端ヌクレオチドは少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドの該ヌクレオチド配列のＡヌクレオチドである）を含む核酸分子を生じるように、核酸配列（ｃ）内で、好ましくは酵素的にまたは別の生化学的方法で切断され得る。
【００３４】
好ましくは、切断後、該核酸分子は、少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列の鋳型として働く鎖の末端に、その転写産物において少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列の鋳型として働くヌクレオチド配列の一部であるＴヌクレオチドを有する。
【００３５】
特定の実施形態では、核酸配列（ｃ）の少なくとも一部は、プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に少なくとも４０、好ましくは少なくとも８０、好ましくは少なくとも１００、特に約１２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする。核酸配列（ｃ）は、プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に５００まで、好ましくは４００まで、好ましくは３００まで、好ましくは２００まで、特に１５０までの連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードするのが好ましい。
【００３６】
該核酸分子は好ましくは、切断前には閉環分子であり、切断後には直鎖分子である。
【００３７】
好ましくはＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの制限切断部位である制限切断部位の助けで切断が行われるのが好ましい。
【００３８】
一実施形態では、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの認識配列は核酸配列（ｃ）の３’末端の５〜２６塩基対、好ましくは２４〜２６塩基対下流に位置する。
【００３９】
本発明の１つの核酸分子では、転写可能な核酸配列は好ましくはペプチドまたはタンパク質をコードする核酸配列を含み、転写可能な核酸配列を導入するための核酸配列は好ましくは多重クローニング部位である。
【００４０】
本発明の核酸分子は、（ｉ）レポーター遺伝子；（ｉｉ）選択マーカー；および（ｉｉｉ）複製起点からなる群から選択される１以上のメンバーをさらに含み得る。
【００４１】
一実施形態では、本発明の核酸分子は閉環コンフォメーションであり、特に線状化後に、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写に好適であるのが好ましい。
【００４２】
さらなる態様では、本発明は、上記の核酸分子の線状化により、好ましくは少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする核酸配列内での切断により得られる核酸分子、ならびにプロモーター（ａ）の制御下、上記の核酸分子との転写、好ましくはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により得られるＲＮＡに関する。
【００４３】
さらなる態様では、本発明は、その安定性および／または翻訳効率を高めるよう選択されたＲＮＡ分子をｉｎ ｖｉｔｒｏで転写させる方法であって、（ｉ）遺伝子の３’非翻訳領域に相当する、またはそれに由来する第一の核酸配列（ｂ−１）を、転写されて該ＲＮＡ分子を生じ得る核酸配列（ａ）の３’末端に結合させること、（ｉｉ）遺伝子の３’非翻訳領域に相当する、またはそれに由来する第二の核酸配列（ｂ−２）を、該第一の核酸配列（ｂ−１）の３’末端に結合させること、および（ｉｉｉ）得られた核酸をｉｎ ｖｉｔｒｏで転写させることを含む方法に関する。
【００４４】
さらなる態様において、本発明は、その発現を増強するよう選択されたｍＲＮＡ分子を転写させる方法であって、（ｉ）遺伝子の３’非翻訳領域に相当する、またはそれに由来する第一の核酸配列（ｂ−１）を、転写されて該ＲＮＡ分子を生じ得る核酸配列（ａ）の３’末端に結合させること、（ｉｉ）遺伝子の３’非翻訳領域に相当する、またはそれに由来する第二の核酸配列（ｂ−２）を、該第一の核酸配列（ｂ−１）の３’末端に結合させること、および（ｉｉｉ）得られた核酸を転写させることにより得ることができるｍＲＮＡを翻訳することを含む方法に関する。転写は好ましくはｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる。
【００４５】
本発明おいて「核酸配列を核酸配列の３’末端に結合させる」とは、第一の核酸配列が第二の核酸配列の下流になり、付加的核酸配列により後者から離されてもよいような、２つの核酸配列の共有結合に関していう。
【００４６】
一実施形態では、本発明の方法は、遺伝子の３’非翻訳領域に相当する、またはそれに由来する少なくとも１つのさらなる核酸配列（ｂ−３）を第二の核酸配列（ｂ−２）の３’末端に結合させることをさらに含む。
【００４７】
核酸配列（ａ）、（ｂ−１）、（ｂ−２）および適当であれば（ｂ−３）は転写されて、核酸配列（ｂ−１）および／または（ｂ−２）および／または適当であれば（ｂ−３）から転写された核酸配列に、好ましくは核酸配列（ａ）により転写された核酸配列の翻訳効率および／または安定性を高めるような活性がある共通転写産物を生じ得ることが好ましい。
【００４８】
さらなる実施形態では、本発明の方法は、転写された際に、少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする核酸配列（ｃ）を核酸配列（ｂ−２）の、または適当であれば核酸配列（ｂ−３）の３’末端に結合させることをさらに含む。
【００４９】
核酸配列（ａ）、（ｂ−１）、（ｂ−２）および適当であれば（ｂ−３）ならびに（ｃ）は転写されて、核酸配列（ｂ−１）および／または（ｂ−２）および／または適当であれば（ｂ−３）および／または（ｃ）から転写された核酸配列に、好ましくは核酸配列（ａ）から転写された核酸配列の翻訳効率および／または安定性を高めるような活性がある共通転写産物を生じ得ることが好ましい。
【００５０】
特定の実施形態では、核酸配列（ｃ）は、その転写産物に少なくとも４０、好ましくは少なくとも８０、好ましくは少なくとも１００、特に約１２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする。核酸配列（ｃ）は、転写された際に、その転写産物に５００まで、好ましくは４００まで、好ましくは３００まで、好ましくは２００まで、特に１５０までの連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードするのが好ましい。
【００５１】
特定の実施形態では、本発明の方法は、得られた核酸の転写の前に、このようにして得られた核酸の転写が、核酸配列（ａ）、（ｂ−１）、（ｂ−２）および適当であれば（ｂ−３）ならびに少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドの３’末端ヌクレオチド配列から転写された核酸配列を有する転写産物（該転写産物の３’末端ヌクレオチドは少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列のＡヌクレオチドである）を生じるように核酸配列（ｃ）内で切断することをさらに含む。
【００５２】
特定の実施形態では、該転写産物は、その３’末端に少なくとも４０、好ましくは少なくとも８０、好ましくは少なくとも１００、特に約１２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する。該転写産物は、その３’末端に５００まで、好ましくは４００まで、好ましくは３００まで、好ましくは２００まで、特に１５０までの連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列を有するのが好ましい。
【００５３】
好ましい実施形態では、核酸配列（ｂ−１）、（ｂ−２）および適当であれば（ｂ−３）は互いに独立にα２−グロビン、α１−グロビン、β−グロビンおよび成長ホルモン、好ましくはヒトβ−グロビンなどのグロビン遺伝子からなる群から選択される遺伝子に由来し、特に好ましい実施形態では、配列表の配列番号１の核酸配列またはそれに由来する核酸配列に相当する。
【００５４】
さらなる態様において、本発明は、その安定性および／または翻訳効率を高めるよう選択されたＲＮＡ分子をｉｎ ｖｉｔｒｏで転写させる方法であって、（ｉ）転写された際に、少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする核酸配列（ｂ）を、転写されて前記ＲＮＡ分子を生じ得る核酸配列（ａ）の３’末端に結合させること、および（ｉｉ）得られた核酸をｉｎ ｖｉｔｒｏで転写させることを含む方法に関する。
【００５５】
さらなる態様において、本発明は、その発現を増強するよう選択されたｍＲＮＡ分子を翻訳する方法であって、（ｉ）転写された際に、少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする核酸配列（ｂ）を、転写されて前記ｍＲＮＡ分子を生じ得る核酸配列（ａ）の３’末端に結合させること、および（ｉｉ）得られた核酸を転写させることにより得ることができるｍＲＮＡを翻訳することを含む方法に関する。転写はｉｎ ｖｉｔｒｏで行われるのが好ましい。
【００５６】
核酸配列（ａ）および（ｂ）は転写されて、核酸配列（ｂ）から転写された核酸配列に、好ましくは核酸配列（ａ）から転写された核酸配列の翻訳効率および／または安定性を高めるような活性がある共通転写産物を生じ得ることが好ましい。
【００５７】
特定の実施形態では、核酸配列（ｂ）は、その転写産物に少なくとも４０、好ましくは少なくとも８０、好ましくは少なくとも１００、特に約１２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする。核酸配列（ｂ）は、転写された際に、その転写産物に５００まで、好ましくは４００まで、好ましくは３００まで、好ましくは２００まで、特に１５０までの連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードするのが好ましい。
【００５８】
特定の実施形態では、本発明の方法は、得られた核酸の転写の前に、このようにして得られた核酸の転写が、核酸配列（ａ）および少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドの３’末端ヌクレオチド配列から転写された核酸配列を有する転写産物（該転写産物の３’末端ヌクレオチドは少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列のＡヌクレオチドである）を生じるように核酸配列（ｂ）内で切断することをさらに含む。
【００５９】
特定の実施形態では、該転写産物は、その３’末端に少なくとも４０、好ましくは少なくとも８０、好ましくは少なくとも１００、特に約１２０の連続するＡヌクレオチドを有する。該転写産物は、その３’末端に５００まで、好ましくは４００まで、好ましくは３００まで、好ましくは２００まで、特に１５０までの連続するＡヌクレオチドを有するのが好ましい。
【００６０】
本発明の方法の全ての態様において、切断は、好ましくはＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの制限切断部位である制限切断部位の助けで行われるのが好ましい。
【００６１】
一実施形態では、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの認識配列は、転写された際に、少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする核酸配列の３’末端の５〜２６塩基対、好ましくは２４〜２６塩基対下流に位置する。
【００６２】
本発明はまた、選択されたＲＮＡ分子をｉｎ ｖｉｔｒｏで転写させる本発明の方法により得ることができるＲＮＡに関する。本発明の核酸分子から、選択されたＲＮＡ分子をｉｎ ｖｉｔｒｏで転写させる本発明の方法により得ることができる、鋳型としてのＲＮＡ調製物は、そのＲＮＡのポリ（Ａ）配列の長さに関して好ましくは均質または本質的に均質であり、すなわち、このポリ（Ａ）配列の長さは、１０個だけ、好ましくは５個、４個、３個、２個または１個のＡヌクレオチドだけ異なるＲＮＡ分子が調製物中に９０％以下、好ましくは９５％以下、好ましくは９８％または９９％以下である。
【００６３】
本発明は例えば、細胞内での転写および発現において組換えタンパク質の発現を増強するために利用可能である。より具体的には、組換えタンパク質を産生する場合、本発明に記載の修飾およびその組合せを発現ベクターに導入し、細胞系において組換え核酸の転写および組換えタンパク質の発現を増強する目的でそれらを利用することができる。これには例えば、組換え抗体、ホルモン、サイトカインおよび酵素などの生産が含まれる。これによりとりわけ生産コストの低減が可能となる。
【００６４】
また、遺伝子療法適用で、本発明に記載の修飾およびその組合せを利用することもできる。該修飾は遺伝子療法ベクターに導入し、それにより導入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎ）の発現を増強させるために利用することができる。この目的で、いずれの核酸（ＤＮＡ／ＲＮＡ）に基づくベクター系（例えば、プラスミド、アデノウイルス、ポックスウイルスベクター、インフルエンザウイルスベクター、およびαウイルスベクターなど）も使用可能である。例えばリンパ球または樹状細胞では、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて細胞をこれらのベクターでトランスフェクトすることができ、あるいは直接ｉｎ ｖｉｖｏに投与することもできる。
【００６５】
さらに、本発明に記載の修飾およびその組合せは、リボ核酸の安定性および／または発現を、そしてそれにより該リボ核酸によりコードされるペプチドまたはタンパク質の量を増強させることができる。コードリボ核酸は例えば遺伝子の一時的発現ために利用可能であり、可能性のある適用分野としては、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて細胞にトランスフェクトされる、または直接ｉｎ ｖｉｖｏに投与されるＲＮＡに基づくワクチン、例えば細胞において分化プロセスを開始させるため、またはタンパク質の機能を研究するためのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける機能的組換えタンパク質の一時的発現、ならびにｉｎ ｖｉｖｏにおける、特に医薬としての、エリスロポエチン、ホルモン、血液凝固阻害剤などのような機能的組換えタンパク質の一時的発現がある。
【００６６】
本発明に記載の修飾により修飾されたＲＮＡ、特にｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡは特に抗原提示細胞をトラスフェクトするために、従って提示されるべき抗原を送達するため、また、抗原提示細胞に、該ＲＮＡから発現されたまたはそれに由来するペプチドまたはタンパク質に相当する該提示抗原を、特に切断などの細胞内プロセシングにより付加するため（すなわち、この提示抗原は例えばＲＮＡから発現されたペプチドまたはタンパク質の断片である）のツールとして使用することができる。このような抗原提示細胞はＴ細胞、特にＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激するために使用可能である。
【００６７】
発明の詳細な説明
本発明によれば、組換え核酸の作製、細胞の培養および核酸、特にＲＮＡの細胞への導入、特にエレクトロポレーションおよびリポフェクションには、標準的な方法が使用可能である。酵素反応は製造業者の使用説明書に従い、またはそれ自体公知の方法で行われる。
【００６８】
本発明によれば、核酸分子または核酸配列とは、好ましくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）である核酸を指す。本発明によれば、核酸はゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、組換え生産された分子、および化学的に合成された分子を含む。本発明によれば、核酸は一本鎖または二本鎖、および直鎖または共有結合的に閉環した分子の形態であってよい。
【００６９】
「ｍＲＮＡ」とは「メッセンジャーＲＮＡ」を意味し、ＤＮＡを鋳型として生産され、それ自体ペプチドまたはタンパク質をコードする「転写産物」を指す。ｍＲＮＡは一般に５’非翻訳領域、タンパク質コード領域および３’非翻訳領域を含む。ｍＲＮＡは、細胞内でもｉｎ ｖｉｔｒｏでも限られた半減期を有する。本発明によれば、ｍＲＮＡはＤＮＡ鋳型からｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により作製することができる。このｍＲＮＡは、本発明の修飾に加え、さらなる安定化修飾およびキャッピングにより修飾してもよい。
【００７０】
「核酸」とはさらにまた、ヌクレオチド塩基、糖またはリン酸基に対する核酸の化学誘導体、ならびに非天然ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含有する核酸を含む。
【００７１】
本発明によれば「核酸配列に由来する核酸配列」とは、それが由来する核酸に比べて、単一または複数のヌクレオチド置換、欠失および／または付加を含み、好ましくはそれが由来する核酸と相補的である、すなわち、該核酸間にある程度の相同性があり、該核酸のヌクレオチド配列が有意な直接的または相補的様式で一致する、核酸配列を指す。本発明によれば、核酸に由来する核酸は、それが由来する核酸の機能的特性を有している。このような機能的特性としては、特に、ＲＮＡへと転写し得る核酸（転写可能な核酸配列）との機能的連結において、完全なＲＮＡ分子においてこの核酸から産生されるＲＮＡの安定性および／または翻訳効率を高める能力が含まれる。
【００７２】
本発明によれば「機能的連結」または「機能的に連結された」とは、機能的関係の範囲内の連結に関していう。核酸は、別の核酸配列と機能的に関連している場合に、「機能的に連結されている」という。例えば、プロモーターは、コード配列の転写に影響を及ぼす場合に、該コード配列に機能的に連結されているという。機能的に連結されている核酸は一般に、別の核酸と、適当であればさらなる核酸配列により離されて隣接しており、特定の実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼにより転写されて、単一のＲＮＡ分子（共通転写産物）が得られる。
【００７３】
本発明に記載される核酸は単離されていることが好ましい。「単離された核酸」とは、本発明によれば、その核酸が（ｉ）例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりｉｎ ｖｉｔｒｏで増幅されたものであるか、（ｉｉ）クローニングにより組換え生産されたものであるか、（ｉｉｉ）例えば切断およびゲル濾過分画により精製されたものであるか、または（ｉｖ）例えば化学合成により合成されたものであることを意味する。単離された核酸は組換えＤＮＡ技術による操作に利用可能な核酸である。
【００７４】
核酸は、その２つの配列が互いにハイブリダイズして安定な二重らせんを形成するこができる場合に別の核酸と「相補的」であるといい、該ハイブリダイゼーションは好ましくはポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能とする条件（ストリンジェント条件）下で行われる。ストリンジェント条件は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８９ ｏｒ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されており、例えば、６５℃、ハイブリダイゼーションバッファー（３．５×ＳＳＣ、０．０２％フィコール、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ウシ血清アルブミン、２．５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）、０．５％ＳＤＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）中でのハイブリダイゼーションを指す。ＳＳＣは０．１５Ｍ塩化ナトリウム／０．１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ ７である。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡを写し取ったメンブランを、例えば２×ＳＳＣ中、室温で洗浄した後、０．１〜０．５×ＳＳＣ／０．１×ＳＤＳ中、６８℃までの温度で洗浄する。
【００７５】
本発明によれば、相補的核酸は、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるヌクレオチドを有する。
【００７６】
「同一性％」とは、比較する２つの配列間で最適なアライメントにおいて同一であるヌクレオチドのパーセンテージを指し、該パーセンテージは単に統計学的なものであり、この２配列間の違いは、配列の全長にわたってランダムに分布している場合もあるし、また、２配列間の最適アライメントを得るために、比較配列は参照配列に対して付加もしくは欠失を含んでいる場合もある。２配列の比較は通常、対応する配列の局部領域を特定するために、最適アライメントの後にこれらの配列をセグメントまたは「比較枠」に関して比較することにより行う。比較のための最適アライメントは手動で、またはＳｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ， １９８１， Ａｄｓ Ａｐｐ． Ｍａｔｈ． ２， ４８２によるローカルホモロジーアルゴリズム、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， １９７０， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８， ４４３によるローカルホモロジーアルゴリズム、およびＰｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５， ２４４４による類似性検索アルゴリズムまたは前記アルゴリズムを用いたコンピュータープログラム（ＧＡＰ， ＢＥＳＴＦＩＴ， ＦＡＳＴＡ， ＢＬＡＳＴ Ｐ， ＢＬＡＳＴ Ｎ ａｎｄ ＴＦＡＳＴＡ ｉｎ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ．）の助けで行うことができる。
【００７７】
同一性パーセンテージは、比較配列が一致する位置の数を求め、この数を比較した位置の数で割り、この解に１００を掛けることにより得られる。
【００７８】
例えば、ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｗｂｌａｓｔ２．ｃｇｉで入手できるＢＬＡＳＴプログラム「ＢＬＡＳＴ２配列」が使用可能である。
【００７９】
「核酸の３’末端」とは、本発明では、遊離ヒドロキシ基を有する末端を指す。二本鎖核酸、特にＤＮＡの模式図では、３’末端は常に右側にある。「核酸の５’末端」とは、本発明では、遊離リン酸基を有する末端を指す。二本鎖核酸、特にＤＮＡの模式図では、５’末端は常に左側にある。
５’末端 ５’−−Ｐ−ＮＮＮＮＮＮＮ−ＯＨ−３’
３’末端 ３’−ＨＯ−ＮＮＮＮＮＮＮ−Ｐ−−５’
【００８０】
特定の実施形態では、核酸は、本発明に従い、その核酸に対して同種であっても異種であってもよい発現制御配列と機能的に連結されている。
【００８１】
転写可能な核酸、特にペプチドまたはタンパク質をコードする核酸および発現制御配列は、それらが、転写可能な、特にコード核酸の転写または発現がその発現制御配列の制御下または影響下にあるように互いに共有結合されている場合に、互いに「機能的に」連結されているという。この核酸が機能的ペプチドまたはタンパク質に翻訳されるならば、そのコード配列に機能的に連結されている発現制御配列の誘導は、コード配列にフレームシフトを起こすことなく、またはコード配列が所望のペプチドまたはタンパク質の翻訳不能となることなく、コード配列の転写を起こす。
【００８２】
「発現制御配列」は、本発明によれば、プロモーター、リボソーム結合配列および遺伝子の転写または誘導されるＲＮＡの翻訳を制御する他の制御エレメントを含む。本発明の特定の実施形態では、発現制御配列は調節可能である。発現制御配列の厳密な構造は、種または細胞種によって異なるが、通常、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列およびＣＡＡＴ配列など、それぞれ転写および翻訳の開始に関与する５’非転写配列ならびに５’および３’非翻訳配列を含む。より具体的には、５’非転写発現制御配列は、機能的に連結された遺伝子の転写制御のためのプロモーター配列を包含するプロモーター領域を含む。発現制御配列はまたエンハンサー配列または上流アクチベーター配列も含み得る。
【００８３】
本明細書に明示される核酸、特に転写可能なコード核酸は、その核酸に対して同種であっても異種であってもよい発現制御配列、特にプロモーターのいずれと組み合わせてもよく、「同種」とは、核酸がまた発現制御配列に天然状態で機能的に連結されているということを表し、「異種」とは、核酸が発現制御配列に天然状態では機能的に連結されていないということを表す。
【００８４】
「プロモーター」または「プロモーター領域」とは、ＲＮＡポリメラーゼの認識および結合部位を提供することでコード配列の発現を制御する、遺伝子のコード配列の上流（５’）ＤＮＡ配列を指す。このプロモーター領域は、該遺伝子の転写の調節に関与するさらなる因子のためのさらなる認識または結合部位を含んでいてもよい。プロモーターは原核生物または真核生物の遺伝子の転写を制御し得る。プロモーターはインデューサーに応答して転写を開始する「誘導型」であるか、転写がインデューサーによって制御されなければ「構成型」である。誘導型プロモーターは、インデューサーが存在しなければ、極めて小さな程度でしか発現しないか、または全く発現しない。インデューサーの存在下では、この遺伝子は「スイッチオン」となるか、または転写レベルが高まる。これは通常、特定の転写因子の結合によって媒介される。
【００８５】
本発明に従う好ましいプロモーターの例としては、ＳＰ６、Ｔ３またはＴ７ポリメラーゼのプロモーターがある。
【００８６】
本発明によれば、「発現」とは、その最も一般的に意味で用いられ、ＲＮＡまたはＲＮＡとタンパク質の産生を含む。また、核酸の部分的発現も含まれる。さらに、発現は一時的なものであっても安定したものであってもよい。ＲＮＡに関して「発現」または「翻訳」とは、特にペプチドまたはタンパク質の産生を指す。
【００８７】
「転写されて共通転写産物を生じ得る核酸」とは、その核酸が、適当であれば該核酸を含む核酸分子の、特に、閉環核酸分子の制限酵素切断などの線状化の後、プロモーターの制御下での転写が、適当であればその間に位置する配列により離されて、互いに共有結合された該核酸の転写産物を含むＲＮＡ分子を生じるように、互いに機能的に連結されていることを意味する。
【００８８】
本発明によれば、「転写」には「ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写」が含まれ、この「ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写」とは、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡが無細胞様式で、すなわち、好ましくは適宜調製された細胞抽出液を用いることでｉｎ ｖｉｔｒｏ合成される方法に関していう。転写産物の調製には、一般に転写ベクターと呼ばれ、本発明によれば「ベクター」という用語に含まれる、クローニングベクターを用いるのが好ましい。
【００８９】
「核酸配列から転写された核酸配列」とは、適当であれば後者の核酸配列の転写産物である完全ＲＮＡ分子の一部としてのＲＮＡを指す。
【００９０】
「核酸配列の翻訳効率および／または安定性を高めるために活性である核酸配列」とは、第一の核酸が第二の核酸との共通転写産物において、第二の核酸の翻訳効率および／または安定性を、その翻訳効率および／または安定性が第一の核酸を用いない場合の第二の核酸の翻訳効率および／または安定性に比べて高まるように修飾することができることを意味する。これに関して、「翻訳効率」とは、特定の時間内にＲＮＡ分子がもたらす翻訳産物の量に関し、「安定性」とは、ＲＮＡ分子の半減期に関していう。
【００９１】
３’非翻訳領域は、タンパク質コード領域の末端コドンの下流の、遺伝子の３’末端に位置し、転写されるがアミノ酸配列へ翻訳されない領域に関していう。
【００９２】
本発明によれば、第一のポリヌクレオチド領域の５’末端が第二のポリヌクレオチド領域の３’末端に最も近い第一のポリヌクレオチド領域の一部である場合に、第一のポリヌクレオチド領域は、第二のポリヌクレオチドの下流に位置するとみなされる。
【００９３】
３’非翻訳領域は一般に、翻訳産物の末端コドンから、通常転写工程後に付着されるポリ（Ａ）配列へと伸びる。哺乳類ｍＲＮＡの３’非翻訳領域は一般に、ＡＡＵＡＡＡヘキサヌクレオチド配列として知られる相同性領域を有する。この配列はおそらくポリ（Ａ）付着シグナルであり、ポリ（Ａ）付着部位の１０〜３０塩基上流に位置している場合が多い。
【００９４】
３’非翻訳領域は、エキソリボヌクレアーゼに対するバリアとして働く、またはＲＮＡの安定性を高めることが知られているタンパク質（例えば、ＲＮＡ結合タンパク質）と相互作用するステム−ループ構造が得られるように折り畳み可能な１以上の逆方向反復を含み得る。
【００９５】
本発明によれば５’および／または３’非翻訳領域は転写可能な、特にコード核酸と機能的に連結させることができ、これによりこれらの領域を、転写可能な核酸から転写されたＲＮＡの安定性および／または翻訳効率が高まるように核酸と結合させる。
【００９６】
免疫グロブリンｍＲＮＡの３’非翻訳領域は比較的短く（約３００ヌクレオチドより短い）が、他の遺伝子の３’非翻訳領域は比較的長い。例えば、ｔＰＡの３’非翻訳領域は約８００ヌクレオチドの長さであり、第ＶＩＩＩ因子の３’非翻訳領域は約１８００ヌクレオチドの長さであり、エリスロポエチンの３’非翻訳領域は約５６０ヌクレオチドの長さである。
【００９７】
本発明によれば、３’非翻訳領域またはそれに由来する核酸配列がＲＮＡの安定性および／または翻訳効率を高めるかどうかは、その３’非翻訳領域またはそれに由来する核酸配列を遺伝子の３’非翻訳領域に組み込み、その組み込みによりタンパク質の合成量が高まるかどうかを測定することによって判定することができる。
【００９８】
上記のことは本発明において核酸が２以上の３’非翻訳領域を含む場合にも適用され、この場合には、間に好ましくは「ヘッド・トゥ・テール関係」（すなわち、これらの３’非翻訳領域は同じ配向、好ましくは核酸において天然の配向を持つ）のリンカーを用いて、または用いずに順次結合されていることが好ましい。
【００９９】
本発明によれば「遺伝子」とは、１以上の細胞産物の産生および／または１以上の細胞間もしくは細胞内機能の達成を担う特定の核酸配列に関していう。より具体的には、この用語は、特定のタンパク質または機能的もしくは構造的ＲＮＡ分子をコードする核酸を含むＤＮＡ部分に関する。
【０１００】
「ポリアデニルカセット」または「ポリ（Ａ）配列」は、一般にＲＮＡ分子の３’末端に位置するアデニル残基の配列を指す。本発明は、コード鎖に相補的な鎖中の反復チミジル残基に基づくＤＮＡ鋳型を介したＲＮＡ転写中に付着されるこのような配列を提供するが、このような配列は通常そのＤＮＡにはコードされておらず、核内で転写後に鋳型依存性のＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡの空いている３’末端に付着される。本発明によれば、この種のポリ（Ａ）配列は少なくとも２０、好ましくは少なくとも４０、好ましくは少なくとも８０、好ましくは少なくとも１００で、好ましくは５００まで、好ましくは４００まで、好ましくは３００まで、好ましくは２００まで、特に１５０までの連続するＡヌクレオチド、特には約１２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列を意味するものと理解され、「Ａヌクレオチド」とはアデニル残基を指す。
【０１０１】
好ましい実施形態では、本発明の核酸分子はベクターである。「ベクター」とは、ここではその最も一般的な意味で用いられ、例えば核酸を原核生物および／または真核生物の宿主細胞へ導入可能とし、および適当であればゲノムへ導入可能とする核酸のいずれの中間ビヒクルも含む。このようなベクターは細胞内で複製および／または発現されることが好ましい。ベクターはプラスミド、ファージミドまたはウイルスゲノムを含む。「プラスミド」とは本明細書において一般に、染色体ＤＮＡとは独立に複製可能な染色体外遺伝物質の構築物、通常、環状ＤＮＡ二重らせんに関していう。
【０１０２】
本発明によれば、「宿主細胞」とは、外来核酸で形質転換またはトランスフェクション可能ないずれの細胞も指す。「宿主細胞」とは、本発明によれば、原核生物（例えば、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ））または真核細胞（例えば、酵母細胞および昆虫細胞）を含む。ヒト、マウス、ハムスター、ブタ、ヤギ、霊長類などの哺乳類細胞が特に好ましい。これらの細胞は多数の細胞種に由来し、一次細胞と細胞系統を含む。特定の例としては、ケラチノサイト、末梢血白血球、骨髄幹細胞および胚幹細胞が挙げられる。他の実施形態では、宿主細胞は抗原提示細胞、特に樹状細胞、単球またはマクロファージである。核酸は一コピーまたは数個ピーで宿主細胞に存在してもよく、一実施形態では宿主細胞内で発現される。
【０１０３】
本発明によれば、核酸によりコードされるペプチドまたはタンパク質は、細胞質、核、膜、オルガネラに存在するペプチドまたはタンパク質であってもよいし、あるいは分泌されるものでもよい。これらのものとして構造タンパク質、調節タンパク質、ホルモン、神経伝達物質、成長調節因子、分化因子、遺伝子発現調節因子、ＤＮＡ会合タンパク質、酵素、血清タンパク質、受容体、薬剤、免疫調節剤、癌遺伝子、毒素、腫瘍抗原または抗原が挙げられる。これらのペプチドまたはタンパク質は天然配列を持っていてもよいし、あるいはそれらの生物活性を増強、阻害、調節または排除するために変異された配列を持っていてもよい。
【０１０４】
「ペプチド」とは、ペプチド結合を介して互いに連結された２以上、好ましくは３以上、好ましくは４以上、好ましくは６以上、好ましくは８以上、好ましくは１０以上、好ましくは１３以上、好ましくは１６以上、好ましくは２０以上で、好ましくは５０まで、好ましくは１００までまたは好ましくは１５０までの連続するアミノ酸を含む物質を指す。「タンパク質」とは、大きなペプチド、好ましくは少なくとも１５１のアミノ酸を有するペプチドを指すが、本明細書では「ペプチド」と「タンパク質」は通常同義で用いる。本発明において「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸成分だけでなく、糖およびリン酸構造などの非アミノ酸成分も含む物質を含み、またエステル、チオエーテルまたはジスルフィド結合などの結合を含む物質も含む。
【０１０５】
本発明は、患者に投与する核酸、特にＲＮＡを提供する。一実施形態では、核酸はｅｘ ｖｉｖｏ法、すなわち、患者から細胞を取り出し、それらの細胞を遺伝的に修飾し、修飾された細胞を患者に再び導入することにより投与される。トランスフェクションおよび形質導入法は当業者に公知である。本発明はまた、ｉｎ ｖｉｖｏ投与される核酸も提供する。
【０１０６】
本発明によれば、「トランスフェクション」とは、１以上の核酸を生物体または宿主細胞に導入することを指す。本発明に従いｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで核酸を細胞に導入するためには、様々な方法が使用できる。このような方法としては、核酸 ＣａＰＯ４沈降物のトランスフェクション、ＤＥＡＥと会合した核酸のトランスフェクション、目的の核酸を運ぶウイルスによるトランスフェクションまたは感染、およびリポソームに媒介されるトランスフェクションなどが挙げられる。特定の実施形態では、核酸を特定の細胞に向けることが好ましい。このような実施形態では、核酸を細胞へ投与するために用いる担体（例えば、レトロウイルスまたはリポソーム）にターゲティング分子を結合させてもよい。例えば、標的細胞上の表面膜タンパク質に特異的な抗体または標的細胞上の受容体に対するリガンドなどの分子を、核酸担体に組み込むか結合させればよい。リポソームによる核酸の投与が望ましければ、ターゲティングおよび／または吸収を可能とするためにエンドサイトーシスに関連する表面膜タンパク質に結合するタンパク質をリポソーム製剤に組み込めばよい。このようなタンパク質としては、特定の細胞種に特異的なキャプシドタンパク質またはその断片、インターナライズされるタンパク質に対する抗体、および細胞内部位をターゲティングするタンパク質などが挙げられる。
【０１０７】
「レポーター」とは、レポーター遺伝子によりコードされ、レポーターアッセイで測定される分子、一般にペプチドまたはタンパク質に関していう。慣例の系としては、通常、酵素レポーターを用い、そのレポーターの活性を測定する。
【０１０８】
「多重クローニング部位」とは、そのいずれか１つが例えばベクターの切断および核酸の挿入に使用できる制限酵素部位を含む核酸領域に関していう。
【０１０９】
本発明によれば、ヌクレオチドまたはアミノ酸などの２つのエレメントは、互いに直接隣接していれば連続のものである。例えば、ｘ個の連続するヌクレオチドＮの配列は、配列（Ｎ）ｘと表す。
【０１１０】
「制限エンドヌクレアーゼ」または「制限酵素」とは、ＤＮＡ分子の両鎖のホスホジエステル結合を特定の塩基配列内で切断する酵素種を指す。これらの酵素は、二本鎖ＤＮＡ分子上の、認識配列と呼ばれる特定の結合部位を認識する。ＤＮＡ中のホスホジエステル結合がこのような酵素により切断される部位は切断部位と呼ばれる。ＩＩＳ型酵素の場合、この切断部位はＤＮＡ結合部位から所定の距離離れたところに存在する。本発明によれば、「制限エンドヌクレアーゼ」には、例えば、酵素ＳａｐＩ、ＥｃｉＩ、ＢｐｉＩ、ＡａｒＩ、ＡｌｏＩ、ＢａｅＩ、ＢｂｖＣＩ、ＰｐｉＩおよびＰｓｒＩ、ＢｓｒＤ１、ＢｔｓＩ、ＥａｒＩ、ＢｍｒＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｍＢＩ、ＦａｕＩ、ＢｂｓＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｅＲＩ、ＥｃｉＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓｇＩ、ＭｍｅＩ、ＣｓｐＣＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＭＩ、Ｍｖａ１２６９Ｉ、ＰｃｔＩ、Ｂｓｅ３ＤＩ、ＢｓｅＭＩ、Ｂｓｔ６Ｉ、Ｅａｍ１１０４Ｉ、Ｋｓｐ６３２Ｉ、ＢｆｉＩ、Ｂｓｏ３１Ｉ、ＢｓｐＴＮＩ、Ｅｃｏ３１Ｉ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＢｆｕＩ、Ａｃｃ３６Ｉ、ＡａｒＩ、Ｅｃｏ５７Ｉ、Ｅｃｏ５７ＭＩ、ＧｓｕＩ、ＡｌｏＩ、Ｈｉｎ４Ｉ、ＰｐｉＩ、およびＰｓｒＩが含まれる。
【０１１１】
「半減期」とは、分子の活性、量または数の半分が消失するのにかかる時間を指す。
【０１１２】
以下、本発明を図面および実施例により詳しく説明するが、これらは単に例示であって、限定を示すものではない。これらの説明および実施例に基づいて当業者ならばさらなる実施例を利用することができるが、それらも同様に本発明の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】図１：さらなるクローニングのため本発明に従って用いられる基本ベクター これらのベクターはＲＮＡポリメラーゼ５’プロモーターの制御下でＲＮＡ転写が可能であり、ポリアデニルカセットを含む。
【０１１４】
【図２】図２：ＩＩ型制限酵素（例えば、ＳｐｅＩ）とＩＩＳ型制限酵素（例えば、ＳａｐＩ）とによるベクター線状化の比較 その認識配列がポリ（Ａ）配列の３’にあり、切断部位が２４〜２６ ｂｐ上流、従ってポリ（Ａ）配列内にあるＩＩＳ型制限切断部位を導入することにより、プラスミドをポリ（Ａ）配列内で線状化することができる。
【０１１５】
【図３】図３：ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のための鋳型として本発明に従って作製されるベクター 発現のレベルおよび持続時間に対する本発明のＲＮＡ修飾の効果を研究するため、いくつかのベクターを作製し、その後、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のための鋳型として用いた。ａ．マスクされたポリ（Ａ）配列とマスクされていないポリ（Ａ）配列を有するベクター；ｂ．長さの異なるポリ（Ａ）配列を有するベクター；ｃ．ヒトβ−グロビンの３’非翻訳領域を有するベクター；ｄ．ＳＩＩＮＦＥＫＬおよびｐｐ６５ベクター；Ｃａｐ−５’−キャッピング；ｅＧＦＰ−ＧＦＰレポーター遺伝子；β−グロビンの３’βｇ−３’非翻訳領域。Ａ（ｘ）−ｘは、ポリ（Ａ）配列中のＡヌクレオチドの数を表す。
【０１１６】
【図４】図４：示された表面マスクによる未成熟樹状細胞と成熟樹状細胞の成熟状態の決定 本発明のＲＮＡ修飾の効果をヒト樹状細胞（ＤＣ）にて、ＤＣ成熟プロセスを誘導する免疫刺激を用いて調べた。これらのＤＣを、特異的ＤＣ成熟マーカーを認識する抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８３抗体、抗ＣＤ８６抗体および抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体で染色し、フローサイトメトリーで分析した。
【０１１７】
【図５】図５：翻訳効率および転写産物の安定性に対する遊離型およびマスク型のポリ（Ａ）配列の影響 ａ．ＦＡＣＳ−Ｋａｌｉｂｕｒにて平均蛍光強度［ＭＦＩ］を測定することによる、Ｋ５６２細胞および樹状細胞におけるｅＧＦＰ ＲＮＡの翻訳効率に対する遊離型およびマスク型のポリ（Ａ）配列の影響。ｂ．４８時間後の未成熟樹状細胞におけるｅＧＦＰ ＲＮＡの転写産物安定性に対する遊離型およびマスク型のポリ（Ａ）配列の影響。腫瘍細胞系統および未成熟ＤＣの双方で、オープンエンド型ポリ（Ａ）配列を有するＲＮＡはマスクエンド型ポリ（Ａ）配列を有するＲＮＡよりも有効かつ長期間翻訳される。ＤＣにおける非マスクエンド型ポリ（Ａ）配列の翻訳効率は、同じ長さのポリ（Ａ）配列の１．５倍高い。さらにオープンエンド型ポリ（Ａ）配列は、より高いＲＮＡ安定性をもたらす。
【０１１８】
【図６】図６：翻訳効率および転写産物の安定性に対するポリ（Ａ）配列長の影響 ａ．Ｋ５６２細胞および樹状細胞におけるｅＧＦＰ ＲＮＡの翻訳効率に対するポリ（Ａ）配列長の影響。ｂ．Ｋ５６２細胞および樹状細胞におけるｄ２ｅＧＦＰ ＲＮＡの翻訳効率に対するポリ（Ａ）配列長の影響。ｃ．エレクトロポレーション４８時間後のＫ５６２細胞におけるｅＧＦＰ ＲＮＡの転写産物安定性に対するポリ（Ａ）配列長の影響。ポリ（Ａ）配列を１２０Ａヌクレオチドまで延長すると、転写産物の安定性および翻訳が高まる。これを超える延長に有効な効果は見られない。ポリ（Ａ）配列を５１〜１２０Ａヌクレオチド延長すると、翻訳効率が１．５〜２倍高まる。この効果はＲＮＡの安定性にも反映される。
【０１１９】
【図７】図７：未成熟および成熟ＤＣにおける翻訳効率に対するヒトβ−グロビンの３’非翻訳領域（ＢｇＵＴＲ）の影響 ヒトβ−グロビンの３’非翻訳領域を導入すると、ＲＮＡ転写産物の発現が増強する。ヒトβ−グロビンの３’非翻訳領域が二重にあると、２４時間後の発現レベルが高まり、このレベルは個々の２つのヒトβ−グロビンの３’非翻訳領域を合わせた効果を著しく超える。
【０１２０】
【図８】図８：未成熟および成熟ＤＣにおける翻訳効率に対する本発明の修飾を組み合わせた効果 未成熟および成熟ＤＣにおけるｅＧＦＰの翻訳効率は、本発明に記載のＲＮＡ転写産物修飾を組み合わせることで、５倍を上回る増強が可能である。
【０１２１】
【図９】図９：ＥＬ４細胞上のＭＨＣ分子によるペプチド提示に対する本発明の修飾を組み合わせた効果 本発明に従って修飾されたＲＮＡ構築物を用いると、高い翻訳効率のために細胞表面上でのペプチド−ＭＨＣ複合体の提示が高まる。記載されているＩＶＴベクターでは、ｅＧＦＰをＯＶＡ２５７−２６４エピトープ（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）に置換し、ＥＬ４細胞（ネズミ、Ｔ細胞リンパ腫）をトランスフェクションの標的細胞として用いた。
【０１２２】
【図１０】図１０：本発明に従って安定化されたＩＶＴ ＲＮＡ構築物を用いることによる、抗原特異的ペプチド／ＭＨＣ複合体の増加 細胞にＳｅｃ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ−Ａ６７−ＡＣＵＡＧ ＲＮＡまたはＳｅｃ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ−２ＢｇＵＴＲ−Ａ１２０ ＲＮＡ（ＥＬ４細胞：１０ｐｍｏｌ、５０ｐｍｏｌ；Ｃ５７Ｂ１／Ｊ６未成熟ＢＭＤＣ１５０ｐｍｏｌ３反復）でエレクトロポレーションを行った。バッファーだけを用いるエレクトロポレーションを対照として用いた。細胞をＳＩＩＮＦＥＫＬ／Ｋｂ複合体に対する２５Ｄ１．１６抗体で染色した。ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド濃度を生細胞の平均蛍光値から、検量曲線としてペプチド滴定を用いて算出した。ＢＭＤＣデータは３回の実験の平均値±ＳＥＭとして示す。
【０１２３】
【図１１】図１１：ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴ細胞刺激に対する、本発明に従って安定化されたＩＶＴ ＲＮＡ構築物の効果 （Ａ）安定化されたＩＶＴ ＲＮＡ構築物の使用によるｉｎ ｖｉｖｏＴ細胞増殖の向上。１×１０５個のＴＣＲ−トランスジェニックＣＤ８＋ ＯＴ−Ｉ細胞をＣ５７Ｂ１／Ｊ６マウスに養子免疫伝達した。Ｃ５７Ｂ１／Ｊ６マウスのＢＭＤＣを５０ｐｍｏｌのＲＮＡ（Ｓｅｃ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ−Ａ６７−ＡＣＵＡＧ、Ｓｅｃ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ−２ＢｇＵＴＲ−Ａ１２０または対照ＲＮＡ）でトランスフェクトし、ポリ（Ｉ：Ｃ）（５０μｇ／ｍｌ）を用いて１６時間成熟させ、Ｔ細胞移入の１日前に腹腔内注射した（ｎ＝３）。４日目に末梢血を採取し、ＳＩＩＮＦＥＫＬ四量体陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞を染色した。ドットブロットはＣＤ８＋Ｔ細胞を表し、示されている数値は四量体陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを表す。 （Ｂ）安定化されたＩＶＴ ＲＮＡ構築物を含むヒトＴ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖の向上。ＨＣＭＶ血清反応陽性健常ドナーからのＣＤ８＋およびＣＤ４＋リンパ球をＳｅｃ−ｐｐ６５−Ａ６７−ＡＣＵＡＧ ＲＮＡ、Ｓｅｃ−ｐｐ６５−２ＢＧＵＴＲ−Ａ１２０ ＲＮＡ、または対照ＲＮＡ（データは示されていない）でトランスフェクトされたか、あるいは陽性対照としてｐｐ６５ペプチドプール（１．７５μｇ／ｍｌ）で刺激した自己ＤＣと同時培養した。７日間増殖させた後、各エフェクター細胞集団（４×１０４／ウェル）を、ｐｐ６５ペプチドプールか無関連のペプチドプール（１．７５μｇ／ｍｌ）のいずれかを付加した自己ＤＣ（３×１０４／ウェル）を用い、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔにてアッセイした。グラフは３回測定したスポットの平均値±ＳＥＭを表す。
【実施例１】
【０１２４】
実施例１：ベクターの作製とＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写
発現のレベルおよび持続時間に対する本発明のＲＮＡ修飾の効果を検討するため、いくつかのＩＶＴベクターを作製した後、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のための鋳型として用いた（図３）。
【０１２５】
半減期（ＨＬ）の異なる２つの分子ｅＧＦＰとｄ２ｅＧＦＰのレポーター遺伝子をベクターに挿入し、これにより本発明のＲＮＡ修飾の影響を分析可能とした。蛍光は減少し、平均ＨＬはｅＧＦＰでは１７．３時間、ｄ２ｅＧＦＰでは２時間であった。これらの構築物をそれぞれｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ｅＧＦＰ ＲＮＡおよびｄ２ｅＧＦＰ ＲＮＡの作製に用いた。
【実施例２】
【０１２６】
実施例２：本発明に従って修飾されたｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡによる細胞のトランスフェクションおよびＲＮＡ翻訳と安定性に対する効果
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ｅＧＦＰ ＲＮＡおよびｄ２ｅＧＦＰ ＲＮＡを用い、エレクトロポレーションによりＫ５６２細胞（ヒト白血病）をトランスフェクトした。トランスフェクション効率はＫ５６２細胞で９０％を超えた。
【０１２７】
その後、免疫系の最も重要なモジュレーターであるヒト樹状細胞（ＤＣ）において、記載のＲＮＡ修飾の作用をアッセイした。このアプローチは、ＲＮＡでトランスフェクトされたＤＣが予防接種として意図され得ることから、免疫関連のものである。未成熟ＤＣを皮膚および末梢器官に付加する。ここで、これらは、十分研究されている表面マーカーにより特徴付けられ、また、高いエンドサイトーシス活性により機能的に識別される未成熟状態にある。例えば病原体の感染などの免疫刺激はＤＣの成熟プロセスを誘導する。それと同時に、この刺激は局部リンパ節へのＤＣの移動を開始させるが、ここでＤＣはＴ細胞およびＢ細胞免疫応答の最も有効なインデューサーである。また、これらのＤＣの成熟状態は表面マーカー発現および詳細に研究されているサイトカインの発現によっても、また、ＤＣ形態の特徴によっても特徴付けられる。血液単球から未成熟ヒトＤＣを分化させるための培養系が確立されている。これらは種々の刺激により成熟が起こり得る。
【０１２８】
一次樹状細胞のトランスフェクション効率は７０〜８０％であった。これらのＤＣを、特異的ＤＣ成熟マーカーを認識する抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８３抗体、抗ＣＤ８６抗体および抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体で染色し、フローサイトメトリーで分析した（図４）。
【０１２９】
発現のレベルおよび持続時間を、ＦＡＣＳ−Ｋａｌｉｂｕｒを用い、ｅＧＦＰの蛍光強度を測定することで測定した。細胞のＲＮＡ量は、定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて測定した。
【０１３０】
ａ．ＲＮＡの翻訳および安定性に対するオープンエンド型ポリ（Ａ）配列の効果
腫瘍細胞系統Ｋ５６２と未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）は双方とも、オープンエンド型ポリ（Ａ）配列を有するＲＮＡを、マスクエンド型ポリ（Ａ）配列を有するＲＮＡよりも効率的にかつ長期間翻訳することが示された（図５ａ）。未成熟ＤＣにおける非マスクエンド型ポリ（Ａ）配列の翻訳効率は、同じ長さのポリ（Ａ）配列では１．５倍高くなる。さらに、この修飾から、より高いＲＮＡ安定性が得られる（図５ｂ）。非マスクポリ（Ａ）配列を有するＲＮＡでトランスフェクトされた未成熟ＤＣでは、エレクトロポレーション４８時間後に４〜５倍量のＲＮＡを検出することができる。
【０１３１】
ｂ．ＲＮＡの翻訳および安定性に対するポリ（Ａ）配列長の効果
１６ｂｐ、４２ｂｐ、５１ｂｐ、６７ｂｐ、１２０ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐおよび６００ｂｐの長さのポリ（Ａ）配列を有するＲＮＡを分析したところ、１２０Ａヌクレオチドまでのポリ（Ａ）配列の延長が転写産物の安定性と翻訳を高めること、また、それを超える延長には有効な効果がないことが明らかになった。この効果はＫ５６２細胞と未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）の双方に見られる（図６ａおよび６ｂ）。ポリ（Ａ）配列を５１〜１２０Ａヌクレオチド延長すると、翻訳効率が１．５〜２倍高まる。この効果はＲＮＡの安定性にも反映される（図６ｃ）。
【０１３２】
ｃ．ＲＮＡの翻訳および安定性に対する３’非翻訳領域の存在の効果
Ｋ５６２細胞および未成熟ＤＣを用いた経時的推移により、ヒトβ−グロビンの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の導入がＲＮＡ転写産物の発現の増強をもたらすことが確認された。さらに、ヒトβ−グロビンの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）が二重にあると、２４時間後に高い発現レベルが得られ、個々の２つのＵＴＲを合わせた効果を大きく超えることが実証された（図７）。
【０１３３】
ｄ．ＲＮＡの翻訳および安定性に対する上記修飾の組合せの効果
本発明によれば、ＲＮＡ転写産物における上記修飾の組合せは、未成熟ＤＣまた成熟ＤＣでも、ｅＧＦＰの翻訳効率を５倍を超えて高めることが示された（図８）。
【実施例３】
【０１３４】
実施例３：安定性および翻訳効率の高められたｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡを介して発現されたペプチドの、ＭＨＣ分子による提示
本発明によれば、本発明に従って修飾されたＲＮＡ構築物を用いると、細胞表面でのペプチド−ＭＨＣの提示が高まることが示された。この目的で、記載のベクター中のｅＧＦＰをコードする核酸配列を、ＯＶＡ２５７−２６４エピトープ（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）をコードする核酸配列に置換し、これらの構築物を互いに比較した。トランスフェクションに用いた標的細胞はＥＬ４細胞（マウス、Ｔ細胞リンパ腫）であった。
【０１３５】
ＭＨＣ分子により提示されたＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドを定量するため、これらの細胞を、エレクトロポレーション後種々の時点で、抗Ｈ２−Ｋｂ ＯＶＡ２５７−２６４抗体で染色し、二次抗体の蛍光強度を、ＦＡＣＳ−Ｋａｌｉｂｕｒを用いて測定した（図９）。
【０１３６】
さらに、このＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドを、あらゆる最適化を反映したベクター（ｐＳＴ１−Ｓｅｃ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ−２ＢｇＵＴＲ−Ａ１２０−Ｓａｐ１）に、また、標準的な特徴を有するベクター（ｐＳＴ１−Ｓｅｃ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ−Ａ６７−Ｓｐｅ１）にクローニングした。両ベクターに由来するＩＶＴ ＲＮＡで、ＥＬ４細胞およびＢＭＤＣに対してエレクトロポレーションを行った。ＯＶＡ−ペプチド／Ｋｂ複合体は細胞表面実質的に多数見られ、本発明に従って修飾されたＲＮＡ、Ｓｅｃ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ−２−ＢｇＵＴＲ−Ａ１２０のエレクトロポレーション後、長期間維持された（図１０）。
【実施例４】
【０１３７】
実施例４：抗原特異的Ｔ細胞の発現に対する、提示されるペプチドをコードするｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡによる細胞のトランスフェクションの効果
刺激能に対する効果を評価するため、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドのＭＨＣクラスＩ提示を検出するためのＣ５７ＢＬ／Ｊ６（Ｂ６）バックグラウンドに集中的に用いられてきたＯＴ−Ｉ−ＴＣＲを用いた。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に関してトランスジェニックであり、ニワトリＯＶＡ由来のＫｂ−特異的ペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＯＶＡ２５７−２６４）を認識するＯＴ−Ｉ ＣＤ８＋Ｔ細胞はＨ． Ｓｃｈｉｌｄ （Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｉｎｚ， Ｇｅｒｍａｎｙ）から厚意により提供されたものである。
【０１３８】
０日目、ＯＴ−Ｉ−ＣＤ８＋Ｔ細胞を用いて、動物に養子免疫伝達を行った。この目的で、ＴＣＲ ｔｇ ＯＴ−Ｉマウスから脾細胞を調製し、Ｃ５７ＢＬ／Ｊ６レシピエントマウスの尾の静脈に導入した。細胞数は１×１０５ ＴＣＲ ｔｇ ＣＤ８＋Ｔ細胞に調整した。翌日、５０ｐｍｏｌのＳＩＩＮＦＥＫＬコードＲＮＡ構築物変異体でエレクトロポレーションを行い、ポリ（Ｉ：Ｃ）で１６時間成熟させたＣ５７ＢＬ／Ｊ６マウスの１×１０６ ＢＭＤＣをマウスに腹腔内投与した。４日目、四量体法を用い、末梢血においてＯＴ−Ｉ−ＣＤ８＋Ｔ細胞を測定した。この目的で、眼窩後方の血液サンプルを採取し、抗ＣＤ８（Ｃａｌｔａｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， ＵＳＡ）およびＳＩＩＮＦＥＫＬ四量体（Ｈ−２Ｋｂ／ＳＩＩＮＦＥＫＬ ２５７−２６４； Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ， Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ， ＵＳＡ）で染色した。
【０１３９】
抗原特異的ＴＣＲ−トランスジェニックＣＤ８＋Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ増殖は、抗原供給源としてＳｅｃ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ−２ＢｇＵＴＲ−Ａ１２０ ＲＮＡを用いた場合には、Ｓｅｃ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ−Ａ６７−ＡＣＵＡＧ ＲＮＡの場合と比べて実質的に向上することが分かった（図１１Ａ）。
【０１４０】
抗原供給源として安定されたＩＶＴ ＲＮＡ構築物が、ヒトＴ細胞の抗原特異的刺激も向上させるかどうか評価するため、ポリエピトープ性のＴ細胞反応の自己刺激をバリデートするために用いられることが多いヒトサイトメガロウイルスの免疫優性抗原であるＨＣＭＶ−ｐｐ６５を用いた。抗体をコーティングしたマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ， Ｂｅｒｇｉｓｃｈ−Ｇｌａｄｂａｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた正磁場セルソーティングにより、ＨＣＭＶ血清反応陽性健常ドナーから精製されたＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、ｐｐ６５をコードする対応するＩＶＴ ＲＮＡ変異体でマイクロポレーションを行った自己ＤＣ２×１０５個とともに同時培養した。Ｔ細胞の増殖を、全ｐｐ６５タンパク質配列にわたる重複ペプチドのプールで、または対照タンパク質で刺激した自己ＤＣを用いたＩＦＮ−γ−ＥＬＩＳｐｏｔで７日目に測定したところ、Ｓｅｃ−ｐｐ６５−２ＢｇＵＴＲ−Ａ１２０が優れていることが実証され、ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖に対する効果が最も顕著であった（図１１Ｂ）。
【０１４１】
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
５’→３’転写方向に、
（ａ）プロモーター；
（ｂ）転写可能な核酸配列または転写可能な核酸配列を導入するための核酸配列；
（ｃ−１）遺伝子の３’非翻訳領域に相当する、またはそれに由来する第一の核酸配列；および
（ｃ−２）遺伝子の３’非翻訳領域に相当する、またはそれに由来する第二の核酸配列
を含む、核酸分子。
【請求項２】
（ｃ−３）遺伝子の３’非翻訳領域に相当する、またはそれに由来する少なくとも１つのさらなる核酸配列をさらに含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
プロモーター（ａ）の制御下の核酸配列（ｂ）、（ｃ−１）、（ｃ−２）および適当であれば（ｃ−３）が転写されて、核酸配列（ｃ−１）および／または（ｃ−２）および／または適当であれば（ｃ−３）から転写された核酸配列に、転写可能な核酸配列（ｂ）から転写された核酸配列の翻訳効率および／または安定性を高めるような活性がある共通転写産物を生じ得る、請求項１または２に記載の核酸分子。
【請求項４】
核酸配列（ｃ−１）、（ｃ−２）および適当であれば（ｃ−３）が同一であっても異なっていてもよい、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項５】
（ｄ）プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする核酸配列をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項６】
プロモーター（ａ）の制御下の核酸配列（ｂ）、（ｃ−１）、（ｃ−２）、適当であれば（ｃ−３）および（ｄ）が転写されて、核酸配列（ｃ−１）および／または（ｃ−２）および／または適当であれば（ｃ−３）および／または（ｄ）から転写された核酸配列に、転写可能な核酸配列（ｂ）から転写された核酸配列の翻訳効率および／または安定性を高めるような活性がある共通転写産物を生じ得る、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項７】
核酸配列（ｄ）が、プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に少なくとも４０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする、請求項５または６に記載の核酸分子。
【請求項８】
核酸配列（ｄ）が、プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に少なくとも８０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする、請求項７に記載の核酸分子。
【請求項９】
核酸配列（ｄ）が、プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に少なくとも１００の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする、請求項８に記載の核酸分子。
【請求項１０】
核酸配列（ｄ）が、プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に約１２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする、請求項９に記載の核酸分子。
【請求項１１】
切断が５’→３’転写方向に、プロモーター（ａ）、核酸配列（ｂ）、核酸配列（ｃ−１）、（ｃ−２）および適当であれば（ｃ−３）、ならびに核酸配列（ｄ）の少なくとも一部（この核酸配列（ｄ）の少なくとも一部は、プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードし、その転写産物において３’末端ヌクレオチドは少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドの該ヌクレオチド配列のＡヌクレオチドである）を含む核酸分子を生じるように、核酸配列（ｄ）内で、好ましくは酵素的にまたは別の生化学的方法で切断され得ることを特徴とする、請求項５〜１０のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１２】
切断後、前記核酸分子が、少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列の鋳型として働く鎖の末端に、その転写産物において少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列の鋳型として働くヌクレオチド配列の一部であるＴヌクレオチドを有する、請求項１１に記載の核酸分子。
【請求項１３】
前記核酸配列（ｄ）の少なくとも一部が、プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に少なくとも４０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする、請求項１１または１２に記載の核酸分子。
【請求項１４】
前記核酸配列（ｄ）の少なくとも一部が、プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に少なくとも８０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする、請求項１３に記載の核酸分子。
【請求項１５】
前記核酸配列（ｄ）の少なくとも一部が、プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に少なくとも１００の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする、請求項１４に記載の核酸分子。
【請求項１６】
前記核酸配列（ｄ）の少なくとも一部が、プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に約１２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする、請求項１５に記載の核酸分子。
【請求項１７】
切断前には閉環分子であり、切断後には直鎖分子であることを特徴とする、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１８】
前記切断が制限切断部位の助けで行われる、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１９】
前記制限切断部位がＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの制限切断部位である、請求項１８に記載の核酸分子。
【請求項２０】
前記ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの認識配列が、核酸配列（ｄ）の３’末端の５〜２６塩基対下流に位置する、請求項１９に記載の核酸分子。
【請求項２１】
前記ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの認識配列が、核酸配列（ｄ）の３’末端の２４〜２６塩基対下流に位置する、請求項２０に記載の核酸分子。
【請求項２２】
核酸配列（ｃ−１）、（ｃ−２）および適当であれば（ｃ−３）が互いに独立にα２−グロビン、α１−グロビン、β−グロビンおよび成長ホルモン、好ましくは、ヒトβ−グロビンからなる群から選択される遺伝子に由来する、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項２３】
５’→３’転写方向に、
（ａ）プロモーター；
（ｂ）転写可能な核酸配列または転写可能な核酸配列を導入するための核酸配列；および
（ｃ）プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする核酸配列
を含む、核酸分子。
【請求項２４】
プロモーター（ａ）の制御下の核酸配列（ｂ）および（ｃ）が転写されて、核酸配列（ｃ）から転写された核酸配列に、転写可能な核酸配列（ｂ）から転写された核酸配列の翻訳効率および／または安定性を高めるような活性がある共通転写産物を生じ得る、請求項２３に記載の核酸分子。
【請求項２５】
核酸配列（ｃ）が、プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に少なくとも４０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする、請求項２３または２４に記載の核酸分子。
【請求項２６】
核酸配列（ｃ）が、プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に少なくとも８０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする、請求項２５に記載の核酸分子。
【請求項２７】
核酸配列（ｃ）が、プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に少なくとも１００の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする、請求項２６に記載の核酸分子。
【請求項２８】
核酸配列（ｃ）が、プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に約１２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする、請求項２７に記載の核酸分子。
【請求項２９】
切断が５’→３’転写方向に、プロモーター（ａ）、核酸配列（ｂ）、および核酸配列（ｃ）の少なくとも一部（この核酸配列（ｃ）の少なくとも一部は、プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードし、その転写産物において３’末端ヌクレオチドは少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドの該ヌクレオチド配列のＡヌクレオチドである）を含む核酸分子を生じるように、核酸配列（ｃ）内で、好ましくは酵素的にまたは別の生化学的方法で切断され得ることを特徴とする、請求項２３〜２８のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項３０】
切断後、前記核酸分子が、少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列の鋳型として働く鎖の末端に、その転写産物において少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列の鋳型として働くヌクレオチド配列の一部であるＴヌクレオチドを有する、請求項２９に記載の核酸分子。
【請求項３１】
前記核酸配列（ｃ）の少なくとも一部が、プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に少なくとも４０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする、請求項２９または３０に記載の核酸分子。
【請求項３２】
前記核酸配列（ｃ）の少なくとも一部が、プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に少なくとも８０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする、請求項３１に記載の核酸分子。
【請求項３３】
前記核酸配列（ｃ）の少なくとも一部が、プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に少なくとも１００の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする、請求項３２に記載の核酸分子。
【請求項３４】
前記核酸配列（ｃ）の少なくとも一部が、プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に約１２０連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする、請求項３３に記載の核酸分子。
【請求項３５】
切断前には閉環分子であり、切断後には直鎖分子であることを特徴とする、請求項２９〜３４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項３６】
切断が制限切断部位の助けで行われる、請求項２９〜３５のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項３７】
前記制限切断部位がＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの制限切断部位である、請求項３６に記載の核酸分子。
【請求項３８】
前記ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの認識配列が、核酸配列（ｃ）の３’末端の５〜２６塩基対下流に位置する、請求項３７に記載の核酸分子。
【請求項３９】
前記ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの認識配列が、核酸配列（ｃ）の３’末端の２４〜２６塩基対下流に位置する、請求項３８に記載の核酸分子。
【請求項４０】
前記の転写可能な核酸配列がペプチドまたはタンパク質をコードする核酸配列を含み、前記の転写可能な核酸配列を導入するための核酸配列が多重クローニング部位である、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項４１】
（ｉ）レポーター遺伝子；（ｉｉ）選択マーカー；および（ｉｉｉ）複製起点からなる群から選択される１以上のメンバーをさらに含む、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項４２】
前記核酸分子が閉環コンフォメーションである、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項４３】
特に線状化後に、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写に好適である、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項４４】
請求項１〜４３のいずれか一項に記載の核酸分子の線状化により得られる、核酸分子。
【請求項４５】
プロモーター（ａ）の制御下、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の核酸分子とともに転写される、好ましくはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写させることにより得られる、ＲＮＡ。
【請求項４６】
その安定性および／または翻訳効率を高めるよう選択されたＲＮＡ分子をｉｎ ｖｉｔｒｏで転写させる方法であって、
（ｉ）遺伝子の３’非翻訳領域に相当する、またはそれに由来する第一の核酸配列（ｂ−１）を、転写されて該ＲＮＡ分子を生じ得る核酸配列（ａ）の３’末端に結合させること、
（ｉｉ）遺伝子の３’非翻訳領域に相当する、またはそれに由来する第二の核酸配列（ｂ−２）を、該第一の核酸配列（ｂ−１）の３’末端に結合させること、および
（ｉｉｉ）得られた核酸をｉｎ ｖｉｔｒｏで転写させること
を含む、方法。
【請求項４７】
その発現を増強するよう選択されたｍＲＮＡ分子を転写させる方法であって、
（ｉ）遺伝子の３’非翻訳領域に相当する、またはそれに由来する第一の核酸配列（ｂ−１）を、転写されて該ＲＮＡ分子を生じ得る核酸配列（ａ）の３’末端に結合させること、
（ｉｉ）遺伝子の３’非翻訳領域に相当する、またはそれに由来する第二の核酸配列（ｂ−２）を、該第一の核酸配列（ｂ−１）の３’末端に結合させること、および
（ｉｉｉ）得られた核酸を転写させることにより得ることができるｍＲＮＡを翻訳すること
を含む、方法。
【請求項４８】
転写がｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
遺伝子の３’非翻訳領域に相当する、またはそれに由来する少なくとも１つのさらなる核酸配列（ｂ−３）を第二の核酸配列（ｂ−２）の３’末端に結合させることをさらに含む、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
核酸配列（ａ）、（ｂ−１）、（ｂ−２）および適当であれば（ｂ−３）が転写されて、核酸配列（ｂ−１）および／または（ｂ−２）および／または適当であれば（ｂ−３）から転写された核酸配列に、核酸配列（ａ）から転写された核酸配列の翻訳効率および／または安定性を高めるような活性がある共通転写産物を生じ得る、請求項４６〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
転写された際に、少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする核酸配列（ｃ）を核酸配列（ｂ−２）の、または適当であれば核酸配列（ｂ−３）の３’末端に結合させることをさらに含む、請求項４６〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
核酸配列（ａ）、（ｂ−１）、（ｂ−２）および適当であれば（ｂ−３）ならびに（ｃ）が転写されて、核酸配列（ｂ−１）および／または（ｂ−２）および／または適当であれば（ｂ−３）および／または（ｃ）から転写された核酸配列に、核酸配列（ａ）から転写された核酸配列の翻訳効率および／または安定性を高めるような活性がある共通転写産物を生じ得る、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
得られた核酸の転写の前に、このようにして得られた核酸の転写が、核酸配列（ａ）、（ｂ−１）、（ｂ−２）および適当であれば（ｂ−３）ならびに少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドの３’末端ヌクレオチド配列から転写された核酸配列を有する転写産物（該転写産物の３’末端ヌクレオチドは少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列のＡヌクレオチドである）を生じるように核酸配列（ｃ）内で切断することをさらに含むことを特徴とする、請求項５１または５２に記載の方法。
【請求項５４】
核酸配列（ｂ−１）、（ｂ−２）および適当であれば（ｂ−３）が互いに独立にα２−グロビン、α１−グロビン、β−グロビンおよび成長ホルモン、好ましくはヒトβ−グロビンからなる群から選択される遺伝子に由来する、請求項４６〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
その安定性および／または翻訳効率を高めるよう選択されたＲＮＡ分子をｉｎ ｖｉｔｒｏで転写させる方法であって、
（ｉ）転写された際に、少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする核酸配列（ｂ）を、転写されて前記ＲＮＡ分子を生じ得る核酸配列（ａ）の３’末端に結合させること、および
（ｉｉ）得られた核酸をｉｎ ｖｉｔｒｏで転写させること
を含む、方法。
【請求項５６】
その発現を増強するよう選択されたｍＲＮＡ分子を翻訳する方法であって、
（ｉ）転写された際に、少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする核酸配列（ｂ）を、転写されて前記ｍＲＮＡ分子を生じ得る核酸配列（ａ）の３’末端に結合させること、および
（ｉｉ）得られた核酸を転写させることにより得ることができるｍＲＮＡを翻訳すること
を含む、方法。
【請求項５７】
転写がｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
核酸配列（ａ）および（ｂ）が転写されて、核酸配列（ｂ）から転写された核酸配列に、核酸配列（ａ）から転写された核酸配列の翻訳効率および／または安定性を高めるような活性がある共通転写産物を生じ得る、請求項５５〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
得られた核酸の転写の前に、このようにして得られた核酸の転写が、核酸配列（ａ）、および少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドの３’末端ヌクレオチド配列から転写された核酸配列を有する転写産物（該転写産物の３’末端ヌクレオチドは少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列のＡヌクレオチドである）を生じるように核酸配列（ｂ）内で切断することをさらに含むことを特徴とする、請求項５５〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
切断が制限切断部位の助けで行われる、請求項５３または５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記制限切断部位がＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの制限切断部位である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの認識配列が、転写された際に、少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする核酸配列の３’末端の５〜２６塩基対下流に位置する、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの認識配列が、転写された際に、少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする核酸配列の３’末端の２４〜２６塩基対下流に位置する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
請求項４６、４９〜５５および５８〜６３のいずれか一項に記載の選択されたＲＮＡ分子をｉｎ ｖｉｔｒｏで転写させる方法により得ることができるＲＮＡ。
【請求項６５】
宿主細胞をトランスフェクトするための請求項４５または６４に記載のＲＮＡの使用。
【請求項６６】
前記宿主細胞が抗原提示細胞、特に、樹状細胞、単球またはマクロファージである、請求項６５に記載の使用。
【請求項１】
５’→３’転写方向に、
（ａ）プロモーター；
（ｂ）転写可能な核酸配列または転写可能な核酸配列を導入するための核酸配列；
（ｃ−１）遺伝子の３’非翻訳領域に相当する、またはそれに由来する第一の核酸配列；および
（ｃ−２）遺伝子の３’非翻訳領域に相当する、またはそれに由来する第二の核酸配列
を含む、核酸分子。
【請求項２】
（ｃ−３）遺伝子の３’非翻訳領域に相当する、またはそれに由来する少なくとも１つのさらなる核酸配列をさらに含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
プロモーター（ａ）の制御下の核酸配列（ｂ）、（ｃ−１）、（ｃ−２）および適当であれば（ｃ−３）が転写されて、核酸配列（ｃ−１）および／または（ｃ−２）および／または適当であれば（ｃ−３）から転写された核酸配列に、転写可能な核酸配列（ｂ）から転写された核酸配列の翻訳効率および／または安定性を高めるような活性がある共通転写産物を生じ得る、請求項１または２に記載の核酸分子。
【請求項４】
核酸配列（ｃ−１）、（ｃ−２）および適当であれば（ｃ−３）が同一であっても異なっていてもよい、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項５】
（ｄ）プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする核酸配列をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項６】
プロモーター（ａ）の制御下の核酸配列（ｂ）、（ｃ−１）、（ｃ−２）、適当であれば（ｃ−３）および（ｄ）が転写されて、核酸配列（ｃ−１）および／または（ｃ−２）および／または適当であれば（ｃ−３）および／または（ｄ）から転写された核酸配列に、転写可能な核酸配列（ｂ）から転写された核酸配列の翻訳効率および／または安定性を高めるような活性がある共通転写産物を生じ得る、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項７】
核酸配列（ｄ）が、プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に少なくとも４０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする、請求項５または６に記載の核酸分子。
【請求項８】
核酸配列（ｄ）が、プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に少なくとも８０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする、請求項７に記載の核酸分子。
【請求項９】
核酸配列（ｄ）が、プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に少なくとも１００の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする、請求項８に記載の核酸分子。
【請求項１０】
核酸配列（ｄ）が、プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に約１２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする、請求項９に記載の核酸分子。
【請求項１１】
切断が５’→３’転写方向に、プロモーター（ａ）、核酸配列（ｂ）、核酸配列（ｃ−１）、（ｃ−２）および適当であれば（ｃ−３）、ならびに核酸配列（ｄ）の少なくとも一部（この核酸配列（ｄ）の少なくとも一部は、プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードし、その転写産物において３’末端ヌクレオチドは少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドの該ヌクレオチド配列のＡヌクレオチドである）を含む核酸分子を生じるように、核酸配列（ｄ）内で、好ましくは酵素的にまたは別の生化学的方法で切断され得ることを特徴とする、請求項５〜１０のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１２】
切断後、前記核酸分子が、少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列の鋳型として働く鎖の末端に、その転写産物において少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列の鋳型として働くヌクレオチド配列の一部であるＴヌクレオチドを有する、請求項１１に記載の核酸分子。
【請求項１３】
前記核酸配列（ｄ）の少なくとも一部が、プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に少なくとも４０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする、請求項１１または１２に記載の核酸分子。
【請求項１４】
前記核酸配列（ｄ）の少なくとも一部が、プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に少なくとも８０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする、請求項１３に記載の核酸分子。
【請求項１５】
前記核酸配列（ｄ）の少なくとも一部が、プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に少なくとも１００の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする、請求項１４に記載の核酸分子。
【請求項１６】
前記核酸配列（ｄ）の少なくとも一部が、プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に約１２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする、請求項１５に記載の核酸分子。
【請求項１７】
切断前には閉環分子であり、切断後には直鎖分子であることを特徴とする、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１８】
前記切断が制限切断部位の助けで行われる、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１９】
前記制限切断部位がＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの制限切断部位である、請求項１８に記載の核酸分子。
【請求項２０】
前記ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの認識配列が、核酸配列（ｄ）の３’末端の５〜２６塩基対下流に位置する、請求項１９に記載の核酸分子。
【請求項２１】
前記ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの認識配列が、核酸配列（ｄ）の３’末端の２４〜２６塩基対下流に位置する、請求項２０に記載の核酸分子。
【請求項２２】
核酸配列（ｃ−１）、（ｃ−２）および適当であれば（ｃ−３）が互いに独立にα２−グロビン、α１−グロビン、β−グロビンおよび成長ホルモン、好ましくは、ヒトβ−グロビンからなる群から選択される遺伝子に由来する、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項２３】
５’→３’転写方向に、
（ａ）プロモーター；
（ｂ）転写可能な核酸配列または転写可能な核酸配列を導入するための核酸配列；および
（ｃ）プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする核酸配列
を含む、核酸分子。
【請求項２４】
プロモーター（ａ）の制御下の核酸配列（ｂ）および（ｃ）が転写されて、核酸配列（ｃ）から転写された核酸配列に、転写可能な核酸配列（ｂ）から転写された核酸配列の翻訳効率および／または安定性を高めるような活性がある共通転写産物を生じ得る、請求項２３に記載の核酸分子。
【請求項２５】
核酸配列（ｃ）が、プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に少なくとも４０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする、請求項２３または２４に記載の核酸分子。
【請求項２６】
核酸配列（ｃ）が、プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に少なくとも８０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする、請求項２５に記載の核酸分子。
【請求項２７】
核酸配列（ｃ）が、プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に少なくとも１００の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする、請求項２６に記載の核酸分子。
【請求項２８】
核酸配列（ｃ）が、プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に約１２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする、請求項２７に記載の核酸分子。
【請求項２９】
切断が５’→３’転写方向に、プロモーター（ａ）、核酸配列（ｂ）、および核酸配列（ｃ）の少なくとも一部（この核酸配列（ｃ）の少なくとも一部は、プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードし、その転写産物において３’末端ヌクレオチドは少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドの該ヌクレオチド配列のＡヌクレオチドである）を含む核酸分子を生じるように、核酸配列（ｃ）内で、好ましくは酵素的にまたは別の生化学的方法で切断され得ることを特徴とする、請求項２３〜２８のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項３０】
切断後、前記核酸分子が、少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列の鋳型として働く鎖の末端に、その転写産物において少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列の鋳型として働くヌクレオチド配列の一部であるＴヌクレオチドを有する、請求項２９に記載の核酸分子。
【請求項３１】
前記核酸配列（ｃ）の少なくとも一部が、プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に少なくとも４０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする、請求項２９または３０に記載の核酸分子。
【請求項３２】
前記核酸配列（ｃ）の少なくとも一部が、プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に少なくとも８０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする、請求項３１に記載の核酸分子。
【請求項３３】
前記核酸配列（ｃ）の少なくとも一部が、プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に少なくとも１００の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする、請求項３２に記載の核酸分子。
【請求項３４】
前記核酸配列（ｃ）の少なくとも一部が、プロモーター（ａ）の制御下で転写された際に、その転写産物に約１２０連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする、請求項３３に記載の核酸分子。
【請求項３５】
切断前には閉環分子であり、切断後には直鎖分子であることを特徴とする、請求項２９〜３４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項３６】
切断が制限切断部位の助けで行われる、請求項２９〜３５のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項３７】
前記制限切断部位がＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの制限切断部位である、請求項３６に記載の核酸分子。
【請求項３８】
前記ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの認識配列が、核酸配列（ｃ）の３’末端の５〜２６塩基対下流に位置する、請求項３７に記載の核酸分子。
【請求項３９】
前記ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの認識配列が、核酸配列（ｃ）の３’末端の２４〜２６塩基対下流に位置する、請求項３８に記載の核酸分子。
【請求項４０】
前記の転写可能な核酸配列がペプチドまたはタンパク質をコードする核酸配列を含み、前記の転写可能な核酸配列を導入するための核酸配列が多重クローニング部位である、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項４１】
（ｉ）レポーター遺伝子；（ｉｉ）選択マーカー；および（ｉｉｉ）複製起点からなる群から選択される１以上のメンバーをさらに含む、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項４２】
前記核酸分子が閉環コンフォメーションである、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項４３】
特に線状化後に、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写に好適である、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項４４】
請求項１〜４３のいずれか一項に記載の核酸分子の線状化により得られる、核酸分子。
【請求項４５】
プロモーター（ａ）の制御下、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の核酸分子とともに転写される、好ましくはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写させることにより得られる、ＲＮＡ。
【請求項４６】
その安定性および／または翻訳効率を高めるよう選択されたＲＮＡ分子をｉｎ ｖｉｔｒｏで転写させる方法であって、
（ｉ）遺伝子の３’非翻訳領域に相当する、またはそれに由来する第一の核酸配列（ｂ−１）を、転写されて該ＲＮＡ分子を生じ得る核酸配列（ａ）の３’末端に結合させること、
（ｉｉ）遺伝子の３’非翻訳領域に相当する、またはそれに由来する第二の核酸配列（ｂ−２）を、該第一の核酸配列（ｂ−１）の３’末端に結合させること、および
（ｉｉｉ）得られた核酸をｉｎ ｖｉｔｒｏで転写させること
を含む、方法。
【請求項４７】
その発現を増強するよう選択されたｍＲＮＡ分子を転写させる方法であって、
（ｉ）遺伝子の３’非翻訳領域に相当する、またはそれに由来する第一の核酸配列（ｂ−１）を、転写されて該ＲＮＡ分子を生じ得る核酸配列（ａ）の３’末端に結合させること、
（ｉｉ）遺伝子の３’非翻訳領域に相当する、またはそれに由来する第二の核酸配列（ｂ−２）を、該第一の核酸配列（ｂ−１）の３’末端に結合させること、および
（ｉｉｉ）得られた核酸を転写させることにより得ることができるｍＲＮＡを翻訳すること
を含む、方法。
【請求項４８】
転写がｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
遺伝子の３’非翻訳領域に相当する、またはそれに由来する少なくとも１つのさらなる核酸配列（ｂ−３）を第二の核酸配列（ｂ−２）の３’末端に結合させることをさらに含む、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
核酸配列（ａ）、（ｂ−１）、（ｂ−２）および適当であれば（ｂ−３）が転写されて、核酸配列（ｂ−１）および／または（ｂ−２）および／または適当であれば（ｂ−３）から転写された核酸配列に、核酸配列（ａ）から転写された核酸配列の翻訳効率および／または安定性を高めるような活性がある共通転写産物を生じ得る、請求項４６〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
転写された際に、少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする核酸配列（ｃ）を核酸配列（ｂ−２）の、または適当であれば核酸配列（ｂ−３）の３’末端に結合させることをさらに含む、請求項４６〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
核酸配列（ａ）、（ｂ−１）、（ｂ−２）および適当であれば（ｂ−３）ならびに（ｃ）が転写されて、核酸配列（ｂ−１）および／または（ｂ−２）および／または適当であれば（ｂ−３）および／または（ｃ）から転写された核酸配列に、核酸配列（ａ）から転写された核酸配列の翻訳効率および／または安定性を高めるような活性がある共通転写産物を生じ得る、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
得られた核酸の転写の前に、このようにして得られた核酸の転写が、核酸配列（ａ）、（ｂ−１）、（ｂ−２）および適当であれば（ｂ−３）ならびに少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドの３’末端ヌクレオチド配列から転写された核酸配列を有する転写産物（該転写産物の３’末端ヌクレオチドは少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列のＡヌクレオチドである）を生じるように核酸配列（ｃ）内で切断することをさらに含むことを特徴とする、請求項５１または５２に記載の方法。
【請求項５４】
核酸配列（ｂ−１）、（ｂ−２）および適当であれば（ｂ−３）が互いに独立にα２−グロビン、α１−グロビン、β−グロビンおよび成長ホルモン、好ましくはヒトβ−グロビンからなる群から選択される遺伝子に由来する、請求項４６〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
その安定性および／または翻訳効率を高めるよう選択されたＲＮＡ分子をｉｎ ｖｉｔｒｏで転写させる方法であって、
（ｉ）転写された際に、少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする核酸配列（ｂ）を、転写されて前記ＲＮＡ分子を生じ得る核酸配列（ａ）の３’末端に結合させること、および
（ｉｉ）得られた核酸をｉｎ ｖｉｔｒｏで転写させること
を含む、方法。
【請求項５６】
その発現を増強するよう選択されたｍＲＮＡ分子を翻訳する方法であって、
（ｉ）転写された際に、少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする核酸配列（ｂ）を、転写されて前記ｍＲＮＡ分子を生じ得る核酸配列（ａ）の３’末端に結合させること、および
（ｉｉ）得られた核酸を転写させることにより得ることができるｍＲＮＡを翻訳すること
を含む、方法。
【請求項５７】
転写がｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
核酸配列（ａ）および（ｂ）が転写されて、核酸配列（ｂ）から転写された核酸配列に、核酸配列（ａ）から転写された核酸配列の翻訳効率および／または安定性を高めるような活性がある共通転写産物を生じ得る、請求項５５〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
得られた核酸の転写の前に、このようにして得られた核酸の転写が、核酸配列（ａ）、および少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドの３’末端ヌクレオチド配列から転写された核酸配列を有する転写産物（該転写産物の３’末端ヌクレオチドは少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列のＡヌクレオチドである）を生じるように核酸配列（ｂ）内で切断することをさらに含むことを特徴とする、請求項５５〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
切断が制限切断部位の助けで行われる、請求項５３または５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記制限切断部位がＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの制限切断部位である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの認識配列が、転写された際に、少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする核酸配列の３’末端の５〜２６塩基対下流に位置する、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの認識配列が、転写された際に、少なくとも２０の連続するＡヌクレオチドのヌクレオチド配列をコードする核酸配列の３’末端の２４〜２６塩基対下流に位置する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
請求項４６、４９〜５５および５８〜６３のいずれか一項に記載の選択されたＲＮＡ分子をｉｎ ｖｉｔｒｏで転写させる方法により得ることができるＲＮＡ。
【請求項６５】
宿主細胞をトランスフェクトするための請求項４５または６４に記載のＲＮＡの使用。
【請求項６６】
前記宿主細胞が抗原提示細胞、特に、樹状細胞、単球またはマクロファージである、請求項６５に記載の使用。
【図１】
【図２】
【図３−１】
【図３−２】
【図４】
【図５（ａ）】
【図５（ｂ）】
【図６（ａ）】
【図６（ｂ）】
【図６（ｃ）】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３−１】
【図３−２】
【図４】
【図５（ａ）】
【図５（ｂ）】
【図６（ａ）】
【図６（ｂ）】
【図６（ｃ）】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２０１２−２３５７８６（Ｐ２０１２−２３５７８６Ａ）
【公開日】平成２４年１２月６日（２０１２．１２．６）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１２−１５４８５２（Ｐ２０１２−１５４８５２）
【出願日】平成２４年７月１０日（２０１２．７．１０）
【分割の表示】特願２００８−５３２６７８（Ｐ２００８−５３２６７８）の分割
【原出願日】平成１８年９月２８日（２００６．９．２８）
【出願人】（５０９１６２５５１）ビオエンテッヒ・アクチェンゲゼルシャフト (1)
【氏名又は名称原語表記】ＢｉｏＮＴｅｃｈ ＡＧ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１２月６日（２０１２．１２．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１５４８５２（Ｐ２０１２−１５４８５２）
【出願日】平成２４年７月１０日（２０１２．７．１０）
【分割の表示】特願２００８−５３２６７８（Ｐ２００８−５３２６７８）の分割
【原出願日】平成１８年９月２８日（２００６．９．２８）
【出願人】（５０９１６２５５１）ビオエンテッヒ・アクチェンゲゼルシャフト (1)
【氏名又は名称原語表記】ＢｉｏＮＴｅｃｈ ＡＧ
【Ｆターム（参考）】
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