転移性乳癌および転移性結腸癌の調節遺伝子
【課題】どの腫瘍が転移するようであることを決定するための、およびこれらの腫瘍の転移を抑制するための試薬ならびに方法を提供する。
【解決手段】特定の遺伝子配列が、発見されかつ単離され、そして他の器官に対する乳癌細胞および結腸癌細胞の転移性の広がりと有意に関連することが見出された。腫瘍由来の組織サンプルが、特定の配列に示されるような遺伝子、またはその実質的な部分によりコードされるポリペプチドを発現するか否かを決定する工程を含む、乳房腫瘍または結腸腫瘍の転移の危険度を決定するための方法。この遺伝子の１つは、どの腫瘍が転移するようであるかを決定するため、およびこれらの腫瘍の転移を抑制するための試薬および方法を提供するために使用され得る、ＣＳＰ５６と呼ばれる新規なアスパルチルプロテアーゼをコードする。
【解決手段】特定の遺伝子配列が、発見されかつ単離され、そして他の器官に対する乳癌細胞および結腸癌細胞の転移性の広がりと有意に関連することが見出された。腫瘍由来の組織サンプルが、特定の配列に示されるような遺伝子、またはその実質的な部分によりコードされるポリペプチドを発現するか否かを決定する工程を含む、乳房腫瘍または結腸腫瘍の転移の危険度を決定するための方法。この遺伝子の１つは、どの腫瘍が転移するようであるかを決定するため、およびこれらの腫瘍の転移を抑制するための試薬および方法を提供するために使用され得る、ＣＳＰ５６と呼ばれる新規なアスパルチルプロテアーゼをコードする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の技術分野）
本発明は、腫瘍の挙動を予測するための方法、および特に、限定されないが、転移の広がりの傾向を示す特定の遺伝子配列の発現について腫瘍サンプルを試験する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
多数の組織化学的、遺伝的、および免疫学的マーカーの使用にもかかわらず、臨床家はなお、どの腫瘍が他の器官に転移するかを予測するために困難な時間を過ごしている。いくらかの患者は、再発および転移を予防するために補助の治療を必要とし、そして他の患者は、必要としない。患者のこれらの亜集団の間を区別することは、簡単ではない。従って、処置の方針は、容易に立てられない。従って、当該分野において、異なる転移可能性の腫瘍の間を区別するための新しいマーカーの必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（発明の要旨）
どの腫瘍が転移するようであることを決定するための、およびこれらの腫瘍の転移を抑制するための試薬ならびに方法を提供することが、本発明の目的である。本発明のこれらおよび他の目的は、以下に記載される１つ以上の実施態様によって提供される。
【０００４】
本発明の１つの実施態様は、配列番号１〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列に少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有する、単離されかつ精製されたタンパク質である。同一性％を、１２のギャップオープンペナルティおよび１のギャップエクステンションペナルティを用いるアフィンギャップ検索を使用するＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムを使用して決定する。
【０００５】
本発明の別の実施態様は、配列番号１〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質の少なくとも８個の連続するアミノ酸からなる、単離されかつ精製されたポリペプチドである。
【０００６】
本発明のさらに別の実施態様は、ペプチド結合によって互いに融合された第１のタンパク質セグメントおよび第２のタンパク質セグメントを含む融合タンパク質である。この第１のタンパク質セグメントは、配列番号１〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むポリペプチドによりコードされるアミノ酸配列から選択される少なくとも８個の連続したアミノ酸からなる。
【０００７】
本発明のなお別の実施態様は、配列番号１〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むポリペプチドによりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質に特異的に結合する抗体調製物である。
【０００８】
本発明のさらに別の実施態様は、配列番号１〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列に少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有する、単離されかつ精製されたタンパク質をコードするｃＤＮＡ分子である。同一性％を、１２のギャップオープンペナルティおよび１のギャップエクステンションペナルティを用いるアフィンギャップ検索を使用するＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムを使用して決定する。
【０００９】
本発明の別の実施態様は、配列番号１〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の少なくとも８個の連続するアミノ酸をコードするｃＤＮＡ分子である。
【００１０】
本発明のさらに別の実施態様は、配列番号１〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１２個の連続するヌクレオチドを含むｃＤＮＡ分子である。
【００１１】
本発明のなお別の実施態様は、配列番号１〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列に少なくとも８５％同一であるｃＤＮＡ分子である。同一性％を、１２のギャップオープンペナルティおよび１のギャップエクステンションペナルティを用いるアフィンギャップ検索を使用するＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムを使用して決定する。
【００１２】
本発明のさらなる実施態様は、６５℃で０．２×ＳＳＣを用いて洗浄した後に、配列番号１〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチドセグメントを含む、単離されかつ精製されたサブゲノムポリヌクレオチドである。
【００１３】
本発明の別の実施態様は、プロモーター、および配列番号１〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の少なくとも８個の連続するアミノ酸をコードするポリヌクレオチドセグメントを含む構築物である。このポリヌクレオチドセグメントは、プロモーターの下流に位置し、ここで、このポリヌクレオチドセグメントの転写は、このプロモーターで開始する。
【００１４】
本発明のなお別の実施態様は、プロモーター、ならびに配列番号１〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の少なくとも８個の連続するアミノ酸をコードするポリヌクレオチドを含む構築物を含む宿主細胞である。
【００１５】
本発明のさらに別の実施態様は、新しい転写単位開始単位を含む組換え宿主細胞である。この新しい転写開始単位は、５’から３’の順に、（ａ）外因性調節配列、（ｂ）外因性エキソン、および（ｃ）スプライスドナー部位、を含む。この新しい転写開始単位は、遺伝子のコード配列の上流に位置する。このコード配列は、配列番号１〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。この外因性調節配列は、遺伝子のコード配列の転写を制御する。
【００１６】
本発明のなお別の実施態様は、（ａ）配列番号１〜１８からなる群から選択される、少なくとも１２個の連続するヌクレオチド、ならびに（ｂ）検出可能な標識、を含むポリヌクレオチドプローブである。
【００１７】
本発明のさらに別の実施態様は、転移性組織または組織の転移可能性を同定するための方法である。配列番号１〜４、配列番号６〜１３、および配列番号１５〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む遺伝子の発現産物は、組織サンプル中で測定される。配列番号１、４、１１、１６、１７、および１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む遺伝子産物を発現するか、または配列番号２、３、６、７、８、９、１０、１２、１３、および１５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む遺伝子産物を発現しない組織サンプルは、転移性として、または転移可能性を有するとして同定される。
【００１８】
本発明のなお別の実施態様は、腫瘍の転移可能性を抑制する能力について試験化合物をスクリーニングする方法である。生物学的サンプルを試験化合物と接触させる。配列番号１〜４、配列番号６〜１３、および配列番号１５〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質の合成は、生物学的サンプル中で測定される。配列番号１、４、１１、１６、１７、または１８を含むポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の合成を減少させるか、または配列番号２、３、６、７、８、９、１０、１２、１３、または１５を含むポリヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質の合成を増加させる試験化合物は、腫瘍の転移可能性を抑制するための潜在的な薬剤として同定される。
【００１９】
本発明の別の実施態様は、結腸腫瘍の高程度または低程度の転移の広がりについての傾向を予測する方法である。配列番号１６および配列番号１７からなる群から選択される配列を有する遺伝子の発現産物は、結腸腫瘍サンプル中で測定される。配列番号１６の産物を発現する結腸腫瘍サンプルは、転移する高い傾向を有するとして分類され、そして配列番号１７の産物を発現する結腸腫瘍サンプルは、転移する低い傾向を有するとして分類される。
【００２０】
本発明のなお別の実施態様は、配列番号１〜１８に示されるヌクレオチド配列からなる群から選択されるコード配列を有する遺伝子の少なくとも一部を増幅するためのプライマーセットである。
【００２１】
本発明のなお別の実施態様は、配列番号１〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１２個の連続するヌクレオチドを含む少なくとも１つの一本鎖ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドアレイである。
【００２２】
本発明のさらなる実施態様は、転移性組織または組織の転移可能性を同定するための方法である。一本鎖のポリヌクレオチド分子を含む組織サンプルは、少なくとも１つの一本鎖ポリヌクレオチドプローブを含むポリヌクレオチドアレイと接触させられる。この少なくとも１つの一本鎖ポリヌクレオチドプローブは、配列番号１〜４、配列番号６〜１３、および配列番号１５〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１２個の連続するヌクレオチドを含む。この組織サンプルは、転移性であるかまたは転移可能性を有すると疑われる。ポリヌクレオチドアレイに結合した二本鎖ポリヌクレオチドを検出する。配列番号１〜４、１１、１６、１７、および１８からなる群から選択される連続するヌクレオチドを含む二本鎖ポリヌクレオチドの検出、または配列番号２、３、６、７、８、９、１０、１２、１３、および１５からなる群から選択される連続するヌクレオチドを含む二本鎖ポリヌクレオチドの検出を欠くことは、この組織サンプルを転移性または転移可能性を有すると同定する。
【００２３】
従って、本発明は、当該分野に、転移のマーカーとして使用され得る多数の遺伝子およびタンパク質を提供する。これらは、癌の患者、特に乳癌または結腸癌に対する治療の方針をより合理的に規定するために有用である。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１） 単離されかつ精製されたタンパク質であって、配列番号１〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列に少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有し、ここで同一性％は、１２のギャップオープンペナルティおよび１のギャップエクステンションペナルティを用いてアフィンギャップ検索を使用するＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムを使用して決定される、タンパク質。
（項目２） 配列番号１９に示されるアミノ酸配列に少なくとも８５％同一である、項目１に記載の単離されかつ精製されたタンパク質。
（項目３） 配列番号１〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を含む、項目１に記載の単離されかつ精製されたタンパク質。
（項目４） 配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含む、項目２に記載の単離されかつ精製されたタンパク質。
（項目５） 配列番号１〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質の少なくとも８個の連続するアミノ酸からなる、単離されかつ精製されたポリペプチド。
（項目６） 配列番号１９の少なくとも８個の連続するアミノ酸からなる、項目５に記載の単離されかつ精製されたポリペプチド。
（項目７） 項目６に記載の単離されたポリペプチドであって、配列番号１９の少なくともアミノ酸４６１〜４８９、配列番号１９の少なくともアミノ酸１０６〜１１５、配列番号１９の少なくともアミノ酸２９７〜３０６、および配列番号１９の少なくとも８〜２０からなる群から選択される、ポリペプチド。
（項目８） 融合タンパク質であって、ペプチド結合によって互いに融合した第１のタンパク質セグメントおよび第２のタンパク質セグメントを含み、ここでその第１のタンパク質セグメントは、配列番号１〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列から選択される少なくとも８個の連続するアミノ酸からなる、融合タンパク質。
（項目９） 上記第１のタンパク質セグメントが、配列番号１９に示されるアミノ酸配列から選択される少なくとも８個の連続するアミノ酸からなる、請求項８に記載の融合タンパク質。
（項目１０） 配列番号１〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質に特異的に結合する、抗体調製物。
（項目１１） ｃＤＮＡ分子であって、配列番号１〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列に少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有する単離されかつ精製されたタンパク質をコードし、ここで同一性％が、１２のギャップオープンペナルティおよび１のギャップエクステンションペナルティを用いるアフィンギャップ検索を使用するＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムを使用して決定される、ｃＤＮＡ分子。
（項目１２） 配列番号１９に少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、項目１１に記載のｃＤＮＡ分子。
（項目１３） 配列番号１〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の少なくとも８個の連続するアミノ酸をコードする、ｃＤＮＡ分子。
（項目１４） 配列番号１９をコードする、項目１３に記載のｃＤＮＡ分子。
（項目１５） 配列番号１８を含む、項目１４に記載のｃＤＮＡ分子。
（項目１６） 配列番号１〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１２の連続するヌクレオチドを含む、ｃＤＮＡ分子。
（項目１７） ｃＤＮＡ分子であって、配列番号１〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列に少なくとも８５％同一であり、ここで同一性％は、１２のギャップオープンペナルティおよび１のギャップエクステンションペナルティを用いるアフィンギャップ検索を使用するＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムを使用して決定される、ｃＤＮＡ分子。
（項目１８） 配列番号１８に示されるヌクレオチド配列に少なくとも８５％同一である、項目１７に記載のｃＤＮＡ分子。
（項目１９） ６５℃で０．２×ＳＳＣを用いて洗浄した後に、配列番号１〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチドセグメントを含む、単離されかつ精製されたサブゲノムポリヌクレオチド。
（項目２０） 上記ヌクレオチドセグメントが、配列番号１８に示されるヌクレオチド配列にハイブリダイズする、項目１９に記載の単離されかつ精製されたサブゲノムポリヌクレオチド。
（項目２１） 構築物であって、以下：
プロモーター；および
配列番号１〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の少なくとも８個の連続するアミノ酸をコードするポリヌクレオチドセグメント、
を含み、そのポリヌクレオチドセグメントは、そのプロモーターの下流に位置し、そのポリヌクレオチドセグメントの転写は、そのプロモーターで開始する、構築物。
（項目２２） 上記タンパク質が、配列番号１９のアミノ酸配列を含む、項目２１に記載の構築物。
（項目２３） プロモーター；および
配列番号１〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の少なくとも８個の連続するアミノ酸をコードするポリヌクレオチドセグメント、を含む構築物を含む、宿主細胞。
（項目２４） 上記タンパク質が、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を有する、項目２３に記載の宿主細胞。
（項目２５） 新しい転写開始単位を含む組換え宿主細胞であって、その新しい転写開始単位が、５’から３’の順で以下：
（ａ）外因性調節配列；
（ｂ）外因性エキソン；および
（ｃ）スプライスドナー部位、
を含み、ここでその新しい転写開始単位は、遺伝子のコード配列の上流に位置し、そのコード配列は、配列番号１〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、その外因性調節配列は、その遺伝子のコード配列の転写を制御する、組換え宿主細胞。
（項目２６） 上記遺伝子が、配列番号１８に示されるコード配列を有する、項目２５に記載の組換え宿主細胞。
（項目２７） ポリヌクレオチドプローブであって、（ａ）配列番号１〜１８からなる群から選択される少なくとも１２個の連続するヌクレオチド、および検出可能な標識、を含む、ポリヌクレオチドプローブ。
（項目２８） 上記少なくとも１２個の連続するヌクレオチドが、配列番号１８から選択される、項目２７に記載のポリヌクレオチドプローブ。
（項目２９） 転移性組織または組織の転移可能性を同定するための方法であって、以下の工程：
組織サンプル中の、配列番号１〜４、配列番号６〜１３、および配列番号１５〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む遺伝子の発現産物を測定する工程であって、ここで配列番号１、４、１１、１６、１７、および１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む遺伝子産物を発現するか、または配列番号２、３、６、７、８、９、１０、１２、１３、および１５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む遺伝子産物を発現しない組織サンプルが、転移性として、または転移する可能性を有するとして同定される、工程、
を包含する、方法。
（項目３０） 上記組織サンプルが、乳房組織および結腸組織からなる群から選択される、項目２９に記載の方法。
（項目３１） 上記発現産物がタンパク質である、項目２９に記載の方法。
（項目３２） 上記発現産物がｍＲＮＡである、項目２９に記載の方法。
（項目３３） 上記遺伝子が、配列番号１８に示されるヌクレオチド配列を含む、項目２９に記載の方法。
（項目３４） 腫瘍の転移する可能性を抑制する能力について試験化合物をスクリーニングする方法であって、以下の工程：
生物学的サンプルを試験化合物と接触させる工程；および
その生物学的サンプル中の、配列番号１〜４、配列番号６〜１３、および配列番号１５〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質の合成を測定する工程であって、ここで配列番号１、４、１１、１６、１７、または１８を含むポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の合成を減少させるか、あるいは配列番号２、３、６、７、８、９、１０、１２、１３、または１５を含むポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の合成を増加させる試験化合物が、腫瘍の転移する可能性を抑制するための可能性のある薬剤として同定される、工程、
を包含する、方法。
（項目３５） 結腸腫瘍の高程度または低程度の転移の広がりについて傾向を予測する方法であって、以下の工程：
結腸腫瘍サンプル中の、配列番号１６および配列番号１７からなる群から選択される配列を有する遺伝子の発現産物を測定する工程であって、ここで配列番号１６の産物を発現する結腸腫瘍サンプルが、転移する高い傾向を有するとして分類され、そして配列番号１７の産物を発現する結腸腫瘍サンプルが、転移する低い傾向を有するとして分類される、工程、
を包含する、方法。
（項目３６） 配列番号１〜１８に示されるヌクレオチド配列からなる群から選択されるコード配列を有する遺伝子の少なくとも一部を増幅するための、プライマーセット。
（項目３７） 上記遺伝子が、配列番号１８に示されるコード配列を有する、項目３６に記載のセット。
（項目３８） 上記プライマーが、配列番号２０および配列番号２１に示されるヌクレオチド配列である、項目３７に記載のセット。
（項目３９） 配列番号１〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１２個の連続するヌクレオチドを含む少なくとも１つの一本鎖ポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドアレイ。
（項目４０） 上記ヌクレオチド配列が、配列番号１、４、１１、１６、１７、および１８からなる群から選択される、項目３９に記載のポリヌクレオチドアレイ。
（項目４１） 上記ヌクレオチド配列が、配列番号２、３、６、７、８，９、１０、１２、１３、および１５からなる群から選択される、項目３９に記載のポリヌクレオチドアレイ。
（項目４２） 転移性組織または組織の転移可能性を同定するための方法であって、以下の工程：
一本鎖ポリヌクレオチド分子を含む組織サンプルを、少なくとも１つの一本鎖ポリヌクレオチドプローブを含むポリヌクレオチドアレイと接触させる工程であって、ここでその少なくとも１つの一本鎖ポリヌクレオチドプローブは、配列番号１〜４、配列番号６〜１３、および配列番号１５〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１２個の連続するヌクレオチドを含み、その組織サンプルが、転移性であるかまたは転移する可能性を有すると疑われる、工程；
そのポリヌクレオチドアレイに結合する二本鎖ポリヌクレオチドを検出する工程であって、ここで配列番号１〜４、１１、１６、１７、および１８からなる群から選択される連続するヌクレオチドを含む二本鎖ポリヌクレオチドの検出、または配列番号２、３、６、７、８、９、１０、１２、１３、および１５からなる群から選択される連続するヌクレオチドを含む二本鎖ポリヌクレオチドの検出を欠くことが、転移性または転移する可能性を有するとして組織サンプルを同定する、工程、
を包含する、方法。
（項目４３） 上記組織サンプルが、乳房サンプルまたは結腸サンプルである、項目４２に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１。異なるヒト乳癌細胞株の任意のプライマーに基づくディファレンシャルディスプレイおよびＲＮＡブロット分析による確認。図１Ａ。ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４３５における約１．２ｋｂのサイズの２つのバンドを示すディファレンシャルディスプレイゲルのオートラジオグラフ。ディファレンシャルディスプレイ反応物を調製し、そして二重で実行した。図１Ｂ。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５における発現パターンを検証するノーザンブロット分析。ディファレンシャルディスプレイゲルから単離されたｃＤＮＡは、約２．０ｋｂおよび２．５ｋｂのサイズである２つの転写物にハイブリダイズした。メチレンブルーを用いる膜の染色およびヒトβアクチンプローブとの膜のハイブリダイゼーションにより判定されるように、各レーンに等量のＲＮＡを充填した。
【図２Ａ−１】図２Ａ。ＣＳＰ５６のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列。５１８アミノ酸長配列を、１８５５塩基対のヌクレオチド配列の下に１文字コードで示す。アスパルチルプロテアーゼの特徴である、活性部位残基（Ｄ）および隣接しているアミノ酸残基は、下線が引かれている。推定プロペプチドは、四角で囲まれている。Ｎ末端の推定シグナルペプチドおよびＣ末端の膜貫通ドメインは、下線が引かれている。
【図２Ａ−２】図２Ａ。ＣＳＰ５６のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列。５１８アミノ酸長配列を、１８５５塩基対のヌクレオチド配列の下に１文字コードで示す。アスパルチルプロテアーゼの特徴である、活性部位残基（Ｄ）および隣接しているアミノ酸残基は、下線が引かれている。推定プロペプチドは、四角で囲まれている。Ｎ末端の推定シグナルペプチドおよびＣ末端の膜貫通ドメインは、下線が引かれている。
【図２Ｂ】図２Ｂ。ＣＳＰ５６のヌクレオチド配列を、２６０６塩基対の長さまで伸長する発現された配列タグ。
【図２Ｃ】図２Ｃ。ＣＳＰ５６の概略図。ＳＳは、シグナル配列；Ｐｒｏは、プロペプチド；ＴＭは、膜貫通ドメイン。アステリスクは、活性部位を示す。
【図３Ａ】図３。アスパルチルプロテアーゼのペプシンファミリーの他のメンバーとのＣＳＰ５６の多数のアミノ酸配列のアライメント。同一のアミノ酸残基を、黒い囲いにより示す。アスパルチルプロテアーゼ活性残基（Ｄ−Ｓ／Ｔ−Ｇ）を、上の線により示す。ペプシンファミリーのメンバーにおけるアスパルチルプロテアーゼに特徴的であるシステイン残基をアステリスクにより示す。推定膜付着ドメインは、下線が引かれている。ギャップを、点で示す。Ｃａｔ−Ｅは、カテプシンＥ；Ｐｅｐ−Ａは、ペプシノゲンＥ；Ｐｅｐ−Ｃは、ペプシノゲンＣ；Ｃａｔ−Ｄは、カテプシンＤ。
【図３Ｂ】図３。アスパルチルプロテアーゼのペプシンファミリーの他のメンバーとのＣＳＰ５６の多数のアミノ酸配列のアライメント。同一のアミノ酸残基を、黒い囲いにより示す。アスパルチルプロテアーゼ活性残基（Ｄ−Ｓ／Ｔ−Ｇ）を、上の線により示す。ペプシンファミリーのメンバーにおけるアスパルチルプロテアーゼに特徴的であるシステイン残基をアステリスクにより示す。推定膜付着ドメインは、下線が引かれている。ギャップを、点で示す。Ｃａｔ−Ｅは、カテプシンＥ；Ｐｅｐ−Ａは、ペプシノゲンＥ；Ｐｅｐ−Ｃは、ペプシノゲンＣ；Ｃａｔ−Ｄは、カテプシンＤ。
【図３Ｃ】図３。アスパルチルプロテアーゼのペプシンファミリーの他のメンバーとのＣＳＰ５６の多数のアミノ酸配列のアライメント。同一のアミノ酸残基を、黒い囲いにより示す。アスパルチルプロテアーゼ活性残基（Ｄ−Ｓ／Ｔ−Ｇ）を、上の線により示す。ペプシンファミリーのメンバーにおけるアスパルチルプロテアーゼに特徴的であるシステイン残基をアステリスクにより示す。推定膜付着ドメインは、下線が引かれている。ギャップを、点で示す。Ｃａｔ−Ｅは、カテプシンＥ；Ｐｅｐ−Ａは、ペプシノゲンＥ；Ｐｅｐ−Ｃは、ペプシノゲンＣ；Ｃａｔ−Ｄは、カテプシンＤ。
【図４】図４。ｓｃｉｄマウスから単離された原発性腫瘍および転移におけるＣＳＰ５６発現。異なるヒト乳癌細胞株を注射されたマウスの原発性腫瘍（ＰＴ）および転移組織（Ｍｅｔ）から単離されたＲＮＡを使用するノーザンブロット分析。メチレンブルーを用いる膜の染色およびヒトβアクチンプローブとの膜のハイブリダイゼーションにより判定されるように、各レーンに等量のＲＮＡを充填した。
【図５】図５。ＣＳＰ５６は、患者の乳房腫瘍サンプルにおいて上方制御される。図５Ａ。同じ患者由来の腫瘍および正常な乳房組織から単離されたＲＮＡを使用するノーザンブロット分析。図５Ｂ。３つの異なるヒト乳房腫瘍の患者および正常な乳房組織から単離されたＲＮＡを使用するノーザンブロット分析。
【図６】図６。乳房腫瘍および結腸腫瘍におけるＣＳＰ５６発現のインサイチュハイブリダイゼーション分析。１人の患者の正常乳房組織（Ａ〜Ｃ）から原発性乳房組織（Ｄ〜Ｆ）まで、ならびに別の患者の正常結腸組織（Ｇ、Ｈ）、原発性結腸組織（Ｊ、Ｋ）、から肝転移（Ｌ、Ｍ）までの隣接または近隣接切片。切片Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｊ、およびＬを、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）を用いて染色した。切片Ｂ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、およびＭをアンチセンスＣＳＰ５６プローブとハイブリダイズし、そして切片ＣおよびＦをＣＳＰ５６センスコントロールプローブとハイブリダイズした。ｄは、乳管；ｆは、脂肪結合組織；ｌｙは、リンパ球；ｍは、結腸粘膜；ｍｅｔは、転移組織；ＰＴは、原発性腫瘍；ｓｔは、支質；ｔｃは、腫瘍細胞。
【図７】図７。ヒト組織におけるＣＳＰ５６発現。種々のヒト組織における２．０ｋｂおよび２．５ｋｂの２つのＣＳＰ５６転写物を示すＲＮＡブロット分析。ｓｋ．筋は、骨格筋；ｓｍ．腸は、小腸；ｐ．ｂ．リンパ球は、末梢血リンパ球。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
（発明の詳細な説明）
多くの遺伝子が、癌細胞および非転移性の癌細胞の間で、差異的に発現されていることが、本発明の知見である（表１）。この情報は、差異的に示される遺伝子の発現産物に特異的な診断試薬の作製に利用され得る。これはまた、癌、特に乳癌および結腸癌の適切な処置法の計画において臨床医の助けとなる診断および予後の方法に用いられ得る。
【００２６】
本明細書において開示されるクローン１２２のような転移性マーカーのいくつかは、非転移性細胞に比較して転移性細胞においてアップレギュレートされる。クローン３３７および２８０のような転移性マーカーのいくつかは、非転移性細胞に比較して転移性細胞においてダウンレギュレートされる。これらの関係およびマーカーの同定は、以下にさらに記載するような試薬の処方および方法を可能にする。さらに、公知のタンパク質との相同性が、同定されており、これは、開示されたタンパク質の機能を示唆する。例えば、転写物２８０は、ヒトＮ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼ前駆体に相同であり、転写物２４５は、二機能性のＡＴＰスルフリラーゼ（ｓｕｌｆｕｒｙｌａｓｅ）−アデノシン５’−ホスホスルフェートキナーゼに相同であり、そして転写物１２２は、アスパルチルプロテアーゼであるヒトペプシノーゲンｃに相同である。
【００２７】
本発明の別の知見は、新規のアスパルチル型のプロテアーゼであるＣＳＰ５６が、高転移性の癌（特に、乳癌および直腸癌）において過剰発現しており、そして転移状態の原発性の腫瘍の進行に関係していることである。この情報は、ＣＳＰ５６遺伝子の発現産物に特異的な診断試薬の作製に利用し得る。これはまた、癌（特に、乳癌および直腸癌）の適切な治療法の計画のための臨床医の助けとなる診断および予後の方法に用い得る。
【００２８】
ＣＳＰ５６タンパク質のアミノ酸配列を、配列番号１９に示す。本発明の新規のポリヌクレオチドにコードされるアミノ酸配列は、特定のポリヌクレオチド配列の３つずつのリーディングフレームについて翻訳プログラムを実行することにより予測され得る。配列番号１〜１７で示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる転移性マーカータンパク質、配列番号１９に示されるＣＳＰ５６タンパク質、あるいはＣＳＰ５６を含む天然または非天然に生じる転移性マーカータンパク質の生物学的に活性なタンパク質改変体は、本発明の診断および治療の方法に用いられ得る。ＣＳＰ５６改変体を含む生物学的に活性な転移性マーカータンパク質改変体は、配列番号１〜１８を含むポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質と同じ生物学的活性を保持する。転移性マーカータンパク質の生物学的活性は、腫瘍組織と正常組織の間の（特に高転移性の可能性を有する腫瘍と正常な組織との間の）差異的発現を含む。ＣＳＰ５６の生物学的活性はまた、転移およびアスパルチル型プロテアーゼ活性を許容する能力を含む。
【００２９】
ＣＳＰ５６改変体を含む転移性マーカータンパク質改変体の生物学的活性は、当業者によって容易に決定され得る。例えば、改変体の差異的発現は、乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（Ｂｒｉｎｋｌｅｙら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４０、３１１８−２９、１９８０）、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５（Ｂｒｉｎｋｌｅｙら、１９８０）、ＭＣＦ−７、ＢＴ−２０、ＺＲ−７５−１、ＭＤＡ−ＭＢ−１５７、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＡｌａｂおよびＭＤＡ−ＭＢ−４６８、または結腸癌細胞株Ｋｍ１２ＣおよびＫｍ１２Ｌ４Ａのような転移能力が変化した細胞株において測定され得る。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株は、１９９８年５月１５日にＡＴＣＣに寄託された（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１２５３２）。Ｋｍ１２Ｃ細胞株は、１９９８年５月１５日にＡＴＣＣに寄託された（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１２５３３）。Ｋｍ１２Ｌ４Ａ細胞株は、１９９８年３月１９日にＡＴＣＣに寄託された（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１２４９６）。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞株は、１９９８年１０月９日にＡＴＣＣに寄託された（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１２５８３）。ＭＣＦ−７細胞株は、１９９８年１０月９日にＡＴＣＣに寄託された（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１２５８４）。
【００３０】
乳癌細胞株Ｈｓ５８Ｂｓｔのような非癌性細胞株での発現は、癌性細胞株における発現と比較され得る。あるいは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１またはＭＤＡ−ＭＢ−４３５のような高い転移能力を有する乳癌細胞株は、改変体をコードするポリヌクレオチドと接触され得、そして当業者に公知であるように、例えば、細胞分割あるいはタンパク質またはＤＮＡ合成をモニターすることにより、低い転移能力のものについてアッセイされ得る。潜在的なＣＳＰ５６改変体のアスパルチルプロテアーゼ活性はまた、例えば、Ｗｒｉｇｈｔら、Ｊ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．１６、１７１−８１（１９９７）に教示されるように測定され得る。
【００３１】
ＣＳＰ５６の変異体を含む天然に生じる生物学的に活性な転移性マーカータンパク質改変体が、ヒトまたはその他の種において見出され、そして配列番号１〜１８のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む。天然には生じない生物学的に活性な転移性マーカータンパク質改変体は、研究室において標準的なＤＮＡ組換え技術を用いて構築され得る。
【００３２】
好ましくは、天然または非天然に生じる生物学的に活性な転移性マーカータンパク質改変体は、配列番号１〜１８のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列に少なくとも６５％、７５％、８５％、９０％または９５％同一であるアミノ酸配列を有し、そしてこれらの性質は、程度において異なり得るが、類似した差異的発現パターンを有する。天然または非天然に生じる生物学的に活性なＣＳＰ５６改変体はまた、アスパルチル型プロテアーゼ活性を有する。さらに好ましくは、この改変体は、少なくとも９８％または９９％同一である。配列同一性％は、以下のパラメーターを有するアフィンギャップ（ａｆｆｉｎｅ ｇａｐ）検索を用いるＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを行なうコンピュータープログラムを用いて決定される：１２のギャップオープンペナルティーおよび１のギャップエクステンションペナルティー。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ（１９８１）２：４８２−４８９中に教示される。
【００３３】
生物学的または免疫学的活性を失うことなく、どのアミノ酸残基が置換、挿入または欠失し得るかの決定に関する手引きが、当該分野で周知であるＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアのようなコンピュータープログラムを用いて見出され得る。好ましくは、生物学的に活性な転移性マーカータンパク質改変体におけるアミノ酸変化が、保存的アミノ酸変化である（すなわち、類似した電荷または無電荷のアミノ酸との置換）。保存的アミノ酸化は、側鎖において関連するアミノ酸のファミリーの１つとの置換を含む。天然に生じるアミノ酸は、一般的に4つのファミリーに分けられる：酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミ
ン酸）、塩基性アミノ酸（リシン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性アミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）および無電荷極性アミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、シスチン、セリン、スレオニン、チロシン）。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、時々芳香族アミノ酸として連帯して分類される。単離された、ロイシンのイソロイシンまたはバリンでの置換、アスパラギン酸のグルタミン酸での置換、スレオニンのセリンでの置換、またはあるアミノ酸の構造的に関連したアミノ酸での同様の置換が、得られる転移性マーカータンパク質改変体の生物学的特性に主要な効果を有さないことと予想することは合理的である。例えば、単離された保存的アミノ酸置換は、特に、置換がプロテアーゼの触媒ドメインではない場合、ＣＳＰ５６のアスパルチルプロテアーゼ活性に主要な効果を有すとは予想されない。
【００３４】
転移性マーカータンパク質改変体はまた、生物学的活性を維持した、対立遺伝子改変体、種改変体、ムテイン、グリコシル化形態、他の分子との凝集的接合、および無関係な化学的部分と結合した共有結合を含む。共有結合性転移性マーカー改変体は、当該分野で公知のように、アミノ酸鎖またはＮ末端残基またはＣ末端残基に見出される基に対する機能性の連結により調製され得る。転移性マーカータンパク質の発現パターン、または例えば、ＣＳＰ５６のアスパルチルプロテアーゼ活性に影響を与えない領域の切断または欠失はまた、生物学的に活性な改変体である。
【００３５】
ムテインと呼ばれる変異体のサブセットは、セリンのような中性のアミノ酸がジスフィルド結合に関与しないシステイン残基と置換されているタンパク質の基である。これらの変異体は、天然に生じるタンパク質よりも広い範囲の温度にわたって安定であり得る。Ｍａｒｋら、米国特許第４，９５９，３１４号を参照のこと。
【００３６】
転移性マーカーポリペプチドは、全長転移性マーカータンパク質よりも少数のアミノ酸を含む。転移性マーカータンパク質ポリペプチドは、全長タンパク質または生物学的に活性な改変体において見られるのと同じ順序で配列番号１を含むポリヌクレオチドによってコードされる、少なくとも８、１０、１２、１５、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、または７００の、連続したアミノ酸；配列番号２または９を含むポリヌクレオチドによってコードされる、少なくとも８、１０、１２、１５、２５、５０、７５、１００、または１２５の連続したアミノ酸；配列番号３、４、５、８、または１０を含むポリヌクレオチドによってコードされる、少なくとも８、１０、１２、１５、２５、５０、７５、または１００の連続したアミノ酸；配列番号６を含むポリヌクレオチドによってコードされる、少なくとも８、１０、１２、１５、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、または８００の連続したアミノ酸；配列番号７を含むポリヌクレオチドによってコードされる、少なくとも８、１０、１２、１４、２５、５０、５５または６０の連続したアミノ酸；配列番号１１に含まれるポリヌクレオチドによってコードされる、少なくとも８、１０、１２、１５、２５、５０、７５、１００、１５０、または１６０の連続したアミノ酸；配列番号１２を含むポリヌクレオチドによってコードされる、少なくとも８、１０、１２、１５、２５、５０、７５、１００、１２５、または１３０の連続したアミノ酸；配列番号１３を含むポリヌクレオチドによってコードされる、少なくとも８、１０、１２、１５、２５、５０、７５、または１００の連続したアミノ酸；配列番号１４を含むポリヌクレオチドによってコードされる、少なくとも８、１０、１２、１５、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、または３００の連続したアミノ酸；配列番号１５を含むポリヌクレオチドによってコードされる、少なくとも８、１０、１２、１５、２５、５０、７５、１００、または１５０の連続したアミノ酸；配列番号１６を含むポリヌクレオチドによってコードされる、少なくとも８、１０、１２、１５、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、または１１００の連続したアミノ酸；あるいは、配列番号１７を含むポリヌクレオチドによってコードされる、少なくとも８、１０、１２、１５、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００の連続するアミノ酸を含み得る。ＣＳＰ５６ポリペプチドは、ＣＳＰ５６タンパク質または生物学的に活性な改変体の少なくとも８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、２０、２１、２３、２５、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３５、４０、５０、６０、７５、１００、１１１、１１２、１２０、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、または５００の、あるいはそれ以上のアミノ酸を含み得る。好ましいＣＳＰ５６ポリペプチドは、配列番号１９の少なくともアミノ酸１０６〜１１５、１０５〜１１６、１０４〜１１７、１００〜１２０、２９７〜３０６、２９６〜３０７、２９５〜３０８、２９０〜３２０、８〜２０、７〜２１、６〜２２、１〜３０、４６１〜４８９、４６０〜４９０、４５９〜４９１および４０７〜５１８を含む。その配列番号１〜１８のヌクレオチド配列を含むが、特定の転移性マーカーポリペプチド改変体の生物学的な特性に実質的に影響を与えない少数のアミノ酸置換を有するポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列と実質的に同等なアミノ酸を有するポリペプチド分子は、転移性マーカーポリペプチドの定義内である。
【００３７】
転移性マーカータンパク質またはポリペプチドは、例えば、当業者に周知である生化学的な技術を用いてヒト細胞から単離され得る。単離されかつ精製された転移性マーカータンパク質の調製物は、少なくとも８０％純粋であり；好ましくは、その調製物は、少なくとも９０％、９５％、９８％または９９％純粋である。転移性マーカータンパク質およびポリペプチドはまた、組換えＤＮＡ法または、合成化学的方法により産生され得る。組換え転移性マーカータンパク質またはポリペプチド産生のために、配列番号１〜１８から選択したコード配列が、公知の原核生物または真核生物の発現系において発現され得る。細菌、酵母、昆虫または哺乳動物の発現系が、当該分野で公知であるように用いられ得る。あるいは、固相ペプチド合成のような合成化学法を、転移性マーカータンパク質またはポリペプチドの合成に用い得る。生物学的に活性なタンパク質またはポリペプチド改変体を、同様に産生し得る。
【００３８】
本発明の転移性マーカータンパク質の連続するアミノ酸を含む融合タンパク質がまた、構築され得る。融合タンパク質は、転移性マーカータンパク質アミノ酸配列に対する抗体を作製するため、および種々のアッセイ系に用いるために有用である。例えば、ＣＳＰ５６融合タンパク質は、ＣＳＰ５６タンパク質と相互作用するタンパク質、および例えば、そのアスパルチルプロテアーゼ活性、その差異的発現、またはその転移を許容する能力に影響するタンパク質の同定に用いられ得る。タンパク質アフィニティークロマトグラフィーのような物理的な方法、または酵母２ハイブリッドまたはファージディスプレイ系のようなタンパク質−タンパク質相互作用のためのライブラリーに基づいたアッセイはまた、この目的のために用いられ得る。そのような方法は、当該分野で周知であり、そして薬物のスクリーニングに用いられ得る。
【００３９】
融合タンパク質は、ペプチド結合によってお互いに融合した２つのタンパク質セグメントを含む。この第１のタンパク質セグメントは、配列番号１を含むポリヌクレオチドによってコードされた少なくとも８、１０、１２、１５、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、または７００の連続したアミノ酸；配列番号２または９を含むポリヌクレオチドによってコードされた少なくとも８、１０、１２、１５、２５、５０、７５、１００、または１２５の連続したアミノ酸；配列番号３、４、５、８または１０を含むポリヌクレオチドによってコードされた少なくとも８、１０、１２、１５、２５、５０、７５、または１００の連続したアミノ酸；配列番号６を含むポリヌクレオチドによってコードされた少なくとも８、１０、１２、１５、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０または８００の連続したアミノ酸；配列番号７を含むポリヌクレオチドによってコードされた少なくとも８、１０、１２、１４、２５、５０、５５または６０の連続したアミノ酸；配列番号１１を含むポリヌクレオチドによってコードされた少なくとも８、１０、１２、１５、２５、５０、７５、１００、１５０または１６０の連続したアミノ酸；配列番号１２を含むポリヌクレオチドによってコードされた少なくとも８、１０、１２、１５、２５、５０、７５、１００、１２５または１３０の連続したアミノ酸；配列番号１３を含むポリヌクレオチドによってコードされた少なくとも８、１０、１２、１５、２５、５０、７５または１００の連続したアミノ酸；配列番号１４を含むポリヌクレオチドによってコードされた少なくとも８、１０、１２、１５、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５または３００の連続したアミノ酸；配列番号１５を含むポリヌクレオチドによってコードされた少なくとも８、１０、１２、１５、２５、５０、７５、１００または１５０の連続したアミノ酸；配列番号１６を含むポリヌクレオチドによってコードされた少なくとも８、１０、１２、１５、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０または１１００の連続したアミノ酸；または配列番号１７を含むポリヌクレオチドによってコードされた少なくとも８、１０、１２、１５、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０または５００の連続したアミノ酸；またはＣＳＰ５６タンパク質の少なくとも８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、２０、２１、２３、２５、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３５、４０、５０、６０、７５、１００、１１１、１１２、１２０、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５または５００の連続したアミノ酸からなる。このアミノ酸は、配列番号１〜１８を含むポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列、またはそれらの配列の生物学的に活性な改変体から選択され得る。この第１のタンパク質セグメントはまた、全長転移性マーカータンパク質であり得る。この第１のタンパク質セグメントは、便利なようにＮ末端またはＣ末端であり得る。
【００４０】
第２のタンパク質セグメントは、全長タンパク質またはタンパク質フラグメントあるいはポリペプチドであり得る。タンパク質は、一般的に、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む自己蛍光タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ルシフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）を含む融合タンパク質構築物に用いた。さらに、エピトープタグは、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ−Ｇタグおよびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグを含む融合タンパク質の構築に用いられる。他の融合構築物は、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ−タグ、Ｌｅｘ Ａ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合体、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン融合体、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合体を含み得る。
【００４１】
これらの融合体は、例えば、２つのタンパク質セグメントの共有結合によるか、または分子生物学の分野において標準的な手順により作製され得る。組換えＤＮＡ法は、当該分野で公知のように、例えば、第２のタンパク質セグメントをコードし、そして宿主細胞においてＤＮＡ構築物を発現するヌクレオチドと適切なリーディングフレームにおいて配列番号１〜１８から選択されるコード配列を含むＤＮＡ構築物の作製によって、融合タンパク質を調製するために用いられ得る。融合タンパク質を構築するための多くのキットが、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ）、ＭＢＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＭＩＣ；Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ、ＭＡ）およびＱｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ、Ｃａｎａｄａ；１−８８８−ＤＮＡ−ＫＩＴＳ）を含む、実験のための器具を研究室に供給する会社より入手可能である。
【００４２】
単離した転移性マーカータンパク質、ポリペプチド、生物学的に活性な変異体、または融合タンパク質は、転移性マーカータンパク質のエピトープと特異的に結合する抗体の調製物を得るための免疫原として用いられ得る。この抗体は、ヒト組織、特にヒト腫瘍またはそれらの画分において、特に、ＣＳＰ５６のような転移性マーカータンパク質を検出するために用い得る。抗体はまた、転移性マーカータンパク質の過少発現もしくは過剰発現、またはサイズもしくは電気泳動移動度が変化した転移性マーカータンパク質の発現を生じる、ＣＳＰ５６遺伝子のような転移性マーカータンパク質での変異の存在の検出に用いられ得る。例えば、抗体がＣＳＰ５６に結合することにより、ＣＳＰ５６アスパルチル型プロテアーゼ活性または転移を可能にするＣＳＰ５６の能力もまた阻害し得る。
【００４３】
転移性マーカータンパク質、ポリペプチド、融合タンパク質または生物学的に活性な改変体のエピトープに特異的に結合する抗体は、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、免疫組織化学的アッセイ、免疫沈降または他の当該分野で公知の免疫化学的アッセイを含むがそれに限定されない免疫化学的アッセイに用い得る。代表的には、本発明の抗体は、そのような免疫化学的アッセイに用いた場合、他のタンパク質により提供される検出シグナルに比べて少なくとも約５、約１０、または約２０倍高い検出シグナルを提供する。好ましくは、特定の転移性マーカータンパク質のエピトープに特異的に結合する抗体は、免疫化学的アッセイにおいて他のタンパク質を検出せず、そして溶液からのその転移性マーカータンパク質または転移性マーカータンパク質のポリペプチドフラグメントを免疫沈降し得る。
【００４４】
転移性マーカータンパク質特異的抗体は、配列番号１〜１８のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列またはそれらのアミノ酸配列の生物学的に活性な改変体を有する転移性マーカータンパク質内に存在するエピトープに特異的に結合する。代表的には、少なくとも６、８、１０、または１２の連続したアミノ酸が、エピトープの形成に必要とされる。しかし、連続しないアミノ酸を含むエピトープは、例えば少なくとも１５、２５、または５０のアミノ酸をさらに必要とし得る。好ましくは、転移性マーカータンパク質のエピトープは、他のヒトタンパク質には存在しない。
【００４５】
特に抗原性である転移性マーカータンパク質のエピトープは、例えば、抗原性について転移性マーカータンパク質のポリペプチドフラグメントの慣用的なスクリーニングにより、または転移性マーカータンパク質のアミノ酸配列に対するタンパク質の抗原性領域の選択のための理論的な方法を適用することにより選択され得る。そのような方法は、例えば、ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８、３８２４−２８（１９８１）、ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄ、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０、４８３−８９（１９８３）、ならびにＳｕｔｃｌｉｆｆｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９、６６０−６６（１９８３）に教示される。図３を参照することにより、他のアスパルチルプロテアーゼと交差反応する抗体にまた結合し得るＣＳＰ５６の抗原性領域が、回避され得る。
【００４６】
当該分野で公知の抗体の任意の型を、転移性マーカータンパク質のエピトープに特異的に結合するために作製し得る。例えば、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の調製は、当該分野で周知の標準的な方法を用いて行われ得る。同様に、一本鎖の抗体もまた、調製され得る。転移性マーカータンパク質のエピトープに特異的に結合する一本鎖の抗体が、例えば、当該分野で公知の一本鎖免疫グロブリンディスプレイライブラリーから単離され得る。このライブラリーは、転移性マーカータンパク質のアミノ酸配列に対して「パニング」され、そして転移性マーカータンパク質の異なるエピトープに対して高い親和性で結合する多くの単鎖抗体が、単離され得る。Ｈａｙａｓｈｉら、１９９５、Ｇｅｎｅ １６０：１２９−３０。一本鎖の抗体はまた、テンプレートとしてハイブリドーマｃＤＮＡを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のようなＤＮＡ増幅法を用いて構築され得る。Ｔｈｉｒｉｏｎら、１９９６、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｅｖ．５：５０７−１１。
【００４７】
単鎖抗体は、単一特異的または二重特異的であり得、そして二価または四価であり得る。四価の二重特異的単鎖抗体の構築が、例えば、ＣｏｌｏｍａおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ、１９９７、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：１５９−６３に教示される。二価の二重特異的１本鎖抗体の構築が、特に、ＭａｌｌｅｎｄｅｒおよびＶｏｓｓ、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１９９−２０６に教示される。
【００４８】
単鎖抗体をコードするヌクレオチド配列は、手動合成または自動ヌクレオチド合成を用いて構築され得、標準的な組換えＤＮＡ方法を用いて発現構築物中にクローニングされ、そして以下のコード配列を発現するための細胞中に導入され得る。あるいは、単鎖抗体は、例えば、糸状のファージ技術を用いて直接産生され得る。Ｖｅｒｈａａｒら、１９９５、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６１：４９７−５０１；Ｎｉｃｈｏｌｌｓら、１９９３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１６５：８１−９１。
【００４９】
モノクローナルおよび他の抗体はまた、それを治療的に用いた場合、患者が抗体に対する免疫応答を生じることを防ぐために「ヒト化」され得る。そのような抗体は、治療に直接用いるヒト抗体に対する配列に十分に類似し得るか、または少数の鍵となる残基の変更を必要とし得る。例えば、げっ歯類の抗体とヒト配列の間の配列の違いは、例えば、個々の残基の部位特異的変異誘発、または完全な相補性決定領域をグレーティングする（ｇｒａｔｉｎｇ）ことにより、ヒト配列における残基と異なる残基との置換により最小化され得る。あるいは、当業者は、ＧＢ２１８８６３８Ｂに記載される組換え方法を用いてヒト化された抗体を産生し得る。転移性マーカータンパク質のエピトープに特異的に結合する抗体は、Ｕ．Ｓ．５，５６５，３３２に開示されるような、部分的または完全にのいずれかでヒト化された抗原結合部位を含み得る。
【００５０】
抗体の他の型が、構築され、そして本発明の方法で治療的に用いられ得る。例えば、キメラ抗体が、例えば、ＷＯ９３／０３１５１に開示されるように構築され得る。免疫グロブリンに由来する結合タンパク質およびＷＯ９４／１３８０４に記載される「ｄｉａｂｏｄｉｅｓ」のような多価および多特異的である結合タンパク質がまた、調製され得る。
【００５１】
本発明の抗体は、当該分野で周知の方法により精製され得る。例えば、抗体は、転移性マーカータンパク質、ポリペプチド、変異体または融合タンパク質が結合するカラムに抗体を通すことによりアフィニティー精製され得る。次いで、結合した抗体は、高塩濃度の緩衝液を用いてカラムから溶出され得る。
【００５２】
本発明はまた、転移性マーカータンパク質、ポリペプチド、改変体または融合タンパク質をコードするサブゲノムポリヌクレオチドを提供し得る。サブゲノムポリヌクレオチドは、全染色体は含まない。好ましくは、サブゲノムポリヌクレオチドは、イントロンを有さない。単離された転移性マーカータンパク質サブゲノムポリヌクレオチドは、少なくとも、配列番号１の８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１５５０、１６００、１６５０、１７００、１７５０、１８００、１８５０、１９００、１９５０、２０００、２０５０、２１００、２１５０、または２２００の連続したヌクレオチド；配列番号２または９の少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０または４００の連続したヌクレオチド；配列番号６の少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１５５０、１６００、１６５０、１７００、１７５０、１８００、１８５０、１９００、１９５０、２０００、２２５０または２５００の連続したヌクレオチド；配列番号７の少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０または１７５の連続したヌクレオチド；配列番号８の少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００または３５０の連続したヌクレオチド；配列番号１２の少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００または３５０の連続したヌクレオチド；配列番号３、４、５、または１０の少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０または３００の連続したヌクレオチド；配列番号１１の少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０または５００の連続したヌクレオチド；配列番号１３の少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０または３００の連続したヌクレオチド；配列番号１４の少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００または９５０の連続したヌクレオチド；配列番号１５の少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００または４５０の連続したヌクレオチド；配列番号１６の少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１５５０、１６００、１６５０、１７００、１７５０、１８００、１８５０、１９００、１９５０、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３２５０または３５００の連続したヌクレオチド；配列番号１７の少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０または１５００の連続したヌクレオチドを含むか、または配列番号１〜１７の１つを含み得る。
【００５３】
ＣＳＰ５６ポリヌクレオチドは、配列番号１８より選択した少なくとも１０、１１、１２、１５、２０、２４、２５、３０、３２、３３、３５、３６、４０、４２、４５、４８、５０、５１、５４、６０、６３、６９、７０、７４、７５、８０、８４、８７、９０、９３、９６、９９、１００、１０５、１１４、１２０、１２５、１５０、２２５、３００、３３３、３３６、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１５５０、１６００、１６５０、１７００、１７５０、１８００または１８５０ヌクレオチドの連続した配列を含み得るか、または配列番号１８を含み得る。単離されたＣＳＰ５６ポリヌクレオチドは、配列番号１９の少なくとも８、１０、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２５、２９、３０、３１、３２、４０、５０、７５、１００または１１１の連続したアミノ酸をコードし、そして配列番号１９に示される全アミノ酸配列をコードし得る。好ましいＣＳＰ５６ポリヌクレオチドは、配列番号１９の少なくともアミノ酸１〜３０、８〜２０、７〜２１、６〜２２、１０６〜１１５、１０５〜１１６、１０４〜１１７、１００〜１２０、２９７〜３０６、２９６〜３０７、２９５〜３０８、２９０〜３２０、４６１〜４８９、４６０〜４９０、４５９−４９１、および４０７−５１８をコードする。
【００５４】
配列番号１〜１８に示されるヌクレオチド配列の相補体は、配列番号１〜１８に示されるような連続するヌクレオチド配列を用いてワトソン−クリック塩基対を形成する連続するヌクレオチド配列である。配列番号１〜１８の相補体はまた、本発明のポリヌクレオチドである。コード配列の相補体は、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびプローブを提供するために使用され得る。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびプローブは、少なくとも１１、１２、１５、２０、２５、３０、５０、または１００の連続するヌクレオチドからなり得る。全体のコード配列の相補体もまた、使用され得る。配列番号１〜１８に示されるヌクレオチド配列の全てまたは一部分を含む二本鎖ポリヌクレオチド、ならびに転移マーカータンパク質特異的抗体またはリボザイムをコードするポリヌクレオチドはまた、本発明のポリヌクレオチドである。
【００５５】
転移マーカータンパク質および／または改変体のアミノ酸配列をコードする縮重ヌクレオチド配列、ならびに配列番号１〜１８に示されるヌクレオチド配列に少なくとも６５％、７５％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一である相同的ヌクレオチド配列もまた、本発明のポリヌクレオチドである。配列同一性％は、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用するコンピュータープログラム（例えば、以下のパラメーター：１２のギャップオープンペナルティおよび１のギャップエクステンションペナルティとともにアフィンギャップサーチ（ａｆｆｉｎｅ ｇａｐ ｓｅａｒｃｈ）を用いてＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）を実行するように）を使用して決定され得る。
【００５６】
代表的には、本発明の相同的ポリヌクレオチド配列は、当該分野において公知のように、ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行うことによって確認され得る。例えば、以下の洗浄条件−−２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、室温で２回、それぞれ３０分間；次いで、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃で３０分間を一回；次いで、２×ＳＳＣ、室温で２回、１０分間を使用して各相同配列を同定し得る。これは最も多くて約２５％〜３０％の塩基対のミスマッチを含む。より好ましくは、相同的核酸鎖は、１５〜２５％の塩基対のミスマッチを含み、さらにより好ましくは５〜１５％、２〜１０％、または１〜５％の塩基対のミスマッチを含む。本発明のポリヌクレオチドの相同性の程度は、当該分野において周知であり、そして例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、第２版（１９８９）のようなマニュアルに記載されるように、遺伝子ライブラリー（または他の遺伝物質供給源）由来のクローンの同定のための洗浄条件のストリンジェンシーを変化することによって選択され得る。
【００５７】
本発明のサブゲノムポリヌクレオチドの種相同体はまた、適切なプローブまたはプライマーを作製し、そしてｃＤＮＡ発現ライブラリーまたは他の種（例えば、マウス、サル、酵母または細菌）由来のゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって同定され得る。完全なポリヌクレオチド配列は、重複しているクローンである、５’ＲＡＣＥのライブラリーの染色体ウォーキング、スクリーニング、または当該分野において周知の他の技術によって得られ得る。相同性が１％減少するごとに、二本鎖ＤＮＡのＴmは、１〜１．５℃減少することが周知である（Ｂｏｎｎｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８１、１２３（１９７３））。従って、相同的なヒトポリヌクレオチドまたは他種のポリヌクレオチドは、例えば、推定相同ポリヌクレオチドを、配列番号１〜１８のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとハイブリダイズし、試験ハイブリッドの融点と、配列番号１〜１８のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドおよびこのヌクレオチド配列と完全に相補的なポリヌクレオチドを含むハイブリッドの融点とを比較し、そして試験ハイブリッド内の塩基対ミスマッチの数を計算することにより、同定され得る。
【００５８】
ストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件に従って、配列番号１〜１８に示されるヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列はまた、本発明のサブゲノムポリヌクレオチドである。ストリンジェントな洗浄条件は、周知でありかつ当該分野において理解され、そして例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、９．５０〜９．５１頁に開示される。
【００５９】
代表的には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件について、温度と塩濃度との組み合せは、研究中に算出したハイブリッドのＴmよりおおよそ１２〜２０℃下を選択すべきである。配列番号１〜１８に示されるポリヌクレオチド配列とその配列に６５％、７５％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なポリヌクレオチド配列との間のハイブリッドのＴmは、例えば、ＢｏｌｔｏｎおよびＭｃＣａｒｔｈｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．４８，１３９０（１９６２）の方程式：
Ｔｍ＝８１．５℃−１６．６（ｌｏｇ10［Ｎａ+］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６３（％ホルムアミド）−６００／ｌ）、
ここで、ｌ＝ハイブリッドの塩基対の長さ、を使用して算出され得る。
【００６０】
ストリンジェントな洗浄条件は、例えば、６５℃で４×ＳＳＣ、または５０％ホルムアミド、４２℃で４×ＳＳＣ、または６５℃で０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含む。高ストリンジェントな洗浄条件は、例えば、６５℃で０．２×ＳＳＣを含む。
【００６１】
サブゲノムポリヌクレオチドは、標準的な核酸精製技術を使用して、他のヌクレオチド配列がないように精製され得る。例えば、制限酵素およびプローブは、転移マーカータンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを単離するために使用され得る。あるいは、ＰＣＲは、このようなポリヌクレオチドを合成および増幅するために使用され得る。単離されかつ精製されたポリヌクレオチドの調製物の少なくとも９０％は、ポリヌクレオチドをコードする転移マーカータンパク質を含む。
【００６２】
転移マーカータンパク質をコードする相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）分子はまた、本発明のサブゲノムポリヌクレオチドである。ｃＤＮＡ分子は、ｍＲＮＡをテンプレートとして使用する標準的な分子生物学的技術を用いて生成され得る。その後、ｃＤＮＡ分子は、当該分野で公知のそしてＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９のようなマニュアルに開示される分子生物学的技術を使用して複製され得る。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような増幅技術は、テンプレートとしてヒトゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのいずれかを使用して、本発明のサブゲノムポリヌクレオチドのさらなるコピーを得るために使用され得る。
【００６３】
あるいは、合成化学技術が、本発明のサブゲノムポリヌクレオチド分子を合成するために使用され得る。ゲノムコードの縮重は、代替のヌクレオチド配列が合成されるのを可能にし、これは、配列番号１〜１７から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列、配列番号１９に示されるようなＣＳＰ５６アミノ酸配列、またはこれらの配列の生物学的活性の改変体を有する転移マーカータンパク質をコードする。このような全てのヌクレオチド配列は、本発明の範囲内である。
【００６４】
本発明はまた、例えば、ノザンまたはサザンブロッティングのようなハイブリダイゼーションプロトコルまたはインサイチュハイブリダイゼーションにおいて、転移マーカーポリペプチド配列を検出するために使用され得るポリヌクレオチドプローブを提供する。本発明のポリヌクレオチドプローブは、配列番号１〜１８から選択される、少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、または４０以上の連続するヌクレオチドを含む。本発明のポリヌクレオチドプローブは、検出標識（例えば、放射性同位体標識、蛍光標識、酵素標識、または化学発光標識）を含み得る。
【００６５】
単離されたポリヌクレオチドは、例えば、このポリヌクレオチドのさらなるコピーを得るためのプライマーとして、またはｍＲＮＡを検出するためのプローブとして使用され得る。ポリヌクレオチドはまた、転移マーカータンパク質ｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、生物学的活性改変体、単鎖抗体、リボザイムまたは融合タンパク質を発現するために使用され得る。上記の任意のポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡの構築物のような構築物中に存在し得る。この構築物は、ベクターであり得、そして例えばこのポリヌクレオチドの増殖のために、ポリヌクレオチドを細胞へ移入するために使用され得る。構築物は、直鎖状分子または環状分子であり得る。それらは、自律複製分子上であり得、または複製配列がない分子上であり得る。そしてそれら構築物は、当該分野において公知のように、それら自体によって、または他の調節配列によって調節され得る。
【００６６】
構築物はまた、発現構築物であり得る。発現構築物は、選択された宿主細胞において機能的であるプロモーターを含む。例えば、当業者は、当該分野で公知であり使用される多くの数の細胞型特異的プロモーターから適切なプロモーターを容易に選択し得る。この発現構築物はまた、宿主細胞中で機能的である転写ターミネーターを含み得る。この発現構築物は、例えば、転移マーカータンパク質の全てまたは一部分、ポリペプチド、生物学的活性改変体、抗体、リボザイム、または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドセグメントを含む。このポリヌクレオチドセグメントは、プロモーターから下流に位置する。ポリヌクレオチドセグメントの転写は、プロモーターで開始する。この発現構築物は、直鎖状または環状であり得、そして所望される場合、自律複製配列を含み得る。
【００６７】
サブゲノムポリヌクレオチドは、当該分野において周知の技術を使用して、ベクターおよび細胞株において増殖され得る。細菌における発現系は、Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７５：６１５、Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２８１：５４４、Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８０）８：４０５７、ＥＰ３６，７７６、米国特許第４，５５１，４３３号、ｄｅＢｏｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３）８０：２１−２５、およびＳｉｅｂｅｎｌｉｓｔら、Ｃｅｌｌ（１９８０）２０：２６９に記載される発現系を含む。
【００６８】
酵母における発現系は、Ｈｉｎｎｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：１９２９；Ｉｔｏら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８３）１５３：１６３；Ｋｕｒｔｚら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８６）６：１４２；Ｋｕｎｚｅら、Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８５）２５：１４１；Ｇｌｅｅｓｏｎら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８６）１３２：３４５９、Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８６）２０２：３０２）Ｄａｓら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８４）１５８：１１６５；Ｄｅ Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８３）１５４：７３７、Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９０）８：１３５；Ｋｕｎｚｅら、Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８５）２５：１４１；Ｃｒｅｇｇら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８５）５：３３７６、米国特許第４，８３７，１４８号、米国特許第４，９２９，５５５号；ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ、Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）３００：７０６；Ｄａｖｉｄｏｗら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８５）１０：３８０、Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８５）１０：４９、Ｂａｌｌａｎｃｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９８３）１１２：２８４−２８９；Ｔｉｌｂｕｒｎら、Ｇｅｎｅ（１９８３）２６：２０５−２２１、Ｙｅｌｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１：１４７０−１４７４、ＫｅｌｌｙおよびＨｙｎｅｓ、ＥＭＢＯ Ｊ．（１９８５）４：４７５４７９；ＥＰ２４４，２３４およびＷＯ ９１／００３５７に記載される発現系を含む。
【００６９】
昆虫におけるサブゲノムポリヌクレオチドの発現は、米国特許第４，７４５，０５１号、Ｆｒｉｅｓｅｎら（１９８６）「バキュロウイルス遺伝子発現の調節」：ＴＨＥ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ ＯＦ ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳＥＳ（Ｗ．Ｄｏｅｒｆｌｅｒ編）、ＥＰ１２７，８３９、ＥＰ１５５，４７６、およびＶｌａｋら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）６９：７６５−７７６、Ｍｉｌｌｅｒら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８８）４２：１７７、Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら、Ｇｅｎｅ（１９８８）７３：４０９、Ｍａｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１５：５９２−５９４、Ｌｅｂａｃｑ−Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎら、Ｍｏｌ．Ｃａｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８８）８：３１２９；Ｓｍｉｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８５）８２：８４０４、Ｍｉｙａｊｉｍａら、Ｇｅｎｅ（１９８７）５８：２７３；およびＭａｒｔｉｎら、ＤＮＡ（１９８８）７：９９に記載されるように達成され得る。多くのバキュロウイルス株および改変体および対応する宿主由来の許容昆虫宿主細胞は、Ｌｕｃｋｏｗら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６：４７−５５、Ｍｉｌｌｅｒら、ＧＥＮＥＴＩＣ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ（Ｓｅｔｌｏｗ，Ｊ．Ｋ．ら編）、第８巻（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、１９８６）、２７７〜２７９頁、ならびにＭａｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ，（１９８５）３１５：５９２−５９４に記載される。
【００７０】
サブゲノムポリヌクレオチドの哺乳動物発現は、Ｄｉｊｋｅｍａら、ＥＭＢＯ Ｊ．（１９８５）４：７６１、Ｇｏｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２ｂ）７９：６７７７、Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ（１９８５）４１：５２１および米国特許第４，３９９，２１６号に記載されるよに達成され得る。哺乳動物発現の他の特徴は、ＨａｍおよびＷａｌｌａｃｅ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．（１９７９）５８：４４、ＢａｒｎｅｓおよびＳａｔｏ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８０）１０２：２５５、米国特許第４，７６７，７０４号、米国特許第４，６５７，８６６号、米国特許第４，９２７，７６２号、米国特許第４，５６０，６５５号、ＷＯ ９０／１０３４３０、ＷＯ ８７／００１９５号、ならびに米国特許再発行３０，９８５に記載されるように容易にされ得る。
【００７１】
サブゲノムポリヌクレオチドは、直鎖状分子または環状分子であり得る。それらは、自律複製分子上または複製配列をもたない分子上にあり得る。それらは、当該分野において公知であるようにそれら自体によって、または他の調節配列によって調節され得る。サブゲノムポリヌクレオチドは、当該分野において利用可能な種々の技術（例えば、トランスフェリン−ポリカチオン媒介ＤＮＡ移入、裸の核酸またはカプセル化核酸を用いたトランスフェクション、リポソーム媒介ＤＮＡ移入、ＤＮＡコートラテックスビーズの細胞内輸送、プロトプラスト融合、ウイルス感染、エレクトロポレーション、およびリン酸カルシウム媒介トランスフェクション）を使用して、適切な宿主細胞へ導入され得る。
【００７２】
本発明のポリヌクレオチドはまた、ｍＲＮＡまたはオリゴヌクレオチド（天然のｍＲＮＡまたはその相補体のいずれかの配列を有する）、全長タンパク質、融合タンパク質、ポリペプチド、またはリボザイム、または単鎖抗体を細胞（好ましくは真核生物細胞）に送達する目的のために、遺伝子送達ビヒクルにおいて使用され得る。本発明に従って、遺伝子送達ビヒクルは、例えば裸のプラスミドＤＮＡ、本発明のポリヌクレオチドを含むウイルス発現ベクター、またはリポソームもしくは縮合試薬と連結した本発明のポリヌクレオチドであり得る。
【００７３】
本発明の１つの実施態様において、この遺伝子送達ビヒクルは、プロモーターおよび本明細書中に開示されるポリヌクレオチドの１つを含む。好ましいプロモーターは、組織特異的プロモーターならびに細胞増殖によって活性化されるプロモーター（例えば、チミジンキナーゼプロモーターおよびチミジレートシンターゼプロモーター）である。他の好ましいプロモーターは、ウイルス感染により活性化され得るプロモーター（例えば、α−およびβ−インターフェロンプロモーター）、ならびにホルモンによって活性化され得るプロモーター（例えば、エストロゲン）を含む。使用され得る他のプロモーターは、モロニーウイルスＬＴＲ、ＣＭＶプロモーター、およびマウスアルブミンプロモーターを含む。
【００７４】
遺伝子送達ビヒクルは、ウイルスの複製またはパッケージングシグナルの起源のようなウイスル配列を含み得る。これらのウイルス配列は、アストロウイルス、コロナウイルス、オルトミクソウイルス、パポバウイルス、パラミクソウイルス、パルボウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、レトロウイルス、トガウイルスまたはアデノウイルスのようなウイルスから選択され得る。好ましい実施態様において、この遺伝子送達ビヒクルは、組換えレトロウイルスベクターである。組換えレトロウイルスおよびそれらの種々の使用は、以下を含む多くの参考文献に記載されている；例えば、Ｍａｎｎら、Ｃｅｌｌ ３３：１５３、１９８３、ＣａｎｅおよびＭｕｌｌｉｇａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６３４９、１９８４、Ｍｉｌｌｅｒら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：５−１４、１９９０、米国特許番号第４，４０５，７１２号、同第４，８６１，７１９号、ならびに同第４，９８０，２８９号、ならびにＰＣＴ出願番号ＷＯ ８９／０２，４６８、同ＷＯ ８９／０５，３４９、ならびに同ＷＯ ９０／０２，８０６。多くのレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルは、例えば、以下に記載の例を含め本発明において利用され得る；ＥＰ ０，４１５，７３１；ＷＯ ９０／０７９３６；ＷＯ ９４／０３６２２；ＷＯ ９３／２５６９８；ＷＯ ９３／２５２３４；米国特許第５，２１９，７４０号；ＷＯ ９３１１２３０；ＷＯ ９３１０２１８；ＶｉｌｅおよびＨａｒｔ、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：３８６０−３８６４、１９９３；ＶｉｌｅおよびＨａｒｔ、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：９６２−９６７、１９９３；Ｒａｍら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：８３−８８、１９９３；Ｔａｋａｍｉｙａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．３３：４９３−５０３、１９９２；Ｂａｂａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７９：７２９−７３５、１９９３（米国特許第４，７７７，１２７号、ＧＢ ２，２００，６５１、ＥＰ ０，３４５，２４２、ならびにＷＯ ９１／０２８０５）。
【００７５】
特定の好ましいレトロウイルスは、ニワトリ白血病ウイルス（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−５３５およびＶＲ−２４７）、ウシ白血病ウイルス（ＶＲ−１３１５）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、ミンク細胞フォーカス形成ウイルス（Ｋｏｃｈら、Ｊ．Ｖｉｒ．４９：８２８、１９８４；およびＯｌｉｆｆら、Ｊ．Ｖｉｒ．４８：５４２、１９８３）、マウス肉腫ウイルス（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−８４４、４５０１０および４５０１６）、細網内皮症ウイルス（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−９９４、ＶＲ−７７０および４５０１１）、ラウス肉腫ウイルス、メイソン‐パイツァーサルウイルス、ヒヒ内因性ウイルス、内因性ネコレトロウイルス（例えば、ＲＤ１１４）、ならびにレトロウイルスベクターとして使用されるマウスもしくはラットｇＬ３０配列を含むレトロウイルス由来である。
【００７６】
組換えレトロウイルスが産生され得るＭＬＶの特定の好ましい株は、４０７０Ａおよび１５０４Ａ（ＨａｒｔｌｅｙおよびＲｏｗｅ、Ｊ．Ｖｉｒ．１９：１９、１９７６）、アーベルソン（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−９９９）、フレンド（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−２４５）、グラフィ（Ｒｕら、Ｊ．Ｖｉｒ．６７：４７２２、１９９３；およびＹａｎｔｃｈｅｖ Ｎｅｏｐｌａｓｍａ ２６：３９７．１９７９）、グロス（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−５９０）、キルステン（Ａｌｂｉｎｏら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６４：１７１０、１９８６）、ハーベイ肉腫ウイルス（Ｍａｎｌｙら、Ｊ．Ｖｉｒ．６２：３５４０、１９８８；およびＡｌｂｉｎｏら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６４：１７１０、１９８６）、ならびにラウシャー（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−９９８）、ならびにモロニーＭＬＶ（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−１９０）を含む。
【００７７】
特定の好ましい非マウスレトロウイルスは、ラウス肉腫ウイルスである。好ましいラウス肉腫ウイルスは、Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ（Ｍａｎｌｙら、Ｊ．Ｖｉｒ．６２：３５４０，１９８８；およびＡｌｂｉｎｏら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６４：１７１０，１９８６）、高力価ブライアン（Ｂｒｙａｎ）株（例えば、ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−３３４、ＶＲ−６５７、ＶＲ−７２６、ＶＲ−６５９およびＶＲ−７２８）、スタンダードブライアン株（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−１４０）、Ｃａｒｒ−Ｚｉｌｂｅｒ（Ａｄｇｉｇｈｉｔｏｖら、Ｎｅｏｐｌａｓｍａ２７：１５９，１９８０）、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ（Ｌａｕｒｅｎｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ９０８：２４１、１９８７）、Ｈａｒｒｉｓ、Ｐｒａｇｕｅ（例えば、ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−７７２および４５０３３）、ならびにＳｃｈｍｉｄｔ−Ｒｕｐｐｉｎ（例えばＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−７２４、ＶＲ−７２５、ＶＲ−３５４）ウイルスを含む。
【００７８】
任意の上記のレトロウイルスは、本明細書中に与えられる開示および当該分野で公知の標準組換え技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、およびＫｕｎｋｌｅ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：４８８、１９８５）によって、レトロウイルス遺伝子送達ビヒクルをアセンブリまたは構築するために容易に利用され得る。レトロウイルス発現ベクターの一部分は、異なるレトロウイルス由来であり得る。例えば、レトロベクターＬＴＲは、マウス肉腫ウイルス、ラウス肉腫ウイルス由来のｔＲＮＡ結合部位、マウス白血病ウイルス由来のパッケージングシグナル、およびニワトリ白血病ウイルスからの第二鎖合成の起点由来であり得る。これらの組換えレトロウイルスベクターは、形質導入コンピテントレトロウイルスベクター粒子を適切なパッケージング細胞株に導入することによって、それらを生成するために使用され得る（１９９１年１１月２９日に出願されたシリアル番号０７／８００，９２１号を参照のこと）。組換えレトロウイルスは産生され、これは組換えレトロウイルスゲノムを宿主細胞ＤＮＡの特定の領域に部位特異的に組込むことを指向する。このような部位特異的組込みは、レトロウイルス粒子に組込まれたキメラインテグラーゼによって媒介され得る（１９９５年５月２２日に出願されたシリアル番号０８／４４５，４６６を参照のこと）。組換えウイルス遺伝子送達ビヒクルは、複製欠陥組換えウイルスであることが好ましい。
【００７９】
上記のレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルを用いた使用に適切なパッケージング細胞株は、容易に調製され得（１９９４年５月９日に出願したシリアル番号０８／２４０，０３０を参照のこと；ＷＯ ９２／０５２６６もまた参照のこと）、そして組換えウイルス粒子の生成のための生成細胞株（ベクター細胞株または「ＶＣＬ」ともいう）を作製するために使用され得る。本発明の特定の好ましい実施態様において、パッケージング細胞株は、ヒト（例えばＨＴ１０８０細胞）またはミンク親細胞株から作製される。それによって、ヒト血清中において不活性のままでいられ得る組換えレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルの作製が可能となる。組換えレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルの構築物は、ＷＯ ９１／０２８０５に詳細に記載される。これらの組換えレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルは、それらを適切なパケージング細胞株に導入することによって形質導入コンピテントレトロウイルス粒子を生成するために使用され得る（シリアル番号０７／８００，９２１を参照のこと）。同様にアデノウイルス遺伝子送達ビヒクルはまた、容易に調製され得、そして本明細書中に提供される開示により利用され得る（Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６−６２７，１９８８およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４、１９９１、ＷＯ ９３／０７２８３、ＷＯ ９３／０６２２３、およびＷＯ ９３／０７２８２もまた参照のこと）。
【００８０】
遺伝子送達ビヒクルはまた、組換えアデノウイルス遺伝子送達ビヒクルであり得る。このようなビヒクルは、容易に調製され得、そして本明細書中に提供される開示より利用され得る（Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６、１９８８、およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１、１９９１、ＷＯ ９３／０７２８３、ＷＯ ９３／０６２２３、およびＷＯ ９３／０７２８２を参照のこと）。アデノ随伴ウイルス遺伝子送達ビヒクルもまた構築され得、そして本発明のタンパク質またはポリヌクレオチドを細胞にインビトロもしくはインビボで送達するために使用され得る。インビトロでのアデノ随伴ウイルス遺伝子送達ビヒクルの使用は、Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８：１４８５−１４８８（１９９２）、Ｗａｌｓｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９：７２５７−７２６１（１９９２）、Ｗａｌｓｈら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１４４０−１４４８（１９９４）、Ｆｌｏｔｔｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３７８１−３７９０（１９９３）、Ｐｏｎｎａｚｈａｇａｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：７３３−７３８（１９９４）、Ｍｉｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：１０１８３−１０１８７（１９９４）、Ｅｉｎｅｒｈａｎｄら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：３３６−３４３（１９９５）、Ｌｕｏら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２３：１２６１−１２６７（１９９５）、およびＺｈｏｕら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：２２３−２２９（１９９６）に記載される。これらのビヒクルのインビボでの使用は、Ｆｌｏｔｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：１０６１３−１０６１７（１９９３）およびＫａｐｌｉｔｔら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．８：１４８−１５３（１９９４）に記載される。
【００８１】
本発明の別の実施態様において、遺伝子送達ビヒクルは、トガウイルス由来である。好ましいトガウイルスは、アルファウイルス、特に米国シリアル番号０８／４０５，６２７（１９９５年３月１５日に出願された、ＷＯ ９５／０７９９４）に記載されるアルファウイルスを含む。シンドビスウイルスおよびＥＬＶＳウイルスを含むアルファウイルスは、本発明のポリヌクレオチドのための遺伝子送達ビヒクルであり得る。アルファウイルスは、ＷＯ ９４／２１７９２、ＷＯ ９２／１０５７８およびＷＯ ９５／０７９９４に記載される。いくつかの異なるアルファウイルス遺伝子送達ビヒクル系が構築され得、そして本発明に従ってポリヌクレオチドを細胞へ送達するために使用され得る。このような系の代表的な例は、米国特許第５，０９１，３０９号および同第５，２１７，８７９号において記載される系を含む。特に、本発明における使用のための特に好ましいアルファウイルス遺伝子送達ビヒクルは、ＷＯ ９５／０７９９４、および米国シリアル番号０８／４０５，６２７に記載されるビヒクルを含む。
【００８２】
好ましくは、組換えウイルスビヒクルは、シンドビスウイルスに基づく組換えアルファウイルスのウイスルビヒクルである。シンドビス構築物、ならびに多くの類似構築物は、米国シリアル番号０８／１９８，４５０に記載のように、基本的には容易に調製され得る。シンドビスウイルス性遺伝子送達ビヒクルは、代表的には、シンドビスウイルスの転写を開始し得る５’配列、シンドビス非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列、フラグメントの転写を妨げるために不活性化されるウイルス結合領域、およびシンドビスＲＮＡポリメラーゼ認識配列を含む。必要に応じて、ポリヌクレオチドの転写は減少され、増加され、または維持されるように、ウイルス結合領域が、改変され得る。当業者に理解されるように、他のアルファウイルス由来の対応する領域は、上記の領域との代わりに使用され得る。
【００８３】
アルファウイルス由来遺伝子送達ビヒクルのウイルス結合領域は、ポリヌクレオチドの転写を妨げるために不活性化された第１のウイルス結合領域、およびポリヌクレオチドの転写が減少されるように改変された第２のウイルス結合領域を含み得る。アルファウイルス由来ビヒクルはまた、ｃＤＮＡ由来のウイルスＲＮＡの合成を開始し得る５’プロモーター、および転写終止を制御する３’配列を含み得る。
【００８４】
本発明において利用され得る他の組換えトガウイルス遺伝子送達ビヒクルは、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−１２４７）、ミッデルブルグウイルス（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−３７０）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−１２４６）、ヴェネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ９２３；ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−１２４９；ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−５３２）由来のビヒクル、ならびに米国特許第５，０９１，３０９号および同第５，２１７，８７９号およびＷＯ ９２／１０５７８に記載のビヒクルを含む。上記のシンドビスビヒクル、ならびに多くの類似構築物は、米国シリアル番号０８／１９８，４５０に記載されるように本質的には容易に調製され得る。
【００８５】
本発明における使用に適する他のウイルス遺伝子送達ビヒクルは、例えば、ポリオウイスル（Ｅｖａｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３３９：３８５、１９８９、ならびにＳａｂｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ １：１１５、１９７３）（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−５８）；ライノウイルス（Ａｒｎｏｌｄら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｌ４０１、１９９０）（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−１１１０）；カナリア痘ウイルスまたはワクシニアウイルスのようなポックスウイルス（Ｆｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈら、ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：３１７、１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５６９：８６、１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ ８：１７、１９９０；米国４，６０３，１１２および米国４，７６９，３３０；ＷＯ ８９／０１９７３）（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−１１１；ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−２０１０）；ＳＶ４０（Ｍｕｌｌｉｇａｎら、Ｎａｔｕｒｅ ２７７：１０８、１９７９）（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−３０５）、（Ｍａｄｚａｋら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒ．７３：１５３３、１９９２）；インフルエンザウイルス（Ｌｕｙｔｊｅｓら、Ｃｅｌｌ ５９：１１０７、１９８９；ＭｃＭｉｃｈｅａｌら、Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３０９：１３、１９８３；ならびにＹａｐら、Ｎａｔｕｒｅ ２７３：２３８、１９７８）（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−７９７）；アデノ随伴ウイルスのようなパルボウイルス（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒ．６３：３８２２、１９８９、およびＭｅｎｄｅｌｓｏｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６６：１５４，１９８８）（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−６４５）；単純ヘルペスウイルス（Ｋｉｔら、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２１５：２１９、１９８９）（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−９７７；ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−２６０）；Ｎａｔｕｒｅ ２７７：１０８、１９７９）；ヒト免疫不全ウイルス（ＥＰＯ３８６，８８２、Ｂｕｃｈｓｃｈａｃｈｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒ．６６：２７３１，１９９２）；麻疹ウイルス（ＥＰＯ ４４０，２１９）（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−２４）；Ａ（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−１２４７），アウラ（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−３６８）、ベバルウイルス（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−６００；ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−１２４０）、Ｃａｂａｓｓｏｕ（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−９２２）、チクングニヤウイルス（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−６４；ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−１２４１）、Ｆｏｒｔ Ｍｏｒｇａｎ（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−９２４）、ゲタウイルス（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−３６９；ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−１２４３）、Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈ（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−９２７）、マヤロ（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−６６）、ムカンボウイルス（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−５８０；ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−１２４４）、ヌヅム（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−３７１）、ピクスナウイルス（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−３７２；ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−１２４５）、Ｔｏｎａｔｅ（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−９２５）、トリニティ（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−４６９）、ユナ（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−３７４）、ワタノワ（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−９２６）、Ｙ−６２−３３（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−３７５）、オニオンウイルス、東部脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−６５；ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−１２４２）、西部脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−７０；ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−１２５１；ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−６２２；ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−１２５２）ならびにコロナウイルス（Ｈａｍｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１２１：１９０，１９６６）（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−７４０）由来のビヒクルを含む。
【００８６】
本発明のポリヌクレオチドはまた、縮合試薬と組み合わされ得、そして遺伝子送達ビヒクルを形成し得る。好ましい実施態様において、縮合試薬は、ポリカチオン（例えば、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、プロタミン、スペルミン、スペルミジン、およびプトレッシン）である。このような結合を生成する多くの適切な方法は、当該分野において公知である（例えば、１９９４年１２月３０日に出願されたシリアル番号０８／３６６，７８７を参照のこと）。
【００８７】
代わりの実施態様において、ポリヌクレオチドは、リポソームと会合して、遺伝子送達ビヒクルを形成する。リポソームは、脂質二重層により囲まれた水性区画から構成される小さな、脂質小胞であり、代表的には球状であり、または直径数百オングストロームのわずかに伸長された構成物である。適切な条件下で、リポソームは、細胞の原形質膜と融合し得るか、またはリポソームをインターナリゼーションした細胞内のエンドサイトーシスな小胞の膜と融合し得、それによって、細胞質へその内容物を放出する。しかし、細胞の表面と相互作用する前に、リポソーム膜は、その内容物を、例えば、分解性酵素から分離しそして保護する比較的不透過性のバリアとして作用する。
【００８８】
リポソームは、合成構造であるため、所望の特徴を組込んだ、特に設計されたリポソームが生成される。Ｓｔｒｙｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２３６〜２４０頁、１９７５（Ｗ．Ｈ.Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）；Ｓｚｏｋａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ６００：１，１９８０；Ｂａｙｅｒら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．５５０：４６４，１９７９；Ｒｉｖｎａｙら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１４９：１１９，１９８７；Ｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：７８５１，１９８７、Ｐｌａｎｔら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７６：４２０，１９８９，ならびに米国特許第４，７６２，９１５号を参照のこと。リポソームは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、および本発明で開示されるポリヌクレオチドのようなポリヌクレオチドを含む発現構築物を含む種々の核酸分子をカプセル化し得る。
【００８９】
本発明における使用のためのリポソーム調製物には、カチオン性（正に荷電した）、アニオン性（負に荷電した）、および中性調製物が挙げられる。カチオン性リポソームは、プラスミドＤＮＡ（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１６，１９８７）、ｍＲＮＡ（Ｍａｌｏｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：６０７７−６０８１、１９８９）、および精製された転写因子（Ｄｅｂｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１０１８９−１０１９２，１９９０）の細胞内伝達を機能的形態において媒介するために、示される。カチオン性リポソームは、容易に入手可能である。例えば、Ｎ［１−２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）リポソームは、登録商標リポフェクチン（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹより）の名の下で入手可能である。Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：５１４８−５１５２．８７，１９９４もまた参照のこと。他の市販のリポソームには、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｃｅ（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ）が挙げられる。他のカチオン性リポソームは、当該分野において周知の技術を使用して、入手可能な物質から容易に調製され得る。例えば、ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）リポソームの合成の説明について、Ｓｚｏｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：４１９４−４１９８、１９７８；およびＷＯ ９０／１１０９２を参照のこと。
【００９０】
同様に、アニオン性および中性のリポソームが、例えば、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）から、容易に入手可能であるか、または容易に入手可能な物質を用いて容易に調製され得る。このような物質として、とりわけ、ホスファチジルコリン、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）が挙げられる。これらの物質はまた、出発物質ＤＯＴＭＡおよびＤＯＴＡＰと適切な比率で混合され得る。これらの物質を使用するリポソームの製造方法は、当該分野において周知である。
【００９１】
このリポソームは、多重ラメラ小胞（ＭＬＶ）、単ラメラ小胞（ＳＵＶ）、または大単ラメラ小胞（ＬＵＶ）を含む。この種々のリポソーム−核酸複合体は、当該分野において公知の方法を用いて調製される。例えば、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら、ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（１９８３）、１０１巻、５１２−５２７頁；Ｓｚｏｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：３４１０−３４１４、１９９０；Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ３９４：４８３，１９７５；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ １７：７７，１９７９；ＤｅａｍｅｒおよびＢａｎｇｈａｍ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ４４３：６２９，１９７６；Ｏｓｔｒｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．７６：８３６，１９７７；Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：３３４８，１９７９；ＥｎｏｃｈおよびＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：１４５，１９７９；Ｆｒａｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：１０４３１，１９８０；ＳｚｏｋａおよびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１４５，１９７９；およびＳｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１５：１６６，１９８２、を参照のこと。
【００９２】
さらに、リポタンパク質が、細胞への送達に関する本発明のポリヌクレオチドと共に含まれ得る。このようなリポタンパク質の例としては、キロミクロン、ＨＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬ、およびＶＬＤＬが挙げられる。これらのタンパク質の変異体、フラグメント、または融合体もまた、用いられ得る。アセチル化ＬＤＬのような、天然に存在するリポタンパク質の改変体もまた、用いられ得る。これらのリポタンパク質は、リポタンパク質レセプターを発現する細胞へのポリヌクレオチドの送達を標的にし得る。好ましくは、リポタンパク質が、ポリヌクレオチドと共に含まれる場合、他の標的リガンドは、この組成物に含まれない。
【００９３】
別の実施態様において、ＷＯ ９０／１１０９２および米国特許第５，５８０，８５９号に記載されるように、裸のポリヌクレオチド分子が、遺伝子送達ビヒクルとして用いられ得る。このような遺伝子送達ビヒクルは、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかであり得、特定の実施態様においては、死菌アデノウィルスと連結される。Ｃｕｒｉｅｌら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．３：１４７−１５４，１９９２。他の適切なビヒクルとしては、ＤＮＡ−リガンド（Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１６９８５−１６９８７，１９８９）、脂質−ＤＮＡ組み合わせ体（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７，１９８９）、リポソーム（Ｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：７８５１−７８５５，１９８７）およびマイクロプロジェクティル（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：２７２６−２７３０，１９９１）が挙げられる。
【００９４】
生分解性ラテックスビーズ上にこのポリヌクレオチドをコーティングすることにより、細胞内への裸のポリヌクレオチド取り込みの効率を増加し得る。このアプローチは、ラテックスビーズが、培養中の細胞と共にインキュベートされる場合、この細胞の核周囲の領域に有効に輸送および濃縮されるという知見を利用する。次いで、筋肉内に注射される場合、このビーズは細胞内へ輸送される。ポリヌクレオチドをコーティングしたラテックスビーズは、エンドサイトーシスが、このラテックスビーズにより開始された後、細胞中へ効率的に輸送されるので、遺伝子移入および発現効率を増大する。この方法は、ビーズを処理してこれらの疎水性を増大することにより、さらに改良され得、それによりエンドソームの分裂および細胞質内へのポリヌクレオチドの放出を促進する。
【００９５】
本発明はまた、乳房または結腸の組織サンプルのような、生物学的サンプル中の転移性マーカー遺伝子の発現を検出する方法を提供する。転移性マーカー遺伝子の発現の検出は、例えば、転移性組織の同定および組織の転移の可能性の同定に関して、身体の他の器官内での転移性癌の進行の危険性のある患者を同定するために有用である。
【００９６】
この組織サンプルは、例えば、固体組織または液体サンプルであり得る。タンパク質または核酸の発現産物は、組織サンプル中で検出され得る。１つの実施態様において、この組織サンプルは、転移性マーカータンパク質の存在に関してアッセイされる。この転移性マーカータンパク質は、配列番号１〜１８を含むポリヌクレオチドによりコードされる配列を有し、かつ本発明の転移性マーカータンパク質に特異的な抗体を用いて検出され得る。この抗体は、例えば、放射活性、蛍光、ビオチン化、または酵素学的タグで標識化され得、そして直接的に検出されるか、または（標識化した二次抗体を使用する）間接的な免疫化学的方法を用いて検出され得る。この転移性マーカータンパク質の存在は、（例えば、免疫細胞化学によって組織切片において、または溶解物中において、当該分野において公知であるようなウェスタンブロットを用いて）アッセイされ得る。
【００９７】
別の実施態様において、組織サンプルは転移性マーカータンパク質ｍＲＮＡの存在に関してアッセイされる。転移性マーカータンパク質ｍＲＮＡは、組織切片中のインサイチュハイブリダイゼーションまたはポリＡおよびｍＲＮＡを含むノーザンブロットにより検出され得る。転移性マーカータンパク質に特異的なプローブは、配列番号１〜１８に開示されるｃＤＮＡ配列を用いて生成され得る。このプローブは、８、１０、１１、１２、２０、２５、３０、３５、４０、４５、６０、７５、または１００ヌクレオチドの長さであり得るが、これらは、好ましくは１５〜５０ヌクレオチドの長さである。これらのプローブは、化学的に合成され得るか、または制限酵素を使用して、より長いポリヌクレオチドから生成され得る。これらのプローブは、例えば、放射活性、ビオチン化、または蛍光タグで、標識化され得る。所望される場合、この組織サンプルは、核酸増幅プロセスに供され得る。
【００９８】
配列番号１、４、１１、１６、１７、または１８を含むポリヌクレオチドの発現産物が検出される組織サンプルは、転移性か、または転移の可能性を有すると同定される。配列番号２、３、６、７、８、９、１０、１２、１３、または１５を含むポリヌクレオチドの発現産物が同定される組織サンプルは、転移性では無いか、または低い転移の可能性を有すると同定される。
【００９９】
結腸腫瘍の高いグレードまたは低いグレードの転移に関する傾向がまた、結腸腫瘍サンプルにおける配列番号１６または１７のヌクレオチド配列を含む遺伝子の発現産物を測定することによって予想され得る。配列番号１６のヌクレオチド配列を含む遺伝子の産物を発現する結腸腫瘍サンプルは、転移する高い傾向を有するものとして分類される。配列番号１７のヌクレオチド配列を含む遺伝子の産物を発現する結腸腫瘍サンプルは、転移する低い傾向を有するものとして分類される。
【０１００】
必要に応じて、組織サンプル中の特定の転移性マーカー発現産物のレベルが、定量され得る。定量は、例えば、組織サンプル中で検出される発現産物のレベルを、検量線中に存在する産物の量とを比較することによって達成され得る。比較は、視覚的または（コンピューター化された補助を伴うか、または伴わない）デンシトメトリーのような技術を用いて行われ得る。コントロールとしての使用のために、組織サンプルは、他のヒト、検査される患者の他の非癌性器官、または好ましくは、検査される患者由来の非転移性乳癌または結腸癌から単離され得る。
【０１０１】
本発明の転移性マーカー特異的試薬をコードするポリヌクレオチド（例えば、抗体プローブおよびヌクレオチドプローブ）は、生物学的サンプルにおいてこれらを検出するためのキットで供給され得る。このキットはまた、緩衝液または標識化成分、ならびに生物学的サンプル中の転移性マーカー発現産物を検出するための試薬を用いる指示を含み得る。
【０１０２】
細胞中の転移性マーカー遺伝子の発現は、所望により、増加され得るか、または減少され得る。転移性マーカー遺伝子の発現は、以下に記載されるように治療を目的に改変され得るか、または治療薬を同定するために用いられ得る。
【０１０３】
本発明の１つの実施態様において、転移性のマーカー遺伝子の発現が転移性の癌においてアップレギュレートされるその発現は、リボザイム（触媒活性を有するＲＮＡ分子）を用いて低下される。例えば、Ｃｅｃｈ，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：１５３２−１５３９：Ｃｅｃｈ，１９９０，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：５４３−５６８；Ｃｅｃｈ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：６０５−６０９；ＣｏｕｔｕｒｅおよびＳｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，１９９６，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１２：５１０−５１５を参照のこと。当該分野において公知であるように（例えば、Ｈａｓｅｌｏｆｆら、米国特許第５，６４１，６７３号）、リボザイムは、ＲＮＡ配列の切断により遺伝子機能を阻害するために用いられ得る。
【０１０４】
この転移性マーカー遺伝子のコード配列は、転移性マーカー遺伝子から転写されるｍＲＮＡに対して特異的に結合するリボザイムを生成するために用いられ得る。高度に配列特異性な様式において、他のＲＮＡ分子をトランスに切断し得るリボザイムの設計方法および構築方法が、当該分野において開発ならびに記載されている（Ｈａｓｅｌｏｆｆら、（１９８８），Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５８５−５９１を参照のこと）。例えば、リボザイムの切断活性は、このリボザイム中の別々の「ハイブリダイゼーション」領域を操作することによって特定のＲＮＡを標的とし得る。このハイブリダイゼーション領域は、この標的ＲＮＡに対して相補的な配列を含み、それによって標的に特異的にハイブリダイズする（例えば、Ｇｅｒｌａｃｈら、欧州特許第３２１，２０１号を参照のこと）。より長い相補的配列は、この標的に対するハイブリダイゼーション配列の親和性を増大するために用いられ得る。このリボザイムのハイブリダイゼーションおよび切断領域は、一体的に関与され得る；従って、相補的な領域をによる標的ＲＮＡに対するハイブリダイゼーションに際し、このリボザイムの触媒領域は、標的を切断し得る。
【０１０５】
当該分野で公知であるように、リボザイムは、ＤＮＡ構築物の一部分として細胞中へ導入され得る。このＤＮＡ構築物はまた、転写調節エレメント（例えば、細胞中のこのリボザイムの転写の制御に関する、プロモーターエレメント、エンハンサーまたはＵＡＳエレメント、および転写ターミネーターシグナル）を含み得る。
【０１０６】
上記のように、機械的方法（例えば、マイクロインジェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、またはリン酸カルシウム沈殿）は、細胞の分裂が低減されることを所望される細胞中へリボザイム含有ＤＮＡ構築物を導入するために用いられ得る。あるいは、ＤＮＡ構築物が、細胞によって安定に保持されることが所望される場合、当該分野において公知であるように、このＤＮＡ構築物は、プラスミド上に供給され得、そして別々のエレメントとして保持され得るか、または細胞のゲノムへ組み込まれ得る。
【０１０７】
Ｈａｓｅｌｏｆｆら、米国特許第５，６４１，６７３号において教示されるように、リボザイムは、その発現が、転移性マーカー遺伝子の発現を誘導する因子に対する応答を生じるように操作され得る。このリボザイムはまた、さらなるレベルの調節を提供するために操作され得、その結果、このリボザイムおよび転移性マーカー遺伝子の両方が細胞中で誘導される場合にのみ、ｍＲＮＡの破壊が生じる。
【０１０８】
転移性マーカー遺伝子の発現はまた、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列を用いて改変され得る。このアンチセンス配列は、配列番号１〜１８に示されるヌクレオチド配列を有する転移性マーカー遺伝子のコード配列の少なくとも一部分に対して相補的である。配列番号１〜１８に示されるヌクレオチド配列の相補物は、配列番号１〜１８に示される連続した配列のヌクレオチドとワトソン−クリック塩基対を形成する連続した配列のヌクレオチドから成る。
【０１０９】
好ましくは、このアンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、少なくとも６ヌクレオチドの長さであるが、約８、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ヌクレオチドの長さであり得る。より長い配列もまた、用いられ得る。上記のように、アンチセンスオリゴヌクレオチド分子は、ＤＮＡ構築物中に提供され得、ならびに細胞分裂が減少されるべきである細胞中へと導入され得る。
【０１１０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、または両方の組み合わせで構成され得る。オリゴヌクレオチドは、手動または自動合成機によって、１つのヌクレオチドの５’末端を、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、アルキルホスホネート、ホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅｓ）、リン酸エステル、カルバメート、アセトアミデート（ａｃｅｔｏａｍｉｄａｔｅ）、カルボキシメチルエステル、カーボネート、およびリン酸トリエステルのような、非リン酸ジエステルのヌクレオチド間結合を有する別のヌクレオチドの３’末端と共有結合することにより合成され得る。Ｂｒｏｗｎ，１９９４，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０：１−８；Ｓｏｎｖｅａｕｘ，１９９４，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６：１−７２；Ｕｈｌｍａｎｎら、１９９０，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０：５４３−５８３を参照のこと。
【０１１１】
正確な相補性は、アンチセンス分子と転移性マーカー遺伝子の相補的コード配列との間に成功した二重鎖の形成を必要としない。例えば、隣接したコード遺伝子に対して相補的ではない連続したヌクレオチドのストレッチにより、それぞれ分離された転移性マーカー遺伝子のコード配列の一部分に対して正確に相補的な、連続したヌクレオチドの２、３，４または５、あるいはそれ以上のストレッチを含むアンチセンス分子は、転移性マーカー遺伝子のｍＲＮＡに対して特異的な標的化を提供し得る。好ましくは、連続したヌクレオチドのそれぞれのストレッチは、少なくとも、４、５，６、７、または８、あるいはそれ以上の長さのヌクレオチドである。非相補的介在配列は、好ましくは、１、２、３、または４ヌクレオチドの長さである。当業者は、アンチセンス−センスペアの計算された融点を容易に利用し得、特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドと特定の転移性マーカー遺伝子コード配列との間で許容されるミスマッチの程度を決定する。
【０１１２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、転移性マーカータンパク質のコード配列に対してハイブリダイゼーションするそれらの能力に影響を与えることなしに改変され得る。これらの改変は、アンチセンス分子の内部か、あるいは片方または両方の末端に存在し得る。例えば、ヌクレオチド間のリン酸結合は、アミノ基と末端リボースとの間で変化する数の炭素残基を有するコレステリル部分またはジアミン部分の付加によって改変され得る。改変塩基および／または糖（例えば、リボースの代わりにアラビノ−ス、あるいは３’水酸基または５’リン酸基が置換されている３’，５’−置換オリゴヌクレオチド）もまた、改変アンチセンスオリゴヌクレオチドに利用され得る。これらの改変オリゴヌクレオチドは、当該分野で周知の方法により調製され得る。Ａｇｒａｗａｌら、１９９２，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：１５２−１５８；Ｕｈｌｍａｎｎら、１９９０，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０：５４３−５８４；Ｕｈｌｍａｎｎら、１９８７，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２１５：３５３９−３５４２。
【０１１３】
転移性マーカータンパク質に特異的に結合する本発明の抗体はまた、転移性マーカー遺伝子の発現を改変するために用いられ得る。特異的抗体は、転移性マーカータンパク質に結合し、そしてこのタンパク質を細胞中で機能しないようにする。上記のように、本発明の特異的抗体をコードするポリヌクレオチドは、細胞中に導入され得る。
【０１１４】
転移細胞中でダウンレギュレートされる転移性マーカー遺伝子の発現を増大するために、全てのまたは一部分の転移性マーカー遺伝子または発現産物は、細胞中へ導入され得る。必要に応じて、この遺伝子または発現産物は、薬学的に受容可能なキャリアを含む治療用組成物の構成要素であり得る（以下を参照のこと）。上記のようにコード配列の全体が導入され得る。あるいは、転移性マーカータンパク質、またはそれをコードするヌクレオチド配列の一部分が、細胞中へ導入され得る。
【０１１５】
細胞中の内因性転移性マーカー遺伝子の発現はまた、内因性転移性マーカー遺伝子とフレームが合って、ＤＮＡ構築物を含む相同的組換え細胞が形成されるような相同組換えによって、転移性マーカータンパク質の標的配列、調節配列、エキソン、および不対のスプライス供与部位を含むＤＮＡ構築物を導入することによって改変され得る。この新しい転写ユニットは、転移性マーカー遺伝子を所望されるようにオンまたはオフするために用いられ得る。内因性遺伝子発現に影響するこの方法は、米国特許第５，６４１，６７０号に教示されている。
【０１１６】
この標的配列は、配列番号１〜１８に示されるヌクレオチド配列から選択される、少なくとも１０、１２、１５，２０、または５０の連続したヌクレオチドのセグメントである。転写ユニットは、内因性転移性マーカータンパク質遺伝子のコード配列の上流に位置される。内因性の調節配列は、転移性マーカー遺伝子のコード配列の転写を指示する。
【０１１７】
本発明の転移性マーカータンパク質の発現は、治療的抗転移効果を有する薬物に関するスクリーニングに用いられ得る。転移性マーカータンパク質の合成に対する試験化合物の効果もまた、転移を調製する試験化合物の同定に用いられ得る。生物学的サンプル（例えば、細胞培養、組織サンプル、または無細胞ホモジネート）中の転移性マーカータンパク質の合成は、当該分野において公知のタンパク質合成の測定のための任意の手段（例えば、タンパク質中への標識アミノ酸の取り込み、およびポリアクリルアミドゲルにおける標識転移性マーカータンパク質の検出）によって測定され得る。転移性マーカータンパク質の量は、例えば、ウェスタンブロットにおける本発明の転移性マーカータンパク質に特異的な抗体を用いて検出され得る。試験化合物の存在下または非存在下で合成された転移性マーカータンパク質の量は、当該分野において公知の任意の手段（例えば、合成された転移性マーカータンパク質の量と、検量線に存在する転移性マーカータンパク質の量との比較）により決定され得る。
【０１１８】
当該分野において公知であるように、転移性マーカータンパク質の合成に対する試験化合物の効果はまた、ノーザンブロット分析により、本発明の転移性マーカータンパク質に特異的なヌクレオチドプローブを用いて試験化合物に応答する転移性マーカータンパク質のｍＲＮＡ発現の量を測定することによって測定され得る。配列番号１、４、１１、１６、１７、または１８を含むポリヌクレオチドによりコードされる転移性マーカータンパク質の合成を減少するか、あるいは配列番号２、３、６、７、８、９、１０、１２、１３、または１５を含むポリヌクレオチドによりコードされる転移性マーカータンパク質の合成を増加する試験化合物は、可能な治療薬として同定される。
【０１１９】
代表的には、生物学的サンプル（例えば、乳房サンプルまたは結腸サンプル）は、この試験化合物の濃度範囲（例えば、１．０ｎＭ、５．０ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭ、１ｍＭ、１０ｍＭ、５０ｍＭ、および１００ｍＭ）と接触される。好ましくは、この試験化合物は、転移性マーカータンパク質の発現を６０％、７５％、または８０％まで増加するか、または減少する。より好ましくは、８５％、９０％、９５％、または９８％の増加または減少が達成される。
【０１２０】
本発明は、転移性マーカータンパク質の発現の増加または減少に関して適切であるような治療用組成物を提供する。転移性マーカー遺伝子発現を増加するための治療用組成物は、転移細胞においてダウンレギュレートされる転移性マーカーに望ましい。これらは、転移性マーカータンパク質の遺伝子の発現産物の全部または一部をコードするポリヌクレオチドを含む。好ましくは、この治療用組成物は、プロモーターおよび転移性マーカータンパク質の少なくとも６つの連続したアミノ酸をコードするポリヌクレオチドセグメントを含む発現構築物を含む。発現構築物の内で、ポリヌクレオチドセグメントはプロモーターの下流に位置され、そしてポリヌクレオチドセグメントの転写は、このプロモーターで開始する。遺伝子移入ベクター（特に、レトロウィルスベクター）のより完全な記載は、米国特許出願番号第０８／８６９，３０９号に含まれる。
【０１２１】
転移性マーカー遺伝子の発現の減少は、この転移性マーカー遺伝子が、転移性の癌においてアップレギュレートされる条件下で所望される。これらの障害を処置するための治療用組成物は、本明細書で開示されるような、転移性マーカーのタンパク質発現産物と特異的に結合する薬剤をコードするポリヌクレオチドを含む。
【０１２２】
本発明の転移性マーカーの治療用組成物はまた、薬学的に受容可能なキャリアを含む。薬学的に受容可能なキャリアは、当該分野において周知である。このようなキャリアは、大きく、ゆっくりと代謝される高分子（例えば、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合体アミノ酸、アミノ酸コポリマー、および不活性ウィルス粒子）を含むが、これらに限定されない。薬学的に受容可能な塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、または硫酸塩のような無機酸の塩、ならびに酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、または安息香酸塩のような有機酸の塩）もまた、この組成物に用いられ得る。
【０１２３】
治療用組成物はまた、水、生理食塩水、グリセロール、およびエタノールのような液体、ならびに湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤のような物質を含み得る。米国特許第５，４２２，１２０号、ＷＯ９５／１３７９６、ＷＯ９１／１４４４５、または欧州特許第５２４，９６８Ｂ１に記載されるようなリポソームもまた、この治療用組成物のためのキャリアとして用いられ得る。
【０１２４】
代表的には、治療用転移性マーカー組成物は、液体溶液または懸濁液としてのいずれかで、注射可能なものとして調製される；しかし、溶液中、または懸濁液中、注射前の液体ビヒクルに適した固形もまた、調製され得る。転移性マーカー組成物もまた、（例えば、米国特許第４，８５３，２３０号、欧州特許第２２５，１８９号、豪州特許第９，２２４，２９６号および豪州特許第９，２３０，８０１号に記載されるような）当該分野において公知の方法に従って、腸溶コーティングの錠剤またはゲルカプセル中に処方され得る。
【０１２５】
本発明の転移性マーカー治療薬の投与は、注射、経口投与、微粒子銃（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｇｕｎ）、またはカテーテル法投与、および局所的投与を含む、局所投与または全身投与を含み得る。多様な方法が、身体における特定の部位に治療用転移性マーカー組成物を直接的に投与するために用いられ得る。
【０１２６】
例えば、腫瘍の処置のために、小さな腫瘍または転移性の病巣が位置付けされ得、そして治療用転移性マーカー組成物が、腫瘍の本体内のいくつかの異なる部位に数回注射され得る。あるいは、腫瘍の役に立つ動脈が同定され得、そして治療用組成物が、この組成物をこの腫瘍中へ直接的に送達するために、このような動脈中に注射され得る。
【０１２７】
壊死の中心を有する腫瘍は、吸引され得、そしてこの組成物が、たった今空になった腫瘍の中心に直接的に注射され得る。治療用転移性マーカー組成物は、腫瘍の表面に（例えば、この組成物の局所的な塗布によって）直接的に投与され得る。Ｘ線造像は、特定の上記の送達方法を補助するために用いられ得る。転移性マーカータンパク質、ポリペプチド、またはサブゲノムポリヌクレオチドおよび他の治療用薬剤を含む、治療用薬剤の組み合わせは、同時に、または経時的に投与され得る。
【０１２８】
レセプターに媒介される標的送達は、サブゲノムポリヌクレオチド、タンパク質、または特定の組織に対する、抗体、リボザイム、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドのような試薬を含む、治療用組成物を送達するために用いられ得る。レセプターに媒介される送達技術は、例えば、Ｆｉｎｄｅｉｓら（１９９３），Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１，２０２−０５；Ｃｈｉｏｕら（１９９４），ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＤＩＲＥＣＴ ＧＥＮＥ ＴＲＡＮＳＦＥＲ（Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆ編）；ＷｕおよびＷｕ（１９８８），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，６２１−２４；Ｗｕら（１９９４），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，５４２−４６；Ｚｅｎｋｅら（１９９０），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８７，３６５５−５９；Ｗｕら（１９９１），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，３３８−４２中に記載される。
【０１２９】
あるいは、転移性マーカー治療用組成物は、エクスビボでヒト細胞中へ導入され得、次いでこの細胞はヒトの中へ再配置され得る。細胞は、例えば、選択された腫瘍から、または罹患した器官からを含む種々の部位から取り出され得る。さらに、治療用組成物は、罹患していない、例えば、皮膚線維芽細胞、または末梢血白血球中へ挿入され得る。所望される場合、Ｔ細胞サブセットまたは幹細胞のような特定の細胞画分もまた、血液から特異的に取り出され得る（例えば、ＰＣＴ ＷＯ９１／１６１１６を参照のこと）。次に、この取り出された細胞は、任意の上記の技術を利用して転移性マーカー治療用組成物と接触され得、続いてこの細胞をヒトに（好ましくは、腫瘍の近傍または処置されるべき他の部位に、あるいはそれらの中に）へ戻される。上記の方法は、ヒトから腫瘍細胞を取り出すことに続き、線維芽細胞、または他の共雑物ではない腫瘍細胞を枯渇する工程、および／または（例えば、照射により）これらの細胞を不活性化する工程をさらに包含し得る。
【０１３０】
転移性マーカー組成物の用量および投与の手段の両方は、治療用組成物の特定の性質、患者の状態、年齢、および体重、この疾患の進行および他の関連する因子に基づき決定され得る。好ましくは、本発明の治療用組成物は、転移性マーカー遺伝子の発現を５０％、６０％、７０％、または８０％まで増加するか、または減少する。最も好ましくは、転移性マーカー遺伝子の発現は、９０％、９５％、９９％、または１００％まで増加するか、または減少する。転移性マーカー遺伝子の発現を改変するために選択されたメカニズムの有効性は、転移性マーカー遺伝子のｍＲＮＡに対するヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、または特異的抗体を用いる転移性マーカータンパク質の検出のような当該分野において周知の方法を用いて評価され得る。
【０１３１】
この組成物が、転移性マーカータンパク質、ポリペプチド、または抗体を含む場合、この組成物の有効用量は、患者の体重１ｋｇあたり約５μｇ〜約５０μｇ、１ｋｇあたり約５０μｇ〜約５ｍｇ、患者の体重１ｋｇあたり約１００μｇ〜約５００μｇ、および１ｋｇあたり約２００μｇ〜約２５０μｇの範囲内である。
【０１３２】
転移性マーカーのサブゲノムポリヌクレオチドを含む治療用組成物は、約１００ｎｇ〜約２００ｍｇの範囲のＤＮＡを、遺伝子治療のプロトコルにおいて局所投与するために投与され得る。約５００ｎｇ〜約５０ｍｇ、約１μｇ〜約２ｍｇ、約５μｇ〜約５００μｇ、および約２０μｇ〜約１００μｇの濃度範囲のＤＮＡもまた、遺伝子治療のプロトコルの間に用いられ得る。作用の方法および形質転換および発現効力のような因子は、転移性マーカータンパク質のサブゲノムポリヌクレオチドの究極の効力のために必要とされる投薬量に影響する考慮すべきことである。より高い発現が、組織のより広い範囲にわたり所望される場合、より大量の転移性マーカータンパク質のサブゲノムポリヌクレオチドであるか、または投与の連続的プロトコルにおいて再投与される同じ量であるか、あるいは、例えば、腫瘍部位の異なる隣接または近接組織の部分に対するいくつかの投与が、陽性の治療結果を行うために必要とされ得る。全ての場合において、臨床試験における慣用的実験が、最適な治療効果についての特定の範囲を決定する。
【０１３３】
本発明の転移性マーカーサブゲノムポリヌクレオチドはまた、ポリヌクレオチドアレイに使用され得る。ポリヌクレオチドアレイは、単一サンプルにおける多数のポリヌクレオチド配列をアッセイし得る高度処理技術を提供する。この技術は、例えば、転移性病巣を同定するため、または腫瘍の転移潜在性を評価するための診断用ツールとして使用され得る。
【０１３４】
アレイを作製するために、一本鎖ポリヌクレオチドプローブは、二次元マトリックスまたはアレイにおいて基質上にスポットされ得る。各一本鎖ポリヌクレオチドプローブは、配列番号１〜１８に示されるヌクレオチド配列から選択される少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、または３０以上の隣接ヌクレオチドを含み得る。好ましいアレイは、配列番号１、４、１１、１６、１７および１８に示されるヌクレオチド配列から選択される少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、または３０以上の隣接ヌクレオチドを含有する少なくとも１つの一本鎖ポリヌクレオチドプローブを含む。他の好ましいアレイは、配列番号２、３、６、７、９、１０、１２、１３および１５に示されるヌクレオチド配列から選択される少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、または３０以上の隣接ヌクレオチドを含有する少なくとも１つの一本鎖ポリヌクレオチドプローブを含む。なお他に好ましいアレイは、配列番号５および１４もしくは配列番号１６および１７に示されるようなヌクレオチド配列から選択される少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、または３０以上の隣接ヌクレオチドを含有する少なくとも１つの一本鎖ポリヌクレオチドプローブを含む。
【０１３５】
基質は、ポリヌクレオチドプローブが付着し得る任意の基質（ガラス、ニトロセルロース、シリコン、およびナイロンを含むがそれらに限定されない）であり得る。ポリヌクレオチドプローブはいずれかの共有結合により、または非特異的相互作用（例えば、疎水結合）により基質に結合され得る。アレイを構築する技術およびそれらのアレイを使用する方法は、ＥＰ番号第０ ７９９ ８９７号；ＰＣＴ番号ＷＯ ９７／２９２１２；ＰＣＴ番号ＷＯ ９７／２７３１７；ＥＰ番号第０ ７８５ ２８０；ＰＣＴ番号ＷＯ ９７／０２３５７；米国特許第５，５９３，８３９号；米国特許第５，５７８，８３２号；ＥＰ番号第０ ７２８ ５２０号；米国特許第５，５９９，６９５号；ＥＰ番号第０ ７２１ ０１６号；米国特許第５，５５６，７５２号；ＰＣＴ番号ＷＯ ９５／２２０５８；および米国特許第５，６３１，７３４号に記載されている。市販のポリヌクレオチドアレイ（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐＯ）もまた使用され得る。遺伝子発現を検出するためのＧｅｎｅＣｈｉｐＯの使用は、例えば、Ｌｏｃｋｈａｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：１６７５（１９９６）；Ｃｈｅｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：６１０（１９９６）；Ｈａｃｉａら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４：４４１、１９９６；およびＫｏｚａｌら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２：７５３、１９９６に記載されている。
【０１３６】
転移性が疑わしいまたは転移潜在性が未知の組織サンプルは、当該分野において公知のように、例えば、加熱または化学変性によって、一本鎖ポリヌクレオチドを形成するように処置され得る。次いで、組織サンプル中の一本鎖ポリヌクレオチドは標識され得、そしてアレイ上のポリヌクレオチドプローブにハイブリダイズされ得る。使用され得る検出可能な標識は、放射性標識、ビオチン化標識、発蛍光団（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒ）、および化学発光標識を含むがそれらに限定されない。ポリヌクレオチドプローブに結合した標識されたサンプルポリヌクレオチドを含む二本鎖ポリヌクレオチドはを、一旦サンプル中の非結合部分を洗い流して検出され得る。検出は、視覚的またはコンピューターの補助を伴うものであり得る。
【０１３７】
配列番号１〜４、１１、１６、１７、および１８からなる群から選択される隣接ヌクレオチドを含む二本鎖ポリヌクレオチドの検出、または配列番号２、３、６、７、８、９、１０、１２、１３、および１５からなる群から選択される隣接ヌクレオチドを含む二本鎖ポリヌクレオチドの検出の欠如は、転移性としてまたは転移潜在性を有するものとして組織サンプルを同定する。
【０１３８】
この開示において引用される全ての参照は、特に本明細書中で参考として援用される。上記の開示は、本発明を一般的に記載する。より完全な理解は、以下の特定の実施例を参照することにより得られ得る。この特定の実施例は、ただ例示目的のために本明細書で提供され、そして本発明の範囲を限定することは意図されない。
【実施例】
【０１３９】
（実験手順）
以下の材料および方法を、以下の実施例において使用した。
【０１４０】
（細胞株）
細胞株ＭＣＦ−７、ＢＲ−３、ＢＴ−２０、ＺＲ−７５−１、ＭＤＡ−ＭＢ−１５７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、Ａｌａｂ、およびＨｓ５７８Ｂｓｔを、アメリカンタイプカルチャーコレクションから入手した。全ての細胞株をそれらの明細書に従って増殖した。
【０１４１】
（ディファレンシャルディスプレイ） ディファレンシャルディスプレイを、製造業者の指示（Ｇｅｎｏｍｙｘ Ｃｏｒｐ．、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）に従ってＨｉｅｒｏｇｌｙｐｈ ｍＲＮＡプロ−フィールキットを使用して実施した。合計２００プライマー対を、遺伝子発現のプロフィールを描くために使用した。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）による、ランダムに開始されたｍＲＮＡの増幅に続いて、ｃＤＮＡ産物を、ｇｅｎｏｍｙｘＬＲシークエンサー（Ｇｅｎｏｍｙｘ Ｃｏｒｐ．）を使用して６％シークエンシング型ゲル上で分離した。乾燥させたゲルをＫｏｄａｋ ＸＡＲ−２フィルム（Ｋｏｄａｋ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）に、種々の時間露光した。
【０１４２】
示差的に発現されたｃＤＮＡフラグメントを摘出し、そして製造業者の指示（Ｇｅｎｏｍｙｘ Ｃｏｒｐ．）に従って再増幅した。ゲルから摘出されたゲル切片は１〜３の同じサイズのｃＤＮＡフラグメントを含むため（Ｍａｒｔｉｎら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４、１０１８−２６、１９９８；Ｇｉｅｓｅら、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｄｉｓｐｌａｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９８）、再増幅した産物を（Ｍａｔｈｉｅｕ−Ｄａｎｄｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４、１５０４−０７、１９９６）に記載されるように一本鎖確認多型性ゲルにより分離し、そしてＭ１３ユニバーサルプライマーおよびＴ７プライマーを使用して、直接的に配列決定した。
【０１４３】
（ヒト骨髄間質細胞ｃＤＮＡライブラリーの構築およびスクリーニング）
ＲＮＡを、チオシアン酸グアニジニウム／フェノールクロロホルム抽出プロトコール（Ｃｈｉｒｇｗｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８、５２９４−９９、１９７９）を使用して、ヒト骨髄間質細胞（Ｐｏｉｅｔｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）から単離した。ポリ（Ａ）+ＲＮＡをｏｌｉｇｏ−ｄＴ ｓｐｉｎカラム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用して単離した。第１鎖および第２鎖の合成を、製造業者の指示（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）に従って実施した。二本鎖ｃＤＮＡをｐＢＫ−ＣＭＶファージミドベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）中にライゲーションした。約１×１０6プラークが、１．２ｋｂ ＣＳＰ５６ ｃＤＮＡフラグメントを使用してスクリーニングされた。陽性クローン由来のプラスミドＤＮＡは、製造業者の指示に従って得られた。ヌクレオチド配列の正確性を、二本鎖配列決定により決定した。
【０１４４】
（ノーザンブロット分析およびＲＴ−ＰＣＲ）
種々のヒト正常組織および腫瘍組織から調製されたポリ（Ａ）+ＲＮＡを含むノーザンブロットを、ＣｌｏｎＴｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）およびＢｉｏｃｈａｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ、ＣＡ）から購入した。全ての他のノーザンブロットは、チオシアン酸グアニジニウム／フェノールクロロホルム抽出プロトコール（Ｃｈｉｒｇｗｉｎら、１９７９）を使用して、異なるヒト乳癌細胞株および正常細胞株から単離された２０〜３０μｇの全ＲＮＡを使用して調製された。ノーザンブロットを、Ｅｘｐｒｅｓｓ−ｈｙｂ（ＣｌｏｎＴｅｃｈ）中で、６５℃でハイブリダイズさせた。
【０１４５】
ＲＴ−ＰＣＲを、製造業者の指示に従って逆転写酵素ＲＮＡ ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ、ＮＪ）を、使用して実施した。
【０１４６】
（インサイチュハイブリダイゼーション） インサイチュハイブリダイゼーションを、Ｐｆａｆｆら、Ｃｅｌｌ ８４、３０９−２０、１９９６の手順に従って、外科的除去および１０μｍでの凍結切片後に直ちに凍結したヒト組織において、実施した。ジゴキシゲニン−ＵＴＰ−標識リボプローブを、テンプレートとしてＣＳＰ５６含有プラスミドＤＮＡを使用して生成した。アンチセンスプローブの生成については、ＤＮＡをＥｃｏＲＩ（約１ｋｂ転写物）またはＮｃｏＩ（全長転写物）で直線化し、そしてＴ３ポリメラーゼで転写した。センスコントロールについては、ＤＮＡをＸｈｏＩ（全長転写物）で直線化し、そしてＴ７ポリメラーゼで転写した。ハイブリダイズしたプローブをＢＭ紫を基質として使用する、アルカリホスファターゼ結合抗ジゴキシゲニン抗体で検出した（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）。
【０１４７】
（免疫不全マウスの乳房脂肪パット（ｆａｔｐａｄ）における腫瘍増殖）
Ｓｃｉｄ（重篤複合免疫不全）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を麻酔し、そして乳房脂肪パッドを曝露させるために小さく切開した。約４×１０6細胞を各マウスの脂肪パッド内に注射した。腫瘍増殖を１週間毎の検査によりモニターし、そして増殖をカリパス測定により決定した。約４週間後、原発腫瘍を麻酔したマウスから除去し、そしてその皮膚切開を創クリップで閉じた。約４週間後、マウスを殺傷し、そして肺転移の存在を検査した。原発腫瘍細胞および肺転移を、ヒト細胞の存在について組織化学的に分析した。８０％を超えるヒト起源の細胞を表す腫瘍組織の塊を、全ＲＮＡを単離するために使用した。ＭＤＡ−ＭＤ−４３５の場合、９０％を超えるヒト細胞を表す広範な肺転移を使用した。全ＲＮＡを、ＣＳＰ５６コード領域について特異的なプライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲにより増幅した。反応産物をナイロンメンブレン上にドットブロットし、そしてＣＳＰ５６特異的プローブでハイブリダイズした。
【０１４８】
（実施例１）
この実施例は、攻撃的で侵襲性のヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４３５において示差的に発現される遺伝子の同定を実証する。
【０１４９】
転移性表現型に関連する遺伝子を同定するために、本発明者らは、貧弱な侵襲性から最も攻撃的な侵襲性まで及ぶ、異なる悪性表現型ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５を示す４つのヒト乳癌細胞株を使用して、遺伝子発現プロフィールを比較した（Ｅｎｇｅｌら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３８、４３２７−３９、１９７８；ＳｈａｆｉｅおよびＬｉｏｔｔａ、Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．１１、８１−８７、１９９０；ＯｚｅｌｌｏおよびＳｏｒｄａｔ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １６、５５３−５９、１９８０；Ｐｒｉｃｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０、７１７−２１、１９９０）。細胞株は、多量の純粋なＲＮＡを得る能力に基づき、出発材料として選択された。対照的に、ヒト乳癌生検は、癌型ならびにマクロファージおよびリンパ球を含む他の細胞型の混合物からなる（Ｋｅｌｌｙら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５７、１７４−７７、１９８８；Ｗｈｉｔｆｏｒｄら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６２、９７１−７５、１９９０）。記載されたヒト乳癌細胞株はマウスモデルにおいて広範囲に研究されており、腫瘍進行において同定された候補遺伝子を機能的に特徴付けることを可能にする。
【０１５０】
細胞株が、培養において継代を延長した後でそれらの起源の悪性特徴を保持したことを保証するために、本発明者らは、ｓｃｉｄマウスにおいて増殖する潜在能および乳房脂肪パッド内への注射に続いて転移を形成する潜在能を検査した。４つの細胞株のうち３つが、以前の報告（Ｅｎｇｅｌら、１９７８；ＳｈａｆｉｅおよびＬｉｏｔｔａ、１９９０；ＯｚｅｌｌｏおよびＳｏｒｄａｔ、１９８０；Ｐｒｉｃｅら、１９９０）と一致して原発腫瘍を形成した。原発腫瘍形成は、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３では全く検出されなかった。さらに、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５を注射されたマウスは、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５を使用して検出される最も高い発生率を有して、肺転移を進展させた。
【０１５１】
次に、本発明者らは、乳癌細胞株から単離された全ＲＮＡおよび合計２００の異なるプライマー対の組み合わせを使用してディファレンシャルディスプレイ分析を実施した。いくつかの示差的に発現される転写物の中で、１．２−ｋｂのｃＤＮＡフラグメントがＭＤＡ−ＭＢ−４３５ ＲＮＡサンプルから、Ａｐ８［５’−ＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ（Ｔ）12ＡＡ］（配列番号２０）およびＡｒｐ１（５’−ＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＣＧＡＣＴＣＣＡＡＧ）（配列番号２１）のプライマー対組み合わせを使用して特異的に増幅された（図１Ａ、レーン５および６）。弱い発現もまた、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１においても検出された（図１Ａ、レーン１および２）が、一方、ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−４５３から単離されたＲＮＡサンプルにおいては全くシグナルは検出されなかった（図１Ａ、レーン３、４、７および８）。
【０１５２】
発現パターンを確認するため、ＤＮＡフラグメントをゲルから単離し、再増幅し、放射性標識し、そして異なる悪性表現型を有するヒト乳癌細胞株および非腫瘍形成乳房細胞株のノーザンブロット分析におけるハイブリダイゼーションプローブとして使用した。（図１Ｂ）。放射性プローブは、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ ＲＮＡサンプルにおいて、約２．０−ｋｂおよび約２．５−ｋｂのサイズの２つの転写物に、類似した強度でハイブリダイズした（レーン９）。これらの転写物の弱い発現は、貧弱な侵襲性のヒト乳房細胞株（レーン２および３）または非腫瘍形成株Ｈｓ５７８Ｂｓｔ（レーン１）において検出された。シグナルは、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３およびＭＣＦ−７では全く検出されなかった。これらのデータは、高度にまたは中程度に転移性のヒト乳癌細胞株に対して、この遺伝子の制限された発現パターンを示す。
【０１５３】
（実施例２）
この実施例は、ＣＳＰ５６ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を実証する。
【０１５４】
公的なデータ−ベースに対するＣＳＰ５６ ｃＤＮＡヌクレオチド配列の比較は、有意な相同性を全く示さなかった。よりヌクレオチド配列の情報を得るため、本発明者らはヒト骨髄間質細胞ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。陽性クローンのうちの１つは、長さを１８５５ヌクレオチドにまで起源クローンを伸長した（図２Ａ）。この配列は、いくつかの発現される配列タグで、３’末端を長さを２６０６ヌクレオチドにまでさらに伸長させた（図２Ｂ）。さらなる７５０ヌクレオチドは、おそらく代わりのポリ−Ａ部位選択の結果である。
【０１５５】
ヌクレオチド配列の分析は、ヌクレオチド１０１位の翻訳開始コドンで開始し、そしてヌクレオチド１６５５位の停止コドンで終結する、５１８アミノ酸の単一のオープンリーディングフレームを明らかにした。開始コドン周囲のコンセンサスＫｏｚａｋ配列（Ｋｏｚａｋ、Ｃｅｌｌ ４４、２８３−９２、１９８６）およびコドン使用頻度（ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ）の分析（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ｐａｃｋａｇｅ、ＵＮＩＸ（登録商標））は、このｃＤＮＡクローンが完全なコード領域を含むことを示唆する。
【０１５６】
このオープンリーディングフレームの翻訳は、５６ｋＤの分子量を有するタンパク質を推定する。高度転移性ヒト乳癌細胞株におけるその特異的発現に基づいて、このｃＤＮＡのコードするタンパク質をＣＳＰ５６（ｃａｎｃｅｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ５６−ｋｄ）と名付けた。
【０１５７】
（実施例３）
この実施例は、ＣＳＰ５６が新規のアスパルチル型プロテアーゼであることを実証する。
【０１５８】
ＣＳＰ５６オープンリーディングフレームの、公的なデータ−ベースにおけるタンパク質との比較は、アスパルチルプロテアーゼのペプシンファミリーのメンバーへのいくらかの相同性を示す（図３）。このプロテアーゼファミリーの特徴的な特色は、遺伝子複製により進化された２つの活性中心の存在である（Ｄａｖｉｅｓ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９、１８９−２１５、１９９０；ＮｅｉｌおよびＢａｒｒｅｔｔ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．２４８、１０５−８０、１９９５）。触媒ドメイン（Ａｓｐ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ−Ｇｌｙ）およびその隣接残基を含むこのアミノ酸残基は、このファミリーにおいて最も高い保存性を示し、そしてこのアミノ酸残基はＣＳＰ５６において保存されている（図２および３）。
【０１５９】
しかし、ＣＳＰ５６は、他のアスパルチルプロテアーゼとは異なる構造的特徴を示す。ペプシノーゲンＣおよびＡ、レニン、ならびにカテプシンＤおよびＥへのＣＳＰ５６の全体的な類似性は、ＣＳＰ５６のＣ末端伸長を無視すると、それぞれ、５５、５１、５４、５２、および５１％にすぎない。他のメンバーにおいて触媒ドメインの前後に見出されるシステイン残基は、ＣＳＰ５６において存在しない（図３）。ＣＳＰ５６はまた、公知のタンパク質に有意な相同性を全く示さない約９０アミノ酸残基のカルボキシ末端伸長を含む。
【０１６０】
ＣＳＰ５６はまた、Ｃ末端伸長に２９のアミノ酸残基からなる疎水性モチーフを含み、これは膜結合ドメインとして機能し得る（図２および３）。ＣＳＰ５６はまた、推定シグナル配列を含む。
【０１６１】
従ってＣＳＰ５６は、推定膜貫通ドメイン（アミノ酸８〜２０）および推定プロペプチドを表す約４５のアミノ酸の伸展（アミノ酸２１〜７６）を有する新規のアスパルチル型プロテアーゼである。
【０１６２】
（実施例４）
この実施例は、ヒト乳癌発達および転移を通したＣＳＰ５６の発現パターンを実証する。
【０１６３】
ＣＳＰ５６の発現パターンをさらに試験するため、本発明者らは、さらなるヒト乳癌細胞細胞株および正常細胞株を使用してノーザンブロット分析を実施した（図４）。ＣＳＰ５６の発現はＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、およびＢＲ−３において検出され（レーン１、４、および９）、最も強いシグナルがＭＤＡ−ＭＢ−４３５で検出された。他の細胞株は弱い発現を示した。貧弱な侵襲性のヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４５３およびＭＣＦ−７ならびに正常な乳房細胞株Ｈｓ５７８Ｂｓｔでは、全くシグナルは検出されなかった。総合して、これらのデータは高度な悪性ヒト乳癌細胞株におけるＣＳＰ５６の発現の増加と一致する。
【０１６４】
（実施例５）
この実施例は、正常ヒト組織におけるＣＳＰ５６の発現パターンを実証する。
【０１６５】
ＣＳＰ５６の組織分布を決定するため、種々のヒト組織由来のポリＡ+ＲＮＡをノーザンブロット分析により試験した（図７）。２つの主な転写物が検出され、それらは癌細胞株およびヒト組織において検出された転写物に類似したサイズである。最も高い発現は、膵臓、前立腺、および胎盤で検出された。脳、および末梢血液リンパ球においては、弱いシグナルが検出されるかまたは全くシグナルは検出されなかった。
【０１６６】
（実施例６）
この実施例は、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５を注射された免疫不全マウスから単離された原発腫瘍および転移性肺組織におけるＣＳＰ５６転写物の同定を実証する。
【０１６７】
ｓｃｉｄマウスモデルを腫瘍におけるＣＳＰ５６発現を試験するために使用した。このモデルは、ヒト乳癌細胞の腫瘍形成能および転移性に関連する遺伝子の機能を評価するために適切であることが示されている（Ｓｔｅｅｇら、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．２５、１７５−８７、１９９３；Ｐｒｉｃｅ、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．３９、９３−１０２、１９９６）。
【０１６８】
異なるヒト乳癌細胞株を免疫不全マウスの乳房脂肪パッド内に注射した。原発腫瘍および、適用性である場合、肺転移をマウスから単離し、そして全ＲＮＡをノーザンブロット分析のために調製した（図４）。
【０１６９】
ＣＳＰ５６転写物は、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８およびＡｌａｂ由来の原発腫瘍ＲＮＡにおいて検出され、ＭＣＦ−７由来の原発腫瘍ＲＮＡにおいては検出されなかった（図４）。ＣＳＰ５６遺伝子発現はまた、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５で注射されたマウスの肺転移においても検出された（レーン１）。ＺＲ−７５−１、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１、およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１で注射されたマウスの原発腫瘍においてＣＳＰ５６転写物を検出できなかったことは、他の原発腫瘍ＲＮＡサンプルと比較した場合、弱いヒトβ−アクチンシグナルにより判断されるように、これらの腫瘍におけるヒト癌組織の量が少ないことで説明され得る。
【０１７０】
総合すると、これらのデータはＣＳＰ５６上方調節の原因としてのインビトロ培養条件を除外し、そしてこれらの遺伝子を新規の腫瘍マーカーとして確立する。
【０１７１】
（実施例７）
この実施例は、患者サンプルにおいて検出されたＣＳＰ５６遺伝子発現の検出を実証する。
【０１７２】
ＣＳＰ５６発現を患者腫瘍生検から単離されたＲＮＡサンプルにおいて試験した。乳癌腫瘍組織および同じ患者に由来する正常乳房組織由来の全ＲＮＡを含むノーザンブロットを、ＣＳＰ５６特異的プローブでハイブリダイズした（図５Ａ）。ＣＳＰ５６転写物は腫瘍サンプルにおいて検出されたが、一方、正常乳房ＲＮＡにおいては全くシグナルは検出されなかった（レーン１および２）。同様に、ＣＳＰ５６転写物の発現は、正常乳房ＲＮＡコントロールと比較された場合、２つの他の乳癌ＲＮＡサンプルにおいて上方調節された（図５Ｂ）。ＣＳＰ５６の発現の増加はまた、ヒト結腸ガン組織において、同じ患者の正常結腸組織と比較された場合に検出された。
【０１７３】
インビボでＣＳＰ５６転写物を発現する細胞型を同定するために、本発明者らは一人の乳癌患者から得られた組織サンプルにおいてインサイチュハイブリダイゼーション分析を実施した（図６Ａ−６Ｆ）。弱いＣＳＰ５６シグナルが、正常乳房組織の管の細胞において検出された（図６Ｂ）。原発腫瘍において、ＣＳＰ５６は腫瘍細胞において高度に発現されたが、周囲のリンパ球においては発現されなかった（図６Ｅ）。センスプローブを使用すると、全くシグナルは検出されなかった（図６Ｃおよび６Ｆ）。
【０１７４】
本発明者らはまた、ＣＳＰ５６発現について２人の結腸ガン患者から得られた組織サンプルを分析した（図６Ｇ−６Ｍ）。正常結腸組織においては全くシグナルは検出されなかったが（図６Ｈ）、一方、ＣＳＰ５６転写物は原発結腸腫瘍および肝転移の両方の腫瘍細胞において富み、そして周囲の支質においては全く発現は検出されなかった（図６Ｋおよび６Ｍ）。
【０１７５】
これらのデータは、ＣＳＰ５６がヒト癌患者の腫瘍細胞において過剰に発現されること、そして異なる型の腫瘍の発達および進行において役割を果たし得ることを実証する。
【０１７６】
【表１】
【技術分野】
【０００１】
（発明の技術分野）
本発明は、腫瘍の挙動を予測するための方法、および特に、限定されないが、転移の広がりの傾向を示す特定の遺伝子配列の発現について腫瘍サンプルを試験する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
多数の組織化学的、遺伝的、および免疫学的マーカーの使用にもかかわらず、臨床家はなお、どの腫瘍が他の器官に転移するかを予測するために困難な時間を過ごしている。いくらかの患者は、再発および転移を予防するために補助の治療を必要とし、そして他の患者は、必要としない。患者のこれらの亜集団の間を区別することは、簡単ではない。従って、処置の方針は、容易に立てられない。従って、当該分野において、異なる転移可能性の腫瘍の間を区別するための新しいマーカーの必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（発明の要旨）
どの腫瘍が転移するようであることを決定するための、およびこれらの腫瘍の転移を抑制するための試薬ならびに方法を提供することが、本発明の目的である。本発明のこれらおよび他の目的は、以下に記載される１つ以上の実施態様によって提供される。
【０００４】
本発明の１つの実施態様は、配列番号１〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列に少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有する、単離されかつ精製されたタンパク質である。同一性％を、１２のギャップオープンペナルティおよび１のギャップエクステンションペナルティを用いるアフィンギャップ検索を使用するＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムを使用して決定する。
【０００５】
本発明の別の実施態様は、配列番号１〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質の少なくとも８個の連続するアミノ酸からなる、単離されかつ精製されたポリペプチドである。
【０００６】
本発明のさらに別の実施態様は、ペプチド結合によって互いに融合された第１のタンパク質セグメントおよび第２のタンパク質セグメントを含む融合タンパク質である。この第１のタンパク質セグメントは、配列番号１〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むポリペプチドによりコードされるアミノ酸配列から選択される少なくとも８個の連続したアミノ酸からなる。
【０００７】
本発明のなお別の実施態様は、配列番号１〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むポリペプチドによりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質に特異的に結合する抗体調製物である。
【０００８】
本発明のさらに別の実施態様は、配列番号１〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列に少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有する、単離されかつ精製されたタンパク質をコードするｃＤＮＡ分子である。同一性％を、１２のギャップオープンペナルティおよび１のギャップエクステンションペナルティを用いるアフィンギャップ検索を使用するＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムを使用して決定する。
【０００９】
本発明の別の実施態様は、配列番号１〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の少なくとも８個の連続するアミノ酸をコードするｃＤＮＡ分子である。
【００１０】
本発明のさらに別の実施態様は、配列番号１〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１２個の連続するヌクレオチドを含むｃＤＮＡ分子である。
【００１１】
本発明のなお別の実施態様は、配列番号１〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列に少なくとも８５％同一であるｃＤＮＡ分子である。同一性％を、１２のギャップオープンペナルティおよび１のギャップエクステンションペナルティを用いるアフィンギャップ検索を使用するＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムを使用して決定する。
【００１２】
本発明のさらなる実施態様は、６５℃で０．２×ＳＳＣを用いて洗浄した後に、配列番号１〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチドセグメントを含む、単離されかつ精製されたサブゲノムポリヌクレオチドである。
【００１３】
本発明の別の実施態様は、プロモーター、および配列番号１〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の少なくとも８個の連続するアミノ酸をコードするポリヌクレオチドセグメントを含む構築物である。このポリヌクレオチドセグメントは、プロモーターの下流に位置し、ここで、このポリヌクレオチドセグメントの転写は、このプロモーターで開始する。
【００１４】
本発明のなお別の実施態様は、プロモーター、ならびに配列番号１〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の少なくとも８個の連続するアミノ酸をコードするポリヌクレオチドを含む構築物を含む宿主細胞である。
【００１５】
本発明のさらに別の実施態様は、新しい転写単位開始単位を含む組換え宿主細胞である。この新しい転写開始単位は、５’から３’の順に、（ａ）外因性調節配列、（ｂ）外因性エキソン、および（ｃ）スプライスドナー部位、を含む。この新しい転写開始単位は、遺伝子のコード配列の上流に位置する。このコード配列は、配列番号１〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。この外因性調節配列は、遺伝子のコード配列の転写を制御する。
【００１６】
本発明のなお別の実施態様は、（ａ）配列番号１〜１８からなる群から選択される、少なくとも１２個の連続するヌクレオチド、ならびに（ｂ）検出可能な標識、を含むポリヌクレオチドプローブである。
【００１７】
本発明のさらに別の実施態様は、転移性組織または組織の転移可能性を同定するための方法である。配列番号１〜４、配列番号６〜１３、および配列番号１５〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む遺伝子の発現産物は、組織サンプル中で測定される。配列番号１、４、１１、１６、１７、および１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む遺伝子産物を発現するか、または配列番号２、３、６、７、８、９、１０、１２、１３、および１５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む遺伝子産物を発現しない組織サンプルは、転移性として、または転移可能性を有するとして同定される。
【００１８】
本発明のなお別の実施態様は、腫瘍の転移可能性を抑制する能力について試験化合物をスクリーニングする方法である。生物学的サンプルを試験化合物と接触させる。配列番号１〜４、配列番号６〜１３、および配列番号１５〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質の合成は、生物学的サンプル中で測定される。配列番号１、４、１１、１６、１７、または１８を含むポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の合成を減少させるか、または配列番号２、３、６、７、８、９、１０、１２、１３、または１５を含むポリヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質の合成を増加させる試験化合物は、腫瘍の転移可能性を抑制するための潜在的な薬剤として同定される。
【００１９】
本発明の別の実施態様は、結腸腫瘍の高程度または低程度の転移の広がりについての傾向を予測する方法である。配列番号１６および配列番号１７からなる群から選択される配列を有する遺伝子の発現産物は、結腸腫瘍サンプル中で測定される。配列番号１６の産物を発現する結腸腫瘍サンプルは、転移する高い傾向を有するとして分類され、そして配列番号１７の産物を発現する結腸腫瘍サンプルは、転移する低い傾向を有するとして分類される。
【００２０】
本発明のなお別の実施態様は、配列番号１〜１８に示されるヌクレオチド配列からなる群から選択されるコード配列を有する遺伝子の少なくとも一部を増幅するためのプライマーセットである。
【００２１】
本発明のなお別の実施態様は、配列番号１〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１２個の連続するヌクレオチドを含む少なくとも１つの一本鎖ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドアレイである。
【００２２】
本発明のさらなる実施態様は、転移性組織または組織の転移可能性を同定するための方法である。一本鎖のポリヌクレオチド分子を含む組織サンプルは、少なくとも１つの一本鎖ポリヌクレオチドプローブを含むポリヌクレオチドアレイと接触させられる。この少なくとも１つの一本鎖ポリヌクレオチドプローブは、配列番号１〜４、配列番号６〜１３、および配列番号１５〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１２個の連続するヌクレオチドを含む。この組織サンプルは、転移性であるかまたは転移可能性を有すると疑われる。ポリヌクレオチドアレイに結合した二本鎖ポリヌクレオチドを検出する。配列番号１〜４、１１、１６、１７、および１８からなる群から選択される連続するヌクレオチドを含む二本鎖ポリヌクレオチドの検出、または配列番号２、３、６、７、８、９、１０、１２、１３、および１５からなる群から選択される連続するヌクレオチドを含む二本鎖ポリヌクレオチドの検出を欠くことは、この組織サンプルを転移性または転移可能性を有すると同定する。
【００２３】
従って、本発明は、当該分野に、転移のマーカーとして使用され得る多数の遺伝子およびタンパク質を提供する。これらは、癌の患者、特に乳癌または結腸癌に対する治療の方針をより合理的に規定するために有用である。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１） 単離されかつ精製されたタンパク質であって、配列番号１〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列に少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有し、ここで同一性％は、１２のギャップオープンペナルティおよび１のギャップエクステンションペナルティを用いてアフィンギャップ検索を使用するＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムを使用して決定される、タンパク質。
（項目２） 配列番号１９に示されるアミノ酸配列に少なくとも８５％同一である、項目１に記載の単離されかつ精製されたタンパク質。
（項目３） 配列番号１〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を含む、項目１に記載の単離されかつ精製されたタンパク質。
（項目４） 配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含む、項目２に記載の単離されかつ精製されたタンパク質。
（項目５） 配列番号１〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質の少なくとも８個の連続するアミノ酸からなる、単離されかつ精製されたポリペプチド。
（項目６） 配列番号１９の少なくとも８個の連続するアミノ酸からなる、項目５に記載の単離されかつ精製されたポリペプチド。
（項目７） 項目６に記載の単離されたポリペプチドであって、配列番号１９の少なくともアミノ酸４６１〜４８９、配列番号１９の少なくともアミノ酸１０６〜１１５、配列番号１９の少なくともアミノ酸２９７〜３０６、および配列番号１９の少なくとも８〜２０からなる群から選択される、ポリペプチド。
（項目８） 融合タンパク質であって、ペプチド結合によって互いに融合した第１のタンパク質セグメントおよび第２のタンパク質セグメントを含み、ここでその第１のタンパク質セグメントは、配列番号１〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列から選択される少なくとも８個の連続するアミノ酸からなる、融合タンパク質。
（項目９） 上記第１のタンパク質セグメントが、配列番号１９に示されるアミノ酸配列から選択される少なくとも８個の連続するアミノ酸からなる、請求項８に記載の融合タンパク質。
（項目１０） 配列番号１〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質に特異的に結合する、抗体調製物。
（項目１１） ｃＤＮＡ分子であって、配列番号１〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列に少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有する単離されかつ精製されたタンパク質をコードし、ここで同一性％が、１２のギャップオープンペナルティおよび１のギャップエクステンションペナルティを用いるアフィンギャップ検索を使用するＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムを使用して決定される、ｃＤＮＡ分子。
（項目１２） 配列番号１９に少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、項目１１に記載のｃＤＮＡ分子。
（項目１３） 配列番号１〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の少なくとも８個の連続するアミノ酸をコードする、ｃＤＮＡ分子。
（項目１４） 配列番号１９をコードする、項目１３に記載のｃＤＮＡ分子。
（項目１５） 配列番号１８を含む、項目１４に記載のｃＤＮＡ分子。
（項目１６） 配列番号１〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１２の連続するヌクレオチドを含む、ｃＤＮＡ分子。
（項目１７） ｃＤＮＡ分子であって、配列番号１〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列に少なくとも８５％同一であり、ここで同一性％は、１２のギャップオープンペナルティおよび１のギャップエクステンションペナルティを用いるアフィンギャップ検索を使用するＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムを使用して決定される、ｃＤＮＡ分子。
（項目１８） 配列番号１８に示されるヌクレオチド配列に少なくとも８５％同一である、項目１７に記載のｃＤＮＡ分子。
（項目１９） ６５℃で０．２×ＳＳＣを用いて洗浄した後に、配列番号１〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチドセグメントを含む、単離されかつ精製されたサブゲノムポリヌクレオチド。
（項目２０） 上記ヌクレオチドセグメントが、配列番号１８に示されるヌクレオチド配列にハイブリダイズする、項目１９に記載の単離されかつ精製されたサブゲノムポリヌクレオチド。
（項目２１） 構築物であって、以下：
プロモーター；および
配列番号１〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の少なくとも８個の連続するアミノ酸をコードするポリヌクレオチドセグメント、
を含み、そのポリヌクレオチドセグメントは、そのプロモーターの下流に位置し、そのポリヌクレオチドセグメントの転写は、そのプロモーターで開始する、構築物。
（項目２２） 上記タンパク質が、配列番号１９のアミノ酸配列を含む、項目２１に記載の構築物。
（項目２３） プロモーター；および
配列番号１〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の少なくとも８個の連続するアミノ酸をコードするポリヌクレオチドセグメント、を含む構築物を含む、宿主細胞。
（項目２４） 上記タンパク質が、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を有する、項目２３に記載の宿主細胞。
（項目２５） 新しい転写開始単位を含む組換え宿主細胞であって、その新しい転写開始単位が、５’から３’の順で以下：
（ａ）外因性調節配列；
（ｂ）外因性エキソン；および
（ｃ）スプライスドナー部位、
を含み、ここでその新しい転写開始単位は、遺伝子のコード配列の上流に位置し、そのコード配列は、配列番号１〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、その外因性調節配列は、その遺伝子のコード配列の転写を制御する、組換え宿主細胞。
（項目２６） 上記遺伝子が、配列番号１８に示されるコード配列を有する、項目２５に記載の組換え宿主細胞。
（項目２７） ポリヌクレオチドプローブであって、（ａ）配列番号１〜１８からなる群から選択される少なくとも１２個の連続するヌクレオチド、および検出可能な標識、を含む、ポリヌクレオチドプローブ。
（項目２８） 上記少なくとも１２個の連続するヌクレオチドが、配列番号１８から選択される、項目２７に記載のポリヌクレオチドプローブ。
（項目２９） 転移性組織または組織の転移可能性を同定するための方法であって、以下の工程：
組織サンプル中の、配列番号１〜４、配列番号６〜１３、および配列番号１５〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む遺伝子の発現産物を測定する工程であって、ここで配列番号１、４、１１、１６、１７、および１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む遺伝子産物を発現するか、または配列番号２、３、６、７、８、９、１０、１２、１３、および１５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む遺伝子産物を発現しない組織サンプルが、転移性として、または転移する可能性を有するとして同定される、工程、
を包含する、方法。
（項目３０） 上記組織サンプルが、乳房組織および結腸組織からなる群から選択される、項目２９に記載の方法。
（項目３１） 上記発現産物がタンパク質である、項目２９に記載の方法。
（項目３２） 上記発現産物がｍＲＮＡである、項目２９に記載の方法。
（項目３３） 上記遺伝子が、配列番号１８に示されるヌクレオチド配列を含む、項目２９に記載の方法。
（項目３４） 腫瘍の転移する可能性を抑制する能力について試験化合物をスクリーニングする方法であって、以下の工程：
生物学的サンプルを試験化合物と接触させる工程；および
その生物学的サンプル中の、配列番号１〜４、配列番号６〜１３、および配列番号１５〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質の合成を測定する工程であって、ここで配列番号１、４、１１、１６、１７、または１８を含むポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の合成を減少させるか、あるいは配列番号２、３、６、７、８、９、１０、１２、１３、または１５を含むポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の合成を増加させる試験化合物が、腫瘍の転移する可能性を抑制するための可能性のある薬剤として同定される、工程、
を包含する、方法。
（項目３５） 結腸腫瘍の高程度または低程度の転移の広がりについて傾向を予測する方法であって、以下の工程：
結腸腫瘍サンプル中の、配列番号１６および配列番号１７からなる群から選択される配列を有する遺伝子の発現産物を測定する工程であって、ここで配列番号１６の産物を発現する結腸腫瘍サンプルが、転移する高い傾向を有するとして分類され、そして配列番号１７の産物を発現する結腸腫瘍サンプルが、転移する低い傾向を有するとして分類される、工程、
を包含する、方法。
（項目３６） 配列番号１〜１８に示されるヌクレオチド配列からなる群から選択されるコード配列を有する遺伝子の少なくとも一部を増幅するための、プライマーセット。
（項目３７） 上記遺伝子が、配列番号１８に示されるコード配列を有する、項目３６に記載のセット。
（項目３８） 上記プライマーが、配列番号２０および配列番号２１に示されるヌクレオチド配列である、項目３７に記載のセット。
（項目３９） 配列番号１〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１２個の連続するヌクレオチドを含む少なくとも１つの一本鎖ポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドアレイ。
（項目４０） 上記ヌクレオチド配列が、配列番号１、４、１１、１６、１７、および１８からなる群から選択される、項目３９に記載のポリヌクレオチドアレイ。
（項目４１） 上記ヌクレオチド配列が、配列番号２、３、６、７、８，９、１０、１２、１３、および１５からなる群から選択される、項目３９に記載のポリヌクレオチドアレイ。
（項目４２） 転移性組織または組織の転移可能性を同定するための方法であって、以下の工程：
一本鎖ポリヌクレオチド分子を含む組織サンプルを、少なくとも１つの一本鎖ポリヌクレオチドプローブを含むポリヌクレオチドアレイと接触させる工程であって、ここでその少なくとも１つの一本鎖ポリヌクレオチドプローブは、配列番号１〜４、配列番号６〜１３、および配列番号１５〜１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも１２個の連続するヌクレオチドを含み、その組織サンプルが、転移性であるかまたは転移する可能性を有すると疑われる、工程；
そのポリヌクレオチドアレイに結合する二本鎖ポリヌクレオチドを検出する工程であって、ここで配列番号１〜４、１１、１６、１７、および１８からなる群から選択される連続するヌクレオチドを含む二本鎖ポリヌクレオチドの検出、または配列番号２、３、６、７、８、９、１０、１２、１３、および１５からなる群から選択される連続するヌクレオチドを含む二本鎖ポリヌクレオチドの検出を欠くことが、転移性または転移する可能性を有するとして組織サンプルを同定する、工程、
を包含する、方法。
（項目４３） 上記組織サンプルが、乳房サンプルまたは結腸サンプルである、項目４２に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１。異なるヒト乳癌細胞株の任意のプライマーに基づくディファレンシャルディスプレイおよびＲＮＡブロット分析による確認。図１Ａ。ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４３５における約１．２ｋｂのサイズの２つのバンドを示すディファレンシャルディスプレイゲルのオートラジオグラフ。ディファレンシャルディスプレイ反応物を調製し、そして二重で実行した。図１Ｂ。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５における発現パターンを検証するノーザンブロット分析。ディファレンシャルディスプレイゲルから単離されたｃＤＮＡは、約２．０ｋｂおよび２．５ｋｂのサイズである２つの転写物にハイブリダイズした。メチレンブルーを用いる膜の染色およびヒトβアクチンプローブとの膜のハイブリダイゼーションにより判定されるように、各レーンに等量のＲＮＡを充填した。
【図２Ａ−１】図２Ａ。ＣＳＰ５６のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列。５１８アミノ酸長配列を、１８５５塩基対のヌクレオチド配列の下に１文字コードで示す。アスパルチルプロテアーゼの特徴である、活性部位残基（Ｄ）および隣接しているアミノ酸残基は、下線が引かれている。推定プロペプチドは、四角で囲まれている。Ｎ末端の推定シグナルペプチドおよびＣ末端の膜貫通ドメインは、下線が引かれている。
【図２Ａ−２】図２Ａ。ＣＳＰ５６のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列。５１８アミノ酸長配列を、１８５５塩基対のヌクレオチド配列の下に１文字コードで示す。アスパルチルプロテアーゼの特徴である、活性部位残基（Ｄ）および隣接しているアミノ酸残基は、下線が引かれている。推定プロペプチドは、四角で囲まれている。Ｎ末端の推定シグナルペプチドおよびＣ末端の膜貫通ドメインは、下線が引かれている。
【図２Ｂ】図２Ｂ。ＣＳＰ５６のヌクレオチド配列を、２６０６塩基対の長さまで伸長する発現された配列タグ。
【図２Ｃ】図２Ｃ。ＣＳＰ５６の概略図。ＳＳは、シグナル配列；Ｐｒｏは、プロペプチド；ＴＭは、膜貫通ドメイン。アステリスクは、活性部位を示す。
【図３Ａ】図３。アスパルチルプロテアーゼのペプシンファミリーの他のメンバーとのＣＳＰ５６の多数のアミノ酸配列のアライメント。同一のアミノ酸残基を、黒い囲いにより示す。アスパルチルプロテアーゼ活性残基（Ｄ−Ｓ／Ｔ−Ｇ）を、上の線により示す。ペプシンファミリーのメンバーにおけるアスパルチルプロテアーゼに特徴的であるシステイン残基をアステリスクにより示す。推定膜付着ドメインは、下線が引かれている。ギャップを、点で示す。Ｃａｔ−Ｅは、カテプシンＥ；Ｐｅｐ−Ａは、ペプシノゲンＥ；Ｐｅｐ−Ｃは、ペプシノゲンＣ；Ｃａｔ−Ｄは、カテプシンＤ。
【図３Ｂ】図３。アスパルチルプロテアーゼのペプシンファミリーの他のメンバーとのＣＳＰ５６の多数のアミノ酸配列のアライメント。同一のアミノ酸残基を、黒い囲いにより示す。アスパルチルプロテアーゼ活性残基（Ｄ−Ｓ／Ｔ−Ｇ）を、上の線により示す。ペプシンファミリーのメンバーにおけるアスパルチルプロテアーゼに特徴的であるシステイン残基をアステリスクにより示す。推定膜付着ドメインは、下線が引かれている。ギャップを、点で示す。Ｃａｔ−Ｅは、カテプシンＥ；Ｐｅｐ−Ａは、ペプシノゲンＥ；Ｐｅｐ−Ｃは、ペプシノゲンＣ；Ｃａｔ−Ｄは、カテプシンＤ。
【図３Ｃ】図３。アスパルチルプロテアーゼのペプシンファミリーの他のメンバーとのＣＳＰ５６の多数のアミノ酸配列のアライメント。同一のアミノ酸残基を、黒い囲いにより示す。アスパルチルプロテアーゼ活性残基（Ｄ−Ｓ／Ｔ−Ｇ）を、上の線により示す。ペプシンファミリーのメンバーにおけるアスパルチルプロテアーゼに特徴的であるシステイン残基をアステリスクにより示す。推定膜付着ドメインは、下線が引かれている。ギャップを、点で示す。Ｃａｔ−Ｅは、カテプシンＥ；Ｐｅｐ−Ａは、ペプシノゲンＥ；Ｐｅｐ−Ｃは、ペプシノゲンＣ；Ｃａｔ−Ｄは、カテプシンＤ。
【図４】図４。ｓｃｉｄマウスから単離された原発性腫瘍および転移におけるＣＳＰ５６発現。異なるヒト乳癌細胞株を注射されたマウスの原発性腫瘍（ＰＴ）および転移組織（Ｍｅｔ）から単離されたＲＮＡを使用するノーザンブロット分析。メチレンブルーを用いる膜の染色およびヒトβアクチンプローブとの膜のハイブリダイゼーションにより判定されるように、各レーンに等量のＲＮＡを充填した。
【図５】図５。ＣＳＰ５６は、患者の乳房腫瘍サンプルにおいて上方制御される。図５Ａ。同じ患者由来の腫瘍および正常な乳房組織から単離されたＲＮＡを使用するノーザンブロット分析。図５Ｂ。３つの異なるヒト乳房腫瘍の患者および正常な乳房組織から単離されたＲＮＡを使用するノーザンブロット分析。
【図６】図６。乳房腫瘍および結腸腫瘍におけるＣＳＰ５６発現のインサイチュハイブリダイゼーション分析。１人の患者の正常乳房組織（Ａ〜Ｃ）から原発性乳房組織（Ｄ〜Ｆ）まで、ならびに別の患者の正常結腸組織（Ｇ、Ｈ）、原発性結腸組織（Ｊ、Ｋ）、から肝転移（Ｌ、Ｍ）までの隣接または近隣接切片。切片Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｊ、およびＬを、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）を用いて染色した。切片Ｂ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、およびＭをアンチセンスＣＳＰ５６プローブとハイブリダイズし、そして切片ＣおよびＦをＣＳＰ５６センスコントロールプローブとハイブリダイズした。ｄは、乳管；ｆは、脂肪結合組織；ｌｙは、リンパ球；ｍは、結腸粘膜；ｍｅｔは、転移組織；ＰＴは、原発性腫瘍；ｓｔは、支質；ｔｃは、腫瘍細胞。
【図７】図７。ヒト組織におけるＣＳＰ５６発現。種々のヒト組織における２．０ｋｂおよび２．５ｋｂの２つのＣＳＰ５６転写物を示すＲＮＡブロット分析。ｓｋ．筋は、骨格筋；ｓｍ．腸は、小腸；ｐ．ｂ．リンパ球は、末梢血リンパ球。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
（発明の詳細な説明）
多くの遺伝子が、癌細胞および非転移性の癌細胞の間で、差異的に発現されていることが、本発明の知見である（表１）。この情報は、差異的に示される遺伝子の発現産物に特異的な診断試薬の作製に利用され得る。これはまた、癌、特に乳癌および結腸癌の適切な処置法の計画において臨床医の助けとなる診断および予後の方法に用いられ得る。
【００２６】
本明細書において開示されるクローン１２２のような転移性マーカーのいくつかは、非転移性細胞に比較して転移性細胞においてアップレギュレートされる。クローン３３７および２８０のような転移性マーカーのいくつかは、非転移性細胞に比較して転移性細胞においてダウンレギュレートされる。これらの関係およびマーカーの同定は、以下にさらに記載するような試薬の処方および方法を可能にする。さらに、公知のタンパク質との相同性が、同定されており、これは、開示されたタンパク質の機能を示唆する。例えば、転写物２８０は、ヒトＮ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼ前駆体に相同であり、転写物２４５は、二機能性のＡＴＰスルフリラーゼ（ｓｕｌｆｕｒｙｌａｓｅ）−アデノシン５’−ホスホスルフェートキナーゼに相同であり、そして転写物１２２は、アスパルチルプロテアーゼであるヒトペプシノーゲンｃに相同である。
【００２７】
本発明の別の知見は、新規のアスパルチル型のプロテアーゼであるＣＳＰ５６が、高転移性の癌（特に、乳癌および直腸癌）において過剰発現しており、そして転移状態の原発性の腫瘍の進行に関係していることである。この情報は、ＣＳＰ５６遺伝子の発現産物に特異的な診断試薬の作製に利用し得る。これはまた、癌（特に、乳癌および直腸癌）の適切な治療法の計画のための臨床医の助けとなる診断および予後の方法に用い得る。
【００２８】
ＣＳＰ５６タンパク質のアミノ酸配列を、配列番号１９に示す。本発明の新規のポリヌクレオチドにコードされるアミノ酸配列は、特定のポリヌクレオチド配列の３つずつのリーディングフレームについて翻訳プログラムを実行することにより予測され得る。配列番号１〜１７で示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる転移性マーカータンパク質、配列番号１９に示されるＣＳＰ５６タンパク質、あるいはＣＳＰ５６を含む天然または非天然に生じる転移性マーカータンパク質の生物学的に活性なタンパク質改変体は、本発明の診断および治療の方法に用いられ得る。ＣＳＰ５６改変体を含む生物学的に活性な転移性マーカータンパク質改変体は、配列番号１〜１８を含むポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質と同じ生物学的活性を保持する。転移性マーカータンパク質の生物学的活性は、腫瘍組織と正常組織の間の（特に高転移性の可能性を有する腫瘍と正常な組織との間の）差異的発現を含む。ＣＳＰ５６の生物学的活性はまた、転移およびアスパルチル型プロテアーゼ活性を許容する能力を含む。
【００２９】
ＣＳＰ５６改変体を含む転移性マーカータンパク質改変体の生物学的活性は、当業者によって容易に決定され得る。例えば、改変体の差異的発現は、乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（Ｂｒｉｎｋｌｅｙら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４０、３１１８−２９、１９８０）、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５（Ｂｒｉｎｋｌｅｙら、１９８０）、ＭＣＦ−７、ＢＴ−２０、ＺＲ−７５−１、ＭＤＡ−ＭＢ−１５７、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＡｌａｂおよびＭＤＡ−ＭＢ−４６８、または結腸癌細胞株Ｋｍ１２ＣおよびＫｍ１２Ｌ４Ａのような転移能力が変化した細胞株において測定され得る。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株は、１９９８年５月１５日にＡＴＣＣに寄託された（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１２５３２）。Ｋｍ１２Ｃ細胞株は、１９９８年５月１５日にＡＴＣＣに寄託された（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１２５３３）。Ｋｍ１２Ｌ４Ａ細胞株は、１９９８年３月１９日にＡＴＣＣに寄託された（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１２４９６）。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞株は、１９９８年１０月９日にＡＴＣＣに寄託された（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１２５８３）。ＭＣＦ−７細胞株は、１９９８年１０月９日にＡＴＣＣに寄託された（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１２５８４）。
【００３０】
乳癌細胞株Ｈｓ５８Ｂｓｔのような非癌性細胞株での発現は、癌性細胞株における発現と比較され得る。あるいは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１またはＭＤＡ−ＭＢ−４３５のような高い転移能力を有する乳癌細胞株は、改変体をコードするポリヌクレオチドと接触され得、そして当業者に公知であるように、例えば、細胞分割あるいはタンパク質またはＤＮＡ合成をモニターすることにより、低い転移能力のものについてアッセイされ得る。潜在的なＣＳＰ５６改変体のアスパルチルプロテアーゼ活性はまた、例えば、Ｗｒｉｇｈｔら、Ｊ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．１６、１７１−８１（１９９７）に教示されるように測定され得る。
【００３１】
ＣＳＰ５６の変異体を含む天然に生じる生物学的に活性な転移性マーカータンパク質改変体が、ヒトまたはその他の種において見出され、そして配列番号１〜１８のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む。天然には生じない生物学的に活性な転移性マーカータンパク質改変体は、研究室において標準的なＤＮＡ組換え技術を用いて構築され得る。
【００３２】
好ましくは、天然または非天然に生じる生物学的に活性な転移性マーカータンパク質改変体は、配列番号１〜１８のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列に少なくとも６５％、７５％、８５％、９０％または９５％同一であるアミノ酸配列を有し、そしてこれらの性質は、程度において異なり得るが、類似した差異的発現パターンを有する。天然または非天然に生じる生物学的に活性なＣＳＰ５６改変体はまた、アスパルチル型プロテアーゼ活性を有する。さらに好ましくは、この改変体は、少なくとも９８％または９９％同一である。配列同一性％は、以下のパラメーターを有するアフィンギャップ（ａｆｆｉｎｅ ｇａｐ）検索を用いるＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを行なうコンピュータープログラムを用いて決定される：１２のギャップオープンペナルティーおよび１のギャップエクステンションペナルティー。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ（１９８１）２：４８２−４８９中に教示される。
【００３３】
生物学的または免疫学的活性を失うことなく、どのアミノ酸残基が置換、挿入または欠失し得るかの決定に関する手引きが、当該分野で周知であるＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアのようなコンピュータープログラムを用いて見出され得る。好ましくは、生物学的に活性な転移性マーカータンパク質改変体におけるアミノ酸変化が、保存的アミノ酸変化である（すなわち、類似した電荷または無電荷のアミノ酸との置換）。保存的アミノ酸化は、側鎖において関連するアミノ酸のファミリーの１つとの置換を含む。天然に生じるアミノ酸は、一般的に4つのファミリーに分けられる：酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミ
ン酸）、塩基性アミノ酸（リシン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性アミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）および無電荷極性アミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、シスチン、セリン、スレオニン、チロシン）。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、時々芳香族アミノ酸として連帯して分類される。単離された、ロイシンのイソロイシンまたはバリンでの置換、アスパラギン酸のグルタミン酸での置換、スレオニンのセリンでの置換、またはあるアミノ酸の構造的に関連したアミノ酸での同様の置換が、得られる転移性マーカータンパク質改変体の生物学的特性に主要な効果を有さないことと予想することは合理的である。例えば、単離された保存的アミノ酸置換は、特に、置換がプロテアーゼの触媒ドメインではない場合、ＣＳＰ５６のアスパルチルプロテアーゼ活性に主要な効果を有すとは予想されない。
【００３４】
転移性マーカータンパク質改変体はまた、生物学的活性を維持した、対立遺伝子改変体、種改変体、ムテイン、グリコシル化形態、他の分子との凝集的接合、および無関係な化学的部分と結合した共有結合を含む。共有結合性転移性マーカー改変体は、当該分野で公知のように、アミノ酸鎖またはＮ末端残基またはＣ末端残基に見出される基に対する機能性の連結により調製され得る。転移性マーカータンパク質の発現パターン、または例えば、ＣＳＰ５６のアスパルチルプロテアーゼ活性に影響を与えない領域の切断または欠失はまた、生物学的に活性な改変体である。
【００３５】
ムテインと呼ばれる変異体のサブセットは、セリンのような中性のアミノ酸がジスフィルド結合に関与しないシステイン残基と置換されているタンパク質の基である。これらの変異体は、天然に生じるタンパク質よりも広い範囲の温度にわたって安定であり得る。Ｍａｒｋら、米国特許第４，９５９，３１４号を参照のこと。
【００３６】
転移性マーカーポリペプチドは、全長転移性マーカータンパク質よりも少数のアミノ酸を含む。転移性マーカータンパク質ポリペプチドは、全長タンパク質または生物学的に活性な改変体において見られるのと同じ順序で配列番号１を含むポリヌクレオチドによってコードされる、少なくとも８、１０、１２、１５、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、または７００の、連続したアミノ酸；配列番号２または９を含むポリヌクレオチドによってコードされる、少なくとも８、１０、１２、１５、２５、５０、７５、１００、または１２５の連続したアミノ酸；配列番号３、４、５、８、または１０を含むポリヌクレオチドによってコードされる、少なくとも８、１０、１２、１５、２５、５０、７５、または１００の連続したアミノ酸；配列番号６を含むポリヌクレオチドによってコードされる、少なくとも８、１０、１２、１５、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、または８００の連続したアミノ酸；配列番号７を含むポリヌクレオチドによってコードされる、少なくとも８、１０、１２、１４、２５、５０、５５または６０の連続したアミノ酸；配列番号１１に含まれるポリヌクレオチドによってコードされる、少なくとも８、１０、１２、１５、２５、５０、７５、１００、１５０、または１６０の連続したアミノ酸；配列番号１２を含むポリヌクレオチドによってコードされる、少なくとも８、１０、１２、１５、２５、５０、７５、１００、１２５、または１３０の連続したアミノ酸；配列番号１３を含むポリヌクレオチドによってコードされる、少なくとも８、１０、１２、１５、２５、５０、７５、または１００の連続したアミノ酸；配列番号１４を含むポリヌクレオチドによってコードされる、少なくとも８、１０、１２、１５、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、または３００の連続したアミノ酸；配列番号１５を含むポリヌクレオチドによってコードされる、少なくとも８、１０、１２、１５、２５、５０、７５、１００、または１５０の連続したアミノ酸；配列番号１６を含むポリヌクレオチドによってコードされる、少なくとも８、１０、１２、１５、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、または１１００の連続したアミノ酸；あるいは、配列番号１７を含むポリヌクレオチドによってコードされる、少なくとも８、１０、１２、１５、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００の連続するアミノ酸を含み得る。ＣＳＰ５６ポリペプチドは、ＣＳＰ５６タンパク質または生物学的に活性な改変体の少なくとも８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、２０、２１、２３、２５、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３５、４０、５０、６０、７５、１００、１１１、１１２、１２０、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、または５００の、あるいはそれ以上のアミノ酸を含み得る。好ましいＣＳＰ５６ポリペプチドは、配列番号１９の少なくともアミノ酸１０６〜１１５、１０５〜１１６、１０４〜１１７、１００〜１２０、２９７〜３０６、２９６〜３０７、２９５〜３０８、２９０〜３２０、８〜２０、７〜２１、６〜２２、１〜３０、４６１〜４８９、４６０〜４９０、４５９〜４９１および４０７〜５１８を含む。その配列番号１〜１８のヌクレオチド配列を含むが、特定の転移性マーカーポリペプチド改変体の生物学的な特性に実質的に影響を与えない少数のアミノ酸置換を有するポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列と実質的に同等なアミノ酸を有するポリペプチド分子は、転移性マーカーポリペプチドの定義内である。
【００３７】
転移性マーカータンパク質またはポリペプチドは、例えば、当業者に周知である生化学的な技術を用いてヒト細胞から単離され得る。単離されかつ精製された転移性マーカータンパク質の調製物は、少なくとも８０％純粋であり；好ましくは、その調製物は、少なくとも９０％、９５％、９８％または９９％純粋である。転移性マーカータンパク質およびポリペプチドはまた、組換えＤＮＡ法または、合成化学的方法により産生され得る。組換え転移性マーカータンパク質またはポリペプチド産生のために、配列番号１〜１８から選択したコード配列が、公知の原核生物または真核生物の発現系において発現され得る。細菌、酵母、昆虫または哺乳動物の発現系が、当該分野で公知であるように用いられ得る。あるいは、固相ペプチド合成のような合成化学法を、転移性マーカータンパク質またはポリペプチドの合成に用い得る。生物学的に活性なタンパク質またはポリペプチド改変体を、同様に産生し得る。
【００３８】
本発明の転移性マーカータンパク質の連続するアミノ酸を含む融合タンパク質がまた、構築され得る。融合タンパク質は、転移性マーカータンパク質アミノ酸配列に対する抗体を作製するため、および種々のアッセイ系に用いるために有用である。例えば、ＣＳＰ５６融合タンパク質は、ＣＳＰ５６タンパク質と相互作用するタンパク質、および例えば、そのアスパルチルプロテアーゼ活性、その差異的発現、またはその転移を許容する能力に影響するタンパク質の同定に用いられ得る。タンパク質アフィニティークロマトグラフィーのような物理的な方法、または酵母２ハイブリッドまたはファージディスプレイ系のようなタンパク質−タンパク質相互作用のためのライブラリーに基づいたアッセイはまた、この目的のために用いられ得る。そのような方法は、当該分野で周知であり、そして薬物のスクリーニングに用いられ得る。
【００３９】
融合タンパク質は、ペプチド結合によってお互いに融合した２つのタンパク質セグメントを含む。この第１のタンパク質セグメントは、配列番号１を含むポリヌクレオチドによってコードされた少なくとも８、１０、１２、１５、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、または７００の連続したアミノ酸；配列番号２または９を含むポリヌクレオチドによってコードされた少なくとも８、１０、１２、１５、２５、５０、７５、１００、または１２５の連続したアミノ酸；配列番号３、４、５、８または１０を含むポリヌクレオチドによってコードされた少なくとも８、１０、１２、１５、２５、５０、７５、または１００の連続したアミノ酸；配列番号６を含むポリヌクレオチドによってコードされた少なくとも８、１０、１２、１５、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０または８００の連続したアミノ酸；配列番号７を含むポリヌクレオチドによってコードされた少なくとも８、１０、１２、１４、２５、５０、５５または６０の連続したアミノ酸；配列番号１１を含むポリヌクレオチドによってコードされた少なくとも８、１０、１２、１５、２５、５０、７５、１００、１５０または１６０の連続したアミノ酸；配列番号１２を含むポリヌクレオチドによってコードされた少なくとも８、１０、１２、１５、２５、５０、７５、１００、１２５または１３０の連続したアミノ酸；配列番号１３を含むポリヌクレオチドによってコードされた少なくとも８、１０、１２、１５、２５、５０、７５または１００の連続したアミノ酸；配列番号１４を含むポリヌクレオチドによってコードされた少なくとも８、１０、１２、１５、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５または３００の連続したアミノ酸；配列番号１５を含むポリヌクレオチドによってコードされた少なくとも８、１０、１２、１５、２５、５０、７５、１００または１５０の連続したアミノ酸；配列番号１６を含むポリヌクレオチドによってコードされた少なくとも８、１０、１２、１５、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０または１１００の連続したアミノ酸；または配列番号１７を含むポリヌクレオチドによってコードされた少なくとも８、１０、１２、１５、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０または５００の連続したアミノ酸；またはＣＳＰ５６タンパク質の少なくとも８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、２０、２１、２３、２５、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３５、４０、５０、６０、７５、１００、１１１、１１２、１２０、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５または５００の連続したアミノ酸からなる。このアミノ酸は、配列番号１〜１８を含むポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列、またはそれらの配列の生物学的に活性な改変体から選択され得る。この第１のタンパク質セグメントはまた、全長転移性マーカータンパク質であり得る。この第１のタンパク質セグメントは、便利なようにＮ末端またはＣ末端であり得る。
【００４０】
第２のタンパク質セグメントは、全長タンパク質またはタンパク質フラグメントあるいはポリペプチドであり得る。タンパク質は、一般的に、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む自己蛍光タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ルシフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）を含む融合タンパク質構築物に用いた。さらに、エピトープタグは、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ−Ｇタグおよびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグを含む融合タンパク質の構築に用いられる。他の融合構築物は、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ−タグ、Ｌｅｘ Ａ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合体、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン融合体、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合体を含み得る。
【００４１】
これらの融合体は、例えば、２つのタンパク質セグメントの共有結合によるか、または分子生物学の分野において標準的な手順により作製され得る。組換えＤＮＡ法は、当該分野で公知のように、例えば、第２のタンパク質セグメントをコードし、そして宿主細胞においてＤＮＡ構築物を発現するヌクレオチドと適切なリーディングフレームにおいて配列番号１〜１８から選択されるコード配列を含むＤＮＡ構築物の作製によって、融合タンパク質を調製するために用いられ得る。融合タンパク質を構築するための多くのキットが、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ）、ＭＢＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＭＩＣ；Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ、ＭＡ）およびＱｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ、Ｃａｎａｄａ；１−８８８−ＤＮＡ−ＫＩＴＳ）を含む、実験のための器具を研究室に供給する会社より入手可能である。
【００４２】
単離した転移性マーカータンパク質、ポリペプチド、生物学的に活性な変異体、または融合タンパク質は、転移性マーカータンパク質のエピトープと特異的に結合する抗体の調製物を得るための免疫原として用いられ得る。この抗体は、ヒト組織、特にヒト腫瘍またはそれらの画分において、特に、ＣＳＰ５６のような転移性マーカータンパク質を検出するために用い得る。抗体はまた、転移性マーカータンパク質の過少発現もしくは過剰発現、またはサイズもしくは電気泳動移動度が変化した転移性マーカータンパク質の発現を生じる、ＣＳＰ５６遺伝子のような転移性マーカータンパク質での変異の存在の検出に用いられ得る。例えば、抗体がＣＳＰ５６に結合することにより、ＣＳＰ５６アスパルチル型プロテアーゼ活性または転移を可能にするＣＳＰ５６の能力もまた阻害し得る。
【００４３】
転移性マーカータンパク質、ポリペプチド、融合タンパク質または生物学的に活性な改変体のエピトープに特異的に結合する抗体は、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、免疫組織化学的アッセイ、免疫沈降または他の当該分野で公知の免疫化学的アッセイを含むがそれに限定されない免疫化学的アッセイに用い得る。代表的には、本発明の抗体は、そのような免疫化学的アッセイに用いた場合、他のタンパク質により提供される検出シグナルに比べて少なくとも約５、約１０、または約２０倍高い検出シグナルを提供する。好ましくは、特定の転移性マーカータンパク質のエピトープに特異的に結合する抗体は、免疫化学的アッセイにおいて他のタンパク質を検出せず、そして溶液からのその転移性マーカータンパク質または転移性マーカータンパク質のポリペプチドフラグメントを免疫沈降し得る。
【００４４】
転移性マーカータンパク質特異的抗体は、配列番号１〜１８のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列またはそれらのアミノ酸配列の生物学的に活性な改変体を有する転移性マーカータンパク質内に存在するエピトープに特異的に結合する。代表的には、少なくとも６、８、１０、または１２の連続したアミノ酸が、エピトープの形成に必要とされる。しかし、連続しないアミノ酸を含むエピトープは、例えば少なくとも１５、２５、または５０のアミノ酸をさらに必要とし得る。好ましくは、転移性マーカータンパク質のエピトープは、他のヒトタンパク質には存在しない。
【００４５】
特に抗原性である転移性マーカータンパク質のエピトープは、例えば、抗原性について転移性マーカータンパク質のポリペプチドフラグメントの慣用的なスクリーニングにより、または転移性マーカータンパク質のアミノ酸配列に対するタンパク質の抗原性領域の選択のための理論的な方法を適用することにより選択され得る。そのような方法は、例えば、ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８、３８２４−２８（１９８１）、ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄ、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０、４８３−８９（１９８３）、ならびにＳｕｔｃｌｉｆｆｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９、６６０−６６（１９８３）に教示される。図３を参照することにより、他のアスパルチルプロテアーゼと交差反応する抗体にまた結合し得るＣＳＰ５６の抗原性領域が、回避され得る。
【００４６】
当該分野で公知の抗体の任意の型を、転移性マーカータンパク質のエピトープに特異的に結合するために作製し得る。例えば、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の調製は、当該分野で周知の標準的な方法を用いて行われ得る。同様に、一本鎖の抗体もまた、調製され得る。転移性マーカータンパク質のエピトープに特異的に結合する一本鎖の抗体が、例えば、当該分野で公知の一本鎖免疫グロブリンディスプレイライブラリーから単離され得る。このライブラリーは、転移性マーカータンパク質のアミノ酸配列に対して「パニング」され、そして転移性マーカータンパク質の異なるエピトープに対して高い親和性で結合する多くの単鎖抗体が、単離され得る。Ｈａｙａｓｈｉら、１９９５、Ｇｅｎｅ １６０：１２９−３０。一本鎖の抗体はまた、テンプレートとしてハイブリドーマｃＤＮＡを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のようなＤＮＡ増幅法を用いて構築され得る。Ｔｈｉｒｉｏｎら、１９９６、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｅｖ．５：５０７−１１。
【００４７】
単鎖抗体は、単一特異的または二重特異的であり得、そして二価または四価であり得る。四価の二重特異的単鎖抗体の構築が、例えば、ＣｏｌｏｍａおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ、１９９７、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：１５９−６３に教示される。二価の二重特異的１本鎖抗体の構築が、特に、ＭａｌｌｅｎｄｅｒおよびＶｏｓｓ、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１９９−２０６に教示される。
【００４８】
単鎖抗体をコードするヌクレオチド配列は、手動合成または自動ヌクレオチド合成を用いて構築され得、標準的な組換えＤＮＡ方法を用いて発現構築物中にクローニングされ、そして以下のコード配列を発現するための細胞中に導入され得る。あるいは、単鎖抗体は、例えば、糸状のファージ技術を用いて直接産生され得る。Ｖｅｒｈａａｒら、１９９５、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６１：４９７−５０１；Ｎｉｃｈｏｌｌｓら、１９９３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１６５：８１−９１。
【００４９】
モノクローナルおよび他の抗体はまた、それを治療的に用いた場合、患者が抗体に対する免疫応答を生じることを防ぐために「ヒト化」され得る。そのような抗体は、治療に直接用いるヒト抗体に対する配列に十分に類似し得るか、または少数の鍵となる残基の変更を必要とし得る。例えば、げっ歯類の抗体とヒト配列の間の配列の違いは、例えば、個々の残基の部位特異的変異誘発、または完全な相補性決定領域をグレーティングする（ｇｒａｔｉｎｇ）ことにより、ヒト配列における残基と異なる残基との置換により最小化され得る。あるいは、当業者は、ＧＢ２１８８６３８Ｂに記載される組換え方法を用いてヒト化された抗体を産生し得る。転移性マーカータンパク質のエピトープに特異的に結合する抗体は、Ｕ．Ｓ．５，５６５，３３２に開示されるような、部分的または完全にのいずれかでヒト化された抗原結合部位を含み得る。
【００５０】
抗体の他の型が、構築され、そして本発明の方法で治療的に用いられ得る。例えば、キメラ抗体が、例えば、ＷＯ９３／０３１５１に開示されるように構築され得る。免疫グロブリンに由来する結合タンパク質およびＷＯ９４／１３８０４に記載される「ｄｉａｂｏｄｉｅｓ」のような多価および多特異的である結合タンパク質がまた、調製され得る。
【００５１】
本発明の抗体は、当該分野で周知の方法により精製され得る。例えば、抗体は、転移性マーカータンパク質、ポリペプチド、変異体または融合タンパク質が結合するカラムに抗体を通すことによりアフィニティー精製され得る。次いで、結合した抗体は、高塩濃度の緩衝液を用いてカラムから溶出され得る。
【００５２】
本発明はまた、転移性マーカータンパク質、ポリペプチド、改変体または融合タンパク質をコードするサブゲノムポリヌクレオチドを提供し得る。サブゲノムポリヌクレオチドは、全染色体は含まない。好ましくは、サブゲノムポリヌクレオチドは、イントロンを有さない。単離された転移性マーカータンパク質サブゲノムポリヌクレオチドは、少なくとも、配列番号１の８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１５５０、１６００、１６５０、１７００、１７５０、１８００、１８５０、１９００、１９５０、２０００、２０５０、２１００、２１５０、または２２００の連続したヌクレオチド；配列番号２または９の少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０または４００の連続したヌクレオチド；配列番号６の少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１５５０、１６００、１６５０、１７００、１７５０、１８００、１８５０、１９００、１９５０、２０００、２２５０または２５００の連続したヌクレオチド；配列番号７の少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０または１７５の連続したヌクレオチド；配列番号８の少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００または３５０の連続したヌクレオチド；配列番号１２の少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００または３５０の連続したヌクレオチド；配列番号３、４、５、または１０の少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０または３００の連続したヌクレオチド；配列番号１１の少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０または５００の連続したヌクレオチド；配列番号１３の少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０または３００の連続したヌクレオチド；配列番号１４の少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００または９５０の連続したヌクレオチド；配列番号１５の少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００または４５０の連続したヌクレオチド；配列番号１６の少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１５５０、１６００、１６５０、１７００、１７５０、１８００、１８５０、１９００、１９５０、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３２５０または３５００の連続したヌクレオチド；配列番号１７の少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０または１５００の連続したヌクレオチドを含むか、または配列番号１〜１７の１つを含み得る。
【００５３】
ＣＳＰ５６ポリヌクレオチドは、配列番号１８より選択した少なくとも１０、１１、１２、１５、２０、２４、２５、３０、３２、３３、３５、３６、４０、４２、４５、４８、５０、５１、５４、６０、６３、６９、７０、７４、７５、８０、８４、８７、９０、９３、９６、９９、１００、１０５、１１４、１２０、１２５、１５０、２２５、３００、３３３、３３６、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１５５０、１６００、１６５０、１７００、１７５０、１８００または１８５０ヌクレオチドの連続した配列を含み得るか、または配列番号１８を含み得る。単離されたＣＳＰ５６ポリヌクレオチドは、配列番号１９の少なくとも８、１０、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２５、２９、３０、３１、３２、４０、５０、７５、１００または１１１の連続したアミノ酸をコードし、そして配列番号１９に示される全アミノ酸配列をコードし得る。好ましいＣＳＰ５６ポリヌクレオチドは、配列番号１９の少なくともアミノ酸１〜３０、８〜２０、７〜２１、６〜２２、１０６〜１１５、１０５〜１１６、１０４〜１１７、１００〜１２０、２９７〜３０６、２９６〜３０７、２９５〜３０８、２９０〜３２０、４６１〜４８９、４６０〜４９０、４５９−４９１、および４０７−５１８をコードする。
【００５４】
配列番号１〜１８に示されるヌクレオチド配列の相補体は、配列番号１〜１８に示されるような連続するヌクレオチド配列を用いてワトソン−クリック塩基対を形成する連続するヌクレオチド配列である。配列番号１〜１８の相補体はまた、本発明のポリヌクレオチドである。コード配列の相補体は、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびプローブを提供するために使用され得る。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびプローブは、少なくとも１１、１２、１５、２０、２５、３０、５０、または１００の連続するヌクレオチドからなり得る。全体のコード配列の相補体もまた、使用され得る。配列番号１〜１８に示されるヌクレオチド配列の全てまたは一部分を含む二本鎖ポリヌクレオチド、ならびに転移マーカータンパク質特異的抗体またはリボザイムをコードするポリヌクレオチドはまた、本発明のポリヌクレオチドである。
【００５５】
転移マーカータンパク質および／または改変体のアミノ酸配列をコードする縮重ヌクレオチド配列、ならびに配列番号１〜１８に示されるヌクレオチド配列に少なくとも６５％、７５％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一である相同的ヌクレオチド配列もまた、本発明のポリヌクレオチドである。配列同一性％は、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用するコンピュータープログラム（例えば、以下のパラメーター：１２のギャップオープンペナルティおよび１のギャップエクステンションペナルティとともにアフィンギャップサーチ（ａｆｆｉｎｅ ｇａｐ ｓｅａｒｃｈ）を用いてＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）を実行するように）を使用して決定され得る。
【００５６】
代表的には、本発明の相同的ポリヌクレオチド配列は、当該分野において公知のように、ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行うことによって確認され得る。例えば、以下の洗浄条件−−２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、室温で２回、それぞれ３０分間；次いで、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃で３０分間を一回；次いで、２×ＳＳＣ、室温で２回、１０分間を使用して各相同配列を同定し得る。これは最も多くて約２５％〜３０％の塩基対のミスマッチを含む。より好ましくは、相同的核酸鎖は、１５〜２５％の塩基対のミスマッチを含み、さらにより好ましくは５〜１５％、２〜１０％、または１〜５％の塩基対のミスマッチを含む。本発明のポリヌクレオチドの相同性の程度は、当該分野において周知であり、そして例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、第２版（１９８９）のようなマニュアルに記載されるように、遺伝子ライブラリー（または他の遺伝物質供給源）由来のクローンの同定のための洗浄条件のストリンジェンシーを変化することによって選択され得る。
【００５７】
本発明のサブゲノムポリヌクレオチドの種相同体はまた、適切なプローブまたはプライマーを作製し、そしてｃＤＮＡ発現ライブラリーまたは他の種（例えば、マウス、サル、酵母または細菌）由来のゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって同定され得る。完全なポリヌクレオチド配列は、重複しているクローンである、５’ＲＡＣＥのライブラリーの染色体ウォーキング、スクリーニング、または当該分野において周知の他の技術によって得られ得る。相同性が１％減少するごとに、二本鎖ＤＮＡのＴmは、１〜１．５℃減少することが周知である（Ｂｏｎｎｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８１、１２３（１９７３））。従って、相同的なヒトポリヌクレオチドまたは他種のポリヌクレオチドは、例えば、推定相同ポリヌクレオチドを、配列番号１〜１８のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとハイブリダイズし、試験ハイブリッドの融点と、配列番号１〜１８のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドおよびこのヌクレオチド配列と完全に相補的なポリヌクレオチドを含むハイブリッドの融点とを比較し、そして試験ハイブリッド内の塩基対ミスマッチの数を計算することにより、同定され得る。
【００５８】
ストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件に従って、配列番号１〜１８に示されるヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列はまた、本発明のサブゲノムポリヌクレオチドである。ストリンジェントな洗浄条件は、周知でありかつ当該分野において理解され、そして例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、９．５０〜９．５１頁に開示される。
【００５９】
代表的には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件について、温度と塩濃度との組み合せは、研究中に算出したハイブリッドのＴmよりおおよそ１２〜２０℃下を選択すべきである。配列番号１〜１８に示されるポリヌクレオチド配列とその配列に６５％、７５％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なポリヌクレオチド配列との間のハイブリッドのＴmは、例えば、ＢｏｌｔｏｎおよびＭｃＣａｒｔｈｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．４８，１３９０（１９６２）の方程式：
Ｔｍ＝８１．５℃−１６．６（ｌｏｇ10［Ｎａ+］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６３（％ホルムアミド）−６００／ｌ）、
ここで、ｌ＝ハイブリッドの塩基対の長さ、を使用して算出され得る。
【００６０】
ストリンジェントな洗浄条件は、例えば、６５℃で４×ＳＳＣ、または５０％ホルムアミド、４２℃で４×ＳＳＣ、または６５℃で０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含む。高ストリンジェントな洗浄条件は、例えば、６５℃で０．２×ＳＳＣを含む。
【００６１】
サブゲノムポリヌクレオチドは、標準的な核酸精製技術を使用して、他のヌクレオチド配列がないように精製され得る。例えば、制限酵素およびプローブは、転移マーカータンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを単離するために使用され得る。あるいは、ＰＣＲは、このようなポリヌクレオチドを合成および増幅するために使用され得る。単離されかつ精製されたポリヌクレオチドの調製物の少なくとも９０％は、ポリヌクレオチドをコードする転移マーカータンパク質を含む。
【００６２】
転移マーカータンパク質をコードする相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）分子はまた、本発明のサブゲノムポリヌクレオチドである。ｃＤＮＡ分子は、ｍＲＮＡをテンプレートとして使用する標準的な分子生物学的技術を用いて生成され得る。その後、ｃＤＮＡ分子は、当該分野で公知のそしてＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９のようなマニュアルに開示される分子生物学的技術を使用して複製され得る。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような増幅技術は、テンプレートとしてヒトゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのいずれかを使用して、本発明のサブゲノムポリヌクレオチドのさらなるコピーを得るために使用され得る。
【００６３】
あるいは、合成化学技術が、本発明のサブゲノムポリヌクレオチド分子を合成するために使用され得る。ゲノムコードの縮重は、代替のヌクレオチド配列が合成されるのを可能にし、これは、配列番号１〜１７から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列、配列番号１９に示されるようなＣＳＰ５６アミノ酸配列、またはこれらの配列の生物学的活性の改変体を有する転移マーカータンパク質をコードする。このような全てのヌクレオチド配列は、本発明の範囲内である。
【００６４】
本発明はまた、例えば、ノザンまたはサザンブロッティングのようなハイブリダイゼーションプロトコルまたはインサイチュハイブリダイゼーションにおいて、転移マーカーポリペプチド配列を検出するために使用され得るポリヌクレオチドプローブを提供する。本発明のポリヌクレオチドプローブは、配列番号１〜１８から選択される、少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、または４０以上の連続するヌクレオチドを含む。本発明のポリヌクレオチドプローブは、検出標識（例えば、放射性同位体標識、蛍光標識、酵素標識、または化学発光標識）を含み得る。
【００６５】
単離されたポリヌクレオチドは、例えば、このポリヌクレオチドのさらなるコピーを得るためのプライマーとして、またはｍＲＮＡを検出するためのプローブとして使用され得る。ポリヌクレオチドはまた、転移マーカータンパク質ｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、生物学的活性改変体、単鎖抗体、リボザイムまたは融合タンパク質を発現するために使用され得る。上記の任意のポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡの構築物のような構築物中に存在し得る。この構築物は、ベクターであり得、そして例えばこのポリヌクレオチドの増殖のために、ポリヌクレオチドを細胞へ移入するために使用され得る。構築物は、直鎖状分子または環状分子であり得る。それらは、自律複製分子上であり得、または複製配列がない分子上であり得る。そしてそれら構築物は、当該分野において公知のように、それら自体によって、または他の調節配列によって調節され得る。
【００６６】
構築物はまた、発現構築物であり得る。発現構築物は、選択された宿主細胞において機能的であるプロモーターを含む。例えば、当業者は、当該分野で公知であり使用される多くの数の細胞型特異的プロモーターから適切なプロモーターを容易に選択し得る。この発現構築物はまた、宿主細胞中で機能的である転写ターミネーターを含み得る。この発現構築物は、例えば、転移マーカータンパク質の全てまたは一部分、ポリペプチド、生物学的活性改変体、抗体、リボザイム、または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドセグメントを含む。このポリヌクレオチドセグメントは、プロモーターから下流に位置する。ポリヌクレオチドセグメントの転写は、プロモーターで開始する。この発現構築物は、直鎖状または環状であり得、そして所望される場合、自律複製配列を含み得る。
【００６７】
サブゲノムポリヌクレオチドは、当該分野において周知の技術を使用して、ベクターおよび細胞株において増殖され得る。細菌における発現系は、Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７５：６１５、Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２８１：５４４、Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８０）８：４０５７、ＥＰ３６，７７６、米国特許第４，５５１，４３３号、ｄｅＢｏｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３）８０：２１−２５、およびＳｉｅｂｅｎｌｉｓｔら、Ｃｅｌｌ（１９８０）２０：２６９に記載される発現系を含む。
【００６８】
酵母における発現系は、Ｈｉｎｎｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：１９２９；Ｉｔｏら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８３）１５３：１６３；Ｋｕｒｔｚら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８６）６：１４２；Ｋｕｎｚｅら、Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８５）２５：１４１；Ｇｌｅｅｓｏｎら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８６）１３２：３４５９、Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８６）２０２：３０２）Ｄａｓら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８４）１５８：１１６５；Ｄｅ Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８３）１５４：７３７、Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９０）８：１３５；Ｋｕｎｚｅら、Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８５）２５：１４１；Ｃｒｅｇｇら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８５）５：３３７６、米国特許第４，８３７，１４８号、米国特許第４，９２９，５５５号；ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ、Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）３００：７０６；Ｄａｖｉｄｏｗら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８５）１０：３８０、Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８５）１０：４９、Ｂａｌｌａｎｃｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９８３）１１２：２８４−２８９；Ｔｉｌｂｕｒｎら、Ｇｅｎｅ（１９８３）２６：２０５−２２１、Ｙｅｌｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１：１４７０−１４７４、ＫｅｌｌｙおよびＨｙｎｅｓ、ＥＭＢＯ Ｊ．（１９８５）４：４７５４７９；ＥＰ２４４，２３４およびＷＯ ９１／００３５７に記載される発現系を含む。
【００６９】
昆虫におけるサブゲノムポリヌクレオチドの発現は、米国特許第４，７４５，０５１号、Ｆｒｉｅｓｅｎら（１９８６）「バキュロウイルス遺伝子発現の調節」：ＴＨＥ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ ＯＦ ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳＥＳ（Ｗ．Ｄｏｅｒｆｌｅｒ編）、ＥＰ１２７，８３９、ＥＰ１５５，４７６、およびＶｌａｋら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）６９：７６５−７７６、Ｍｉｌｌｅｒら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８８）４２：１７７、Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら、Ｇｅｎｅ（１９８８）７３：４０９、Ｍａｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１５：５９２−５９４、Ｌｅｂａｃｑ−Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎら、Ｍｏｌ．Ｃａｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８８）８：３１２９；Ｓｍｉｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８５）８２：８４０４、Ｍｉｙａｊｉｍａら、Ｇｅｎｅ（１９８７）５８：２７３；およびＭａｒｔｉｎら、ＤＮＡ（１９８８）７：９９に記載されるように達成され得る。多くのバキュロウイルス株および改変体および対応する宿主由来の許容昆虫宿主細胞は、Ｌｕｃｋｏｗら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６：４７−５５、Ｍｉｌｌｅｒら、ＧＥＮＥＴＩＣ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ（Ｓｅｔｌｏｗ，Ｊ．Ｋ．ら編）、第８巻（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、１９８６）、２７７〜２７９頁、ならびにＭａｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ，（１９８５）３１５：５９２−５９４に記載される。
【００７０】
サブゲノムポリヌクレオチドの哺乳動物発現は、Ｄｉｊｋｅｍａら、ＥＭＢＯ Ｊ．（１９８５）４：７６１、Ｇｏｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２ｂ）７９：６７７７、Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ（１９８５）４１：５２１および米国特許第４，３９９，２１６号に記載されるよに達成され得る。哺乳動物発現の他の特徴は、ＨａｍおよびＷａｌｌａｃｅ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．（１９７９）５８：４４、ＢａｒｎｅｓおよびＳａｔｏ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８０）１０２：２５５、米国特許第４，７６７，７０４号、米国特許第４，６５７，８６６号、米国特許第４，９２７，７６２号、米国特許第４，５６０，６５５号、ＷＯ ９０／１０３４３０、ＷＯ ８７／００１９５号、ならびに米国特許再発行３０，９８５に記載されるように容易にされ得る。
【００７１】
サブゲノムポリヌクレオチドは、直鎖状分子または環状分子であり得る。それらは、自律複製分子上または複製配列をもたない分子上にあり得る。それらは、当該分野において公知であるようにそれら自体によって、または他の調節配列によって調節され得る。サブゲノムポリヌクレオチドは、当該分野において利用可能な種々の技術（例えば、トランスフェリン−ポリカチオン媒介ＤＮＡ移入、裸の核酸またはカプセル化核酸を用いたトランスフェクション、リポソーム媒介ＤＮＡ移入、ＤＮＡコートラテックスビーズの細胞内輸送、プロトプラスト融合、ウイルス感染、エレクトロポレーション、およびリン酸カルシウム媒介トランスフェクション）を使用して、適切な宿主細胞へ導入され得る。
【００７２】
本発明のポリヌクレオチドはまた、ｍＲＮＡまたはオリゴヌクレオチド（天然のｍＲＮＡまたはその相補体のいずれかの配列を有する）、全長タンパク質、融合タンパク質、ポリペプチド、またはリボザイム、または単鎖抗体を細胞（好ましくは真核生物細胞）に送達する目的のために、遺伝子送達ビヒクルにおいて使用され得る。本発明に従って、遺伝子送達ビヒクルは、例えば裸のプラスミドＤＮＡ、本発明のポリヌクレオチドを含むウイルス発現ベクター、またはリポソームもしくは縮合試薬と連結した本発明のポリヌクレオチドであり得る。
【００７３】
本発明の１つの実施態様において、この遺伝子送達ビヒクルは、プロモーターおよび本明細書中に開示されるポリヌクレオチドの１つを含む。好ましいプロモーターは、組織特異的プロモーターならびに細胞増殖によって活性化されるプロモーター（例えば、チミジンキナーゼプロモーターおよびチミジレートシンターゼプロモーター）である。他の好ましいプロモーターは、ウイルス感染により活性化され得るプロモーター（例えば、α−およびβ−インターフェロンプロモーター）、ならびにホルモンによって活性化され得るプロモーター（例えば、エストロゲン）を含む。使用され得る他のプロモーターは、モロニーウイルスＬＴＲ、ＣＭＶプロモーター、およびマウスアルブミンプロモーターを含む。
【００７４】
遺伝子送達ビヒクルは、ウイルスの複製またはパッケージングシグナルの起源のようなウイスル配列を含み得る。これらのウイルス配列は、アストロウイルス、コロナウイルス、オルトミクソウイルス、パポバウイルス、パラミクソウイルス、パルボウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、レトロウイルス、トガウイルスまたはアデノウイルスのようなウイルスから選択され得る。好ましい実施態様において、この遺伝子送達ビヒクルは、組換えレトロウイルスベクターである。組換えレトロウイルスおよびそれらの種々の使用は、以下を含む多くの参考文献に記載されている；例えば、Ｍａｎｎら、Ｃｅｌｌ ３３：１５３、１９８３、ＣａｎｅおよびＭｕｌｌｉｇａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６３４９、１９８４、Ｍｉｌｌｅｒら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：５−１４、１９９０、米国特許番号第４，４０５，７１２号、同第４，８６１，７１９号、ならびに同第４，９８０，２８９号、ならびにＰＣＴ出願番号ＷＯ ８９／０２，４６８、同ＷＯ ８９／０５，３４９、ならびに同ＷＯ ９０／０２，８０６。多くのレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルは、例えば、以下に記載の例を含め本発明において利用され得る；ＥＰ ０，４１５，７３１；ＷＯ ９０／０７９３６；ＷＯ ９４／０３６２２；ＷＯ ９３／２５６９８；ＷＯ ９３／２５２３４；米国特許第５，２１９，７４０号；ＷＯ ９３１１２３０；ＷＯ ９３１０２１８；ＶｉｌｅおよびＨａｒｔ、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：３８６０−３８６４、１９９３；ＶｉｌｅおよびＨａｒｔ、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：９６２−９６７、１９９３；Ｒａｍら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：８３−８８、１９９３；Ｔａｋａｍｉｙａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．３３：４９３−５０３、１９９２；Ｂａｂａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７９：７２９−７３５、１９９３（米国特許第４，７７７，１２７号、ＧＢ ２，２００，６５１、ＥＰ ０，３４５，２４２、ならびにＷＯ ９１／０２８０５）。
【００７５】
特定の好ましいレトロウイルスは、ニワトリ白血病ウイルス（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−５３５およびＶＲ−２４７）、ウシ白血病ウイルス（ＶＲ−１３１５）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、ミンク細胞フォーカス形成ウイルス（Ｋｏｃｈら、Ｊ．Ｖｉｒ．４９：８２８、１９８４；およびＯｌｉｆｆら、Ｊ．Ｖｉｒ．４８：５４２、１９８３）、マウス肉腫ウイルス（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−８４４、４５０１０および４５０１６）、細網内皮症ウイルス（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−９９４、ＶＲ−７７０および４５０１１）、ラウス肉腫ウイルス、メイソン‐パイツァーサルウイルス、ヒヒ内因性ウイルス、内因性ネコレトロウイルス（例えば、ＲＤ１１４）、ならびにレトロウイルスベクターとして使用されるマウスもしくはラットｇＬ３０配列を含むレトロウイルス由来である。
【００７６】
組換えレトロウイルスが産生され得るＭＬＶの特定の好ましい株は、４０７０Ａおよび１５０４Ａ（ＨａｒｔｌｅｙおよびＲｏｗｅ、Ｊ．Ｖｉｒ．１９：１９、１９７６）、アーベルソン（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−９９９）、フレンド（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−２４５）、グラフィ（Ｒｕら、Ｊ．Ｖｉｒ．６７：４７２２、１９９３；およびＹａｎｔｃｈｅｖ Ｎｅｏｐｌａｓｍａ ２６：３９７．１９７９）、グロス（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−５９０）、キルステン（Ａｌｂｉｎｏら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６４：１７１０、１９８６）、ハーベイ肉腫ウイルス（Ｍａｎｌｙら、Ｊ．Ｖｉｒ．６２：３５４０、１９８８；およびＡｌｂｉｎｏら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６４：１７１０、１９８６）、ならびにラウシャー（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−９９８）、ならびにモロニーＭＬＶ（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−１９０）を含む。
【００７７】
特定の好ましい非マウスレトロウイルスは、ラウス肉腫ウイルスである。好ましいラウス肉腫ウイルスは、Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ（Ｍａｎｌｙら、Ｊ．Ｖｉｒ．６２：３５４０，１９８８；およびＡｌｂｉｎｏら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６４：１７１０，１９８６）、高力価ブライアン（Ｂｒｙａｎ）株（例えば、ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−３３４、ＶＲ−６５７、ＶＲ−７２６、ＶＲ−６５９およびＶＲ−７２８）、スタンダードブライアン株（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−１４０）、Ｃａｒｒ−Ｚｉｌｂｅｒ（Ａｄｇｉｇｈｉｔｏｖら、Ｎｅｏｐｌａｓｍａ２７：１５９，１９８０）、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ（Ｌａｕｒｅｎｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ９０８：２４１、１９８７）、Ｈａｒｒｉｓ、Ｐｒａｇｕｅ（例えば、ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−７７２および４５０３３）、ならびにＳｃｈｍｉｄｔ−Ｒｕｐｐｉｎ（例えばＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−７２４、ＶＲ−７２５、ＶＲ−３５４）ウイルスを含む。
【００７８】
任意の上記のレトロウイルスは、本明細書中に与えられる開示および当該分野で公知の標準組換え技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、およびＫｕｎｋｌｅ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：４８８、１９８５）によって、レトロウイルス遺伝子送達ビヒクルをアセンブリまたは構築するために容易に利用され得る。レトロウイルス発現ベクターの一部分は、異なるレトロウイルス由来であり得る。例えば、レトロベクターＬＴＲは、マウス肉腫ウイルス、ラウス肉腫ウイルス由来のｔＲＮＡ結合部位、マウス白血病ウイルス由来のパッケージングシグナル、およびニワトリ白血病ウイルスからの第二鎖合成の起点由来であり得る。これらの組換えレトロウイルスベクターは、形質導入コンピテントレトロウイルスベクター粒子を適切なパッケージング細胞株に導入することによって、それらを生成するために使用され得る（１９９１年１１月２９日に出願されたシリアル番号０７／８００，９２１号を参照のこと）。組換えレトロウイルスは産生され、これは組換えレトロウイルスゲノムを宿主細胞ＤＮＡの特定の領域に部位特異的に組込むことを指向する。このような部位特異的組込みは、レトロウイルス粒子に組込まれたキメラインテグラーゼによって媒介され得る（１９９５年５月２２日に出願されたシリアル番号０８／４４５，４６６を参照のこと）。組換えウイルス遺伝子送達ビヒクルは、複製欠陥組換えウイルスであることが好ましい。
【００７９】
上記のレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルを用いた使用に適切なパッケージング細胞株は、容易に調製され得（１９９４年５月９日に出願したシリアル番号０８／２４０，０３０を参照のこと；ＷＯ ９２／０５２６６もまた参照のこと）、そして組換えウイルス粒子の生成のための生成細胞株（ベクター細胞株または「ＶＣＬ」ともいう）を作製するために使用され得る。本発明の特定の好ましい実施態様において、パッケージング細胞株は、ヒト（例えばＨＴ１０８０細胞）またはミンク親細胞株から作製される。それによって、ヒト血清中において不活性のままでいられ得る組換えレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルの作製が可能となる。組換えレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルの構築物は、ＷＯ ９１／０２８０５に詳細に記載される。これらの組換えレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルは、それらを適切なパケージング細胞株に導入することによって形質導入コンピテントレトロウイルス粒子を生成するために使用され得る（シリアル番号０７／８００，９２１を参照のこと）。同様にアデノウイルス遺伝子送達ビヒクルはまた、容易に調製され得、そして本明細書中に提供される開示により利用され得る（Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６−６２７，１９８８およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４、１９９１、ＷＯ ９３／０７２８３、ＷＯ ９３／０６２２３、およびＷＯ ９３／０７２８２もまた参照のこと）。
【００８０】
遺伝子送達ビヒクルはまた、組換えアデノウイルス遺伝子送達ビヒクルであり得る。このようなビヒクルは、容易に調製され得、そして本明細書中に提供される開示より利用され得る（Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６、１９８８、およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１、１９９１、ＷＯ ９３／０７２８３、ＷＯ ９３／０６２２３、およびＷＯ ９３／０７２８２を参照のこと）。アデノ随伴ウイルス遺伝子送達ビヒクルもまた構築され得、そして本発明のタンパク質またはポリヌクレオチドを細胞にインビトロもしくはインビボで送達するために使用され得る。インビトロでのアデノ随伴ウイルス遺伝子送達ビヒクルの使用は、Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８：１４８５−１４８８（１９９２）、Ｗａｌｓｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９：７２５７−７２６１（１９９２）、Ｗａｌｓｈら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１４４０−１４４８（１９９４）、Ｆｌｏｔｔｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３７８１−３７９０（１９９３）、Ｐｏｎｎａｚｈａｇａｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：７３３−７３８（１９９４）、Ｍｉｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：１０１８３−１０１８７（１９９４）、Ｅｉｎｅｒｈａｎｄら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：３３６−３４３（１９９５）、Ｌｕｏら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２３：１２６１−１２６７（１９９５）、およびＺｈｏｕら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：２２３−２２９（１９９６）に記載される。これらのビヒクルのインビボでの使用は、Ｆｌｏｔｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：１０６１３−１０６１７（１９９３）およびＫａｐｌｉｔｔら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．８：１４８−１５３（１９９４）に記載される。
【００８１】
本発明の別の実施態様において、遺伝子送達ビヒクルは、トガウイルス由来である。好ましいトガウイルスは、アルファウイルス、特に米国シリアル番号０８／４０５，６２７（１９９５年３月１５日に出願された、ＷＯ ９５／０７９９４）に記載されるアルファウイルスを含む。シンドビスウイルスおよびＥＬＶＳウイルスを含むアルファウイルスは、本発明のポリヌクレオチドのための遺伝子送達ビヒクルであり得る。アルファウイルスは、ＷＯ ９４／２１７９２、ＷＯ ９２／１０５７８およびＷＯ ９５／０７９９４に記載される。いくつかの異なるアルファウイルス遺伝子送達ビヒクル系が構築され得、そして本発明に従ってポリヌクレオチドを細胞へ送達するために使用され得る。このような系の代表的な例は、米国特許第５，０９１，３０９号および同第５，２１７，８７９号において記載される系を含む。特に、本発明における使用のための特に好ましいアルファウイルス遺伝子送達ビヒクルは、ＷＯ ９５／０７９９４、および米国シリアル番号０８／４０５，６２７に記載されるビヒクルを含む。
【００８２】
好ましくは、組換えウイルスビヒクルは、シンドビスウイルスに基づく組換えアルファウイルスのウイスルビヒクルである。シンドビス構築物、ならびに多くの類似構築物は、米国シリアル番号０８／１９８，４５０に記載のように、基本的には容易に調製され得る。シンドビスウイルス性遺伝子送達ビヒクルは、代表的には、シンドビスウイルスの転写を開始し得る５’配列、シンドビス非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列、フラグメントの転写を妨げるために不活性化されるウイルス結合領域、およびシンドビスＲＮＡポリメラーゼ認識配列を含む。必要に応じて、ポリヌクレオチドの転写は減少され、増加され、または維持されるように、ウイルス結合領域が、改変され得る。当業者に理解されるように、他のアルファウイルス由来の対応する領域は、上記の領域との代わりに使用され得る。
【００８３】
アルファウイルス由来遺伝子送達ビヒクルのウイルス結合領域は、ポリヌクレオチドの転写を妨げるために不活性化された第１のウイルス結合領域、およびポリヌクレオチドの転写が減少されるように改変された第２のウイルス結合領域を含み得る。アルファウイルス由来ビヒクルはまた、ｃＤＮＡ由来のウイルスＲＮＡの合成を開始し得る５’プロモーター、および転写終止を制御する３’配列を含み得る。
【００８４】
本発明において利用され得る他の組換えトガウイルス遺伝子送達ビヒクルは、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−１２４７）、ミッデルブルグウイルス（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−３７０）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−１２４６）、ヴェネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ９２３；ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−１２４９；ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−５３２）由来のビヒクル、ならびに米国特許第５，０９１，３０９号および同第５，２１７，８７９号およびＷＯ ９２／１０５７８に記載のビヒクルを含む。上記のシンドビスビヒクル、ならびに多くの類似構築物は、米国シリアル番号０８／１９８，４５０に記載されるように本質的には容易に調製され得る。
【００８５】
本発明における使用に適する他のウイルス遺伝子送達ビヒクルは、例えば、ポリオウイスル（Ｅｖａｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３３９：３８５、１９８９、ならびにＳａｂｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ １：１１５、１９７３）（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−５８）；ライノウイルス（Ａｒｎｏｌｄら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｌ４０１、１９９０）（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−１１１０）；カナリア痘ウイルスまたはワクシニアウイルスのようなポックスウイルス（Ｆｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈら、ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：３１７、１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５６９：８６、１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ ８：１７、１９９０；米国４，６０３，１１２および米国４，７６９，３３０；ＷＯ ８９／０１９７３）（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−１１１；ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−２０１０）；ＳＶ４０（Ｍｕｌｌｉｇａｎら、Ｎａｔｕｒｅ ２７７：１０８、１９７９）（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−３０５）、（Ｍａｄｚａｋら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒ．７３：１５３３、１９９２）；インフルエンザウイルス（Ｌｕｙｔｊｅｓら、Ｃｅｌｌ ５９：１１０７、１９８９；ＭｃＭｉｃｈｅａｌら、Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３０９：１３、１９８３；ならびにＹａｐら、Ｎａｔｕｒｅ ２７３：２３８、１９７８）（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−７９７）；アデノ随伴ウイルスのようなパルボウイルス（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒ．６３：３８２２、１９８９、およびＭｅｎｄｅｌｓｏｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６６：１５４，１９８８）（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−６４５）；単純ヘルペスウイルス（Ｋｉｔら、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２１５：２１９、１９８９）（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−９７７；ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−２６０）；Ｎａｔｕｒｅ ２７７：１０８、１９７９）；ヒト免疫不全ウイルス（ＥＰＯ３８６，８８２、Ｂｕｃｈｓｃｈａｃｈｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒ．６６：２７３１，１９９２）；麻疹ウイルス（ＥＰＯ ４４０，２１９）（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−２４）；Ａ（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−１２４７），アウラ（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−３６８）、ベバルウイルス（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−６００；ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−１２４０）、Ｃａｂａｓｓｏｕ（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−９２２）、チクングニヤウイルス（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−６４；ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−１２４１）、Ｆｏｒｔ Ｍｏｒｇａｎ（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−９２４）、ゲタウイルス（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−３６９；ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−１２４３）、Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈ（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−９２７）、マヤロ（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−６６）、ムカンボウイルス（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−５８０；ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−１２４４）、ヌヅム（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−３７１）、ピクスナウイルス（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−３７２；ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−１２４５）、Ｔｏｎａｔｅ（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−９２５）、トリニティ（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−４６９）、ユナ（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−３７４）、ワタノワ（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−９２６）、Ｙ−６２−３３（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−３７５）、オニオンウイルス、東部脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−６５；ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−１２４２）、西部脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−７０；ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−１２５１；ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−６２２；ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−１２５２）ならびにコロナウイルス（Ｈａｍｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１２１：１９０，１９６６）（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−７４０）由来のビヒクルを含む。
【００８６】
本発明のポリヌクレオチドはまた、縮合試薬と組み合わされ得、そして遺伝子送達ビヒクルを形成し得る。好ましい実施態様において、縮合試薬は、ポリカチオン（例えば、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、プロタミン、スペルミン、スペルミジン、およびプトレッシン）である。このような結合を生成する多くの適切な方法は、当該分野において公知である（例えば、１９９４年１２月３０日に出願されたシリアル番号０８／３６６，７８７を参照のこと）。
【００８７】
代わりの実施態様において、ポリヌクレオチドは、リポソームと会合して、遺伝子送達ビヒクルを形成する。リポソームは、脂質二重層により囲まれた水性区画から構成される小さな、脂質小胞であり、代表的には球状であり、または直径数百オングストロームのわずかに伸長された構成物である。適切な条件下で、リポソームは、細胞の原形質膜と融合し得るか、またはリポソームをインターナリゼーションした細胞内のエンドサイトーシスな小胞の膜と融合し得、それによって、細胞質へその内容物を放出する。しかし、細胞の表面と相互作用する前に、リポソーム膜は、その内容物を、例えば、分解性酵素から分離しそして保護する比較的不透過性のバリアとして作用する。
【００８８】
リポソームは、合成構造であるため、所望の特徴を組込んだ、特に設計されたリポソームが生成される。Ｓｔｒｙｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２３６〜２４０頁、１９７５（Ｗ．Ｈ.Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）；Ｓｚｏｋａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ６００：１，１９８０；Ｂａｙｅｒら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．５５０：４６４，１９７９；Ｒｉｖｎａｙら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１４９：１１９，１９８７；Ｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：７８５１，１９８７、Ｐｌａｎｔら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７６：４２０，１９８９，ならびに米国特許第４，７６２，９１５号を参照のこと。リポソームは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、および本発明で開示されるポリヌクレオチドのようなポリヌクレオチドを含む発現構築物を含む種々の核酸分子をカプセル化し得る。
【００８９】
本発明における使用のためのリポソーム調製物には、カチオン性（正に荷電した）、アニオン性（負に荷電した）、および中性調製物が挙げられる。カチオン性リポソームは、プラスミドＤＮＡ（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１６，１９８７）、ｍＲＮＡ（Ｍａｌｏｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：６０７７−６０８１、１９８９）、および精製された転写因子（Ｄｅｂｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１０１８９−１０１９２，１９９０）の細胞内伝達を機能的形態において媒介するために、示される。カチオン性リポソームは、容易に入手可能である。例えば、Ｎ［１−２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）リポソームは、登録商標リポフェクチン（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹより）の名の下で入手可能である。Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：５１４８−５１５２．８７，１９９４もまた参照のこと。他の市販のリポソームには、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｃｅ（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ）が挙げられる。他のカチオン性リポソームは、当該分野において周知の技術を使用して、入手可能な物質から容易に調製され得る。例えば、ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）リポソームの合成の説明について、Ｓｚｏｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：４１９４−４１９８、１９７８；およびＷＯ ９０／１１０９２を参照のこと。
【００９０】
同様に、アニオン性および中性のリポソームが、例えば、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）から、容易に入手可能であるか、または容易に入手可能な物質を用いて容易に調製され得る。このような物質として、とりわけ、ホスファチジルコリン、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）が挙げられる。これらの物質はまた、出発物質ＤＯＴＭＡおよびＤＯＴＡＰと適切な比率で混合され得る。これらの物質を使用するリポソームの製造方法は、当該分野において周知である。
【００９１】
このリポソームは、多重ラメラ小胞（ＭＬＶ）、単ラメラ小胞（ＳＵＶ）、または大単ラメラ小胞（ＬＵＶ）を含む。この種々のリポソーム−核酸複合体は、当該分野において公知の方法を用いて調製される。例えば、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら、ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（１９８３）、１０１巻、５１２−５２７頁；Ｓｚｏｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：３４１０−３４１４、１９９０；Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ３９４：４８３，１９７５；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ １７：７７，１９７９；ＤｅａｍｅｒおよびＢａｎｇｈａｍ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ４４３：６２９，１９７６；Ｏｓｔｒｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．７６：８３６，１９７７；Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：３３４８，１９７９；ＥｎｏｃｈおよびＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：１４５，１９７９；Ｆｒａｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：１０４３１，１９８０；ＳｚｏｋａおよびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１４５，１９７９；およびＳｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１５：１６６，１９８２、を参照のこと。
【００９２】
さらに、リポタンパク質が、細胞への送達に関する本発明のポリヌクレオチドと共に含まれ得る。このようなリポタンパク質の例としては、キロミクロン、ＨＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬ、およびＶＬＤＬが挙げられる。これらのタンパク質の変異体、フラグメント、または融合体もまた、用いられ得る。アセチル化ＬＤＬのような、天然に存在するリポタンパク質の改変体もまた、用いられ得る。これらのリポタンパク質は、リポタンパク質レセプターを発現する細胞へのポリヌクレオチドの送達を標的にし得る。好ましくは、リポタンパク質が、ポリヌクレオチドと共に含まれる場合、他の標的リガンドは、この組成物に含まれない。
【００９３】
別の実施態様において、ＷＯ ９０／１１０９２および米国特許第５，５８０，８５９号に記載されるように、裸のポリヌクレオチド分子が、遺伝子送達ビヒクルとして用いられ得る。このような遺伝子送達ビヒクルは、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかであり得、特定の実施態様においては、死菌アデノウィルスと連結される。Ｃｕｒｉｅｌら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．３：１４７−１５４，１９９２。他の適切なビヒクルとしては、ＤＮＡ−リガンド（Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１６９８５−１６９８７，１９８９）、脂質−ＤＮＡ組み合わせ体（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７，１９８９）、リポソーム（Ｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：７８５１−７８５５，１９８７）およびマイクロプロジェクティル（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：２７２６−２７３０，１９９１）が挙げられる。
【００９４】
生分解性ラテックスビーズ上にこのポリヌクレオチドをコーティングすることにより、細胞内への裸のポリヌクレオチド取り込みの効率を増加し得る。このアプローチは、ラテックスビーズが、培養中の細胞と共にインキュベートされる場合、この細胞の核周囲の領域に有効に輸送および濃縮されるという知見を利用する。次いで、筋肉内に注射される場合、このビーズは細胞内へ輸送される。ポリヌクレオチドをコーティングしたラテックスビーズは、エンドサイトーシスが、このラテックスビーズにより開始された後、細胞中へ効率的に輸送されるので、遺伝子移入および発現効率を増大する。この方法は、ビーズを処理してこれらの疎水性を増大することにより、さらに改良され得、それによりエンドソームの分裂および細胞質内へのポリヌクレオチドの放出を促進する。
【００９５】
本発明はまた、乳房または結腸の組織サンプルのような、生物学的サンプル中の転移性マーカー遺伝子の発現を検出する方法を提供する。転移性マーカー遺伝子の発現の検出は、例えば、転移性組織の同定および組織の転移の可能性の同定に関して、身体の他の器官内での転移性癌の進行の危険性のある患者を同定するために有用である。
【００９６】
この組織サンプルは、例えば、固体組織または液体サンプルであり得る。タンパク質または核酸の発現産物は、組織サンプル中で検出され得る。１つの実施態様において、この組織サンプルは、転移性マーカータンパク質の存在に関してアッセイされる。この転移性マーカータンパク質は、配列番号１〜１８を含むポリヌクレオチドによりコードされる配列を有し、かつ本発明の転移性マーカータンパク質に特異的な抗体を用いて検出され得る。この抗体は、例えば、放射活性、蛍光、ビオチン化、または酵素学的タグで標識化され得、そして直接的に検出されるか、または（標識化した二次抗体を使用する）間接的な免疫化学的方法を用いて検出され得る。この転移性マーカータンパク質の存在は、（例えば、免疫細胞化学によって組織切片において、または溶解物中において、当該分野において公知であるようなウェスタンブロットを用いて）アッセイされ得る。
【００９７】
別の実施態様において、組織サンプルは転移性マーカータンパク質ｍＲＮＡの存在に関してアッセイされる。転移性マーカータンパク質ｍＲＮＡは、組織切片中のインサイチュハイブリダイゼーションまたはポリＡおよびｍＲＮＡを含むノーザンブロットにより検出され得る。転移性マーカータンパク質に特異的なプローブは、配列番号１〜１８に開示されるｃＤＮＡ配列を用いて生成され得る。このプローブは、８、１０、１１、１２、２０、２５、３０、３５、４０、４５、６０、７５、または１００ヌクレオチドの長さであり得るが、これらは、好ましくは１５〜５０ヌクレオチドの長さである。これらのプローブは、化学的に合成され得るか、または制限酵素を使用して、より長いポリヌクレオチドから生成され得る。これらのプローブは、例えば、放射活性、ビオチン化、または蛍光タグで、標識化され得る。所望される場合、この組織サンプルは、核酸増幅プロセスに供され得る。
【００９８】
配列番号１、４、１１、１６、１７、または１８を含むポリヌクレオチドの発現産物が検出される組織サンプルは、転移性か、または転移の可能性を有すると同定される。配列番号２、３、６、７、８、９、１０、１２、１３、または１５を含むポリヌクレオチドの発現産物が同定される組織サンプルは、転移性では無いか、または低い転移の可能性を有すると同定される。
【００９９】
結腸腫瘍の高いグレードまたは低いグレードの転移に関する傾向がまた、結腸腫瘍サンプルにおける配列番号１６または１７のヌクレオチド配列を含む遺伝子の発現産物を測定することによって予想され得る。配列番号１６のヌクレオチド配列を含む遺伝子の産物を発現する結腸腫瘍サンプルは、転移する高い傾向を有するものとして分類される。配列番号１７のヌクレオチド配列を含む遺伝子の産物を発現する結腸腫瘍サンプルは、転移する低い傾向を有するものとして分類される。
【０１００】
必要に応じて、組織サンプル中の特定の転移性マーカー発現産物のレベルが、定量され得る。定量は、例えば、組織サンプル中で検出される発現産物のレベルを、検量線中に存在する産物の量とを比較することによって達成され得る。比較は、視覚的または（コンピューター化された補助を伴うか、または伴わない）デンシトメトリーのような技術を用いて行われ得る。コントロールとしての使用のために、組織サンプルは、他のヒト、検査される患者の他の非癌性器官、または好ましくは、検査される患者由来の非転移性乳癌または結腸癌から単離され得る。
【０１０１】
本発明の転移性マーカー特異的試薬をコードするポリヌクレオチド（例えば、抗体プローブおよびヌクレオチドプローブ）は、生物学的サンプルにおいてこれらを検出するためのキットで供給され得る。このキットはまた、緩衝液または標識化成分、ならびに生物学的サンプル中の転移性マーカー発現産物を検出するための試薬を用いる指示を含み得る。
【０１０２】
細胞中の転移性マーカー遺伝子の発現は、所望により、増加され得るか、または減少され得る。転移性マーカー遺伝子の発現は、以下に記載されるように治療を目的に改変され得るか、または治療薬を同定するために用いられ得る。
【０１０３】
本発明の１つの実施態様において、転移性のマーカー遺伝子の発現が転移性の癌においてアップレギュレートされるその発現は、リボザイム（触媒活性を有するＲＮＡ分子）を用いて低下される。例えば、Ｃｅｃｈ，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：１５３２−１５３９：Ｃｅｃｈ，１９９０，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：５４３−５６８；Ｃｅｃｈ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：６０５−６０９；ＣｏｕｔｕｒｅおよびＳｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，１９９６，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１２：５１０−５１５を参照のこと。当該分野において公知であるように（例えば、Ｈａｓｅｌｏｆｆら、米国特許第５，６４１，６７３号）、リボザイムは、ＲＮＡ配列の切断により遺伝子機能を阻害するために用いられ得る。
【０１０４】
この転移性マーカー遺伝子のコード配列は、転移性マーカー遺伝子から転写されるｍＲＮＡに対して特異的に結合するリボザイムを生成するために用いられ得る。高度に配列特異性な様式において、他のＲＮＡ分子をトランスに切断し得るリボザイムの設計方法および構築方法が、当該分野において開発ならびに記載されている（Ｈａｓｅｌｏｆｆら、（１９８８），Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５８５−５９１を参照のこと）。例えば、リボザイムの切断活性は、このリボザイム中の別々の「ハイブリダイゼーション」領域を操作することによって特定のＲＮＡを標的とし得る。このハイブリダイゼーション領域は、この標的ＲＮＡに対して相補的な配列を含み、それによって標的に特異的にハイブリダイズする（例えば、Ｇｅｒｌａｃｈら、欧州特許第３２１，２０１号を参照のこと）。より長い相補的配列は、この標的に対するハイブリダイゼーション配列の親和性を増大するために用いられ得る。このリボザイムのハイブリダイゼーションおよび切断領域は、一体的に関与され得る；従って、相補的な領域をによる標的ＲＮＡに対するハイブリダイゼーションに際し、このリボザイムの触媒領域は、標的を切断し得る。
【０１０５】
当該分野で公知であるように、リボザイムは、ＤＮＡ構築物の一部分として細胞中へ導入され得る。このＤＮＡ構築物はまた、転写調節エレメント（例えば、細胞中のこのリボザイムの転写の制御に関する、プロモーターエレメント、エンハンサーまたはＵＡＳエレメント、および転写ターミネーターシグナル）を含み得る。
【０１０６】
上記のように、機械的方法（例えば、マイクロインジェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、またはリン酸カルシウム沈殿）は、細胞の分裂が低減されることを所望される細胞中へリボザイム含有ＤＮＡ構築物を導入するために用いられ得る。あるいは、ＤＮＡ構築物が、細胞によって安定に保持されることが所望される場合、当該分野において公知であるように、このＤＮＡ構築物は、プラスミド上に供給され得、そして別々のエレメントとして保持され得るか、または細胞のゲノムへ組み込まれ得る。
【０１０７】
Ｈａｓｅｌｏｆｆら、米国特許第５，６４１，６７３号において教示されるように、リボザイムは、その発現が、転移性マーカー遺伝子の発現を誘導する因子に対する応答を生じるように操作され得る。このリボザイムはまた、さらなるレベルの調節を提供するために操作され得、その結果、このリボザイムおよび転移性マーカー遺伝子の両方が細胞中で誘導される場合にのみ、ｍＲＮＡの破壊が生じる。
【０１０８】
転移性マーカー遺伝子の発現はまた、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列を用いて改変され得る。このアンチセンス配列は、配列番号１〜１８に示されるヌクレオチド配列を有する転移性マーカー遺伝子のコード配列の少なくとも一部分に対して相補的である。配列番号１〜１８に示されるヌクレオチド配列の相補物は、配列番号１〜１８に示される連続した配列のヌクレオチドとワトソン−クリック塩基対を形成する連続した配列のヌクレオチドから成る。
【０１０９】
好ましくは、このアンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、少なくとも６ヌクレオチドの長さであるが、約８、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ヌクレオチドの長さであり得る。より長い配列もまた、用いられ得る。上記のように、アンチセンスオリゴヌクレオチド分子は、ＤＮＡ構築物中に提供され得、ならびに細胞分裂が減少されるべきである細胞中へと導入され得る。
【０１１０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、または両方の組み合わせで構成され得る。オリゴヌクレオチドは、手動または自動合成機によって、１つのヌクレオチドの５’末端を、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、アルキルホスホネート、ホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅｓ）、リン酸エステル、カルバメート、アセトアミデート（ａｃｅｔｏａｍｉｄａｔｅ）、カルボキシメチルエステル、カーボネート、およびリン酸トリエステルのような、非リン酸ジエステルのヌクレオチド間結合を有する別のヌクレオチドの３’末端と共有結合することにより合成され得る。Ｂｒｏｗｎ，１９９４，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０：１−８；Ｓｏｎｖｅａｕｘ，１９９４，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６：１−７２；Ｕｈｌｍａｎｎら、１９９０，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０：５４３−５８３を参照のこと。
【０１１１】
正確な相補性は、アンチセンス分子と転移性マーカー遺伝子の相補的コード配列との間に成功した二重鎖の形成を必要としない。例えば、隣接したコード遺伝子に対して相補的ではない連続したヌクレオチドのストレッチにより、それぞれ分離された転移性マーカー遺伝子のコード配列の一部分に対して正確に相補的な、連続したヌクレオチドの２、３，４または５、あるいはそれ以上のストレッチを含むアンチセンス分子は、転移性マーカー遺伝子のｍＲＮＡに対して特異的な標的化を提供し得る。好ましくは、連続したヌクレオチドのそれぞれのストレッチは、少なくとも、４、５，６、７、または８、あるいはそれ以上の長さのヌクレオチドである。非相補的介在配列は、好ましくは、１、２、３、または４ヌクレオチドの長さである。当業者は、アンチセンス−センスペアの計算された融点を容易に利用し得、特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドと特定の転移性マーカー遺伝子コード配列との間で許容されるミスマッチの程度を決定する。
【０１１２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、転移性マーカータンパク質のコード配列に対してハイブリダイゼーションするそれらの能力に影響を与えることなしに改変され得る。これらの改変は、アンチセンス分子の内部か、あるいは片方または両方の末端に存在し得る。例えば、ヌクレオチド間のリン酸結合は、アミノ基と末端リボースとの間で変化する数の炭素残基を有するコレステリル部分またはジアミン部分の付加によって改変され得る。改変塩基および／または糖（例えば、リボースの代わりにアラビノ−ス、あるいは３’水酸基または５’リン酸基が置換されている３’，５’−置換オリゴヌクレオチド）もまた、改変アンチセンスオリゴヌクレオチドに利用され得る。これらの改変オリゴヌクレオチドは、当該分野で周知の方法により調製され得る。Ａｇｒａｗａｌら、１９９２，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：１５２−１５８；Ｕｈｌｍａｎｎら、１９９０，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０：５４３−５８４；Ｕｈｌｍａｎｎら、１９８７，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２１５：３５３９−３５４２。
【０１１３】
転移性マーカータンパク質に特異的に結合する本発明の抗体はまた、転移性マーカー遺伝子の発現を改変するために用いられ得る。特異的抗体は、転移性マーカータンパク質に結合し、そしてこのタンパク質を細胞中で機能しないようにする。上記のように、本発明の特異的抗体をコードするポリヌクレオチドは、細胞中に導入され得る。
【０１１４】
転移細胞中でダウンレギュレートされる転移性マーカー遺伝子の発現を増大するために、全てのまたは一部分の転移性マーカー遺伝子または発現産物は、細胞中へ導入され得る。必要に応じて、この遺伝子または発現産物は、薬学的に受容可能なキャリアを含む治療用組成物の構成要素であり得る（以下を参照のこと）。上記のようにコード配列の全体が導入され得る。あるいは、転移性マーカータンパク質、またはそれをコードするヌクレオチド配列の一部分が、細胞中へ導入され得る。
【０１１５】
細胞中の内因性転移性マーカー遺伝子の発現はまた、内因性転移性マーカー遺伝子とフレームが合って、ＤＮＡ構築物を含む相同的組換え細胞が形成されるような相同組換えによって、転移性マーカータンパク質の標的配列、調節配列、エキソン、および不対のスプライス供与部位を含むＤＮＡ構築物を導入することによって改変され得る。この新しい転写ユニットは、転移性マーカー遺伝子を所望されるようにオンまたはオフするために用いられ得る。内因性遺伝子発現に影響するこの方法は、米国特許第５，６４１，６７０号に教示されている。
【０１１６】
この標的配列は、配列番号１〜１８に示されるヌクレオチド配列から選択される、少なくとも１０、１２、１５，２０、または５０の連続したヌクレオチドのセグメントである。転写ユニットは、内因性転移性マーカータンパク質遺伝子のコード配列の上流に位置される。内因性の調節配列は、転移性マーカー遺伝子のコード配列の転写を指示する。
【０１１７】
本発明の転移性マーカータンパク質の発現は、治療的抗転移効果を有する薬物に関するスクリーニングに用いられ得る。転移性マーカータンパク質の合成に対する試験化合物の効果もまた、転移を調製する試験化合物の同定に用いられ得る。生物学的サンプル（例えば、細胞培養、組織サンプル、または無細胞ホモジネート）中の転移性マーカータンパク質の合成は、当該分野において公知のタンパク質合成の測定のための任意の手段（例えば、タンパク質中への標識アミノ酸の取り込み、およびポリアクリルアミドゲルにおける標識転移性マーカータンパク質の検出）によって測定され得る。転移性マーカータンパク質の量は、例えば、ウェスタンブロットにおける本発明の転移性マーカータンパク質に特異的な抗体を用いて検出され得る。試験化合物の存在下または非存在下で合成された転移性マーカータンパク質の量は、当該分野において公知の任意の手段（例えば、合成された転移性マーカータンパク質の量と、検量線に存在する転移性マーカータンパク質の量との比較）により決定され得る。
【０１１８】
当該分野において公知であるように、転移性マーカータンパク質の合成に対する試験化合物の効果はまた、ノーザンブロット分析により、本発明の転移性マーカータンパク質に特異的なヌクレオチドプローブを用いて試験化合物に応答する転移性マーカータンパク質のｍＲＮＡ発現の量を測定することによって測定され得る。配列番号１、４、１１、１６、１７、または１８を含むポリヌクレオチドによりコードされる転移性マーカータンパク質の合成を減少するか、あるいは配列番号２、３、６、７、８、９、１０、１２、１３、または１５を含むポリヌクレオチドによりコードされる転移性マーカータンパク質の合成を増加する試験化合物は、可能な治療薬として同定される。
【０１１９】
代表的には、生物学的サンプル（例えば、乳房サンプルまたは結腸サンプル）は、この試験化合物の濃度範囲（例えば、１．０ｎＭ、５．０ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭ、１ｍＭ、１０ｍＭ、５０ｍＭ、および１００ｍＭ）と接触される。好ましくは、この試験化合物は、転移性マーカータンパク質の発現を６０％、７５％、または８０％まで増加するか、または減少する。より好ましくは、８５％、９０％、９５％、または９８％の増加または減少が達成される。
【０１２０】
本発明は、転移性マーカータンパク質の発現の増加または減少に関して適切であるような治療用組成物を提供する。転移性マーカー遺伝子発現を増加するための治療用組成物は、転移細胞においてダウンレギュレートされる転移性マーカーに望ましい。これらは、転移性マーカータンパク質の遺伝子の発現産物の全部または一部をコードするポリヌクレオチドを含む。好ましくは、この治療用組成物は、プロモーターおよび転移性マーカータンパク質の少なくとも６つの連続したアミノ酸をコードするポリヌクレオチドセグメントを含む発現構築物を含む。発現構築物の内で、ポリヌクレオチドセグメントはプロモーターの下流に位置され、そしてポリヌクレオチドセグメントの転写は、このプロモーターで開始する。遺伝子移入ベクター（特に、レトロウィルスベクター）のより完全な記載は、米国特許出願番号第０８／８６９，３０９号に含まれる。
【０１２１】
転移性マーカー遺伝子の発現の減少は、この転移性マーカー遺伝子が、転移性の癌においてアップレギュレートされる条件下で所望される。これらの障害を処置するための治療用組成物は、本明細書で開示されるような、転移性マーカーのタンパク質発現産物と特異的に結合する薬剤をコードするポリヌクレオチドを含む。
【０１２２】
本発明の転移性マーカーの治療用組成物はまた、薬学的に受容可能なキャリアを含む。薬学的に受容可能なキャリアは、当該分野において周知である。このようなキャリアは、大きく、ゆっくりと代謝される高分子（例えば、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合体アミノ酸、アミノ酸コポリマー、および不活性ウィルス粒子）を含むが、これらに限定されない。薬学的に受容可能な塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、または硫酸塩のような無機酸の塩、ならびに酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、または安息香酸塩のような有機酸の塩）もまた、この組成物に用いられ得る。
【０１２３】
治療用組成物はまた、水、生理食塩水、グリセロール、およびエタノールのような液体、ならびに湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤のような物質を含み得る。米国特許第５，４２２，１２０号、ＷＯ９５／１３７９６、ＷＯ９１／１４４４５、または欧州特許第５２４，９６８Ｂ１に記載されるようなリポソームもまた、この治療用組成物のためのキャリアとして用いられ得る。
【０１２４】
代表的には、治療用転移性マーカー組成物は、液体溶液または懸濁液としてのいずれかで、注射可能なものとして調製される；しかし、溶液中、または懸濁液中、注射前の液体ビヒクルに適した固形もまた、調製され得る。転移性マーカー組成物もまた、（例えば、米国特許第４，８５３，２３０号、欧州特許第２２５，１８９号、豪州特許第９，２２４，２９６号および豪州特許第９，２３０，８０１号に記載されるような）当該分野において公知の方法に従って、腸溶コーティングの錠剤またはゲルカプセル中に処方され得る。
【０１２５】
本発明の転移性マーカー治療薬の投与は、注射、経口投与、微粒子銃（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｇｕｎ）、またはカテーテル法投与、および局所的投与を含む、局所投与または全身投与を含み得る。多様な方法が、身体における特定の部位に治療用転移性マーカー組成物を直接的に投与するために用いられ得る。
【０１２６】
例えば、腫瘍の処置のために、小さな腫瘍または転移性の病巣が位置付けされ得、そして治療用転移性マーカー組成物が、腫瘍の本体内のいくつかの異なる部位に数回注射され得る。あるいは、腫瘍の役に立つ動脈が同定され得、そして治療用組成物が、この組成物をこの腫瘍中へ直接的に送達するために、このような動脈中に注射され得る。
【０１２７】
壊死の中心を有する腫瘍は、吸引され得、そしてこの組成物が、たった今空になった腫瘍の中心に直接的に注射され得る。治療用転移性マーカー組成物は、腫瘍の表面に（例えば、この組成物の局所的な塗布によって）直接的に投与され得る。Ｘ線造像は、特定の上記の送達方法を補助するために用いられ得る。転移性マーカータンパク質、ポリペプチド、またはサブゲノムポリヌクレオチドおよび他の治療用薬剤を含む、治療用薬剤の組み合わせは、同時に、または経時的に投与され得る。
【０１２８】
レセプターに媒介される標的送達は、サブゲノムポリヌクレオチド、タンパク質、または特定の組織に対する、抗体、リボザイム、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドのような試薬を含む、治療用組成物を送達するために用いられ得る。レセプターに媒介される送達技術は、例えば、Ｆｉｎｄｅｉｓら（１９９３），Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１，２０２−０５；Ｃｈｉｏｕら（１９９４），ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＤＩＲＥＣＴ ＧＥＮＥ ＴＲＡＮＳＦＥＲ（Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆ編）；ＷｕおよびＷｕ（１９８８），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，６２１−２４；Ｗｕら（１９９４），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，５４２−４６；Ｚｅｎｋｅら（１９９０），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８７，３６５５−５９；Ｗｕら（１９９１），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，３３８−４２中に記載される。
【０１２９】
あるいは、転移性マーカー治療用組成物は、エクスビボでヒト細胞中へ導入され得、次いでこの細胞はヒトの中へ再配置され得る。細胞は、例えば、選択された腫瘍から、または罹患した器官からを含む種々の部位から取り出され得る。さらに、治療用組成物は、罹患していない、例えば、皮膚線維芽細胞、または末梢血白血球中へ挿入され得る。所望される場合、Ｔ細胞サブセットまたは幹細胞のような特定の細胞画分もまた、血液から特異的に取り出され得る（例えば、ＰＣＴ ＷＯ９１／１６１１６を参照のこと）。次に、この取り出された細胞は、任意の上記の技術を利用して転移性マーカー治療用組成物と接触され得、続いてこの細胞をヒトに（好ましくは、腫瘍の近傍または処置されるべき他の部位に、あるいはそれらの中に）へ戻される。上記の方法は、ヒトから腫瘍細胞を取り出すことに続き、線維芽細胞、または他の共雑物ではない腫瘍細胞を枯渇する工程、および／または（例えば、照射により）これらの細胞を不活性化する工程をさらに包含し得る。
【０１３０】
転移性マーカー組成物の用量および投与の手段の両方は、治療用組成物の特定の性質、患者の状態、年齢、および体重、この疾患の進行および他の関連する因子に基づき決定され得る。好ましくは、本発明の治療用組成物は、転移性マーカー遺伝子の発現を５０％、６０％、７０％、または８０％まで増加するか、または減少する。最も好ましくは、転移性マーカー遺伝子の発現は、９０％、９５％、９９％、または１００％まで増加するか、または減少する。転移性マーカー遺伝子の発現を改変するために選択されたメカニズムの有効性は、転移性マーカー遺伝子のｍＲＮＡに対するヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、または特異的抗体を用いる転移性マーカータンパク質の検出のような当該分野において周知の方法を用いて評価され得る。
【０１３１】
この組成物が、転移性マーカータンパク質、ポリペプチド、または抗体を含む場合、この組成物の有効用量は、患者の体重１ｋｇあたり約５μｇ〜約５０μｇ、１ｋｇあたり約５０μｇ〜約５ｍｇ、患者の体重１ｋｇあたり約１００μｇ〜約５００μｇ、および１ｋｇあたり約２００μｇ〜約２５０μｇの範囲内である。
【０１３２】
転移性マーカーのサブゲノムポリヌクレオチドを含む治療用組成物は、約１００ｎｇ〜約２００ｍｇの範囲のＤＮＡを、遺伝子治療のプロトコルにおいて局所投与するために投与され得る。約５００ｎｇ〜約５０ｍｇ、約１μｇ〜約２ｍｇ、約５μｇ〜約５００μｇ、および約２０μｇ〜約１００μｇの濃度範囲のＤＮＡもまた、遺伝子治療のプロトコルの間に用いられ得る。作用の方法および形質転換および発現効力のような因子は、転移性マーカータンパク質のサブゲノムポリヌクレオチドの究極の効力のために必要とされる投薬量に影響する考慮すべきことである。より高い発現が、組織のより広い範囲にわたり所望される場合、より大量の転移性マーカータンパク質のサブゲノムポリヌクレオチドであるか、または投与の連続的プロトコルにおいて再投与される同じ量であるか、あるいは、例えば、腫瘍部位の異なる隣接または近接組織の部分に対するいくつかの投与が、陽性の治療結果を行うために必要とされ得る。全ての場合において、臨床試験における慣用的実験が、最適な治療効果についての特定の範囲を決定する。
【０１３３】
本発明の転移性マーカーサブゲノムポリヌクレオチドはまた、ポリヌクレオチドアレイに使用され得る。ポリヌクレオチドアレイは、単一サンプルにおける多数のポリヌクレオチド配列をアッセイし得る高度処理技術を提供する。この技術は、例えば、転移性病巣を同定するため、または腫瘍の転移潜在性を評価するための診断用ツールとして使用され得る。
【０１３４】
アレイを作製するために、一本鎖ポリヌクレオチドプローブは、二次元マトリックスまたはアレイにおいて基質上にスポットされ得る。各一本鎖ポリヌクレオチドプローブは、配列番号１〜１８に示されるヌクレオチド配列から選択される少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、または３０以上の隣接ヌクレオチドを含み得る。好ましいアレイは、配列番号１、４、１１、１６、１７および１８に示されるヌクレオチド配列から選択される少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、または３０以上の隣接ヌクレオチドを含有する少なくとも１つの一本鎖ポリヌクレオチドプローブを含む。他の好ましいアレイは、配列番号２、３、６、７、９、１０、１２、１３および１５に示されるヌクレオチド配列から選択される少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、または３０以上の隣接ヌクレオチドを含有する少なくとも１つの一本鎖ポリヌクレオチドプローブを含む。なお他に好ましいアレイは、配列番号５および１４もしくは配列番号１６および１７に示されるようなヌクレオチド配列から選択される少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、または３０以上の隣接ヌクレオチドを含有する少なくとも１つの一本鎖ポリヌクレオチドプローブを含む。
【０１３５】
基質は、ポリヌクレオチドプローブが付着し得る任意の基質（ガラス、ニトロセルロース、シリコン、およびナイロンを含むがそれらに限定されない）であり得る。ポリヌクレオチドプローブはいずれかの共有結合により、または非特異的相互作用（例えば、疎水結合）により基質に結合され得る。アレイを構築する技術およびそれらのアレイを使用する方法は、ＥＰ番号第０ ７９９ ８９７号；ＰＣＴ番号ＷＯ ９７／２９２１２；ＰＣＴ番号ＷＯ ９７／２７３１７；ＥＰ番号第０ ７８５ ２８０；ＰＣＴ番号ＷＯ ９７／０２３５７；米国特許第５，５９３，８３９号；米国特許第５，５７８，８３２号；ＥＰ番号第０ ７２８ ５２０号；米国特許第５，５９９，６９５号；ＥＰ番号第０ ７２１ ０１６号；米国特許第５，５５６，７５２号；ＰＣＴ番号ＷＯ ９５／２２０５８；および米国特許第５，６３１，７３４号に記載されている。市販のポリヌクレオチドアレイ（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐＯ）もまた使用され得る。遺伝子発現を検出するためのＧｅｎｅＣｈｉｐＯの使用は、例えば、Ｌｏｃｋｈａｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：１６７５（１９９６）；Ｃｈｅｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：６１０（１９９６）；Ｈａｃｉａら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４：４４１、１９９６；およびＫｏｚａｌら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２：７５３、１９９６に記載されている。
【０１３６】
転移性が疑わしいまたは転移潜在性が未知の組織サンプルは、当該分野において公知のように、例えば、加熱または化学変性によって、一本鎖ポリヌクレオチドを形成するように処置され得る。次いで、組織サンプル中の一本鎖ポリヌクレオチドは標識され得、そしてアレイ上のポリヌクレオチドプローブにハイブリダイズされ得る。使用され得る検出可能な標識は、放射性標識、ビオチン化標識、発蛍光団（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒ）、および化学発光標識を含むがそれらに限定されない。ポリヌクレオチドプローブに結合した標識されたサンプルポリヌクレオチドを含む二本鎖ポリヌクレオチドはを、一旦サンプル中の非結合部分を洗い流して検出され得る。検出は、視覚的またはコンピューターの補助を伴うものであり得る。
【０１３７】
配列番号１〜４、１１、１６、１７、および１８からなる群から選択される隣接ヌクレオチドを含む二本鎖ポリヌクレオチドの検出、または配列番号２、３、６、７、８、９、１０、１２、１３、および１５からなる群から選択される隣接ヌクレオチドを含む二本鎖ポリヌクレオチドの検出の欠如は、転移性としてまたは転移潜在性を有するものとして組織サンプルを同定する。
【０１３８】
この開示において引用される全ての参照は、特に本明細書中で参考として援用される。上記の開示は、本発明を一般的に記載する。より完全な理解は、以下の特定の実施例を参照することにより得られ得る。この特定の実施例は、ただ例示目的のために本明細書で提供され、そして本発明の範囲を限定することは意図されない。
【実施例】
【０１３９】
（実験手順）
以下の材料および方法を、以下の実施例において使用した。
【０１４０】
（細胞株）
細胞株ＭＣＦ−７、ＢＲ−３、ＢＴ−２０、ＺＲ−７５−１、ＭＤＡ−ＭＢ−１５７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、Ａｌａｂ、およびＨｓ５７８Ｂｓｔを、アメリカンタイプカルチャーコレクションから入手した。全ての細胞株をそれらの明細書に従って増殖した。
【０１４１】
（ディファレンシャルディスプレイ） ディファレンシャルディスプレイを、製造業者の指示（Ｇｅｎｏｍｙｘ Ｃｏｒｐ．、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）に従ってＨｉｅｒｏｇｌｙｐｈ ｍＲＮＡプロ−フィールキットを使用して実施した。合計２００プライマー対を、遺伝子発現のプロフィールを描くために使用した。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）による、ランダムに開始されたｍＲＮＡの増幅に続いて、ｃＤＮＡ産物を、ｇｅｎｏｍｙｘＬＲシークエンサー（Ｇｅｎｏｍｙｘ Ｃｏｒｐ．）を使用して６％シークエンシング型ゲル上で分離した。乾燥させたゲルをＫｏｄａｋ ＸＡＲ−２フィルム（Ｋｏｄａｋ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）に、種々の時間露光した。
【０１４２】
示差的に発現されたｃＤＮＡフラグメントを摘出し、そして製造業者の指示（Ｇｅｎｏｍｙｘ Ｃｏｒｐ．）に従って再増幅した。ゲルから摘出されたゲル切片は１〜３の同じサイズのｃＤＮＡフラグメントを含むため（Ｍａｒｔｉｎら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４、１０１８−２６、１９９８；Ｇｉｅｓｅら、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｄｉｓｐｌａｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９８）、再増幅した産物を（Ｍａｔｈｉｅｕ−Ｄａｎｄｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４、１５０４−０７、１９９６）に記載されるように一本鎖確認多型性ゲルにより分離し、そしてＭ１３ユニバーサルプライマーおよびＴ７プライマーを使用して、直接的に配列決定した。
【０１４３】
（ヒト骨髄間質細胞ｃＤＮＡライブラリーの構築およびスクリーニング）
ＲＮＡを、チオシアン酸グアニジニウム／フェノールクロロホルム抽出プロトコール（Ｃｈｉｒｇｗｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８、５２９４−９９、１９７９）を使用して、ヒト骨髄間質細胞（Ｐｏｉｅｔｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）から単離した。ポリ（Ａ）+ＲＮＡをｏｌｉｇｏ−ｄＴ ｓｐｉｎカラム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用して単離した。第１鎖および第２鎖の合成を、製造業者の指示（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）に従って実施した。二本鎖ｃＤＮＡをｐＢＫ−ＣＭＶファージミドベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）中にライゲーションした。約１×１０6プラークが、１．２ｋｂ ＣＳＰ５６ ｃＤＮＡフラグメントを使用してスクリーニングされた。陽性クローン由来のプラスミドＤＮＡは、製造業者の指示に従って得られた。ヌクレオチド配列の正確性を、二本鎖配列決定により決定した。
【０１４４】
（ノーザンブロット分析およびＲＴ−ＰＣＲ）
種々のヒト正常組織および腫瘍組織から調製されたポリ（Ａ）+ＲＮＡを含むノーザンブロットを、ＣｌｏｎＴｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）およびＢｉｏｃｈａｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ、ＣＡ）から購入した。全ての他のノーザンブロットは、チオシアン酸グアニジニウム／フェノールクロロホルム抽出プロトコール（Ｃｈｉｒｇｗｉｎら、１９７９）を使用して、異なるヒト乳癌細胞株および正常細胞株から単離された２０〜３０μｇの全ＲＮＡを使用して調製された。ノーザンブロットを、Ｅｘｐｒｅｓｓ−ｈｙｂ（ＣｌｏｎＴｅｃｈ）中で、６５℃でハイブリダイズさせた。
【０１４５】
ＲＴ−ＰＣＲを、製造業者の指示に従って逆転写酵素ＲＮＡ ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ、ＮＪ）を、使用して実施した。
【０１４６】
（インサイチュハイブリダイゼーション） インサイチュハイブリダイゼーションを、Ｐｆａｆｆら、Ｃｅｌｌ ８４、３０９−２０、１９９６の手順に従って、外科的除去および１０μｍでの凍結切片後に直ちに凍結したヒト組織において、実施した。ジゴキシゲニン−ＵＴＰ−標識リボプローブを、テンプレートとしてＣＳＰ５６含有プラスミドＤＮＡを使用して生成した。アンチセンスプローブの生成については、ＤＮＡをＥｃｏＲＩ（約１ｋｂ転写物）またはＮｃｏＩ（全長転写物）で直線化し、そしてＴ３ポリメラーゼで転写した。センスコントロールについては、ＤＮＡをＸｈｏＩ（全長転写物）で直線化し、そしてＴ７ポリメラーゼで転写した。ハイブリダイズしたプローブをＢＭ紫を基質として使用する、アルカリホスファターゼ結合抗ジゴキシゲニン抗体で検出した（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）。
【０１４７】
（免疫不全マウスの乳房脂肪パット（ｆａｔｐａｄ）における腫瘍増殖）
Ｓｃｉｄ（重篤複合免疫不全）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を麻酔し、そして乳房脂肪パッドを曝露させるために小さく切開した。約４×１０6細胞を各マウスの脂肪パッド内に注射した。腫瘍増殖を１週間毎の検査によりモニターし、そして増殖をカリパス測定により決定した。約４週間後、原発腫瘍を麻酔したマウスから除去し、そしてその皮膚切開を創クリップで閉じた。約４週間後、マウスを殺傷し、そして肺転移の存在を検査した。原発腫瘍細胞および肺転移を、ヒト細胞の存在について組織化学的に分析した。８０％を超えるヒト起源の細胞を表す腫瘍組織の塊を、全ＲＮＡを単離するために使用した。ＭＤＡ−ＭＤ−４３５の場合、９０％を超えるヒト細胞を表す広範な肺転移を使用した。全ＲＮＡを、ＣＳＰ５６コード領域について特異的なプライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲにより増幅した。反応産物をナイロンメンブレン上にドットブロットし、そしてＣＳＰ５６特異的プローブでハイブリダイズした。
【０１４８】
（実施例１）
この実施例は、攻撃的で侵襲性のヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４３５において示差的に発現される遺伝子の同定を実証する。
【０１４９】
転移性表現型に関連する遺伝子を同定するために、本発明者らは、貧弱な侵襲性から最も攻撃的な侵襲性まで及ぶ、異なる悪性表現型ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５を示す４つのヒト乳癌細胞株を使用して、遺伝子発現プロフィールを比較した（Ｅｎｇｅｌら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３８、４３２７−３９、１９７８；ＳｈａｆｉｅおよびＬｉｏｔｔａ、Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．１１、８１−８７、１９９０；ＯｚｅｌｌｏおよびＳｏｒｄａｔ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １６、５５３−５９、１９８０；Ｐｒｉｃｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０、７１７−２１、１９９０）。細胞株は、多量の純粋なＲＮＡを得る能力に基づき、出発材料として選択された。対照的に、ヒト乳癌生検は、癌型ならびにマクロファージおよびリンパ球を含む他の細胞型の混合物からなる（Ｋｅｌｌｙら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５７、１７４−７７、１９８８；Ｗｈｉｔｆｏｒｄら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６２、９７１−７５、１９９０）。記載されたヒト乳癌細胞株はマウスモデルにおいて広範囲に研究されており、腫瘍進行において同定された候補遺伝子を機能的に特徴付けることを可能にする。
【０１５０】
細胞株が、培養において継代を延長した後でそれらの起源の悪性特徴を保持したことを保証するために、本発明者らは、ｓｃｉｄマウスにおいて増殖する潜在能および乳房脂肪パッド内への注射に続いて転移を形成する潜在能を検査した。４つの細胞株のうち３つが、以前の報告（Ｅｎｇｅｌら、１９７８；ＳｈａｆｉｅおよびＬｉｏｔｔａ、１９９０；ＯｚｅｌｌｏおよびＳｏｒｄａｔ、１９８０；Ｐｒｉｃｅら、１９９０）と一致して原発腫瘍を形成した。原発腫瘍形成は、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３では全く検出されなかった。さらに、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５を注射されたマウスは、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５を使用して検出される最も高い発生率を有して、肺転移を進展させた。
【０１５１】
次に、本発明者らは、乳癌細胞株から単離された全ＲＮＡおよび合計２００の異なるプライマー対の組み合わせを使用してディファレンシャルディスプレイ分析を実施した。いくつかの示差的に発現される転写物の中で、１．２−ｋｂのｃＤＮＡフラグメントがＭＤＡ−ＭＢ−４３５ ＲＮＡサンプルから、Ａｐ８［５’−ＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ（Ｔ）12ＡＡ］（配列番号２０）およびＡｒｐ１（５’−ＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＣＧＡＣＴＣＣＡＡＧ）（配列番号２１）のプライマー対組み合わせを使用して特異的に増幅された（図１Ａ、レーン５および６）。弱い発現もまた、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１においても検出された（図１Ａ、レーン１および２）が、一方、ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−４５３から単離されたＲＮＡサンプルにおいては全くシグナルは検出されなかった（図１Ａ、レーン３、４、７および８）。
【０１５２】
発現パターンを確認するため、ＤＮＡフラグメントをゲルから単離し、再増幅し、放射性標識し、そして異なる悪性表現型を有するヒト乳癌細胞株および非腫瘍形成乳房細胞株のノーザンブロット分析におけるハイブリダイゼーションプローブとして使用した。（図１Ｂ）。放射性プローブは、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ ＲＮＡサンプルにおいて、約２．０−ｋｂおよび約２．５−ｋｂのサイズの２つの転写物に、類似した強度でハイブリダイズした（レーン９）。これらの転写物の弱い発現は、貧弱な侵襲性のヒト乳房細胞株（レーン２および３）または非腫瘍形成株Ｈｓ５７８Ｂｓｔ（レーン１）において検出された。シグナルは、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３およびＭＣＦ−７では全く検出されなかった。これらのデータは、高度にまたは中程度に転移性のヒト乳癌細胞株に対して、この遺伝子の制限された発現パターンを示す。
【０１５３】
（実施例２）
この実施例は、ＣＳＰ５６ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を実証する。
【０１５４】
公的なデータ−ベースに対するＣＳＰ５６ ｃＤＮＡヌクレオチド配列の比較は、有意な相同性を全く示さなかった。よりヌクレオチド配列の情報を得るため、本発明者らはヒト骨髄間質細胞ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。陽性クローンのうちの１つは、長さを１８５５ヌクレオチドにまで起源クローンを伸長した（図２Ａ）。この配列は、いくつかの発現される配列タグで、３’末端を長さを２６０６ヌクレオチドにまでさらに伸長させた（図２Ｂ）。さらなる７５０ヌクレオチドは、おそらく代わりのポリ−Ａ部位選択の結果である。
【０１５５】
ヌクレオチド配列の分析は、ヌクレオチド１０１位の翻訳開始コドンで開始し、そしてヌクレオチド１６５５位の停止コドンで終結する、５１８アミノ酸の単一のオープンリーディングフレームを明らかにした。開始コドン周囲のコンセンサスＫｏｚａｋ配列（Ｋｏｚａｋ、Ｃｅｌｌ ４４、２８３−９２、１９８６）およびコドン使用頻度（ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ）の分析（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ｐａｃｋａｇｅ、ＵＮＩＸ（登録商標））は、このｃＤＮＡクローンが完全なコード領域を含むことを示唆する。
【０１５６】
このオープンリーディングフレームの翻訳は、５６ｋＤの分子量を有するタンパク質を推定する。高度転移性ヒト乳癌細胞株におけるその特異的発現に基づいて、このｃＤＮＡのコードするタンパク質をＣＳＰ５６（ｃａｎｃｅｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ５６−ｋｄ）と名付けた。
【０１５７】
（実施例３）
この実施例は、ＣＳＰ５６が新規のアスパルチル型プロテアーゼであることを実証する。
【０１５８】
ＣＳＰ５６オープンリーディングフレームの、公的なデータ−ベースにおけるタンパク質との比較は、アスパルチルプロテアーゼのペプシンファミリーのメンバーへのいくらかの相同性を示す（図３）。このプロテアーゼファミリーの特徴的な特色は、遺伝子複製により進化された２つの活性中心の存在である（Ｄａｖｉｅｓ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９、１８９−２１５、１９９０；ＮｅｉｌおよびＢａｒｒｅｔｔ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．２４８、１０５−８０、１９９５）。触媒ドメイン（Ａｓｐ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ−Ｇｌｙ）およびその隣接残基を含むこのアミノ酸残基は、このファミリーにおいて最も高い保存性を示し、そしてこのアミノ酸残基はＣＳＰ５６において保存されている（図２および３）。
【０１５９】
しかし、ＣＳＰ５６は、他のアスパルチルプロテアーゼとは異なる構造的特徴を示す。ペプシノーゲンＣおよびＡ、レニン、ならびにカテプシンＤおよびＥへのＣＳＰ５６の全体的な類似性は、ＣＳＰ５６のＣ末端伸長を無視すると、それぞれ、５５、５１、５４、５２、および５１％にすぎない。他のメンバーにおいて触媒ドメインの前後に見出されるシステイン残基は、ＣＳＰ５６において存在しない（図３）。ＣＳＰ５６はまた、公知のタンパク質に有意な相同性を全く示さない約９０アミノ酸残基のカルボキシ末端伸長を含む。
【０１６０】
ＣＳＰ５６はまた、Ｃ末端伸長に２９のアミノ酸残基からなる疎水性モチーフを含み、これは膜結合ドメインとして機能し得る（図２および３）。ＣＳＰ５６はまた、推定シグナル配列を含む。
【０１６１】
従ってＣＳＰ５６は、推定膜貫通ドメイン（アミノ酸８〜２０）および推定プロペプチドを表す約４５のアミノ酸の伸展（アミノ酸２１〜７６）を有する新規のアスパルチル型プロテアーゼである。
【０１６２】
（実施例４）
この実施例は、ヒト乳癌発達および転移を通したＣＳＰ５６の発現パターンを実証する。
【０１６３】
ＣＳＰ５６の発現パターンをさらに試験するため、本発明者らは、さらなるヒト乳癌細胞細胞株および正常細胞株を使用してノーザンブロット分析を実施した（図４）。ＣＳＰ５６の発現はＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、およびＢＲ−３において検出され（レーン１、４、および９）、最も強いシグナルがＭＤＡ−ＭＢ−４３５で検出された。他の細胞株は弱い発現を示した。貧弱な侵襲性のヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４５３およびＭＣＦ−７ならびに正常な乳房細胞株Ｈｓ５７８Ｂｓｔでは、全くシグナルは検出されなかった。総合して、これらのデータは高度な悪性ヒト乳癌細胞株におけるＣＳＰ５６の発現の増加と一致する。
【０１６４】
（実施例５）
この実施例は、正常ヒト組織におけるＣＳＰ５６の発現パターンを実証する。
【０１６５】
ＣＳＰ５６の組織分布を決定するため、種々のヒト組織由来のポリＡ+ＲＮＡをノーザンブロット分析により試験した（図７）。２つの主な転写物が検出され、それらは癌細胞株およびヒト組織において検出された転写物に類似したサイズである。最も高い発現は、膵臓、前立腺、および胎盤で検出された。脳、および末梢血液リンパ球においては、弱いシグナルが検出されるかまたは全くシグナルは検出されなかった。
【０１６６】
（実施例６）
この実施例は、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５を注射された免疫不全マウスから単離された原発腫瘍および転移性肺組織におけるＣＳＰ５６転写物の同定を実証する。
【０１６７】
ｓｃｉｄマウスモデルを腫瘍におけるＣＳＰ５６発現を試験するために使用した。このモデルは、ヒト乳癌細胞の腫瘍形成能および転移性に関連する遺伝子の機能を評価するために適切であることが示されている（Ｓｔｅｅｇら、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．２５、１７５−８７、１９９３；Ｐｒｉｃｅ、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．３９、９３−１０２、１９９６）。
【０１６８】
異なるヒト乳癌細胞株を免疫不全マウスの乳房脂肪パッド内に注射した。原発腫瘍および、適用性である場合、肺転移をマウスから単離し、そして全ＲＮＡをノーザンブロット分析のために調製した（図４）。
【０１６９】
ＣＳＰ５６転写物は、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８およびＡｌａｂ由来の原発腫瘍ＲＮＡにおいて検出され、ＭＣＦ−７由来の原発腫瘍ＲＮＡにおいては検出されなかった（図４）。ＣＳＰ５６遺伝子発現はまた、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５で注射されたマウスの肺転移においても検出された（レーン１）。ＺＲ−７５−１、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１、およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１で注射されたマウスの原発腫瘍においてＣＳＰ５６転写物を検出できなかったことは、他の原発腫瘍ＲＮＡサンプルと比較した場合、弱いヒトβ−アクチンシグナルにより判断されるように、これらの腫瘍におけるヒト癌組織の量が少ないことで説明され得る。
【０１７０】
総合すると、これらのデータはＣＳＰ５６上方調節の原因としてのインビトロ培養条件を除外し、そしてこれらの遺伝子を新規の腫瘍マーカーとして確立する。
【０１７１】
（実施例７）
この実施例は、患者サンプルにおいて検出されたＣＳＰ５６遺伝子発現の検出を実証する。
【０１７２】
ＣＳＰ５６発現を患者腫瘍生検から単離されたＲＮＡサンプルにおいて試験した。乳癌腫瘍組織および同じ患者に由来する正常乳房組織由来の全ＲＮＡを含むノーザンブロットを、ＣＳＰ５６特異的プローブでハイブリダイズした（図５Ａ）。ＣＳＰ５６転写物は腫瘍サンプルにおいて検出されたが、一方、正常乳房ＲＮＡにおいては全くシグナルは検出されなかった（レーン１および２）。同様に、ＣＳＰ５６転写物の発現は、正常乳房ＲＮＡコントロールと比較された場合、２つの他の乳癌ＲＮＡサンプルにおいて上方調節された（図５Ｂ）。ＣＳＰ５６の発現の増加はまた、ヒト結腸ガン組織において、同じ患者の正常結腸組織と比較された場合に検出された。
【０１７３】
インビボでＣＳＰ５６転写物を発現する細胞型を同定するために、本発明者らは一人の乳癌患者から得られた組織サンプルにおいてインサイチュハイブリダイゼーション分析を実施した（図６Ａ−６Ｆ）。弱いＣＳＰ５６シグナルが、正常乳房組織の管の細胞において検出された（図６Ｂ）。原発腫瘍において、ＣＳＰ５６は腫瘍細胞において高度に発現されたが、周囲のリンパ球においては発現されなかった（図６Ｅ）。センスプローブを使用すると、全くシグナルは検出されなかった（図６Ｃおよび６Ｆ）。
【０１７４】
本発明者らはまた、ＣＳＰ５６発現について２人の結腸ガン患者から得られた組織サンプルを分析した（図６Ｇ−６Ｍ）。正常結腸組織においては全くシグナルは検出されなかったが（図６Ｈ）、一方、ＣＳＰ５６転写物は原発結腸腫瘍および肝転移の両方の腫瘍細胞において富み、そして周囲の支質においては全く発現は検出されなかった（図６Ｋおよび６Ｍ）。
【０１７５】
これらのデータは、ＣＳＰ５６がヒト癌患者の腫瘍細胞において過剰に発現されること、そして異なる型の腫瘍の発達および進行において役割を果たし得ることを実証する。
【０１７６】
【表１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の単離されかつ精製されたタンパク質。
【請求項１】
明細書中に記載の単離されかつ精製されたタンパク質。
【図１】
【図２Ａ−１】
【図２Ａ−２】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２Ａ−１】
【図２Ａ−２】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１２−１３１７９８（Ｐ２０１２−１３１７９８Ａ）
【公開日】平成２４年７月１２日（２０１２．７．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−２０８４１（Ｐ２０１２−２０８４１）
【出願日】平成２４年２月２日（２０１２．２．２）
【分割の表示】特願２００９−２９５５１９（Ｐ２００９−２９５５１９）の分割
【原出願日】平成１０年１２月２４日（１９９８．１２．２４）
【出願人】（５９１０７６８１１）ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド (265)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年７月１２日（２０１２．７．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年２月２日（２０１２．２．２）
【分割の表示】特願２００９−２９５５１９（Ｐ２００９−２９５５１９）の分割
【原出願日】平成１０年１２月２４日（１９９８．１２．２４）
【出願人】（５９１０７６８１１）ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド (265)
【Ｆターム（参考）】
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