軽度認知障害の治療用医薬剤、初期認知症の治療用医薬剤、神経細胞の樹状突起形成促進剤、神経細胞のシナプス形成促進剤、検定方法およびスクリーニング方法
【課題】 軽度認知障害及び初期認知症の治療用医薬剤、神経細胞の樹状突起形成促進剤、あるいは神経細胞のシナプス形成促進剤など、を提供すること。
【解決手段】 ＭＡＰＲＧＦＳＣＬＬＬＬＴＳＥＩＤＬＰＶＫＲＲＡ（配列番号１）またはＭＡＰＲＧＦＳＣＬＬＬＬＴＧＥＩＤＬＰＶＫＲＲＡ（配列番号２）からなる配列を有するペプチド、あるいは、前記ペプチドを発現する発現ベクターを含有する医薬または試薬を製造する。その医薬または試薬は、軽度認知障害及び初期認知症の治療用医薬剤、神経細胞の樹状突起形成促進剤、あるいは、神経細胞のシナプス形成促進剤として有効である。
【解決手段】 ＭＡＰＲＧＦＳＣＬＬＬＬＴＳＥＩＤＬＰＶＫＲＲＡ（配列番号１）またはＭＡＰＲＧＦＳＣＬＬＬＬＴＧＥＩＤＬＰＶＫＲＲＡ（配列番号２）からなる配列を有するペプチド、あるいは、前記ペプチドを発現する発現ベクターを含有する医薬または試薬を製造する。その医薬または試薬は、軽度認知障害及び初期認知症の治療用医薬剤、神経細胞の樹状突起形成促進剤、あるいは、神経細胞のシナプス形成促進剤として有効である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、軽度認知障害（MCI: mild cognitive impairment）の治療用医薬剤、初期認知症の治療用医薬剤、神経細胞の樹状突起形成促進剤、神経細胞のシナプス形成促進剤、検定方法およびスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
軽度認知障害（MCI: mild cognitive impairment）は、年齢相応の加齢による認知力減退（ADAS: age-associated memory impairment）を有する正常群と、認知症と診断される群との中間に位置する病的状態と考えられている。軽度認知障害を有する患者のうち、約７０％は、アルツハイマー病へと移行し(非特許文献１参照)、約３０％は、血管性認知症、Lewy小体型認知症など他の認知症に移行することもあるが、通常、症状は非進行で比較的安定である (非特許文献２及び３参照)。
【０００３】
軽度認知障害の診断には、２００３年のMCIコンセンサス会議で提唱された診断基準が、一般的に用いられている(非特許文献４参照)。それによると、
（１）正常ではなく、認知症でもない（DSMIVやICD10の認知症の診断基準を満たさない）、
（２）本人かつ／または家族から認知機能低下の訴えがあり、客観的な認知機能検査でも障害を認めるかつ／または検査上以前と比べて認知機能低下がある、
（３）ADL（日常生活動作）は正常あるいはごく軽度に、複雑な動作機能が障害されているのみである、という３点を満たす場合に、軽度認知障害と診断される。それ以外の診断基準としては、Clinical Dementia Rating (CDR)では0.5（認知症疑いに相当）、Global Deterioration Scale (GDS)では2〜3（年齢相応の認知障害〜軽度認知障害に相当）、簡易認知機能検査のMini-Mental State Examination (MMSE)では、26〜27程度（30満点で24までが正常）などが用いられている。
【０００４】
軽度認知障害を有する患者の脳においては、病理学的には、神経突起変性、シナプス形成異常、あるいはシナプス数減少などのシナプス形成不全が観察され、海馬におけるシナプス数減少が認知機能の低下と相関していることが報告された（非特許文献５参照）。また、Functional MRIで調べられた結果、海馬内での機能的連絡、すなわちシナプスを介した神経細胞同士の連絡の低下が軽度認知障害で認められた(非特許文献６及び７参照)。
【０００５】
軽度認知障害の初期には、シナプス活動の低下に対する代償として、シナプスマーカーが一時的に上昇する(非特許文献８参照)が、その後、シナプス数の減少が進行性に起こり、アルツハイマー病などの認知症へ移行すると、シナプスマーカーの発現は減少する(非特許文献９参照)。
【０００６】
このように、シナプス活動の低下とシナプス数の減少は、軽度認知障害の発症過程における初期イベントであって、軽度認知障害の症状に重要な役割を果たしており（非特許文献５参照）、シナプス機能及び／又はシナプス数の維持は、軽度認知障害または初期認知障害の治療に有用であると考えられている（非特許文献１０参照）。
【０００７】
一方、認知症の一種であるアルツハイマー病患者の脳内でも、神経細胞死よりも神経突起変性やシナプス数減少などが、より早期に起こることが知られている（非特許文献１１参照）。しかしながら、アルツハイマー病のような神経変性疾患の病因は多様であって、例えば、コリン作動性神経の機能が低下していることがその一つであると考えられ、治療薬として塩酸ドネペジル（アリセプト）、リバスチグミン、ガランタミンなどのアセチルコリンエステラーゼ阻害剤が用いられている。
【０００８】
これに対し、軽度認知障害の患者では、海馬におけるコリン作動性神経の機能が上昇していることが知られており（非特許文献１２、１３参照）、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤をそのまま適用しても、軽度認知障害に対する治療効果は全く期待できない。実際、塩酸ドネペジルを軽度認知障害患者に使用した治験では、部分的にしか効果が得られていない（非特許文献１４−１８参照）。
【０００９】
また、神経細胞死を抑制するとされるメマンチンは、アルツハイマー性細胞死を抑制する治療薬として知られているが、シナプス活動の低下とシナプス数の減少が、認知症の発症過程における初期イベントであって、細胞死はその後に起きる（非特許文献１１参照）ため、まだ細胞死が認められないような初期認知症の患者に対しては効果が得られないと考えられる。実際、メマンチンは、アルツハイマー認知症の中等度・重度における適用が欧米で認められているにすぎない。
【００１０】
ヒューマニンペプチドおよび第１４位アミノ酸Ｇ置換ヒューマニンペプチドも、神経細胞死抑制作用を有することから、神経細胞の変性、脱落に起因するアルツハイマー症の治療薬としての有用性が既に報告されている（特許文献１、２参照）。しかしながら、ヒューマニンペプチドおよび第１４位アミノ酸Ｇ置換ヒューマニンペプチドに関し、神経細胞死抑制以外の薬理効果については報告がなく、脳で神経細胞死が生じていないケースに対する適用は考えられていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】ＷＯ０１／２１７８７号公報
【特許文献２】特開２００８−１９２４５号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Petersen et al, Arch Neurol. 1999 Mar; 56(3):303-8.
【非特許文献２】Jicha et al, Arch Neurol. 2006 May; 63(5):674-81.
【非特許文献３】Morris et al, J Mol Neurosci. 2001 Oct; 17(2):101-18.
【非特許文献４】Winblad et al, J Intern Med. 2004 Sep; 256(3):240-6.
【非特許文献５】Scheff et al., Neurobiol. Aging 2006 Oct; 27(10):1372-84.
【非特許文献６】Bai et al, Biol Psychiatry. 2009 Jun 1; 65(11):951-8.
【非特許文献７】Johnson et al, Neurobiol Aging. 2006 Nov; 27(11):1604-12.
【非特許文献８】Counts et al, J Neuropathol Exp Neurol. 2006 Jun; 65(6):592-601.
【非特許文献９】Masliah et al, Neurology. 2001 Jan 9; 56(1):127-9.
【非特許文献１０】Selkoe, Science 2002 Oct 25; 298(5594):789-791.
【非特許文献１１】Hardy and Selkoe, Science 2002 Jul 19; 297(5580):353-6.
【非特許文献１２】DeKosky et al., Ann Neurol. 2002 Feb; 51(2):145-55.
【非特許文献１３】Jackisch et al., Exp Neurol. 2008 Oct; 213(2):345-53.
【非特許文献１４】Petrella et al., AJNR Am J Neuroradiol. 2009 Feb;30(2):411-6.
【非特許文献１５】Doody et al. Neurology. 2009 May 5;72(18):1555-61.
【非特許文献１６】Lu et al. Neurology. 2009 Jun 16;72(24):2115-21.
【非特許文献１７】Crane and Doody Neurology. 2009 Nov 3;73(18):1514-5.
【非特許文献１８】Doody et al. Am J Alzheimers Dis Other Demen. 2010 Mar;25(2):155-9.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、軽度認知障害（MCI: mild cognitive impairment）の治療用医薬剤、初期認知症の治療用医薬剤、神経細胞の樹状突起形成促進剤、神経細胞のシナプス形成促進剤、検定方法およびスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、ＭＡＰＲＧＦＳＣＬＬＬＬＴＳＥＩＤＬＰＶＫＲＲＡ（配列番号１）またはＭＡＰＲＧＦＳＣＬＬＬＬＴＧＥＩＤＬＰＶＫＲＲＡ（配列番号２）からなる配列を有するペプチドが、神経細胞の樹状突起形成促進作用およびシナプス形成促進作用を有することを見出し、本発明の完成に至った。
【００１５】
すなわち、本発明に係る軽度認知障害（MCI: mild cognitive impairment）または初期認知症の治療用医薬剤は、ヒューマニンペプチドまたは第１４位アミノ酸Ｇ置換ヒューマニンペプチド、あるいは、前記ペプチドを発現する発現ベクターを含有することを特徴とする。前記ペプチドのアミノ酸配列は、ヒト由来であることが好ましく、ＭＡＰＲＧＦＳＣＬＬＬＬＴＳＥＩＤＬＰＶＫＲＲＡ（配列番号１）またはＭＡＰＲＧＦＳＣＬＬＬＬＴＧＥＩＤＬＰＶＫＲＲＡ（配列番号２）であることがより好ましい。前記軽度認知障害または前記初期認知症の患者においては、シナプス形成不全が生じているが、神経細胞死が事実上生じていないことが好ましい。
【００１６】
また、本発明に係る神経細胞の樹状突起形成促進剤は、ヒューマニンペプチドまたは第１４位アミノ酸Ｇ置換ヒューマニンペプチド、あるいは、前記ペプチドを発現する発現ベクターを含有することを特徴とする。
【００１７】
さらに、本発明に係る神経細胞のシナプス形成促進剤は、ヒューマニンペプチドまたは第１４位アミノ酸Ｇ置換ヒューマニンペプチド、あるいは、前記ペプチドを発現する発現ベクターを含有することを特徴とする。
【００１８】
また、本発明に係る軽度認知障害または初期認知症の治療方法は、軽度認知障害または初期認知症の患者に対し、ヒューマニンペプチドまたは第１４位アミノ酸Ｇ置換ヒューマニンペプチド、あるいは、前記ペプチドを発現する発現ベクターを投与することを特徴とする。投与方法は、静脈内投与、脊髄腔内投与、脳室内投与、硬膜内投与であることが好ましい。また、前記軽度認知障害または前記初期認知症の患者においては、シナプス形成不全が生じているが、神経細胞死が事実上生じていない期間に投与することが好ましい。なお、前記ペプチドのアミノ酸配列は、ヒト由来であることが好ましく、ＭＡＰＲＧＦＳＣＬＬＬＬＴＳＥＩＤＬＰＶＫＲＲＡ（配列番号１）またはＭＡＰＲＧＦＳＣＬＬＬＬＴＧＥＩＤＬＰＶＫＲＲＡ（配列番号２）であることがより好ましい。
【００１９】
また、本発明に係る細胞の樹状突起形成促進方法またはシナプス形成促進方法は、細胞に対し、ヒューマニンペプチドまたは第１４位アミノ酸Ｇ置換ヒューマニンペプチド、あるいは、前記ペプチドを発現する発現ベクターを投与することを特徴とする。前記細胞は、培養細胞であっても、組織または器官の細胞であっても、個体の細胞であってもよく、前記個体は、ヒトでもヒト以外の脊椎動物でもよい。また、前記ペプチドまたは前記ベクターは、in vivoで投与されてもin vitroで投与されてもよい。前記細胞は、樹状突起形成能またはシナプス形成能を有する細胞であることが好ましく、神経幹細胞、神経前駆細胞、または神経細胞であることがより好ましい。
【００２０】
さらに、本発明にかかる検定方法は、ヒューマニンペプチドまたはヒューマニンペプチド誘導体が、軽度認知障害または初期認知症の治療効果、神経細胞の樹状突起形成促進効果、または神経細胞のシナプス形成促進効果を有するかどうかを調べる検定方法であって、前記ヒューマニンペプチドまたはヒューマニンペプチド誘導体を作製する工程と、作製された前記ヒューマニンペプチドまたはヒューマニンペプチド誘導体が軽度認知障害または初期認知症の治療効果、神経細胞の樹状突起形成促進効果、または神経細胞のシナプス形成促進効果を有するかどうか、in vivoまたはin vitroで調べる工程と、を含む。
【００２１】
さらに、本発明に係るスクリーニング方法は、軽度認知障害または初期認知症の治療用医薬剤、神経細胞の樹状突起形成促進剤、または神経細胞のシナプス形成促進剤として有効なペプチドのスクリーニング方法であって、ヒューマニンペプチドまたはヒューマニンペプチド誘導体を作製する工程と、作製された前記ヒューマニンペプチドまたはヒューマニンペプチド誘導体が軽度認知障害または初期認知症の治療用医薬剤、神経細胞の樹状突起形成促進剤、または神経細胞のシナプス形成促進剤として有効かどうか、in vivoまたはin vitroで検定する工程と、前記検定の結果、有効と判定されたヒューマニンペプチド誘導体を選択する工程と、を含む。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によって、軽度認知障害（MCI: mild cognitive impairment）または初期認知症の治療用医薬剤、神経細胞の樹状突起形成促進剤、神経細胞のシナプス形成促進剤、およびスクリーニング方法を提供することができるようになった。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の一実施形態において、ＰＣ１２細胞におけるヒューマニンペプチド（ＨＮ）、第１４位アミノ酸Ｇ置換ヒューマニンペプチド（ＨＮＧ）、第８位アミノ酸Ａ置換ヒューマニンペプチド（ＨＮＡ）、の樹状突起伸長促進効果を示す図である。
【図２】本発明の一実施形態において、皮質ニューロン初代培養細胞（ＰＣＮ）におけるＨＮの樹状突起伸長促進とシナプス形成促進効果を示す図である。
【図３】本発明の一実施形態において、Ａβ１−４２またはＩＯＡで処理したＰＣＮに対する、ＨＮの樹状突起伸長促進効果と、細胞死率改善効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。
【００２５】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.等の標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００２６】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例等は、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００２７】
＝＝ヒューマニンペプチド、ヒューマニン誘導体、及びそれらを発現させるための発現ベクター＝＝
本発明の一実施態様における医薬または試薬は、ヒューマニンペプチド（ＨＮ）またはヒューマニン誘導体（ＨＮＤ）を有効成分として含有する。
【００２８】
ＨＮおよびＨＮＤのアミノ酸配列は、それらを含む医薬の投与対象の動物や試薬の投与対象の細胞に由来することが好ましいが、投与された神経細胞において所望の樹状突起形成促進作用、あるいは、シナプス形成促進作用を持つ範囲で制限されない。例えば、医薬の投与対象がヒトの場合、GenBank AAK50430に登録されたヒトＨＮ（ＭＡＰＲＧＦＳＣＬＬＬＬＴＳＥＩＤＬＰＶＫＲＲＡ、配列番号１）、あるいは、その誘導体であることが好ましいが、ヒトにおいて神経細胞の樹状突起形成促進作用またはシナプス形成促進作用を持つ他の動物種のホモログ（オーソログを含む）であってもよい。
【００２９】
ＨＮＤは、所望の樹状突起形成促進作用およびシナプス形成促進作用を有する範囲で制限されず、ＨＮの数アミノ酸残基（例えば、１０アミノ酸残基、好ましくは８アミノ酸残基、より好ましくは６アミノ酸残基、さらに好ましくは４アミノ酸残基、さらに好ましくは２アミノ酸残基）が欠失、挿入、または置換されたアミノ酸配列を有していてもよいが、その神経細胞における樹状突起形成促進作用およびシナプス形成促進作用を考慮すると、αヘリックス構造が４．８〜６．６％、βシート構造が４０．９〜３８．３％、βターン構造が２０．６〜２２．１％、ランダム構造が３３．８〜３２．６％を占める二次構造を有することが好ましい。例えば、このような二次構造を有するヒトＨＮＤとして、第１４アミノ酸Ｇ置換ヒトＨＮＧ（ＭＡＰＲＧＦＳＣＬＬＬＬＴＧＥＩＤＬＰＶＫＲＲＡ、配列番号２）が挙げられる。なお、この二次構造は、円二色性スペクトル測定法（circular dichroism spectroscopy）を用いて測定することができる。また、これらのＨＮやＨＮＤはその樹状突起形成促進作用およびシナプス形成促進作用を失わない範囲で、糖修飾等の翻訳後修飾や、生体内で分解されにくくするような修飾が施されていてもよい。
【００３０】
ここで、ＨＮおよびＨＮＤの製造方法は特に制限されず、ＨＮあるいはＨＮＤを発現する細胞から単離、精製してもよく、遺伝子組換え技術によって組換えペプチドとして調製してもよく、または周知の方法で化学合成してもよい。
【００３１】
本発明の他の態様に係る医薬または試薬は、ＨＮまたはＨＮＤを発現する発現ベクターを含有する。この発現ベクターは、神経細胞内でＨＮまたはＨＮＤを発現させるための適切なエンハンサー及び／又はプロモーター、および、その下流にＨＮあるいはＨＮＤをコードするＤＮＡを有しており、この発現ベクターを細胞に導入すると、細胞内でＨＮあるいはＨＮＤが発現する。このため、この発現ベクターを含有する医薬や試薬は、神経細胞に対し、ＨＮあるはＨＮＤを含有する医薬や試薬と同じ効果をもたらす。このような発現ベクターは、当業者に周知の遺伝子組換え技術を用い、ＨＮまたはＨＮＤをコードするＤＮＡを好適な発現ベクターに挿入して調製することができる。
【００３２】
＝＝樹状突起形成促進剤及びシナプス形成促進剤＝＝
以下の実施例で示すように、ＨＮおよびＨＮＤは、細胞の樹状突起形成およびシナプス形成を促進する作用を有する。従って、ＨＮ、ＨＮＤ、および、ＨＮまたはＨＮＤを発現する発現ベクターを含有する医薬や試薬は、細胞の樹状突起形成促進剤またはシナプス形成促進剤として有効である。
【００３３】
樹状突起形成促進剤やシナプス形成促進剤は、in vitroで、培養細胞や、培養されている組織または器官の中の細胞に投与されてもよく、in vivoで、ヒトやヒト以外の脊椎動物の個体中の組織、器官、または細胞に投与されてもよい。培養細胞や、培養された組織または器官の中の細胞の場合、ＨＮやＨＮＤを培地に添加したり、ＨＮやＨＮＤを発現する発現ベクターを細胞内に導入したりすることにより、細胞に投与できる。また、ＨＮやＨＮＧを発現する発現ベクターを有し、これらのペプチドを細胞外に分泌する細胞を培地に添加してもよい。培地は、用いる細胞、組織または器官に従って、当業者が適切なものを選択することができる。また、発現ベクターの細胞内への導入方法も、当業者が適切なものを選択することができる。一方、個体中の組織、器官、または細胞を用いる場合、樹状突起形成促進剤やシナプス形成促進剤は、典型的には、以下に述べる医薬剤として用いることができる。
【００３４】
ここで、樹状突起形成促進剤やシナプス形成促進剤を投与する対象の細胞は、樹状突起形成能またはシナプス形成能を有する細胞であることが好ましく、例えば、神経幹細胞、神経前駆細胞、神経細胞、及びこれらの細胞に分化予定の細胞あるいはこれらの細胞に分化決定した細胞などが例示できる。
【００３５】
＝＝医薬剤＝＝
ＨＮ、ＨＮＤ、および、ＨＮまたはＨＮＤを発現する発現ベクターを含有する医薬は、神経細胞の樹状突起形成やシナプス形成を促進することにより治癒、または、症状が改善される疾患に対する治療用医薬剤として使用することができる。また、そのような疾患に対して、実際に効果があるかどうか、またどのくらいの効果があるのかを、その疾患を有する患者やヒト以外のモデル脊椎動物に投与して調べることができる。
【００３６】
本医薬剤の治療対象としては、例えば、中枢神経系や末梢神経系の神経細胞における神経突起変性、シナプス形成異常、あるいはシナプス数減少などのシナプス形成不全を原因とする疾患が挙げられる。具体的には、例えば、認知障害、変性性認知症（アルツハイマー症を含む）、血管性認知症、二次的認知症などの認知症が挙げられるが、軽度認知障害（すなわち、MCI: mild cognitive impairment）や初期認知症（例えば、初期アルツハイマー症）が好ましく、特に、シナプス形成不全が生じているが、神経細胞死が事実上生じていない軽度認知障害や初期認知症が好ましい。なお、これらの認知障害や認知症は、遺伝、加齢、外傷、または、腫瘍形成、脳虚血、自己免疫疾患等の二次疾患であってもよい。
【００３７】
軽度認知障害の診断は、例えば、MCIコンセンサス会議（２００３年）で提案された診断基準に従って行うことができる。この診断では、（１）正常ではなく、認知症でもない、（２）本人または家族から認知機能低下の訴えがあり、客観的な認知機能検査でも障害を認める、または、以前と比較して検査上認知機能低下が認められる、（３）日常生活動作は正常、あるいは極軽度に煩雑な動作機能が障害されているのみである、の３項目に該当するか否かを調べることにより、患者が軽度認知障害を発症しているか否かを判断する（例えば、Winblad B et al., J. Intern. Med 256(3): 240-246, 2004 参照）。なお、軽度認知障害の病理的特徴としては、脳神経細胞のシナプス形成異常やシナプス数の減少、海馬の神経伝達機能低下等（Johnson SC et al., Neurobiol. Aging 27(11): 1604-1612, 2006; Scheff SW et al., Neurobiol. Aging 27(10): 1372-1384, 2006; Bai F et al., Neurosci. Lett. 438(1): 111-115, 2008）をはじめとして、側頭葉内側の神経原線維変化（Mitchell TW et al., Ann. Neurol. 51(2): 182-189, 2002; Guillozet AL et al., Arch. Neurol. 60(5): 729-736, 2003; Markesbery WR et al., Arch. Neurol. 63(1): 38-46, 2006）等が認められる。
【００３８】
また、認知症とは、銘力・記憶力低下、見当識障害、判断力低下等の症状を呈する疾患であり、その原因によって変性性認知症（アルツハイマー病を含む）、血管性認知症、二次性認知症等に分類される。認知症の診断は、例えば、短期記憶力の喪失に加え、失語、失行、失認、実行機能不全（計画、整理、順序付け、抽象的思考ができないこと）のいずれか１項目以上の症状に該当することを基準として行えばよい（例えば、メルクマニュアル第１８版 日本語版、日経ＢＰ社刊参照）。このような症状に該当するか否かを診断するため臨床的に用いられている尺度としては、Clinical Dementia Rating（CDR）、Global Deterioration Scale（GDS）、Mini-Mental State Examination（MMSE）等が挙げられる。
【００３９】
発明に係る医薬剤の投与対象は、脊椎動物であることが好ましく、ヒトでもヒト以外でもよいが、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ウサギ、ブタ、サル等の哺乳動物であることがより好ましく、ヒトであることが最も好ましい。また、脊椎動物の年齢、性別は制限されない。
【００４０】
本発明に係る医薬剤の剤形化には、当業者に周知の薬学的に許容される担体、希釈剤、腑形剤等の製剤用添加物が用いられる。その形態は本医薬剤を投与対象の動物体内において、投与部位から医薬剤を作用させたい部位に送達するために適切な剤形であれば特に制限されず、水溶液、錠剤、カプセル、顆粒、散剤、シロップ、腸溶剤、徐放性カプセル、カシュー、咀嚼錠、ドロップ、丸剤、内用液剤、菓子錠剤、徐放錠、徐放性顆粒等いずれの剤形であってもよい。なお、本医薬剤には、ＨＮ、ＨＮＧ、ＨＮ発現ベクター、またはＨＮＧ発現ベクターと上記製剤用添加物以外に、異なる物質を一種類以上配合してもよく、そのような物質として、例えば、神経細胞間の神経伝達活性を維持または促進する作用のある物質、神経細胞の細胞死を抑制または阻害する作用のある物質、神経細胞の増殖を促進する物質が挙げられる。
【００４１】
患者への投与方法は、治療者が適宜選択することができ、例えば、皮内投与、皮下投与、静脈内投与、リンパ節投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、経気管支投与、筋肉内投与、脳室内投与、脊髄腔内投与等であってもよいが、有効成分を適切に疾患部位に送達させることを考慮すると、静脈内投与、脊髄腔内投与、脳室内投与、硬膜内投与等が好ましい。
【００４２】
本発明の医薬剤の投与は、安全とされている投与量の範囲内において、投与対象の動物に対し、必要量を適した方法で行うことができる。本発明の医薬剤の投与量は、剤形の種類、投与方法、投与対象の年齢や体重、投与対象の病状等を考慮して、最終的には医師または獣医師の判断により適宜決定することができる。本医薬剤は、予防または治療の対象疾患に対する、異なる医薬剤を併用して投与することもできる。
【００４３】
また、投与時期に関しても、投与者が適切な時期を選択できる。特に、認知症患者の脳内では、神経細胞死よりもシナプス形成不全が、より早期に起こることが知られている（Hardy and Selkoe, Science 2002 Jul 19; 297(5580):353-6.）ので、軽度認知障害や初期認知症では、主に、シナプス形成不全が生じている時期に投与することが好ましく、海馬におけるシナプス形成不全が生じているが、症状に関わる神経細胞死が事実上生じていない時期に投与することが最も好ましい。なお、シナプス形成不全や細胞死は、頭部ＣＴや頭部ＭＲＩなどの画像検査によって検出可能であるが、海馬におけるシナプス数減少が認知機能の低下と相関している（Scheff et al., Neurobiol. Aging 2006 Oct; 27(10):1372-84.）ため、シナプス形成不全を認知機能検査によって診断し、細胞死を画像検査によって診断してもよい。
【００４４】
＝＝ＨＮ及びＨＮＤのスクリーニング方法＝＝
本発明の一実施態様におけるスクリーニング方法は、軽度認知障害または初期認知症の治療用医薬剤、神経細胞の樹状突起形成促進剤、または神経細胞のシナプス形成促進剤として有効なＨＮまたはＨＮＤのスクリーニング方法である。
【００４５】
具体的には、まず、スクリーニングする対象となるＨＮやＨＮＤを作製する。ＨＮＤとしては、例えば、ＨＮに対し、数アミノ酸残基（例えば、１０アミノ酸残基、好ましくは８アミノ酸残基、より好ましくは６アミノ酸残基、さらに好ましくは４アミノ酸残基、さらに好ましくは２アミノ酸残基）を欠失、挿入、または置換させたアミノ酸配列を有するＨＮＤを作製する。ＨＮＤの作製方法は、当業者の定法を用いればよく、例えば、化学合成してもよく、ＨＮをコードする遺伝子にin vitro mutagenesisで変異を導入し、細胞内で発現させてもよい。
【００４６】
次に、スクリーニング対象のＨＮやＨＮＤに対し、軽度認知障害または初期認知症の治療用医薬剤、神経細胞の樹状突起形成促進剤、または神経細胞のシナプス形成促進剤として有効かどうか検定し、有効と判定されたＨＮＤを選択する。以下、この検定方法について、詳細に記載する。
【００４７】
＝＝検定方法＝＝
ＨＮやＨＮＤの効果の検定は、例えば、培養細胞に対する樹状突起伸長促進効果、シナプス形成促進効果を調べることによって、あるいは、動物個体における神経細胞の樹状突起伸長促進効果、シナプス形成促進効果、または疾患の治癒や改善が認められるか否かを調べることによって、行うことができる。
【００４８】
なお、効果を検定する対象の疾患は、神経細胞の樹状突起やシナプス形成を促進することにより治癒または症状が改善される疾患であって、上述したような、ＨＮやＨＮＤが医薬剤として治療対象にできる疾患と同じである。
【００４９】
（１）in vitroにおけるＨＮやＨＮＤの効果の検定
ＨＮやＨＮＤのペプチドの効果の検定方法の一つの態様は、ペプチドを添加した培養細胞群と添加しない培養細胞群において、培養細胞の樹状突起伸長、あるいは、シナプス形成を調べることを特徴とする。培養細胞は、例えば、ＰＣ１２細胞やＰＣＮ等の細胞を用いることができる。例えば、培養細胞群を２つの群に分け、一方の添加群の培養細胞にはペプチドを添加し、もう一方の対照群にはペプチドを添加しないか、あるいは担体を投与する。その後、添加群と対照群における樹状突起の形成、あるいは、シナプス形成を調べ、添加したペプチドが樹状突起形成促進効果またはシナプス形成促進効果を有する場合には、そのペプチドは、神経細胞の樹状突起形成促進剤、シナプス形成促進剤、および、神経細胞の樹状突起やシナプス形成を促進することにより治癒または症状が改善される疾患に対する治療用医薬剤における有効物質として適用することができる。
【００５０】
（２）in vivoにおけるＨＮやＨＮＤの効果の検定
ＨＮやＨＮＤのペプチドを含有する医薬の検定方法の一つの態様は、神経細胞の樹状突起形成促進、あるいは、シナプス形成促進により治癒または症状が改善されると考えられる疾患を有する患者または患獣に対してペプチドを投与し、そのペプチドの投与前と比較して疾患の治癒または改善が認められるか否かを調べる。患者または患獣が有する具体的な疾患例は、上述したような、ＨＮやＨＮＤが医薬剤として治療対象にできる疾患と同じである。
【００５１】
あるいは、患者または患獣を２つの群に分け、一方の投与群にはペプチドを投与し、もう一方の対照群にはペプチドを投与しないか、またはプラセボを投与し、対照群と比較して、投与群で疾患の治癒または改善が認められるか否かを調べてもよい。
【００５２】
なお、そのペプチドによって個体の疾患が治癒または改善しているか否かを調べる方法は、ＣＴやＭＲＩ等を用いた病理学的診断方法であっても、または、Clinical Dementia Rating（CDR）、Global Deterioration Scale（GDS）、Mini-Mental State Examination（MMSE）等、臨床的に用いられている診断方法であってもよい。あるいは、対象が患獣である場合には、疾患の原因疾患を有する組織を摘出し、顕微鏡下で神経細胞の樹状突起形成や、シナプス形成を観察して調べてもよい。
【実施例】
【００５３】
＝＝ペプチド＝＝
ＨＮ（ＭＡＰＲＧＦＳＣＬＬＬＬＴＳＥＩＤＬＰＶＫＲＲＡ）、ＨＮＧ（ＭＡＰＲＧＦＳＣＬＬＬＬＴＧＥＩＤＬＰＶＫＲＲＡ）、第８位アミノ酸Ａ置換ヒューマニンペプチド（ＨＮＡ（ＭＡＰＲＧＦＳＡＬＬＬＬＴＳＥＩＤＬＰＶＫＲＲＡ、配列番号３））は、化学合成した。
【００５４】
＝＝細胞培養＝＝
特記しない限り、細胞培養は全て５％ ＣＯ２存在下、３７℃で、１０％ ＦＢＳ含有 Dulbecco's modified Eagle's medium （ＤＭＥＭ）を用いて行った。
【００５５】
[実施例１]
本実施例では、ＨＮおよびＨＮＧが樹状突起伸長の促進作用を有することを示す。
【００５６】
ＰＣ１２細胞（ラット副腎髄質由来褐色細胞腫）をＦＢＳ非含有ＤＭＥＭで３時間リンスした後、培地に１０ μＭ ＨＮ、ＨＮＧ、あるいは、ＨＮＡを添加してインキュベートし、０、１、３、６、２４時間後の樹状突起の伸長の様子を観察した。対照群の細胞は、溶媒である水のみを添加し同様にインキュベートした。０、１、３、６、２４時間後にランダムに選択した１．８ × １０５ μｍ2（４００ μｍ × ４５０ μｍ）の面積の５視野において樹状突起が伸長している細胞数を計数し、樹状突起伸長細胞率（樹状突起が伸長している細胞数／全細胞数×１００）を算出した。なお、ＰＣ１２細胞は、神経分化および樹状突起伸長のモデル細胞として広く用いられている（例えば、McGee R Jr., Mol. Cell Biochem. 16, 33(3): 121-133, 1980 参照）。
【００５７】
その結果、図１Ａに示すように、インキュベート開始６時間後には、対照群およびＨＮＡと比較してＨＮ、ＨＮＧ添加群で細胞の樹状突起が顕著に伸長していた。また、図１Ｂに示すように、インキュベート開始２４時間後には、対照群およびＨＮＡ群と比較して、ＨＮ群およびＨＮＧ群で樹状突起伸長細胞率が有意に高かった。
【００５８】
このように、ＨＮおよびＨＮＧは、樹状突起伸長の促進作用を有する。
【００５９】
次に、ＨＮ、ＨＮＧ、およびＨＮＡの二次構造の解析を行った。ＨＮ、ＨＮＧ、ＨＮＡを各々ＰＢＳに溶解し、２０μＭ溶液を調製した。この溶液の円二色性スペクトルを、Jasco 820 spectrometer（日本分光株式会社）を用いて測定した。この際、光路長１ｍｍ、０．１ｎｍインターバルで１分当たり１００ｎｍの測定を行った。これにより得られた楕円率の平均値（[θ]）を基に、ＨＮ、ＨＮＧ、およびＨＮＡのそれぞれについて、二次構造の比率をJasco analytical program （Yang et al., Methods Enzymol. 130: 208-269, 1986）を用いて予測した。
【００６０】
表１に示すように、ＨＮおよびＨＮＧには各二次構造について有意な差が認められないが、ＨＮＡでは、ＨＮと比較してβシート構造率が低く、ランダム構造率が高かった。
【表１】
【００６１】
この結果は、一定の二次構造、すなわち平均値として、αヘリックス構造が４．８〜６．６％、βシート構造が４０．９〜３８．３％、βターン構造が２０．６〜２２．１％、ランダム構造が３３．８〜３２．６％を占める二次構造を有するＨＮＤはＨＮと同様の樹状突起伸長作用を有することを示している。
【００６２】
[実施例２]
本実施例では、ＨＮ、ＨＮＧがシナプス形成促進作用を有することを示す。
【００６３】
ＰＣＮ（皮質ニューロン初代培養細胞）は、Sasabe et al. (EMBO J. 26(18): 4149-4159, 2007)の方法に従い、受精後１４日のマウス胚から採取した皮質細胞から調製した。ＰＣＮは、poly-L-lysine コートディッシュまたはカバーガラスに播種し（５ｘ１０４個／ｃｍ２）、Ｂ２７（×５０）(Invitrogen 社)および０．５ ｍＭグルタミン（和光純薬工業株式会社）を添加した神経細胞基本培地（Invitrogen 社）で培養した。培養開始から４日目、最終濃度が１０ μＭになるようにＨＮを添加し、３０分〜９６時間インキュベートした後、以下の組織学的検出法で樹状突起を検出した。
【００６４】
＝＝組織学的検出法＝＝
細胞（５ｘ１０４個／ｃｍ２）を４％パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳ溶液で２０分間固定し、０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で１５分間透過処理し、１％ ＢＳＡ(Sigma-Aldrich 社)−ＰＢＳ溶液で１時間ブロッキングを行った。その後、抗Tyrosinated tubulin(Tyr-Tub)マウスモノクローナル抗体（１００倍希釈、Sigma-Aldrich 社）、抗ＮＲ１マウスモノクローナル抗体（１００倍希釈、BD Pharmingen 社）、または抗ｓｙｎａｐｓｉｎ １ ウサギポリクローナル抗体（２００倍希釈、Millipore 社）を含有した１％ ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液中で、室温で３時間インキュベートした。ＰＢＳで細胞をリンスした後、ＦＩＴＣまたはＴｅｘａｓ−Ｒｅｄ標識抗マウスＩｇＧまたは抗ウサギＩｇＧ（２５０倍希釈、Jackson laboratories 社）を含有した１％ ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液中、４０分間室温でインキュベートした。また、F-actin可視化のために、透過処理後の細胞を、ローダミン標識phalloidin （１００ ｎｇ/ｍｌ、Sigma-Aldrich 社）を含有した１％ ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液中、室温で２０分間インキュベートした。なお、phalloidinはF-actinの特異的検出に一般的に用いられている。以上のように染色した細胞を、ＰＢＳでリンスし、ＤＡＰＩ（Invitrogen 社）で核を対比染色した後、Zeiss LSM510共焦点レーザー顕微鏡下で観察した。
【００６５】
phalloidinにより検出されたF-actinの染色強度の定量的解析は、グレイスケールに転換した顕微鏡写真においてランダムに選択した２４０ μｍ２の５視野について行った。また、シナプス形成数の定量的解析のため、抗synapsin 1抗体および抗ＮＲ１抗体による免疫染色の共局在を、ランダムに選択した９０ μｍ２の１０視野について計数した。
【００６６】
その結果、図２Ａに示すように、ＨＮ処理群では、対照群と比較して、樹状突起端部にF-actinがより局在していた。つまり、ＨＮ処理開始から６時間〜２４時間後には、顕著な樹状突起形成が見られ、その時間経過と共に、ＨＮ処理群の樹状突起端部のF-actinの局在がさらに強まった。ＨＮ処理開始から９６時間後には、ＨＮ処理群で樹状突起端部へのF-actinの局在は失われ、特に樹状突起以外の細胞体におけるF-actin局在が強まった。微小管マーカーであるTyr-Tubの染色像から、対照群と比較してＨＮ処理群でより密に局在し、形成された樹状突起が維持されていた。
【００６７】
次に、神経成長円錐当たりの樹状突起数を、F-actinの染色写真を用いて解析した結果を図２Ｂに示す。神経成長円錐あたりの樹状突起数は、対照群と比較して、ＨＮ処理群（２４時間）で有意に多かった（unpaired Student's t-test）。
【００６８】
また、ＨＮ処理開始９６時間後のプレシナプス（ｓｙｎａｐｓｉｎ １ 陽性）、および、ポストシナプス（ＮＲ１）の形成数を図２Ｃに示す。シナプスは、プレシナプスとポストシナプスの対から形成されるが、対照群に比較して、ＨＮ処理群では顕著にシナプス形成数が多かった。
【００６９】
ＨＮ処理開始２４時間後の神経細胞あたりのシナプス形成数は、図２Ｄに示すように対照群に比較してＨＮ処理群で有意に高かった（unpaired Student's t-test）。
【００７０】
このように、ＨＮはＰＣＮ細胞において樹状突起伸長促進作用、及びシナプス形成促進作用を有する。
【００７１】
[実施例３]
本実施例は、神経細胞死因子存在下において、ＨＮが細胞の樹状突起伸長促進作用、および死細胞率を低下させる作用を有することを示す。
【００７２】
ヒトＡβ１−４２ペプチドはPeptide Institute 社から購入した。このヒトＡβ１−４２ペプチドをＭｅ２ＳＯに３ｍＭで溶解し、氷冷した神経細胞基本培地で１００μＭに希釈した。その後、３０秒間ボルテックスし、４℃で４８時間インキュベートして、ヒトＡβ１−４２オリゴマーを調製した（Lambert et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(11):6448-6453, 1998 参照）。
【００７３】
実施例２と同様に調製したＰＣＮ（５ｘ１０４個／ｃｍ２）に、Ａβ１−４２オリゴマー（最終濃度１μＭ）を加えて３０分間インキュベートした（Ａβ１−４２群）。一方、Iodoacetic acid（ＩＯＡ）群では、ＰＣＮにＩＯＡ（Sigma-Aldrich 社）（最終濃度５０ μＭ）を加えて３０分間インキュベート後、ＩＯＡ非含有培地でリンスした。これらの各群において、Ａβ１−４２処理またはＩＯＡ処理に続いて、ＨＮを最終濃度１０ μＭで加え２４時間インキュベートした。なお、ＨＮ処理に対する対照として、同量の水を培地に添加して同様にインキュベートした（図ではＨ２Ｏ）。以上の処理後、実施例２の組織学的検出法を用い、抗体または特異的マーカーによりＰＣＮを特異的に検出した。F-actinの染色強度の定量的解析は、実施例２と同様に行った。神経細胞死は、ＤＡＰＩで核染色したＰＣＮについて、核の凝縮を指標にして形態的に判定し、全神経細胞数（核数）に対する死細胞率を算出した。これらの定量的解析は、各群、５．８×１０４ μｍ2（２４０×２４０ μｍ）の５視野について行った。
【００７４】
図３Ａに示すように、水添加群では、対照に比較してＡβ１−４２あるいはＩＯＡ群でF-actinおよびTyr-Tub陽性の樹状突起が少なかった。すなわち、Ａβ１−４２、およびＩＯＡの処理によりＰＣＮがダメージを受けていることが確認された。一方、これらの各群において、ＨＮを添加してインキュベートを行った場合、水添加群の対照と比較してもより顕著にＰＣＮの樹状突起が伸長していた（図３Ａ下段）。図３Ｂに示すように、F-actinの染色は、対照、Ａβ１−４２、ＩＯＡのいずれの群においてもＨＮを添加してインキュベートした場合に有意に強くなっていた。
【００７５】
また、死細胞率は、Ａβ１−４２処理群およびＩＯＡ処理群で対照と比較して有意に上昇したが（図３Ｃ、Ｄ白棒）、ＨＮを添加してインキュベートした場合には、Ａβ処理群、ＩＯＡ処理群で死細胞率が有意にあるいは顕著に低下した（図３Ｃ、Ｄ黒棒）（Turkey's post-hoc 検定）。
【００７６】
このように、神経細胞死因子によりダメージを受けた神経細胞においても、ＨＮは細胞死抑制、および、樹状突起形成促進効果を有する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、軽度認知障害（MCI: mild cognitive impairment）の治療用医薬剤、初期認知症の治療用医薬剤、神経細胞の樹状突起形成促進剤、神経細胞のシナプス形成促進剤、検定方法およびスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
軽度認知障害（MCI: mild cognitive impairment）は、年齢相応の加齢による認知力減退（ADAS: age-associated memory impairment）を有する正常群と、認知症と診断される群との中間に位置する病的状態と考えられている。軽度認知障害を有する患者のうち、約７０％は、アルツハイマー病へと移行し(非特許文献１参照)、約３０％は、血管性認知症、Lewy小体型認知症など他の認知症に移行することもあるが、通常、症状は非進行で比較的安定である (非特許文献２及び３参照)。
【０００３】
軽度認知障害の診断には、２００３年のMCIコンセンサス会議で提唱された診断基準が、一般的に用いられている(非特許文献４参照)。それによると、
（１）正常ではなく、認知症でもない（DSMIVやICD10の認知症の診断基準を満たさない）、
（２）本人かつ／または家族から認知機能低下の訴えがあり、客観的な認知機能検査でも障害を認めるかつ／または検査上以前と比べて認知機能低下がある、
（３）ADL（日常生活動作）は正常あるいはごく軽度に、複雑な動作機能が障害されているのみである、という３点を満たす場合に、軽度認知障害と診断される。それ以外の診断基準としては、Clinical Dementia Rating (CDR)では0.5（認知症疑いに相当）、Global Deterioration Scale (GDS)では2〜3（年齢相応の認知障害〜軽度認知障害に相当）、簡易認知機能検査のMini-Mental State Examination (MMSE)では、26〜27程度（30満点で24までが正常）などが用いられている。
【０００４】
軽度認知障害を有する患者の脳においては、病理学的には、神経突起変性、シナプス形成異常、あるいはシナプス数減少などのシナプス形成不全が観察され、海馬におけるシナプス数減少が認知機能の低下と相関していることが報告された（非特許文献５参照）。また、Functional MRIで調べられた結果、海馬内での機能的連絡、すなわちシナプスを介した神経細胞同士の連絡の低下が軽度認知障害で認められた(非特許文献６及び７参照)。
【０００５】
軽度認知障害の初期には、シナプス活動の低下に対する代償として、シナプスマーカーが一時的に上昇する(非特許文献８参照)が、その後、シナプス数の減少が進行性に起こり、アルツハイマー病などの認知症へ移行すると、シナプスマーカーの発現は減少する(非特許文献９参照)。
【０００６】
このように、シナプス活動の低下とシナプス数の減少は、軽度認知障害の発症過程における初期イベントであって、軽度認知障害の症状に重要な役割を果たしており（非特許文献５参照）、シナプス機能及び／又はシナプス数の維持は、軽度認知障害または初期認知障害の治療に有用であると考えられている（非特許文献１０参照）。
【０００７】
一方、認知症の一種であるアルツハイマー病患者の脳内でも、神経細胞死よりも神経突起変性やシナプス数減少などが、より早期に起こることが知られている（非特許文献１１参照）。しかしながら、アルツハイマー病のような神経変性疾患の病因は多様であって、例えば、コリン作動性神経の機能が低下していることがその一つであると考えられ、治療薬として塩酸ドネペジル（アリセプト）、リバスチグミン、ガランタミンなどのアセチルコリンエステラーゼ阻害剤が用いられている。
【０００８】
これに対し、軽度認知障害の患者では、海馬におけるコリン作動性神経の機能が上昇していることが知られており（非特許文献１２、１３参照）、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤をそのまま適用しても、軽度認知障害に対する治療効果は全く期待できない。実際、塩酸ドネペジルを軽度認知障害患者に使用した治験では、部分的にしか効果が得られていない（非特許文献１４−１８参照）。
【０００９】
また、神経細胞死を抑制するとされるメマンチンは、アルツハイマー性細胞死を抑制する治療薬として知られているが、シナプス活動の低下とシナプス数の減少が、認知症の発症過程における初期イベントであって、細胞死はその後に起きる（非特許文献１１参照）ため、まだ細胞死が認められないような初期認知症の患者に対しては効果が得られないと考えられる。実際、メマンチンは、アルツハイマー認知症の中等度・重度における適用が欧米で認められているにすぎない。
【００１０】
ヒューマニンペプチドおよび第１４位アミノ酸Ｇ置換ヒューマニンペプチドも、神経細胞死抑制作用を有することから、神経細胞の変性、脱落に起因するアルツハイマー症の治療薬としての有用性が既に報告されている（特許文献１、２参照）。しかしながら、ヒューマニンペプチドおよび第１４位アミノ酸Ｇ置換ヒューマニンペプチドに関し、神経細胞死抑制以外の薬理効果については報告がなく、脳で神経細胞死が生じていないケースに対する適用は考えられていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】ＷＯ０１／２１７８７号公報
【特許文献２】特開２００８−１９２４５号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Petersen et al, Arch Neurol. 1999 Mar; 56(3):303-8.
【非特許文献２】Jicha et al, Arch Neurol. 2006 May; 63(5):674-81.
【非特許文献３】Morris et al, J Mol Neurosci. 2001 Oct; 17(2):101-18.
【非特許文献４】Winblad et al, J Intern Med. 2004 Sep; 256(3):240-6.
【非特許文献５】Scheff et al., Neurobiol. Aging 2006 Oct; 27(10):1372-84.
【非特許文献６】Bai et al, Biol Psychiatry. 2009 Jun 1; 65(11):951-8.
【非特許文献７】Johnson et al, Neurobiol Aging. 2006 Nov; 27(11):1604-12.
【非特許文献８】Counts et al, J Neuropathol Exp Neurol. 2006 Jun; 65(6):592-601.
【非特許文献９】Masliah et al, Neurology. 2001 Jan 9; 56(1):127-9.
【非特許文献１０】Selkoe, Science 2002 Oct 25; 298(5594):789-791.
【非特許文献１１】Hardy and Selkoe, Science 2002 Jul 19; 297(5580):353-6.
【非特許文献１２】DeKosky et al., Ann Neurol. 2002 Feb; 51(2):145-55.
【非特許文献１３】Jackisch et al., Exp Neurol. 2008 Oct; 213(2):345-53.
【非特許文献１４】Petrella et al., AJNR Am J Neuroradiol. 2009 Feb;30(2):411-6.
【非特許文献１５】Doody et al. Neurology. 2009 May 5;72(18):1555-61.
【非特許文献１６】Lu et al. Neurology. 2009 Jun 16;72(24):2115-21.
【非特許文献１７】Crane and Doody Neurology. 2009 Nov 3;73(18):1514-5.
【非特許文献１８】Doody et al. Am J Alzheimers Dis Other Demen. 2010 Mar;25(2):155-9.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、軽度認知障害（MCI: mild cognitive impairment）の治療用医薬剤、初期認知症の治療用医薬剤、神経細胞の樹状突起形成促進剤、神経細胞のシナプス形成促進剤、検定方法およびスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、ＭＡＰＲＧＦＳＣＬＬＬＬＴＳＥＩＤＬＰＶＫＲＲＡ（配列番号１）またはＭＡＰＲＧＦＳＣＬＬＬＬＴＧＥＩＤＬＰＶＫＲＲＡ（配列番号２）からなる配列を有するペプチドが、神経細胞の樹状突起形成促進作用およびシナプス形成促進作用を有することを見出し、本発明の完成に至った。
【００１５】
すなわち、本発明に係る軽度認知障害（MCI: mild cognitive impairment）または初期認知症の治療用医薬剤は、ヒューマニンペプチドまたは第１４位アミノ酸Ｇ置換ヒューマニンペプチド、あるいは、前記ペプチドを発現する発現ベクターを含有することを特徴とする。前記ペプチドのアミノ酸配列は、ヒト由来であることが好ましく、ＭＡＰＲＧＦＳＣＬＬＬＬＴＳＥＩＤＬＰＶＫＲＲＡ（配列番号１）またはＭＡＰＲＧＦＳＣＬＬＬＬＴＧＥＩＤＬＰＶＫＲＲＡ（配列番号２）であることがより好ましい。前記軽度認知障害または前記初期認知症の患者においては、シナプス形成不全が生じているが、神経細胞死が事実上生じていないことが好ましい。
【００１６】
また、本発明に係る神経細胞の樹状突起形成促進剤は、ヒューマニンペプチドまたは第１４位アミノ酸Ｇ置換ヒューマニンペプチド、あるいは、前記ペプチドを発現する発現ベクターを含有することを特徴とする。
【００１７】
さらに、本発明に係る神経細胞のシナプス形成促進剤は、ヒューマニンペプチドまたは第１４位アミノ酸Ｇ置換ヒューマニンペプチド、あるいは、前記ペプチドを発現する発現ベクターを含有することを特徴とする。
【００１８】
また、本発明に係る軽度認知障害または初期認知症の治療方法は、軽度認知障害または初期認知症の患者に対し、ヒューマニンペプチドまたは第１４位アミノ酸Ｇ置換ヒューマニンペプチド、あるいは、前記ペプチドを発現する発現ベクターを投与することを特徴とする。投与方法は、静脈内投与、脊髄腔内投与、脳室内投与、硬膜内投与であることが好ましい。また、前記軽度認知障害または前記初期認知症の患者においては、シナプス形成不全が生じているが、神経細胞死が事実上生じていない期間に投与することが好ましい。なお、前記ペプチドのアミノ酸配列は、ヒト由来であることが好ましく、ＭＡＰＲＧＦＳＣＬＬＬＬＴＳＥＩＤＬＰＶＫＲＲＡ（配列番号１）またはＭＡＰＲＧＦＳＣＬＬＬＬＴＧＥＩＤＬＰＶＫＲＲＡ（配列番号２）であることがより好ましい。
【００１９】
また、本発明に係る細胞の樹状突起形成促進方法またはシナプス形成促進方法は、細胞に対し、ヒューマニンペプチドまたは第１４位アミノ酸Ｇ置換ヒューマニンペプチド、あるいは、前記ペプチドを発現する発現ベクターを投与することを特徴とする。前記細胞は、培養細胞であっても、組織または器官の細胞であっても、個体の細胞であってもよく、前記個体は、ヒトでもヒト以外の脊椎動物でもよい。また、前記ペプチドまたは前記ベクターは、in vivoで投与されてもin vitroで投与されてもよい。前記細胞は、樹状突起形成能またはシナプス形成能を有する細胞であることが好ましく、神経幹細胞、神経前駆細胞、または神経細胞であることがより好ましい。
【００２０】
さらに、本発明にかかる検定方法は、ヒューマニンペプチドまたはヒューマニンペプチド誘導体が、軽度認知障害または初期認知症の治療効果、神経細胞の樹状突起形成促進効果、または神経細胞のシナプス形成促進効果を有するかどうかを調べる検定方法であって、前記ヒューマニンペプチドまたはヒューマニンペプチド誘導体を作製する工程と、作製された前記ヒューマニンペプチドまたはヒューマニンペプチド誘導体が軽度認知障害または初期認知症の治療効果、神経細胞の樹状突起形成促進効果、または神経細胞のシナプス形成促進効果を有するかどうか、in vivoまたはin vitroで調べる工程と、を含む。
【００２１】
さらに、本発明に係るスクリーニング方法は、軽度認知障害または初期認知症の治療用医薬剤、神経細胞の樹状突起形成促進剤、または神経細胞のシナプス形成促進剤として有効なペプチドのスクリーニング方法であって、ヒューマニンペプチドまたはヒューマニンペプチド誘導体を作製する工程と、作製された前記ヒューマニンペプチドまたはヒューマニンペプチド誘導体が軽度認知障害または初期認知症の治療用医薬剤、神経細胞の樹状突起形成促進剤、または神経細胞のシナプス形成促進剤として有効かどうか、in vivoまたはin vitroで検定する工程と、前記検定の結果、有効と判定されたヒューマニンペプチド誘導体を選択する工程と、を含む。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によって、軽度認知障害（MCI: mild cognitive impairment）または初期認知症の治療用医薬剤、神経細胞の樹状突起形成促進剤、神経細胞のシナプス形成促進剤、およびスクリーニング方法を提供することができるようになった。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の一実施形態において、ＰＣ１２細胞におけるヒューマニンペプチド（ＨＮ）、第１４位アミノ酸Ｇ置換ヒューマニンペプチド（ＨＮＧ）、第８位アミノ酸Ａ置換ヒューマニンペプチド（ＨＮＡ）、の樹状突起伸長促進効果を示す図である。
【図２】本発明の一実施形態において、皮質ニューロン初代培養細胞（ＰＣＮ）におけるＨＮの樹状突起伸長促進とシナプス形成促進効果を示す図である。
【図３】本発明の一実施形態において、Ａβ１−４２またはＩＯＡで処理したＰＣＮに対する、ＨＮの樹状突起伸長促進効果と、細胞死率改善効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。
【００２５】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.等の標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００２６】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例等は、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００２７】
＝＝ヒューマニンペプチド、ヒューマニン誘導体、及びそれらを発現させるための発現ベクター＝＝
本発明の一実施態様における医薬または試薬は、ヒューマニンペプチド（ＨＮ）またはヒューマニン誘導体（ＨＮＤ）を有効成分として含有する。
【００２８】
ＨＮおよびＨＮＤのアミノ酸配列は、それらを含む医薬の投与対象の動物や試薬の投与対象の細胞に由来することが好ましいが、投与された神経細胞において所望の樹状突起形成促進作用、あるいは、シナプス形成促進作用を持つ範囲で制限されない。例えば、医薬の投与対象がヒトの場合、GenBank AAK50430に登録されたヒトＨＮ（ＭＡＰＲＧＦＳＣＬＬＬＬＴＳＥＩＤＬＰＶＫＲＲＡ、配列番号１）、あるいは、その誘導体であることが好ましいが、ヒトにおいて神経細胞の樹状突起形成促進作用またはシナプス形成促進作用を持つ他の動物種のホモログ（オーソログを含む）であってもよい。
【００２９】
ＨＮＤは、所望の樹状突起形成促進作用およびシナプス形成促進作用を有する範囲で制限されず、ＨＮの数アミノ酸残基（例えば、１０アミノ酸残基、好ましくは８アミノ酸残基、より好ましくは６アミノ酸残基、さらに好ましくは４アミノ酸残基、さらに好ましくは２アミノ酸残基）が欠失、挿入、または置換されたアミノ酸配列を有していてもよいが、その神経細胞における樹状突起形成促進作用およびシナプス形成促進作用を考慮すると、αヘリックス構造が４．８〜６．６％、βシート構造が４０．９〜３８．３％、βターン構造が２０．６〜２２．１％、ランダム構造が３３．８〜３２．６％を占める二次構造を有することが好ましい。例えば、このような二次構造を有するヒトＨＮＤとして、第１４アミノ酸Ｇ置換ヒトＨＮＧ（ＭＡＰＲＧＦＳＣＬＬＬＬＴＧＥＩＤＬＰＶＫＲＲＡ、配列番号２）が挙げられる。なお、この二次構造は、円二色性スペクトル測定法（circular dichroism spectroscopy）を用いて測定することができる。また、これらのＨＮやＨＮＤはその樹状突起形成促進作用およびシナプス形成促進作用を失わない範囲で、糖修飾等の翻訳後修飾や、生体内で分解されにくくするような修飾が施されていてもよい。
【００３０】
ここで、ＨＮおよびＨＮＤの製造方法は特に制限されず、ＨＮあるいはＨＮＤを発現する細胞から単離、精製してもよく、遺伝子組換え技術によって組換えペプチドとして調製してもよく、または周知の方法で化学合成してもよい。
【００３１】
本発明の他の態様に係る医薬または試薬は、ＨＮまたはＨＮＤを発現する発現ベクターを含有する。この発現ベクターは、神経細胞内でＨＮまたはＨＮＤを発現させるための適切なエンハンサー及び／又はプロモーター、および、その下流にＨＮあるいはＨＮＤをコードするＤＮＡを有しており、この発現ベクターを細胞に導入すると、細胞内でＨＮあるいはＨＮＤが発現する。このため、この発現ベクターを含有する医薬や試薬は、神経細胞に対し、ＨＮあるはＨＮＤを含有する医薬や試薬と同じ効果をもたらす。このような発現ベクターは、当業者に周知の遺伝子組換え技術を用い、ＨＮまたはＨＮＤをコードするＤＮＡを好適な発現ベクターに挿入して調製することができる。
【００３２】
＝＝樹状突起形成促進剤及びシナプス形成促進剤＝＝
以下の実施例で示すように、ＨＮおよびＨＮＤは、細胞の樹状突起形成およびシナプス形成を促進する作用を有する。従って、ＨＮ、ＨＮＤ、および、ＨＮまたはＨＮＤを発現する発現ベクターを含有する医薬や試薬は、細胞の樹状突起形成促進剤またはシナプス形成促進剤として有効である。
【００３３】
樹状突起形成促進剤やシナプス形成促進剤は、in vitroで、培養細胞や、培養されている組織または器官の中の細胞に投与されてもよく、in vivoで、ヒトやヒト以外の脊椎動物の個体中の組織、器官、または細胞に投与されてもよい。培養細胞や、培養された組織または器官の中の細胞の場合、ＨＮやＨＮＤを培地に添加したり、ＨＮやＨＮＤを発現する発現ベクターを細胞内に導入したりすることにより、細胞に投与できる。また、ＨＮやＨＮＧを発現する発現ベクターを有し、これらのペプチドを細胞外に分泌する細胞を培地に添加してもよい。培地は、用いる細胞、組織または器官に従って、当業者が適切なものを選択することができる。また、発現ベクターの細胞内への導入方法も、当業者が適切なものを選択することができる。一方、個体中の組織、器官、または細胞を用いる場合、樹状突起形成促進剤やシナプス形成促進剤は、典型的には、以下に述べる医薬剤として用いることができる。
【００３４】
ここで、樹状突起形成促進剤やシナプス形成促進剤を投与する対象の細胞は、樹状突起形成能またはシナプス形成能を有する細胞であることが好ましく、例えば、神経幹細胞、神経前駆細胞、神経細胞、及びこれらの細胞に分化予定の細胞あるいはこれらの細胞に分化決定した細胞などが例示できる。
【００３５】
＝＝医薬剤＝＝
ＨＮ、ＨＮＤ、および、ＨＮまたはＨＮＤを発現する発現ベクターを含有する医薬は、神経細胞の樹状突起形成やシナプス形成を促進することにより治癒、または、症状が改善される疾患に対する治療用医薬剤として使用することができる。また、そのような疾患に対して、実際に効果があるかどうか、またどのくらいの効果があるのかを、その疾患を有する患者やヒト以外のモデル脊椎動物に投与して調べることができる。
【００３６】
本医薬剤の治療対象としては、例えば、中枢神経系や末梢神経系の神経細胞における神経突起変性、シナプス形成異常、あるいはシナプス数減少などのシナプス形成不全を原因とする疾患が挙げられる。具体的には、例えば、認知障害、変性性認知症（アルツハイマー症を含む）、血管性認知症、二次的認知症などの認知症が挙げられるが、軽度認知障害（すなわち、MCI: mild cognitive impairment）や初期認知症（例えば、初期アルツハイマー症）が好ましく、特に、シナプス形成不全が生じているが、神経細胞死が事実上生じていない軽度認知障害や初期認知症が好ましい。なお、これらの認知障害や認知症は、遺伝、加齢、外傷、または、腫瘍形成、脳虚血、自己免疫疾患等の二次疾患であってもよい。
【００３７】
軽度認知障害の診断は、例えば、MCIコンセンサス会議（２００３年）で提案された診断基準に従って行うことができる。この診断では、（１）正常ではなく、認知症でもない、（２）本人または家族から認知機能低下の訴えがあり、客観的な認知機能検査でも障害を認める、または、以前と比較して検査上認知機能低下が認められる、（３）日常生活動作は正常、あるいは極軽度に煩雑な動作機能が障害されているのみである、の３項目に該当するか否かを調べることにより、患者が軽度認知障害を発症しているか否かを判断する（例えば、Winblad B et al., J. Intern. Med 256(3): 240-246, 2004 参照）。なお、軽度認知障害の病理的特徴としては、脳神経細胞のシナプス形成異常やシナプス数の減少、海馬の神経伝達機能低下等（Johnson SC et al., Neurobiol. Aging 27(11): 1604-1612, 2006; Scheff SW et al., Neurobiol. Aging 27(10): 1372-1384, 2006; Bai F et al., Neurosci. Lett. 438(1): 111-115, 2008）をはじめとして、側頭葉内側の神経原線維変化（Mitchell TW et al., Ann. Neurol. 51(2): 182-189, 2002; Guillozet AL et al., Arch. Neurol. 60(5): 729-736, 2003; Markesbery WR et al., Arch. Neurol. 63(1): 38-46, 2006）等が認められる。
【００３８】
また、認知症とは、銘力・記憶力低下、見当識障害、判断力低下等の症状を呈する疾患であり、その原因によって変性性認知症（アルツハイマー病を含む）、血管性認知症、二次性認知症等に分類される。認知症の診断は、例えば、短期記憶力の喪失に加え、失語、失行、失認、実行機能不全（計画、整理、順序付け、抽象的思考ができないこと）のいずれか１項目以上の症状に該当することを基準として行えばよい（例えば、メルクマニュアル第１８版 日本語版、日経ＢＰ社刊参照）。このような症状に該当するか否かを診断するため臨床的に用いられている尺度としては、Clinical Dementia Rating（CDR）、Global Deterioration Scale（GDS）、Mini-Mental State Examination（MMSE）等が挙げられる。
【００３９】
発明に係る医薬剤の投与対象は、脊椎動物であることが好ましく、ヒトでもヒト以外でもよいが、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ウサギ、ブタ、サル等の哺乳動物であることがより好ましく、ヒトであることが最も好ましい。また、脊椎動物の年齢、性別は制限されない。
【００４０】
本発明に係る医薬剤の剤形化には、当業者に周知の薬学的に許容される担体、希釈剤、腑形剤等の製剤用添加物が用いられる。その形態は本医薬剤を投与対象の動物体内において、投与部位から医薬剤を作用させたい部位に送達するために適切な剤形であれば特に制限されず、水溶液、錠剤、カプセル、顆粒、散剤、シロップ、腸溶剤、徐放性カプセル、カシュー、咀嚼錠、ドロップ、丸剤、内用液剤、菓子錠剤、徐放錠、徐放性顆粒等いずれの剤形であってもよい。なお、本医薬剤には、ＨＮ、ＨＮＧ、ＨＮ発現ベクター、またはＨＮＧ発現ベクターと上記製剤用添加物以外に、異なる物質を一種類以上配合してもよく、そのような物質として、例えば、神経細胞間の神経伝達活性を維持または促進する作用のある物質、神経細胞の細胞死を抑制または阻害する作用のある物質、神経細胞の増殖を促進する物質が挙げられる。
【００４１】
患者への投与方法は、治療者が適宜選択することができ、例えば、皮内投与、皮下投与、静脈内投与、リンパ節投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、経気管支投与、筋肉内投与、脳室内投与、脊髄腔内投与等であってもよいが、有効成分を適切に疾患部位に送達させることを考慮すると、静脈内投与、脊髄腔内投与、脳室内投与、硬膜内投与等が好ましい。
【００４２】
本発明の医薬剤の投与は、安全とされている投与量の範囲内において、投与対象の動物に対し、必要量を適した方法で行うことができる。本発明の医薬剤の投与量は、剤形の種類、投与方法、投与対象の年齢や体重、投与対象の病状等を考慮して、最終的には医師または獣医師の判断により適宜決定することができる。本医薬剤は、予防または治療の対象疾患に対する、異なる医薬剤を併用して投与することもできる。
【００４３】
また、投与時期に関しても、投与者が適切な時期を選択できる。特に、認知症患者の脳内では、神経細胞死よりもシナプス形成不全が、より早期に起こることが知られている（Hardy and Selkoe, Science 2002 Jul 19; 297(5580):353-6.）ので、軽度認知障害や初期認知症では、主に、シナプス形成不全が生じている時期に投与することが好ましく、海馬におけるシナプス形成不全が生じているが、症状に関わる神経細胞死が事実上生じていない時期に投与することが最も好ましい。なお、シナプス形成不全や細胞死は、頭部ＣＴや頭部ＭＲＩなどの画像検査によって検出可能であるが、海馬におけるシナプス数減少が認知機能の低下と相関している（Scheff et al., Neurobiol. Aging 2006 Oct; 27(10):1372-84.）ため、シナプス形成不全を認知機能検査によって診断し、細胞死を画像検査によって診断してもよい。
【００４４】
＝＝ＨＮ及びＨＮＤのスクリーニング方法＝＝
本発明の一実施態様におけるスクリーニング方法は、軽度認知障害または初期認知症の治療用医薬剤、神経細胞の樹状突起形成促進剤、または神経細胞のシナプス形成促進剤として有効なＨＮまたはＨＮＤのスクリーニング方法である。
【００４５】
具体的には、まず、スクリーニングする対象となるＨＮやＨＮＤを作製する。ＨＮＤとしては、例えば、ＨＮに対し、数アミノ酸残基（例えば、１０アミノ酸残基、好ましくは８アミノ酸残基、より好ましくは６アミノ酸残基、さらに好ましくは４アミノ酸残基、さらに好ましくは２アミノ酸残基）を欠失、挿入、または置換させたアミノ酸配列を有するＨＮＤを作製する。ＨＮＤの作製方法は、当業者の定法を用いればよく、例えば、化学合成してもよく、ＨＮをコードする遺伝子にin vitro mutagenesisで変異を導入し、細胞内で発現させてもよい。
【００４６】
次に、スクリーニング対象のＨＮやＨＮＤに対し、軽度認知障害または初期認知症の治療用医薬剤、神経細胞の樹状突起形成促進剤、または神経細胞のシナプス形成促進剤として有効かどうか検定し、有効と判定されたＨＮＤを選択する。以下、この検定方法について、詳細に記載する。
【００４７】
＝＝検定方法＝＝
ＨＮやＨＮＤの効果の検定は、例えば、培養細胞に対する樹状突起伸長促進効果、シナプス形成促進効果を調べることによって、あるいは、動物個体における神経細胞の樹状突起伸長促進効果、シナプス形成促進効果、または疾患の治癒や改善が認められるか否かを調べることによって、行うことができる。
【００４８】
なお、効果を検定する対象の疾患は、神経細胞の樹状突起やシナプス形成を促進することにより治癒または症状が改善される疾患であって、上述したような、ＨＮやＨＮＤが医薬剤として治療対象にできる疾患と同じである。
【００４９】
（１）in vitroにおけるＨＮやＨＮＤの効果の検定
ＨＮやＨＮＤのペプチドの効果の検定方法の一つの態様は、ペプチドを添加した培養細胞群と添加しない培養細胞群において、培養細胞の樹状突起伸長、あるいは、シナプス形成を調べることを特徴とする。培養細胞は、例えば、ＰＣ１２細胞やＰＣＮ等の細胞を用いることができる。例えば、培養細胞群を２つの群に分け、一方の添加群の培養細胞にはペプチドを添加し、もう一方の対照群にはペプチドを添加しないか、あるいは担体を投与する。その後、添加群と対照群における樹状突起の形成、あるいは、シナプス形成を調べ、添加したペプチドが樹状突起形成促進効果またはシナプス形成促進効果を有する場合には、そのペプチドは、神経細胞の樹状突起形成促進剤、シナプス形成促進剤、および、神経細胞の樹状突起やシナプス形成を促進することにより治癒または症状が改善される疾患に対する治療用医薬剤における有効物質として適用することができる。
【００５０】
（２）in vivoにおけるＨＮやＨＮＤの効果の検定
ＨＮやＨＮＤのペプチドを含有する医薬の検定方法の一つの態様は、神経細胞の樹状突起形成促進、あるいは、シナプス形成促進により治癒または症状が改善されると考えられる疾患を有する患者または患獣に対してペプチドを投与し、そのペプチドの投与前と比較して疾患の治癒または改善が認められるか否かを調べる。患者または患獣が有する具体的な疾患例は、上述したような、ＨＮやＨＮＤが医薬剤として治療対象にできる疾患と同じである。
【００５１】
あるいは、患者または患獣を２つの群に分け、一方の投与群にはペプチドを投与し、もう一方の対照群にはペプチドを投与しないか、またはプラセボを投与し、対照群と比較して、投与群で疾患の治癒または改善が認められるか否かを調べてもよい。
【００５２】
なお、そのペプチドによって個体の疾患が治癒または改善しているか否かを調べる方法は、ＣＴやＭＲＩ等を用いた病理学的診断方法であっても、または、Clinical Dementia Rating（CDR）、Global Deterioration Scale（GDS）、Mini-Mental State Examination（MMSE）等、臨床的に用いられている診断方法であってもよい。あるいは、対象が患獣である場合には、疾患の原因疾患を有する組織を摘出し、顕微鏡下で神経細胞の樹状突起形成や、シナプス形成を観察して調べてもよい。
【実施例】
【００５３】
＝＝ペプチド＝＝
ＨＮ（ＭＡＰＲＧＦＳＣＬＬＬＬＴＳＥＩＤＬＰＶＫＲＲＡ）、ＨＮＧ（ＭＡＰＲＧＦＳＣＬＬＬＬＴＧＥＩＤＬＰＶＫＲＲＡ）、第８位アミノ酸Ａ置換ヒューマニンペプチド（ＨＮＡ（ＭＡＰＲＧＦＳＡＬＬＬＬＴＳＥＩＤＬＰＶＫＲＲＡ、配列番号３））は、化学合成した。
【００５４】
＝＝細胞培養＝＝
特記しない限り、細胞培養は全て５％ ＣＯ２存在下、３７℃で、１０％ ＦＢＳ含有 Dulbecco's modified Eagle's medium （ＤＭＥＭ）を用いて行った。
【００５５】
[実施例１]
本実施例では、ＨＮおよびＨＮＧが樹状突起伸長の促進作用を有することを示す。
【００５６】
ＰＣ１２細胞（ラット副腎髄質由来褐色細胞腫）をＦＢＳ非含有ＤＭＥＭで３時間リンスした後、培地に１０ μＭ ＨＮ、ＨＮＧ、あるいは、ＨＮＡを添加してインキュベートし、０、１、３、６、２４時間後の樹状突起の伸長の様子を観察した。対照群の細胞は、溶媒である水のみを添加し同様にインキュベートした。０、１、３、６、２４時間後にランダムに選択した１．８ × １０５ μｍ2（４００ μｍ × ４５０ μｍ）の面積の５視野において樹状突起が伸長している細胞数を計数し、樹状突起伸長細胞率（樹状突起が伸長している細胞数／全細胞数×１００）を算出した。なお、ＰＣ１２細胞は、神経分化および樹状突起伸長のモデル細胞として広く用いられている（例えば、McGee R Jr., Mol. Cell Biochem. 16, 33(3): 121-133, 1980 参照）。
【００５７】
その結果、図１Ａに示すように、インキュベート開始６時間後には、対照群およびＨＮＡと比較してＨＮ、ＨＮＧ添加群で細胞の樹状突起が顕著に伸長していた。また、図１Ｂに示すように、インキュベート開始２４時間後には、対照群およびＨＮＡ群と比較して、ＨＮ群およびＨＮＧ群で樹状突起伸長細胞率が有意に高かった。
【００５８】
このように、ＨＮおよびＨＮＧは、樹状突起伸長の促進作用を有する。
【００５９】
次に、ＨＮ、ＨＮＧ、およびＨＮＡの二次構造の解析を行った。ＨＮ、ＨＮＧ、ＨＮＡを各々ＰＢＳに溶解し、２０μＭ溶液を調製した。この溶液の円二色性スペクトルを、Jasco 820 spectrometer（日本分光株式会社）を用いて測定した。この際、光路長１ｍｍ、０．１ｎｍインターバルで１分当たり１００ｎｍの測定を行った。これにより得られた楕円率の平均値（[θ]）を基に、ＨＮ、ＨＮＧ、およびＨＮＡのそれぞれについて、二次構造の比率をJasco analytical program （Yang et al., Methods Enzymol. 130: 208-269, 1986）を用いて予測した。
【００６０】
表１に示すように、ＨＮおよびＨＮＧには各二次構造について有意な差が認められないが、ＨＮＡでは、ＨＮと比較してβシート構造率が低く、ランダム構造率が高かった。
【表１】
【００６１】
この結果は、一定の二次構造、すなわち平均値として、αヘリックス構造が４．８〜６．６％、βシート構造が４０．９〜３８．３％、βターン構造が２０．６〜２２．１％、ランダム構造が３３．８〜３２．６％を占める二次構造を有するＨＮＤはＨＮと同様の樹状突起伸長作用を有することを示している。
【００６２】
[実施例２]
本実施例では、ＨＮ、ＨＮＧがシナプス形成促進作用を有することを示す。
【００６３】
ＰＣＮ（皮質ニューロン初代培養細胞）は、Sasabe et al. (EMBO J. 26(18): 4149-4159, 2007)の方法に従い、受精後１４日のマウス胚から採取した皮質細胞から調製した。ＰＣＮは、poly-L-lysine コートディッシュまたはカバーガラスに播種し（５ｘ１０４個／ｃｍ２）、Ｂ２７（×５０）(Invitrogen 社)および０．５ ｍＭグルタミン（和光純薬工業株式会社）を添加した神経細胞基本培地（Invitrogen 社）で培養した。培養開始から４日目、最終濃度が１０ μＭになるようにＨＮを添加し、３０分〜９６時間インキュベートした後、以下の組織学的検出法で樹状突起を検出した。
【００６４】
＝＝組織学的検出法＝＝
細胞（５ｘ１０４個／ｃｍ２）を４％パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳ溶液で２０分間固定し、０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で１５分間透過処理し、１％ ＢＳＡ(Sigma-Aldrich 社)−ＰＢＳ溶液で１時間ブロッキングを行った。その後、抗Tyrosinated tubulin(Tyr-Tub)マウスモノクローナル抗体（１００倍希釈、Sigma-Aldrich 社）、抗ＮＲ１マウスモノクローナル抗体（１００倍希釈、BD Pharmingen 社）、または抗ｓｙｎａｐｓｉｎ １ ウサギポリクローナル抗体（２００倍希釈、Millipore 社）を含有した１％ ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液中で、室温で３時間インキュベートした。ＰＢＳで細胞をリンスした後、ＦＩＴＣまたはＴｅｘａｓ−Ｒｅｄ標識抗マウスＩｇＧまたは抗ウサギＩｇＧ（２５０倍希釈、Jackson laboratories 社）を含有した１％ ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液中、４０分間室温でインキュベートした。また、F-actin可視化のために、透過処理後の細胞を、ローダミン標識phalloidin （１００ ｎｇ/ｍｌ、Sigma-Aldrich 社）を含有した１％ ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液中、室温で２０分間インキュベートした。なお、phalloidinはF-actinの特異的検出に一般的に用いられている。以上のように染色した細胞を、ＰＢＳでリンスし、ＤＡＰＩ（Invitrogen 社）で核を対比染色した後、Zeiss LSM510共焦点レーザー顕微鏡下で観察した。
【００６５】
phalloidinにより検出されたF-actinの染色強度の定量的解析は、グレイスケールに転換した顕微鏡写真においてランダムに選択した２４０ μｍ２の５視野について行った。また、シナプス形成数の定量的解析のため、抗synapsin 1抗体および抗ＮＲ１抗体による免疫染色の共局在を、ランダムに選択した９０ μｍ２の１０視野について計数した。
【００６６】
その結果、図２Ａに示すように、ＨＮ処理群では、対照群と比較して、樹状突起端部にF-actinがより局在していた。つまり、ＨＮ処理開始から６時間〜２４時間後には、顕著な樹状突起形成が見られ、その時間経過と共に、ＨＮ処理群の樹状突起端部のF-actinの局在がさらに強まった。ＨＮ処理開始から９６時間後には、ＨＮ処理群で樹状突起端部へのF-actinの局在は失われ、特に樹状突起以外の細胞体におけるF-actin局在が強まった。微小管マーカーであるTyr-Tubの染色像から、対照群と比較してＨＮ処理群でより密に局在し、形成された樹状突起が維持されていた。
【００６７】
次に、神経成長円錐当たりの樹状突起数を、F-actinの染色写真を用いて解析した結果を図２Ｂに示す。神経成長円錐あたりの樹状突起数は、対照群と比較して、ＨＮ処理群（２４時間）で有意に多かった（unpaired Student's t-test）。
【００６８】
また、ＨＮ処理開始９６時間後のプレシナプス（ｓｙｎａｐｓｉｎ １ 陽性）、および、ポストシナプス（ＮＲ１）の形成数を図２Ｃに示す。シナプスは、プレシナプスとポストシナプスの対から形成されるが、対照群に比較して、ＨＮ処理群では顕著にシナプス形成数が多かった。
【００６９】
ＨＮ処理開始２４時間後の神経細胞あたりのシナプス形成数は、図２Ｄに示すように対照群に比較してＨＮ処理群で有意に高かった（unpaired Student's t-test）。
【００７０】
このように、ＨＮはＰＣＮ細胞において樹状突起伸長促進作用、及びシナプス形成促進作用を有する。
【００７１】
[実施例３]
本実施例は、神経細胞死因子存在下において、ＨＮが細胞の樹状突起伸長促進作用、および死細胞率を低下させる作用を有することを示す。
【００７２】
ヒトＡβ１−４２ペプチドはPeptide Institute 社から購入した。このヒトＡβ１−４２ペプチドをＭｅ２ＳＯに３ｍＭで溶解し、氷冷した神経細胞基本培地で１００μＭに希釈した。その後、３０秒間ボルテックスし、４℃で４８時間インキュベートして、ヒトＡβ１−４２オリゴマーを調製した（Lambert et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(11):6448-6453, 1998 参照）。
【００７３】
実施例２と同様に調製したＰＣＮ（５ｘ１０４個／ｃｍ２）に、Ａβ１−４２オリゴマー（最終濃度１μＭ）を加えて３０分間インキュベートした（Ａβ１−４２群）。一方、Iodoacetic acid（ＩＯＡ）群では、ＰＣＮにＩＯＡ（Sigma-Aldrich 社）（最終濃度５０ μＭ）を加えて３０分間インキュベート後、ＩＯＡ非含有培地でリンスした。これらの各群において、Ａβ１−４２処理またはＩＯＡ処理に続いて、ＨＮを最終濃度１０ μＭで加え２４時間インキュベートした。なお、ＨＮ処理に対する対照として、同量の水を培地に添加して同様にインキュベートした（図ではＨ２Ｏ）。以上の処理後、実施例２の組織学的検出法を用い、抗体または特異的マーカーによりＰＣＮを特異的に検出した。F-actinの染色強度の定量的解析は、実施例２と同様に行った。神経細胞死は、ＤＡＰＩで核染色したＰＣＮについて、核の凝縮を指標にして形態的に判定し、全神経細胞数（核数）に対する死細胞率を算出した。これらの定量的解析は、各群、５．８×１０４ μｍ2（２４０×２４０ μｍ）の５視野について行った。
【００７４】
図３Ａに示すように、水添加群では、対照に比較してＡβ１−４２あるいはＩＯＡ群でF-actinおよびTyr-Tub陽性の樹状突起が少なかった。すなわち、Ａβ１−４２、およびＩＯＡの処理によりＰＣＮがダメージを受けていることが確認された。一方、これらの各群において、ＨＮを添加してインキュベートを行った場合、水添加群の対照と比較してもより顕著にＰＣＮの樹状突起が伸長していた（図３Ａ下段）。図３Ｂに示すように、F-actinの染色は、対照、Ａβ１−４２、ＩＯＡのいずれの群においてもＨＮを添加してインキュベートした場合に有意に強くなっていた。
【００７５】
また、死細胞率は、Ａβ１−４２処理群およびＩＯＡ処理群で対照と比較して有意に上昇したが（図３Ｃ、Ｄ白棒）、ＨＮを添加してインキュベートした場合には、Ａβ処理群、ＩＯＡ処理群で死細胞率が有意にあるいは顕著に低下した（図３Ｃ、Ｄ黒棒）（Turkey's post-hoc 検定）。
【００７６】
このように、神経細胞死因子によりダメージを受けた神経細胞においても、ＨＮは細胞死抑制、および、樹状突起形成促進効果を有する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒューマニンペプチドまたは第１４位アミノ酸Ｇ置換ヒューマニンペプチド、あるいは、前記ペプチドを発現する発現ベクターを含有することを特徴とする、軽度認知障害（MCI: mild cognitive impairment）または初期認知症の治療用医薬剤。
【請求項２】
前記ペプチドのアミノ酸配列がヒト由来であることを特徴とする請求項１に記載の治療用医薬剤。
【請求項３】
前記ペプチドが、ＭＡＰＲＧＦＳＣＬＬＬＬＴＳＥＩＤＬＰＶＫＲＲＡ（配列番号１）またはＭＡＰＲＧＦＳＣＬＬＬＬＴＧＥＩＤＬＰＶＫＲＲＡ（配列番号２）からなる配列を有することを特徴とする請求項２に記載の治療用医薬剤。
【請求項４】
前記軽度認知障害または前記初期認知症の患者においては、シナプス形成不全が生じているが、神経細胞死が事実上生じていないことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の治療用医薬剤。
【請求項５】
ヒューマニンペプチドまたは第１４位アミノ酸Ｇ置換ヒューマニンペプチド、あるいは、前記ペプチドを発現する発現ベクターを含有することを特徴とする、神経細胞の樹状突起形成促進剤。
【請求項６】
ヒューマニンペプチドまたは第１４位アミノ酸Ｇ置換ヒューマニンペプチド、あるいは、前記ペプチドを発現する発現ベクターを含有することを特徴とする、神経細胞のシナプス形成促進剤。
【請求項７】
ヒューマニンペプチドまたはヒューマニンペプチド誘導体が、神経細胞の樹状突起形成促進効果、または神経細胞のシナプス形成促進効果を有するかどうかを調べる検定方法であって、
前記ヒューマニンペプチドまたはヒューマニンペプチド誘導体を作製する工程と、
作製された前記ヒューマニンペプチドまたはヒューマニンペプチド誘導体が神経細胞の樹状突起形成促進効果、または神経細胞のシナプス形成促進効果を有するかどうか、in vitroで調べる工程と、
を含む検定方法。
【請求項８】
神経細胞の樹状突起形成促進剤、または神経細胞のシナプス形成促進剤として有効なペプチドのスクリーニング方法であって、
複数のヒューマニンペプチドまたはヒューマニンペプチド誘導体を作製する工程と、
作製された前記ヒューマニンペプチド誘導体が神経細胞の樹状突起形成促進剤、または神経細胞のシナプス形成促進剤として有効かどうか、in vitroで調べる工程と、
前記検定の結果、有効と判定されたヒューマニンペプチド誘導体を選択する工程と、
を含むスクリーニング方法。
【請求項１】
ヒューマニンペプチドまたは第１４位アミノ酸Ｇ置換ヒューマニンペプチド、あるいは、前記ペプチドを発現する発現ベクターを含有することを特徴とする、軽度認知障害（MCI: mild cognitive impairment）または初期認知症の治療用医薬剤。
【請求項２】
前記ペプチドのアミノ酸配列がヒト由来であることを特徴とする請求項１に記載の治療用医薬剤。
【請求項３】
前記ペプチドが、ＭＡＰＲＧＦＳＣＬＬＬＬＴＳＥＩＤＬＰＶＫＲＲＡ（配列番号１）またはＭＡＰＲＧＦＳＣＬＬＬＬＴＧＥＩＤＬＰＶＫＲＲＡ（配列番号２）からなる配列を有することを特徴とする請求項２に記載の治療用医薬剤。
【請求項４】
前記軽度認知障害または前記初期認知症の患者においては、シナプス形成不全が生じているが、神経細胞死が事実上生じていないことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の治療用医薬剤。
【請求項５】
ヒューマニンペプチドまたは第１４位アミノ酸Ｇ置換ヒューマニンペプチド、あるいは、前記ペプチドを発現する発現ベクターを含有することを特徴とする、神経細胞の樹状突起形成促進剤。
【請求項６】
ヒューマニンペプチドまたは第１４位アミノ酸Ｇ置換ヒューマニンペプチド、あるいは、前記ペプチドを発現する発現ベクターを含有することを特徴とする、神経細胞のシナプス形成促進剤。
【請求項７】
ヒューマニンペプチドまたはヒューマニンペプチド誘導体が、神経細胞の樹状突起形成促進効果、または神経細胞のシナプス形成促進効果を有するかどうかを調べる検定方法であって、
前記ヒューマニンペプチドまたはヒューマニンペプチド誘導体を作製する工程と、
作製された前記ヒューマニンペプチドまたはヒューマニンペプチド誘導体が神経細胞の樹状突起形成促進効果、または神経細胞のシナプス形成促進効果を有するかどうか、in vitroで調べる工程と、
を含む検定方法。
【請求項８】
神経細胞の樹状突起形成促進剤、または神経細胞のシナプス形成促進剤として有効なペプチドのスクリーニング方法であって、
複数のヒューマニンペプチドまたはヒューマニンペプチド誘導体を作製する工程と、
作製された前記ヒューマニンペプチド誘導体が神経細胞の樹状突起形成促進剤、または神経細胞のシナプス形成促進剤として有効かどうか、in vitroで調べる工程と、
前記検定の結果、有効と判定されたヒューマニンペプチド誘導体を選択する工程と、
を含むスクリーニング方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１２−９２０４８（Ｐ２０１２−９２０４８Ａ）
【公開日】平成２４年５月１７日（２０１２．５．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２４１２９３（Ｐ２０１０−２４１２９３）
【出願日】平成２２年１０月２７日（２０１０．１０．２７）
【出願人】（８９９００００７９）学校法人慶應義塾 (742)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年５月１７日（２０１２．５．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１０月２７日（２０１０．１０．２７）
【出願人】（８９９００００７９）学校法人慶應義塾 (742)
【Ｆターム（参考）】
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