逆相カラムクロマトグラフィーを使用したヘパリンまたは低分子量ヘパリンを構成する特定グループの測定方法
本発明は、第四アンモニウム塩を動的にコートした固定相を使用する高速液体クロマトグラフィーによってヘパリン、低分子量ヘパリン、超低分子量ヘパリン及びオリゴ糖を分析する方法を提供する。本発明の方法はサンプルを前処理なしに分析するため、または、部分解重合もしくは完全解重合させ場合によっては還元させたサンプルを分析するために使用し得る。糖の特異的検出が可能である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘパリン、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）または超低分子量ヘパリン（ＵＬＭＷＨ）を構成するオリゴ糖の直接分析方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
へパリンは、天然ソースから抽出されたグリコサミノグリカンファミリーの生物活性物質であり、有効な抗凝固性及び抗血栓性を有している。これらは術後静脈血栓の治療に特に有用である。
【０００３】
ヘパリンソースからＬＭＷＨを製造するために、長いヘパリン多糖鎖を低分子量の短い鎖に分割する。これは化学的または酵素的な解重合によって行われる。例えば、エノキサパリンの場合、解重合プロセスは２つの競合的化学反応、即ち、β除去とベンジルエステルの加水分解とを含む。その結果として、平均分子量約４５００ＤａのＬＭＷＨ多糖鎖が得られる。ＬＭＷＨは非分割ヘパリンと同様に、いくつかの多糖鎖に沿って分布した特定の５糖配列でＡＴＩＩＩに結合することによって凝固を阻害する。
【０００４】
ＬＭＷＨの認可製品の製造業者は各々で異なる解重合プロセスを使用している。２つの製造業者が同じプロセスを使用することがなければ、このようなプロセスの違いから、異なる化学構造を持ち、従って異なる薬理学的活性及び異なる臨床使用承認表示をもつＬＭＷＨが製造される。
【０００５】
従って、ＬＭＷＨはそれらの製造に使用された解重合プロセスによって構造的に識別される（Ｒ．Ｊ．Ｌｉｎｈａｒｄｔら，Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｔｈｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈｅｍｏｓｔａｔｉｓ １９９９；２５（３ ｓｕｐｐ．）：５−１６）。その結果としてＬＭＷＨはヘパリンよりも不均質である。異なるプロセスの各々が特有の極めて複雑な構造的修飾を多糖鎖に生じさせる。これらの修飾は、鎖の長さ、鎖の配列、及び、構造フィンガープリントの違いを含む。その結果として、異なるＬＭＷＨの各々は、異なる薬理学的プロフィル及び異なる承認臨床表示を有している。
【０００６】
米国でＬｏｖｅｎｏｘＲＴＭ及び他のいくつかの国々でＣｌｅｘａｎｅＲＴＭという商品名で販売されているエノキサパリンナトリウムを純ヘパリンから製造するプロセスでは、水相アルカリ性解重合プロセスによってオリゴ糖鎖の還元性末端のグルコサミンに部分的ではあるが特徴的な変換が生じる。
【０００７】
この変換の第一段階は、グルコサミンとマンノサミンとの間の可逆的エピマー化から成る（Ｔ．Ｔｏｉｄａら，Ｊ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１５（３），３５１−３６０（１９９６））。第二段階は、グルコサミンの６−Ｏ−脱硫酸であり、これによって “１，６−無水”と呼ばれる誘導体が形成される（国際特許出願ＷＯ０１／２９０５５）。
【０００８】
【化４】
【０００９】
６−Ｏ−硫酸化された末端グルコサミンを有しているオリゴ糖鎖の場合にこの種の誘導体が得られる。
【００１０】
１，６−無水結合で修飾された末端をもつオリゴ糖鎖のパーセンテージはＬｏｖｅｎｏｘＲＴＭ（エノキサパリンナトリウム）のオリゴ糖混合物の構造的特徴である。現在知られている範囲では、ＬｏｖｅｎｏｘＲＴＭ（エノキサパリンナトリウム）の成分の１５％−２５％が鎖の還元性末端に１，６−無水構造を有している。
【００１１】
最近では、例えば公開された米国特許出願Ｎｏ．２００２−００５５６２１Ａ１に記載されているように、強塩基の存在下の解重合を使用するヘパリンフラグメントの新しい製造方法で約１５００−約３０００ドルトンの範囲の重量平均分子量をもつ超低分子量ヘパリン（ＵＬＭＷＨ）が得られるようになっている。該特許の記載内容は参照によって本発明に含まれるものとする。
【００１２】
ヘパリン、低分子量ヘパリン、超低分子量ヘパリンが元のままの（ｉｎｔａｃｔ）分子であるかまたは酵素消化物であるかを分析することは、混合物が多分散性であり、また、分子の官能化度が高くまた変わり易いため、難しい作業である。この問題に取組むためにクロマトグラフィー法及び電気泳動法が開発された。毛管電気泳動（ＣＥ）はヘパリンオリゴ糖を分離するために使用される（Ｍ．Ｇｕｅｒｒｉｎｉら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １２（２００２）７１３−７１９；Ｒ．Ｊ．Ｌｉｎｈａｒｄｔ．ら，ＢｉｏＭｅｔｈｏｄｓ（Ｂａｓｅｌ）９（１９９７）１８３−１９７）。しかしながら、ＣＥの選択性は液体クロマトグラフィーに比べてかなり低い。更に、（ＵＶによる）ＣＥ検出ではしばしば、不十分な感度が原因で問題が生じる。さらに、この分析方法のために開発された分離を分取技術に適応させることができないこともＣＥの欠点のひとつである。
【００１３】
いくつかの場合には、クロマトグラフィー分離を伴うことなくＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリー分析を行うことができ、これを予備的なヘパリンオリゴ糖分析方法及び配列決定ツールとして使用してもよい（Ｈ．Ｓａｋａｇｕｃｈｉら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２９（２００１）１０７−１８；Ａ．Ｊ．Ｒｈｏｍｂｅｒｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｌｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５（１９９８）４１７６−４１８１；Ｌ．Ｓｔｕｒｉａｌｅら，Ｓｅｍｉｎ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．２７（２００１）４６５−４７２）。しかしながらＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリー分析は複合混合物に対する分解能がない。また、費用も高い。
【００１４】
これらの理由から、硫酸化オリゴ糖の分離には液体クロマトグラフィーが好ましい。塩化ナトリウムを基剤とする移動相による強アニオン交換（ＳＡＸ）はヘパリン由来のオリゴ糖を分解するクロマトグラフィー方法の１つである。更に、ＨＰＬＣまたは低圧クロマトグラフィーによるゲル浸透クロマトグラフィーは、オリゴ糖のサイズ分離及び脱塩に使用できる強力なツールである。これらの方法では移動相に塩化ナトリウムを使用することが２つの重大な欠点を生む。即ち、ＮａＣｌを含む移動相は塩の腐蝕作用を克服するように特殊処理されたクロマトグラフを必要とする。また、２１５ｎｍよりも低い波長に強力なＵＶ吸光度を有している。このため、ある種のオリゴ糖に対してはこの検出方法の使用が制限される。
【００１５】
このような理由で、ＳＡＸクロマトグラフィーの固定相の開発が行き詰っていた。ＳＡＸクロマトグラフィーの使用はしばしば５−１０未満の硫酸基を含有するオリゴ糖の分離に限定されており、高度に硫酸化した生成物の場合には固定相の開孔への物質移動が少ない結果として重大なピーク拡大が頻繁に生じる。Ｃ１８またはＣ８結合シリカ上のイオン対クロマトグラフィーをテトラブチルアンモニウム含有移動相で代替する方法（Ｎ．Ｋ．Ｋａｒａｍａｎｏｓら，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．７６５（１９９７）１６９−１７９；Ｃ．Ｆ．Ｍｏｆｆａｔら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９７（１９９１ ４４９−４５９）または等価の方法も、アセトニトリル溶出勾配の終点で観察される選択性の低下を理由として低硫酸化種に限定されている。イオン対クロマトグラフィーの注目を呼ぶ開発が最近Ｌｉｎｈａｒｄｔらによって報告された（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１０１４（２００３）２１５−２２３）。この方法はマススペクトロスコピーと容易に組合せることができるであろうが、その使用はやはり高硫酸化オリゴ糖に対する選択性によって限定される。セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡ）のようなより親油性のアンモニウム塩とのイオン対合は難しい。その理由は、このような塩は、硫酸化オリゴ糖と共に著しく非極性のイオン対を形成し、これらの多くが水性溶媒に不溶性であるからである。
【００１６】
ＣＴＡのようなイオン対化剤を予め吸着させた固定相を使用する無機アニオンの分離はＩｔｏらによって一度ならず行われた（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，５４９（１９９１）２６５−２７２；Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６３（１９９１）２７３−２７６．；Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，５９８（１９９２） ２３７−２４１）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
従って、本発明の目的は、２０個までの硫酸基基をもち十二糖という大きさの高電荷のオリゴ糖を分離及び分析できる新規な配列決定方法を提供することである。
【００１８】
本発明の別の目的は、ヘパリン、低分子量ヘパリン、超低分子量ヘパリン及びオリゴ糖から選択されたサンプルのアッセイ方法を提供することである。本発明の方法では、第四アンモニウム塩をコートした逆相カラムを使用したオリゴ糖の複合混合物のクロマトグラフィー分離及び分析によってサンプルを分析する。これに関連した本発明の特徴によれば、逆相カラムがＣ８またはＣ１８カラムである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
１つの実施態様では、本発明の方法が、Ｃ８またはＣ１８逆相カラムに第四アンモニウム塩溶液を動的にコートすることによって調製した固定相を使用する分析用高速液体クロマトグラフィーを使用する。（逆相がＣ８またはＣ１８に限定されないこと、他の逆相もこの目的に適合し得ることは理解されよう。）
【００２０】
本発明の１つの実施態様では、固定相がセチルトリメチルアンモニウム塩またはセチルピリジニウム塩で動的にコートされたＣ８またはＣ１８逆相カラムである。逆相カラムは例えばＨｙｐｅｒｓｉｌ ＢＤＳでよい。
【００２１】
本発明において、“ヘパリン”という用語は、粗ヘパリン、高品質化ヘパリン、精製ヘパリンを制限なく含む、ヘパリン生成物以外のすべての形態のヘパリンを意味する。本発明において、“ヘパリン生成物”という用語はＬＭＷＨ及びＵＬＭＷＨを意味する。
【００２２】
本発明において、“低分子量ヘパリン”または“ＬＭＷＨ”は、約３，０００ドルトン超で約１０，０００ドルトン未満の重量平均分子量を有している、ヘパリンから得られた多糖混合物を意味する。
【００２３】
本発明において、“超低分子量ヘパリン”または“ＵＬＭＷＨ” は、約１，５００ドルトンから約３，０００ドルトンまでの重量平均分子量を有している、ヘパリンから得られた多糖混合物を意味する。
【００２４】
本文中で使用したＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラフィーは、第四アンモニウム塩で動的にコートされ約ｐＨ２−約ｐＨ１２の範囲で一定の正味正電荷を維持している逆相シリカカラムで行うアニオン交換クロマトグラフィーを意味する。
【００２５】
本発明の１つの実施態様では、逆相カラムがオクチルまたはオクタデシルシリカカラムであろう。
【００２６】
本発明の１つの実施態様では、第四アンモニウム塩がセチルトリメチルアンモニウムまたはセチルピリジニウムであろう。
【００２７】
本発明の１つの実施態様では、ＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラフィーが、セチルトリメチルアンモニウムまたはセチルピリジニウムでコートされたオクチルまたはオクタデシル結合シリカを含む固体支持体を使用する。この実施態様では、慣用のオクチルまたはオクタデシル結合シリカがセチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡ）またはセチルピリジニウム塩溶液によって“動的にコート”されており、それらのアニオン交換容量は、吸着されたＣＴＡまたはセチルピリジニウムの量によって慎重にコントロールされる。
【００２８】
１つの実施態様では、クロマトグラフィーの固定相がセチルトリメチルアンモニウム塩でコートされたＨｙｐｅｒｓｉｌ ＢＤＳ Ｃ８またはＣ１８逆相カラムである。
【００２９】
本発明の分析方法は以下の段階を含む：Ｃ８またはＣ１８逆相カラムに第四アンモニウム塩溶液を動的にコートすることによって調製した固定相を使用する高速液体クロマトグラフィー（例えば、ＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラフィー）によってサンプルを直接分析し、二糖から十二糖までの全てのオリゴ糖を検出する。この場合、オリゴ糖配列は生成物中に存在するままで観察される。これはオリゴ糖を直接検査できる分析である。
【００３０】
ゲル浸透クロマトグラフィー（分析すべきサンプルのＧＰＣ）による分析とＣ８またはＣ１８逆相カラムに第四アンモニウム塩溶液を動的にコートすることによって調製した固定相を使用する高速液体クロマトグラフィー（例えばＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラフィー）とを組合せた分析も、二糖から十二糖までのオリゴ糖を分析するために使用し得る。この二次元分離方法では、分解能の向上、及び、サンプル中のオリゴ糖の直接検査が可能である。さらに、二次元分析はオリゴ糖ピークがオーバーラップする可能性を最小にする。これもまた被験サンプル中に存在するままのオリゴ糖を直接観察できる方法である。
【００３１】
Ｃ８またはＣ１８逆相カラムに第四アンモニウム塩溶液を動的にコートすることによって調製した固定相を使用する高速液体クロマトグラフィー（例えば、ＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラフィー）の前に、アッセイ対象サンプルを解重合してもよい。本発明のこの実施態様では、ヘパリナーゼの作用によってサンプルを部分的にまたは全体的に解重合し、次いで得られた解重合物を適宜還元させてもよい。次に、例えばＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラフィーまたはゲル浸透クロマトグラフィーとＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラフィーとの併用によって解重合物を分析する。
【００３２】
１つの具体的な実施態様では、解重合物をＮａＢＨ４で処理することによって還元し、次いでＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラフィーまたはゲル浸透クロマトグラフィーとＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラフィーとの併用によって分析する。
【００３３】
１つの実施態様で、本発明の方法は、ヘパリン、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）、超低分子量ヘパリン（ＵＬＭＷＨ）及びオリゴ糖を直接分析するために使用でき、Ｃ８またはＣ１８逆相カラムの第四アンモニウム塩コーティングを使用してオリゴ糖の複合混合物を分離及び分析し二糖から十二糖までのすべてのオリゴ糖を検出し得る。
【００３４】
１つの関連実施態様では、分析をＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラフィーによって行う。
【００３５】
別の実施態様では、ヘパリン、低分子量ヘパリン、超低分子量ヘパリン及びオリゴ糖の分析方法が２つの段階、即ち、（ａ）ゲル浸透クロマトグラフィーによる第一分離段階、及び、（ｂ）Ｃ８またはＣ１８逆相カラムの第四アンモニウム塩コーティングを使用して二糖から十二糖までの画分の各々を分離し、二糖から十二糖までのすべてのオリゴ糖を検出する第二分離段階、を含む。
【００３６】
関連実施態様では、上記分析の第二分離段階をＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラフィーによって行う。
【００３７】
本発明の別の実施態様では、ヘパリン、低分子量ヘパリン、超低分子量ヘパリン及びオリゴ糖の分析方法が、例えばヘパリナーゼの作用によってサンプルを部分的または全体的に解重合し、次いで解重合物を適宜還元させる段階を含む。次に、オリゴ糖の複合混合物を分離及び分析するためにＣ８またはＣ１８逆相カラムの第四アンモニウム塩コーティングを使用して直接分析を行って二糖から十二糖までのすべてのオリゴ糖を検出する。
【００３８】
関連実施態様では、上記分析をＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラフィーによって行う。
【００３９】
ＬＭＷＨ、ＵＬＭＷＨ及びオリゴ糖の製造に使用する解重合プロセスの選択性を決定するために本発明方法を使用してもよい。十二糖までのオリゴ糖を直接分析することができれば、特定の解重合プロセスによって生成するオリゴ糖配列を決定できる。先に指摘したように、２つ以上の製造業者が同じプロセスを使用しているのでなければ、ＬＭＷＨの製造業者の各々は異なる解重合プロセスを使用しており、その結果として、異なる化学構造のＬＭＷＨが生成し、これらはそれぞれに異なる薬理学的活性及び臨床使用承認表示を有することになる。本発明方法はここに、ＬＭＷＨまたはＵＬＭＷＨの各々の極めて複雑な特有の構造プロフィルを同定し特性決定するための方法を提供する。
【００４０】
本発明の方法はまた、１，６−無水結合（即ち、“１，６−無水基”）または製造プロセスによって生じた他の何らかの特定の構造的修飾によって修飾された末端をもつオリゴ糖鎖の存在を検出及び／または定量するために使用し得る。
【００４１】
本発明の１つの実施態様では、アッセイ対象サンプル中の “１，６−無水基”の存在を十二糖までのＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラフィーによって直接的に（即ち、酵素的または化学的前処理なしで）分析及び／または定量し得る。
【００４２】
本発明の別の実施態様では、ゲル浸透クロマトグラフィーを使用してサンプルを分画化し、次いで二糖から十二糖までの各画分のＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラフィーによってサンプル中の“１，６−無水基”を直接的に分析及び／または定量し得る。本発明の方法によれば、１，６−無水基を含むオリゴ糖を個別に同定できまたサンプル中のこの部分（二糖から十二糖）におけるそれらの分布も同定できる。
【００４３】
本発明の別の実施態様では、ヘパリナーゼの混合物で完全に解重合したサンプル中の“１，６−無水基”を分析する。
【００４４】
関連実施態様では、ヘパリナーゼ混合物がヘパリナーゼ１（ＥＣ ４．２．２．７）、ヘパリナーゼ２（ヘパリンリアーゼＩＩ）及びヘパリナーゼ３（ＥＣ ４．２．２．８）を含み、各ヘパリナーゼが例えば０．５単位／ｍｌで存在している。（これらの酵素はＧｒａｍｐｉａｎ Ｅｎｚｙｍｅｓグループによって上市されている。）
【００４５】
本発明の方法は、“１，６−無水”誘導体を含有していない低分子量ヘパリンからＬｏｖｅｎｏｘＲＴＭ（エノキサパリンナトリウム）を識別し得る。逆の言い方をすれば、本発明の方法によって、低分子量ヘパリンがＬｏｖｅｎｏｘＲＴＭ（エノキサパリンナトリウム）の物理化学的特性をもたないことを確認することが可能である。
【００４６】
さらに、本発明方法は、β−除去を含む化学的または酵素的解重合によるＬｏｖｅｎｏｘＲＴＭ（エノキサパリンナトリウム）のようなＬＭＷＨ及びＵＬＭＷＨの製造プロセスを標準化して均一なバッチを得るためにサンプルをインプロセスでコントロールする工業的方法に応用できる。
【００４７】
１つの実施態様では、ＬｏｖｅｎｏｘＲＴＭ（エノキサパリンナトリウム）を特性決定するために本発明の方法を使用し得る。この方法は以下の段階を含む：
ＬｏｖｅｎｏｘＲＴＭ（エノキサパリンナトリウム）のサンプルをヘパリナーゼ１（ＥＣ ４．２．２．７）、ヘパリナーゼ２（ヘパリンリアーゼＩＩ）及びヘパリナーゼ３（ＥＣ ４．２．２．８）の混合物で解重合させる；
場合によっては、解重合したサンプルを例えば酢酸ナトリウム中のＮａＢＨ４溶液で処理することによって還元させる（この段階は、１，６−無水形態でない還元性末端を特異的に還元させることが可能である（国際特許出願ＷＯ０１／７２７６２に記載の生成物））；
次いで、解重合し場合によっては還元したサンプル中の種々のオリゴ糖をＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）によって分離する。
【００４８】
本発明の１つの実施態様では、ＨＰＬＣがＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラフィー（上記に定義）でよい。
【００４９】
別の実施態様では本発明は、例えば本文中に記載のようなヘパリン、低分子量ヘパリン、超低分子量ヘパリン及びオリゴ糖の分析方法に使用するための、Ｃ８またはＣ１８逆相カラムに第四アンモニウム塩を動的にコートする処理を含むＨＰＬＣ／固定相の調製方法を提供する。特定実施態様では、第四アンモニウム塩がセチルトリメチルアンモニウム硫酸水素塩であり、動的コーティングがＨ２Ｏ−ＣＨ３ＯＨ溶液中、約４５℃のカラム温度で行われる。カラムに吸着されるＣＴＡの量は、カラム通過溶液が含有しているメタノールのパーセンテージに正比例し、従って調節できる。
【００５０】
本発明に使用されるＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラフィーでは、Ｃ８またはＣ１８逆相カラムが例えばＨｙｐｅｒｓｉｌ ＢＤＳカラムまたはＨｙｐｅｒｓｉｌ β ｂａｓｉｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｎｎｉｇａｎ）でよい。分析作業のためには、Ｃ８またはＣ１８逆相カラムが３μｍの粒度、約１５ｃｍのカラム長さ及び約１ｍｍ−約４．６ｍｍの範囲のカラム直径を有していればよい。分取目的には、Ｃ８またはＣ１８逆相カラムが、もっと大きい直径、例えば５０ｍｍ、及び、もっと大きい粒度、例えば８μｍを有していればよい。
【００５１】
当業者は、カラムに吸着させるＣＴＡの量、粒度、カラム直径及びカラム長さを変更することによって、２０個までの硫酸基基をもつ十二糖までの大きさの高電荷オリゴ糖を分離できる。更に、最近のオクタデシル結合シリカの開発は３μｍ粒子の高効率使用を可能にした。
【００５２】
本発明の方法では、硫酸化オリゴ糖の保持時間がカラムに吸着されたセチルトリメチルアンモニウム塩の量に従属して直接的に調整され得る。２０個以下の硫酸基を含有しているオリゴ糖は、慣用のＳＡＸ分析よりも優れた分解能で分離され得る。カラムコーティングの安定性が数百回の注入を可能にする。
【００５３】
本発明はまた、リアーゼによるヘパリン、ＬＭＷＨまたはＵＬＭＷＨの部分解重合に基づく簡単なオリゴ糖の配列決定方法を提供する。更に、本発明のＣＴＡ−ＳＡＸ法は上述のような分取規模の処理に直接的に移行できる。メタノールまたはアセトニトリルのような有機溶媒を単独でまたは水と混合してカラムに通すとカラムからＣＴＡを脱着させることが可能である。しかしながら水性移動相を使用する限り、ＣＴＡはカラムに吸着された状態に維持され、カラムは少なくとも数ヶ月間の使用が可能である。この期間中、特に使用期間の初期には保持の僅かな減少が観察されるかもしれないが、カラム保持は比較的安定に維持される（Ｋ．Ｉｔｏら，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，５４９（１９９１ ２６５−２７２Ａ）。
【００５４】
本発明のＣＴＡ−ＳＡＸカラムの追加の特性は、カラムがオリゴ糖の還元性末端のα及びβアノマーを分離する能力を有することである。２つのアノマーのモル比は還元性末端の硫酸化パターンに依存する。還元性末端がＮ−硫酸化グルコサミンの場合には、アノマーα／アノマーβの比は約９５／５であるが、Ｎ−アセチル化グルコサミンの場合にはこの比が６０／４０から４０／６０の範囲である。同様に、グルコサミンの６位及び３位の硫酸化がアノマーの特徴的な溶出パターンを与える。マンノサミンで終結するオリゴ糖で極めて特異的なアノマーパターンが観察される（例えば、ΔＩｓ−ｌｓｉｄｅｐｉ）。前述したように、この特殊な構造はＬｏｖｅｎｏｘＲＴＭ（エノキサパリンナトリウム）の特徴であり、化学プロセス中にアルカリ性媒体中で還元性末端がエピマー化することによって生じる。
【００５５】
使用する装置は溶出勾配を形成できかつＵＶデテクタを備えているいかなるクロマトグラフでもよい。本発明の１つの実施態様では、ＵＶデテクタは諸成分のＵＶスペクトルを発生させ、異なる２つの波長の吸光度の差から生じる複合シグナルを記録し得るダイオードアレイである。このようなダイオードアレイデテクタによれば、アセチル化オリゴ糖の特異的検出が容易である。関連実施態様では、約２００ｎｍ−約４００ｎｍのＵＶ範囲に透明なＨＰＬＣ移動相を使用する。本発明のこの実施態様に使用できる移動相の非限定例は、過塩素酸ナトリウムまたはメタンスルホン酸ナトリウムを基剤とする移動相である。１つの実施態様では、移動相がメタンスルホン酸アンモニウムの水溶液である。
【００５６】
従って、アニオン交換クロマトグラフィーによる分離を使用する上記に定義のような分析方法も本発明の目的の１つである。この方法では、約２００ｎＭ−約４００ｎｍのＵＶ領域に透明な移動相が使用される。
【００５７】
いくつかの実施態様では、強アニオンクロマトグラフィー分離が約２．０−約７．０のｐＨで行われる。もっと高いｐＨ条件も使用できる。関連実施態様では、約２．５のｐＨが使用されるであろう。別の実施態様では、発色性イオンがメタンスルホン酸アンモニウムであり、メタンスルホン酸をアンモニア水溶液でｐＨ２．５に中和することによって調製し得る。
【００５８】
代表的なクロマトグラフィー分離条件を以下に与える：
溶媒Ａ：メタンスルホン酸の添加によってｐＨ３に調整したＭｉｌｌｉ−Ｑ品質の水
溶媒Ｂ：ｐＨ２．５の２Ｍのメタンスルホン酸アンモニウム
直線溶出勾配：Ｔ＝０分：％Ｂ＝１；Ｔ＝７４分：％Ｂ＝１００
流速：０．２２ｍｌ／分
カラム温度４０℃。
【００５９】
本発明の別の目的は、ヘパリン、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）または超低分子量ヘパリンに見出される特異的基の検出方法である。
【００６０】
１つの実施態様では、この方法が、ＵＶによるヘパリンまたはＬＭＷＨ基の検出特異性を強化する。非アセチル化多糖はいずれも所与のｐＨでかなり類似のＵＶスペクトルを有しているので、非アセチル化糖の吸光度が相殺されるように選択した２つの波長の吸光度の差をシグナルとして取出すことによってアセチル化糖を選択的に検出することが可能である。
【００６１】
実施例に後述するように、２０２ｎｍ及び２３０ｎｍを検出波長及び基準波長として選択し、２０２−２３０ｎｍのシグナルを記録するとよい。使用できる波長の選択が移動相のｐＨに依存することは当業者には理解されよう（上記条件が最適条件になるように数ｎｍの調整が必要になることもあり得る）。
【００６２】
２つ以上の波長の吸光度を同時に測定できるいかなるＵＶデテクタも使用し得る。本発明の１つの実施態様では、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＤＡＤ１１００デテクタを使用する。この実施態様では、一方で２３４ｎｍ及び他方で２０２−２３０ｎｍで二重検出を行う。アセチル化オリゴ糖の選択的検出の原理を図１に示す。図１では硫酸化二糖ΔＩｓのＵＶスペクトルをアセチル化二糖ΔＩａのＵＶスペクトルに比較している。
【００６３】
従って、アセチル化糖を選択的に検出することが可能な検出方法を含む分析方法も本発明の目的の１つである。
【００６４】
いくつかの実施態様では、分析方法がＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラフィーによる分離を使用しており、非アセチル化糖の吸光度が相殺されるように選択した２つの波長の吸光度の差を測定することによってアセチル化糖を選択的に検出する。更に本発明の方法では以下に示す４つの１，６−無水残基を定量できるが、このような定量のためには、クロマトグラフィーシステムが混合物の他のすべての成分についても十分な選択性を有することが要求されていた。
【００６５】
ピーク分割の原因は、１つはアノマー形態にあり、もっと些少な別の原因はオリゴ糖鎖の末端位置に存在するときのΔＩＩｓ、ΔＩＩＩｓ及びΔＩｓに部分的に存在するグルコサミン−マンノサミン間の可逆的エピマー化にある。しかしながら、ＣＴＡ−ＳＡＸ法はクロマトグラムの全部のオリゴ糖を十分に定量できる分解能を有している。
【００６６】
酵素的解重合及び還元性末端の還元の後のＬｏｖｅｎｏｘＲＴＭ（エノキサパリンナトリウム）の１，６−無水誘導体は４つの本質的な形態で存在する：
【００６７】
【化５】
【００６８】
末端二糖ユニットに１，６−無水末端を含有しており該末端二糖のウロン酸に２−Ｏ−硫酸基を有していないすべてのオリゴ糖及び多糖は、ヘパリナーゼによって完全に解重合され、二糖１及び２の形態になっている。他方、末端の糖がウロン酸に２−Ｏ−硫酸基を含有しており、マンノサミン形態であるとき、１，６−無水誘導体は四糖の形態である（ヘパリナーゼ抵抗性の形態）。
【００６９】
混合物中に三糖１（下記参照）も存在し得る。これは以下の構造に導く別の分解プロセスから誘導される（ＬｏｖｅｎｏｘＲＴＭ（エノキサパリンナトリウム）の化学的解重合中に観察されるピーリング現象）。
【００７０】
【化６】
【００７１】
混合物の他の成分はＬｏｖｅｎｏｘＲＴＭ（エノキサパリンナトリウム）だけの特徴ではない。勿論、ヘパリン鎖の８つの基本的二糖が存在する。これらの８つの基本的二糖は、Ｓｉｇｍａ社及びその他の会社によって上市されている。
【００７２】
混合物中の他の二糖、即ち、二糖ΔＩＩＳｇａｌ及びΔＩＶＳｇａｌが本発明の方法によって同定された。これらは、−ｌｄｏＡ（２Ｓ）−ＧｌｃＮＳ（６Ｓ）−及び−ｌｄｏＡ（２Ｓ）−ＧｌｃＮＳ−のアルカリ性２−Ｏ−脱硫酸化を起原として有しており、２つのガラクツロン酸の形成に導く。これらはヘパリンの初期構造中に通常は存在していない（Ｕ．Ｍ．Ｄｅｓａｉら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３０６（２）４６１−４６８（１９９３）。
【００７３】
【化７】
【００７４】
３−Ｏ−硫酸化グルコサミンを含有しているオリゴ糖はヘパリナーゼによる開裂に抵抗性であり、四糖の形態に維持される。
【００７５】
たいていの低分子量ヘパリンの場合、ヘパリンがブタの粘膜から抽出され、主な四糖は以下に示すものである。これらの四糖は酵素的解重合に抵抗性であり、抗トロンビンＩＩＩに親和性をもつ配列を含む。これらの四糖は以下の記号で示される：ΔＩＩａ−ＩＩｓｇｌｕ及びΔＩＩａ−ＩＶｓｇｌｕ（Ｓ．Ｙａｍａｄａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．；２７０（７），４７８０−４７８７（１９９３）。
【００７６】
【化８】
【００７７】
ヘパリナーゼで開裂された混合物の最終成分はグリコセリン末端ΔＧｌｃＡ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘｙｌ−Ｓｅｒである（Ｋ．Ｓｕｇａｈａｒａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．；２７０（３９），２２９１４−２２９２３（１９９５）；Ｋ．Ｓｕｇａｈａｒａ，；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．；２６７（３），１５２８−１５３３（１９９２））。
【００７８】
【化９】
【００７９】
本発明の１つの実施態様によれば、分析したオリゴ糖混合物の二次元プロフィルを得るためにＧＰＣカラムをＣＴＡ−ＳＡＸカラムに直結させる。関連実施態様では、ヘパリナーゼによるサンプルの部分解重合によって得られたヘパリンオリゴ糖をサイズ及び硫酸化パターン及び消化物のＣＴＡ−ＳＡＸ分析に従って配列決定する方法が、ＣＴＡ−ＳＡＸカラムに直結された分析用ＧＰＣカラムを使用して行われ、分析したオリゴ糖混合物の二次元プロフィルが得られる。
【００８０】
ヘパリン、ＬｏｖｅｎｏｘＲＴＭ（エノキサパリンナトリウム）を非限定例とする低分子量ヘパリン、超低分子量ヘパリン及びオリゴ糖（十二糖以下）を分析する本発明の方法は、ＬｏｖｅｎｏｘＲＴＭ／ＣｌｅｘａｎｅＲＴＭを認定薬物として引用した出願に準じて規制当局の承認を求めるいかなるＬＭＷＨにも勿論適用できる。
【００８１】
（実施例）
以下の実施例は本発明の種々の特徴を示す。しかしながら本発明は以下に例示の実施例に限定されない。
【００８２】
【表１】
【００８３】
材料：メタンスルホン酸（９９．５％）はＡｌｄｒｉｃｈから購入した。Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍに由来の酵素リアーゼ（ヘパリナーゼＩ（ＥＣ ４．２．２．７）、ヘパリナーゼＩＩ（ＥＣ番号なし）ヘパリナーゼＩＩＩ（ＥＣ ４．２．２．８））はすべてＧｒａｍｐｉａｎ Ｅｎｚｙｍｅｓ（Ａｂｅｒｄｅｅｎ）から入手した。セチルトリメチルアンモニウム硫酸水素塩はＭｅｒｃｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）から購入した。その他の試薬及び化学薬品はいずれも入手できる最高品質のものであった。水はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ精製システムで精製した。
【実施例１】
【００８４】
酵素消化
以下の一般方法を実施例３−５に適宜使用した。
【００８５】
ヘパリンまたはオリゴ糖（０．１ｍｇ）の完全消化は、２ｍＭのＣａ（ＯＡｃ）２と２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡとを含有している全量３０μｌの１００ｍＭの酢酸ナトリウムバッファ，ｐＨ ７．０中、１０ｍｌＵのヘパリナーゼＩ、１０ｍｌＵのヘパリナーゼＩＩ及び１０ｍｌＵのヘパリナーゼＩＩＩの混合物によって室温で４８時間行う。ヘパリナーゼＩによるヘパリンまたはオリゴ糖（０．１ｍｇ）の部分消化は、２００ｍＭのＮａＣｌと２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡとを含有している全量１−３０μｌの５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．０中、０．１−１０ｍｌＵのヘパリナーゼＩによって、１７℃で１時間から１０日間行う。
【実施例２】
【００８６】
ＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラフィー
以下の一般方法を実施例３−５に適宜使用した。
【００８７】
装置：使用したクロマトグラフィーシステムは、ＵＶダイオードアレイデテクタを備えた慣用のＡｇｉｌｅｎｔ １１００システムである。
【００８８】
カラムの動的コーテイング：使用した手順は、Ｉｔｏ ａｎｄ Ｓｕｎｈａｒａ（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６３（１９９１）２７３−２７６）に記載された手順と同様である。Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＢＤＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｎｎｉｇａｎ製）を充填したＣ８またはＣ１８逆相カラムを使用する（１５０ｘ２．１ｍｍ内径、粒度３μｍ）。カラムをＨ２Ｏ−ＣＨ３ＯＨ（６８−３２）ｖ／ｖ溶液中の１ｍＭのセチルトリメチルアンモニウム硫酸水素塩と共に４５℃のカラム温度で２４０分間平衡させる。カラムに吸着されたＣＴＡの量は、カラム通過溶液が含有していたメタノールのパーセンテージに正比例するので調節できる。
【００８９】
クロマトグラフィー条件：使用カラムを既述のようにＣＴＡで動的コーティングする。発色性イオンは、メタンスルホン酸をアンモニア水溶液でｐＨ２．５に中和することによって調製したメタンスルホン酸アンモニウムである。ＣＴＡ−ＳＡＸの溶媒Ｂは、２Ｍのメタンスルホン酸アンモニウム，ｐＨ２．５である。溶媒Ａはメタンスルホン酸の添加によってｐＨ３に調整したＭｉｌｌｉ−Ｑ品質水である。１％Ｂから出発して７４分で１００％Ｂになる直線勾配を流速０．２２ｍｌ．分−１で使用する。毎回の処理後に、１８分間のリコンディショニング段階を使用する。カラム温度は４０℃である。
【００９０】
これらの条件を使用すると、オリゴ糖の濃度、サンプルのイオン強度、及び、ピーク拡大を生じないイオンの溶出能に依存して、約１μｌ−約１ｍｌの範囲の量を注入できる。例えば、分析用ＧＰＣから得られた画分を使用する場合（１００ｍＭの酢酸アンモニウム）５００μ１までの量を注入できる。
【００９１】
従って、サンプルが濃ＮａＣｌ溶液（ほぼ２Ｎ）に含有されているときは、注入前に水で４倍または５倍に希釈する必要がある。いずれにしても、水で４倍に希釈した４００μｌのＮａＣｌ溶液を注入するほうが、１００μｌの初期ＮａＣｌ溶液を注入するよりも良好な分離結果が得られる。
【００９２】
メタンスルホネートがＵＶ透明性なので、ダイオードデテクタアレイを使用して官能基を選択的に検出できる。化学的または酵素的なβ−除去によって得られた不飽和オリゴ糖は特徴的なＵＶスペクトルを有している。オリゴ糖の構造を記号化するために使用した略号は上記に示した。ＵＶスペクトルは主として、移動相のｐＨ及びグルコサミンのＮ−アセチル基の存在に依存する。図２に示すように、ｐＨ２．５の移動相では、２０２ｎｍ（検出波長）の吸光度から２４７ｎｍ（基準波長）の吸光度を減算することによって、非Ｎ−アセチル化オリゴ糖の寄与分をＵＶスペクトルから除去することが可能である（Ｈｕｂｅｒ，Ｄｉｏｄｅ ａｒｒａｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ＨＰＬＣ，Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｓｃｉ．Ｓｅｒ．，６２（１９９３）３６３−３９２）。得られたシグナルにはＮ−アセチル化オリゴ糖だけが検出されている。ヘパリン性オリゴ糖の場合、ＵＶスペクトルが移動相のｐＨに依存することは理解されよう。その結果として、ｐＨが２．５でなく６．０である場合には、基準波長が２４７ｎｍでなく２３０ｎｍであろう。すべてのクロマトグラムに２つの検出シグナルが与えられる。２３２ｎｍのＵＶシグナルはすべての不飽和オリゴ糖を検出し、２０２−２４７ｎｍの吸光度の差に対応するシグナルはＮ−アセチル化オリゴ糖を特異的に検出する。同様に、溶出勾配に起因する基線量のドリフトはブランク処理によって消去される。
【００９３】
ＣＴＡ−ＳＡＸ法は、粒度５μｍのＨｙｐｅｒｓｉｌ ＢＤＳ Ｃ１８を充填した２５０ｘ２１ｍｍカラムを使用する準分取規模で使用し得る。カラムのＣＴＡコーティングは分析用カラムの場合と同様にカラム温度を４５℃に調整して行う。移動相は濃度０−２．５ＮのＮａＣｌの水溶液である。通常は希塩酸を加えてｐＨを２．５に調整する。分離は約１０−約２０ｍｌ．分−１の範囲の流速を使用して室温で行う。２３４ｎｍのＵＶ検出を使用する。集めた画分を酢酸で中和し、後述するようにＧＰＣカラムで脱塩する。
【００９４】
分析用ＧＰＣ：分析用ゲル浸透は、１つのガードＴＳＫ Ｓｕｐｅｒ ＳＷプレカラム（３５ｘ４．６ｍｍ）（ＴＯＳＯＨ ＢＩＯＳＥＰ）の付いた２つのＴＳＫ Ｓｕｐｅｒ ＳＷ２０００（３００ｘ４．６ｍｍ）で行う。不飽和オリゴ糖は２３２ｎｍのＵＶ吸光度の測定によって検出される。移動相は０．１Ｍの酢酸アンモニウムであり、流速は０．１５ｍｌ．分−１である。注入量は５μｌである。ＧＰＣをＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラフイーに結合させる場合には、サンプル濃度は次段階の検出が可能な十分に高い濃度でなければならない。解重合したサンプルを分析するときは、ＧＰＣ注入溶液中のサンプル濃度は、サンプル毎に異なるであろうが、約２５−約１００ｍｇ／ｍｌの範囲であればよい。二糖、四糖、六糖、八糖、十糖に対応するピークを集める。２５０μｌまでの各画分をＣＴＡ−ＳＡＸカラムに直接的に再注入する。
【００９５】
脱塩手順：水を溶出剤として使用し、ＳｅｐｈａｄｅｘＲＴＭ Ｇ−１０ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を充填したカラムに、脱塩すべきオリゴ糖を通す。カラムサイズは脱塩すべきサンプルの量に応じて選択し得る。この目的には、１００ｘ７ｃｍ、１００ｘ５ｃｍ、４０ｘ２．６ｃｍ、２０ｘ１．６ｃｍのカラムセットが好都合である。導電率及び２３２ｎｍの吸光度を測定することによって二重検出を行う。
【００９６】
配列決定手順：１５０ｘ３ｍｍのＣＴＡ−ＳＡＸカラムで分離し２０ｘ１．６ｃｍのＳｅｐｈａｄｅｘＲＴＭ Ｇ−１０カラムで脱塩した精製オリゴ糖を集める。あるいは、精製オリゴ糖を水で５倍に希釈し、希ＮＨ３を加えてｐＨ７．０に中和する。次に、ヘパリナーゼまたは２−スルファターゼを使用する部分的分画化によって配列決定する（Ｒ．Ｒａｍａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（２００３）１２１６７−１２１７４；Ｇ．Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６（１９９９）５３７−５４２；Ｓ．Ｅｒｎｓｔら，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３０（１９９５）３８７−４４４）。
いくつかの分析では、オリゴ糖鎖の還元性末端に位置する二糖をマークするために１００ｍＭの酢酸ナトリウム中のＮａＢＨ４によってオリゴ糖を予備還元する。１５０ｘ２．１ｍｍのＣＴＡ−ＳＡＸカラムでＨＰＬＣ注入によって分画化をモニターする。
【００９７】
ＮＭＲスペクトル：７００μｌの９９％Ｄ２０にサンプルを溶解した。標準パルス列を使用し、室温、４００．１３ＭＨｚでオリゴ糖の一次元（１Ｄ）及び二次元（２Ｄ）ＮＭＲスペクトル（ＣＯＳＹ，ＴＯＣＳＹ，ＲＯＥＳＹ及びＨＳＱＣ）をＢｒｕｋｅｒ ＤＲＸ４００スペクトル計に記録した。２Ｄ等核Ｈａｒｔｍａｎｎ−Ｈａｈｎ（ＴＯＣＳＹ）実験をスピンロック時間１００ｍｓで記録した。２Ｄ ＲＯＥＳＹスペクトルは混合時間４００ｍｓで得られた。化学シフトは外部標準ＴＳＰＤ４を基準としたｐｐｍで与える。プロトン化学シフトはＴＯＣＳＹ実験から測定した。プロトン結合定数は、スペクトル分解能が十分でプロトンシグナルがオーバーラップしないときは１Ｄスペクトルで直接測定できた。炭素化学シフトはＨＳＱＣスペクトルから得られた。構造決定は１Ｈ及び１３Ｃ ＮＭＲスペクトロスコピ―をＴＯＣＳＹ，ＲＯＥＳＹ及びＨＳＱＣ １Ｈ／１３Ｃ ２Ｄスペクトルと共に使用して行った。
【実施例３】
【００９８】
ブタ腸ヘパリンの完全解重合
図３は上記に記載のヘパリナーゼ混合物によって完全に解重合したブタ腸ヘパリンのＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラムを示す。また、ＧＰＣ及びＣＴＡ−ＳＡＸカラムの組合せによる本発明の二重検出の利点を示す。ΔＩＶａ以外のすべての基本的二糖が分解された。ΔＩＶａは硫酸官能基が存在しないので保持されなかった。アセチル化二糖ΔＩＩａ、ΔＩＩＩａ及びΔＩａは双方のＵＶシグナルに検出されたが、Ｎ−硫酸化二糖は第一のシグナル（２３２ｎｍのＵＶ吸光度）だけに検出された。本発明方法の３−Ｏ硫酸化オリゴ糖の検出能力は、これらのオリゴ糖がＡＴＩＩＩ結合配列の一部であるという理由から注目に値する。
【００９９】
異なる５つの硫酸化度（４０１＜Ｍｗ＜８６７）を含む二糖画分の不均一性が原因で、完全に解重合したサンプル中に存在するオリゴ糖すべてを解明することはできなかった。四糖については、重量平均分子量範囲が１０６６−１３３０である。例えば、主要な２つの四糖（Ｓ．Ｙａｍａｄａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２７０（１９９５）８６９６−８７０５）ΔＩＩａ−ＩＩｓｇｌｕ及びΔＩＩａ−ＩＶｓｇｌｕ（Ｍｗ１０６６及び１１６８）は高度に硫酸化した二糖に極めて近い分子量を有している。従って、ＧＰＣ画分Ｆ１−Ｆ３だけをＣＴＡ−ＦＡＸカラムに注入した。低硫酸化二糖画分Ｆ４はあまり重要でなく、注入されたＧＰＣ移動相の酢酸アンモニウムはそれらの溶出範囲に対応してＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラムの初端を乱した。
【０１００】
分離に引き続いて、ヘパリン消化物中の新しい四硫酸化二糖を同定した。分子量７６７ドルトンがＬＣ／ＭＳによって確認され（結果公表せず）、これはΔＩｓ構造に一致する。この二糖は最近、３−ＯＳＴ−５Ｈの発現によってヘパリン中でｉｎ ｖｉｔｒｏ形成された（Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８（２００３）２６７８０−２６７８７）。この種の３−Ｏ硫酸化二糖は、ウシ腸ヘパリンに由来の完全解重合ヘパリン中に多量に存在する。しかしながら、ウシ腸ヘパリンのサンプル中では本発明の二重ＵＶ検出方法で２つの同様の二糖ΔＩＩｓ及びΔＩＩＩｓが検出され、また、３−Ｏ硫酸化四糖ΔＩＩｓ−ＩＩｓｇｌｕ、ΔＩｓ−ＩＩｓｇｌｕ及びΔＩａ−ＩＩｓｇｌｕも検出できる。不飽和酸に存在する２−Ｏ硫酸官能基は、最大吸収波長をシフトさせ、それらの認識を可能にする。極めて過剰な量のヘパリナーゼ混合物でヘパリナーゼ抵抗性の四糖を処理すると、二糖生成物の部分的解重合及びキャラクタリゼーションが可能になった。例えばこれらの条件下でΔＩａ−ＩＩｓｇｌｕは部分的にΔＩａ及びΔＩＩｓに変換された。
【実施例４】
【０１０１】
ヘパリナーゼ１によるブタ腸ヘパリンの解重合
ヘパリナーゼ１によるブタ腸ヘパリンの解重合を試験し、得られたオリゴ糖の多くを同定した。この混合物はヘパリナーゼ１による開裂が連続的に進行するので極めて分解性（ｅｖｏｌｕｔｉｖｅ）であることが証明された。一般には二糖、四糖及び六糖の混合物が反応終了後に回収されるが、その理由は主として、アセチル化部位−Ｇｌｃ（ＮＳ，６−ＯＨまたは６Ｓ）↓ＩｄｏＡ（２−ＯＨまたは２Ｓ）−ＧｌｃＮＡｃ（６−ＯＨまたは６Ｓ）↓ＧｌｃＡ−がヘパリナーゼ１に抵抗性なので六糖が生成し、−ＧｌｃＮＳ（６−ＯＨまたは６Ｓ）↓ＧｌｃＡ−の抵抗性が四糖を生成するからである。
【０１０２】
図５ａは、ヘパリナーゼ１によって消化されたブタ腸ヘパリンの完全クロマトグラムをその二糖、四糖及び六糖画分に関連するクロマトグラム（図５ｂ）と共に示す。四糖ΔＩｓ−Ｉｓｉｄが二糖ΔＩｓに完全変換したことは、酵素反応がほぼ完全であったことを示す。図示の分離は、ＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラフイーの単独使用では得られなかった。その理由は、ある種の低硫酸化六糖は同じ時間範囲でいくつかの硫酸化四糖として溶出したからである。二糖画分のクロマトグラムは、ΔＩｓ、ΔＩＩｓ、ΔＩＩＩｓ及び３−Ｏ硫酸化ΔＩｓを含んでいた。四糖画分は、ΔＩｓ−ＩＩＩｓｉｄ、ΔＩｓ−ＩＩｓｉｄ、ΔＩＩＩｓ−ＩＩＩｓｉｄ及びΔＩＩＩｓ−ＩＩｓｇｌｕを含んでおり、これは多くの論文で報告された単離構造に符合した。例えば、Ｈ．Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（２００３）２６７８０−２６７８７参照。
【０１０３】
本発明では、単離したヘパリナーゼ１抵抗性四糖にヘパリナーゼ２を作用させ開裂後に二糖構成単位の混合物とすることによって構造認識を行った。ΔＩｓ−ＩＩｓｇｌｕ及びΔＩＩＩｓ−ＩＩｓｇｌｕの場合、ＵＶ吸収の最大とアノマー溶出パターンとを考察して可能なΔＩＩｓ−Ｉｓｉｄ及びΔＩＩｓ−ＩＩＩｓｉｄ配列を除去した。ＩＩｓのイズロニック立体配置（即ち、ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＳ）がヘパリン中にほとんど存在しないので、Ｌｉｎｄａｈｌの法則（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５（１９９０）７２９２−７３００）を応用して、第二の可能性ΔＩｓ−ＩＩｓｉｄ及びΔＩＩＩｓ−ＩＩｓｉｄを除去した。最も難しいケースはΔＩｓ−ＩＩＩｓｉｄとΔＩＩＩｓ−Ｉｓｉｄとの識別であった。この識別は、予測された四糖ΔＩｓ−ＩＩＩｓｉｄをＮａＢＨ４で予め還元することによって行った。極めて過剰な量のヘパリナーゼ１、２及び３の混合物を十分に脱塩したサンプルに作用させると、還元四糖が開裂され、ΔＩｓが還元ΔＩＩＩｓ（アノマーの不在によって容易に同定される）二糖と共に生じた。完全に解重合したサンプル中と同様にΔＩｓ−ＩＩｓｇｌｕも存在していた。この混合物中には新しい構造（ΔＩｓ−ＩＩｓｅｐｏｘｙ）も同定された。
【０１０４】
【化１０】
【０１０５】
１Ｈ及び１３ＣのＮＭＲスペクトロスコピーをＣＯＳＹ，ＴＯＣＳＹ，ＲＯＥＳＹ及びＨＳＱＣの１Ｈ／１３Ｃ ２Ｄスペクトルと共に使用して構造を決定した。１Ｈ及び１３Ｃの全アサインメント（ΔＩｓ−ＩＩｓｅｐｏｘｙのプロトン及び炭素の化学シフト）を以下に報告する：
【０１０６】
【表２】
【０１０７】
１Ｄプロトンスペクトルのシグナル（図４）とＴＯＣＳＹスペクトルの分析とを統合すると、化合物が四糖の特性を有していることが示される。３．０１ｐｐｍで観察された弱いシグナルは、還元性末端に他のアルファアノマー残基（１５％）が存在することを示す。４，５−不飽和ウロン酸のアサインメントを開始するために５．９５ｐｐｍで観察されたエチレン系プロトンＨ４を使用する。４つの残基に対応する４つのアノマープロトンがＴＯＣＳＹスペクトルで明白に同定される。プロトン間結合定数は、公表されたデータと完全に一致する（Ａｂｄｅｌ−Ｍａｌｉｋら，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，１５９（１９８７）１１−２３）。β−（１−＞４）−Ｏ−グルコシド結合の証拠は、ＲＯＥＳＹスペクトルで残基間の相関関係から観察される。プロトン及び炭素化学シフトは、観察された２Ｄスペクトル相関関係と共にΔＩｓ−ＩＩｓｅｐｏｘｙ適合性である。
【０１０８】
この四糖ΔＩｓ−ＩＩｓｅｐｏｘｙはΔＩｓ−（Ｉｓｉｄ）ｎの２−Ｏ硫酸化によって生成されるが（Ｒ．Ｎ．Ｒｅｊら，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，２００（１９９０）４３７−４４７；Ｍ．Ｊａｓｅｊａら，Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ． ６７（１９８９）１４４９−１４５６；Ｓ．Ｐｉａｎｉら，Ｊ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｃｈｅｍ．１２（１９９３）５０７−２１；Ｕ．Ｒ．Ｄｅｓａｉら，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，２４１（１９９３）２４９−２５９）、アルカリ性条件下（１ＮのＮａＯＨ）、６０℃で３０分間処理したウシ肺ヘパリンから単離された。ヘパリナーゼ１による解重合は、ＮＭＲによるこの成分の単離及びキャラクタリゼーションを可能にした。この中間体は比較的不安定であり、さらに加水分解が進んでＬ−イズロン酸またはＬ−ガラクツロン酸部分に分解される（Ｍ．Ｊａｓｅｊａら，Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．，６７（１９８９）１４４９−１４５６；Ｕ．Ｒ．Ｄｅｓａｉら，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，２４１（１９９３）２４９−２５９）。
【０１０９】
Ｎ−アセチル化四糖ΔＩａ−ＩＩｓｇｌｕ、ΔＩＩＩａ−ＩＩｓｇｌｕ及びΔＩＩａ−ＩＩｓｇｌｕも同定した。これらは解重合の最終時期にＮ−アセチル化六糖が式：
【０１１０】
【化１１】
に従って開裂する結果として生成する。
【０１１１】
イズロン酸の２−Ｏ硫酸化は、部位−Ｇｌｃ（ＮＳ，６Ｓ）↓ＩｄｏＡ（２Ｓ）−ＧｌｃＮＡｃ（６−ＯＨまたは６Ｓ）の開裂を促進した。ΔＩＩａ−ＩＩｓｇｌｕの存在は、反応：
【０１１２】
【化１２】
が可能であるが不完全であることを示した。六糖画分中のΔＩｓ−Ｉａｉｄ−ＩＩｓｇｌｕ及びΔＩｓ−ＩＩＩａｉｄ−ＩＩｓｇｌｕの非存在は、それらが完全に開裂されたことを示した。他方、ΔＩｓ−ＩＩａｉｄ−ＩＩｓｇｌｕは六糖画分の主要成分としてまだ存在していた。六糖画分のその他の成分、ΔＩｓ−ＩＩａｉｄ−ＩＩｓｇｌｕ、ΔＩｓ−ＩＩａｉｄ−ＩＶｓｇｌｕ及びΔＩｓ−ＩＩａｉｄ−ＩＶｓｇｌｕは、我々の配列決定法を使用して先ず同定し、次いで分取クロマトグラフィーによって単離し、それらの一致をＮＭＲスペクトロスコピーによって確認した。３−Ｏ硫酸化六糖は、式：
【０１１３】
【化１３】
で示されるような反応を使用するヘパリナーゼ２の作用によって同定された。この分画化スキームを考察すると、ΔＩＩａ−ＩＩｓｇｌｕ−Ｉｓｉｄ構造の存在の可能性はＵＶスペクトル及びアノマーパターンの双方を検討することによって排除された。他の２つの六糖、ΔＩｓ−ＩＩａｉｄ−ＩＩｓｇｌｕ及びΔＩｓ−ＩＩａｉｄ−ＩＶｓｇｌｕは、ヘパリナーゼ１、ヘパリナーゼ３＋ヘパリナーゼ１、次いで３つのヘパリナーゼの混合物の作用を使用する同様の方法で同定した。
【０１１４】
既述のように、ヘパリナーゼ１の作用はΔＩＩａ−ＩＩｓｇｌｕ及びΔＩＩａ−ＩＶｓｇｌｕに導く。
【０１１５】
【化１４】
【０１１６】
ΔＩｓ−ＩＩａｉｄから二糖構成単位への変換がヘパリナーゼ３の作用に起因することに注目されたい。同じ酵素処理後に、ΔＩｓ−ＩＩＩａｉｄ−ＩＩｓｇｌｕはΔＩｓ−ＩＩＩａｉｄ＋ΔＩＩｓに分画化されただけであった。この場合、ΔＩｓ↓ＩＩＩａｉｄ−ＩＩｓｇｌｕと対照的にΔＩｓ↓ＩＩａｉｄをヘパリナーゼ１で開裂することはできない。ΔＩｓ−ＩＩａｉｄまたはΔＩｓ−ＩＩＩａｉｄのような、還元性末端にアセチル化グルコサミンを有している多くのオリゴ糖は、ＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラフィーでΔＩＩａまたはΔＩＩＩａと同様の特異的アノマーパターンを有している。所望の場合には、これが還元性末端にＮ−アセチル化部分をもつオリゴ糖のもう１つの同定方法である。結論として、ヘパリナーゼ１によるアセチル化六糖から四糖への変換を導くために、開裂性の低い順に以下の順序が確定した：ΔＩｓ−ＩＩａｉｄ−ＩＩｓｇｌｕ ≒ ΔＩｓ−ＩＩａｉｄ−ＩＶｓｇｌｕ ＜ ΔＩｓ−ＩＩａｉｄ−ＩＩｓｇｌｕ ≒ ΔＩｓ−ＩＩａｉｄ−ＩＶｓｇｌｕ ＜ ΔＩＩＩｓ−ＩＩＩａｉｄ−ＩＩｓｇｌｕ ≒ ΔＩＩＩｓ−ＩＩＩａｉｄ−ＩＶｓｇｌｕ ＜ ΔＩｓ−ＩＩＩａｉｄ−ＩＩｓｇｌｕ ≒ Δｌｓ−ＩＩＩａｉｄ−ＩＶｓｇｌｕ ＞ ΔＩｓ−Ｉａｉｄ−ＩＩｓｇｌｕ。
【０１１７】
図６はヘパリナーゼ１で部分解重合させることによってブタ腸ヘパリンから得られた画分のＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラムを示す。この図は、高度に硫酸化したオリゴ糖についてもＣＴＡ−ＳＡＸの高い分解能が得られることを示す。図３及び図４の四糖及び六糖画分の内容の比較によって、ヘパリナーゼ１によるヘパリン開裂の進行の影響を示す。
【実施例５】
【０１１８】
配列決定の例
ヘパリナーゼによる管理解重合に基づくオリゴ糖の簡単な配列決定方法が開発された。選択的ＵＶ検出に組合せたＣＴＡ−ＳＡＸの分解能は分画化スキームの同定及び出発材料構造の推定を可能にする。ヘパリナーゼのようなリアーゼによる消化物の分析に基づく方法の弱点は、開裂中の不飽和結合の生成後にウロン酸が消滅するので（β−除去）ウロン酸の立体配置に関する構造が比較的不確実なことである（Ｙ．Ｋａｒｉｙａら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２３（１９９８）２４０−２４６）。ヘパリン二糖の立体配置及び結合に関する法則を考察するならばこの不確実性が実際にはかなり小さい。必要な場合には酸の立体配置をＮＭＲ法によって確認した。我々の配列決定方法は、ヘパリンオリゴ糖構造に対する我々の知識を向上させた。この方法は、基本的四糖の同定から開始し、次いで六糖及びそれ以上の多糖の同定を漸進的に継続する。図７は、十糖ΔＩｓ−Ｉｓｉｄ−Ｉｓｉｄ−ＩＩａｉｄ−ＩＩｓｇｌｕの配列決定例を示す。ヘパリナーゼ１を使用したとき、２つの部位：ΔＩｓ↓Ｉｓｉｄ↓Ｉｓｉｄ−ＩＩａｉｄ−ＩＩｓｇｌｕが開裂された。４つのフラグメントΔＩｓ−Ｉｓｉｄ−ＩＩａｉｄ−ＩＩｓｇｌｕ、ΔＩｓ−ＩＩａｉｄ−ＩＩｓｇｌｕ、ΔＩｓ−Ｉｓｉｄ及びΔｌｓの混合物を観察した。反応がさらに進行するのに伴って、ΔＩｓ−Ｉｓｉｄ−ＩＩａｉｄ−ＩＩｓｇｌｕがΔＩｓ−ＩＩａｉｄ−ＩＩｓｇｌｕ及びΔＩｓに開裂された。アセチル化画分は二重波長ＵＶ検出を使用して容易に検出された。ヘパリナーゼ２を使用すると、３つの部位、ΔＩｓ↓Ｉｓｉｄ↓Ｉｓｉｄ↓ＩＩａｉｄ−ＩＩｓｇｌｕが開裂された。これらの部位が開裂されたとき、残りのフラグメントはΔｌｌａ−ＩＩｓｇｌｕ及びΔＩｓであった。同定されたフラグメントの構造を考察すると、配列決定された十糖の可能な唯一の構造は、ΔＩｓ−Ｉｓｉｄ−Ｉｓｉｄ−ＩＩａｉｄ−ＩＩｓｇｌｕである。ΔＩｓ−Ｉｓｉｄ−ＩＩａｉｄ−ＩＩｓｇｌｕ−Ｉｓｉｄの配列決定は可能でない。その理由はこれらがヘパリナーゼ１開裂によって ΔＩｓ−Ｉｓｉｄのフラグメントを与えることができないからである。別の可能配列ΔＩｓ−ＩＩａｉｄ−ＩＩｓｇｌｕ−Ｉｓｉｄ−Ｉｓｉｄは、その八糖フラグメントＩｓ−Ｉｓｉｄ−ＩＩａｉｄ−ＩＩｓｇｌｕの認識及び出発十糖のアノマーパターンの双方によって除去された。
【０１１９】
本発明による定量方法では、混合物中に含有されていたすべての不飽和オリゴ糖が５５００ｍｏｌ−１．ｌ．ｃｍ−１に等しい同じモル吸光度を有しているという広く受け入れられている仮説を利用する。従って、出発低分子量ヘパリン中の解重合混合物の全ての構成成分の重量パーセンテージを決定することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】硫酸化二糖ΔＩｓのＵＶスペクトルをアセチル化二糖ΔＩａのＵＶスペクトルに比較したアセチル化オリゴ糖の選択的検出を示す。ｘ−軸は時間を分で示し、ｙ−軸はＵＶデテクタからのミリアンペアシグナルを表す。
【図２】ＣＴＡ−ＳＡＸカラムにおけるオリゴ糖アノマーの分離を示す。ｘ−軸は時間を分で示し、ｙ−軸はＵＶデテクタからのミリアンペアシグナルを表す。
【図３】ブタ腸ヘパリンの完全解重合によって得られた混合物中のオリゴ糖を分離するためのＧＰＣ／ＣＴＡ−ＳＡＸ結合の使用を示す。ｘ−軸は時間を分で示し、ｙ−軸はＵＶデテクタからのミリアンペアシグナルを表す。
【図４】Ｄ２０−４００ＭＨｚ中のΔＩｓ−ＩＩｓｅｐｏｘｙのＰｒｏｔｏｎスペクトル及びＣＯＳＹスペクトルを示す。主なクロスピークを、糖単位に対応する文字及びプロトン数ｚで標識する。
【図５】５ａ及び５ｂは、ブタ腸ヘパリンをヘパリナーゼ１で完全解重合して得られた混合物中のオリゴ糖を分離するためのＧＰＣ／ＣＴＡ−ＳＡＸ結合の使用を示す。ｘ−軸は時間を分で示し、ｙ−軸はＵＶデテクタからのミリアンペアシグナルを表す。
【図６】ブタ腸ヘパリンをヘパリナーゼ１で部分解重合して得られた混合物中のオリゴ糖を分離するためのＧＰＣ／ＣＴＡ−ＳＡＸ結合の使用を示す。ｘ−軸は時間を分で示し、ｙ−軸はＵＶデテクタからのミリアンペアシグナルを表す。
【図７】ΔＩｓ−Ｉｓｉｄ−Ｉｓｉｄ−ＩＩａｉｄ−ＩＩｓｇｌｕの配列決定を示す。ｘ−軸は時間を分で示し、ｙ−軸はＵＶデテクタからのミリアンペアシグナルを表す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘパリン、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）または超低分子量ヘパリン（ＵＬＭＷＨ）を構成するオリゴ糖の直接分析方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
へパリンは、天然ソースから抽出されたグリコサミノグリカンファミリーの生物活性物質であり、有効な抗凝固性及び抗血栓性を有している。これらは術後静脈血栓の治療に特に有用である。
【０００３】
ヘパリンソースからＬＭＷＨを製造するために、長いヘパリン多糖鎖を低分子量の短い鎖に分割する。これは化学的または酵素的な解重合によって行われる。例えば、エノキサパリンの場合、解重合プロセスは２つの競合的化学反応、即ち、β除去とベンジルエステルの加水分解とを含む。その結果として、平均分子量約４５００ＤａのＬＭＷＨ多糖鎖が得られる。ＬＭＷＨは非分割ヘパリンと同様に、いくつかの多糖鎖に沿って分布した特定の５糖配列でＡＴＩＩＩに結合することによって凝固を阻害する。
【０００４】
ＬＭＷＨの認可製品の製造業者は各々で異なる解重合プロセスを使用している。２つの製造業者が同じプロセスを使用することがなければ、このようなプロセスの違いから、異なる化学構造を持ち、従って異なる薬理学的活性及び異なる臨床使用承認表示をもつＬＭＷＨが製造される。
【０００５】
従って、ＬＭＷＨはそれらの製造に使用された解重合プロセスによって構造的に識別される（Ｒ．Ｊ．Ｌｉｎｈａｒｄｔら，Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｔｈｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈｅｍｏｓｔａｔｉｓ １９９９；２５（３ ｓｕｐｐ．）：５−１６）。その結果としてＬＭＷＨはヘパリンよりも不均質である。異なるプロセスの各々が特有の極めて複雑な構造的修飾を多糖鎖に生じさせる。これらの修飾は、鎖の長さ、鎖の配列、及び、構造フィンガープリントの違いを含む。その結果として、異なるＬＭＷＨの各々は、異なる薬理学的プロフィル及び異なる承認臨床表示を有している。
【０００６】
米国でＬｏｖｅｎｏｘＲＴＭ及び他のいくつかの国々でＣｌｅｘａｎｅＲＴＭという商品名で販売されているエノキサパリンナトリウムを純ヘパリンから製造するプロセスでは、水相アルカリ性解重合プロセスによってオリゴ糖鎖の還元性末端のグルコサミンに部分的ではあるが特徴的な変換が生じる。
【０００７】
この変換の第一段階は、グルコサミンとマンノサミンとの間の可逆的エピマー化から成る（Ｔ．Ｔｏｉｄａら，Ｊ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１５（３），３５１−３６０（１９９６））。第二段階は、グルコサミンの６−Ｏ−脱硫酸であり、これによって “１，６−無水”と呼ばれる誘導体が形成される（国際特許出願ＷＯ０１／２９０５５）。
【０００８】
【化４】
【０００９】
６−Ｏ−硫酸化された末端グルコサミンを有しているオリゴ糖鎖の場合にこの種の誘導体が得られる。
【００１０】
１，６−無水結合で修飾された末端をもつオリゴ糖鎖のパーセンテージはＬｏｖｅｎｏｘＲＴＭ（エノキサパリンナトリウム）のオリゴ糖混合物の構造的特徴である。現在知られている範囲では、ＬｏｖｅｎｏｘＲＴＭ（エノキサパリンナトリウム）の成分の１５％−２５％が鎖の還元性末端に１，６−無水構造を有している。
【００１１】
最近では、例えば公開された米国特許出願Ｎｏ．２００２−００５５６２１Ａ１に記載されているように、強塩基の存在下の解重合を使用するヘパリンフラグメントの新しい製造方法で約１５００−約３０００ドルトンの範囲の重量平均分子量をもつ超低分子量ヘパリン（ＵＬＭＷＨ）が得られるようになっている。該特許の記載内容は参照によって本発明に含まれるものとする。
【００１２】
ヘパリン、低分子量ヘパリン、超低分子量ヘパリンが元のままの（ｉｎｔａｃｔ）分子であるかまたは酵素消化物であるかを分析することは、混合物が多分散性であり、また、分子の官能化度が高くまた変わり易いため、難しい作業である。この問題に取組むためにクロマトグラフィー法及び電気泳動法が開発された。毛管電気泳動（ＣＥ）はヘパリンオリゴ糖を分離するために使用される（Ｍ．Ｇｕｅｒｒｉｎｉら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １２（２００２）７１３−７１９；Ｒ．Ｊ．Ｌｉｎｈａｒｄｔ．ら，ＢｉｏＭｅｔｈｏｄｓ（Ｂａｓｅｌ）９（１９９７）１８３−１９７）。しかしながら、ＣＥの選択性は液体クロマトグラフィーに比べてかなり低い。更に、（ＵＶによる）ＣＥ検出ではしばしば、不十分な感度が原因で問題が生じる。さらに、この分析方法のために開発された分離を分取技術に適応させることができないこともＣＥの欠点のひとつである。
【００１３】
いくつかの場合には、クロマトグラフィー分離を伴うことなくＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリー分析を行うことができ、これを予備的なヘパリンオリゴ糖分析方法及び配列決定ツールとして使用してもよい（Ｈ．Ｓａｋａｇｕｃｈｉら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２９（２００１）１０７−１８；Ａ．Ｊ．Ｒｈｏｍｂｅｒｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｌｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５（１９９８）４１７６−４１８１；Ｌ．Ｓｔｕｒｉａｌｅら，Ｓｅｍｉｎ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．２７（２００１）４６５−４７２）。しかしながらＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリー分析は複合混合物に対する分解能がない。また、費用も高い。
【００１４】
これらの理由から、硫酸化オリゴ糖の分離には液体クロマトグラフィーが好ましい。塩化ナトリウムを基剤とする移動相による強アニオン交換（ＳＡＸ）はヘパリン由来のオリゴ糖を分解するクロマトグラフィー方法の１つである。更に、ＨＰＬＣまたは低圧クロマトグラフィーによるゲル浸透クロマトグラフィーは、オリゴ糖のサイズ分離及び脱塩に使用できる強力なツールである。これらの方法では移動相に塩化ナトリウムを使用することが２つの重大な欠点を生む。即ち、ＮａＣｌを含む移動相は塩の腐蝕作用を克服するように特殊処理されたクロマトグラフを必要とする。また、２１５ｎｍよりも低い波長に強力なＵＶ吸光度を有している。このため、ある種のオリゴ糖に対してはこの検出方法の使用が制限される。
【００１５】
このような理由で、ＳＡＸクロマトグラフィーの固定相の開発が行き詰っていた。ＳＡＸクロマトグラフィーの使用はしばしば５−１０未満の硫酸基を含有するオリゴ糖の分離に限定されており、高度に硫酸化した生成物の場合には固定相の開孔への物質移動が少ない結果として重大なピーク拡大が頻繁に生じる。Ｃ１８またはＣ８結合シリカ上のイオン対クロマトグラフィーをテトラブチルアンモニウム含有移動相で代替する方法（Ｎ．Ｋ．Ｋａｒａｍａｎｏｓら，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．７６５（１９９７）１６９−１７９；Ｃ．Ｆ．Ｍｏｆｆａｔら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９７（１９９１ ４４９−４５９）または等価の方法も、アセトニトリル溶出勾配の終点で観察される選択性の低下を理由として低硫酸化種に限定されている。イオン対クロマトグラフィーの注目を呼ぶ開発が最近Ｌｉｎｈａｒｄｔらによって報告された（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１０１４（２００３）２１５−２２３）。この方法はマススペクトロスコピーと容易に組合せることができるであろうが、その使用はやはり高硫酸化オリゴ糖に対する選択性によって限定される。セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡ）のようなより親油性のアンモニウム塩とのイオン対合は難しい。その理由は、このような塩は、硫酸化オリゴ糖と共に著しく非極性のイオン対を形成し、これらの多くが水性溶媒に不溶性であるからである。
【００１６】
ＣＴＡのようなイオン対化剤を予め吸着させた固定相を使用する無機アニオンの分離はＩｔｏらによって一度ならず行われた（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，５４９（１９９１）２６５−２７２；Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６３（１９９１）２７３−２７６．；Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，５９８（１９９２） ２３７−２４１）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
従って、本発明の目的は、２０個までの硫酸基基をもち十二糖という大きさの高電荷のオリゴ糖を分離及び分析できる新規な配列決定方法を提供することである。
【００１８】
本発明の別の目的は、ヘパリン、低分子量ヘパリン、超低分子量ヘパリン及びオリゴ糖から選択されたサンプルのアッセイ方法を提供することである。本発明の方法では、第四アンモニウム塩をコートした逆相カラムを使用したオリゴ糖の複合混合物のクロマトグラフィー分離及び分析によってサンプルを分析する。これに関連した本発明の特徴によれば、逆相カラムがＣ８またはＣ１８カラムである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
１つの実施態様では、本発明の方法が、Ｃ８またはＣ１８逆相カラムに第四アンモニウム塩溶液を動的にコートすることによって調製した固定相を使用する分析用高速液体クロマトグラフィーを使用する。（逆相がＣ８またはＣ１８に限定されないこと、他の逆相もこの目的に適合し得ることは理解されよう。）
【００２０】
本発明の１つの実施態様では、固定相がセチルトリメチルアンモニウム塩またはセチルピリジニウム塩で動的にコートされたＣ８またはＣ１８逆相カラムである。逆相カラムは例えばＨｙｐｅｒｓｉｌ ＢＤＳでよい。
【００２１】
本発明において、“ヘパリン”という用語は、粗ヘパリン、高品質化ヘパリン、精製ヘパリンを制限なく含む、ヘパリン生成物以外のすべての形態のヘパリンを意味する。本発明において、“ヘパリン生成物”という用語はＬＭＷＨ及びＵＬＭＷＨを意味する。
【００２２】
本発明において、“低分子量ヘパリン”または“ＬＭＷＨ”は、約３，０００ドルトン超で約１０，０００ドルトン未満の重量平均分子量を有している、ヘパリンから得られた多糖混合物を意味する。
【００２３】
本発明において、“超低分子量ヘパリン”または“ＵＬＭＷＨ” は、約１，５００ドルトンから約３，０００ドルトンまでの重量平均分子量を有している、ヘパリンから得られた多糖混合物を意味する。
【００２４】
本文中で使用したＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラフィーは、第四アンモニウム塩で動的にコートされ約ｐＨ２−約ｐＨ１２の範囲で一定の正味正電荷を維持している逆相シリカカラムで行うアニオン交換クロマトグラフィーを意味する。
【００２５】
本発明の１つの実施態様では、逆相カラムがオクチルまたはオクタデシルシリカカラムであろう。
【００２６】
本発明の１つの実施態様では、第四アンモニウム塩がセチルトリメチルアンモニウムまたはセチルピリジニウムであろう。
【００２７】
本発明の１つの実施態様では、ＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラフィーが、セチルトリメチルアンモニウムまたはセチルピリジニウムでコートされたオクチルまたはオクタデシル結合シリカを含む固体支持体を使用する。この実施態様では、慣用のオクチルまたはオクタデシル結合シリカがセチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡ）またはセチルピリジニウム塩溶液によって“動的にコート”されており、それらのアニオン交換容量は、吸着されたＣＴＡまたはセチルピリジニウムの量によって慎重にコントロールされる。
【００２８】
１つの実施態様では、クロマトグラフィーの固定相がセチルトリメチルアンモニウム塩でコートされたＨｙｐｅｒｓｉｌ ＢＤＳ Ｃ８またはＣ１８逆相カラムである。
【００２９】
本発明の分析方法は以下の段階を含む：Ｃ８またはＣ１８逆相カラムに第四アンモニウム塩溶液を動的にコートすることによって調製した固定相を使用する高速液体クロマトグラフィー（例えば、ＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラフィー）によってサンプルを直接分析し、二糖から十二糖までの全てのオリゴ糖を検出する。この場合、オリゴ糖配列は生成物中に存在するままで観察される。これはオリゴ糖を直接検査できる分析である。
【００３０】
ゲル浸透クロマトグラフィー（分析すべきサンプルのＧＰＣ）による分析とＣ８またはＣ１８逆相カラムに第四アンモニウム塩溶液を動的にコートすることによって調製した固定相を使用する高速液体クロマトグラフィー（例えばＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラフィー）とを組合せた分析も、二糖から十二糖までのオリゴ糖を分析するために使用し得る。この二次元分離方法では、分解能の向上、及び、サンプル中のオリゴ糖の直接検査が可能である。さらに、二次元分析はオリゴ糖ピークがオーバーラップする可能性を最小にする。これもまた被験サンプル中に存在するままのオリゴ糖を直接観察できる方法である。
【００３１】
Ｃ８またはＣ１８逆相カラムに第四アンモニウム塩溶液を動的にコートすることによって調製した固定相を使用する高速液体クロマトグラフィー（例えば、ＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラフィー）の前に、アッセイ対象サンプルを解重合してもよい。本発明のこの実施態様では、ヘパリナーゼの作用によってサンプルを部分的にまたは全体的に解重合し、次いで得られた解重合物を適宜還元させてもよい。次に、例えばＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラフィーまたはゲル浸透クロマトグラフィーとＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラフィーとの併用によって解重合物を分析する。
【００３２】
１つの具体的な実施態様では、解重合物をＮａＢＨ４で処理することによって還元し、次いでＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラフィーまたはゲル浸透クロマトグラフィーとＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラフィーとの併用によって分析する。
【００３３】
１つの実施態様で、本発明の方法は、ヘパリン、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）、超低分子量ヘパリン（ＵＬＭＷＨ）及びオリゴ糖を直接分析するために使用でき、Ｃ８またはＣ１８逆相カラムの第四アンモニウム塩コーティングを使用してオリゴ糖の複合混合物を分離及び分析し二糖から十二糖までのすべてのオリゴ糖を検出し得る。
【００３４】
１つの関連実施態様では、分析をＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラフィーによって行う。
【００３５】
別の実施態様では、ヘパリン、低分子量ヘパリン、超低分子量ヘパリン及びオリゴ糖の分析方法が２つの段階、即ち、（ａ）ゲル浸透クロマトグラフィーによる第一分離段階、及び、（ｂ）Ｃ８またはＣ１８逆相カラムの第四アンモニウム塩コーティングを使用して二糖から十二糖までの画分の各々を分離し、二糖から十二糖までのすべてのオリゴ糖を検出する第二分離段階、を含む。
【００３６】
関連実施態様では、上記分析の第二分離段階をＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラフィーによって行う。
【００３７】
本発明の別の実施態様では、ヘパリン、低分子量ヘパリン、超低分子量ヘパリン及びオリゴ糖の分析方法が、例えばヘパリナーゼの作用によってサンプルを部分的または全体的に解重合し、次いで解重合物を適宜還元させる段階を含む。次に、オリゴ糖の複合混合物を分離及び分析するためにＣ８またはＣ１８逆相カラムの第四アンモニウム塩コーティングを使用して直接分析を行って二糖から十二糖までのすべてのオリゴ糖を検出する。
【００３８】
関連実施態様では、上記分析をＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラフィーによって行う。
【００３９】
ＬＭＷＨ、ＵＬＭＷＨ及びオリゴ糖の製造に使用する解重合プロセスの選択性を決定するために本発明方法を使用してもよい。十二糖までのオリゴ糖を直接分析することができれば、特定の解重合プロセスによって生成するオリゴ糖配列を決定できる。先に指摘したように、２つ以上の製造業者が同じプロセスを使用しているのでなければ、ＬＭＷＨの製造業者の各々は異なる解重合プロセスを使用しており、その結果として、異なる化学構造のＬＭＷＨが生成し、これらはそれぞれに異なる薬理学的活性及び臨床使用承認表示を有することになる。本発明方法はここに、ＬＭＷＨまたはＵＬＭＷＨの各々の極めて複雑な特有の構造プロフィルを同定し特性決定するための方法を提供する。
【００４０】
本発明の方法はまた、１，６−無水結合（即ち、“１，６−無水基”）または製造プロセスによって生じた他の何らかの特定の構造的修飾によって修飾された末端をもつオリゴ糖鎖の存在を検出及び／または定量するために使用し得る。
【００４１】
本発明の１つの実施態様では、アッセイ対象サンプル中の “１，６−無水基”の存在を十二糖までのＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラフィーによって直接的に（即ち、酵素的または化学的前処理なしで）分析及び／または定量し得る。
【００４２】
本発明の別の実施態様では、ゲル浸透クロマトグラフィーを使用してサンプルを分画化し、次いで二糖から十二糖までの各画分のＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラフィーによってサンプル中の“１，６−無水基”を直接的に分析及び／または定量し得る。本発明の方法によれば、１，６−無水基を含むオリゴ糖を個別に同定できまたサンプル中のこの部分（二糖から十二糖）におけるそれらの分布も同定できる。
【００４３】
本発明の別の実施態様では、ヘパリナーゼの混合物で完全に解重合したサンプル中の“１，６−無水基”を分析する。
【００４４】
関連実施態様では、ヘパリナーゼ混合物がヘパリナーゼ１（ＥＣ ４．２．２．７）、ヘパリナーゼ２（ヘパリンリアーゼＩＩ）及びヘパリナーゼ３（ＥＣ ４．２．２．８）を含み、各ヘパリナーゼが例えば０．５単位／ｍｌで存在している。（これらの酵素はＧｒａｍｐｉａｎ Ｅｎｚｙｍｅｓグループによって上市されている。）
【００４５】
本発明の方法は、“１，６−無水”誘導体を含有していない低分子量ヘパリンからＬｏｖｅｎｏｘＲＴＭ（エノキサパリンナトリウム）を識別し得る。逆の言い方をすれば、本発明の方法によって、低分子量ヘパリンがＬｏｖｅｎｏｘＲＴＭ（エノキサパリンナトリウム）の物理化学的特性をもたないことを確認することが可能である。
【００４６】
さらに、本発明方法は、β−除去を含む化学的または酵素的解重合によるＬｏｖｅｎｏｘＲＴＭ（エノキサパリンナトリウム）のようなＬＭＷＨ及びＵＬＭＷＨの製造プロセスを標準化して均一なバッチを得るためにサンプルをインプロセスでコントロールする工業的方法に応用できる。
【００４７】
１つの実施態様では、ＬｏｖｅｎｏｘＲＴＭ（エノキサパリンナトリウム）を特性決定するために本発明の方法を使用し得る。この方法は以下の段階を含む：
ＬｏｖｅｎｏｘＲＴＭ（エノキサパリンナトリウム）のサンプルをヘパリナーゼ１（ＥＣ ４．２．２．７）、ヘパリナーゼ２（ヘパリンリアーゼＩＩ）及びヘパリナーゼ３（ＥＣ ４．２．２．８）の混合物で解重合させる；
場合によっては、解重合したサンプルを例えば酢酸ナトリウム中のＮａＢＨ４溶液で処理することによって還元させる（この段階は、１，６−無水形態でない還元性末端を特異的に還元させることが可能である（国際特許出願ＷＯ０１／７２７６２に記載の生成物））；
次いで、解重合し場合によっては還元したサンプル中の種々のオリゴ糖をＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）によって分離する。
【００４８】
本発明の１つの実施態様では、ＨＰＬＣがＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラフィー（上記に定義）でよい。
【００４９】
別の実施態様では本発明は、例えば本文中に記載のようなヘパリン、低分子量ヘパリン、超低分子量ヘパリン及びオリゴ糖の分析方法に使用するための、Ｃ８またはＣ１８逆相カラムに第四アンモニウム塩を動的にコートする処理を含むＨＰＬＣ／固定相の調製方法を提供する。特定実施態様では、第四アンモニウム塩がセチルトリメチルアンモニウム硫酸水素塩であり、動的コーティングがＨ２Ｏ−ＣＨ３ＯＨ溶液中、約４５℃のカラム温度で行われる。カラムに吸着されるＣＴＡの量は、カラム通過溶液が含有しているメタノールのパーセンテージに正比例し、従って調節できる。
【００５０】
本発明に使用されるＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラフィーでは、Ｃ８またはＣ１８逆相カラムが例えばＨｙｐｅｒｓｉｌ ＢＤＳカラムまたはＨｙｐｅｒｓｉｌ β ｂａｓｉｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｎｎｉｇａｎ）でよい。分析作業のためには、Ｃ８またはＣ１８逆相カラムが３μｍの粒度、約１５ｃｍのカラム長さ及び約１ｍｍ−約４．６ｍｍの範囲のカラム直径を有していればよい。分取目的には、Ｃ８またはＣ１８逆相カラムが、もっと大きい直径、例えば５０ｍｍ、及び、もっと大きい粒度、例えば８μｍを有していればよい。
【００５１】
当業者は、カラムに吸着させるＣＴＡの量、粒度、カラム直径及びカラム長さを変更することによって、２０個までの硫酸基基をもつ十二糖までの大きさの高電荷オリゴ糖を分離できる。更に、最近のオクタデシル結合シリカの開発は３μｍ粒子の高効率使用を可能にした。
【００５２】
本発明の方法では、硫酸化オリゴ糖の保持時間がカラムに吸着されたセチルトリメチルアンモニウム塩の量に従属して直接的に調整され得る。２０個以下の硫酸基を含有しているオリゴ糖は、慣用のＳＡＸ分析よりも優れた分解能で分離され得る。カラムコーティングの安定性が数百回の注入を可能にする。
【００５３】
本発明はまた、リアーゼによるヘパリン、ＬＭＷＨまたはＵＬＭＷＨの部分解重合に基づく簡単なオリゴ糖の配列決定方法を提供する。更に、本発明のＣＴＡ−ＳＡＸ法は上述のような分取規模の処理に直接的に移行できる。メタノールまたはアセトニトリルのような有機溶媒を単独でまたは水と混合してカラムに通すとカラムからＣＴＡを脱着させることが可能である。しかしながら水性移動相を使用する限り、ＣＴＡはカラムに吸着された状態に維持され、カラムは少なくとも数ヶ月間の使用が可能である。この期間中、特に使用期間の初期には保持の僅かな減少が観察されるかもしれないが、カラム保持は比較的安定に維持される（Ｋ．Ｉｔｏら，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，５４９（１９９１ ２６５−２７２Ａ）。
【００５４】
本発明のＣＴＡ−ＳＡＸカラムの追加の特性は、カラムがオリゴ糖の還元性末端のα及びβアノマーを分離する能力を有することである。２つのアノマーのモル比は還元性末端の硫酸化パターンに依存する。還元性末端がＮ−硫酸化グルコサミンの場合には、アノマーα／アノマーβの比は約９５／５であるが、Ｎ−アセチル化グルコサミンの場合にはこの比が６０／４０から４０／６０の範囲である。同様に、グルコサミンの６位及び３位の硫酸化がアノマーの特徴的な溶出パターンを与える。マンノサミンで終結するオリゴ糖で極めて特異的なアノマーパターンが観察される（例えば、ΔＩｓ−ｌｓｉｄｅｐｉ）。前述したように、この特殊な構造はＬｏｖｅｎｏｘＲＴＭ（エノキサパリンナトリウム）の特徴であり、化学プロセス中にアルカリ性媒体中で還元性末端がエピマー化することによって生じる。
【００５５】
使用する装置は溶出勾配を形成できかつＵＶデテクタを備えているいかなるクロマトグラフでもよい。本発明の１つの実施態様では、ＵＶデテクタは諸成分のＵＶスペクトルを発生させ、異なる２つの波長の吸光度の差から生じる複合シグナルを記録し得るダイオードアレイである。このようなダイオードアレイデテクタによれば、アセチル化オリゴ糖の特異的検出が容易である。関連実施態様では、約２００ｎｍ−約４００ｎｍのＵＶ範囲に透明なＨＰＬＣ移動相を使用する。本発明のこの実施態様に使用できる移動相の非限定例は、過塩素酸ナトリウムまたはメタンスルホン酸ナトリウムを基剤とする移動相である。１つの実施態様では、移動相がメタンスルホン酸アンモニウムの水溶液である。
【００５６】
従って、アニオン交換クロマトグラフィーによる分離を使用する上記に定義のような分析方法も本発明の目的の１つである。この方法では、約２００ｎＭ−約４００ｎｍのＵＶ領域に透明な移動相が使用される。
【００５７】
いくつかの実施態様では、強アニオンクロマトグラフィー分離が約２．０−約７．０のｐＨで行われる。もっと高いｐＨ条件も使用できる。関連実施態様では、約２．５のｐＨが使用されるであろう。別の実施態様では、発色性イオンがメタンスルホン酸アンモニウムであり、メタンスルホン酸をアンモニア水溶液でｐＨ２．５に中和することによって調製し得る。
【００５８】
代表的なクロマトグラフィー分離条件を以下に与える：
溶媒Ａ：メタンスルホン酸の添加によってｐＨ３に調整したＭｉｌｌｉ−Ｑ品質の水
溶媒Ｂ：ｐＨ２．５の２Ｍのメタンスルホン酸アンモニウム
直線溶出勾配：Ｔ＝０分：％Ｂ＝１；Ｔ＝７４分：％Ｂ＝１００
流速：０．２２ｍｌ／分
カラム温度４０℃。
【００５９】
本発明の別の目的は、ヘパリン、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）または超低分子量ヘパリンに見出される特異的基の検出方法である。
【００６０】
１つの実施態様では、この方法が、ＵＶによるヘパリンまたはＬＭＷＨ基の検出特異性を強化する。非アセチル化多糖はいずれも所与のｐＨでかなり類似のＵＶスペクトルを有しているので、非アセチル化糖の吸光度が相殺されるように選択した２つの波長の吸光度の差をシグナルとして取出すことによってアセチル化糖を選択的に検出することが可能である。
【００６１】
実施例に後述するように、２０２ｎｍ及び２３０ｎｍを検出波長及び基準波長として選択し、２０２−２３０ｎｍのシグナルを記録するとよい。使用できる波長の選択が移動相のｐＨに依存することは当業者には理解されよう（上記条件が最適条件になるように数ｎｍの調整が必要になることもあり得る）。
【００６２】
２つ以上の波長の吸光度を同時に測定できるいかなるＵＶデテクタも使用し得る。本発明の１つの実施態様では、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＤＡＤ１１００デテクタを使用する。この実施態様では、一方で２３４ｎｍ及び他方で２０２−２３０ｎｍで二重検出を行う。アセチル化オリゴ糖の選択的検出の原理を図１に示す。図１では硫酸化二糖ΔＩｓのＵＶスペクトルをアセチル化二糖ΔＩａのＵＶスペクトルに比較している。
【００６３】
従って、アセチル化糖を選択的に検出することが可能な検出方法を含む分析方法も本発明の目的の１つである。
【００６４】
いくつかの実施態様では、分析方法がＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラフィーによる分離を使用しており、非アセチル化糖の吸光度が相殺されるように選択した２つの波長の吸光度の差を測定することによってアセチル化糖を選択的に検出する。更に本発明の方法では以下に示す４つの１，６−無水残基を定量できるが、このような定量のためには、クロマトグラフィーシステムが混合物の他のすべての成分についても十分な選択性を有することが要求されていた。
【００６５】
ピーク分割の原因は、１つはアノマー形態にあり、もっと些少な別の原因はオリゴ糖鎖の末端位置に存在するときのΔＩＩｓ、ΔＩＩＩｓ及びΔＩｓに部分的に存在するグルコサミン−マンノサミン間の可逆的エピマー化にある。しかしながら、ＣＴＡ−ＳＡＸ法はクロマトグラムの全部のオリゴ糖を十分に定量できる分解能を有している。
【００６６】
酵素的解重合及び還元性末端の還元の後のＬｏｖｅｎｏｘＲＴＭ（エノキサパリンナトリウム）の１，６−無水誘導体は４つの本質的な形態で存在する：
【００６７】
【化５】
【００６８】
末端二糖ユニットに１，６−無水末端を含有しており該末端二糖のウロン酸に２−Ｏ−硫酸基を有していないすべてのオリゴ糖及び多糖は、ヘパリナーゼによって完全に解重合され、二糖１及び２の形態になっている。他方、末端の糖がウロン酸に２−Ｏ−硫酸基を含有しており、マンノサミン形態であるとき、１，６−無水誘導体は四糖の形態である（ヘパリナーゼ抵抗性の形態）。
【００６９】
混合物中に三糖１（下記参照）も存在し得る。これは以下の構造に導く別の分解プロセスから誘導される（ＬｏｖｅｎｏｘＲＴＭ（エノキサパリンナトリウム）の化学的解重合中に観察されるピーリング現象）。
【００７０】
【化６】
【００７１】
混合物の他の成分はＬｏｖｅｎｏｘＲＴＭ（エノキサパリンナトリウム）だけの特徴ではない。勿論、ヘパリン鎖の８つの基本的二糖が存在する。これらの８つの基本的二糖は、Ｓｉｇｍａ社及びその他の会社によって上市されている。
【００７２】
混合物中の他の二糖、即ち、二糖ΔＩＩＳｇａｌ及びΔＩＶＳｇａｌが本発明の方法によって同定された。これらは、−ｌｄｏＡ（２Ｓ）−ＧｌｃＮＳ（６Ｓ）−及び−ｌｄｏＡ（２Ｓ）−ＧｌｃＮＳ−のアルカリ性２−Ｏ−脱硫酸化を起原として有しており、２つのガラクツロン酸の形成に導く。これらはヘパリンの初期構造中に通常は存在していない（Ｕ．Ｍ．Ｄｅｓａｉら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３０６（２）４６１−４６８（１９９３）。
【００７３】
【化７】
【００７４】
３−Ｏ−硫酸化グルコサミンを含有しているオリゴ糖はヘパリナーゼによる開裂に抵抗性であり、四糖の形態に維持される。
【００７５】
たいていの低分子量ヘパリンの場合、ヘパリンがブタの粘膜から抽出され、主な四糖は以下に示すものである。これらの四糖は酵素的解重合に抵抗性であり、抗トロンビンＩＩＩに親和性をもつ配列を含む。これらの四糖は以下の記号で示される：ΔＩＩａ−ＩＩｓｇｌｕ及びΔＩＩａ−ＩＶｓｇｌｕ（Ｓ．Ｙａｍａｄａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．；２７０（７），４７８０−４７８７（１９９３）。
【００７６】
【化８】
【００７７】
ヘパリナーゼで開裂された混合物の最終成分はグリコセリン末端ΔＧｌｃＡ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘｙｌ−Ｓｅｒである（Ｋ．Ｓｕｇａｈａｒａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．；２７０（３９），２２９１４−２２９２３（１９９５）；Ｋ．Ｓｕｇａｈａｒａ，；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．；２６７（３），１５２８−１５３３（１９９２））。
【００７８】
【化９】
【００７９】
本発明の１つの実施態様によれば、分析したオリゴ糖混合物の二次元プロフィルを得るためにＧＰＣカラムをＣＴＡ−ＳＡＸカラムに直結させる。関連実施態様では、ヘパリナーゼによるサンプルの部分解重合によって得られたヘパリンオリゴ糖をサイズ及び硫酸化パターン及び消化物のＣＴＡ−ＳＡＸ分析に従って配列決定する方法が、ＣＴＡ−ＳＡＸカラムに直結された分析用ＧＰＣカラムを使用して行われ、分析したオリゴ糖混合物の二次元プロフィルが得られる。
【００８０】
ヘパリン、ＬｏｖｅｎｏｘＲＴＭ（エノキサパリンナトリウム）を非限定例とする低分子量ヘパリン、超低分子量ヘパリン及びオリゴ糖（十二糖以下）を分析する本発明の方法は、ＬｏｖｅｎｏｘＲＴＭ／ＣｌｅｘａｎｅＲＴＭを認定薬物として引用した出願に準じて規制当局の承認を求めるいかなるＬＭＷＨにも勿論適用できる。
【００８１】
（実施例）
以下の実施例は本発明の種々の特徴を示す。しかしながら本発明は以下に例示の実施例に限定されない。
【００８２】
【表１】
【００８３】
材料：メタンスルホン酸（９９．５％）はＡｌｄｒｉｃｈから購入した。Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍに由来の酵素リアーゼ（ヘパリナーゼＩ（ＥＣ ４．２．２．７）、ヘパリナーゼＩＩ（ＥＣ番号なし）ヘパリナーゼＩＩＩ（ＥＣ ４．２．２．８））はすべてＧｒａｍｐｉａｎ Ｅｎｚｙｍｅｓ（Ａｂｅｒｄｅｅｎ）から入手した。セチルトリメチルアンモニウム硫酸水素塩はＭｅｒｃｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）から購入した。その他の試薬及び化学薬品はいずれも入手できる最高品質のものであった。水はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ精製システムで精製した。
【実施例１】
【００８４】
酵素消化
以下の一般方法を実施例３−５に適宜使用した。
【００８５】
ヘパリンまたはオリゴ糖（０．１ｍｇ）の完全消化は、２ｍＭのＣａ（ＯＡｃ）２と２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡとを含有している全量３０μｌの１００ｍＭの酢酸ナトリウムバッファ，ｐＨ ７．０中、１０ｍｌＵのヘパリナーゼＩ、１０ｍｌＵのヘパリナーゼＩＩ及び１０ｍｌＵのヘパリナーゼＩＩＩの混合物によって室温で４８時間行う。ヘパリナーゼＩによるヘパリンまたはオリゴ糖（０．１ｍｇ）の部分消化は、２００ｍＭのＮａＣｌと２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡとを含有している全量１−３０μｌの５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．０中、０．１−１０ｍｌＵのヘパリナーゼＩによって、１７℃で１時間から１０日間行う。
【実施例２】
【００８６】
ＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラフィー
以下の一般方法を実施例３−５に適宜使用した。
【００８７】
装置：使用したクロマトグラフィーシステムは、ＵＶダイオードアレイデテクタを備えた慣用のＡｇｉｌｅｎｔ １１００システムである。
【００８８】
カラムの動的コーテイング：使用した手順は、Ｉｔｏ ａｎｄ Ｓｕｎｈａｒａ（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６３（１９９１）２７３−２７６）に記載された手順と同様である。Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＢＤＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｎｎｉｇａｎ製）を充填したＣ８またはＣ１８逆相カラムを使用する（１５０ｘ２．１ｍｍ内径、粒度３μｍ）。カラムをＨ２Ｏ−ＣＨ３ＯＨ（６８−３２）ｖ／ｖ溶液中の１ｍＭのセチルトリメチルアンモニウム硫酸水素塩と共に４５℃のカラム温度で２４０分間平衡させる。カラムに吸着されたＣＴＡの量は、カラム通過溶液が含有していたメタノールのパーセンテージに正比例するので調節できる。
【００８９】
クロマトグラフィー条件：使用カラムを既述のようにＣＴＡで動的コーティングする。発色性イオンは、メタンスルホン酸をアンモニア水溶液でｐＨ２．５に中和することによって調製したメタンスルホン酸アンモニウムである。ＣＴＡ−ＳＡＸの溶媒Ｂは、２Ｍのメタンスルホン酸アンモニウム，ｐＨ２．５である。溶媒Ａはメタンスルホン酸の添加によってｐＨ３に調整したＭｉｌｌｉ−Ｑ品質水である。１％Ｂから出発して７４分で１００％Ｂになる直線勾配を流速０．２２ｍｌ．分−１で使用する。毎回の処理後に、１８分間のリコンディショニング段階を使用する。カラム温度は４０℃である。
【００９０】
これらの条件を使用すると、オリゴ糖の濃度、サンプルのイオン強度、及び、ピーク拡大を生じないイオンの溶出能に依存して、約１μｌ−約１ｍｌの範囲の量を注入できる。例えば、分析用ＧＰＣから得られた画分を使用する場合（１００ｍＭの酢酸アンモニウム）５００μ１までの量を注入できる。
【００９１】
従って、サンプルが濃ＮａＣｌ溶液（ほぼ２Ｎ）に含有されているときは、注入前に水で４倍または５倍に希釈する必要がある。いずれにしても、水で４倍に希釈した４００μｌのＮａＣｌ溶液を注入するほうが、１００μｌの初期ＮａＣｌ溶液を注入するよりも良好な分離結果が得られる。
【００９２】
メタンスルホネートがＵＶ透明性なので、ダイオードデテクタアレイを使用して官能基を選択的に検出できる。化学的または酵素的なβ−除去によって得られた不飽和オリゴ糖は特徴的なＵＶスペクトルを有している。オリゴ糖の構造を記号化するために使用した略号は上記に示した。ＵＶスペクトルは主として、移動相のｐＨ及びグルコサミンのＮ−アセチル基の存在に依存する。図２に示すように、ｐＨ２．５の移動相では、２０２ｎｍ（検出波長）の吸光度から２４７ｎｍ（基準波長）の吸光度を減算することによって、非Ｎ−アセチル化オリゴ糖の寄与分をＵＶスペクトルから除去することが可能である（Ｈｕｂｅｒ，Ｄｉｏｄｅ ａｒｒａｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ＨＰＬＣ，Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｓｃｉ．Ｓｅｒ．，６２（１９９３）３６３−３９２）。得られたシグナルにはＮ−アセチル化オリゴ糖だけが検出されている。ヘパリン性オリゴ糖の場合、ＵＶスペクトルが移動相のｐＨに依存することは理解されよう。その結果として、ｐＨが２．５でなく６．０である場合には、基準波長が２４７ｎｍでなく２３０ｎｍであろう。すべてのクロマトグラムに２つの検出シグナルが与えられる。２３２ｎｍのＵＶシグナルはすべての不飽和オリゴ糖を検出し、２０２−２４７ｎｍの吸光度の差に対応するシグナルはＮ−アセチル化オリゴ糖を特異的に検出する。同様に、溶出勾配に起因する基線量のドリフトはブランク処理によって消去される。
【００９３】
ＣＴＡ−ＳＡＸ法は、粒度５μｍのＨｙｐｅｒｓｉｌ ＢＤＳ Ｃ１８を充填した２５０ｘ２１ｍｍカラムを使用する準分取規模で使用し得る。カラムのＣＴＡコーティングは分析用カラムの場合と同様にカラム温度を４５℃に調整して行う。移動相は濃度０−２．５ＮのＮａＣｌの水溶液である。通常は希塩酸を加えてｐＨを２．５に調整する。分離は約１０−約２０ｍｌ．分−１の範囲の流速を使用して室温で行う。２３４ｎｍのＵＶ検出を使用する。集めた画分を酢酸で中和し、後述するようにＧＰＣカラムで脱塩する。
【００９４】
分析用ＧＰＣ：分析用ゲル浸透は、１つのガードＴＳＫ Ｓｕｐｅｒ ＳＷプレカラム（３５ｘ４．６ｍｍ）（ＴＯＳＯＨ ＢＩＯＳＥＰ）の付いた２つのＴＳＫ Ｓｕｐｅｒ ＳＷ２０００（３００ｘ４．６ｍｍ）で行う。不飽和オリゴ糖は２３２ｎｍのＵＶ吸光度の測定によって検出される。移動相は０．１Ｍの酢酸アンモニウムであり、流速は０．１５ｍｌ．分−１である。注入量は５μｌである。ＧＰＣをＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラフイーに結合させる場合には、サンプル濃度は次段階の検出が可能な十分に高い濃度でなければならない。解重合したサンプルを分析するときは、ＧＰＣ注入溶液中のサンプル濃度は、サンプル毎に異なるであろうが、約２５−約１００ｍｇ／ｍｌの範囲であればよい。二糖、四糖、六糖、八糖、十糖に対応するピークを集める。２５０μｌまでの各画分をＣＴＡ−ＳＡＸカラムに直接的に再注入する。
【００９５】
脱塩手順：水を溶出剤として使用し、ＳｅｐｈａｄｅｘＲＴＭ Ｇ−１０ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を充填したカラムに、脱塩すべきオリゴ糖を通す。カラムサイズは脱塩すべきサンプルの量に応じて選択し得る。この目的には、１００ｘ７ｃｍ、１００ｘ５ｃｍ、４０ｘ２．６ｃｍ、２０ｘ１．６ｃｍのカラムセットが好都合である。導電率及び２３２ｎｍの吸光度を測定することによって二重検出を行う。
【００９６】
配列決定手順：１５０ｘ３ｍｍのＣＴＡ−ＳＡＸカラムで分離し２０ｘ１．６ｃｍのＳｅｐｈａｄｅｘＲＴＭ Ｇ−１０カラムで脱塩した精製オリゴ糖を集める。あるいは、精製オリゴ糖を水で５倍に希釈し、希ＮＨ３を加えてｐＨ７．０に中和する。次に、ヘパリナーゼまたは２−スルファターゼを使用する部分的分画化によって配列決定する（Ｒ．Ｒａｍａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（２００３）１２１６７−１２１７４；Ｇ．Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６（１９９９）５３７−５４２；Ｓ．Ｅｒｎｓｔら，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３０（１９９５）３８７−４４４）。
いくつかの分析では、オリゴ糖鎖の還元性末端に位置する二糖をマークするために１００ｍＭの酢酸ナトリウム中のＮａＢＨ４によってオリゴ糖を予備還元する。１５０ｘ２．１ｍｍのＣＴＡ−ＳＡＸカラムでＨＰＬＣ注入によって分画化をモニターする。
【００９７】
ＮＭＲスペクトル：７００μｌの９９％Ｄ２０にサンプルを溶解した。標準パルス列を使用し、室温、４００．１３ＭＨｚでオリゴ糖の一次元（１Ｄ）及び二次元（２Ｄ）ＮＭＲスペクトル（ＣＯＳＹ，ＴＯＣＳＹ，ＲＯＥＳＹ及びＨＳＱＣ）をＢｒｕｋｅｒ ＤＲＸ４００スペクトル計に記録した。２Ｄ等核Ｈａｒｔｍａｎｎ−Ｈａｈｎ（ＴＯＣＳＹ）実験をスピンロック時間１００ｍｓで記録した。２Ｄ ＲＯＥＳＹスペクトルは混合時間４００ｍｓで得られた。化学シフトは外部標準ＴＳＰＤ４を基準としたｐｐｍで与える。プロトン化学シフトはＴＯＣＳＹ実験から測定した。プロトン結合定数は、スペクトル分解能が十分でプロトンシグナルがオーバーラップしないときは１Ｄスペクトルで直接測定できた。炭素化学シフトはＨＳＱＣスペクトルから得られた。構造決定は１Ｈ及び１３Ｃ ＮＭＲスペクトロスコピ―をＴＯＣＳＹ，ＲＯＥＳＹ及びＨＳＱＣ １Ｈ／１３Ｃ ２Ｄスペクトルと共に使用して行った。
【実施例３】
【００９８】
ブタ腸ヘパリンの完全解重合
図３は上記に記載のヘパリナーゼ混合物によって完全に解重合したブタ腸ヘパリンのＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラムを示す。また、ＧＰＣ及びＣＴＡ−ＳＡＸカラムの組合せによる本発明の二重検出の利点を示す。ΔＩＶａ以外のすべての基本的二糖が分解された。ΔＩＶａは硫酸官能基が存在しないので保持されなかった。アセチル化二糖ΔＩＩａ、ΔＩＩＩａ及びΔＩａは双方のＵＶシグナルに検出されたが、Ｎ−硫酸化二糖は第一のシグナル（２３２ｎｍのＵＶ吸光度）だけに検出された。本発明方法の３−Ｏ硫酸化オリゴ糖の検出能力は、これらのオリゴ糖がＡＴＩＩＩ結合配列の一部であるという理由から注目に値する。
【００９９】
異なる５つの硫酸化度（４０１＜Ｍｗ＜８６７）を含む二糖画分の不均一性が原因で、完全に解重合したサンプル中に存在するオリゴ糖すべてを解明することはできなかった。四糖については、重量平均分子量範囲が１０６６−１３３０である。例えば、主要な２つの四糖（Ｓ．Ｙａｍａｄａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２７０（１９９５）８６９６−８７０５）ΔＩＩａ−ＩＩｓｇｌｕ及びΔＩＩａ−ＩＶｓｇｌｕ（Ｍｗ１０６６及び１１６８）は高度に硫酸化した二糖に極めて近い分子量を有している。従って、ＧＰＣ画分Ｆ１−Ｆ３だけをＣＴＡ−ＦＡＸカラムに注入した。低硫酸化二糖画分Ｆ４はあまり重要でなく、注入されたＧＰＣ移動相の酢酸アンモニウムはそれらの溶出範囲に対応してＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラムの初端を乱した。
【０１００】
分離に引き続いて、ヘパリン消化物中の新しい四硫酸化二糖を同定した。分子量７６７ドルトンがＬＣ／ＭＳによって確認され（結果公表せず）、これはΔＩｓ構造に一致する。この二糖は最近、３−ＯＳＴ−５Ｈの発現によってヘパリン中でｉｎ ｖｉｔｒｏ形成された（Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８（２００３）２６７８０−２６７８７）。この種の３−Ｏ硫酸化二糖は、ウシ腸ヘパリンに由来の完全解重合ヘパリン中に多量に存在する。しかしながら、ウシ腸ヘパリンのサンプル中では本発明の二重ＵＶ検出方法で２つの同様の二糖ΔＩＩｓ及びΔＩＩＩｓが検出され、また、３−Ｏ硫酸化四糖ΔＩＩｓ−ＩＩｓｇｌｕ、ΔＩｓ−ＩＩｓｇｌｕ及びΔＩａ−ＩＩｓｇｌｕも検出できる。不飽和酸に存在する２−Ｏ硫酸官能基は、最大吸収波長をシフトさせ、それらの認識を可能にする。極めて過剰な量のヘパリナーゼ混合物でヘパリナーゼ抵抗性の四糖を処理すると、二糖生成物の部分的解重合及びキャラクタリゼーションが可能になった。例えばこれらの条件下でΔＩａ−ＩＩｓｇｌｕは部分的にΔＩａ及びΔＩＩｓに変換された。
【実施例４】
【０１０１】
ヘパリナーゼ１によるブタ腸ヘパリンの解重合
ヘパリナーゼ１によるブタ腸ヘパリンの解重合を試験し、得られたオリゴ糖の多くを同定した。この混合物はヘパリナーゼ１による開裂が連続的に進行するので極めて分解性（ｅｖｏｌｕｔｉｖｅ）であることが証明された。一般には二糖、四糖及び六糖の混合物が反応終了後に回収されるが、その理由は主として、アセチル化部位−Ｇｌｃ（ＮＳ，６−ＯＨまたは６Ｓ）↓ＩｄｏＡ（２−ＯＨまたは２Ｓ）−ＧｌｃＮＡｃ（６−ＯＨまたは６Ｓ）↓ＧｌｃＡ−がヘパリナーゼ１に抵抗性なので六糖が生成し、−ＧｌｃＮＳ（６−ＯＨまたは６Ｓ）↓ＧｌｃＡ−の抵抗性が四糖を生成するからである。
【０１０２】
図５ａは、ヘパリナーゼ１によって消化されたブタ腸ヘパリンの完全クロマトグラムをその二糖、四糖及び六糖画分に関連するクロマトグラム（図５ｂ）と共に示す。四糖ΔＩｓ−Ｉｓｉｄが二糖ΔＩｓに完全変換したことは、酵素反応がほぼ完全であったことを示す。図示の分離は、ＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラフイーの単独使用では得られなかった。その理由は、ある種の低硫酸化六糖は同じ時間範囲でいくつかの硫酸化四糖として溶出したからである。二糖画分のクロマトグラムは、ΔＩｓ、ΔＩＩｓ、ΔＩＩＩｓ及び３−Ｏ硫酸化ΔＩｓを含んでいた。四糖画分は、ΔＩｓ−ＩＩＩｓｉｄ、ΔＩｓ−ＩＩｓｉｄ、ΔＩＩＩｓ−ＩＩＩｓｉｄ及びΔＩＩＩｓ−ＩＩｓｇｌｕを含んでおり、これは多くの論文で報告された単離構造に符合した。例えば、Ｈ．Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（２００３）２６７８０−２６７８７参照。
【０１０３】
本発明では、単離したヘパリナーゼ１抵抗性四糖にヘパリナーゼ２を作用させ開裂後に二糖構成単位の混合物とすることによって構造認識を行った。ΔＩｓ−ＩＩｓｇｌｕ及びΔＩＩＩｓ−ＩＩｓｇｌｕの場合、ＵＶ吸収の最大とアノマー溶出パターンとを考察して可能なΔＩＩｓ−Ｉｓｉｄ及びΔＩＩｓ−ＩＩＩｓｉｄ配列を除去した。ＩＩｓのイズロニック立体配置（即ち、ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＳ）がヘパリン中にほとんど存在しないので、Ｌｉｎｄａｈｌの法則（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５（１９９０）７２９２−７３００）を応用して、第二の可能性ΔＩｓ−ＩＩｓｉｄ及びΔＩＩＩｓ−ＩＩｓｉｄを除去した。最も難しいケースはΔＩｓ−ＩＩＩｓｉｄとΔＩＩＩｓ−Ｉｓｉｄとの識別であった。この識別は、予測された四糖ΔＩｓ−ＩＩＩｓｉｄをＮａＢＨ４で予め還元することによって行った。極めて過剰な量のヘパリナーゼ１、２及び３の混合物を十分に脱塩したサンプルに作用させると、還元四糖が開裂され、ΔＩｓが還元ΔＩＩＩｓ（アノマーの不在によって容易に同定される）二糖と共に生じた。完全に解重合したサンプル中と同様にΔＩｓ−ＩＩｓｇｌｕも存在していた。この混合物中には新しい構造（ΔＩｓ−ＩＩｓｅｐｏｘｙ）も同定された。
【０１０４】
【化１０】
【０１０５】
１Ｈ及び１３ＣのＮＭＲスペクトロスコピーをＣＯＳＹ，ＴＯＣＳＹ，ＲＯＥＳＹ及びＨＳＱＣの１Ｈ／１３Ｃ ２Ｄスペクトルと共に使用して構造を決定した。１Ｈ及び１３Ｃの全アサインメント（ΔＩｓ−ＩＩｓｅｐｏｘｙのプロトン及び炭素の化学シフト）を以下に報告する：
【０１０６】
【表２】
【０１０７】
１Ｄプロトンスペクトルのシグナル（図４）とＴＯＣＳＹスペクトルの分析とを統合すると、化合物が四糖の特性を有していることが示される。３．０１ｐｐｍで観察された弱いシグナルは、還元性末端に他のアルファアノマー残基（１５％）が存在することを示す。４，５−不飽和ウロン酸のアサインメントを開始するために５．９５ｐｐｍで観察されたエチレン系プロトンＨ４を使用する。４つの残基に対応する４つのアノマープロトンがＴＯＣＳＹスペクトルで明白に同定される。プロトン間結合定数は、公表されたデータと完全に一致する（Ａｂｄｅｌ−Ｍａｌｉｋら，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，１５９（１９８７）１１−２３）。β−（１−＞４）−Ｏ−グルコシド結合の証拠は、ＲＯＥＳＹスペクトルで残基間の相関関係から観察される。プロトン及び炭素化学シフトは、観察された２Ｄスペクトル相関関係と共にΔＩｓ−ＩＩｓｅｐｏｘｙ適合性である。
【０１０８】
この四糖ΔＩｓ−ＩＩｓｅｐｏｘｙはΔＩｓ−（Ｉｓｉｄ）ｎの２−Ｏ硫酸化によって生成されるが（Ｒ．Ｎ．Ｒｅｊら，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，２００（１９９０）４３７−４４７；Ｍ．Ｊａｓｅｊａら，Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ． ６７（１９８９）１４４９−１４５６；Ｓ．Ｐｉａｎｉら，Ｊ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｃｈｅｍ．１２（１９９３）５０７−２１；Ｕ．Ｒ．Ｄｅｓａｉら，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，２４１（１９９３）２４９−２５９）、アルカリ性条件下（１ＮのＮａＯＨ）、６０℃で３０分間処理したウシ肺ヘパリンから単離された。ヘパリナーゼ１による解重合は、ＮＭＲによるこの成分の単離及びキャラクタリゼーションを可能にした。この中間体は比較的不安定であり、さらに加水分解が進んでＬ−イズロン酸またはＬ−ガラクツロン酸部分に分解される（Ｍ．Ｊａｓｅｊａら，Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．，６７（１９８９）１４４９−１４５６；Ｕ．Ｒ．Ｄｅｓａｉら，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，２４１（１９９３）２４９−２５９）。
【０１０９】
Ｎ−アセチル化四糖ΔＩａ−ＩＩｓｇｌｕ、ΔＩＩＩａ−ＩＩｓｇｌｕ及びΔＩＩａ−ＩＩｓｇｌｕも同定した。これらは解重合の最終時期にＮ−アセチル化六糖が式：
【０１１０】
【化１１】
に従って開裂する結果として生成する。
【０１１１】
イズロン酸の２−Ｏ硫酸化は、部位−Ｇｌｃ（ＮＳ，６Ｓ）↓ＩｄｏＡ（２Ｓ）−ＧｌｃＮＡｃ（６−ＯＨまたは６Ｓ）の開裂を促進した。ΔＩＩａ−ＩＩｓｇｌｕの存在は、反応：
【０１１２】
【化１２】
が可能であるが不完全であることを示した。六糖画分中のΔＩｓ−Ｉａｉｄ−ＩＩｓｇｌｕ及びΔＩｓ−ＩＩＩａｉｄ−ＩＩｓｇｌｕの非存在は、それらが完全に開裂されたことを示した。他方、ΔＩｓ−ＩＩａｉｄ−ＩＩｓｇｌｕは六糖画分の主要成分としてまだ存在していた。六糖画分のその他の成分、ΔＩｓ−ＩＩａｉｄ−ＩＩｓｇｌｕ、ΔＩｓ−ＩＩａｉｄ−ＩＶｓｇｌｕ及びΔＩｓ−ＩＩａｉｄ−ＩＶｓｇｌｕは、我々の配列決定法を使用して先ず同定し、次いで分取クロマトグラフィーによって単離し、それらの一致をＮＭＲスペクトロスコピーによって確認した。３−Ｏ硫酸化六糖は、式：
【０１１３】
【化１３】
で示されるような反応を使用するヘパリナーゼ２の作用によって同定された。この分画化スキームを考察すると、ΔＩＩａ−ＩＩｓｇｌｕ−Ｉｓｉｄ構造の存在の可能性はＵＶスペクトル及びアノマーパターンの双方を検討することによって排除された。他の２つの六糖、ΔＩｓ−ＩＩａｉｄ−ＩＩｓｇｌｕ及びΔＩｓ−ＩＩａｉｄ−ＩＶｓｇｌｕは、ヘパリナーゼ１、ヘパリナーゼ３＋ヘパリナーゼ１、次いで３つのヘパリナーゼの混合物の作用を使用する同様の方法で同定した。
【０１１４】
既述のように、ヘパリナーゼ１の作用はΔＩＩａ−ＩＩｓｇｌｕ及びΔＩＩａ−ＩＶｓｇｌｕに導く。
【０１１５】
【化１４】
【０１１６】
ΔＩｓ−ＩＩａｉｄから二糖構成単位への変換がヘパリナーゼ３の作用に起因することに注目されたい。同じ酵素処理後に、ΔＩｓ−ＩＩＩａｉｄ−ＩＩｓｇｌｕはΔＩｓ−ＩＩＩａｉｄ＋ΔＩＩｓに分画化されただけであった。この場合、ΔＩｓ↓ＩＩＩａｉｄ−ＩＩｓｇｌｕと対照的にΔＩｓ↓ＩＩａｉｄをヘパリナーゼ１で開裂することはできない。ΔＩｓ−ＩＩａｉｄまたはΔＩｓ−ＩＩＩａｉｄのような、還元性末端にアセチル化グルコサミンを有している多くのオリゴ糖は、ＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラフィーでΔＩＩａまたはΔＩＩＩａと同様の特異的アノマーパターンを有している。所望の場合には、これが還元性末端にＮ−アセチル化部分をもつオリゴ糖のもう１つの同定方法である。結論として、ヘパリナーゼ１によるアセチル化六糖から四糖への変換を導くために、開裂性の低い順に以下の順序が確定した：ΔＩｓ−ＩＩａｉｄ−ＩＩｓｇｌｕ ≒ ΔＩｓ−ＩＩａｉｄ−ＩＶｓｇｌｕ ＜ ΔＩｓ−ＩＩａｉｄ−ＩＩｓｇｌｕ ≒ ΔＩｓ−ＩＩａｉｄ−ＩＶｓｇｌｕ ＜ ΔＩＩＩｓ−ＩＩＩａｉｄ−ＩＩｓｇｌｕ ≒ ΔＩＩＩｓ−ＩＩＩａｉｄ−ＩＶｓｇｌｕ ＜ ΔＩｓ−ＩＩＩａｉｄ−ＩＩｓｇｌｕ ≒ Δｌｓ−ＩＩＩａｉｄ−ＩＶｓｇｌｕ ＞ ΔＩｓ−Ｉａｉｄ−ＩＩｓｇｌｕ。
【０１１７】
図６はヘパリナーゼ１で部分解重合させることによってブタ腸ヘパリンから得られた画分のＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラムを示す。この図は、高度に硫酸化したオリゴ糖についてもＣＴＡ−ＳＡＸの高い分解能が得られることを示す。図３及び図４の四糖及び六糖画分の内容の比較によって、ヘパリナーゼ１によるヘパリン開裂の進行の影響を示す。
【実施例５】
【０１１８】
配列決定の例
ヘパリナーゼによる管理解重合に基づくオリゴ糖の簡単な配列決定方法が開発された。選択的ＵＶ検出に組合せたＣＴＡ−ＳＡＸの分解能は分画化スキームの同定及び出発材料構造の推定を可能にする。ヘパリナーゼのようなリアーゼによる消化物の分析に基づく方法の弱点は、開裂中の不飽和結合の生成後にウロン酸が消滅するので（β−除去）ウロン酸の立体配置に関する構造が比較的不確実なことである（Ｙ．Ｋａｒｉｙａら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２３（１９９８）２４０−２４６）。ヘパリン二糖の立体配置及び結合に関する法則を考察するならばこの不確実性が実際にはかなり小さい。必要な場合には酸の立体配置をＮＭＲ法によって確認した。我々の配列決定方法は、ヘパリンオリゴ糖構造に対する我々の知識を向上させた。この方法は、基本的四糖の同定から開始し、次いで六糖及びそれ以上の多糖の同定を漸進的に継続する。図７は、十糖ΔＩｓ−Ｉｓｉｄ−Ｉｓｉｄ−ＩＩａｉｄ−ＩＩｓｇｌｕの配列決定例を示す。ヘパリナーゼ１を使用したとき、２つの部位：ΔＩｓ↓Ｉｓｉｄ↓Ｉｓｉｄ−ＩＩａｉｄ−ＩＩｓｇｌｕが開裂された。４つのフラグメントΔＩｓ−Ｉｓｉｄ−ＩＩａｉｄ−ＩＩｓｇｌｕ、ΔＩｓ−ＩＩａｉｄ−ＩＩｓｇｌｕ、ΔＩｓ−Ｉｓｉｄ及びΔｌｓの混合物を観察した。反応がさらに進行するのに伴って、ΔＩｓ−Ｉｓｉｄ−ＩＩａｉｄ−ＩＩｓｇｌｕがΔＩｓ−ＩＩａｉｄ−ＩＩｓｇｌｕ及びΔＩｓに開裂された。アセチル化画分は二重波長ＵＶ検出を使用して容易に検出された。ヘパリナーゼ２を使用すると、３つの部位、ΔＩｓ↓Ｉｓｉｄ↓Ｉｓｉｄ↓ＩＩａｉｄ−ＩＩｓｇｌｕが開裂された。これらの部位が開裂されたとき、残りのフラグメントはΔｌｌａ−ＩＩｓｇｌｕ及びΔＩｓであった。同定されたフラグメントの構造を考察すると、配列決定された十糖の可能な唯一の構造は、ΔＩｓ−Ｉｓｉｄ−Ｉｓｉｄ−ＩＩａｉｄ−ＩＩｓｇｌｕである。ΔＩｓ−Ｉｓｉｄ−ＩＩａｉｄ−ＩＩｓｇｌｕ−Ｉｓｉｄの配列決定は可能でない。その理由はこれらがヘパリナーゼ１開裂によって ΔＩｓ−Ｉｓｉｄのフラグメントを与えることができないからである。別の可能配列ΔＩｓ−ＩＩａｉｄ−ＩＩｓｇｌｕ−Ｉｓｉｄ−Ｉｓｉｄは、その八糖フラグメントＩｓ−Ｉｓｉｄ−ＩＩａｉｄ−ＩＩｓｇｌｕの認識及び出発十糖のアノマーパターンの双方によって除去された。
【０１１９】
本発明による定量方法では、混合物中に含有されていたすべての不飽和オリゴ糖が５５００ｍｏｌ−１．ｌ．ｃｍ−１に等しい同じモル吸光度を有しているという広く受け入れられている仮説を利用する。従って、出発低分子量ヘパリン中の解重合混合物の全ての構成成分の重量パーセンテージを決定することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】硫酸化二糖ΔＩｓのＵＶスペクトルをアセチル化二糖ΔＩａのＵＶスペクトルに比較したアセチル化オリゴ糖の選択的検出を示す。ｘ−軸は時間を分で示し、ｙ−軸はＵＶデテクタからのミリアンペアシグナルを表す。
【図２】ＣＴＡ−ＳＡＸカラムにおけるオリゴ糖アノマーの分離を示す。ｘ−軸は時間を分で示し、ｙ−軸はＵＶデテクタからのミリアンペアシグナルを表す。
【図３】ブタ腸ヘパリンの完全解重合によって得られた混合物中のオリゴ糖を分離するためのＧＰＣ／ＣＴＡ−ＳＡＸ結合の使用を示す。ｘ−軸は時間を分で示し、ｙ−軸はＵＶデテクタからのミリアンペアシグナルを表す。
【図４】Ｄ２０−４００ＭＨｚ中のΔＩｓ−ＩＩｓｅｐｏｘｙのＰｒｏｔｏｎスペクトル及びＣＯＳＹスペクトルを示す。主なクロスピークを、糖単位に対応する文字及びプロトン数ｚで標識する。
【図５】５ａ及び５ｂは、ブタ腸ヘパリンをヘパリナーゼ１で完全解重合して得られた混合物中のオリゴ糖を分離するためのＧＰＣ／ＣＴＡ−ＳＡＸ結合の使用を示す。ｘ−軸は時間を分で示し、ｙ−軸はＵＶデテクタからのミリアンペアシグナルを表す。
【図６】ブタ腸ヘパリンをヘパリナーゼ１で部分解重合して得られた混合物中のオリゴ糖を分離するためのＧＰＣ／ＣＴＡ−ＳＡＸ結合の使用を示す。ｘ−軸は時間を分で示し、ｙ−軸はＵＶデテクタからのミリアンペアシグナルを表す。
【図７】ΔＩｓ−Ｉｓｉｄ−Ｉｓｉｄ−ＩＩａｉｄ−ＩＩｓｇｌｕの配列決定を示す。ｘ−軸は時間を分で示し、ｙ−軸はＵＶデテクタからのミリアンペアシグナルを表す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴ糖の複合混合物のクロマトグラフィー分離及び分析のため、サンプルが第四アンモニウム塩をコートした逆相カラムを使用して分析される、ヘパリン、低分子量ヘパリン、超低分子量ヘパリン及びオリゴ糖から選択されたサンプルのアッセイ方法。
【請求項２】
逆相カラムがＣ８またはＣ１８カラムである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
二糖から十二糖までのすべてのオリゴ糖が検出される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第四アンモニウム塩をコートしたＣ８またはＣ１８逆相カラムを使用してサンプルが前処理なしに分析される請求項２に記載の方法。
【請求項５】
第四アンモニウム塩をコートしたＣ８またはＣ１８逆相カラムがセチルトリメチルアンモニウム−強アニオン交換（ＣＴＡ−ＳＡＸ）カラムである請求項２に記載の方法。
【請求項６】
第四アンモニウム塩をコートしたＣ８またはＣ１８逆相カラムがＣＴＡ−ＳＡＸカラムである請求項２に記載の方法。
【請求項７】
第四アンモニウム塩をコートしたＣ８またはＣ１８逆相カラムを使用するクロマトグラフィー分離に先立ってゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によってサンプルが分画化される請求項２に記載の方法。
【請求項８】
第四アンモニウム塩をコートしたＣ８またはＣ１８逆相カラムがＣＴＡ−ＳＡＸカラムである請求項７に記載の方法。
【請求項９】
第四アンモニウム塩をコートしたＣ８またはＣ１８逆相カラムを使用するクロマトグラフィー分離に先立ってサンプルが部分的にまたは全体的に解重合される請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
サンプルを解重合した後、第四アンモニウム塩をコートしたＣ８またはＣ１８逆相カラムを使用してクロマトグラフィー分離する前に、該サンプルが還元される請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
第四アンモニウム塩をコートしたＣ８またはＣ１８逆相カラムがＣＴＡ−ＳＡＸカラムである請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
第四アンモニウム塩をコートしたＣ８またはＣ１８逆相カラムがＣＴＡ−ＳＡＸカラムである請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）酵素的解重合によってサンプルを解重合させる段階、
（ｂ）解重合したサンプルを還元させる段階、及び
（ｃ）段階（ａ）及び／または段階（ｂ）のサンプルをＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラフィーによってアッセイする段階、
を含むヘパリン、低分子量ヘパリン、超低分子量ヘパリン及びオリゴ糖から選択されたサンプルのアッセイ方法。
【請求項１４】
少なくとも１つのヘパリナーゼを使用してサンプルが酵素的に解重合される請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも１つのヘパリナーゼがヘパリナーゼ１（ＥＣ ４．２．２．７）、ヘパリナーゼ２（ヘパリンリアーゼＩＩ）及びヘパリナーゼ３（ＥＣ ４．２．２．８）から選択される請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ヘパリナーゼ１（ＥＣ ４．２．２．７）、ヘパリナーゼ２（ヘパリンリアーゼＩＩ）及びヘパリナーゼ３（ＥＣ ４．２．２．８）を含むヘパリナーゼ混合物を使用してサンプルが酵素的に解重合される請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
ＮａＢＨ４またはホウ水素化アニオンのアルカリ金属塩によってサンプルが還元される請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
低分子量ヘパリンがエノキサパリンナトリウムである請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
サンプルがエノキサパリンナトリウムであり、１，６−無水形態でない前記エノキサパリンナトリウムの還元性末端が還元されるように前記サンプルが還元される請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
クロマトグラフィー分離が約２００ｎｍから約４００ｎｍの範囲の波長を有するＵＶ光に対し透明な移動相を使用する請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
クロマトグラフィー分離がメタンスルホネート塩を含む移動相を使用する請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
クロマトグラフィー分離が、メタンスルホン酸アンモニウムまたはメタンスルホン酸ナトリウムを含む移動相を使用する請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
第四アンモニウム塩をコートしたＣ８またはＣ１８逆相カラムにおけるクロマトグラフィーが約２．０から約７．０のｐＨで行われる請求項２に記載の方法。
【請求項２４】
第四アンモニウム塩をコートしたＣ８またはＣ１８逆相カラムにおけるクロマトグラフィーが約２．５から約３．０のｐＨで行われる請求項２に記載の方法。
【請求項２５】
第四アンモニウム塩をコートしたＣ８またはＣ１８逆相カラムにおけるクロマトグラフィーが、メタンスルホン酸の添加によってｐＨ約３及び／または２Ｍのメタンスルホン酸アンモニウムの添加によってｐＨ約２．５に調整された水を含む移動相で行われる請求項１２に記載の方法。
【請求項２６】
１，６−無水結合によって修飾された末端をもつオリゴ糖鎖の存在を検出する段階をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
アセチル化糖を検出する段階をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
アセチル化糖及び非アセチル化糖の双方に吸収される波長で測定した吸光度をアセチル化糖に吸収されるが非アセチル化糖には吸収されない波長で測定した吸光度から減算することによってアセチル化糖が検出される請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
アセチル化糖が選択的に検出される請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
検出されたアセチル化糖が、ΔＩＶａ、ΔＩＩａ、ΔＩＩＩａ、ΔＩａ、ΔＩＩａ−ＩＶｓｇｌｕ及びΔＩＩａ−ＩＩｓｇｌｕから選択された少なくとも１つのアセチル化オリゴ糖である請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
低分子量ヘパリンが、ＬｏｖｅｎｏｘＲＴＭ／ＣｌｅｘａｎｅＲＴＭ（エノキサパリンナトリウムインジェクション）を認定薬物として引用した出願に準じて規制当局による承認を求めるＬＭＷＨのいずれかである請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
カラムがオリゴ糖の定量用の第四アンモニウム塩をコートしたＣ８またはＣ１８の逆相樹脂を含んでいる、オリゴ糖の複合混合物を分離するためのクロマトグラフィーカラムの使用。
【請求項３３】
Ｃ８またはＣ１８の逆相樹脂がＨｙｐｅｒｓｉｌ ＢＤＳである請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
第四アンモニウム塩がセチルトリメチルアンモニウム硫酸水素塩である請求項３２に記載の使用。
【請求項３５】
前記分析が、以下の４つの糖：
【化１】
のいずれかから選択された少なくとも１つの糖の検出に導く請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
前記分析が、以下の糖：
【化２】
の検出に導く請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
前記分析が、以下の糖：
【化３】
のいずれかから選択された少なくとも１つの糖の検出に導く請求項１に記載の方法。
【請求項１】
オリゴ糖の複合混合物のクロマトグラフィー分離及び分析のため、サンプルが第四アンモニウム塩をコートした逆相カラムを使用して分析される、ヘパリン、低分子量ヘパリン、超低分子量ヘパリン及びオリゴ糖から選択されたサンプルのアッセイ方法。
【請求項２】
逆相カラムがＣ８またはＣ１８カラムである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
二糖から十二糖までのすべてのオリゴ糖が検出される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第四アンモニウム塩をコートしたＣ８またはＣ１８逆相カラムを使用してサンプルが前処理なしに分析される請求項２に記載の方法。
【請求項５】
第四アンモニウム塩をコートしたＣ８またはＣ１８逆相カラムがセチルトリメチルアンモニウム−強アニオン交換（ＣＴＡ−ＳＡＸ）カラムである請求項２に記載の方法。
【請求項６】
第四アンモニウム塩をコートしたＣ８またはＣ１８逆相カラムがＣＴＡ−ＳＡＸカラムである請求項２に記載の方法。
【請求項７】
第四アンモニウム塩をコートしたＣ８またはＣ１８逆相カラムを使用するクロマトグラフィー分離に先立ってゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によってサンプルが分画化される請求項２に記載の方法。
【請求項８】
第四アンモニウム塩をコートしたＣ８またはＣ１８逆相カラムがＣＴＡ−ＳＡＸカラムである請求項７に記載の方法。
【請求項９】
第四アンモニウム塩をコートしたＣ８またはＣ１８逆相カラムを使用するクロマトグラフィー分離に先立ってサンプルが部分的にまたは全体的に解重合される請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
サンプルを解重合した後、第四アンモニウム塩をコートしたＣ８またはＣ１８逆相カラムを使用してクロマトグラフィー分離する前に、該サンプルが還元される請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
第四アンモニウム塩をコートしたＣ８またはＣ１８逆相カラムがＣＴＡ−ＳＡＸカラムである請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
第四アンモニウム塩をコートしたＣ８またはＣ１８逆相カラムがＣＴＡ−ＳＡＸカラムである請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）酵素的解重合によってサンプルを解重合させる段階、
（ｂ）解重合したサンプルを還元させる段階、及び
（ｃ）段階（ａ）及び／または段階（ｂ）のサンプルをＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラフィーによってアッセイする段階、
を含むヘパリン、低分子量ヘパリン、超低分子量ヘパリン及びオリゴ糖から選択されたサンプルのアッセイ方法。
【請求項１４】
少なくとも１つのヘパリナーゼを使用してサンプルが酵素的に解重合される請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも１つのヘパリナーゼがヘパリナーゼ１（ＥＣ ４．２．２．７）、ヘパリナーゼ２（ヘパリンリアーゼＩＩ）及びヘパリナーゼ３（ＥＣ ４．２．２．８）から選択される請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ヘパリナーゼ１（ＥＣ ４．２．２．７）、ヘパリナーゼ２（ヘパリンリアーゼＩＩ）及びヘパリナーゼ３（ＥＣ ４．２．２．８）を含むヘパリナーゼ混合物を使用してサンプルが酵素的に解重合される請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
ＮａＢＨ４またはホウ水素化アニオンのアルカリ金属塩によってサンプルが還元される請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
低分子量ヘパリンがエノキサパリンナトリウムである請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
サンプルがエノキサパリンナトリウムであり、１，６−無水形態でない前記エノキサパリンナトリウムの還元性末端が還元されるように前記サンプルが還元される請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
クロマトグラフィー分離が約２００ｎｍから約４００ｎｍの範囲の波長を有するＵＶ光に対し透明な移動相を使用する請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
クロマトグラフィー分離がメタンスルホネート塩を含む移動相を使用する請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
クロマトグラフィー分離が、メタンスルホン酸アンモニウムまたはメタンスルホン酸ナトリウムを含む移動相を使用する請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
第四アンモニウム塩をコートしたＣ８またはＣ１８逆相カラムにおけるクロマトグラフィーが約２．０から約７．０のｐＨで行われる請求項２に記載の方法。
【請求項２４】
第四アンモニウム塩をコートしたＣ８またはＣ１８逆相カラムにおけるクロマトグラフィーが約２．５から約３．０のｐＨで行われる請求項２に記載の方法。
【請求項２５】
第四アンモニウム塩をコートしたＣ８またはＣ１８逆相カラムにおけるクロマトグラフィーが、メタンスルホン酸の添加によってｐＨ約３及び／または２Ｍのメタンスルホン酸アンモニウムの添加によってｐＨ約２．５に調整された水を含む移動相で行われる請求項１２に記載の方法。
【請求項２６】
１，６−無水結合によって修飾された末端をもつオリゴ糖鎖の存在を検出する段階をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
アセチル化糖を検出する段階をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
アセチル化糖及び非アセチル化糖の双方に吸収される波長で測定した吸光度をアセチル化糖に吸収されるが非アセチル化糖には吸収されない波長で測定した吸光度から減算することによってアセチル化糖が検出される請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
アセチル化糖が選択的に検出される請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
検出されたアセチル化糖が、ΔＩＶａ、ΔＩＩａ、ΔＩＩＩａ、ΔＩａ、ΔＩＩａ−ＩＶｓｇｌｕ及びΔＩＩａ−ＩＩｓｇｌｕから選択された少なくとも１つのアセチル化オリゴ糖である請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
低分子量ヘパリンが、ＬｏｖｅｎｏｘＲＴＭ／ＣｌｅｘａｎｅＲＴＭ（エノキサパリンナトリウムインジェクション）を認定薬物として引用した出願に準じて規制当局による承認を求めるＬＭＷＨのいずれかである請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
カラムがオリゴ糖の定量用の第四アンモニウム塩をコートしたＣ８またはＣ１８の逆相樹脂を含んでいる、オリゴ糖の複合混合物を分離するためのクロマトグラフィーカラムの使用。
【請求項３３】
Ｃ８またはＣ１８の逆相樹脂がＨｙｐｅｒｓｉｌ ＢＤＳである請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
第四アンモニウム塩がセチルトリメチルアンモニウム硫酸水素塩である請求項３２に記載の使用。
【請求項３５】
前記分析が、以下の４つの糖：
【化１】
のいずれかから選択された少なくとも１つの糖の検出に導く請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
前記分析が、以下の糖：
【化２】
の検出に導く請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
前記分析が、以下の糖：
【化３】
のいずれかから選択された少なくとも１つの糖の検出に導く請求項１に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２００７−５２３３５２（Ｐ２００７−５２３３５２Ａ）
【公表日】平成１９年８月１６日（２００７．８．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５００１８９（Ｐ２００７−５００１８９）
【出願日】平成１７年２月１８日（２００５．２．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００２５７５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８０４３８
【国際公開日】平成１７年９月１日（２００５．９．１）
【出願人】（５００１５２１１９）アバンテイス・フアルマ・エス・アー (65)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年８月１６日（２００７．８．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年２月１８日（２００５．２．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００２５７５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８０４３８
【国際公開日】平成１７年９月１日（２００５．９．１）
【出願人】（５００１５２１１９）アバンテイス・フアルマ・エス・アー (65)
【Ｆターム（参考）】
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