逆転写酵素を用いて切断構造を形成することによる標的核酸の検出のための方法
本発明は、サンプル中の標的核酸の存在の指標となるシグナルを発生させるための方法に関する。この組成物および方法は、逆転写酵素と、ヌクレアーゼと、上流プライマーと、下流プローブとを含む。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
逆転写酵素と、切断手段と、第一のオリゴヌクレオチドと、第二のオリゴヌクレオチドとを含む組成物。
【請求項２】
前記切断手段が５’ヌクレアーゼを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記５’ヌクレアーゼがＦＥＮ−１ヌクレアーゼである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＦＥＮ−１ヌクレアーゼがフラップ特異的ヌクレアーゼである、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＦＥＮ−１ヌクレアーゼが熱安定性である、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
前記逆転写酵素が熱安定性である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記第二のオリゴヌクレオチドの３’ヌクレオチドが保護基を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記第二のオリゴヌクレオチドがシグナルを提供し得る少なくとも１つの標識された部分を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記第二のオリゴヌクレオチドが１対の相互作用性シグナル発生標識部分を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記対の相互作用性シグナル発生標識部分が消光部分および蛍光部分を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記対の相互作用性シグナル発生標識部分のうちの少なくとも１つの部分が、前記第二のオリゴヌクレオチドの５’領域に機能的に連結されている、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの標識部分が、前記第二のオリゴヌクレオチドの５’領域に機能的に連結されている、請求項８に記載の組成物。
【請求項１３】
請求項１に記載の組成物とその包装材とを備えるキット。
【請求項１４】
前記切断手段が５’ヌクレアーゼを含む、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
前記５’ヌクレアーゼがＦＥＮ−１ヌクレアーゼである、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記第二のオリゴヌクレオチドの３’ヌクレオチドが保護基を有する、請求項１３に記載のキット。
【請求項１７】
前記第二のオリゴヌクレオチドがシグナルを提供し得る少なくとも１つの標識部分を含む、請求項１３に記載のキット。
【請求項１８】
前記第二のオリゴヌクレオチドが１対の相互作用性シグナル発生標識部分を含む、請求項１３に記載のキット。
【請求項１９】
前記対の相互作用性シグナル発生標識部分がクエンチャー部分と蛍光部分とを含む、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記対の相互作用性シグナル発生標識部分の少なくとも１つの部分が、前記第二のオリゴヌクレオチドの５’フラップに機能的に連結されている、請求項１８に記載のキット。
【請求項２１】
前記少なくとも１つの標識された部分が前記第二のオリゴヌクレオチドの５’フラップに機能的に連結されている、請求項１７に記載のキット。
【請求項２２】
標的核酸をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２３】
（ｉ）３’から５’の順序に、第一の領域と、伸長領域と、第二の領域とを含む標的核酸と、
（ｉｉ）前記標的核酸の前記第一の領域に対して少なくとも部分的に相補的である、第一のオリゴヌクレオチドと、
（ｉｉｉ）５’領域および３’領域を含む第二のオリゴヌクレオチドであって、前記３’領域が前記標的核酸の前記第二の領域に対して少なくとも部分的に相補的であり、前記５’領域が前記標的核酸に対して相補的でない第二のオリゴヌクレオチドと、
（ｉｖ）逆転写酵素と、
（ｖ）切断手段と
を含む組成物。
【請求項２４】
請求項２３の組成物と、その包装材とを備えるキット。
【請求項２５】
（ｉ）３’から５’の順序に、第一の領域と、伸長領域と、第二の領域とを含む標的核酸と、
（ｉｉ）前記標的核酸の前記第一の領域に対して少なくとも部分的に相補的である、第一のオリゴヌクレオチドと、
（ｉｉｉ）前記標的核酸に対応する第二のオリゴヌクレオチドであって、前記第二のオリゴヌクレオチドは５’領域および３’領域を含み、前記３’領域が前記標的核酸の前記第二の領域に対して少なくとも部分的に相補的であり、かつ、前記５’領域が前記標的核酸の前記第一の領域の上流、下流、または前記第一の領域を含んでもよい領域に対して少なくとも部分的に相補的である第二のオリゴヌクレオチドと、
（ｉｖ）逆転写酵素と、
（ｖ）切断手段と
を含む組成物。
【請求項２６】
請求項２５の組成物と、その包装材とを備えるキット。
【請求項２７】
前記逆転写酵素が、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）ＲＴ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＲＴ、トリ肉腫白血病ウイルス（ＡＳＬＶ）ＲＴ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＲＴ、ニワトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）ＲＴ、ニワトリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）ヘルパーウイルスＭＣＡＶ ＲＴ、ニワトリ骨髄球腫症ウイルスＭＣ２９ヘルパーウイルスＭＣＡＶ ＲＴ、ニワトリ細網内皮症ウイルス（ＲＥＶ−Ｔ）ヘルパーウイルスＲＥＶ−Ａ ＲＴ、トリ肉腫ウイルスＵＲ２ヘルパーウイルスＵＲ２ＡＶ ＲＴ、トリ肉腫ウイルスＹ７３ヘルパーウイルスＹＡＶ ＲＴ、ラウス随伴ウイルス（ＲＡＶ）ＲＴ、および骨髄芽球症随伴ウイルス（ＭＡＶ）ＲＴからなる群より選択される、請求項１、２３または２５に記載の組成物。
【請求項２８】
サンプル中の標的核酸の存在の指標となるシグナルを発生させる方法であって、標的核酸配列を含むサンプルと、逆転写酵素とをインキュベートすることによって切断構造を形成するステップと、切断剤を用いて切断構造を切断してシグナルを発生させるステップとを含み、前記シグナルの発生は、前記サンプル中の標的核酸配列の存在の指標である方法。
【請求項２９】
標的核酸配列を検出または測定する方法であって、標的核酸配列を含むサンプルと、逆転写酵素とをインキュベートすることによって切断構造を形成するステップと、切断剤を用いて切断構造を切断して核酸フラグメントを遊離するステップと、前記サンプル中の標的核酸の存在の指標として前記フラグメントの遊離を検出および／または測定するステップとを含む、方法。
【請求項３０】
前記逆転写酵素が熱安定性である、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記逆転写酵素が、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）ＲＴ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＲＴ、トリ肉腫白血病ウイルス（ＡＳＬＶ）ＲＴ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＲＴ、ニワトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）ＲＴ、ニワトリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）ヘルパーウイルスＭＣＡＶ ＲＴ、ニワトリ骨髄球腫症ウイルスＭＣ２９ヘルパーウイルスＭＣＡＶ ＲＴ、ニワトリ細網内皮症ウイルス（ＲＥＶ−Ｔ）ヘルパーウイルスＲＥＶ−Ａ ＲＴ、トリ肉腫ウイルスＵＲ２ヘルパーウイルスＵＲ２ＡＶ ＲＴ、トリ肉腫ウイルスＹ７３ヘルパーウイルスＹＡＶ ＲＴ、ラウス随伴ウイルス（ＲＡＶ）ＲＴ、および骨髄芽球症随伴ウイルス（ＭＡＶ）ＲＴからなる群より選択される、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記切断剤がＦＥＮヌクレアーゼである、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＦＥＮヌクレアーゼがフラップ特異的なヌクレアーゼである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＦＥＮヌクレアーゼが熱安定性である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
シグナルを提供し得る少なくとも１つの標識された部分を含む前記切断構造が形成される、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３６】
請求項３２に記載の方法であって、検出可能なシグナルを消光するように効率的に位置決めされた１対の相互作用性シグナル発生標識部分を含む切断構造が形成され、前記標識部分がＦＥＮヌクレアーゼ切断に対して感受性の部位によって隔てられ、ＦＥＮヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性が、ＦＥＮヌクレアーゼに感受性である部位を切断することにより、前記第二の相互作用性シグナル発生標識部分から第一の相互作用性シグナル発生標識部分を分離することを可能にし、これによって検出可能シグナルが発生する、方法。
【請求項３７】
前記相互作用性シグナル発生標識部分の対がクエンチャー部分と蛍光部分とを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
サンプル中の標的核酸配列を検出するための方法であって、
上流プライマーと、下流プローブと、逆転写酵素と、切断剤と、標的核酸とを以下のステップを可能にする条件下で混合するステップと、
（ｉ）上流プライマーと下流プローブとのアニーリングステップと、
（ｉｉ）上流プライマーを伸長するステップと、ここで、前記逆転写酵素がプライマー伸長産物を合成し、下流プローブとともに切断構造を形成し、
（ｉｉｉ）前記切断剤で前記切断構造を切断して、検出可能シグナルを発生させるステップと、
前記シグナルを検出および／または測定するステップと
を含む方法。
【請求項３９】
前記切断剤がＦＥＮヌクレアーゼである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記逆転写酵素が熱安定性である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記逆転写酵素が、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）ＲＴ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＲＴ、トリ肉腫白血病ウイルス（ＡＳＬＶ）ＲＴ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＲＴ、ニワトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）ＲＴ、ニワトリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）ヘルパーウイルスＭＣＡＶ ＲＴ、ニワトリ骨髄球腫症ウイルスＭＣ２９ヘルパーウイルスＭＣＡＶ ＲＴ、ニワトリ細網内皮症ウイルス（ＲＥＶ−Ｔ）ヘルパーウイルスＲＥＶ−Ａ ＲＴ、トリ肉腫ウイルスＵＲ２ヘルパーウイルスＵＲ２ＡＶ ＲＴ、トリ肉腫ウイルスＹ７３ヘルパーウイルスＹＡＶ ＲＴ、ラウス随伴ウイルス（ＲＡＶ）ＲＴ、および骨髄芽球症随伴ウイルス（ＭＡＶ）ＲＴからなる群より選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＦＥＮヌクレアーゼが熱安定性である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＦＥＮヌクレアーゼがフラップ特異的なヌクレアーゼである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
前記下流プローブが５’領域および３’領域を含み、前記３’領域が前記標的核酸に対して少なくとも部分的に相補的であり、かつ前記５’領域がフラップを形成する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
標的核酸を検出するための方法であって、
（ａ）標的核酸の第一の領域に対して少なくとも部分的に相補性である上流プライマーと、
５’領域および３’領域を含み、前記３’領域が前記標的核酸の第二の領域に対して少なくとも部分的に相補的である下流オリゴヌクレオチドと
を提供するステップと、
（ｂ）前記標的核酸と、上流プライマーと、下流オリゴヌクレオチドとを、標的核酸と上流プライマーと下流オリゴヌクレオチドの３’領域との間の二本鎖の形成を可能にする条件下で混合するステップと、
（ｃ）逆転写酵素の重合化活性による相補的ＤＮＡ鎖の重合によって、標的の伸長領域が切断構造を形成するために十分な長さにまで上流プライマーを伸長することができる反応条件下で、前記二本鎖を逆転写酵素の重合化活性に対して供するステップと、
（ｄ）第一の切断構造の形成に伴って、下流オリゴヌクレオチド内に位置する部位において前記切断構造の切断が生じるような条件下で切断剤を提供するステップと、これによって前記下流オリゴヌクレオチドの切断が可能となり、
（ｅ）下流オリゴヌクレオチドの切断を検出するステップと
を含む方法。
【請求項４６】
前記プライマーおよび下流オリゴヌクレオチドが、標的核酸の非重複領域にハイブリダイズする、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記切断剤がＦＥＮヌクレアーゼである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記逆転写酵素の重合化活性が鎖置換活性を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記方法が、等温条件下で行われる、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記逆転写酵素が、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）ＲＴ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＲＴ、トリ肉腫白血病ウイルス（ＡＳＬＶ）ＲＴ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＲＴ、ニワトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）ＲＴ、ニワトリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）ヘルパーウイルスＭＣＡＶ ＲＴ、ニワトリ骨髄球腫症ウイルスＭＣ２９ヘルパーウイルスＭＣＡＶ ＲＴ、ニワトリ細網内皮症ウイルス（ＲＥＶ−Ｔ）ヘルパーウイルスＲＥＶ−Ａ ＲＴ、トリ肉腫ウイルスＵＲ２ヘルパーウイルスＵＲ２ＡＶ ＲＴ、トリ肉腫ウイルスＹ７３ヘルパーウイルスＹＡＶ ＲＴ、ラウス随伴ウイルス（ＲＡＶ）ＲＴ、および骨髄芽球症随伴ウイルス（ＭＡＶ）ＲＴからなる群より選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
前記逆転写酵素の重合化活性が、切断構造を形成するのに十分な長さの伸長領域に対して相補的なヌクレオチドを重合化し、前記重合化された相補的核酸はその３’末端で二本鎖における下流オリゴヌクレオチドに対して隣接する、請求項４５に記載の方法。
【請求項５２】
前記逆転写酵素活性が、切断構造を形成するのに十分な長さの伸長領域に対して相補的なヌクレオチドを重合化し、前記伸長領域の長さは前記伸長領域の長さが完全な二本鎖核酸であるような長さである、請求項４５に記載の方法。
【請求項５３】
前記下流プローブの５’領域が５’フラップを形成する、請求項４５に記載の方法。
【請求項１】
逆転写酵素と、切断手段と、第一のオリゴヌクレオチドと、第二のオリゴヌクレオチドとを含む組成物。
【請求項２】
前記切断手段が５’ヌクレアーゼを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記５’ヌクレアーゼがＦＥＮ−１ヌクレアーゼである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＦＥＮ−１ヌクレアーゼがフラップ特異的ヌクレアーゼである、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＦＥＮ−１ヌクレアーゼが熱安定性である、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
前記逆転写酵素が熱安定性である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記第二のオリゴヌクレオチドの３’ヌクレオチドが保護基を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記第二のオリゴヌクレオチドがシグナルを提供し得る少なくとも１つの標識された部分を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記第二のオリゴヌクレオチドが１対の相互作用性シグナル発生標識部分を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記対の相互作用性シグナル発生標識部分が消光部分および蛍光部分を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記対の相互作用性シグナル発生標識部分のうちの少なくとも１つの部分が、前記第二のオリゴヌクレオチドの５’領域に機能的に連結されている、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの標識部分が、前記第二のオリゴヌクレオチドの５’領域に機能的に連結されている、請求項８に記載の組成物。
【請求項１３】
請求項１に記載の組成物とその包装材とを備えるキット。
【請求項１４】
前記切断手段が５’ヌクレアーゼを含む、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
前記５’ヌクレアーゼがＦＥＮ−１ヌクレアーゼである、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記第二のオリゴヌクレオチドの３’ヌクレオチドが保護基を有する、請求項１３に記載のキット。
【請求項１７】
前記第二のオリゴヌクレオチドがシグナルを提供し得る少なくとも１つの標識部分を含む、請求項１３に記載のキット。
【請求項１８】
前記第二のオリゴヌクレオチドが１対の相互作用性シグナル発生標識部分を含む、請求項１３に記載のキット。
【請求項１９】
前記対の相互作用性シグナル発生標識部分がクエンチャー部分と蛍光部分とを含む、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記対の相互作用性シグナル発生標識部分の少なくとも１つの部分が、前記第二のオリゴヌクレオチドの５’フラップに機能的に連結されている、請求項１８に記載のキット。
【請求項２１】
前記少なくとも１つの標識された部分が前記第二のオリゴヌクレオチドの５’フラップに機能的に連結されている、請求項１７に記載のキット。
【請求項２２】
標的核酸をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２３】
（ｉ）３’から５’の順序に、第一の領域と、伸長領域と、第二の領域とを含む標的核酸と、
（ｉｉ）前記標的核酸の前記第一の領域に対して少なくとも部分的に相補的である、第一のオリゴヌクレオチドと、
（ｉｉｉ）５’領域および３’領域を含む第二のオリゴヌクレオチドであって、前記３’領域が前記標的核酸の前記第二の領域に対して少なくとも部分的に相補的であり、前記５’領域が前記標的核酸に対して相補的でない第二のオリゴヌクレオチドと、
（ｉｖ）逆転写酵素と、
（ｖ）切断手段と
を含む組成物。
【請求項２４】
請求項２３の組成物と、その包装材とを備えるキット。
【請求項２５】
（ｉ）３’から５’の順序に、第一の領域と、伸長領域と、第二の領域とを含む標的核酸と、
（ｉｉ）前記標的核酸の前記第一の領域に対して少なくとも部分的に相補的である、第一のオリゴヌクレオチドと、
（ｉｉｉ）前記標的核酸に対応する第二のオリゴヌクレオチドであって、前記第二のオリゴヌクレオチドは５’領域および３’領域を含み、前記３’領域が前記標的核酸の前記第二の領域に対して少なくとも部分的に相補的であり、かつ、前記５’領域が前記標的核酸の前記第一の領域の上流、下流、または前記第一の領域を含んでもよい領域に対して少なくとも部分的に相補的である第二のオリゴヌクレオチドと、
（ｉｖ）逆転写酵素と、
（ｖ）切断手段と
を含む組成物。
【請求項２６】
請求項２５の組成物と、その包装材とを備えるキット。
【請求項２７】
前記逆転写酵素が、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）ＲＴ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＲＴ、トリ肉腫白血病ウイルス（ＡＳＬＶ）ＲＴ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＲＴ、ニワトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）ＲＴ、ニワトリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）ヘルパーウイルスＭＣＡＶ ＲＴ、ニワトリ骨髄球腫症ウイルスＭＣ２９ヘルパーウイルスＭＣＡＶ ＲＴ、ニワトリ細網内皮症ウイルス（ＲＥＶ−Ｔ）ヘルパーウイルスＲＥＶ−Ａ ＲＴ、トリ肉腫ウイルスＵＲ２ヘルパーウイルスＵＲ２ＡＶ ＲＴ、トリ肉腫ウイルスＹ７３ヘルパーウイルスＹＡＶ ＲＴ、ラウス随伴ウイルス（ＲＡＶ）ＲＴ、および骨髄芽球症随伴ウイルス（ＭＡＶ）ＲＴからなる群より選択される、請求項１、２３または２５に記載の組成物。
【請求項２８】
サンプル中の標的核酸の存在の指標となるシグナルを発生させる方法であって、標的核酸配列を含むサンプルと、逆転写酵素とをインキュベートすることによって切断構造を形成するステップと、切断剤を用いて切断構造を切断してシグナルを発生させるステップとを含み、前記シグナルの発生は、前記サンプル中の標的核酸配列の存在の指標である方法。
【請求項２９】
標的核酸配列を検出または測定する方法であって、標的核酸配列を含むサンプルと、逆転写酵素とをインキュベートすることによって切断構造を形成するステップと、切断剤を用いて切断構造を切断して核酸フラグメントを遊離するステップと、前記サンプル中の標的核酸の存在の指標として前記フラグメントの遊離を検出および／または測定するステップとを含む、方法。
【請求項３０】
前記逆転写酵素が熱安定性である、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記逆転写酵素が、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）ＲＴ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＲＴ、トリ肉腫白血病ウイルス（ＡＳＬＶ）ＲＴ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＲＴ、ニワトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）ＲＴ、ニワトリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）ヘルパーウイルスＭＣＡＶ ＲＴ、ニワトリ骨髄球腫症ウイルスＭＣ２９ヘルパーウイルスＭＣＡＶ ＲＴ、ニワトリ細網内皮症ウイルス（ＲＥＶ−Ｔ）ヘルパーウイルスＲＥＶ−Ａ ＲＴ、トリ肉腫ウイルスＵＲ２ヘルパーウイルスＵＲ２ＡＶ ＲＴ、トリ肉腫ウイルスＹ７３ヘルパーウイルスＹＡＶ ＲＴ、ラウス随伴ウイルス（ＲＡＶ）ＲＴ、および骨髄芽球症随伴ウイルス（ＭＡＶ）ＲＴからなる群より選択される、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記切断剤がＦＥＮヌクレアーゼである、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＦＥＮヌクレアーゼがフラップ特異的なヌクレアーゼである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＦＥＮヌクレアーゼが熱安定性である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
シグナルを提供し得る少なくとも１つの標識された部分を含む前記切断構造が形成される、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３６】
請求項３２に記載の方法であって、検出可能なシグナルを消光するように効率的に位置決めされた１対の相互作用性シグナル発生標識部分を含む切断構造が形成され、前記標識部分がＦＥＮヌクレアーゼ切断に対して感受性の部位によって隔てられ、ＦＥＮヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性が、ＦＥＮヌクレアーゼに感受性である部位を切断することにより、前記第二の相互作用性シグナル発生標識部分から第一の相互作用性シグナル発生標識部分を分離することを可能にし、これによって検出可能シグナルが発生する、方法。
【請求項３７】
前記相互作用性シグナル発生標識部分の対がクエンチャー部分と蛍光部分とを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
サンプル中の標的核酸配列を検出するための方法であって、
上流プライマーと、下流プローブと、逆転写酵素と、切断剤と、標的核酸とを以下のステップを可能にする条件下で混合するステップと、
（ｉ）上流プライマーと下流プローブとのアニーリングステップと、
（ｉｉ）上流プライマーを伸長するステップと、ここで、前記逆転写酵素がプライマー伸長産物を合成し、下流プローブとともに切断構造を形成し、
（ｉｉｉ）前記切断剤で前記切断構造を切断して、検出可能シグナルを発生させるステップと、
前記シグナルを検出および／または測定するステップと
を含む方法。
【請求項３９】
前記切断剤がＦＥＮヌクレアーゼである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記逆転写酵素が熱安定性である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記逆転写酵素が、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）ＲＴ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＲＴ、トリ肉腫白血病ウイルス（ＡＳＬＶ）ＲＴ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＲＴ、ニワトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）ＲＴ、ニワトリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）ヘルパーウイルスＭＣＡＶ ＲＴ、ニワトリ骨髄球腫症ウイルスＭＣ２９ヘルパーウイルスＭＣＡＶ ＲＴ、ニワトリ細網内皮症ウイルス（ＲＥＶ−Ｔ）ヘルパーウイルスＲＥＶ−Ａ ＲＴ、トリ肉腫ウイルスＵＲ２ヘルパーウイルスＵＲ２ＡＶ ＲＴ、トリ肉腫ウイルスＹ７３ヘルパーウイルスＹＡＶ ＲＴ、ラウス随伴ウイルス（ＲＡＶ）ＲＴ、および骨髄芽球症随伴ウイルス（ＭＡＶ）ＲＴからなる群より選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＦＥＮヌクレアーゼが熱安定性である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＦＥＮヌクレアーゼがフラップ特異的なヌクレアーゼである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
前記下流プローブが５’領域および３’領域を含み、前記３’領域が前記標的核酸に対して少なくとも部分的に相補的であり、かつ前記５’領域がフラップを形成する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
標的核酸を検出するための方法であって、
（ａ）標的核酸の第一の領域に対して少なくとも部分的に相補性である上流プライマーと、
５’領域および３’領域を含み、前記３’領域が前記標的核酸の第二の領域に対して少なくとも部分的に相補的である下流オリゴヌクレオチドと
を提供するステップと、
（ｂ）前記標的核酸と、上流プライマーと、下流オリゴヌクレオチドとを、標的核酸と上流プライマーと下流オリゴヌクレオチドの３’領域との間の二本鎖の形成を可能にする条件下で混合するステップと、
（ｃ）逆転写酵素の重合化活性による相補的ＤＮＡ鎖の重合によって、標的の伸長領域が切断構造を形成するために十分な長さにまで上流プライマーを伸長することができる反応条件下で、前記二本鎖を逆転写酵素の重合化活性に対して供するステップと、
（ｄ）第一の切断構造の形成に伴って、下流オリゴヌクレオチド内に位置する部位において前記切断構造の切断が生じるような条件下で切断剤を提供するステップと、これによって前記下流オリゴヌクレオチドの切断が可能となり、
（ｅ）下流オリゴヌクレオチドの切断を検出するステップと
を含む方法。
【請求項４６】
前記プライマーおよび下流オリゴヌクレオチドが、標的核酸の非重複領域にハイブリダイズする、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記切断剤がＦＥＮヌクレアーゼである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記逆転写酵素の重合化活性が鎖置換活性を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記方法が、等温条件下で行われる、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記逆転写酵素が、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）ＲＴ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＲＴ、トリ肉腫白血病ウイルス（ＡＳＬＶ）ＲＴ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＲＴ、ニワトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）ＲＴ、ニワトリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）ヘルパーウイルスＭＣＡＶ ＲＴ、ニワトリ骨髄球腫症ウイルスＭＣ２９ヘルパーウイルスＭＣＡＶ ＲＴ、ニワトリ細網内皮症ウイルス（ＲＥＶ−Ｔ）ヘルパーウイルスＲＥＶ−Ａ ＲＴ、トリ肉腫ウイルスＵＲ２ヘルパーウイルスＵＲ２ＡＶ ＲＴ、トリ肉腫ウイルスＹ７３ヘルパーウイルスＹＡＶ ＲＴ、ラウス随伴ウイルス（ＲＡＶ）ＲＴ、および骨髄芽球症随伴ウイルス（ＭＡＶ）ＲＴからなる群より選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
前記逆転写酵素の重合化活性が、切断構造を形成するのに十分な長さの伸長領域に対して相補的なヌクレオチドを重合化し、前記重合化された相補的核酸はその３’末端で二本鎖における下流オリゴヌクレオチドに対して隣接する、請求項４５に記載の方法。
【請求項５２】
前記逆転写酵素活性が、切断構造を形成するのに十分な長さの伸長領域に対して相補的なヌクレオチドを重合化し、前記伸長領域の長さは前記伸長領域の長さが完全な二本鎖核酸であるような長さである、請求項４５に記載の方法。
【請求項５３】
前記下流プローブの５’領域が５’フラップを形成する、請求項４５に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３Ａ−３Ｅ】
【図３Ｆ−３Ｈ】
【図４】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２Ａ．１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１２Ｄ】
【図１２Ｅ】
【図１２Ｆ】
【図１２Ｇ】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３Ａ−３Ｅ】
【図３Ｆ−３Ｈ】
【図４】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２Ａ．１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１２Ｄ】
【図１２Ｅ】
【図１２Ｆ】
【図１２Ｇ】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２００９−５４０８６７（Ｐ２００９−５４０８６７Ａ）
【公表日】平成２１年１１月２６日（２００９．１１．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５２２７５６（Ｐ２００９−５２２７５６）
【出願日】平成１９年６月２２日（２００７．６．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１４５９０
【国際公開番号】ＷＯ２００９／００８８５４
【国際公開日】平成２１年１月１５日（２００９．１．１５）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
【出願人】（３０２０１９８０９）ストラタジーン カリフォルニア (23)
【氏名又は名称原語表記】Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１１月２６日（２００９．１１．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年６月２２日（２００７．６．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１４５９０
【国際公開番号】ＷＯ２００９／００８８５４
【国際公開日】平成２１年１月１５日（２００９．１．１５）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
【出願人】（３０２０１９８０９）ストラタジーン カリフォルニア (23)
【氏名又は名称原語表記】Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ
【Ｆターム（参考）】
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