造血を促進する分子
本発明は、ＥＰＯ模倣ペプチド、ならびに多価および／または超価ペプチドの生成のための特別な合成方法に関する。本発明のある態様によると、ＥＰＯ受容体に結合することができ、アゴニスト活性を含む、少なくとも長さ１０アミノ酸のペプチドが提供される。したがって、ペプチドは、ＥＰＯ模倣特性を示す。本発明のＥＰＯ模倣ペプチドは、ＥＰＯ模倣ペプチドの、一般に１０位と呼ばれる位置にプロリンを含まず、正に荷電したアミノ酸を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エリスロポイエチン受容体のための結合分子としてのペプチド、その調製方法、これらのペプチドを含有する医薬品、および選択された指示における、好ましくは種々の形態の貧血および脳卒中の治療のための、それらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホルモン、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）は、１６５個のアミノ酸によって構成され、４つの糖化部位を有する糖タンパク質である。４つの複雑な炭水化物側鎖は、約３５ｋＤの全体の分子量の４０パーセントを構成する。ＥＰＯは腎臓で形成され、そこから脾臓および骨髄に移動し、そこで赤血球の生成を刺激する。慢性腎疾患において、減少したＥＰＯ生成は、赤血球減少貧血を生じる。遺伝子工学によって調製した組換えＥＰＯを用いて、貧血を効果的に治療することができる。ＥＰＯは、透析患者の生活の質を向上させる。腎性貧血だけでなく、早産新生児における貧血、炎症および腫瘍関連貧血もまた、組換えＥＰＯによって改善することができる。ＥＰＯによって、腫瘍患者において、よりうまく高投与量化学療法を行うことができる。同様に、ＥＰＯは、放射線療法の範囲内で投与される場合、癌患者の回復を向上する。
【０００３】
ＥＰＯを用いた治療において、タンパク質が体内で比較的迅速に分解されるので、必要とされる投与計画が頻繁または継続的な静脈内または皮下適用に基づく点に問題がある。したがって、組換えＥＰＯ由来分子の発展は、安定性、およびしたがって生物学的半減期を増大させるために、例えばさらなる糖化またはペグ化によって、糖タンパク質を選択的に修飾することに向かっている。
【０００４】
組換えＥＰＯでの治療に関連する別の重要な問題は、治療の間に患者が組換えＥＰＯに対する抗体を発生する危険性である。これは、組換えＥＰＯが内在性ＥＰＯと完全に同一ではないためである。一旦抗体形成が誘導されると、これは内在性エリスロポイエチンの活性の障害にもなる抗体につながることがある。これはしばしば、治療に必要な組換えＥＰＯの投与量を増大させる。特に、かかる抗体が内在性ＥＰＯの障害になる場合、この効果は、治療誘導性自己免疫疾患と解釈することができる。これは、例えば数ヶ月または数年のＥＰＯ治療後に腎臓移植を受ける透析患者の場合に、特に望まれていない。このとき抗体は、移植によって生成される内在性ＥＰＯの活性の障害となることがあり、したがって移植された器官の赤血球形成活性の障害となることがある。現在、生物学的半減期を増大させるために組換えＥＰＯ中で導入された修飾がこの問題を悪化させるか改善させるかは、未決問題である。一般に、広範囲な修飾およびより長い半減期が、この問題のある特性を悪化させると予想される。
【０００５】
代替的戦略は、エリスロポイエチンと配列相同性または構造的関係を共有しないアミノ酸からの合成ペプチドの調製である。エリスロポイエチンより有意に小さい、ＥＰＯの配列と関連のないペプチドが、アゴニストとして作用することができることが示された（非特許文献１）。同じ著者が、かかるペプチドがトランケートされて、依然として活性のある長さ１０アミノ酸の最小のペプチドになることができることを示した。
【０００６】
ＥＰＯの活性を模倣する合成ペプチドは、特許文献１の対象である。これは、好ましくは、一般に１０および１７位と呼ばれる、一方が必須と考えられる位置で２つのプロリンを含む、１０〜４０アミノ酸の明確なコンセンサスの模倣ペプチドを開示している。
【０００７】
したがって、現在までのところ、ＥＰＯ受容体のすべての小ペプチドベースのアゴニストは、非常に活性のあるエリスロポイエチン模倣ペプチドＥＭＰ１中の位置を参照して通常１０および１７位と番号付けられる定義された位置に、少なくとも１つのプロリン、しばしば２つのプロリン残基を含む構造を有してきた（特許文献１、非特許文献１、非特許文献２）。
【０００８】
【化１０】
これらのプロリンは、ペプチドの効果に不可欠であると考えられている。１７位のプロリンに関しては、これは受容体との相互作用によって実証されているが、１０位のプロリンは分子の正しい折りたたみに必要であると考えられた（非特許文献２、非特許文献３も参照のこと）。プロリンの特異的立体化学的特性によって支持される、正しい折りたたみは、通常、生物学的活性の、必要な前提条件である。一般に、プロリンは、（この場合のように）しばしばヘアピン構造およびβターンの形成に関係する、構造形成アミノ酸である。この特性のために、とりわけ、これは、プロリン含有ペプチド／タンパク質を破壊するポストプロリン特異的エンドペプチダーゼの頻繁な攻撃の点である。多数の内在性ペプチドホルモン（アンギオテンシンＩおよびＩＩ、ウロテンシン、チレオリベリン、他の分泌刺激因子等）が、かかる「シングルヒット」ポストプロリン切断によって不活性化される。したがって、プロリン含有ＥＰＯ模倣ペプチドの半減期は、これらの頻繁で活性のある酵素の活性によって短縮される。
【０００９】
そのようなペプチドは化学的に生成することができ、定義された質および同一性で生成物を制御および生じるのがより一層難しい組換え生成を必要としない。かかる小さいサイズのペプチドの化学的生成はまた、生産コストの見地からも競合的であることができる。さらに、化学的生成によって、生物学的半減期を増大させる公知の能力を有することができる糖化、ペグ化、または任意の他の定義された修飾等の、定義された分子変化の導入を可能にする。しかしながら、これまで、既存のＥＰＯ模倣ペプチドを用いたいかなる療法も認可されていない。
【特許文献１】国際公開第９６／４０７４９号パンフレット
【非特許文献１】Ｗｈｉｇｈｔｏｎ ＮＣ，Ｆｒｒｅｌｌ ＦＸ，Ｃｈａｎｇ Ｒ，Ｋａｓｈｙａｐ ＡＫ，Ｂａｒｂｏｎｅ ＦＰ，Ｍｕｌｃａｈｙ ＬＳ，Ｊｏｈｎｓｏｎ ＤＬ，Ｂａｒｒｅｔｔ ＲＷ，Ｊｏｌｌｉｆｆｅ ＬＫ，Ｄｏｗｅｒ ＷＪ（１９９６）Ｓｍａｌｌ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ Ｐｏｔｅｎｔ Ｍｉｍｅｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：４５８−４６３
【非特許文献２】Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｄ．Ｌ．，Ｆ．Ｘ．Ｆａｒｒｅｌｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）．「Ａｍｉｎｏ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｍｉｍｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｔｉｅｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ．」Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４：９３９−９５０
【非特許文献３】Ｗｈｉｇｈｔｏｎ ＮＣ，Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ Ｐ，Ｂａｒｂｏｎｅ ＦＰ，Ｋａｓｈｙａｐ ＡＫ，Ｆｒｒｅｌｌ ＦＸ，Ｊｏｌｌｉｆｆｅ Ｌ，Ｂａｒｒｅｔｔ ＲＷ，Ｄｏｗｅｒ ＷＪ（１９９７）Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｐｏｔｅｎｃｙ ｏｆ ａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｍｅｔｉｃ ｔｈｒｏｕｇｈ ｃｏｖａｌｅｎｄ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：１２６１−１２６５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、本発明の目的は、少なくとも天然のＥＰＯの生物学的活性の必須の部分を示す、代替的合成ペプチドを提供すること、およびしたがって、特に貧血または脳卒中の治療のための、効率的な治療戦略の代替的手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明のある態様によると、ＥＰＯ受容体に結合することができ、アゴニスト活性を含む、少なくとも長さ１０アミノ酸のペプチドが提供される。したがって、ペプチドは、ＥＰＯ模倣特性を示す。本発明のＥＰＯ模倣ペプチドは、ＥＰＯ模倣ペプチドの、一般に１０位と呼ばれる位置にプロリンを含まず、正に荷電したアミノ酸を含む（番号付けに関しては、例えばＥＭＰ１の祖先配列について記載しているＪｏｈｎｓｏｎら、１９９７年を参照されたい）。
【００１２】
前記１０位のプロリンは、ある折りたたみ構造に特徴的なアミノ酸モチーフ、すなわちβターンモチーフ中に位置する（Ｊｏｈｎｓｏｎ、１９９７年を参照されたい）。前記βターン構造は、受容体結合のときに生じる。したがって、本発明のＥＰＯ模倣ペプチドは、１０位でβターンモチーフ中にプロリンを含まないが、正に荷電したアミノ酸を含む。例は、Ｋ、Ｒ、Ｈ、または例えばホモアルギニン等の、それぞれの非天然アミノ酸である。
【００１３】
さらに、以下のアミノ酸の配列を含むペプチドが提供される。
【００１４】
【化１１】
配列中、各アミノ酸は、天然または非天然アミノ酸から選択され、
Ｘ６はＣ、Ａ、Ｅ、α−アミノ−γ−ブロモ酪酸もしくはホモシステイン（ｈｏｃ）であり、
Ｘ７はＲ、Ｈ、Ｌ、ＷもしくはＹもしくはＳであり、
Ｘ８はＭ、Ｆ、Ｉ、ホモセリンメチルエーテル（ｈｓｍ）もしくはノルイソロイシンであり、
Ｘ９はＧ、もしくはＧの保存的交換であり、
Ｘ１０はプロリンの非保存的交換であるか、
またはＸ９およびＸ１０は単一のアミノ酸によって置換され、
Ｘ１１は任意のアミノ酸から独立して選択され、
Ｘ１２はＴもしくはＡであり、
Ｘ１３はＷ、１−ｎａｌ、２−ｎａｌ、ＡもしくはＦであり、
Ｘ１４はＤ、Ｅ、Ｉ、ＬもしくはＶであり、
Ｘ１５はＣ、Ａ、Ｋ、α−アミノ−γ−ブロモ酪酸もしくはホモシステイン（ｈｏｃ）であり、
ただしＸ６もしくはＸ１５のいずれかはＣもしくはｈｏｃである。
【００１５】
記載されるペプチドコンセンサスの長さは、好ましくは１０〜４０または５０または６０アミノ酸の間である。上述の、長さ６０アミノ酸のペプチドは、技術的には適しているものの、ペプチドの長さが増大すると、通常合成がより複雑になり、したがって高価になるので、必ずしも好ましくはない。好ましい実施形態において、ペプチドコンセンサスは、少なくとも１０、１５、１８または２０アミノ酸の長さを示す。勿論、これらは、より長い配列に、それぞれ埋め込まれることができ、含まれることができる。記載されるペプチド配列は、ＥＰＯ受容体の結合ドメインと認められ得る。ＥＰＯ模倣ペプチドとして、それらは、ＥＰＯ受容体に結合することができる。
【００１６】
一方の、または（いくつかの実施形態によると）両方のプロリンまでも、他の天然または非天然アミノ酸によって置換され得るが、本発明のペプチドがＥＰＯ模倣活性をまさに示すことは、非常に驚くべきことであった。実際、本発明のペプチドは、プロリン含有ペプチドのそれに匹敵する活性を有する。しかしながら、プロリン残基を置換するアミノ酸が保存的交換を表さず、それよりも非保存的交換を表すことは、注目すべきことである。好ましくは、Ｋ、ＲおよびＨ等の塩基性アミノ酸等の、正に荷電したアミノ酸、および特にＫが置換に用いられる。置換に用いられる非保存的アミノ酸はまた、非天然アミノ酸であることができ、好ましくは、正に荷電した側鎖を有するものである。言及したアミノ酸の、それぞれの類似物もまた、含まれる。非天然アミノ酸の、適した例は、ホモアルギニンである。ある実施形態によると、ペプチドは、天然アミノ酸のアルギニンを除いて、正に荷電したアミノ酸を１０位に有する。したがって、この実施形態によると、プロリン１０は、Ｋ、Ｈ、または例えばホモアルギニン等の非天然の正に荷電したアミノ酸から選択されるアミノ酸によって置換される。ペプチドが１０位にリシンまたはホモアルギニンを示すことが好ましい。上述のように、１７位のプロリンもまた、非保存的アミノ酸によって置換されることができる。これに関して、前記非保存的アミノ酸がＫ、Ｒ、Ｈまたはホモアルギニン等のそれぞれの非天然アミノ酸等の正に荷電した側鎖を有するものであることも好ましい。この実施形態の副実施形態によると、ペプチドは、天然アミノ酸のアルギニンを除いて、正に荷電したアミノ酸を１７位に有する。したがって、この実施形態によると、プロリン１７は、Ｋ、Ｈ、またはホモアルギニン等の非天然の正に荷電したアミノ酸から選択されるアミノ酸によって置換される。ペプチドが１７位にリシンまたはホモアルギニンを示すことが好ましい。
【００１７】
さらに、配列は、Ｎ末端および／またはＣ末端アセチル化およびアミド化を有することができる。いくつかのアミノ酸はまた、リン酸化されることができる。
【００１８】
本発明によると、エリスロポイエチン受容体に結合し、以下のアミノ酸の配列を含むペプチドもまた提供される。
【００１９】
【化１２】
配列中、各アミノ酸は標準的文字省略形によって示され、
Ｘ６はＣであり、
Ｘ７はＲ、Ｈ、ＬまたはＷであり、
Ｘ８はＭ、ＦまたはＩであり、
Ｘ９はＧ、またはＧの保存的交換であり、
Ｘ１０はプロリンの非保存的交換であり、
Ｘ１１は任意のアミノ酸から独立して選択され、
Ｘ１２はＴであり、
Ｘ１３はＷであり、
Ｘ１４はＤ、Ｅ、Ｉ、ＬまたはＶであり、
Ｘ１５はＣである。
【００２０】
さらに、Ｘ７はセリンであることができ、Ｘ８はｈｓｍまたはノルイソロイシンであることができ、Ｘ１３はまた、１−ｎａｌ、２−ｎａｌ、ＡまたはＦであることができる。ペプチドコンセンサスの長さは、好ましくは１０〜４０または５０または６０アミノ酸の間である。好ましい実施形態において、ペプチドコンセンサスは、少なくとも１０、１５、１８または２０個のアミノ酸を含む。
【００２１】
本発明のペプチドは、Ｌ−アミノ酸または立体異性的Ｄ−アミノ酸の他に、例えばα，α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸または乳酸等の非天然／非保存的アミノ酸、例えば１−ナフチルアラニン、２−ナフチルアラニン、ホモセリン−メチルエーテル、β−アラニン、３−ピリジルアラニン、４−ヒドロキシプロリン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−メチルグリシン（サルコシン）、ホモアルギニン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−アセチルグリシン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリシン、ノル−リシン、５−アミノレブリン酸またはアミノ吉草酸を含むことができる。具体的には末端の位置での、Ｎ−メチルグリシン（ＭｅＧ）およびＮ−アセチルグリシン（ＡｃＧ）の使用が特に好ましい。定義されたペプチドのｒｅｔｒｏ、ｉｎｖｅｒｓｏ型、およびｒｅｔｒｏ／ｉｎｖｅｒｓｏ型ペプチドであるペプチド、ならびに完全にＤ−アミノ酸からなるペプチドもまた、本発明の範囲内である。
【００２２】
本発明はまた、ペプチドの誘導体、例えばメチオニンの酸化生成物、脱アミド化されたグルタミン、アルギニンおよびＣ末端アミドにも関する。
【００２３】
本発明のある実施形態によると、ペプチドは、アミノ酸残基Ｘ９およびＸ１０を置換する単一のアミノ酸を有する。この実施形態において、１つの非天然アミノ酸、例えば５−アミノレブリン酸またはアミ吉草酸によって、両方の残基もまた置換されることができる。
【００２４】
さらなる実施形態において、本発明によるペプチドは、コンセンサス配列
【００２５】
【化１３】
を含み、
配列中、Ｘ６〜Ｘ１５は上記の意味を有し、
Ｘ４はＹであり、
Ｘ５は任意のアミノ酸から独立して選択され、好ましくはＡ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、ＴまたはＩである。
【００２６】
本発明のペプチドは伸長されることができ、コンセンサス配列
【００２７】
【化１４】
を含むことができ、
配列中、Ｘ４〜Ｘ１５は上記の意味を有し、
Ｘ３は任意のアミノ酸から独立して選択され、好ましくはＤ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ｓ、ＴまたはＶであり、
Ｘ１６は任意のアミノ酸から独立して選択され、好ましくはＧ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、ＳまたはＴ、より好ましくはＫ、Ｒ、ＳまたはＴであり、
Ｘ１７は任意のアミノ酸から独立して選択され、好ましくはＡ、Ｇ、Ｐ、Ｒ、Ｋ、Ｙ、または正に荷電した側鎖を有する非天然アミノ酸、より好ましくはＫまたはＨａｒであり、
Ｘ１８は任意のアミノ酸から独立して選択される。
【００２８】
本発明のさらなる実施形態において、ペプチドは、Ｃ、Ｅ、Ａもしくはｈｏｃ、好ましくはＣとしてのＸ６、および／またはＲ、ＨもしくはＹもしくはＳとしてのＸ７、および／またはＦもしくはＭとしてのＸ８、および／またはＧもしくはＡ、好ましくはＧとしてのＸ９、および／またはＫもしくはＨａｒとしてのＸ１０、および／またはＶ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｅ、Ａ、ＴもしくはノルイソロイシンとしてのＸ１１、および／またはＴとしてのＸ１２、および／またはＷとしてのＸ１３、および／またはＤもしくはＶとしてのＸ１４、および／またはＣもしくはｈｏｃ、好ましくはＣとしてのＸ１５、および／またはＰ、ＹもしくはＡ、または塩基性の天然もしくは非天然アミノ酸としてのＸ１７を含む。しかしながら、Ｘ１７がＫ、または例えばホモアルギニン等の正に荷電した側鎖を有する非天然アミノ酸であることもまた好ましい。
【００２９】
図１９は、ＥＰＯ模倣活性を示す、さらなる新規の適したペプチド配列を開示する。さらなるペプチドは、以下の配列を示す：
【００３０】
【化１５−１】
５−アミノレブリン酸（５−Ａｌｓ）は、
【００３１】
【化１５−２】
である。
【００３２】
ホルモンエリスロポイエチンの受容体への結合能を有し、アゴニスト活性を示し、ペプチドがプロリンを示さないことを特徴とするペプチドもまた開示される。上述のように、これらのペプチドは、好ましくは、一般に１０および１７位と呼ばれる位置にプロリンを含まず、異なる天然アミノ酸または５−アミノレブリン酸を含む。これらは、好ましくは１７位のリシンを示す。それぞれのペプチドをコードする核酸もまた開示される。
【００３３】
本発明のポリペプチドのアミノ酸配列内で、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換を行うことができ、置換は非極性側鎖を有するアミノ酸、極性側鎖を有する天然または非天然の、荷電していないＤ−またはＬ−アミノ酸、芳香族側鎖を有するアミノ酸、天然または非天然の正に荷電したＤ−またはＬ−アミノ酸、天然または非天然の負に荷電したＤ−またはＬ−アミノ酸内、ならびにより小さいサイズおよび分子量の任意のアミノ酸内で起こり、ここで元のアミノ酸の分子量は、元のアミノ酸の分子量のおよそ±２５％より大きく外れるべきではなく、アゴニスト効果を伴うホルモンエリスロポイエチンの受容体への結合能は維持される。好ましくは、わずか１、２または３個のアミノ酸が置換される。１０および１７位にプロリンが導入されない配列変化が好ましい。
【００３４】
本明細書中に記載されるペプチド配列は、ＥＰＯ受容体への結合ドメインを構成する、適した単量体ペプチド単位として使用することができる。これらは、ＥＰＯ受容体に結合するので、そのモノマー形態で使用することができる。本明細書中に記載されるように、ＥＰＯ受容体の二量体化を誘導する能力およびしたがって生物学的活性が単量体結合単位の二量体化によって促進されることが示されたので、これらは、好ましくは二量体として使用される。
【００３５】
したがって、多くの異なるペプチドが本発明の範囲内であることは明らかである。しかしながら、配列
【００３６】
【化１５−３】
は、ある欠点を有し、したがって本発明によると好ましくないことがわかっている。
【００３７】
記載される個々のペプチド配列の始まり（Ｎ末端）および終わり（Ｃ末端）で、５個までのアミノ酸が除去および／または付加され得る。ペプチド機能が保存される限りサイズは直接的に関連しないことは、自明である。さらに、単量体としての活性を包むのに短すぎるかもしれない個々のペプチド配列は、通常、二量体化のときにアゴニストとして機能することに留意されたい。したがって、かかるペプチドは、好ましくは、それらの二量体形で用いられる。したがって、それぞれの、トランケートされた、およびまたは伸長された実施形態もまた、本発明の精神に含まれる。
【００３８】
本発明において、大文字としての一文字表記の省略形は、標準的ポリペプチド命名法のものであり、非天然アミノ酸の付加によって伸長される。
【００３９】
【化１６】
【００４０】
【化１７】
上述のように、本発明はまた、単一のアミノ酸の保存的交換による、ペプチドおよび定義されたペプチドコンセンサスの修飾を含む。かかる交換は、結合する分子の構造および機能を変化させるが、ほとんどの場合、変化はわずかでしかない。保存的交換では、あるアミノ酸が、同様の特性を有するグループ内の別のアミノ酸によって置換される。
【００４１】
対応するグループの例は、
− 非極性側鎖を有するアミノ酸：Ａ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、Ｍ
− 極性側鎖を有する、荷電していないアミノ酸：Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、Ｙ、Ｎ、Ｑ
− 芳香族側鎖を有するアミノ酸：Ｆ、Ｙ、Ｗ
− 正に荷電したアミノ酸：Ｋ、Ｒ、Ｈ
− 負に荷電したアミノ酸：Ｄ、Ｅ
− 同様のサイズまたは分子量のアミノ酸であって、置換するアミノ酸の分子量が元のアミノ酸の分子量から最大±２５％（または±２０％、±１５％、±１０％）外れる、アミノ酸。
【００４２】
グループが、例えば正に荷電した側鎖を示すグループの場合はホモアルギニン等の、それぞれの側鎖プロフィールを有する非天然アミノ酸も含むことは、自明である。プロリン１０の場合、例えば非天然アミノ酸等の置換する分子は、側鎖の特性によって特徴付けられる上記のグループの１つに明確に割り振ることができず、通常、本発明によるプロリンの非保存的置換として認められるべきである。これらの通常でないアミノ酸を類別するために、分子量による分類補助が役立つかもしれない。
【００４３】
より具体的には、Ｗｒｉｇｈｔｏｎら（米国特許第５７７３５６９号および関連する特許）は、ファージディスプレイ技術を用いて、どのアミノ酸が活性を維持しながら置換されることができるかを詳細に調べた。彼らはまた、可能性のあるトランケーション、すなわち所定のＥＰＯ模倣ペプチドの最小の長さに関するデータを調査および公開した。しかしながら、中央のＧｌｙ残基の近くのプロリンが、活性のあるペプチドを得るために唯一の可能性のあるものと思われた。
【００４４】
本発明のある実施形態によると、下記の配列番号２、４〜９からなる群より選択されるペプチドが提供される。配列番号２の場合のように、１０位のＫおよび１７位のＫを有するペプチドが特に好ましい。
【００４５】
【化１８】
ある実施形態によると、ペプチド二量体または多量体は、上記の配列番号２および４〜９またはそれらの修飾による単量体に基づいて形成される。本明細書中に記載されるペプチドは、例えば単一のアミノ酸の保存的交換によっても修飾されることができ、好ましくは、１、２または３個より多くないアミノ酸が交換される。
【００４６】
好ましくは、これらのペプチドは、Ｎ末端のＡｃＧおよびＣ末端のＭｅＧに関して修飾される。
【００４７】
上記で概略を述べたように、本発明の記載されるペプチドは、エリスロポイエチン受容体の結合部位を認識する単量体結合ドメインと考えることができる。しかしながら、Ｗｒｉｇｈｔｏｎら（Ｗｒｉｇｈｔｏｎ、１９９７年）によって指摘されたように、受容体をホモ二量体化させてシグナルトランスダクションを誘導するためには、これらの結合ドメインの２つが一般に必要とされる。したがって、１つの単一の分子中のこれらの結合ドメインの２つの組合せが活性を相当に増大させ、１つの単一の結合ドメインを有するペプチドが同じ活性の定性的パターンを示すがともに結合した結合ドメインの２つがかなり低いＥＤ５０（５０％有効量、活性の尺度）を示す結果につながったことは、非常に驚くべきようなことではなかった。２つの結合ドメインを含むペプチドは、本明細書中の文脈内で、二価または二量体ペプチドであるとして特定され、特に好ましい。
【００４８】
２つの単量体結合ドメインを組み合わせるための、ある周知の技術的解決法は、二量体化である。このアプローチに従うすべての解決法は、これまでのところ、
ａ）結合ドメインがまず一価または単量体ペプチドとして別々に合成され、これが工程ｂの調製において、例えば反応基の結合によって修飾されることができ、
ｂ）第２の反応工程において、２つの（ほとんどの場合同一な）結合ドメインが別々の二量体化反応において連結され、これが通常２つの二量体化ドメインの間に挟まれるリンカー分子を含むことができること
によって特徴付けられる。
【００４９】
かかる二量体は、二価ペプチドの例であり、本質的に単量体と同じ生物学的機能を示す。通常これらは、ＥＰＯ模倣ペプチドの場合、促進された生物学的活性を示す。
【００５０】
本発明の教示に従って適用することもできる、単量体の二量体化またはオリゴマー化するいくつかの技術が、当業者に公知である。単量体は、例えばリンカーへの共有結合によって、二量体化することができる。リンカーは、本発明のポリペプチド単位の間の共有結合を生じる連結分子である。ポリペプチド単位は、ＥＰＯ受容体への結合が向上するように、リンカーを介して組み合わせることができる（Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９７年、Ｗｒｉｇｈｔｏｎら、１９９７年）。これはさらに、Ｗｒｉｇｈｔｏｎら（Ｗｒｉｇｈｔｏｎ、１９９７年）によって記載されているタンパク質担体分子との非共有相互作用による単量体ビオチン化ペプチドの多量体化を参照する。ビオチン／スロレプトアビジン系、すなわちペプチドのＣ末端をビオチン化して、続いてビオチン化ペプチドをストレプトアビジンとともにインキュベートすることを使用することも可能である。あるいは、ジケトピペラジン構造を形成することによって二量体化を達成することもまた公知である。この当業者に公知の方法は、例えばＣａｖｅｌｉｅｒら（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｔｈｅ ｗａｖｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｕｔｕｒｅ中、Ｍｉｃｈａｌ ＬａｂｌおよびＲｉｃｈａｒｄ Ａ．Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（編）、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ、２００１年）に詳細に記載されている。二量体化および非共有多量体化に関するこれらの文献の開示は、参照によって本明細書中に援用される。従来技術から公知の、ペプチド二量体を得る別の代替的方法は、Ｎ末端アミノ基と反応することによって最終的な二量体ペプチドを形成する、後のリンカー部分の反応性前駆体として、二官能性活性化ジカルボン酸誘導体を使用することである（Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９７年）。単量体もまた、リンカーへの共有結合によって二量体化することができる。好ましくは、リンカーは、ＮＨ−Ｒ−ＮＨを含み、Ｒは、別の分子部分への結合を可能にするカルボキシル基またはアミノ基等の官能基で置換された低級アルキレンである。リンカーは、リシン残基またはリシンアミドを含有することができる。同様に、ＰＥＧもリンカーとして使用することができる。リンカーは、２つのカルボン酸を含み、任意の１つまたは複数の原子が１つまたは複数のＰＥＧ分子に結合することのできるアミン等の官能基で置換された分子であることができる。連結部分を用いた、ペプチドのオリゴマー化および二量体化の可能性のある工程の詳細な説明はまた、国際公開第２００４／１０１６０６号に挙げられている。
【００５１】
二量体化／多量体化に関するこれらの文献の開示は、参照によって本明細書中に援用される。
【００５２】
ペプチド単量体または二量体は、少なくとも１つのスペーサー部分をさらに含むことができる。好ましくは、かかるスペーサーは、単量体または二量体のリンカーを水溶性ポリマー部分、または例えばＰＥＧであることができる保護基に連結する。ＰＥＧは、少なくとも３ｋＤ、好ましくは２０〜６０ｋＤの間の、好ましい分子量を有する。スペーサーは、−ＮＨ−結合またはＣＯＯＨ基で終わるＣ１〜１２部分であることができ、１つまたは複数の利用可能な炭素原子が、低級アルキル置換基で必要に応じて置換され得る。特に好ましいスペーサーは、国際公開第２００４／１００９９７号に開示されている。すべての文献、国際公開第２００４／１００９９７号および国際公開第２００４／１０１６０６号は、参照によって本明細書中に援用される。ペプチドのＰＥＧ修飾は、国際公開第２００４／１０１６００号に開示されており、これも参照によって本明細書中に援用される。
【００５３】
機能的に十分であり、したがって本発明の教示に従って使用可能であるが、二量体分子の合成の従来技術のアプローチは、いくつかの欠点を有することがある。
【００５４】
ある可能性のある欠点は、連結される単量体がまず別々に合成されなければならない点にあると認められた。二量体化、それぞれの多量体化反応の間の単量体ペプチドの推計学的な組合せのために、このアプローチでヘテロ二量体二価／多価ペプチドを（選択的および意図的に）得ることは、特に難しい。少なくとも、これは特別で意図的なヘテロ二量体の収量の大きな損失につながる。２つ以上のわずかに異なる単量体結合ドメインを含む二価または多価ペプチドは、そのヘテロ二量体の性質のために、最終的な二価ペプチド中の相互作用を安定させることができる２つのドメインの間の特別な相互作用を導入することができるので、非常に望ましい。しかしながら、従来技術の「推定学的な二量体化反応」に関連する収量の高い損失のために、これは通常、経済的に魅力的なアプローチではない。
【００５５】
したがって、二量体化に従来技術のアプローチを適用することは、技術的には適しているが、記載されたように異種結合ドメインを有するこれらのペプチドを提供するのに、いくつかの経済的欠点を有する。しかしながら、本発明はまた、異種結合ドメインをも含み得る、高度に活性のある多価または二価ペプチドを得るための、かなりより効率の高い戦略を有利に教示する。
【００５６】
この戦略の中心的概念は、二量体化または多量体化の前の別々の反応における多価または二価ペプチドの一部を形成する単量体ペプチドの合成を断つが、１つの工程で単一のペプチドとして、例えば１つの単一の固相反応において、最終的な二価または多価ペプチドを合成する。したがって、別々の二量体化または多量体化工程は、もはや必要ではない。この態様は、大きな利点、すなわち最終的なペプチド単位中の各配列位置に対する完全で独立した制御を提供する。この方法は、各配列位置に対する独立した制御のために、ペプチド単位中に少なくとも２つの異なる受容体特異的結合ドメインを容易に含むことを可能にする。
【００５７】
この実施形態によると、結合ドメインの間の最終的なペプチドの配列（「リンカー領域」である）は、アミノ酸のみで構成され、したがって、１つの単一で連続した二価または多価ＥＰＯ模倣ペプチドにつながる。本発明の好ましい実施形態において、リンカーは、高い構造的柔軟性を可能にする天然または非天然アミノ酸で構成される。これに関して、連結するアミノ酸として、ねじれに関する高い柔軟性が知られているグリシン残基を使用することが有利であることができる。しかしながら、同様にアラニンまたはβ−アラニン等の他のアミノ酸、またはそれらの混合物もまた用いることができる。使用されるアミノ酸の数または選択は、それぞれの立体的事実に依存する。本発明のこの実施形態は、生物活性構造のゆがみを避けるために、分子モデリングによって、適したリンカーの、あつらえの設計を可能にする。３〜５個のアミノ酸で構成されるリンカーが特に好ましい。
【００５８】
最終的な二価または多価ペプチドの機能的ドメイン（または単量体単位）の間のリンカーがペプチドの別個の部分であるか、または完全もしくは部分的に、単量体機能的ドメインの一部であるアミノ酸で構成されることができるかのいずれかであることができることは、注目に値する。例えば、アミノ酸１および２および１９および２０位のグリシン残基が、リンカーの一部を形成することができる。例としては、配列１１〜１４が挙げられる。したがって、アミノ酸がリンカー単位ならびに単量体サブユニットの一部を形成することができるので、用語「リンカー」は、構造的よりもむしろ機能的に定義される。
【００５９】
上述のように、二価／多価ペプチドの合成の間に、最終的なペプチド内の各配列位置が制御され、したがって正確に決定することができるので、リンカーを含む、ペプチドまたはその特定の領域もしくはドメインを特別にまたは目的に合わせて作製することが可能である。これは、好ましくない分子内相互作用による最終的な二価ペプチドの生物活性構造のゆがみを避けることを可能にするので、特に有利である。ゆがみの危険性は、合成の前に分子モデリングによって評価され得る。これは特に、単量体ドメインの間のリンカーの設計に適用される。
【００６０】
本発明の連続した二価／多価ペプチドは、対応する単量体ペプチドよりもかなり高い活性を示し、したがって、効率の増大が二価ペプチド概念に関連するという、他の二量体ペプチドから知られている観察を確かにする。
【００６１】
単量体および二量体ペプチドに関して、連続した二価／多価ペプチドは、例えばアセチル化もしくはアミド化によって修飾することができるか、またはＣ末端もしくはＮ末端の位置で伸長することができる。ＰＥＧ、デンプンまたはデキストラン等の可溶性部分の結合を含む、上述の単量体ペプチド（単量体）の従来技術の修飾もまた、本発明の多価または二価ペプチドに適用される。
【００６２】
すべての可能性のある修飾もまた、リンカーの修飾に適用される。具体的には、例えばＰＥＧ、デンプンまたはデキストラン等の可溶性ポリマー部分をリンカーに結合させることが有利であることができる。
【００６３】
本発明の最終的な多価または二価ペプチドの合成はまた、２回の、それに続く独立した、結合ドメインのそれぞれの内のジスルフィド結合または他の分子内結合の形成を有利に含むことができる。それによって、ペプチドはまた環化され得る。
【００６４】
本発明の二価構造は、有利に、本明細書中に報告されるペプチド単量体に基づいて形成される。
【００６５】
ＥＰＯ受容体の二量体化のために適切なペプチド単位のいくつかの例を、次に挙げる。結合ドメイン上方の棒は、任意選択である好ましい分子内ジスルフィド架橋を象徴する。
【００６６】
【化１９】
【００６７】
【化２０】
これらの二価構造中のリンカーは、分子モデリングによって、生物活性構造のゆがみを避けるように特別に作製する（図１）。
【００６８】
配列番号１２
リンカー配列は、グリシン残基１つ分短縮することができる。この配列はまた、同時に結合ドメインの一部を形成するグリシン残基によって構成されるリンカーの例である（配列番号２参照）。
【００６９】
【化２１】
結合ドメインはまた、単量体単位として使用され得る（配列番号１３）。
【００７０】
【化２２】
【００７１】
【化２３】
この配列は、２つのわずかに異なる（異種の）結合ドメインを含む、本発明の連続した二価ペプチドを提供する。かかる二価ペプチドは、従来技術の二量体化アプローチ（上記参照）では、経済的に入手できない。これらの結合ドメインもまた、単量体
【００７２】
【化２４】
として適用することができる。
【００７３】
さらなる例は、
【００７４】
【化２５】
である。
【００７５】
さらなる実施形態によると、ペプチドは、さらなるアミノ酸、好ましくは、例えば以下の配列等の中に、Ｎ末端のシステイン等の反応性側鎖を有するアミノ酸を必要に応じて有する。
【００７６】
【化２６】
さらなるペプチドの例は、以下のアミノ酸配列を示す。
【００７７】
【化２７】
第１の配列は、Ｘ７位にセリンを示す。この配列が二量体に組み込まれると、水酸基の導入を介して新しい水素架橋が生じることがわかった。したがって、生物活性構造が安定化されるので、Ｘ７位のセリンの使用は、二量体に特に有利である。
【００７８】
非天然アミノ酸ホモアルギニンを示す第２の配列は、獣医学的目的のための医薬組成物での使用に特に適している。１０および／または１７位に、例えばホモアルギニン等の、長い正に荷電した側鎖を有するアミノ酸を有するペプチド配列が、例えばマウス／イヌ受容体等のＥＰＯ受容体に対する強力な結合能を示すことが、一般にわかっている。したがって、これらは獣医学的製品での使用に特に適しているが、これらの使用は、それに限定されない。
【００７９】
反応性側鎖は、例えばさらなる修飾のための、連結する結びつきとして機能することができる。ペプチドはさらに、第１および第２ならびに／または第３および第４のシステインの間の分子内ジスルフィド架橋を必要に応じて含む。
【００８０】
配列番号２、４〜９および１２、１３および１５、１５ａによって例示されるような単量体ペプチドが、本発明の連続した二価ペプチドに有利に組み合わされることに気づくのは重要である。しかしながら、同様にこれらの単量体の二量体化の従来技術の方法も適用することができる。本発明の範囲に入る単量体ペプチドに適用されるこれらの従来技術のアプローチの例としては、以下のものが挙げられる（が、これに限定されない）。
【００８１】
１．前記単量体ペプチドの一方のＣ末端がもう一方のペプチドのＣ末端に共有結合する、Ｃ末端からＣ末端への連結を介した二量体化。単量体の間のリンカー／スペーサーは、ジケトピペラジン単位を含むことができる。好ましいＧｌｙ−Ｇｌｙジケトピペラジン骨格は、Ｃ末端グリシン単量体を活性化することによって達成することができる。この原理はまた、Ｃ末端二量体化を形成するための使用であり得る。
【００８２】
以下の式および例は、分子モデリングによって最適化された、４つの特製の例を表す。
【００８３】
（ａ）配列番号２に基づく二量体（二量体構造を図２に示す）：
【００８４】
【化２８】
（ｂ）グリシン１つ分短縮されたリンカーを有する、配列番号２に基づく二量体。構造を図３に示す。
【００８５】
【化２９】
（ｃ）グリシンがβ−アラニンによって置換された、配列番号２に基づく二量体（図４）。単量体（配列番号１６）もまた、ＥＰＯ模倣ペプチドとして適用可能である。
【００８６】
【化３０】
（ｄ）代替的グリシンがβ−アラニンによって置換された、配列番号２に基づく二量体（図５）。単量体（配列番号１７）もまた、ＥＰＯ模倣ペプチドとして適用される。
【００８７】
【化３１】
。
【００８８】
２．前記単量体ペプチドの一方のＮ末端がもう一方のペプチドのＮ末端に共有結合し、それによってスペーサー単位が、好ましくはジカルボン酸ビルディングブロックを含んでいる、Ｎ末端からＮ末端への連結を介した二量体化。
【００８９】
（ａ）ある実施形態において、Ｎ末端でグリシン残基１つ分伸長された、配列番号２に基づいて得られる二量体（配列番号１８）は、リンカー／スペーサーとしてヘキサンジオイル単位を含む（図６）：
【００９０】
【化３２】
（ｂ）代替的な実施形態において、二量体化は、リンカー／スペーサーとしてオクタンジオイル単位を用いることによって達成することができる（図７）：
【００９１】
【化３３】
。
【００９２】
３．２つのペプチド単量体を連結する適したスペーサー分子を含むことによって、前記単量体ペプチドの一方のアミノ酸側鎖がもう一方のペプチドのアミノ酸側鎖に共有結合する、側鎖を介した二量体化。これは、
（ａ）アミド結合を介した連結
【００９３】
【化３４】
（ｂ）またはジスルフィド架橋を介した連結
【００９４】
【化３５】
を含むことができる。
【００９５】
Ｘは、それぞれの連結する結合の形成に関与するそれぞれのアミノ酸のバックボーンの中心を象徴する。
【００９６】
上述のそれぞれの集合方法はまた、多量体の調製に用いることができる。
【００９７】
それぞれの異種または同種の二価または多価ペプチドを形成するために、本明細書中に記載される、結合ドメイン、それぞれのペプチドのすべてが、単独または二価／多価ペプチドの一部としてのいずれかで、単量体形で使用することができるおよび／または１つまたは複数の他の同一もしくは異なるペプチドドメインのいずれかと組み合わせることができることが指摘される。
【００９８】
ペプチドは、例えばアセチル化もしくはアミド化によって修飾することができるか、またはＣ末端もしくはＮ末端の位置で伸長することができる。例えばポリマーの結合部位の調製のための、２つの末端の一方での１つまたは複数のアミノ酸での伸長は、しばしば、連続したペプチドとして最良に製造され得るヘテロ二量体二価ペプチド単位につながる。
【００９９】
本発明の化合物は、ヒトおよび／または獣医学的医薬組成物の調製に、有利に使用され得る。ＥＰＯ模倣剤として、これらは、エリスロポイエチンと基本的に同じ定性的活性パターンを示す。したがって、これらは一般に、エリスロポイエチンと同じ兆候に適している。
【０１００】
エリスロポイエチンは、サイトカインスーパーファミリーの１つである。序文に記載された刺激効果の他に、エリスロポイエチンが幹細胞を刺激することもわかっている。したがって、本明細書中に記載されるＥＰＯ模倣剤は、幹細胞関連効果によって引き起こされるすべての兆候に適している。非限定的例は、神経系に関連する疾患の予防および／または治療である。例は、例えばパーキンソン症候群、アルツハイマー病、ハンティングトン舞踏病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、ゴーシェ病、テイ−サックス病、ニューロパシー、末端神経損傷、脳腫瘍、脳損傷、脊髄損傷または脳卒中性損傷等の、神経学的損傷、疾患または障害である。本発明のＥＰＯ模倣ペプチドはまた、心不全を患う、または患う危険性のある患者の予防的および／または治療的処置にも使用可能である。例は、心筋梗塞、冠状動脈疾患、心筋炎、化学療法治療、アルコール症、心筋症、高血圧症、僧帽弁閉鎖不全症または大動脈狭窄症を含む心臓弁膜症、ならびに甲状腺の障害、慢性および／または急性冠症候群である。
【０１０１】
さらに、ＥＰＯ模倣剤は、内皮前駆細胞の生理学的動員、増殖および分化の刺激、脈管形成の刺激、内皮前駆細胞の機能不全に関連する疾患の治療、ならびにかかる疾患の治療のための医薬組成物および前記ペプチドおよび内皮前駆細胞の刺激に適した他の作用物質を含む医薬組成物の製造に用いることができる。かかる疾患の例は、高コレステロール血症、真性糖尿病、内皮媒介性慢性炎症疾患、細網内皮症を含む内皮症、アテローム性動脈硬化症、冠状心疾患、心筋虚血、狭心症、加齢性心臓血管疾患、レーノー病、妊娠性高血圧症、慢性もしくは急性腎不全、心不全、創傷治癒および続発疾患である。
【０１０２】
さらに、本発明のペプチドは、血液脳関門を横切って作用物質を送達するための適した担体であり、それぞれの目的および／または血液脳関門を通過することのできるそれぞれの治療的複合剤の製造に用いることができる。
【０１０３】
本明細書中に記載されるペプチドは、エリスロポイエチンの欠乏または少ないもしくは不完全な赤血球集団によって特徴付けられる障害の治療、および特に任意の型の貧血または脳卒中の治療に特に適している。ペプチドはまた、哺乳動物におけるヘマトクリットの増大および／または維持に適している。かかる医薬組成物は、意図する投与手順に組成物を採用するために、薬学的に許容され得る担体を必要に応じて含むことができる。適した送達方法ならびに担体および添加物は、例えば、国際公開第２００４／１０１６１１号および国際公開第２００４／１００９９７号に記載されている。
【０１０４】
上記で概略を述べたように、二量体またはさらには多量体への単量体ペプチドの二量体化は、通常、それぞれの単量体ペプチドと比較して、ＥＰＯ模倣アゴニスト活性を向上させる。しかしながら、活性をさらに促進することが望ましい。例えば、二量体ＥＰＯ模倣ペプチドであっても、細胞の機構の活性化に関して、ＥＰＯよりも能力が低い。
【０１０５】
従来技術において、ペプチドの活性を増大させるために、例えばより能力の高い候補を同定するためのアミノ酸配列の変化によって、いくつかのアプローチがなされた。しかしながら、これまでのところ、生物学的活性を向上させるために、ペプチド、特にＥＰＯ模倣ペプチドの活性をさらに増大させることが、依然として望ましい。
【０１０６】
本発明のさらなる実施形態は、この問題の解決法を提供する。ここでは、標的分子に結合し、
ｉ）各ペプチド単位が、標的への結合能を有する少なくとも２つのドメインを含む、少なくとも２つのペプチド単位、
ｉｉ）少なくとも１つのポリマー担体単位
を含む化合物が提供され、ここで前記ペプチド単位は、前記ポリマー担体単位に結合する。
【０１０７】
驚くべきことに、ポリマー支持体上の２つ以上の本発明の二価または多価ペプチドの組合せが、付加的なだけでなく過剰付加的にもそれらの結合受容体に対する二価（またはさらには多価）ペプチドの効率を大いに増大させることがわかっている。したがって、相乗効果が観察される。
【０１０８】
用語「二価」は、本発明の目的のために使用される場合、標的への、本明細書中では具体的にはＥＰＯ受容体への結合能を有する２つのドメインを含むペプチドとして定義される。これは、用語「二量体」と交換可能に使用される。したがって、「多価」または「多量体」ＥＰＯ模倣ペプチドは、ＥＰＯ受容体へのいくつかの個々の結合ドメインを有する。用語「ペプチド」および「ペプチド単位」がサイズに関するいかなる制限も組み込まず、オリゴおよびポリペプチドならびにタンパク質を組み込むことは、自明である。
【０１０９】
ポリマー担体単位に結合された、２つ以上の二価または多価ペプチド単位を含む化合物は、この実施形態の文脈において、「超価（ｓｕｐｒａｖａｌｅｎｔ）」と呼ばれる。これらの超価分子は、技術の現状で公知の二量体または多量体分子とは大いに異なる。技術の現状は単に、二量体を生じるために単量体ＥＰＯ模倣ペプチドを組み合わせるだけである。対照的に、超価分子は、すでに（少なくとも）二価のペプチド単位をポリマー担体単位に連結させ、それによって超価分子を生じることによって生じる（例を図１３〜１５に挙げる）。それによって、ペプチドの全体的活性および効率が大いに促進され、したがってＥＣ５０用量が減少する。
【０１１０】
これまでのところ、超価分子の、技術の現状で公知の分子と比較して大きな能力の理由は、完全には理解されていない。これは、技術の現状で公知の二量体分子が単に、二量体１つあたり１つの標的、それぞれの受容体結合単位を提供するだけであるためかもしれない。したがって、１つの受容体複合体だけが、二量体化合物の結合のときに生じ、それによって１つのシグナルトランスダクション過程だけが誘導される。例えば、２つの単量体ＥＰＯ模倣ペプチドがＰＥＧを介して連結されてペプチド二量体を形成し、それによって、シグナルトランスダクションに必要な受容体単量体の二量体化を容易にする（Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９７年）。対照的に、本発明の超価化合物は、いくつかの、すでに二価または多価の、それぞれの受容体結合単位を含む。これによって、化合物１分子あたりに、細胞表面にいくつかの受容体複合体が生じることが可能になり、それによっていくつかのシグナルトランスダクションが誘導され、それによってペプチド単位の活性が過剰付加的に高まる。超価化合物の結合は、細胞表面での受容体複合体の密集を生じ得る。
【０１１１】
この実施形態で用いられるＥＰＯ模倣ペプチド単位は、同種または異種のいずれかであることができ、同一または異なるペプチド単位のいずれかが用いられることを意味する。同種または異種でもあり得るペプチド単位の結合ドメイン（上述のような単量体ペプチド）も同様である。担体単位に結合する二価または多価ペプチド単位は、同じ受容体標的に結合する。
【０１１２】
しかしながら、これらは勿論、依然としてそれらのアミノ酸配列は異なることができる。二価または多価ペプチド単位の単量体結合ドメインは、直鎖状または環状のいずれかであることができる。環状分子は、例えば分子内システイン架橋の形成によって生じることができる（上記参照）。
【０１１３】
ポリマー担体単位は、少なくとも１つの天然または非天然の、分枝、直鎖状または樹状ポリマーを含む。ポリマー担体単位は、好ましくは水および体液に可溶性であり、好ましくは薬学的に許容され得るポリマーである。水溶性ポリマー部分としては、例えば、ＰＥＧ、ＰＥＧホモポリマー、ｍＰＥＧ、ポリプロピレングリコールホモポリマー、エチレングリコールとプロピレングリコールとの共重合体（ここで前記ホモポリマーおよび共重合体は、置換されていないか、または一方の末端で、例えばアシル基で置換されている）を含む、ポリアルキレングリコールおよびその誘導体、ポリグリセリンもしくはポリシアリン酸、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースを含む、セルロースおよびセルロース誘導体、デンプン（例えば、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）、特にヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）およびデキストリンならびにそれらの誘導体）、硫酸デキストラン、架橋デキストリンおよびカルボキシメチルデキストリンを含むデキストランおよびデキストラン誘導体、ヘパリンおよびヘパリンの断片、ポリビニルアルコールおよびポリビニルエチルエーテル、ポリビニルピロリドン、ａ，ｂ−ポリ［（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパラギン酸アミド、ならびにポリオキシエチル化ポリオルが挙げられるが、これらに限定されない。勿論、他の生物学的に不活性な水溶液ポリマーもまた用いられ得る。適切な担体単位の、単純だがやはり好ましい例は、例えばポリエチレングリコール（ビス−マレイミド、ビス−カルボキシ、ビス−アミノ等）の、ホモ二官能性ポリマーである。
【０１１４】
ポリマー担体単位は、本発明に関連して適した異なるポリマーの異なる性質のために、広範な分子量を有することができる。したがって、サイズ制限はない。しかしながら、分子量が少なくとも３ｋＤ、好ましくは少なくとも１０ｋＤおよびおよそ約２０〜５００ｋＤ、より好ましくは約３０〜１５０または約６０もしくは８０ｋＤであることが好ましい。担体単位のサイズは、選択されるポリマーに依存し、したがって異なり得る。例えば、特にヒドロキシエチルデンプン等のデンプンを使用する場合、分子量は、かなりより高くあることができる。この場合、平均分子量は、約１００〜４，０００ｋＤまたはさらに高くにそろえることができる。担体単位のサイズは、好ましくは、各ペプチド単位がそれらのそれぞれの受容体分子に結合するために最適にそろえられるよう選択される。これを容易にするために、本発明のある実施形態は、分枝単位を含む担体単位を使用する。この実施形態によると、ポリマー、例えばＰＥＧが分枝単位に結合され、したがって、多数のペプチド単位の組込みを可能にする、大きな担体分子が生じる。適切な分枝単位の例は、グリセロールまたはポリグリセロールである。同様に、樹状分枝単位も、例えば参照によって本明細書中に援用されるＨａａｇ、２０００年に教示されているように、使用され得る。
【０１１５】
好ましくは、単量体を組み合わせること（頭−頭、頭−尾、または尾−尾のいずれか）によってペプチド単位が生じた後、ポリマー担体単位がペプチド単位に連結される。ポリマー担体単位は、共有または非共有（例えば配位）結合を介してペプチド単位に連結される。しかしながら、共有結合の使用が好ましい。結合は、例えば、例えばリシン、システイン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、チロシン等のペプチド単位の反応性アミノ酸またはＮ末端のアミノ基およびＣ末端のカルボン酸を介して起こることができる。
【０１１６】
ポリマー担体単位が適切な結合基を有さない場合、ペプチド単位上の少なくとも１つの反応基と反応することができるためにポリマーを適切に修飾するために、いくつかの結合物質を用いることができる。ポリマーを修飾するのに用いることができる、適した化学基は、例えば以下のものである。
【０１１７】
タンパク質のアミノ基と反応するアシル化基、例えば酸無水物基、Ｎ−アシルイミダゾール基、アジド基、Ｎ−カルボキシ無水物基、ジケテン基、ピロ炭酸ジアルキル基、イミドエステル基およびカルボジイミド−活性化カルボキシル基。上記の基のすべては、タンパク質／ペプチドのアミノ基と反応して、アシルまたは類似した結合を含む共有結合を形成することが知られている。
【０１１８】
ペプチドのアミノ基と反応する還元剤とともに、ハロ−カルボキシル基、マレイミド基、活性化ビニル基、エチレンイミン基、ハロゲン化アリール基、臭化２−ヒドロキシ５−ニトロ−ベンジル基等のペプチド単位のスルフヒドリル（メルカプト）、チオメチル、イミダゾまたはアミノ基と反応するアルキル化基、ならびに脂肪族アルデヒドおよびケトン基、
ジアゾカルボン酸基等の、タンパク質のカルボキシル基、ならびにカルボジイミドおよびアミン基とともに反応するエステルおよびアミド形成基、
５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）基およびアルキルメルカプタン基（ヨウ素等の酸化剤の存在下でタンパク質のスルフヒドリル基と反応する）等の、タンパク質のスルフヒドリル基と反応するジスルフィド形成基、
シクロヘキサンジオン基等のジカルボニル基、およびペプチドのグアニジン部分と反応する他の１，２−ジケトン基、
ペプチドのフェノール基と反応するジアゾ基、
ペプチドのアミノ基と反応する、多糖との臭化シアンの反応からの反応基。
【０１１９】
したがって、要約すると、本発明の化合物は、（必要に応じて）まずポリマーを化学的に修飾して、ペプチド単位上の利用可能な、または導入された化学基と反応することができる少なくとも１つの化学基を有するポリマーを生成すること、および次いで（必要に応じて）修飾されたポリマーとペプチド単位とをともに反応させて、（必要であれば）修飾されたポリマーの化学基を利用して、共有結合した複合体を形成することによって製造され得る。
【０１２０】
結合がペプチドの遊離ＳＨ−基（例えばシステイン基）を介して起こる場合、ポリマー中のマレイミド基の使用が好ましい。
【０１２１】
定義された分子を生じるために、ペプチド単位をポリマー担体単位に結合させるための、標的化されたアプローチを用いることが好ましい。適切なアミノ酸が所望の結合部位に存在しない場合、適切なアミノ酸を二量体ＥＰＯ模倣ペプチド単位に組み込むことができる。部位特異的ポリマー結合のために、いくつかの異なるポリエチレングリコール分子の集団を含む不均一な混合物につながるペプチド全体の制御されていない結合反応を避けるために、独特の反応基、例えばペプチド単位の末端の特定のアミノ酸が好ましい。
【０１２２】
ポリマー担体単位、例えばＰＥＧまたはＨＥＳへのペプチド単位の結合は、主に当業者に公知の反応を用いて行われる。例えば、当業者にとって利用可能な、多くのＰＥＧおよびＨＥＳ結合方法がある（例えば、国際公開第２００４／１００９９７号、さらなる参考文献を挙げると、すべて参照によって本明細書中に援用される、Ｒｏｂｅｒｔｓら、２００２年、米国特許第４０６４１１８号、ＥＰ１３９８３２２、ＥＰ１３９８３２７、ＥＰ１３９８３２８、国際公開第２００４／０２４７６１号参照）。
【０１２３】
本明細書中に記載される超価の概念が、公知のＰＥＧ化またはＨＥＳ化の概念と異なることを理解するのは重要である。技術の現状で、例えばＰＥＧ化は、ペプチド二量体を生成するため、または薬物動態学的パラメータを向上させるためのいずれかに用いられるだけである。しかしながら、上記で概略を述べたように、例えばポリマー担体単位としてのＰＥＧへの２つ以上の少なくとも二価のペプチド単位の結合もまた、効率を大いに促進する（したがってＥＣ５０用量を減少させる）。したがって、本発明の概念は、技術の現状で公知のＰＥＧ化の概念の場合のように薬物動態学的パラメータだけでなく、薬力学的パラメータに対しても強力な効果を有する。しかしながら、勿論、ポリマー担体単位としての、例えばＰＥＧの組込みもまた、薬物動態学に関する公知の利点を有する。
【０１２４】
ＰＥＧ化は通常、ペプチドの生物薬剤学的特性を向上させるために取りかかられる。ＰＥＧ複合の後の、タンパク質分子の最も関連性のある変化は、サイズ拡大、タンパク質表面および糖化機能マスキング、電荷修飾ならびにエピトープ遮蔽である。具体的には、サイズ拡大は、受動的促進浸透および保持機構によって、腎臓限外ろ過を減速させ、透過性組織への蓄積を促進する。タンパク質遮蔽は、排泄の重要な経路であるタンパク質分解および免疫系認識を減少させる。タンパク質の物理化学的および生物学的特性に対するＰＥＧ化の特定の効果は、タンパク質およびポリマーの特性ならびに採用されるＰＥＧ化戦略によって、厳密に決定される。
【０１２５】
しかしながら、超価分子の支持体単位としてのＰＥＧまたは他の非生分解性ポリマーの使用は、新しい問題につながり得る。
【０１２６】
インビボ適用の間に、臨床環境における投与間隔は、薬物の効果の喪失によって引き起こされる。通法の投与および投与間隔は、投与間隔の間に効果が失われないように適合させられる。非生分解性の大きなポリマー単位（例えばＰＥＧ部分）に結合されたペプチドは支持体分子よりも速く分解されて体によって排泄され得るために、担体単位の蓄積の危険性が生じることがある。かかる蓄積の危険性は、薬物の効果半減期が薬物自体またはその構成要素／代謝産物の排泄半減期よりも短いので、常に生じる。したがって、ペプチドは通常非常に大きなＰＥＧ部分（約２０〜４０ｋＤ）でＰＥＧ化されるために遅い腎排出を示すので、担体分子の蓄積は避けられるべきである。ペプチド部分自体は、酵素的分解を受け、ペプチドを非活性化するには、部分的切断でも十分なことがある。
【０１２７】
この問題に対する解決法を見つけるために、本発明のある実施形態は、少なくとも２つのサブユニットで構成されるポリマー担体単位の使用を教示する。ポリマーサブユニットは、生分解性共有リンカー構造を介して連結される。この実施形態によると、大きな担体分子の分子量（例えば４０ｋＤ）は、生分解性リンカーを介して連結された、いくつかの小さな、または中間のサイズのサブユニット（例えば、５〜１０ｋＤの分子量を有する各サブユニット）によって生じる。モジュラーサブユニットの分子量は大きな量になり、それによって、担体分子の所望の分子量を生じる。しかしながら、生分解性リンカー構造は体内で分解されることがあり、それによって、より小さい担体サブユニット（例えば５〜１０ｋＤ）を放出する。小さい担体サブユニットは、全体的分子量（例えば４０ｋＤ）を有するポリマー分子よりも良い腎クリアランスを示す。図１６に例を挙げる。
【０１２８】
リンカー構造は、公知の分解特性および体液中の分解の期間に従って選択される。分解可能な構造は、例えば、加水分解によって切断することができるアミド／ペプチド結合またはエステルとして、カルボン酸誘導体等の切断可能な基を含むことができる（例えば、参照によって本明細書中に援用される、Ｒｏｂｅｒｔｓ、２００２年参照）。ＰＥＧスクシンイミジルエステルもまた、ＰＥＧバックボーン中の種々のエステル結合で合成されて、生理学的ｐＨで分解速度を制御することができる（参照によって本明細書中に援用される、Ｚｈａｏ、１９９７年）。ベンジルウレタンのジスルフィドのような他の分解可能な構造は、細胞のエンドソーム区画中等の穏やかな還元性環境下で切断することができ（Ｚａｌｉｐｓｋｙ、１９９９年）、したがって、同様に適している。適切なリンカーの他の選択の基準は、速い（しばしば酵素的な）分解または遅い（しばしば非酵素的分解）分解に関する選択である。体液中のこれらの２つの機構の組合せもまた実行可能である。この高度に有利な概念が、本明細書中で記載または参照された特定のペプチド単位に限定されず、同じ蓄積の問題が生じるＰＥＧ分子等の大きなポリマー単位に結合された他の医薬分子にも適用されることは、明らかである。
【０１２９】
ある実施形態によると、ヒドロキシアルキルデンプンおよび好ましくはＨＥＳが、ポリマー担体単位として使用される。ＨＥＳは、いくつかの重要な利点を有する。まず、ＨＥＳは生分解性である。さらに、ＨＥＳの生分解性は、エチル基の割合を介して制御することができ、したがって影響を受けることができる。３０〜５０％のエチル基が、本発明の目的のために十分適している。生分解性のために、ＰＥＧとの複合における上述のような蓄積問題は、通常起こらない。さらに、ＨＥＳは、例えば代用血漿の形態で、医療に長年使用されている。したがって、その無害さは立証されている。
【０１３０】
さらに、ＨＥＳの加水分解産物の誘導体は、ガスクロマトグラフィーによって検出可能である。ＨＥＳ−ペプチド複合体は、ペプチド単位が安定なままの条件下で加水分解することができる。これは、分解産物の定量およびモニタリングを可能にし、活性のあるペプチドの評価および正規化を可能にする。
【０１３１】
さらなる実施形態によると、第１の型のポリマー担体単位が使用され、ペプチド単位を負荷される。この第１の担体は、例えばＨＥＳのように、好ましくは容易に生分解される。しかしながら、第１の担体のすべての結合箇所がペプチド単位で占められるわけではなく、例えば約２０〜５０％のみが占められる。使用されるポリマーのサイズに依存して、数百のペプチド単位を担体分子に結合することができる。第１の担体の残りの結合箇所は、異なる担体、例えば第１の担体よりも低い分子量を有する小さいＰＥＧ単位で占められる。この実施形態は、第１の担体のために超価組成物が生じるが、これは好ましくは３〜５または１０ｋＤのＰＥＧ単位によって構成される第２の担体の存在のために非常に耐久性がある、という利点を有する。しかしながら、第１の担体（例えばＨＥＳ）およびペプチド単位が生分解性であり、第２の担体、例えばＰＥＧが体から容易に除かれるのに十分な程小さいので、全体的な実体は非常に分解性が高い。
【０１３２】
ペプチド単位の結合ドメインを構成する単量体は、ホモ二量体エリスロポイエチン受容体を認識する。ホモ二量体受容体であるという後者の特性は、ＥＰＯ受容体を多くの他のサイトカイン受容体から区別する。上述のような、少なくとも２つのＥＰＯ模倣単量体結合ドメインを含むペプチド単位は、ＥＰＯ受容体に結合し、好ましくはそれらの標的を二価、それぞれ多量体化および／またはそれを安定化することができ、したがって、それによって複合体を誘導するシグナルトランスダクションを生じる。
【０１３３】
本発明はまた、ペプチド単位がそれぞれの担体単位に連結される、それぞれの化合物生成方法を含む。本発明はさらに、ペプチド単位がそれぞれのポリマー担体単位に連結される、それぞれの化合物生成方法を含む。本発明の化合物は、ヒトおよび／または獣医医薬組成物の調製に有利に使用することができる。これらは、エリスロポイエチンの欠乏または少ないもしくは不完全な赤血球集団によって特徴付けられる障害の治療、および特に任意の型の貧血および脳卒中の治療に特に適している。これらはまた、上述のすべての指示に使用可能である。かかる医薬組成物はまた、組成物を意図される投与手順に採用するために、薬学的に許容され得る担体を必要に応じて含むことができる。適した送達方法ならびに担体および添加物は、例えば、参照によって本明細書中に援用される、国際公開第２００４／１００９９７号および国際公開第２００４／１０１６１１号に記載されている。
【実施例】
【０１３４】
超価分子の概念を、実施例によって説明する。図１３は、本発明の単純な超価分子の例を示す。２つの連続した二価ＥＰＯ模倣ペプチドが、マレイミド基を有する二官能性ＰＥＧ部分によってＮ末端で連結されている。ＰＥＧ担体単位の反応性結合部位として、システインを選択した。
【０１３５】
しかしながら、超価分子は、２つより多い連続した二価または多価ペプチド単位を含むことができる。図１４は、分枝単位として中央のグリセロール単位を有し、３つの連続した二価ペプチドを含む担体単位に基づいた例を挙げる。ここでも、結合にシステインを用いた。図２０は、ポリマー担体単位としてＨＥＳを用いた例を示す。ＨＥＳを、ペプチド単位のＳＨ基と反応するマレイミド基を有するように修飾した。実施例によると、すべての結合部位はペプチド単位に結合している。しかしながら、小さいＰＥＧ単位（例えば３〜１０ｋＤ）もまた、結合部位の少なくとも一部を占めることができた。
【０１３６】
上記で説明したように、超価概念はまた、樹状および／またはポリマー担体単位がより多数の連続した二価ペプチドに連結した、多価樹状ポリマーにも拡張することができる。例えば、樹状分枝単位は、ポリグリセロールに基づき得る（参照によって本明細書中に援用される、Ｈａａｇ、２０００年を参照されたい）。
【０１３７】
６つの連続した二価ペプチドを含む樹状分枝単位を有する担体単位に基づく超価分子の例を、図１５に示す。
【０１３８】
超価分子の他の例は、例えば過ヨウ素酸を用いて酸化されて多数のアルデヒド官能基を含む、デンプンまたはデキストランを有する担体単位を含む。第２の工程において、多くの二価ペプチドを担体単位に結合させ、ともに最終的な分子を形成させる。数百（例えば５０〜１０００、好ましくは１５０〜８００、より好ましくは２５０〜７００）ものペプチド単位を、例えばＨＥＳである担体分子に結合させることができることに留意されたい。
【０１３９】
図１６は、単純な生分解性超価分子の概念を示す。２つの連続した二価ＥＰＯ模倣ペプチドが、中間の切断位置を有する生分解性リンカーを介して連結された２つの二価ＰＥＧ部分によってＮ末端で連結している。リンカーは、サブユニット中の大きなＰＥＧ単位の分解を可能にし、それによって腎クリアランスを容易にする。
【０１４０】
Ｉ．単量体のペプチド合成
手作業の合成
ＰＬ−Ｒｉｎｋ−アミド−樹脂（置換速度０．４ｍｍｏｌ／ｇ）または０．４ｍｍｏｌの規模の前処置されたＷａｎｇ−樹脂を用いたＤｉｓｃｏｖｅｒマイクロ波システム（ＣＥＭ）の使用によって合成を行う。Ｆｍｏｃ基の除去を、３０ｍｌのピペラジン／ＤＭＦ（１：３）の添加および３×３０秒間の１００Ｗの照射によって達成する。アミノ酸の結合を、結合添加物としてのＤＭＦ ＰｙＢＯＰ／ＨＯＢＴ／ＤＩＰＥＡ中の５倍過剰のアミノ酸の添加および５×３０秒間の５０Ｗの照射によって達成する。すべての照射サイクルの間に、氷浴の助けを借りて溶液を手作業で冷却する。脱保護および結合の後、３０ｍｌのＤＭＦで樹脂を６回洗浄する。最後のアミノ酸の脱保護の後、１．２６８ｍｌのキャッピング溶液（１００ｍｌのＤＭＳＯ中４．７３ｍｌの無水酢酸および８．７３ｍｌのＤＩＥＡ）との５分間のインキュベーションによって、いくつかのペプチドをアセチル化する。次いで樹脂を３０ｍｌのＤＭＦで６回洗浄し、３０ｍｌのＤＣＭで６回洗浄してから、切断する。粗ペプチドの切断を、不活性な大気下で、５ｍｌのＴＦＡ／ＴＩＳ／ＥＤＴ／Ｈ２Ｏ（９４／１／２．５／２．５）で１２０分間の処理によって達成する。この溶液を４０ｍｌの冷たいエーテル中にろ過する。沈殿をアセトニトリル／水（１／１）に溶解し、ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｋｒｏｍａｓｉｌ １００ Ｃ１８ １０μｍ、２５０×４．６ｍｍ）によってペプチドを精製する。
【０１４１】
自動化合成
ＰＬ−Ｒｉｎｋ−アミド−樹脂（置換速度０．４ｍｍｏｌ／ｇ）または０．２５ｍｍｏｌの規模の前処置されたＷａｎｇ−樹脂を用いたＯｄｙｓｓｅｙマイクロ波システム（ＣＥＭ）の使用によって、合成を行う。Ｆｍｏｃ基の除去を、１０ｍｌのピペラジン／ＤＭＦ（１：３）の添加および１０×１０秒間の１００Ｗの照射によって達成する。アミノ酸の結合を、結合添加物としてのＤＭＦ ＰｙＢＯＰ／ＨＯＢＴ／ＤＩＰＥＡ中の５倍過剰のアミノ酸の添加および５×３０秒間の５０Ｗの照射によって達成する。すべての照射サイクルの間に、反応混合物に窒素の泡を吹き込むことによって溶液を冷却する。脱保護および結合の後、１０ｍｌのＤＭＦで樹脂を６回洗浄する。最後のアミノ酸の脱保護の後、０．７９３ｍｌのキャッピング溶液（１００ｍｌのＤＭＳＯ中４．７３ｍｌの無水酢酸および８．７３ｍｌのＤＩＥＡ）との５分間のインキュベーションによって、いくつかのペプチドをアセチル化する。次いで樹脂を１０ｍｌのＤＭＦで６回洗浄し、１０ｍｌのＤＣＭで６回洗浄してから、切断する。粗ペプチドの切断を、不活性な大気下で、５ｍｌのＴＦＡ／ＴＩＳ／ＥＤＴ／Ｈ２Ｏ（９４／１／２．５／２．５）で１２０分間の処理によって達成する。この溶液を４０ｍｌの冷たいエーテル中にろ過し、沈殿をアセトニトリル／水（１／１）に溶解させ、ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｋｒｏｍａｓｉｌ １００ Ｃ１８ １０μｍ、２５０×４．６ｍｍ）によってペプチドを精製する。
【０１４２】
精製
Ｎｅｂｕｌａ−ＬＣＭＳ−システム（Ｇｉｌｓｏｎ）を使用して、すべてのペプチドを精製した。すべてのペプチドの粗原料を、アセトニトリル／水（１／１）中に溶解し、ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｋｒｏｍａｓｉｌ １００ Ｃ１８ １０μｍ、２５０×４．６ｍｍ）によってペプチドを精製した。流速は２０ｍｌ／分、ＬＣＭＳ分割比は１／１０００であった。
【０１４３】
ＩＩ．分子内ジスルフィド架橋の形成
Ｋ３［（ＦｅＣＮ６）での環化
溶液１：１０ｍｇのペプチドを０．１％ＴＦＡ／アセトニトリルに溶解させ、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度に達するまで水で希釈する。およそ８のｐＨに達するまで、固形重炭酸アンモニウムを加える。
【０１４４】
溶液２：第２のバイアル中、１０ｍｌの０．１％ＴＦＡ／アセトニトリルを、１０ｍｌの水で希釈する。８のｐＨに達するまで固体重炭酸アンモニウムを加え、Ｋ３［（ＦｅＣＮ６）］の０．１Ｍ溶液を１滴加える。
【０１４５】
溶液１および２を、３時間にわたってアセトニトリル／水（１／１、ｐＨ＝８）の混合物に滴下する。混合物を室温で一晩インキュベートし、ＬＣＭＳによって混合物を濃縮および精製する。
【０１４６】
ＣＬＥＡＲ−ＯＸ（商標）樹脂での環化
１００ｍｌのアセトニトリル／水（１／１、０．１％ＴＦＡ）に、８のｐＨに達するまで固形重炭酸アンモニウムを添加する。３０分間アルゴンの泡を吹き込むことによって、この溶液から脱気する。ここで１００ｍｇのＣＬＥＡＲ−ＯＸ（商標）樹脂を加える。１０分後、１０ｍｇのペプチドを固体として加える。２時間のインキュベーション後、ＬＣＭＳによって溶液をろ過、濃縮および精製する。
【０１４７】
環状ペプチドの精製
Ｎｅｂｕｌａ−ＬＣＭＳシステム（Ｇｉｌｓｏｎ）を使用して、すべてのペプチドを精製した。すべてのペプチドの粗原料を、アセトニトリル／水（１／１）またはＤＭＳＯ中に溶解し、ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｋｒｏｍａｓｉｌ １００ Ｃ１８またはＣ８ １０μｍ、２５０×４．６ｍｍ）によってペプチドを精製した。流速は２０ｍｌ／分、ＬＣＭＳ分割比は１／１０００であった。
【０１４８】
ＩＩＩ．単量体でのインビトロアッセイ
ＢｒｄＵ組込みによる、ＴＦ−１細胞での増殖アッセイ
対数増殖期にあるＴＦ−１細胞（約２×１０５〜１×１０６細胞／ｍｌ、ＲＰＭＩ培地、２０％ウシ胎仔血清、ペニシリン、ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン、０．５ｎｇ／ｍｌインターロイキン３を補充）を洗浄（５分間１５００ｒｐｍで遠心分離し、ＩＬ３のないＲＰＭＩ培地に５００，０００細胞／ｍｌで再懸濁）し、アッセイの開始前にＩＬ−３なしで２４時間前培養する。翌日、細胞を、通常試験する薬剤あたり、少なくとも６つの濃度および１つの濃度あたり少なくとも１０，０００細胞／ウェルを含む４ウェルを用いて、２４または９６ウェルプレートに播種する。各実験は、陽性対照作用物質としての組換えＥＰＯおよび陰性対照作用物質としてのサイトカインの添加のないウェルを含む対照を含む。ペプチドおよびＥＰＯ対照を所望の濃度まで培地中に前もって希釈し、細胞に加え、標準的培養条件下（３７℃、気相中５％二酸化炭素、水で飽和した大気）で３日間の培養期間を開始する。濃度は常に、この３日間の培養期間の間のウェル中の作用物質の終濃度をいう。この培養期間の終わりに、ＦｄＵを８ｎｇ／ｍｌ培地の終濃度まで添加し、培養を６時間続ける。次いで、ＢｒｄＵ（ブロモデオキシウリジン）およびｄＣｄ（２−デオキシシチジン）をそれらの終濃度（１０ｎｇ／ｍｌ ＢｒｄＵ、８ｎｇ／ｍｌ ｄＣＤ、培地中の終濃度）まで添加し、培養をさらに２時間続ける。
【０１４９】
このインキュベーションおよび培養期間の終わりに、１．５％ＢＳＡを含有するリン酸緩衝生理食塩水で細胞を１回洗浄し、最小量の液体中に再懸濁する。この懸濁液から、細胞を７０％エタノール中に−２０℃で滴下する。ここから、細胞を氷上で１０分間インキュベートし、次いで直接解析するか、または解析の前に４℃で保存することができる。
【０１５０】
解析の前に、遠心分離によって細胞をペレット化し、上清を廃棄し、細胞を最小量の残った液体に再懸濁する。次いで細胞を０．５ｍｌの２Ｍ ＨＣｌ／０．５％ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中に懸濁および１０分間インキュベートする。次いでそれらを再びペレット化し、最小量の残った液体に再懸濁し、直後の細胞の再ペレット化の前に、０．５ｍｌの０．１Ｎ Ｎａ２Ｂ４Ｏ７、ｐＨ８．５で希釈する。最後に、細胞を４０μｌのリン酸緩衝生理食塩水（１．５％ＢＳＡ）に再懸濁し、それぞれ２０μｌの細胞懸濁液を含む２つの反応チューブに分割する。２μｌの抗ＢｒｄＵ−ＦＩＴＣ（ＤＡＫＯ、クローンＢｕ２０ａ）を一方のチューブに添加し、２μｌの対照ｍｌｇＧ１−ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ）を第２のチューブに添加して、室温で３０分間のインキュベーション期間を開始する。次いで、０．４ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水および１０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（終濃度）を添加する。フローサイトメーターにおける解析は、４Ｃ細胞またはより高い倍数性を有する細胞の分画およびＢｒｄＵ陽性細胞の分画をいい、したがって、細胞周期の関連性のある段階の細胞の分画を決定する。
【０１５１】
ＭＴＴによる、ＴＦ−１細胞での増殖アッセイ
対数増殖期にあるＴＦ−１細胞（約２×１０５〜１×１０６細胞／ｍｌ、ＲＰＭＩ培地、２０％ウシ胎仔血清、ペニシリン、ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン、０．５ｎｇ／ｍｌインターロイキン３を補充）を洗浄（５分間１５００ｒｐｍで遠心分離し、ＩＬ３のないＲＰＭＩ完全培地に５００，０００細胞／ｍｌで再懸濁）し、アッセイの開始前にＩＬ−３なしで２４時間前培養する。翌日、細胞を、通常試験する作用物質あたり、少なくとも６つの濃度および１つの濃度あたり少なくとも１０，０００細胞／ウェルを含む４ウェルを用いて、２４または９６ウェルプレートに播種する。各実験は、陽性対照作用物質としての組換えＥＰＯおよび陰性対照作用物質としてのサイトカインの添加のないウェルを含む対照を含む。ペプチドおよびＥＰＯ対照を所望の濃度まで培地中に前もって希釈し、細胞に加え、標準的培養条件下（３７℃、気相中５％二酸化炭素、水で飽和した大気）で３日間の培養期間を開始する。濃度は常に、この４日間の培養期間の間のウェル中の作用物質の終濃度をいう。
【０１５２】
４日目、解析の開始前に、既知の数のＴＦ−１細胞の希釈系列を、いくつかのウェル中で調製する（１００μｌの培地中０／２５００／５０００／１００００／２００００／５００００細胞／ウェル）。これらのウェルを、試験ウェルと同じように処理し、細胞数を決定することができる検量線を後に提供する。これらの参照ウェルを構成して、ＭＴＴ増殖キット（プロメガ、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６水性非放射活性細胞増殖アッセイ）からのＭＴＳおよびＰＭＳを３７℃の水浴中で解凍し、１００μｌのＰＭＳ溶液を２ｍｌのＭＴＳ溶液に添加する。この混合物の２０μｌをアッセイプレートの各ウェルに加え、３７℃で３〜４時間インキュベートする。ＥＬＩＳＡ読み取り装置におけるＥ４９２の測定の前に、２５μｌの、水中１０％ドデシル硫酸ナトリウムを各ウェルに加える。
【０１５３】
プログラムＧｒａｐｈＰａｄを用いた用量応答関係の計算に基づく図１７および１８に示すようなグラフでの評価を用いて、ＭＴＴアッセイのデータに基づいて以下のＥＣ５０値を決定した。
【０１５４】
以下の表は、いくつかの例示的ペプチドのＥＣ５０値を示す。
【０１５５】
【化３６】
。
【０１５６】
ＩＶ．二価ＥＰＯ模倣ペプチドの合成
直鎖状の配列番号１１（ＡＧＥＭ１１）の自動化合成
０．２５ｍｍｏｌの規模のＲｉｎｋ−アミド−樹脂（置換速度０．１９ｍｍｏｌ／ｇ）を用いたＬｉｂｅｒｔｙマイクロ波システム（ＣＥＭ）の使用によって合成を行う。Ｆｍｏｃ基の除去を、１０ｍｌのピペラジン／ＤＭＦ（１：３）および１０×１０秒間の５０Ｗの照射の二重処理によって達成する。アミノ酸の結合を、結合添加物としてのＤＭＦ ＰｙＢＯＰ／ＨＯＢＴ／ＤＩＰＥＡ中の４倍過剰のアミノ酸および５×３０秒間の５０Ｗの照射の二重処理によって達成する。すべての照射サイクルの間に、反応混合物に窒素を吹き込むことによって溶液を手作業で冷却する。脱保護および結合の後、１０ｍｌのＤＭＦで樹脂を６回洗浄する。二重結合サイクルの後、すべての未処理アミノ基を、１０倍過剰のＮ−（２−クロロベンジルオキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（０．２Ｍ ＤＭＦ溶液）および３×３０秒間の５０Ｗの照射での処理によってブロックする。最後のアミノ酸の脱保護の後、０．７９３ｍｌのキャッピング溶液（１００ｍｌのＤＭＳＯ中４．７３ｍｌの無水酢酸および８．７３ｍｌのＤＩＥＡ）との５分間のインキュベーションによって、いくつかのペプチドをアセチル化する。次いで樹脂を１０ｍｌのＤＭＦで６回洗浄し、１０ｍｌのＤＣＭで６回洗浄してから、切断する。粗ペプチドの切断を、不活性な大気下で、５ｍｌのＴＦＡ／ＴＩＳ／ＥＤＴ／Ｈ２Ｏ（９４／１／２．５／２．５）で１２０分間の処理によって達成する。この溶液を４０ｍｌの冷たいエーテル中にろ過し、沈殿をアセトニトリル／水（１／１）に溶解し、ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｋｒｏｍａｓｉｌ １００ Ｃ１８ １０μｍ、２５０×４．６ｍｍ）によってペプチドを精製する。
【０１５７】
したがって、直鎖状ＡＧＥＭ１１、Ｋｒｏｍａｓｉｌ １００ Ｃ１８ １０μｍ、２５０×４．６ｍｍおよび使用したグラジエントの精製概略図を、５０分で５％〜５０％アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）まで、図８および９に示す。
【０１５８】
ＡＧＥＭ１１の環化
【０１５９】
【化３７】
３０ｍｇの直鎖状ペプチドを６０ｍｌの溶液Ａに溶解する。この溶液および６０ｍｌのＤＭＳＯを、６０ｍｌの溶液Ａに滴下する（添加の合計時間は３時間）。４８時間後、蒸発によって溶媒を除去し、残った残渣を３０ｍｌのＤＭＳＯ／水（１／１）に溶解する。３０ｍｌの酢酸および１７ｍｇのヨウ素（ＤＭＳＯ／水（１／１）に溶解）を添加し、溶液を９０分間室温で混合する。その後、２０ｍｇのアスコルビン酸を添加し、蒸発によって溶媒を除去する。この粗混合物をアセトニトリル／水（２／１）に溶解し、ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｋｒｏｍａｓｉｌ １００ Ｃ１８ １０μｍ、２５０×４．６ｍｍ）によってペプチドを精製する。
【０１６０】
溶液Ａ：０．１％ＴＦＡを含有するアセトニトリル／水（１／１）。重炭酸アンモニウムの添加によってｐＨを８．０に調節する。
【０１６１】
環状ＡＧＥＭ１１の精製パラメータを図１０および１１に示す（概略図：環状ＡＧＥＭ１１の精製、Ｋｒｏｍａｓｉｌ １００ Ｃ１８ １０μｍ、２５０×４．６ｍｍ、５０分で５％〜３５％アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）のグラジエント）。
【０１６２】
Ｖ．ＥＰＯ活性を決定するインビトロ増殖アッセイ
対数増殖期にあるＴＦ１細胞（約２×１０５〜１×１０６細胞／ｍｌ、２０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）および０．５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ３を含むＲＰＭＩ中で増殖）を計数し、アッセイを行うのに必要な細胞の数を遠心分離（５分間１５００ｒｐｍ）し、５％ＦＣＳを含み、ＩＬ−３のないＲＰＭＩに３０００００細胞／ｍｌで再懸濁した。このＩＬ−３のない（飢餓）培地中で、細胞を４８時間前培養した。アッセイを開始する前に、細胞を再度計数した。
【０１６３】
アッセイを開始する直前に、ペプチドおよびＥＰＯのストック溶液を調製した。ペプチドを計量し、１ｍＭ、４６７μＭまたは２００μＭの濃度まで、５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩに溶解した。ＥＰＯストック溶液は、１０ｎＭまたは２０ｎＭであった。これらのストック溶液の２９２μｌを、９６ウェル培養プレートの１つのウェルにピペットで移し、試験する各物質について１つのプレートを採取した。５％ＦＣＳを含む２００μｌのＲＰＭＩを、各プレートの１７個の他のウェルにピペットで移した。９２μｌのストック溶液を、２００μｌの培地を含むウェルにピペットで移した。内容物を混合し、このウェルからの９２μｌを隣から隣へと移していった。このようにして、各連続したウェルにおいて濃度がその前のウェル中の濃度の１：√１０であるように、各物質の希釈系列（１８の希釈物）を調製した。各ウェルから、３×５０μｌを３つの空のウェルに移した。このようにして、物質の各濃度を４つ一組で測定した。各プレートのウェルの一番上および一番下の列は空のままであったことに留意されたい。
【０１６４】
前処理した（飢餓）細胞を遠心分離（５分間１５００ｒｐｍ）し、５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩに１ｍｌあたり２０００００細胞の濃度で再懸濁した。５０μｌの細胞懸濁液（１００００個の細胞を含む）を各ウェルに加えた。細胞の添加のためにウェル中の物質の終濃度が元の希釈範囲の半分であったことに留意されたい。プレートを５％ＣＯ２中、３７℃で７２時間インキュベートした。
【０１６５】
評価を開始する前に、ウェル中への既知の量の希釈範囲のＴＦ−１細胞を調製した。０／２５００／５０００／１００００／２００００／５００００細胞／ウェルを４つ一組でピペットで移した（１００μｌのＲＰＭＩ＋５％ＦＣＳ中）。
【０１６６】
１ウェルあたりの生細胞の数を測定するために、既製のＭＴＴ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６水性一溶液細胞増殖アッセイ）を、３７℃水浴中で解凍した。１ウェルあたり２０μｌのＭＴＴ試薬を加え、プレートを５％ＣＯ２中３７℃で、さらに１〜２時間インキュベートした。２５μｌの１０％ＳＤＳ溶液を加え、プレートをＥＬＩＳＡ読み取り装置（Ｇｅｎｉｏｓ、Ｔｅｃａｎ）において測定した。スプレッドシート（Ｅｘｃｅｌ）中でデータを処理し、Ｇｒａｐｈｐａｄにプロットした。
【０１６７】
図１２にデータを要約する。
【０１６８】
ＥＤ５０（ｎＭ）
ＥＰＯ ０．０１５８
ＢＢ４９（単量体、配列番号２） ４１１３
ＡＧＥＭ１１（二価） ３６．７３。
【０１６９】
ＶＩ．拡張されたペプチドアッセイ
拡張されたアッセイにおいて、およそ２００個のペプチド配列を、それらのＥＰＯ模倣活性に関して試験した。
【０１７０】
ＬＩＰＳ−Ｖａｒｉｏシンセサイザーシステムで、ペプチドアミドとしてペプチドを合成した。特別なＭＴＰ合成プレート中で合成を行い、規模は１ペプチドあたり２μｍｏｌであった。合成は、活性化試薬としてＨＯＢＴを用いた標準的なＦｍｏｃプロトコルに従った。４回の結合として結合工程を行った。各結合工程は２５分を要し、１工程あたりの過剰なアミノ酸は２．８であった。９０％ＴＦＡ、５％ＴＩＰＳ、２．５％Ｈ２Ｏおよび２．５％ＤＤＴを含有する切断溶液で、ペプチドの切断および脱保護を行った。樹脂に結合した完成ペプチドを含む合成プレートを、９６ディープウェルプレートの上部で保存した。５０μｌの切断溶液を各ウェルに加え、１０分間切断を行い、この手順を３回繰り返した。切断したペプチドを、ディープウェルプレートへの重力流によって、２００μｌの切断溶液で溶出した。さらに２．５時間、ディープウェルプレート内で側鎖官能基の脱保護を行った。その後、氷冷エーテル／ヘキサンでペプチドを沈殿させ、遠心分離した。ペプチドを中性の水溶液に溶解させ、環化を４℃で一晩インキュベートした。ペプチドを凍結乾燥した。
【０１７１】
図１９は、合成および試験したペプチド単量体に関する概観を示す。
【０１７２】
インビトロ増殖アッセイにおいて、ペプチドを、それらのＥＰＯ模倣活性に関して試験した。下記のＶに記載するようにアッセイを行った。各アッセイ日に、３８個の試験ペプチド、１つの参照例、およびＥＰＯのインビトロ活性を並行して測定するために、４０個のマイクロタイタープレートを調製した。ＥＰＯストック溶液は２０ｎＭであった。
【０１７３】
図１９に結果を示す。結果からわかるように、本発明のコンセンサスを満たさない、試験したペプチドは、ＥＰＯ模倣活性を示さなかった。
【０１７４】
ＶＩＩ．ペプチドＨＥＳ−複合体の合成
原理反応概略図を図２１に示す。
【０１７５】
記載される方法の狙いは、本実施例のＨＥＳに従った、穏やかな水性反応条件下でチオール基と選択的に反応する、デンプンの誘導体の生成である。この選択性は、マレイミド基で到達される。
【０１７６】
ＨＥＳを、まずアミノ基で官能化し、その後それぞれのマレイミド誘導体に転換する。限外ろ過膜を介して、反応バッチから低分子量反応物を除いた。生成物、中間体生成物ならびに抽出物はすべて多分散系である。
【０１７７】
アミノ−ＨＥＳ（ＡＨＥＳ）の合成
ダイアフィルトレーションおよびそれに続く凍結乾燥を介して、ヒドロキシエチルデンプン（Ｖｏｌｕｖｅｎ（登録商標））を得た。平均分子量は、４０％の置換グレードの、およそ１３０ｋＤａであった。
【０１７８】
参照によって本明細書中に援用される、Ｊａｃｏｂ Ｐｉｅｈｌｅｒの論文、「Ｍｏｄｉｆｉｚｉｅｒｕｎｇ ｖｏｎ Ｏｂｅｒｆｌａｃｈｅｎ ｆｕｒ ｄｉｅ ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｓｃｈｅ ｕｎｄ ｋｉｎｅｔｉｓｃｈｅ Ｃｈａｒａｋｔｅｒｉｓｉｅｒｕｎｇ ｂｉｏｍｏｌｅｋｕｌａｒｅｒ Ｅｒｋｅｎｎｕｎｇ ｍｉｔ ｏｐｔｉｓｃｈｅｎ Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒｎ」、１９９７年のアミノデキストランに関して記載されている合成に従って、合成を行った。Ｆｌｏｏｒら（１９８９年）に記載されているように、過ヨウ素酸ナトリウムでの、ジオールの水酸基のアルデヒドへの部分的な選択的酸化によって、ＨＥＳを不活性化した。アンモニア存在下で、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）での還元的アミノ化を介してアルデヒド基をアミノ基に転換した（ＹａｌｐａｎｉおよびＢｒｏｏｋｓ、１９９５年）。
【０１７９】
過ヨウ素酸塩開始：過ヨウ素酸塩の使用量は、グルコースビルディングブロックの２０％の数を示す（１８０ｇ／ｍｏｌのグルコースビルディングブロック塊を適用、ＤＳ＝０，４）。限外ろ過および凍結乾燥によって後処理を行った。
【０１８０】
ＭＨ４Ｃｌ／Ｎａ［ＢＨ３ＣＮ］（過剰）での還元的アミノ化
生成物の沈殿およびダイアフィルトレーションを介した作製
解析
定性的：ニンヒドリン反応（Ｋａｉｓｅｒ試験）
定量的：アミノデキストランと比較して２，４，６−ニトロベンゾールスルホン酸（ＴＮＢＳ）を用いる
得られた置換グレードは、約２．８％であった。これは、およそ６４００ｇ／ｍｏｌの１つのアミノ基を有する１つのビルディングブロックのモル質量を生じる。
【０１８１】
マレイミドプロピオニル−アミノ−ヒドロキシエチルデンプン（「ＭａｌＰＡ−ＨＥＳ」）の合成
合成
３−マレイミドプロピオン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭａｌＰＡ−ＯＳｕ）を過剰に用い（１０倍）（５０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７、２０％ＤＭＦ、一晩）、限外ろ過および凍結乾燥によって後処理を行った。
【０１８２】
解析
アミノ基の反応をニンヒドリンおよびＴＮＢＳで実証した。
【０１８３】
導入されたマレイミド基の数を、グルタチオン（ＧＳＨ）の反応、およびエルマン試薬（ＤＮＴＢ）での、７００ＭＨｚ−１Ｈ−ＮＭＲ分光学を介した過度のチオール基の検出よって示した。
【０１８４】
得られた置換グレードは約２％であり、マレイミドビルディングブロックあたり８５００ｇ／ｍｏｌに相当する（１８０ｇ／ｍｏｌのグルコースビルディングブロック塊、ＤＳ＝０，４）。
【０１８５】
ペプチド−ヒドロキシエチルデンプン−複合体（Ｐｅｐ−ＡＨＥＳ）
合成
遊離（Ｐｅｐ−ＩＡ）またはビオチン化（Ｐｅｐ−ＩＢ）Ｎ末端のいずれかを有するシステイン含有ペプチドを用いた。Ｐｅｐ−ＩＡ／Ｂの４：１混合物を一晩過剰に（およそ６当量）リン酸バッファー、５０ｍＭ、ｐＨ６．５／ＤＭＦ ８０：２０中のＭａｌＰＡ−ＨＥＳで転換し、限外ろ過および凍結乾燥によって後処理を行った。
【０１８６】
解析
ＵＶ吸収を２８０ｎｍで測定し、マレイミド基の残りの内容物をＧＳＨ／ＤＮＴＢで測定した。
【０１８７】
ペプチド収量はほとんど定量的であった。検出可能な遊離マレイミド基は、ほとんどまったくなかった。
【０１８８】
ＶＩＩＩ．抗体交差反応性アッセイ
本願の序文に記載したように、患者は時々、ｒｈｕＥＰＯに対する抗体を発生させる。これは、序文に記載した深刻な結果につながる。
【０１８９】
本発明のペプチドの特性をさらに調査するために、ペプチドが実際に抗ＥＰＯ抗体と交差反応するかどうかを解析した。
【０１９０】
抗ＥＰＯ抗体を含有する、ウサギおよびヒト血清を試験に使用した。ＥＰＯまたは以下のＥＰＯ模倣ペプチドのいずれかで、これらの血清を前処理した。
【０１９１】
【化３８】
異なる濃度のエリスロポイエチンおよびＥＰＯ模倣ペプチドを解析で使用した。血清中に存在する抗ＥＰＯ抗体を吸着させるための試験物質での血清の前処理の後、血清を放射活性標識エリスロポイエチンで処理した。前吸着工程の後に血清中に残っている抗体はエリスロポイエチンによって結合し、再度免疫沈降する。この試験に用いたプロトコルは、参照によって本明細書中に援用される、Ｔａｃｅｙら、２００３年に記載されている。
【０１９２】
ＥＰＯまたは本発明のＥＰＯ模倣ペプチドのいずれかを用いて行った、抗ＥＰＯ抗体含有血清での前吸着の結果を、図２２に開示する。
【０１９３】
血清をＥＰＯ模倣ペプチドで前処理すると、血清はその後、放射活性標識エリスロポイエチンに接触させると陽性を示した。したがって、抗ＥＰＯ抗体は、前処理にもかかわらず血清中で検出された。これは、ＥＰＯ模倣ペプチドが前処理の間に抗ＥＰＯ抗体に結合できなかったことを意味する。結合活性なしで、抗ＥＰＯ抗体はＥＰＯ模倣ペプチドとともに血清から排除されず、したがって、血清中に残る。抗ＥＰＯ抗体はＥＰＯ模倣ペプチドを認識できず、したがって、ＥＰＯ模倣ペプチドに結合できなかった。
【０１９４】
組換えヒトＥＰＯ（ｒｈｕＥＰＯ）を対照として使用した。血清をエリスロポイエチンで前処理すると、エリスロポイエチンでの前処理によって抗体はすでに結合および排除されていたので、ほとんどの場合、それに続く放射活性標識エリスロポイエチンを取り込むアッセイにおいて、検出可能な抗体はなかった。
【０１９５】
図２２に示す絶対値は、ＩＰで使用した全計数の％ｃｐｍを表す。％ｃｐｍ値が０．９より大きいと、血清は陽性と評価される。１００％ｃｐｍは、全体の使用した計数（放射活性トレーサ）の量、現在のところ放射活性標識ＥＰＯを表す。
【０１９６】
アッセイから、本発明のＥＰＯ模倣ペプチドは有利に抗ＥＰＯ抗体に対する交差反応性を示さないことが示される。したがって、本明細書中に記載されるＥＰＯ模倣ペプチドは、ｒｈｕＥＰＯに対する抗体を発生させた患者においても治療効果を示す。さらに、ＥＰＯ模倣ペプチドに対する抗体はエリスロポイエチンに結合しないと予想される。したがって、本発明のＥＰＯ模倣ペプチドはまた、好ましくは、それらが抗ＥＰＯ抗体との有意な交差反応性を示さない点で特徴付けられる。
【０１９７】
（参考文献）
【０１９８】
【化３９】
。
【図面の簡単な説明】
【０１９９】
【図１】図１である。
【図２】図２である。
【図３】図３である。
【図４】図４である。
【図５】図５である。
【図６】図６である。
【図７】図７である。
【図８】図８である。
【図９】図９である。
【図１０】図１０である。
【図１１】図１１である。
【図１２】図１２である。
【図１３】図１３である。
【図１４】図１４である。
【図１５】図１５である。
【図１６】図１６である。
【図１７】図１７である。
【図１８】図１８である。
【図１９−１】図１９である。
【図１９−２】図１９である。
【図１９−３】図１９である。
【図１９−４】図１９である。
【図１９−５】図１９である。
【図２０】図２０である。
【図２１】図２１である。
【図２２】図２２である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エリスロポイエチン受容体のための結合分子としてのペプチド、その調製方法、これらのペプチドを含有する医薬品、および選択された指示における、好ましくは種々の形態の貧血および脳卒中の治療のための、それらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホルモン、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）は、１６５個のアミノ酸によって構成され、４つの糖化部位を有する糖タンパク質である。４つの複雑な炭水化物側鎖は、約３５ｋＤの全体の分子量の４０パーセントを構成する。ＥＰＯは腎臓で形成され、そこから脾臓および骨髄に移動し、そこで赤血球の生成を刺激する。慢性腎疾患において、減少したＥＰＯ生成は、赤血球減少貧血を生じる。遺伝子工学によって調製した組換えＥＰＯを用いて、貧血を効果的に治療することができる。ＥＰＯは、透析患者の生活の質を向上させる。腎性貧血だけでなく、早産新生児における貧血、炎症および腫瘍関連貧血もまた、組換えＥＰＯによって改善することができる。ＥＰＯによって、腫瘍患者において、よりうまく高投与量化学療法を行うことができる。同様に、ＥＰＯは、放射線療法の範囲内で投与される場合、癌患者の回復を向上する。
【０００３】
ＥＰＯを用いた治療において、タンパク質が体内で比較的迅速に分解されるので、必要とされる投与計画が頻繁または継続的な静脈内または皮下適用に基づく点に問題がある。したがって、組換えＥＰＯ由来分子の発展は、安定性、およびしたがって生物学的半減期を増大させるために、例えばさらなる糖化またはペグ化によって、糖タンパク質を選択的に修飾することに向かっている。
【０００４】
組換えＥＰＯでの治療に関連する別の重要な問題は、治療の間に患者が組換えＥＰＯに対する抗体を発生する危険性である。これは、組換えＥＰＯが内在性ＥＰＯと完全に同一ではないためである。一旦抗体形成が誘導されると、これは内在性エリスロポイエチンの活性の障害にもなる抗体につながることがある。これはしばしば、治療に必要な組換えＥＰＯの投与量を増大させる。特に、かかる抗体が内在性ＥＰＯの障害になる場合、この効果は、治療誘導性自己免疫疾患と解釈することができる。これは、例えば数ヶ月または数年のＥＰＯ治療後に腎臓移植を受ける透析患者の場合に、特に望まれていない。このとき抗体は、移植によって生成される内在性ＥＰＯの活性の障害となることがあり、したがって移植された器官の赤血球形成活性の障害となることがある。現在、生物学的半減期を増大させるために組換えＥＰＯ中で導入された修飾がこの問題を悪化させるか改善させるかは、未決問題である。一般に、広範囲な修飾およびより長い半減期が、この問題のある特性を悪化させると予想される。
【０００５】
代替的戦略は、エリスロポイエチンと配列相同性または構造的関係を共有しないアミノ酸からの合成ペプチドの調製である。エリスロポイエチンより有意に小さい、ＥＰＯの配列と関連のないペプチドが、アゴニストとして作用することができることが示された（非特許文献１）。同じ著者が、かかるペプチドがトランケートされて、依然として活性のある長さ１０アミノ酸の最小のペプチドになることができることを示した。
【０００６】
ＥＰＯの活性を模倣する合成ペプチドは、特許文献１の対象である。これは、好ましくは、一般に１０および１７位と呼ばれる、一方が必須と考えられる位置で２つのプロリンを含む、１０〜４０アミノ酸の明確なコンセンサスの模倣ペプチドを開示している。
【０００７】
したがって、現在までのところ、ＥＰＯ受容体のすべての小ペプチドベースのアゴニストは、非常に活性のあるエリスロポイエチン模倣ペプチドＥＭＰ１中の位置を参照して通常１０および１７位と番号付けられる定義された位置に、少なくとも１つのプロリン、しばしば２つのプロリン残基を含む構造を有してきた（特許文献１、非特許文献１、非特許文献２）。
【０００８】
【化１０】
これらのプロリンは、ペプチドの効果に不可欠であると考えられている。１７位のプロリンに関しては、これは受容体との相互作用によって実証されているが、１０位のプロリンは分子の正しい折りたたみに必要であると考えられた（非特許文献２、非特許文献３も参照のこと）。プロリンの特異的立体化学的特性によって支持される、正しい折りたたみは、通常、生物学的活性の、必要な前提条件である。一般に、プロリンは、（この場合のように）しばしばヘアピン構造およびβターンの形成に関係する、構造形成アミノ酸である。この特性のために、とりわけ、これは、プロリン含有ペプチド／タンパク質を破壊するポストプロリン特異的エンドペプチダーゼの頻繁な攻撃の点である。多数の内在性ペプチドホルモン（アンギオテンシンＩおよびＩＩ、ウロテンシン、チレオリベリン、他の分泌刺激因子等）が、かかる「シングルヒット」ポストプロリン切断によって不活性化される。したがって、プロリン含有ＥＰＯ模倣ペプチドの半減期は、これらの頻繁で活性のある酵素の活性によって短縮される。
【０００９】
そのようなペプチドは化学的に生成することができ、定義された質および同一性で生成物を制御および生じるのがより一層難しい組換え生成を必要としない。かかる小さいサイズのペプチドの化学的生成はまた、生産コストの見地からも競合的であることができる。さらに、化学的生成によって、生物学的半減期を増大させる公知の能力を有することができる糖化、ペグ化、または任意の他の定義された修飾等の、定義された分子変化の導入を可能にする。しかしながら、これまで、既存のＥＰＯ模倣ペプチドを用いたいかなる療法も認可されていない。
【特許文献１】国際公開第９６／４０７４９号パンフレット
【非特許文献１】Ｗｈｉｇｈｔｏｎ ＮＣ，Ｆｒｒｅｌｌ ＦＸ，Ｃｈａｎｇ Ｒ，Ｋａｓｈｙａｐ ＡＫ，Ｂａｒｂｏｎｅ ＦＰ，Ｍｕｌｃａｈｙ ＬＳ，Ｊｏｈｎｓｏｎ ＤＬ，Ｂａｒｒｅｔｔ ＲＷ，Ｊｏｌｌｉｆｆｅ ＬＫ，Ｄｏｗｅｒ ＷＪ（１９９６）Ｓｍａｌｌ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ Ｐｏｔｅｎｔ Ｍｉｍｅｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：４５８−４６３
【非特許文献２】Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｄ．Ｌ．，Ｆ．Ｘ．Ｆａｒｒｅｌｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）．「Ａｍｉｎｏ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｍｉｍｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｔｉｅｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ．」Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４：９３９−９５０
【非特許文献３】Ｗｈｉｇｈｔｏｎ ＮＣ，Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ Ｐ，Ｂａｒｂｏｎｅ ＦＰ，Ｋａｓｈｙａｐ ＡＫ，Ｆｒｒｅｌｌ ＦＸ，Ｊｏｌｌｉｆｆｅ Ｌ，Ｂａｒｒｅｔｔ ＲＷ，Ｄｏｗｅｒ ＷＪ（１９９７）Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｐｏｔｅｎｃｙ ｏｆ ａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｍｅｔｉｃ ｔｈｒｏｕｇｈ ｃｏｖａｌｅｎｄ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：１２６１−１２６５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、本発明の目的は、少なくとも天然のＥＰＯの生物学的活性の必須の部分を示す、代替的合成ペプチドを提供すること、およびしたがって、特に貧血または脳卒中の治療のための、効率的な治療戦略の代替的手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明のある態様によると、ＥＰＯ受容体に結合することができ、アゴニスト活性を含む、少なくとも長さ１０アミノ酸のペプチドが提供される。したがって、ペプチドは、ＥＰＯ模倣特性を示す。本発明のＥＰＯ模倣ペプチドは、ＥＰＯ模倣ペプチドの、一般に１０位と呼ばれる位置にプロリンを含まず、正に荷電したアミノ酸を含む（番号付けに関しては、例えばＥＭＰ１の祖先配列について記載しているＪｏｈｎｓｏｎら、１９９７年を参照されたい）。
【００１２】
前記１０位のプロリンは、ある折りたたみ構造に特徴的なアミノ酸モチーフ、すなわちβターンモチーフ中に位置する（Ｊｏｈｎｓｏｎ、１９９７年を参照されたい）。前記βターン構造は、受容体結合のときに生じる。したがって、本発明のＥＰＯ模倣ペプチドは、１０位でβターンモチーフ中にプロリンを含まないが、正に荷電したアミノ酸を含む。例は、Ｋ、Ｒ、Ｈ、または例えばホモアルギニン等の、それぞれの非天然アミノ酸である。
【００１３】
さらに、以下のアミノ酸の配列を含むペプチドが提供される。
【００１４】
【化１１】
配列中、各アミノ酸は、天然または非天然アミノ酸から選択され、
Ｘ６はＣ、Ａ、Ｅ、α−アミノ−γ−ブロモ酪酸もしくはホモシステイン（ｈｏｃ）であり、
Ｘ７はＲ、Ｈ、Ｌ、ＷもしくはＹもしくはＳであり、
Ｘ８はＭ、Ｆ、Ｉ、ホモセリンメチルエーテル（ｈｓｍ）もしくはノルイソロイシンであり、
Ｘ９はＧ、もしくはＧの保存的交換であり、
Ｘ１０はプロリンの非保存的交換であるか、
またはＸ９およびＸ１０は単一のアミノ酸によって置換され、
Ｘ１１は任意のアミノ酸から独立して選択され、
Ｘ１２はＴもしくはＡであり、
Ｘ１３はＷ、１−ｎａｌ、２−ｎａｌ、ＡもしくはＦであり、
Ｘ１４はＤ、Ｅ、Ｉ、ＬもしくはＶであり、
Ｘ１５はＣ、Ａ、Ｋ、α−アミノ−γ−ブロモ酪酸もしくはホモシステイン（ｈｏｃ）であり、
ただしＸ６もしくはＸ１５のいずれかはＣもしくはｈｏｃである。
【００１５】
記載されるペプチドコンセンサスの長さは、好ましくは１０〜４０または５０または６０アミノ酸の間である。上述の、長さ６０アミノ酸のペプチドは、技術的には適しているものの、ペプチドの長さが増大すると、通常合成がより複雑になり、したがって高価になるので、必ずしも好ましくはない。好ましい実施形態において、ペプチドコンセンサスは、少なくとも１０、１５、１８または２０アミノ酸の長さを示す。勿論、これらは、より長い配列に、それぞれ埋め込まれることができ、含まれることができる。記載されるペプチド配列は、ＥＰＯ受容体の結合ドメインと認められ得る。ＥＰＯ模倣ペプチドとして、それらは、ＥＰＯ受容体に結合することができる。
【００１６】
一方の、または（いくつかの実施形態によると）両方のプロリンまでも、他の天然または非天然アミノ酸によって置換され得るが、本発明のペプチドがＥＰＯ模倣活性をまさに示すことは、非常に驚くべきことであった。実際、本発明のペプチドは、プロリン含有ペプチドのそれに匹敵する活性を有する。しかしながら、プロリン残基を置換するアミノ酸が保存的交換を表さず、それよりも非保存的交換を表すことは、注目すべきことである。好ましくは、Ｋ、ＲおよびＨ等の塩基性アミノ酸等の、正に荷電したアミノ酸、および特にＫが置換に用いられる。置換に用いられる非保存的アミノ酸はまた、非天然アミノ酸であることができ、好ましくは、正に荷電した側鎖を有するものである。言及したアミノ酸の、それぞれの類似物もまた、含まれる。非天然アミノ酸の、適した例は、ホモアルギニンである。ある実施形態によると、ペプチドは、天然アミノ酸のアルギニンを除いて、正に荷電したアミノ酸を１０位に有する。したがって、この実施形態によると、プロリン１０は、Ｋ、Ｈ、または例えばホモアルギニン等の非天然の正に荷電したアミノ酸から選択されるアミノ酸によって置換される。ペプチドが１０位にリシンまたはホモアルギニンを示すことが好ましい。上述のように、１７位のプロリンもまた、非保存的アミノ酸によって置換されることができる。これに関して、前記非保存的アミノ酸がＫ、Ｒ、Ｈまたはホモアルギニン等のそれぞれの非天然アミノ酸等の正に荷電した側鎖を有するものであることも好ましい。この実施形態の副実施形態によると、ペプチドは、天然アミノ酸のアルギニンを除いて、正に荷電したアミノ酸を１７位に有する。したがって、この実施形態によると、プロリン１７は、Ｋ、Ｈ、またはホモアルギニン等の非天然の正に荷電したアミノ酸から選択されるアミノ酸によって置換される。ペプチドが１７位にリシンまたはホモアルギニンを示すことが好ましい。
【００１７】
さらに、配列は、Ｎ末端および／またはＣ末端アセチル化およびアミド化を有することができる。いくつかのアミノ酸はまた、リン酸化されることができる。
【００１８】
本発明によると、エリスロポイエチン受容体に結合し、以下のアミノ酸の配列を含むペプチドもまた提供される。
【００１９】
【化１２】
配列中、各アミノ酸は標準的文字省略形によって示され、
Ｘ６はＣであり、
Ｘ７はＲ、Ｈ、ＬまたはＷであり、
Ｘ８はＭ、ＦまたはＩであり、
Ｘ９はＧ、またはＧの保存的交換であり、
Ｘ１０はプロリンの非保存的交換であり、
Ｘ１１は任意のアミノ酸から独立して選択され、
Ｘ１２はＴであり、
Ｘ１３はＷであり、
Ｘ１４はＤ、Ｅ、Ｉ、ＬまたはＶであり、
Ｘ１５はＣである。
【００２０】
さらに、Ｘ７はセリンであることができ、Ｘ８はｈｓｍまたはノルイソロイシンであることができ、Ｘ１３はまた、１−ｎａｌ、２−ｎａｌ、ＡまたはＦであることができる。ペプチドコンセンサスの長さは、好ましくは１０〜４０または５０または６０アミノ酸の間である。好ましい実施形態において、ペプチドコンセンサスは、少なくとも１０、１５、１８または２０個のアミノ酸を含む。
【００２１】
本発明のペプチドは、Ｌ−アミノ酸または立体異性的Ｄ−アミノ酸の他に、例えばα，α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸または乳酸等の非天然／非保存的アミノ酸、例えば１−ナフチルアラニン、２−ナフチルアラニン、ホモセリン−メチルエーテル、β−アラニン、３−ピリジルアラニン、４−ヒドロキシプロリン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−メチルグリシン（サルコシン）、ホモアルギニン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−アセチルグリシン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリシン、ノル−リシン、５−アミノレブリン酸またはアミノ吉草酸を含むことができる。具体的には末端の位置での、Ｎ−メチルグリシン（ＭｅＧ）およびＮ−アセチルグリシン（ＡｃＧ）の使用が特に好ましい。定義されたペプチドのｒｅｔｒｏ、ｉｎｖｅｒｓｏ型、およびｒｅｔｒｏ／ｉｎｖｅｒｓｏ型ペプチドであるペプチド、ならびに完全にＤ−アミノ酸からなるペプチドもまた、本発明の範囲内である。
【００２２】
本発明はまた、ペプチドの誘導体、例えばメチオニンの酸化生成物、脱アミド化されたグルタミン、アルギニンおよびＣ末端アミドにも関する。
【００２３】
本発明のある実施形態によると、ペプチドは、アミノ酸残基Ｘ９およびＸ１０を置換する単一のアミノ酸を有する。この実施形態において、１つの非天然アミノ酸、例えば５−アミノレブリン酸またはアミ吉草酸によって、両方の残基もまた置換されることができる。
【００２４】
さらなる実施形態において、本発明によるペプチドは、コンセンサス配列
【００２５】
【化１３】
を含み、
配列中、Ｘ６〜Ｘ１５は上記の意味を有し、
Ｘ４はＹであり、
Ｘ５は任意のアミノ酸から独立して選択され、好ましくはＡ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、ＴまたはＩである。
【００２６】
本発明のペプチドは伸長されることができ、コンセンサス配列
【００２７】
【化１４】
を含むことができ、
配列中、Ｘ４〜Ｘ１５は上記の意味を有し、
Ｘ３は任意のアミノ酸から独立して選択され、好ましくはＤ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ｓ、ＴまたはＶであり、
Ｘ１６は任意のアミノ酸から独立して選択され、好ましくはＧ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、ＳまたはＴ、より好ましくはＫ、Ｒ、ＳまたはＴであり、
Ｘ１７は任意のアミノ酸から独立して選択され、好ましくはＡ、Ｇ、Ｐ、Ｒ、Ｋ、Ｙ、または正に荷電した側鎖を有する非天然アミノ酸、より好ましくはＫまたはＨａｒであり、
Ｘ１８は任意のアミノ酸から独立して選択される。
【００２８】
本発明のさらなる実施形態において、ペプチドは、Ｃ、Ｅ、Ａもしくはｈｏｃ、好ましくはＣとしてのＸ６、および／またはＲ、ＨもしくはＹもしくはＳとしてのＸ７、および／またはＦもしくはＭとしてのＸ８、および／またはＧもしくはＡ、好ましくはＧとしてのＸ９、および／またはＫもしくはＨａｒとしてのＸ１０、および／またはＶ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｅ、Ａ、ＴもしくはノルイソロイシンとしてのＸ１１、および／またはＴとしてのＸ１２、および／またはＷとしてのＸ１３、および／またはＤもしくはＶとしてのＸ１４、および／またはＣもしくはｈｏｃ、好ましくはＣとしてのＸ１５、および／またはＰ、ＹもしくはＡ、または塩基性の天然もしくは非天然アミノ酸としてのＸ１７を含む。しかしながら、Ｘ１７がＫ、または例えばホモアルギニン等の正に荷電した側鎖を有する非天然アミノ酸であることもまた好ましい。
【００２９】
図１９は、ＥＰＯ模倣活性を示す、さらなる新規の適したペプチド配列を開示する。さらなるペプチドは、以下の配列を示す：
【００３０】
【化１５−１】
５−アミノレブリン酸（５−Ａｌｓ）は、
【００３１】
【化１５−２】
である。
【００３２】
ホルモンエリスロポイエチンの受容体への結合能を有し、アゴニスト活性を示し、ペプチドがプロリンを示さないことを特徴とするペプチドもまた開示される。上述のように、これらのペプチドは、好ましくは、一般に１０および１７位と呼ばれる位置にプロリンを含まず、異なる天然アミノ酸または５−アミノレブリン酸を含む。これらは、好ましくは１７位のリシンを示す。それぞれのペプチドをコードする核酸もまた開示される。
【００３３】
本発明のポリペプチドのアミノ酸配列内で、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換を行うことができ、置換は非極性側鎖を有するアミノ酸、極性側鎖を有する天然または非天然の、荷電していないＤ−またはＬ−アミノ酸、芳香族側鎖を有するアミノ酸、天然または非天然の正に荷電したＤ−またはＬ−アミノ酸、天然または非天然の負に荷電したＤ−またはＬ−アミノ酸内、ならびにより小さいサイズおよび分子量の任意のアミノ酸内で起こり、ここで元のアミノ酸の分子量は、元のアミノ酸の分子量のおよそ±２５％より大きく外れるべきではなく、アゴニスト効果を伴うホルモンエリスロポイエチンの受容体への結合能は維持される。好ましくは、わずか１、２または３個のアミノ酸が置換される。１０および１７位にプロリンが導入されない配列変化が好ましい。
【００３４】
本明細書中に記載されるペプチド配列は、ＥＰＯ受容体への結合ドメインを構成する、適した単量体ペプチド単位として使用することができる。これらは、ＥＰＯ受容体に結合するので、そのモノマー形態で使用することができる。本明細書中に記載されるように、ＥＰＯ受容体の二量体化を誘導する能力およびしたがって生物学的活性が単量体結合単位の二量体化によって促進されることが示されたので、これらは、好ましくは二量体として使用される。
【００３５】
したがって、多くの異なるペプチドが本発明の範囲内であることは明らかである。しかしながら、配列
【００３６】
【化１５−３】
は、ある欠点を有し、したがって本発明によると好ましくないことがわかっている。
【００３７】
記載される個々のペプチド配列の始まり（Ｎ末端）および終わり（Ｃ末端）で、５個までのアミノ酸が除去および／または付加され得る。ペプチド機能が保存される限りサイズは直接的に関連しないことは、自明である。さらに、単量体としての活性を包むのに短すぎるかもしれない個々のペプチド配列は、通常、二量体化のときにアゴニストとして機能することに留意されたい。したがって、かかるペプチドは、好ましくは、それらの二量体形で用いられる。したがって、それぞれの、トランケートされた、およびまたは伸長された実施形態もまた、本発明の精神に含まれる。
【００３８】
本発明において、大文字としての一文字表記の省略形は、標準的ポリペプチド命名法のものであり、非天然アミノ酸の付加によって伸長される。
【００３９】
【化１６】
【００４０】
【化１７】
上述のように、本発明はまた、単一のアミノ酸の保存的交換による、ペプチドおよび定義されたペプチドコンセンサスの修飾を含む。かかる交換は、結合する分子の構造および機能を変化させるが、ほとんどの場合、変化はわずかでしかない。保存的交換では、あるアミノ酸が、同様の特性を有するグループ内の別のアミノ酸によって置換される。
【００４１】
対応するグループの例は、
− 非極性側鎖を有するアミノ酸：Ａ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、Ｍ
− 極性側鎖を有する、荷電していないアミノ酸：Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、Ｙ、Ｎ、Ｑ
− 芳香族側鎖を有するアミノ酸：Ｆ、Ｙ、Ｗ
− 正に荷電したアミノ酸：Ｋ、Ｒ、Ｈ
− 負に荷電したアミノ酸：Ｄ、Ｅ
− 同様のサイズまたは分子量のアミノ酸であって、置換するアミノ酸の分子量が元のアミノ酸の分子量から最大±２５％（または±２０％、±１５％、±１０％）外れる、アミノ酸。
【００４２】
グループが、例えば正に荷電した側鎖を示すグループの場合はホモアルギニン等の、それぞれの側鎖プロフィールを有する非天然アミノ酸も含むことは、自明である。プロリン１０の場合、例えば非天然アミノ酸等の置換する分子は、側鎖の特性によって特徴付けられる上記のグループの１つに明確に割り振ることができず、通常、本発明によるプロリンの非保存的置換として認められるべきである。これらの通常でないアミノ酸を類別するために、分子量による分類補助が役立つかもしれない。
【００４３】
より具体的には、Ｗｒｉｇｈｔｏｎら（米国特許第５７７３５６９号および関連する特許）は、ファージディスプレイ技術を用いて、どのアミノ酸が活性を維持しながら置換されることができるかを詳細に調べた。彼らはまた、可能性のあるトランケーション、すなわち所定のＥＰＯ模倣ペプチドの最小の長さに関するデータを調査および公開した。しかしながら、中央のＧｌｙ残基の近くのプロリンが、活性のあるペプチドを得るために唯一の可能性のあるものと思われた。
【００４４】
本発明のある実施形態によると、下記の配列番号２、４〜９からなる群より選択されるペプチドが提供される。配列番号２の場合のように、１０位のＫおよび１７位のＫを有するペプチドが特に好ましい。
【００４５】
【化１８】
ある実施形態によると、ペプチド二量体または多量体は、上記の配列番号２および４〜９またはそれらの修飾による単量体に基づいて形成される。本明細書中に記載されるペプチドは、例えば単一のアミノ酸の保存的交換によっても修飾されることができ、好ましくは、１、２または３個より多くないアミノ酸が交換される。
【００４６】
好ましくは、これらのペプチドは、Ｎ末端のＡｃＧおよびＣ末端のＭｅＧに関して修飾される。
【００４７】
上記で概略を述べたように、本発明の記載されるペプチドは、エリスロポイエチン受容体の結合部位を認識する単量体結合ドメインと考えることができる。しかしながら、Ｗｒｉｇｈｔｏｎら（Ｗｒｉｇｈｔｏｎ、１９９７年）によって指摘されたように、受容体をホモ二量体化させてシグナルトランスダクションを誘導するためには、これらの結合ドメインの２つが一般に必要とされる。したがって、１つの単一の分子中のこれらの結合ドメインの２つの組合せが活性を相当に増大させ、１つの単一の結合ドメインを有するペプチドが同じ活性の定性的パターンを示すがともに結合した結合ドメインの２つがかなり低いＥＤ５０（５０％有効量、活性の尺度）を示す結果につながったことは、非常に驚くべきようなことではなかった。２つの結合ドメインを含むペプチドは、本明細書中の文脈内で、二価または二量体ペプチドであるとして特定され、特に好ましい。
【００４８】
２つの単量体結合ドメインを組み合わせるための、ある周知の技術的解決法は、二量体化である。このアプローチに従うすべての解決法は、これまでのところ、
ａ）結合ドメインがまず一価または単量体ペプチドとして別々に合成され、これが工程ｂの調製において、例えば反応基の結合によって修飾されることができ、
ｂ）第２の反応工程において、２つの（ほとんどの場合同一な）結合ドメインが別々の二量体化反応において連結され、これが通常２つの二量体化ドメインの間に挟まれるリンカー分子を含むことができること
によって特徴付けられる。
【００４９】
かかる二量体は、二価ペプチドの例であり、本質的に単量体と同じ生物学的機能を示す。通常これらは、ＥＰＯ模倣ペプチドの場合、促進された生物学的活性を示す。
【００５０】
本発明の教示に従って適用することもできる、単量体の二量体化またはオリゴマー化するいくつかの技術が、当業者に公知である。単量体は、例えばリンカーへの共有結合によって、二量体化することができる。リンカーは、本発明のポリペプチド単位の間の共有結合を生じる連結分子である。ポリペプチド単位は、ＥＰＯ受容体への結合が向上するように、リンカーを介して組み合わせることができる（Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９７年、Ｗｒｉｇｈｔｏｎら、１９９７年）。これはさらに、Ｗｒｉｇｈｔｏｎら（Ｗｒｉｇｈｔｏｎ、１９９７年）によって記載されているタンパク質担体分子との非共有相互作用による単量体ビオチン化ペプチドの多量体化を参照する。ビオチン／スロレプトアビジン系、すなわちペプチドのＣ末端をビオチン化して、続いてビオチン化ペプチドをストレプトアビジンとともにインキュベートすることを使用することも可能である。あるいは、ジケトピペラジン構造を形成することによって二量体化を達成することもまた公知である。この当業者に公知の方法は、例えばＣａｖｅｌｉｅｒら（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｔｈｅ ｗａｖｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｕｔｕｒｅ中、Ｍｉｃｈａｌ ＬａｂｌおよびＲｉｃｈａｒｄ Ａ．Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（編）、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ、２００１年）に詳細に記載されている。二量体化および非共有多量体化に関するこれらの文献の開示は、参照によって本明細書中に援用される。従来技術から公知の、ペプチド二量体を得る別の代替的方法は、Ｎ末端アミノ基と反応することによって最終的な二量体ペプチドを形成する、後のリンカー部分の反応性前駆体として、二官能性活性化ジカルボン酸誘導体を使用することである（Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９７年）。単量体もまた、リンカーへの共有結合によって二量体化することができる。好ましくは、リンカーは、ＮＨ−Ｒ−ＮＨを含み、Ｒは、別の分子部分への結合を可能にするカルボキシル基またはアミノ基等の官能基で置換された低級アルキレンである。リンカーは、リシン残基またはリシンアミドを含有することができる。同様に、ＰＥＧもリンカーとして使用することができる。リンカーは、２つのカルボン酸を含み、任意の１つまたは複数の原子が１つまたは複数のＰＥＧ分子に結合することのできるアミン等の官能基で置換された分子であることができる。連結部分を用いた、ペプチドのオリゴマー化および二量体化の可能性のある工程の詳細な説明はまた、国際公開第２００４／１０１６０６号に挙げられている。
【００５１】
二量体化／多量体化に関するこれらの文献の開示は、参照によって本明細書中に援用される。
【００５２】
ペプチド単量体または二量体は、少なくとも１つのスペーサー部分をさらに含むことができる。好ましくは、かかるスペーサーは、単量体または二量体のリンカーを水溶性ポリマー部分、または例えばＰＥＧであることができる保護基に連結する。ＰＥＧは、少なくとも３ｋＤ、好ましくは２０〜６０ｋＤの間の、好ましい分子量を有する。スペーサーは、−ＮＨ−結合またはＣＯＯＨ基で終わるＣ１〜１２部分であることができ、１つまたは複数の利用可能な炭素原子が、低級アルキル置換基で必要に応じて置換され得る。特に好ましいスペーサーは、国際公開第２００４／１００９９７号に開示されている。すべての文献、国際公開第２００４／１００９９７号および国際公開第２００４／１０１６０６号は、参照によって本明細書中に援用される。ペプチドのＰＥＧ修飾は、国際公開第２００４／１０１６００号に開示されており、これも参照によって本明細書中に援用される。
【００５３】
機能的に十分であり、したがって本発明の教示に従って使用可能であるが、二量体分子の合成の従来技術のアプローチは、いくつかの欠点を有することがある。
【００５４】
ある可能性のある欠点は、連結される単量体がまず別々に合成されなければならない点にあると認められた。二量体化、それぞれの多量体化反応の間の単量体ペプチドの推計学的な組合せのために、このアプローチでヘテロ二量体二価／多価ペプチドを（選択的および意図的に）得ることは、特に難しい。少なくとも、これは特別で意図的なヘテロ二量体の収量の大きな損失につながる。２つ以上のわずかに異なる単量体結合ドメインを含む二価または多価ペプチドは、そのヘテロ二量体の性質のために、最終的な二価ペプチド中の相互作用を安定させることができる２つのドメインの間の特別な相互作用を導入することができるので、非常に望ましい。しかしながら、従来技術の「推定学的な二量体化反応」に関連する収量の高い損失のために、これは通常、経済的に魅力的なアプローチではない。
【００５５】
したがって、二量体化に従来技術のアプローチを適用することは、技術的には適しているが、記載されたように異種結合ドメインを有するこれらのペプチドを提供するのに、いくつかの経済的欠点を有する。しかしながら、本発明はまた、異種結合ドメインをも含み得る、高度に活性のある多価または二価ペプチドを得るための、かなりより効率の高い戦略を有利に教示する。
【００５６】
この戦略の中心的概念は、二量体化または多量体化の前の別々の反応における多価または二価ペプチドの一部を形成する単量体ペプチドの合成を断つが、１つの工程で単一のペプチドとして、例えば１つの単一の固相反応において、最終的な二価または多価ペプチドを合成する。したがって、別々の二量体化または多量体化工程は、もはや必要ではない。この態様は、大きな利点、すなわち最終的なペプチド単位中の各配列位置に対する完全で独立した制御を提供する。この方法は、各配列位置に対する独立した制御のために、ペプチド単位中に少なくとも２つの異なる受容体特異的結合ドメインを容易に含むことを可能にする。
【００５７】
この実施形態によると、結合ドメインの間の最終的なペプチドの配列（「リンカー領域」である）は、アミノ酸のみで構成され、したがって、１つの単一で連続した二価または多価ＥＰＯ模倣ペプチドにつながる。本発明の好ましい実施形態において、リンカーは、高い構造的柔軟性を可能にする天然または非天然アミノ酸で構成される。これに関して、連結するアミノ酸として、ねじれに関する高い柔軟性が知られているグリシン残基を使用することが有利であることができる。しかしながら、同様にアラニンまたはβ−アラニン等の他のアミノ酸、またはそれらの混合物もまた用いることができる。使用されるアミノ酸の数または選択は、それぞれの立体的事実に依存する。本発明のこの実施形態は、生物活性構造のゆがみを避けるために、分子モデリングによって、適したリンカーの、あつらえの設計を可能にする。３〜５個のアミノ酸で構成されるリンカーが特に好ましい。
【００５８】
最終的な二価または多価ペプチドの機能的ドメイン（または単量体単位）の間のリンカーがペプチドの別個の部分であるか、または完全もしくは部分的に、単量体機能的ドメインの一部であるアミノ酸で構成されることができるかのいずれかであることができることは、注目に値する。例えば、アミノ酸１および２および１９および２０位のグリシン残基が、リンカーの一部を形成することができる。例としては、配列１１〜１４が挙げられる。したがって、アミノ酸がリンカー単位ならびに単量体サブユニットの一部を形成することができるので、用語「リンカー」は、構造的よりもむしろ機能的に定義される。
【００５９】
上述のように、二価／多価ペプチドの合成の間に、最終的なペプチド内の各配列位置が制御され、したがって正確に決定することができるので、リンカーを含む、ペプチドまたはその特定の領域もしくはドメインを特別にまたは目的に合わせて作製することが可能である。これは、好ましくない分子内相互作用による最終的な二価ペプチドの生物活性構造のゆがみを避けることを可能にするので、特に有利である。ゆがみの危険性は、合成の前に分子モデリングによって評価され得る。これは特に、単量体ドメインの間のリンカーの設計に適用される。
【００６０】
本発明の連続した二価／多価ペプチドは、対応する単量体ペプチドよりもかなり高い活性を示し、したがって、効率の増大が二価ペプチド概念に関連するという、他の二量体ペプチドから知られている観察を確かにする。
【００６１】
単量体および二量体ペプチドに関して、連続した二価／多価ペプチドは、例えばアセチル化もしくはアミド化によって修飾することができるか、またはＣ末端もしくはＮ末端の位置で伸長することができる。ＰＥＧ、デンプンまたはデキストラン等の可溶性部分の結合を含む、上述の単量体ペプチド（単量体）の従来技術の修飾もまた、本発明の多価または二価ペプチドに適用される。
【００６２】
すべての可能性のある修飾もまた、リンカーの修飾に適用される。具体的には、例えばＰＥＧ、デンプンまたはデキストラン等の可溶性ポリマー部分をリンカーに結合させることが有利であることができる。
【００６３】
本発明の最終的な多価または二価ペプチドの合成はまた、２回の、それに続く独立した、結合ドメインのそれぞれの内のジスルフィド結合または他の分子内結合の形成を有利に含むことができる。それによって、ペプチドはまた環化され得る。
【００６４】
本発明の二価構造は、有利に、本明細書中に報告されるペプチド単量体に基づいて形成される。
【００６５】
ＥＰＯ受容体の二量体化のために適切なペプチド単位のいくつかの例を、次に挙げる。結合ドメイン上方の棒は、任意選択である好ましい分子内ジスルフィド架橋を象徴する。
【００６６】
【化１９】
【００６７】
【化２０】
これらの二価構造中のリンカーは、分子モデリングによって、生物活性構造のゆがみを避けるように特別に作製する（図１）。
【００６８】
配列番号１２
リンカー配列は、グリシン残基１つ分短縮することができる。この配列はまた、同時に結合ドメインの一部を形成するグリシン残基によって構成されるリンカーの例である（配列番号２参照）。
【００６９】
【化２１】
結合ドメインはまた、単量体単位として使用され得る（配列番号１３）。
【００７０】
【化２２】
【００７１】
【化２３】
この配列は、２つのわずかに異なる（異種の）結合ドメインを含む、本発明の連続した二価ペプチドを提供する。かかる二価ペプチドは、従来技術の二量体化アプローチ（上記参照）では、経済的に入手できない。これらの結合ドメインもまた、単量体
【００７２】
【化２４】
として適用することができる。
【００７３】
さらなる例は、
【００７４】
【化２５】
である。
【００７５】
さらなる実施形態によると、ペプチドは、さらなるアミノ酸、好ましくは、例えば以下の配列等の中に、Ｎ末端のシステイン等の反応性側鎖を有するアミノ酸を必要に応じて有する。
【００７６】
【化２６】
さらなるペプチドの例は、以下のアミノ酸配列を示す。
【００７７】
【化２７】
第１の配列は、Ｘ７位にセリンを示す。この配列が二量体に組み込まれると、水酸基の導入を介して新しい水素架橋が生じることがわかった。したがって、生物活性構造が安定化されるので、Ｘ７位のセリンの使用は、二量体に特に有利である。
【００７８】
非天然アミノ酸ホモアルギニンを示す第２の配列は、獣医学的目的のための医薬組成物での使用に特に適している。１０および／または１７位に、例えばホモアルギニン等の、長い正に荷電した側鎖を有するアミノ酸を有するペプチド配列が、例えばマウス／イヌ受容体等のＥＰＯ受容体に対する強力な結合能を示すことが、一般にわかっている。したがって、これらは獣医学的製品での使用に特に適しているが、これらの使用は、それに限定されない。
【００７９】
反応性側鎖は、例えばさらなる修飾のための、連結する結びつきとして機能することができる。ペプチドはさらに、第１および第２ならびに／または第３および第４のシステインの間の分子内ジスルフィド架橋を必要に応じて含む。
【００８０】
配列番号２、４〜９および１２、１３および１５、１５ａによって例示されるような単量体ペプチドが、本発明の連続した二価ペプチドに有利に組み合わされることに気づくのは重要である。しかしながら、同様にこれらの単量体の二量体化の従来技術の方法も適用することができる。本発明の範囲に入る単量体ペプチドに適用されるこれらの従来技術のアプローチの例としては、以下のものが挙げられる（が、これに限定されない）。
【００８１】
１．前記単量体ペプチドの一方のＣ末端がもう一方のペプチドのＣ末端に共有結合する、Ｃ末端からＣ末端への連結を介した二量体化。単量体の間のリンカー／スペーサーは、ジケトピペラジン単位を含むことができる。好ましいＧｌｙ−Ｇｌｙジケトピペラジン骨格は、Ｃ末端グリシン単量体を活性化することによって達成することができる。この原理はまた、Ｃ末端二量体化を形成するための使用であり得る。
【００８２】
以下の式および例は、分子モデリングによって最適化された、４つの特製の例を表す。
【００８３】
（ａ）配列番号２に基づく二量体（二量体構造を図２に示す）：
【００８４】
【化２８】
（ｂ）グリシン１つ分短縮されたリンカーを有する、配列番号２に基づく二量体。構造を図３に示す。
【００８５】
【化２９】
（ｃ）グリシンがβ−アラニンによって置換された、配列番号２に基づく二量体（図４）。単量体（配列番号１６）もまた、ＥＰＯ模倣ペプチドとして適用可能である。
【００８６】
【化３０】
（ｄ）代替的グリシンがβ−アラニンによって置換された、配列番号２に基づく二量体（図５）。単量体（配列番号１７）もまた、ＥＰＯ模倣ペプチドとして適用される。
【００８７】
【化３１】
。
【００８８】
２．前記単量体ペプチドの一方のＮ末端がもう一方のペプチドのＮ末端に共有結合し、それによってスペーサー単位が、好ましくはジカルボン酸ビルディングブロックを含んでいる、Ｎ末端からＮ末端への連結を介した二量体化。
【００８９】
（ａ）ある実施形態において、Ｎ末端でグリシン残基１つ分伸長された、配列番号２に基づいて得られる二量体（配列番号１８）は、リンカー／スペーサーとしてヘキサンジオイル単位を含む（図６）：
【００９０】
【化３２】
（ｂ）代替的な実施形態において、二量体化は、リンカー／スペーサーとしてオクタンジオイル単位を用いることによって達成することができる（図７）：
【００９１】
【化３３】
。
【００９２】
３．２つのペプチド単量体を連結する適したスペーサー分子を含むことによって、前記単量体ペプチドの一方のアミノ酸側鎖がもう一方のペプチドのアミノ酸側鎖に共有結合する、側鎖を介した二量体化。これは、
（ａ）アミド結合を介した連結
【００９３】
【化３４】
（ｂ）またはジスルフィド架橋を介した連結
【００９４】
【化３５】
を含むことができる。
【００９５】
Ｘは、それぞれの連結する結合の形成に関与するそれぞれのアミノ酸のバックボーンの中心を象徴する。
【００９６】
上述のそれぞれの集合方法はまた、多量体の調製に用いることができる。
【００９７】
それぞれの異種または同種の二価または多価ペプチドを形成するために、本明細書中に記載される、結合ドメイン、それぞれのペプチドのすべてが、単独または二価／多価ペプチドの一部としてのいずれかで、単量体形で使用することができるおよび／または１つまたは複数の他の同一もしくは異なるペプチドドメインのいずれかと組み合わせることができることが指摘される。
【００９８】
ペプチドは、例えばアセチル化もしくはアミド化によって修飾することができるか、またはＣ末端もしくはＮ末端の位置で伸長することができる。例えばポリマーの結合部位の調製のための、２つの末端の一方での１つまたは複数のアミノ酸での伸長は、しばしば、連続したペプチドとして最良に製造され得るヘテロ二量体二価ペプチド単位につながる。
【００９９】
本発明の化合物は、ヒトおよび／または獣医学的医薬組成物の調製に、有利に使用され得る。ＥＰＯ模倣剤として、これらは、エリスロポイエチンと基本的に同じ定性的活性パターンを示す。したがって、これらは一般に、エリスロポイエチンと同じ兆候に適している。
【０１００】
エリスロポイエチンは、サイトカインスーパーファミリーの１つである。序文に記載された刺激効果の他に、エリスロポイエチンが幹細胞を刺激することもわかっている。したがって、本明細書中に記載されるＥＰＯ模倣剤は、幹細胞関連効果によって引き起こされるすべての兆候に適している。非限定的例は、神経系に関連する疾患の予防および／または治療である。例は、例えばパーキンソン症候群、アルツハイマー病、ハンティングトン舞踏病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、ゴーシェ病、テイ−サックス病、ニューロパシー、末端神経損傷、脳腫瘍、脳損傷、脊髄損傷または脳卒中性損傷等の、神経学的損傷、疾患または障害である。本発明のＥＰＯ模倣ペプチドはまた、心不全を患う、または患う危険性のある患者の予防的および／または治療的処置にも使用可能である。例は、心筋梗塞、冠状動脈疾患、心筋炎、化学療法治療、アルコール症、心筋症、高血圧症、僧帽弁閉鎖不全症または大動脈狭窄症を含む心臓弁膜症、ならびに甲状腺の障害、慢性および／または急性冠症候群である。
【０１０１】
さらに、ＥＰＯ模倣剤は、内皮前駆細胞の生理学的動員、増殖および分化の刺激、脈管形成の刺激、内皮前駆細胞の機能不全に関連する疾患の治療、ならびにかかる疾患の治療のための医薬組成物および前記ペプチドおよび内皮前駆細胞の刺激に適した他の作用物質を含む医薬組成物の製造に用いることができる。かかる疾患の例は、高コレステロール血症、真性糖尿病、内皮媒介性慢性炎症疾患、細網内皮症を含む内皮症、アテローム性動脈硬化症、冠状心疾患、心筋虚血、狭心症、加齢性心臓血管疾患、レーノー病、妊娠性高血圧症、慢性もしくは急性腎不全、心不全、創傷治癒および続発疾患である。
【０１０２】
さらに、本発明のペプチドは、血液脳関門を横切って作用物質を送達するための適した担体であり、それぞれの目的および／または血液脳関門を通過することのできるそれぞれの治療的複合剤の製造に用いることができる。
【０１０３】
本明細書中に記載されるペプチドは、エリスロポイエチンの欠乏または少ないもしくは不完全な赤血球集団によって特徴付けられる障害の治療、および特に任意の型の貧血または脳卒中の治療に特に適している。ペプチドはまた、哺乳動物におけるヘマトクリットの増大および／または維持に適している。かかる医薬組成物は、意図する投与手順に組成物を採用するために、薬学的に許容され得る担体を必要に応じて含むことができる。適した送達方法ならびに担体および添加物は、例えば、国際公開第２００４／１０１６１１号および国際公開第２００４／１００９９７号に記載されている。
【０１０４】
上記で概略を述べたように、二量体またはさらには多量体への単量体ペプチドの二量体化は、通常、それぞれの単量体ペプチドと比較して、ＥＰＯ模倣アゴニスト活性を向上させる。しかしながら、活性をさらに促進することが望ましい。例えば、二量体ＥＰＯ模倣ペプチドであっても、細胞の機構の活性化に関して、ＥＰＯよりも能力が低い。
【０１０５】
従来技術において、ペプチドの活性を増大させるために、例えばより能力の高い候補を同定するためのアミノ酸配列の変化によって、いくつかのアプローチがなされた。しかしながら、これまでのところ、生物学的活性を向上させるために、ペプチド、特にＥＰＯ模倣ペプチドの活性をさらに増大させることが、依然として望ましい。
【０１０６】
本発明のさらなる実施形態は、この問題の解決法を提供する。ここでは、標的分子に結合し、
ｉ）各ペプチド単位が、標的への結合能を有する少なくとも２つのドメインを含む、少なくとも２つのペプチド単位、
ｉｉ）少なくとも１つのポリマー担体単位
を含む化合物が提供され、ここで前記ペプチド単位は、前記ポリマー担体単位に結合する。
【０１０７】
驚くべきことに、ポリマー支持体上の２つ以上の本発明の二価または多価ペプチドの組合せが、付加的なだけでなく過剰付加的にもそれらの結合受容体に対する二価（またはさらには多価）ペプチドの効率を大いに増大させることがわかっている。したがって、相乗効果が観察される。
【０１０８】
用語「二価」は、本発明の目的のために使用される場合、標的への、本明細書中では具体的にはＥＰＯ受容体への結合能を有する２つのドメインを含むペプチドとして定義される。これは、用語「二量体」と交換可能に使用される。したがって、「多価」または「多量体」ＥＰＯ模倣ペプチドは、ＥＰＯ受容体へのいくつかの個々の結合ドメインを有する。用語「ペプチド」および「ペプチド単位」がサイズに関するいかなる制限も組み込まず、オリゴおよびポリペプチドならびにタンパク質を組み込むことは、自明である。
【０１０９】
ポリマー担体単位に結合された、２つ以上の二価または多価ペプチド単位を含む化合物は、この実施形態の文脈において、「超価（ｓｕｐｒａｖａｌｅｎｔ）」と呼ばれる。これらの超価分子は、技術の現状で公知の二量体または多量体分子とは大いに異なる。技術の現状は単に、二量体を生じるために単量体ＥＰＯ模倣ペプチドを組み合わせるだけである。対照的に、超価分子は、すでに（少なくとも）二価のペプチド単位をポリマー担体単位に連結させ、それによって超価分子を生じることによって生じる（例を図１３〜１５に挙げる）。それによって、ペプチドの全体的活性および効率が大いに促進され、したがってＥＣ５０用量が減少する。
【０１１０】
これまでのところ、超価分子の、技術の現状で公知の分子と比較して大きな能力の理由は、完全には理解されていない。これは、技術の現状で公知の二量体分子が単に、二量体１つあたり１つの標的、それぞれの受容体結合単位を提供するだけであるためかもしれない。したがって、１つの受容体複合体だけが、二量体化合物の結合のときに生じ、それによって１つのシグナルトランスダクション過程だけが誘導される。例えば、２つの単量体ＥＰＯ模倣ペプチドがＰＥＧを介して連結されてペプチド二量体を形成し、それによって、シグナルトランスダクションに必要な受容体単量体の二量体化を容易にする（Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９７年）。対照的に、本発明の超価化合物は、いくつかの、すでに二価または多価の、それぞれの受容体結合単位を含む。これによって、化合物１分子あたりに、細胞表面にいくつかの受容体複合体が生じることが可能になり、それによっていくつかのシグナルトランスダクションが誘導され、それによってペプチド単位の活性が過剰付加的に高まる。超価化合物の結合は、細胞表面での受容体複合体の密集を生じ得る。
【０１１１】
この実施形態で用いられるＥＰＯ模倣ペプチド単位は、同種または異種のいずれかであることができ、同一または異なるペプチド単位のいずれかが用いられることを意味する。同種または異種でもあり得るペプチド単位の結合ドメイン（上述のような単量体ペプチド）も同様である。担体単位に結合する二価または多価ペプチド単位は、同じ受容体標的に結合する。
【０１１２】
しかしながら、これらは勿論、依然としてそれらのアミノ酸配列は異なることができる。二価または多価ペプチド単位の単量体結合ドメインは、直鎖状または環状のいずれかであることができる。環状分子は、例えば分子内システイン架橋の形成によって生じることができる（上記参照）。
【０１１３】
ポリマー担体単位は、少なくとも１つの天然または非天然の、分枝、直鎖状または樹状ポリマーを含む。ポリマー担体単位は、好ましくは水および体液に可溶性であり、好ましくは薬学的に許容され得るポリマーである。水溶性ポリマー部分としては、例えば、ＰＥＧ、ＰＥＧホモポリマー、ｍＰＥＧ、ポリプロピレングリコールホモポリマー、エチレングリコールとプロピレングリコールとの共重合体（ここで前記ホモポリマーおよび共重合体は、置換されていないか、または一方の末端で、例えばアシル基で置換されている）を含む、ポリアルキレングリコールおよびその誘導体、ポリグリセリンもしくはポリシアリン酸、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースを含む、セルロースおよびセルロース誘導体、デンプン（例えば、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）、特にヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）およびデキストリンならびにそれらの誘導体）、硫酸デキストラン、架橋デキストリンおよびカルボキシメチルデキストリンを含むデキストランおよびデキストラン誘導体、ヘパリンおよびヘパリンの断片、ポリビニルアルコールおよびポリビニルエチルエーテル、ポリビニルピロリドン、ａ，ｂ−ポリ［（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパラギン酸アミド、ならびにポリオキシエチル化ポリオルが挙げられるが、これらに限定されない。勿論、他の生物学的に不活性な水溶液ポリマーもまた用いられ得る。適切な担体単位の、単純だがやはり好ましい例は、例えばポリエチレングリコール（ビス−マレイミド、ビス−カルボキシ、ビス−アミノ等）の、ホモ二官能性ポリマーである。
【０１１４】
ポリマー担体単位は、本発明に関連して適した異なるポリマーの異なる性質のために、広範な分子量を有することができる。したがって、サイズ制限はない。しかしながら、分子量が少なくとも３ｋＤ、好ましくは少なくとも１０ｋＤおよびおよそ約２０〜５００ｋＤ、より好ましくは約３０〜１５０または約６０もしくは８０ｋＤであることが好ましい。担体単位のサイズは、選択されるポリマーに依存し、したがって異なり得る。例えば、特にヒドロキシエチルデンプン等のデンプンを使用する場合、分子量は、かなりより高くあることができる。この場合、平均分子量は、約１００〜４，０００ｋＤまたはさらに高くにそろえることができる。担体単位のサイズは、好ましくは、各ペプチド単位がそれらのそれぞれの受容体分子に結合するために最適にそろえられるよう選択される。これを容易にするために、本発明のある実施形態は、分枝単位を含む担体単位を使用する。この実施形態によると、ポリマー、例えばＰＥＧが分枝単位に結合され、したがって、多数のペプチド単位の組込みを可能にする、大きな担体分子が生じる。適切な分枝単位の例は、グリセロールまたはポリグリセロールである。同様に、樹状分枝単位も、例えば参照によって本明細書中に援用されるＨａａｇ、２０００年に教示されているように、使用され得る。
【０１１５】
好ましくは、単量体を組み合わせること（頭−頭、頭−尾、または尾−尾のいずれか）によってペプチド単位が生じた後、ポリマー担体単位がペプチド単位に連結される。ポリマー担体単位は、共有または非共有（例えば配位）結合を介してペプチド単位に連結される。しかしながら、共有結合の使用が好ましい。結合は、例えば、例えばリシン、システイン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、チロシン等のペプチド単位の反応性アミノ酸またはＮ末端のアミノ基およびＣ末端のカルボン酸を介して起こることができる。
【０１１６】
ポリマー担体単位が適切な結合基を有さない場合、ペプチド単位上の少なくとも１つの反応基と反応することができるためにポリマーを適切に修飾するために、いくつかの結合物質を用いることができる。ポリマーを修飾するのに用いることができる、適した化学基は、例えば以下のものである。
【０１１７】
タンパク質のアミノ基と反応するアシル化基、例えば酸無水物基、Ｎ−アシルイミダゾール基、アジド基、Ｎ−カルボキシ無水物基、ジケテン基、ピロ炭酸ジアルキル基、イミドエステル基およびカルボジイミド−活性化カルボキシル基。上記の基のすべては、タンパク質／ペプチドのアミノ基と反応して、アシルまたは類似した結合を含む共有結合を形成することが知られている。
【０１１８】
ペプチドのアミノ基と反応する還元剤とともに、ハロ−カルボキシル基、マレイミド基、活性化ビニル基、エチレンイミン基、ハロゲン化アリール基、臭化２−ヒドロキシ５−ニトロ−ベンジル基等のペプチド単位のスルフヒドリル（メルカプト）、チオメチル、イミダゾまたはアミノ基と反応するアルキル化基、ならびに脂肪族アルデヒドおよびケトン基、
ジアゾカルボン酸基等の、タンパク質のカルボキシル基、ならびにカルボジイミドおよびアミン基とともに反応するエステルおよびアミド形成基、
５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）基およびアルキルメルカプタン基（ヨウ素等の酸化剤の存在下でタンパク質のスルフヒドリル基と反応する）等の、タンパク質のスルフヒドリル基と反応するジスルフィド形成基、
シクロヘキサンジオン基等のジカルボニル基、およびペプチドのグアニジン部分と反応する他の１，２−ジケトン基、
ペプチドのフェノール基と反応するジアゾ基、
ペプチドのアミノ基と反応する、多糖との臭化シアンの反応からの反応基。
【０１１９】
したがって、要約すると、本発明の化合物は、（必要に応じて）まずポリマーを化学的に修飾して、ペプチド単位上の利用可能な、または導入された化学基と反応することができる少なくとも１つの化学基を有するポリマーを生成すること、および次いで（必要に応じて）修飾されたポリマーとペプチド単位とをともに反応させて、（必要であれば）修飾されたポリマーの化学基を利用して、共有結合した複合体を形成することによって製造され得る。
【０１２０】
結合がペプチドの遊離ＳＨ−基（例えばシステイン基）を介して起こる場合、ポリマー中のマレイミド基の使用が好ましい。
【０１２１】
定義された分子を生じるために、ペプチド単位をポリマー担体単位に結合させるための、標的化されたアプローチを用いることが好ましい。適切なアミノ酸が所望の結合部位に存在しない場合、適切なアミノ酸を二量体ＥＰＯ模倣ペプチド単位に組み込むことができる。部位特異的ポリマー結合のために、いくつかの異なるポリエチレングリコール分子の集団を含む不均一な混合物につながるペプチド全体の制御されていない結合反応を避けるために、独特の反応基、例えばペプチド単位の末端の特定のアミノ酸が好ましい。
【０１２２】
ポリマー担体単位、例えばＰＥＧまたはＨＥＳへのペプチド単位の結合は、主に当業者に公知の反応を用いて行われる。例えば、当業者にとって利用可能な、多くのＰＥＧおよびＨＥＳ結合方法がある（例えば、国際公開第２００４／１００９９７号、さらなる参考文献を挙げると、すべて参照によって本明細書中に援用される、Ｒｏｂｅｒｔｓら、２００２年、米国特許第４０６４１１８号、ＥＰ１３９８３２２、ＥＰ１３９８３２７、ＥＰ１３９８３２８、国際公開第２００４／０２４７６１号参照）。
【０１２３】
本明細書中に記載される超価の概念が、公知のＰＥＧ化またはＨＥＳ化の概念と異なることを理解するのは重要である。技術の現状で、例えばＰＥＧ化は、ペプチド二量体を生成するため、または薬物動態学的パラメータを向上させるためのいずれかに用いられるだけである。しかしながら、上記で概略を述べたように、例えばポリマー担体単位としてのＰＥＧへの２つ以上の少なくとも二価のペプチド単位の結合もまた、効率を大いに促進する（したがってＥＣ５０用量を減少させる）。したがって、本発明の概念は、技術の現状で公知のＰＥＧ化の概念の場合のように薬物動態学的パラメータだけでなく、薬力学的パラメータに対しても強力な効果を有する。しかしながら、勿論、ポリマー担体単位としての、例えばＰＥＧの組込みもまた、薬物動態学に関する公知の利点を有する。
【０１２４】
ＰＥＧ化は通常、ペプチドの生物薬剤学的特性を向上させるために取りかかられる。ＰＥＧ複合の後の、タンパク質分子の最も関連性のある変化は、サイズ拡大、タンパク質表面および糖化機能マスキング、電荷修飾ならびにエピトープ遮蔽である。具体的には、サイズ拡大は、受動的促進浸透および保持機構によって、腎臓限外ろ過を減速させ、透過性組織への蓄積を促進する。タンパク質遮蔽は、排泄の重要な経路であるタンパク質分解および免疫系認識を減少させる。タンパク質の物理化学的および生物学的特性に対するＰＥＧ化の特定の効果は、タンパク質およびポリマーの特性ならびに採用されるＰＥＧ化戦略によって、厳密に決定される。
【０１２５】
しかしながら、超価分子の支持体単位としてのＰＥＧまたは他の非生分解性ポリマーの使用は、新しい問題につながり得る。
【０１２６】
インビボ適用の間に、臨床環境における投与間隔は、薬物の効果の喪失によって引き起こされる。通法の投与および投与間隔は、投与間隔の間に効果が失われないように適合させられる。非生分解性の大きなポリマー単位（例えばＰＥＧ部分）に結合されたペプチドは支持体分子よりも速く分解されて体によって排泄され得るために、担体単位の蓄積の危険性が生じることがある。かかる蓄積の危険性は、薬物の効果半減期が薬物自体またはその構成要素／代謝産物の排泄半減期よりも短いので、常に生じる。したがって、ペプチドは通常非常に大きなＰＥＧ部分（約２０〜４０ｋＤ）でＰＥＧ化されるために遅い腎排出を示すので、担体分子の蓄積は避けられるべきである。ペプチド部分自体は、酵素的分解を受け、ペプチドを非活性化するには、部分的切断でも十分なことがある。
【０１２７】
この問題に対する解決法を見つけるために、本発明のある実施形態は、少なくとも２つのサブユニットで構成されるポリマー担体単位の使用を教示する。ポリマーサブユニットは、生分解性共有リンカー構造を介して連結される。この実施形態によると、大きな担体分子の分子量（例えば４０ｋＤ）は、生分解性リンカーを介して連結された、いくつかの小さな、または中間のサイズのサブユニット（例えば、５〜１０ｋＤの分子量を有する各サブユニット）によって生じる。モジュラーサブユニットの分子量は大きな量になり、それによって、担体分子の所望の分子量を生じる。しかしながら、生分解性リンカー構造は体内で分解されることがあり、それによって、より小さい担体サブユニット（例えば５〜１０ｋＤ）を放出する。小さい担体サブユニットは、全体的分子量（例えば４０ｋＤ）を有するポリマー分子よりも良い腎クリアランスを示す。図１６に例を挙げる。
【０１２８】
リンカー構造は、公知の分解特性および体液中の分解の期間に従って選択される。分解可能な構造は、例えば、加水分解によって切断することができるアミド／ペプチド結合またはエステルとして、カルボン酸誘導体等の切断可能な基を含むことができる（例えば、参照によって本明細書中に援用される、Ｒｏｂｅｒｔｓ、２００２年参照）。ＰＥＧスクシンイミジルエステルもまた、ＰＥＧバックボーン中の種々のエステル結合で合成されて、生理学的ｐＨで分解速度を制御することができる（参照によって本明細書中に援用される、Ｚｈａｏ、１９９７年）。ベンジルウレタンのジスルフィドのような他の分解可能な構造は、細胞のエンドソーム区画中等の穏やかな還元性環境下で切断することができ（Ｚａｌｉｐｓｋｙ、１９９９年）、したがって、同様に適している。適切なリンカーの他の選択の基準は、速い（しばしば酵素的な）分解または遅い（しばしば非酵素的分解）分解に関する選択である。体液中のこれらの２つの機構の組合せもまた実行可能である。この高度に有利な概念が、本明細書中で記載または参照された特定のペプチド単位に限定されず、同じ蓄積の問題が生じるＰＥＧ分子等の大きなポリマー単位に結合された他の医薬分子にも適用されることは、明らかである。
【０１２９】
ある実施形態によると、ヒドロキシアルキルデンプンおよび好ましくはＨＥＳが、ポリマー担体単位として使用される。ＨＥＳは、いくつかの重要な利点を有する。まず、ＨＥＳは生分解性である。さらに、ＨＥＳの生分解性は、エチル基の割合を介して制御することができ、したがって影響を受けることができる。３０〜５０％のエチル基が、本発明の目的のために十分適している。生分解性のために、ＰＥＧとの複合における上述のような蓄積問題は、通常起こらない。さらに、ＨＥＳは、例えば代用血漿の形態で、医療に長年使用されている。したがって、その無害さは立証されている。
【０１３０】
さらに、ＨＥＳの加水分解産物の誘導体は、ガスクロマトグラフィーによって検出可能である。ＨＥＳ−ペプチド複合体は、ペプチド単位が安定なままの条件下で加水分解することができる。これは、分解産物の定量およびモニタリングを可能にし、活性のあるペプチドの評価および正規化を可能にする。
【０１３１】
さらなる実施形態によると、第１の型のポリマー担体単位が使用され、ペプチド単位を負荷される。この第１の担体は、例えばＨＥＳのように、好ましくは容易に生分解される。しかしながら、第１の担体のすべての結合箇所がペプチド単位で占められるわけではなく、例えば約２０〜５０％のみが占められる。使用されるポリマーのサイズに依存して、数百のペプチド単位を担体分子に結合することができる。第１の担体の残りの結合箇所は、異なる担体、例えば第１の担体よりも低い分子量を有する小さいＰＥＧ単位で占められる。この実施形態は、第１の担体のために超価組成物が生じるが、これは好ましくは３〜５または１０ｋＤのＰＥＧ単位によって構成される第２の担体の存在のために非常に耐久性がある、という利点を有する。しかしながら、第１の担体（例えばＨＥＳ）およびペプチド単位が生分解性であり、第２の担体、例えばＰＥＧが体から容易に除かれるのに十分な程小さいので、全体的な実体は非常に分解性が高い。
【０１３２】
ペプチド単位の結合ドメインを構成する単量体は、ホモ二量体エリスロポイエチン受容体を認識する。ホモ二量体受容体であるという後者の特性は、ＥＰＯ受容体を多くの他のサイトカイン受容体から区別する。上述のような、少なくとも２つのＥＰＯ模倣単量体結合ドメインを含むペプチド単位は、ＥＰＯ受容体に結合し、好ましくはそれらの標的を二価、それぞれ多量体化および／またはそれを安定化することができ、したがって、それによって複合体を誘導するシグナルトランスダクションを生じる。
【０１３３】
本発明はまた、ペプチド単位がそれぞれの担体単位に連結される、それぞれの化合物生成方法を含む。本発明はさらに、ペプチド単位がそれぞれのポリマー担体単位に連結される、それぞれの化合物生成方法を含む。本発明の化合物は、ヒトおよび／または獣医医薬組成物の調製に有利に使用することができる。これらは、エリスロポイエチンの欠乏または少ないもしくは不完全な赤血球集団によって特徴付けられる障害の治療、および特に任意の型の貧血および脳卒中の治療に特に適している。これらはまた、上述のすべての指示に使用可能である。かかる医薬組成物はまた、組成物を意図される投与手順に採用するために、薬学的に許容され得る担体を必要に応じて含むことができる。適した送達方法ならびに担体および添加物は、例えば、参照によって本明細書中に援用される、国際公開第２００４／１００９９７号および国際公開第２００４／１０１６１１号に記載されている。
【実施例】
【０１３４】
超価分子の概念を、実施例によって説明する。図１３は、本発明の単純な超価分子の例を示す。２つの連続した二価ＥＰＯ模倣ペプチドが、マレイミド基を有する二官能性ＰＥＧ部分によってＮ末端で連結されている。ＰＥＧ担体単位の反応性結合部位として、システインを選択した。
【０１３５】
しかしながら、超価分子は、２つより多い連続した二価または多価ペプチド単位を含むことができる。図１４は、分枝単位として中央のグリセロール単位を有し、３つの連続した二価ペプチドを含む担体単位に基づいた例を挙げる。ここでも、結合にシステインを用いた。図２０は、ポリマー担体単位としてＨＥＳを用いた例を示す。ＨＥＳを、ペプチド単位のＳＨ基と反応するマレイミド基を有するように修飾した。実施例によると、すべての結合部位はペプチド単位に結合している。しかしながら、小さいＰＥＧ単位（例えば３〜１０ｋＤ）もまた、結合部位の少なくとも一部を占めることができた。
【０１３６】
上記で説明したように、超価概念はまた、樹状および／またはポリマー担体単位がより多数の連続した二価ペプチドに連結した、多価樹状ポリマーにも拡張することができる。例えば、樹状分枝単位は、ポリグリセロールに基づき得る（参照によって本明細書中に援用される、Ｈａａｇ、２０００年を参照されたい）。
【０１３７】
６つの連続した二価ペプチドを含む樹状分枝単位を有する担体単位に基づく超価分子の例を、図１５に示す。
【０１３８】
超価分子の他の例は、例えば過ヨウ素酸を用いて酸化されて多数のアルデヒド官能基を含む、デンプンまたはデキストランを有する担体単位を含む。第２の工程において、多くの二価ペプチドを担体単位に結合させ、ともに最終的な分子を形成させる。数百（例えば５０〜１０００、好ましくは１５０〜８００、より好ましくは２５０〜７００）ものペプチド単位を、例えばＨＥＳである担体分子に結合させることができることに留意されたい。
【０１３９】
図１６は、単純な生分解性超価分子の概念を示す。２つの連続した二価ＥＰＯ模倣ペプチドが、中間の切断位置を有する生分解性リンカーを介して連結された２つの二価ＰＥＧ部分によってＮ末端で連結している。リンカーは、サブユニット中の大きなＰＥＧ単位の分解を可能にし、それによって腎クリアランスを容易にする。
【０１４０】
Ｉ．単量体のペプチド合成
手作業の合成
ＰＬ−Ｒｉｎｋ−アミド−樹脂（置換速度０．４ｍｍｏｌ／ｇ）または０．４ｍｍｏｌの規模の前処置されたＷａｎｇ−樹脂を用いたＤｉｓｃｏｖｅｒマイクロ波システム（ＣＥＭ）の使用によって合成を行う。Ｆｍｏｃ基の除去を、３０ｍｌのピペラジン／ＤＭＦ（１：３）の添加および３×３０秒間の１００Ｗの照射によって達成する。アミノ酸の結合を、結合添加物としてのＤＭＦ ＰｙＢＯＰ／ＨＯＢＴ／ＤＩＰＥＡ中の５倍過剰のアミノ酸の添加および５×３０秒間の５０Ｗの照射によって達成する。すべての照射サイクルの間に、氷浴の助けを借りて溶液を手作業で冷却する。脱保護および結合の後、３０ｍｌのＤＭＦで樹脂を６回洗浄する。最後のアミノ酸の脱保護の後、１．２６８ｍｌのキャッピング溶液（１００ｍｌのＤＭＳＯ中４．７３ｍｌの無水酢酸および８．７３ｍｌのＤＩＥＡ）との５分間のインキュベーションによって、いくつかのペプチドをアセチル化する。次いで樹脂を３０ｍｌのＤＭＦで６回洗浄し、３０ｍｌのＤＣＭで６回洗浄してから、切断する。粗ペプチドの切断を、不活性な大気下で、５ｍｌのＴＦＡ／ＴＩＳ／ＥＤＴ／Ｈ２Ｏ（９４／１／２．５／２．５）で１２０分間の処理によって達成する。この溶液を４０ｍｌの冷たいエーテル中にろ過する。沈殿をアセトニトリル／水（１／１）に溶解し、ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｋｒｏｍａｓｉｌ １００ Ｃ１８ １０μｍ、２５０×４．６ｍｍ）によってペプチドを精製する。
【０１４１】
自動化合成
ＰＬ−Ｒｉｎｋ−アミド−樹脂（置換速度０．４ｍｍｏｌ／ｇ）または０．２５ｍｍｏｌの規模の前処置されたＷａｎｇ−樹脂を用いたＯｄｙｓｓｅｙマイクロ波システム（ＣＥＭ）の使用によって、合成を行う。Ｆｍｏｃ基の除去を、１０ｍｌのピペラジン／ＤＭＦ（１：３）の添加および１０×１０秒間の１００Ｗの照射によって達成する。アミノ酸の結合を、結合添加物としてのＤＭＦ ＰｙＢＯＰ／ＨＯＢＴ／ＤＩＰＥＡ中の５倍過剰のアミノ酸の添加および５×３０秒間の５０Ｗの照射によって達成する。すべての照射サイクルの間に、反応混合物に窒素の泡を吹き込むことによって溶液を冷却する。脱保護および結合の後、１０ｍｌのＤＭＦで樹脂を６回洗浄する。最後のアミノ酸の脱保護の後、０．７９３ｍｌのキャッピング溶液（１００ｍｌのＤＭＳＯ中４．７３ｍｌの無水酢酸および８．７３ｍｌのＤＩＥＡ）との５分間のインキュベーションによって、いくつかのペプチドをアセチル化する。次いで樹脂を１０ｍｌのＤＭＦで６回洗浄し、１０ｍｌのＤＣＭで６回洗浄してから、切断する。粗ペプチドの切断を、不活性な大気下で、５ｍｌのＴＦＡ／ＴＩＳ／ＥＤＴ／Ｈ２Ｏ（９４／１／２．５／２．５）で１２０分間の処理によって達成する。この溶液を４０ｍｌの冷たいエーテル中にろ過し、沈殿をアセトニトリル／水（１／１）に溶解させ、ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｋｒｏｍａｓｉｌ １００ Ｃ１８ １０μｍ、２５０×４．６ｍｍ）によってペプチドを精製する。
【０１４２】
精製
Ｎｅｂｕｌａ−ＬＣＭＳ−システム（Ｇｉｌｓｏｎ）を使用して、すべてのペプチドを精製した。すべてのペプチドの粗原料を、アセトニトリル／水（１／１）中に溶解し、ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｋｒｏｍａｓｉｌ １００ Ｃ１８ １０μｍ、２５０×４．６ｍｍ）によってペプチドを精製した。流速は２０ｍｌ／分、ＬＣＭＳ分割比は１／１０００であった。
【０１４３】
ＩＩ．分子内ジスルフィド架橋の形成
Ｋ３［（ＦｅＣＮ６）での環化
溶液１：１０ｍｇのペプチドを０．１％ＴＦＡ／アセトニトリルに溶解させ、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度に達するまで水で希釈する。およそ８のｐＨに達するまで、固形重炭酸アンモニウムを加える。
【０１４４】
溶液２：第２のバイアル中、１０ｍｌの０．１％ＴＦＡ／アセトニトリルを、１０ｍｌの水で希釈する。８のｐＨに達するまで固体重炭酸アンモニウムを加え、Ｋ３［（ＦｅＣＮ６）］の０．１Ｍ溶液を１滴加える。
【０１４５】
溶液１および２を、３時間にわたってアセトニトリル／水（１／１、ｐＨ＝８）の混合物に滴下する。混合物を室温で一晩インキュベートし、ＬＣＭＳによって混合物を濃縮および精製する。
【０１４６】
ＣＬＥＡＲ−ＯＸ（商標）樹脂での環化
１００ｍｌのアセトニトリル／水（１／１、０．１％ＴＦＡ）に、８のｐＨに達するまで固形重炭酸アンモニウムを添加する。３０分間アルゴンの泡を吹き込むことによって、この溶液から脱気する。ここで１００ｍｇのＣＬＥＡＲ−ＯＸ（商標）樹脂を加える。１０分後、１０ｍｇのペプチドを固体として加える。２時間のインキュベーション後、ＬＣＭＳによって溶液をろ過、濃縮および精製する。
【０１４７】
環状ペプチドの精製
Ｎｅｂｕｌａ−ＬＣＭＳシステム（Ｇｉｌｓｏｎ）を使用して、すべてのペプチドを精製した。すべてのペプチドの粗原料を、アセトニトリル／水（１／１）またはＤＭＳＯ中に溶解し、ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｋｒｏｍａｓｉｌ １００ Ｃ１８またはＣ８ １０μｍ、２５０×４．６ｍｍ）によってペプチドを精製した。流速は２０ｍｌ／分、ＬＣＭＳ分割比は１／１０００であった。
【０１４８】
ＩＩＩ．単量体でのインビトロアッセイ
ＢｒｄＵ組込みによる、ＴＦ−１細胞での増殖アッセイ
対数増殖期にあるＴＦ−１細胞（約２×１０５〜１×１０６細胞／ｍｌ、ＲＰＭＩ培地、２０％ウシ胎仔血清、ペニシリン、ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン、０．５ｎｇ／ｍｌインターロイキン３を補充）を洗浄（５分間１５００ｒｐｍで遠心分離し、ＩＬ３のないＲＰＭＩ培地に５００，０００細胞／ｍｌで再懸濁）し、アッセイの開始前にＩＬ−３なしで２４時間前培養する。翌日、細胞を、通常試験する薬剤あたり、少なくとも６つの濃度および１つの濃度あたり少なくとも１０，０００細胞／ウェルを含む４ウェルを用いて、２４または９６ウェルプレートに播種する。各実験は、陽性対照作用物質としての組換えＥＰＯおよび陰性対照作用物質としてのサイトカインの添加のないウェルを含む対照を含む。ペプチドおよびＥＰＯ対照を所望の濃度まで培地中に前もって希釈し、細胞に加え、標準的培養条件下（３７℃、気相中５％二酸化炭素、水で飽和した大気）で３日間の培養期間を開始する。濃度は常に、この３日間の培養期間の間のウェル中の作用物質の終濃度をいう。この培養期間の終わりに、ＦｄＵを８ｎｇ／ｍｌ培地の終濃度まで添加し、培養を６時間続ける。次いで、ＢｒｄＵ（ブロモデオキシウリジン）およびｄＣｄ（２−デオキシシチジン）をそれらの終濃度（１０ｎｇ／ｍｌ ＢｒｄＵ、８ｎｇ／ｍｌ ｄＣＤ、培地中の終濃度）まで添加し、培養をさらに２時間続ける。
【０１４９】
このインキュベーションおよび培養期間の終わりに、１．５％ＢＳＡを含有するリン酸緩衝生理食塩水で細胞を１回洗浄し、最小量の液体中に再懸濁する。この懸濁液から、細胞を７０％エタノール中に−２０℃で滴下する。ここから、細胞を氷上で１０分間インキュベートし、次いで直接解析するか、または解析の前に４℃で保存することができる。
【０１５０】
解析の前に、遠心分離によって細胞をペレット化し、上清を廃棄し、細胞を最小量の残った液体に再懸濁する。次いで細胞を０．５ｍｌの２Ｍ ＨＣｌ／０．５％ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中に懸濁および１０分間インキュベートする。次いでそれらを再びペレット化し、最小量の残った液体に再懸濁し、直後の細胞の再ペレット化の前に、０．５ｍｌの０．１Ｎ Ｎａ２Ｂ４Ｏ７、ｐＨ８．５で希釈する。最後に、細胞を４０μｌのリン酸緩衝生理食塩水（１．５％ＢＳＡ）に再懸濁し、それぞれ２０μｌの細胞懸濁液を含む２つの反応チューブに分割する。２μｌの抗ＢｒｄＵ−ＦＩＴＣ（ＤＡＫＯ、クローンＢｕ２０ａ）を一方のチューブに添加し、２μｌの対照ｍｌｇＧ１−ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ）を第２のチューブに添加して、室温で３０分間のインキュベーション期間を開始する。次いで、０．４ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水および１０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（終濃度）を添加する。フローサイトメーターにおける解析は、４Ｃ細胞またはより高い倍数性を有する細胞の分画およびＢｒｄＵ陽性細胞の分画をいい、したがって、細胞周期の関連性のある段階の細胞の分画を決定する。
【０１５１】
ＭＴＴによる、ＴＦ−１細胞での増殖アッセイ
対数増殖期にあるＴＦ−１細胞（約２×１０５〜１×１０６細胞／ｍｌ、ＲＰＭＩ培地、２０％ウシ胎仔血清、ペニシリン、ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン、０．５ｎｇ／ｍｌインターロイキン３を補充）を洗浄（５分間１５００ｒｐｍで遠心分離し、ＩＬ３のないＲＰＭＩ完全培地に５００，０００細胞／ｍｌで再懸濁）し、アッセイの開始前にＩＬ−３なしで２４時間前培養する。翌日、細胞を、通常試験する作用物質あたり、少なくとも６つの濃度および１つの濃度あたり少なくとも１０，０００細胞／ウェルを含む４ウェルを用いて、２４または９６ウェルプレートに播種する。各実験は、陽性対照作用物質としての組換えＥＰＯおよび陰性対照作用物質としてのサイトカインの添加のないウェルを含む対照を含む。ペプチドおよびＥＰＯ対照を所望の濃度まで培地中に前もって希釈し、細胞に加え、標準的培養条件下（３７℃、気相中５％二酸化炭素、水で飽和した大気）で３日間の培養期間を開始する。濃度は常に、この４日間の培養期間の間のウェル中の作用物質の終濃度をいう。
【０１５２】
４日目、解析の開始前に、既知の数のＴＦ−１細胞の希釈系列を、いくつかのウェル中で調製する（１００μｌの培地中０／２５００／５０００／１００００／２００００／５００００細胞／ウェル）。これらのウェルを、試験ウェルと同じように処理し、細胞数を決定することができる検量線を後に提供する。これらの参照ウェルを構成して、ＭＴＴ増殖キット（プロメガ、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６水性非放射活性細胞増殖アッセイ）からのＭＴＳおよびＰＭＳを３７℃の水浴中で解凍し、１００μｌのＰＭＳ溶液を２ｍｌのＭＴＳ溶液に添加する。この混合物の２０μｌをアッセイプレートの各ウェルに加え、３７℃で３〜４時間インキュベートする。ＥＬＩＳＡ読み取り装置におけるＥ４９２の測定の前に、２５μｌの、水中１０％ドデシル硫酸ナトリウムを各ウェルに加える。
【０１５３】
プログラムＧｒａｐｈＰａｄを用いた用量応答関係の計算に基づく図１７および１８に示すようなグラフでの評価を用いて、ＭＴＴアッセイのデータに基づいて以下のＥＣ５０値を決定した。
【０１５４】
以下の表は、いくつかの例示的ペプチドのＥＣ５０値を示す。
【０１５５】
【化３６】
。
【０１５６】
ＩＶ．二価ＥＰＯ模倣ペプチドの合成
直鎖状の配列番号１１（ＡＧＥＭ１１）の自動化合成
０．２５ｍｍｏｌの規模のＲｉｎｋ−アミド−樹脂（置換速度０．１９ｍｍｏｌ／ｇ）を用いたＬｉｂｅｒｔｙマイクロ波システム（ＣＥＭ）の使用によって合成を行う。Ｆｍｏｃ基の除去を、１０ｍｌのピペラジン／ＤＭＦ（１：３）および１０×１０秒間の５０Ｗの照射の二重処理によって達成する。アミノ酸の結合を、結合添加物としてのＤＭＦ ＰｙＢＯＰ／ＨＯＢＴ／ＤＩＰＥＡ中の４倍過剰のアミノ酸および５×３０秒間の５０Ｗの照射の二重処理によって達成する。すべての照射サイクルの間に、反応混合物に窒素を吹き込むことによって溶液を手作業で冷却する。脱保護および結合の後、１０ｍｌのＤＭＦで樹脂を６回洗浄する。二重結合サイクルの後、すべての未処理アミノ基を、１０倍過剰のＮ−（２−クロロベンジルオキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（０．２Ｍ ＤＭＦ溶液）および３×３０秒間の５０Ｗの照射での処理によってブロックする。最後のアミノ酸の脱保護の後、０．７９３ｍｌのキャッピング溶液（１００ｍｌのＤＭＳＯ中４．７３ｍｌの無水酢酸および８．７３ｍｌのＤＩＥＡ）との５分間のインキュベーションによって、いくつかのペプチドをアセチル化する。次いで樹脂を１０ｍｌのＤＭＦで６回洗浄し、１０ｍｌのＤＣＭで６回洗浄してから、切断する。粗ペプチドの切断を、不活性な大気下で、５ｍｌのＴＦＡ／ＴＩＳ／ＥＤＴ／Ｈ２Ｏ（９４／１／２．５／２．５）で１２０分間の処理によって達成する。この溶液を４０ｍｌの冷たいエーテル中にろ過し、沈殿をアセトニトリル／水（１／１）に溶解し、ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｋｒｏｍａｓｉｌ １００ Ｃ１８ １０μｍ、２５０×４．６ｍｍ）によってペプチドを精製する。
【０１５７】
したがって、直鎖状ＡＧＥＭ１１、Ｋｒｏｍａｓｉｌ １００ Ｃ１８ １０μｍ、２５０×４．６ｍｍおよび使用したグラジエントの精製概略図を、５０分で５％〜５０％アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）まで、図８および９に示す。
【０１５８】
ＡＧＥＭ１１の環化
【０１５９】
【化３７】
３０ｍｇの直鎖状ペプチドを６０ｍｌの溶液Ａに溶解する。この溶液および６０ｍｌのＤＭＳＯを、６０ｍｌの溶液Ａに滴下する（添加の合計時間は３時間）。４８時間後、蒸発によって溶媒を除去し、残った残渣を３０ｍｌのＤＭＳＯ／水（１／１）に溶解する。３０ｍｌの酢酸および１７ｍｇのヨウ素（ＤＭＳＯ／水（１／１）に溶解）を添加し、溶液を９０分間室温で混合する。その後、２０ｍｇのアスコルビン酸を添加し、蒸発によって溶媒を除去する。この粗混合物をアセトニトリル／水（２／１）に溶解し、ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｋｒｏｍａｓｉｌ １００ Ｃ１８ １０μｍ、２５０×４．６ｍｍ）によってペプチドを精製する。
【０１６０】
溶液Ａ：０．１％ＴＦＡを含有するアセトニトリル／水（１／１）。重炭酸アンモニウムの添加によってｐＨを８．０に調節する。
【０１６１】
環状ＡＧＥＭ１１の精製パラメータを図１０および１１に示す（概略図：環状ＡＧＥＭ１１の精製、Ｋｒｏｍａｓｉｌ １００ Ｃ１８ １０μｍ、２５０×４．６ｍｍ、５０分で５％〜３５％アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）のグラジエント）。
【０１６２】
Ｖ．ＥＰＯ活性を決定するインビトロ増殖アッセイ
対数増殖期にあるＴＦ１細胞（約２×１０５〜１×１０６細胞／ｍｌ、２０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）および０．５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ３を含むＲＰＭＩ中で増殖）を計数し、アッセイを行うのに必要な細胞の数を遠心分離（５分間１５００ｒｐｍ）し、５％ＦＣＳを含み、ＩＬ−３のないＲＰＭＩに３０００００細胞／ｍｌで再懸濁した。このＩＬ−３のない（飢餓）培地中で、細胞を４８時間前培養した。アッセイを開始する前に、細胞を再度計数した。
【０１６３】
アッセイを開始する直前に、ペプチドおよびＥＰＯのストック溶液を調製した。ペプチドを計量し、１ｍＭ、４６７μＭまたは２００μＭの濃度まで、５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩに溶解した。ＥＰＯストック溶液は、１０ｎＭまたは２０ｎＭであった。これらのストック溶液の２９２μｌを、９６ウェル培養プレートの１つのウェルにピペットで移し、試験する各物質について１つのプレートを採取した。５％ＦＣＳを含む２００μｌのＲＰＭＩを、各プレートの１７個の他のウェルにピペットで移した。９２μｌのストック溶液を、２００μｌの培地を含むウェルにピペットで移した。内容物を混合し、このウェルからの９２μｌを隣から隣へと移していった。このようにして、各連続したウェルにおいて濃度がその前のウェル中の濃度の１：√１０であるように、各物質の希釈系列（１８の希釈物）を調製した。各ウェルから、３×５０μｌを３つの空のウェルに移した。このようにして、物質の各濃度を４つ一組で測定した。各プレートのウェルの一番上および一番下の列は空のままであったことに留意されたい。
【０１６４】
前処理した（飢餓）細胞を遠心分離（５分間１５００ｒｐｍ）し、５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩに１ｍｌあたり２０００００細胞の濃度で再懸濁した。５０μｌの細胞懸濁液（１００００個の細胞を含む）を各ウェルに加えた。細胞の添加のためにウェル中の物質の終濃度が元の希釈範囲の半分であったことに留意されたい。プレートを５％ＣＯ２中、３７℃で７２時間インキュベートした。
【０１６５】
評価を開始する前に、ウェル中への既知の量の希釈範囲のＴＦ−１細胞を調製した。０／２５００／５０００／１００００／２００００／５００００細胞／ウェルを４つ一組でピペットで移した（１００μｌのＲＰＭＩ＋５％ＦＣＳ中）。
【０１６６】
１ウェルあたりの生細胞の数を測定するために、既製のＭＴＴ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６水性一溶液細胞増殖アッセイ）を、３７℃水浴中で解凍した。１ウェルあたり２０μｌのＭＴＴ試薬を加え、プレートを５％ＣＯ２中３７℃で、さらに１〜２時間インキュベートした。２５μｌの１０％ＳＤＳ溶液を加え、プレートをＥＬＩＳＡ読み取り装置（Ｇｅｎｉｏｓ、Ｔｅｃａｎ）において測定した。スプレッドシート（Ｅｘｃｅｌ）中でデータを処理し、Ｇｒａｐｈｐａｄにプロットした。
【０１６７】
図１２にデータを要約する。
【０１６８】
ＥＤ５０（ｎＭ）
ＥＰＯ ０．０１５８
ＢＢ４９（単量体、配列番号２） ４１１３
ＡＧＥＭ１１（二価） ３６．７３。
【０１６９】
ＶＩ．拡張されたペプチドアッセイ
拡張されたアッセイにおいて、およそ２００個のペプチド配列を、それらのＥＰＯ模倣活性に関して試験した。
【０１７０】
ＬＩＰＳ−Ｖａｒｉｏシンセサイザーシステムで、ペプチドアミドとしてペプチドを合成した。特別なＭＴＰ合成プレート中で合成を行い、規模は１ペプチドあたり２μｍｏｌであった。合成は、活性化試薬としてＨＯＢＴを用いた標準的なＦｍｏｃプロトコルに従った。４回の結合として結合工程を行った。各結合工程は２５分を要し、１工程あたりの過剰なアミノ酸は２．８であった。９０％ＴＦＡ、５％ＴＩＰＳ、２．５％Ｈ２Ｏおよび２．５％ＤＤＴを含有する切断溶液で、ペプチドの切断および脱保護を行った。樹脂に結合した完成ペプチドを含む合成プレートを、９６ディープウェルプレートの上部で保存した。５０μｌの切断溶液を各ウェルに加え、１０分間切断を行い、この手順を３回繰り返した。切断したペプチドを、ディープウェルプレートへの重力流によって、２００μｌの切断溶液で溶出した。さらに２．５時間、ディープウェルプレート内で側鎖官能基の脱保護を行った。その後、氷冷エーテル／ヘキサンでペプチドを沈殿させ、遠心分離した。ペプチドを中性の水溶液に溶解させ、環化を４℃で一晩インキュベートした。ペプチドを凍結乾燥した。
【０１７１】
図１９は、合成および試験したペプチド単量体に関する概観を示す。
【０１７２】
インビトロ増殖アッセイにおいて、ペプチドを、それらのＥＰＯ模倣活性に関して試験した。下記のＶに記載するようにアッセイを行った。各アッセイ日に、３８個の試験ペプチド、１つの参照例、およびＥＰＯのインビトロ活性を並行して測定するために、４０個のマイクロタイタープレートを調製した。ＥＰＯストック溶液は２０ｎＭであった。
【０１７３】
図１９に結果を示す。結果からわかるように、本発明のコンセンサスを満たさない、試験したペプチドは、ＥＰＯ模倣活性を示さなかった。
【０１７４】
ＶＩＩ．ペプチドＨＥＳ−複合体の合成
原理反応概略図を図２１に示す。
【０１７５】
記載される方法の狙いは、本実施例のＨＥＳに従った、穏やかな水性反応条件下でチオール基と選択的に反応する、デンプンの誘導体の生成である。この選択性は、マレイミド基で到達される。
【０１７６】
ＨＥＳを、まずアミノ基で官能化し、その後それぞれのマレイミド誘導体に転換する。限外ろ過膜を介して、反応バッチから低分子量反応物を除いた。生成物、中間体生成物ならびに抽出物はすべて多分散系である。
【０１７７】
アミノ−ＨＥＳ（ＡＨＥＳ）の合成
ダイアフィルトレーションおよびそれに続く凍結乾燥を介して、ヒドロキシエチルデンプン（Ｖｏｌｕｖｅｎ（登録商標））を得た。平均分子量は、４０％の置換グレードの、およそ１３０ｋＤａであった。
【０１７８】
参照によって本明細書中に援用される、Ｊａｃｏｂ Ｐｉｅｈｌｅｒの論文、「Ｍｏｄｉｆｉｚｉｅｒｕｎｇ ｖｏｎ Ｏｂｅｒｆｌａｃｈｅｎ ｆｕｒ ｄｉｅ ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｓｃｈｅ ｕｎｄ ｋｉｎｅｔｉｓｃｈｅ Ｃｈａｒａｋｔｅｒｉｓｉｅｒｕｎｇ ｂｉｏｍｏｌｅｋｕｌａｒｅｒ Ｅｒｋｅｎｎｕｎｇ ｍｉｔ ｏｐｔｉｓｃｈｅｎ Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒｎ」、１９９７年のアミノデキストランに関して記載されている合成に従って、合成を行った。Ｆｌｏｏｒら（１９８９年）に記載されているように、過ヨウ素酸ナトリウムでの、ジオールの水酸基のアルデヒドへの部分的な選択的酸化によって、ＨＥＳを不活性化した。アンモニア存在下で、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）での還元的アミノ化を介してアルデヒド基をアミノ基に転換した（ＹａｌｐａｎｉおよびＢｒｏｏｋｓ、１９９５年）。
【０１７９】
過ヨウ素酸塩開始：過ヨウ素酸塩の使用量は、グルコースビルディングブロックの２０％の数を示す（１８０ｇ／ｍｏｌのグルコースビルディングブロック塊を適用、ＤＳ＝０，４）。限外ろ過および凍結乾燥によって後処理を行った。
【０１８０】
ＭＨ４Ｃｌ／Ｎａ［ＢＨ３ＣＮ］（過剰）での還元的アミノ化
生成物の沈殿およびダイアフィルトレーションを介した作製
解析
定性的：ニンヒドリン反応（Ｋａｉｓｅｒ試験）
定量的：アミノデキストランと比較して２，４，６−ニトロベンゾールスルホン酸（ＴＮＢＳ）を用いる
得られた置換グレードは、約２．８％であった。これは、およそ６４００ｇ／ｍｏｌの１つのアミノ基を有する１つのビルディングブロックのモル質量を生じる。
【０１８１】
マレイミドプロピオニル−アミノ−ヒドロキシエチルデンプン（「ＭａｌＰＡ−ＨＥＳ」）の合成
合成
３−マレイミドプロピオン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭａｌＰＡ−ＯＳｕ）を過剰に用い（１０倍）（５０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７、２０％ＤＭＦ、一晩）、限外ろ過および凍結乾燥によって後処理を行った。
【０１８２】
解析
アミノ基の反応をニンヒドリンおよびＴＮＢＳで実証した。
【０１８３】
導入されたマレイミド基の数を、グルタチオン（ＧＳＨ）の反応、およびエルマン試薬（ＤＮＴＢ）での、７００ＭＨｚ−１Ｈ−ＮＭＲ分光学を介した過度のチオール基の検出よって示した。
【０１８４】
得られた置換グレードは約２％であり、マレイミドビルディングブロックあたり８５００ｇ／ｍｏｌに相当する（１８０ｇ／ｍｏｌのグルコースビルディングブロック塊、ＤＳ＝０，４）。
【０１８５】
ペプチド−ヒドロキシエチルデンプン−複合体（Ｐｅｐ−ＡＨＥＳ）
合成
遊離（Ｐｅｐ−ＩＡ）またはビオチン化（Ｐｅｐ−ＩＢ）Ｎ末端のいずれかを有するシステイン含有ペプチドを用いた。Ｐｅｐ−ＩＡ／Ｂの４：１混合物を一晩過剰に（およそ６当量）リン酸バッファー、５０ｍＭ、ｐＨ６．５／ＤＭＦ ８０：２０中のＭａｌＰＡ−ＨＥＳで転換し、限外ろ過および凍結乾燥によって後処理を行った。
【０１８６】
解析
ＵＶ吸収を２８０ｎｍで測定し、マレイミド基の残りの内容物をＧＳＨ／ＤＮＴＢで測定した。
【０１８７】
ペプチド収量はほとんど定量的であった。検出可能な遊離マレイミド基は、ほとんどまったくなかった。
【０１８８】
ＶＩＩＩ．抗体交差反応性アッセイ
本願の序文に記載したように、患者は時々、ｒｈｕＥＰＯに対する抗体を発生させる。これは、序文に記載した深刻な結果につながる。
【０１８９】
本発明のペプチドの特性をさらに調査するために、ペプチドが実際に抗ＥＰＯ抗体と交差反応するかどうかを解析した。
【０１９０】
抗ＥＰＯ抗体を含有する、ウサギおよびヒト血清を試験に使用した。ＥＰＯまたは以下のＥＰＯ模倣ペプチドのいずれかで、これらの血清を前処理した。
【０１９１】
【化３８】
異なる濃度のエリスロポイエチンおよびＥＰＯ模倣ペプチドを解析で使用した。血清中に存在する抗ＥＰＯ抗体を吸着させるための試験物質での血清の前処理の後、血清を放射活性標識エリスロポイエチンで処理した。前吸着工程の後に血清中に残っている抗体はエリスロポイエチンによって結合し、再度免疫沈降する。この試験に用いたプロトコルは、参照によって本明細書中に援用される、Ｔａｃｅｙら、２００３年に記載されている。
【０１９２】
ＥＰＯまたは本発明のＥＰＯ模倣ペプチドのいずれかを用いて行った、抗ＥＰＯ抗体含有血清での前吸着の結果を、図２２に開示する。
【０１９３】
血清をＥＰＯ模倣ペプチドで前処理すると、血清はその後、放射活性標識エリスロポイエチンに接触させると陽性を示した。したがって、抗ＥＰＯ抗体は、前処理にもかかわらず血清中で検出された。これは、ＥＰＯ模倣ペプチドが前処理の間に抗ＥＰＯ抗体に結合できなかったことを意味する。結合活性なしで、抗ＥＰＯ抗体はＥＰＯ模倣ペプチドとともに血清から排除されず、したがって、血清中に残る。抗ＥＰＯ抗体はＥＰＯ模倣ペプチドを認識できず、したがって、ＥＰＯ模倣ペプチドに結合できなかった。
【０１９４】
組換えヒトＥＰＯ（ｒｈｕＥＰＯ）を対照として使用した。血清をエリスロポイエチンで前処理すると、エリスロポイエチンでの前処理によって抗体はすでに結合および排除されていたので、ほとんどの場合、それに続く放射活性標識エリスロポイエチンを取り込むアッセイにおいて、検出可能な抗体はなかった。
【０１９５】
図２２に示す絶対値は、ＩＰで使用した全計数の％ｃｐｍを表す。％ｃｐｍ値が０．９より大きいと、血清は陽性と評価される。１００％ｃｐｍは、全体の使用した計数（放射活性トレーサ）の量、現在のところ放射活性標識ＥＰＯを表す。
【０１９６】
アッセイから、本発明のＥＰＯ模倣ペプチドは有利に抗ＥＰＯ抗体に対する交差反応性を示さないことが示される。したがって、本明細書中に記載されるＥＰＯ模倣ペプチドは、ｒｈｕＥＰＯに対する抗体を発生させた患者においても治療効果を示す。さらに、ＥＰＯ模倣ペプチドに対する抗体はエリスロポイエチンに結合しないと予想される。したがって、本発明のＥＰＯ模倣ペプチドはまた、好ましくは、それらが抗ＥＰＯ抗体との有意な交差反応性を示さない点で特徴付けられる。
【０１９７】
（参考文献）
【０１９８】
【化３９】
。
【図面の簡単な説明】
【０１９９】
【図１】図１である。
【図２】図２である。
【図３】図３である。
【図４】図４である。
【図５】図５である。
【図６】図６である。
【図７】図７である。
【図８】図８である。
【図９】図９である。
【図１０】図１０である。
【図１１】図１１である。
【図１２】図１２である。
【図１３】図１３である。
【図１４】図１４である。
【図１５】図１５である。
【図１６】図１６である。
【図１７】図１７である。
【図１８】図１８である。
【図１９−１】図１９である。
【図１９−２】図１９である。
【図１９−３】図１９である。
【図１９−４】図１９である。
【図１９−５】図１９である。
【図２０】図２０である。
【図２１】図２１である。
【図２２】図２２である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＰＯ受容体に結合することができ、アゴニスト活性を含む、長さが少なくとも１０アミノ酸のペプチドであって、ＥＰＯ模倣ペプチドがＥＰＯ模倣ペプチドの１０位と呼ばれる位置にプロリンを含まず、正に荷電したアミノ酸を含むことを特徴とするペプチド。
【請求項２】
前記ＥＰＯ模倣ペプチドが折りたたみ構造に特徴的なアミノ酸モチーフ（β−ターンモチーフ）を有し、前記ペプチドが１０位でβ−ターンモチーフにプロリンを含まず、正に荷電したアミノ酸、好ましくはＫを含むことを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
９位および１０位が５−アミノレブリン酸（５−Ａｌｓ）
【化１】
で占められていることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
１７位に、正に荷電したアミノ酸、好ましくはＫまたはＨａｒを有することを特徴とする、請求項１〜３の一項に記載のペプチド。
【請求項５】
特にＥＰＯ受容体に結合することができ、以下のアミノ酸の配列：
【化２】
を含み、
配列中、各アミノ酸が天然または非天然アミノ酸から選択され、
Ｘ６がＣ、Ａ、Ｅ、α−アミノ−γ−ブロモ酪酸もしくはホモシステイン（ｈｏｃ）であり、
Ｘ７がＲ、Ｈ、Ｌ、ＷもしくはＹもしくはＳであり、
Ｘ８がＭ、Ｆ、Ｉ、ホモセリンメチルエーテルもしくはノルイソロイシンであり、
Ｘ９がＧ、もしくはＧの保存的交換であり、
Ｘ１０がプロリンの非保存的交換であるか、
またはＸ９およびＸ１０が単一のアミノ酸によって置換されており、
Ｘ１１が任意のアミノ酸から選択され、
Ｘ１２がＴもしくはＡであり、
Ｘ１３がＷ、１−ｎａｌ、２−ｎａｌ、ＡもしくはＦであり、
Ｘ１４がＤ、Ｅ、Ｉ、ＬもしくはＶであり、
Ｘ１５がＣ、Ａ、Ｋ、α−アミノ−γ−ブロモ酪酸もしくはホモシステイン（ｈｏｃ）であり、
ただしＸ６もしくはＸ１５のいずれかがＣもしくはｈｏｃである、
ペプチド。
【請求項６】
以下のアミノ酸の配列：
【化３】
を特徴とし、
配列中、各アミノ酸が標準的文字省略形によって示され、
Ｘ６がＣであり、
Ｘ７がＲ、Ｈ、ＬもしくはＷであり、
Ｘ８がＭ、ＦもしくはＩであり、
Ｘ９がＧ、もしくはＧの保存的交換であり、
Ｘ１０がプロリンの非保存的交換であり、
Ｘ１１が任意のアミノ酸から独立して選択され、
Ｘ１２がＴであり、
Ｘ１３がＷであり、
Ｘ１４がＤ、Ｅ、Ｉ、ＬもしくはＶであり、
Ｘ１５がＣであるか、
またはＸ９およびＸ１０が単一のアミノ酸によって置換されているか、
あるいは以下のアミノ酸配列：
【化４】
を特徴とし、
配列中、Ｘ６がＣであり、
Ｘ７がＲ、Ｈ、ＬもしくはＷであり、
Ｘ８がＭ、Ｆ、Ｉもしくはｈｓｍ（ホモセリンメチルエーテル）であり、
Ｘ９がＧ、もしくはＧの保存的交換であり、
Ｘ１０がプロリンの非保存的交換であり、
Ｘ１１が任意のアミノ酸から独立して選択され、
Ｘ１２がＴであり、
Ｘ１３がＷであり、
Ｘ１４がＤ、Ｅ、Ｉ、ＬもしくはＶ、１−ｎａｌ（１−ナフチルアラニン）もしくは２−ｎａｌ（２−ナフチルアラニン）であり、
Ｘ１５がＣである、
請求項５に記載のペプチド。
【請求項７】
Ｘ１０が正に荷電した側鎖を有するアミノ酸、好ましくはＲ、Ｋもしくはそれぞれの非天然アミノ酸、好ましくはＨａｒであるか、またはＸ９およびＸ１０が単一のアミノ酸、好ましくは５−アミノレブリン酸（Ａｌｓ）もしくはアミノ吉草酸によって置換されていることを特徴とする、請求項５または６の一項に記載のペプチド。
【請求項８】
請求項１〜７の一項に記載のペプチドであって、
以下のアミノ酸配列：
【化５】
を含み、
配列中、Ｘ６〜Ｘ１５が請求項１〜７に記載される意味を有し、
Ｘ４がＹであり、
Ｘ５が任意のアミノ酸から独立して選択され、好ましくはＡ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、ＴまたはＩである、
ペプチド。
【請求項９】
請求項８に記載のペプチドであって、
以下のアミノ酸配列
【化６】
を含み、
配列中、Ｘ４〜Ｘ１５が請求項８に記載の意味を有し、
Ｘ３が任意のアミノ酸から独立して選択され、好ましくはＤ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ｓ、ＴまたはＶであり、
Ｘ１６が任意のアミノ酸から独立して選択され、好ましくはＧ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、ＳまたはＴであり、
Ｘ１７が任意のアミノ酸から独立して選択され、好ましくはＡ、Ｇ、Ｐ、Ｒ、Ｋ、Ｙ、または正に荷電した側鎖を有する非天然アミノ酸、好ましくはホモアルギニンであり、
Ｘ１８が任意のアミノ酸から独立して選択される、
ペプチド。
【請求項１０】
Ｘ６がＣ、Ｅ、Ａもしくはｈｏｃ、好ましくはＣであり、そして／またはＸ７がＲ、Ｓ、ＨもしくはＹであり、そして／またはＸ８がＦもしくはＭであり、そして／またはＸ９がＧもしくはＡ、好ましくはＧであり、そして／またはＸ１０がＫもしくはＨａｒであり、そして／またはＸ１１がＶ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｅ、Ａ、Ｔもしくはノルイソロイシンであり、そして／またはＸ１２がＴであり、そして／またはＸ１３がＷであり、そして／またはＸ１４がＤもしくはＶであり、そして／またはＸ１５がＣもしくはｈｏｃ、好ましくはＣであり、そして／またはＸ１７がＰ、Ｙ、ＡもしくはＫもしくはＨａｒである、請求項１〜９の一項に記載のペプチド。
【請求項１１】
【化７−１】
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、５−アミノレブリン酸（Ａｌｓ）は、
【化７−２】
である、請求項１または５に記載のペプチド。
【請求項１２】
【化８】
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、
配列中、Ｘが１−ナフチルアラニンであり、Ｕが２−ナフチルアラニンである、請求項１〜１１の少なくとも一項に記載のペプチド。
【請求項１３】
単一のアミノ酸の保存的交換によって修飾され、好ましくは１、２または３つより多くないアミノ酸が交換されることを特徴とする、請求項１〜１２の少なくとも一項に記載のペプチド。
【請求項１４】
抗ＥＰＯ抗体と交差反応しないことを特徴とする、請求項１〜１３の一項に記載のペプチド。
【請求項１５】
前記ペプチドが修飾され、前記修飾が好ましくはＮ末端および／またはＣ末端アセチル化（Ａｃ）および／またはアミド化（Ａｍ）、好ましくは分子内ジスルフィド架橋を介した分子内環化、および／またはリン酸化からなる群より選択され、Ｎ−メチルグリシン（ｍｅＧ）としてのＣ末端グリシンの修飾およびＮ−アセチルグリシン（ＡｃＧ）としてのＮ末端グリシンの修飾が特に好ましく、そして／または前記ペプチドがポリマー部分に結合され、前記部分が好ましくはポリエチレングリコール、デキストランおよびデンプンからなる群より選択される、請求項１〜１４の少なくとも一項に記載のペプチド。
【請求項１６】
請求項１〜１５の少なくとも一項に記載のペプチドであって、請求項１〜１５で定義されたペプチド配列の単量体、二量体または多量体のいずれかを形成する、ペプチド。
【請求項１７】
前記二量体または多量体が、分枝または非分枝構造を有するホモマーまたはヘテロマーのいずれかであり、前記単量体ペプチド単位が互いにＮ末端からＮ末端、Ｃ末端からＣ末端、またはＮ末端からＣ末端へ連結される、請求項１６に記載のペプチド。
【請求項１８】
リンカーおよび／またはスペーサー単位を含む、請求項１５または１７の一項に記載のペプチド。
【請求項１９】
受容体に対する結合能を有する少なくとも２つのドメインを含み、前記ドメインが請求項１〜１４および５５で定義されるアミノ酸配列を含む、連続したペプチド鎖を有する合成ペプチド。
【請求項２０】
少なくとも２つの異種結合ドメインを含む、請求項１９に記載の合成ペプチド。
【請求項２１】
天然または非天然アミノ酸残基の連結部分（リンカー）を含む、請求項１９または２０に記載の合成ペプチド。
【請求項２２】
連結部分が３〜５個のグリシンおよび／もしくはアラニン残基またはそれらの誘導体を含む、請求項１９〜２１の一項に記載の合成ペプチド。
【請求項２３】
前記リンカーが、結合ドメインの一部を形成するアミノ酸によって提供される、請求項１９〜２２の一項に記載の合成ペプチド。
【請求項２４】
【化９】
または請求項１〜１４で定義されるペプチド配列の１つから選択されるペプチド配列を含み、さらなるアミノ酸、好ましくはＮ末端のシステインのような反応性側鎖を必要に応じて有するアミノ酸を有し、それぞれの配列中に存在する場合、第１のシステインと第２のシステインとの間の分子内ジスルフィド架橋、および／または第３のシステインと第４のシステインとの間の分子内ジスルフィド架橋を必要に応じて含む、請求項１９に記載の合成ペプチド。
【請求項２５】
少なくとも、以下：
ａ．第１のペプチド
ｂ．第２のペプチドならびに
ｃ．好ましくは前記第１および第２のペプチドを連結する連結部分（リンカー）
を含み、
前記ペプチドの少なくとも１つが、請求項１〜１４、２４または５５の一項で定義されるアミノ酸配列を含むペプチド単位を含む、
ペプチド二量体または多量体。
【請求項２６】
前記第１のペプチドのＣ末端が前記第２のペプチドのＮ末端に共有結合しているか、または前記ペプチドのＣ末端が前記第２のペプチドのＣ末端に共有結合しているか、または前記第１のペプチドのＮ末端が前記第２のペプチドのＮ末端に共有結合している、請求項２５に記載のペプチド二量体または多量体。
【請求項２７】
前記リンカーが天然および／または非天然アミノ酸、好ましくはグリシン、アラニン、またはそれらの誘導体の配列を含む、請求項２５または２６に記載のペプチド二量体または多量体。
【請求項２８】
前記リンカー／スペーサー単位がジケトピペラジン単位を含む、請求項２５〜２７に記載のペプチド二量体または多量体。
【請求項２９】
前記リンカーが二価ジアシルビルディングブロック、好ましくは脂肪族ジカルボン酸由来のジアシルビルディングブロックである、請求項２６に記載のペプチド二量体または多量体。
【請求項３０】
前記第１のペプチドのアミノ酸側鎖が前記第２のペプチドのアミノ酸側鎖に共有結合している、請求項２５に記載のペプチド二量体または多量体。
【請求項３１】
前記ペプチドに共有結合した水溶性ポリマー、好ましくはポリエチレングリコール、デキストランまたはデンプンからなる群より選択される水溶性ポリマーをさらに含む、請求項１〜３０のいずれかに記載のペプチド。
【請求項３２】
前記水溶性部分がＰＥＧ、好ましくは少なくとも１０ｋＤ、最も好ましくは２０と６０ＫＤとの間の分子量を有するＰＥＧである、請求項３１に記載のペプチド。
【請求項３３】
（ｉ）各ペプチド単位が標的への結合能を有する少なくとも２つのドメインを含み、前記結合ドメインが請求項１〜１４または５５のいずれか一項で定義されるアミノ酸配列を含む、少なくとも２つのペプチド単位；
（ｉｉ）少なくとも１つのポリマー担体単位
を含み、
前記ペプチド単位が前記ポリマー担体単位に結合されている、標的分子に結合する化合物。
【請求項３４】
前記担体単位が少なくとも１つの天然または合成の分枝、樹状または直鎖状のポリマーであるか、またはこれを含み、好ましくはポリグリセリン、ポリシアリン酸、デキストラン、デンプンまたはポリエチレングリコールからなる群より選択されるか、または他の生物学的に不活性な水溶性ポリマーに由来する、請求項３３に記載の化合物。
【請求項３５】
前記担体単位が分枝単位を含む、請求項３３または３４に記載の化合物。
【請求項３６】
前記分枝単位がグリセロールまたはポリグリセロールを含む、請求項３５に記載の化合物。
【請求項３７】
前記担体分子が少なくとも５ｋＤ、好ましくは２０〜２００または４０００ｋＤの分子量を有し、そしてポリエチレングリコールのようなより小さい担体が使用される場合は２０〜８０ｋＤの分子量を有する、請求項３３〜３６の少なくとも一項に記載の化合物。
【請求項３８】
前記担体単位が少なくとも２つのポリマーサブユニットを含み、前記ポリマーサブユニットが少なくとも１つの生分解性共有リンカー構造を介して互いに連結されている、請求項３３〜３７の少なくとも一項に記載の化合物。
【請求項３９】
第１の生分解性担体単位を含み、ペプチド単位および第２のポリマー担体単位が前記第１のポリマー担体単位に結合している、請求項３３〜３８の少なくとも一項に記載の化合物。
【請求項４０】
前記第２の担体単位が前記第１の担体単位よりも低い分子量を有し、好ましくはＨＥＳのようなヒドロキシアルキルデンプンである前記第１の担体単位のおよそ２０〜５０％の結合部位が、好ましくは分子量約３〜１０ｋＤのポリエチレングリコールである前記第２の担体単位で占められている、請求項３９に記載の化合物。
【請求項４１】
修飾されたポリマー担体単位が使用される、請求項３３〜４０の少なくとも一項に記載の化合物。
【請求項４２】
前記ペプチド単位が共有結合を介して前記ポリマー担体単位に結合しており、前記ペプチド単位の反応性アミノ酸、Ｎ末端アミノ基および／またはＣ末端カルボン酸を介して結合が起こり、前記反応性アミノ酸が好ましくはリシン、システイン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニンおよびチロシンからなる群より選択され、
ポリマーが適切な反応性結合基を有さない場合はポリマー担体単位の修飾に結合物質が使用され、
前記結合物質は好ましくはペプチド単位のアミノ基と反応するアシル化基、ペプチド単位のスルフヒドリル（メルカプト）、チオメチル、イミダゾまたはアミノ基と反応するアルキル化基からなる群より選択され、最も好ましくはマレイミド基、ペプチド単位のカルボキシル基と反応するエステルおよびアミド形成基、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）基およびアルキルメルカプタン基、シクロヘキサンジオン基のようなジカルボニル基のようなペプチド単位のスルフヒドリル基と反応するジスルフィド形成基、およびペプチド単位のグアニジン部分と反応する他の１，２−ジケトン基；ペプチドのフェノール基と反応するジアゾ基；ペプチド単位のアミノ基と反応する、ポリマーと臭化シアンとの反応に由来する反応基からなる群より選択される、
請求項４１に記載の化合物。
【請求項４３】
前記反応性アミノ酸がシステインであり、結合基がマレイミドである、請求項４２に記載の化合物。
【請求項４４】
前記ペプチド単位の前記結合ドメインがリンカー構造を介して内部で連結される、請求項３３〜４３の少なくとも一項に記載の化合物。
【請求項４５】
リンカーが連続したペプチドリンカーである、請求項４４に記載の化合物。
【請求項４６】
医薬組成物の調製のための、請求項１〜４５または５５の少なくとも一項に記載のペプチドおよび／または化合物の使用。
【請求項４７】
エリスロポイエチンの欠乏または少ないもしくは不完全な赤血球集団によって特徴付けられるか、またはエリスロポイエチンの投与によって治療可能な障害の予防または治療のため、および特に任意の型の貧血もしくは脳卒中の治療のための医薬組成物の調製のための、請求項１〜４５または５５の少なくとも一項に記載のペプチドおよび／または化合物の使用。
【請求項４８】
エリスロポイエチンの欠乏または少ないもしくは不完全な赤血球集団によって特徴付けられるか、またはエリスロポイエチンの投与によって治療可能な障害の予防または治療のため、および特に任意の型の貧血もしくは脳卒中の治療のための、請求項１〜４５または５５の少なくとも一項に記載のペプチドおよび／または化合物の使用。
【請求項４９】
請求項１〜４５または５５の少なくとも一項に記載の化合物、および必要に応じて薬学的に許容され得る担体を含む、医薬組成物。
【請求項５０】
エリスロポイエチンの欠乏または少ないもしくは不完全な赤血球集団によって特徴付けられるか、またはエリスロポイエチンの投与によって治療可能な障害の予防または治療のため、および特に任意の型の貧血もしくは脳卒中の治療のための、請求項４９に記載の医薬組成物。
【請求項５１】
（ｉ）各ペプチド単位が受容体に対する結合能を有する少なくとも２つのドメインを含む、少なくとも２つのペプチド単位を生じること、
（ｉｉ）少なくとも１つのポリマー担体単位を生じること、
（ｉｉｉ）前記ペプチド単位を前記ポリマー担体単位に結合させること
を含む、請求項３３〜４５の少なくとも一項に記載の化合物を生成する方法。
【請求項５２】
前記ペプチド単位が連続したペプチド鎖として合成される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
ペプチド単位上の利用可能な化学基と反応することができ、次いでポリマー担体単位の化学基を利用して反応性ポリマー担体単位とペプチド単位をともに反応させて共有結合したその複合体を形成することができる少なくとも１つの化学基を有するポリマー担体単位が使用される、請求項５１または５２に記載の方法。
【請求項５４】
請求項１〜１４および１６のいずれか一項に記載のペプチドをコードする核酸。
【請求項５５】
請求項１〜１４の少なくとも一項に記載のペプチドのｉｎｖｅｒｓｏ型および／またはｒｅｔｒｏ／ｉｎｖｅｒｓｏ型ペプチド、または完全にＤ−アミノ酸からなるそれぞれのペプチドであることを特徴とするペプチド。
【請求項１】
ＥＰＯ受容体に結合することができ、アゴニスト活性を含む、長さが少なくとも１０アミノ酸のペプチドであって、ＥＰＯ模倣ペプチドがＥＰＯ模倣ペプチドの１０位と呼ばれる位置にプロリンを含まず、正に荷電したアミノ酸を含むことを特徴とするペプチド。
【請求項２】
前記ＥＰＯ模倣ペプチドが折りたたみ構造に特徴的なアミノ酸モチーフ（β−ターンモチーフ）を有し、前記ペプチドが１０位でβ−ターンモチーフにプロリンを含まず、正に荷電したアミノ酸、好ましくはＫを含むことを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
９位および１０位が５−アミノレブリン酸（５−Ａｌｓ）
【化１】
で占められていることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
１７位に、正に荷電したアミノ酸、好ましくはＫまたはＨａｒを有することを特徴とする、請求項１〜３の一項に記載のペプチド。
【請求項５】
特にＥＰＯ受容体に結合することができ、以下のアミノ酸の配列：
【化２】
を含み、
配列中、各アミノ酸が天然または非天然アミノ酸から選択され、
Ｘ６がＣ、Ａ、Ｅ、α−アミノ−γ−ブロモ酪酸もしくはホモシステイン（ｈｏｃ）であり、
Ｘ７がＲ、Ｈ、Ｌ、ＷもしくはＹもしくはＳであり、
Ｘ８がＭ、Ｆ、Ｉ、ホモセリンメチルエーテルもしくはノルイソロイシンであり、
Ｘ９がＧ、もしくはＧの保存的交換であり、
Ｘ１０がプロリンの非保存的交換であるか、
またはＸ９およびＸ１０が単一のアミノ酸によって置換されており、
Ｘ１１が任意のアミノ酸から選択され、
Ｘ１２がＴもしくはＡであり、
Ｘ１３がＷ、１−ｎａｌ、２−ｎａｌ、ＡもしくはＦであり、
Ｘ１４がＤ、Ｅ、Ｉ、ＬもしくはＶであり、
Ｘ１５がＣ、Ａ、Ｋ、α−アミノ−γ−ブロモ酪酸もしくはホモシステイン（ｈｏｃ）であり、
ただしＸ６もしくはＸ１５のいずれかがＣもしくはｈｏｃである、
ペプチド。
【請求項６】
以下のアミノ酸の配列：
【化３】
を特徴とし、
配列中、各アミノ酸が標準的文字省略形によって示され、
Ｘ６がＣであり、
Ｘ７がＲ、Ｈ、ＬもしくはＷであり、
Ｘ８がＭ、ＦもしくはＩであり、
Ｘ９がＧ、もしくはＧの保存的交換であり、
Ｘ１０がプロリンの非保存的交換であり、
Ｘ１１が任意のアミノ酸から独立して選択され、
Ｘ１２がＴであり、
Ｘ１３がＷであり、
Ｘ１４がＤ、Ｅ、Ｉ、ＬもしくはＶであり、
Ｘ１５がＣであるか、
またはＸ９およびＸ１０が単一のアミノ酸によって置換されているか、
あるいは以下のアミノ酸配列：
【化４】
を特徴とし、
配列中、Ｘ６がＣであり、
Ｘ７がＲ、Ｈ、ＬもしくはＷであり、
Ｘ８がＭ、Ｆ、Ｉもしくはｈｓｍ（ホモセリンメチルエーテル）であり、
Ｘ９がＧ、もしくはＧの保存的交換であり、
Ｘ１０がプロリンの非保存的交換であり、
Ｘ１１が任意のアミノ酸から独立して選択され、
Ｘ１２がＴであり、
Ｘ１３がＷであり、
Ｘ１４がＤ、Ｅ、Ｉ、ＬもしくはＶ、１−ｎａｌ（１−ナフチルアラニン）もしくは２−ｎａｌ（２−ナフチルアラニン）であり、
Ｘ１５がＣである、
請求項５に記載のペプチド。
【請求項７】
Ｘ１０が正に荷電した側鎖を有するアミノ酸、好ましくはＲ、Ｋもしくはそれぞれの非天然アミノ酸、好ましくはＨａｒであるか、またはＸ９およびＸ１０が単一のアミノ酸、好ましくは５−アミノレブリン酸（Ａｌｓ）もしくはアミノ吉草酸によって置換されていることを特徴とする、請求項５または６の一項に記載のペプチド。
【請求項８】
請求項１〜７の一項に記載のペプチドであって、
以下のアミノ酸配列：
【化５】
を含み、
配列中、Ｘ６〜Ｘ１５が請求項１〜７に記載される意味を有し、
Ｘ４がＹであり、
Ｘ５が任意のアミノ酸から独立して選択され、好ましくはＡ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、ＴまたはＩである、
ペプチド。
【請求項９】
請求項８に記載のペプチドであって、
以下のアミノ酸配列
【化６】
を含み、
配列中、Ｘ４〜Ｘ１５が請求項８に記載の意味を有し、
Ｘ３が任意のアミノ酸から独立して選択され、好ましくはＤ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ｓ、ＴまたはＶであり、
Ｘ１６が任意のアミノ酸から独立して選択され、好ましくはＧ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、ＳまたはＴであり、
Ｘ１７が任意のアミノ酸から独立して選択され、好ましくはＡ、Ｇ、Ｐ、Ｒ、Ｋ、Ｙ、または正に荷電した側鎖を有する非天然アミノ酸、好ましくはホモアルギニンであり、
Ｘ１８が任意のアミノ酸から独立して選択される、
ペプチド。
【請求項１０】
Ｘ６がＣ、Ｅ、Ａもしくはｈｏｃ、好ましくはＣであり、そして／またはＸ７がＲ、Ｓ、ＨもしくはＹであり、そして／またはＸ８がＦもしくはＭであり、そして／またはＸ９がＧもしくはＡ、好ましくはＧであり、そして／またはＸ１０がＫもしくはＨａｒであり、そして／またはＸ１１がＶ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｅ、Ａ、Ｔもしくはノルイソロイシンであり、そして／またはＸ１２がＴであり、そして／またはＸ１３がＷであり、そして／またはＸ１４がＤもしくはＶであり、そして／またはＸ１５がＣもしくはｈｏｃ、好ましくはＣであり、そして／またはＸ１７がＰ、Ｙ、ＡもしくはＫもしくはＨａｒである、請求項１〜９の一項に記載のペプチド。
【請求項１１】
【化７−１】
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、５−アミノレブリン酸（Ａｌｓ）は、
【化７−２】
である、請求項１または５に記載のペプチド。
【請求項１２】
【化８】
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、
配列中、Ｘが１−ナフチルアラニンであり、Ｕが２−ナフチルアラニンである、請求項１〜１１の少なくとも一項に記載のペプチド。
【請求項１３】
単一のアミノ酸の保存的交換によって修飾され、好ましくは１、２または３つより多くないアミノ酸が交換されることを特徴とする、請求項１〜１２の少なくとも一項に記載のペプチド。
【請求項１４】
抗ＥＰＯ抗体と交差反応しないことを特徴とする、請求項１〜１３の一項に記載のペプチド。
【請求項１５】
前記ペプチドが修飾され、前記修飾が好ましくはＮ末端および／またはＣ末端アセチル化（Ａｃ）および／またはアミド化（Ａｍ）、好ましくは分子内ジスルフィド架橋を介した分子内環化、および／またはリン酸化からなる群より選択され、Ｎ−メチルグリシン（ｍｅＧ）としてのＣ末端グリシンの修飾およびＮ−アセチルグリシン（ＡｃＧ）としてのＮ末端グリシンの修飾が特に好ましく、そして／または前記ペプチドがポリマー部分に結合され、前記部分が好ましくはポリエチレングリコール、デキストランおよびデンプンからなる群より選択される、請求項１〜１４の少なくとも一項に記載のペプチド。
【請求項１６】
請求項１〜１５の少なくとも一項に記載のペプチドであって、請求項１〜１５で定義されたペプチド配列の単量体、二量体または多量体のいずれかを形成する、ペプチド。
【請求項１７】
前記二量体または多量体が、分枝または非分枝構造を有するホモマーまたはヘテロマーのいずれかであり、前記単量体ペプチド単位が互いにＮ末端からＮ末端、Ｃ末端からＣ末端、またはＮ末端からＣ末端へ連結される、請求項１６に記載のペプチド。
【請求項１８】
リンカーおよび／またはスペーサー単位を含む、請求項１５または１７の一項に記載のペプチド。
【請求項１９】
受容体に対する結合能を有する少なくとも２つのドメインを含み、前記ドメインが請求項１〜１４および５５で定義されるアミノ酸配列を含む、連続したペプチド鎖を有する合成ペプチド。
【請求項２０】
少なくとも２つの異種結合ドメインを含む、請求項１９に記載の合成ペプチド。
【請求項２１】
天然または非天然アミノ酸残基の連結部分（リンカー）を含む、請求項１９または２０に記載の合成ペプチド。
【請求項２２】
連結部分が３〜５個のグリシンおよび／もしくはアラニン残基またはそれらの誘導体を含む、請求項１９〜２１の一項に記載の合成ペプチド。
【請求項２３】
前記リンカーが、結合ドメインの一部を形成するアミノ酸によって提供される、請求項１９〜２２の一項に記載の合成ペプチド。
【請求項２４】
【化９】
または請求項１〜１４で定義されるペプチド配列の１つから選択されるペプチド配列を含み、さらなるアミノ酸、好ましくはＮ末端のシステインのような反応性側鎖を必要に応じて有するアミノ酸を有し、それぞれの配列中に存在する場合、第１のシステインと第２のシステインとの間の分子内ジスルフィド架橋、および／または第３のシステインと第４のシステインとの間の分子内ジスルフィド架橋を必要に応じて含む、請求項１９に記載の合成ペプチド。
【請求項２５】
少なくとも、以下：
ａ．第１のペプチド
ｂ．第２のペプチドならびに
ｃ．好ましくは前記第１および第２のペプチドを連結する連結部分（リンカー）
を含み、
前記ペプチドの少なくとも１つが、請求項１〜１４、２４または５５の一項で定義されるアミノ酸配列を含むペプチド単位を含む、
ペプチド二量体または多量体。
【請求項２６】
前記第１のペプチドのＣ末端が前記第２のペプチドのＮ末端に共有結合しているか、または前記ペプチドのＣ末端が前記第２のペプチドのＣ末端に共有結合しているか、または前記第１のペプチドのＮ末端が前記第２のペプチドのＮ末端に共有結合している、請求項２５に記載のペプチド二量体または多量体。
【請求項２７】
前記リンカーが天然および／または非天然アミノ酸、好ましくはグリシン、アラニン、またはそれらの誘導体の配列を含む、請求項２５または２６に記載のペプチド二量体または多量体。
【請求項２８】
前記リンカー／スペーサー単位がジケトピペラジン単位を含む、請求項２５〜２７に記載のペプチド二量体または多量体。
【請求項２９】
前記リンカーが二価ジアシルビルディングブロック、好ましくは脂肪族ジカルボン酸由来のジアシルビルディングブロックである、請求項２６に記載のペプチド二量体または多量体。
【請求項３０】
前記第１のペプチドのアミノ酸側鎖が前記第２のペプチドのアミノ酸側鎖に共有結合している、請求項２５に記載のペプチド二量体または多量体。
【請求項３１】
前記ペプチドに共有結合した水溶性ポリマー、好ましくはポリエチレングリコール、デキストランまたはデンプンからなる群より選択される水溶性ポリマーをさらに含む、請求項１〜３０のいずれかに記載のペプチド。
【請求項３２】
前記水溶性部分がＰＥＧ、好ましくは少なくとも１０ｋＤ、最も好ましくは２０と６０ＫＤとの間の分子量を有するＰＥＧである、請求項３１に記載のペプチド。
【請求項３３】
（ｉ）各ペプチド単位が標的への結合能を有する少なくとも２つのドメインを含み、前記結合ドメインが請求項１〜１４または５５のいずれか一項で定義されるアミノ酸配列を含む、少なくとも２つのペプチド単位；
（ｉｉ）少なくとも１つのポリマー担体単位
を含み、
前記ペプチド単位が前記ポリマー担体単位に結合されている、標的分子に結合する化合物。
【請求項３４】
前記担体単位が少なくとも１つの天然または合成の分枝、樹状または直鎖状のポリマーであるか、またはこれを含み、好ましくはポリグリセリン、ポリシアリン酸、デキストラン、デンプンまたはポリエチレングリコールからなる群より選択されるか、または他の生物学的に不活性な水溶性ポリマーに由来する、請求項３３に記載の化合物。
【請求項３５】
前記担体単位が分枝単位を含む、請求項３３または３４に記載の化合物。
【請求項３６】
前記分枝単位がグリセロールまたはポリグリセロールを含む、請求項３５に記載の化合物。
【請求項３７】
前記担体分子が少なくとも５ｋＤ、好ましくは２０〜２００または４０００ｋＤの分子量を有し、そしてポリエチレングリコールのようなより小さい担体が使用される場合は２０〜８０ｋＤの分子量を有する、請求項３３〜３６の少なくとも一項に記載の化合物。
【請求項３８】
前記担体単位が少なくとも２つのポリマーサブユニットを含み、前記ポリマーサブユニットが少なくとも１つの生分解性共有リンカー構造を介して互いに連結されている、請求項３３〜３７の少なくとも一項に記載の化合物。
【請求項３９】
第１の生分解性担体単位を含み、ペプチド単位および第２のポリマー担体単位が前記第１のポリマー担体単位に結合している、請求項３３〜３８の少なくとも一項に記載の化合物。
【請求項４０】
前記第２の担体単位が前記第１の担体単位よりも低い分子量を有し、好ましくはＨＥＳのようなヒドロキシアルキルデンプンである前記第１の担体単位のおよそ２０〜５０％の結合部位が、好ましくは分子量約３〜１０ｋＤのポリエチレングリコールである前記第２の担体単位で占められている、請求項３９に記載の化合物。
【請求項４１】
修飾されたポリマー担体単位が使用される、請求項３３〜４０の少なくとも一項に記載の化合物。
【請求項４２】
前記ペプチド単位が共有結合を介して前記ポリマー担体単位に結合しており、前記ペプチド単位の反応性アミノ酸、Ｎ末端アミノ基および／またはＣ末端カルボン酸を介して結合が起こり、前記反応性アミノ酸が好ましくはリシン、システイン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニンおよびチロシンからなる群より選択され、
ポリマーが適切な反応性結合基を有さない場合はポリマー担体単位の修飾に結合物質が使用され、
前記結合物質は好ましくはペプチド単位のアミノ基と反応するアシル化基、ペプチド単位のスルフヒドリル（メルカプト）、チオメチル、イミダゾまたはアミノ基と反応するアルキル化基からなる群より選択され、最も好ましくはマレイミド基、ペプチド単位のカルボキシル基と反応するエステルおよびアミド形成基、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）基およびアルキルメルカプタン基、シクロヘキサンジオン基のようなジカルボニル基のようなペプチド単位のスルフヒドリル基と反応するジスルフィド形成基、およびペプチド単位のグアニジン部分と反応する他の１，２−ジケトン基；ペプチドのフェノール基と反応するジアゾ基；ペプチド単位のアミノ基と反応する、ポリマーと臭化シアンとの反応に由来する反応基からなる群より選択される、
請求項４１に記載の化合物。
【請求項４３】
前記反応性アミノ酸がシステインであり、結合基がマレイミドである、請求項４２に記載の化合物。
【請求項４４】
前記ペプチド単位の前記結合ドメインがリンカー構造を介して内部で連結される、請求項３３〜４３の少なくとも一項に記載の化合物。
【請求項４５】
リンカーが連続したペプチドリンカーである、請求項４４に記載の化合物。
【請求項４６】
医薬組成物の調製のための、請求項１〜４５または５５の少なくとも一項に記載のペプチドおよび／または化合物の使用。
【請求項４７】
エリスロポイエチンの欠乏または少ないもしくは不完全な赤血球集団によって特徴付けられるか、またはエリスロポイエチンの投与によって治療可能な障害の予防または治療のため、および特に任意の型の貧血もしくは脳卒中の治療のための医薬組成物の調製のための、請求項１〜４５または５５の少なくとも一項に記載のペプチドおよび／または化合物の使用。
【請求項４８】
エリスロポイエチンの欠乏または少ないもしくは不完全な赤血球集団によって特徴付けられるか、またはエリスロポイエチンの投与によって治療可能な障害の予防または治療のため、および特に任意の型の貧血もしくは脳卒中の治療のための、請求項１〜４５または５５の少なくとも一項に記載のペプチドおよび／または化合物の使用。
【請求項４９】
請求項１〜４５または５５の少なくとも一項に記載の化合物、および必要に応じて薬学的に許容され得る担体を含む、医薬組成物。
【請求項５０】
エリスロポイエチンの欠乏または少ないもしくは不完全な赤血球集団によって特徴付けられるか、またはエリスロポイエチンの投与によって治療可能な障害の予防または治療のため、および特に任意の型の貧血もしくは脳卒中の治療のための、請求項４９に記載の医薬組成物。
【請求項５１】
（ｉ）各ペプチド単位が受容体に対する結合能を有する少なくとも２つのドメインを含む、少なくとも２つのペプチド単位を生じること、
（ｉｉ）少なくとも１つのポリマー担体単位を生じること、
（ｉｉｉ）前記ペプチド単位を前記ポリマー担体単位に結合させること
を含む、請求項３３〜４５の少なくとも一項に記載の化合物を生成する方法。
【請求項５２】
前記ペプチド単位が連続したペプチド鎖として合成される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
ペプチド単位上の利用可能な化学基と反応することができ、次いでポリマー担体単位の化学基を利用して反応性ポリマー担体単位とペプチド単位をともに反応させて共有結合したその複合体を形成することができる少なくとも１つの化学基を有するポリマー担体単位が使用される、請求項５１または５２に記載の方法。
【請求項５４】
請求項１〜１４および１６のいずれか一項に記載のペプチドをコードする核酸。
【請求項５５】
請求項１〜１４の少なくとも一項に記載のペプチドのｉｎｖｅｒｓｏ型および／またはｒｅｔｒｏ／ｉｎｖｅｒｓｏ型ペプチド、または完全にＤ−アミノ酸からなるそれぞれのペプチドであることを特徴とするペプチド。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９−１】
【図１９−２】
【図１９−３】
【図１９−４】
【図１９−５】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９−１】
【図１９−２】
【図１９−３】
【図１９−４】
【図１９−５】
【図２０】
【図２１】
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【公表番号】特表２００８−５１９５８９（Ｐ２００８−５１９５８９Ａ）
【公表日】平成２０年６月１２日（２００８．６．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５４０５８２（Ｐ２００７−５４０５８２）
【出願日】平成１７年１１月１０日（２００５．１１．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１２０７５
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０５０９５９
【国際公開日】平成１８年５月１８日（２００６．５．１８）
【出願人】（５０７１５１１８０）アプラゲン ゲーエムベーハー (4)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年６月１２日（２００８．６．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１１月１０日（２００５．１１．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１２０７５
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０５０９５９
【国際公開日】平成１８年５月１８日（２００６．５．１８）
【出願人】（５０７１５１１８０）アプラゲン ゲーエムベーハー (4)
【Ｆターム（参考）】
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