連続合成装置および方法
【課題】 原料の成分の濃度を一定にした状態で反応を進行させ、効率よく連続ペプチド合成を行うことができる連続合成装置を提供する。
【解決手段】 この連続合成装置は、水溶性縮合剤と、Ｎ保護アミノ酸およびＣ保護ペプチドの混合液とを連続流れで混合し反応させる混合反応手段５と、合成後の液中から未反応の水相成分を分離し除去する油水分離手段６と、水相成分が除去された有機相成分液中に水素ガスを混合させ、触媒を介して生成したペプチドの脱保護反応を行う気体触媒反応手段７とを有する。
【解決手段】 この連続合成装置は、水溶性縮合剤と、Ｎ保護アミノ酸およびＣ保護ペプチドの混合液とを連続流れで混合し反応させる混合反応手段５と、合成後の液中から未反応の水相成分を分離し除去する油水分離手段６と、水相成分が除去された有機相成分液中に水素ガスを混合させ、触媒を介して生成したペプチドの脱保護反応を行う気体触媒反応手段７とを有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、水溶性縮合剤と有機溶媒に溶解した原料を用いるペプチドの合成を、連続流方式を用いて微細空間で行うための連続合成装置および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬品等の重要な原料であるペプチドは、分子設計された順序で、素材となるアミノ酸を順次ペプチド結合することによって合成される。必要なペプチド結合をさせるために、通常、結合すべきでない官能基（アミノ基又はカルボキシル基）を不活性化し、結合させる官能基の対を活性化する処理を行う。従来行われているペプチドの化学合成は、リンカーを付加させたスチレン樹脂粒子（担体）に、ベースとなるアミノ酸のカルボキシル基側末端（Ｃ末端）のアミノ酸を結合させ、他端のアミノ基側末端（Ｎ末端）に順次各構成アミノ酸を１個づつ付加して、最終的に所定数のアミノ酸残基を有するペプチドを合成する固相法が一般的である。
【０００３】
このような固相法では、反応部位が担体のごく一部であるので反応効率が低い上、反応中間体を精製することができないため、各反応を定量的に進行させねばならず、各試薬を常に過剰に使用する必要が有る。過剰に使用した試薬は大量の溶媒で洗って除去しなければならない。このようにして、どのようなペプチドも同じ操作の繰り返しにより合成することは可能ではあるが、担体粒子の寸法、形状など細部の性質が少しづつ異なるため、毎回再現性ある合成が得られないという問題があった。
【０００４】
一方、液相でペプチド合成が行われる場合においても、バッチ処理反応容器内において混合が機械的な攪拌で行われる。このため、釜内部に濃度の不均一が生じ、反応液どうしの濃度のバランスが一様でない状態で反応が進行し、その結果、不要な副反応が生じたりして不純物を多く生産し、収率を落とす結果をもたらしている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、前記事情に鑑みて為されたもので、微細な流路において、成分の濃度を一定にした状態で反応を進行させて効率よく連続ペプチド合成を行うことができる連続合成装置および方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記目的を達成するために、請求項１に記載の連続合成装置は、水溶性縮合剤と、Ｎ保護アミノ酸およびＣ保護ペプチドの混合液とを連続流れで混合し反応させる混合反応手段と、合成後の液中から未反応の水相成分を分離し除去する油水分離手段と、水相成分が除去された有機相成分液中に水素ガスを混合させ、触媒を介して生成したペプチドの脱保護反応を行う気体触媒反応手段とを有することを特徴とする。
【０００７】
請求項１に記載の発明においては、混合反応手段において、水溶性縮合剤と、Ｎ保護アミノ酸とＣ保護ペプチドの有機溶媒混合液とが連続流れで混合・反応し、油水分離手段により、合成後の液中から未反応の水相成分が分離・除去され、気体触媒反応手段において、有機相成分液中に水素ガスを混合させ、触媒を介して生成ペプチドの脱保護反応が行われる。これによりペプチドへのアミノ酸残基の付加と、その前後の処理が連続流れによる処理プロセスによって達成され、成分の濃度を一定にした状態で反応を進行させて効率よく連続ペプチド合成を行うことができる。バッチ式ではなく、連続流方式であるため液のリアクタ内の滞在時間は流量さえ維持すれば常に均一になるため、滞留による生成物の変質を防ぐことも出来る。
【０００８】
請求項２に記載の連続合成装置は、請求項１に記載の発明において、さらに、脱保護した前記生成ペプチド溶液とＣ保護ペプチドとを予備混合し、混合液として混合反応手段に供給する予備混合手段を有することを特徴とする。
請求項２に記載の発明においては、予備混合手段において、脱保護した前記生成ペプチド溶液とＣ保護ペプチドとが予備混合され、混合液として混合反応手段に供給される。これにより、生成したペプチドを順次原料として使用して、必要なアミノ酸残基を有するペプチドを連続的に合成することができる。
【０００９】
請求項３に記載の連続合成装置は、請求項２に記載の発明において、前記予備混合した混合液と水溶性縮合剤を前記混合反応手段に導く流路手段を有することを特徴とする。
請求項３に記載の発明においては、流路手段によって、予備混合した混合液と水溶性縮合剤が同じ混合反応手段に導かれ、低装置コストにより、順次ペプチド合成が進行する。
【００１０】
請求項４に記載の連続合成装置は、請求項２に記載の発明において、ｎ回のペプチド合成を連続に行うため、水溶性縮合剤を溜める縮合剤貯槽と、生成したＣ保護ペプチド/有機溶媒をＮ保護アミノ酸と混合させるｎ個の予備混合手段とを備え、前記予備混合手段は前記気体触媒反応手段の出口と流体移送管路で接続されていることを特徴とする。
請求項４に記載の発明においては、予備混合手段を気体触媒反応手段の出口と流体移送管路で接続することにより、脱保護されたペプチドが直接に次の原料としてＮ保護アミノ酸と予備混合されるので、余分の過程を経ることがなく、変質を防止することができる。
【００１１】
請求項５に記載の連続合成装置は、請求項２に記載の発明において、さらに、前記予備混合した混合液と水溶性縮合剤を連続流れで混合し反応させてこれらをペプチド結合させる第２次混合反応手段と、合成後の液中から未反応の水相成分を分離し除去する第２次油水分離手段と、水相成分が除去された有機相成分液中に水素ガスを混合させ、触媒を介して生成したペプチドの脱保護反応を行う第２次気体触媒反応手段とを有することを特徴とする。
請求項５に記載の発明においては、第２次混合反応手段、第２次油水分離手段と、第２次気体触媒反応手段という、先の装置と異なる装置により第２段の反応を進行させるので、処理が並行的に実行され、生産効率が向上する。
【００１２】
請求項６に記載の連続合成装置は、連続流路中において複数液を混合して有機合成を行う液体混合反応手段と、該液体混合反応手段から流出する生成液を油性成分と水性成分とに分離する油水分離手段と、分離された油性成分液に気体を混合させる気液混合手段と、成分液の流路に触媒を付与した気体触媒反応手段とを具備したことを特徴とする。
【００１３】
請求項７に記載の連続合成装置は、請求項１ないし請求項６のいずれかに記載の発明において、前記油水分離手段の一部が孔径が１μm以下の多孔質膜で構成されていることを特徴とする。
【００１４】
請求項８に記載の連続合成装置は、請求項１ないし請求項７のいずれかに記載の発明において、前記気液混合手段の一部が孔径が１μm以下の多孔質膜で構成されていることを特徴とする。
【００１５】
請求項９に記載の連続合成装置は、請求項１ないし請求項８のいずれかに記載の発明において、気体触媒反応手段が、表面にPd触媒を担持した粒径１mm以下の微粒子を充填した流路からなることを特徴とする。
【００１６】
請求項１０に記載の連続合成装置は、請求項１ないし請求項９のいずれかに記載の発明において、前記混合反応手段は、５００μm以下の流路幅を含む混合流路を有するマイクロリアクタであることを特徴とする。
請求項１０に記載の発明においては、５００μm以下の流路幅を含むマイクロリアクタ内において、２液の混合が、混合比率を厳密に制御した状態で、層流領域の分子拡散下で行われるため、２液の濃度のアンバランスを最小限に抑えることができる。さらに流路が微小であることで、反応温度を均一にでき、かつ吸熱応答性にも優れるため、選択性の高い反応が可能になる。
【００１７】
請求項１１に記載の連続合成装置は、請求項１ないし請求項９のいずれかに記載の発明において、前記混合反応手段は、孔径が１μm以下の多孔質膜を有する液体分散手段であることを特徴とする。
【００１８】
請求項１２に記載の連続合成方法は、水溶性縮合剤と、Ｎ保護アミノ酸とＣ保護ペプチド/有機溶媒の混合液を連続流れで混合し反応させてこれらをペプチド結合させる混合反応工程と、合成後の液中から未反応の水相成分を分離し除去する油水分離工程と、水相成分が除去された有機相成分液中に水素ガスを混合させ、触媒を介して生成したペプチドの脱保護反応を行う気体触媒反応工程とを有することを特徴とする。
【００１９】
請求項１３に記載の連続合成方法は、請求項１２に記載の発明において、さらに、脱保護した前記生成ペプチドにＮ保護アミノ酸を混合し、これと水溶性縮合剤の混合液を連続流れで混合し反応させてこれらをペプチド結合させる第２次混合反応工程と、合成後の液中から未反応の水相成分を分離し除去する第２次油水分離工程と、水相成分が除去された有機相成分液中に水素ガスを混合させ、触媒を介して生成したペプチドの脱保護反応を行う第２次気体触媒反応工程とを、所定回数繰り返すことによって所定数のアミノ酸残基を有するペプチドを合成することを特徴とする。
【発明の効果】
【００２０】
請求項１ないし請求項１３に記載の発明によれば、ペプチドへのアミノ酸残基の付加と、その前後の処理が連続流れによる処理プロセスによって達成され、成分の濃度を一定にした状態で反応を進行させて効率よく連続ペプチド合成を行うことができる。バッチ式ではなく、連続流方式であるため液のリアクタ内の滞在時間は流量さえ維持すれば常に均一になるため、滞留による生成物の変質を防ぐことも出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
図１は、この発明の連続流式ペプチド合成装置の１つの実施の形態を示すもので、アミノ酸付加ステップを行うための合成ユニット１を主体として構成されている。この合成ユニット１は、原料であるＮ保護アミノ酸を有機溶媒に溶解させた混合液を収容するｎ個の原料液容器２（２−１，２−２，・・，２−ｎ）と、同じく原料であるＣ保護ペプチドとＮ保護アミノ酸を予備混合して保持する予備混合容器（予備混合手段）３−１，３−２と、縮合剤を収容する縮合剤容器４と、これらを導入して混合・反応させる流路を有するマイクロリアクタ５と、マイクロリアクタ５の下流側に設置した油水分離器６と、分離された流体に水素ガスを混合させ、触媒によって水素化反応を行わせる気液反応器７とを備えて構成されている。気液反応器７は、気液混合器８と触媒反応器９から構成されている。
原料液容器２と触媒反応器９の出口は、それぞれ予備混合容器３−１，３−２に、開閉弁ＶおよびポンプＰを有する管路を介して接続されている。
【００２２】
Ｎ保護アミノ酸は、アミノ基に保護基を結合させて不活性化したアミノ酸であり、Ｃ保護ペプチドはカルボキシル基に保護基を結合させて不活性化した（ｋ）ペプチドである。なお、ここで（ｋ）ペプチドとは、ｋ番目の処理において用いるアミノ酸残基ｋ個を有するペプチドを言う。つまり、ｋ回目の反応では、
（ｋ）ペプチド＋アミノ酸→（ｋ＋１）ペプチド
の反応が起き、生成されたペプチドが次回の反応の原料となる。
【００２３】
Ｎ保護アミノ酸としては、例えば、カルボベンゾキシルアミノ酸（ｋ）、Ｃ保護ペプチドとしては、例えば（ｋ）ペプチド−ｔ−ブチルエステルが挙げられる。これらも、ｋ番目の反応に用いるアミノ酸あるいはペプチドを意味している（ｋ＝１〜ｎ）。
【００２４】
縮合剤は、Ｎ保護アミノ酸とＣ保護ペプチドのカルボキシル基とアミノ基を脱水縮合してペプチド結合させるもので、反応に応じて適宜のものを使用するが、本発明では、後段で反応生成物から分離を容易にするために、有機溶媒への溶解性とともに水溶性を有する縮合剤が好ましい。特に、副生する尿素誘導体が水溶性であるような、1−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）やジイソプロビルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤＩ）が好ましい。
【００２５】
マイクロリアクタ（混合反応手段）５は、流路幅（流れ方向と直角方向の分子の拡散移動距離）が５００μm以下の微細流路を合流させる混合流路を含む基板ユニットとして構成されており、流路寸法や形状は、実行する反応に合わせて設計される。この例では、単純なＹ字流路を用いているが、後述するような複数流路を交互に合流させる形式のものでもよい。一方の導入流路には予備混合容器（予備混合手段）３−１，３−２が、他方の流路には縮合剤容器４が、それぞれポンプＰを有する管路を介して接続されている。マイクロリアクタ５には、反応に応じて、加熱・保温手段を設けるとともに、圧力計、分析手段等を設置し、反応をモニターすることが好ましい。
【００２６】
油水分離器６は、図２に示すように、この例では筒状の容器１０の内部に撥水性を有する多孔質膜から構成された濾過管１１が配置された二重管構造となっており、濾過管１１に所定の圧力で反応生成流体を流すことにより、濾過管１１の細孔１５から油分のみを排出して分離するものである。撥水性を有する多孔質膜の素材としては、ＰＴＦＥ（polytetrafluoroethylene）、ＰＣＴＦＥ（polychlorotrifluoroethylene）等が好適に用いられ、平均孔径は、１μｍ以下、好ましくは0.1〜0.5μｍ、さらに好ましくは0.1〜0.2μｍである。PTFEとしては、ゴアテックス（商品名：ジャパンゴアテックス株式会社製）が好適である。多孔質膜を形成する方法は、焼結による方法、ハニカム構造を形成する方法、あるいはその他の濾過膜を製造する各種の方法を適宜に採用することができる。
【００２７】
なお、図示するように、圧力計１２と圧力制御弁１３を設け、制御部１４によって検出された差圧が所定値となるように圧力制御弁１３を操作するようにしてもよい。圧力計１２は、濾過管１１の入口と出口に設置され、片側又は両方の圧力信号を監視しながら圧力制御弁１３を調整するようになっている。
【００２８】
このような構成の油水分離器６において、油性成分と水性成分が分離される過程を、図３を参照して説明する。同図（ａ）は濾過管１１の断面を細孔１５を誇張して描いたもので、油性成分と水性成分がエマルジョン状態にある流体が流入すると、撥水性素材からなる内壁の表面に油が付着する。孔径が小さい場合は細孔１５内が油で満たされた状態となる（同図（ｂ））。圧力制御弁１３により徐々に濾過管１１内の圧力を上げていくと、孔１５から油が外部に出てきて筒状容器１０に溜まる。さらに圧力を上げると細孔１５の中心から水が押し出され（同図（ｃ））、水と油の混合体が新たなエマルジョンを形成する。水と油を分離するには油分が細孔内を移動して且つ油分のみが細孔から押し出される最適な圧力を確保する必要がある。濾過管１１を通過した水性成分（未反応のアミノ酸誘導体、水溶性縮合剤、副生物である水溶性の尿素誘導体等）は排出容器１６に排出され、油性成分中の縮合ジペプチドは気液混合器８に導入される。
【００２９】
なお、濾過効率は、濾過管１１の管径、細孔径、流体に負荷される圧力、濾過管１１内を通過する時間（管長）等に影響される。圧力は、装置の耐圧性向上のためのコスト上昇を抑えるために、１ｍ水柱圧以下が好ましいので、この範囲内で良い濾過率を得ることができるように、他の条件を揃えるようにする。比較的低圧で良い分離特性を得るには、管長を長くするのが好ましいが、図４のように、濾過管１１を螺旋状にすることで、コンパクトな形状を維持することができる。もちろん、濾過管１１の配置は適宜であり、また、濾過水／濾過油を収容する外側の容器１０の形状も適宜である。
【００３０】
また、濾過管１１の素材として、親水性材料を使えば、壁面から外に出るのは水分であり、そのまま通過して出てくるのは油分となる。親水性材料としては、SiC、アルミナなどのセラミックやポリエチレン、ポリプロピレンなどが挙げられる。いずれを用いるかは、分離する対象の流体の油性成分と水性成分の混合比率等を考慮して決めればよい。
【００３１】
気液反応器７は、前段で生成されたペプチドのアミノ基側末端の保護基（カルボベンゾキシ基、ベンジル基等）の接触水素化による脱保護反応を行う。例えば、図５（ａ）はオキシフェニールアラニンに水素が作用して保護基（カルボベンゾキシ基）が外れる反応であり、図５（ｂ）はベンゾイルフェニールアラニンに水素が作用して保護基（ベンジル基）が外れる反応である。このようにして、脱Ｃ保護反応を行って次のペプチド結合反応に備えるようになっている。
【００３２】
気液反応器７は、この実施の形態では、気液混合器８と触媒反応器９が直列に配置されて構成されている。気液混合器８は、図６（ａ）に示すように、筒状の容器（外管）１７の内部に多孔質膜から構成された送気管（内管）１８が配置された二重管構造となっており、送気管１８の内側には反応ガス（水素ガス）が、外側には前段で生成した油性の液体が流れるようになっている。外管１７の外周には、加熱又は冷却用の熱媒体を流すジャケット１９が形成されている。内管１８を構成する多孔質膜の孔の径は、気体は通し、液体は通さないような値に設定され、０.５μm以下、好ましくは０.１〜０.２μｍで、材料はPTFEが好ましい。気体は孔内を通過する際に微細化され、外側を流れる液体中に拡散する。これにより、水素は液中に一時的に許容溶解度を超えて存在することになり、反応に対する効率が上昇する。反応が終えた液は出口から排出される。
【００３３】
触媒反応器９は、図６（ｂ）に示すように、多孔質シリカ、アルミナ、SiC等からなる微粒子２０の表面にPd等の触媒を担持させたものを筒状容器２１に充填したもので、筒状容器２１の両端に入口と出口が設けられている。筒状容器２１には、加熱冷却媒体を流通させる配管２２が設けられている。筒状容器２１内に水素と流体を通過させることにより、Pd等の触媒効果により水素による還元反応が促進される。触媒反応は固液界面の相互作用で行われる反応であるため、触媒の表面積比率が高いほど好ましいが、一方、粒子径が小さすぎると流れの圧力損失が大きくなる。従って、粒子径は、１μm以下で０.１μm以上が好ましい。粒度が揃っていれば、より小さい粒径を選定できる。また、多孔質粒子を用いることで、表面積比率は格段に向上する。たとえば平均粒径０.４μmの多孔質シリカは１ｇあたりの表面積が１m２にも達する。
【００３４】
触媒はPd， Pt， Cu， Zr， Nb， Co， Ni等から選ばれるが、水素吸蔵量の高いPdが最も好ましい。図６（ｃ）に示すように、Pdを孔内に均一に成膜するには、スパッタリング等のドライプロセスより、ウェット処理が好ましい。Pdの場合は、塩化パラジウムによる無電解めっきか、Pd錯塩を使った還元吸着が好ましい。真空蒸着では孔内への均一な膜は得られなかった。
【００３５】
このような連続式の気液反応器７では、バッチ方式に比較して反応器が小型であること、連続流であるため常に反応器全域で液が充満していること、メンテナンス時は反応器ごと交換すればよいことなどにより、爆発の危険性が激減するという利点が得られる。
【００３６】
次に、上記のように構成された合成ユニット１を用いて、（ｎ＋１）個のアミノ残基を有するペプチド（＝（ｎ＋１）ペプチド）を合成する装置について説明する。
図７は、合成ユニット１を１台だけ用いてペプチド合成を行うもので、１回目の反応で所定量のジペプチド（＝（２）ペプチド）を製造した後、それを原料として同じ合成ユニット１で２回目の反応を行ってトリ（３）ペプチドを製造し、以下、順次ｎ回目までの反応を行って、最終的に（ｎ＋１）個のアミノ残基を有する（ｎ＋１）ペプチドを合成する。
【００３７】
以上のように構成された連続ペプチド合成装置によるペプチド合成の工程を説明する。第１の予備混合容器３−１には、事前にＮ末端が活性化されたアミノ酸、例えば、アミノ酸−ｔ−ブチルエステルの有機系溶媒液が準備されている。1回目の合成では、その予備混合容器３−１にＮ保護アミノ酸、例えば、カルボベンゾキシルアミノ酸（１）が導入され、適当な手段、例えば、容器に設置した撹拌翼で混合される。このアミノ酸−ｔ−ブチルエステルとカルボベンゾキシルアミノ酸（１）を含む有機系溶媒液はポンプＰで圧送され、マイクロリアクタ５の片側の入口に導入される。水溶性縮合剤であるカルボジイミド水溶液はポンプＰで圧送され、マイクロリアクタ５のもう一つの入口から導入される。
【００３８】
マイクロリアクタ５の中で２液は１：１の当量で混合され、選択性が高く収率が高い脱水縮合反応が行われ、２個のアミノ酸残基を有するジペプチドが生成される。マイクロリアクタ５からの流出液は、生成したペプチドを含む有機溶媒と、未反応のアミノ酸誘導体、カルボジイミド試薬および副生物の水溶性ウレアが含まれる二相混合液である。
【００３９】
この二相混合液は、連続式油水分離器６に導入され、有機相（油性成分）と水性成分とに分離される。分離された水性成分は排出容器１６に排出されて系外に出され、有機相中のジペプチドはさらに気液混合器８に導入されて、水素が導入される。水素を溶解したジペプチド溶液は、触媒反応器９に導入され、Pd触媒の効果により接触水素化反応が行われる。これにより、カルボベンゾキシル基が除去され、ジペプチド−ｔ−ブチルエステルが生成される。これは、有機系溶媒と一緒に、予備混合容器３−２に溜められる。ここまでが１回目のペプチド合成反応となる。
【００４０】
２回目の合成反応では、予備混合容器３−２に溜められたジペプチド−ｔ−ブチルエステルに、カルボベンゾキシルアミノ酸（２）が導入され、混合される。この混合液はポンプＰにより、マイクロリアクタ５の片側の入口に導入され、１回目と同じように水溶性カルボジイミド水溶液と混合反応し、1回目と同じ工程を経て、トリ（３）ペプチド−ｔ−ブチルエステルが生成される。生成された溶液は、既に空になり、洗浄した予備混合容器３−１に溜められる。予備混合容器３−１、３−２は繰り返される合成ごとに交替して使用されるが、勿論３個以上の予備混合容器を使うようにしてもよい。同様の反応操作をｎ回繰り返した後で、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）によりｔ−ブチルエステルを除去することで、（ｎ＋１）ペプチドが得られる。
【００４１】
この実施の形態の連続合成装置により、ペプチドの液相合成をマイクロリアクタ５を用いて連続的に実行することが可能になった。またカルボベンゾキシルアミノ酸の量がマイクロリアクタ５を用いて等当量で済むこと、および任意の段階で必要に応じてカラムクロマト精製が可能であることから、ペプチド固相合成法、従来の液相合成法と比較して、純度の高い目的のペプチドがより容易にかつ経済的に得られる。
また、マイクロリアクタ５から触媒反応器９までの工程を連続流方式にしたことで、滞留個所が無く、反応に掛かる滞留時間、分離や混合に掛かる時間を全て均一に制御できるため、高品質なペプチドを製造することが可能になった。
【００４２】
図８は、この発明の合成ユニット１を用いたペプチド合成装置の他の実施の形態を示すものである。先の実施の形態では、１台の合成ユニット１を用いたので、装置コストは安いが、多量の製品を製造するには多くの時間を要する。そこで、この実施の形態では、複数の合成ユニット１を配置して、各合成ユニット１で並行的に反応を行わせるようにして、多量に生産する場合の効率化を図るようにした。各合成ユニット１には、それぞれ少なくとも２つの予備混合容器が設置され、これには前段の合成ユニット１で製造され、脱Ｃ保護された（ｋ）ペプチド−ｔ−エステルと、Ｎ保護アミノ酸（ｋ）が配管および弁を介して供給されるようになっている。
【００４３】
なお、予備混合容器を少なくとも２つ設置したのは、（ｋ）ペプチド−ｔ−エステルとＮ保護アミノ酸（ｋ）の混合をバッチ的に行うからである。すなわち、前段で製造されたペプチド溶液が或る量に達したところで、その予備混合容器への流入を止め、それに当量のＮ保護アミノ酸（ｋ）を供給し、混合して次の合成ユニット１の原料として用いる。その間、前段から流出するペプチド溶液は他の予備混合容器に受け、第１の予備混合容器の原料が無くなる時に、第２の予備混合容器にＮ保護アミノ酸（ｋ）を供給して原料として用いる。この切換時の原料使用を連続的に行うために、第３の予備混合容器を配置するようにしてもよい。
【００４４】
図９は、この発明の合成ユニット１を用いたペプチド合成装置のさらに他の実施の形態を示すものである。ここでは、予備混合をマイクロリアクタ５によって行っている。すなわち、マイクロリアクタ５は、３つの原料が合流可能なタイプとし、（ｋ）ペプチド−ｔ−エステルとＮ保護アミノ酸（ｋ）をまず混合させ、さらにこれに縮合剤を混合させるようにしている。このように、（ｋ）ペプチド−ｔ−エステルとＮ保護アミノ酸（ｋ）の混合を連続的に行うことで、全体のプロセスと装置をより単純化することができる。なお、各反応段階での生産速度に差がある場合、ポンプの供給速度等で調整するか、あるいは予め生産速度に見合う装置構成とする。
【００４５】
図９の連続合成装置において、合成ユニット１を反応の数（ｎ）だけ設置すれば、はじめから終わりまで連続的に製造することができる。一方、定常的に又は多量に製造するのでない場合には、適宜に段数を設置して、これを繰り返して用いるようにしてもよい。例えば、合成ユニット１を３段設置すれば、１〜３段の反応をまず行い、１段目の反応が終了したところで、その合成ユニット１を４段目に用いるようにすればよい。段数を増やせば、その分時間当たりの生産量は増えるが、装置コストは上昇する。目標とする生産効率に応じた装置構成とすればよい。
【００４６】
図１０は、予備加熱と混合を行うためのマイクロリアクタ４０を示すもので、３枚の薄板状の基材である上板４４ａ、中板４４ｂ、下板４４ｃが接合されて全厚さ５mmの混合基板４０が形成されている。流路を形成する溝はいずれも中板４４ｂに形成されており、図において、実線は中板４４ｂの上面に形成された溝、鎖線は中板４４ｂの下面に形成された溝を示している。すなわち、上板４４ａを貫通して形成された２つの流入ポート４７は、中板４４ｂの上面に形成されたそれぞれ２つの予備加熱流路４８に連通する。これらの予備加熱流路４８はそれぞれ途中で分岐しかつそれぞれ拡大し、再度合流して出口流路５０，５１に通じ、さらに混合部５２に通じている。一方の出口流路５０は、中板４４ｂの上面に、他方の出口流路５１は中板４４ｂの下面に形成されている。
【００４７】
混合部５２は、図１１に拡大して示すように、中板４４ｂの上下面にそれぞれ出口流路５０，５１と通じる円弧状の溝として形成されたヘッダ部５４，５５と、このヘッダ部５４，５５の各点から円弧の中心に向かって延びる複数の分液流路５６，５７と、これらの表裏の径方向流路が合流するように形成された合流空間５８とを有している。分液流路５６，５７と合流空間５８は中板４４ｂの上面に形成され、分液流路５６，５７はそれぞれのヘッダ部５４，５５に通じるものが交互に配置されている。下面側のヘッダ部５５に通じる分液流路５７は、中板４４ｂを貫通する連絡孔５７ａにより連通している。合流空間５８は、他端の出口側に向けて徐々に幅が小さくなるように形成され、他端側の中板４４ｂおよび下板４４ｃを貫通して形成された流出ポート６０に開口している。
【００４８】
図示の例では、合流空間５８の入口側の開口面５９においてＡ液の分液流路５６が５本、Ｂ液の分液流路５７が４本、交互に配置されている。流出したＡ液とＢ液は交互の層状で縞状の流れのまま徐々に流路幅が縮小し、この場合は４０μmに達し、強制的に両液が混合されるようになる。幅はその後徐々に大きくなっており、定常流速が得られるようになっている。このような構成によって、拡散混合性能を向上させたマイクロリアクタ４０を用いることにより、図１の単純形状のマイクロリアクタの場合よりも多くの反応処理を行うことができ、生産効率を向上させることができる。
【００４９】
図１２は、混合反応手段の他の実施の形態を示すもので、微細流路を持つマイクロリアクタ５の代わりに、多孔質膜７０を用いた油水混合器７１を使うものである。すなわち、この油水混合器７１は、筒状の容器７２の内部に多孔質膜７０ら構成された内管７３が配置されて構成されている。内管７３は一端側に流入口があり、流出口は設けられていない。この場合の細孔の孔径は１μｍ以下で、膜材はPTFE、SiC、シリカ等から選ばれる。このような装置において、内側の流体（この例では水溶成分）に多孔質膜７０を通過させるに充分な圧力を掛けることにより、内側流体を微細化して外側流体中に分散させたエマルジョンが形成される。両者の混合比率は、外側空間の寸法や流体の流通速度、多孔質膜７０の細孔の径や孔密度、あるいは内側流体の圧力等によって調整される。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】この発明の連続合成装置の要部である合成ユニットを示す図である。
【図２】油水分離装置を示す図である。
【図３】油水分離装置による分離作用の原理を示す図である。
【図４】油水分離装置の他の実施の形態を示す図である。
【図５】（ａ）および（ｂ）はそれぞれ脱保護反応の例を示す図である。
【図６】（ａ）は気液混合装置を、（ｂ）は触媒反応器を、（ｃ）触媒を付加した微粒子を示す図である。
【図７】この発明の連続合成装置の１つの実施の形態を示す図である。
【図８】この発明の連続合成装置の他の実施の形態を示す図である。
【図９】この発明の連続合成装置のさらに他の実施の形態を示す図である。
【図１０】マイクロリアクタの他の実施の形態の構成を示す（ａ）平面図、（ｂ）断面図である。
【図１１】図１０のマイクロリアクタの混合部を拡大して示す図である。
【図１２】混合反応装置の他の実施の形態を示す図である。
【符号の説明】
【００５１】
１ 合成ユニット
２ 原料液容器
３ 予備混合容器（予備混合手段）
４ 縮合剤容器
５ マイクロリアクタ（混合反応手段）
６ 油水分離器（油水分離手段）
７ 気液反応器（気体触媒反応手段）
８ 気液混合器
９ 触媒反応器
１１ 濾過管
１５ 細孔
１７ 外管
１８ 送気管
２０ 微粒子
２１ 筒状容器
４０ マイクロリアクタ
７０ 多孔質膜
７１ 油水混合器
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、水溶性縮合剤と有機溶媒に溶解した原料を用いるペプチドの合成を、連続流方式を用いて微細空間で行うための連続合成装置および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬品等の重要な原料であるペプチドは、分子設計された順序で、素材となるアミノ酸を順次ペプチド結合することによって合成される。必要なペプチド結合をさせるために、通常、結合すべきでない官能基（アミノ基又はカルボキシル基）を不活性化し、結合させる官能基の対を活性化する処理を行う。従来行われているペプチドの化学合成は、リンカーを付加させたスチレン樹脂粒子（担体）に、ベースとなるアミノ酸のカルボキシル基側末端（Ｃ末端）のアミノ酸を結合させ、他端のアミノ基側末端（Ｎ末端）に順次各構成アミノ酸を１個づつ付加して、最終的に所定数のアミノ酸残基を有するペプチドを合成する固相法が一般的である。
【０００３】
このような固相法では、反応部位が担体のごく一部であるので反応効率が低い上、反応中間体を精製することができないため、各反応を定量的に進行させねばならず、各試薬を常に過剰に使用する必要が有る。過剰に使用した試薬は大量の溶媒で洗って除去しなければならない。このようにして、どのようなペプチドも同じ操作の繰り返しにより合成することは可能ではあるが、担体粒子の寸法、形状など細部の性質が少しづつ異なるため、毎回再現性ある合成が得られないという問題があった。
【０００４】
一方、液相でペプチド合成が行われる場合においても、バッチ処理反応容器内において混合が機械的な攪拌で行われる。このため、釜内部に濃度の不均一が生じ、反応液どうしの濃度のバランスが一様でない状態で反応が進行し、その結果、不要な副反応が生じたりして不純物を多く生産し、収率を落とす結果をもたらしている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、前記事情に鑑みて為されたもので、微細な流路において、成分の濃度を一定にした状態で反応を進行させて効率よく連続ペプチド合成を行うことができる連続合成装置および方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記目的を達成するために、請求項１に記載の連続合成装置は、水溶性縮合剤と、Ｎ保護アミノ酸およびＣ保護ペプチドの混合液とを連続流れで混合し反応させる混合反応手段と、合成後の液中から未反応の水相成分を分離し除去する油水分離手段と、水相成分が除去された有機相成分液中に水素ガスを混合させ、触媒を介して生成したペプチドの脱保護反応を行う気体触媒反応手段とを有することを特徴とする。
【０００７】
請求項１に記載の発明においては、混合反応手段において、水溶性縮合剤と、Ｎ保護アミノ酸とＣ保護ペプチドの有機溶媒混合液とが連続流れで混合・反応し、油水分離手段により、合成後の液中から未反応の水相成分が分離・除去され、気体触媒反応手段において、有機相成分液中に水素ガスを混合させ、触媒を介して生成ペプチドの脱保護反応が行われる。これによりペプチドへのアミノ酸残基の付加と、その前後の処理が連続流れによる処理プロセスによって達成され、成分の濃度を一定にした状態で反応を進行させて効率よく連続ペプチド合成を行うことができる。バッチ式ではなく、連続流方式であるため液のリアクタ内の滞在時間は流量さえ維持すれば常に均一になるため、滞留による生成物の変質を防ぐことも出来る。
【０００８】
請求項２に記載の連続合成装置は、請求項１に記載の発明において、さらに、脱保護した前記生成ペプチド溶液とＣ保護ペプチドとを予備混合し、混合液として混合反応手段に供給する予備混合手段を有することを特徴とする。
請求項２に記載の発明においては、予備混合手段において、脱保護した前記生成ペプチド溶液とＣ保護ペプチドとが予備混合され、混合液として混合反応手段に供給される。これにより、生成したペプチドを順次原料として使用して、必要なアミノ酸残基を有するペプチドを連続的に合成することができる。
【０００９】
請求項３に記載の連続合成装置は、請求項２に記載の発明において、前記予備混合した混合液と水溶性縮合剤を前記混合反応手段に導く流路手段を有することを特徴とする。
請求項３に記載の発明においては、流路手段によって、予備混合した混合液と水溶性縮合剤が同じ混合反応手段に導かれ、低装置コストにより、順次ペプチド合成が進行する。
【００１０】
請求項４に記載の連続合成装置は、請求項２に記載の発明において、ｎ回のペプチド合成を連続に行うため、水溶性縮合剤を溜める縮合剤貯槽と、生成したＣ保護ペプチド/有機溶媒をＮ保護アミノ酸と混合させるｎ個の予備混合手段とを備え、前記予備混合手段は前記気体触媒反応手段の出口と流体移送管路で接続されていることを特徴とする。
請求項４に記載の発明においては、予備混合手段を気体触媒反応手段の出口と流体移送管路で接続することにより、脱保護されたペプチドが直接に次の原料としてＮ保護アミノ酸と予備混合されるので、余分の過程を経ることがなく、変質を防止することができる。
【００１１】
請求項５に記載の連続合成装置は、請求項２に記載の発明において、さらに、前記予備混合した混合液と水溶性縮合剤を連続流れで混合し反応させてこれらをペプチド結合させる第２次混合反応手段と、合成後の液中から未反応の水相成分を分離し除去する第２次油水分離手段と、水相成分が除去された有機相成分液中に水素ガスを混合させ、触媒を介して生成したペプチドの脱保護反応を行う第２次気体触媒反応手段とを有することを特徴とする。
請求項５に記載の発明においては、第２次混合反応手段、第２次油水分離手段と、第２次気体触媒反応手段という、先の装置と異なる装置により第２段の反応を進行させるので、処理が並行的に実行され、生産効率が向上する。
【００１２】
請求項６に記載の連続合成装置は、連続流路中において複数液を混合して有機合成を行う液体混合反応手段と、該液体混合反応手段から流出する生成液を油性成分と水性成分とに分離する油水分離手段と、分離された油性成分液に気体を混合させる気液混合手段と、成分液の流路に触媒を付与した気体触媒反応手段とを具備したことを特徴とする。
【００１３】
請求項７に記載の連続合成装置は、請求項１ないし請求項６のいずれかに記載の発明において、前記油水分離手段の一部が孔径が１μm以下の多孔質膜で構成されていることを特徴とする。
【００１４】
請求項８に記載の連続合成装置は、請求項１ないし請求項７のいずれかに記載の発明において、前記気液混合手段の一部が孔径が１μm以下の多孔質膜で構成されていることを特徴とする。
【００１５】
請求項９に記載の連続合成装置は、請求項１ないし請求項８のいずれかに記載の発明において、気体触媒反応手段が、表面にPd触媒を担持した粒径１mm以下の微粒子を充填した流路からなることを特徴とする。
【００１６】
請求項１０に記載の連続合成装置は、請求項１ないし請求項９のいずれかに記載の発明において、前記混合反応手段は、５００μm以下の流路幅を含む混合流路を有するマイクロリアクタであることを特徴とする。
請求項１０に記載の発明においては、５００μm以下の流路幅を含むマイクロリアクタ内において、２液の混合が、混合比率を厳密に制御した状態で、層流領域の分子拡散下で行われるため、２液の濃度のアンバランスを最小限に抑えることができる。さらに流路が微小であることで、反応温度を均一にでき、かつ吸熱応答性にも優れるため、選択性の高い反応が可能になる。
【００１７】
請求項１１に記載の連続合成装置は、請求項１ないし請求項９のいずれかに記載の発明において、前記混合反応手段は、孔径が１μm以下の多孔質膜を有する液体分散手段であることを特徴とする。
【００１８】
請求項１２に記載の連続合成方法は、水溶性縮合剤と、Ｎ保護アミノ酸とＣ保護ペプチド/有機溶媒の混合液を連続流れで混合し反応させてこれらをペプチド結合させる混合反応工程と、合成後の液中から未反応の水相成分を分離し除去する油水分離工程と、水相成分が除去された有機相成分液中に水素ガスを混合させ、触媒を介して生成したペプチドの脱保護反応を行う気体触媒反応工程とを有することを特徴とする。
【００１９】
請求項１３に記載の連続合成方法は、請求項１２に記載の発明において、さらに、脱保護した前記生成ペプチドにＮ保護アミノ酸を混合し、これと水溶性縮合剤の混合液を連続流れで混合し反応させてこれらをペプチド結合させる第２次混合反応工程と、合成後の液中から未反応の水相成分を分離し除去する第２次油水分離工程と、水相成分が除去された有機相成分液中に水素ガスを混合させ、触媒を介して生成したペプチドの脱保護反応を行う第２次気体触媒反応工程とを、所定回数繰り返すことによって所定数のアミノ酸残基を有するペプチドを合成することを特徴とする。
【発明の効果】
【００２０】
請求項１ないし請求項１３に記載の発明によれば、ペプチドへのアミノ酸残基の付加と、その前後の処理が連続流れによる処理プロセスによって達成され、成分の濃度を一定にした状態で反応を進行させて効率よく連続ペプチド合成を行うことができる。バッチ式ではなく、連続流方式であるため液のリアクタ内の滞在時間は流量さえ維持すれば常に均一になるため、滞留による生成物の変質を防ぐことも出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
図１は、この発明の連続流式ペプチド合成装置の１つの実施の形態を示すもので、アミノ酸付加ステップを行うための合成ユニット１を主体として構成されている。この合成ユニット１は、原料であるＮ保護アミノ酸を有機溶媒に溶解させた混合液を収容するｎ個の原料液容器２（２−１，２−２，・・，２−ｎ）と、同じく原料であるＣ保護ペプチドとＮ保護アミノ酸を予備混合して保持する予備混合容器（予備混合手段）３−１，３−２と、縮合剤を収容する縮合剤容器４と、これらを導入して混合・反応させる流路を有するマイクロリアクタ５と、マイクロリアクタ５の下流側に設置した油水分離器６と、分離された流体に水素ガスを混合させ、触媒によって水素化反応を行わせる気液反応器７とを備えて構成されている。気液反応器７は、気液混合器８と触媒反応器９から構成されている。
原料液容器２と触媒反応器９の出口は、それぞれ予備混合容器３−１，３−２に、開閉弁ＶおよびポンプＰを有する管路を介して接続されている。
【００２２】
Ｎ保護アミノ酸は、アミノ基に保護基を結合させて不活性化したアミノ酸であり、Ｃ保護ペプチドはカルボキシル基に保護基を結合させて不活性化した（ｋ）ペプチドである。なお、ここで（ｋ）ペプチドとは、ｋ番目の処理において用いるアミノ酸残基ｋ個を有するペプチドを言う。つまり、ｋ回目の反応では、
（ｋ）ペプチド＋アミノ酸→（ｋ＋１）ペプチド
の反応が起き、生成されたペプチドが次回の反応の原料となる。
【００２３】
Ｎ保護アミノ酸としては、例えば、カルボベンゾキシルアミノ酸（ｋ）、Ｃ保護ペプチドとしては、例えば（ｋ）ペプチド−ｔ−ブチルエステルが挙げられる。これらも、ｋ番目の反応に用いるアミノ酸あるいはペプチドを意味している（ｋ＝１〜ｎ）。
【００２４】
縮合剤は、Ｎ保護アミノ酸とＣ保護ペプチドのカルボキシル基とアミノ基を脱水縮合してペプチド結合させるもので、反応に応じて適宜のものを使用するが、本発明では、後段で反応生成物から分離を容易にするために、有機溶媒への溶解性とともに水溶性を有する縮合剤が好ましい。特に、副生する尿素誘導体が水溶性であるような、1−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）やジイソプロビルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤＩ）が好ましい。
【００２５】
マイクロリアクタ（混合反応手段）５は、流路幅（流れ方向と直角方向の分子の拡散移動距離）が５００μm以下の微細流路を合流させる混合流路を含む基板ユニットとして構成されており、流路寸法や形状は、実行する反応に合わせて設計される。この例では、単純なＹ字流路を用いているが、後述するような複数流路を交互に合流させる形式のものでもよい。一方の導入流路には予備混合容器（予備混合手段）３−１，３−２が、他方の流路には縮合剤容器４が、それぞれポンプＰを有する管路を介して接続されている。マイクロリアクタ５には、反応に応じて、加熱・保温手段を設けるとともに、圧力計、分析手段等を設置し、反応をモニターすることが好ましい。
【００２６】
油水分離器６は、図２に示すように、この例では筒状の容器１０の内部に撥水性を有する多孔質膜から構成された濾過管１１が配置された二重管構造となっており、濾過管１１に所定の圧力で反応生成流体を流すことにより、濾過管１１の細孔１５から油分のみを排出して分離するものである。撥水性を有する多孔質膜の素材としては、ＰＴＦＥ（polytetrafluoroethylene）、ＰＣＴＦＥ（polychlorotrifluoroethylene）等が好適に用いられ、平均孔径は、１μｍ以下、好ましくは0.1〜0.5μｍ、さらに好ましくは0.1〜0.2μｍである。PTFEとしては、ゴアテックス（商品名：ジャパンゴアテックス株式会社製）が好適である。多孔質膜を形成する方法は、焼結による方法、ハニカム構造を形成する方法、あるいはその他の濾過膜を製造する各種の方法を適宜に採用することができる。
【００２７】
なお、図示するように、圧力計１２と圧力制御弁１３を設け、制御部１４によって検出された差圧が所定値となるように圧力制御弁１３を操作するようにしてもよい。圧力計１２は、濾過管１１の入口と出口に設置され、片側又は両方の圧力信号を監視しながら圧力制御弁１３を調整するようになっている。
【００２８】
このような構成の油水分離器６において、油性成分と水性成分が分離される過程を、図３を参照して説明する。同図（ａ）は濾過管１１の断面を細孔１５を誇張して描いたもので、油性成分と水性成分がエマルジョン状態にある流体が流入すると、撥水性素材からなる内壁の表面に油が付着する。孔径が小さい場合は細孔１５内が油で満たされた状態となる（同図（ｂ））。圧力制御弁１３により徐々に濾過管１１内の圧力を上げていくと、孔１５から油が外部に出てきて筒状容器１０に溜まる。さらに圧力を上げると細孔１５の中心から水が押し出され（同図（ｃ））、水と油の混合体が新たなエマルジョンを形成する。水と油を分離するには油分が細孔内を移動して且つ油分のみが細孔から押し出される最適な圧力を確保する必要がある。濾過管１１を通過した水性成分（未反応のアミノ酸誘導体、水溶性縮合剤、副生物である水溶性の尿素誘導体等）は排出容器１６に排出され、油性成分中の縮合ジペプチドは気液混合器８に導入される。
【００２９】
なお、濾過効率は、濾過管１１の管径、細孔径、流体に負荷される圧力、濾過管１１内を通過する時間（管長）等に影響される。圧力は、装置の耐圧性向上のためのコスト上昇を抑えるために、１ｍ水柱圧以下が好ましいので、この範囲内で良い濾過率を得ることができるように、他の条件を揃えるようにする。比較的低圧で良い分離特性を得るには、管長を長くするのが好ましいが、図４のように、濾過管１１を螺旋状にすることで、コンパクトな形状を維持することができる。もちろん、濾過管１１の配置は適宜であり、また、濾過水／濾過油を収容する外側の容器１０の形状も適宜である。
【００３０】
また、濾過管１１の素材として、親水性材料を使えば、壁面から外に出るのは水分であり、そのまま通過して出てくるのは油分となる。親水性材料としては、SiC、アルミナなどのセラミックやポリエチレン、ポリプロピレンなどが挙げられる。いずれを用いるかは、分離する対象の流体の油性成分と水性成分の混合比率等を考慮して決めればよい。
【００３１】
気液反応器７は、前段で生成されたペプチドのアミノ基側末端の保護基（カルボベンゾキシ基、ベンジル基等）の接触水素化による脱保護反応を行う。例えば、図５（ａ）はオキシフェニールアラニンに水素が作用して保護基（カルボベンゾキシ基）が外れる反応であり、図５（ｂ）はベンゾイルフェニールアラニンに水素が作用して保護基（ベンジル基）が外れる反応である。このようにして、脱Ｃ保護反応を行って次のペプチド結合反応に備えるようになっている。
【００３２】
気液反応器７は、この実施の形態では、気液混合器８と触媒反応器９が直列に配置されて構成されている。気液混合器８は、図６（ａ）に示すように、筒状の容器（外管）１７の内部に多孔質膜から構成された送気管（内管）１８が配置された二重管構造となっており、送気管１８の内側には反応ガス（水素ガス）が、外側には前段で生成した油性の液体が流れるようになっている。外管１７の外周には、加熱又は冷却用の熱媒体を流すジャケット１９が形成されている。内管１８を構成する多孔質膜の孔の径は、気体は通し、液体は通さないような値に設定され、０.５μm以下、好ましくは０.１〜０.２μｍで、材料はPTFEが好ましい。気体は孔内を通過する際に微細化され、外側を流れる液体中に拡散する。これにより、水素は液中に一時的に許容溶解度を超えて存在することになり、反応に対する効率が上昇する。反応が終えた液は出口から排出される。
【００３３】
触媒反応器９は、図６（ｂ）に示すように、多孔質シリカ、アルミナ、SiC等からなる微粒子２０の表面にPd等の触媒を担持させたものを筒状容器２１に充填したもので、筒状容器２１の両端に入口と出口が設けられている。筒状容器２１には、加熱冷却媒体を流通させる配管２２が設けられている。筒状容器２１内に水素と流体を通過させることにより、Pd等の触媒効果により水素による還元反応が促進される。触媒反応は固液界面の相互作用で行われる反応であるため、触媒の表面積比率が高いほど好ましいが、一方、粒子径が小さすぎると流れの圧力損失が大きくなる。従って、粒子径は、１μm以下で０.１μm以上が好ましい。粒度が揃っていれば、より小さい粒径を選定できる。また、多孔質粒子を用いることで、表面積比率は格段に向上する。たとえば平均粒径０.４μmの多孔質シリカは１ｇあたりの表面積が１m２にも達する。
【００３４】
触媒はPd， Pt， Cu， Zr， Nb， Co， Ni等から選ばれるが、水素吸蔵量の高いPdが最も好ましい。図６（ｃ）に示すように、Pdを孔内に均一に成膜するには、スパッタリング等のドライプロセスより、ウェット処理が好ましい。Pdの場合は、塩化パラジウムによる無電解めっきか、Pd錯塩を使った還元吸着が好ましい。真空蒸着では孔内への均一な膜は得られなかった。
【００３５】
このような連続式の気液反応器７では、バッチ方式に比較して反応器が小型であること、連続流であるため常に反応器全域で液が充満していること、メンテナンス時は反応器ごと交換すればよいことなどにより、爆発の危険性が激減するという利点が得られる。
【００３６】
次に、上記のように構成された合成ユニット１を用いて、（ｎ＋１）個のアミノ残基を有するペプチド（＝（ｎ＋１）ペプチド）を合成する装置について説明する。
図７は、合成ユニット１を１台だけ用いてペプチド合成を行うもので、１回目の反応で所定量のジペプチド（＝（２）ペプチド）を製造した後、それを原料として同じ合成ユニット１で２回目の反応を行ってトリ（３）ペプチドを製造し、以下、順次ｎ回目までの反応を行って、最終的に（ｎ＋１）個のアミノ残基を有する（ｎ＋１）ペプチドを合成する。
【００３７】
以上のように構成された連続ペプチド合成装置によるペプチド合成の工程を説明する。第１の予備混合容器３−１には、事前にＮ末端が活性化されたアミノ酸、例えば、アミノ酸−ｔ−ブチルエステルの有機系溶媒液が準備されている。1回目の合成では、その予備混合容器３−１にＮ保護アミノ酸、例えば、カルボベンゾキシルアミノ酸（１）が導入され、適当な手段、例えば、容器に設置した撹拌翼で混合される。このアミノ酸−ｔ−ブチルエステルとカルボベンゾキシルアミノ酸（１）を含む有機系溶媒液はポンプＰで圧送され、マイクロリアクタ５の片側の入口に導入される。水溶性縮合剤であるカルボジイミド水溶液はポンプＰで圧送され、マイクロリアクタ５のもう一つの入口から導入される。
【００３８】
マイクロリアクタ５の中で２液は１：１の当量で混合され、選択性が高く収率が高い脱水縮合反応が行われ、２個のアミノ酸残基を有するジペプチドが生成される。マイクロリアクタ５からの流出液は、生成したペプチドを含む有機溶媒と、未反応のアミノ酸誘導体、カルボジイミド試薬および副生物の水溶性ウレアが含まれる二相混合液である。
【００３９】
この二相混合液は、連続式油水分離器６に導入され、有機相（油性成分）と水性成分とに分離される。分離された水性成分は排出容器１６に排出されて系外に出され、有機相中のジペプチドはさらに気液混合器８に導入されて、水素が導入される。水素を溶解したジペプチド溶液は、触媒反応器９に導入され、Pd触媒の効果により接触水素化反応が行われる。これにより、カルボベンゾキシル基が除去され、ジペプチド−ｔ−ブチルエステルが生成される。これは、有機系溶媒と一緒に、予備混合容器３−２に溜められる。ここまでが１回目のペプチド合成反応となる。
【００４０】
２回目の合成反応では、予備混合容器３−２に溜められたジペプチド−ｔ−ブチルエステルに、カルボベンゾキシルアミノ酸（２）が導入され、混合される。この混合液はポンプＰにより、マイクロリアクタ５の片側の入口に導入され、１回目と同じように水溶性カルボジイミド水溶液と混合反応し、1回目と同じ工程を経て、トリ（３）ペプチド−ｔ−ブチルエステルが生成される。生成された溶液は、既に空になり、洗浄した予備混合容器３−１に溜められる。予備混合容器３−１、３−２は繰り返される合成ごとに交替して使用されるが、勿論３個以上の予備混合容器を使うようにしてもよい。同様の反応操作をｎ回繰り返した後で、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）によりｔ−ブチルエステルを除去することで、（ｎ＋１）ペプチドが得られる。
【００４１】
この実施の形態の連続合成装置により、ペプチドの液相合成をマイクロリアクタ５を用いて連続的に実行することが可能になった。またカルボベンゾキシルアミノ酸の量がマイクロリアクタ５を用いて等当量で済むこと、および任意の段階で必要に応じてカラムクロマト精製が可能であることから、ペプチド固相合成法、従来の液相合成法と比較して、純度の高い目的のペプチドがより容易にかつ経済的に得られる。
また、マイクロリアクタ５から触媒反応器９までの工程を連続流方式にしたことで、滞留個所が無く、反応に掛かる滞留時間、分離や混合に掛かる時間を全て均一に制御できるため、高品質なペプチドを製造することが可能になった。
【００４２】
図８は、この発明の合成ユニット１を用いたペプチド合成装置の他の実施の形態を示すものである。先の実施の形態では、１台の合成ユニット１を用いたので、装置コストは安いが、多量の製品を製造するには多くの時間を要する。そこで、この実施の形態では、複数の合成ユニット１を配置して、各合成ユニット１で並行的に反応を行わせるようにして、多量に生産する場合の効率化を図るようにした。各合成ユニット１には、それぞれ少なくとも２つの予備混合容器が設置され、これには前段の合成ユニット１で製造され、脱Ｃ保護された（ｋ）ペプチド−ｔ−エステルと、Ｎ保護アミノ酸（ｋ）が配管および弁を介して供給されるようになっている。
【００４３】
なお、予備混合容器を少なくとも２つ設置したのは、（ｋ）ペプチド−ｔ−エステルとＮ保護アミノ酸（ｋ）の混合をバッチ的に行うからである。すなわち、前段で製造されたペプチド溶液が或る量に達したところで、その予備混合容器への流入を止め、それに当量のＮ保護アミノ酸（ｋ）を供給し、混合して次の合成ユニット１の原料として用いる。その間、前段から流出するペプチド溶液は他の予備混合容器に受け、第１の予備混合容器の原料が無くなる時に、第２の予備混合容器にＮ保護アミノ酸（ｋ）を供給して原料として用いる。この切換時の原料使用を連続的に行うために、第３の予備混合容器を配置するようにしてもよい。
【００４４】
図９は、この発明の合成ユニット１を用いたペプチド合成装置のさらに他の実施の形態を示すものである。ここでは、予備混合をマイクロリアクタ５によって行っている。すなわち、マイクロリアクタ５は、３つの原料が合流可能なタイプとし、（ｋ）ペプチド−ｔ−エステルとＮ保護アミノ酸（ｋ）をまず混合させ、さらにこれに縮合剤を混合させるようにしている。このように、（ｋ）ペプチド−ｔ−エステルとＮ保護アミノ酸（ｋ）の混合を連続的に行うことで、全体のプロセスと装置をより単純化することができる。なお、各反応段階での生産速度に差がある場合、ポンプの供給速度等で調整するか、あるいは予め生産速度に見合う装置構成とする。
【００４５】
図９の連続合成装置において、合成ユニット１を反応の数（ｎ）だけ設置すれば、はじめから終わりまで連続的に製造することができる。一方、定常的に又は多量に製造するのでない場合には、適宜に段数を設置して、これを繰り返して用いるようにしてもよい。例えば、合成ユニット１を３段設置すれば、１〜３段の反応をまず行い、１段目の反応が終了したところで、その合成ユニット１を４段目に用いるようにすればよい。段数を増やせば、その分時間当たりの生産量は増えるが、装置コストは上昇する。目標とする生産効率に応じた装置構成とすればよい。
【００４６】
図１０は、予備加熱と混合を行うためのマイクロリアクタ４０を示すもので、３枚の薄板状の基材である上板４４ａ、中板４４ｂ、下板４４ｃが接合されて全厚さ５mmの混合基板４０が形成されている。流路を形成する溝はいずれも中板４４ｂに形成されており、図において、実線は中板４４ｂの上面に形成された溝、鎖線は中板４４ｂの下面に形成された溝を示している。すなわち、上板４４ａを貫通して形成された２つの流入ポート４７は、中板４４ｂの上面に形成されたそれぞれ２つの予備加熱流路４８に連通する。これらの予備加熱流路４８はそれぞれ途中で分岐しかつそれぞれ拡大し、再度合流して出口流路５０，５１に通じ、さらに混合部５２に通じている。一方の出口流路５０は、中板４４ｂの上面に、他方の出口流路５１は中板４４ｂの下面に形成されている。
【００４７】
混合部５２は、図１１に拡大して示すように、中板４４ｂの上下面にそれぞれ出口流路５０，５１と通じる円弧状の溝として形成されたヘッダ部５４，５５と、このヘッダ部５４，５５の各点から円弧の中心に向かって延びる複数の分液流路５６，５７と、これらの表裏の径方向流路が合流するように形成された合流空間５８とを有している。分液流路５６，５７と合流空間５８は中板４４ｂの上面に形成され、分液流路５６，５７はそれぞれのヘッダ部５４，５５に通じるものが交互に配置されている。下面側のヘッダ部５５に通じる分液流路５７は、中板４４ｂを貫通する連絡孔５７ａにより連通している。合流空間５８は、他端の出口側に向けて徐々に幅が小さくなるように形成され、他端側の中板４４ｂおよび下板４４ｃを貫通して形成された流出ポート６０に開口している。
【００４８】
図示の例では、合流空間５８の入口側の開口面５９においてＡ液の分液流路５６が５本、Ｂ液の分液流路５７が４本、交互に配置されている。流出したＡ液とＢ液は交互の層状で縞状の流れのまま徐々に流路幅が縮小し、この場合は４０μmに達し、強制的に両液が混合されるようになる。幅はその後徐々に大きくなっており、定常流速が得られるようになっている。このような構成によって、拡散混合性能を向上させたマイクロリアクタ４０を用いることにより、図１の単純形状のマイクロリアクタの場合よりも多くの反応処理を行うことができ、生産効率を向上させることができる。
【００４９】
図１２は、混合反応手段の他の実施の形態を示すもので、微細流路を持つマイクロリアクタ５の代わりに、多孔質膜７０を用いた油水混合器７１を使うものである。すなわち、この油水混合器７１は、筒状の容器７２の内部に多孔質膜７０ら構成された内管７３が配置されて構成されている。内管７３は一端側に流入口があり、流出口は設けられていない。この場合の細孔の孔径は１μｍ以下で、膜材はPTFE、SiC、シリカ等から選ばれる。このような装置において、内側の流体（この例では水溶成分）に多孔質膜７０を通過させるに充分な圧力を掛けることにより、内側流体を微細化して外側流体中に分散させたエマルジョンが形成される。両者の混合比率は、外側空間の寸法や流体の流通速度、多孔質膜７０の細孔の径や孔密度、あるいは内側流体の圧力等によって調整される。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】この発明の連続合成装置の要部である合成ユニットを示す図である。
【図２】油水分離装置を示す図である。
【図３】油水分離装置による分離作用の原理を示す図である。
【図４】油水分離装置の他の実施の形態を示す図である。
【図５】（ａ）および（ｂ）はそれぞれ脱保護反応の例を示す図である。
【図６】（ａ）は気液混合装置を、（ｂ）は触媒反応器を、（ｃ）触媒を付加した微粒子を示す図である。
【図７】この発明の連続合成装置の１つの実施の形態を示す図である。
【図８】この発明の連続合成装置の他の実施の形態を示す図である。
【図９】この発明の連続合成装置のさらに他の実施の形態を示す図である。
【図１０】マイクロリアクタの他の実施の形態の構成を示す（ａ）平面図、（ｂ）断面図である。
【図１１】図１０のマイクロリアクタの混合部を拡大して示す図である。
【図１２】混合反応装置の他の実施の形態を示す図である。
【符号の説明】
【００５１】
１ 合成ユニット
２ 原料液容器
３ 予備混合容器（予備混合手段）
４ 縮合剤容器
５ マイクロリアクタ（混合反応手段）
６ 油水分離器（油水分離手段）
７ 気液反応器（気体触媒反応手段）
８ 気液混合器
９ 触媒反応器
１１ 濾過管
１５ 細孔
１７ 外管
１８ 送気管
２０ 微粒子
２１ 筒状容器
４０ マイクロリアクタ
７０ 多孔質膜
７１ 油水混合器
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶性縮合剤と、Ｎ保護アミノ酸およびＣ保護ペプチドの有機溶媒混合液とを連続流れで混合し反応させる混合反応手段と、
合成後の液中から未反応の水相成分を分離し除去する油水分離手段と、
水相成分が除去された有機相成分液中に水素ガスを混合させ、触媒を介して生成したペプチドの脱保護反応を行う気体触媒反応手段とを有することを特徴とする連続合成装置。
【請求項２】
さらに、脱保護した前記生成ペプチド溶液とＣ保護ペプチドとを予備混合し、混合液として混合反応手段に供給する予備混合手段を有することを特徴とする請求項１に記載の連続合成装置。
【請求項３】
前記予備混合した混合液と水溶性縮合剤を前記混合反応手段に導く流路手段を有することを特徴とする請求項２に記載の連続合成装置。
【請求項４】
ｎ回のペプチド合成を連続に行うため、水溶性縮合剤を溜める縮合剤貯槽と、生成したＣ保護ペプチド/有機溶媒をＮ保護アミノ酸と混合させるｎ個の予備混合手段とを備え、前記予備混合手段は前記気体触媒反応手段の出口と流体移送管路で接続されていることを特徴とする請求項２に記載の連続合成装置。
【請求項５】
さらに、前記予備混合した混合液と水溶性縮合剤を連続流れで混合し反応させてこれらをペプチド結合させる第２次混合反応手段と、
合成後の液中から未反応の水相成分を分離し除去する第２次油水分離手段と、
水相成分が除去された有機相成分液中に水素ガスを混合させ、触媒を介して生成したペプチドの脱保護反応を行う第２次気体触媒反応手段とを有することを特徴とする請求項２に記載の連続合成装置。
【請求項６】
連続流路中において複数液を混合して有機合成を行う液体混合反応手段と、
該液体混合反応手段から流出する生成液を油性成分と水性成分とに分離する油水分離手段と、
分離された油性成分液に気体を混合させる気液混合手段と、
成分液の流路に触媒を付与した気体触媒反応手段とを具備したことを特徴とする連続合成装置。
【請求項７】
前記油水分離手段の一部が孔径が１μm以下の多孔質膜で構成されていることを特徴とする請求項１ないし請求項６のいずれかに記載の連続合成装置。
【請求項８】
前記気液混合手段の一部が孔径が１μm以下の多孔質膜で構成されていることを特徴とする請求項１ないし請求項７のいずれかに記載の連続合成装置。
【請求項９】
気体触媒反応手段が、表面にPd触媒を担持した粒径１mm以下の微粒子を充填した流路からなることを特徴とする請求項１ないし請求項８のいずれかに記載の連続合成装置。
【請求項１０】
前記混合反応手段は、５００μm以下の流路幅を含む混合流路を有するマイクロリアクタであることを特徴とする請求項１ないし請求項９のいずれかに記載の連続合成装置。
【請求項１１】
前記混合反応手段は、孔径が１μm以下の多孔質膜を有する液体分散手段であることを特徴とする請求項１ないし請求項９のいずれかに記載の連続合成装置。
【請求項１２】
水溶性縮合剤と、Ｎ保護アミノ酸とＣ保護ペプチド/有機溶媒の混合液を連続流れで混合し反応させてこれらをペプチド結合させる混合反応工程と、
合成後の液中から未反応の水相成分を分離し除去する油水分離工程と、
水相成分が除去された有機相成分液中に水素ガスを混合させ、触媒を介して生成したペプチドの脱保護反応を行う気体触媒反応工程とを有することを特徴とする連続合成方法。
【請求項１３】
さらに、脱保護した前記生成ペプチドにＮ保護アミノ酸を混合し、これと水溶性縮合剤の混合液を連続流れで混合し反応させてこれらをペプチド結合させる第２次混合反応工程と、
合成後の液中から未反応の水相成分を分離し除去する第２次油水分離工程と、
水相成分が除去された有機相成分液中に水素ガスを混合させ、触媒を介して生成したペプチドの脱保護反応を行う第２次気体触媒反応工程とを、
所定回数繰り返すことによって所定数のアミノ酸残基を有するペプチドを合成することを特徴とする請求項１２に記載の連続合成方法。
【請求項１】
水溶性縮合剤と、Ｎ保護アミノ酸およびＣ保護ペプチドの有機溶媒混合液とを連続流れで混合し反応させる混合反応手段と、
合成後の液中から未反応の水相成分を分離し除去する油水分離手段と、
水相成分が除去された有機相成分液中に水素ガスを混合させ、触媒を介して生成したペプチドの脱保護反応を行う気体触媒反応手段とを有することを特徴とする連続合成装置。
【請求項２】
さらに、脱保護した前記生成ペプチド溶液とＣ保護ペプチドとを予備混合し、混合液として混合反応手段に供給する予備混合手段を有することを特徴とする請求項１に記載の連続合成装置。
【請求項３】
前記予備混合した混合液と水溶性縮合剤を前記混合反応手段に導く流路手段を有することを特徴とする請求項２に記載の連続合成装置。
【請求項４】
ｎ回のペプチド合成を連続に行うため、水溶性縮合剤を溜める縮合剤貯槽と、生成したＣ保護ペプチド/有機溶媒をＮ保護アミノ酸と混合させるｎ個の予備混合手段とを備え、前記予備混合手段は前記気体触媒反応手段の出口と流体移送管路で接続されていることを特徴とする請求項２に記載の連続合成装置。
【請求項５】
さらに、前記予備混合した混合液と水溶性縮合剤を連続流れで混合し反応させてこれらをペプチド結合させる第２次混合反応手段と、
合成後の液中から未反応の水相成分を分離し除去する第２次油水分離手段と、
水相成分が除去された有機相成分液中に水素ガスを混合させ、触媒を介して生成したペプチドの脱保護反応を行う第２次気体触媒反応手段とを有することを特徴とする請求項２に記載の連続合成装置。
【請求項６】
連続流路中において複数液を混合して有機合成を行う液体混合反応手段と、
該液体混合反応手段から流出する生成液を油性成分と水性成分とに分離する油水分離手段と、
分離された油性成分液に気体を混合させる気液混合手段と、
成分液の流路に触媒を付与した気体触媒反応手段とを具備したことを特徴とする連続合成装置。
【請求項７】
前記油水分離手段の一部が孔径が１μm以下の多孔質膜で構成されていることを特徴とする請求項１ないし請求項６のいずれかに記載の連続合成装置。
【請求項８】
前記気液混合手段の一部が孔径が１μm以下の多孔質膜で構成されていることを特徴とする請求項１ないし請求項７のいずれかに記載の連続合成装置。
【請求項９】
気体触媒反応手段が、表面にPd触媒を担持した粒径１mm以下の微粒子を充填した流路からなることを特徴とする請求項１ないし請求項８のいずれかに記載の連続合成装置。
【請求項１０】
前記混合反応手段は、５００μm以下の流路幅を含む混合流路を有するマイクロリアクタであることを特徴とする請求項１ないし請求項９のいずれかに記載の連続合成装置。
【請求項１１】
前記混合反応手段は、孔径が１μm以下の多孔質膜を有する液体分散手段であることを特徴とする請求項１ないし請求項９のいずれかに記載の連続合成装置。
【請求項１２】
水溶性縮合剤と、Ｎ保護アミノ酸とＣ保護ペプチド/有機溶媒の混合液を連続流れで混合し反応させてこれらをペプチド結合させる混合反応工程と、
合成後の液中から未反応の水相成分を分離し除去する油水分離工程と、
水相成分が除去された有機相成分液中に水素ガスを混合させ、触媒を介して生成したペプチドの脱保護反応を行う気体触媒反応工程とを有することを特徴とする連続合成方法。
【請求項１３】
さらに、脱保護した前記生成ペプチドにＮ保護アミノ酸を混合し、これと水溶性縮合剤の混合液を連続流れで混合し反応させてこれらをペプチド結合させる第２次混合反応工程と、
合成後の液中から未反応の水相成分を分離し除去する第２次油水分離工程と、
水相成分が除去された有機相成分液中に水素ガスを混合させ、触媒を介して生成したペプチドの脱保護反応を行う第２次気体触媒反応工程とを、
所定回数繰り返すことによって所定数のアミノ酸残基を有するペプチドを合成することを特徴とする請求項１２に記載の連続合成方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２００７−１８６４５２（Ｐ２００７−１８６４５２Ａ）
【公開日】平成１９年７月２６日（２００７．７．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５６１３（Ｐ２００６−５６１３）
【出願日】平成１８年１月１３日（２００６．１．１３）
【出願人】（００００００２３９）株式会社荏原製作所 (1,477)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年７月２６日（２００７．７．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１月１３日（２００６．１．１３）
【出願人】（００００００２３９）株式会社荏原製作所 (1,477)
【Ｆターム（参考）】
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