連続発酵による核酸の製造方法
【課題】簡便な操作条件で、長時間にわたり安定して高生産性を維持する連続発酵法による核酸の製造方法を提供する。
【解決手段】核酸を生産する能力を有する原核微生物の発酵培養液を分離膜によって濾液と未濾過液に分離し、濾液から所望の発酵生産物である核酸を回収するとともに、未濾過液を発酵培養液に保持または還流する連続発酵方法による核酸の製造方法であって、分離膜に高い透過性と高い細胞阻止率を持ち閉塞しにくい特定の多孔性膜を用い、特定の低い膜間差圧で濾過処理することにより、安定に低コストで発酵による核酸の生産効率を著しく向上させる。
【解決手段】核酸を生産する能力を有する原核微生物の発酵培養液を分離膜によって濾液と未濾過液に分離し、濾液から所望の発酵生産物である核酸を回収するとともに、未濾過液を発酵培養液に保持または還流する連続発酵方法による核酸の製造方法であって、分離膜に高い透過性と高い細胞阻止率を持ち閉塞しにくい特定の多孔性膜を用い、特定の低い膜間差圧で濾過処理することにより、安定に低コストで発酵による核酸の生産効率を著しく向上させる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸を生産する能力のある原核微生物の発酵培養液から、目詰まりが生じにくい多孔性膜を通して核酸を含む液を効率よく濾過・回収すること、および未濾過液を前記の発酵培養液に戻すことにより発酵に関与する微生物濃度を向上させ、高い生産性を得ることができる連続発酵による核酸の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
微生物や培養細胞の培養を伴う物質生産方法である発酵法は、大きく（１）バッチ発酵法（Ｂａｔｃｈ発酵法）および流加発酵法（Ｆｅｄ−Ｂａｔｃh発酵法）と、（２）連続発酵法とに分類することができる。
【０００３】
上記（１）のバッチ発酵法および流加発酵法は、設備的には簡素であり短時間で培養が終了し、雑菌汚染による被害が少ないという利点がある。しかしながら、時間経過と共に培養液中の生産物濃度が高くなり、浸透圧あるいは生産物阻害等の影響により生産性および収率が低下してくる。そのため、長時間にわたり安定して高収率かつ高生産性を維持することが困難である。一方、上記（２）の連続発酵法は、発酵槽内で目的物質が高濃度に蓄積されることを回避することによって、長時間にわたって高収率でかつ高生産性を維持することができるという利点がある。
【０００４】
次に、核酸とその製造方法に関する技術背景について説明する。核酸は、主に核酸系調味料として用いられている。具体的に、核酸は核酸系調味料の主成分の一つであるイノシン酸ナトリウムとして用いられており、かつお節のうま味成分として知られている。イノシン酸ナトリウムは核酸のイノシンを原料として製造されており、その需要は大きい。また、核酸系調味料のもう一つの主成分は、グアニル酸ナトリウムであり、しいたけのうま味成分として有名である。グアニル酸ナトリウムは核酸のグアノシンを原料として製造されており、その需要も大きい。また、イノシンとグアノシンは、医薬中間体としても用途がある。また、核酸のウリジンは、核酸系抗ウィルス薬などの医薬品の合成原料としての用途がある。また、核酸のシチジンは、医薬品であるＣＤＰ―コリンの合成原料として大きな需要がある。したがって、これらの核酸を効率的に製造することができれば、上記需要に対する核酸供給が更に容易になることが期待できる。
【０００５】
現在、イノシンは、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスの変異株あるいはバチルス・サチルスの変異株を用いた発酵法によって製造されている。グアノシン、ウリジンおよびシチジンは、主にバチルス・サチルスの変異株によって生産されている。また、イノシンとグアノシンの混合物がバチルス・サチルスの変異株によって生産されており、生産菌の育種に関しては多くの検討がなされている（非特許文献１参照。）。
【０００６】
一方、核酸の発酵生産性能を向上させるための発酵プロセスの検討も行われている（非特許文献２参照。）。また、イノシンあるいはグアノシンの生産性を向上させるために流加発酵法に関する技術が提案されている（特許文献１参照。）が、この流加発酵においても、発酵槽容量を超えて原料を流加することができないことから、生産性能の向上には限界がある。また、限られた容量の発酵槽において生産性能を高くするためには、流加する原料の濃度を高く設定する必要があるが、原料の調整等に労力を要する等の不具合を内包している。
【０００７】
このように、核酸の発酵生産において、効率的な核酸の製造を目的とした生産性能の向上に向けた様々な検討が行われており、核酸発酵の一層の技術革新が望まれていた。
【非特許文献１】財団法人バイオインダストリー協会 発酵と代謝研究会編、「発酵ハンドブック」、６４−６５、共立出版（２００１）
【非特許文献２】アドバンシス・イン・バイオケミカル・エンジニアリング／バイオテクノロジー（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、８７巻、９７−１５０）、２００４年
【特許文献１】米国特許４５７８３３６号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで本発明の目的は、簡便な操作方法で、長時間にわたり安定して高生産性を維持することができる連続発酵法による核酸の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意研究の結果、微生物や細胞の分離膜内への侵入が少なく、微生物や細胞を膜間差圧が低い条件で培養液を濾過した場合に、分離膜の目詰まりが著しく抑制されることを見出し、分離膜を用いた連続発酵を行うことにより、課題であった核酸の発酵生産性能が飛躍的に向上することを発見し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明の核酸の製造方法は、核酸を生産する能力を有する原核微生物の発酵培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を前記の発酵培養液に保持または還流し、かつ、その原核微生物の発酵原料を前記の発酵培養液に追加する連続発酵により核酸を製造する方法であって、前記の分離膜として平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の細孔を有する多孔性膜を用い、その膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲にして濾過処理することを特徴とする連続発酵による核酸の製造方法である。
【００１１】
具体的に本発明は、発酵培養液を分離膜によって濾液と未濾過液に分離し、その濾液から所望の発酵生産物である核酸を回収するとともに、その未濾過液を発酵培養液に保持または還流させる連続発酵方法による核酸の製造方法であって、高い透過性と高い細胞阻止率を持ち閉塞しにくい上記特定の多孔性分離膜を利用すると共に上記特定の低い膜間差圧で濾過処理することにより、安定に低コストで、発酵生産効率を著しく向上させる核酸の製造方法を提供するものである。
【００１２】
本発明の連続発酵による核酸の製造方法の好ましい態様によれば、前記の多孔性膜の純水透過係数は、２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上６×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下である。
【００１３】
本発明の連続発酵による核酸の製造方法の好ましい態様によれば、前記の多孔性膜の平均細孔径は０.０１μｍ以上０.２μｍ未満であり、その平均細孔径の標準偏差は０.１μｍ以下であり、その膜表面粗さは０.１μｍ以下である。
【００１４】
本発明の連続発酵による核酸の製造方法の好ましい態様によれば、前記の多孔性膜は多孔性樹脂層を含む多孔性膜であり、多孔性樹脂層は有機高分子膜からなるものである。
【００１５】
本発明の連続発酵による核酸の製造方法の好ましい態様によれば、前記の多孔性膜の素材にポリフッ化ビニリデン系樹脂が用いられることである。
【００１６】
本発明の連続発酵による核酸の製造方法の好ましい態様によれば、前記の原核微生物の培養液および発酵原料は糖類を含むことである。
【００１７】
本発明の連続発酵による核酸の製造方法の好ましい態様によれば、前記の核酸はイノシンまたはグアノシンである。
【００１８】
本発明の連続発酵による核酸の製造方法の好ましい態様によれば、前記の原核微生物は、核酸を生産する能力のある原核微生物であり、その核酸を生産する能力のある原核微生物はアデニン要求性であり、ヌクレオシダーゼ活性を持たない原核微生物である。
【００１９】
本発明の連続発酵による核酸の製造方法の好ましい態様によれば、前記の核酸はシチジンであり、シチジン生産能力のある原核微生物はシチジンデアミナーゼ活性を持たない原核微生物である。
【００２０】
本発明の連続発酵による核酸の製造方法の好ましい態様によれば、前記の原核微生物は、バチルス属（Ｇｅｎｕｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する原核微生物である。
【００２１】
本発明の連続発酵による核酸の製造方法の好ましい態様によれば、前記の原核微生物は、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。
【００２２】
本発明の連続発酵による核酸の製造方法の好ましい態様によれば、前記の原核微生物は、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ株である。
【００２３】
本発明の連続発酵による核酸の製造方法の好ましい態様によれば、前記の原核微生物は、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する原核微生物である。
【００２４】
本発明の連続発酵による核酸の製造方法の好ましい態様によれば、前記の原核微生物は、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）である。
【００２５】
本発明の連続発酵による核酸の製造方法の好ましい態様によれば、前記の原核微生物は、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ株である。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、簡便な操作条件で、長時間にわたり安定して所望の発酵生産物の高生産性を維持する連続発酵が可能となり、広く発酵工業において、発酵生産物である核酸を低コストで安定に生産することが可能となる。本発明の連続発酵による核酸の製造方法により得られた核酸は、例えば、核酸調味料や医薬品の原料として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明は、核酸を生産する能力のある原核微生物の培養液を、分離膜で濾過して濾液と未濾過液に分離し濾液から生産物を回収すると共に未濾過液を前記培養液に保持または還流し、かつ、その原核微生物の発酵原料を前記の培養液に追加する連続発酵であって、前記の分離膜として平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の細孔を有する多孔性膜を用い、その膜間差圧を０.１以上２０ｋＰａ未満にして濾過処理することを特徴とする連続発酵による核酸の製造方法である。
【００２８】
本発明において分離膜として用いられる多孔性膜は、発酵に使用される原核微生物による目詰まりが起こりにくく、かつ、濾過性能が長期間安定に継続する性能を有するものであることが望ましい。そのため、本発明で使用される多孔性膜は、その平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満であることが重要である。
【００２９】
次に、本発明で分離膜として用いられる多孔性膜の構成について説明する。本発明における多孔性膜は、被処理水の水質や用途に応じた分離性能と透水性能を有するものであり、阻止性能および透水性能や耐汚れ性という分離性能の点からは、多孔質樹脂層を含む多孔性膜であることが好ましい。このような多孔性膜は、多孔質基材の表面に、分離機能層として作用とする多孔質樹脂層を有している。多孔質基材は、多孔質樹脂層を支持して分離膜としての多孔性膜に強度を与えるものである。
【００３０】
多孔質基材の材質は、有機材料および／または無機材料等からなり、中でも有機繊維が望ましく用いられる。好ましい多孔質基材は、セルロース繊維、セルローストリアセテート繊維、ポリエステル繊維、ポリプロピレン繊維およびポリエチレン繊維などの有機繊維を用いてなる織布や不織布であり、中でも、密度の制御が比較的容易であり製造も容易で安価な不織布が好ましく用いられる。多孔質基材の平均厚みは、好ましくは５０μｍ以上３０００μｍ以下である。
【００３１】
また、多孔質樹脂層は、上述したように分離機能層として作用するものであり、有機高分子膜を好適に使用することができる。有機高分子膜の材質としては、例えば、ポリエチレン系樹脂、ポリプロピレン系樹脂、ポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂、ポリアクリロニトリル系樹脂、セルロース系樹脂およびセルローストリアセテート系樹脂などが挙げられる。有機高分子膜は、これらの樹脂を主成分とする樹脂の混合物からなるものであってもよい。ここで主成分とは、その成分が５０重量％以上、好ましくは６０重量％以上含有することをいう。中でも、多孔性膜を構成する多孔質樹脂層の素材としては、溶液による製膜が容易で物理的耐久性や耐薬品性にも優れているポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂およびポリアクリロニトリル系樹脂が好ましく、ポリフッ化ビニリデン系樹脂またはそれを主成分とする樹脂が最も好ましく用いられる。
【００３２】
ここで、ポリフッ化ビニリデン系樹脂としては、フッ化ビニリデンの単独重合体が好ましく用いられるが、その他、フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体との共重合体も好ましく用いられる。フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体としては、テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロピレンおよび三塩化フッ化エチレンなどが例示される。
【００３３】
本発明で用いられる多孔性膜の作成法の概要を説明する。まず、上述した多孔質基材の表面に、上述した樹脂と溶媒とを含む原液の被膜を形成するとともに、その原液を多孔質基材に含浸させる。しかる後、被膜を有する多孔質基材の被膜側表面のみを、非溶媒を含む凝固浴と接触させて樹脂を凝固させると共に多孔質基材の表面に多孔質樹脂層を形成する。原液にさらに非溶媒を含ませることもできる。原液の温度は、製膜性の観点から、通常、１５〜１２０℃の範囲内で選定することが好ましい。
【００３４】
ここで、原液には、開孔剤を添加することもできる。開孔剤は、凝固浴に浸漬された際に抽出されて、樹脂層を多孔質にする作用を持つものである。開孔剤を添加することにより、平均細孔径の大きさを制御することができる。開孔剤は、凝固浴に浸漬された際に抽出されて、樹脂層を多孔質にする作用を持つものである。開孔剤は、凝固浴への溶解性の高いものであることが好ましい。開孔剤としては、例えば、塩化カルシウムや炭酸カルシウムなどの無機塩を用いることができる。また、開孔剤として、ポリエチレングリコールやポリプロピレングリコールなどのポリオキシアルキレン類や、ポリビニルアルコール、ポリビニルブチラールおよびポリアクリル酸などの水溶性高分子化合物や、グリセリンを用いることができる。
【００３５】
また、溶媒は、樹脂を溶解するものである。溶媒は、樹脂および開孔剤に作用してそれらが多孔質樹脂層を形成するのを促す。このような溶媒としては、Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトンおよびメチルエチルケトンなどを用いることができる。中でも、樹脂の溶解性の高いＮＭＰ、ＤＭＡｃ、ＤＭＦおよびＤＭＳＯを好ましく用いられる。
【００３６】
さらに、原液には、非溶媒を添加することもできる。非溶媒は、樹脂を溶解しない液体である。非溶媒は、樹脂の凝固の速度を制御して細孔の大きさを制御するように作用する。非溶媒としては、水やメタノールおよびエタノールなどのアルコール類を用いることができる。中でも、価格の点から水やメタノールが好ましい。非溶媒は、これらの混合物であってもよい。
【００３７】
本発明で用いられる多孔性膜は、平膜であっても中空糸膜であっても良い。平膜の場合、その平均厚みは用途に応じて選択されるが、好ましくは２０μｍ以上５０００μｍ以下であり、より好ましくは５０μｍ以上２０００μｍ以下の範囲で選択される。
【００３８】
上述のように、本発明で分離膜として用いられる多孔性膜は、多孔質基材と多孔質樹脂層とから形成されている多孔性膜であることが望ましい。その際、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していても、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していなくてもどちらでも良く、用途に応じて選択される。多孔質基材の平均厚みは、好ましくは５０μｍ以上３０００μｍ以下の範囲で選択される。また、多孔性膜が中空糸膜の場合、中空糸の内径は好ましくは２００μｍ以上５０００μｍ以下の範囲で選択され、膜厚は好ましくは２０μｍ以上２０００μｍ以下の範囲で選択される。また、有機繊維または無機繊維を筒状にした織物や編物を中空糸膜の内部に含んでいても良い。
【００３９】
次にまず、多孔性膜のうち、平膜の作成法の概要について説明する。
【００４０】
多孔質基材の表面に、樹脂と溶媒とを含む原液の被膜を形成すると共に、その原液を多孔質基材に含浸させる。その後、被膜を有する多孔質基材の被膜側表面のみを、非溶媒を含む凝固浴と接触させて樹脂を凝固させると共に、多孔質基材の表面に多孔質樹脂層を形成する。
【００４１】
原液は、樹脂を溶媒に溶解させて調整する。原液の温度は、製膜性の観点から、通常、５〜１２０℃の範囲内で選定することが好ましい。溶媒は、樹脂を溶解するものであり、樹脂に作用してそれらが多孔質樹脂層を形成するのを促すものである。溶媒としては、Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ −メチル− ２− ピロリドン、メチルエチルケトン、テトラヒドロフラン、テトラメチル尿素、リン酸トリメチル、シクロヘキサノン、イソホロン、γ −ブチロラクトン、メチルイソアミルケトン、フタル酸ジメチル、プロピレングリコールメチルエーテール、プロピレンカーボネート、ジアセトンアルコール、グリセロールトリアセテート、アセトンおよびメチルエチルケトンなどを用いることができる。なかでも、樹脂の溶解性の高いＮ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が好ましく用いられる。これらの溶媒は、単独で用いても良いし２種類以上を混合して用いても良い。原液は、先述の樹脂を好ましくは５重量％以上６０重量％以下の濃度で、上述の溶媒に溶解させることにより調整することができる。
【００４２】
また、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンおよびグリセリンなどの溶媒以外の成分を溶媒に添加しても良い。溶媒に非溶媒を添加することもできる。非溶媒は、樹脂を溶解しない液体である。非溶媒は、樹脂の凝固の速度を制御して細孔の大きさを制御するように作用する。非溶媒としては、水や、メタノールおよびエタノールなどのアルコール類を用いることができる。なかでも、非溶媒として、価格の点から水やメタノールが好ましく用いられる。溶媒以外の成分および非溶媒は、混合物であってもよい。
【００４３】
原液には、開孔剤を添加することもできる。開孔剤は、凝固浴に浸漬された際に抽出されて、樹脂層を多孔質にする作用を持つものである。開孔剤を添加することにより、平均細孔径の大きさを制御することができる。開孔剤は、凝固浴への溶解性の高いものであることが好ましい。開孔剤としては、例えば、塩化カルシウムや炭酸カルシウムなどの無機塩を用いることができる。また、開孔剤として、ポリエチレングリコールやポリプロピレングリコールなどのポリオキシアルキレン類や、ポリビニルアルコール、ポリビニルブチラールおよびポリアクリル酸などの水溶性高分子化合物や、グリセリンを用いることができる。
【００４４】
次に、多孔性膜のうち、中空糸膜の作成法の概要について説明する。
【００４５】
中空糸膜は、樹脂と溶媒からなる原液を二重管式口金の外側の管から吐出すると共に、中空部形成用流体を二重管式口金の内側の管から吐出して、冷却浴中で冷却固化して作製することができる。
【００４６】
原液は、上述の平膜の作成法で述べた樹脂を好ましくは２０重量％以上６０重量％以下の濃度で、上述の平膜の生成法で述べた溶媒に溶解させることにより調整することができる。また、中空部形成用流体には、通常気体もしくは液体を用いることができる。また、得られた中空糸膜の外表面に、新たな多孔性樹脂層をコーティング（積層）することもできる。積層は中空糸膜の性質、例えば、親水性・疎水性あるいは細孔径等を所望の性質に変化させるために行うことができる。積層される新たな多孔性樹脂層は、樹脂を溶媒に溶解させた原液を、非溶媒を含む凝固浴と接触させて樹脂を凝固させることによって作製することができる。その樹脂の材質は、例えば、上述有機高分子膜の材質と同様のものが好ましく用いられる。また、積層方法としては、原液に中空糸膜を浸漬してもよいし、中空糸膜の表面に原液を塗布してもよく、積層後、付着した原液の一部を掻き取ったり、エアナイフを用いて吹き飛ばしすることにより積層量を調整することもできる。
【００４７】
本発明で用いられる多孔性膜は、支持体と組み合わせることによって分離膜エレメントとすることができる。支持体として支持板を用い、その支持板の少なくとも片面に、本発明で用いられる多孔性膜を配した分離膜エレメントは、本発明で用いられる多孔性膜を有する分離膜エレメントの好適な形態の一つである。この形態で、膜面積を大きくすることが困難な場合には、透水量を大きくするために、支持板の両面に多孔性膜を配することも好ましい態様である。
【００４８】
分離膜としての多孔性膜の平均細孔径が上記のように０．０１μｍ以上１μｍ未満の範囲内にあると、菌体がリークすることのない高い排除率と、高い透水性を両立させることができ、さらに目詰まりをしにくく、透水性を長時間保持することが、より高い精度と再現性を持って実施することができる。原核微生物として細菌類を用いた場合、多孔性膜の平均細孔径は好ましくは０.４μｍ以下であり、平均細孔径は０.２μｍ未満であればなお好適に実施することが可能である。平均細孔径は、小さすぎると透水量が低下することがあるので、本発明では、平均細孔径は０.０１μｍ以上であり、好ましくは０．０２μｍ以上であり、さらに好ましくは０．０４μｍ以上である。
【００４９】
ここで、平均細孔径は、倍率１０，０００倍の走査型電子顕微鏡観察における、９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔すべての直径を測定し、平均することにより求めることができる。
【００５０】
また、上記の平均細孔径の標準偏差σは、０．１μｍ以下であることが好ましい。更に、平均細孔径の標準偏差が小さい、すなわち細孔径の大きさが揃っている方が均一な透過液を得ることができ、発酵運転管理が容易になることから、平均細孔径の標準偏差は小さければ小さい方が望ましい。
【００５１】
平均細孔径の標準偏差σは、上述の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔数をＮとして、測定した各々の直径をＸｋとし、細孔直径の平均をＸ（ａｖｅ）とした下記の（式１）により算出される。
【００５２】
【数１】
【００５３】
本発明で用いられる多孔性膜においては、発酵培養液の透過性が重要点の一つであり、透過性の指標として、使用前の多孔性膜の純水透過係数を用いることができる。本発明において、多孔性膜の純水透過係数は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで透水量を測定し算出したとき、２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上であることが好ましい。純水透過係数が２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上６×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下であれば、実用的に十分な透過水量が得られる。より好ましい純水透過係数は、２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上１×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下である。
【００５４】
本発明で用いられる多孔性膜の膜表面粗さは、分離膜の目詰まりに影響を与える因子である。好ましくは膜表面粗さが０.１μｍ以下のときに分離膜の剥離係数や膜抵抗を好適に低下させることができ、より低い膜間差圧で連続発酵が実施可能である。従って、目詰まりを抑えることにより安定した連続発酵が可能になることから、表面粗さは小さければ小さいほど好ましい。
【００５５】
また、多孔性膜の膜表面粗さを低くすることにより、原核微生物の濾過において、膜表面で発生する剪断力を低下させることが期待でき、原核微生物の破壊が抑制され、多孔性膜の目詰まりも抑制されることにより、長期間安定な濾過が可能になると考えられる。
【００５６】
ここで、膜表面粗さは、下記の原子間力顕微鏡装置（ＡＦＭ）を使用して、下記の装置と条件で測定することができる。
・装置：原子間力顕微鏡装置(Digital Instruments（株）製Nanoscope IIIa)
・条件：探針 SiNカンチレバー(Digital Instruments（株）製)
：走査モード コンタクトモード（気中測定）
水中タッピングモード（水中測定）
：走査範囲 １０μm、２５μm 四方（気中測定）
５μm、１０μm 四方（水中測定）
：走査解像度 ５１２×５１２
・試料調製 測定に際し膜サンプルは、常温でエタノールに１５分浸漬後、ＲＯ水中に２４時間浸漬し洗浄した後、風乾し用いた。ＲＯ水とは、ろ過膜の一種である逆浸透膜（ＲＯ膜）を用いてろ過し、イオンや塩類などの不純物を排除した水を指す。ＲＯ膜の孔の大きさは、概ね２ｎｍ以下である。
【００５７】
膜表面粗さｄｒｏｕｇｈは、上記ＡＦＭにより各ポイントのＺ軸方向の高さから、下記の（式２）により算出する。
【００５８】
【数２】
【００５９】
本発明において、原核微生物を分離膜で濾過処理する際の膜間差圧は、原核微生物および培地成分が容易に目詰まりしない条件であればよいが、膜間差圧を０.１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下の範囲にして濾過処理することが重要である。膜間差圧は好ましくは０.１ｋＰａ以上１０ｋＰａ以下の範囲であり、さらに好ましくは０.１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下の範囲である。上記の膜間差圧０.１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下の範囲を外れた場合、原核微生物および培地成分の目詰まりが急速に発生し、透過水量の低下を招き、連続発酵運転に不具合を生じることがある。
【００６０】
濾過の駆動力としては、発酵培養液と多孔性膜処理水の液位差（水頭差）を利用したサイホンにより多孔性膜に膜間差圧を発生させることが可能である。また、濾過の駆動力として多孔性膜処理水側に吸引ポンプを設置してもよいし、多孔性膜の発酵培養液側に加圧ポンプを設置することも可能である。膜間差圧は、発酵培養液と多孔性膜処理水の液位差を変化させることにより制御することができる、また、膜間差圧を発生させるためにポンプを使用する場合には、吸引圧力により膜間差圧を制御することができ、更に発酵培養液側の圧力を導入する気体または液体の圧力によっても膜間差圧を制御することができる。これら圧力制御を行う場合には、発酵培養液側の圧力と多孔性膜処理水側の圧力差をもって膜間差圧とし、膜間差圧の制御に用いることができる。
【００６１】
また、本発明において使用される多孔性膜は、濾過処理する膜間差圧として、０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下の範囲で濾過処理することができる性能を有するものであることが好ましい。また、本発明で使用される多孔性膜は、上述のように、使用前の純水透過係数が、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで透水量を測定し算出したとき、２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上の範囲であることが好ましく、さらに２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上６×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下の範囲にあることが好ましい。
【００６２】
本発明で使用される原核微生物の発酵原料としては、発酵培養する原核微生物の生育を促し、目的とする発酵生産物である核酸を良好に生産させ得るものであれば良い。発酵原料としては、例えば、炭素源、窒素源、無機塩類、および必要に応じてアミノ酸、およびビタミンなどの有機微量栄養素を適宜含有する液体培地等が好ましく用いられる。
【００６３】
上記の炭素源としては、例えば、グルコース、シュークロース、フラクトース、ガラクトース、ラクトース等の糖類、これら糖類を含有する澱粉糖化液、甘藷糖蜜、甜菜糖蜜、ハイテストモラセス、サトウキビ搾汁、更には酢酸、フマル酸等の有機酸、エタノールなどのアルコール類、およびグリセリン等が使用される。ここで糖類とは、多価アルコールの最初の酸化生成物であり、アルデヒド基またはケトン基をひとつ持ち、アルデヒド基を持つ糖をアルドース、ケトン基を持つ糖をケトースと分類される炭水化物のことを指す。
【００６４】
また、上記の窒素源としては、例えば、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば、油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、ビタミン類、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種発酵菌体およびその加水分解物などが使用される。
【００６５】
また、上記の無機塩類としては、例えば、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩およびマンガン塩等を適宜添加使用することができる。
【００６６】
本発明で使用される原核微生物が生育のために特定の栄養素を必要とする場合には、その栄養物を標品もしくはそれを含有する天然物として添加することができる。また、消泡剤も必要に応じて添加使用することができる。
【００６７】
本発明において、発酵培養液とは、発酵原料に原核微生物が増殖した結果得られる液のことを言い、追加する発酵原料の組成は、培養開始時の発酵原料組成から適宜変更しても良い。発酵原料組成から追加する発酵原料の組成に変更する場合、目的とする核酸の生産性が高くなるような変更が好ましい。例えば、上記炭素源に対する窒素源、無機塩類、アミノ酸およびビタミンなどの有機微量栄養素の重量比率を低下させることにより、核酸の生産コストの低減、すなわち広義で核酸の生産性の向上が実現できる場合もある。一方、上記炭素源に対する窒素源、無機塩類、アミノ酸およびビタミンなどの有機微量栄養素の重量比率を増加させることにより、核酸の生産性を向上させることができる場合もある。
【００６８】
本発明では、発酵培養液中の糖類など発酵原料の濃度は、５ｇ／Ｌ以下に保持されるようにすることが好ましい。その理由は、発酵培養液の引き抜きによる発酵原料の流失を最小限にするためである。そのため発酵原料の濃度は、可能な限り小さいことが望ましい。
【００６９】
微生物の発酵培養は、通常、ｐＨが４〜８で温度が２０〜４０℃の範囲で行われることが多い。発酵培養液のｐＨは、無機の酸または有機の酸、アルカリ性物質、さらには尿素、炭酸カルシウムおよびアンモニアガスなどによって、上記範囲内のあらかじめ定められた値に調節される。
【００７０】
原核微生物の培養において、酸素の供給速度を上げる必要があれば、空気に酸素を加えて酸素濃度を例えば２１％以上に保つ、発酵培養液を加圧する、攪拌速度を上げる、あるいは通気量を上げるなどの手段を用いることができる。逆に、酸素の供給速度を下げる必要があれば、炭酸ガス、窒素およびアルゴンなど酸素を含まないガスを空気に混合して供給することも可能である。
【００７１】
本発明においては、培養初期にＢａｔｃｈ培養またはＦｅｄ−Ｂａｔｃｈ培養を行って微生物濃度を高くした後に連続培養（引き抜き）を開始しても良いし、高濃度の菌体をシードし、培養開始とともに連続培養を行っても良い。適当な時期から、発酵原料液の供給および培養物の引き抜きを行うことが可能である。発酵原料液供給と培養物の引き抜きの開始時期は、必ずしも同じである必要はない。また、発酵原料液の供給と培養物の引き抜きは連続的であってもよいし、間欠的であってもよい。発酵原料液には、上記に示したような菌体増殖に必要な栄養素を添加し、菌体増殖が連続的に行われるようにすればよい。
【００７２】
発酵培養液中の原核微生物の濃度は、効率よい生産性を得る上で、発酵培養液の環境が微生物の増殖にとって不適切となって死滅する比率が高くならない範囲で、高い状態で維持することが好ましい。一例として、濃度を乾燥重量として５ｇ／Ｌ以上に維持することにより、より良好な生産効率が得られる。また、連続発酵装置の運転上の不具合や生産効率の低下を招かなければ、原核微生物の濃度の上限値は特に限定されない。
【００７３】
発酵生産能力のあるフレッシュな菌体を増殖させつつ行う連続培養操作は、培養管理上、通常、単一の発酵反応槽で行うことが好ましい。しかしながら、菌体を増殖しつつ生産物を生成する連続培養法であれば、発酵反応槽の数は問わない。発酵反応槽の容量が小さい等の理由から、複数の発酵反応槽を用いることもあり得る。この場合、複数の発酵反応槽を配管で並列または直列に接続して連続培養を行っても、発酵生産物の高生産性は得られる。
【００７４】
本発明においては、原核微生物を発酵反応槽に維持したままで、発酵反応槽からの発酵培養液の連続的かつ効率的な抜き出しが可能となることから、原核微生物を連続的に培養し、十分な増殖を確保した後に発酵原料液組成を変更し、目的とする化学品を効率よく製造することも可能である。
【００７５】
本発明により得られる核酸とは、塩基と糖からなるヌクレオシド、あるいは塩基と糖とリン酸からなるヌクレオチドのことである。ヌクレオシドとは、塩基と糖が結合した化合物の一種であり、塩基としては、アデニンやグアニンなどのプリン塩基、チミン、シトシン、ウラシルなどのピリミジン塩基、ニコチンアミドおよびジメチルイソアロキサジンなどが挙げられる。また、糖としては、デオキシリボースやリボースが結合した化合物が挙げられる。
【００７６】
また、ヌクレオチドとは、ヌクレオシドにリン酸基が結合した化合物のことである。糖の違いによって、リボースを持つデオキシリボ核酸と２−デオキシリボースを持つリボ核酸とがある。更に、本発明により得られる核酸には、これらヌクレオチドの糖の１'位の塩基（核酸塩基）が結合し、さらに糖の３'位と隣の糖の５'位はリン酸エステル構造で結合し、その結合が繰り返されたリン酸エステル結合化合物、いわゆるＤＮＡとＲＮＡも含まれる。
【００７７】
本発明で使用される原核微生物は、核酸を生産する能力を持つもので例えば、発酵工業においてよく使用される大腸菌、コリネ型細菌および枯草菌などのバクテリアなどが挙げられる。使用される原核微生物は、自然環境から単離されたものでもよく、また、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。
【００７８】
本発明で用いられる原核微生物とは、原核細胞からなる微生物のことである。原核細胞の最も際立った特徴は、細胞内に細胞核（核）と呼ばれる構造を持たないことである。細胞核（核）を有する真核生物とは明確に区別される。
【００７９】
本発明で使用される原核微生物は、核酸の生産能力が高いものが好ましい。元来核酸の生産能力が高いものを自然界から分離してもよいし、人為的に生産能力を高めた原核微生物であってもよい。具体的には、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。
【００８０】
ここで一部性質の改変に関して説明する。核酸を効率よく生産するためには、核酸を生合成して蓄積し、生体外に放出する必要がある。そのため、核酸の生合成系路に関与する酵素の増強、核酸の分解路に関与する酵素活性低下、また核酸を生体外放出に関わるタンパク質、あるいは生体膜組成等の改変など、原核微生物の性質を変えることによって効率的に核酸を生産する原核微生物を作出することができる。
【００８１】
具体的には、一部性質の内、イノシンを生産する場合には、アデニロコハク酸シンテターゼ活性を持たないか、微弱であることが望ましい。また、イノシン酸デヒドロゲナーゼ活性を持たないか、微弱であることが望ましい。また、ヌクレオシダーゼ活性を持たないか、微弱であることが望ましい。
【００８２】
グアノシンを生産する場合には、アデニロコハク酸シンテターゼ活性を持たないか、微弱であることが望ましい。また、グアニル酸レダクターゼ活性を持たないか、微弱であることが望ましい。また、ヌクレオシダーゼ活性を持たないか、微弱であることが望ましい。また、ヌクレオチダーゼ活性を持たないか、微弱であることが望ましい。
【００８３】
ウリジンを生産する場合には、ウリジンホスホリラーゼ活性を持たないか、微弱であることが望ましい。
【００８４】
シチジンを生産する場合には、シジチンデアミナーゼ活性を持たないか、微弱であることが望ましく、ホモセリンデヒドロゲナーゼ活性を持たないか、微弱であることが望ましい。
【００８５】
本発明では、その原核微生物のうちで更に好ましくはコリネ型細菌および枯草菌を用いることができる。例えば、イノシンを生産する場合には、コリネ型細菌として、コリネバクテリウム属（Ｇｅｎｕｓ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に属する細菌が挙げられる。コリネバクテリウム属の中でも、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム・グアノファシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｕａｎｏｆａｃｉｅｎｓ）、およびコリネバクテリウム・ペトロフィリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｅｔｒｏｐｈｉｌｉｕｍ）が好ましく用いられる。コリネバクテリウム・アンモニアゲネスとしては、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ２１４７９株が好ましく用いられる
また、枯草菌として、バチルス属（Ｇｅｎｕｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する細菌が挙げられる。バチルス属の中でも、バチスル・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチスル・ライケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｑｕｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、およびバチスル・プミラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）が好ましく用いられる。
【００８６】
また、グアノシンを生産する場合には、コリネ型細菌として、コリネバクテリウム属（Ｇｅｎｕｓ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に属する細菌が挙げられる。コリネバクテリウム属の中でも、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ）が好ましく、枯草菌としては、例えば、バチルス属（Ｇｅｎｕｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する細菌が挙げられる。バチルス属の中でも、バチスル・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチスル・ライケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｑｕｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチスル・プミラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）が好ましく用いられる。また、ウリジンを生産する場合には、枯草菌を用いることができ、枯草菌の中でもバチルス属（Ｇｅｎｕｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する細菌が好ましく用いられる。バチルス属の中でも、バチスル・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が好ましく用いられる。
【００８７】
シチジンを生産する場合には、枯草菌を用いることができ、枯草菌の中でもバチルス属（Ｇｅｎｕｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する細菌が好ましく用いられる。バチルス属の中でも、バチスル・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が好ましく用いられる。
【００８８】
バチスル・サチルスとしては、バチスル・サチルスＡＴＣＣ１９２２１株が好ましく用いられる。
【００８９】
これら原核微生物を選択して、核酸の生産に用いることが可能である。また、これら原核微生物を人為的に上記一部の性質を改変することで核酸の生産能力を向上させ、用いることが可能である。
【００９０】
本発明の連続発酵による核酸の製造方法における発酵培養は、ｐＨ４ないし８、温度２０ないし４０℃の範囲で好気的条件下で行われることが望ましい。発酵培養液のｐＨ調整は、無機の酸あるいは有機の酸、アルカリ性物質、更には尿素、炭酸カルシウムおよびアンモニアガスなどによって行うことができる。これらの条件下で連続発酵させることにより核酸を製造することができる。また、発酵培養液から核酸を採取する方法は公知の方法に従って行えばよく、例えば、菌体を分離除去し、イオン交換樹脂処理法、濃縮冷却晶析法、膜分離法およびその他の方法を組み合わせることにより行なわれる。不純物を除くためには、常法の活性炭吸着法および再結法を用いて精製してもよい。
【００９１】
本発明の連続発酵による核酸の製造方法は、分離膜として平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の多孔性膜を使用し、濾過圧力である膜間差圧が０.１から２０ｋＰａの範囲で濾過処理することを特徴としている。そのため、特別に発酵反応槽内を加圧状態に保つ必要がないことから、濾過分離装置と発酵反応槽間で発酵液を循環させる動力手段が不要となる。分離膜エレメントは発酵反応槽の外側に設置しても良いし、発酵反応槽内部に設置して発酵装置をコンパクト化することもできる。
【００９２】
本発明の連続発酵による核酸の製造方法で用いられる連続発酵装置のうち、分離膜エレメントが、発酵反応槽の外部に設置された代表的な一例を図１の概要図に示す。図１は、本発明で用いられる他の膜分離型連続発酵装置の一つの実施の形態を説明するための概略側面図である。
【００９３】
図１において、連続発酵装置は、原核微生物を発酵培養させるための発酵反応槽１と、その発酵反応槽１に発酵培養液循環ポンプ１１を介して接続され内部に分離膜エレメント２を備えた膜分離槽１２と、発酵反応槽１の内の発酵培養液の量を制御するための水頭差制御装置３で基本的に構成されている。ここで、分離膜エレメント２には、多孔性膜が組み込まれている。この多孔性膜としては、例えば、国際公開第２００２／０６４２４０号パンフレットに開示されている分離膜および分離膜エレメントを好適に使用することが好適である。
【００９４】
図１において、培地供給ポンプ７によって培地を発酵反応槽１に投入し、必要に応じて、攪拌機５で発酵反応槽１内の発酵培養液を攪拌することができる。また必要に応じて、気体供給装置４によって必要とする気体を供給することができる。このとき、供給した気体を回収リサイクルして再び気体供給装置４で供給することができる。また、必要に応じて、ｐＨセンサ・制御装置９およびよびｐＨ調整溶液供給ポンプ８によって発酵培養液のｐＨを調整することができる。また必要に応じて、温度調節器１０によって発酵培養液の温度を調節することにより、生産性の高い発酵生産を行うことができる。さらに、装置内の発酵培養液は、発酵培養液循環ポンプ１１によって発酵反応槽１と膜分離槽１２の間を循環する。発酵生産物を含む発酵培養液は、分離膜エレメント２によって原核微生物と発酵生産物に濾過・分離され、発酵生産物を装置系から取り出すことができる。
【００９５】
ここでは、計装・制御装置による発酵培養液の物理化学的条件の調節に、ｐＨおよび温度の調節を例示したが、必要に応じて、発酵培養液の溶存酸素や酸化還元電位（ＯＲＰ）の制御を行うことができ、更にはオンラインケミカルセンサーなどの分析装置により発酵培養液中の核酸の濃度を測定し、それを指標とした物理化学的条件の制御を行うことができる。また、培地の連続的もしくは断続的投入の形態に関しては、特に限定されるものではないが、上記計装装置による発酵培養液の物理化学的環境の測定値を指標として、培地投入量および速度を適宜調節することができる。
【００９６】
また、濾過・分離された原核微生物は、装置系内に留まることにより装置系内の原核微生物濃度を高く維持することができ、生産性の高い発酵生産を可能としている。ここで、分離膜エレメント２による濾過・分離は膜分離槽１２の水面との水頭差圧によって行なうことができ、特別な動力を必要としない。また、必要に応じて、レベルセンサ６および水頭差圧制御装置３によって、分離膜エレメント２の濾過・分離速度および装置系内の発酵培養液量を適当に調節することができる。また、必要に応じて、気体供給装置４によって必要とする気体を膜分離槽１２内に供給することができる。
【００９７】
次に本発明の連続発酵による核酸の製造方法で用いられる連続発酵装置のうち、分離膜エレメントが発酵反応槽の内部に設置された代表的な一例を図２に示す。図２は、本発明で用いられる連続発酵装置の一つの実施の形態を説明するための概略側面図である。図１において、連続発酵装置は、原核微生物を発酵培養させるための発酵反応槽１と、その発酵反応槽１の内の発酵培養液の量を制御するための水頭差制御装置３で基本的に構成されている。発酵反応槽１内には分離膜エレメント２が配設されており、その分離膜エレメント２には、多孔性膜が組み込まれている。この多孔性膜としては、例えば、国際公開第２００２／０６４２４０号パンフレットに開示されている分離膜および分離膜エレメントを使用することができる。分離膜エレメントに関しては、追って詳述する。
【００９８】
次に、図２の連続発酵装置による連続発酵の形態について説明する。図２において、培地供給ポンプ７によって、培地を発酵反応槽１に連続的もしくは断続的に投入する。培地については、発酵反応槽１に投入する前に、必要に応じて加熱殺菌、加熱滅菌あるいはフィルターを用いた滅菌処理を行うことができる。発酵生産時には、必要に応じて、発酵反応槽１内の攪拌機５で発酵反応槽１内の発酵培養液を攪拌することができる。また必要に応じて、気体供給装置４によって必要とする気体を発酵反応槽１内に供給することができる。このとき、供給した気体を回収リサイクルして再び気体供給装置４によって供給することができる。また必要に応じて、ｐＨセンサ・制御装置９およびｐＨ調整溶液供給ポンプ８によって発酵反応槽１内の発酵培養液のｐＨを調整することができる。また必要に応じて、温度調節器１０によって発酵反応槽１内の発酵培養液の温度を調節することにより生産性の高い発酵生産を行うことができる。
【００９９】
ここでは、計装・制御装置による発酵培養液の物理化学的条件の調節に、ｐＨおよび温度の調節を例示したが、必要に応じて、図１に示した連続発酵装置同様の制御を行い最適な発酵生産条件に調節することができる。
【０１００】
図２に示す連続発酵装置において発酵培養液は、発酵反応槽１内に設置された分離膜エレメント２によって、原核微生物と発酵生産物に濾過・分離され、発酵生産物が装置系から取り出される。また、濾過・分離された原核微生物は装置系内に留まることにより装置系内の原核微生物濃度を高く維持することができ、生産性の高い発酵生産を可能としている。ここで、分離膜エレメント２による濾過・分離は発酵反応槽１の水面との水頭差圧によって行い、特別な動力を必要としない。また、必要に応じて、レベルセンサ６および水頭差圧制御装置３によって、分離膜エレメント２の濾過・分離速度およびよび発酵反応槽１内の発酵培養液量を適当に調節することができる。上記の分離膜エレメント２による濾過・分離は水頭差圧によって行うことができるが、必要に応じて、ポンプや、液体や気体等による吸引濾過あるいは装置系内を加圧することにより、濾過・分離することもできる。
【０１０１】
上記のように、分離膜エレメント２による濾過・分離は水頭差圧によって行うことができるが、必要に応じて、ポンプや、液体や気体等による吸引濾過あるいは装置系内を加圧することにより濾過・分離することもできる。このような手段により、膜間差圧を調整制御することができる。
【０１０２】
本発明で用いられる分離膜エレメントについて、好適な形態の例である国際公開第２００２／０６４２４０号パンフレットに開示されている分離膜および分離膜エレメントを、以下に図面を用いてその概略を説明する。図３は、本発明で用いられる分離膜エレメントの一つの実施の形態を説明するための概略斜視図である。
【０１０３】
分離膜エレメントは、図３に示すように、剛性を有する支持板１３の両面に、流路材１４と前記の分離膜１５をこの順序で配し構成されている。支持板１３は、両面に凹部１６を有している。分離膜１５は、発酵培養液を濾過する。流路材１４は、分離膜１５で濾過された濾液を効率よく支持板１３に流すためのものである。支持板１３に流れた濾液は、支持板１３の凹部１６を通り、排出手段である集水パイプ１７を介して連続発酵装置外部に取り出される。
【０１０４】
図４は、本発明で用いられる別の分離膜エレメントの他の実施の形態を説明するための概略斜視図である。分離膜エレメントは、図４に示すように、中空糸膜（多孔性膜）で構成された分離膜束１８と上部樹脂封止層１９と下部樹脂封止層２０によって主に構成される。分離膜束１８は、上部樹脂封止層１９および下部樹脂封止層２０よって束状に接着・固定化されている。下部樹脂封止層２０による接着・固定化は、分離膜束１８の中空糸膜（多孔性膜）の中空部を封止しており、発酵培養液の漏出を防ぐ構造になっている。一方、上部樹脂封止層１９は、分離膜束１８の中空糸膜（多孔性膜）の内孔を封止しておらず、集水パイプ２２に濾液が流れる構造となっている。この分離膜エレメントは、支持フレーム２１を介して連続発酵装置内に設置することが可能である。分離膜束１８によって濾過された濾液は、中空糸膜の中空部を通り、集水パイプ２２を介して連続発酵装置外部に取り出される。透過水を取り出すための動力として、水頭差圧、ポンプ、液体や気体等による吸引濾過、あるいは装置系内を加圧するなどの方法を用いることができる。
【０１０５】
本発明の核酸の製造方法で用いられる連続発酵装置の分離膜エレメントを構成する部材は、高圧蒸気滅菌操作に耐性の部材であることが好ましい。連続発酵装置内が滅菌可能であれば、連続発酵時に好ましくない微生物による汚染の危険を回避することができ、より安定した連続発酵が可能となる。分離膜エレメントを構成する部材は、高圧蒸気滅菌操作の条件である、１２１℃で１５分間に耐性であることが好ましい。分離膜エレメント部材は、例えば、ステンレスやアルミニウムなどの金属、ポリアミド系樹脂、フッ素系樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリアセタール系樹脂、ポリブチレンテレフタレート系樹脂、ＰＶＤＦ、変性ポリフェニレンエーテル系樹脂およびポリサルホン系樹脂等の樹脂を好ましく選定できる。
【０１０６】
本発明の連続発酵による核酸の製造方法で用いられる連続発酵装置では、分離膜エレメントは、図１のように発酵反応槽内に設置しても良いし、図２のように発酵反応槽外に設置しても良い。分離膜エレメントを発酵反応槽外に設置する場合には、別途、膜分離槽を設けてその内部に分離膜エレメントを設置することができ、発酵反応槽と膜分離槽の間を発酵培養液を循環させながら、分離膜エレメントにより発酵培養液を連続的に濾過することができる。
【０１０７】
本発明の連続発酵による核酸の製造方法で用いられる連続発酵装置では、膜分離槽は、高圧蒸気滅菌可能であることが望ましい。膜分離槽が高圧蒸気滅菌可能であると、雑菌による汚染回避が容易である。
【０１０８】
本発明の連続発酵による核酸の製造方法に従って連続発酵を行った場合、従来のバッチ式の発酵と比較して、高い体積生産速度が得られ、極めて効率のよい発酵生産が可能となる。ここで、連続培養における発酵生産速度は、次の（式３）で計算される。
・発酵生産速度（ｇ／Ｌ／ｈｒ）＝抜き取り液中の生産物濃度（ｇ／Ｌ）×発酵培養液抜き取り速度（Ｌ／ｈｒ）÷装置の運転液量（Ｌ） ・・・・（式３）
また、バッチ式培養による発酵生産速度は、原料炭素源をすべて消費した時点の生産物量（ｇ）を、炭素源の消費に要した時間（ｈ）とその時点の発酵培養液量（Ｌ）で除して求められる。
【０１０９】
本発明の連続発酵による核酸の製造方法で得られる核酸のうち、イノシンとグアノシンは、それぞれ、主に核酸調味料として用いられるイノシン酸およびグアニル酸の原料として用いられている。イノシンからイノシン酸への変換、およびグアノシンからグアニル酸へ変換は、公知の方法を用いて行うことができる。例えば、酵素を用いる方法や有機化学的な方法により変換することができる。また、イノシンとグアノシンは、医薬中間体の原料としても用いられている。本発明の連続発酵による核酸の製造方法を用いることにより、これらの幅広い用途のある核酸を効率的に製造することができることから、より安価に核酸を提供することが可能となる。
【実施例】
【０１１０】
以下、本発明の連続発酵による核酸の製造方法をさらに詳細に説明するために、図１および図２の概略図に示す装置を用いることによる、連続的な核酸の発酵生産について、実施例を挙げて説明する。本発明はこれらの実施例に限定されない。
【０１１１】
下記の核酸の製造方法に関する実施例においては、核酸の例として、イノシンの発酵生産およびグアノシンの発酵生産の検討を行った。また、核酸を生産させる原核微生物の一例として、バチスル・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のうち、バチスル・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ１９２２１株（実施例１〜４、比較例１）、およびコリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）のうちコリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ２１４７９株（実施例５〜８、比較例２）を用いた。また、発酵原料のうち炭素源としては、グルコースを用い、窒素源や無機塩類など栄養源に関しては、下記の実施例で説明する原料を用いた。
【０１１２】
（実施例１）連続発酵による核酸の製造（その１）
図１に示す連続発酵装置を稼働させることにより、核酸が連続発酵で得られるかどうかを調べるため、同装置を用いた連続発酵試験を行った。培地には表１に示す培地を用い、１２１℃の温度、圧力１ｋｇ／ｃｍ２で、１５分間高圧蒸気滅菌処理して用いた。分離膜エレメント部材として、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成形品を用いた。分離膜には、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）を主成分とする後述の参考例１で作製した多孔性膜を用いた。この多孔質膜の平均細孔径は０.１μｍであり、純水透過係数は５０×１０-9ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａである。この実施例１における運転条件は、特に断らない限り下記のとおりである。
・発酵反応槽容量：１．５（Ｌ）
・膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
・使用分離膜：ＰＶＤＦ濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
・温度調整：３８（℃）
・ 発酵反応槽通気量：１０００（ｍＬ／ｍｉｎ）
・ 膜分離槽通気量：１０００（ｍＬ／ｍｉｎ）
・発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
・滅菌：分離膜エレメントを含む発酵反応槽、および使用培地高圧蒸気滅菌。
・ｐＨ調整：２５％アンモニア水溶液によりｐＨ６．７に調整
・ 膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御
（連続発酵開始後〜１５０時間：０．１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下で制御
１５０時間〜３００時間：０．１ｋＰａ以上２ｋＰａ以下で制御
３００時間〜４００時間：０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）
原核微生物としてバチスル・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ１９２２１株を用い、培地に表１に示す組成の核酸発酵培地を用いた。濾液に含まれるグアノシンおよびイノシンは、下記に示す条件でＨＰＬＣ法により各々の核酸量を測定することで確認した。
【０１１３】
［分析条件］
カラム：Ａｓａｈｉｐａｋ ＧＳ−２２０（７．６ｍｍＩＤ×５００ｍｍＬ）、緩衝液：０．２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ３．９８）リン酸にてｐＨ調整、温度：５５℃、流速：１．５ｍｌ／ｍｉｎ、検出：ＵＶ２５４ｎｍ、保持時間 （ｍｉｎ）：イノシン １６．１、グアノシン ２０．５。また、グルコース濃度の測定には、“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬社製）を用いた。
【０１１４】
【表１】
【０１１５】
まず、バチスル・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ１９２２１株を、５００ｍｌ容坂口フラスコ中で表１に示す前培養培地１００ｍｌを用いて２４時間、３７℃の温度で振とう培養した（前々々培養）。得られた前々々培養液を、ジャーファーメンターの前培養培地１．５Ｌに植菌し、１５時間、３７℃の温度で培養した（前々培養）。得られた前々培養液を、図１に示す連続発酵装置の１．５Ｌの前培養培地に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって１０００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１の通気量の調整と３０℃の温度に温度調整を行い、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、表１に示す連続培養培地の連続供給を行い、発酵培養液循環ポンプ１１によって発酵反応槽１と膜分離槽１２の間を循環させ、連続発酵装置の発酵培養液量を２Ｌとなるように膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵による核酸の製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置３により水頭差を膜間差圧として測定し、上記膜透過水量制御条件で変化させることで行った。適宜、膜透過濾液中の生産された核酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。連続発酵の期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下０．１ｋＰａ以上で推移した。また、核酸およびグルコース濃度から算出された投入グルコースから算出された核酸生産速度を、表３に示した。
【０１１６】
（実施例２）連続発酵による核酸の製造（その２）
実施例１と同様、図１に示す連続発酵装置を用いて核酸の製造を行った。この実施例２では、分離膜に参考例２で作成した分離膜を用い、膜透過水量制御を除くその他の条件は実施例１と同様の条件で核酸の製造を行った。
・ 膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御
（連続発酵開始後〜１００時間：０．１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下で制御
１００時間〜２００時間：０．１ｋＰａ以上２ｋＰａ以下で制御
２００時間〜３００時間：０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）
生産された核酸生産速度を、表３に示した。３００時間の発酵試験を行った結果、図１に示した連続発酵装置を用いることにより、安定した連続発酵による核酸の製造が可能であることを確認することができた。
【０１１７】
（実施例３）連続発酵による核酸の製造（その３）
図２に示す連続発酵装置を稼働させることにより、核酸が得られるかどうかを調べるため、同装置を用いた連続発酵試験を行った。培地には表１に示す培地を用い、１２１℃の温度、圧力１ｋｇ／ｃｍ２で、１５分間高圧蒸気滅菌処理して用いた。分離膜エレメント部材として、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成形品を用いた。分離膜には、実施例１と同じ多孔性膜を用いた。この多孔質膜の平均細孔径は０.１μｍであり、純水透過係数は５０×１０-9ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａである。この実施例３における運転条件は、特に断らない限り下記のとおりである。
・発酵反応槽容量：１．５（Ｌ）
・使用分離膜：ＰＶＤＦ濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
・温度調整：３８（℃）
・発酵反応槽通気量：１０００（ｍＬ／ｍｉｎ）
・発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
・滅菌：分離膜エレメントを含む発酵反応槽、および使用培地は総て高圧蒸気滅菌。
・ｐＨ調整：２５％ アンモニア水溶液によりｐＨ６．７に調整
・ 膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御
（連続発酵開始後〜１５０時間：０．１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下で制御
１５０時間〜３００時間：０．１ｋＰａ以上２ｋＰａ以下で制御
３００時間〜４００時間：０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）
まず、バチスル・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ１９２２１株を、坂口フラスコ中で表１に示す前培養培地１００ｍｌを用いて２４時間、３０℃の温度で振とう培養した（前々培養）。得られた前々培養液を、図２に示す連続発酵装置の１．５Ｌの前培養培地に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって８００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１の通気量の調整と３８℃の温度に温度調整を行い、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、連続発酵培地の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵培養液量を１．５Ｌとなるように膜透過水量の制御を行いながら連続培養することにより連続発酵による核酸の製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置３により水頭差を膜間差圧として測定し、上記膜透過水量制御条件で変化させることで行った。適宜、濾液中の生産された核酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。連続発酵期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下０．１ｋＰａ以上で推移した。また、核酸およびグルコース濃度から算出された投入グルコースから算出された核酸生産速度を、表３に示した。
【０１１８】
（実施例４）連続発酵による核酸の製造（その４）
実施例３と同様、図２に示す連続発酵装置を用いて核酸の製造を行った。この実施例４では、分離膜に参考例２で作成した分離膜を用い、膜透過水量制御を除くその他は実施例３と同様の条件で核酸の製造を行った。
・ 膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御
（連続発酵開始後〜１００時間：０．１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下で制御
１００時間〜２００時間：０．１ｋＰａ以上２ｋＰａ以下で制御
２００時間〜３００時間：０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）
生産された核酸の生産速度を、表３に示した。３００時間の発酵試験を行った結果、図２に示した連続発酵装置を用いることにより、安定した連続発酵による核酸の製造が可能であることを確認することができた。
【０１１９】
（実施例５）連続発酵による核酸の製造（その５）
図１に示す連続発酵装置を稼働させることにより、核酸が連続発酵で得られるかどうかを調べるため、同装置を用いた連続発酵試験を行った。培地には表２に示す培地を用い、１２１℃の温度、圧力１ｋｇ／ｃｍ２で、１５分間高圧蒸気滅菌処理して用いた。分離膜エレメント部材として、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成形品を用いた。分離膜には、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）を主成分とする後述の参考例１で作製した多孔性膜を用いた。この多孔質膜の平均細孔径は０.１μｍであり、純水透過係数は４５×１０-9ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａである。この実施例５における運転条件は、特に断らない限り下記のとおりである。
・発酵反応槽容量：１．５（Ｌ）
・膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
・使用分離膜：ＰＶＤＦ濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
・ 温度調整：３０（℃）
・ 発酵反応槽通気量：１０００（ｍＬ／ｍｉｎ）
・ 膜分離槽通気量：５００（ｍｌ／ｍｉｎ）
・発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
・滅菌：分離膜エレメントを含む発酵反応槽、および使用培地は総て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。
・ｐＨ調整：２５％ アンモニア水溶液によりｐＨ６．８に調整
・ 膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御
（連続発酵開始後〜１５０時間：０．１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下で制御
１５０時間〜３００時間：０．１ｋＰａ以上２ｋＰａ以下で制御
３００時間〜４００時間：０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）
原核微生物としてコリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ２１４７９株を用い、培地には表２に示す組成の核酸発酵培地を用いた。濾液に含まれるグアノシン、およびイノシン、グルコースは、実施例１と同様の方法により各々の核酸量を測定することで確認した。
【０１２０】
【表２】
【０１２１】
まず、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ２１４７９株を、坂口フラスコ中で表２に示す前培養培地１５０ｍｌを用いて２４時間、３０℃の温度で振とう培養した（前々培養）。得られた前々培養液を、図１に示す連続発酵装置の１Ｌの前培養培地に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって８００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１の通気量の調整と３０℃の温度に温度調整を行い、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、連続発酵培地の連続供給を行い、発酵培養液循環ポンプ１１によって発酵反応槽１と膜分離槽１２の間を循環させ、連続発酵装置の発酵培養液量を２Ｌとなるように膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵による核酸の製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置３により水頭差を膜間差圧として測定し、上記膜透過水量制御条件で変化させることで行った。適宜、膜透過濾液中の生産された核酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。連続発酵の期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下０．１ｋＰａ以上で推移した。また、核酸およびグルコース濃度から算出された投入グルコースから算出された核酸生産速度を、表４に示した。
【０１２２】
（実施例６）連続発酵による核酸の製造（その６）
実施例５と同様、図１に示す連続発酵装置を用いて核酸の製造を行った。この実施例６では、分離膜に参考例２で作成した分離膜を用い、膜透過水量制御を除くその他は実施例５と同様の条件で核酸の製造を行った。
・ 膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御
（連続発酵開始後〜１００時間：０．１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下で制御
１００時間〜２００時間：０．１ｋＰａ以上２ｋＰａ以下で制御
２００時間〜３００時間：０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）
生産された核酸の生産速度を、表４に示した。３００時間の発酵試験を行った結果、図２に示した連続発酵装置を用いることにより、安定した連続発酵による核酸の製造が可能であることを確認することができた。
【０１２３】
（実施例７）連続発酵による核酸の製造（その７）
図２に示す連続発酵装置を稼働させることにより、核酸がで得られるかどうかを調べるため、同装置を用いた連続発酵試験を行った。培地には表２に示す培地を用い、１２１℃の温度、圧力１ｋｇ／ｃｍ２で、１５分間高圧蒸気滅菌処理して用いた。分離膜エレメント部材として、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成形品を用いた。分離膜には、実施例１と同じ多孔性膜を用いた。この多孔質膜の平均細孔径は０.１μｍであり、純水透過係数は４５×１０-9ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａである。この本実施例７における運転条件は、特に断らない限り下記のとおりである。
・発酵反応槽容量：１．５（Ｌ）
・使用分離膜：ＰＶＤＦ濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
・温度調整：３０（℃）
・発酵反応槽通気量：１０００（ｍＬ／ｍｉｎ）
・発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
・滅菌：分離膜エレメントを含む発酵反応槽、および使用培地は総て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。
・ｐＨ調整：２５％ アンモニア水溶液によりｐＨ６．８に調整
・ 膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御
（連続発酵開始後〜１５０時間：０．１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下で制御
１５０時間〜３００時間：０．１ｋＰａ以上２ｋＰａ以下で制御
３００時間〜４００時間：０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）
原核微生物として、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ２１４７９株を用い、培地として表２に示す組成の核酸発酵培地を用いた。発酵液に含まれるグアノシン、およびイノシン、グルコースは、実施例１と同様の方法により各々の核酸量を測定することで確認した。
【０１２４】
まず、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ２１４７９株を、坂口フラスコ中で表２に示す前培養培地１５０ｍｌを用いて２４時間、３０℃の温度で振とう培養した（前々培養）。得られた前々培養液を、図１に示す連続発酵装置の１Ｌの前培養培地に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって８００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１の通気量の調整と３０℃の温度に温度調整を行い、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、連続発酵培地の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵培養液量を１．５Ｌとなるように膜透過水量の制御を行いながら連続培養することで連続発酵による核酸の製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置３により水頭差を膜間差圧として測定し、上記膜透過水量制御条件で変化させることで行った。適宜、濾液中の生産された核酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。連続発酵の期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下０．１ｋＰａ以上で推移した。また、核酸およびグルコース濃度から算出された投入グルコースから算出された核酸生産速度を、表４に示した。
【０１２５】
（実施例８）連続発酵による核酸の製造（その８）
実施例７と同様、図２に示す連続発酵装置を用いて核酸の製造を行った。この実施例８では、分離膜に参考例２で作成した分離膜を用い、膜透過水量制御を除くその他は実施例７と同様の条件で核酸の製造を行った。
・ 膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御
（連続発酵開始後〜１００時間：０．１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下で制御
１００時間〜２００時間：０．１ｋＰａ以上２ｋＰａ以下で制御
２００時間〜３００時間：０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）
生産された核酸の生産速度を、表４に示した。３００時間の発酵試験を行った結果、図２に示した連続発酵装置を用いることにより、安定した連続発酵による核酸の製造が可能であることを確認することができた。
【０１２６】
（比較例１）流加発酵による核酸の製造
現在採用されている微生物を用いた発酵形態として最も典型的な流加発酵を２Ｌ容のジャーファーメンターを用いて行い、その核酸生産性を評価した。培地には表１に示す連続発酵培地を用い、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌処理して用いた。この比較例１では、原核微生物としてバチスル・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ１９２２１株を用い、生産物である核酸の濃度の評価は、実施例１に示した方法を用いて評価し、グルコース濃度の測定には“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬社製）を用いた。この比較例１の運転条件は、下記のとおりである。
・発酵反応槽容量：２（Ｌ）
・温度調整：３８（℃）
・発酵反応槽通気量：１０００（ｍＬ／ｍｉｎ）
・発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：２５％ アンモニア水溶液によりｐＨ６．７に調整。
【０１２７】
まず、バチスル・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ１９２２１株を、５００ｍｌ容坂口フラスコ中で表１に示す前培養培地１００ｍｌを用いて２４時間、３７℃の温度で振とう培養した（前々培養）。得られた前々培養液をジャーファーメンターの前培養培地１Ｌに植菌し、１５時間、３８℃の温度で培養した（前培養）。前培養液に流加培養培地を経時的に投入して流加発酵を行った。流加培養培地の投入方法は、発酵培養液中のグルコース濃度が２ｇ／Ｌとなるように調整しながら投入した。９６時間の発酵を行い、核酸発酵能力の評価を行った。発酵の結果を、上記実施例１〜４の連続発酵試験で得られた核酸発酵生産性と比較して表３に示す。
【０１２８】
【表３】
【０１２９】
（比較例２）バッチ発酵による核酸の製造
現在採用されている微生物を用いた発酵形態として最も典型的なバッチ発酵を２Ｌ容のジャーファーメンターを用いて行い、その核酸生産性を評価した。培地には表２に示す連続発酵培地を用い、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌処理して用いた。この比較例２では、原核微生物としてコリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ２１４７９株を用い、生産物である核酸の濃度の評価は、実施例１に示した方法を用いて評価し、グルコース濃度の測定には“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬社製）を用いた。本比較例の運転条件を以下に示す。
・発酵反応槽容量：２（Ｌ）
・温度調整：３０（℃）
・発酵反応槽通気量：１０００（ｍＬ／ｍｉｎ）
・発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
・滅菌：分離膜エレメントを含む発酵反応槽、および使用培地は総て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。
・ｐＨ調整：２５％ アンモニア水溶液によりｐＨ６．８に調整。
【０１３０】
まず、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ２１４７９株を、坂口フラスコ中で表２に示す前培養培地１５０ｍｌを用いて２４時間、３０℃の温度で振とう培養した（前培養）。得られた前培養液をジャーファーメンターの１Ｌの表１に示す連続発酵培地に植菌し、バッチ発酵を行った。発酵開始後、５％のグルコースを添加して発酵を継続した。１２０時間のバッチ発酵の結果を、上記実施例５〜８の連続発酵試験で得られた核酸発酵生産性と比較して表４に示す。
【０１３１】
【表４】
【０１３２】
これらを比較した結果、図１および図２の連続発酵装置を用いることにより、核酸の生産速度が大幅に向上することを明らかになった。すなわち、本発明によって開示された多孔性膜を組み込んだ連続発酵装置を用い、膜間差圧を制御することにより、発酵培養液を分離膜によって濾液と未濾過液に分離し、濾液から所望の発酵生産物を回収するとともに、未濾過液を発酵培養液に戻す連続発酵方法を可能とし、微生物量を高く維持しながら、連続発酵による核酸の製造が可能であることが明らかとなった。
【０１３３】
（参考例１）多孔性膜の作製（その１）
樹脂としてポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）樹脂を、また溶媒としてＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）をそれぞれ用い、これらを９０℃の温度下に十分に攪拌し、次の組成を有する原液を得た。
・ＰＶＤＦ：１３．０重量％
・ＤＭＡｃ：８７．０重量％
次に、上記原液を２５℃の温度に冷却した後、あらかじめガラス板上に貼り付けて置いた、密度が０．４８ｇ／ｃｍ3で、厚みが２２０μｍのポリエステル繊維製不織布（多孔質基材）に塗布し、直ちに次の組成を有する２５℃の温度の凝固浴中に５分間浸漬して、多孔質基材に多孔質樹脂層が形成された多孔性膜を得た。
・水 ：３０．０重量％
・ＤＭＡｃ：７０．０重量％
この多孔性膜をガラス板から剥がした後、８０℃の温度の熱水に３回浸漬してＤＭＡｃを洗い出し、分離膜を得た。多孔質樹脂層表面の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内を、倍率１０，０００倍で走査型電子顕微鏡観察を行ったところ、観察できる細孔すべての直径の平均は０．１μｍであった。次に、上記分離膜について純水透水透過係数を評価したところ、５０×１０-9ｍ3／ｍ2／ｓ／Ｐａであった。純水透水量の測定は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで行った。また、平均細孔径の標準偏差 は０．０３５μｍで、膜表面粗さは０．０６μｍであった。
【０１３４】
（参考例２）多孔性膜の作製（その２）
重量平均分子量４１．７万のフッ化ビニリデンホモポリマーとγ-ブチロラクトンとを、それぞれ３８重量％と６２重量％の割合で１７０℃の温度で溶解し原液を作製した。この原液をγ-ブチロラクトンを中空部形成液体として随拌させながら口金から吐出し、温度２０℃のγ-ブチロラクトン８０重量％水溶液からなる冷却浴中で固化して中空糸膜を作製した。
【０１３５】
次いで、重量平均分子量２８．４万のフッ化ビニリデンホモポリマーを１４重量％、セルロースアセテートプロピオネート（イーストマンケミカル社、ＣＡＰ４８２−０．５）を１重量％、Ｎ-メチル-２-ピロリドンを７７重量％、ポリオキシエチレンヤシ油脂肪酸ソルビタン（三洋化成株式会社製、商品名“イオネットＴ−２０Ｃ”（登録商標））を５重量％、および水を３重量％の割合で９５℃の温度で混合溶解して原液を調整した。この原液を、上記で得られた中空糸膜の表面に均一に塗布し、すぐに水浴中で凝固させた本発明で用いる中空糸膜（多孔性膜）を製作した。得られた中空糸膜（分離膜）の被処理水側表面の平均細孔径は、０．０５μｍであった。次に、上記の分離膜である中空糸多孔性膜について純水透水量を評価したところ、５．５×１０-9ｍ3／ｍ2・ｓ・Ｐａであった。透水量の測定は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで行った。また、平均細孔径の標準偏差 は０．００６μｍであった。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】図１は、本発明で用いられる膜分離型連続発酵装置の一つの実施の形態を説明するための概略側面図である。
【図２】図２は、本発明で用いられる他の膜分離型連続発酵装置の一つの実施の形態を説明するための概略側面図である。
【図３】図３は、本発明で用いられる分離膜エレメントの一つの実施の形態を説明するための概略斜視図である。
【図４】図４は、本発明で用いられる他の分離膜エレメントの一つの実施の形態を説明するための概略斜視図である。
【符号の説明】
【０１３７】
１ 発酵反応槽
２ 分離膜エレメント
３ 水頭差制御装置
４ 気体供給装置
５ 攪拌機
６ レベルセンサ
７ 培地供給ポンプ
８ ｐＨ調整溶液供給ポンプ
９ ｐＨセンサ・制御装置
１０ 温度調節器
１１ 発酵培養液循環ポンプ
１２ 膜分離槽
１３ 支持板
１４ 流路材
１５ 分離膜
１６ 凹部
１７ 集水パイプ
１８ 分離膜束
１９ 上部樹脂封止層
２０ 下部樹脂封止層
２１ 支持フレーム
２２ 集水パイプ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸を生産する能力のある原核微生物の発酵培養液から、目詰まりが生じにくい多孔性膜を通して核酸を含む液を効率よく濾過・回収すること、および未濾過液を前記の発酵培養液に戻すことにより発酵に関与する微生物濃度を向上させ、高い生産性を得ることができる連続発酵による核酸の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
微生物や培養細胞の培養を伴う物質生産方法である発酵法は、大きく（１）バッチ発酵法（Ｂａｔｃｈ発酵法）および流加発酵法（Ｆｅｄ−Ｂａｔｃh発酵法）と、（２）連続発酵法とに分類することができる。
【０００３】
上記（１）のバッチ発酵法および流加発酵法は、設備的には簡素であり短時間で培養が終了し、雑菌汚染による被害が少ないという利点がある。しかしながら、時間経過と共に培養液中の生産物濃度が高くなり、浸透圧あるいは生産物阻害等の影響により生産性および収率が低下してくる。そのため、長時間にわたり安定して高収率かつ高生産性を維持することが困難である。一方、上記（２）の連続発酵法は、発酵槽内で目的物質が高濃度に蓄積されることを回避することによって、長時間にわたって高収率でかつ高生産性を維持することができるという利点がある。
【０００４】
次に、核酸とその製造方法に関する技術背景について説明する。核酸は、主に核酸系調味料として用いられている。具体的に、核酸は核酸系調味料の主成分の一つであるイノシン酸ナトリウムとして用いられており、かつお節のうま味成分として知られている。イノシン酸ナトリウムは核酸のイノシンを原料として製造されており、その需要は大きい。また、核酸系調味料のもう一つの主成分は、グアニル酸ナトリウムであり、しいたけのうま味成分として有名である。グアニル酸ナトリウムは核酸のグアノシンを原料として製造されており、その需要も大きい。また、イノシンとグアノシンは、医薬中間体としても用途がある。また、核酸のウリジンは、核酸系抗ウィルス薬などの医薬品の合成原料としての用途がある。また、核酸のシチジンは、医薬品であるＣＤＰ―コリンの合成原料として大きな需要がある。したがって、これらの核酸を効率的に製造することができれば、上記需要に対する核酸供給が更に容易になることが期待できる。
【０００５】
現在、イノシンは、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスの変異株あるいはバチルス・サチルスの変異株を用いた発酵法によって製造されている。グアノシン、ウリジンおよびシチジンは、主にバチルス・サチルスの変異株によって生産されている。また、イノシンとグアノシンの混合物がバチルス・サチルスの変異株によって生産されており、生産菌の育種に関しては多くの検討がなされている（非特許文献１参照。）。
【０００６】
一方、核酸の発酵生産性能を向上させるための発酵プロセスの検討も行われている（非特許文献２参照。）。また、イノシンあるいはグアノシンの生産性を向上させるために流加発酵法に関する技術が提案されている（特許文献１参照。）が、この流加発酵においても、発酵槽容量を超えて原料を流加することができないことから、生産性能の向上には限界がある。また、限られた容量の発酵槽において生産性能を高くするためには、流加する原料の濃度を高く設定する必要があるが、原料の調整等に労力を要する等の不具合を内包している。
【０００７】
このように、核酸の発酵生産において、効率的な核酸の製造を目的とした生産性能の向上に向けた様々な検討が行われており、核酸発酵の一層の技術革新が望まれていた。
【非特許文献１】財団法人バイオインダストリー協会 発酵と代謝研究会編、「発酵ハンドブック」、６４−６５、共立出版（２００１）
【非特許文献２】アドバンシス・イン・バイオケミカル・エンジニアリング／バイオテクノロジー（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、８７巻、９７−１５０）、２００４年
【特許文献１】米国特許４５７８３３６号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで本発明の目的は、簡便な操作方法で、長時間にわたり安定して高生産性を維持することができる連続発酵法による核酸の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意研究の結果、微生物や細胞の分離膜内への侵入が少なく、微生物や細胞を膜間差圧が低い条件で培養液を濾過した場合に、分離膜の目詰まりが著しく抑制されることを見出し、分離膜を用いた連続発酵を行うことにより、課題であった核酸の発酵生産性能が飛躍的に向上することを発見し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明の核酸の製造方法は、核酸を生産する能力を有する原核微生物の発酵培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を前記の発酵培養液に保持または還流し、かつ、その原核微生物の発酵原料を前記の発酵培養液に追加する連続発酵により核酸を製造する方法であって、前記の分離膜として平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の細孔を有する多孔性膜を用い、その膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲にして濾過処理することを特徴とする連続発酵による核酸の製造方法である。
【００１１】
具体的に本発明は、発酵培養液を分離膜によって濾液と未濾過液に分離し、その濾液から所望の発酵生産物である核酸を回収するとともに、その未濾過液を発酵培養液に保持または還流させる連続発酵方法による核酸の製造方法であって、高い透過性と高い細胞阻止率を持ち閉塞しにくい上記特定の多孔性分離膜を利用すると共に上記特定の低い膜間差圧で濾過処理することにより、安定に低コストで、発酵生産効率を著しく向上させる核酸の製造方法を提供するものである。
【００１２】
本発明の連続発酵による核酸の製造方法の好ましい態様によれば、前記の多孔性膜の純水透過係数は、２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上６×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下である。
【００１３】
本発明の連続発酵による核酸の製造方法の好ましい態様によれば、前記の多孔性膜の平均細孔径は０.０１μｍ以上０.２μｍ未満であり、その平均細孔径の標準偏差は０.１μｍ以下であり、その膜表面粗さは０.１μｍ以下である。
【００１４】
本発明の連続発酵による核酸の製造方法の好ましい態様によれば、前記の多孔性膜は多孔性樹脂層を含む多孔性膜であり、多孔性樹脂層は有機高分子膜からなるものである。
【００１５】
本発明の連続発酵による核酸の製造方法の好ましい態様によれば、前記の多孔性膜の素材にポリフッ化ビニリデン系樹脂が用いられることである。
【００１６】
本発明の連続発酵による核酸の製造方法の好ましい態様によれば、前記の原核微生物の培養液および発酵原料は糖類を含むことである。
【００１７】
本発明の連続発酵による核酸の製造方法の好ましい態様によれば、前記の核酸はイノシンまたはグアノシンである。
【００１８】
本発明の連続発酵による核酸の製造方法の好ましい態様によれば、前記の原核微生物は、核酸を生産する能力のある原核微生物であり、その核酸を生産する能力のある原核微生物はアデニン要求性であり、ヌクレオシダーゼ活性を持たない原核微生物である。
【００１９】
本発明の連続発酵による核酸の製造方法の好ましい態様によれば、前記の核酸はシチジンであり、シチジン生産能力のある原核微生物はシチジンデアミナーゼ活性を持たない原核微生物である。
【００２０】
本発明の連続発酵による核酸の製造方法の好ましい態様によれば、前記の原核微生物は、バチルス属（Ｇｅｎｕｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する原核微生物である。
【００２１】
本発明の連続発酵による核酸の製造方法の好ましい態様によれば、前記の原核微生物は、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。
【００２２】
本発明の連続発酵による核酸の製造方法の好ましい態様によれば、前記の原核微生物は、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ株である。
【００２３】
本発明の連続発酵による核酸の製造方法の好ましい態様によれば、前記の原核微生物は、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する原核微生物である。
【００２４】
本発明の連続発酵による核酸の製造方法の好ましい態様によれば、前記の原核微生物は、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）である。
【００２５】
本発明の連続発酵による核酸の製造方法の好ましい態様によれば、前記の原核微生物は、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ株である。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、簡便な操作条件で、長時間にわたり安定して所望の発酵生産物の高生産性を維持する連続発酵が可能となり、広く発酵工業において、発酵生産物である核酸を低コストで安定に生産することが可能となる。本発明の連続発酵による核酸の製造方法により得られた核酸は、例えば、核酸調味料や医薬品の原料として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明は、核酸を生産する能力のある原核微生物の培養液を、分離膜で濾過して濾液と未濾過液に分離し濾液から生産物を回収すると共に未濾過液を前記培養液に保持または還流し、かつ、その原核微生物の発酵原料を前記の培養液に追加する連続発酵であって、前記の分離膜として平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の細孔を有する多孔性膜を用い、その膜間差圧を０.１以上２０ｋＰａ未満にして濾過処理することを特徴とする連続発酵による核酸の製造方法である。
【００２８】
本発明において分離膜として用いられる多孔性膜は、発酵に使用される原核微生物による目詰まりが起こりにくく、かつ、濾過性能が長期間安定に継続する性能を有するものであることが望ましい。そのため、本発明で使用される多孔性膜は、その平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満であることが重要である。
【００２９】
次に、本発明で分離膜として用いられる多孔性膜の構成について説明する。本発明における多孔性膜は、被処理水の水質や用途に応じた分離性能と透水性能を有するものであり、阻止性能および透水性能や耐汚れ性という分離性能の点からは、多孔質樹脂層を含む多孔性膜であることが好ましい。このような多孔性膜は、多孔質基材の表面に、分離機能層として作用とする多孔質樹脂層を有している。多孔質基材は、多孔質樹脂層を支持して分離膜としての多孔性膜に強度を与えるものである。
【００３０】
多孔質基材の材質は、有機材料および／または無機材料等からなり、中でも有機繊維が望ましく用いられる。好ましい多孔質基材は、セルロース繊維、セルローストリアセテート繊維、ポリエステル繊維、ポリプロピレン繊維およびポリエチレン繊維などの有機繊維を用いてなる織布や不織布であり、中でも、密度の制御が比較的容易であり製造も容易で安価な不織布が好ましく用いられる。多孔質基材の平均厚みは、好ましくは５０μｍ以上３０００μｍ以下である。
【００３１】
また、多孔質樹脂層は、上述したように分離機能層として作用するものであり、有機高分子膜を好適に使用することができる。有機高分子膜の材質としては、例えば、ポリエチレン系樹脂、ポリプロピレン系樹脂、ポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂、ポリアクリロニトリル系樹脂、セルロース系樹脂およびセルローストリアセテート系樹脂などが挙げられる。有機高分子膜は、これらの樹脂を主成分とする樹脂の混合物からなるものであってもよい。ここで主成分とは、その成分が５０重量％以上、好ましくは６０重量％以上含有することをいう。中でも、多孔性膜を構成する多孔質樹脂層の素材としては、溶液による製膜が容易で物理的耐久性や耐薬品性にも優れているポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂およびポリアクリロニトリル系樹脂が好ましく、ポリフッ化ビニリデン系樹脂またはそれを主成分とする樹脂が最も好ましく用いられる。
【００３２】
ここで、ポリフッ化ビニリデン系樹脂としては、フッ化ビニリデンの単独重合体が好ましく用いられるが、その他、フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体との共重合体も好ましく用いられる。フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体としては、テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロピレンおよび三塩化フッ化エチレンなどが例示される。
【００３３】
本発明で用いられる多孔性膜の作成法の概要を説明する。まず、上述した多孔質基材の表面に、上述した樹脂と溶媒とを含む原液の被膜を形成するとともに、その原液を多孔質基材に含浸させる。しかる後、被膜を有する多孔質基材の被膜側表面のみを、非溶媒を含む凝固浴と接触させて樹脂を凝固させると共に多孔質基材の表面に多孔質樹脂層を形成する。原液にさらに非溶媒を含ませることもできる。原液の温度は、製膜性の観点から、通常、１５〜１２０℃の範囲内で選定することが好ましい。
【００３４】
ここで、原液には、開孔剤を添加することもできる。開孔剤は、凝固浴に浸漬された際に抽出されて、樹脂層を多孔質にする作用を持つものである。開孔剤を添加することにより、平均細孔径の大きさを制御することができる。開孔剤は、凝固浴に浸漬された際に抽出されて、樹脂層を多孔質にする作用を持つものである。開孔剤は、凝固浴への溶解性の高いものであることが好ましい。開孔剤としては、例えば、塩化カルシウムや炭酸カルシウムなどの無機塩を用いることができる。また、開孔剤として、ポリエチレングリコールやポリプロピレングリコールなどのポリオキシアルキレン類や、ポリビニルアルコール、ポリビニルブチラールおよびポリアクリル酸などの水溶性高分子化合物や、グリセリンを用いることができる。
【００３５】
また、溶媒は、樹脂を溶解するものである。溶媒は、樹脂および開孔剤に作用してそれらが多孔質樹脂層を形成するのを促す。このような溶媒としては、Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトンおよびメチルエチルケトンなどを用いることができる。中でも、樹脂の溶解性の高いＮＭＰ、ＤＭＡｃ、ＤＭＦおよびＤＭＳＯを好ましく用いられる。
【００３６】
さらに、原液には、非溶媒を添加することもできる。非溶媒は、樹脂を溶解しない液体である。非溶媒は、樹脂の凝固の速度を制御して細孔の大きさを制御するように作用する。非溶媒としては、水やメタノールおよびエタノールなどのアルコール類を用いることができる。中でも、価格の点から水やメタノールが好ましい。非溶媒は、これらの混合物であってもよい。
【００３７】
本発明で用いられる多孔性膜は、平膜であっても中空糸膜であっても良い。平膜の場合、その平均厚みは用途に応じて選択されるが、好ましくは２０μｍ以上５０００μｍ以下であり、より好ましくは５０μｍ以上２０００μｍ以下の範囲で選択される。
【００３８】
上述のように、本発明で分離膜として用いられる多孔性膜は、多孔質基材と多孔質樹脂層とから形成されている多孔性膜であることが望ましい。その際、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していても、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していなくてもどちらでも良く、用途に応じて選択される。多孔質基材の平均厚みは、好ましくは５０μｍ以上３０００μｍ以下の範囲で選択される。また、多孔性膜が中空糸膜の場合、中空糸の内径は好ましくは２００μｍ以上５０００μｍ以下の範囲で選択され、膜厚は好ましくは２０μｍ以上２０００μｍ以下の範囲で選択される。また、有機繊維または無機繊維を筒状にした織物や編物を中空糸膜の内部に含んでいても良い。
【００３９】
次にまず、多孔性膜のうち、平膜の作成法の概要について説明する。
【００４０】
多孔質基材の表面に、樹脂と溶媒とを含む原液の被膜を形成すると共に、その原液を多孔質基材に含浸させる。その後、被膜を有する多孔質基材の被膜側表面のみを、非溶媒を含む凝固浴と接触させて樹脂を凝固させると共に、多孔質基材の表面に多孔質樹脂層を形成する。
【００４１】
原液は、樹脂を溶媒に溶解させて調整する。原液の温度は、製膜性の観点から、通常、５〜１２０℃の範囲内で選定することが好ましい。溶媒は、樹脂を溶解するものであり、樹脂に作用してそれらが多孔質樹脂層を形成するのを促すものである。溶媒としては、Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ −メチル− ２− ピロリドン、メチルエチルケトン、テトラヒドロフラン、テトラメチル尿素、リン酸トリメチル、シクロヘキサノン、イソホロン、γ −ブチロラクトン、メチルイソアミルケトン、フタル酸ジメチル、プロピレングリコールメチルエーテール、プロピレンカーボネート、ジアセトンアルコール、グリセロールトリアセテート、アセトンおよびメチルエチルケトンなどを用いることができる。なかでも、樹脂の溶解性の高いＮ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が好ましく用いられる。これらの溶媒は、単独で用いても良いし２種類以上を混合して用いても良い。原液は、先述の樹脂を好ましくは５重量％以上６０重量％以下の濃度で、上述の溶媒に溶解させることにより調整することができる。
【００４２】
また、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンおよびグリセリンなどの溶媒以外の成分を溶媒に添加しても良い。溶媒に非溶媒を添加することもできる。非溶媒は、樹脂を溶解しない液体である。非溶媒は、樹脂の凝固の速度を制御して細孔の大きさを制御するように作用する。非溶媒としては、水や、メタノールおよびエタノールなどのアルコール類を用いることができる。なかでも、非溶媒として、価格の点から水やメタノールが好ましく用いられる。溶媒以外の成分および非溶媒は、混合物であってもよい。
【００４３】
原液には、開孔剤を添加することもできる。開孔剤は、凝固浴に浸漬された際に抽出されて、樹脂層を多孔質にする作用を持つものである。開孔剤を添加することにより、平均細孔径の大きさを制御することができる。開孔剤は、凝固浴への溶解性の高いものであることが好ましい。開孔剤としては、例えば、塩化カルシウムや炭酸カルシウムなどの無機塩を用いることができる。また、開孔剤として、ポリエチレングリコールやポリプロピレングリコールなどのポリオキシアルキレン類や、ポリビニルアルコール、ポリビニルブチラールおよびポリアクリル酸などの水溶性高分子化合物や、グリセリンを用いることができる。
【００４４】
次に、多孔性膜のうち、中空糸膜の作成法の概要について説明する。
【００４５】
中空糸膜は、樹脂と溶媒からなる原液を二重管式口金の外側の管から吐出すると共に、中空部形成用流体を二重管式口金の内側の管から吐出して、冷却浴中で冷却固化して作製することができる。
【００４６】
原液は、上述の平膜の作成法で述べた樹脂を好ましくは２０重量％以上６０重量％以下の濃度で、上述の平膜の生成法で述べた溶媒に溶解させることにより調整することができる。また、中空部形成用流体には、通常気体もしくは液体を用いることができる。また、得られた中空糸膜の外表面に、新たな多孔性樹脂層をコーティング（積層）することもできる。積層は中空糸膜の性質、例えば、親水性・疎水性あるいは細孔径等を所望の性質に変化させるために行うことができる。積層される新たな多孔性樹脂層は、樹脂を溶媒に溶解させた原液を、非溶媒を含む凝固浴と接触させて樹脂を凝固させることによって作製することができる。その樹脂の材質は、例えば、上述有機高分子膜の材質と同様のものが好ましく用いられる。また、積層方法としては、原液に中空糸膜を浸漬してもよいし、中空糸膜の表面に原液を塗布してもよく、積層後、付着した原液の一部を掻き取ったり、エアナイフを用いて吹き飛ばしすることにより積層量を調整することもできる。
【００４７】
本発明で用いられる多孔性膜は、支持体と組み合わせることによって分離膜エレメントとすることができる。支持体として支持板を用い、その支持板の少なくとも片面に、本発明で用いられる多孔性膜を配した分離膜エレメントは、本発明で用いられる多孔性膜を有する分離膜エレメントの好適な形態の一つである。この形態で、膜面積を大きくすることが困難な場合には、透水量を大きくするために、支持板の両面に多孔性膜を配することも好ましい態様である。
【００４８】
分離膜としての多孔性膜の平均細孔径が上記のように０．０１μｍ以上１μｍ未満の範囲内にあると、菌体がリークすることのない高い排除率と、高い透水性を両立させることができ、さらに目詰まりをしにくく、透水性を長時間保持することが、より高い精度と再現性を持って実施することができる。原核微生物として細菌類を用いた場合、多孔性膜の平均細孔径は好ましくは０.４μｍ以下であり、平均細孔径は０.２μｍ未満であればなお好適に実施することが可能である。平均細孔径は、小さすぎると透水量が低下することがあるので、本発明では、平均細孔径は０.０１μｍ以上であり、好ましくは０．０２μｍ以上であり、さらに好ましくは０．０４μｍ以上である。
【００４９】
ここで、平均細孔径は、倍率１０，０００倍の走査型電子顕微鏡観察における、９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔すべての直径を測定し、平均することにより求めることができる。
【００５０】
また、上記の平均細孔径の標準偏差σは、０．１μｍ以下であることが好ましい。更に、平均細孔径の標準偏差が小さい、すなわち細孔径の大きさが揃っている方が均一な透過液を得ることができ、発酵運転管理が容易になることから、平均細孔径の標準偏差は小さければ小さい方が望ましい。
【００５１】
平均細孔径の標準偏差σは、上述の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔数をＮとして、測定した各々の直径をＸｋとし、細孔直径の平均をＸ（ａｖｅ）とした下記の（式１）により算出される。
【００５２】
【数１】
【００５３】
本発明で用いられる多孔性膜においては、発酵培養液の透過性が重要点の一つであり、透過性の指標として、使用前の多孔性膜の純水透過係数を用いることができる。本発明において、多孔性膜の純水透過係数は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで透水量を測定し算出したとき、２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上であることが好ましい。純水透過係数が２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上６×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下であれば、実用的に十分な透過水量が得られる。より好ましい純水透過係数は、２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上１×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下である。
【００５４】
本発明で用いられる多孔性膜の膜表面粗さは、分離膜の目詰まりに影響を与える因子である。好ましくは膜表面粗さが０.１μｍ以下のときに分離膜の剥離係数や膜抵抗を好適に低下させることができ、より低い膜間差圧で連続発酵が実施可能である。従って、目詰まりを抑えることにより安定した連続発酵が可能になることから、表面粗さは小さければ小さいほど好ましい。
【００５５】
また、多孔性膜の膜表面粗さを低くすることにより、原核微生物の濾過において、膜表面で発生する剪断力を低下させることが期待でき、原核微生物の破壊が抑制され、多孔性膜の目詰まりも抑制されることにより、長期間安定な濾過が可能になると考えられる。
【００５６】
ここで、膜表面粗さは、下記の原子間力顕微鏡装置（ＡＦＭ）を使用して、下記の装置と条件で測定することができる。
・装置：原子間力顕微鏡装置(Digital Instruments（株）製Nanoscope IIIa)
・条件：探針 SiNカンチレバー(Digital Instruments（株）製)
：走査モード コンタクトモード（気中測定）
水中タッピングモード（水中測定）
：走査範囲 １０μm、２５μm 四方（気中測定）
５μm、１０μm 四方（水中測定）
：走査解像度 ５１２×５１２
・試料調製 測定に際し膜サンプルは、常温でエタノールに１５分浸漬後、ＲＯ水中に２４時間浸漬し洗浄した後、風乾し用いた。ＲＯ水とは、ろ過膜の一種である逆浸透膜（ＲＯ膜）を用いてろ過し、イオンや塩類などの不純物を排除した水を指す。ＲＯ膜の孔の大きさは、概ね２ｎｍ以下である。
【００５７】
膜表面粗さｄｒｏｕｇｈは、上記ＡＦＭにより各ポイントのＺ軸方向の高さから、下記の（式２）により算出する。
【００５８】
【数２】
【００５９】
本発明において、原核微生物を分離膜で濾過処理する際の膜間差圧は、原核微生物および培地成分が容易に目詰まりしない条件であればよいが、膜間差圧を０.１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下の範囲にして濾過処理することが重要である。膜間差圧は好ましくは０.１ｋＰａ以上１０ｋＰａ以下の範囲であり、さらに好ましくは０.１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下の範囲である。上記の膜間差圧０.１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下の範囲を外れた場合、原核微生物および培地成分の目詰まりが急速に発生し、透過水量の低下を招き、連続発酵運転に不具合を生じることがある。
【００６０】
濾過の駆動力としては、発酵培養液と多孔性膜処理水の液位差（水頭差）を利用したサイホンにより多孔性膜に膜間差圧を発生させることが可能である。また、濾過の駆動力として多孔性膜処理水側に吸引ポンプを設置してもよいし、多孔性膜の発酵培養液側に加圧ポンプを設置することも可能である。膜間差圧は、発酵培養液と多孔性膜処理水の液位差を変化させることにより制御することができる、また、膜間差圧を発生させるためにポンプを使用する場合には、吸引圧力により膜間差圧を制御することができ、更に発酵培養液側の圧力を導入する気体または液体の圧力によっても膜間差圧を制御することができる。これら圧力制御を行う場合には、発酵培養液側の圧力と多孔性膜処理水側の圧力差をもって膜間差圧とし、膜間差圧の制御に用いることができる。
【００６１】
また、本発明において使用される多孔性膜は、濾過処理する膜間差圧として、０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下の範囲で濾過処理することができる性能を有するものであることが好ましい。また、本発明で使用される多孔性膜は、上述のように、使用前の純水透過係数が、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで透水量を測定し算出したとき、２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上の範囲であることが好ましく、さらに２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上６×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下の範囲にあることが好ましい。
【００６２】
本発明で使用される原核微生物の発酵原料としては、発酵培養する原核微生物の生育を促し、目的とする発酵生産物である核酸を良好に生産させ得るものであれば良い。発酵原料としては、例えば、炭素源、窒素源、無機塩類、および必要に応じてアミノ酸、およびビタミンなどの有機微量栄養素を適宜含有する液体培地等が好ましく用いられる。
【００６３】
上記の炭素源としては、例えば、グルコース、シュークロース、フラクトース、ガラクトース、ラクトース等の糖類、これら糖類を含有する澱粉糖化液、甘藷糖蜜、甜菜糖蜜、ハイテストモラセス、サトウキビ搾汁、更には酢酸、フマル酸等の有機酸、エタノールなどのアルコール類、およびグリセリン等が使用される。ここで糖類とは、多価アルコールの最初の酸化生成物であり、アルデヒド基またはケトン基をひとつ持ち、アルデヒド基を持つ糖をアルドース、ケトン基を持つ糖をケトースと分類される炭水化物のことを指す。
【００６４】
また、上記の窒素源としては、例えば、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば、油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、ビタミン類、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種発酵菌体およびその加水分解物などが使用される。
【００６５】
また、上記の無機塩類としては、例えば、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩およびマンガン塩等を適宜添加使用することができる。
【００６６】
本発明で使用される原核微生物が生育のために特定の栄養素を必要とする場合には、その栄養物を標品もしくはそれを含有する天然物として添加することができる。また、消泡剤も必要に応じて添加使用することができる。
【００６７】
本発明において、発酵培養液とは、発酵原料に原核微生物が増殖した結果得られる液のことを言い、追加する発酵原料の組成は、培養開始時の発酵原料組成から適宜変更しても良い。発酵原料組成から追加する発酵原料の組成に変更する場合、目的とする核酸の生産性が高くなるような変更が好ましい。例えば、上記炭素源に対する窒素源、無機塩類、アミノ酸およびビタミンなどの有機微量栄養素の重量比率を低下させることにより、核酸の生産コストの低減、すなわち広義で核酸の生産性の向上が実現できる場合もある。一方、上記炭素源に対する窒素源、無機塩類、アミノ酸およびビタミンなどの有機微量栄養素の重量比率を増加させることにより、核酸の生産性を向上させることができる場合もある。
【００６８】
本発明では、発酵培養液中の糖類など発酵原料の濃度は、５ｇ／Ｌ以下に保持されるようにすることが好ましい。その理由は、発酵培養液の引き抜きによる発酵原料の流失を最小限にするためである。そのため発酵原料の濃度は、可能な限り小さいことが望ましい。
【００６９】
微生物の発酵培養は、通常、ｐＨが４〜８で温度が２０〜４０℃の範囲で行われることが多い。発酵培養液のｐＨは、無機の酸または有機の酸、アルカリ性物質、さらには尿素、炭酸カルシウムおよびアンモニアガスなどによって、上記範囲内のあらかじめ定められた値に調節される。
【００７０】
原核微生物の培養において、酸素の供給速度を上げる必要があれば、空気に酸素を加えて酸素濃度を例えば２１％以上に保つ、発酵培養液を加圧する、攪拌速度を上げる、あるいは通気量を上げるなどの手段を用いることができる。逆に、酸素の供給速度を下げる必要があれば、炭酸ガス、窒素およびアルゴンなど酸素を含まないガスを空気に混合して供給することも可能である。
【００７１】
本発明においては、培養初期にＢａｔｃｈ培養またはＦｅｄ−Ｂａｔｃｈ培養を行って微生物濃度を高くした後に連続培養（引き抜き）を開始しても良いし、高濃度の菌体をシードし、培養開始とともに連続培養を行っても良い。適当な時期から、発酵原料液の供給および培養物の引き抜きを行うことが可能である。発酵原料液供給と培養物の引き抜きの開始時期は、必ずしも同じである必要はない。また、発酵原料液の供給と培養物の引き抜きは連続的であってもよいし、間欠的であってもよい。発酵原料液には、上記に示したような菌体増殖に必要な栄養素を添加し、菌体増殖が連続的に行われるようにすればよい。
【００７２】
発酵培養液中の原核微生物の濃度は、効率よい生産性を得る上で、発酵培養液の環境が微生物の増殖にとって不適切となって死滅する比率が高くならない範囲で、高い状態で維持することが好ましい。一例として、濃度を乾燥重量として５ｇ／Ｌ以上に維持することにより、より良好な生産効率が得られる。また、連続発酵装置の運転上の不具合や生産効率の低下を招かなければ、原核微生物の濃度の上限値は特に限定されない。
【００７３】
発酵生産能力のあるフレッシュな菌体を増殖させつつ行う連続培養操作は、培養管理上、通常、単一の発酵反応槽で行うことが好ましい。しかしながら、菌体を増殖しつつ生産物を生成する連続培養法であれば、発酵反応槽の数は問わない。発酵反応槽の容量が小さい等の理由から、複数の発酵反応槽を用いることもあり得る。この場合、複数の発酵反応槽を配管で並列または直列に接続して連続培養を行っても、発酵生産物の高生産性は得られる。
【００７４】
本発明においては、原核微生物を発酵反応槽に維持したままで、発酵反応槽からの発酵培養液の連続的かつ効率的な抜き出しが可能となることから、原核微生物を連続的に培養し、十分な増殖を確保した後に発酵原料液組成を変更し、目的とする化学品を効率よく製造することも可能である。
【００７５】
本発明により得られる核酸とは、塩基と糖からなるヌクレオシド、あるいは塩基と糖とリン酸からなるヌクレオチドのことである。ヌクレオシドとは、塩基と糖が結合した化合物の一種であり、塩基としては、アデニンやグアニンなどのプリン塩基、チミン、シトシン、ウラシルなどのピリミジン塩基、ニコチンアミドおよびジメチルイソアロキサジンなどが挙げられる。また、糖としては、デオキシリボースやリボースが結合した化合物が挙げられる。
【００７６】
また、ヌクレオチドとは、ヌクレオシドにリン酸基が結合した化合物のことである。糖の違いによって、リボースを持つデオキシリボ核酸と２−デオキシリボースを持つリボ核酸とがある。更に、本発明により得られる核酸には、これらヌクレオチドの糖の１'位の塩基（核酸塩基）が結合し、さらに糖の３'位と隣の糖の５'位はリン酸エステル構造で結合し、その結合が繰り返されたリン酸エステル結合化合物、いわゆるＤＮＡとＲＮＡも含まれる。
【００７７】
本発明で使用される原核微生物は、核酸を生産する能力を持つもので例えば、発酵工業においてよく使用される大腸菌、コリネ型細菌および枯草菌などのバクテリアなどが挙げられる。使用される原核微生物は、自然環境から単離されたものでもよく、また、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。
【００７８】
本発明で用いられる原核微生物とは、原核細胞からなる微生物のことである。原核細胞の最も際立った特徴は、細胞内に細胞核（核）と呼ばれる構造を持たないことである。細胞核（核）を有する真核生物とは明確に区別される。
【００７９】
本発明で使用される原核微生物は、核酸の生産能力が高いものが好ましい。元来核酸の生産能力が高いものを自然界から分離してもよいし、人為的に生産能力を高めた原核微生物であってもよい。具体的には、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。
【００８０】
ここで一部性質の改変に関して説明する。核酸を効率よく生産するためには、核酸を生合成して蓄積し、生体外に放出する必要がある。そのため、核酸の生合成系路に関与する酵素の増強、核酸の分解路に関与する酵素活性低下、また核酸を生体外放出に関わるタンパク質、あるいは生体膜組成等の改変など、原核微生物の性質を変えることによって効率的に核酸を生産する原核微生物を作出することができる。
【００８１】
具体的には、一部性質の内、イノシンを生産する場合には、アデニロコハク酸シンテターゼ活性を持たないか、微弱であることが望ましい。また、イノシン酸デヒドロゲナーゼ活性を持たないか、微弱であることが望ましい。また、ヌクレオシダーゼ活性を持たないか、微弱であることが望ましい。
【００８２】
グアノシンを生産する場合には、アデニロコハク酸シンテターゼ活性を持たないか、微弱であることが望ましい。また、グアニル酸レダクターゼ活性を持たないか、微弱であることが望ましい。また、ヌクレオシダーゼ活性を持たないか、微弱であることが望ましい。また、ヌクレオチダーゼ活性を持たないか、微弱であることが望ましい。
【００８３】
ウリジンを生産する場合には、ウリジンホスホリラーゼ活性を持たないか、微弱であることが望ましい。
【００８４】
シチジンを生産する場合には、シジチンデアミナーゼ活性を持たないか、微弱であることが望ましく、ホモセリンデヒドロゲナーゼ活性を持たないか、微弱であることが望ましい。
【００８５】
本発明では、その原核微生物のうちで更に好ましくはコリネ型細菌および枯草菌を用いることができる。例えば、イノシンを生産する場合には、コリネ型細菌として、コリネバクテリウム属（Ｇｅｎｕｓ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に属する細菌が挙げられる。コリネバクテリウム属の中でも、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム・グアノファシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｕａｎｏｆａｃｉｅｎｓ）、およびコリネバクテリウム・ペトロフィリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｅｔｒｏｐｈｉｌｉｕｍ）が好ましく用いられる。コリネバクテリウム・アンモニアゲネスとしては、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ２１４７９株が好ましく用いられる
また、枯草菌として、バチルス属（Ｇｅｎｕｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する細菌が挙げられる。バチルス属の中でも、バチスル・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチスル・ライケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｑｕｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、およびバチスル・プミラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）が好ましく用いられる。
【００８６】
また、グアノシンを生産する場合には、コリネ型細菌として、コリネバクテリウム属（Ｇｅｎｕｓ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に属する細菌が挙げられる。コリネバクテリウム属の中でも、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ）が好ましく、枯草菌としては、例えば、バチルス属（Ｇｅｎｕｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する細菌が挙げられる。バチルス属の中でも、バチスル・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチスル・ライケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｑｕｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチスル・プミラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）が好ましく用いられる。また、ウリジンを生産する場合には、枯草菌を用いることができ、枯草菌の中でもバチルス属（Ｇｅｎｕｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する細菌が好ましく用いられる。バチルス属の中でも、バチスル・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が好ましく用いられる。
【００８７】
シチジンを生産する場合には、枯草菌を用いることができ、枯草菌の中でもバチルス属（Ｇｅｎｕｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する細菌が好ましく用いられる。バチルス属の中でも、バチスル・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が好ましく用いられる。
【００８８】
バチスル・サチルスとしては、バチスル・サチルスＡＴＣＣ１９２２１株が好ましく用いられる。
【００８９】
これら原核微生物を選択して、核酸の生産に用いることが可能である。また、これら原核微生物を人為的に上記一部の性質を改変することで核酸の生産能力を向上させ、用いることが可能である。
【００９０】
本発明の連続発酵による核酸の製造方法における発酵培養は、ｐＨ４ないし８、温度２０ないし４０℃の範囲で好気的条件下で行われることが望ましい。発酵培養液のｐＨ調整は、無機の酸あるいは有機の酸、アルカリ性物質、更には尿素、炭酸カルシウムおよびアンモニアガスなどによって行うことができる。これらの条件下で連続発酵させることにより核酸を製造することができる。また、発酵培養液から核酸を採取する方法は公知の方法に従って行えばよく、例えば、菌体を分離除去し、イオン交換樹脂処理法、濃縮冷却晶析法、膜分離法およびその他の方法を組み合わせることにより行なわれる。不純物を除くためには、常法の活性炭吸着法および再結法を用いて精製してもよい。
【００９１】
本発明の連続発酵による核酸の製造方法は、分離膜として平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の多孔性膜を使用し、濾過圧力である膜間差圧が０.１から２０ｋＰａの範囲で濾過処理することを特徴としている。そのため、特別に発酵反応槽内を加圧状態に保つ必要がないことから、濾過分離装置と発酵反応槽間で発酵液を循環させる動力手段が不要となる。分離膜エレメントは発酵反応槽の外側に設置しても良いし、発酵反応槽内部に設置して発酵装置をコンパクト化することもできる。
【００９２】
本発明の連続発酵による核酸の製造方法で用いられる連続発酵装置のうち、分離膜エレメントが、発酵反応槽の外部に設置された代表的な一例を図１の概要図に示す。図１は、本発明で用いられる他の膜分離型連続発酵装置の一つの実施の形態を説明するための概略側面図である。
【００９３】
図１において、連続発酵装置は、原核微生物を発酵培養させるための発酵反応槽１と、その発酵反応槽１に発酵培養液循環ポンプ１１を介して接続され内部に分離膜エレメント２を備えた膜分離槽１２と、発酵反応槽１の内の発酵培養液の量を制御するための水頭差制御装置３で基本的に構成されている。ここで、分離膜エレメント２には、多孔性膜が組み込まれている。この多孔性膜としては、例えば、国際公開第２００２／０６４２４０号パンフレットに開示されている分離膜および分離膜エレメントを好適に使用することが好適である。
【００９４】
図１において、培地供給ポンプ７によって培地を発酵反応槽１に投入し、必要に応じて、攪拌機５で発酵反応槽１内の発酵培養液を攪拌することができる。また必要に応じて、気体供給装置４によって必要とする気体を供給することができる。このとき、供給した気体を回収リサイクルして再び気体供給装置４で供給することができる。また、必要に応じて、ｐＨセンサ・制御装置９およびよびｐＨ調整溶液供給ポンプ８によって発酵培養液のｐＨを調整することができる。また必要に応じて、温度調節器１０によって発酵培養液の温度を調節することにより、生産性の高い発酵生産を行うことができる。さらに、装置内の発酵培養液は、発酵培養液循環ポンプ１１によって発酵反応槽１と膜分離槽１２の間を循環する。発酵生産物を含む発酵培養液は、分離膜エレメント２によって原核微生物と発酵生産物に濾過・分離され、発酵生産物を装置系から取り出すことができる。
【００９５】
ここでは、計装・制御装置による発酵培養液の物理化学的条件の調節に、ｐＨおよび温度の調節を例示したが、必要に応じて、発酵培養液の溶存酸素や酸化還元電位（ＯＲＰ）の制御を行うことができ、更にはオンラインケミカルセンサーなどの分析装置により発酵培養液中の核酸の濃度を測定し、それを指標とした物理化学的条件の制御を行うことができる。また、培地の連続的もしくは断続的投入の形態に関しては、特に限定されるものではないが、上記計装装置による発酵培養液の物理化学的環境の測定値を指標として、培地投入量および速度を適宜調節することができる。
【００９６】
また、濾過・分離された原核微生物は、装置系内に留まることにより装置系内の原核微生物濃度を高く維持することができ、生産性の高い発酵生産を可能としている。ここで、分離膜エレメント２による濾過・分離は膜分離槽１２の水面との水頭差圧によって行なうことができ、特別な動力を必要としない。また、必要に応じて、レベルセンサ６および水頭差圧制御装置３によって、分離膜エレメント２の濾過・分離速度および装置系内の発酵培養液量を適当に調節することができる。また、必要に応じて、気体供給装置４によって必要とする気体を膜分離槽１２内に供給することができる。
【００９７】
次に本発明の連続発酵による核酸の製造方法で用いられる連続発酵装置のうち、分離膜エレメントが発酵反応槽の内部に設置された代表的な一例を図２に示す。図２は、本発明で用いられる連続発酵装置の一つの実施の形態を説明するための概略側面図である。図１において、連続発酵装置は、原核微生物を発酵培養させるための発酵反応槽１と、その発酵反応槽１の内の発酵培養液の量を制御するための水頭差制御装置３で基本的に構成されている。発酵反応槽１内には分離膜エレメント２が配設されており、その分離膜エレメント２には、多孔性膜が組み込まれている。この多孔性膜としては、例えば、国際公開第２００２／０６４２４０号パンフレットに開示されている分離膜および分離膜エレメントを使用することができる。分離膜エレメントに関しては、追って詳述する。
【００９８】
次に、図２の連続発酵装置による連続発酵の形態について説明する。図２において、培地供給ポンプ７によって、培地を発酵反応槽１に連続的もしくは断続的に投入する。培地については、発酵反応槽１に投入する前に、必要に応じて加熱殺菌、加熱滅菌あるいはフィルターを用いた滅菌処理を行うことができる。発酵生産時には、必要に応じて、発酵反応槽１内の攪拌機５で発酵反応槽１内の発酵培養液を攪拌することができる。また必要に応じて、気体供給装置４によって必要とする気体を発酵反応槽１内に供給することができる。このとき、供給した気体を回収リサイクルして再び気体供給装置４によって供給することができる。また必要に応じて、ｐＨセンサ・制御装置９およびｐＨ調整溶液供給ポンプ８によって発酵反応槽１内の発酵培養液のｐＨを調整することができる。また必要に応じて、温度調節器１０によって発酵反応槽１内の発酵培養液の温度を調節することにより生産性の高い発酵生産を行うことができる。
【００９９】
ここでは、計装・制御装置による発酵培養液の物理化学的条件の調節に、ｐＨおよび温度の調節を例示したが、必要に応じて、図１に示した連続発酵装置同様の制御を行い最適な発酵生産条件に調節することができる。
【０１００】
図２に示す連続発酵装置において発酵培養液は、発酵反応槽１内に設置された分離膜エレメント２によって、原核微生物と発酵生産物に濾過・分離され、発酵生産物が装置系から取り出される。また、濾過・分離された原核微生物は装置系内に留まることにより装置系内の原核微生物濃度を高く維持することができ、生産性の高い発酵生産を可能としている。ここで、分離膜エレメント２による濾過・分離は発酵反応槽１の水面との水頭差圧によって行い、特別な動力を必要としない。また、必要に応じて、レベルセンサ６および水頭差圧制御装置３によって、分離膜エレメント２の濾過・分離速度およびよび発酵反応槽１内の発酵培養液量を適当に調節することができる。上記の分離膜エレメント２による濾過・分離は水頭差圧によって行うことができるが、必要に応じて、ポンプや、液体や気体等による吸引濾過あるいは装置系内を加圧することにより、濾過・分離することもできる。
【０１０１】
上記のように、分離膜エレメント２による濾過・分離は水頭差圧によって行うことができるが、必要に応じて、ポンプや、液体や気体等による吸引濾過あるいは装置系内を加圧することにより濾過・分離することもできる。このような手段により、膜間差圧を調整制御することができる。
【０１０２】
本発明で用いられる分離膜エレメントについて、好適な形態の例である国際公開第２００２／０６４２４０号パンフレットに開示されている分離膜および分離膜エレメントを、以下に図面を用いてその概略を説明する。図３は、本発明で用いられる分離膜エレメントの一つの実施の形態を説明するための概略斜視図である。
【０１０３】
分離膜エレメントは、図３に示すように、剛性を有する支持板１３の両面に、流路材１４と前記の分離膜１５をこの順序で配し構成されている。支持板１３は、両面に凹部１６を有している。分離膜１５は、発酵培養液を濾過する。流路材１４は、分離膜１５で濾過された濾液を効率よく支持板１３に流すためのものである。支持板１３に流れた濾液は、支持板１３の凹部１６を通り、排出手段である集水パイプ１７を介して連続発酵装置外部に取り出される。
【０１０４】
図４は、本発明で用いられる別の分離膜エレメントの他の実施の形態を説明するための概略斜視図である。分離膜エレメントは、図４に示すように、中空糸膜（多孔性膜）で構成された分離膜束１８と上部樹脂封止層１９と下部樹脂封止層２０によって主に構成される。分離膜束１８は、上部樹脂封止層１９および下部樹脂封止層２０よって束状に接着・固定化されている。下部樹脂封止層２０による接着・固定化は、分離膜束１８の中空糸膜（多孔性膜）の中空部を封止しており、発酵培養液の漏出を防ぐ構造になっている。一方、上部樹脂封止層１９は、分離膜束１８の中空糸膜（多孔性膜）の内孔を封止しておらず、集水パイプ２２に濾液が流れる構造となっている。この分離膜エレメントは、支持フレーム２１を介して連続発酵装置内に設置することが可能である。分離膜束１８によって濾過された濾液は、中空糸膜の中空部を通り、集水パイプ２２を介して連続発酵装置外部に取り出される。透過水を取り出すための動力として、水頭差圧、ポンプ、液体や気体等による吸引濾過、あるいは装置系内を加圧するなどの方法を用いることができる。
【０１０５】
本発明の核酸の製造方法で用いられる連続発酵装置の分離膜エレメントを構成する部材は、高圧蒸気滅菌操作に耐性の部材であることが好ましい。連続発酵装置内が滅菌可能であれば、連続発酵時に好ましくない微生物による汚染の危険を回避することができ、より安定した連続発酵が可能となる。分離膜エレメントを構成する部材は、高圧蒸気滅菌操作の条件である、１２１℃で１５分間に耐性であることが好ましい。分離膜エレメント部材は、例えば、ステンレスやアルミニウムなどの金属、ポリアミド系樹脂、フッ素系樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリアセタール系樹脂、ポリブチレンテレフタレート系樹脂、ＰＶＤＦ、変性ポリフェニレンエーテル系樹脂およびポリサルホン系樹脂等の樹脂を好ましく選定できる。
【０１０６】
本発明の連続発酵による核酸の製造方法で用いられる連続発酵装置では、分離膜エレメントは、図１のように発酵反応槽内に設置しても良いし、図２のように発酵反応槽外に設置しても良い。分離膜エレメントを発酵反応槽外に設置する場合には、別途、膜分離槽を設けてその内部に分離膜エレメントを設置することができ、発酵反応槽と膜分離槽の間を発酵培養液を循環させながら、分離膜エレメントにより発酵培養液を連続的に濾過することができる。
【０１０７】
本発明の連続発酵による核酸の製造方法で用いられる連続発酵装置では、膜分離槽は、高圧蒸気滅菌可能であることが望ましい。膜分離槽が高圧蒸気滅菌可能であると、雑菌による汚染回避が容易である。
【０１０８】
本発明の連続発酵による核酸の製造方法に従って連続発酵を行った場合、従来のバッチ式の発酵と比較して、高い体積生産速度が得られ、極めて効率のよい発酵生産が可能となる。ここで、連続培養における発酵生産速度は、次の（式３）で計算される。
・発酵生産速度（ｇ／Ｌ／ｈｒ）＝抜き取り液中の生産物濃度（ｇ／Ｌ）×発酵培養液抜き取り速度（Ｌ／ｈｒ）÷装置の運転液量（Ｌ） ・・・・（式３）
また、バッチ式培養による発酵生産速度は、原料炭素源をすべて消費した時点の生産物量（ｇ）を、炭素源の消費に要した時間（ｈ）とその時点の発酵培養液量（Ｌ）で除して求められる。
【０１０９】
本発明の連続発酵による核酸の製造方法で得られる核酸のうち、イノシンとグアノシンは、それぞれ、主に核酸調味料として用いられるイノシン酸およびグアニル酸の原料として用いられている。イノシンからイノシン酸への変換、およびグアノシンからグアニル酸へ変換は、公知の方法を用いて行うことができる。例えば、酵素を用いる方法や有機化学的な方法により変換することができる。また、イノシンとグアノシンは、医薬中間体の原料としても用いられている。本発明の連続発酵による核酸の製造方法を用いることにより、これらの幅広い用途のある核酸を効率的に製造することができることから、より安価に核酸を提供することが可能となる。
【実施例】
【０１１０】
以下、本発明の連続発酵による核酸の製造方法をさらに詳細に説明するために、図１および図２の概略図に示す装置を用いることによる、連続的な核酸の発酵生産について、実施例を挙げて説明する。本発明はこれらの実施例に限定されない。
【０１１１】
下記の核酸の製造方法に関する実施例においては、核酸の例として、イノシンの発酵生産およびグアノシンの発酵生産の検討を行った。また、核酸を生産させる原核微生物の一例として、バチスル・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のうち、バチスル・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ１９２２１株（実施例１〜４、比較例１）、およびコリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）のうちコリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ２１４７９株（実施例５〜８、比較例２）を用いた。また、発酵原料のうち炭素源としては、グルコースを用い、窒素源や無機塩類など栄養源に関しては、下記の実施例で説明する原料を用いた。
【０１１２】
（実施例１）連続発酵による核酸の製造（その１）
図１に示す連続発酵装置を稼働させることにより、核酸が連続発酵で得られるかどうかを調べるため、同装置を用いた連続発酵試験を行った。培地には表１に示す培地を用い、１２１℃の温度、圧力１ｋｇ／ｃｍ２で、１５分間高圧蒸気滅菌処理して用いた。分離膜エレメント部材として、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成形品を用いた。分離膜には、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）を主成分とする後述の参考例１で作製した多孔性膜を用いた。この多孔質膜の平均細孔径は０.１μｍであり、純水透過係数は５０×１０-9ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａである。この実施例１における運転条件は、特に断らない限り下記のとおりである。
・発酵反応槽容量：１．５（Ｌ）
・膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
・使用分離膜：ＰＶＤＦ濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
・温度調整：３８（℃）
・ 発酵反応槽通気量：１０００（ｍＬ／ｍｉｎ）
・ 膜分離槽通気量：１０００（ｍＬ／ｍｉｎ）
・発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
・滅菌：分離膜エレメントを含む発酵反応槽、および使用培地高圧蒸気滅菌。
・ｐＨ調整：２５％アンモニア水溶液によりｐＨ６．７に調整
・ 膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御
（連続発酵開始後〜１５０時間：０．１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下で制御
１５０時間〜３００時間：０．１ｋＰａ以上２ｋＰａ以下で制御
３００時間〜４００時間：０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）
原核微生物としてバチスル・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ１９２２１株を用い、培地に表１に示す組成の核酸発酵培地を用いた。濾液に含まれるグアノシンおよびイノシンは、下記に示す条件でＨＰＬＣ法により各々の核酸量を測定することで確認した。
【０１１３】
［分析条件］
カラム：Ａｓａｈｉｐａｋ ＧＳ−２２０（７．６ｍｍＩＤ×５００ｍｍＬ）、緩衝液：０．２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ３．９８）リン酸にてｐＨ調整、温度：５５℃、流速：１．５ｍｌ／ｍｉｎ、検出：ＵＶ２５４ｎｍ、保持時間 （ｍｉｎ）：イノシン １６．１、グアノシン ２０．５。また、グルコース濃度の測定には、“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬社製）を用いた。
【０１１４】
【表１】
【０１１５】
まず、バチスル・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ１９２２１株を、５００ｍｌ容坂口フラスコ中で表１に示す前培養培地１００ｍｌを用いて２４時間、３７℃の温度で振とう培養した（前々々培養）。得られた前々々培養液を、ジャーファーメンターの前培養培地１．５Ｌに植菌し、１５時間、３７℃の温度で培養した（前々培養）。得られた前々培養液を、図１に示す連続発酵装置の１．５Ｌの前培養培地に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって１０００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１の通気量の調整と３０℃の温度に温度調整を行い、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、表１に示す連続培養培地の連続供給を行い、発酵培養液循環ポンプ１１によって発酵反応槽１と膜分離槽１２の間を循環させ、連続発酵装置の発酵培養液量を２Ｌとなるように膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵による核酸の製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置３により水頭差を膜間差圧として測定し、上記膜透過水量制御条件で変化させることで行った。適宜、膜透過濾液中の生産された核酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。連続発酵の期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下０．１ｋＰａ以上で推移した。また、核酸およびグルコース濃度から算出された投入グルコースから算出された核酸生産速度を、表３に示した。
【０１１６】
（実施例２）連続発酵による核酸の製造（その２）
実施例１と同様、図１に示す連続発酵装置を用いて核酸の製造を行った。この実施例２では、分離膜に参考例２で作成した分離膜を用い、膜透過水量制御を除くその他の条件は実施例１と同様の条件で核酸の製造を行った。
・ 膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御
（連続発酵開始後〜１００時間：０．１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下で制御
１００時間〜２００時間：０．１ｋＰａ以上２ｋＰａ以下で制御
２００時間〜３００時間：０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）
生産された核酸生産速度を、表３に示した。３００時間の発酵試験を行った結果、図１に示した連続発酵装置を用いることにより、安定した連続発酵による核酸の製造が可能であることを確認することができた。
【０１１７】
（実施例３）連続発酵による核酸の製造（その３）
図２に示す連続発酵装置を稼働させることにより、核酸が得られるかどうかを調べるため、同装置を用いた連続発酵試験を行った。培地には表１に示す培地を用い、１２１℃の温度、圧力１ｋｇ／ｃｍ２で、１５分間高圧蒸気滅菌処理して用いた。分離膜エレメント部材として、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成形品を用いた。分離膜には、実施例１と同じ多孔性膜を用いた。この多孔質膜の平均細孔径は０.１μｍであり、純水透過係数は５０×１０-9ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａである。この実施例３における運転条件は、特に断らない限り下記のとおりである。
・発酵反応槽容量：１．５（Ｌ）
・使用分離膜：ＰＶＤＦ濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
・温度調整：３８（℃）
・発酵反応槽通気量：１０００（ｍＬ／ｍｉｎ）
・発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
・滅菌：分離膜エレメントを含む発酵反応槽、および使用培地は総て高圧蒸気滅菌。
・ｐＨ調整：２５％ アンモニア水溶液によりｐＨ６．７に調整
・ 膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御
（連続発酵開始後〜１５０時間：０．１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下で制御
１５０時間〜３００時間：０．１ｋＰａ以上２ｋＰａ以下で制御
３００時間〜４００時間：０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）
まず、バチスル・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ１９２２１株を、坂口フラスコ中で表１に示す前培養培地１００ｍｌを用いて２４時間、３０℃の温度で振とう培養した（前々培養）。得られた前々培養液を、図２に示す連続発酵装置の１．５Ｌの前培養培地に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって８００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１の通気量の調整と３８℃の温度に温度調整を行い、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、連続発酵培地の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵培養液量を１．５Ｌとなるように膜透過水量の制御を行いながら連続培養することにより連続発酵による核酸の製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置３により水頭差を膜間差圧として測定し、上記膜透過水量制御条件で変化させることで行った。適宜、濾液中の生産された核酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。連続発酵期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下０．１ｋＰａ以上で推移した。また、核酸およびグルコース濃度から算出された投入グルコースから算出された核酸生産速度を、表３に示した。
【０１１８】
（実施例４）連続発酵による核酸の製造（その４）
実施例３と同様、図２に示す連続発酵装置を用いて核酸の製造を行った。この実施例４では、分離膜に参考例２で作成した分離膜を用い、膜透過水量制御を除くその他は実施例３と同様の条件で核酸の製造を行った。
・ 膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御
（連続発酵開始後〜１００時間：０．１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下で制御
１００時間〜２００時間：０．１ｋＰａ以上２ｋＰａ以下で制御
２００時間〜３００時間：０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）
生産された核酸の生産速度を、表３に示した。３００時間の発酵試験を行った結果、図２に示した連続発酵装置を用いることにより、安定した連続発酵による核酸の製造が可能であることを確認することができた。
【０１１９】
（実施例５）連続発酵による核酸の製造（その５）
図１に示す連続発酵装置を稼働させることにより、核酸が連続発酵で得られるかどうかを調べるため、同装置を用いた連続発酵試験を行った。培地には表２に示す培地を用い、１２１℃の温度、圧力１ｋｇ／ｃｍ２で、１５分間高圧蒸気滅菌処理して用いた。分離膜エレメント部材として、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成形品を用いた。分離膜には、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）を主成分とする後述の参考例１で作製した多孔性膜を用いた。この多孔質膜の平均細孔径は０.１μｍであり、純水透過係数は４５×１０-9ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａである。この実施例５における運転条件は、特に断らない限り下記のとおりである。
・発酵反応槽容量：１．５（Ｌ）
・膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
・使用分離膜：ＰＶＤＦ濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
・ 温度調整：３０（℃）
・ 発酵反応槽通気量：１０００（ｍＬ／ｍｉｎ）
・ 膜分離槽通気量：５００（ｍｌ／ｍｉｎ）
・発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
・滅菌：分離膜エレメントを含む発酵反応槽、および使用培地は総て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。
・ｐＨ調整：２５％ アンモニア水溶液によりｐＨ６．８に調整
・ 膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御
（連続発酵開始後〜１５０時間：０．１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下で制御
１５０時間〜３００時間：０．１ｋＰａ以上２ｋＰａ以下で制御
３００時間〜４００時間：０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）
原核微生物としてコリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ２１４７９株を用い、培地には表２に示す組成の核酸発酵培地を用いた。濾液に含まれるグアノシン、およびイノシン、グルコースは、実施例１と同様の方法により各々の核酸量を測定することで確認した。
【０１２０】
【表２】
【０１２１】
まず、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ２１４７９株を、坂口フラスコ中で表２に示す前培養培地１５０ｍｌを用いて２４時間、３０℃の温度で振とう培養した（前々培養）。得られた前々培養液を、図１に示す連続発酵装置の１Ｌの前培養培地に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって８００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１の通気量の調整と３０℃の温度に温度調整を行い、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、連続発酵培地の連続供給を行い、発酵培養液循環ポンプ１１によって発酵反応槽１と膜分離槽１２の間を循環させ、連続発酵装置の発酵培養液量を２Ｌとなるように膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵による核酸の製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置３により水頭差を膜間差圧として測定し、上記膜透過水量制御条件で変化させることで行った。適宜、膜透過濾液中の生産された核酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。連続発酵の期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下０．１ｋＰａ以上で推移した。また、核酸およびグルコース濃度から算出された投入グルコースから算出された核酸生産速度を、表４に示した。
【０１２２】
（実施例６）連続発酵による核酸の製造（その６）
実施例５と同様、図１に示す連続発酵装置を用いて核酸の製造を行った。この実施例６では、分離膜に参考例２で作成した分離膜を用い、膜透過水量制御を除くその他は実施例５と同様の条件で核酸の製造を行った。
・ 膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御
（連続発酵開始後〜１００時間：０．１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下で制御
１００時間〜２００時間：０．１ｋＰａ以上２ｋＰａ以下で制御
２００時間〜３００時間：０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）
生産された核酸の生産速度を、表４に示した。３００時間の発酵試験を行った結果、図２に示した連続発酵装置を用いることにより、安定した連続発酵による核酸の製造が可能であることを確認することができた。
【０１２３】
（実施例７）連続発酵による核酸の製造（その７）
図２に示す連続発酵装置を稼働させることにより、核酸がで得られるかどうかを調べるため、同装置を用いた連続発酵試験を行った。培地には表２に示す培地を用い、１２１℃の温度、圧力１ｋｇ／ｃｍ２で、１５分間高圧蒸気滅菌処理して用いた。分離膜エレメント部材として、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成形品を用いた。分離膜には、実施例１と同じ多孔性膜を用いた。この多孔質膜の平均細孔径は０.１μｍであり、純水透過係数は４５×１０-9ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａである。この本実施例７における運転条件は、特に断らない限り下記のとおりである。
・発酵反応槽容量：１．５（Ｌ）
・使用分離膜：ＰＶＤＦ濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
・温度調整：３０（℃）
・発酵反応槽通気量：１０００（ｍＬ／ｍｉｎ）
・発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
・滅菌：分離膜エレメントを含む発酵反応槽、および使用培地は総て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。
・ｐＨ調整：２５％ アンモニア水溶液によりｐＨ６．８に調整
・ 膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御
（連続発酵開始後〜１５０時間：０．１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下で制御
１５０時間〜３００時間：０．１ｋＰａ以上２ｋＰａ以下で制御
３００時間〜４００時間：０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）
原核微生物として、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ２１４７９株を用い、培地として表２に示す組成の核酸発酵培地を用いた。発酵液に含まれるグアノシン、およびイノシン、グルコースは、実施例１と同様の方法により各々の核酸量を測定することで確認した。
【０１２４】
まず、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ２１４７９株を、坂口フラスコ中で表２に示す前培養培地１５０ｍｌを用いて２４時間、３０℃の温度で振とう培養した（前々培養）。得られた前々培養液を、図１に示す連続発酵装置の１Ｌの前培養培地に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって８００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１の通気量の調整と３０℃の温度に温度調整を行い、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、連続発酵培地の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵培養液量を１．５Ｌとなるように膜透過水量の制御を行いながら連続培養することで連続発酵による核酸の製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置３により水頭差を膜間差圧として測定し、上記膜透過水量制御条件で変化させることで行った。適宜、濾液中の生産された核酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。連続発酵の期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下０．１ｋＰａ以上で推移した。また、核酸およびグルコース濃度から算出された投入グルコースから算出された核酸生産速度を、表４に示した。
【０１２５】
（実施例８）連続発酵による核酸の製造（その８）
実施例７と同様、図２に示す連続発酵装置を用いて核酸の製造を行った。この実施例８では、分離膜に参考例２で作成した分離膜を用い、膜透過水量制御を除くその他は実施例７と同様の条件で核酸の製造を行った。
・ 膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御
（連続発酵開始後〜１００時間：０．１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下で制御
１００時間〜２００時間：０．１ｋＰａ以上２ｋＰａ以下で制御
２００時間〜３００時間：０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）
生産された核酸の生産速度を、表４に示した。３００時間の発酵試験を行った結果、図２に示した連続発酵装置を用いることにより、安定した連続発酵による核酸の製造が可能であることを確認することができた。
【０１２６】
（比較例１）流加発酵による核酸の製造
現在採用されている微生物を用いた発酵形態として最も典型的な流加発酵を２Ｌ容のジャーファーメンターを用いて行い、その核酸生産性を評価した。培地には表１に示す連続発酵培地を用い、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌処理して用いた。この比較例１では、原核微生物としてバチスル・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ１９２２１株を用い、生産物である核酸の濃度の評価は、実施例１に示した方法を用いて評価し、グルコース濃度の測定には“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬社製）を用いた。この比較例１の運転条件は、下記のとおりである。
・発酵反応槽容量：２（Ｌ）
・温度調整：３８（℃）
・発酵反応槽通気量：１０００（ｍＬ／ｍｉｎ）
・発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：２５％ アンモニア水溶液によりｐＨ６．７に調整。
【０１２７】
まず、バチスル・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ１９２２１株を、５００ｍｌ容坂口フラスコ中で表１に示す前培養培地１００ｍｌを用いて２４時間、３７℃の温度で振とう培養した（前々培養）。得られた前々培養液をジャーファーメンターの前培養培地１Ｌに植菌し、１５時間、３８℃の温度で培養した（前培養）。前培養液に流加培養培地を経時的に投入して流加発酵を行った。流加培養培地の投入方法は、発酵培養液中のグルコース濃度が２ｇ／Ｌとなるように調整しながら投入した。９６時間の発酵を行い、核酸発酵能力の評価を行った。発酵の結果を、上記実施例１〜４の連続発酵試験で得られた核酸発酵生産性と比較して表３に示す。
【０１２８】
【表３】
【０１２９】
（比較例２）バッチ発酵による核酸の製造
現在採用されている微生物を用いた発酵形態として最も典型的なバッチ発酵を２Ｌ容のジャーファーメンターを用いて行い、その核酸生産性を評価した。培地には表２に示す連続発酵培地を用い、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌処理して用いた。この比較例２では、原核微生物としてコリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ２１４７９株を用い、生産物である核酸の濃度の評価は、実施例１に示した方法を用いて評価し、グルコース濃度の測定には“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬社製）を用いた。本比較例の運転条件を以下に示す。
・発酵反応槽容量：２（Ｌ）
・温度調整：３０（℃）
・発酵反応槽通気量：１０００（ｍＬ／ｍｉｎ）
・発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
・滅菌：分離膜エレメントを含む発酵反応槽、および使用培地は総て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。
・ｐＨ調整：２５％ アンモニア水溶液によりｐＨ６．８に調整。
【０１３０】
まず、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ２１４７９株を、坂口フラスコ中で表２に示す前培養培地１５０ｍｌを用いて２４時間、３０℃の温度で振とう培養した（前培養）。得られた前培養液をジャーファーメンターの１Ｌの表１に示す連続発酵培地に植菌し、バッチ発酵を行った。発酵開始後、５％のグルコースを添加して発酵を継続した。１２０時間のバッチ発酵の結果を、上記実施例５〜８の連続発酵試験で得られた核酸発酵生産性と比較して表４に示す。
【０１３１】
【表４】
【０１３２】
これらを比較した結果、図１および図２の連続発酵装置を用いることにより、核酸の生産速度が大幅に向上することを明らかになった。すなわち、本発明によって開示された多孔性膜を組み込んだ連続発酵装置を用い、膜間差圧を制御することにより、発酵培養液を分離膜によって濾液と未濾過液に分離し、濾液から所望の発酵生産物を回収するとともに、未濾過液を発酵培養液に戻す連続発酵方法を可能とし、微生物量を高く維持しながら、連続発酵による核酸の製造が可能であることが明らかとなった。
【０１３３】
（参考例１）多孔性膜の作製（その１）
樹脂としてポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）樹脂を、また溶媒としてＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）をそれぞれ用い、これらを９０℃の温度下に十分に攪拌し、次の組成を有する原液を得た。
・ＰＶＤＦ：１３．０重量％
・ＤＭＡｃ：８７．０重量％
次に、上記原液を２５℃の温度に冷却した後、あらかじめガラス板上に貼り付けて置いた、密度が０．４８ｇ／ｃｍ3で、厚みが２２０μｍのポリエステル繊維製不織布（多孔質基材）に塗布し、直ちに次の組成を有する２５℃の温度の凝固浴中に５分間浸漬して、多孔質基材に多孔質樹脂層が形成された多孔性膜を得た。
・水 ：３０．０重量％
・ＤＭＡｃ：７０．０重量％
この多孔性膜をガラス板から剥がした後、８０℃の温度の熱水に３回浸漬してＤＭＡｃを洗い出し、分離膜を得た。多孔質樹脂層表面の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内を、倍率１０，０００倍で走査型電子顕微鏡観察を行ったところ、観察できる細孔すべての直径の平均は０．１μｍであった。次に、上記分離膜について純水透水透過係数を評価したところ、５０×１０-9ｍ3／ｍ2／ｓ／Ｐａであった。純水透水量の測定は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで行った。また、平均細孔径の標準偏差 は０．０３５μｍで、膜表面粗さは０．０６μｍであった。
【０１３４】
（参考例２）多孔性膜の作製（その２）
重量平均分子量４１．７万のフッ化ビニリデンホモポリマーとγ-ブチロラクトンとを、それぞれ３８重量％と６２重量％の割合で１７０℃の温度で溶解し原液を作製した。この原液をγ-ブチロラクトンを中空部形成液体として随拌させながら口金から吐出し、温度２０℃のγ-ブチロラクトン８０重量％水溶液からなる冷却浴中で固化して中空糸膜を作製した。
【０１３５】
次いで、重量平均分子量２８．４万のフッ化ビニリデンホモポリマーを１４重量％、セルロースアセテートプロピオネート（イーストマンケミカル社、ＣＡＰ４８２−０．５）を１重量％、Ｎ-メチル-２-ピロリドンを７７重量％、ポリオキシエチレンヤシ油脂肪酸ソルビタン（三洋化成株式会社製、商品名“イオネットＴ−２０Ｃ”（登録商標））を５重量％、および水を３重量％の割合で９５℃の温度で混合溶解して原液を調整した。この原液を、上記で得られた中空糸膜の表面に均一に塗布し、すぐに水浴中で凝固させた本発明で用いる中空糸膜（多孔性膜）を製作した。得られた中空糸膜（分離膜）の被処理水側表面の平均細孔径は、０．０５μｍであった。次に、上記の分離膜である中空糸多孔性膜について純水透水量を評価したところ、５．５×１０-9ｍ3／ｍ2・ｓ・Ｐａであった。透水量の測定は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで行った。また、平均細孔径の標準偏差 は０．００６μｍであった。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】図１は、本発明で用いられる膜分離型連続発酵装置の一つの実施の形態を説明するための概略側面図である。
【図２】図２は、本発明で用いられる他の膜分離型連続発酵装置の一つの実施の形態を説明するための概略側面図である。
【図３】図３は、本発明で用いられる分離膜エレメントの一つの実施の形態を説明するための概略斜視図である。
【図４】図４は、本発明で用いられる他の分離膜エレメントの一つの実施の形態を説明するための概略斜視図である。
【符号の説明】
【０１３７】
１ 発酵反応槽
２ 分離膜エレメント
３ 水頭差制御装置
４ 気体供給装置
５ 攪拌機
６ レベルセンサ
７ 培地供給ポンプ
８ ｐＨ調整溶液供給ポンプ
９ ｐＨセンサ・制御装置
１０ 温度調節器
１１ 発酵培養液循環ポンプ
１２ 膜分離槽
１３ 支持板
１４ 流路材
１５ 分離膜
１６ 凹部
１７ 集水パイプ
１８ 分離膜束
１９ 上部樹脂封止層
２０ 下部樹脂封止層
２１ 支持フレーム
２２ 集水パイプ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を生産する能力を有する原核微生物の発酵培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を前記の発酵培養液に保持または還流し、かつ、その原核微生物の発酵原料を前記の発酵培養液に追加する連続発酵により核酸を製造する方法であって、前記の分離膜として平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の細孔を有する多孔性膜を用い、その膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲にして濾過処理することを特徴とする連続発酵による核酸の製造方法。
【請求項２】
多孔性膜の純水透過係数が、２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上６×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下である請求項１記載の連続発酵による核酸の製造方法。
【請求項３】
多孔性膜の平均細孔径が０.０１μｍ以上０.２μｍ未満であり、かつ、該平均細孔径の標準偏差が０.１μｍ以下である請求項１または２記載の連続発酵による核酸の製造方法。
【請求項４】
多孔性膜の膜表面粗さが０.１μｍ以下である請求項１から３のいずれかに記載の連続発酵による核酸の製造方法。
【請求項５】
多孔性膜が多孔性樹脂層を含む多孔性膜である請求項１から４のいずれかに記載の連続発酵による核酸の製造方法。
【請求項６】
多孔性膜の素材がポリフッ化ビニリデン系樹脂である請求項１から５のいずれかに記載の連続発酵による核酸の製造方法。
【請求項７】
原核微生物の発酵原料が糖類を含む請求項１から６のいずれかに記載の連続発酵による核酸の製造方法。
【請求項８】
核酸がイノシンまたはグアノシンである請求項１から７のいずれかに記載の連続発酵による核酸の製造方法。
【請求項９】
原核微生物がアデニン要求性であり、かつヌクレオシダーゼ活性を持たない原核微生物である請求項１から８のいずれかに記載の連続発酵による核酸の製造方法。
【請求項１０】
核酸がシチジンである請求項１から６のいずれかに記載の連続発酵による核酸の製造方法。
【請求項１１】
原核微生物がシチジンデアミナーゼ活性を持たない原核微生物である請求項１０記載の連続発酵による核酸の製造方法。
【請求項１２】
原核微生物がバチルス属（Ｇｅｎｕｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ）またはコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に属する原核微生物である請求項１から１１のいずれかに記載の連続発酵による核酸の製造方法。
【請求項１】
核酸を生産する能力を有する原核微生物の発酵培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を前記の発酵培養液に保持または還流し、かつ、その原核微生物の発酵原料を前記の発酵培養液に追加する連続発酵により核酸を製造する方法であって、前記の分離膜として平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の細孔を有する多孔性膜を用い、その膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲にして濾過処理することを特徴とする連続発酵による核酸の製造方法。
【請求項２】
多孔性膜の純水透過係数が、２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上６×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下である請求項１記載の連続発酵による核酸の製造方法。
【請求項３】
多孔性膜の平均細孔径が０.０１μｍ以上０.２μｍ未満であり、かつ、該平均細孔径の標準偏差が０.１μｍ以下である請求項１または２記載の連続発酵による核酸の製造方法。
【請求項４】
多孔性膜の膜表面粗さが０.１μｍ以下である請求項１から３のいずれかに記載の連続発酵による核酸の製造方法。
【請求項５】
多孔性膜が多孔性樹脂層を含む多孔性膜である請求項１から４のいずれかに記載の連続発酵による核酸の製造方法。
【請求項６】
多孔性膜の素材がポリフッ化ビニリデン系樹脂である請求項１から５のいずれかに記載の連続発酵による核酸の製造方法。
【請求項７】
原核微生物の発酵原料が糖類を含む請求項１から６のいずれかに記載の連続発酵による核酸の製造方法。
【請求項８】
核酸がイノシンまたはグアノシンである請求項１から７のいずれかに記載の連続発酵による核酸の製造方法。
【請求項９】
原核微生物がアデニン要求性であり、かつヌクレオシダーゼ活性を持たない原核微生物である請求項１から８のいずれかに記載の連続発酵による核酸の製造方法。
【請求項１０】
核酸がシチジンである請求項１から６のいずれかに記載の連続発酵による核酸の製造方法。
【請求項１１】
原核微生物がシチジンデアミナーゼ活性を持たない原核微生物である請求項１０記載の連続発酵による核酸の製造方法。
【請求項１２】
原核微生物がバチルス属（Ｇｅｎｕｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ）またはコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に属する原核微生物である請求項１から１１のいずれかに記載の連続発酵による核酸の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００８−２３７２０６（Ｐ２００８−２３７２０６Ａ）
【公開日】平成２０年１０月９日（２００８．１０．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２１２７４７（Ｐ２００７−２１２７４７）
【出願日】平成１９年８月１７日（２００７．８．１７）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月９日（２００８．１０．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年８月１７日（２００７．８．１７）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
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