連続発酵装置
【課題】簡便な操作条件で、低い膜間差圧で濾過処理しながら、長時間にわたり安定して高生産性を維持する連続発酵法による化学品を製造するための連続発酵装置を提供する。
【解決手段】微生物もしくは培養細胞の培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を発酵培養液に追加する連続発酵のための装置であって、分離膜として平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の細孔を有する多孔性膜を用い、膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲で濾過処理し、かつ、微生物もしくは培養細胞を培養する培養槽１７と、連続発酵を行う発酵反応槽１と、発酵培養液を濾過するための分離膜を有する分離膜エレメント２と、培養した微生物もしくは培養細胞を培養槽から発酵反応槽へ供給する移送手段１８で構成される。
【解決手段】微生物もしくは培養細胞の培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を発酵培養液に追加する連続発酵のための装置であって、分離膜として平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の細孔を有する多孔性膜を用い、膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲で濾過処理し、かつ、微生物もしくは培養細胞を培養する培養槽１７と、連続発酵を行う発酵反応槽１と、発酵培養液を濾過するための分離膜を有する分離膜エレメント２と、培養した微生物もしくは培養細胞を培養槽から発酵反応槽へ供給する移送手段１８で構成される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物または培養細胞の培養方法の改良およびそれに用いられる培養装置に関するものである。さらに詳しくは、本発明は、培養を行いながら、微生物または培養細胞の発酵培養液から、目詰まりが生じにくい多孔性分離膜を通して生産物を含む液を効率よく濾過・回収すること、および未濾過液を発酵培養液に戻すことにより発酵に関与する微生物濃度を向上させ、高い生産性を得る化学品を製造するための連続発酵装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
微生物や培養細胞の培養を伴う物質生産方法である発酵法は、大きく（１）回分発酵法（Ｂａｔｃｈ発酵法）および流加発酵法（Ｆｅｄ−Ｂａｔｃh発酵法）と、（２）連続発酵法に分類することができる。
【０００３】
上記（１）の回分発酵法と流加発酵法は、設備的には簡素であり短時間で培養が終了し、雑菌汚染による被害が少ないという利点がある。しかしながら、これらの方法は時間の経過とともに培養液中の生産物濃度が高くなり、浸透圧あるいは生産物阻害等の影響により生産性および収率が低下してくる。そのためこれらの発酵法は、長時間にわたり安定して高収率かつ高生産性を維持することが困難である。
【０００４】
一方、上記（２）の連続発酵法は、発酵反応槽内で目的物質が高濃度に蓄積することを回避することによって、長時間にわたって高収率かつ高生産性を維持できるという特徴がある。Ｌ−グルタミン酸（特許文献１参照。）やＬ−リジン（非特許文献１参照。）の発酵について連続培養法が開示されている。しかしながら、これらの例では、発酵培養液へ原料の連続的な供給を行うと共に、微生物や培養細胞を含んだ発酵培養液を抜き出すために、発酵培養液中の微生物や培養細胞が希釈されることから、生産効率の向上は限定されたものであった。
【０００５】
このことから、連続発酵法において、微生物や培養細胞を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収すると同時に濾過された微生物や培養細胞を発酵培養液に保持または還流させることにより、発酵培養液中の微生物や細胞濃度を高く維持する方法が提案されている。
【０００６】
例えば、セラミックス膜を用いた連続発酵装置により、連続発酵する技術が提案されている（特許文献２、特許文献３および特許文献４参照。）。しかしながらこれらの提案では、分離膜の目詰りによる濾過流量や濾過効率の低下に問題があり、目詰まり防止のために逆洗浄等を行っている。また別に、分離膜を用いたコハク酸の製造方法が提案されている（特許文献５参照。）。しかしながら、この提案では膜分離において、高い濾過圧（約２００ｋＰａ）が採用されている。高い濾過圧は、コスト的にも不利であるばかりでなく、濾過処理において微生物や培養細胞が圧力によって物理的なダメージを受けることから、微生物や培養細胞を連続的に発酵培養液に戻す連続発酵法においては適切ではない。
【０００７】
このように、従来の連続発酵法には様々な問題があり、産業的応用が難しかった。すなわち、連続発酵法において、微生物や培養細胞を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収すると同時に濾過された微生物や培養細胞を培養液に還流させ、発酵培養液中の微生物や細胞濃度を向上させ、かつ、高く維持させることにより高い物質生産性を得ることは、依然として困難であり、技術の革新が望まれていた。
【特許文献１】特開平１０−１５０９９６号公報
【特許文献２】特開平５−９５７７８号公報
【特許文献３】特開昭６２−１３８１８４号公報
【特許文献４】特開平１０−１７４５９４号公報
【特許文献５】特開２００５−３３３８８６号公報
【非特許文献１】Toshihiko Hirao et. al.（ヒラノ・トシヒコ ら）、 Appl. Microbiol. Biotechnol.（アプライド マイクロバイアル アンド マイクロバイオロジー），３２，２６９−２７３（１９８９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで本発明の目的は、簡便な操作で、長時間にわたり安定して高生産性を維持することができる連続発酵法による化学品を製造するための連続発酵装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、微生物や培養細胞の分離膜内への侵入が少なく、微生物や培養細胞を膜間差圧が低い条件で濾過した場合に、かつ微生物もしくは培養細胞を培養する培養槽と、連続発酵を行う発酵反応槽と、培養した微生物もしくは培養細胞を培養槽から発酵反応槽に供給する移送手段と、分離膜を有する分離膜エレメントを配することにより、分離膜の目詰まりが著しく抑制されることを見いだし、課題であった高濃度の微生物の濾過が長期間安定に維持できることを可能とし、本発明を完成した。
【００１０】
本発明の連続発酵装置は、微生物もしくは培養細胞の発酵培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を該発酵培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を該発酵培養液に追加する連続発酵による化学品の製造装置であって、微生物もしくは培養細胞を培養する培養槽と、微生物もしくは培養細胞の連続発酵を行う発酵反応槽と、該培養槽で培養した微生物もしくは培養細胞を培養槽から発酵反応槽へ供給する移送手段と、発酵培養液を濾過するための分離膜を有する分離膜エレメントと、該分離膜の膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲に制御する手段からなり、該分離膜が平均細孔径０.０１μｍ以上１μｍ未満の細孔を有する多孔性膜であることを特徴とする連続発酵装置である。
【００１１】
また、本発明の連続発酵装置の好ましい態様によれば、前記の連続発酵装置は、微生物もしくは培養細胞を培養する培養槽と、微生物もしくは培養細胞の連続発酵を行う発酵反応槽と、該培養槽で培養した微生物もしくは培養細胞を培養槽から発酵反応槽へ供給する移送手段と、該発酵反応槽に発酵培養液循環手段を介して接続され内部に発酵培養液を濾過するための分離膜を有する分離膜エレメントを備えた膜分離槽と、該分離膜の膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲に制御する手段からなり、該分離膜が平均細孔径０.０１μｍ以上１μｍ未満の細孔を有する多孔性膜であることを特徴とする連続発酵装置である。
【００１２】
また、本発明の連続発酵装置の好ましい態様によれば、前記の連続発酵装置は、微生物もしくは培養細胞を培養する培養槽と、培養した微生物もしくは培養細胞の連続発酵を行う発酵反応槽と、該培養槽で培養した微生物もしくは培養細胞を培養槽から発酵反応槽へ供給する移送手段と、該発酵反応槽内に配設され発酵培養液を濾過するための分離膜を有する分離膜エレメントと、該分離膜エレメントに接続され濾過された発酵生産物を含む透過液を排出するための手段と、該分離膜の膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲に制御するための手段からなり、該分離膜が平均細孔径０.０１μｍ以上１μｍ未満の細孔を有する多孔性膜であることを特徴とする連続発酵装置である。
【００１３】
また、本発明の連続発酵装置の好ましい態様によれば、前記の多孔性膜の純水透過係数は、２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上６×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下である。
【００１４】
また、本発明の連続発酵装置の好ましい態様によれば、前記の多孔性膜の平均細孔径は０.０１μｍ以上０.２μｍ未満の範囲内にあり、かつ、その平均細孔径の標準偏差は０.１μｍ以下である。
【００１５】
また、本発明の連続発酵装置の好ましい態様によれば、前記の多孔性膜の膜表面粗さは０.１μｍ以下である。
【００１６】
また、本発明の連続発酵装置の好ましい態様によれば、前記の多孔性膜はポリフッ化ビニリデンからなる多孔質樹脂層を含む多孔性膜である。
【００１７】
また、本発明の連続発酵装置の好ましい態様によれば、前記の多孔性膜を含む膜分離エレメントを構成する部材は、高圧蒸気滅菌操作に耐性である。
【００１８】
また、本発明の連続発酵装置の好ましい態様によれば、前記の分離膜の膜間差圧を制御するための手段は、発酵培養液と多孔性膜処理水の液位差を制御する水頭差制御装置、または加圧ポンプまたは／および吸引ポンプ、または気体または液体の圧力である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の連続発酵装置によれば、簡便な操作条件で、長時間にわたり安定して所望の発酵生産物の高生産性を維持する連続発酵が可能となり、広く発酵工業において、発酵生産物である各種化学品を低コストで安定に生産することが可能となる。
【００２０】
また本発明の連続発酵装置では、別の培養槽で微生物もしくは培養細胞を培養し、培養されたフレッシュな発酵能力が高い状態の微生物もしくは培養細胞を含む培養液を培養槽から発酵反応槽に供給しながら連続発酵するから、常に高い化学品の生産性能を維持させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明の連続発酵装置は、連続発酵によって化学品を製造するための装置であって、基本構造として、微生物もしくは培養細胞を培養する培養槽と、微生物もしくは培養細胞の連続発酵を行う発酵反応槽と、該培養槽で培養した微生物もしくは培養細胞を培養槽から発酵反応槽へ供給する移送手段と、発酵培養液を濾過するための分離膜を有する分離膜エレメントと、該分離膜の膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲に制御する手段からなり、該分離膜が平均細孔径０.０１μｍ以上１μｍ未満の細孔を有する多孔性膜であることを特徴とする連続発酵装置である。
【００２２】
本発明で分離膜として用いられる多孔性膜の構成について説明する。本発明における多孔性膜は、被処理水の水質や用途に応じた分離性能と透水性能を有するものである。多孔性膜は、阻止性能および透水性能や耐汚れ性という分離性能の点からは、多孔質樹脂層を含む多孔性膜であることが好ましい。このような多孔性膜は、多孔質基材の表面に、分離機能層として作用とする多孔質樹脂層を有している。多孔質基材は、多孔質樹脂層を支持して分離膜に強度を与えるものである。
【００２３】
多孔質基材の材質は、有機材料および／または無機材料等からなり、中でも有機繊維が望ましく用いられる。好ましい多孔質基材は、セルロース繊維、セルローストリアセテート繊維、ポリエステル繊維、ポリプロピレン繊維およびポリエチレン繊維などの有機繊維を用いてなる織布や不織布等である。中でも、密度の制御が比較的容易であり製造も容易で安価な不織布が好ましく用いられる。
【００２４】
また、多孔質樹脂層は、上述したように分離機能層として作用するものであり、有機高分子膜を好適に使用することができる。有機高分子膜の材質としては、例えば、ポリエチレン系樹脂、ポリプロピレン系樹脂、ポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂、ポリアクリロニトリル系樹脂、セルロース系樹脂およびセルローストリアセテート系樹脂等が挙げられる。有機高分子膜は、これらの樹脂を主成分とする樹脂の混合物からなるものであってもよい。ここで主成分とは、その成分が５０重量％以上、好ましくは６０重量％以上含有することをいう。中でも、多孔質樹脂層を構成する素材としては、溶液による製膜が容易で物理的耐久性や耐薬品性にも優れているポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂およびポリアクリロニトリル系樹脂が好ましく用いられる。多孔質樹脂層を構成する素材には、ポリフッ化ビニリデン系樹脂またはそれを主成分とする樹脂が最も好ましく用いられる。
【００２５】
ここで、ポリフッ化ビニリデン系樹脂としては、フッ化ビニリデンの単独重合体が好ましいが、フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体との共重合体も好ましく用いられる。フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体としては、テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロピレンおよび三塩化フッ化エチレンなどが例示される。
【００２６】
本発明で用いられる多孔性膜は、発酵に使用する微生物および培養細胞による目詰まりが起こりにくく、かつ濾過性能が長期間安定に継続する性能を有するものであることが望ましい。そのため、本発明で使用される多孔性膜は、平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の細孔を有する多孔性膜であることが重要である。
【００２７】
平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の範囲にあると、菌体や汚泥などがリークすることのない高い排除率と、高い透水性を両立させることができ、さらに目詰まりしにくく、透水性を長時間保持することが、より高い精度と再現性を持って実施することができる。平均細孔径が、０.０１μｍ以上１μｍ未満の範囲にあれば、動物細胞、酵母および糸状菌などを用いた場合、目詰まりが少なく、また、細胞の濾液への漏れもなく安定に連続発酵が実施可能である。また、動物細胞、酵母および糸状菌より小さな細菌類を用いた場合は、０.４μｍ以下の平均細孔径であればよりよく、０.２μｍ以下の平均細孔径であればなお好適に実施可能である。平均細孔径は、小さすぎると透水量が低下することがあるので、通常は０．０２μｍ以上が好ましく、より好ましくは０．０４μｍ以上である。
【００２８】
ここで、平均細孔径は、倍率１０，０００倍の走査型電子顕微鏡観察における、９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔すべての直径を測定し、平均することにより求めることができる。
【００２９】
また、平均細孔径の標準偏差σは、０．１μｍ以下であることが好ましい。細孔径の標準偏差σは、上記の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔数をＮとして、測定した各々の直径をＸｋ、細孔直径の平均をＸ（ａｖｅ）とした、下記の式（１）により算出される。
【００３０】
【数１】
【００３１】
本発明で用いられる多孔性膜において、発酵培養液の透過性が重要点の一つであり、透過性の指標として、使用前の多孔性膜の純水透過係数を用いることができる。多孔性膜の純水透過係数が、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで透水量を測定し算出したとき、２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上であることが好ましく、２×１０−９以上６×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下であれば、実用的に十分な透過水量が得られる。より好ましい純水透過係数は、２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上１×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下である。
【００３２】
本発明で用いられる多孔性膜の表面粗さは、分離膜の目詰まりに影響を与える因子である。多孔性膜の表面粗さは、０.１μｍ以下であることが好ましい。表面粗さが０.１μｍ以下のときに分離膜の剥離係数や膜抵抗をさらに低下させることができ、より低い膜間差圧で連続発酵が実施可能である。また、表面粗さを低くすることにより、微生物や培養細胞の濾過において、膜表面で発生する剪断力を低下させることが期待でき、微生物または培養細胞の破壊が抑制され、多孔性膜の目詰まりも抑制されることにより、長期間安定な濾過が可能になると考えられる。
【００３３】
ここで、表面粗さは、下記の原子間力顕微鏡装置（ＡＦＭ）を使用して、下記の装置と条件で測定することができる。
【００３４】
・装置：原子間力顕微鏡装置(Digital Instruments（株）製Nanoscope IIIa)
・条件：探針 ＳｉＮカンチレバー(Digital Instruments（株）製)
：走査モード コンタクトモード（気中測定）
水中タッピングモード（水中測定）
：走査範囲 １０μm,２５μm 四方（気中測定）
５μm,１０μm 四方（水中測定）
：走査解像度 ５１２×５１２
・試料調製：
測定に際し膜サンプルは常温でエタノールに１５分浸漬後ＲＯ水中に２４時間浸漬し洗浄した後風乾し用いた。ＲＯ水とは、ろ過膜の一種である逆浸透膜（ＲＯ膜）を用いてろ過し、イオンや塩類などの不純物を排除した水を指す。ＲＯ膜の孔の大きさは、概ね２ｎｍ以下である。
【００３５】
膜の表面粗さdroughはAFMにより各ポイントのＺ軸方向の高さから、下記の式（２）により算出する。
【００３６】
【数２】
【００３７】
本発明で用いられる多孔性膜は、平膜であっても中空糸膜であっても良い。平膜の場合、その厚みは用途に応じて選択されるが、例えば、厚みは好ましくは２０μｍ以上５０００μｍ以下であり、より好ましくは５０μｍ以上２０００μｍ以下の範囲で選択される。上述したように、多孔性膜は多孔質基材と多孔質樹脂層とから形成されていても良い。その際、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していても、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していなくてもどちらでも良く、用途に応じて選択される。多孔質基材の厚みは、好ましくは５０μｍ以上３０００μｍ以下の範囲で選択される。中空糸膜の場合、内径は好ましくは２００μｍ以上５０００μｍ以下の範囲で選択され、膜厚は好ましくは２０μｍ以上２０００μｍ以下の範囲で選択される。また、有機繊維または無機繊維を筒状にした織物や編み物を含んでいても良い。
【００３８】
本発明で用いられる多孔性膜の作成法の概要を例示して説明する。
【００３９】
まず、多孔性膜のうち、平膜の作成法の概要について説明する。
【００４０】
多孔質基材の表面に、樹脂と溶媒とを含む原液の被膜を形成すると共に、その原液を多孔質基材に含浸させる。その後、被膜を有する多孔質基材の被膜側表面のみを、非溶媒を含む凝固浴と接触させて樹脂を凝固させると共に、多孔質基材の表面に多孔質樹脂層を形成する。
【００４１】
原液は、樹脂を溶媒に溶解させて調整する。原液の温度は、製膜性の観点から、通常、５〜１２０℃の範囲内で選定することが好ましい。溶媒は、樹脂を溶解するものであり、樹脂に作用してそれらが多孔質樹脂層を形成するのを促すものである。溶媒としては、Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ − メチル− ２ − ピロリドン、メチルエチルケトン、テトラヒドロフラン、テトラメチル尿素、リン酸トリメチル、シクロヘキサノン、イソホロン、γ − ブチロラクトン、メチルイソアミルケトン、フタル酸ジメチル、プロピレングリコールメチルエーテール、プロピレンカーボネート、ジアセトンアルコール、グリセロールトリアセテート、アセトンおよびメチルエチルケトンなどを用いることができる。なかでも、樹脂の溶解性の高いＮ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が好ましく用いられる。これらの溶媒は、単独で用いても良いし２種類以上を混合して用いても良い。
【００４２】
また、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンおよびグリセリンなどの溶媒以外の成分を溶媒に添加しても良い。溶媒に非溶媒を添加することもできる。非溶媒は、樹脂を溶解しない液体である。非溶媒は、樹脂の凝固の速度を制御して細孔の大きさを制御するように作用する。非溶媒としては、水や、メタノールおよびエタノールなどのアルコール類を用いることができる。なかでも、非溶媒として、価格の点から水やメタノールが好ましく用いられる。溶媒以外の成分および非溶媒は、混合物であってもよい。
【００４３】
原液には、開孔剤を添加することもできる。開孔剤は、凝固浴に浸漬された際に抽出されて、樹脂層を多孔質にする作用を持つものである。開孔剤を添加することにより、平均細孔径の大きさを制御することができる。開孔剤は、凝固浴への溶解性の高いものであることが好ましい。開孔剤としては、例えば、塩化カルシウムや炭酸カルシウムなどの無機塩を用いることができる。また、開孔剤として、ポリエチレングリコールやポリプロピレングリコールなどのポリオキシアルキレン類や、ポリビニルアルコール、ポリビニルブチラールおよびポリアクリル酸などの水溶性高分子化合物や、グリセリンを用いることができる。
【００４４】
次に、多孔性膜のうち、中空糸膜の作成法の概要について説明する。
【００４５】
中空糸膜は、樹脂と溶媒からなる原液を二重管式口金の外側の管から吐出すると共に、中空部形成用流体を二重管式口金の内側の管から吐出して、冷却浴中で冷却固化して作製することができる。
【００４６】
原液は、上述の平膜の作成法で述べた樹脂を２０重量％以上６０重量％以下の濃度で、上述の平膜の生成法で述べた溶媒に溶解させることにより調整することができる。また、中空部形成用流体には、通常気体もしくは液体を用いることができる。また、得られた中空糸膜の外表面に、新たな多孔性樹脂層をコーティング（積層）することもできる。積層は中空糸膜の性質、例えば、親水・疎水性あるいは細孔径等を所望の性質に変化させるために行うことができる。積層される新たな多孔性樹脂層は、樹脂を溶媒に溶解させた原液を、非溶媒を含む凝固浴と接触させて樹脂を凝固させることによって作製することができる。その樹脂の材質は、例えば、上述有機高分子膜の材質と同様のものが好ましく用いられる。また、積層方法としては、原液に中空糸膜を浸漬してもよいし、中空糸膜の表面に原液を塗布してもよく、積層後、付着した原液の一部を掻き取ったり、エアナイフを用いて吹き飛ばしすることにより積層量を調整することもできる。
【００４７】
本発明で用いられる多孔性膜は、支持体と組み合わせることによって分離膜エレメントとすることができる。分離膜エレメントの形態は特に限定されないが、支持体として支持板を用い、その支持板の少なくとも片面に、本発明の多孔性膜を配した分離膜エレメントは、本発明の分離膜エレメントの好適な形態の一つである。この形態では、膜面積を大きくすることが困難なので、透水量を大きくするために、支持板の両面に多孔性膜を配することも好ましい態様である。
【００４８】
本発明において、微生物や培養細胞を濾過処理する際の膜間差圧は、微生物や培養細胞および培地成分が容易に目詰まりしない条件であればよく、膜間差圧を０.１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下の範囲とする。膜間差圧を制御するための手段である濾過の駆動力としては、発酵培養液と多孔性膜処理水の液位差（水頭差）を利用したサイホンにより多孔性膜に膜間差圧を発生させることが可能である。また、濾過の駆動力として多孔性膜処理水側に吸引ポンプを設置してもよいし、多孔性膜の発酵培養液側に加圧ポンプを設置することも可能である。このように膜間差圧は、発酵培養液と多孔性膜処理水の液位差を変化させることで制御することができる。また、ポンプを使用する場合には吸引圧力により制御することができ、更に発酵培養液側の圧力を導入する気体または液体の圧力によって制御することができる。これら圧力制御を行う場合には発酵培養液側の圧力と多孔性膜処理水側の圧力差をもって膜間差圧とし、膜間差圧の制御に用いることができる。
【００４９】
また、本発明において使用する多孔性膜は、０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下の範囲で濾過処理することができるものが好ましい。
【００５０】
本発明で使用される発酵原料としては、培養する微生物または培養細胞の生育を促し、目的とする発酵生産物である化学品を良好に生産させ得るものであればよいが、炭素源、窒素源、無機塩類、および必要に応じてアミノ酸、ビタミンなどの有機微量栄養素を適宜含有する通常の液体培地が好ましく用いられる。
【００５１】
炭素源としては、グルコース、シュークロース、フラクトース、ガラクトースおよびラクトース等の糖類、これら糖類を含有する澱粉糖化液、甘藷糖蜜、甜菜糖蜜、ハイテストモラセス、更には酢酸等の有機酸、エタノールなどのアルコール類、およびグリセリンなども使用される。
【００５２】
窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、ビタミン類、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種発酵菌体およびその加水分解物などが使用される。
【００５３】
無機塩類としては、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩およびマンガン塩等を適宜添加することができる。本発明に使用する微生物が生育のために特定の栄養素を必要とする場合には、その栄養物を標品もしくはそれを含有する天然物として添加することができる。また、消泡剤も必要に応じて使用することができる。
【００５４】
本発明において、発酵培養液とは、発酵原料に微生物または培養細胞が増殖した結果得られる液のことを言い、追加する発酵原料の組成は、目的とする化学品の生産性が高くなるように、培養開始時の発酵原料組成から適宜変更しても良い。
【００５５】
本発明では、発酵培養液中の糖類濃度は、５ｇ／ｌ以下に保持されるようにすることが好ましい。その理由は、発酵培養液の引き抜きによる糖類の流失を最小限にするためである。微生物または培養細胞の培養は、通常ｐＨ４〜８、温度２０〜４０℃の範囲で行われることが多い。発酵培養液のｐＨは、無機の酸あるいは有機の酸、アルカリ性物質、さらには尿素、炭酸カルシウムおよびアンモニアガスなどによって、上記範囲内のあらかじめ定められた値に調節することができる。酸素の供給速度を上げる必要があれば、空気に酸素を加えて酸素濃度を２１％以上に保つ、あるいは培養を加圧する、攪拌速度を上げる、通気量を上げるなどの手段を用いることができる。
【００５６】
本発明では、培養初期にＢａｔｃｈ培養またはＦｅｄ−Ｂａｔｃｈ培養を行って微生物または培養細胞の濃度を高くした後に連続培養（引き抜き）を開始しても良いし、高濃度の菌体をシードし、培養開始とともに連続培養を行っても良い。適当な時期から原料培養液の供給および培養物の引き抜きを行うことが可能である。原料培養液供給と培養物の引き抜きの開始時期は必ずしも同じである必要はない。また、原料培養液の供給と培養物の引き抜きは連続的であってもよいし、間欠的であってもよい。原料培養液には上記に示したような菌体増殖に必要な栄養素を添加し、菌体増殖が連続的に行われるようにすればよい。培養液中の微生物または培養細胞の濃度は、発酵培養液の環境が微生物または培養細胞の増殖にとって不適切となって死滅する比率が高くならない範囲で、高い状態で維持することが効率よい生産性を得るのに好ましい。一例として、濃度は乾燥重量として５ｇ／Ｌ以上に維持することにより良好な生産効率が得られる。
【００５７】
また、必要に応じて発酵反応槽内から微生物または培養細胞を引き抜くことができる。例えば、発酵反応槽内の微生物または培養細胞濃度が高くなりすぎると、分離膜の閉塞が発生しやすくなる場合があることから、引き抜くことにより閉塞から回避することができる。また、発酵反応槽内の微生物または培養細胞濃度によって化学品の生産性能が変化することがあり、生産性能を指標として微生物または培養細胞を引き抜くことで生産性能を維持させることも可能である。
【００５８】
発酵生産能力のあるフレッシュな菌体を増殖させつつ行う連続培養操作は、通常、培養管理上単一の発酵反応槽で行うことが好ましい。しかしながら、菌体を増殖しつつ生産物を生成する連続培養法であれば、発酵反応槽の数は問わない。発酵反応槽の容量が小さい等の理由から、複数の発酵反応槽を用いることもあり得る。この場合、複数の発酵反応槽を配管で並列または直列に接続して連続培養を行っても発酵生産物の高生産性は得られる。
【００５９】
また本発明では、別の培養槽で微生物もしくは培養細胞を培養し、培養されたフレッシュな微生物もしくは培養細胞を含む培養液を培養槽から発酵反応槽に供給する装置（移送手段）を介して発酵反応槽に供給しながら連続発酵する。すなわち、発酵能力が高い状態の微生物もしくは培養細胞を含む培養液を培養槽から発酵反応槽に供給することにより、常に高い化学品の生産性能を維持させることができる。
【００６０】
培養槽における微生物もしくは培養細胞の培養条件は、微生物もしくは培養細胞が増殖できる条件であればよいが、好ましくは高い増殖速度を示す条件であることが望ましい。
【００６１】
また培養に用いられる培養培地も微生物もしくは培養細胞が増殖し得る組成の培地を用いればよいが、好ましくは高い増殖速度を示す組成の培地を用いることが望ましい。
【００６２】
培養槽内における培養方法は、回分式であっても良いし連続式であっても良い。培養槽から発酵反応槽への微生物もしくは培養細胞を含む培養液の供給方法は、所望の化学品の生産能力を維持するように供給することが望ましい。例えば、発酵反応槽内の濁度、生存微生物・細胞濃度あるいは化学品の生産能力を指標にして供給することも可能である。また、発酵液の供給は連続的であっても良いし間欠的であっても良く、また、ポンプ等の動力を用いても良く、自然落下による供給でもよい。
【００６３】
本発明で使用される微生物や培養細胞としては、例えば、発酵工業においてよく使用されるパン酵母などの酵母、大腸菌、コリネ型細菌などのバクテリア、糸状菌、放線菌、動物細胞および昆虫細胞などが挙げられる。使用する微生物や細胞は、自然環境から単離されたものでもよく、また、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。
【００６４】
本発明の連続発酵装置で製造される化学品は、上記の微生物や培養細胞が発酵培養液中に生産する物質であれば特に制限はないが、例えば、アルコール、有機酸、アミノ酸および核酸など発酵工業において大量生産されている物質を挙げることができる。アルコールとしては、例えば、エタノール、１，３−プロパンジオール、１,４−ブタンジオールおよびグリセロールなどが挙げられる。また有機酸としては、例えば、酢酸、乳酸、ピルビン酸、コハク酸、リンゴ酸、イタコン酸、クエン酸が挙げられ、核酸としては、イノシンやグアノシンなどのヌクレオシド、イノシン酸、グアニル酸などのヌクレオチドが挙げられる。また、化学品のその他の例としては、カダベリンなどのジアミン化合物、抗生物質、酵素、組換えタンパク質が挙げられる。本発明の連続発酵装置を用いることにより、上記化学品の高い生産性を得ることができる。
【００６５】
次に、本発明の連続発酵装置を用いて行われる連続発酵の形態について説明する。
【００６６】
従来の連続発酵培養は、発酵反応槽へ新鮮培地を一定速度で供給し、これと同量の発酵培養液を槽外へ排出することによって、発酵反応槽内の液量を常に一定に保つ培養法である。回分培養では、初発基質濃度が消費されると発酵培養が終了するが、連続発酵培養では、理論的には無限に発酵培養を持続させることができる。
【００６７】
一般に回分培養では、微生物の増殖、基質の消費および微生物の生産物により、微生物濃度、基質濃度、生産物濃度、ｐＨおよび溶存酸素等の微生物のおかれた環境条件が、発酵培養時間の経過に伴って変化する。それに対して、連続発酵培養においては、これらの環境条件が一定に保たれた状態（定常状態）が出現し且つ持続する。
【００６８】
一方、上述従来の連続培養では発酵培養液と共に微生物も槽外に排出され、発酵反応槽内の微生物濃度を高く維持することは難しい。ここで、発酵生産を行う場合には発酵を行う微生物を高濃度に保つことができれば、発酵容積当たりの発酵生産効率を向上させることができる。そのためには、微生物を発酵反応槽内に保持、あるいは還流させる必要がある。微生物を発酵反応槽内に保持あるいは還流させる方法としては、排出された発酵培養液を重力、例えば、遠心分離により固液分離し、沈殿物である微生物を発酵反応槽に返送する方法、濾過することにより固形分である微生物を分離し、発酵培養液上清のみを発酵反応槽外に排出する方法等が挙げられる。しかしながら、遠心分離による方法は動力費が高く現実的ではない。濾過による方法は、前述のように濾過するために高い圧力要することから、実験室レベルでの検討がほとんどである。
【００６９】
ここで、本発明の連続発酵装置の基本構成と特徴について説明する。本発明の連続発酵装置の主たる構成は、微生物もしくは培養細胞を培養する培養槽と、微生物もしくは培養細胞の連続発酵を行う発酵反応槽と、該培養槽で培養した微生物もしくは培養細胞を培養槽から発酵反応槽へ供給する移送手段と、発酵培養液を濾過するための分離膜を有する分離膜エレメントと、該分離膜の膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲に制御する手段である。多孔性膜は、発酵反応槽の外部に設置しても良いし、内部に設置してもよい。ここで使用される多孔性膜は、平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満である。
【００７０】
従来の連続発酵装置、例えば、セラミックフィルター等の従来の濾過装置を用いた発酵液の分離濾過時に高いろ過圧力が必要であるが、発酵装置内を加圧状態で保つことが困難なことから、濾過分離装置は発酵反応槽の外部に設置されていたが、本発明の連続発酵装置においては、濾過圧力である膜間差圧が０.１から２０ｋＰａの範囲であり、特別に発酵槽内を加圧状態に保つ必要がないことから、多孔性膜を有する分離膜エレメントを設置する位置は、発酵反応槽の内部でもあってもよいし、外部であっても良い。
【００７１】
すなわち、分離膜エレメントは、上述のように発酵反応槽外に設置しても良いし、発酵反応槽内に設置しても良い。発酵反応槽外に設置する場合には、上述のように別途、膜分離槽を設けてその内部に分離膜エレメントを設置することができ、発酵反応槽と膜分離槽の間を発酵培養液を循環させながら、分離膜エレメントにより発酵培養液を連続的に濾過することができる。膜分離槽は、高圧蒸気滅菌可能なことが望ましく、このようにすることにより雑菌からの汚染回避を可能となる。
【００７２】
本発明の連続発酵装置の分離膜エレメントを構成する分離膜ならびに支持材部材は、高圧蒸気滅菌操作に耐性の部材を用いることが好ましい。これにより分離膜エレメントを含む発酵反応槽内を滅菌可能とすることができる。発酵反応槽内が滅菌可能であれば、連続発酵培養時に好ましくない微生物による汚染の危険を回避できることから、安定した連続発酵培養が可能となる。分離膜エレメントを構成する分離膜ならびに支持材部材は、高圧蒸気滅菌操作の条件である１２１℃の温度で１５分間という条件に耐性であれば、分離膜ならびに支持材部材の種類は特に限定されない。分離膜の素材としては上述の分離膜として用いられる多孔性膜の素材を用いることが可能である。また、支持材部材としては、例えば、ステンレスやアルミニウムなどの金属、あるいはポリアミド系樹脂、フッ素系樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリアセタール系樹脂、ポリブチレンテレフタレート系樹脂、ＰＶＤＦ、変性ポリフェニレンエーテル系樹脂およびポリサルホン系樹脂等を好ましく選定することができる。
【００７３】
次に、本発明の連続発酵で用いられる膜分離型の連続発酵装置のうち、分離膜エレメントが、発酵反応槽の外部に設置された代表的な一例を図１に示す。図１は、本発明で用いられる膜分離型の連続発酵装置の一つの実施の形態を説明するための概略側面図である。
【００７４】
図１において、連続発酵装置は、微生物もしくは培養細胞を培養する培養槽１７と、微生物もしくは培養細胞の連続発酵を行う発酵反応槽１と、前記の培養槽１７で培養した微生物もしくは培養細胞を培養槽１７から発酵反応槽１へ供給する移送手段１８と、該発酵反応槽１に発酵培養液循環手段（発酵培養液循環ポンプ１１）を介して接続され内部に発酵培養液を濾過するための分離膜を有する分離膜エレメントを２備えた膜分離槽１２と、水頭差制御装置３と、該分離膜の膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲に制御する手段で構成されている。
【００７５】
上記のように、膜分離槽１２は、発酵液循環ポンプ１１を介して発酵反応槽１に接続されており、また分離膜エレメント２には多孔性膜が組み込まれている。この多孔性膜としては、例えば、国際公開第２００２／０６４２４０号パンフレットに開示されている分離膜および分離膜エレメントを使用することが好適である。分離膜エレメントについては、後で具体的に説明する。
【００７６】
図１において、培地供給ポンプ７によって培地を発酵反応槽１に投入し、必要に応じて、攪拌機５で発酵反応槽１内の発酵培養液を攪拌することができる。また必要に応じて、気体供給装置４によって必要とする気体を供給することができる。このとき、供給した気体を回収リサイクルして再び気体供給装置４によって供給することができる。また、必要に応じて、ｐＨセンサ・制御装置９およびｐＨ調整溶液供給ポンプ８によって発酵培養液のｐＨを調整することができる。また必要に応じて、温度調節器１０によって発酵培養液の温度を調節することにより、生産性の高い発酵生産を行うことができる。
【００７７】
さらに、装置内の発酵培養液は、発酵培養液循環ポンプ１１によって発酵反応槽１と膜分離槽１２の間を循環する。発酵生産物を含む発酵培養液は、分離膜エレメント２によって微生物と発酵生産物に濾過・分離され、装置系から取り出すことができる。
【００７８】
また、濾過・分離された微生物または培養細胞は、装置系内に留まることにより装置系内の微生物濃度を高く維持することができ、生産性の高い発酵生産を可能としている。ここで、分離膜を備えた分離膜エレメント２による発酵培養液の濾過・分離は、膜分離槽１２の水面との水頭差圧によって行うことができ、特別な動力は必要ない。また、必要に応じて、レベルセンサ６および水頭差圧制御装置３によって、分離膜エレメント２の濾過・分離速度および装置系内の発酵培養液量を適当に調節することができる。
【００７９】
上記のように、分離膜エレメント２による濾過・分離は、水頭差圧によって行うことができるが、必要に応じて、ポンプによる吸引濾過あるいは気体・液体等で装置系内を加圧することにより濾過・分離することもできる。このような手段により、膜間差圧を制御することができる。
【００８０】
本発明の連続発酵装置では、発酵生産に用いられる微生物または培養細胞を、別途設けた培養槽１７で培養し、得られた培養液を発酵反応槽１に供給する。具体的には、培養槽１７で連続発酵のために微生物または培養細胞を培養し、培養した微生物または培養細胞を発酵反応槽１に送るための移送手段１８により発酵反応槽１に供給する。培養槽１７は、化学品を生産し得る微生物または培養細胞を培養する。培養槽１７の構造は、例えば、フラスコ等の容器を用いても良いし、ジャーファーメンターなどの培養装置を用いてもよい。培養槽１７の規模は、発酵反応槽１の容積を超えないことが望ましく、さらに好ましくは発酵反応槽１の容積の１／１０以下の容積であることが望ましい。
【００８１】
培養槽１７内における培養方式は、バッチ式であっても良いし連続式であってもよい。培養した微生物または培養細胞の移送手段１８にはポンプ等の動力を用いてもよいし、自然落下によって移送しても良い。このようにすることにより、常にフレッシュで化学品の生産能力の高い微生物または培養細胞による連続発酵が可能となり、高い生産性能を長期間維持した連続発酵が可能となる。
【００８２】
上記のように、図１では分離膜エレメント２を膜分離槽１２外に設置する形態を例示したが、分離膜エレメント２を発酵反応槽１内に設置することができる。分離膜エレメント２を発酵反応槽１内に設置した場合は、膜分離槽１２、発酵培養液循環ポンプ１１およびそれに付帯する設備を省略することができる。また、分離膜エレメント２を発酵反応槽１内に設置した場合における分離膜エレメント２による濾過・分離は、発酵反応槽１との水頭差圧によって行うことができ、特別な動力は必要ない。
【００８３】
次に、本発明の連続発酵装置のうち、分離膜エレメント２が発酵反応槽１の内部に設置された代表的な一例を図２に示す。図２は、本発明で用いられる膜分離型の他の連続発酵装置の一つの実施の形態を説明するための概略側面図である。
【００８４】
図２において、連続発酵装置は、微生物もしくは培養細胞を培養する培養槽１７と、培養した微生物もしくは培養細胞の連続発酵を行う発酵反応槽１と、該培養槽１７で培養した微生物もしくは培養細胞を培養槽１７から発酵反応槽１へ供給する移送手段１８と、該発酵反応槽１内に配設され発酵培養液を濾過するための分離膜を有する分離膜エレメント２と、該分離膜エレメント２に接続され濾過された発酵生産物を含む透過液を排出するための手段（集水ポンプ１９）と、水頭差制御装置３と、該分離膜の膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲に制御するための手段で構成されている。
【００８５】
この多孔性膜としては、例えば、国際公開第２００２／０６４２４０号パンフレットに開示されている分離膜および分離膜エレメントを使用することができる。分離膜エレメントに関しては、追って詳述する。
【００８６】
次に、図１の膜分離型の連続発酵装置による連続発酵の形態について説明する。培地供給ポンプ７によって、培地を発酵反応槽１内に連続的もしくは断続的に投入する。培地については、発酵反応槽１内に投入する前に、必要に応じて加熱殺菌、加熱滅菌あるいはフィルターを用いた滅菌処理を行うことができる。発酵生産時には、必要に応じて、発酵反応槽１内の攪拌機５で発酵反応槽１内の発酵培養液を攪拌することができる。また必要に応じて、気体供給装置４によって必要とする気体を発酵反応槽１内に供給することができる。このとき、供給した気体を回収リサイクルして再び気体供給装置４に供給することができる。また必要に応じて、ｐＨセンサ・制御装置９およびｐＨ調整溶液供給ポンプ８によって発酵反応槽１内の発酵培養液のｐＨを調整することができる。また必要に応じて、温度調節器１０によって発酵反応槽１内の発酵培養液の温度を調節することにより生産性の高い発酵生産を行うことができる。
【００８７】
ここでは、計装・制御装置による発酵培養液の物理化学的条件の調節に、ｐＨおよび温度の調節を例示したが、必要に応じて、溶存酸素やＯＲＰの制御を行うことができ、更にはオンラインケミカルセンサーなどの分析装置により発酵培養液中の微生物の濃度を測定し、それを指標とした物理化学的条件の制御を行うことができる。また、培地の連続的もしくは断続的投入の形態に関しては、特に限定されるものではないが、上記の計装・制御装置による発酵培養液の物理化学的環境の測定値を指標として、培地投入量および速度を適宜調節することができる。
【００８８】
発酵培養液は、発酵反応槽１内に設置された分離膜エレメント２によって、微生物または培養細胞と発酵生産物に濾過・分離され連続発酵装置系から排出され取り出される。この排出の方法については下記に詳述する。
【００８９】
また、濾過・分離された微生物または培養細胞は、装置系内に留まることにより装置系内の微生物濃度を高く維持することができ、生産性の高い発酵生産を可能としている。ここで、分離膜エレメント２による濾過・分離は、発酵反応槽１の水面との水頭差圧によって行い、特別な動力を必要としない。また、必要に応じて、レベルセンサ６および水頭差圧制御装置３によって、分離膜エレメント２の濾過・分離速度およびよび発酵反応槽１内の発酵培養液量を適当に調節することができる。上記の分離膜エレメント２による濾過・分離は、水頭差圧によって行うことを例示したが、必要に応じて、ポンプによる吸引濾過あるいは液体や気体等により装置系内を加圧することにより、濾過・分離することもできる。
【００９０】
すなわち、膜間差圧を制御するための手段として、発酵培養液と多孔性膜処理水の液位差を制御する水頭差制御装置３や、加圧ポンプまたは／および吸引ポンプを用いることができ、また、気体または液体の圧力によって膜間差圧を制御することができることから、長期間安定な発酵生産が可能となる。
【００９１】
なお本発明の連続発酵装置では、前述の通り発酵生産に用いられる微生物または培養細胞を、別途設けた培養槽１７で培養し、得られた培養液を発酵反応槽１に供給する。具体的には、培養槽１７で連続発酵のために微生物または培養細胞を培養し、培養した微生物または培養細胞を発酵反応槽１に送るための移送手段１８により発酵反応槽１に供給する。移送手段１８にはポンプ等の動力を用いてもよいし、自然落下によって移送しても良い。このようにすることにより、常にフレッシュで化学品の生産能力の高い微生物または培養細胞による連続発酵が可能となり、高い生産性能を長期間維持した連続発酵が可能となる。
【００９２】
本発明で用いられる分離膜エレメント２の好適な形態の例である国際公開第２００２／０６４２４０号パンフレットに開示されている分離膜および分離膜エレメントを、以下、図面を用いてその概略を説明する。図３は、本発明で用いられる分離膜エレメントの一つの実施の形態を説明するための概略斜視図である。
【００９３】
分離膜エレメントは、図３に示すように、剛性を有する支持板１３の両面に、流路材１４と分離膜１５とをこの順序で配し構成されている。支持板１３は、両面に凹部１６を有している。分離膜１５は発酵培養液を濾過する。流路材１４は、分離膜１５で濾過された透過水を効率よく支持板１３に流すためのものである。支持板１３に流れた発酵生成物を含む透過液は、支持板１３の凹部１６を通り、排出手段である集水パイプ１９を経て連続発酵装置外部に取り出される。ここで、上述の水頭差圧、ポンプ、液体や気体等による吸引濾過、あるいは装置系内を加圧するなどの方法を、透過水を取り出すための動力として用いることができる。
【００９４】
次に、図４に示す分離膜エレメントについて説明する。図４は、本発明で用いられる別の分離膜エレメントを例示説明するための概略斜視図である。分離膜エレメントは、図４に示すように、中空糸膜（多孔性膜）で構成された分離膜束２０と上部樹脂封止層２１と下部樹脂封止層２２によって主に構成される。分離膜束２０は、上部樹脂封止層２１および下部樹脂封止層２２よって束状に接着・固定化されている。下部樹脂封止層２２による接着・固定化は、分離膜束２０の中空糸膜（多孔性膜）の中空部を封止しており、発酵培養液の漏出を防ぐ構造になっている。一方、上部樹脂封止層２１は、分離膜束２０の中空糸膜（多孔性膜）の内孔を封止しておらず、集水パイプ２４に透過水が流れる構造となっている。この分離膜エレメントは、支持フレーム２３を介して連続発酵装置内に設置することが可能である。分離膜束２０によって濾過された透過水は、中空糸膜の中空部を通り、集水パイプ２４を介して連続発酵装置外部に取り出される。透過水を取り出すための動力として、水頭差圧、ポンプ、液体や気体等による吸引濾過、あるいは装置系内を加圧するなどの方法を用いることができる。
【００９５】
本発明に従って連続発酵を行った場合、従来のバッチ発酵と比較して、高い体積生産速度が得られ、極めて効率のよい発酵生産が可能となる。ここで、連続発酵培養における生産速度は、次の式（３）で計算される。
【００９６】
・発酵生産速度（ｇ／Ｌ／ｈｒ）＝抜き取り液中の生産物濃度（ｇ／Ｌ）×発酵培養液抜き取り速度（Ｌ／ｈｒ）÷装置の運転液量（Ｌ）・・・・（式３）。
【００９７】
また、バッチ培養での発酵生産速度は、原料炭素源をすべて消費した時点の生産物量（ｇ）を、炭素源の消費に要した時間（ｈ）とその時点の発酵培養液量（Ｌ）で除して求められる。
【実施例】
【００９８】
以下、本発明の連続発酵装置をさらに詳細に説明するために、発酵生産物である化学品としてＬ−乳酸を選定し、図１および図２に示す連続発酵装置を用いた連続的なＬ−乳酸の製造について、実施例を挙げて説明する。本発明は、これらの実施例に限定されない。
【００９９】
ここで、Ｌ−乳酸を生産させる微生物としては、酵母サッカロミセス・セレビセ（Saccharomyces cerevisae）を用いた。サッカロミセス・セレビセは、本来Ｌ−乳酸発酵を持たないが、Ｌ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子をサッカロミセス・セレビセに導入することによりＬ−乳酸発酵能力をもつサッカロミセス・セレビセ株を造成し実施した。具体的には、ヒト由来ＬＤＨ遺伝子を酵母ゲノム上のＰＤＣ１プロモーターの下流に連結することにより、Ｌ−乳酸発酵能力を持つ酵母株を造成して使用した。
【０１００】
（実施例１）連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その１）
図１の連続発酵装置を稼働させることにより、Ｌ−乳酸連続発酵系が得られるかどうかを調べるため、表１に示す組成の酵母乳酸発酵培地を用い、培養槽で別途培養したフレッシュな酵母を発酵反応槽に移送しながら連続発酵試験を行った。連続発酵試験を行った。図１の連続発酵装置は、本発明の一実施の形態を示すものであり、本発明はその形態になんら限定されるものではない。該酵母乳酸発酵培地は、１２１℃の温度で１５分間、高圧蒸気滅菌して用いた。分離膜エレメントの基材部材には、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成型品を用い、分離膜には後述する参考例２で作製した多孔性膜を用いた。実施例１における運転条件は、特に断らない限り、下記のとおりである。
【０１０１】
・発酵反応槽容量：２（Ｌ）
・膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
・使用分離膜：ＰＶＤＦ濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
・温度調整：３０（℃）
・発酵反応槽通気量：０．０５（Ｌ／ｍｉｎ）
・膜分離槽通気量：０．３（Ｌ／ｍｉｎ）
・発酵反応槽攪拌速度：１００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ５に調整
・乳酸発酵培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
・発酵培養液循環装置による循環液量：０．１（Ｌ／ｍｉｎ）
・膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御
（連続発酵開始後〜８０時間：０．１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下で制御、８０時間〜１６０時間：０．１ｋＰａ以上２ｋＰａ以下で制御、１６０時間〜２４０時間：０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御。）。
【０１０２】
微生物として後述する参考例１で造成した酵母ＳＷ−１株を用い、培地として表１に示す組成の乳酸発酵培地を用い、発酵生産物であるＬ−乳酸の濃度の評価には、後述する参考例１に示したＨＰＬＣを用い、グルコース濃度の測定には“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬社製）を用いた。
【０１０３】
【表１】
【０１０４】
まず、試験管中で５ｍｌの乳酸発酵培地を用いＳＷ−１株を一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を新鮮な乳酸発酵培地１００ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコ中で２４時間、３０℃の温度で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図１に示した膜分離型連続発酵装置の１．５Ｌの乳酸発酵培地に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって４００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１の通気量の調整、温度調整およびｐＨ調整を行った。発酵培養液循環ポンプ１１を稼働させることなく、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、発酵培養液循環ポンプ１１を稼働させた。前培養時の運転条件に加え、膜分離槽２を通気し、乳酸発酵培地の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵培養液量を２Ｌとなるように膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるＬ−乳酸の製造を行った。連続発酵期間中に、予め５００ｍｌ容坂口フラスコ中で乳酸発酵培地を用いてＯＤ＝１５まで別途培養しておいたＳＷ−１株を含む１５０ｍｌの培養液を、１時間にあたり５ｍｌずつ発酵反応槽１に移送した。坂口フラスコによる培養を適宜行い得られた培養液を発酵反応槽１に補充することにより、継続して移送を続けた。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置３により水頭差を膜間差圧として測定し、上記の膜透過水量制御条件で変化させることで行った。連続発酵の期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。適宜、膜透過発酵液中の生産されたＬ−乳酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。３００時間の連続発酵試験を行った結果を表２に示す。その結果、図１の連続発酵装置を用いることにより、安定したＬ−乳酸の連続発酵による製造が可能であることを確認することができた。
【０１０５】
（実施例２）連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その２）
分離膜として参考例３で作製した多孔性膜を用い、実施例１と同様のＬ−乳酸連続発酵試験を行った。その結果を表２に示す。その結果、安定したＬ−乳酸の連続発酵による製造が可能であることを確認することができた。実施例２においても連続発酵の期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。
【０１０６】
（実施例３）連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その３）
分離膜として参考例４で作製した多孔性膜を用い、実施例１と同様のＬ−乳酸連続発酵試験を行った。その結果を表２に示す。その結果、安定したＬ−乳酸の連続発酵による製造が可能であることが確認できた。実施例３においても連続発酵の期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。
【０１０７】
（実施例４）連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その４）
図２の連続発酵装置を稼働させることにより、Ｌ−乳酸連続発酵系が得られるかどうかを調べるため、表１に示す組成の乳酸発酵培地を用い、培養槽で別途培養したフレッシュな酵母を発酵反応槽に移送しながら連続発酵試験を行った。該乳酸発酵培地は、１２１℃の温度で１５分間、高圧蒸気滅菌して用いた。分離膜エレメントの基材部材には、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成型品を用い、分離膜には後述する参考例１で作製した多孔性膜を用いた。この実施例４における運転条件は、特に断らない限り、下記のとおりである。
【０１０８】
・発酵反応槽容量：２（Ｌ）
・使用分離膜：ＰＶＤＦ濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
・温度調整：３０（℃）
・発酵反応槽通気量：０．０５（Ｌ／ｍｉｎ）
・乳酸発酵培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
・発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ５に調整
・膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御
（連続発酵開始後〜８０時間：０．１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下で制御、８０時間〜１６０時間：０．１ｋＰａ以上２ｋＰａ以下で制御、１６０時間〜２４０時間：０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）
・滅菌：分離膜エレメントを含む培養槽、および使用培地は総て１２１℃の温度で２０分間のオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。
【０１０９】
微生物として参考例１で造成した酵母ＳＷ−１株を用い、培地として表１に示す組成の乳酸発酵培地を用い、発酵生産物であるＬ−乳酸の濃度の評価には、後述する参考例１に示したＨＰＬＣを用い、グルコース濃度の測定には“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬）を用いた。
【０１１０】
まず、ＳＷ−１株を試験管中で５ｍｌの乳酸発酵培地で一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を新鮮な乳酸発酵培地１００ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコ中で２４時間、３０℃の温度で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図２に示した連続発酵装置の１．５Ｌの乳酸発酵培地に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって４００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１の通気量の調整、温度調整およびｐＨ調整を行い、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、乳酸発酵培地の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵培養液量が１．５Ｌとなるように膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるＬ−乳酸の製造を行った。連続発酵期間中に、予め５００ｍｌ容坂口フラスコ中で乳酸発酵培地を用いてＯＤ＝１５まで別途培養しておいたＳＷ−１株を含む１５０ｍｌの培養液を１時間にあたり５ｍｌずつ発酵反応槽１に移送した。坂口フラスコによる培養を適宜行い培養液を補充することにより、継続して移送を続けた。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置３により水頭差を膜間差圧として測定し、上記の膜透過水量制御条件で変化させることで行った。連続発酵の期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。適宜、膜透過発酵液中の生産されたＬ−乳酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。また、Ｌ−乳酸およびグルコース濃度から算出された投入グルコースから算出されたＬ−乳酸対糖収率とＬ−乳酸生産速度を表２に示した。２４０時間の発酵試験を行った結果、図２の連続発酵装置を用いることにより、安定したＬ−乳酸の連続発酵による製造が可能であることを確認することができた。
【０１１１】
（実施例５）連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その５）
分離膜には述する参考例３で作製した多孔性膜を用い、実施例４と同様のＬ−乳酸連続発酵試験を行った。その結果を表２に示す。その結果、安定したＬ−乳酸の連続発酵による製造が可能であることを確認することができた。
【０１１２】
（実施例６）連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その６）
分離膜に後述する参考例４で作製した多孔性膜を用い、実施例５と同様のＬ−乳酸連続発酵試験を行った。その結果を表２に示す。その結果、安定したＬ−乳酸の連続発酵による製造が可能であることを確認することができた。
【０１１３】
（実施例７）連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その７）
分離膜には述する参考例６で作製した中空糸多孔性膜を用い、実施例１と同様のＬ−乳酸連続発酵試験を行った。その結果を表２に示す。その結果、安定したＬ−乳酸の連続発酵による製造が可能であることを確認することができた。
【０１１４】
（実施例８）連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その８）
分離膜に後述する参考例６で作製した中空糸多孔性膜を用い、実施例４と同様のＬ−乳酸連続発酵試験を行った。その結果を表２に示す。その結果、安定したＬ−乳酸の連続発酵による製造が可能であることを確認することができた。
【０１１５】
（比較例１）回分発酵によるＬ−乳酸の製造
図１および図２に示す連続発酵装置を用いることによりＬ−乳酸発酵生産性が向上するかどうかを調べるため、微生物を用いた発酵形態として最も典型的な回分発酵を行い、その乳酸生産性を評価した。表１に示す乳酸発酵培地を用い、ミニジャーファメンター（ＡＢＬＥ社製、ＢＭＪ型、２Ｌ）による回分発酵試験を行った。該乳酸発酵培地は、１２１℃の温度で１５分間、高圧蒸気滅菌して用いた。この比較例１では、微生物として参考例１で造成した酵母ＳＷ−１株を用い、発酵生産物であるＬ−乳酸の濃度の評価には、後述する参考例１に示したＨＰＬＣを用いて評価し、グルコース濃度の測定には“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬社製）を用いた。比較例２の運転条件を以下に示す。
【０１１６】
・発酵反応槽容量（乳酸発酵培地量）：１（Ｌ）
・温度調整：３０（℃）
・発酵反応槽通気量：０．０５（Ｌ／ｍｉｎ）
・発酵反応槽攪拌速度：１００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ５に調整。
【０１１７】
まず、ＳＷ−１株を試験管中で５ｍｌの乳酸発酵培地で一晩振とう培養した（前々培養）。前々培養液を新鮮な乳酸発酵培地１００ｍｌに植菌し５００ｍｌ容坂口フラスコ中で２４時間振とう培養した（前培養）。前培養液をミニジャーファメンターの１Ｌの乳酸発酵培地に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５で１００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１を通気した。温度調整とｐＨ調整を行い、回分発酵培養を行った。このときの菌体増殖量は、６００ｎｍでの吸光度で１４であった。回分発酵の結果を、実施例１から６の連続発酵試験で得られたＬ―乳酸発酵生産性と比較して表２に示す。表２の実施例１〜６の結果では、別途培養し発酵反応槽に移送したＳＷ−１株培養液中に含まれるＬ−乳酸量を差し引いた各値を示している。これらの比較の結果、図１および図２の連続発酵装置を用いることにより、Ｌ−乳酸の生産速度が大幅に向上することを明らかにすることができた。すなわち、本発明によって開示された多孔性膜を組み込んだ膜分離型の連続発酵装置を用い、膜間差圧を制御することにより、発酵培養液を分離膜によって濾液と未濾過液に分離し、濾液から所望の発酵生産物を回収するとともに、未濾過液を発酵培養液に戻す連続発酵方法を可能とし、微生物量を高く維持しながら、連続発酵によるＬ―乳酸等の化学品の製造が可能であることが明らかとなった。
【０１１８】
【表２】
【０１１９】
（比較例２）連続発酵によるＬ−乳酸の製造
細孔径が小さく、純水透過係数が小さい多孔性膜を用い、図１の膜分離型連続発酵装置を稼働させることにより、Ｌ−乳酸連続発酵系が得られるかどうかを調べるため、表１に示す組成の酵母乳酸発酵培地を用い、この装置による連続発酵試験を行った。比較例２は、分離膜としては参考例５で作製した細孔径が小さく、純水透過係数が小さい多孔性膜を用い、膜透過水量制御方法を膜間差圧による流量制御（連続発酵全期間０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）し、その他試験条件は実施例２と同様に行った。その結果、培養開始後７２時間で、膜間差圧が２０ｋＰａを超え膜の閉塞が発生したため、連続発酵を停止した。このことから、本発明の連続発酵装置には、参考例５で作製した多孔性膜は不適であることが明らかになった。
【０１２０】
（比較例３）連続発酵によるＬ−乳酸の製造
細孔径が小さく、純水透過係数が小さい多孔性膜を用い、図２の膜分離型連続発酵装置を稼働させることにより、Ｌ−乳酸連続発酵系が得られるかどうかを調べるため、表１に示す組成の酵母乳酸発酵培地を用い、この装置による連続発酵試験を行った。この比較例３では、分離膜としては参考例５で作製した細孔径が小さく、純水透過係数が小さい多孔性膜を用い、膜透過水量制御方法を膜間差圧による流量制御（連続発酵全期間０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）し、その他試験条件は実施例４と同様に行った。その結果、培養開始後８０時間で、膜間差圧が２０ｋＰａを超え膜の閉塞が発生したため、連続発酵を停止した。このことから、本発明の連続発酵装置には、参考例５で作製した多孔性膜は不適であることが明らかになった。
【０１２１】
（参考例１）乳酸生産能力を持つ酵母株（ＳＷ−１株）の作製
乳酸生産能力を持つ酵母株を、下記のように造成した。具体的には、ヒト由来ＬＤＨ遺伝子を酵母ゲノム上のＰＤＣ１プロモーターの下流に連結することにより、Ｌ−乳酸生産能力を持つ酵母株を造成する。ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）には、Ｌａ−Ｔａｑ（宝酒造社製）あるいはKOD-Plus-polymerase（東洋紡社製）を用い、付属の取扱説明に従って行った。
【０１２２】
ヒト乳ガン株化細胞（ＭＣＦ−７）を培養回収後、TRIZOL Reagent（Invitrogen）を用いてtotal ＲＮＡを抽出し、得られたtotal ＲＮＡを鋳型としてSuperScript Choice System（Invitrogen）を用いた逆転写反応によりｃＤＮＡの合成を行った。これらの操作の詳細は、それぞれ付属のプロトコールに従った。得られたｃＤＮＡを、続くＰＣＲの増幅鋳型とした。
【０１２３】
上記の操作で得られたｃＤＮＡを増幅鋳型とし、配列番号１および配列番号２で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたKOD-Plus-polymeraseによるＰＣＲによりＬ−ｌｄｈ遺伝子のクローニングを行った。各ＰＣＲ増幅断片を精製し末端をT4 Polynucleotide Kinase（TAKARA社製）によりリン酸化後、ｐＵＣ１１８ベクター（制限酵素HincIIで切断し、切断面を脱リン酸化処理したもの）にライゲーションした。ライゲーションは、DNA Ligation Kit Ver.2（TAKARA社製）を用いて行った。ライゲーションプラスミド産物で大腸菌DH５αを形質転換し、プラスミドＤＮＡを回収することにより、各種Ｌ−ｌｄｈ遺伝子（配列番号３）がサブクローニングされたプラスミドを得た。得られたＬ−ｌｄｈ遺伝子が挿入されたｐＵＣ１１８プラスミドを制限酵素ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、得られた各ＤＮＡ断片を酵母発現用ベクターｐＴＲＳ１１（図４）のＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断部位に挿入した。このようにして、ヒト由来Ｌ−ｌｄｈ遺伝子発現プラスミドｐＬ−ｌｄｈ５（Ｌ−ｌｄｈ遺伝子）を得た。ヒト由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子発現ベクターである上記ｐＬ−ｌｄｈ５は、プラスミド単独で独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１中央第６）にＦＥＲＭＡＰ−２０４２１として寄託した（寄託日：平成１７年２月２１日）。
【０１２４】
ヒト由来ＬＤＨ遺伝子を含むプラスミドｐＬ−ｌｄｈ５を増幅鋳型とし、配列番号４および配列番号５で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより、１．３ｋｂのヒト由来ＬＤＨ遺伝子、及びサッカロミセス・セレビセ由来のＴＤＨ３遺伝子のターミネーター配列含むＤＮＡ断片を増幅した。また、プラスミドｐＲＳ４２４を増幅鋳型として、配列番号６および配列番号７で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより、１．２ｋｂのサッカロミセス・セレビセ由来のＴＲＰ１遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。それぞれのＤＮＡ断片を、１．５％アガロースゲル電気泳動により分離し、常法に従い精製した。ここで得られた１．３ｋｂ断片と１．２ｋｂ断片を混合したものを増幅鋳型とし、配列番号４および配列番号７で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲ法によって得られた産物を１．５％アガロースゲル電気泳動して、ヒト由来ＬＤＨ遺伝子およびＴＲＰ１遺伝子が連結された２．５ｋｂのＤＮＡ断片を、常法に従い調整した。この２．５ｋｂのＤＮＡ断片で、出芽酵母ＮＢＲＣ１０５０５株を常法に従いトリプトファン非要求性に形質転換した。
【０１２５】
得られた形質転換細胞が、ヒト由来ＬＤＨ遺伝子を酵母ゲノム上のＰＤＣ１プロモーターの下流に連結されている細胞であることの確認は、下記のようにして行った。まず、形質転換細胞のゲノムＤＮＡを常法に従って調製し、これを増幅鋳型とした配列番号８および配列番号９で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより０．７ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られることにより確認した。また、形質転換細胞が乳酸生産能力を持つかどうかは、ＳＣ培地（ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＹＥＡＳＴ ＧＥＮＥＴＩＣＳ ２０００ ＥＤＩＴＩＯＮ、 ＣＳＨＬ ＰＲＥＳＳ）で形質転換細胞を培養した培養上澄に乳酸が含まれていることを、下記に示す条件でＨＰＬＣ法により乳酸量を測定することにより確認した。
【０１２６】
・カラム：Shim-Pack SPR-H（島津社製）
・移動相：５mM ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
・反応液：５mM ｐ−トルエンスルホン酸、２０mM ビストリス、０．１mM EDTA・２Na（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
・検出方法：電気伝導度
・温度：４５℃。
【０１２７】
また、Ｌ−乳酸の光学純度測定は以下の条件でＨＰＬＣ法により測定した。
【０１２８】
・カラム：TSK-gel Enantio L1（東ソー社製）
・移動相：１ｍＭ 硫酸銅水溶液
・流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
・検出方法：ＵＶ２５４ｎｍ
・温度：３０℃。
【０１２９】
また、Ｌ−乳酸の光学純度は次式で計算される。
【０１３０】
・光学純度（％）＝１００×（Ｌ−Ｄ）／（Ｌ＋Ｄ）
ここで、ＬはＬ−乳酸の濃度を表し、ＤはＤ−乳酸の濃度を表す。
【０１３１】
ＨＰＬＣ分析の結果、４ｇ／ＬのＬ−乳酸が検出され、Ｄ−乳酸は検出限界以下であった。以上の検討により、この形質転換体がＬ−乳酸生産能力を持つことが確認された。得られた形質転換細胞を、酵母ＳＷ−１株として、実施例に用いた。
【０１３２】
（参考例２）多孔性膜の作製（その１）
樹脂としてポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）樹脂を、また溶媒としてＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）をそれぞれ用い、これらを９０℃の温度下に十分に攪拌し、次の組成の原液を得た。
【０１３３】
・ＰＶＤＦ：１３．０重量％
・ＤＭＡｃ：８７．０重量％。
【０１３４】
次に、上記原液を２５℃の温度に冷却した後、あらかじめガラス板上に貼り付けて置いた、密度が０．４８ｇ／ｃｍ3で、厚みが２２０μｍのポリエステル繊維製不織布（多孔質基材）に塗布し、直ちに次の組成を有する２５℃の温度の凝固浴中に５分間浸漬して、多孔質基材に多孔質樹脂層が形成された多孔質性膜を得た。
【０１３５】
・水：３０．０重量％
・ＤＭＡｃ：７０．０重量％。
【０１３６】
この多孔質性膜をガラス板から剥がした後、８０℃の温度の熱水に３回浸漬してＤＭＡｃを洗い出し、分離膜（多孔性膜）を得た。多孔質樹脂層表面の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内を、倍率１０，０００倍で走査型電子顕微鏡観察を行ったところ、観察できる細孔すべての直径の平均は０．１μｍであった。次に、上記の分離膜について純水透過係数を評価したところ、５０×１０-9ｍ3／ｍ2・ｓ・Ｐａであった。純水透水量の測定は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで行った。また、平均細孔径の標準偏差 は０．０３５μｍで、膜表面粗さは０．０６μｍであった。
【０１３７】
（参考例３）多孔性膜の作製（その２）
樹脂としてポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）樹脂を、開孔剤として分子量が約２０，０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を、溶媒としてＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）を、そして非溶媒として純水をそれぞれ用い、これらを９０℃の温度下に十分に攪拌し、次の組成の原液を得た。
【０１３８】
・ＰＶＤＦ：１３．０重量％
・ＰＥＧ：５．５重量％
・ＤＭＡｃ：７８．０重量％
・水：３．５重量％。
【０１３９】
次に、上記原液を２５℃の温度に冷却した後、密度が０．４８ｇ／ｃｍ3 で、厚みが２２０μｍのポリエステル繊維製不織布（多孔質基材）に塗布し、塗布後、直ちに２５℃の温度の純水中に５分間浸漬し、さらに８０℃の温度の熱水に３回浸漬してＤＭＡｃおよびＰＥＧを洗い出し、分離膜（多孔性膜）を得た。この分離膜の原液を塗布した側における、多孔質樹脂層表面の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内を、倍率１０，０００倍で走査型電子顕微鏡観察を行ったところ、観察できる細孔すべての直径の平均は０．０２μｍであった。この分離膜について純水透過係数を評価したところ、２×１０-9ｍ3／ｍ2・ｓ・Ｐａであった。透水量の測定は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで行った。また、平均細孔径の標準偏差 は０．００５５μｍで、膜表面粗さは０．１μｍであった。
【０１４０】
（参考例４） 多孔性膜の作製（その３）
下記組成の原液を用いた他は、参考例２と同様にして分離膜（多孔性膜）を得た。
【０１４１】
・ＰＶＤＦ：１３．０重量％
・ＰＥＧ ： ５．５重量％
・ＤＭＡｃ：８１．５重量％。
【０１４２】
この分離膜の原液を塗布した側における、多孔質樹脂層表面の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内を、倍率１０，０００倍で走査型電子顕微鏡観察を行ったところ、観察できる細孔すべての直径の平均は０．１９μｍであり、この分離膜について純水透過係数を評価したところ、１００×１０-9ｍ3／ｍ2・ｓ・Ｐａであった。透水量の測定は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで行った。また、平均細孔径の標準偏差 は０．０６０μｍで、膜表面粗さは０．０８μｍであった。
（参考例５） 多孔性膜の作製（その４）
樹脂としてポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）樹脂を、また溶媒としてＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）をそれぞれ用い、これらを９０℃の温度下に十分に攪拌し、次の組成を有する原液を得た。
【０１４３】
・ＰＶＤＦ：１５．０重量％
・ＤＭＡｃ：８５．０重量％。
【０１４４】
次に、上記原液を２５℃の温度に冷却した後、あらかじめガラス板上に貼り付けて置いた、密度が０．４８ｇ／ｃｍ3、厚みが２２０μｍのポリエステル繊維製不織布（多孔質基材）に塗布し、２５℃の温度の水の凝固浴中に５分間浸漬して、多孔質基材に多孔質樹脂層が形成された多孔性膜を得た。
【０１４５】
この多孔性膜をガラス板から剥がした後、８０℃の温度の熱水に３回浸漬してＤＭＡｃを洗い出し、分離膜を得た。多孔質樹脂層表面の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内を、倍率１０，０００倍で走査型電子顕微鏡観察を行ったところ、観察できる細孔すべての直径の平均は０．００８μｍであった。次に、上記分離膜について純水透水量を評価したところ、０．３×１０-9ｍ3／ｍ2・ｓ・Ｐａであった。透水量の測定は、逆浸透膜による２５℃の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで行った。また、平均細孔径の標準偏差 は０．００２μｍで、膜表面粗さは０．０６μｍであった。
【０１４６】
（参考例６）中空糸多孔性膜の作製
重量平均分子量４１．７万のフッ化ビニリデンホモポリマーとγ-ブチロラクトンとを、それぞれ３８重量％と６２重量％の割合で１７０℃の温度で溶解し原液を作製した。この原液をγ-ブチロラクトンを中空部形成液体として随拌させながら口金から吐出し、温度２０℃のγ-ブチロラクトン８０重量％水溶液からなる冷却浴中で固化して中空糸膜を作製した。
【０１４７】
次いで、重量平均分子量２８．４万のフッ化ビニリデンホモポリマーを１４重量％、セルロースアセテートプロピオネート（イーストマンケミカル社、ＣＡＰ４８２−０．５）を１重量％、Ｎ-メチル-２-ピロリドンを７７重量％、ポリオキシエチレンヤシ油脂肪酸ソルビタン（三洋化成株式会社、商品名イオネットＴ−２０Ｃ）を５重量％、水を３重量％の割合で９５℃の温度で混合溶解して原液を調整した。この原液を、上記で得られた中空糸膜の表面に均一に塗布し、すぐに水浴中で凝固させた本発明で用いる中空糸多孔性膜を製作した。得られた中空糸多孔性膜の被処理水側表面の平均細孔径は、０．０５μｍであった。次に、上記の分離膜である中空糸多孔性膜について純水透水量を評価したところ、５．５×１０-9ｍ3／ｍ2・ｓ・Ｐａであった。透水量の測定は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで行った。また、平均細孔径の標準偏差 は０．００６μｍであった。
【産業上の利用可能性】
【０１４８】
本発明の連続発酵装置では、別の培養槽で微生物もしくは培養細胞を培養し、培養されたフレッシュな発酵能力が高い状態の微生物もしくは培養細胞を含む培養液を培養槽から発酵反応槽に供給しながら連続発酵するから、常に高い化学品の生産性能を維持させることができる。
【０１４９】
また、本発明の連続発酵装置は、簡便な操作条件で、長時間にわたり安定して所望の発酵生産物の高生産性を維持する連続発酵が可能であり、広く発酵工業において、発酵生産物である各種化学品を低コストで安定に生産することができ有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】図１は、本発明で用いられる膜分離型の連続発酵装置の一つの実施の形態を説明するための概略側面図である。
【図２】図２は、本発明で用いられる他の膜分離型連続発酵装置の一つの実施の形態を説明するための概略側面図である。
【図３】図３は、本発明で用いられる分離膜エレメントの一つの実施の形態を説明するための概略斜視図である。
【図４】図４は、本発明で用いられる他の分離膜エレメントの例を説明するための断面説明図である。
【図５】図４は、酵母用発現ベクターｐＴＲＳ１１のフィジカルマップを示す図である。
【符号の説明】
【０１５１】
１ 発酵反応槽
２ 分離膜エレメント
３ 水頭差制御装置
４ 気体供給装置
５ 攪拌機
６ レベルセンサ
７ 培地供給ポンプ
８ ｐＨ調整溶液供給ポンプ
９ ｐＨセンサ・制御装置
１０ 温度調節器
１１ 発酵培養液循環ポンプ
１２ 膜分離槽
１３ 支持板
１４ 流路材
１５ 分離膜
１６ 凹部
１７ 培養槽
１８ 移送手段
１９ 集水パイプ
２０ 分離膜束
２１ 上部樹脂封止層
２２ 下部樹脂封止層
２３ 支持フレーム
２４ 集水パイプ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物または培養細胞の培養方法の改良およびそれに用いられる培養装置に関するものである。さらに詳しくは、本発明は、培養を行いながら、微生物または培養細胞の発酵培養液から、目詰まりが生じにくい多孔性分離膜を通して生産物を含む液を効率よく濾過・回収すること、および未濾過液を発酵培養液に戻すことにより発酵に関与する微生物濃度を向上させ、高い生産性を得る化学品を製造するための連続発酵装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
微生物や培養細胞の培養を伴う物質生産方法である発酵法は、大きく（１）回分発酵法（Ｂａｔｃｈ発酵法）および流加発酵法（Ｆｅｄ−Ｂａｔｃh発酵法）と、（２）連続発酵法に分類することができる。
【０００３】
上記（１）の回分発酵法と流加発酵法は、設備的には簡素であり短時間で培養が終了し、雑菌汚染による被害が少ないという利点がある。しかしながら、これらの方法は時間の経過とともに培養液中の生産物濃度が高くなり、浸透圧あるいは生産物阻害等の影響により生産性および収率が低下してくる。そのためこれらの発酵法は、長時間にわたり安定して高収率かつ高生産性を維持することが困難である。
【０００４】
一方、上記（２）の連続発酵法は、発酵反応槽内で目的物質が高濃度に蓄積することを回避することによって、長時間にわたって高収率かつ高生産性を維持できるという特徴がある。Ｌ−グルタミン酸（特許文献１参照。）やＬ−リジン（非特許文献１参照。）の発酵について連続培養法が開示されている。しかしながら、これらの例では、発酵培養液へ原料の連続的な供給を行うと共に、微生物や培養細胞を含んだ発酵培養液を抜き出すために、発酵培養液中の微生物や培養細胞が希釈されることから、生産効率の向上は限定されたものであった。
【０００５】
このことから、連続発酵法において、微生物や培養細胞を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収すると同時に濾過された微生物や培養細胞を発酵培養液に保持または還流させることにより、発酵培養液中の微生物や細胞濃度を高く維持する方法が提案されている。
【０００６】
例えば、セラミックス膜を用いた連続発酵装置により、連続発酵する技術が提案されている（特許文献２、特許文献３および特許文献４参照。）。しかしながらこれらの提案では、分離膜の目詰りによる濾過流量や濾過効率の低下に問題があり、目詰まり防止のために逆洗浄等を行っている。また別に、分離膜を用いたコハク酸の製造方法が提案されている（特許文献５参照。）。しかしながら、この提案では膜分離において、高い濾過圧（約２００ｋＰａ）が採用されている。高い濾過圧は、コスト的にも不利であるばかりでなく、濾過処理において微生物や培養細胞が圧力によって物理的なダメージを受けることから、微生物や培養細胞を連続的に発酵培養液に戻す連続発酵法においては適切ではない。
【０００７】
このように、従来の連続発酵法には様々な問題があり、産業的応用が難しかった。すなわち、連続発酵法において、微生物や培養細胞を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収すると同時に濾過された微生物や培養細胞を培養液に還流させ、発酵培養液中の微生物や細胞濃度を向上させ、かつ、高く維持させることにより高い物質生産性を得ることは、依然として困難であり、技術の革新が望まれていた。
【特許文献１】特開平１０−１５０９９６号公報
【特許文献２】特開平５−９５７７８号公報
【特許文献３】特開昭６２−１３８１８４号公報
【特許文献４】特開平１０−１７４５９４号公報
【特許文献５】特開２００５−３３３８８６号公報
【非特許文献１】Toshihiko Hirao et. al.（ヒラノ・トシヒコ ら）、 Appl. Microbiol. Biotechnol.（アプライド マイクロバイアル アンド マイクロバイオロジー），３２，２６９−２７３（１９８９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで本発明の目的は、簡便な操作で、長時間にわたり安定して高生産性を維持することができる連続発酵法による化学品を製造するための連続発酵装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、微生物や培養細胞の分離膜内への侵入が少なく、微生物や培養細胞を膜間差圧が低い条件で濾過した場合に、かつ微生物もしくは培養細胞を培養する培養槽と、連続発酵を行う発酵反応槽と、培養した微生物もしくは培養細胞を培養槽から発酵反応槽に供給する移送手段と、分離膜を有する分離膜エレメントを配することにより、分離膜の目詰まりが著しく抑制されることを見いだし、課題であった高濃度の微生物の濾過が長期間安定に維持できることを可能とし、本発明を完成した。
【００１０】
本発明の連続発酵装置は、微生物もしくは培養細胞の発酵培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を該発酵培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を該発酵培養液に追加する連続発酵による化学品の製造装置であって、微生物もしくは培養細胞を培養する培養槽と、微生物もしくは培養細胞の連続発酵を行う発酵反応槽と、該培養槽で培養した微生物もしくは培養細胞を培養槽から発酵反応槽へ供給する移送手段と、発酵培養液を濾過するための分離膜を有する分離膜エレメントと、該分離膜の膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲に制御する手段からなり、該分離膜が平均細孔径０.０１μｍ以上１μｍ未満の細孔を有する多孔性膜であることを特徴とする連続発酵装置である。
【００１１】
また、本発明の連続発酵装置の好ましい態様によれば、前記の連続発酵装置は、微生物もしくは培養細胞を培養する培養槽と、微生物もしくは培養細胞の連続発酵を行う発酵反応槽と、該培養槽で培養した微生物もしくは培養細胞を培養槽から発酵反応槽へ供給する移送手段と、該発酵反応槽に発酵培養液循環手段を介して接続され内部に発酵培養液を濾過するための分離膜を有する分離膜エレメントを備えた膜分離槽と、該分離膜の膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲に制御する手段からなり、該分離膜が平均細孔径０.０１μｍ以上１μｍ未満の細孔を有する多孔性膜であることを特徴とする連続発酵装置である。
【００１２】
また、本発明の連続発酵装置の好ましい態様によれば、前記の連続発酵装置は、微生物もしくは培養細胞を培養する培養槽と、培養した微生物もしくは培養細胞の連続発酵を行う発酵反応槽と、該培養槽で培養した微生物もしくは培養細胞を培養槽から発酵反応槽へ供給する移送手段と、該発酵反応槽内に配設され発酵培養液を濾過するための分離膜を有する分離膜エレメントと、該分離膜エレメントに接続され濾過された発酵生産物を含む透過液を排出するための手段と、該分離膜の膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲に制御するための手段からなり、該分離膜が平均細孔径０.０１μｍ以上１μｍ未満の細孔を有する多孔性膜であることを特徴とする連続発酵装置である。
【００１３】
また、本発明の連続発酵装置の好ましい態様によれば、前記の多孔性膜の純水透過係数は、２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上６×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下である。
【００１４】
また、本発明の連続発酵装置の好ましい態様によれば、前記の多孔性膜の平均細孔径は０.０１μｍ以上０.２μｍ未満の範囲内にあり、かつ、その平均細孔径の標準偏差は０.１μｍ以下である。
【００１５】
また、本発明の連続発酵装置の好ましい態様によれば、前記の多孔性膜の膜表面粗さは０.１μｍ以下である。
【００１６】
また、本発明の連続発酵装置の好ましい態様によれば、前記の多孔性膜はポリフッ化ビニリデンからなる多孔質樹脂層を含む多孔性膜である。
【００１７】
また、本発明の連続発酵装置の好ましい態様によれば、前記の多孔性膜を含む膜分離エレメントを構成する部材は、高圧蒸気滅菌操作に耐性である。
【００１８】
また、本発明の連続発酵装置の好ましい態様によれば、前記の分離膜の膜間差圧を制御するための手段は、発酵培養液と多孔性膜処理水の液位差を制御する水頭差制御装置、または加圧ポンプまたは／および吸引ポンプ、または気体または液体の圧力である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の連続発酵装置によれば、簡便な操作条件で、長時間にわたり安定して所望の発酵生産物の高生産性を維持する連続発酵が可能となり、広く発酵工業において、発酵生産物である各種化学品を低コストで安定に生産することが可能となる。
【００２０】
また本発明の連続発酵装置では、別の培養槽で微生物もしくは培養細胞を培養し、培養されたフレッシュな発酵能力が高い状態の微生物もしくは培養細胞を含む培養液を培養槽から発酵反応槽に供給しながら連続発酵するから、常に高い化学品の生産性能を維持させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明の連続発酵装置は、連続発酵によって化学品を製造するための装置であって、基本構造として、微生物もしくは培養細胞を培養する培養槽と、微生物もしくは培養細胞の連続発酵を行う発酵反応槽と、該培養槽で培養した微生物もしくは培養細胞を培養槽から発酵反応槽へ供給する移送手段と、発酵培養液を濾過するための分離膜を有する分離膜エレメントと、該分離膜の膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲に制御する手段からなり、該分離膜が平均細孔径０.０１μｍ以上１μｍ未満の細孔を有する多孔性膜であることを特徴とする連続発酵装置である。
【００２２】
本発明で分離膜として用いられる多孔性膜の構成について説明する。本発明における多孔性膜は、被処理水の水質や用途に応じた分離性能と透水性能を有するものである。多孔性膜は、阻止性能および透水性能や耐汚れ性という分離性能の点からは、多孔質樹脂層を含む多孔性膜であることが好ましい。このような多孔性膜は、多孔質基材の表面に、分離機能層として作用とする多孔質樹脂層を有している。多孔質基材は、多孔質樹脂層を支持して分離膜に強度を与えるものである。
【００２３】
多孔質基材の材質は、有機材料および／または無機材料等からなり、中でも有機繊維が望ましく用いられる。好ましい多孔質基材は、セルロース繊維、セルローストリアセテート繊維、ポリエステル繊維、ポリプロピレン繊維およびポリエチレン繊維などの有機繊維を用いてなる織布や不織布等である。中でも、密度の制御が比較的容易であり製造も容易で安価な不織布が好ましく用いられる。
【００２４】
また、多孔質樹脂層は、上述したように分離機能層として作用するものであり、有機高分子膜を好適に使用することができる。有機高分子膜の材質としては、例えば、ポリエチレン系樹脂、ポリプロピレン系樹脂、ポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂、ポリアクリロニトリル系樹脂、セルロース系樹脂およびセルローストリアセテート系樹脂等が挙げられる。有機高分子膜は、これらの樹脂を主成分とする樹脂の混合物からなるものであってもよい。ここで主成分とは、その成分が５０重量％以上、好ましくは６０重量％以上含有することをいう。中でも、多孔質樹脂層を構成する素材としては、溶液による製膜が容易で物理的耐久性や耐薬品性にも優れているポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂およびポリアクリロニトリル系樹脂が好ましく用いられる。多孔質樹脂層を構成する素材には、ポリフッ化ビニリデン系樹脂またはそれを主成分とする樹脂が最も好ましく用いられる。
【００２５】
ここで、ポリフッ化ビニリデン系樹脂としては、フッ化ビニリデンの単独重合体が好ましいが、フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体との共重合体も好ましく用いられる。フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体としては、テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロピレンおよび三塩化フッ化エチレンなどが例示される。
【００２６】
本発明で用いられる多孔性膜は、発酵に使用する微生物および培養細胞による目詰まりが起こりにくく、かつ濾過性能が長期間安定に継続する性能を有するものであることが望ましい。そのため、本発明で使用される多孔性膜は、平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の細孔を有する多孔性膜であることが重要である。
【００２７】
平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の範囲にあると、菌体や汚泥などがリークすることのない高い排除率と、高い透水性を両立させることができ、さらに目詰まりしにくく、透水性を長時間保持することが、より高い精度と再現性を持って実施することができる。平均細孔径が、０.０１μｍ以上１μｍ未満の範囲にあれば、動物細胞、酵母および糸状菌などを用いた場合、目詰まりが少なく、また、細胞の濾液への漏れもなく安定に連続発酵が実施可能である。また、動物細胞、酵母および糸状菌より小さな細菌類を用いた場合は、０.４μｍ以下の平均細孔径であればよりよく、０.２μｍ以下の平均細孔径であればなお好適に実施可能である。平均細孔径は、小さすぎると透水量が低下することがあるので、通常は０．０２μｍ以上が好ましく、より好ましくは０．０４μｍ以上である。
【００２８】
ここで、平均細孔径は、倍率１０，０００倍の走査型電子顕微鏡観察における、９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔すべての直径を測定し、平均することにより求めることができる。
【００２９】
また、平均細孔径の標準偏差σは、０．１μｍ以下であることが好ましい。細孔径の標準偏差σは、上記の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔数をＮとして、測定した各々の直径をＸｋ、細孔直径の平均をＸ（ａｖｅ）とした、下記の式（１）により算出される。
【００３０】
【数１】
【００３１】
本発明で用いられる多孔性膜において、発酵培養液の透過性が重要点の一つであり、透過性の指標として、使用前の多孔性膜の純水透過係数を用いることができる。多孔性膜の純水透過係数が、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで透水量を測定し算出したとき、２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上であることが好ましく、２×１０−９以上６×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下であれば、実用的に十分な透過水量が得られる。より好ましい純水透過係数は、２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上１×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下である。
【００３２】
本発明で用いられる多孔性膜の表面粗さは、分離膜の目詰まりに影響を与える因子である。多孔性膜の表面粗さは、０.１μｍ以下であることが好ましい。表面粗さが０.１μｍ以下のときに分離膜の剥離係数や膜抵抗をさらに低下させることができ、より低い膜間差圧で連続発酵が実施可能である。また、表面粗さを低くすることにより、微生物や培養細胞の濾過において、膜表面で発生する剪断力を低下させることが期待でき、微生物または培養細胞の破壊が抑制され、多孔性膜の目詰まりも抑制されることにより、長期間安定な濾過が可能になると考えられる。
【００３３】
ここで、表面粗さは、下記の原子間力顕微鏡装置（ＡＦＭ）を使用して、下記の装置と条件で測定することができる。
【００３４】
・装置：原子間力顕微鏡装置(Digital Instruments（株）製Nanoscope IIIa)
・条件：探針 ＳｉＮカンチレバー(Digital Instruments（株）製)
：走査モード コンタクトモード（気中測定）
水中タッピングモード（水中測定）
：走査範囲 １０μm,２５μm 四方（気中測定）
５μm,１０μm 四方（水中測定）
：走査解像度 ５１２×５１２
・試料調製：
測定に際し膜サンプルは常温でエタノールに１５分浸漬後ＲＯ水中に２４時間浸漬し洗浄した後風乾し用いた。ＲＯ水とは、ろ過膜の一種である逆浸透膜（ＲＯ膜）を用いてろ過し、イオンや塩類などの不純物を排除した水を指す。ＲＯ膜の孔の大きさは、概ね２ｎｍ以下である。
【００３５】
膜の表面粗さdroughはAFMにより各ポイントのＺ軸方向の高さから、下記の式（２）により算出する。
【００３６】
【数２】
【００３７】
本発明で用いられる多孔性膜は、平膜であっても中空糸膜であっても良い。平膜の場合、その厚みは用途に応じて選択されるが、例えば、厚みは好ましくは２０μｍ以上５０００μｍ以下であり、より好ましくは５０μｍ以上２０００μｍ以下の範囲で選択される。上述したように、多孔性膜は多孔質基材と多孔質樹脂層とから形成されていても良い。その際、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していても、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していなくてもどちらでも良く、用途に応じて選択される。多孔質基材の厚みは、好ましくは５０μｍ以上３０００μｍ以下の範囲で選択される。中空糸膜の場合、内径は好ましくは２００μｍ以上５０００μｍ以下の範囲で選択され、膜厚は好ましくは２０μｍ以上２０００μｍ以下の範囲で選択される。また、有機繊維または無機繊維を筒状にした織物や編み物を含んでいても良い。
【００３８】
本発明で用いられる多孔性膜の作成法の概要を例示して説明する。
【００３９】
まず、多孔性膜のうち、平膜の作成法の概要について説明する。
【００４０】
多孔質基材の表面に、樹脂と溶媒とを含む原液の被膜を形成すると共に、その原液を多孔質基材に含浸させる。その後、被膜を有する多孔質基材の被膜側表面のみを、非溶媒を含む凝固浴と接触させて樹脂を凝固させると共に、多孔質基材の表面に多孔質樹脂層を形成する。
【００４１】
原液は、樹脂を溶媒に溶解させて調整する。原液の温度は、製膜性の観点から、通常、５〜１２０℃の範囲内で選定することが好ましい。溶媒は、樹脂を溶解するものであり、樹脂に作用してそれらが多孔質樹脂層を形成するのを促すものである。溶媒としては、Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ − メチル− ２ − ピロリドン、メチルエチルケトン、テトラヒドロフラン、テトラメチル尿素、リン酸トリメチル、シクロヘキサノン、イソホロン、γ − ブチロラクトン、メチルイソアミルケトン、フタル酸ジメチル、プロピレングリコールメチルエーテール、プロピレンカーボネート、ジアセトンアルコール、グリセロールトリアセテート、アセトンおよびメチルエチルケトンなどを用いることができる。なかでも、樹脂の溶解性の高いＮ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が好ましく用いられる。これらの溶媒は、単独で用いても良いし２種類以上を混合して用いても良い。
【００４２】
また、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンおよびグリセリンなどの溶媒以外の成分を溶媒に添加しても良い。溶媒に非溶媒を添加することもできる。非溶媒は、樹脂を溶解しない液体である。非溶媒は、樹脂の凝固の速度を制御して細孔の大きさを制御するように作用する。非溶媒としては、水や、メタノールおよびエタノールなどのアルコール類を用いることができる。なかでも、非溶媒として、価格の点から水やメタノールが好ましく用いられる。溶媒以外の成分および非溶媒は、混合物であってもよい。
【００４３】
原液には、開孔剤を添加することもできる。開孔剤は、凝固浴に浸漬された際に抽出されて、樹脂層を多孔質にする作用を持つものである。開孔剤を添加することにより、平均細孔径の大きさを制御することができる。開孔剤は、凝固浴への溶解性の高いものであることが好ましい。開孔剤としては、例えば、塩化カルシウムや炭酸カルシウムなどの無機塩を用いることができる。また、開孔剤として、ポリエチレングリコールやポリプロピレングリコールなどのポリオキシアルキレン類や、ポリビニルアルコール、ポリビニルブチラールおよびポリアクリル酸などの水溶性高分子化合物や、グリセリンを用いることができる。
【００４４】
次に、多孔性膜のうち、中空糸膜の作成法の概要について説明する。
【００４５】
中空糸膜は、樹脂と溶媒からなる原液を二重管式口金の外側の管から吐出すると共に、中空部形成用流体を二重管式口金の内側の管から吐出して、冷却浴中で冷却固化して作製することができる。
【００４６】
原液は、上述の平膜の作成法で述べた樹脂を２０重量％以上６０重量％以下の濃度で、上述の平膜の生成法で述べた溶媒に溶解させることにより調整することができる。また、中空部形成用流体には、通常気体もしくは液体を用いることができる。また、得られた中空糸膜の外表面に、新たな多孔性樹脂層をコーティング（積層）することもできる。積層は中空糸膜の性質、例えば、親水・疎水性あるいは細孔径等を所望の性質に変化させるために行うことができる。積層される新たな多孔性樹脂層は、樹脂を溶媒に溶解させた原液を、非溶媒を含む凝固浴と接触させて樹脂を凝固させることによって作製することができる。その樹脂の材質は、例えば、上述有機高分子膜の材質と同様のものが好ましく用いられる。また、積層方法としては、原液に中空糸膜を浸漬してもよいし、中空糸膜の表面に原液を塗布してもよく、積層後、付着した原液の一部を掻き取ったり、エアナイフを用いて吹き飛ばしすることにより積層量を調整することもできる。
【００４７】
本発明で用いられる多孔性膜は、支持体と組み合わせることによって分離膜エレメントとすることができる。分離膜エレメントの形態は特に限定されないが、支持体として支持板を用い、その支持板の少なくとも片面に、本発明の多孔性膜を配した分離膜エレメントは、本発明の分離膜エレメントの好適な形態の一つである。この形態では、膜面積を大きくすることが困難なので、透水量を大きくするために、支持板の両面に多孔性膜を配することも好ましい態様である。
【００４８】
本発明において、微生物や培養細胞を濾過処理する際の膜間差圧は、微生物や培養細胞および培地成分が容易に目詰まりしない条件であればよく、膜間差圧を０.１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下の範囲とする。膜間差圧を制御するための手段である濾過の駆動力としては、発酵培養液と多孔性膜処理水の液位差（水頭差）を利用したサイホンにより多孔性膜に膜間差圧を発生させることが可能である。また、濾過の駆動力として多孔性膜処理水側に吸引ポンプを設置してもよいし、多孔性膜の発酵培養液側に加圧ポンプを設置することも可能である。このように膜間差圧は、発酵培養液と多孔性膜処理水の液位差を変化させることで制御することができる。また、ポンプを使用する場合には吸引圧力により制御することができ、更に発酵培養液側の圧力を導入する気体または液体の圧力によって制御することができる。これら圧力制御を行う場合には発酵培養液側の圧力と多孔性膜処理水側の圧力差をもって膜間差圧とし、膜間差圧の制御に用いることができる。
【００４９】
また、本発明において使用する多孔性膜は、０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下の範囲で濾過処理することができるものが好ましい。
【００５０】
本発明で使用される発酵原料としては、培養する微生物または培養細胞の生育を促し、目的とする発酵生産物である化学品を良好に生産させ得るものであればよいが、炭素源、窒素源、無機塩類、および必要に応じてアミノ酸、ビタミンなどの有機微量栄養素を適宜含有する通常の液体培地が好ましく用いられる。
【００５１】
炭素源としては、グルコース、シュークロース、フラクトース、ガラクトースおよびラクトース等の糖類、これら糖類を含有する澱粉糖化液、甘藷糖蜜、甜菜糖蜜、ハイテストモラセス、更には酢酸等の有機酸、エタノールなどのアルコール類、およびグリセリンなども使用される。
【００５２】
窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、ビタミン類、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種発酵菌体およびその加水分解物などが使用される。
【００５３】
無機塩類としては、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩およびマンガン塩等を適宜添加することができる。本発明に使用する微生物が生育のために特定の栄養素を必要とする場合には、その栄養物を標品もしくはそれを含有する天然物として添加することができる。また、消泡剤も必要に応じて使用することができる。
【００５４】
本発明において、発酵培養液とは、発酵原料に微生物または培養細胞が増殖した結果得られる液のことを言い、追加する発酵原料の組成は、目的とする化学品の生産性が高くなるように、培養開始時の発酵原料組成から適宜変更しても良い。
【００５５】
本発明では、発酵培養液中の糖類濃度は、５ｇ／ｌ以下に保持されるようにすることが好ましい。その理由は、発酵培養液の引き抜きによる糖類の流失を最小限にするためである。微生物または培養細胞の培養は、通常ｐＨ４〜８、温度２０〜４０℃の範囲で行われることが多い。発酵培養液のｐＨは、無機の酸あるいは有機の酸、アルカリ性物質、さらには尿素、炭酸カルシウムおよびアンモニアガスなどによって、上記範囲内のあらかじめ定められた値に調節することができる。酸素の供給速度を上げる必要があれば、空気に酸素を加えて酸素濃度を２１％以上に保つ、あるいは培養を加圧する、攪拌速度を上げる、通気量を上げるなどの手段を用いることができる。
【００５６】
本発明では、培養初期にＢａｔｃｈ培養またはＦｅｄ−Ｂａｔｃｈ培養を行って微生物または培養細胞の濃度を高くした後に連続培養（引き抜き）を開始しても良いし、高濃度の菌体をシードし、培養開始とともに連続培養を行っても良い。適当な時期から原料培養液の供給および培養物の引き抜きを行うことが可能である。原料培養液供給と培養物の引き抜きの開始時期は必ずしも同じである必要はない。また、原料培養液の供給と培養物の引き抜きは連続的であってもよいし、間欠的であってもよい。原料培養液には上記に示したような菌体増殖に必要な栄養素を添加し、菌体増殖が連続的に行われるようにすればよい。培養液中の微生物または培養細胞の濃度は、発酵培養液の環境が微生物または培養細胞の増殖にとって不適切となって死滅する比率が高くならない範囲で、高い状態で維持することが効率よい生産性を得るのに好ましい。一例として、濃度は乾燥重量として５ｇ／Ｌ以上に維持することにより良好な生産効率が得られる。
【００５７】
また、必要に応じて発酵反応槽内から微生物または培養細胞を引き抜くことができる。例えば、発酵反応槽内の微生物または培養細胞濃度が高くなりすぎると、分離膜の閉塞が発生しやすくなる場合があることから、引き抜くことにより閉塞から回避することができる。また、発酵反応槽内の微生物または培養細胞濃度によって化学品の生産性能が変化することがあり、生産性能を指標として微生物または培養細胞を引き抜くことで生産性能を維持させることも可能である。
【００５８】
発酵生産能力のあるフレッシュな菌体を増殖させつつ行う連続培養操作は、通常、培養管理上単一の発酵反応槽で行うことが好ましい。しかしながら、菌体を増殖しつつ生産物を生成する連続培養法であれば、発酵反応槽の数は問わない。発酵反応槽の容量が小さい等の理由から、複数の発酵反応槽を用いることもあり得る。この場合、複数の発酵反応槽を配管で並列または直列に接続して連続培養を行っても発酵生産物の高生産性は得られる。
【００５９】
また本発明では、別の培養槽で微生物もしくは培養細胞を培養し、培養されたフレッシュな微生物もしくは培養細胞を含む培養液を培養槽から発酵反応槽に供給する装置（移送手段）を介して発酵反応槽に供給しながら連続発酵する。すなわち、発酵能力が高い状態の微生物もしくは培養細胞を含む培養液を培養槽から発酵反応槽に供給することにより、常に高い化学品の生産性能を維持させることができる。
【００６０】
培養槽における微生物もしくは培養細胞の培養条件は、微生物もしくは培養細胞が増殖できる条件であればよいが、好ましくは高い増殖速度を示す条件であることが望ましい。
【００６１】
また培養に用いられる培養培地も微生物もしくは培養細胞が増殖し得る組成の培地を用いればよいが、好ましくは高い増殖速度を示す組成の培地を用いることが望ましい。
【００６２】
培養槽内における培養方法は、回分式であっても良いし連続式であっても良い。培養槽から発酵反応槽への微生物もしくは培養細胞を含む培養液の供給方法は、所望の化学品の生産能力を維持するように供給することが望ましい。例えば、発酵反応槽内の濁度、生存微生物・細胞濃度あるいは化学品の生産能力を指標にして供給することも可能である。また、発酵液の供給は連続的であっても良いし間欠的であっても良く、また、ポンプ等の動力を用いても良く、自然落下による供給でもよい。
【００６３】
本発明で使用される微生物や培養細胞としては、例えば、発酵工業においてよく使用されるパン酵母などの酵母、大腸菌、コリネ型細菌などのバクテリア、糸状菌、放線菌、動物細胞および昆虫細胞などが挙げられる。使用する微生物や細胞は、自然環境から単離されたものでもよく、また、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。
【００６４】
本発明の連続発酵装置で製造される化学品は、上記の微生物や培養細胞が発酵培養液中に生産する物質であれば特に制限はないが、例えば、アルコール、有機酸、アミノ酸および核酸など発酵工業において大量生産されている物質を挙げることができる。アルコールとしては、例えば、エタノール、１，３−プロパンジオール、１,４−ブタンジオールおよびグリセロールなどが挙げられる。また有機酸としては、例えば、酢酸、乳酸、ピルビン酸、コハク酸、リンゴ酸、イタコン酸、クエン酸が挙げられ、核酸としては、イノシンやグアノシンなどのヌクレオシド、イノシン酸、グアニル酸などのヌクレオチドが挙げられる。また、化学品のその他の例としては、カダベリンなどのジアミン化合物、抗生物質、酵素、組換えタンパク質が挙げられる。本発明の連続発酵装置を用いることにより、上記化学品の高い生産性を得ることができる。
【００６５】
次に、本発明の連続発酵装置を用いて行われる連続発酵の形態について説明する。
【００６６】
従来の連続発酵培養は、発酵反応槽へ新鮮培地を一定速度で供給し、これと同量の発酵培養液を槽外へ排出することによって、発酵反応槽内の液量を常に一定に保つ培養法である。回分培養では、初発基質濃度が消費されると発酵培養が終了するが、連続発酵培養では、理論的には無限に発酵培養を持続させることができる。
【００６７】
一般に回分培養では、微生物の増殖、基質の消費および微生物の生産物により、微生物濃度、基質濃度、生産物濃度、ｐＨおよび溶存酸素等の微生物のおかれた環境条件が、発酵培養時間の経過に伴って変化する。それに対して、連続発酵培養においては、これらの環境条件が一定に保たれた状態（定常状態）が出現し且つ持続する。
【００６８】
一方、上述従来の連続培養では発酵培養液と共に微生物も槽外に排出され、発酵反応槽内の微生物濃度を高く維持することは難しい。ここで、発酵生産を行う場合には発酵を行う微生物を高濃度に保つことができれば、発酵容積当たりの発酵生産効率を向上させることができる。そのためには、微生物を発酵反応槽内に保持、あるいは還流させる必要がある。微生物を発酵反応槽内に保持あるいは還流させる方法としては、排出された発酵培養液を重力、例えば、遠心分離により固液分離し、沈殿物である微生物を発酵反応槽に返送する方法、濾過することにより固形分である微生物を分離し、発酵培養液上清のみを発酵反応槽外に排出する方法等が挙げられる。しかしながら、遠心分離による方法は動力費が高く現実的ではない。濾過による方法は、前述のように濾過するために高い圧力要することから、実験室レベルでの検討がほとんどである。
【００６９】
ここで、本発明の連続発酵装置の基本構成と特徴について説明する。本発明の連続発酵装置の主たる構成は、微生物もしくは培養細胞を培養する培養槽と、微生物もしくは培養細胞の連続発酵を行う発酵反応槽と、該培養槽で培養した微生物もしくは培養細胞を培養槽から発酵反応槽へ供給する移送手段と、発酵培養液を濾過するための分離膜を有する分離膜エレメントと、該分離膜の膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲に制御する手段である。多孔性膜は、発酵反応槽の外部に設置しても良いし、内部に設置してもよい。ここで使用される多孔性膜は、平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満である。
【００７０】
従来の連続発酵装置、例えば、セラミックフィルター等の従来の濾過装置を用いた発酵液の分離濾過時に高いろ過圧力が必要であるが、発酵装置内を加圧状態で保つことが困難なことから、濾過分離装置は発酵反応槽の外部に設置されていたが、本発明の連続発酵装置においては、濾過圧力である膜間差圧が０.１から２０ｋＰａの範囲であり、特別に発酵槽内を加圧状態に保つ必要がないことから、多孔性膜を有する分離膜エレメントを設置する位置は、発酵反応槽の内部でもあってもよいし、外部であっても良い。
【００７１】
すなわち、分離膜エレメントは、上述のように発酵反応槽外に設置しても良いし、発酵反応槽内に設置しても良い。発酵反応槽外に設置する場合には、上述のように別途、膜分離槽を設けてその内部に分離膜エレメントを設置することができ、発酵反応槽と膜分離槽の間を発酵培養液を循環させながら、分離膜エレメントにより発酵培養液を連続的に濾過することができる。膜分離槽は、高圧蒸気滅菌可能なことが望ましく、このようにすることにより雑菌からの汚染回避を可能となる。
【００７２】
本発明の連続発酵装置の分離膜エレメントを構成する分離膜ならびに支持材部材は、高圧蒸気滅菌操作に耐性の部材を用いることが好ましい。これにより分離膜エレメントを含む発酵反応槽内を滅菌可能とすることができる。発酵反応槽内が滅菌可能であれば、連続発酵培養時に好ましくない微生物による汚染の危険を回避できることから、安定した連続発酵培養が可能となる。分離膜エレメントを構成する分離膜ならびに支持材部材は、高圧蒸気滅菌操作の条件である１２１℃の温度で１５分間という条件に耐性であれば、分離膜ならびに支持材部材の種類は特に限定されない。分離膜の素材としては上述の分離膜として用いられる多孔性膜の素材を用いることが可能である。また、支持材部材としては、例えば、ステンレスやアルミニウムなどの金属、あるいはポリアミド系樹脂、フッ素系樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリアセタール系樹脂、ポリブチレンテレフタレート系樹脂、ＰＶＤＦ、変性ポリフェニレンエーテル系樹脂およびポリサルホン系樹脂等を好ましく選定することができる。
【００７３】
次に、本発明の連続発酵で用いられる膜分離型の連続発酵装置のうち、分離膜エレメントが、発酵反応槽の外部に設置された代表的な一例を図１に示す。図１は、本発明で用いられる膜分離型の連続発酵装置の一つの実施の形態を説明するための概略側面図である。
【００７４】
図１において、連続発酵装置は、微生物もしくは培養細胞を培養する培養槽１７と、微生物もしくは培養細胞の連続発酵を行う発酵反応槽１と、前記の培養槽１７で培養した微生物もしくは培養細胞を培養槽１７から発酵反応槽１へ供給する移送手段１８と、該発酵反応槽１に発酵培養液循環手段（発酵培養液循環ポンプ１１）を介して接続され内部に発酵培養液を濾過するための分離膜を有する分離膜エレメントを２備えた膜分離槽１２と、水頭差制御装置３と、該分離膜の膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲に制御する手段で構成されている。
【００７５】
上記のように、膜分離槽１２は、発酵液循環ポンプ１１を介して発酵反応槽１に接続されており、また分離膜エレメント２には多孔性膜が組み込まれている。この多孔性膜としては、例えば、国際公開第２００２／０６４２４０号パンフレットに開示されている分離膜および分離膜エレメントを使用することが好適である。分離膜エレメントについては、後で具体的に説明する。
【００７６】
図１において、培地供給ポンプ７によって培地を発酵反応槽１に投入し、必要に応じて、攪拌機５で発酵反応槽１内の発酵培養液を攪拌することができる。また必要に応じて、気体供給装置４によって必要とする気体を供給することができる。このとき、供給した気体を回収リサイクルして再び気体供給装置４によって供給することができる。また、必要に応じて、ｐＨセンサ・制御装置９およびｐＨ調整溶液供給ポンプ８によって発酵培養液のｐＨを調整することができる。また必要に応じて、温度調節器１０によって発酵培養液の温度を調節することにより、生産性の高い発酵生産を行うことができる。
【００７７】
さらに、装置内の発酵培養液は、発酵培養液循環ポンプ１１によって発酵反応槽１と膜分離槽１２の間を循環する。発酵生産物を含む発酵培養液は、分離膜エレメント２によって微生物と発酵生産物に濾過・分離され、装置系から取り出すことができる。
【００７８】
また、濾過・分離された微生物または培養細胞は、装置系内に留まることにより装置系内の微生物濃度を高く維持することができ、生産性の高い発酵生産を可能としている。ここで、分離膜を備えた分離膜エレメント２による発酵培養液の濾過・分離は、膜分離槽１２の水面との水頭差圧によって行うことができ、特別な動力は必要ない。また、必要に応じて、レベルセンサ６および水頭差圧制御装置３によって、分離膜エレメント２の濾過・分離速度および装置系内の発酵培養液量を適当に調節することができる。
【００７９】
上記のように、分離膜エレメント２による濾過・分離は、水頭差圧によって行うことができるが、必要に応じて、ポンプによる吸引濾過あるいは気体・液体等で装置系内を加圧することにより濾過・分離することもできる。このような手段により、膜間差圧を制御することができる。
【００８０】
本発明の連続発酵装置では、発酵生産に用いられる微生物または培養細胞を、別途設けた培養槽１７で培養し、得られた培養液を発酵反応槽１に供給する。具体的には、培養槽１７で連続発酵のために微生物または培養細胞を培養し、培養した微生物または培養細胞を発酵反応槽１に送るための移送手段１８により発酵反応槽１に供給する。培養槽１７は、化学品を生産し得る微生物または培養細胞を培養する。培養槽１７の構造は、例えば、フラスコ等の容器を用いても良いし、ジャーファーメンターなどの培養装置を用いてもよい。培養槽１７の規模は、発酵反応槽１の容積を超えないことが望ましく、さらに好ましくは発酵反応槽１の容積の１／１０以下の容積であることが望ましい。
【００８１】
培養槽１７内における培養方式は、バッチ式であっても良いし連続式であってもよい。培養した微生物または培養細胞の移送手段１８にはポンプ等の動力を用いてもよいし、自然落下によって移送しても良い。このようにすることにより、常にフレッシュで化学品の生産能力の高い微生物または培養細胞による連続発酵が可能となり、高い生産性能を長期間維持した連続発酵が可能となる。
【００８２】
上記のように、図１では分離膜エレメント２を膜分離槽１２外に設置する形態を例示したが、分離膜エレメント２を発酵反応槽１内に設置することができる。分離膜エレメント２を発酵反応槽１内に設置した場合は、膜分離槽１２、発酵培養液循環ポンプ１１およびそれに付帯する設備を省略することができる。また、分離膜エレメント２を発酵反応槽１内に設置した場合における分離膜エレメント２による濾過・分離は、発酵反応槽１との水頭差圧によって行うことができ、特別な動力は必要ない。
【００８３】
次に、本発明の連続発酵装置のうち、分離膜エレメント２が発酵反応槽１の内部に設置された代表的な一例を図２に示す。図２は、本発明で用いられる膜分離型の他の連続発酵装置の一つの実施の形態を説明するための概略側面図である。
【００８４】
図２において、連続発酵装置は、微生物もしくは培養細胞を培養する培養槽１７と、培養した微生物もしくは培養細胞の連続発酵を行う発酵反応槽１と、該培養槽１７で培養した微生物もしくは培養細胞を培養槽１７から発酵反応槽１へ供給する移送手段１８と、該発酵反応槽１内に配設され発酵培養液を濾過するための分離膜を有する分離膜エレメント２と、該分離膜エレメント２に接続され濾過された発酵生産物を含む透過液を排出するための手段（集水ポンプ１９）と、水頭差制御装置３と、該分離膜の膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲に制御するための手段で構成されている。
【００８５】
この多孔性膜としては、例えば、国際公開第２００２／０６４２４０号パンフレットに開示されている分離膜および分離膜エレメントを使用することができる。分離膜エレメントに関しては、追って詳述する。
【００８６】
次に、図１の膜分離型の連続発酵装置による連続発酵の形態について説明する。培地供給ポンプ７によって、培地を発酵反応槽１内に連続的もしくは断続的に投入する。培地については、発酵反応槽１内に投入する前に、必要に応じて加熱殺菌、加熱滅菌あるいはフィルターを用いた滅菌処理を行うことができる。発酵生産時には、必要に応じて、発酵反応槽１内の攪拌機５で発酵反応槽１内の発酵培養液を攪拌することができる。また必要に応じて、気体供給装置４によって必要とする気体を発酵反応槽１内に供給することができる。このとき、供給した気体を回収リサイクルして再び気体供給装置４に供給することができる。また必要に応じて、ｐＨセンサ・制御装置９およびｐＨ調整溶液供給ポンプ８によって発酵反応槽１内の発酵培養液のｐＨを調整することができる。また必要に応じて、温度調節器１０によって発酵反応槽１内の発酵培養液の温度を調節することにより生産性の高い発酵生産を行うことができる。
【００８７】
ここでは、計装・制御装置による発酵培養液の物理化学的条件の調節に、ｐＨおよび温度の調節を例示したが、必要に応じて、溶存酸素やＯＲＰの制御を行うことができ、更にはオンラインケミカルセンサーなどの分析装置により発酵培養液中の微生物の濃度を測定し、それを指標とした物理化学的条件の制御を行うことができる。また、培地の連続的もしくは断続的投入の形態に関しては、特に限定されるものではないが、上記の計装・制御装置による発酵培養液の物理化学的環境の測定値を指標として、培地投入量および速度を適宜調節することができる。
【００８８】
発酵培養液は、発酵反応槽１内に設置された分離膜エレメント２によって、微生物または培養細胞と発酵生産物に濾過・分離され連続発酵装置系から排出され取り出される。この排出の方法については下記に詳述する。
【００８９】
また、濾過・分離された微生物または培養細胞は、装置系内に留まることにより装置系内の微生物濃度を高く維持することができ、生産性の高い発酵生産を可能としている。ここで、分離膜エレメント２による濾過・分離は、発酵反応槽１の水面との水頭差圧によって行い、特別な動力を必要としない。また、必要に応じて、レベルセンサ６および水頭差圧制御装置３によって、分離膜エレメント２の濾過・分離速度およびよび発酵反応槽１内の発酵培養液量を適当に調節することができる。上記の分離膜エレメント２による濾過・分離は、水頭差圧によって行うことを例示したが、必要に応じて、ポンプによる吸引濾過あるいは液体や気体等により装置系内を加圧することにより、濾過・分離することもできる。
【００９０】
すなわち、膜間差圧を制御するための手段として、発酵培養液と多孔性膜処理水の液位差を制御する水頭差制御装置３や、加圧ポンプまたは／および吸引ポンプを用いることができ、また、気体または液体の圧力によって膜間差圧を制御することができることから、長期間安定な発酵生産が可能となる。
【００９１】
なお本発明の連続発酵装置では、前述の通り発酵生産に用いられる微生物または培養細胞を、別途設けた培養槽１７で培養し、得られた培養液を発酵反応槽１に供給する。具体的には、培養槽１７で連続発酵のために微生物または培養細胞を培養し、培養した微生物または培養細胞を発酵反応槽１に送るための移送手段１８により発酵反応槽１に供給する。移送手段１８にはポンプ等の動力を用いてもよいし、自然落下によって移送しても良い。このようにすることにより、常にフレッシュで化学品の生産能力の高い微生物または培養細胞による連続発酵が可能となり、高い生産性能を長期間維持した連続発酵が可能となる。
【００９２】
本発明で用いられる分離膜エレメント２の好適な形態の例である国際公開第２００２／０６４２４０号パンフレットに開示されている分離膜および分離膜エレメントを、以下、図面を用いてその概略を説明する。図３は、本発明で用いられる分離膜エレメントの一つの実施の形態を説明するための概略斜視図である。
【００９３】
分離膜エレメントは、図３に示すように、剛性を有する支持板１３の両面に、流路材１４と分離膜１５とをこの順序で配し構成されている。支持板１３は、両面に凹部１６を有している。分離膜１５は発酵培養液を濾過する。流路材１４は、分離膜１５で濾過された透過水を効率よく支持板１３に流すためのものである。支持板１３に流れた発酵生成物を含む透過液は、支持板１３の凹部１６を通り、排出手段である集水パイプ１９を経て連続発酵装置外部に取り出される。ここで、上述の水頭差圧、ポンプ、液体や気体等による吸引濾過、あるいは装置系内を加圧するなどの方法を、透過水を取り出すための動力として用いることができる。
【００９４】
次に、図４に示す分離膜エレメントについて説明する。図４は、本発明で用いられる別の分離膜エレメントを例示説明するための概略斜視図である。分離膜エレメントは、図４に示すように、中空糸膜（多孔性膜）で構成された分離膜束２０と上部樹脂封止層２１と下部樹脂封止層２２によって主に構成される。分離膜束２０は、上部樹脂封止層２１および下部樹脂封止層２２よって束状に接着・固定化されている。下部樹脂封止層２２による接着・固定化は、分離膜束２０の中空糸膜（多孔性膜）の中空部を封止しており、発酵培養液の漏出を防ぐ構造になっている。一方、上部樹脂封止層２１は、分離膜束２０の中空糸膜（多孔性膜）の内孔を封止しておらず、集水パイプ２４に透過水が流れる構造となっている。この分離膜エレメントは、支持フレーム２３を介して連続発酵装置内に設置することが可能である。分離膜束２０によって濾過された透過水は、中空糸膜の中空部を通り、集水パイプ２４を介して連続発酵装置外部に取り出される。透過水を取り出すための動力として、水頭差圧、ポンプ、液体や気体等による吸引濾過、あるいは装置系内を加圧するなどの方法を用いることができる。
【００９５】
本発明に従って連続発酵を行った場合、従来のバッチ発酵と比較して、高い体積生産速度が得られ、極めて効率のよい発酵生産が可能となる。ここで、連続発酵培養における生産速度は、次の式（３）で計算される。
【００９６】
・発酵生産速度（ｇ／Ｌ／ｈｒ）＝抜き取り液中の生産物濃度（ｇ／Ｌ）×発酵培養液抜き取り速度（Ｌ／ｈｒ）÷装置の運転液量（Ｌ）・・・・（式３）。
【００９７】
また、バッチ培養での発酵生産速度は、原料炭素源をすべて消費した時点の生産物量（ｇ）を、炭素源の消費に要した時間（ｈ）とその時点の発酵培養液量（Ｌ）で除して求められる。
【実施例】
【００９８】
以下、本発明の連続発酵装置をさらに詳細に説明するために、発酵生産物である化学品としてＬ−乳酸を選定し、図１および図２に示す連続発酵装置を用いた連続的なＬ−乳酸の製造について、実施例を挙げて説明する。本発明は、これらの実施例に限定されない。
【００９９】
ここで、Ｌ−乳酸を生産させる微生物としては、酵母サッカロミセス・セレビセ（Saccharomyces cerevisae）を用いた。サッカロミセス・セレビセは、本来Ｌ−乳酸発酵を持たないが、Ｌ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子をサッカロミセス・セレビセに導入することによりＬ−乳酸発酵能力をもつサッカロミセス・セレビセ株を造成し実施した。具体的には、ヒト由来ＬＤＨ遺伝子を酵母ゲノム上のＰＤＣ１プロモーターの下流に連結することにより、Ｌ−乳酸発酵能力を持つ酵母株を造成して使用した。
【０１００】
（実施例１）連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その１）
図１の連続発酵装置を稼働させることにより、Ｌ−乳酸連続発酵系が得られるかどうかを調べるため、表１に示す組成の酵母乳酸発酵培地を用い、培養槽で別途培養したフレッシュな酵母を発酵反応槽に移送しながら連続発酵試験を行った。連続発酵試験を行った。図１の連続発酵装置は、本発明の一実施の形態を示すものであり、本発明はその形態になんら限定されるものではない。該酵母乳酸発酵培地は、１２１℃の温度で１５分間、高圧蒸気滅菌して用いた。分離膜エレメントの基材部材には、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成型品を用い、分離膜には後述する参考例２で作製した多孔性膜を用いた。実施例１における運転条件は、特に断らない限り、下記のとおりである。
【０１０１】
・発酵反応槽容量：２（Ｌ）
・膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
・使用分離膜：ＰＶＤＦ濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
・温度調整：３０（℃）
・発酵反応槽通気量：０．０５（Ｌ／ｍｉｎ）
・膜分離槽通気量：０．３（Ｌ／ｍｉｎ）
・発酵反応槽攪拌速度：１００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ５に調整
・乳酸発酵培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
・発酵培養液循環装置による循環液量：０．１（Ｌ／ｍｉｎ）
・膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御
（連続発酵開始後〜８０時間：０．１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下で制御、８０時間〜１６０時間：０．１ｋＰａ以上２ｋＰａ以下で制御、１６０時間〜２４０時間：０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御。）。
【０１０２】
微生物として後述する参考例１で造成した酵母ＳＷ−１株を用い、培地として表１に示す組成の乳酸発酵培地を用い、発酵生産物であるＬ−乳酸の濃度の評価には、後述する参考例１に示したＨＰＬＣを用い、グルコース濃度の測定には“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬社製）を用いた。
【０１０３】
【表１】
【０１０４】
まず、試験管中で５ｍｌの乳酸発酵培地を用いＳＷ−１株を一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を新鮮な乳酸発酵培地１００ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコ中で２４時間、３０℃の温度で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図１に示した膜分離型連続発酵装置の１．５Ｌの乳酸発酵培地に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって４００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１の通気量の調整、温度調整およびｐＨ調整を行った。発酵培養液循環ポンプ１１を稼働させることなく、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、発酵培養液循環ポンプ１１を稼働させた。前培養時の運転条件に加え、膜分離槽２を通気し、乳酸発酵培地の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵培養液量を２Ｌとなるように膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるＬ−乳酸の製造を行った。連続発酵期間中に、予め５００ｍｌ容坂口フラスコ中で乳酸発酵培地を用いてＯＤ＝１５まで別途培養しておいたＳＷ−１株を含む１５０ｍｌの培養液を、１時間にあたり５ｍｌずつ発酵反応槽１に移送した。坂口フラスコによる培養を適宜行い得られた培養液を発酵反応槽１に補充することにより、継続して移送を続けた。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置３により水頭差を膜間差圧として測定し、上記の膜透過水量制御条件で変化させることで行った。連続発酵の期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。適宜、膜透過発酵液中の生産されたＬ−乳酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。３００時間の連続発酵試験を行った結果を表２に示す。その結果、図１の連続発酵装置を用いることにより、安定したＬ−乳酸の連続発酵による製造が可能であることを確認することができた。
【０１０５】
（実施例２）連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その２）
分離膜として参考例３で作製した多孔性膜を用い、実施例１と同様のＬ−乳酸連続発酵試験を行った。その結果を表２に示す。その結果、安定したＬ−乳酸の連続発酵による製造が可能であることを確認することができた。実施例２においても連続発酵の期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。
【０１０６】
（実施例３）連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その３）
分離膜として参考例４で作製した多孔性膜を用い、実施例１と同様のＬ−乳酸連続発酵試験を行った。その結果を表２に示す。その結果、安定したＬ−乳酸の連続発酵による製造が可能であることが確認できた。実施例３においても連続発酵の期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。
【０１０７】
（実施例４）連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その４）
図２の連続発酵装置を稼働させることにより、Ｌ−乳酸連続発酵系が得られるかどうかを調べるため、表１に示す組成の乳酸発酵培地を用い、培養槽で別途培養したフレッシュな酵母を発酵反応槽に移送しながら連続発酵試験を行った。該乳酸発酵培地は、１２１℃の温度で１５分間、高圧蒸気滅菌して用いた。分離膜エレメントの基材部材には、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成型品を用い、分離膜には後述する参考例１で作製した多孔性膜を用いた。この実施例４における運転条件は、特に断らない限り、下記のとおりである。
【０１０８】
・発酵反応槽容量：２（Ｌ）
・使用分離膜：ＰＶＤＦ濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
・温度調整：３０（℃）
・発酵反応槽通気量：０．０５（Ｌ／ｍｉｎ）
・乳酸発酵培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
・発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ５に調整
・膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御
（連続発酵開始後〜８０時間：０．１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下で制御、８０時間〜１６０時間：０．１ｋＰａ以上２ｋＰａ以下で制御、１６０時間〜２４０時間：０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）
・滅菌：分離膜エレメントを含む培養槽、および使用培地は総て１２１℃の温度で２０分間のオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。
【０１０９】
微生物として参考例１で造成した酵母ＳＷ−１株を用い、培地として表１に示す組成の乳酸発酵培地を用い、発酵生産物であるＬ−乳酸の濃度の評価には、後述する参考例１に示したＨＰＬＣを用い、グルコース濃度の測定には“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬）を用いた。
【０１１０】
まず、ＳＷ−１株を試験管中で５ｍｌの乳酸発酵培地で一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を新鮮な乳酸発酵培地１００ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコ中で２４時間、３０℃の温度で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図２に示した連続発酵装置の１．５Ｌの乳酸発酵培地に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって４００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１の通気量の調整、温度調整およびｐＨ調整を行い、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、乳酸発酵培地の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵培養液量が１．５Ｌとなるように膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるＬ−乳酸の製造を行った。連続発酵期間中に、予め５００ｍｌ容坂口フラスコ中で乳酸発酵培地を用いてＯＤ＝１５まで別途培養しておいたＳＷ−１株を含む１５０ｍｌの培養液を１時間にあたり５ｍｌずつ発酵反応槽１に移送した。坂口フラスコによる培養を適宜行い培養液を補充することにより、継続して移送を続けた。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置３により水頭差を膜間差圧として測定し、上記の膜透過水量制御条件で変化させることで行った。連続発酵の期間中の膜間差圧は、２ｋＰａ以下で推移した。適宜、膜透過発酵液中の生産されたＬ−乳酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。また、Ｌ−乳酸およびグルコース濃度から算出された投入グルコースから算出されたＬ−乳酸対糖収率とＬ−乳酸生産速度を表２に示した。２４０時間の発酵試験を行った結果、図２の連続発酵装置を用いることにより、安定したＬ−乳酸の連続発酵による製造が可能であることを確認することができた。
【０１１１】
（実施例５）連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その５）
分離膜には述する参考例３で作製した多孔性膜を用い、実施例４と同様のＬ−乳酸連続発酵試験を行った。その結果を表２に示す。その結果、安定したＬ−乳酸の連続発酵による製造が可能であることを確認することができた。
【０１１２】
（実施例６）連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その６）
分離膜に後述する参考例４で作製した多孔性膜を用い、実施例５と同様のＬ−乳酸連続発酵試験を行った。その結果を表２に示す。その結果、安定したＬ−乳酸の連続発酵による製造が可能であることを確認することができた。
【０１１３】
（実施例７）連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その７）
分離膜には述する参考例６で作製した中空糸多孔性膜を用い、実施例１と同様のＬ−乳酸連続発酵試験を行った。その結果を表２に示す。その結果、安定したＬ−乳酸の連続発酵による製造が可能であることを確認することができた。
【０１１４】
（実施例８）連続発酵によるＬ−乳酸の製造（その８）
分離膜に後述する参考例６で作製した中空糸多孔性膜を用い、実施例４と同様のＬ−乳酸連続発酵試験を行った。その結果を表２に示す。その結果、安定したＬ−乳酸の連続発酵による製造が可能であることを確認することができた。
【０１１５】
（比較例１）回分発酵によるＬ−乳酸の製造
図１および図２に示す連続発酵装置を用いることによりＬ−乳酸発酵生産性が向上するかどうかを調べるため、微生物を用いた発酵形態として最も典型的な回分発酵を行い、その乳酸生産性を評価した。表１に示す乳酸発酵培地を用い、ミニジャーファメンター（ＡＢＬＥ社製、ＢＭＪ型、２Ｌ）による回分発酵試験を行った。該乳酸発酵培地は、１２１℃の温度で１５分間、高圧蒸気滅菌して用いた。この比較例１では、微生物として参考例１で造成した酵母ＳＷ−１株を用い、発酵生産物であるＬ−乳酸の濃度の評価には、後述する参考例１に示したＨＰＬＣを用いて評価し、グルコース濃度の測定には“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬社製）を用いた。比較例２の運転条件を以下に示す。
【０１１６】
・発酵反応槽容量（乳酸発酵培地量）：１（Ｌ）
・温度調整：３０（℃）
・発酵反応槽通気量：０．０５（Ｌ／ｍｉｎ）
・発酵反応槽攪拌速度：１００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ５に調整。
【０１１７】
まず、ＳＷ−１株を試験管中で５ｍｌの乳酸発酵培地で一晩振とう培養した（前々培養）。前々培養液を新鮮な乳酸発酵培地１００ｍｌに植菌し５００ｍｌ容坂口フラスコ中で２４時間振とう培養した（前培養）。前培養液をミニジャーファメンターの１Ｌの乳酸発酵培地に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５で１００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１を通気した。温度調整とｐＨ調整を行い、回分発酵培養を行った。このときの菌体増殖量は、６００ｎｍでの吸光度で１４であった。回分発酵の結果を、実施例１から６の連続発酵試験で得られたＬ―乳酸発酵生産性と比較して表２に示す。表２の実施例１〜６の結果では、別途培養し発酵反応槽に移送したＳＷ−１株培養液中に含まれるＬ−乳酸量を差し引いた各値を示している。これらの比較の結果、図１および図２の連続発酵装置を用いることにより、Ｌ−乳酸の生産速度が大幅に向上することを明らかにすることができた。すなわち、本発明によって開示された多孔性膜を組み込んだ膜分離型の連続発酵装置を用い、膜間差圧を制御することにより、発酵培養液を分離膜によって濾液と未濾過液に分離し、濾液から所望の発酵生産物を回収するとともに、未濾過液を発酵培養液に戻す連続発酵方法を可能とし、微生物量を高く維持しながら、連続発酵によるＬ―乳酸等の化学品の製造が可能であることが明らかとなった。
【０１１８】
【表２】
【０１１９】
（比較例２）連続発酵によるＬ−乳酸の製造
細孔径が小さく、純水透過係数が小さい多孔性膜を用い、図１の膜分離型連続発酵装置を稼働させることにより、Ｌ−乳酸連続発酵系が得られるかどうかを調べるため、表１に示す組成の酵母乳酸発酵培地を用い、この装置による連続発酵試験を行った。比較例２は、分離膜としては参考例５で作製した細孔径が小さく、純水透過係数が小さい多孔性膜を用い、膜透過水量制御方法を膜間差圧による流量制御（連続発酵全期間０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）し、その他試験条件は実施例２と同様に行った。その結果、培養開始後７２時間で、膜間差圧が２０ｋＰａを超え膜の閉塞が発生したため、連続発酵を停止した。このことから、本発明の連続発酵装置には、参考例５で作製した多孔性膜は不適であることが明らかになった。
【０１２０】
（比較例３）連続発酵によるＬ−乳酸の製造
細孔径が小さく、純水透過係数が小さい多孔性膜を用い、図２の膜分離型連続発酵装置を稼働させることにより、Ｌ−乳酸連続発酵系が得られるかどうかを調べるため、表１に示す組成の酵母乳酸発酵培地を用い、この装置による連続発酵試験を行った。この比較例３では、分離膜としては参考例５で作製した細孔径が小さく、純水透過係数が小さい多孔性膜を用い、膜透過水量制御方法を膜間差圧による流量制御（連続発酵全期間０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）し、その他試験条件は実施例４と同様に行った。その結果、培養開始後８０時間で、膜間差圧が２０ｋＰａを超え膜の閉塞が発生したため、連続発酵を停止した。このことから、本発明の連続発酵装置には、参考例５で作製した多孔性膜は不適であることが明らかになった。
【０１２１】
（参考例１）乳酸生産能力を持つ酵母株（ＳＷ−１株）の作製
乳酸生産能力を持つ酵母株を、下記のように造成した。具体的には、ヒト由来ＬＤＨ遺伝子を酵母ゲノム上のＰＤＣ１プロモーターの下流に連結することにより、Ｌ−乳酸生産能力を持つ酵母株を造成する。ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）には、Ｌａ−Ｔａｑ（宝酒造社製）あるいはKOD-Plus-polymerase（東洋紡社製）を用い、付属の取扱説明に従って行った。
【０１２２】
ヒト乳ガン株化細胞（ＭＣＦ−７）を培養回収後、TRIZOL Reagent（Invitrogen）を用いてtotal ＲＮＡを抽出し、得られたtotal ＲＮＡを鋳型としてSuperScript Choice System（Invitrogen）を用いた逆転写反応によりｃＤＮＡの合成を行った。これらの操作の詳細は、それぞれ付属のプロトコールに従った。得られたｃＤＮＡを、続くＰＣＲの増幅鋳型とした。
【０１２３】
上記の操作で得られたｃＤＮＡを増幅鋳型とし、配列番号１および配列番号２で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたKOD-Plus-polymeraseによるＰＣＲによりＬ−ｌｄｈ遺伝子のクローニングを行った。各ＰＣＲ増幅断片を精製し末端をT4 Polynucleotide Kinase（TAKARA社製）によりリン酸化後、ｐＵＣ１１８ベクター（制限酵素HincIIで切断し、切断面を脱リン酸化処理したもの）にライゲーションした。ライゲーションは、DNA Ligation Kit Ver.2（TAKARA社製）を用いて行った。ライゲーションプラスミド産物で大腸菌DH５αを形質転換し、プラスミドＤＮＡを回収することにより、各種Ｌ−ｌｄｈ遺伝子（配列番号３）がサブクローニングされたプラスミドを得た。得られたＬ−ｌｄｈ遺伝子が挿入されたｐＵＣ１１８プラスミドを制限酵素ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、得られた各ＤＮＡ断片を酵母発現用ベクターｐＴＲＳ１１（図４）のＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断部位に挿入した。このようにして、ヒト由来Ｌ−ｌｄｈ遺伝子発現プラスミドｐＬ−ｌｄｈ５（Ｌ−ｌｄｈ遺伝子）を得た。ヒト由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子発現ベクターである上記ｐＬ−ｌｄｈ５は、プラスミド単独で独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１中央第６）にＦＥＲＭＡＰ−２０４２１として寄託した（寄託日：平成１７年２月２１日）。
【０１２４】
ヒト由来ＬＤＨ遺伝子を含むプラスミドｐＬ−ｌｄｈ５を増幅鋳型とし、配列番号４および配列番号５で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより、１．３ｋｂのヒト由来ＬＤＨ遺伝子、及びサッカロミセス・セレビセ由来のＴＤＨ３遺伝子のターミネーター配列含むＤＮＡ断片を増幅した。また、プラスミドｐＲＳ４２４を増幅鋳型として、配列番号６および配列番号７で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより、１．２ｋｂのサッカロミセス・セレビセ由来のＴＲＰ１遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。それぞれのＤＮＡ断片を、１．５％アガロースゲル電気泳動により分離し、常法に従い精製した。ここで得られた１．３ｋｂ断片と１．２ｋｂ断片を混合したものを増幅鋳型とし、配列番号４および配列番号７で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲ法によって得られた産物を１．５％アガロースゲル電気泳動して、ヒト由来ＬＤＨ遺伝子およびＴＲＰ１遺伝子が連結された２．５ｋｂのＤＮＡ断片を、常法に従い調整した。この２．５ｋｂのＤＮＡ断片で、出芽酵母ＮＢＲＣ１０５０５株を常法に従いトリプトファン非要求性に形質転換した。
【０１２５】
得られた形質転換細胞が、ヒト由来ＬＤＨ遺伝子を酵母ゲノム上のＰＤＣ１プロモーターの下流に連結されている細胞であることの確認は、下記のようにして行った。まず、形質転換細胞のゲノムＤＮＡを常法に従って調製し、これを増幅鋳型とした配列番号８および配列番号９で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより０．７ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られることにより確認した。また、形質転換細胞が乳酸生産能力を持つかどうかは、ＳＣ培地（ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＹＥＡＳＴ ＧＥＮＥＴＩＣＳ ２０００ ＥＤＩＴＩＯＮ、 ＣＳＨＬ ＰＲＥＳＳ）で形質転換細胞を培養した培養上澄に乳酸が含まれていることを、下記に示す条件でＨＰＬＣ法により乳酸量を測定することにより確認した。
【０１２６】
・カラム：Shim-Pack SPR-H（島津社製）
・移動相：５mM ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
・反応液：５mM ｐ−トルエンスルホン酸、２０mM ビストリス、０．１mM EDTA・２Na（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
・検出方法：電気伝導度
・温度：４５℃。
【０１２７】
また、Ｌ−乳酸の光学純度測定は以下の条件でＨＰＬＣ法により測定した。
【０１２８】
・カラム：TSK-gel Enantio L1（東ソー社製）
・移動相：１ｍＭ 硫酸銅水溶液
・流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
・検出方法：ＵＶ２５４ｎｍ
・温度：３０℃。
【０１２９】
また、Ｌ−乳酸の光学純度は次式で計算される。
【０１３０】
・光学純度（％）＝１００×（Ｌ−Ｄ）／（Ｌ＋Ｄ）
ここで、ＬはＬ−乳酸の濃度を表し、ＤはＤ−乳酸の濃度を表す。
【０１３１】
ＨＰＬＣ分析の結果、４ｇ／ＬのＬ−乳酸が検出され、Ｄ−乳酸は検出限界以下であった。以上の検討により、この形質転換体がＬ−乳酸生産能力を持つことが確認された。得られた形質転換細胞を、酵母ＳＷ−１株として、実施例に用いた。
【０１３２】
（参考例２）多孔性膜の作製（その１）
樹脂としてポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）樹脂を、また溶媒としてＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）をそれぞれ用い、これらを９０℃の温度下に十分に攪拌し、次の組成の原液を得た。
【０１３３】
・ＰＶＤＦ：１３．０重量％
・ＤＭＡｃ：８７．０重量％。
【０１３４】
次に、上記原液を２５℃の温度に冷却した後、あらかじめガラス板上に貼り付けて置いた、密度が０．４８ｇ／ｃｍ3で、厚みが２２０μｍのポリエステル繊維製不織布（多孔質基材）に塗布し、直ちに次の組成を有する２５℃の温度の凝固浴中に５分間浸漬して、多孔質基材に多孔質樹脂層が形成された多孔質性膜を得た。
【０１３５】
・水：３０．０重量％
・ＤＭＡｃ：７０．０重量％。
【０１３６】
この多孔質性膜をガラス板から剥がした後、８０℃の温度の熱水に３回浸漬してＤＭＡｃを洗い出し、分離膜（多孔性膜）を得た。多孔質樹脂層表面の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内を、倍率１０，０００倍で走査型電子顕微鏡観察を行ったところ、観察できる細孔すべての直径の平均は０．１μｍであった。次に、上記の分離膜について純水透過係数を評価したところ、５０×１０-9ｍ3／ｍ2・ｓ・Ｐａであった。純水透水量の測定は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで行った。また、平均細孔径の標準偏差 は０．０３５μｍで、膜表面粗さは０．０６μｍであった。
【０１３７】
（参考例３）多孔性膜の作製（その２）
樹脂としてポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）樹脂を、開孔剤として分子量が約２０，０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を、溶媒としてＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）を、そして非溶媒として純水をそれぞれ用い、これらを９０℃の温度下に十分に攪拌し、次の組成の原液を得た。
【０１３８】
・ＰＶＤＦ：１３．０重量％
・ＰＥＧ：５．５重量％
・ＤＭＡｃ：７８．０重量％
・水：３．５重量％。
【０１３９】
次に、上記原液を２５℃の温度に冷却した後、密度が０．４８ｇ／ｃｍ3 で、厚みが２２０μｍのポリエステル繊維製不織布（多孔質基材）に塗布し、塗布後、直ちに２５℃の温度の純水中に５分間浸漬し、さらに８０℃の温度の熱水に３回浸漬してＤＭＡｃおよびＰＥＧを洗い出し、分離膜（多孔性膜）を得た。この分離膜の原液を塗布した側における、多孔質樹脂層表面の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内を、倍率１０，０００倍で走査型電子顕微鏡観察を行ったところ、観察できる細孔すべての直径の平均は０．０２μｍであった。この分離膜について純水透過係数を評価したところ、２×１０-9ｍ3／ｍ2・ｓ・Ｐａであった。透水量の測定は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで行った。また、平均細孔径の標準偏差 は０．００５５μｍで、膜表面粗さは０．１μｍであった。
【０１４０】
（参考例４） 多孔性膜の作製（その３）
下記組成の原液を用いた他は、参考例２と同様にして分離膜（多孔性膜）を得た。
【０１４１】
・ＰＶＤＦ：１３．０重量％
・ＰＥＧ ： ５．５重量％
・ＤＭＡｃ：８１．５重量％。
【０１４２】
この分離膜の原液を塗布した側における、多孔質樹脂層表面の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内を、倍率１０，０００倍で走査型電子顕微鏡観察を行ったところ、観察できる細孔すべての直径の平均は０．１９μｍであり、この分離膜について純水透過係数を評価したところ、１００×１０-9ｍ3／ｍ2・ｓ・Ｐａであった。透水量の測定は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで行った。また、平均細孔径の標準偏差 は０．０６０μｍで、膜表面粗さは０．０８μｍであった。
（参考例５） 多孔性膜の作製（その４）
樹脂としてポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）樹脂を、また溶媒としてＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）をそれぞれ用い、これらを９０℃の温度下に十分に攪拌し、次の組成を有する原液を得た。
【０１４３】
・ＰＶＤＦ：１５．０重量％
・ＤＭＡｃ：８５．０重量％。
【０１４４】
次に、上記原液を２５℃の温度に冷却した後、あらかじめガラス板上に貼り付けて置いた、密度が０．４８ｇ／ｃｍ3、厚みが２２０μｍのポリエステル繊維製不織布（多孔質基材）に塗布し、２５℃の温度の水の凝固浴中に５分間浸漬して、多孔質基材に多孔質樹脂層が形成された多孔性膜を得た。
【０１４５】
この多孔性膜をガラス板から剥がした後、８０℃の温度の熱水に３回浸漬してＤＭＡｃを洗い出し、分離膜を得た。多孔質樹脂層表面の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内を、倍率１０，０００倍で走査型電子顕微鏡観察を行ったところ、観察できる細孔すべての直径の平均は０．００８μｍであった。次に、上記分離膜について純水透水量を評価したところ、０．３×１０-9ｍ3／ｍ2・ｓ・Ｐａであった。透水量の測定は、逆浸透膜による２５℃の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで行った。また、平均細孔径の標準偏差 は０．００２μｍで、膜表面粗さは０．０６μｍであった。
【０１４６】
（参考例６）中空糸多孔性膜の作製
重量平均分子量４１．７万のフッ化ビニリデンホモポリマーとγ-ブチロラクトンとを、それぞれ３８重量％と６２重量％の割合で１７０℃の温度で溶解し原液を作製した。この原液をγ-ブチロラクトンを中空部形成液体として随拌させながら口金から吐出し、温度２０℃のγ-ブチロラクトン８０重量％水溶液からなる冷却浴中で固化して中空糸膜を作製した。
【０１４７】
次いで、重量平均分子量２８．４万のフッ化ビニリデンホモポリマーを１４重量％、セルロースアセテートプロピオネート（イーストマンケミカル社、ＣＡＰ４８２−０．５）を１重量％、Ｎ-メチル-２-ピロリドンを７７重量％、ポリオキシエチレンヤシ油脂肪酸ソルビタン（三洋化成株式会社、商品名イオネットＴ−２０Ｃ）を５重量％、水を３重量％の割合で９５℃の温度で混合溶解して原液を調整した。この原液を、上記で得られた中空糸膜の表面に均一に塗布し、すぐに水浴中で凝固させた本発明で用いる中空糸多孔性膜を製作した。得られた中空糸多孔性膜の被処理水側表面の平均細孔径は、０．０５μｍであった。次に、上記の分離膜である中空糸多孔性膜について純水透水量を評価したところ、５．５×１０-9ｍ3／ｍ2・ｓ・Ｐａであった。透水量の測定は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで行った。また、平均細孔径の標準偏差 は０．００６μｍであった。
【産業上の利用可能性】
【０１４８】
本発明の連続発酵装置では、別の培養槽で微生物もしくは培養細胞を培養し、培養されたフレッシュな発酵能力が高い状態の微生物もしくは培養細胞を含む培養液を培養槽から発酵反応槽に供給しながら連続発酵するから、常に高い化学品の生産性能を維持させることができる。
【０１４９】
また、本発明の連続発酵装置は、簡便な操作条件で、長時間にわたり安定して所望の発酵生産物の高生産性を維持する連続発酵が可能であり、広く発酵工業において、発酵生産物である各種化学品を低コストで安定に生産することができ有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】図１は、本発明で用いられる膜分離型の連続発酵装置の一つの実施の形態を説明するための概略側面図である。
【図２】図２は、本発明で用いられる他の膜分離型連続発酵装置の一つの実施の形態を説明するための概略側面図である。
【図３】図３は、本発明で用いられる分離膜エレメントの一つの実施の形態を説明するための概略斜視図である。
【図４】図４は、本発明で用いられる他の分離膜エレメントの例を説明するための断面説明図である。
【図５】図４は、酵母用発現ベクターｐＴＲＳ１１のフィジカルマップを示す図である。
【符号の説明】
【０１５１】
１ 発酵反応槽
２ 分離膜エレメント
３ 水頭差制御装置
４ 気体供給装置
５ 攪拌機
６ レベルセンサ
７ 培地供給ポンプ
８ ｐＨ調整溶液供給ポンプ
９ ｐＨセンサ・制御装置
１０ 温度調節器
１１ 発酵培養液循環ポンプ
１２ 膜分離槽
１３ 支持板
１４ 流路材
１５ 分離膜
１６ 凹部
１７ 培養槽
１８ 移送手段
１９ 集水パイプ
２０ 分離膜束
２１ 上部樹脂封止層
２２ 下部樹脂封止層
２３ 支持フレーム
２４ 集水パイプ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物もしくは培養細胞の発酵培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を該発酵培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を該発酵培養液に追加する連続発酵による化学品の製造装置であって、微生物もしくは培養細胞を培養する培養槽と、微生物もしくは培養細胞の連続発酵を行う発酵反応槽と、該培養槽で培養した微生物もしくは培養細胞を培養槽から発酵反応槽へ供給する移送手段と、発酵培養液を濾過するための分離膜を有する分離膜エレメントと、該分離膜の膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲に制御する手段からなり、該分離膜が平均細孔径０.０１μｍ以上１μｍ未満の細孔を有する多孔性膜であることを特徴とする連続発酵装置。
【請求項２】
微生物もしくは培養細胞の発酵培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を該発酵培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を該発酵培養液に追加する連続発酵による化学品の製造装置であって、微生物もしくは培養細胞を培養する培養槽と、微生物もしくは培養細胞の連続発酵を行う発酵反応槽と、該培養槽で培養した微生物もしくは培養細胞を培養槽から発酵反応槽へ供給する移送手段と、該発酵反応槽に発酵培養液循環手段を介して接続され内部に発酵培養液を濾過するための分離膜を有する分離膜エレメントを備えた膜分離槽と、該分離膜の膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲に制御する手段からなり、該分離膜が平均細孔径０.０１μｍ以上１μｍ未満の細孔を有する多孔性膜であることを特徴とする連続発酵装置。
【請求項３】
微生物もしくは培養細胞の発酵培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を該発酵培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を該発酵培養液に追加する連続発酵による化学品の製造装置であって、微生物もしくは培養細胞を培養する培養槽と、培養した微生物もしくは培養細胞の連続発酵を行う発酵反応槽と、該培養槽で培養した微生物もしくは培養細胞を培養槽から発酵反応槽へ供給する移送手段と、該発酵反応槽内に配設され発酵培養液を濾過するための分離膜を有する分離膜エレメントと、該分離膜エレメントに接続され濾過された発酵生産物を含む透過液を排出するための手段と、該分離膜の膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲に制御するための手段からなり、該分離膜が平均細孔径０.０１μｍ以上１μｍ未満の細孔を有する多孔性膜であることを特徴とする連続発酵装置。
【請求項４】
多孔性膜の純水透過係数が、２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上６×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下である請求項１〜３のいずれかに記載の連続発酵装置。
【請求項５】
多孔性膜の平均細孔径が０.０１μｍ以上０.２μｍ未満の範囲内にあり、かつ、該平均細孔径の標準偏差が０.１μｍ以下である請求項１から４のいずれかに記載の連続発酵装置。
【請求項６】
多孔性膜の膜表面粗さが０.１μｍ以下である請求項１から５のいずれかに記載の連続発酵装置。
【請求項７】
多孔性膜がポリフッ化ビニリデンからなる多孔質樹脂層を含む多孔性膜である請求項１から６のいずれかに記載の連続発酵装置。
【請求項８】
多孔性膜を含む膜分離エレメントを構成する部材が高圧蒸気滅菌操作に耐性である請求項１から７のいずれかに記載の連続発酵装置。
【請求項９】
分離膜の膜間差圧を制御するための手段が、発酵培養液と多孔性膜処理水の液位差を制御する水頭差制御装置である請求項１から８のいずれかに記載の連続発酵装置。
【請求項１０】
分離膜の膜間差圧を制御するための手段が、加圧ポンプまたは／および吸引ポンプである請求項１から９のいずれかに記載の連続発酵装置。
【請求項１１】
分離膜の膜間差圧を制御するための手段が、気体または液体の圧力である請求項１から１０のいずれかに記載の連続発酵装置。
【請求項１】
微生物もしくは培養細胞の発酵培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を該発酵培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を該発酵培養液に追加する連続発酵による化学品の製造装置であって、微生物もしくは培養細胞を培養する培養槽と、微生物もしくは培養細胞の連続発酵を行う発酵反応槽と、該培養槽で培養した微生物もしくは培養細胞を培養槽から発酵反応槽へ供給する移送手段と、発酵培養液を濾過するための分離膜を有する分離膜エレメントと、該分離膜の膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲に制御する手段からなり、該分離膜が平均細孔径０.０１μｍ以上１μｍ未満の細孔を有する多孔性膜であることを特徴とする連続発酵装置。
【請求項２】
微生物もしくは培養細胞の発酵培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を該発酵培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を該発酵培養液に追加する連続発酵による化学品の製造装置であって、微生物もしくは培養細胞を培養する培養槽と、微生物もしくは培養細胞の連続発酵を行う発酵反応槽と、該培養槽で培養した微生物もしくは培養細胞を培養槽から発酵反応槽へ供給する移送手段と、該発酵反応槽に発酵培養液循環手段を介して接続され内部に発酵培養液を濾過するための分離膜を有する分離膜エレメントを備えた膜分離槽と、該分離膜の膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲に制御する手段からなり、該分離膜が平均細孔径０.０１μｍ以上１μｍ未満の細孔を有する多孔性膜であることを特徴とする連続発酵装置。
【請求項３】
微生物もしくは培養細胞の発酵培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を該発酵培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を該発酵培養液に追加する連続発酵による化学品の製造装置であって、微生物もしくは培養細胞を培養する培養槽と、培養した微生物もしくは培養細胞の連続発酵を行う発酵反応槽と、該培養槽で培養した微生物もしくは培養細胞を培養槽から発酵反応槽へ供給する移送手段と、該発酵反応槽内に配設され発酵培養液を濾過するための分離膜を有する分離膜エレメントと、該分離膜エレメントに接続され濾過された発酵生産物を含む透過液を排出するための手段と、該分離膜の膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲に制御するための手段からなり、該分離膜が平均細孔径０.０１μｍ以上１μｍ未満の細孔を有する多孔性膜であることを特徴とする連続発酵装置。
【請求項４】
多孔性膜の純水透過係数が、２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上６×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下である請求項１〜３のいずれかに記載の連続発酵装置。
【請求項５】
多孔性膜の平均細孔径が０.０１μｍ以上０.２μｍ未満の範囲内にあり、かつ、該平均細孔径の標準偏差が０.１μｍ以下である請求項１から４のいずれかに記載の連続発酵装置。
【請求項６】
多孔性膜の膜表面粗さが０.１μｍ以下である請求項１から５のいずれかに記載の連続発酵装置。
【請求項７】
多孔性膜がポリフッ化ビニリデンからなる多孔質樹脂層を含む多孔性膜である請求項１から６のいずれかに記載の連続発酵装置。
【請求項８】
多孔性膜を含む膜分離エレメントを構成する部材が高圧蒸気滅菌操作に耐性である請求項１から７のいずれかに記載の連続発酵装置。
【請求項９】
分離膜の膜間差圧を制御するための手段が、発酵培養液と多孔性膜処理水の液位差を制御する水頭差制御装置である請求項１から８のいずれかに記載の連続発酵装置。
【請求項１０】
分離膜の膜間差圧を制御するための手段が、加圧ポンプまたは／および吸引ポンプである請求項１から９のいずれかに記載の連続発酵装置。
【請求項１１】
分離膜の膜間差圧を制御するための手段が、気体または液体の圧力である請求項１から１０のいずれかに記載の連続発酵装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００８−２３７２１３（Ｐ２００８−２３７２１３Ａ）
【公開日】平成２０年１０月９日（２００８．１０．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−４３２９２（Ｐ２００８−４３２９２）
【出願日】平成２０年２月２５日（２００８．２．２５）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１９年度新エネルギー・産業技術総合開発機構、「微生物機能を活用した環境調和型製造基盤技術開発／微生物機能を活用した高度製造基盤技術開発」に係る委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月９日（２００８．１０．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月２５日（２００８．２．２５）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１９年度新エネルギー・産業技術総合開発機構、「微生物機能を活用した環境調和型製造基盤技術開発／微生物機能を活用した高度製造基盤技術開発」に係る委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
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