進行波アレイ、分離方法、および精製セル
【課題】液体もしくはガス状媒質から粒子もしくはサンプルを収集かつ選別する器具またはデバイスを提供すること。
【解決手段】様々な進行波グリッド構成を開示する。該グリッドおよびシステムは、液体またはガス状媒質中に分散した小さな粒子を輸送、分離、および分類するのに非常に適している。また、そのような進行波アレイおよび戦略を用いる様々な分離戦略および精製セルも開示する。
【解決手段】様々な進行波グリッド構成を開示する。該グリッドおよびシステムは、液体またはガス状媒質中に分散した小さな粒子を輸送、分離、および分類するのに非常に適している。また、そのような進行波アレイおよび戦略を用いる様々な分離戦略および精製セルも開示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本例示的実施形態は、特に液体もしくはガス状媒質から、粒子もしくはサンプルを収集かつ選別する器具またはデバイスに関する。該例示的実施形態は、生物学的作用物質（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｇｅｎｔｓ）の分離および検出と併せた特定の用途を見出しており、特にそれに関して説明する。ただし、本例示的実施形態が他の類似用途にも適していることを理解すべきである。
【背景技術】
【０００２】
エアロゾルの形態でまたは水中に分散した生物学的作用物質は、通常、最も感度の高い検出スキームの検出限界（ＬＯＤ：ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）さえも下回るような低い濃度である。それにもかかわらず、ただ１つのバクテリアの摂取でさえ、命に関わる結果をまねくことがある。したがって、サンプルがエアロゾル収集で得られたにせよ、水収集で得られたにせよ、該サンプルを検出前にさらに濃縮する必要がある。
【０００３】
エアロゾルおよびヒドロゾル収集スキームは、通常、非常に高流量（１５０ｋＬ／分以上）で大量の空気を採取し、サイクロンインパクタ設計を使用して脅威範囲内のサイズを有する粒子を収集し、それらを体積５〜１０ｍＬのウェットサンプル中に捕集する。次いで、この上清を作用物質検出のためのテストサンプルとして使用する。現在利用可能な検出戦略を使用するには、ヒドロゾルをさらに２桁濃縮することが望ましい。これは、例えば、サンプルの体積中の生物粒子すべてを、より小さい５０〜１００μＬの体積中に収集することによって達成することができる。
【０００４】
水中の汚染物質は、通常、作用物質試験用のサンプルを回収するために、いくつかの濾過ステップによって処理される。初めにより大きな植物性物質を除去するために予備濾過された後、サンプルは、限外濾過を用いてさらに２〜３桁濃縮される。このタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ：ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）法は、各ステップが標的分子の分子量（ＭＷ）に比べて１／３〜１／６の分子量を分画（カットオフ）するフィルタを用い、かつ保持液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を再循環させる、多数の連続ＴＦＦステップを必要とすることがあるので、面倒である。ＴＦＦの制限因子は、システムロスであり、それ未満ではさらなる濃度改善をもたらすことのできない分画が存在する。検出器に供給されることになる最後の保持液は、体積約５０ｍＬである。保持液をさらに最大３桁まで濃縮することが特に望ましい。
【０００５】
フィールドフローフラクショネーション（ＦＦＦ：Ｆｉｅｌｄ Ｆｌｏｗ Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）は、流路チャネル内で様々な電荷対サイズ比（ｑ／ｄ）の粒子の分離を可能にする技術である。この技術は、印刷から生物医学および生化学用途にまで及ぶ、多くの分野で有用である。分離が達成されるのは、ｑ／ｄ比の異なる粒子が流路チャネルを横切って移動するのに要する時間が異なり、したがって収集壁に到達する前に流路チャネルに沿って進む距離が異なるからである。ｑ／ｄ値が異なる種の、分離した明確なバンドを得るために、粒子は、通常、チャネルの最上部から狭い入口を通じて注入される。総処理量は、入口の幾何学形状および流量によって決まり、それがシステムのｑ／ｄ分解能に影響を及ぼす。
【０００６】
ＦＦＦは、流れ場に注入された粒子の泳動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）の制御を、分離方向に垂直な場の存在に頼っている。分離された構成成分は、保持時間に基づいてシステムから１つずつ溶出し、順に収集される。この分離は、分離チャネルを通じてポンプで送り込まれる、ポアゾイユ流に特有の放物線速度プロファイルを生み出す低粘性液体中、通常は緩衝水溶液中で実施される。該プロセスは、注入された粒子と側壁との間隔を調節することによって該粒子の相対速度を制御することに頼っている。より高い電気泳動移動度またはゼータ電位をもつ粒子は、壁の近くに集まり、したがってチャネル中央寄りにある粒子よりも移動が遅い。事実上、粒子は、ゼータ電位およびサイズに基づいてシステム内を異なる速度で移動する。熱、磁気、誘電泳動、遠心分離、沈降、立体的（ｓｔｅｒｉｃ）、および直交流など、様々な分離メカニズムの使用が、ＦＦＦ方法群を生み出してきた。多くの点では満足のいくものであるが、依然として改良型ＦＦＦ分離技術が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第６３５１６２３号明細書
【特許文献２】米国特許第６２９０３４２号明細書
【特許文献３】米国特許第６２７２２９６号明細書
【特許文献４】米国特許第６２４６８５５号明細書
【特許文献５】米国特許第６２１９５１５号明細書
【特許文献６】米国特許第６１３７９７９号明細書
【特許文献７】米国特許第６１３４４１２号明細書
【特許文献８】米国特許第５８９３０１５号明細書
【特許文献９】米国特許第４８９６１７４号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本例示的実施形態は、前述の問題などを克服する、新しい改良型のシステム、デバイス、セル、および関連方法を企図している。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
第１の態様では、例示的実施形態は、第１の進行波グリッドと、該第１の進行波グリッドの下流にある第２の進行波グリッドと、該第１の進行波グリッドと該第２の進行波グリッドとの間を延びる移行領域とを含む、進行波グリッドシステムを提供する。移行領域には、アーチ形トレースの集合体が含まれる。移行領域は、第１のグリッドから第２のグリッドへと粒子ストリームを輸送し、かつ該粒子ストリームの収束（ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｃｅ）を引き起こすように適合される。
【００１０】
他の態様では、例示的実施形態は、粒子のサンプルからサイズに応じて粒子を区別し、任意で粒子を収集する方法を提供する。該方法は、第１の進行波グリッドと第２の進行波グリッドとを含む進行波グリッドシステムを提供するステップを含む。第１および第２の進行波グリッドは、互いに対してある角度を成すように向けられている。その角度は、約１０°〜約１７０°にわたる。該方法は、様々なサイズの粒子を含んだサンプルを第１の進行波グリッド上に導入するステップを含む。該方法は、進行波グリッドシステムを操作し、それによって粒子を第１および第２の進行波グリッドに沿って輸送するステップをさらに含む。粒子は、第１および第２の進行波グリッドの角度配向に対応する方向変化を起こすと、該粒子のサイズに応じて少なくとも２つの群に分かれる。
【００１１】
さらに他の態様では、例示的実施形態は、複数の粒子のサンプルからサイズに応じて粒子を区別し、任意で粒子を収集する方法を提供する。該方法は、グリッドに印加される電圧信号の掃引周波数を選択的に調節する準備を含めて、進行波グリッドを提供するステップを含む。該方法は、また、様々なサイズの粒子を含んだサンプルを進行波グリッド上に導入するステップも含む。該方法は、第１のサイズの粒子がそれによってグリッドのある領域から別の領域へと変位する第１の掃引周波数で、グリッドを操作するステップをさらに含む。また、該方法は、第１のサイズとは異なる第２のサイズの粒子がそれによってグリッドのある領域から別の領域へと変位する、第１の掃引周波数とは異なる第２の掃引周波数で、グリッドを操作するステップを含む。
【００１２】
他の態様では、例示的実施形態は、サンプルから粒子を除去かつ分類するように適合された精製セルを提供する。該セルは、第１の進行波グリッドを含んだ濃縮チャンバと、第２の進行波グリッドを含んだ分離チャンバと、該第１の進行波グリッドと該第２の進行波グリッドとの間を延びる集束（ｆｏｃｕｓｉｎｇ）チャネルとを含む。該集束チャネルには、第３の進行波グリッドが含まれる。第２および第３の進行波グリッドは、互いに対して約１０°〜約１７０°の角度に向けられている。分離チャンバには、さらに、様々なサイズの粒子を受け取るように適合された区画の集合体が含まれる。区画の集合体は、第２の進行波グリッドをまたいで整列している。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】微粒子のストリームを濃縮して所望の位置へと誘導する進行波アレイの略図である。
【図２】中程度の質量負荷で停滞する恐れのある進行波アレイを示す図である。
【図３】ブランク領域が粒子を集束させる曲線グリッドを示す、例示的実施形態の進行波アレイの略図である。
【図４】停滞を起こしにくい進行波アレイの他の例示的実施形態の略図である。
【図５】他の例示的実施形態の進行波アレイの略図である。
【図６】例示的実施形態による、方向変化を起こしている異なったサイズの微粒子のストリームにおける曲率および結果として得られる集束の程度を示す、曲線状進行波グリッドの幅をまたぐ３つの顕微鏡写真のコレクションである。
【図７】集束された粒子ストリームの分離を示す、他の例示的実施形態の進行波アレイの略図である。
【図８】例示的実施形態による分離戦略を示す図である。
【図９】例示的実施形態による精製セルの略図である。
【図１０】例示的実施形態による他の再循環式精製セルの略図である。
【図１１】例示的実施形態による、連続分離のために変形フィールドフローフラクショネーションセルと統合された精製デバイスの略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
現在、遠心分離および限外濾過によって達成される典型的な濃縮に優る、液体サンプル中の非常に希薄な量の生物学的作用物質（または生体分子）を濃縮する有効な方法は、他に存在しない。高速（１０，０００ｒｐｍ）での遠心分離を使用して、バクテリアなどの多数の粒子をペレット化できるが、その方法は、容易に持ち運び可能ではない。例示的実施形態のデバイスは、限外濾過後に保持液を処理し、さらに１００倍以上濃縮することが可能である。加えて、精製またはバイオエンリッチメント操作に通常関係した体積を取り扱うことのできる利用可能なデバイスも、ほとんど存在しない。ラボオンチップ（ＬＯＣ：ｌａｂ−ｏｎ−ｃｈｉｐ）デバイスは、わずかな体積しか取り扱うことができない。例示的実施形態のデバイスは、そのような大きい体積を容易に取り扱うことができる。
【００１５】
より具体的には、例示的実施形態は、デバイスの動作を最適化するために、具体的には、質量輸送を最大にし、かつ密集（ｃｏｎｇｅｓｔｉｏｎ）を最小限に抑えるために使用できる、様々な独特の進行波アレイ構成を提供する。例示的実施形態は、また、液体媒質でのサンプル分離のための様々な方法も提供する。また、例示的実施形態は、濃縮、集束、および分離機能をもたらすカスケード式進行波グリッドを用いる精製セルを提供する。
【００１６】
本明細書で使用する用語「進行波グリッド」または「進行波アレイ」は、集合的に、基材、進行波を発生するために電圧波形が印加される複数の電極、ならびに電気信号（または電位）をグリッド全体に分配するための１つ以上のバス、バイアス（ｖｉａｓ）、および電気接触パッドを指す。この用語は、また、集合的に、グリッドを操作する多相電気信号を提供する１つ以上の電力源も指す。進行波グリッドは、例えば、扁平な平面形態や非平面形態など、ほとんどどの形態にもすることができる。非平面形態は、例えば、円筒の外壁に沿って延びるアーチ形領域の形態にすることができる。非平面グリッドは、チューブの内部領域内に画定される環状グリッドの形態にすることができる。進行波グリッド、それらの使用、および製造については、一般に、前述の米国特許に記載されている。
【００１７】
本明細書で述べるように、様々な例示的実施形態の進行波グリッドシステムは、１つ以上の山形グリッドを含む。本明細書で使用する用語「山形（ｃｈｅｖｒｏｎ）」は、進行波グリッドもしくはその一部分を構成する電極またはトレースのパターンを指しており、トレースのかなりの部分、通常はトレースすべてがアーチ形で、さらに同心的に配置される。通常、アーチ形トレースは、また、該トレースの集合体の動作時に、粒子の意図される流れの方向から上流に位置した１つ以上の中心点の周りに該トレースが画定されるように配置される。この構成は、流れの方向に対して、ストリームの方向を維持し、かつ流れているストリーム中の微粒子の分散を低減する働きをする。
【００１８】
本明細書に記載の進行波グリッドまたはアレイシステムの他の態様は、特定の用途では、該グリッドが互いに対してある角度を成すように向けられていることである。この配向態様は、実際、別のグリッド上の微粒子の進行方向に対する、あるグリッド上の微粒子の意図される（もしくは実際の）進行方向に関する。一般に、隣接したグリッド間またはグリッド領域間の角度は、約１０°〜約１７０°、より具体的には約４５°〜約１３５°、しばしば約９０°にすることができる。特定の用途では、例示的実施形態は、粒子流ストリームの方向変化を用いて、該粒子を区別し、分離し、かつ／または分類する。
【００１９】
進行波アレイは、図１にそれぞれ示したように、隣接した直線グリッド１０と山形グリッド５０とを含むことができる。直線グリッド１０は、微粒子を第１の縁部１２から第２の縁部１４へと横方向に輸送し、該第２の縁部１４で、山形グリッド５０が方向転換を引き起こして微粒子をサンプルウェル（ｓａｍｐｌｅ ｗｅｌｌ）７０へと移動させており、該サンプルウェル７０では、電界引出し（ｆｉｅｌｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）を使用して微粒子を収集し、それによって微粒子の濃度を増大させることができる。ストリームが山形グリッド５０上に配置されたときにグリッド１０上のストリームの方向に対して直角に移動する傾向にあるので、山形グリッド５０は、また、得られる粒子ストリームを集束させる働きもする。この実施形態の山形グリッド５０の幅は、約３ｍｍであり、サンプル濃度が４０ｍｇ／Ｌを超えるときには密集状態になりやすい。
【００２０】
図２は、直径３μｍおよび６μｍのポリスチレンビーズ（ｂｅａｄｓ）の濃縮サンプルによる停滞（ｓｔａｇｎａｔｉｏｎ）状態を示す。直線グリッド１１０と山形グリッド１５０とを含む進行波アレイ１００では、山形グリッド１５０は、比較的狭い。ビーズは、領域１１４に沿ってグリッド１１０の左縁部に集まっており、粒子の密度が高いので、山形グリッド１５０に沿ってサンプルウェル（図示せず）まで進み続けることができない。密集の理由は、図２から明らかである。直線グリッドから山形グリッドへの移行は、多車線のハイウェイがはるかに狭いレーンへと収束するのに似ている。直線グリッド１１０の幅は約５ｃｍであるので、３ｍｍへの圧縮率は１６倍を超える。山形グリッド１５０の底部から頂部への輸送（図２に示した通り）であるので、微粒子がサンプルウェルに接近するにつれて密集の可能性が増大する。密集は、多量の微粒子が、輸送電場の低下に起因して非効率的となる多層状輸送を引き起こす、停滞状態である。
【００２１】
この状況を緩和し、かつ質量流量を増大させる（より高い濃度を伴う生物医学的用途に有用である）ために、例示的実施形態は、進行波グリッドの改良型システムのいくつかの変形形態を提供する。一般に、例示的実施形態によれば、通常は直線グリッドの形態をした第１の進行波グリッドと、直線グリッドもしくは山形グリッドのいずれかの形態、または他の何らかのタイプのグリッドにすることのできる第２の進行波グリッドと、該第１のグリッドと該第２のグリッドとの間を延びる移行領域とを含む、進行波グリッドまたはアレイのシステムが提供される。前述のように、第１および第２のグリッドは、互いに対してある角度を成すように向けられている。移行領域は、微粒子をあるグリッドから別のグリッドに輸送するのを効率的に補助する働きをし、かつ好ましくはさらに該微粒子の方向変化を促進する、進行波グリッドまたはその一部分である。
【００２２】
具体的には、図３は、角度を成した境界領域２６０を有する山形グリッド２５０と連通した直線グリッド２１０を含む、例示的実施形態による進行波アレイ２００を示す。境界領域２６０の遠位端２６４は、該領域２６０の近位端２６２よりも大きな面積または幅を有する。すなわち、山形グリッド２５０上の微粒子の流れの方向に関して、境界領域２６０の幅は、流れの方向にしたがって縮小する。図３は、移行領域２６０に、収束する放射状進行波アレイを使用する様子を示す。図３のアレイの特徴は、グリッド２１０のある領域内の粒子が山形グリッド２５０の特定の領域内の粒子と重なり合うときの重複経路である。
【００２３】
図４は、角度を成した境界領域３６０を有する山形グリッド３５０と連通した直線グリッド３１０を含む、進行波アレイ３００を示す。領域３６０の遠位端３６４は、該領域３６０の近位端３６２よりも小さな面積または幅を有する。図３の構成とは対照的に、図４のアレイは、山形グリッド３５０上の微粒子の流れの方向にしたがって幅が増大する境界領域３６０を特色とする。図４のアレイでは、やはり収束する放射状進行波アレイが描かれているが、その重複経路は、最小限である。図４のアレイは、密集が最小限に抑えられ、また進行する粒子の重複経路も低減されている点で、特に有益である。
【００２４】
図５は、複数のアーチ形電極４０５を用いる第１のグリッド４１０と、山形グリッドまたは直線グリッドの形態にすることのできる第２のグリッド４５０とを含む、他の進行波アレイ４００を示す。例示的実施形態のこの変形形態では、第１のグリッド４１０は、事実上それ自体が移行領域である。図５は、収束する単一の放射状進行波アレイについての他の戦略を示す。このアレイは、より高速の濃縮のための比較的短い進行距離を特色とする。
【００２５】
図３〜５では、影付きの面積は、前述の移行領域を示しており、サンプルウェル入口から出てくる拡張した山形グリッド領域の形態にすることができる。３つの構成は、すべて、サンプルウェルへと多くのレーンを開いている。山形グリッド領域を拡張すると、より大きなアプローチ角度スパンにわたる、より緩やかな粒子ストリームの収束が可能になる。
【００２６】
例示的実施形態は、また、粒子分離のための戦略も提供する。ほとんどの微粒子は、ｐＨに応じて、クーロン力をもたらす固有の電荷を有するが、また、不均一な場では分極することもある。誘起双極子モーメント（Ｃｌａｕｓｉｕｓ−Ｍｏｓｓｏｔｔｉ）は：
【数１】
であり、式中、ａは粒子の半径、εparticleは粒子の誘電率、εfluidは流体の誘電率である。低周波数では、εは実数である。双極子力は、次式によって与えられる：
【数２】
【００２７】
バチルスチューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）胞子およびサイズ範囲２００ｎｍ〜１０μｍのポリスチレンビーズに対する実験で、動電輸送が、電気浸透流（ＥＯＦ：ｅｌｅｃｔｒｏ−ｏｓｍｏｔｉｃ ｆｌｏｗ）、電気泳動、および誘電泳動効果のバランスであることが示される。
【００２８】
一態様では、例示的実施形態は、進行波掃引周波数を変化させることによって粒子を分離する。進行波の特徴的な輸送は、閾値掃引周波数未満では同期的であり、該周波数を上回ると非同期モードになる。相違は、一部の粒子はそれによって追従可能で、一部の粒子は追従不可能な、抵抗力に対するクーロン力と誘電泳動力とのバランスである。この特性は、特に、より大きく、より双極性の粒子の場合に、流体環境について保持される。１μｍ、３μｍ、および６μｍポリスチレンビーズのサンプル混合物によって、３Ｈｚでは該サイズ範囲内のすべてのビーズが輸送されることが実証される。４Ｈｚでは、いくらか大きい方のビーズがトレースに捕獲されて停滞する。それは、該ビーズの変位が進行波アレイのピッチよりも短いので、該ビーズがトレース間を前後に移動する状況で該ビーズが捕獲されるからである。６Ｈｚでは、すべてのビーズが捕獲される。この周波数感度は分離方法で利用することができる。戦略は、動きやすい粒子から順に混合物から選択的に移動させるために、周波数を下方にスキャンすることである。
【００２９】
他の態様では、例示的実施形態は、コーナー部の周りで粒子ストリームを屈曲または転回させることによって粒子を分離する。具体的には、この分離方式は、場もまた方向変化を反映するように、進行波グリッドが移行するコーナー部の周りで粒子ストリームを移動させるものである。この戦略は、様々なサイズの粒子がサンプルウェルへと集まるときに、該粒子がその相対的なサイズに応じて異なる転回半径をもつように思われるという観察結果を動機とする。図６は、山形グリッド領域の幅をまたぐ３つの顕微鏡写真Ａ、Ｂ、およびＣを示す。結果は、１μｍ、３μｍ、および６μｍポリスチレンビーズのサンプル混合物に関するものである。６μｍビーズは、顕微鏡写真Ｃから明らかなように、コーナー部の周りをより密に転回する。より小さい１μｍおよび３μｍビーズは、顕微鏡写真ＡおよびＢに示されるように、より広く転回する。それは、誘電泳動力が体積（ｒ3）とともに変化するので、より大きいビーズは、転回場の直接的な影響を受け、より速く転回可能であるからである。
【００３０】
図７を参照すると、この現象をさらに調査かつ実施するために、例示的実施形態による進行波グリッド５００が使用された。アレイ５００は、山形グリッド５５０と直線グリッド５１０とを含む。単なる近似ではあるが、例示的実施形態の分離戦略を使用した分離能力を試験する一方法は、アレイ５００を逆に操作することである。１、３、および６μｍ粒子の濃縮混合物１００μＬの体積を、山形グリッド５５０の第１の端部５５４のところでサンプルウェルに導入し、進行波グリッド５１０および５５０を逆に操作して、サンプルを主要直線グリッド５１０へと外に移動させる。具体的には、微粒子は、山形グリッドの第１の端部５５４から第２の端部５５２へと輸送され、次いで、直線グリッド５１０の第１の端部もしくは領域５１２またはその付近から、該直線グリッド５１０の第２の端部もしくは領域５１４へと輸送される。より大きい６μｍ粒子の経路は、矢印５３０によって示される。より小さい３μｍ粒子の経路は、矢印５４０によって示される。方向変化する粒子は、一般に、より長い距離に沿って同じ方向変化を起こす粒子よりもサイズが大きい。山形グリッド５５０の比較的狭いチャネル内の粒子混合物は、放射状進行波アレイ、すなわち山形グリッド５５０によって、輸送かつ集束され、線形進行波アレイ、すなわち粒子を上方に移動させる直線グリッド５１０によって、分離キャビティに注入される。３μｍサイズのビーズなど、比較的小さいビーズまたは粒子は、より速く移動して一番に到着する。より大きい６μｍのビーズまたは粒子は、より遅く移動し、Ｄで示されるようなコーナー部周りの掃引の際に、より短い距離で方向変化に反応することができる。
【００３１】
図８は、１、３、および６μｍビーズが幅１ｃｍの帯状域にわたって分布した、この試行の結果を示す。具体的には、６μｍ粒子の経路は、矢印５３０によって示される。３μｍ粒子の経路は、矢印５４０によって示される。１μｍ粒子の経路は、矢印５４５によって示される。６μｍ粒子および３μｍ粒子の両方の経路が、コーナー部Ｄの周りで、０．５ｃｍスパン内で９０°の方向変化を起こしたことに注目することが重要である。この結果は、山形が集束ではなく分散的になる傾向にあるような方向を向いていることを見事に考慮している。直線チャンバ内の低いサンプル密度は、また、サンプル分離を視覚化するのに顕微鏡使用を必要とする。
【００３２】
例示的実施形態は、また、精製セルも提供する。前述の進行波グリッドのレイアウトとサンプル分離戦略との組み合わせをデバイスの濃縮および集束アスペクトとともに組み込んで、図９に示した精製セル６００を提供することができる。精製セル６００には、濃縮チャンバ６１０と、集束チャネル６５０と、分離チャンバ６７０および６８０とが含まれる。分離チャンバの最上部６８０を、横列に並んだ区画６８２、６８４、６８６、６８８、および６９０に分割して、左から右へと進むにつれて増大する範囲の粒子サイズを収集することができる。例えば、比較的大きいサイズの粒子は、矢印６７２によって示されたストリームを構成し、その後区画６９０内に収集される。中間サイズの粒子は、矢印６７４によって示されたストリームを構成し、その後区画６８８内に収集される。ストリーム６７６内の比較的小さいサイズの粒子は、区画６８６内に収集される。より微小なサイズの粒子のストリームは、区画６８２および６８４の一方または両方に収集することができる。分離チャンバ内の進行波アレイは、様々なサイズ範囲内の微粒子を最上部の指定された収集区画へと集束させるために、連続的な山形レイアウトにすることができる。集束部分６５０は、分離性能の改善をもたらすことになる狭いストリームを形成する。セル６００の各部分またはコンポーネントについての代表的な寸法は、図９に示されている。
【００３３】
図１０は、セル上のループを閉じるために連結ブリッジが使用され、かつ最上部の中間に配置された、他の例示的実施形態の進行波アレイ７００を示す。この戦略は、収集された区画のうちの１つの内容物を再循環させて、さらなる精製をもたらす。精製セル７００には、濃縮チャンバ７１０と、集束チャネル７５０と、分離チャンバ７７０および７８０と、連結ブリッジ７４０とが含まれる。分離チャンバの最上部を、区画７８２、７８４、７８６、７８８、および７９０の集合体に分割して、左から右へと進むにつれて増大する範囲の粒子サイズを収集することができる。例えば、比較的大きいサイズの粒子は、矢印７７２によって示されたストリームを構成し、その後区画７９０内に収集される。中間サイズの粒子は、矢印７７４によって示されたストリームを構成し、その後区画７８８内に収集される。ストリーム７７６内の比較的小さいサイズの粒子は、区画７８６内に収集される。より微小なサイズの粒子のストリームは、区画７８４および７８２の一方または両方に収集することができる。さらなるプロセス処理が望まれる場合、連結ブリッジ７４０を使用して、特定のサイズまたはサイズ範囲の粒子を選択的に濃縮チャンバ７１０に戻すことができる。
【００３４】
大量のサンプルの場合、例示的実施形態の精製セルを、図１１に示したｍＦＦＦセルジオメトリに組み込むことができる。具体的には、セル８００は、濃縮チャンバ８１０と、分離チャンバの上部領域８８０および下部領域８７０と、該濃縮チャンバ８１０と該分離チャンバの下部領域８７０との間を延びる集束チャネル８５０とを含む。チャンバの上部領域８８０には、図９および図１０に関して記載したように、様々なサイズの粒子を保持する複数の区画の集合体が含まれる。具体的には、セル８００には、離隔された２つの基材もしくはプレート８２０および８３０が含まれており、そのうちの１つが、流入ストリームＥのための入口８２２と、流出ストリームＦのための出口８２４とを画定する。図９および図１０の構成で前述したように、分離チャンバの上部領域８８０には、様々なサイズまたはサイズ範囲の粒子を収集する複数の区画８８２、８８４、８８６、８８８、および８９０が含まれる。精製セルの操作は、以下の通りである。サンプルストリームＥが、入口８２２を通ってセル８００に進入する。進入するサンプルは、濃縮チャンバ８１０に流れ込む。圧縮場が、微粒子を下側表面の近傍へと下方に移動させ、該下側表面で、そこに配置された進行波グリッドがストリームおよびストリーム中の構成成分を集束チャネル８５０に向かって輸送する。サンプルがチャネル８５０内に入ると、その中を延びる山形進行波グリッドがサンプルを輸送して前述の分離チャンバへと誘導する。分離チャンバの向きは、概ね集束チャネル８５０内のサンプルの流れの方向に直交する。ストリームが分離チャンバの下部領域８７０に進入すると、前述のように、微粒子は、別個のストリーム８７２、８７４、および８７６に分かれる。最も大きい粒子は、区画８９０に集まる。より小さいサイズの粒子は、他の区画に集まる。ストリームの残りの部分は、出口８２４でストリームＦとしてセル８００から出ていく。
【００３５】
例示的実施形態の様々な精製セルは、濃縮、集束、および分離のカスケード型機能を使用することができる。該セルは、定体積設計、体積増加を伴うフロースルー構成を特色とすることができ、または、再循環式輸送とともに定体積を用いて、より高純度の濃縮を達成することができる。
【００３６】
例示的実施形態の利点には、質量流量を増大させ、かつ密集および停滞を最小限に抑えるための新しい進行波グリッド構成、新しい分離戦略の提供、ならびに、最大数百マイクロリットルまでしか取り扱えない複雑な既存の方法に比べて、数十ミリリットルを取り扱うことのできる精製セルの提供が含まれるが、これに限るものではない。
【００３７】
例示的実施形態の潜在用途には、生物兵器防衛（ｂｉｏ−ｄｅｆｅｎｓｅ）用途でのフロントエンド検出のための予備濃縮、公共設備の給水モニタリング、食品の毒物検査、血漿分離、細胞エンリッチメント（ｃｅｌｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）、およびタンパク質精製が含まれるが、これに限るものではない。
【００３８】
その他の実施形態として、次のものを挙げることができる。
【００３９】
前記進行波グリッドシステムであって、前記第１の進行波グリッドおよび前記第２の進行波グリッドが互いに対して約１０°〜約１７０°の角度に向けられていることを特徴とする進行波グリッドシステム。
【００４０】
前記進行波グリッドシステムであって、前記第１および第２のグリッドが互いに対して約４５°〜約１３５°の角度に向けられていることを特徴とする進行波グリッドシステム。
【００４１】
前記進行波グリッドシステムであって、前記第１および第２のグリッドが互いに対して約９０°の角度に向けられていることを特徴とする進行波グリッドシステム。
【００４２】
前記進行波グリッドシステムであって、前記第２の進行波グリッドが山形グリッドであることを特徴とする進行波グリッドシステム。
【００４３】
前記進行波グリッドシステムであって、前記移行領域が前記第２の進行波グリッドへと延びるにつれて前記移行領域の幅が縮小することを特徴とする進行波グリッドシステム。
【００４４】
前記進行波グリッドシステムであって、前記移行領域が前記第２の進行波グリッドへと延びるにつれて前記移行領域の幅が増大することを特徴とする進行波グリッドシステム。
【００４５】
前記進行波グリッドシステムであって、前記移行領域に山形進行波グリッドが含まれることを特徴とする進行波グリッドシステム。
【００４６】
前記方法であって、他の粒子よりも長い距離に沿って方向変化を起こす粒子が、前記他の粒子よりもサイズが小さいことを特徴とする方法。
【００４７】
前記方法であって、より大きい粒子が、より小さい粒子よりも短い転回半径をもつことを特徴とする方法。
【００４８】
前記方法であって、前記第１の掃引周波数が前記第２の掃引周波数よりも高いことを特徴とする方法。
【００４９】
前記方法であって、前記第１の掃引周波数を用いて変位した粒子が、前記第２の掃引周波数を用いて変位した粒子よりも小さいことを特徴とする方法。
【００５０】
前記精製セルであって、前記第３の進行波グリッドが山形進行波グリッドであることを特徴とする精製セル。
【００５１】
前記精製セルであって、前記分離チャンバに１つ以上の山形進行波グリッドが含まれることを特徴とする精製セル。
【００５２】
前記精製セルであって、山形進行波グリッドの数が区画の数に対応することを特徴とする精製セル。
【００５３】
前記精製セルであって、前記集束チャネルに最も近い区画が、前記セルが操作されたときに前記サンプル内の最も大きいサイズの粒子を受け取ることを特徴とする精製セル。
【００５４】
前記精製セルであって、前記濃縮チャンバと前記分離チャンバとの間を延びる再循環ループをさらに含んでおり、前記再循環ループに第４の進行波グリッドが含まれることを特徴とする精製セル。
【符号の説明】
【００５５】
１０ 直線グリッド、１２ 第１の縁部、１４ 第２の縁部、５０ 山形グリッド、７０ サンプルウェル、１００ 進行波アレイ、１１０ 直線グリッド、１５０ 山形グリッド、２００ 進行波アレイ、２１０ 直線グリッド、２５０ 山形グリッド、２６０ 境界領域、２６２ 近位端、２６４ 遠位端、３００ 進行波アレイ、３１０ 直線グリッド、３５０ 山形グリッド、３６０ 境界領域、３６２ 近位端、３６４ 遠位端、４００ 進行波アレイ、４０５ アーチ形電極、４１０ 第１のグリッド、４５０ 第２のグリッド、５００ 進行波アレイ、５１０ 直線グリッド、５１２ 第１の領域、５１４ 第２の領域、５３０ ６μｍ粒子の経路、５４０ ３μｍ粒子の経路、５４５ １μｍ粒子の経路、５５０ 山形グリッド、５５２ 第２の端部、５５４ 第１の端部、６００ 精製セル、６１０ 濃縮チャンバ、６５０ 集束チャネル、６７０ 分離チャンバ、６８０ 分離チャンバの最上部、６８２ 区画、６８４ 区画、６８６ 区画、６８８ 区画、６９０ 区画、７００ 進行波アレイ／精製セル、７１０ 濃縮チャンバ、７４０ 連結ブリッジ、７５０ 集束チャネル、７７０ 分離チャンバ、７８０ 分離チャンバ、７８２ 区画、７８４ 区画、７８６ 区画、７８８ 区画、７９０ 区画、８００ セル、８１０ 濃縮チャンバ、８２０ 基材またはプレート、８２２ 入口、８２４ 出口、８３０ 基材またはプレート、８５０ 集束チャネル、８７０ 分離チャンバの下部領域、８８０ 分離チャンバの上部領域、８８２ 区画、８８４ 区画、８８６ 区画、８８８ 区画、８９０ 区画。
【技術分野】
【０００１】
本例示的実施形態は、特に液体もしくはガス状媒質から、粒子もしくはサンプルを収集かつ選別する器具またはデバイスに関する。該例示的実施形態は、生物学的作用物質（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｇｅｎｔｓ）の分離および検出と併せた特定の用途を見出しており、特にそれに関して説明する。ただし、本例示的実施形態が他の類似用途にも適していることを理解すべきである。
【背景技術】
【０００２】
エアロゾルの形態でまたは水中に分散した生物学的作用物質は、通常、最も感度の高い検出スキームの検出限界（ＬＯＤ：ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）さえも下回るような低い濃度である。それにもかかわらず、ただ１つのバクテリアの摂取でさえ、命に関わる結果をまねくことがある。したがって、サンプルがエアロゾル収集で得られたにせよ、水収集で得られたにせよ、該サンプルを検出前にさらに濃縮する必要がある。
【０００３】
エアロゾルおよびヒドロゾル収集スキームは、通常、非常に高流量（１５０ｋＬ／分以上）で大量の空気を採取し、サイクロンインパクタ設計を使用して脅威範囲内のサイズを有する粒子を収集し、それらを体積５〜１０ｍＬのウェットサンプル中に捕集する。次いで、この上清を作用物質検出のためのテストサンプルとして使用する。現在利用可能な検出戦略を使用するには、ヒドロゾルをさらに２桁濃縮することが望ましい。これは、例えば、サンプルの体積中の生物粒子すべてを、より小さい５０〜１００μＬの体積中に収集することによって達成することができる。
【０００４】
水中の汚染物質は、通常、作用物質試験用のサンプルを回収するために、いくつかの濾過ステップによって処理される。初めにより大きな植物性物質を除去するために予備濾過された後、サンプルは、限外濾過を用いてさらに２〜３桁濃縮される。このタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ：ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）法は、各ステップが標的分子の分子量（ＭＷ）に比べて１／３〜１／６の分子量を分画（カットオフ）するフィルタを用い、かつ保持液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を再循環させる、多数の連続ＴＦＦステップを必要とすることがあるので、面倒である。ＴＦＦの制限因子は、システムロスであり、それ未満ではさらなる濃度改善をもたらすことのできない分画が存在する。検出器に供給されることになる最後の保持液は、体積約５０ｍＬである。保持液をさらに最大３桁まで濃縮することが特に望ましい。
【０００５】
フィールドフローフラクショネーション（ＦＦＦ：Ｆｉｅｌｄ Ｆｌｏｗ Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）は、流路チャネル内で様々な電荷対サイズ比（ｑ／ｄ）の粒子の分離を可能にする技術である。この技術は、印刷から生物医学および生化学用途にまで及ぶ、多くの分野で有用である。分離が達成されるのは、ｑ／ｄ比の異なる粒子が流路チャネルを横切って移動するのに要する時間が異なり、したがって収集壁に到達する前に流路チャネルに沿って進む距離が異なるからである。ｑ／ｄ値が異なる種の、分離した明確なバンドを得るために、粒子は、通常、チャネルの最上部から狭い入口を通じて注入される。総処理量は、入口の幾何学形状および流量によって決まり、それがシステムのｑ／ｄ分解能に影響を及ぼす。
【０００６】
ＦＦＦは、流れ場に注入された粒子の泳動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）の制御を、分離方向に垂直な場の存在に頼っている。分離された構成成分は、保持時間に基づいてシステムから１つずつ溶出し、順に収集される。この分離は、分離チャネルを通じてポンプで送り込まれる、ポアゾイユ流に特有の放物線速度プロファイルを生み出す低粘性液体中、通常は緩衝水溶液中で実施される。該プロセスは、注入された粒子と側壁との間隔を調節することによって該粒子の相対速度を制御することに頼っている。より高い電気泳動移動度またはゼータ電位をもつ粒子は、壁の近くに集まり、したがってチャネル中央寄りにある粒子よりも移動が遅い。事実上、粒子は、ゼータ電位およびサイズに基づいてシステム内を異なる速度で移動する。熱、磁気、誘電泳動、遠心分離、沈降、立体的（ｓｔｅｒｉｃ）、および直交流など、様々な分離メカニズムの使用が、ＦＦＦ方法群を生み出してきた。多くの点では満足のいくものであるが、依然として改良型ＦＦＦ分離技術が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第６３５１６２３号明細書
【特許文献２】米国特許第６２９０３４２号明細書
【特許文献３】米国特許第６２７２２９６号明細書
【特許文献４】米国特許第６２４６８５５号明細書
【特許文献５】米国特許第６２１９５１５号明細書
【特許文献６】米国特許第６１３７９７９号明細書
【特許文献７】米国特許第６１３４４１２号明細書
【特許文献８】米国特許第５８９３０１５号明細書
【特許文献９】米国特許第４８９６１７４号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本例示的実施形態は、前述の問題などを克服する、新しい改良型のシステム、デバイス、セル、および関連方法を企図している。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
第１の態様では、例示的実施形態は、第１の進行波グリッドと、該第１の進行波グリッドの下流にある第２の進行波グリッドと、該第１の進行波グリッドと該第２の進行波グリッドとの間を延びる移行領域とを含む、進行波グリッドシステムを提供する。移行領域には、アーチ形トレースの集合体が含まれる。移行領域は、第１のグリッドから第２のグリッドへと粒子ストリームを輸送し、かつ該粒子ストリームの収束（ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｃｅ）を引き起こすように適合される。
【００１０】
他の態様では、例示的実施形態は、粒子のサンプルからサイズに応じて粒子を区別し、任意で粒子を収集する方法を提供する。該方法は、第１の進行波グリッドと第２の進行波グリッドとを含む進行波グリッドシステムを提供するステップを含む。第１および第２の進行波グリッドは、互いに対してある角度を成すように向けられている。その角度は、約１０°〜約１７０°にわたる。該方法は、様々なサイズの粒子を含んだサンプルを第１の進行波グリッド上に導入するステップを含む。該方法は、進行波グリッドシステムを操作し、それによって粒子を第１および第２の進行波グリッドに沿って輸送するステップをさらに含む。粒子は、第１および第２の進行波グリッドの角度配向に対応する方向変化を起こすと、該粒子のサイズに応じて少なくとも２つの群に分かれる。
【００１１】
さらに他の態様では、例示的実施形態は、複数の粒子のサンプルからサイズに応じて粒子を区別し、任意で粒子を収集する方法を提供する。該方法は、グリッドに印加される電圧信号の掃引周波数を選択的に調節する準備を含めて、進行波グリッドを提供するステップを含む。該方法は、また、様々なサイズの粒子を含んだサンプルを進行波グリッド上に導入するステップも含む。該方法は、第１のサイズの粒子がそれによってグリッドのある領域から別の領域へと変位する第１の掃引周波数で、グリッドを操作するステップをさらに含む。また、該方法は、第１のサイズとは異なる第２のサイズの粒子がそれによってグリッドのある領域から別の領域へと変位する、第１の掃引周波数とは異なる第２の掃引周波数で、グリッドを操作するステップを含む。
【００１２】
他の態様では、例示的実施形態は、サンプルから粒子を除去かつ分類するように適合された精製セルを提供する。該セルは、第１の進行波グリッドを含んだ濃縮チャンバと、第２の進行波グリッドを含んだ分離チャンバと、該第１の進行波グリッドと該第２の進行波グリッドとの間を延びる集束（ｆｏｃｕｓｉｎｇ）チャネルとを含む。該集束チャネルには、第３の進行波グリッドが含まれる。第２および第３の進行波グリッドは、互いに対して約１０°〜約１７０°の角度に向けられている。分離チャンバには、さらに、様々なサイズの粒子を受け取るように適合された区画の集合体が含まれる。区画の集合体は、第２の進行波グリッドをまたいで整列している。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】微粒子のストリームを濃縮して所望の位置へと誘導する進行波アレイの略図である。
【図２】中程度の質量負荷で停滞する恐れのある進行波アレイを示す図である。
【図３】ブランク領域が粒子を集束させる曲線グリッドを示す、例示的実施形態の進行波アレイの略図である。
【図４】停滞を起こしにくい進行波アレイの他の例示的実施形態の略図である。
【図５】他の例示的実施形態の進行波アレイの略図である。
【図６】例示的実施形態による、方向変化を起こしている異なったサイズの微粒子のストリームにおける曲率および結果として得られる集束の程度を示す、曲線状進行波グリッドの幅をまたぐ３つの顕微鏡写真のコレクションである。
【図７】集束された粒子ストリームの分離を示す、他の例示的実施形態の進行波アレイの略図である。
【図８】例示的実施形態による分離戦略を示す図である。
【図９】例示的実施形態による精製セルの略図である。
【図１０】例示的実施形態による他の再循環式精製セルの略図である。
【図１１】例示的実施形態による、連続分離のために変形フィールドフローフラクショネーションセルと統合された精製デバイスの略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
現在、遠心分離および限外濾過によって達成される典型的な濃縮に優る、液体サンプル中の非常に希薄な量の生物学的作用物質（または生体分子）を濃縮する有効な方法は、他に存在しない。高速（１０，０００ｒｐｍ）での遠心分離を使用して、バクテリアなどの多数の粒子をペレット化できるが、その方法は、容易に持ち運び可能ではない。例示的実施形態のデバイスは、限外濾過後に保持液を処理し、さらに１００倍以上濃縮することが可能である。加えて、精製またはバイオエンリッチメント操作に通常関係した体積を取り扱うことのできる利用可能なデバイスも、ほとんど存在しない。ラボオンチップ（ＬＯＣ：ｌａｂ−ｏｎ−ｃｈｉｐ）デバイスは、わずかな体積しか取り扱うことができない。例示的実施形態のデバイスは、そのような大きい体積を容易に取り扱うことができる。
【００１５】
より具体的には、例示的実施形態は、デバイスの動作を最適化するために、具体的には、質量輸送を最大にし、かつ密集（ｃｏｎｇｅｓｔｉｏｎ）を最小限に抑えるために使用できる、様々な独特の進行波アレイ構成を提供する。例示的実施形態は、また、液体媒質でのサンプル分離のための様々な方法も提供する。また、例示的実施形態は、濃縮、集束、および分離機能をもたらすカスケード式進行波グリッドを用いる精製セルを提供する。
【００１６】
本明細書で使用する用語「進行波グリッド」または「進行波アレイ」は、集合的に、基材、進行波を発生するために電圧波形が印加される複数の電極、ならびに電気信号（または電位）をグリッド全体に分配するための１つ以上のバス、バイアス（ｖｉａｓ）、および電気接触パッドを指す。この用語は、また、集合的に、グリッドを操作する多相電気信号を提供する１つ以上の電力源も指す。進行波グリッドは、例えば、扁平な平面形態や非平面形態など、ほとんどどの形態にもすることができる。非平面形態は、例えば、円筒の外壁に沿って延びるアーチ形領域の形態にすることができる。非平面グリッドは、チューブの内部領域内に画定される環状グリッドの形態にすることができる。進行波グリッド、それらの使用、および製造については、一般に、前述の米国特許に記載されている。
【００１７】
本明細書で述べるように、様々な例示的実施形態の進行波グリッドシステムは、１つ以上の山形グリッドを含む。本明細書で使用する用語「山形（ｃｈｅｖｒｏｎ）」は、進行波グリッドもしくはその一部分を構成する電極またはトレースのパターンを指しており、トレースのかなりの部分、通常はトレースすべてがアーチ形で、さらに同心的に配置される。通常、アーチ形トレースは、また、該トレースの集合体の動作時に、粒子の意図される流れの方向から上流に位置した１つ以上の中心点の周りに該トレースが画定されるように配置される。この構成は、流れの方向に対して、ストリームの方向を維持し、かつ流れているストリーム中の微粒子の分散を低減する働きをする。
【００１８】
本明細書に記載の進行波グリッドまたはアレイシステムの他の態様は、特定の用途では、該グリッドが互いに対してある角度を成すように向けられていることである。この配向態様は、実際、別のグリッド上の微粒子の進行方向に対する、あるグリッド上の微粒子の意図される（もしくは実際の）進行方向に関する。一般に、隣接したグリッド間またはグリッド領域間の角度は、約１０°〜約１７０°、より具体的には約４５°〜約１３５°、しばしば約９０°にすることができる。特定の用途では、例示的実施形態は、粒子流ストリームの方向変化を用いて、該粒子を区別し、分離し、かつ／または分類する。
【００１９】
進行波アレイは、図１にそれぞれ示したように、隣接した直線グリッド１０と山形グリッド５０とを含むことができる。直線グリッド１０は、微粒子を第１の縁部１２から第２の縁部１４へと横方向に輸送し、該第２の縁部１４で、山形グリッド５０が方向転換を引き起こして微粒子をサンプルウェル（ｓａｍｐｌｅ ｗｅｌｌ）７０へと移動させており、該サンプルウェル７０では、電界引出し（ｆｉｅｌｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）を使用して微粒子を収集し、それによって微粒子の濃度を増大させることができる。ストリームが山形グリッド５０上に配置されたときにグリッド１０上のストリームの方向に対して直角に移動する傾向にあるので、山形グリッド５０は、また、得られる粒子ストリームを集束させる働きもする。この実施形態の山形グリッド５０の幅は、約３ｍｍであり、サンプル濃度が４０ｍｇ／Ｌを超えるときには密集状態になりやすい。
【００２０】
図２は、直径３μｍおよび６μｍのポリスチレンビーズ（ｂｅａｄｓ）の濃縮サンプルによる停滞（ｓｔａｇｎａｔｉｏｎ）状態を示す。直線グリッド１１０と山形グリッド１５０とを含む進行波アレイ１００では、山形グリッド１５０は、比較的狭い。ビーズは、領域１１４に沿ってグリッド１１０の左縁部に集まっており、粒子の密度が高いので、山形グリッド１５０に沿ってサンプルウェル（図示せず）まで進み続けることができない。密集の理由は、図２から明らかである。直線グリッドから山形グリッドへの移行は、多車線のハイウェイがはるかに狭いレーンへと収束するのに似ている。直線グリッド１１０の幅は約５ｃｍであるので、３ｍｍへの圧縮率は１６倍を超える。山形グリッド１５０の底部から頂部への輸送（図２に示した通り）であるので、微粒子がサンプルウェルに接近するにつれて密集の可能性が増大する。密集は、多量の微粒子が、輸送電場の低下に起因して非効率的となる多層状輸送を引き起こす、停滞状態である。
【００２１】
この状況を緩和し、かつ質量流量を増大させる（より高い濃度を伴う生物医学的用途に有用である）ために、例示的実施形態は、進行波グリッドの改良型システムのいくつかの変形形態を提供する。一般に、例示的実施形態によれば、通常は直線グリッドの形態をした第１の進行波グリッドと、直線グリッドもしくは山形グリッドのいずれかの形態、または他の何らかのタイプのグリッドにすることのできる第２の進行波グリッドと、該第１のグリッドと該第２のグリッドとの間を延びる移行領域とを含む、進行波グリッドまたはアレイのシステムが提供される。前述のように、第１および第２のグリッドは、互いに対してある角度を成すように向けられている。移行領域は、微粒子をあるグリッドから別のグリッドに輸送するのを効率的に補助する働きをし、かつ好ましくはさらに該微粒子の方向変化を促進する、進行波グリッドまたはその一部分である。
【００２２】
具体的には、図３は、角度を成した境界領域２６０を有する山形グリッド２５０と連通した直線グリッド２１０を含む、例示的実施形態による進行波アレイ２００を示す。境界領域２６０の遠位端２６４は、該領域２６０の近位端２６２よりも大きな面積または幅を有する。すなわち、山形グリッド２５０上の微粒子の流れの方向に関して、境界領域２６０の幅は、流れの方向にしたがって縮小する。図３は、移行領域２６０に、収束する放射状進行波アレイを使用する様子を示す。図３のアレイの特徴は、グリッド２１０のある領域内の粒子が山形グリッド２５０の特定の領域内の粒子と重なり合うときの重複経路である。
【００２３】
図４は、角度を成した境界領域３６０を有する山形グリッド３５０と連通した直線グリッド３１０を含む、進行波アレイ３００を示す。領域３６０の遠位端３６４は、該領域３６０の近位端３６２よりも小さな面積または幅を有する。図３の構成とは対照的に、図４のアレイは、山形グリッド３５０上の微粒子の流れの方向にしたがって幅が増大する境界領域３６０を特色とする。図４のアレイでは、やはり収束する放射状進行波アレイが描かれているが、その重複経路は、最小限である。図４のアレイは、密集が最小限に抑えられ、また進行する粒子の重複経路も低減されている点で、特に有益である。
【００２４】
図５は、複数のアーチ形電極４０５を用いる第１のグリッド４１０と、山形グリッドまたは直線グリッドの形態にすることのできる第２のグリッド４５０とを含む、他の進行波アレイ４００を示す。例示的実施形態のこの変形形態では、第１のグリッド４１０は、事実上それ自体が移行領域である。図５は、収束する単一の放射状進行波アレイについての他の戦略を示す。このアレイは、より高速の濃縮のための比較的短い進行距離を特色とする。
【００２５】
図３〜５では、影付きの面積は、前述の移行領域を示しており、サンプルウェル入口から出てくる拡張した山形グリッド領域の形態にすることができる。３つの構成は、すべて、サンプルウェルへと多くのレーンを開いている。山形グリッド領域を拡張すると、より大きなアプローチ角度スパンにわたる、より緩やかな粒子ストリームの収束が可能になる。
【００２６】
例示的実施形態は、また、粒子分離のための戦略も提供する。ほとんどの微粒子は、ｐＨに応じて、クーロン力をもたらす固有の電荷を有するが、また、不均一な場では分極することもある。誘起双極子モーメント（Ｃｌａｕｓｉｕｓ−Ｍｏｓｓｏｔｔｉ）は：
【数１】
であり、式中、ａは粒子の半径、εparticleは粒子の誘電率、εfluidは流体の誘電率である。低周波数では、εは実数である。双極子力は、次式によって与えられる：
【数２】
【００２７】
バチルスチューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）胞子およびサイズ範囲２００ｎｍ〜１０μｍのポリスチレンビーズに対する実験で、動電輸送が、電気浸透流（ＥＯＦ：ｅｌｅｃｔｒｏ−ｏｓｍｏｔｉｃ ｆｌｏｗ）、電気泳動、および誘電泳動効果のバランスであることが示される。
【００２８】
一態様では、例示的実施形態は、進行波掃引周波数を変化させることによって粒子を分離する。進行波の特徴的な輸送は、閾値掃引周波数未満では同期的であり、該周波数を上回ると非同期モードになる。相違は、一部の粒子はそれによって追従可能で、一部の粒子は追従不可能な、抵抗力に対するクーロン力と誘電泳動力とのバランスである。この特性は、特に、より大きく、より双極性の粒子の場合に、流体環境について保持される。１μｍ、３μｍ、および６μｍポリスチレンビーズのサンプル混合物によって、３Ｈｚでは該サイズ範囲内のすべてのビーズが輸送されることが実証される。４Ｈｚでは、いくらか大きい方のビーズがトレースに捕獲されて停滞する。それは、該ビーズの変位が進行波アレイのピッチよりも短いので、該ビーズがトレース間を前後に移動する状況で該ビーズが捕獲されるからである。６Ｈｚでは、すべてのビーズが捕獲される。この周波数感度は分離方法で利用することができる。戦略は、動きやすい粒子から順に混合物から選択的に移動させるために、周波数を下方にスキャンすることである。
【００２９】
他の態様では、例示的実施形態は、コーナー部の周りで粒子ストリームを屈曲または転回させることによって粒子を分離する。具体的には、この分離方式は、場もまた方向変化を反映するように、進行波グリッドが移行するコーナー部の周りで粒子ストリームを移動させるものである。この戦略は、様々なサイズの粒子がサンプルウェルへと集まるときに、該粒子がその相対的なサイズに応じて異なる転回半径をもつように思われるという観察結果を動機とする。図６は、山形グリッド領域の幅をまたぐ３つの顕微鏡写真Ａ、Ｂ、およびＣを示す。結果は、１μｍ、３μｍ、および６μｍポリスチレンビーズのサンプル混合物に関するものである。６μｍビーズは、顕微鏡写真Ｃから明らかなように、コーナー部の周りをより密に転回する。より小さい１μｍおよび３μｍビーズは、顕微鏡写真ＡおよびＢに示されるように、より広く転回する。それは、誘電泳動力が体積（ｒ3）とともに変化するので、より大きいビーズは、転回場の直接的な影響を受け、より速く転回可能であるからである。
【００３０】
図７を参照すると、この現象をさらに調査かつ実施するために、例示的実施形態による進行波グリッド５００が使用された。アレイ５００は、山形グリッド５５０と直線グリッド５１０とを含む。単なる近似ではあるが、例示的実施形態の分離戦略を使用した分離能力を試験する一方法は、アレイ５００を逆に操作することである。１、３、および６μｍ粒子の濃縮混合物１００μＬの体積を、山形グリッド５５０の第１の端部５５４のところでサンプルウェルに導入し、進行波グリッド５１０および５５０を逆に操作して、サンプルを主要直線グリッド５１０へと外に移動させる。具体的には、微粒子は、山形グリッドの第１の端部５５４から第２の端部５５２へと輸送され、次いで、直線グリッド５１０の第１の端部もしくは領域５１２またはその付近から、該直線グリッド５１０の第２の端部もしくは領域５１４へと輸送される。より大きい６μｍ粒子の経路は、矢印５３０によって示される。より小さい３μｍ粒子の経路は、矢印５４０によって示される。方向変化する粒子は、一般に、より長い距離に沿って同じ方向変化を起こす粒子よりもサイズが大きい。山形グリッド５５０の比較的狭いチャネル内の粒子混合物は、放射状進行波アレイ、すなわち山形グリッド５５０によって、輸送かつ集束され、線形進行波アレイ、すなわち粒子を上方に移動させる直線グリッド５１０によって、分離キャビティに注入される。３μｍサイズのビーズなど、比較的小さいビーズまたは粒子は、より速く移動して一番に到着する。より大きい６μｍのビーズまたは粒子は、より遅く移動し、Ｄで示されるようなコーナー部周りの掃引の際に、より短い距離で方向変化に反応することができる。
【００３１】
図８は、１、３、および６μｍビーズが幅１ｃｍの帯状域にわたって分布した、この試行の結果を示す。具体的には、６μｍ粒子の経路は、矢印５３０によって示される。３μｍ粒子の経路は、矢印５４０によって示される。１μｍ粒子の経路は、矢印５４５によって示される。６μｍ粒子および３μｍ粒子の両方の経路が、コーナー部Ｄの周りで、０．５ｃｍスパン内で９０°の方向変化を起こしたことに注目することが重要である。この結果は、山形が集束ではなく分散的になる傾向にあるような方向を向いていることを見事に考慮している。直線チャンバ内の低いサンプル密度は、また、サンプル分離を視覚化するのに顕微鏡使用を必要とする。
【００３２】
例示的実施形態は、また、精製セルも提供する。前述の進行波グリッドのレイアウトとサンプル分離戦略との組み合わせをデバイスの濃縮および集束アスペクトとともに組み込んで、図９に示した精製セル６００を提供することができる。精製セル６００には、濃縮チャンバ６１０と、集束チャネル６５０と、分離チャンバ６７０および６８０とが含まれる。分離チャンバの最上部６８０を、横列に並んだ区画６８２、６８４、６８６、６８８、および６９０に分割して、左から右へと進むにつれて増大する範囲の粒子サイズを収集することができる。例えば、比較的大きいサイズの粒子は、矢印６７２によって示されたストリームを構成し、その後区画６９０内に収集される。中間サイズの粒子は、矢印６７４によって示されたストリームを構成し、その後区画６８８内に収集される。ストリーム６７６内の比較的小さいサイズの粒子は、区画６８６内に収集される。より微小なサイズの粒子のストリームは、区画６８２および６８４の一方または両方に収集することができる。分離チャンバ内の進行波アレイは、様々なサイズ範囲内の微粒子を最上部の指定された収集区画へと集束させるために、連続的な山形レイアウトにすることができる。集束部分６５０は、分離性能の改善をもたらすことになる狭いストリームを形成する。セル６００の各部分またはコンポーネントについての代表的な寸法は、図９に示されている。
【００３３】
図１０は、セル上のループを閉じるために連結ブリッジが使用され、かつ最上部の中間に配置された、他の例示的実施形態の進行波アレイ７００を示す。この戦略は、収集された区画のうちの１つの内容物を再循環させて、さらなる精製をもたらす。精製セル７００には、濃縮チャンバ７１０と、集束チャネル７５０と、分離チャンバ７７０および７８０と、連結ブリッジ７４０とが含まれる。分離チャンバの最上部を、区画７８２、７８４、７８６、７８８、および７９０の集合体に分割して、左から右へと進むにつれて増大する範囲の粒子サイズを収集することができる。例えば、比較的大きいサイズの粒子は、矢印７７２によって示されたストリームを構成し、その後区画７９０内に収集される。中間サイズの粒子は、矢印７７４によって示されたストリームを構成し、その後区画７８８内に収集される。ストリーム７７６内の比較的小さいサイズの粒子は、区画７８６内に収集される。より微小なサイズの粒子のストリームは、区画７８４および７８２の一方または両方に収集することができる。さらなるプロセス処理が望まれる場合、連結ブリッジ７４０を使用して、特定のサイズまたはサイズ範囲の粒子を選択的に濃縮チャンバ７１０に戻すことができる。
【００３４】
大量のサンプルの場合、例示的実施形態の精製セルを、図１１に示したｍＦＦＦセルジオメトリに組み込むことができる。具体的には、セル８００は、濃縮チャンバ８１０と、分離チャンバの上部領域８８０および下部領域８７０と、該濃縮チャンバ８１０と該分離チャンバの下部領域８７０との間を延びる集束チャネル８５０とを含む。チャンバの上部領域８８０には、図９および図１０に関して記載したように、様々なサイズの粒子を保持する複数の区画の集合体が含まれる。具体的には、セル８００には、離隔された２つの基材もしくはプレート８２０および８３０が含まれており、そのうちの１つが、流入ストリームＥのための入口８２２と、流出ストリームＦのための出口８２４とを画定する。図９および図１０の構成で前述したように、分離チャンバの上部領域８８０には、様々なサイズまたはサイズ範囲の粒子を収集する複数の区画８８２、８８４、８８６、８８８、および８９０が含まれる。精製セルの操作は、以下の通りである。サンプルストリームＥが、入口８２２を通ってセル８００に進入する。進入するサンプルは、濃縮チャンバ８１０に流れ込む。圧縮場が、微粒子を下側表面の近傍へと下方に移動させ、該下側表面で、そこに配置された進行波グリッドがストリームおよびストリーム中の構成成分を集束チャネル８５０に向かって輸送する。サンプルがチャネル８５０内に入ると、その中を延びる山形進行波グリッドがサンプルを輸送して前述の分離チャンバへと誘導する。分離チャンバの向きは、概ね集束チャネル８５０内のサンプルの流れの方向に直交する。ストリームが分離チャンバの下部領域８７０に進入すると、前述のように、微粒子は、別個のストリーム８７２、８７４、および８７６に分かれる。最も大きい粒子は、区画８９０に集まる。より小さいサイズの粒子は、他の区画に集まる。ストリームの残りの部分は、出口８２４でストリームＦとしてセル８００から出ていく。
【００３５】
例示的実施形態の様々な精製セルは、濃縮、集束、および分離のカスケード型機能を使用することができる。該セルは、定体積設計、体積増加を伴うフロースルー構成を特色とすることができ、または、再循環式輸送とともに定体積を用いて、より高純度の濃縮を達成することができる。
【００３６】
例示的実施形態の利点には、質量流量を増大させ、かつ密集および停滞を最小限に抑えるための新しい進行波グリッド構成、新しい分離戦略の提供、ならびに、最大数百マイクロリットルまでしか取り扱えない複雑な既存の方法に比べて、数十ミリリットルを取り扱うことのできる精製セルの提供が含まれるが、これに限るものではない。
【００３７】
例示的実施形態の潜在用途には、生物兵器防衛（ｂｉｏ−ｄｅｆｅｎｓｅ）用途でのフロントエンド検出のための予備濃縮、公共設備の給水モニタリング、食品の毒物検査、血漿分離、細胞エンリッチメント（ｃｅｌｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）、およびタンパク質精製が含まれるが、これに限るものではない。
【００３８】
その他の実施形態として、次のものを挙げることができる。
【００３９】
前記進行波グリッドシステムであって、前記第１の進行波グリッドおよび前記第２の進行波グリッドが互いに対して約１０°〜約１７０°の角度に向けられていることを特徴とする進行波グリッドシステム。
【００４０】
前記進行波グリッドシステムであって、前記第１および第２のグリッドが互いに対して約４５°〜約１３５°の角度に向けられていることを特徴とする進行波グリッドシステム。
【００４１】
前記進行波グリッドシステムであって、前記第１および第２のグリッドが互いに対して約９０°の角度に向けられていることを特徴とする進行波グリッドシステム。
【００４２】
前記進行波グリッドシステムであって、前記第２の進行波グリッドが山形グリッドであることを特徴とする進行波グリッドシステム。
【００４３】
前記進行波グリッドシステムであって、前記移行領域が前記第２の進行波グリッドへと延びるにつれて前記移行領域の幅が縮小することを特徴とする進行波グリッドシステム。
【００４４】
前記進行波グリッドシステムであって、前記移行領域が前記第２の進行波グリッドへと延びるにつれて前記移行領域の幅が増大することを特徴とする進行波グリッドシステム。
【００４５】
前記進行波グリッドシステムであって、前記移行領域に山形進行波グリッドが含まれることを特徴とする進行波グリッドシステム。
【００４６】
前記方法であって、他の粒子よりも長い距離に沿って方向変化を起こす粒子が、前記他の粒子よりもサイズが小さいことを特徴とする方法。
【００４７】
前記方法であって、より大きい粒子が、より小さい粒子よりも短い転回半径をもつことを特徴とする方法。
【００４８】
前記方法であって、前記第１の掃引周波数が前記第２の掃引周波数よりも高いことを特徴とする方法。
【００４９】
前記方法であって、前記第１の掃引周波数を用いて変位した粒子が、前記第２の掃引周波数を用いて変位した粒子よりも小さいことを特徴とする方法。
【００５０】
前記精製セルであって、前記第３の進行波グリッドが山形進行波グリッドであることを特徴とする精製セル。
【００５１】
前記精製セルであって、前記分離チャンバに１つ以上の山形進行波グリッドが含まれることを特徴とする精製セル。
【００５２】
前記精製セルであって、山形進行波グリッドの数が区画の数に対応することを特徴とする精製セル。
【００５３】
前記精製セルであって、前記集束チャネルに最も近い区画が、前記セルが操作されたときに前記サンプル内の最も大きいサイズの粒子を受け取ることを特徴とする精製セル。
【００５４】
前記精製セルであって、前記濃縮チャンバと前記分離チャンバとの間を延びる再循環ループをさらに含んでおり、前記再循環ループに第４の進行波グリッドが含まれることを特徴とする精製セル。
【符号の説明】
【００５５】
１０ 直線グリッド、１２ 第１の縁部、１４ 第２の縁部、５０ 山形グリッド、７０ サンプルウェル、１００ 進行波アレイ、１１０ 直線グリッド、１５０ 山形グリッド、２００ 進行波アレイ、２１０ 直線グリッド、２５０ 山形グリッド、２６０ 境界領域、２６２ 近位端、２６４ 遠位端、３００ 進行波アレイ、３１０ 直線グリッド、３５０ 山形グリッド、３６０ 境界領域、３６２ 近位端、３６４ 遠位端、４００ 進行波アレイ、４０５ アーチ形電極、４１０ 第１のグリッド、４５０ 第２のグリッド、５００ 進行波アレイ、５１０ 直線グリッド、５１２ 第１の領域、５１４ 第２の領域、５３０ ６μｍ粒子の経路、５４０ ３μｍ粒子の経路、５４５ １μｍ粒子の経路、５５０ 山形グリッド、５５２ 第２の端部、５５４ 第１の端部、６００ 精製セル、６１０ 濃縮チャンバ、６５０ 集束チャネル、６７０ 分離チャンバ、６８０ 分離チャンバの最上部、６８２ 区画、６８４ 区画、６８６ 区画、６８８ 区画、６９０ 区画、７００ 進行波アレイ／精製セル、７１０ 濃縮チャンバ、７４０ 連結ブリッジ、７５０ 集束チャネル、７７０ 分離チャンバ、７８０ 分離チャンバ、７８２ 区画、７８４ 区画、７８６ 区画、７８８ 区画、７９０ 区画、８００ セル、８１０ 濃縮チャンバ、８２０ 基材またはプレート、８２２ 入口、８２４ 出口、８３０ 基材またはプレート、８５０ 集束チャネル、８７０ 分離チャンバの下部領域、８８０ 分離チャンバの上部領域、８８２ 区画、８８４ 区画、８８６ 区画、８８８ 区画、８９０ 区画。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の粒子のサンプルからサイズに応じて粒子を区別する方法であって、
進行波グリッドに印加される電圧信号の掃引周波数を選択的に調節する準備を含めて、前記進行波グリッドを提供するステップと、
様々なサイズの粒子を含んだサンプルを前記進行波グリッド上に導入するステップと、
第１のサイズの粒子がそれによって前記グリッドのある領域から別の領域へと変位する第１の掃引周波数で、前記グリッドを操作するステップと、
前記第１のサイズとは異なる第２のサイズの粒子がそれによって前記グリッドのある領域から別の領域へと変位する、前記第１の掃引周波数とは異なる第２の掃引周波数で、前記グリッドを操作するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１】
複数の粒子のサンプルからサイズに応じて粒子を区別する方法であって、
進行波グリッドに印加される電圧信号の掃引周波数を選択的に調節する準備を含めて、前記進行波グリッドを提供するステップと、
様々なサイズの粒子を含んだサンプルを前記進行波グリッド上に導入するステップと、
第１のサイズの粒子がそれによって前記グリッドのある領域から別の領域へと変位する第１の掃引周波数で、前記グリッドを操作するステップと、
前記第１のサイズとは異なる第２のサイズの粒子がそれによって前記グリッドのある領域から別の領域へと変位する、前記第１の掃引周波数とは異なる第２の掃引周波数で、前記グリッドを操作するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図７】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図６】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図７】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図６】
【図８】
【公開番号】特開２０１２−９８２９７（Ｐ２０１２−９８２９７Ａ）
【公開日】平成２４年５月２４日（２０１２．５．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２８０１７１（Ｐ２０１１−２８０１７１）
【出願日】平成２３年１２月２１日（２０１１．１２．２１）
【分割の表示】特願２００６−２４５３７４（Ｐ２００６−２４５３７４）の分割
【原出願日】平成１８年９月１１日（２００６．９．１１）
【出願人】（５０２０９６５４３）パロ・アルト・リサーチ・センター・インコーポレーテッド (393)
【氏名又は名称原語表記】Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年５月２４日（２０１２．５．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１２月２１日（２０１１．１２．２１）
【分割の表示】特願２００６−２４５３７４（Ｐ２００６−２４５３７４）の分割
【原出願日】平成１８年９月１１日（２００６．９．１１）
【出願人】（５０２０９６５４３）パロ・アルト・リサーチ・センター・インコーポレーテッド (393)
【氏名又は名称原語表記】Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ
【Ｆターム（参考）】
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