過剰ブレブ形成Ｓｈｉｇｅｌｌａ株
過剰ブレブ形成Ｓｈｉｇｅｌｌａ株を、Ｔｏｌ−Ｐａｌシステムの１つまたはそれ以上の成分を破壊することによって産生する。これらの株由来のブレブは、ワクチン接種のための有用な免疫原である。これらのブレブ中で見出される個々のタンパク質も、免疫原として使用し得る。本発明は、ＴｏｌＡ、ＴｏｌＢ、ＴｏｌＱ、ＴｏｌＲ、およびＰａｌタンパク質のうちの４つ以下を発現する、Ｓｈｉｇｅｌｌａ細菌を提供する。従って、天然の５つのタンパク質のＴｏｌ−Ｐａｌシステムから、少なくとも１つのタンパク質が欠けており、これにより、培地中での増殖の間に、５つのＴｏｌ−Ｐａｌタンパク質を全て発現する同じ細菌より、より多くの量の外膜ブレブを培地に放出する細菌を生じる。ＴｏｌＲは発現されないが、他の４つのタンパク質は発現され得ることが好ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、Ｓｈｉｇｅｌｌａ種に対する免疫の分野内にある。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
Ｓｈｉｇｅｌｌａは、グラム陰性非運動性通性嫌気性バチルスであり、４つの血清群：Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓ．ｂｏｙｄｉｉ、およびＳ．ｓｏｎｎｅｉに分類される。それらは細菌性赤痢（ｓｈｉｇｅｌｌｏｓｉｓ）（細菌性赤痢（ｂａｃｉｌｌａｒｙ ｄｙｓｅｎｔｅｒｙ））を引き起こす。
【０００３】
臨床的細菌性赤痢の特徴は、発熱、吐き気、食欲不振、脱水症、粘液膿性および出血性下痢、ならびにテネスムスを伴う急性直腸結腸炎である。Ｓｈｉｇｅｌｌａによる赤痢は、風土性であり、そして発展途上国において数百万の病気エピソードを引き起こす。例えば、１年あたり１億６５００万例のＳｈｉｇｅｌｌａ下痢が存在すると推定され、そのうちの９９％は発展途上国で起こり、そして６９％は５歳未満の小児で起こる。細菌性赤痢の罹患率および死亡率は、発展途上国の小児において特に高い。
【０００４】
Ｓｈｉｇｅｌｌａワクチンに対する既存のアプローチは、非特許文献１（参考文献１）において概説され、これは経口免疫化のための生の弱毒化株、注射のための結合型Ｏ糖、鼻腔内使用のためのプロテオソーム（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ＬＰＳが結合した髄膜炎菌外膜小胞）、鼻腔内使用のためのｉｎｖａｐｌｅｘ（ＩｐａＢ、ＩｐａＣおよびＬＰＳを含む、Ｓｈｉｇｅｌｌａの細胞内抽出物）、および無毒化ＬＰＳを含むｍｓｂＢ−ｖｅから調製した核タンパク質−リボソーム複合体に基づく。これらのワクチンのうちのいくつかは実地試験において有効であったが、複数のＳｈｉｇｅｌｌａ血清型に対して保護するものはなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｋｗｅｏｎ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．（２００８）２１（３）：３１３−８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
Ｓｈｉｇｅｌｌａワクチンの調製において、特に複数の血清型に対して保護し得るワクチンの調製において有用な、さらなる改善された成分を提供することが、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の開示
Ｓｈｉｇｅｌｌａは、細胞エンベロープの膨圧（ｔｕｒｇｏｕｒ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）のために、増殖の間、外膜ブレブを自然に放出する。参考文献２において開示されるように、ブレブの放出は、細菌のエンベロープ構造に高度に依存する。本発明者らは、エンベロープ構造を乱すために、Ｔｏｌ−Ｐａｌシステムが破壊されたＳｈｉｇｅｌｌａの変異株を用いた。正常な増殖の間に、これらの変異株は、大量のブレブ（これは、免疫原性の外膜タンパク質が豊富である）をその培地に放出する。従ってこれらのブレブを免疫原として使用し得る。
【０００８】
従って、本発明は、ＴｏｌＡ、ＴｏｌＢ、ＴｏｌＱ、ＴｏｌＲ、およびＰａｌタンパク質のうちの４つ以下を発現する、Ｓｈｉｇｅｌｌａ細菌を提供する。従って、天然の５つのタンパク質のＴｏｌ−Ｐａｌシステムから、少なくとも１つのタンパク質が欠けており、これにより、培地中での増殖の間に、５つのＴｏｌ−Ｐａｌタンパク質を全て発現する同じ細菌より、より多くの量の外膜ブレブを培地に放出する細菌を生じる。ＴｏｌＲは発現されないが、他の４つのタンパク質は発現され得ることが好ましい。
【０００９】
本発明はまた、ＴｏｌＲタンパク質を発現しないＳｈｉｇｅｌｌａ細菌を提供する。本発明はまた、ΔｔｏｌＲΔｇａｌＵ株のような、ＳｈｉｇｅｌｌａのΔｔｏｌＲ株を提供する。
【００１０】
本発明はまた、ＴｏｌＡ、ＴｏｌＢ、ＴｏｌＱ、ＴｏｌＲ、およびＰａｌタンパク質を発現するＳｈｉｇｅｌｌａ細菌を提供し、ここでそのＴｏｌＡ、ＴｏｌＱ、ＴｏｌＲ、および／またはＰａｌタンパク質は、（ａ）細菌の内膜または外膜に位置し、ならびに（ｂ）１つまたはそれ以上のアミノ酸配列変異を含み、そのため、培地中で増殖する場合に、当該変異を含まない同じ細菌と比較して、その細菌はより多い量の外膜ブレブを放出する。
【００１１】
本発明はまた、そのＴｏｌ−Ｐａｌシステムの１つまたはそれ以上の成分が修飾を有するＳｈｉｇｅｌｌａ細菌であって、修飾のため、培地中での増殖の間、その修飾を欠いている同じ細菌よりも、培地中により多くの量の外膜ブレブを放出し、ならびに（ｉ）天然のＳｈｉｇｅｌｌａリポ多糖および／または（ｉｉ）Ｓｈｉｇｅｌｌａ腸毒素を発現しない、Ｓｈｉｇｅｌｌａ細菌を提供する。
【００１２】
本発明はまた、培地中で増殖した場合に、細菌が開始細菌より多くの量の外膜ブレブを培地中へ放出するように、開始細菌Ｔｏｌ−Ｐａｌシステムの１つまたはそれ以上の成分をコードする遺伝子を修飾する工程を含む、過剰ブレブ形成（ｈｙｐｅｒｂｌｅｂｂｉｎｇ）Ｓｈｉｇｅｌｌａ細菌を調製する方法を提供し、そしてここでその修飾は、開始細菌のｔｏｌＡ、ｔｏｌＢ、ｔｏｌＱ、ｔｏｌＲ、および／またはｐａｌ遺伝子の１つまたはそれ以上を変異させることを含む。その変異工程は、遺伝子を欠失させ得る。その方法はまた、細菌のリポ多糖または腸毒素の合成に必要なタンパク質をコードする遺伝子の修飾を含み得る。
【００１３】
本発明はまた、本発明の細菌から単離されたか、またはそれから得ることができるブレブを提供する。これらのブレブは、Ｓｈｉｇｅｌｌａワクチンの成分として有用である。
【００１４】
本発明はまた、細菌によるブレブの培地への放出を可能にする条件下で増殖させた、本発明の細菌を含む培地からブレブを分離する工程を含む、Ｓｈｉｇｅｌｌａブレブを調製するためのプロセスを提供する。このプロセスによって調製されたブレブを、Ｓｈｉｇｅｌｌａワクチンの成分として使用し得る。
【００１５】
本発明はまた、細菌によるブレブの培地への放出を可能にする条件下で増殖させた、本発明の細菌を含む培地を提供する。ブレブを、この培地から精製し得る。
【００１６】
本発明はまた、本発明の細菌の培養の間に、培地へ放出されるブレブを含む組成物を提供する。この組成物は、任意の生の細菌および／または細菌全体も含まない。この組成物および／またはその成分を、Ｓｈｉｇｅｌｌａワクチン調製のために使用し得る。
【００１７】
本発明はまた、ブレブを含む組成物を提供し、ここでそのブレブは、本発明の細菌を増殖させた培地の、０．２２μｍのフィルターを通したろ過後に得ることができるろ液に存在する。この組成物および／またはその成分を、Ｓｈｉｇｅｌｌａワクチン調製のために使用し得る。
【００１８】
本発明はまた、１つまたはそれ以上（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０）の、（ａ）配列番号８から６７から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質；（ｂ）配列番号８から６７の１つと少なくともｊ％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ／または配列番号８から６７のいずれか１つの少なくともｎ個の連続的なアミノ酸の断片を含むタンパク質、を含む、Ｓｈｉｇｅｌｌａブレブを提供し、ここでｊは５０またはそれ以上（例えば６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９）、ｎは７またはそれ以上（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である。好ましい断片は、配列番号８から６７の１つ由来のエピトープを含む。他の好ましい断片は、配列番号の少なくとも１つのエピトープを保持しながら、配列番号のＣ末端から１つまたはそれ以上（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、またはそれ以上）のアミノ酸、および／またはＮ末端から１つまたはそれ以上（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、またはそれ以上）のアミノ酸を欠く。他の断片は、１つまたはそれ以上のタンパク質ドメインを省略し、例えばシグナルペプチド等を欠く。
【００１９】
６０個のタンパク質が、本発明のブレブ内に存在すること、ならびにブレブに対して調製した血清と免疫反応性であることが確認された。従って個々のタンパク質を、ブレブと分離した、精製形態で免疫原性の成分として使用し得る。従って、本発明はまた、（ａ）１つまたはそれ以上（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０）のアミノ酸配列配列番号８から６７を含むブレブタンパク質；（ｂ）配列番号８から６７の１つと少なくともｊ％の同一性を有し、かつ／または配列番号８から６７のいずれか１つの少なくともｎ個の連続的なアミノ酸の断片を含むアミノ酸配列を含むブレブタンパク質、を含む、ブレブを含まない免疫原性組成物を提供し、ここでｊは５０またはそれ以上（例えば６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９）、ｎは７またはそれ以上（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である。好ましい断片は、配列番号８から６７の１つ由来のエピトープを含み、そしてより好ましい断片は、免疫原性の断片である。他の好ましい断片は、配列番号の少なくとも１つのエピトープを保持しながら、配列番号のＣ末端から１つまたはそれ以上のアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、またはそれ以上）、および／またはＮ末端から１つまたはそれ以上のアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、またはそれ以上）を欠く。他の断片は、１つまたはそれ以上のタンパク質ドメインを省略し、例えば膜貫通ドメイン、シグナルペプチド等を欠く。
【００２０】
本発明はまた、１つまたはそれ以上（すなわち１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、または１２９）の、（ａ）配列番号８から１３６から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質；（ｂ）配列番号８から１３６の１つと少なくともｊ％の同一性を有し、かつ／または配列番号８から１３６のいずれか１つの少なくともｎ個の連続的なアミノ酸の断片を含むアミノ酸配列を含むタンパク質、を含む、Ｓｈｉｇｅｌｌａブレブを提供し、ここでｊは５０またはそれ以上（例えば６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９）、ｎは７またはそれ以上（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である。好ましい断片は、配列番号８から１３６の１つ由来のエピトープを含む。他の好ましい断片は、配列番号の少なくとも１つのエピトープを保持しながら、配列番号のＣ末端から１つまたはそれ以上のアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、またはそれ以上）、および／またはＮ末端から１つまたはそれ以上のアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、またはそれ以上）を欠く。他の断片は、１つまたはそれ以上のタンパク質ドメインを省略し、例えばシグナルペプチド等を欠く。
【００２１】
１２９個のタンパク質が、本発明のブレブ内に存在すること、ならびにブレブに対して調製した血清と免疫反応性であることが確認された。従って個々のタンパク質を、ブレブと分離した、精製形態で免疫原性の成分として使用し得る。従って、本発明はまた、（ａ）１つまたはそれ以上（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、または１２９）のアミノ酸配列配列番号８から１３６を含むブレブタンパク質；（ｂ）配列番号８から１３６の１つと少なくともｊ％の同一性を有し、かつ／または配列番号８から１３６のいずれか１つの少なくともｎ個の連続的なアミノ酸の断片を含むアミノ酸配列を含むブレブタンパク質、を含む、ブレブを含まない免疫原性組成物を提供し、ここでｊは５０またはそれ以上（例えば６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９）、ｎは７またはそれ以上（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である。好ましい断片は、配列番号８から１３６の１つ由来のエピトープを含み、そしてより好ましい断片は、免疫原性の断片である。他の好ましい断片は、配列番号の少なくとも１つのエピトープを保持しながら、配列番号のＣ末端から１つまたはそれ以上のアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、またはそれ以上）、および／またはＮ末端から１つまたはそれ以上のアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、またはそれ以上）を欠く。他の断片は、１つまたはそれ以上のタンパク質ドメインを省略し、例えば膜貫通ドメイン、シグナルペプチド等を欠く。
【００２２】
配列番号８から１３６のうちの、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉに関して好ましいサブセットは、表１の下の「サブセット１」に列挙される配列番号である。配列番号８から１３６のうちの、Ｓ．ｓｏｎｎｅｉに関して好ましいサブセットは、表１の下の「サブセット２」に列挙される配列番号である。
【００２３】
Ｔｏｌ−Ｐａｌシステム
多くのグラム陰性細菌と同様、Ｓｈｉｇｅｌｌａは、天然でＴｏｌ−Ｐａｌシステムを有し、それはＴｏｌＡ、ＴｏｌＢ、ＴｏｌＱ、ＴｏｌＲ、およびＰａｌタンパク質からなる。本発明によって、天然のＴｏｌ−Ｐａｌシステムを破壊し、それによって細菌の複製の間に、細菌がより多量の外膜ブレブを培地へ放出することを引き起こす。様々な破壊を行い得る。
【００２４】
いくつかの実施態様において、５つのＴｏｌ−Ｐａｌタンパク質のうちの少なくとも１つを、例えばそのタンパク質をコードする遺伝子の欠失または不活性化によって除去する。従って、その細菌はＴｏｌＡ、ＴｏｌＢ、ＴｏｌＱ、ＴｏｌＲ、およびＰａｌタンパク質の０、１、２、３、または４個を発現し得る。５つのタンパク質のうちの１つの除去で十分であり得、その場合その細菌はこれらのタンパク質の４個のみを発現する。好ましくは、ＴｏｌＲタンパク質を、例えば開始株のｔｏｌＲ遺伝子を不活性化することによって除去する。従って、その細菌はｔｏｌＡ＋ｔｏｌＢ＋ｔｏｌＱ＋ｔｏｌＲ−Ｐａｌ＋であり得る。
【００２５】
いくつかの実施態様において、その細菌は、５個のＴｏｌ−Ｐａｌタンパク質を全て発現するが、少なくとも１つが、過剰ブレブ形成を引き起こすように変異している。例えば、ＴｏｌＡ、ＴｏｌＱ、ＴｏｌＲ、および／またはＰａｌタンパク質を、そのタンパク質のその膜局在を保持しながら、Ｔｏｌ−Ｐａｌシステムの他のメンバーとの相互作用が破壊されるように変異させ得る。従ってその細菌は、ＴｏｌＡ、ＴｏｌＱ、およびＴｏｌＲを内膜の膜貫通タンパク質として、およびＰａｌタンパク質を外膜のペリプラズムに面するリポタンパク質として保持するが、ＴｏｌＡ、ＴｏｌＱ、ＴｏｌＲ、および／またはＰａｌタンパク質の少なくとも１つが変異している。
【００２６】
ＴｏｌＡ、ＴｏｌＢ、ＴｏｌＱ、ＴｏｌＲ、およびＰａｌタンパク質の野生型Ｓｈｉｇｅｌｌａアミノ酸配列の例を、配列番号１から５として配列表において提供する。
【００２７】
Ｓｈｉｇｅｌｌａ細菌
本発明を、血清群Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓ．ｂｏｙｄｉｉおよびＳ．ｓｏｎｎｅｉのいずれかと使用し得る。
【００２８】
破壊されたＴｏｌ−Ｐａｌシステムを有する（このことは、細菌が、細菌複製の間により多量の外膜ブレブをその培地に放出することを引き起こす）ことに加えて、本発明のＳｈｉｇｅｌｌａは、野生型株と比較して、１つまたはそれ以上のさらなる変化を有利に含み得る。これらの変化を、特にヒトワクチンにおいて毒性または望ましくない成分を細菌から除去するために使用し得る。
【００２９】
例えば、細菌は天然のＳｈｉｇｅｌｌａリポ多糖（ＬＰＳ）を発現せず、これにより、内毒素の活性が低減し得る。天然のＬＰＳの合成を妨げるために様々な修飾を行うことができ、そしてこれらは天然のリピドＡ構造、オリゴ糖コア、または外側Ｏ抗原を破壊し得る。例えば、参考文献３は、ｒｆｅおよびｇａｌＵ遺伝子の不活性化によって引き起こされるＬＰＳ変異体を報告し、そして参考文献４は、ｙｉｈＥ、ｇａｌＥ、ｇａｌＫ、ｇａｌＭ、およびｇａｌＴの不活性化によって引き起こされるＬＰＳ変異体を報告する。同様に、参考文献５は、ｒｆｃ、ｒｆａＬ、またはｇａｌＵの変異による欠損ＬＰＳを報告する。参考文献６は、リピドＡのアシル化を低減する、ｍｓｂＢ１およびｍｓｂＢ２の不活性化によって引き起こされるＬＰＳ変異体を報告する。本明細書中で示されるように、リピドＡのアシル化が低減した別のＬＰＳ変異体を、ｈｔｒＢの不活性化によって産生し得る［７、８］。
【００３０】
ＬＰＳにおけるＯ抗原の欠如が好ましく、それによって血清型特異的反応を回避する。Ｓ．ｓｏｎｎｅｉにおいて、有毒性プラスミドが除去される場合にＯ抗原が欠如する（下記を参照のこと）。ｇａｌＵ遺伝子はウリジンジホスホグルコース（ＵＤＰ−グルコース）ピロホスホリラーゼをコードし、そしてその不活性化は、Ｏ抗原が結合していないＬＰＳの合成を引き起こす。ｇａｌＵの不活性化は、ウリジンジホスホグルコースピロホスホリラーゼ活性を有さないＳｈｉｇｅｌｌａを提供するために有用である。ｒｆｂＦおよび／またはｒｆｂＧ遺伝子の不活性化を、ラムノシルトランスフェラーゼ活性を有さないＳｈｉｇｅｌｌａを提供するために使用し得る。ｒｆｃの不活性化を、Ｏ抗原ポリメラーゼ活性を有さないＳｈｉｇｅｌｌａを提供するために使用し得る。ｒｆｂＦ、ｒｆｂＧおよびｒｆｃの３つ全ての不活性化は、有用な株を提供し得る。
【００３１】
ＬＰＳにおけるヘキサアシル化リピドＡの欠如が好ましい。有毒性プラスミドの喪失（下記を参照のこと）は、自動的にｍｓｂＢ２遺伝子の喪失を引き起こし、そして染色体ｍｓｂＢ１遺伝子を不活性化し得、それによってミリストイルトランスフェラーゼ活性を除去し、そしてＬＰＳにおけるペンタアシル化リピドＡを提供する。ＨｔｒＢラウロイルトランスフェラーゼの不活性化は、主にテトラアシル化リピドＡを有するＳｈｉｇｅｌｌａを提供し得る。好ましい株は、ペンタまたはテトラアシル化ＬＰＳを有する。
【００３２】
好ましい株は、ｇａｌＵおよびｍｓｂＢ１がどちらも不活性化され、そしてまた有毒性プラスミドを欠き、それによってそのＬＰＳがペンタアシル化され、結合したＯ抗原を欠く株を提供する。
【００３３】
いくつかの有用な株は、結合したＯ抗原を含む、ペンタまたはテトラアシル化ＬＰＳを有する。しかし、より一般的には、好ましい株は、結合したＯ抗原を欠くペンタまたはテトラアシル化ＬＰＳを有する。ｔｏｌＲ、ｒｆｂＧおよびｈｔｒＢノックアウト（および、任意でｒｆｂＦおよび／またはｒｆｃ不活性化）を有するＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ株が有用である。有用なＳ．ｓｏｎｎｅｉ株は、ｔｏｌＲ変異を有し、そして有毒性プラスミドを欠く。
【００３４】
細菌は、腸毒素を発現しない場合がある。例えば、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ株（特に２ａ株）は、Ｓｈｉｇｅｌｌａエンテロトキシン１（ＳｈＥＴ−１）のサブユニットの全てを発現しない場合があり、例えばｓｅｔ１Ａおよび／またはｓｅｔ１Ｂ遺伝子が不活性化され得る。Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ株は、Ｓｈｉｇａ毒素の両方のサブユニットを発現しない場合があり、例えばｓｔｘＡおよび／またはｓｔｘＢ遺伝子の１つまたは両方が不活性化され得る。Ｓｈｉｇｅｌｌａ、特にＳ．ｓｏｎｎｅｉまたはＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉは、エンテロトキシン２（ＳｈＥＴ−２）を発現しない場合があり、例えばｏｓｐＤ３遺伝子が不活性化され得、または有毒性プラスミドが欠如し得る。好ましい株は、ＳｈＥＴ−１、ＳｈＥＴ−２、およびＳｈｉｇａ毒素をどれもコードしない。
【００３５】
本発明のＳｈｉｇｅｌｌａ細菌を、従来の変異生成技術を用いて、野生型または他の開始株から簡便に調製し得る（例えば参考文献９から１１を参照のこと）。ラムダレッド組換えシステムが、Ｓｈｉｇｅｌｌａで特に有用である。遺伝子の不活性化を、様々な方法で、例えばそのプロモーターの欠失または変異、その開始コドンの欠失または変異、時期尚早でのストップコドンの導入、完全なコード領域の欠失、ノックアウト等によって、達成し得る。同系ノックアウト変異体が好ましい。結果としてできたＳｈｉｇｅｌｌａ細菌において、所望の遺伝子をコードするｍＲＮＡが欠如しており、および／またはその翻訳が阻害されている（例えば野生型レベルの１％未満まで）。
【００３６】
本発明のＳｈｉｇｅｌｌａ細菌は、不活性化された遺伝子の代わりに、マーカー遺伝子、例えば抗生物質耐性マーカーを含み得る。相同的組換えを用いてこれを達成し得る。しかし好ましくは、マーカー無しでの（ｕｎｍａｒｋｅｄ）欠失（すなわち、マーカー遺伝子の導入無しの欠失）を使用する。
【００３７】
有毒性Ｓｈｉｇｅｌｌａ株は、有毒性性質を媒介する、２２０ｋｂのプラスミドを有する。この「有毒性プラスミド」は、標的上皮細胞のためのアドヘシン、侵入プラスミド抗原、ｖｉｒＦ、ｖｉｒＧ等を含む、Ｓｈｉｇｅｌｌａ有毒性のいくつかの局面に関する遺伝子をコードすることが示された。本発明のＳｈｉｇｅｌｌａは、有毒性プラスミドを有し得るが、有毒性プラスミドを有さないことが好ましい。そのプラスミドの欠如は、工業的な培養の間、その株を安定化し得、有毒性因子を除去することによってその株を弱毒化し得（それによって製造の安全性が増す）、リポ多糖を破壊し得（Ｓ．ｓｏｎｎｅｉにおいてＯ抗原の生合成遺伝子は、プラスミド上にある）、ＳｈＥＴ−２エンテロトキシンの存在を回避し得（プラスミドのｏｓｐＤ３またはｓｅｎ遺伝子によってコードされる）、およびｍｓｂＢ２（リピドＡのアシル化に関与するｍｓｂＢ遺伝子の２番目のコピーである）の存在を回避し得る。
【００３８】
本発明のＳｈｉｇｅｌｌａは、１つまたはそれ以上の異種タンパク質、例えば天然にはＳｈｉｇｅｌｌａにおいて見出されないタンパク質を発現し得る。その異種タンパク質が外膜タンパク質ならば、上記株からのブレブを、非Ｓｈｉｇｅｌｌａ抗原を免疫系に提示するための送達システムとして使用し得る。
【００３９】
Ｓｈｉｇｅｌｌａを増殖させるための培養条件は、当該分野で周知であり、例えば参考文献１２から１４を参照のこと。例えば、それらを、有機窒素源（例えばＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐを含むアミノ酸混合物など；カザミノ酸を使用し得る）、炭素源としてグリセロールを使用する等して、増殖させ得る。培地中にＬ−アスパラギン酸を含むことが特に有用であり、これは、窒素源および炭素源の両方として機能し得る。
【００４０】
本発明のＳｈｉｇｅｌｌａを鉄制限条件下で有利に増殖させ得る。これは、鉄制限条件が、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．において免疫原性であり、そして高度に保存されている鉄調節タンパク質をアップレギュレートすることが示されたためである。例えば、その細菌を、デスフェラールまたは２，２’−ジピリジルまたは８−ヒドロキシキノリンのような化合物の存在下で増殖させ得る。これらの条件下で、その細菌は、ＦｅｐＡ外膜受容体、コリシンＩ受容体（ＣｉｒＡ）、および／または鉄シデロホア受容体（ＦｈｕＡ）のようなタンパク質の発現を増加させ得る。
【００４１】
ブレブおよび過剰ブレブ形成
本発明のＳｈｉｇｅｌｌａ細菌は、その対応する野生型株と比較して、過剰にブレブを形成する。すなわち、それらは野生型株より多量のブレブを培地へ放出する。これらのブレブは、Ｓｈｉｇｅｌｌａワクチンの成分として有用である。
【００４２】
そのブレブは、典型的には電子顕微鏡によって３５−１２０ｎｍの直径、例えば５０ｎｍの直径を有する。
【００４３】
そのブレブは、細菌増殖の間に自然に放出され、そして培地から精製され得る。その精製は、理想的にはブレブを、生のおよび／またはインタクトなＳｈｉｇｅｌｌａ細菌から、例えば、ブレブは通過させるがインタクトな細菌は通過させない、０．２２μｍのフィルターのようなフィルターを用いたサイズに基づくろ過によって、またはブレブを懸濁物中に残しながら細胞をペレットにする低速遠心分離を用いることによって、分離することを含む。
【００４４】
従って、培地と異なり、本発明のブレブを含む組成物は一般的に、生きているか死んでいるにかかわらず、実質的に細菌全体を含まない。ブレブのサイズは、例えば典型的にろ過滅菌に使用されるようなろ過によって、それらを容易に細菌全体から分離し得ることを意味する。ブレブは標準的な０．２２μｍのフィルターを通過するが、これらは他の物質によって迅速に詰まることがあり、０．２２μｍのフィルターを使用する前に、一連の漸減孔径のフィルターを通した連続的なろ過滅菌の工程を行うことが有用であり得る。先行するフィルターの例は、０．８μｍ、０．４５μｍ等の孔径を有するものである。
【００４５】
自然に放出されたブレブの培地からの分離は、外膜小胞を形成させるための外膜の故意の破壊（例えば界面活性剤処理または超音波処理による）を含む方法よりも簡便である。さらに、それらは内膜および細胞質の混入を実質的に含まない。
【００４６】
本発明のブレブは、脂質およびタンパク質を含む。ブレブのタンパク質の内容物は分析されている。そのブレブは、表１に列挙し、そして下記で議論するタンパク質を含む。
【００４７】
Ｓｈｉｇｅｌｌａ外膜タンパク質
表１は、本発明のＳｈｉｇｅｌｌａブレブにおいて検出された１２９個のタンパク質のＧｅｎＢａｎｋ名およびＧＩ番号を列挙する。これらの１２７個のタンパク質を、ブレブから分離した精製形態で、免疫原性の成分として使用し得る。１２９個のうちの好ましいサブセットは、リストの最初の６０個である（「サブセット３」）。
【００４８】
ポリペプチドを、様々な手段で、例えば化学的合成（少なくとも部分的に）、プロテアーゼを用いて長いポリペプチドを消化すること、ＲＮＡからの翻訳、細胞培養物からの精製（例えば、組換え発現から、またはＳｈｉｇｅｌｌａ培養物から）等によって調製し得る。Ｅ．ｃｏｌｉ宿主における異種性の発現が、好ましい発現経路である。
【００４９】
本発明のポリペプチドを、固体支持体に結合または固定化し得る。本発明のポリペプチドは、検出可能な標識、例えば放射性標識、蛍光標識、またはビオチン標識を含み得る。これはイムノアッセイ技術において特に有用である。
【００５０】
ポリペプチドは、様々な形態（例えば天然、融合、グリコシル化、非グリコシル化、脂質付加、ジスルフィド架橋等）をとり得る。ポリペプチドは、好ましくはＳｈｉｇｅｌｌａポリペプチドである。
【００５１】
ポリペプチドを、好ましくは実質的に純粋な、または実質的に単離された（すなわち、実質的に他のＳｈｉｇｅｌｌａまたは宿主細胞ポリペプチドを含まない）形態で調製する。一般的に、そのポリペプチドは、天然に存在する環境ではない環境で提供され、例えばそれらは天然に存在する環境から分離される。ある実施態様において、対象ポリペプチドは、コントロールと比較して、そのポリペプチドが濃縮された組成物において存在する。そのように、精製されたポリペプチドが提供され、ここで「精製された」によって、そのポリペプチドが実質的に他の発現されたポリぺプチドを含まない組成物に存在することを意味し、ここで「実質的に含まない」によって、組成物の５０％未満、通常３０％未満、およびより通常には１０％未満が、他の発現したポリペプチドからなることを意味する。
【００５２】
「ポリペプチド」という用語は、あらゆる長さのアミノ酸ポリマーを指す。そのポリマーは直鎖状、または分岐であり得、それは修飾アミノ酸を含み得、そしてそれは非アミノ酸によって中断され得る。その用語はまた、天然に、または介入によって、例えばジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化、または標識成分との結合体化のような任意の他の操作もしくは修飾によって、修飾されたアミノ酸ポリマーを含む。例えば、１つまたはそれ以上のアミノ酸のアナログ（例えば非天然アミノ酸等を含む）、および当該分野で公知の他の修飾を含むポリペプチドも、その定義に含まれる。ポリペプチドは、１本鎖または結合した鎖として存在し得る。
【００５３】
薬学的組成物
本発明は、（ａ）本発明のブレブ、および（ｂ）薬学的に許容可能なキャリアを含む薬学的組成物を提供する。本発明はまた、本発明のブレブを薬学的に許容可能なキャリアと混合する工程を含む、そのような組成物を調製するためのプロセスを提供する。
【００５４】
本発明はまた、（ａ）上記で定義したブレブを含まない免疫原性組成物、および（ｂ）薬学的に許容可能なキャリアを含む薬学的組成物を提供する。
【００５５】
その免疫原性組成物は、薬学的に許容可能なキャリアを含み得、薬学的に許容可能なキャリアはそれ自体では、その組成物を投与される患者にとって有害な抗体の産生を誘発しないあらゆる物質であり得、そしてそれは過度な毒性無しに投与され得る。薬学的に許容可能なキャリアは、水、生理食塩水、グリセロールおよびエタノールのような液体を含み得る。湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝化物質等のような補助的な物質も、そのようなビヒクル中に存在し得る。適当なキャリアの十分な議論は、参考文献１５において得られる。
【００５６】
Ｓｈｉｇｅｌｌａ感染は、体の様々な領域に影響を与え得、従って本発明の組成物を、様々な形態で調製し得る。例えば、その組成物を、液体溶液または懸濁物のいずれかとして、注射剤として調製し得る。注射の前の、液体ビヒクルにおける溶液または懸濁物のために適当な固体形態も調製し得る。その組成物を、局所投与のために、例えば軟膏、クリーム、または粉末として調製し得る。その組成物を、経口投与のために、例えば錠剤またはカプセル、またはシロップ（任意で矯味矯臭された）として調製する。その組成物を、肺投与のために、例えば細かい粉末またはスプレーを用いた吸入剤として調製し得る。その組成物を、坐剤または膣坐剤として調製し得る。その組成物を、鼻腔内、耳内、または眼内投与のために、例えば滴剤として調製し得る。
【００５７】
その組成物は、好ましくは無菌である。それは好ましくは発熱物質を含まない。それは好ましくは、例えばｐＨ６からｐＨ８で、一般的にはｐＨ７の周辺で緩衝化される。本発明の組成物は、ヒトに関して等張であり得る。
【００５８】
免疫原性組成物は、免疫学的に有効な量の免疫原、および必要に応じてあらゆる他の指定された成分を含む。「免疫学的に有効な量」によって、単回投与または一連の投与の一部としての、その量の個体に対する投与が、処置または防止のために有効であることを意味する。この量は、処置する個体の健康および身体的状態、年齢、処置する個体の分類学的群（例えば非ヒト霊長類、霊長類等）、その個体の免疫系の抗体を合成する能力、望ましい保護の程度、ワクチンの処方、治療する医師の医学的状況の評価、および他の関連する因子に依存して変化する。その量は、日常的な試験によって決定し得る比較的広い範囲に入ることが予測される。
【００５９】
小胞ワクチン（例えば髄膜炎菌に対する）を用いた以前の研究は、ブレブを投与するための薬学的、薬量学的、および処方の指針を提供する。本発明の組成物中のブレブの濃度は、一般的に１０〜５００μｇ／ｍｌ、好ましくは２５〜２００μｇ／ｍｌ、そしてより好ましくは約５０μｇ／ｍｌまたは約１００μｇ／ｍｌ（ブレブ中の全タンパク質に関して表す）である。０．５ｍｌの投与容積が注射のために典型的である。
【００６０】
その組成物を、他の免疫調節性薬剤と組み合わせて投与し得る。
【００６１】
本発明の組成物中で（特にブレブを含まない組成物中で）使用し得るアジュバントは、以下のものを含むがこれに限らない。
【００６２】
Ａ．ミネラルを含む組成物
本発明においてアジュバントとして使用するために適当な、ミネラルを含む組成物は、アルミニウム塩およびカルシウム塩のようなミネラル塩を含む。本発明は、水酸化物（例えばオキシ水酸化物）、リン酸塩（例えばヒドロキシリン酸塩、オルトリン酸塩）、硫酸塩等のようなミネラル塩［例えば参考文献１９の第８および９章を参照のこと］、または異なるミネラル化合物の混合物を含み、その化合物はあらゆる適当な形態（例えばゲル、結晶性、非晶質等）を取り、および吸着が好ましい。そのミネラルを含む組成物はまた、ミネラル塩の粒子として処方され得る。
【００６３】
「水酸化アルミニウム」として公知のアジュバントは、典型的にはオキシ水酸化アルミニウム塩であり、それは通常少なくとも部分的に結晶性である。式ＡｌＯ（ＯＨ）によって表し得るオキシ水酸化アルミニウムは、赤外（ＩＲ）分光法によって、特に１０７０ｃｍ−１における吸収（ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ）バンド、および３０９０−３１００ｃｍ−１における強い肩部の存在によって、水酸化アルミニウムＡｌ（ＯＨ）３のような他のアルミニウム化合物から区別し得る［参考文献１９の第９章］。水酸化アルミニウムアジュバントの結晶化の程度は、半値における回折バンドの幅（ｗｉｄｔｈ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ ｂａｎｄ ａｔ ｈａｌｆ ｈｅｉｇｈｔ（ＷＨＨ））によって反映され、結晶性の低い粒子は、小さい結晶子サイズのために、大きな線の広がりを示す。表面積は、ＷＨＨが増加するにつれて増加し、そしてより高いＷＨＨ値を有するアジュバントが、抗原吸着のより高い能力を有することが示された。線維状の形態（例えば透過型電子顕微鏡写真において見られるような）は、水酸化アルミニウムアジュバントに典型的である。水酸化アルミニウムアジュバントのｐＩは、典型的には約１１であり、すなわちアジュバント自体が、生理学的ｐＨにおいて正の表面電荷を有する。水酸化アルミニウムアジュバントに関して、ｐＨ７．４におけるＡｌ＋＋＋１ｍｇあたり１．８−２．６ｍｇのタンパク質の吸着能力が報告された。
【００６４】
「リン酸アルミニウム」として公知のアジュバントは、典型的にはヒドロキシリン酸アルミニウムであり、多くの場合少量の硫酸塩も含む（すなわち、ヒドロキシリン酸アルミニウム硫酸塩）。それらを沈殿によって得ることができ、そしてその反応条件および沈殿の間の濃度は、塩におけるリン酸のヒドロキシルによる置換の程度に影響を与える。ヒドロキシリン酸塩は、一般的に０．３〜１．２のＰＯ４／Ａｌモル比を有する。ヒドロキシリン酸塩を、ヒドロキシル基の存在によって、厳密なＡｌＰＯ４から区別し得る。例えば、３１６４ｃｍ−１におけるＩＲスペクトルのバンド（例えば２００℃における）が、構造的ヒドロキシルの存在を示す［参考文献１９の第９章］。
【００６５】
リン酸アルミニウムアジュバントのＰＯ４／Ａｌ３＋モル比は、一般的に０．３〜１．２、好ましくは０．８〜１．２、そしてより好ましくは０．９５±０．１である。リン酸アルミニウムは、特にヒドロキシリン酸塩に関して、一般的に非晶質である。典型的なアジュバントは、０．８４〜０．９２のＰＯ４／Ａｌモル比を有する非晶質のヒドロキシリン酸アルミニウムであり、０．６ｍｇのＡｌ３＋／ｍｌで含まれる。リン酸アルミニウムは、一般的に粒子性である（例えば、透過型電子顕微鏡写真において見られるような、プレート様の形態）。その粒子の典型的な直径は、任意の抗原の吸着後、０．５−２０μｍの範囲（例えば約５−１０μｍ）である。リン酸アルミニウムアジュバントに関して、ｐＨ７．４においてＡｌ＋＋＋１ｍｇあたり０．７から１．５ｍｇのタンパク質の吸着能力が報告された。
【００６６】
リン酸アルミニウムのゼロ電荷点（ＰＺＣ）は、リン酸のヒドロキシルによる置換の程度と反比例し、そしてこの置換の程度は、反応条件および沈殿による塩の調製のために使用された反応物の濃度に依存して変化し得る。ＰＺＣはまた、溶液中の遊離リン酸イオンの濃度を変化させることによって（より多くのリン酸＝より酸性のＰＺＣ）、またはヒスチジン緩衝液のような緩衝液を加えることによって（ＰＺＣをより塩基性にする）、変化する。本発明によって使用されるリン酸アルミニウムは、一般的に４．０〜７．０、より好ましくは５．０〜６．５、例えば約５．７のＰＺＣを有する。
【００６７】
本発明の組成物を調製するために使用されたアルミニウム塩の懸濁物は、緩衝液（例えばリン酸またはヒスチジンまたはＴｒｉｓ緩衝液）を含み得るが、これは常に必要というわけではない。その懸濁物は、好ましくは無菌であり、そして発熱物質を含まない。懸濁物は、例えば１．０〜２０ｍＭ、好ましくは５〜１５ｍＭ、そしてより好ましくは約１０ｍＭの濃度で存在する、遊離水性リン酸イオンを含み得る。その懸濁物はまた、塩化ナトリウムを含み得る。
【００６８】
１つの実施態様において、アジュバント成分は、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムの両方の混合物を含む。この場合、例えば少なくとも２：１、例えば≧５：１、≧６：１、≧７：１、≧８：１、≧９：１等の重量比で、水酸化アルミニウムより多くのリン酸アルミニウムが存在し得る。
【００６９】
患者に投与するための組成物中のＡｌ＋＋＋の濃度は、好ましくは１０ｍｇ／ｍｌ未満、例えば≦５ｍｇ／ｍｌ、≦４ｍｇ／ｍｌ、≦３ｍｇ／ｍｌ、≦２ｍｇ／ｍｌ、≦１ｍｇ／ｍｌ等である。好ましい範囲は、０．３〜１ｍｇ／ｍｌである。最高で＜０．８５ｍｇ／用量が好ましい。
【００７０】
Ｂ．油エマルジョン
本発明においてアジュバントとして使用するために適当な油エマルジョン組成物は、ＭＦ５９のようなスクアレン−水エマルジョンを含む［参考文献１９の第１０章；参考文献１６も参照のこと］（５％のスクアレン、０．５％のＴｗｅｅｎ８０、および０．５％のＳｐａｎ８５、マイクロフルイダイザーを用いてサブミクロンの粒子に処方する）。完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）も使用し得る。
【００７１】
様々な適当な水中油型エマルジョンが公知であり、そしてそれらは典型的には少なくとも１つの油および少なくとも１つのサーファクタントを含み、その油およびサーファクタントは生物分解性（代謝性）および生体適合性である。エマルジョン中の油滴は、一般的に直径５μｍ未満であり、そして有利にそのエマルジョンはサブミクロンの直径を有する油滴を含み、これらの小さいサイズは、マイクロフルイダイザーによって達成され、安定なエマルジョンが提供される。ろ過滅菌に供することができるので、２２０ｎｍ未満のサイズを有する液滴が好ましい。
【００７２】
本発明を、動物（魚のような）または植物供給源由来のもののような油と共に使用し得る。植物油の供給源は、ナッツ、種子、および穀物を含む。ピーナッツ油、ダイズ油、ココナッツ油、およびオリーブ油は最も通常に入手可能であり、ナッツ油の例示となる。例えばホホバ豆から得られる、ホホバ油も使用し得る。種子油は、ベニバナ油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ種子油等を含む。穀物群の中で、コーン油が最も容易に入手可能であるが、コムギ、カラスムギ、ライムギ、コメ、テフ、ライコムギ等のような他の穀物の油も使用し得る。種子油には天然に存在しないが、グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの６−１０炭素脂肪酸エステルを、ナッツおよび種子油から開始して、適当な材料の加水分解、分離、およびエステル化によって調製し得る。哺乳動物乳由来の脂肪および油は、代謝可能であり、従って本発明の実施において使用し得る。動物供給源から純粋な油を得るために必要な、分離、精製、けん化および他の手段の手順が、当該分野で周知である。ほとんどの魚は、容易に収集し得る代謝可能な油を含む。例えば、タラ肝油、サメ肝油、および鯨蝋のような鯨油は、本明細書中で使用し得る魚油のいくつかの例示である。多くの分岐鎖油は、５炭素イソプレン単位で生化学的に合成され、そして一般的にテルペノイドと呼ばれる。サメ肝油は、スクアレン、２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエンとして公知である、分岐、不飽和テルペノイドを含む。他の好ましい油は、トコフェロールである（下記を参照のこと）。スクアレン（ｓｑｌａｕｅｎｅ）を含む水中油型エマルジョンが特に好ましい。油の混合物を使用し得る。
【００７３】
サーファクタントを、その「ＨＬＢ」（親水性／親油性バランス）によって分類し得る。本発明の好ましいサーファクタントは、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、そしてより好ましくは少なくとも１６のＨＬＢを有する。本発明を、ポリオキシエチレンソルビタンエステルサーファクタント（通常Ｔｗｅｅｎと呼ばれる）、特にポリソルベート２０およびポリソルベート８０；直鎖状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマーなど、ＤＯＷＦＡＸＴＭの商品名で販売されている、エチレンオキシド（ＥＯ）、酸化プロピレン（ＰＯ）、および／または酸化ブチレン（ＢＯ）のコポリマー；エトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の反復数が変動し得るオクトキシノール、オクトキシノール−９（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が特に興味深い；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；ホスファチジルコリン（レシチン）のようなリン脂質；トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ３０）のような、ラウリル、セチル、ステアリル、およびオレイルアルコール由来のポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊサーファクタントとして公知である）；およびソルビタントリオレアート（Ｓｐａｎ８５）およびソルビタンモノラウラートのような、ソルビタンエステル（通常ＳＰＡＮとして公知である）を含むがこれに限らないサーファクタントと使用し得る。エマルジョンに含めるために好ましいサーファクタントは、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）、Ｓｐａｎ８５（ソルビタントリオレアート）、レシチンおよびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００である。上記で述べたように、Ｔｗｅｅｎ８０のような界面活性剤は、下記の実施例で見られる熱安定性に寄与し得る。
【００７４】
サーファクタントの混合物、例えばＴｗｅｅｎ８０／Ｓｐａｎ８５混合物を使用し得る。ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（Ｔｗｅｅｎ８０）のようなポリオキシエチレンソルビタンエステルおよびｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）のようなオクトキシノールの組み合わせも適当である。別の有用な組み合わせは、ラウレス９とポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールを含む。
【００７５】
サーファクタントの好ましい量（重量％）は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ８０のような）０．０１−１％、特に約０．１％；オクチルまたはノニルフェノキシポリオキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、またはＴｒｉｔｏｎシリーズの他の界面活性剤のような）０．００１から０．１％、特に０．００５から０．０２％；ポリオキシエチレンエーテル（ラウレス９のような）０．１から２０％、好ましくは０．１から１０％、および特に０．１から１％または約０．５％である。
【００７６】
本発明で有用な、特定の水中油型エマルジョンアジュバントは、以下のものを含むがこれに限らない。
【００７７】
・スクアレン、Ｔｗｅｅｎ８０、およびＳｐａｎ８５のサブミクロンのエマルジョン。容積によるそのエマルジョンの組成は、約５％のスクアレン、約０．５％のポリソルベート８０、および約０．５％のＳｐａｎ８５であり得る。重量に関して、これらの比は、４．３％のスクアレン、０．５％のポリソルベート８０、および０．４８％のＳｐａｎ８５になる。このアジュバントは、参考文献１９の第１０章および参考文献２０の第１２章においてより詳細に記載されるように、「ＭＦ５９」［１６−１８］として公知である。ＭＦ５９エマルジョンは、クエン酸イオン、例えば１０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液を有利に含む。
【００７８】
・スクアレン、α−トコフェロール、およびポリソルベート８０を含むエマルジョン。これらのエマルジョンは、２から１０％のスクアレン、２から１０％のトコフェロール、および０．３から３％のＴｗｅｅｎ８０を有し得、そしてスクアレン：トコフェロールの重量比は、より安定なエマルジョンを提供するので、好ましくは≦１（例えば０．９０）である。スクアレンおよびＴｗｅｅｎ８０は、約５：２の容積比で、または約１１：５の重量比で存在し得る。Ｔｗｅｅｎ８０をＰＢＳに２％溶液を生じるように溶解させ、次いで９０ｍｌのこの溶液を、（５ｇのＤＬ−α−トコフェロールおよび５ｍｌのスクアレン）の混合物と混合し、次いでその混合物をマイクロフルイダイズすることによって、１つのそのようなエマルジョンを産生し得る。できたエマルジョンは、例えば１００〜２５０ｎｍ、好ましくは約１８０ｎｍの平均直径を有する、サブミクロンの油滴を有し得る。
【００７９】
・スクアレン、トコフェロール、およびＴｒｉｔｏｎ界面活性剤（例えばＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）のエマルジョン。そのエマルジョンはまた、３ｄ−ＭＰＬを含み得る（下記を参照のこと）。そのエマルジョンは、リン酸緩衝液を含み得る。
【００８０】
・ポリソルベート（例えばポリソルベート８０）、Ｔｒｉｔｏｎ界面活性剤（例えばＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）およびトコフェロール（例えばコハク酸α−トコフェロール）を含むエマルジョン。そのエマルジョンは、これらの３つの成分を、約７５：１１：１０の質量比で含み得（例えば７５０μｇ／ｍｌのポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、および１００μｇ／ｍｌのコハク酸α−トコフェロール）、そしてこれらの濃度は、抗原からのこれらの成分のあらゆる寄与を含むだろう。そのエマルジョンはまた、スクアレンを含み得る。そのエマルジョンはまた、３ｄ−ＭＰＬを含み得る（下記を参照のこと）。その水相は、リン酸緩衝液を含み得る。
【００８１】
・スクアラン、ポリソルベート８０およびポロクサマー４０１（「ＰｌｕｒｏｎｉｃＴＭ Ｌ１２１」）のエマルジョン。そのエマルジョンを、リン酸緩衝化生理食塩水、ｐＨ７．４中で処方し得る。このエマルジョンは、ムラミルジペプチドの有用な送達ビヒクルであり、そして「ＳＡＦ−１」アジュバントにおいて、スレオニル−ＭＤＰと共に使用された［２１］（０．０５−１％のＴｈｒ−ＭＤＰ、５％のスクアラン、２．５％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１および０．２％のポリソルベート８０）。「ＡＦ」アジュバント［２２］（５％のスクアラン、１．２５％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１および０．２％のポリソルベート８０）におけるように、それをまたＴｈｒ−ＭＤＰ無しで使用し得る。マイクロフルイダイゼーションが好ましい。
【００８２】
・スクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性サーファクタント（例えばポリオキシエチレン（１２）セトステアリルエーテル）および疎水性非イオン性サーファクタント（例えばソルビタンモノオレアート（ｍｏｎｏｌｅａｔｅ）または「Ｓｐａｎ８０」のような、ソルビタンエステルまたはマンニドエステル）を含むエマルジョン。そのエマルジョンは、好ましくは熱可逆的であり、および／または少なくとも９０％の２００ｎｍ未満のサイズを有する油滴（容積で）を有する［２３］。そのエマルジョンはまた、１つまたはそれ以上のアルジトール；凍結保護剤（例えばドデシルマルトシドおよび／またはショ糖のような糖）；および／またはアルキルポリグリコシドを含み得る。そのようなエマルジョンを、凍結乾燥し得る。
【００８３】
・０．５−５０％の油、０．１−１０％のリン脂質、および０．０５−５％の非イオン性サーファクタントを有するエマルジョン。参考文献２４で記載されるように、好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリンおよびカルジオリピンである。サブミクロンの液滴サイズが有利である。
【００８４】
・非代謝性油（軽油のような）および少なくとも１つのサーファクタント（レシチン、Ｔｗｅｅｎ８０、またはＳｐａｎ８０のような）の、サブミクロンの水中油型エマルジョン。ＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、サポニン−親油性結合体（参考文献２５において記載され、グルクロン酸のカルボキシル基を介した脂肪族アミンのデスアシルサポニンへの付加によって産生される、ＧＰＩ−０１００のような）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ｄｉｍｅｔｈｙｉｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ）ブロミドおよび／またはＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミンのような、添加物を含み得る。
【００８５】
・ミネラル油、非イオン性親油性エトキシ化脂肪アルコール、および非イオン性親水性サーファクタント（例えばエトキシ化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）［２６］を含むエマルジョン。
【００８６】
・ミネラル油、非イオン性親水性エトキシ化脂肪アルコール、および非イオン性親油性サーファクタント（例えばエトキシ化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）［２６］を含むエマルジョン。
【００８７】
・サポニン（例えばＱｕｉｌＡまたはＱＳ２１）およびステロール（例えばコレステロール）が、らせん状ミセルとして結合しているエマルジョン［２７］。
【００８８】
組成物中の抗原およびアジュバントは、典型的には患者への送達時には混合物である。そのエマルジョンを、製造の間に、または送達に際し即席で抗原と混合し得る。従って、そのアジュバントおよび抗原を、パッケージまたは分配したワクチンにおいて別々に維持し、使用時の最終的な処方に備え得る。その抗原は一般的に水性形態であり、そのためワクチンを、最終的に２つの液体を混合することによって調製する。混合するための２つの液体の容積比は変動し得るが（例えば５：１〜１：５）、一般的に約１：１である。
【００８９】
Ｃ．サポニン処方物［参考文献１９の第２２章］
本発明において、サポニン処方物もアジュバントとして使用し得る。サポニンは、広い範囲の植物種の、樹皮、葉、茎、根、さらには花において見出される、ステロールグリコシドおよびトリテルペノイドグリコシドの異種群である。Ｑｕｉｌｌａｉａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａの木の樹皮由来のサポニンは、アジュバントとして広く研究されている。サポニンをまた、Ｓｍｉｌａｘ ｏｒｎａｔａ（サルサパリラ（ｓａｒｓａｐｒｉｌｌａ））、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（ブライズベール（ｂｒｉｄｅｓ ｖｅｉｌ））、およびＳａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ（ソープルート（ｓｏａｐ ｒｏｏｔ））から、市販で得ることができる。サポニンアジュバント処方は、ＱＳ２１のような精製した処方物、およびＩＳＣＯＭのような脂質処方物を含む。ＱＳ２１は、ＳｔｉｍｕｌｏｎＴＭとして販売されている。
【００９０】
サポニン組成物を、ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣを用いて精製した。これらの技術を用いて、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−Ｂ、およびＱＨ−Ｃを含む、特定の精製画分が同定された。好ましくは、そのサポニンはＱＳ２１である。ＱＳ２１の産生方法が、参考文献２８において開示される。サポニン処方物はまた、コレステロールのようなステロールを含み得る［２９］。
【００９１】
サポニンおよびコレステロールの組み合わせを使用して、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ；参考文献１９の第２３章；参考文献３０および３１も参照のこと）と呼ばれる独特な粒子を形成し得る。ＩＳＣＯＭはまた、典型的にはホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンのようなリン脂質を含む。あらゆる公知のサポニンを、ＩＳＣＯＭにおいて使用し得る。好ましくは、そのＩＳＣＯＭは、１つまたはそれ以上のＱｕｉｌＡ、ＱＨＡおよびＱＨＣを含む。任意で、そのＩＳＣＯＭは、さらなる界面活性剤を欠き得る［３２］。
【００９２】
サポニンに基づくアジュバントの開発の概説を、参考文献３３および３４において見出し得る。
【００９３】
Ｄ．細菌または微生物誘導体
本発明において使用するために適当なアジュバントは、腸内細菌リポ多糖（ＬＰＳ）の無毒性誘導体、リピドＡ誘導体、免疫刺激性オリゴヌクレオチドならびにＡＤＰ−リボシル化毒素およびその無毒化誘導体のような、細菌または微生物誘導体を含む。
【００９４】
ＬＰＳの無毒性誘導体は、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）および３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）を含む。３ｄＭＰＬは、４、５、または６アシル化鎖を有する３脱Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの混合物である。３脱Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの好ましい「小粒子」形態が、参考文献３５において開示される。そのような３ｄＭＰＬの「小粒子」は、０．２２μｍの膜を通して滅菌ろ過するために十分小さい［３５］。他の無毒性ＬＰＳ誘導体は、アミノアルキルグルコサミニドリン酸塩誘導体、例えばＲＣ−５２９のような、モノホスホリルリピドＡ模倣物を含む［３６、３７］。
【００９５】
リピドＡ誘導体は、ＯＭ−１７４のようなＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のリピドＡの誘導体を含む。ＯＭ−１７４は、例えば参考文献３８および３９において記載される。
【００９６】
本発明においてアジュバントとして使用するために適当な免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧモチーフ（リン酸結合によってグアノシンに結合した非メチル化シトシンを含むジヌクレオチド配列）を含むヌクレオチド配列を含む。２本鎖ＲＮＡおよびパリンドロームまたはポリ（ｄＧ）配列を含むオリゴヌクレオチドも、免疫刺激性であることが示された。
【００９７】
ＣｐＧは、ホスホロチオエート修飾のようなヌクレオチド修飾／アナログを含み得、そして２本鎖または１本鎖であり得る。参考文献４０、４１、および４２は、可能性のあるアナログ置換、例えばグアノシンの２’−デオキシ−７−デアザグアノシンによる置換を開示する。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、参考文献４３−４８においてさらに議論される。
【００９８】
ＣｐＧ配列を、モチーフＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴのような、ＴＬＲ９に向け得る［４９］。そのＣｐＧ配列は、ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮのように、Ｔｈ１免疫反応を誘発するために特異的であり得、またはそれはＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮのように、Ｂ細胞反応を誘発するためにより特異的であり得る。ＣｐＧ−ＡおよびＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮは、参考文献５０−５２において議論される。好ましくは、そのＣｐＧはＣｐＧ−Ａ ＯＤＮである。
【００９９】
好ましくは、そのＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’末端が受容体認識のためにアクセス可能であるように構築される。任意で、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列を、その３’末端で結合して、「イムノマー」を形成し得る。例えば、参考文献５３−５５を参照のこと。
【０１００】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドに基づく特に有用なアジュバントは、ＩＣ−３１ＴＭとして公知である［５６−５８］。従って、本発明で使用されるアジュバントは、（ｉ）少なくとも１つ（および好ましくは複数）のＣｐＩモチーフ（すなわち、イノシンと結合してジヌクレオチドを形成するシトシン）を含むオリゴヌクレオチド（例えば１５−４０ヌクレオチド）、および（ｉｉ）少なくとも１つ（および好ましくは複数）のＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓトリペプチド配列を含む、オリゴペプチド（例えば５−２０アミノ酸）のようなポリカチオン性ポリマーの混合物を含み得る。そのオリゴヌクレオチドは、２６マーの配列５’−（ＩＣ）１３−３’（配列番号７）を含むデオキシヌクレオチドであり得る。そのポリカチオン性ポリマーは、１１マーのアミノ酸配列ＫＬＫＬＬＬＬＬＫＬＫ（配列番号６）を含むペプチドであり得る。配列番号６および７のこの組み合わせが、ＩＣ−３１ＴＭアジュバントを提供する。
【０１０１】
細菌ＡＤＰリボシル化毒素およびその無毒化誘導体を、本発明でアジュバントとして使用し得る。好ましくは、そのタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性エンテロトキシン「ＬＴ」）、コレラ（「ＣＴ」）、または百日咳（「ＰＴ」）由来である。粘膜アジュバントとして無毒化ＡＤＰリボシル化毒素を用いることが、参考文献５９に、そして非経口アジュバントとして用いることが、参考文献６０に記載されている。その毒素またはトキソイドは、好ましくは、ＡおよびＢサブユニットを両方含むホロ毒素の形態である。好ましくは、Ａサブユニットが、無毒化変異を含み；好ましくは、Ｂサブユニットは変異していない。好ましくは、そのアジュバントは、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、およびＬＴ−Ｇ１９２のような、無毒化ＬＴ変異体である。ＡＤＰリボシル化毒素およびその無毒化誘導体、特にＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２をアジュバントとして使用することは、参考文献６１−６８において見出し得る。有用なＣＴ変異体は、ＣＴ−Ｅ２９Ｈである［６９］。アミノ酸置換に関する数字の言及は、好ましくは、本明細書中にその全体が明確に参考として組み込まれる、参考文献７０において記載されたＡＤＰリボシル化毒素のＡおよびＢサブユニットのアライメントに基づく。
【０１０２】
Ｅ．ヒト免疫調節物質
本発明においてアジュバントとして使用するために適当なヒト免疫調節物質は、インターロイキン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２［７１］等）［７２］、インターフェロン（例えばインターフェロン−γ）、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子のようなサイトカインを含む。好ましい免疫調節物質はＩＬ−１２である。
【０１０３】
Ｆ．生体付着性物質（ｂｉｏａｄｈｅｓｉｖｅ）および粘膜付着性物質（ｍｕｃｏａｄｈｅｓｉｖｅ）
生体付着性物質および粘膜付着性物質も、本発明においてアジュバントとして使用し得る。適当な生体付着性物質は、エステル化ヒアルロン酸ミクロスフェア［７３］またはポリ（アクリル酸）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖類およびカルボキシメチルセルロースの架橋誘導体のような粘膜付着性物質を含む。キトサンおよびその誘導体も、本発明においてアジュバントとして使用し得る［７４］。
【０１０４】
Ｇ．微粒子
微粒子も、本発明においてアジュバントとして使用し得る。生物分解性および無毒性である材料（例えばポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ酸無水物、ポリカプロラクトン等、（ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）が好ましい））から形成された、微粒子（すなわち、直径約１００ｎｍから約１５０μｍ、より好ましくは直径約２００ｎｍから約３０μｍ、そして最も好ましくは直径約５００ｎｍから約１０μｍの粒子）が好ましく、任意で負に荷電した表面（例えばＳＤＳによって）または正に荷電した表面（例えばＣＴＡＢのような陽イオン性界面活性剤によって）を有するように処理する。
【０１０５】
Ｈ．リポソーム（参考文献１９の第１３および１４章）
アジュバントとして使用するために適当なリポソーム処方物の例が、参考文献７５−７７において記載されている。
【０１０６】
Ｉ．イミダゾキノロン化合物
本発明においてアジュバントとして使用するために適当なイミダゾキノロン化合物の例は、参考文献７８および７９においてさらに記載される、イミキモド（Ｉｍｉｑｕａｍｏｄ）およびそのホモログ（例えば「Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ３Ｍ」）を含む。
【０１０７】
本発明はまた、上記で同定した１つまたはそれ以上のアジュバントの局面の組み合わせを含み得る。例えば、以下のアジュバント組成物を、本発明において使用し得る：（１）サポニンおよび水中油型エマルジョン［８０］；（２）サポニン（例えばＱＳ２１）＋無毒性ＬＰＳ誘導体（例えば３ｄＭＰＬ）［８１］；（３）サポニン（例えばＱＳ２１）＋無毒性ＬＰＳ誘導体（例えば３ｄＭＰＬ）＋コレステロール；（４）サポニン（例えばＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（任意で＋ステロール）［８２］；（５）３ｄＭＰＬと、例えばＱＳ２１および／または水中油型エマルジョンとの組み合わせ［８３］；（６）サブミクロンのエマルジョンにマイクロフルイダイズしたか、またはより大きな粒子サイズのエマルジョンを産生するためにボルテックスした、１０％のスクアラン、０．４％のＴｗｅｅｎ８０ＴＭ、５％のプルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含むＳＡＦ；（７）２％のスクアレン、０．２％のＴｗｅｅｎ８０、ならびにモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコラート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群からの１つまたはそれ以上の細菌細胞壁成分、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＴＭ）を含むＲｉｂｉＴＭアジュバントシステム（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）；および（８）１つまたはそれ以上のミネラル塩（アルミニウム塩のような）＋ＬＰＳの無毒性誘導体（３ｄＭＰＬのような）。
【０１０８】
免疫刺激剤として作用する他の物質が、参考文献１９の第７章において開示される。
【０１０９】
水酸化アルミニウムアジュバントが有用であり、そして抗原は一般的にこの塩に吸着させられる。サブミクロンの油滴を有し、スクアレンを含む水中油型エマルジョンも、特に高齢者において好ましい。有用なアジュバントの組み合わせは、ＣｐＧ＆アルミニウム塩、またはレシキモド＆アルミニウム塩のような、Ｔｈ１およびＴｈ２アジュバントの組み合わせを含む。アルミニウム塩および３ｄＭＰＬの組み合わせを使用し得る。
【０１１０】
免疫化
上記で記載したような免疫原性組成物を提供することに加えて、本発明はまた、本発明の免疫原性組成物を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物において抗体反応を起こす方法を提供する。その抗体反応は、好ましくは保護的抗体反応である。本発明はまた、そのような方法において使用するための本発明の組成物を提供する。
【０１１１】
本発明はまた、本発明の免疫原性組成物を哺乳動物に投与することを含む、Ｓｈｉｇｅｌｌａ感染および／または疾患に対して（例えば細菌性赤痢、ライター症候群、および／または溶血性尿毒症症候群に対して）哺乳動物を保護するための方法を提供する。
【０１１２】
本発明は、薬物として（例えば免疫原性組成物またはワクチンとして）使用するための本発明の組成物を提供する。それはまた、哺乳動物においてＳｈｉｇｅｌｌａ感染を防止するための、例えば細菌性赤痢、ライター症候群、および／または溶血性尿毒症症候群を防止するための薬物の製造において、本発明の小胞を使用することを提供する。それはまた、哺乳動物においてＳｈｉｇｅｌｌａ感染を防止するための、例えば細菌性赤痢を防止するための、ブレブを含まない薬物の製造において、ブレブタンパク質（上記で定義したような）を使用することを提供する。
【０１１３】
その哺乳動物は、好ましくはヒトである。そのヒトは、成人、または好ましくは小児であり得る。そのワクチンを予防的に使用する場合、ヒトは好ましくは小児（例えば幼児または乳児）であり；そのワクチンを治療的に使用する場合、そのヒトは好ましくは成人である。小児を意図したワクチンをまた、例えば安全性、投与量、免疫原性等を評価するために、成人に投与し得る。
【０１１４】
その使用および方法は、細菌性赤痢、ライター症候群、および／または溶血性尿毒症症候群を含むがこれに限らない疾患を防止／処置するために特に有用である。
【０１１５】
治療的処置の有効性を、本発明の組成物の投与後にＳｈｉｇｅｌｌａ感染をモニターすることによって試験し得る。予防的処置の有効性を、その組成物の投与後に、ブレブ中の免疫原性タンパク質または他の抗原に対する免疫反応をモニターすることによって試験し得る。本発明の組成物の免疫原性を、それらを試験被験体（例えば１２−１６ヶ月齢の小児）に投与し、そして次いで標準的な血清学的パラメーターを決定することによって決定し得る。これらの免疫反応を、一般的に組成物の投与のおよそ４週間後に決定し、そして組成物の投与前に決定した値と比較する。１回より多くその組成物の投与を行う場合、１回より多い投与後の決定を行い得る。
【０１１６】
本発明の組成物を、一般的に患者へ直接投与する。直接的な送達を、非経口注射（例えば皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、または組織の間質腔に）によって、または直腸、経口、膣、局所、経皮、鼻腔内、眼、耳、肺、もしくは他の粘膜投与によって達成し得る。大腿または上腕への筋肉内投与が好ましい。注射は、針（例えば皮下針）により得るが、代替的に無針注射を使用し得る。典型的な筋肉内投与量は、約０．５ｍｌである。
【０１１７】
本発明を使用して、全身性および／または粘膜免疫を誘発し得る。
【０１１８】
投薬処置は、単回投与スケジュールまたは複数回投与スケジュールであり得る。一次免疫化スケジュールにおいて、および／または追加免疫化スケジュールにおいて、複数回投与を使用し得る。一次投与スケジュールの後に、追加投与スケジュールが続き得る。一次投与の間（例えば４−１６週間）および一次投与と追加投与との間の適当な時間を、日常的に決定し得る。
【０１１９】
一般
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えばＸを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、Ｘのみからなり得、またはさらなる何かを含み得る（例えばＸ＋Ｙ）。
【０１２０】
数値ｘに関連して「約」という用語は任意であり、そして例えばｘ±１０％を意味する。
【０１２１】
「実質的に」という用語は、「完全に」を除外しない。例えばＹを「実質的に含まない」組成物は、完全にＹを含まない場合がある。必要な場合、「実質的に」という用語を、本発明の定義から省略し得る。
【０１２２】
２つのアミノ酸配列の間の配列同一性パーセンテージへの言及は、アライメントした場合に、２つの配列を比較して、そのパーセンテージのアミノ酸が同一であることを意味する。このアライメントおよび相同性または配列同一性パーセントを、当該分野で公知であるソフトウェアプログラム、例えば参考文献８４の項７．７．１８において記載されたものを用いて決定し得る。好ましいアライメントを、ギャップオープンペナルティーが１２、およびギャップ伸長ペナルティーが２、ＢＬＯＳＵＭマトリックスが６２であるアフィンギャップサーチを用いたＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定する。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは周知であり、そして参考文献８５において開示される。
【０１２３】
「ＧＩ」ナンバリングを上記で使用する。ＧＩナンバー、または「ＧｅｎＩｎｆｏ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ」は、配列がデータベースに加えられたときに、ＮＣＢＩによって処理された各配列記録に連続的に割り当てられた一連の数字である。ＧＩナンバーは、配列記録のアクセッション番号との類似性はない。配列がアップデートされた場合（例えば訂正のために、またはより多くのアノテーションまたは情報を加えるために）、それは新しいＧＩナンバーを受け取る。従って、所定のＧＩナンバーに関連する配列は決して変化しない。
【０１２４】
本発明が「エピトープ」に関する場合、このエピトープはＢ細胞エピトープおよび／またはＴ細胞エピトープであり得る。そのようなエピトープを、経験的に（例えばＰＥＰＳＣＡＮ［８６、８７］または同様の方法を用いて）同定し得、またはそれらを予測し得る（例えばＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性指標［８８］、マトリックスに基づくアプローチ［８９］、ＭＡＰＩＴＯＰＥ［９０］、ＴＥＰＩＴＯＰＥ［９１、９２］、神経ネットワーク（ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋ）［９３］、ＯｐｔｉＭｅｒ＆ＥｐｉＭｅｒ［９４、９５］、ＡＤＥＰＴ［９６］、Ｔｓｉｔｅｓ［９７］、親水性［９８］、抗原性指標［９９］、または参考文献１００−１０１において開示された方法等を用いて）。エピトープは、抗体またはＴ細胞受容体の抗原結合部位によって認識され、そしてそこに結合する抗原の一部であり、そしてそれらはまた「抗原決定基」とも呼ばれ得る。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】図１は、培養物から精製した本発明のブレブの電子顕微鏡写真を示す。
【図２】図２は、Ｓ．ｓｏｎｎｅｉΔｔｏｌＲΔｇａｌＵ由来のブレブの２Ｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図３】図３は、抗コア抗体で染色した、様々な示した株におけるブレブのＬＰＳを示す。
【図４】図４は、免疫したマウス由来の血清を用いた、ブレブの２Ｄ分離タンパク質のイムノブロットを示す。
【図５】図５は、異なる条件下で増殖した細菌のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図６】図６は、吸着したブレブ中のタンパク質を示す。レーン左から右へ：１）タンパク質分子量マーカー、２）ＳｓＯＭＢ１０μｇ、３）ＳｓＯＭＢ２μｇ、４）１ヶ月間アルミニウムに吸着したＳｓＯＭＢ１０μｇ。
【図７】図７は、示した株のＦＡＣＳデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【０１２６】
発明を実施するための様式
Ｓ．ｓｏｎｎｅｉの変異体の調製
野生型Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ５３ＧのｔｏｌＲ遺伝子を、λ Ｒｅｄシステムを用いて欠失させた［１１、１０２］。λ Ｒｅｄプラスミドで形質転換したコンピテント細胞を調製し、そして次いで相同的組換えによってｔｏｌＲ遺伝子を抗生物質耐性遺伝子と交換するようデザインされた直鎖状断片で形質転換する。その断片が染色体に組み込まれたクローンを、抗生物質に対する耐性によって選択し、そしてｔｏｌＲの欠失を、ＰＣＲまたは他の技術によって確認する。次いで、３７℃で新しいクローンを増殖させることによって、温度感受性λＲｅｄプラスミドを除去し得る。
【０１２７】
このΔｔｏｌＲ変異体におけるＴｏｌＲ発現の欠如を確認し、そしてもとの野生型単離物と比較し、増殖の間、培地へより多くのブレブが放出されることが確認された。
【０１２８】
ｇａｌＵ遺伝子も、同様の方法で欠失させて、ΔｇａｌＵ単一変異体およびΔｔｏｌＲΔｇａｌＵ二重変異体を生じた。変異体によって放出されるブレブは、Ｏ抗原を欠く欠損ＬＰＳを有することが確認される。
【０１２９】
修飾ＬＰＳを有するΔｔｏｌＲΔｍｓｂＢ二重変異体株を、同じ方法で調製する。
【０１３０】
有毒性プラスミドも、ΔｔｏｌＲおよびΔｔｏｌＲΔｍｓｂＢ株から除去した。
【０１３１】
Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉの変異体の調製
Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉのｔｏｌＲ遺伝子を、上記でＳ．ｓｏｎｎｅｉに関して記載したように、λＲｅｄシステムを用いて欠失させた。Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉのＯ抗原生合成を、完全なｒｆｂＧ遺伝子ならびにｒｆｂＦおよびｒｆｃの一部を含む染色体断片の欠失によって破壊し、このことは、３つの遺伝子全ての活性化を引き起こす。その欠失を、λＲｅｄシステムを用いて産生し、そしてΔｒｆｂＧと省略される。
【０１３２】
ΔｔｏｌＲΔｒｆｂＧ二重変異体を、同じ方法で産生した。
【０１３３】
修飾ＬＰＳを含むΔｔｏｌＲΔｈｔｒＢ二重変異体を、同じ方法で産生した。
【０１３４】
有毒性プラスミドも、これらの株から除去した。
【０１３５】
ブレブの精製
二重変異体ΔｔｏｌＲΔｇａｌＵ株の発酵を、以下の条件下で行った：ｐＨ７．１、３７℃、撹拌を調節し、そして通気を最大に設定することによって溶存酸素を３０％飽和に維持。ｐＨを、４Ｍの水酸化アンモニウムを加えることによって調節した。泡を、実施の間に１０％のＰＰＧを加えることによって調節した。培地は以下の成分からなっていた：ＫＨ２ＰＯ４ ５ｇ／ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ ２０ｇ／ｌ、および酵母抽出物３０ｇ／ｌ。オートクレーブによって培地を滅菌した後、グリセロール １５ｇ／ｌおよびＭｇＳＯ４ ２ｍＭを、接種の前に加えた。培養接種材料は、発酵槽容量の５％であった。その発酵プロセスは約１３時間かかり、そして細胞濃度を６００ｎｍにおける光学密度として測定した。
【０１３６】
Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ ΔｔｏｌＲΔｍｓｂＢ二重変異体株の発酵プロセスを、規定の培地で行った：グリセロール ３０ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ １３．３ｇ／ｌ、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４ ４ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（１Ｍ） ２ｍｌ、クエン酸１．７ｇ／ｌ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ２．５ｍｇ／ｌ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ １５ｍｇ／ｌ、ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ １．５ｍｇ／ｌ、Ｈ３ＢＯ３ ３ｍｇ／ｌ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ２．５ｍｇ／ｌ、Ｚｎ（ＣＨ３ＣＯＯ）２・２Ｈ２Ｏ １３ｍｇ／ｌ、クエン酸第二鉄２μＭ、チアミン ５０ｍｇ／ｌ、ニコチン酸１０ｍｇ／ｌ、Ｌ−アスパラギン酸２．５ｇ／ｌ。
【０１３７】
発酵ブロスにおいて産生した小胞を、２つの連続的なＴＦＦ（タンジェンシャルフローろ過）工程：０．２２μｍにおけるマイクロろ過（ｍｉｃｒｏ−ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）および次いで０．１μｍにおける２番目のマイクロろ過を用いて精製した。最初のろ過工程中に、孔径０．２２μｍのカセットを通したＴＦＦによって、小胞をバイオマスから分離した。そのバイオマスを最初に４倍に濃縮し、ＰＢＳに対する５回のダイアフィルトレーション工程の後に、その小胞をろ液中で収集した。２番目のろ過工程において、小胞を可溶性タンパク質から精製するために、０．２２μｍＴＦＦからのろ液を、さらに０．１μｍカットオフカセットを通してマイクロろ過した。その小胞はフィルターカセットを通過できなかった。５回のダイアフィルトレーション工程後、小胞を含む保持物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を収集した。
【０１３８】
最終的な精製産物を、ＴＥＭで観察した（図１）。ブレブは、直径約５０ｎｍの均一なサイズを有する。
【０１３９】
Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ変異体由来のブレブを、Ｓ．ｓｏｎｎｅｉΔｔｏｌＲΔｇａｌＵに関して使用したのと同じ方法で、酵母抽出培地中で様々な株を増殖させた後、精製した。
【０１４０】
ブレブの特徴付け
プロテオミクスアプローチは、そのブレブが本質的に純粋な外膜であることを確認した。外膜の破壊によって得られる従来の外膜小胞（ＯＭＶ）と異なり、そのブレブは親油性タンパク質を保存し、そして本質的に細胞質および内膜成分を含まない。
【０１４１】
Ｓ．ｓｏｎｎｅｉおよびＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来のブレブを、界面活性剤で変性させ、そしてタンパク質をＬＣ−ＭＳ／ＭＳアプローチで同定した。あるいは、ブレブをＳＤＳｐａｇｅまたは２Ｄゲル電気泳動によって分離した（図２）。目に見えるバンドおよびスポットをゲルから切り取り、そしてタンパク質マスフィンガープリントによってタンパク質を同定した。異なるタンパク質の相対的な量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのバンドまたは２Ｄゲルのスポットの濃度計分析によって研究した。
【０１４２】
図３は、野生型ＳｈｉｇｅｌｌａおよびＥ．ｃｏｌｉ（全ての株はΔｔｏｌＲバックグラウンドである）と比較した、ΔｇａｌＵ変異体株のＬＰＳ移動度のシフトを示す。
【０１４３】
表面の消化に基づく、２番目のプロテオミクスアプローチを使用して、膜タンパク質の露出した部分を特徴付けした。タンパク質のセットは、ブレブで免疫化したマウス由来の血清と反応性であると同定され、そしてこれらの多くは、株の大きなパネルにおいて保存されていることが見出された。大部分の内在性外膜タンパク質の構造については、ほとんど何も知られていない。ブレブのサーフォーム（ｓｕｒｆｏｍｅ）を、プロテアーゼによる処理および放出されたペプチドのＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる回収および同定によって調査した。ブレブは生の細菌細胞全体の表面を示すはずであるため、このマップはＳ．ｓｏｎｎｅｉの表面の露出タンパク質を表すはずである。
【０１４４】
これらおよび他のアプローチによって、表１に列挙した１２９個のタンパク質がブレブにおいて見られた。
【０１４５】
ブレブ免疫原性
ΔｔｏｌＲΔｇａｌＵ株由来のブレブで免疫化したマウスは、図４で示すように、ブレブの２Ｄゲルと反応する血清を産生する。従ってそのブレブは免疫原性である。
【０１４６】
アジュバント（水酸化アルミニウムまたはフロイント完全）有りまたは無しで、２μｇまたは１０μｇのＳ．ｓｏｎｎｅｉΔｔｏｌＲΔｇａｌＵブレブ（全タンパク質として測定）をマウスに投与した。免疫化研究から得られた血清におけるＩｇＧの産生を分析するために、伝統的なＥＬＩＳＡ法を行った。全ての群のマウス由来の血清は、ブレブ特異的ＩｇＧの高レベルの産生を示した。ブレブを単独で、またはアジュバントと組み合わせて使用した場合に、ＩｇＧ産生に有意な差は検出されなかった。２μｇの低用量で免疫化した群は、１０μｇで免疫化した群と同じレベルのブレブ特異的ＩｇＧを示し、このことは、低用量ワクチンが達成可能であり得ることを示す（すなわち１ドルあたりより多くの投与）。他のＳ．ＳｏｎｎｅｉおよびＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ株由来のブレブが、同様に免疫原性であった。
【０１４７】
ブレブに対して産生した血清を、３つの異なる細菌：Ｓ．ｓｏｎｎｅｉＧ５３、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ ２ａ ２４５７Ｔ、またはＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ ５ Ｍ９０Ｔとの反応性に関して試験した。次いでサンプルを標識した二次Ａｂで染色し、そしてフローサイトメトリーによって分析した。図７で示すように、Ｓ．ｓｏｎｎｅｉおよびＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ株は、上記血清と交差反応する。
【０１４８】
従って、ブレブアプローチは、有効かつ低コストのワクチンを産生する強い可能性を有し、そして広域スペクトルのワクチンへ向けて、様々なＳｈｉｇｅｌｌａ株へと拡張し得る。
【０１４９】
ブレブの吸着
ブレブを、吸着のために水酸化アルミニウム（２ｍｇ／ｍｌ）と組み合わせた。吸着した物質を、４℃で１日、１週間、または１ヶ月間保存した。ブレブは１日後完全に吸着され、そして１ヶ月後でも脱着の証拠は存在しなかった（図６）。
【０１５０】
鉄制限増殖
図５は、様々な条件下で増殖したＳｈｉｇｅｌｌａによって発現されるタンパク質を示す。レーン４において、細菌を２００μＭのＦｅＳＯ４の存在下で増殖させ、一方レーン５においてその培養は２００μＭのジピリジルを有していた。挿入図は、鉄制限条件下で３つのタンパク質がアップレギュレートされることを示す。これらの３つのタンパク質は、ＦｅｐＡ外膜受容体（ＧＩ７４３１１１１８）、コリシンＩ受容体（ＧＩ７４３１２６７７）、および推定鉄シデロホア受容体（ＧＩ７４３１３９７２）と同定された。これらのタンパク質は、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．およびｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ内でよく保存されており、そして潜在的に高度に免疫原性である。従って鉄制限条件下でＳｈｉｇｅｌｌａを増殖させることは、通常の増殖条件と比較して、これらのタンパク質が濃縮されたブレブの放出を引き起こし得る。
【０１５１】
本発明は、単なる例とし記載され、そして本発明の範囲および精神に留まりながら修飾を行い得ることが理解される。
【０１５２】
【表１−１】
【０１５３】
【表１−２】
【０１５４】
【表１−３】
【０１５５】
【表１−４】
配列番号７０、７１、７３、７４、７６、１１１、１１２、１１４−１２９および１３１−１３５は、Ｓ．ｓｏｎｎｅｉΔｔｏｌＲブレブから同定された。配列番号８−１５および１７−５８は、Ｓ．ｓｏｎｎｅｉΔｔｏｌＲΔｇａｌＵブレブから同定された。配列番号８３、９４、９７、および１０７は、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉΔｔｏｌＲブレブから同定された。配列番号６８、６９、７２、７５、７７−８２、８４−９３、９５、９６、９８−１０６、１０８−１０、１１３、１３０、および１３６は、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉΔｔｏｌＲΔｒｆｂＧブレブから同定された。配列番号６０−６７は、Ｓ．ｓｏｎｎｅｉの表面消化から同定された。
【０１５６】
サブセット１：配列番号６８、６９、７２、７５、７７−１１０、１１３、１３０および１３６
サブセット２：配列番号８−１５、１７−５８、６０−６７、７０、７１、７３、７４、７６、１１１、１１２、１１４−１２９および１３１−１３５
サブセット３：配列番号１−６０
ＮＢ：配列番号１８は、配列番号５と同一である；配列番号３３は、配列番号２と同一である；配列番号９および１６は関連している（約９７％の同一性）；配列番号２３および５９は関連している（約９８％の同一性）。
【０１５７】
【数１】
【０１５８】
【数２】
【０１５９】
【数３】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、Ｓｈｉｇｅｌｌａ種に対する免疫の分野内にある。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
Ｓｈｉｇｅｌｌａは、グラム陰性非運動性通性嫌気性バチルスであり、４つの血清群：Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓ．ｂｏｙｄｉｉ、およびＳ．ｓｏｎｎｅｉに分類される。それらは細菌性赤痢（ｓｈｉｇｅｌｌｏｓｉｓ）（細菌性赤痢（ｂａｃｉｌｌａｒｙ ｄｙｓｅｎｔｅｒｙ））を引き起こす。
【０００３】
臨床的細菌性赤痢の特徴は、発熱、吐き気、食欲不振、脱水症、粘液膿性および出血性下痢、ならびにテネスムスを伴う急性直腸結腸炎である。Ｓｈｉｇｅｌｌａによる赤痢は、風土性であり、そして発展途上国において数百万の病気エピソードを引き起こす。例えば、１年あたり１億６５００万例のＳｈｉｇｅｌｌａ下痢が存在すると推定され、そのうちの９９％は発展途上国で起こり、そして６９％は５歳未満の小児で起こる。細菌性赤痢の罹患率および死亡率は、発展途上国の小児において特に高い。
【０００４】
Ｓｈｉｇｅｌｌａワクチンに対する既存のアプローチは、非特許文献１（参考文献１）において概説され、これは経口免疫化のための生の弱毒化株、注射のための結合型Ｏ糖、鼻腔内使用のためのプロテオソーム（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ＬＰＳが結合した髄膜炎菌外膜小胞）、鼻腔内使用のためのｉｎｖａｐｌｅｘ（ＩｐａＢ、ＩｐａＣおよびＬＰＳを含む、Ｓｈｉｇｅｌｌａの細胞内抽出物）、および無毒化ＬＰＳを含むｍｓｂＢ−ｖｅから調製した核タンパク質−リボソーム複合体に基づく。これらのワクチンのうちのいくつかは実地試験において有効であったが、複数のＳｈｉｇｅｌｌａ血清型に対して保護するものはなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｋｗｅｏｎ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．（２００８）２１（３）：３１３−８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
Ｓｈｉｇｅｌｌａワクチンの調製において、特に複数の血清型に対して保護し得るワクチンの調製において有用な、さらなる改善された成分を提供することが、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の開示
Ｓｈｉｇｅｌｌａは、細胞エンベロープの膨圧（ｔｕｒｇｏｕｒ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）のために、増殖の間、外膜ブレブを自然に放出する。参考文献２において開示されるように、ブレブの放出は、細菌のエンベロープ構造に高度に依存する。本発明者らは、エンベロープ構造を乱すために、Ｔｏｌ−Ｐａｌシステムが破壊されたＳｈｉｇｅｌｌａの変異株を用いた。正常な増殖の間に、これらの変異株は、大量のブレブ（これは、免疫原性の外膜タンパク質が豊富である）をその培地に放出する。従ってこれらのブレブを免疫原として使用し得る。
【０００８】
従って、本発明は、ＴｏｌＡ、ＴｏｌＢ、ＴｏｌＱ、ＴｏｌＲ、およびＰａｌタンパク質のうちの４つ以下を発現する、Ｓｈｉｇｅｌｌａ細菌を提供する。従って、天然の５つのタンパク質のＴｏｌ−Ｐａｌシステムから、少なくとも１つのタンパク質が欠けており、これにより、培地中での増殖の間に、５つのＴｏｌ−Ｐａｌタンパク質を全て発現する同じ細菌より、より多くの量の外膜ブレブを培地に放出する細菌を生じる。ＴｏｌＲは発現されないが、他の４つのタンパク質は発現され得ることが好ましい。
【０００９】
本発明はまた、ＴｏｌＲタンパク質を発現しないＳｈｉｇｅｌｌａ細菌を提供する。本発明はまた、ΔｔｏｌＲΔｇａｌＵ株のような、ＳｈｉｇｅｌｌａのΔｔｏｌＲ株を提供する。
【００１０】
本発明はまた、ＴｏｌＡ、ＴｏｌＢ、ＴｏｌＱ、ＴｏｌＲ、およびＰａｌタンパク質を発現するＳｈｉｇｅｌｌａ細菌を提供し、ここでそのＴｏｌＡ、ＴｏｌＱ、ＴｏｌＲ、および／またはＰａｌタンパク質は、（ａ）細菌の内膜または外膜に位置し、ならびに（ｂ）１つまたはそれ以上のアミノ酸配列変異を含み、そのため、培地中で増殖する場合に、当該変異を含まない同じ細菌と比較して、その細菌はより多い量の外膜ブレブを放出する。
【００１１】
本発明はまた、そのＴｏｌ−Ｐａｌシステムの１つまたはそれ以上の成分が修飾を有するＳｈｉｇｅｌｌａ細菌であって、修飾のため、培地中での増殖の間、その修飾を欠いている同じ細菌よりも、培地中により多くの量の外膜ブレブを放出し、ならびに（ｉ）天然のＳｈｉｇｅｌｌａリポ多糖および／または（ｉｉ）Ｓｈｉｇｅｌｌａ腸毒素を発現しない、Ｓｈｉｇｅｌｌａ細菌を提供する。
【００１２】
本発明はまた、培地中で増殖した場合に、細菌が開始細菌より多くの量の外膜ブレブを培地中へ放出するように、開始細菌Ｔｏｌ−Ｐａｌシステムの１つまたはそれ以上の成分をコードする遺伝子を修飾する工程を含む、過剰ブレブ形成（ｈｙｐｅｒｂｌｅｂｂｉｎｇ）Ｓｈｉｇｅｌｌａ細菌を調製する方法を提供し、そしてここでその修飾は、開始細菌のｔｏｌＡ、ｔｏｌＢ、ｔｏｌＱ、ｔｏｌＲ、および／またはｐａｌ遺伝子の１つまたはそれ以上を変異させることを含む。その変異工程は、遺伝子を欠失させ得る。その方法はまた、細菌のリポ多糖または腸毒素の合成に必要なタンパク質をコードする遺伝子の修飾を含み得る。
【００１３】
本発明はまた、本発明の細菌から単離されたか、またはそれから得ることができるブレブを提供する。これらのブレブは、Ｓｈｉｇｅｌｌａワクチンの成分として有用である。
【００１４】
本発明はまた、細菌によるブレブの培地への放出を可能にする条件下で増殖させた、本発明の細菌を含む培地からブレブを分離する工程を含む、Ｓｈｉｇｅｌｌａブレブを調製するためのプロセスを提供する。このプロセスによって調製されたブレブを、Ｓｈｉｇｅｌｌａワクチンの成分として使用し得る。
【００１５】
本発明はまた、細菌によるブレブの培地への放出を可能にする条件下で増殖させた、本発明の細菌を含む培地を提供する。ブレブを、この培地から精製し得る。
【００１６】
本発明はまた、本発明の細菌の培養の間に、培地へ放出されるブレブを含む組成物を提供する。この組成物は、任意の生の細菌および／または細菌全体も含まない。この組成物および／またはその成分を、Ｓｈｉｇｅｌｌａワクチン調製のために使用し得る。
【００１７】
本発明はまた、ブレブを含む組成物を提供し、ここでそのブレブは、本発明の細菌を増殖させた培地の、０．２２μｍのフィルターを通したろ過後に得ることができるろ液に存在する。この組成物および／またはその成分を、Ｓｈｉｇｅｌｌａワクチン調製のために使用し得る。
【００１８】
本発明はまた、１つまたはそれ以上（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０）の、（ａ）配列番号８から６７から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質；（ｂ）配列番号８から６７の１つと少なくともｊ％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ／または配列番号８から６７のいずれか１つの少なくともｎ個の連続的なアミノ酸の断片を含むタンパク質、を含む、Ｓｈｉｇｅｌｌａブレブを提供し、ここでｊは５０またはそれ以上（例えば６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９）、ｎは７またはそれ以上（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である。好ましい断片は、配列番号８から６７の１つ由来のエピトープを含む。他の好ましい断片は、配列番号の少なくとも１つのエピトープを保持しながら、配列番号のＣ末端から１つまたはそれ以上（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、またはそれ以上）のアミノ酸、および／またはＮ末端から１つまたはそれ以上（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、またはそれ以上）のアミノ酸を欠く。他の断片は、１つまたはそれ以上のタンパク質ドメインを省略し、例えばシグナルペプチド等を欠く。
【００１９】
６０個のタンパク質が、本発明のブレブ内に存在すること、ならびにブレブに対して調製した血清と免疫反応性であることが確認された。従って個々のタンパク質を、ブレブと分離した、精製形態で免疫原性の成分として使用し得る。従って、本発明はまた、（ａ）１つまたはそれ以上（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０）のアミノ酸配列配列番号８から６７を含むブレブタンパク質；（ｂ）配列番号８から６７の１つと少なくともｊ％の同一性を有し、かつ／または配列番号８から６７のいずれか１つの少なくともｎ個の連続的なアミノ酸の断片を含むアミノ酸配列を含むブレブタンパク質、を含む、ブレブを含まない免疫原性組成物を提供し、ここでｊは５０またはそれ以上（例えば６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９）、ｎは７またはそれ以上（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である。好ましい断片は、配列番号８から６７の１つ由来のエピトープを含み、そしてより好ましい断片は、免疫原性の断片である。他の好ましい断片は、配列番号の少なくとも１つのエピトープを保持しながら、配列番号のＣ末端から１つまたはそれ以上のアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、またはそれ以上）、および／またはＮ末端から１つまたはそれ以上のアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、またはそれ以上）を欠く。他の断片は、１つまたはそれ以上のタンパク質ドメインを省略し、例えば膜貫通ドメイン、シグナルペプチド等を欠く。
【００２０】
本発明はまた、１つまたはそれ以上（すなわち１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、または１２９）の、（ａ）配列番号８から１３６から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質；（ｂ）配列番号８から１３６の１つと少なくともｊ％の同一性を有し、かつ／または配列番号８から１３６のいずれか１つの少なくともｎ個の連続的なアミノ酸の断片を含むアミノ酸配列を含むタンパク質、を含む、Ｓｈｉｇｅｌｌａブレブを提供し、ここでｊは５０またはそれ以上（例えば６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９）、ｎは７またはそれ以上（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である。好ましい断片は、配列番号８から１３６の１つ由来のエピトープを含む。他の好ましい断片は、配列番号の少なくとも１つのエピトープを保持しながら、配列番号のＣ末端から１つまたはそれ以上のアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、またはそれ以上）、および／またはＮ末端から１つまたはそれ以上のアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、またはそれ以上）を欠く。他の断片は、１つまたはそれ以上のタンパク質ドメインを省略し、例えばシグナルペプチド等を欠く。
【００２１】
１２９個のタンパク質が、本発明のブレブ内に存在すること、ならびにブレブに対して調製した血清と免疫反応性であることが確認された。従って個々のタンパク質を、ブレブと分離した、精製形態で免疫原性の成分として使用し得る。従って、本発明はまた、（ａ）１つまたはそれ以上（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、または１２９）のアミノ酸配列配列番号８から１３６を含むブレブタンパク質；（ｂ）配列番号８から１３６の１つと少なくともｊ％の同一性を有し、かつ／または配列番号８から１３６のいずれか１つの少なくともｎ個の連続的なアミノ酸の断片を含むアミノ酸配列を含むブレブタンパク質、を含む、ブレブを含まない免疫原性組成物を提供し、ここでｊは５０またはそれ以上（例えば６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９）、ｎは７またはそれ以上（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である。好ましい断片は、配列番号８から１３６の１つ由来のエピトープを含み、そしてより好ましい断片は、免疫原性の断片である。他の好ましい断片は、配列番号の少なくとも１つのエピトープを保持しながら、配列番号のＣ末端から１つまたはそれ以上のアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、またはそれ以上）、および／またはＮ末端から１つまたはそれ以上のアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、またはそれ以上）を欠く。他の断片は、１つまたはそれ以上のタンパク質ドメインを省略し、例えば膜貫通ドメイン、シグナルペプチド等を欠く。
【００２２】
配列番号８から１３６のうちの、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉに関して好ましいサブセットは、表１の下の「サブセット１」に列挙される配列番号である。配列番号８から１３６のうちの、Ｓ．ｓｏｎｎｅｉに関して好ましいサブセットは、表１の下の「サブセット２」に列挙される配列番号である。
【００２３】
Ｔｏｌ−Ｐａｌシステム
多くのグラム陰性細菌と同様、Ｓｈｉｇｅｌｌａは、天然でＴｏｌ−Ｐａｌシステムを有し、それはＴｏｌＡ、ＴｏｌＢ、ＴｏｌＱ、ＴｏｌＲ、およびＰａｌタンパク質からなる。本発明によって、天然のＴｏｌ−Ｐａｌシステムを破壊し、それによって細菌の複製の間に、細菌がより多量の外膜ブレブを培地へ放出することを引き起こす。様々な破壊を行い得る。
【００２４】
いくつかの実施態様において、５つのＴｏｌ−Ｐａｌタンパク質のうちの少なくとも１つを、例えばそのタンパク質をコードする遺伝子の欠失または不活性化によって除去する。従って、その細菌はＴｏｌＡ、ＴｏｌＢ、ＴｏｌＱ、ＴｏｌＲ、およびＰａｌタンパク質の０、１、２、３、または４個を発現し得る。５つのタンパク質のうちの１つの除去で十分であり得、その場合その細菌はこれらのタンパク質の４個のみを発現する。好ましくは、ＴｏｌＲタンパク質を、例えば開始株のｔｏｌＲ遺伝子を不活性化することによって除去する。従って、その細菌はｔｏｌＡ＋ｔｏｌＢ＋ｔｏｌＱ＋ｔｏｌＲ−Ｐａｌ＋であり得る。
【００２５】
いくつかの実施態様において、その細菌は、５個のＴｏｌ−Ｐａｌタンパク質を全て発現するが、少なくとも１つが、過剰ブレブ形成を引き起こすように変異している。例えば、ＴｏｌＡ、ＴｏｌＱ、ＴｏｌＲ、および／またはＰａｌタンパク質を、そのタンパク質のその膜局在を保持しながら、Ｔｏｌ−Ｐａｌシステムの他のメンバーとの相互作用が破壊されるように変異させ得る。従ってその細菌は、ＴｏｌＡ、ＴｏｌＱ、およびＴｏｌＲを内膜の膜貫通タンパク質として、およびＰａｌタンパク質を外膜のペリプラズムに面するリポタンパク質として保持するが、ＴｏｌＡ、ＴｏｌＱ、ＴｏｌＲ、および／またはＰａｌタンパク質の少なくとも１つが変異している。
【００２６】
ＴｏｌＡ、ＴｏｌＢ、ＴｏｌＱ、ＴｏｌＲ、およびＰａｌタンパク質の野生型Ｓｈｉｇｅｌｌａアミノ酸配列の例を、配列番号１から５として配列表において提供する。
【００２７】
Ｓｈｉｇｅｌｌａ細菌
本発明を、血清群Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓ．ｂｏｙｄｉｉおよびＳ．ｓｏｎｎｅｉのいずれかと使用し得る。
【００２８】
破壊されたＴｏｌ−Ｐａｌシステムを有する（このことは、細菌が、細菌複製の間により多量の外膜ブレブをその培地に放出することを引き起こす）ことに加えて、本発明のＳｈｉｇｅｌｌａは、野生型株と比較して、１つまたはそれ以上のさらなる変化を有利に含み得る。これらの変化を、特にヒトワクチンにおいて毒性または望ましくない成分を細菌から除去するために使用し得る。
【００２９】
例えば、細菌は天然のＳｈｉｇｅｌｌａリポ多糖（ＬＰＳ）を発現せず、これにより、内毒素の活性が低減し得る。天然のＬＰＳの合成を妨げるために様々な修飾を行うことができ、そしてこれらは天然のリピドＡ構造、オリゴ糖コア、または外側Ｏ抗原を破壊し得る。例えば、参考文献３は、ｒｆｅおよびｇａｌＵ遺伝子の不活性化によって引き起こされるＬＰＳ変異体を報告し、そして参考文献４は、ｙｉｈＥ、ｇａｌＥ、ｇａｌＫ、ｇａｌＭ、およびｇａｌＴの不活性化によって引き起こされるＬＰＳ変異体を報告する。同様に、参考文献５は、ｒｆｃ、ｒｆａＬ、またはｇａｌＵの変異による欠損ＬＰＳを報告する。参考文献６は、リピドＡのアシル化を低減する、ｍｓｂＢ１およびｍｓｂＢ２の不活性化によって引き起こされるＬＰＳ変異体を報告する。本明細書中で示されるように、リピドＡのアシル化が低減した別のＬＰＳ変異体を、ｈｔｒＢの不活性化によって産生し得る［７、８］。
【００３０】
ＬＰＳにおけるＯ抗原の欠如が好ましく、それによって血清型特異的反応を回避する。Ｓ．ｓｏｎｎｅｉにおいて、有毒性プラスミドが除去される場合にＯ抗原が欠如する（下記を参照のこと）。ｇａｌＵ遺伝子はウリジンジホスホグルコース（ＵＤＰ−グルコース）ピロホスホリラーゼをコードし、そしてその不活性化は、Ｏ抗原が結合していないＬＰＳの合成を引き起こす。ｇａｌＵの不活性化は、ウリジンジホスホグルコースピロホスホリラーゼ活性を有さないＳｈｉｇｅｌｌａを提供するために有用である。ｒｆｂＦおよび／またはｒｆｂＧ遺伝子の不活性化を、ラムノシルトランスフェラーゼ活性を有さないＳｈｉｇｅｌｌａを提供するために使用し得る。ｒｆｃの不活性化を、Ｏ抗原ポリメラーゼ活性を有さないＳｈｉｇｅｌｌａを提供するために使用し得る。ｒｆｂＦ、ｒｆｂＧおよびｒｆｃの３つ全ての不活性化は、有用な株を提供し得る。
【００３１】
ＬＰＳにおけるヘキサアシル化リピドＡの欠如が好ましい。有毒性プラスミドの喪失（下記を参照のこと）は、自動的にｍｓｂＢ２遺伝子の喪失を引き起こし、そして染色体ｍｓｂＢ１遺伝子を不活性化し得、それによってミリストイルトランスフェラーゼ活性を除去し、そしてＬＰＳにおけるペンタアシル化リピドＡを提供する。ＨｔｒＢラウロイルトランスフェラーゼの不活性化は、主にテトラアシル化リピドＡを有するＳｈｉｇｅｌｌａを提供し得る。好ましい株は、ペンタまたはテトラアシル化ＬＰＳを有する。
【００３２】
好ましい株は、ｇａｌＵおよびｍｓｂＢ１がどちらも不活性化され、そしてまた有毒性プラスミドを欠き、それによってそのＬＰＳがペンタアシル化され、結合したＯ抗原を欠く株を提供する。
【００３３】
いくつかの有用な株は、結合したＯ抗原を含む、ペンタまたはテトラアシル化ＬＰＳを有する。しかし、より一般的には、好ましい株は、結合したＯ抗原を欠くペンタまたはテトラアシル化ＬＰＳを有する。ｔｏｌＲ、ｒｆｂＧおよびｈｔｒＢノックアウト（および、任意でｒｆｂＦおよび／またはｒｆｃ不活性化）を有するＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ株が有用である。有用なＳ．ｓｏｎｎｅｉ株は、ｔｏｌＲ変異を有し、そして有毒性プラスミドを欠く。
【００３４】
細菌は、腸毒素を発現しない場合がある。例えば、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ株（特に２ａ株）は、Ｓｈｉｇｅｌｌａエンテロトキシン１（ＳｈＥＴ−１）のサブユニットの全てを発現しない場合があり、例えばｓｅｔ１Ａおよび／またはｓｅｔ１Ｂ遺伝子が不活性化され得る。Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ株は、Ｓｈｉｇａ毒素の両方のサブユニットを発現しない場合があり、例えばｓｔｘＡおよび／またはｓｔｘＢ遺伝子の１つまたは両方が不活性化され得る。Ｓｈｉｇｅｌｌａ、特にＳ．ｓｏｎｎｅｉまたはＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉは、エンテロトキシン２（ＳｈＥＴ−２）を発現しない場合があり、例えばｏｓｐＤ３遺伝子が不活性化され得、または有毒性プラスミドが欠如し得る。好ましい株は、ＳｈＥＴ−１、ＳｈＥＴ−２、およびＳｈｉｇａ毒素をどれもコードしない。
【００３５】
本発明のＳｈｉｇｅｌｌａ細菌を、従来の変異生成技術を用いて、野生型または他の開始株から簡便に調製し得る（例えば参考文献９から１１を参照のこと）。ラムダレッド組換えシステムが、Ｓｈｉｇｅｌｌａで特に有用である。遺伝子の不活性化を、様々な方法で、例えばそのプロモーターの欠失または変異、その開始コドンの欠失または変異、時期尚早でのストップコドンの導入、完全なコード領域の欠失、ノックアウト等によって、達成し得る。同系ノックアウト変異体が好ましい。結果としてできたＳｈｉｇｅｌｌａ細菌において、所望の遺伝子をコードするｍＲＮＡが欠如しており、および／またはその翻訳が阻害されている（例えば野生型レベルの１％未満まで）。
【００３６】
本発明のＳｈｉｇｅｌｌａ細菌は、不活性化された遺伝子の代わりに、マーカー遺伝子、例えば抗生物質耐性マーカーを含み得る。相同的組換えを用いてこれを達成し得る。しかし好ましくは、マーカー無しでの（ｕｎｍａｒｋｅｄ）欠失（すなわち、マーカー遺伝子の導入無しの欠失）を使用する。
【００３７】
有毒性Ｓｈｉｇｅｌｌａ株は、有毒性性質を媒介する、２２０ｋｂのプラスミドを有する。この「有毒性プラスミド」は、標的上皮細胞のためのアドヘシン、侵入プラスミド抗原、ｖｉｒＦ、ｖｉｒＧ等を含む、Ｓｈｉｇｅｌｌａ有毒性のいくつかの局面に関する遺伝子をコードすることが示された。本発明のＳｈｉｇｅｌｌａは、有毒性プラスミドを有し得るが、有毒性プラスミドを有さないことが好ましい。そのプラスミドの欠如は、工業的な培養の間、その株を安定化し得、有毒性因子を除去することによってその株を弱毒化し得（それによって製造の安全性が増す）、リポ多糖を破壊し得（Ｓ．ｓｏｎｎｅｉにおいてＯ抗原の生合成遺伝子は、プラスミド上にある）、ＳｈＥＴ−２エンテロトキシンの存在を回避し得（プラスミドのｏｓｐＤ３またはｓｅｎ遺伝子によってコードされる）、およびｍｓｂＢ２（リピドＡのアシル化に関与するｍｓｂＢ遺伝子の２番目のコピーである）の存在を回避し得る。
【００３８】
本発明のＳｈｉｇｅｌｌａは、１つまたはそれ以上の異種タンパク質、例えば天然にはＳｈｉｇｅｌｌａにおいて見出されないタンパク質を発現し得る。その異種タンパク質が外膜タンパク質ならば、上記株からのブレブを、非Ｓｈｉｇｅｌｌａ抗原を免疫系に提示するための送達システムとして使用し得る。
【００３９】
Ｓｈｉｇｅｌｌａを増殖させるための培養条件は、当該分野で周知であり、例えば参考文献１２から１４を参照のこと。例えば、それらを、有機窒素源（例えばＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐを含むアミノ酸混合物など；カザミノ酸を使用し得る）、炭素源としてグリセロールを使用する等して、増殖させ得る。培地中にＬ−アスパラギン酸を含むことが特に有用であり、これは、窒素源および炭素源の両方として機能し得る。
【００４０】
本発明のＳｈｉｇｅｌｌａを鉄制限条件下で有利に増殖させ得る。これは、鉄制限条件が、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．において免疫原性であり、そして高度に保存されている鉄調節タンパク質をアップレギュレートすることが示されたためである。例えば、その細菌を、デスフェラールまたは２，２’−ジピリジルまたは８−ヒドロキシキノリンのような化合物の存在下で増殖させ得る。これらの条件下で、その細菌は、ＦｅｐＡ外膜受容体、コリシンＩ受容体（ＣｉｒＡ）、および／または鉄シデロホア受容体（ＦｈｕＡ）のようなタンパク質の発現を増加させ得る。
【００４１】
ブレブおよび過剰ブレブ形成
本発明のＳｈｉｇｅｌｌａ細菌は、その対応する野生型株と比較して、過剰にブレブを形成する。すなわち、それらは野生型株より多量のブレブを培地へ放出する。これらのブレブは、Ｓｈｉｇｅｌｌａワクチンの成分として有用である。
【００４２】
そのブレブは、典型的には電子顕微鏡によって３５−１２０ｎｍの直径、例えば５０ｎｍの直径を有する。
【００４３】
そのブレブは、細菌増殖の間に自然に放出され、そして培地から精製され得る。その精製は、理想的にはブレブを、生のおよび／またはインタクトなＳｈｉｇｅｌｌａ細菌から、例えば、ブレブは通過させるがインタクトな細菌は通過させない、０．２２μｍのフィルターのようなフィルターを用いたサイズに基づくろ過によって、またはブレブを懸濁物中に残しながら細胞をペレットにする低速遠心分離を用いることによって、分離することを含む。
【００４４】
従って、培地と異なり、本発明のブレブを含む組成物は一般的に、生きているか死んでいるにかかわらず、実質的に細菌全体を含まない。ブレブのサイズは、例えば典型的にろ過滅菌に使用されるようなろ過によって、それらを容易に細菌全体から分離し得ることを意味する。ブレブは標準的な０．２２μｍのフィルターを通過するが、これらは他の物質によって迅速に詰まることがあり、０．２２μｍのフィルターを使用する前に、一連の漸減孔径のフィルターを通した連続的なろ過滅菌の工程を行うことが有用であり得る。先行するフィルターの例は、０．８μｍ、０．４５μｍ等の孔径を有するものである。
【００４５】
自然に放出されたブレブの培地からの分離は、外膜小胞を形成させるための外膜の故意の破壊（例えば界面活性剤処理または超音波処理による）を含む方法よりも簡便である。さらに、それらは内膜および細胞質の混入を実質的に含まない。
【００４６】
本発明のブレブは、脂質およびタンパク質を含む。ブレブのタンパク質の内容物は分析されている。そのブレブは、表１に列挙し、そして下記で議論するタンパク質を含む。
【００４７】
Ｓｈｉｇｅｌｌａ外膜タンパク質
表１は、本発明のＳｈｉｇｅｌｌａブレブにおいて検出された１２９個のタンパク質のＧｅｎＢａｎｋ名およびＧＩ番号を列挙する。これらの１２７個のタンパク質を、ブレブから分離した精製形態で、免疫原性の成分として使用し得る。１２９個のうちの好ましいサブセットは、リストの最初の６０個である（「サブセット３」）。
【００４８】
ポリペプチドを、様々な手段で、例えば化学的合成（少なくとも部分的に）、プロテアーゼを用いて長いポリペプチドを消化すること、ＲＮＡからの翻訳、細胞培養物からの精製（例えば、組換え発現から、またはＳｈｉｇｅｌｌａ培養物から）等によって調製し得る。Ｅ．ｃｏｌｉ宿主における異種性の発現が、好ましい発現経路である。
【００４９】
本発明のポリペプチドを、固体支持体に結合または固定化し得る。本発明のポリペプチドは、検出可能な標識、例えば放射性標識、蛍光標識、またはビオチン標識を含み得る。これはイムノアッセイ技術において特に有用である。
【００５０】
ポリペプチドは、様々な形態（例えば天然、融合、グリコシル化、非グリコシル化、脂質付加、ジスルフィド架橋等）をとり得る。ポリペプチドは、好ましくはＳｈｉｇｅｌｌａポリペプチドである。
【００５１】
ポリペプチドを、好ましくは実質的に純粋な、または実質的に単離された（すなわち、実質的に他のＳｈｉｇｅｌｌａまたは宿主細胞ポリペプチドを含まない）形態で調製する。一般的に、そのポリペプチドは、天然に存在する環境ではない環境で提供され、例えばそれらは天然に存在する環境から分離される。ある実施態様において、対象ポリペプチドは、コントロールと比較して、そのポリペプチドが濃縮された組成物において存在する。そのように、精製されたポリペプチドが提供され、ここで「精製された」によって、そのポリペプチドが実質的に他の発現されたポリぺプチドを含まない組成物に存在することを意味し、ここで「実質的に含まない」によって、組成物の５０％未満、通常３０％未満、およびより通常には１０％未満が、他の発現したポリペプチドからなることを意味する。
【００５２】
「ポリペプチド」という用語は、あらゆる長さのアミノ酸ポリマーを指す。そのポリマーは直鎖状、または分岐であり得、それは修飾アミノ酸を含み得、そしてそれは非アミノ酸によって中断され得る。その用語はまた、天然に、または介入によって、例えばジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化、または標識成分との結合体化のような任意の他の操作もしくは修飾によって、修飾されたアミノ酸ポリマーを含む。例えば、１つまたはそれ以上のアミノ酸のアナログ（例えば非天然アミノ酸等を含む）、および当該分野で公知の他の修飾を含むポリペプチドも、その定義に含まれる。ポリペプチドは、１本鎖または結合した鎖として存在し得る。
【００５３】
薬学的組成物
本発明は、（ａ）本発明のブレブ、および（ｂ）薬学的に許容可能なキャリアを含む薬学的組成物を提供する。本発明はまた、本発明のブレブを薬学的に許容可能なキャリアと混合する工程を含む、そのような組成物を調製するためのプロセスを提供する。
【００５４】
本発明はまた、（ａ）上記で定義したブレブを含まない免疫原性組成物、および（ｂ）薬学的に許容可能なキャリアを含む薬学的組成物を提供する。
【００５５】
その免疫原性組成物は、薬学的に許容可能なキャリアを含み得、薬学的に許容可能なキャリアはそれ自体では、その組成物を投与される患者にとって有害な抗体の産生を誘発しないあらゆる物質であり得、そしてそれは過度な毒性無しに投与され得る。薬学的に許容可能なキャリアは、水、生理食塩水、グリセロールおよびエタノールのような液体を含み得る。湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝化物質等のような補助的な物質も、そのようなビヒクル中に存在し得る。適当なキャリアの十分な議論は、参考文献１５において得られる。
【００５６】
Ｓｈｉｇｅｌｌａ感染は、体の様々な領域に影響を与え得、従って本発明の組成物を、様々な形態で調製し得る。例えば、その組成物を、液体溶液または懸濁物のいずれかとして、注射剤として調製し得る。注射の前の、液体ビヒクルにおける溶液または懸濁物のために適当な固体形態も調製し得る。その組成物を、局所投与のために、例えば軟膏、クリーム、または粉末として調製し得る。その組成物を、経口投与のために、例えば錠剤またはカプセル、またはシロップ（任意で矯味矯臭された）として調製する。その組成物を、肺投与のために、例えば細かい粉末またはスプレーを用いた吸入剤として調製し得る。その組成物を、坐剤または膣坐剤として調製し得る。その組成物を、鼻腔内、耳内、または眼内投与のために、例えば滴剤として調製し得る。
【００５７】
その組成物は、好ましくは無菌である。それは好ましくは発熱物質を含まない。それは好ましくは、例えばｐＨ６からｐＨ８で、一般的にはｐＨ７の周辺で緩衝化される。本発明の組成物は、ヒトに関して等張であり得る。
【００５８】
免疫原性組成物は、免疫学的に有効な量の免疫原、および必要に応じてあらゆる他の指定された成分を含む。「免疫学的に有効な量」によって、単回投与または一連の投与の一部としての、その量の個体に対する投与が、処置または防止のために有効であることを意味する。この量は、処置する個体の健康および身体的状態、年齢、処置する個体の分類学的群（例えば非ヒト霊長類、霊長類等）、その個体の免疫系の抗体を合成する能力、望ましい保護の程度、ワクチンの処方、治療する医師の医学的状況の評価、および他の関連する因子に依存して変化する。その量は、日常的な試験によって決定し得る比較的広い範囲に入ることが予測される。
【００５９】
小胞ワクチン（例えば髄膜炎菌に対する）を用いた以前の研究は、ブレブを投与するための薬学的、薬量学的、および処方の指針を提供する。本発明の組成物中のブレブの濃度は、一般的に１０〜５００μｇ／ｍｌ、好ましくは２５〜２００μｇ／ｍｌ、そしてより好ましくは約５０μｇ／ｍｌまたは約１００μｇ／ｍｌ（ブレブ中の全タンパク質に関して表す）である。０．５ｍｌの投与容積が注射のために典型的である。
【００６０】
その組成物を、他の免疫調節性薬剤と組み合わせて投与し得る。
【００６１】
本発明の組成物中で（特にブレブを含まない組成物中で）使用し得るアジュバントは、以下のものを含むがこれに限らない。
【００６２】
Ａ．ミネラルを含む組成物
本発明においてアジュバントとして使用するために適当な、ミネラルを含む組成物は、アルミニウム塩およびカルシウム塩のようなミネラル塩を含む。本発明は、水酸化物（例えばオキシ水酸化物）、リン酸塩（例えばヒドロキシリン酸塩、オルトリン酸塩）、硫酸塩等のようなミネラル塩［例えば参考文献１９の第８および９章を参照のこと］、または異なるミネラル化合物の混合物を含み、その化合物はあらゆる適当な形態（例えばゲル、結晶性、非晶質等）を取り、および吸着が好ましい。そのミネラルを含む組成物はまた、ミネラル塩の粒子として処方され得る。
【００６３】
「水酸化アルミニウム」として公知のアジュバントは、典型的にはオキシ水酸化アルミニウム塩であり、それは通常少なくとも部分的に結晶性である。式ＡｌＯ（ＯＨ）によって表し得るオキシ水酸化アルミニウムは、赤外（ＩＲ）分光法によって、特に１０７０ｃｍ−１における吸収（ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ）バンド、および３０９０−３１００ｃｍ−１における強い肩部の存在によって、水酸化アルミニウムＡｌ（ＯＨ）３のような他のアルミニウム化合物から区別し得る［参考文献１９の第９章］。水酸化アルミニウムアジュバントの結晶化の程度は、半値における回折バンドの幅（ｗｉｄｔｈ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ ｂａｎｄ ａｔ ｈａｌｆ ｈｅｉｇｈｔ（ＷＨＨ））によって反映され、結晶性の低い粒子は、小さい結晶子サイズのために、大きな線の広がりを示す。表面積は、ＷＨＨが増加するにつれて増加し、そしてより高いＷＨＨ値を有するアジュバントが、抗原吸着のより高い能力を有することが示された。線維状の形態（例えば透過型電子顕微鏡写真において見られるような）は、水酸化アルミニウムアジュバントに典型的である。水酸化アルミニウムアジュバントのｐＩは、典型的には約１１であり、すなわちアジュバント自体が、生理学的ｐＨにおいて正の表面電荷を有する。水酸化アルミニウムアジュバントに関して、ｐＨ７．４におけるＡｌ＋＋＋１ｍｇあたり１．８−２．６ｍｇのタンパク質の吸着能力が報告された。
【００６４】
「リン酸アルミニウム」として公知のアジュバントは、典型的にはヒドロキシリン酸アルミニウムであり、多くの場合少量の硫酸塩も含む（すなわち、ヒドロキシリン酸アルミニウム硫酸塩）。それらを沈殿によって得ることができ、そしてその反応条件および沈殿の間の濃度は、塩におけるリン酸のヒドロキシルによる置換の程度に影響を与える。ヒドロキシリン酸塩は、一般的に０．３〜１．２のＰＯ４／Ａｌモル比を有する。ヒドロキシリン酸塩を、ヒドロキシル基の存在によって、厳密なＡｌＰＯ４から区別し得る。例えば、３１６４ｃｍ−１におけるＩＲスペクトルのバンド（例えば２００℃における）が、構造的ヒドロキシルの存在を示す［参考文献１９の第９章］。
【００６５】
リン酸アルミニウムアジュバントのＰＯ４／Ａｌ３＋モル比は、一般的に０．３〜１．２、好ましくは０．８〜１．２、そしてより好ましくは０．９５±０．１である。リン酸アルミニウムは、特にヒドロキシリン酸塩に関して、一般的に非晶質である。典型的なアジュバントは、０．８４〜０．９２のＰＯ４／Ａｌモル比を有する非晶質のヒドロキシリン酸アルミニウムであり、０．６ｍｇのＡｌ３＋／ｍｌで含まれる。リン酸アルミニウムは、一般的に粒子性である（例えば、透過型電子顕微鏡写真において見られるような、プレート様の形態）。その粒子の典型的な直径は、任意の抗原の吸着後、０．５−２０μｍの範囲（例えば約５−１０μｍ）である。リン酸アルミニウムアジュバントに関して、ｐＨ７．４においてＡｌ＋＋＋１ｍｇあたり０．７から１．５ｍｇのタンパク質の吸着能力が報告された。
【００６６】
リン酸アルミニウムのゼロ電荷点（ＰＺＣ）は、リン酸のヒドロキシルによる置換の程度と反比例し、そしてこの置換の程度は、反応条件および沈殿による塩の調製のために使用された反応物の濃度に依存して変化し得る。ＰＺＣはまた、溶液中の遊離リン酸イオンの濃度を変化させることによって（より多くのリン酸＝より酸性のＰＺＣ）、またはヒスチジン緩衝液のような緩衝液を加えることによって（ＰＺＣをより塩基性にする）、変化する。本発明によって使用されるリン酸アルミニウムは、一般的に４．０〜７．０、より好ましくは５．０〜６．５、例えば約５．７のＰＺＣを有する。
【００６７】
本発明の組成物を調製するために使用されたアルミニウム塩の懸濁物は、緩衝液（例えばリン酸またはヒスチジンまたはＴｒｉｓ緩衝液）を含み得るが、これは常に必要というわけではない。その懸濁物は、好ましくは無菌であり、そして発熱物質を含まない。懸濁物は、例えば１．０〜２０ｍＭ、好ましくは５〜１５ｍＭ、そしてより好ましくは約１０ｍＭの濃度で存在する、遊離水性リン酸イオンを含み得る。その懸濁物はまた、塩化ナトリウムを含み得る。
【００６８】
１つの実施態様において、アジュバント成分は、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムの両方の混合物を含む。この場合、例えば少なくとも２：１、例えば≧５：１、≧６：１、≧７：１、≧８：１、≧９：１等の重量比で、水酸化アルミニウムより多くのリン酸アルミニウムが存在し得る。
【００６９】
患者に投与するための組成物中のＡｌ＋＋＋の濃度は、好ましくは１０ｍｇ／ｍｌ未満、例えば≦５ｍｇ／ｍｌ、≦４ｍｇ／ｍｌ、≦３ｍｇ／ｍｌ、≦２ｍｇ／ｍｌ、≦１ｍｇ／ｍｌ等である。好ましい範囲は、０．３〜１ｍｇ／ｍｌである。最高で＜０．８５ｍｇ／用量が好ましい。
【００７０】
Ｂ．油エマルジョン
本発明においてアジュバントとして使用するために適当な油エマルジョン組成物は、ＭＦ５９のようなスクアレン−水エマルジョンを含む［参考文献１９の第１０章；参考文献１６も参照のこと］（５％のスクアレン、０．５％のＴｗｅｅｎ８０、および０．５％のＳｐａｎ８５、マイクロフルイダイザーを用いてサブミクロンの粒子に処方する）。完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）も使用し得る。
【００７１】
様々な適当な水中油型エマルジョンが公知であり、そしてそれらは典型的には少なくとも１つの油および少なくとも１つのサーファクタントを含み、その油およびサーファクタントは生物分解性（代謝性）および生体適合性である。エマルジョン中の油滴は、一般的に直径５μｍ未満であり、そして有利にそのエマルジョンはサブミクロンの直径を有する油滴を含み、これらの小さいサイズは、マイクロフルイダイザーによって達成され、安定なエマルジョンが提供される。ろ過滅菌に供することができるので、２２０ｎｍ未満のサイズを有する液滴が好ましい。
【００７２】
本発明を、動物（魚のような）または植物供給源由来のもののような油と共に使用し得る。植物油の供給源は、ナッツ、種子、および穀物を含む。ピーナッツ油、ダイズ油、ココナッツ油、およびオリーブ油は最も通常に入手可能であり、ナッツ油の例示となる。例えばホホバ豆から得られる、ホホバ油も使用し得る。種子油は、ベニバナ油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ種子油等を含む。穀物群の中で、コーン油が最も容易に入手可能であるが、コムギ、カラスムギ、ライムギ、コメ、テフ、ライコムギ等のような他の穀物の油も使用し得る。種子油には天然に存在しないが、グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの６−１０炭素脂肪酸エステルを、ナッツおよび種子油から開始して、適当な材料の加水分解、分離、およびエステル化によって調製し得る。哺乳動物乳由来の脂肪および油は、代謝可能であり、従って本発明の実施において使用し得る。動物供給源から純粋な油を得るために必要な、分離、精製、けん化および他の手段の手順が、当該分野で周知である。ほとんどの魚は、容易に収集し得る代謝可能な油を含む。例えば、タラ肝油、サメ肝油、および鯨蝋のような鯨油は、本明細書中で使用し得る魚油のいくつかの例示である。多くの分岐鎖油は、５炭素イソプレン単位で生化学的に合成され、そして一般的にテルペノイドと呼ばれる。サメ肝油は、スクアレン、２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエンとして公知である、分岐、不飽和テルペノイドを含む。他の好ましい油は、トコフェロールである（下記を参照のこと）。スクアレン（ｓｑｌａｕｅｎｅ）を含む水中油型エマルジョンが特に好ましい。油の混合物を使用し得る。
【００７３】
サーファクタントを、その「ＨＬＢ」（親水性／親油性バランス）によって分類し得る。本発明の好ましいサーファクタントは、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、そしてより好ましくは少なくとも１６のＨＬＢを有する。本発明を、ポリオキシエチレンソルビタンエステルサーファクタント（通常Ｔｗｅｅｎと呼ばれる）、特にポリソルベート２０およびポリソルベート８０；直鎖状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマーなど、ＤＯＷＦＡＸＴＭの商品名で販売されている、エチレンオキシド（ＥＯ）、酸化プロピレン（ＰＯ）、および／または酸化ブチレン（ＢＯ）のコポリマー；エトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の反復数が変動し得るオクトキシノール、オクトキシノール−９（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が特に興味深い；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；ホスファチジルコリン（レシチン）のようなリン脂質；トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ３０）のような、ラウリル、セチル、ステアリル、およびオレイルアルコール由来のポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊサーファクタントとして公知である）；およびソルビタントリオレアート（Ｓｐａｎ８５）およびソルビタンモノラウラートのような、ソルビタンエステル（通常ＳＰＡＮとして公知である）を含むがこれに限らないサーファクタントと使用し得る。エマルジョンに含めるために好ましいサーファクタントは、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）、Ｓｐａｎ８５（ソルビタントリオレアート）、レシチンおよびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００である。上記で述べたように、Ｔｗｅｅｎ８０のような界面活性剤は、下記の実施例で見られる熱安定性に寄与し得る。
【００７４】
サーファクタントの混合物、例えばＴｗｅｅｎ８０／Ｓｐａｎ８５混合物を使用し得る。ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（Ｔｗｅｅｎ８０）のようなポリオキシエチレンソルビタンエステルおよびｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）のようなオクトキシノールの組み合わせも適当である。別の有用な組み合わせは、ラウレス９とポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールを含む。
【００７５】
サーファクタントの好ましい量（重量％）は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ８０のような）０．０１−１％、特に約０．１％；オクチルまたはノニルフェノキシポリオキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、またはＴｒｉｔｏｎシリーズの他の界面活性剤のような）０．００１から０．１％、特に０．００５から０．０２％；ポリオキシエチレンエーテル（ラウレス９のような）０．１から２０％、好ましくは０．１から１０％、および特に０．１から１％または約０．５％である。
【００７６】
本発明で有用な、特定の水中油型エマルジョンアジュバントは、以下のものを含むがこれに限らない。
【００７７】
・スクアレン、Ｔｗｅｅｎ８０、およびＳｐａｎ８５のサブミクロンのエマルジョン。容積によるそのエマルジョンの組成は、約５％のスクアレン、約０．５％のポリソルベート８０、および約０．５％のＳｐａｎ８５であり得る。重量に関して、これらの比は、４．３％のスクアレン、０．５％のポリソルベート８０、および０．４８％のＳｐａｎ８５になる。このアジュバントは、参考文献１９の第１０章および参考文献２０の第１２章においてより詳細に記載されるように、「ＭＦ５９」［１６−１８］として公知である。ＭＦ５９エマルジョンは、クエン酸イオン、例えば１０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液を有利に含む。
【００７８】
・スクアレン、α−トコフェロール、およびポリソルベート８０を含むエマルジョン。これらのエマルジョンは、２から１０％のスクアレン、２から１０％のトコフェロール、および０．３から３％のＴｗｅｅｎ８０を有し得、そしてスクアレン：トコフェロールの重量比は、より安定なエマルジョンを提供するので、好ましくは≦１（例えば０．９０）である。スクアレンおよびＴｗｅｅｎ８０は、約５：２の容積比で、または約１１：５の重量比で存在し得る。Ｔｗｅｅｎ８０をＰＢＳに２％溶液を生じるように溶解させ、次いで９０ｍｌのこの溶液を、（５ｇのＤＬ−α−トコフェロールおよび５ｍｌのスクアレン）の混合物と混合し、次いでその混合物をマイクロフルイダイズすることによって、１つのそのようなエマルジョンを産生し得る。できたエマルジョンは、例えば１００〜２５０ｎｍ、好ましくは約１８０ｎｍの平均直径を有する、サブミクロンの油滴を有し得る。
【００７９】
・スクアレン、トコフェロール、およびＴｒｉｔｏｎ界面活性剤（例えばＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）のエマルジョン。そのエマルジョンはまた、３ｄ−ＭＰＬを含み得る（下記を参照のこと）。そのエマルジョンは、リン酸緩衝液を含み得る。
【００８０】
・ポリソルベート（例えばポリソルベート８０）、Ｔｒｉｔｏｎ界面活性剤（例えばＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）およびトコフェロール（例えばコハク酸α−トコフェロール）を含むエマルジョン。そのエマルジョンは、これらの３つの成分を、約７５：１１：１０の質量比で含み得（例えば７５０μｇ／ｍｌのポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、および１００μｇ／ｍｌのコハク酸α−トコフェロール）、そしてこれらの濃度は、抗原からのこれらの成分のあらゆる寄与を含むだろう。そのエマルジョンはまた、スクアレンを含み得る。そのエマルジョンはまた、３ｄ−ＭＰＬを含み得る（下記を参照のこと）。その水相は、リン酸緩衝液を含み得る。
【００８１】
・スクアラン、ポリソルベート８０およびポロクサマー４０１（「ＰｌｕｒｏｎｉｃＴＭ Ｌ１２１」）のエマルジョン。そのエマルジョンを、リン酸緩衝化生理食塩水、ｐＨ７．４中で処方し得る。このエマルジョンは、ムラミルジペプチドの有用な送達ビヒクルであり、そして「ＳＡＦ−１」アジュバントにおいて、スレオニル−ＭＤＰと共に使用された［２１］（０．０５−１％のＴｈｒ−ＭＤＰ、５％のスクアラン、２．５％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１および０．２％のポリソルベート８０）。「ＡＦ」アジュバント［２２］（５％のスクアラン、１．２５％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１および０．２％のポリソルベート８０）におけるように、それをまたＴｈｒ−ＭＤＰ無しで使用し得る。マイクロフルイダイゼーションが好ましい。
【００８２】
・スクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性サーファクタント（例えばポリオキシエチレン（１２）セトステアリルエーテル）および疎水性非イオン性サーファクタント（例えばソルビタンモノオレアート（ｍｏｎｏｌｅａｔｅ）または「Ｓｐａｎ８０」のような、ソルビタンエステルまたはマンニドエステル）を含むエマルジョン。そのエマルジョンは、好ましくは熱可逆的であり、および／または少なくとも９０％の２００ｎｍ未満のサイズを有する油滴（容積で）を有する［２３］。そのエマルジョンはまた、１つまたはそれ以上のアルジトール；凍結保護剤（例えばドデシルマルトシドおよび／またはショ糖のような糖）；および／またはアルキルポリグリコシドを含み得る。そのようなエマルジョンを、凍結乾燥し得る。
【００８３】
・０．５−５０％の油、０．１−１０％のリン脂質、および０．０５−５％の非イオン性サーファクタントを有するエマルジョン。参考文献２４で記載されるように、好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリンおよびカルジオリピンである。サブミクロンの液滴サイズが有利である。
【００８４】
・非代謝性油（軽油のような）および少なくとも１つのサーファクタント（レシチン、Ｔｗｅｅｎ８０、またはＳｐａｎ８０のような）の、サブミクロンの水中油型エマルジョン。ＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、サポニン−親油性結合体（参考文献２５において記載され、グルクロン酸のカルボキシル基を介した脂肪族アミンのデスアシルサポニンへの付加によって産生される、ＧＰＩ−０１００のような）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ｄｉｍｅｔｈｙｉｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ）ブロミドおよび／またはＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミンのような、添加物を含み得る。
【００８５】
・ミネラル油、非イオン性親油性エトキシ化脂肪アルコール、および非イオン性親水性サーファクタント（例えばエトキシ化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）［２６］を含むエマルジョン。
【００８６】
・ミネラル油、非イオン性親水性エトキシ化脂肪アルコール、および非イオン性親油性サーファクタント（例えばエトキシ化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）［２６］を含むエマルジョン。
【００８７】
・サポニン（例えばＱｕｉｌＡまたはＱＳ２１）およびステロール（例えばコレステロール）が、らせん状ミセルとして結合しているエマルジョン［２７］。
【００８８】
組成物中の抗原およびアジュバントは、典型的には患者への送達時には混合物である。そのエマルジョンを、製造の間に、または送達に際し即席で抗原と混合し得る。従って、そのアジュバントおよび抗原を、パッケージまたは分配したワクチンにおいて別々に維持し、使用時の最終的な処方に備え得る。その抗原は一般的に水性形態であり、そのためワクチンを、最終的に２つの液体を混合することによって調製する。混合するための２つの液体の容積比は変動し得るが（例えば５：１〜１：５）、一般的に約１：１である。
【００８９】
Ｃ．サポニン処方物［参考文献１９の第２２章］
本発明において、サポニン処方物もアジュバントとして使用し得る。サポニンは、広い範囲の植物種の、樹皮、葉、茎、根、さらには花において見出される、ステロールグリコシドおよびトリテルペノイドグリコシドの異種群である。Ｑｕｉｌｌａｉａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａの木の樹皮由来のサポニンは、アジュバントとして広く研究されている。サポニンをまた、Ｓｍｉｌａｘ ｏｒｎａｔａ（サルサパリラ（ｓａｒｓａｐｒｉｌｌａ））、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（ブライズベール（ｂｒｉｄｅｓ ｖｅｉｌ））、およびＳａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ（ソープルート（ｓｏａｐ ｒｏｏｔ））から、市販で得ることができる。サポニンアジュバント処方は、ＱＳ２１のような精製した処方物、およびＩＳＣＯＭのような脂質処方物を含む。ＱＳ２１は、ＳｔｉｍｕｌｏｎＴＭとして販売されている。
【００９０】
サポニン組成物を、ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣを用いて精製した。これらの技術を用いて、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−Ｂ、およびＱＨ−Ｃを含む、特定の精製画分が同定された。好ましくは、そのサポニンはＱＳ２１である。ＱＳ２１の産生方法が、参考文献２８において開示される。サポニン処方物はまた、コレステロールのようなステロールを含み得る［２９］。
【００９１】
サポニンおよびコレステロールの組み合わせを使用して、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ；参考文献１９の第２３章；参考文献３０および３１も参照のこと）と呼ばれる独特な粒子を形成し得る。ＩＳＣＯＭはまた、典型的にはホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンのようなリン脂質を含む。あらゆる公知のサポニンを、ＩＳＣＯＭにおいて使用し得る。好ましくは、そのＩＳＣＯＭは、１つまたはそれ以上のＱｕｉｌＡ、ＱＨＡおよびＱＨＣを含む。任意で、そのＩＳＣＯＭは、さらなる界面活性剤を欠き得る［３２］。
【００９２】
サポニンに基づくアジュバントの開発の概説を、参考文献３３および３４において見出し得る。
【００９３】
Ｄ．細菌または微生物誘導体
本発明において使用するために適当なアジュバントは、腸内細菌リポ多糖（ＬＰＳ）の無毒性誘導体、リピドＡ誘導体、免疫刺激性オリゴヌクレオチドならびにＡＤＰ−リボシル化毒素およびその無毒化誘導体のような、細菌または微生物誘導体を含む。
【００９４】
ＬＰＳの無毒性誘導体は、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）および３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）を含む。３ｄＭＰＬは、４、５、または６アシル化鎖を有する３脱Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの混合物である。３脱Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの好ましい「小粒子」形態が、参考文献３５において開示される。そのような３ｄＭＰＬの「小粒子」は、０．２２μｍの膜を通して滅菌ろ過するために十分小さい［３５］。他の無毒性ＬＰＳ誘導体は、アミノアルキルグルコサミニドリン酸塩誘導体、例えばＲＣ−５２９のような、モノホスホリルリピドＡ模倣物を含む［３６、３７］。
【００９５】
リピドＡ誘導体は、ＯＭ−１７４のようなＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のリピドＡの誘導体を含む。ＯＭ−１７４は、例えば参考文献３８および３９において記載される。
【００９６】
本発明においてアジュバントとして使用するために適当な免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧモチーフ（リン酸結合によってグアノシンに結合した非メチル化シトシンを含むジヌクレオチド配列）を含むヌクレオチド配列を含む。２本鎖ＲＮＡおよびパリンドロームまたはポリ（ｄＧ）配列を含むオリゴヌクレオチドも、免疫刺激性であることが示された。
【００９７】
ＣｐＧは、ホスホロチオエート修飾のようなヌクレオチド修飾／アナログを含み得、そして２本鎖または１本鎖であり得る。参考文献４０、４１、および４２は、可能性のあるアナログ置換、例えばグアノシンの２’−デオキシ−７−デアザグアノシンによる置換を開示する。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、参考文献４３−４８においてさらに議論される。
【００９８】
ＣｐＧ配列を、モチーフＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴのような、ＴＬＲ９に向け得る［４９］。そのＣｐＧ配列は、ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮのように、Ｔｈ１免疫反応を誘発するために特異的であり得、またはそれはＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮのように、Ｂ細胞反応を誘発するためにより特異的であり得る。ＣｐＧ−ＡおよびＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮは、参考文献５０−５２において議論される。好ましくは、そのＣｐＧはＣｐＧ−Ａ ＯＤＮである。
【００９９】
好ましくは、そのＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’末端が受容体認識のためにアクセス可能であるように構築される。任意で、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列を、その３’末端で結合して、「イムノマー」を形成し得る。例えば、参考文献５３−５５を参照のこと。
【０１００】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドに基づく特に有用なアジュバントは、ＩＣ−３１ＴＭとして公知である［５６−５８］。従って、本発明で使用されるアジュバントは、（ｉ）少なくとも１つ（および好ましくは複数）のＣｐＩモチーフ（すなわち、イノシンと結合してジヌクレオチドを形成するシトシン）を含むオリゴヌクレオチド（例えば１５−４０ヌクレオチド）、および（ｉｉ）少なくとも１つ（および好ましくは複数）のＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓトリペプチド配列を含む、オリゴペプチド（例えば５−２０アミノ酸）のようなポリカチオン性ポリマーの混合物を含み得る。そのオリゴヌクレオチドは、２６マーの配列５’−（ＩＣ）１３−３’（配列番号７）を含むデオキシヌクレオチドであり得る。そのポリカチオン性ポリマーは、１１マーのアミノ酸配列ＫＬＫＬＬＬＬＬＫＬＫ（配列番号６）を含むペプチドであり得る。配列番号６および７のこの組み合わせが、ＩＣ−３１ＴＭアジュバントを提供する。
【０１０１】
細菌ＡＤＰリボシル化毒素およびその無毒化誘導体を、本発明でアジュバントとして使用し得る。好ましくは、そのタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性エンテロトキシン「ＬＴ」）、コレラ（「ＣＴ」）、または百日咳（「ＰＴ」）由来である。粘膜アジュバントとして無毒化ＡＤＰリボシル化毒素を用いることが、参考文献５９に、そして非経口アジュバントとして用いることが、参考文献６０に記載されている。その毒素またはトキソイドは、好ましくは、ＡおよびＢサブユニットを両方含むホロ毒素の形態である。好ましくは、Ａサブユニットが、無毒化変異を含み；好ましくは、Ｂサブユニットは変異していない。好ましくは、そのアジュバントは、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、およびＬＴ−Ｇ１９２のような、無毒化ＬＴ変異体である。ＡＤＰリボシル化毒素およびその無毒化誘導体、特にＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２をアジュバントとして使用することは、参考文献６１−６８において見出し得る。有用なＣＴ変異体は、ＣＴ−Ｅ２９Ｈである［６９］。アミノ酸置換に関する数字の言及は、好ましくは、本明細書中にその全体が明確に参考として組み込まれる、参考文献７０において記載されたＡＤＰリボシル化毒素のＡおよびＢサブユニットのアライメントに基づく。
【０１０２】
Ｅ．ヒト免疫調節物質
本発明においてアジュバントとして使用するために適当なヒト免疫調節物質は、インターロイキン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２［７１］等）［７２］、インターフェロン（例えばインターフェロン−γ）、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子のようなサイトカインを含む。好ましい免疫調節物質はＩＬ−１２である。
【０１０３】
Ｆ．生体付着性物質（ｂｉｏａｄｈｅｓｉｖｅ）および粘膜付着性物質（ｍｕｃｏａｄｈｅｓｉｖｅ）
生体付着性物質および粘膜付着性物質も、本発明においてアジュバントとして使用し得る。適当な生体付着性物質は、エステル化ヒアルロン酸ミクロスフェア［７３］またはポリ（アクリル酸）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖類およびカルボキシメチルセルロースの架橋誘導体のような粘膜付着性物質を含む。キトサンおよびその誘導体も、本発明においてアジュバントとして使用し得る［７４］。
【０１０４】
Ｇ．微粒子
微粒子も、本発明においてアジュバントとして使用し得る。生物分解性および無毒性である材料（例えばポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ酸無水物、ポリカプロラクトン等、（ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）が好ましい））から形成された、微粒子（すなわち、直径約１００ｎｍから約１５０μｍ、より好ましくは直径約２００ｎｍから約３０μｍ、そして最も好ましくは直径約５００ｎｍから約１０μｍの粒子）が好ましく、任意で負に荷電した表面（例えばＳＤＳによって）または正に荷電した表面（例えばＣＴＡＢのような陽イオン性界面活性剤によって）を有するように処理する。
【０１０５】
Ｈ．リポソーム（参考文献１９の第１３および１４章）
アジュバントとして使用するために適当なリポソーム処方物の例が、参考文献７５−７７において記載されている。
【０１０６】
Ｉ．イミダゾキノロン化合物
本発明においてアジュバントとして使用するために適当なイミダゾキノロン化合物の例は、参考文献７８および７９においてさらに記載される、イミキモド（Ｉｍｉｑｕａｍｏｄ）およびそのホモログ（例えば「Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ３Ｍ」）を含む。
【０１０７】
本発明はまた、上記で同定した１つまたはそれ以上のアジュバントの局面の組み合わせを含み得る。例えば、以下のアジュバント組成物を、本発明において使用し得る：（１）サポニンおよび水中油型エマルジョン［８０］；（２）サポニン（例えばＱＳ２１）＋無毒性ＬＰＳ誘導体（例えば３ｄＭＰＬ）［８１］；（３）サポニン（例えばＱＳ２１）＋無毒性ＬＰＳ誘導体（例えば３ｄＭＰＬ）＋コレステロール；（４）サポニン（例えばＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（任意で＋ステロール）［８２］；（５）３ｄＭＰＬと、例えばＱＳ２１および／または水中油型エマルジョンとの組み合わせ［８３］；（６）サブミクロンのエマルジョンにマイクロフルイダイズしたか、またはより大きな粒子サイズのエマルジョンを産生するためにボルテックスした、１０％のスクアラン、０．４％のＴｗｅｅｎ８０ＴＭ、５％のプルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含むＳＡＦ；（７）２％のスクアレン、０．２％のＴｗｅｅｎ８０、ならびにモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコラート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群からの１つまたはそれ以上の細菌細胞壁成分、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＴＭ）を含むＲｉｂｉＴＭアジュバントシステム（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）；および（８）１つまたはそれ以上のミネラル塩（アルミニウム塩のような）＋ＬＰＳの無毒性誘導体（３ｄＭＰＬのような）。
【０１０８】
免疫刺激剤として作用する他の物質が、参考文献１９の第７章において開示される。
【０１０９】
水酸化アルミニウムアジュバントが有用であり、そして抗原は一般的にこの塩に吸着させられる。サブミクロンの油滴を有し、スクアレンを含む水中油型エマルジョンも、特に高齢者において好ましい。有用なアジュバントの組み合わせは、ＣｐＧ＆アルミニウム塩、またはレシキモド＆アルミニウム塩のような、Ｔｈ１およびＴｈ２アジュバントの組み合わせを含む。アルミニウム塩および３ｄＭＰＬの組み合わせを使用し得る。
【０１１０】
免疫化
上記で記載したような免疫原性組成物を提供することに加えて、本発明はまた、本発明の免疫原性組成物を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物において抗体反応を起こす方法を提供する。その抗体反応は、好ましくは保護的抗体反応である。本発明はまた、そのような方法において使用するための本発明の組成物を提供する。
【０１１１】
本発明はまた、本発明の免疫原性組成物を哺乳動物に投与することを含む、Ｓｈｉｇｅｌｌａ感染および／または疾患に対して（例えば細菌性赤痢、ライター症候群、および／または溶血性尿毒症症候群に対して）哺乳動物を保護するための方法を提供する。
【０１１２】
本発明は、薬物として（例えば免疫原性組成物またはワクチンとして）使用するための本発明の組成物を提供する。それはまた、哺乳動物においてＳｈｉｇｅｌｌａ感染を防止するための、例えば細菌性赤痢、ライター症候群、および／または溶血性尿毒症症候群を防止するための薬物の製造において、本発明の小胞を使用することを提供する。それはまた、哺乳動物においてＳｈｉｇｅｌｌａ感染を防止するための、例えば細菌性赤痢を防止するための、ブレブを含まない薬物の製造において、ブレブタンパク質（上記で定義したような）を使用することを提供する。
【０１１３】
その哺乳動物は、好ましくはヒトである。そのヒトは、成人、または好ましくは小児であり得る。そのワクチンを予防的に使用する場合、ヒトは好ましくは小児（例えば幼児または乳児）であり；そのワクチンを治療的に使用する場合、そのヒトは好ましくは成人である。小児を意図したワクチンをまた、例えば安全性、投与量、免疫原性等を評価するために、成人に投与し得る。
【０１１４】
その使用および方法は、細菌性赤痢、ライター症候群、および／または溶血性尿毒症症候群を含むがこれに限らない疾患を防止／処置するために特に有用である。
【０１１５】
治療的処置の有効性を、本発明の組成物の投与後にＳｈｉｇｅｌｌａ感染をモニターすることによって試験し得る。予防的処置の有効性を、その組成物の投与後に、ブレブ中の免疫原性タンパク質または他の抗原に対する免疫反応をモニターすることによって試験し得る。本発明の組成物の免疫原性を、それらを試験被験体（例えば１２−１６ヶ月齢の小児）に投与し、そして次いで標準的な血清学的パラメーターを決定することによって決定し得る。これらの免疫反応を、一般的に組成物の投与のおよそ４週間後に決定し、そして組成物の投与前に決定した値と比較する。１回より多くその組成物の投与を行う場合、１回より多い投与後の決定を行い得る。
【０１１６】
本発明の組成物を、一般的に患者へ直接投与する。直接的な送達を、非経口注射（例えば皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、または組織の間質腔に）によって、または直腸、経口、膣、局所、経皮、鼻腔内、眼、耳、肺、もしくは他の粘膜投与によって達成し得る。大腿または上腕への筋肉内投与が好ましい。注射は、針（例えば皮下針）により得るが、代替的に無針注射を使用し得る。典型的な筋肉内投与量は、約０．５ｍｌである。
【０１１７】
本発明を使用して、全身性および／または粘膜免疫を誘発し得る。
【０１１８】
投薬処置は、単回投与スケジュールまたは複数回投与スケジュールであり得る。一次免疫化スケジュールにおいて、および／または追加免疫化スケジュールにおいて、複数回投与を使用し得る。一次投与スケジュールの後に、追加投与スケジュールが続き得る。一次投与の間（例えば４−１６週間）および一次投与と追加投与との間の適当な時間を、日常的に決定し得る。
【０１１９】
一般
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えばＸを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、Ｘのみからなり得、またはさらなる何かを含み得る（例えばＸ＋Ｙ）。
【０１２０】
数値ｘに関連して「約」という用語は任意であり、そして例えばｘ±１０％を意味する。
【０１２１】
「実質的に」という用語は、「完全に」を除外しない。例えばＹを「実質的に含まない」組成物は、完全にＹを含まない場合がある。必要な場合、「実質的に」という用語を、本発明の定義から省略し得る。
【０１２２】
２つのアミノ酸配列の間の配列同一性パーセンテージへの言及は、アライメントした場合に、２つの配列を比較して、そのパーセンテージのアミノ酸が同一であることを意味する。このアライメントおよび相同性または配列同一性パーセントを、当該分野で公知であるソフトウェアプログラム、例えば参考文献８４の項７．７．１８において記載されたものを用いて決定し得る。好ましいアライメントを、ギャップオープンペナルティーが１２、およびギャップ伸長ペナルティーが２、ＢＬＯＳＵＭマトリックスが６２であるアフィンギャップサーチを用いたＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定する。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは周知であり、そして参考文献８５において開示される。
【０１２３】
「ＧＩ」ナンバリングを上記で使用する。ＧＩナンバー、または「ＧｅｎＩｎｆｏ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ」は、配列がデータベースに加えられたときに、ＮＣＢＩによって処理された各配列記録に連続的に割り当てられた一連の数字である。ＧＩナンバーは、配列記録のアクセッション番号との類似性はない。配列がアップデートされた場合（例えば訂正のために、またはより多くのアノテーションまたは情報を加えるために）、それは新しいＧＩナンバーを受け取る。従って、所定のＧＩナンバーに関連する配列は決して変化しない。
【０１２４】
本発明が「エピトープ」に関する場合、このエピトープはＢ細胞エピトープおよび／またはＴ細胞エピトープであり得る。そのようなエピトープを、経験的に（例えばＰＥＰＳＣＡＮ［８６、８７］または同様の方法を用いて）同定し得、またはそれらを予測し得る（例えばＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性指標［８８］、マトリックスに基づくアプローチ［８９］、ＭＡＰＩＴＯＰＥ［９０］、ＴＥＰＩＴＯＰＥ［９１、９２］、神経ネットワーク（ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋ）［９３］、ＯｐｔｉＭｅｒ＆ＥｐｉＭｅｒ［９４、９５］、ＡＤＥＰＴ［９６］、Ｔｓｉｔｅｓ［９７］、親水性［９８］、抗原性指標［９９］、または参考文献１００−１０１において開示された方法等を用いて）。エピトープは、抗体またはＴ細胞受容体の抗原結合部位によって認識され、そしてそこに結合する抗原の一部であり、そしてそれらはまた「抗原決定基」とも呼ばれ得る。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】図１は、培養物から精製した本発明のブレブの電子顕微鏡写真を示す。
【図２】図２は、Ｓ．ｓｏｎｎｅｉΔｔｏｌＲΔｇａｌＵ由来のブレブの２Ｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図３】図３は、抗コア抗体で染色した、様々な示した株におけるブレブのＬＰＳを示す。
【図４】図４は、免疫したマウス由来の血清を用いた、ブレブの２Ｄ分離タンパク質のイムノブロットを示す。
【図５】図５は、異なる条件下で増殖した細菌のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図６】図６は、吸着したブレブ中のタンパク質を示す。レーン左から右へ：１）タンパク質分子量マーカー、２）ＳｓＯＭＢ１０μｇ、３）ＳｓＯＭＢ２μｇ、４）１ヶ月間アルミニウムに吸着したＳｓＯＭＢ１０μｇ。
【図７】図７は、示した株のＦＡＣＳデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【０１２６】
発明を実施するための様式
Ｓ．ｓｏｎｎｅｉの変異体の調製
野生型Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ５３ＧのｔｏｌＲ遺伝子を、λ Ｒｅｄシステムを用いて欠失させた［１１、１０２］。λ Ｒｅｄプラスミドで形質転換したコンピテント細胞を調製し、そして次いで相同的組換えによってｔｏｌＲ遺伝子を抗生物質耐性遺伝子と交換するようデザインされた直鎖状断片で形質転換する。その断片が染色体に組み込まれたクローンを、抗生物質に対する耐性によって選択し、そしてｔｏｌＲの欠失を、ＰＣＲまたは他の技術によって確認する。次いで、３７℃で新しいクローンを増殖させることによって、温度感受性λＲｅｄプラスミドを除去し得る。
【０１２７】
このΔｔｏｌＲ変異体におけるＴｏｌＲ発現の欠如を確認し、そしてもとの野生型単離物と比較し、増殖の間、培地へより多くのブレブが放出されることが確認された。
【０１２８】
ｇａｌＵ遺伝子も、同様の方法で欠失させて、ΔｇａｌＵ単一変異体およびΔｔｏｌＲΔｇａｌＵ二重変異体を生じた。変異体によって放出されるブレブは、Ｏ抗原を欠く欠損ＬＰＳを有することが確認される。
【０１２９】
修飾ＬＰＳを有するΔｔｏｌＲΔｍｓｂＢ二重変異体株を、同じ方法で調製する。
【０１３０】
有毒性プラスミドも、ΔｔｏｌＲおよびΔｔｏｌＲΔｍｓｂＢ株から除去した。
【０１３１】
Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉの変異体の調製
Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉのｔｏｌＲ遺伝子を、上記でＳ．ｓｏｎｎｅｉに関して記載したように、λＲｅｄシステムを用いて欠失させた。Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉのＯ抗原生合成を、完全なｒｆｂＧ遺伝子ならびにｒｆｂＦおよびｒｆｃの一部を含む染色体断片の欠失によって破壊し、このことは、３つの遺伝子全ての活性化を引き起こす。その欠失を、λＲｅｄシステムを用いて産生し、そしてΔｒｆｂＧと省略される。
【０１３２】
ΔｔｏｌＲΔｒｆｂＧ二重変異体を、同じ方法で産生した。
【０１３３】
修飾ＬＰＳを含むΔｔｏｌＲΔｈｔｒＢ二重変異体を、同じ方法で産生した。
【０１３４】
有毒性プラスミドも、これらの株から除去した。
【０１３５】
ブレブの精製
二重変異体ΔｔｏｌＲΔｇａｌＵ株の発酵を、以下の条件下で行った：ｐＨ７．１、３７℃、撹拌を調節し、そして通気を最大に設定することによって溶存酸素を３０％飽和に維持。ｐＨを、４Ｍの水酸化アンモニウムを加えることによって調節した。泡を、実施の間に１０％のＰＰＧを加えることによって調節した。培地は以下の成分からなっていた：ＫＨ２ＰＯ４ ５ｇ／ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ ２０ｇ／ｌ、および酵母抽出物３０ｇ／ｌ。オートクレーブによって培地を滅菌した後、グリセロール １５ｇ／ｌおよびＭｇＳＯ４ ２ｍＭを、接種の前に加えた。培養接種材料は、発酵槽容量の５％であった。その発酵プロセスは約１３時間かかり、そして細胞濃度を６００ｎｍにおける光学密度として測定した。
【０１３６】
Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ ΔｔｏｌＲΔｍｓｂＢ二重変異体株の発酵プロセスを、規定の培地で行った：グリセロール ３０ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ １３．３ｇ／ｌ、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４ ４ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（１Ｍ） ２ｍｌ、クエン酸１．７ｇ／ｌ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ２．５ｍｇ／ｌ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ １５ｍｇ／ｌ、ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ １．５ｍｇ／ｌ、Ｈ３ＢＯ３ ３ｍｇ／ｌ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ２．５ｍｇ／ｌ、Ｚｎ（ＣＨ３ＣＯＯ）２・２Ｈ２Ｏ １３ｍｇ／ｌ、クエン酸第二鉄２μＭ、チアミン ５０ｍｇ／ｌ、ニコチン酸１０ｍｇ／ｌ、Ｌ−アスパラギン酸２．５ｇ／ｌ。
【０１３７】
発酵ブロスにおいて産生した小胞を、２つの連続的なＴＦＦ（タンジェンシャルフローろ過）工程：０．２２μｍにおけるマイクロろ過（ｍｉｃｒｏ−ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）および次いで０．１μｍにおける２番目のマイクロろ過を用いて精製した。最初のろ過工程中に、孔径０．２２μｍのカセットを通したＴＦＦによって、小胞をバイオマスから分離した。そのバイオマスを最初に４倍に濃縮し、ＰＢＳに対する５回のダイアフィルトレーション工程の後に、その小胞をろ液中で収集した。２番目のろ過工程において、小胞を可溶性タンパク質から精製するために、０．２２μｍＴＦＦからのろ液を、さらに０．１μｍカットオフカセットを通してマイクロろ過した。その小胞はフィルターカセットを通過できなかった。５回のダイアフィルトレーション工程後、小胞を含む保持物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を収集した。
【０１３８】
最終的な精製産物を、ＴＥＭで観察した（図１）。ブレブは、直径約５０ｎｍの均一なサイズを有する。
【０１３９】
Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ変異体由来のブレブを、Ｓ．ｓｏｎｎｅｉΔｔｏｌＲΔｇａｌＵに関して使用したのと同じ方法で、酵母抽出培地中で様々な株を増殖させた後、精製した。
【０１４０】
ブレブの特徴付け
プロテオミクスアプローチは、そのブレブが本質的に純粋な外膜であることを確認した。外膜の破壊によって得られる従来の外膜小胞（ＯＭＶ）と異なり、そのブレブは親油性タンパク質を保存し、そして本質的に細胞質および内膜成分を含まない。
【０１４１】
Ｓ．ｓｏｎｎｅｉおよびＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来のブレブを、界面活性剤で変性させ、そしてタンパク質をＬＣ−ＭＳ／ＭＳアプローチで同定した。あるいは、ブレブをＳＤＳｐａｇｅまたは２Ｄゲル電気泳動によって分離した（図２）。目に見えるバンドおよびスポットをゲルから切り取り、そしてタンパク質マスフィンガープリントによってタンパク質を同定した。異なるタンパク質の相対的な量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのバンドまたは２Ｄゲルのスポットの濃度計分析によって研究した。
【０１４２】
図３は、野生型ＳｈｉｇｅｌｌａおよびＥ．ｃｏｌｉ（全ての株はΔｔｏｌＲバックグラウンドである）と比較した、ΔｇａｌＵ変異体株のＬＰＳ移動度のシフトを示す。
【０１４３】
表面の消化に基づく、２番目のプロテオミクスアプローチを使用して、膜タンパク質の露出した部分を特徴付けした。タンパク質のセットは、ブレブで免疫化したマウス由来の血清と反応性であると同定され、そしてこれらの多くは、株の大きなパネルにおいて保存されていることが見出された。大部分の内在性外膜タンパク質の構造については、ほとんど何も知られていない。ブレブのサーフォーム（ｓｕｒｆｏｍｅ）を、プロテアーゼによる処理および放出されたペプチドのＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる回収および同定によって調査した。ブレブは生の細菌細胞全体の表面を示すはずであるため、このマップはＳ．ｓｏｎｎｅｉの表面の露出タンパク質を表すはずである。
【０１４４】
これらおよび他のアプローチによって、表１に列挙した１２９個のタンパク質がブレブにおいて見られた。
【０１４５】
ブレブ免疫原性
ΔｔｏｌＲΔｇａｌＵ株由来のブレブで免疫化したマウスは、図４で示すように、ブレブの２Ｄゲルと反応する血清を産生する。従ってそのブレブは免疫原性である。
【０１４６】
アジュバント（水酸化アルミニウムまたはフロイント完全）有りまたは無しで、２μｇまたは１０μｇのＳ．ｓｏｎｎｅｉΔｔｏｌＲΔｇａｌＵブレブ（全タンパク質として測定）をマウスに投与した。免疫化研究から得られた血清におけるＩｇＧの産生を分析するために、伝統的なＥＬＩＳＡ法を行った。全ての群のマウス由来の血清は、ブレブ特異的ＩｇＧの高レベルの産生を示した。ブレブを単独で、またはアジュバントと組み合わせて使用した場合に、ＩｇＧ産生に有意な差は検出されなかった。２μｇの低用量で免疫化した群は、１０μｇで免疫化した群と同じレベルのブレブ特異的ＩｇＧを示し、このことは、低用量ワクチンが達成可能であり得ることを示す（すなわち１ドルあたりより多くの投与）。他のＳ．ＳｏｎｎｅｉおよびＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ株由来のブレブが、同様に免疫原性であった。
【０１４７】
ブレブに対して産生した血清を、３つの異なる細菌：Ｓ．ｓｏｎｎｅｉＧ５３、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ ２ａ ２４５７Ｔ、またはＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ ５ Ｍ９０Ｔとの反応性に関して試験した。次いでサンプルを標識した二次Ａｂで染色し、そしてフローサイトメトリーによって分析した。図７で示すように、Ｓ．ｓｏｎｎｅｉおよびＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ株は、上記血清と交差反応する。
【０１４８】
従って、ブレブアプローチは、有効かつ低コストのワクチンを産生する強い可能性を有し、そして広域スペクトルのワクチンへ向けて、様々なＳｈｉｇｅｌｌａ株へと拡張し得る。
【０１４９】
ブレブの吸着
ブレブを、吸着のために水酸化アルミニウム（２ｍｇ／ｍｌ）と組み合わせた。吸着した物質を、４℃で１日、１週間、または１ヶ月間保存した。ブレブは１日後完全に吸着され、そして１ヶ月後でも脱着の証拠は存在しなかった（図６）。
【０１５０】
鉄制限増殖
図５は、様々な条件下で増殖したＳｈｉｇｅｌｌａによって発現されるタンパク質を示す。レーン４において、細菌を２００μＭのＦｅＳＯ４の存在下で増殖させ、一方レーン５においてその培養は２００μＭのジピリジルを有していた。挿入図は、鉄制限条件下で３つのタンパク質がアップレギュレートされることを示す。これらの３つのタンパク質は、ＦｅｐＡ外膜受容体（ＧＩ７４３１１１１８）、コリシンＩ受容体（ＧＩ７４３１２６７７）、および推定鉄シデロホア受容体（ＧＩ７４３１３９７２）と同定された。これらのタンパク質は、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．およびｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ内でよく保存されており、そして潜在的に高度に免疫原性である。従って鉄制限条件下でＳｈｉｇｅｌｌａを増殖させることは、通常の増殖条件と比較して、これらのタンパク質が濃縮されたブレブの放出を引き起こし得る。
【０１５１】
本発明は、単なる例とし記載され、そして本発明の範囲および精神に留まりながら修飾を行い得ることが理解される。
【０１５２】
【表１−１】
【０１５３】
【表１−２】
【０１５４】
【表１−３】
【０１５５】
【表１−４】
配列番号７０、７１、７３、７４、７６、１１１、１１２、１１４−１２９および１３１−１３５は、Ｓ．ｓｏｎｎｅｉΔｔｏｌＲブレブから同定された。配列番号８−１５および１７−５８は、Ｓ．ｓｏｎｎｅｉΔｔｏｌＲΔｇａｌＵブレブから同定された。配列番号８３、９４、９７、および１０７は、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉΔｔｏｌＲブレブから同定された。配列番号６８、６９、７２、７５、７７−８２、８４−９３、９５、９６、９８−１０６、１０８−１０、１１３、１３０、および１３６は、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉΔｔｏｌＲΔｒｆｂＧブレブから同定された。配列番号６０−６７は、Ｓ．ｓｏｎｎｅｉの表面消化から同定された。
【０１５６】
サブセット１：配列番号６８、６９、７２、７５、７７−１１０、１１３、１３０および１３６
サブセット２：配列番号８−１５、１７−５８、６０−６７、７０、７１、７３、７４、７６、１１１、１１２、１１４−１２９および１３１−１３５
サブセット３：配列番号１−６０
ＮＢ：配列番号１８は、配列番号５と同一である；配列番号３３は、配列番号２と同一である；配列番号９および１６は関連している（約９７％の同一性）；配列番号２３および５９は関連している（約９８％の同一性）。
【０１５７】
【数１】
【０１５８】
【数２】
【０１５９】
【数３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴｏｌＡタンパク質、ＴｏｌＢタンパク質、ＴｏｌＱタンパク質、ＴｏｌＲタンパク質、およびＰａｌタンパク質のうちの４つ以下を発現する、Ｓｈｉｇｅｌｌａ細菌。
【請求項２】
前記タンパク質のうちの４つを発現し、ＴｏｌＲを発現しない、請求項１に記載の細菌。
【請求項３】
ＴｏｌＲタンパク質を発現しない、Ｓｈｉｇｅｌｌａ細菌。
【請求項４】
ＳｈｉｇｅｌｌａのΔｔｏｌＲ株である、細菌。
【請求項５】
天然のＳｈｉｇｅｌｌａリポ多糖を発現しない、前述の請求項のいずれかに記載の細菌。
【請求項６】
天然のＳｈｉｇｅｌｌａ Ｏ抗原を発現しない、請求項５に記載の細菌。
【請求項７】
前記株が、ΔｔｏｌＲΔｇａｌＵ株である、請求項４に記載の細菌。
【請求項８】
ｓｔｘＡ遺伝子および／またはｓｔｘＢ遺伝子が、不活性化されている、前述の請求項のいずれかに記載の細菌。
【請求項９】
ＴｏｌＡタンパク質、ＴｏｌＢタンパク質、ＴｏｌＱタンパク質、ＴｏｌＲタンパク質およびＰａｌタンパク質を発現するＳｈｉｇｅｌｌａ細菌であって、該ＴｏｌＡタンパク質、該ＴｏｌＱタンパク質、該ＴｏｌＲタンパク質および／または該Ｐａｌタンパク質は、（ａ）該細菌の内膜または外膜に位置し、かつ（ｂ）１つまたはそれ以上のアミノ酸配列変異を含み、ここで、該細菌は、培地中で増殖する場合に、該変異を含まない同じ細菌と比較して、より多量の外膜ブレブを放出する、Ｓｈｉｇｅｌｌａ細菌。
【請求項１０】
Ｓｈｉｇｅｌｌａ細菌であって、該Ｓｈｉｇｅｌｌａ細菌のＴｏｌ−Ｐａｌシステムの１つまたはそれ以上の成分が修飾を有し、ここで、該細菌は、培地中で増殖する間に、該修飾を欠いている同じ細菌よりも、該培地中に多量の外膜ブレブを放出し、かつ該細菌は、（ｉ）天然のＳｈｉｇｅｌｌａリポ多糖および／または（ｉｉ）Ｓｈｉｇｅｌｌａ腸毒素を発現しない、Ｓｈｉｇｅｌｌａ細菌。
【請求項１１】
Ｓｈｉｇｅｌｌａブレブを調製するためのプロセスであって、請求項１から１０のいずれか一項に記載の細菌を含む培地から該ブレブを分離する工程を含み、該細菌が、該細菌による該培地へのブレブの放出を可能にする条件下で増殖させられた、プロセス。
【請求項１２】
前記細菌が、鉄制限条件下で増殖させられた、請求項１１に記載のプロセス。
【請求項１３】
過剰ブレブ形成Ｓｈｉｇｅｌｌａ細菌を調製する方法であって、培地中で増殖させられた場合に、修飾によって該細菌が開始細菌より多量の外膜ブレブを該培地中へ放出するように、該開始細菌のＴｏｌ−Ｐａｌシステムの１つまたはそれ以上の成分をコードする遺伝子を修飾する工程を含み、該修飾は、該開始細菌のｔｏｌＡ遺伝子、ｔｏｌＢ遺伝子、ｔｏｌＱ遺伝子、ｔｏｌＲ遺伝子、および／またはｐａｌ遺伝子の１つまたはそれ以上を変異させることを含む、方法。
【請求項１４】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の細菌もしくは請求項１３に記載の方法によって得ることができる細菌から単離されたかもしくは得ることができるか、または請求項１１もしくは請求項１２に記載のプロセスによって単離されたかもしくは得ることができる、ブレブ。
【請求項１５】
ブレブを含む組成物であって、該ブレブは、請求項１から１０のいずれか一項に記載の細菌または請求項１３に記載の方法によって得ることができる細菌の培養の間に培地に放出される、組成物。
【請求項１６】
任意の生の細菌および／または細菌全体を含まない、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
ブレブを含む組成物であって、該ブレブが、培地の０．２２μｍのフィルターを通したろ過後に得ることができるろ液に存在し、請求項１から１０のいずれか一項に記載の細菌または請求項１３に記載の方法によって得ることができる細菌が、該培地中で増殖させられた、組成物。
【請求項１８】
請求項１から１０に記載の細菌または請求項１３に記載の方法によって得ることができる細菌を含む培地であって、該細菌が、該細菌による該培地へのブレブの放出を可能にする条件下で増殖させられた、培地。
【請求項１９】
機能的ＨｔｒＢ酵素を発現しない、Ｓｈｉｇｅｌｌａ株。
【請求項２０】
ｈｔｒＢがノックアウトされている、請求項１９に記載のＳｈｉｇｅｌｌａ株。
【請求項２１】
以下：
（ａ）配列番号８から６７から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号８から６７のうちの１つと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ／または配列番号８から６７のいずれか１つの少なくとも７個の連続的なアミノ酸の断片であって、エピトープを含む、断片を含む、タンパク質
のうちの１つまたはそれ以上を含む、Ｓｈｉｇｅｌｌａブレブ。
【請求項２２】
ブレブを含まない免疫原性組成物であって、該組成物は、
（ａ）アミノ酸配列配列番号８から１３６；
（ｂ）配列番号８から１３６のうちの１つと少なくとも８５％の同一性を有し、かつ／または配列番号８から１３６のいずれか１つの少なくとも７個の連続的なアミノ酸の断片を含み、かつ配列番号８から１３６のうちの１つに由来するエピトープを含む、アミノ酸配列
を含むタンパク質を含む、組成物。
【請求項２３】
鉄利用可能性を制限している、Ｓｈｉｇｅｌｌａを培養するためのプロセス。
【請求項１】
ＴｏｌＡタンパク質、ＴｏｌＢタンパク質、ＴｏｌＱタンパク質、ＴｏｌＲタンパク質、およびＰａｌタンパク質のうちの４つ以下を発現する、Ｓｈｉｇｅｌｌａ細菌。
【請求項２】
前記タンパク質のうちの４つを発現し、ＴｏｌＲを発現しない、請求項１に記載の細菌。
【請求項３】
ＴｏｌＲタンパク質を発現しない、Ｓｈｉｇｅｌｌａ細菌。
【請求項４】
ＳｈｉｇｅｌｌａのΔｔｏｌＲ株である、細菌。
【請求項５】
天然のＳｈｉｇｅｌｌａリポ多糖を発現しない、前述の請求項のいずれかに記載の細菌。
【請求項６】
天然のＳｈｉｇｅｌｌａ Ｏ抗原を発現しない、請求項５に記載の細菌。
【請求項７】
前記株が、ΔｔｏｌＲΔｇａｌＵ株である、請求項４に記載の細菌。
【請求項８】
ｓｔｘＡ遺伝子および／またはｓｔｘＢ遺伝子が、不活性化されている、前述の請求項のいずれかに記載の細菌。
【請求項９】
ＴｏｌＡタンパク質、ＴｏｌＢタンパク質、ＴｏｌＱタンパク質、ＴｏｌＲタンパク質およびＰａｌタンパク質を発現するＳｈｉｇｅｌｌａ細菌であって、該ＴｏｌＡタンパク質、該ＴｏｌＱタンパク質、該ＴｏｌＲタンパク質および／または該Ｐａｌタンパク質は、（ａ）該細菌の内膜または外膜に位置し、かつ（ｂ）１つまたはそれ以上のアミノ酸配列変異を含み、ここで、該細菌は、培地中で増殖する場合に、該変異を含まない同じ細菌と比較して、より多量の外膜ブレブを放出する、Ｓｈｉｇｅｌｌａ細菌。
【請求項１０】
Ｓｈｉｇｅｌｌａ細菌であって、該Ｓｈｉｇｅｌｌａ細菌のＴｏｌ−Ｐａｌシステムの１つまたはそれ以上の成分が修飾を有し、ここで、該細菌は、培地中で増殖する間に、該修飾を欠いている同じ細菌よりも、該培地中に多量の外膜ブレブを放出し、かつ該細菌は、（ｉ）天然のＳｈｉｇｅｌｌａリポ多糖および／または（ｉｉ）Ｓｈｉｇｅｌｌａ腸毒素を発現しない、Ｓｈｉｇｅｌｌａ細菌。
【請求項１１】
Ｓｈｉｇｅｌｌａブレブを調製するためのプロセスであって、請求項１から１０のいずれか一項に記載の細菌を含む培地から該ブレブを分離する工程を含み、該細菌が、該細菌による該培地へのブレブの放出を可能にする条件下で増殖させられた、プロセス。
【請求項１２】
前記細菌が、鉄制限条件下で増殖させられた、請求項１１に記載のプロセス。
【請求項１３】
過剰ブレブ形成Ｓｈｉｇｅｌｌａ細菌を調製する方法であって、培地中で増殖させられた場合に、修飾によって該細菌が開始細菌より多量の外膜ブレブを該培地中へ放出するように、該開始細菌のＴｏｌ−Ｐａｌシステムの１つまたはそれ以上の成分をコードする遺伝子を修飾する工程を含み、該修飾は、該開始細菌のｔｏｌＡ遺伝子、ｔｏｌＢ遺伝子、ｔｏｌＱ遺伝子、ｔｏｌＲ遺伝子、および／またはｐａｌ遺伝子の１つまたはそれ以上を変異させることを含む、方法。
【請求項１４】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の細菌もしくは請求項１３に記載の方法によって得ることができる細菌から単離されたかもしくは得ることができるか、または請求項１１もしくは請求項１２に記載のプロセスによって単離されたかもしくは得ることができる、ブレブ。
【請求項１５】
ブレブを含む組成物であって、該ブレブは、請求項１から１０のいずれか一項に記載の細菌または請求項１３に記載の方法によって得ることができる細菌の培養の間に培地に放出される、組成物。
【請求項１６】
任意の生の細菌および／または細菌全体を含まない、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
ブレブを含む組成物であって、該ブレブが、培地の０．２２μｍのフィルターを通したろ過後に得ることができるろ液に存在し、請求項１から１０のいずれか一項に記載の細菌または請求項１３に記載の方法によって得ることができる細菌が、該培地中で増殖させられた、組成物。
【請求項１８】
請求項１から１０に記載の細菌または請求項１３に記載の方法によって得ることができる細菌を含む培地であって、該細菌が、該細菌による該培地へのブレブの放出を可能にする条件下で増殖させられた、培地。
【請求項１９】
機能的ＨｔｒＢ酵素を発現しない、Ｓｈｉｇｅｌｌａ株。
【請求項２０】
ｈｔｒＢがノックアウトされている、請求項１９に記載のＳｈｉｇｅｌｌａ株。
【請求項２１】
以下：
（ａ）配列番号８から６７から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号８から６７のうちの１つと少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ／または配列番号８から６７のいずれか１つの少なくとも７個の連続的なアミノ酸の断片であって、エピトープを含む、断片を含む、タンパク質
のうちの１つまたはそれ以上を含む、Ｓｈｉｇｅｌｌａブレブ。
【請求項２２】
ブレブを含まない免疫原性組成物であって、該組成物は、
（ａ）アミノ酸配列配列番号８から１３６；
（ｂ）配列番号８から１３６のうちの１つと少なくとも８５％の同一性を有し、かつ／または配列番号８から１３６のいずれか１つの少なくとも７個の連続的なアミノ酸の断片を含み、かつ配列番号８から１３６のうちの１つに由来するエピトープを含む、アミノ酸配列
を含むタンパク質を含む、組成物。
【請求項２３】
鉄利用可能性を制限している、Ｓｈｉｇｅｌｌａを培養するためのプロセス。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図６】
【図５】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図６】
【図５】
【図７】
【公表番号】特表２０１３−５０５７１６（Ｐ２０１３−５０５７１６Ａ）
【公表日】平成２５年２月２１日（２０１３．２．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５３０３５９（Ｐ２０１２−５３０３５９）
【出願日】平成２２年９月２８日（２０１０．９．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／００２５８２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０３６５６４
【国際公開日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【出願人】（５１２０７８９８２）ノバルティス バクシンズ インスティテュート フォー グローバル ヘルス エスアールエル (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年２月２１日（２０１３．２．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月２８日（２０１０．９．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／００２５８２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０３６５６４
【国際公開日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【出願人】（５１２０７８９８２）ノバルティス バクシンズ インスティテュート フォー グローバル ヘルス エスアールエル (1)
【Ｆターム（参考）】
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