過活動膀胱治療剤
【課題】前立腺肥大症などの膀胱出口部閉塞によりしばしば引き起こされる、止めようのない強い尿意が出現する過活動膀胱に対し、副作用として膀胱収縮力の低下を引き起こさない優れた治療薬を提供する。
【解決手段】筋原性の過活動膀胱におけるギャップジャンクションの機能を、グリチルレチン酸類又は医薬として許容されるその塩が抑制して、膀胱の過活動を抑えると共に、膀胱の収縮力を低下させない優れた過活動膀胱治療剤。
【解決手段】筋原性の過活動膀胱におけるギャップジャンクションの機能を、グリチルレチン酸類又は医薬として許容されるその塩が抑制して、膀胱の過活動を抑えると共に、膀胱の収縮力を低下させない優れた過活動膀胱治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グリチルレチン酸類の新規医薬用途に関する。具体的には、本発明はグリチルレチン酸類を含む過活動膀胱治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
過活動膀胱は、前立腺肥大症などの膀胱出口部閉塞によりしばしば引き起こされる、有病率の高い臨床症状である。
【０００３】
過活動膀胱の要因としては、神経原性と筋原性の２つが考えられている（非特許文献１及び２）。従来から、神経原性の要因については研究が進んでおり、様々な神経伝達物質や神経成長因子の関与が明らかになっている（非特許文献３及び４）。神経原性の要因に対しては、抗コリン剤（商品名：ポラキス、バップフォー、ベシケア、デトルシトール、ウリトス、ステーブラ等）が有効であるが、膀胱収縮力低下を引き起こすために、前立腺肥大症などの閉塞膀胱症例では使用できない難点がある（非特許文献５）。従って、膀胱収縮力の低下を引き起こさない、新たな過活動膀胱の治療薬の開発が望まれている。
【０００４】
一方で、筋原性の要因に関しては未解明な部分が多い。これまでに、過活動膀胱では、細胞細胞間電気的結合を形成するギャップジャンクションの構成タンパク質コネキシン４３の発現が増強することが報告されているが、過活動膀胱との明確な因果関係は証明されていない（非特許文献６〜８）。
【０００５】
本発明者らはこれまでに、過活動を呈する閉塞膀胱において、ｂＦＧＦが病態を制御していることを明らかにしている（非特許文献９）。
【非特許文献１】Ouslander, J.G., N Engl J Med, 2004. 350(8): p.786-799
【非特許文献２】Yoshimura, N. and M.B. Chancellor, J Urol, 2002. 168(5): p.1897-1913
【非特許文献３】de Groat, W.C., Urology, 1997. 50(6A Suppl): p.36-52; discussion 53-56
【非特許文献４】Yoshimura, N. Neurourol Urodyn, 2007. 26(6 Suppl): p.908-913
【非特許文献５】Abrams, P. and K.E. Andersson, BJU Int, 2007. 100(5): p.987-1006
【非特許文献６】Haefliger, J.A., et al., Exp Cell Res, 2002. 274(2): p.216-225
【非特許文献７】Haferkamp, A., et al., Eur Urol, 2004. 46(6):p.799-805
【非特許文献８】Li, L., et al., Am J Physiol Cell Physiol, 2007. 293(5): p. C1627-1635
【非特許文献９】Imamura, M., Am J Physiol Renal Physiol, 2007. 293(4): p.F1007-1017
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、膀胱収縮力の低下を引き起こさない、優れた過活動膀胱の治療剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ｂＦＧＦ徐放製剤を膀胱に投与することによりラット過活動膀胱モデルを作製した上で、筋原性要因としてのギャップジャンクションの関与を明らかにし、過活動膀胱の新たな治療方法の確立を目指した。
その結果、過活動膀胱においては、ｂＦＧＦにより膀胱筋層においてギャップジャンクションの構成タンパク質であるコネキシン４３の発現が上昇し、グリチルレチン酸によりギャップジャンクションの機能を抑制することで、膀胱の過活動を抑制し得ることを見出した。驚くべきことに、グリチルレチン酸は膀胱の収縮力を低下させなかった。
以上の知見に基づき、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明は以下に関する。
［１］グリチルレチン酸類又は医薬として許容されるその塩を含む、過活動膀胱治療剤。
［２］過活動膀胱が筋原性のものである、［１］記載の治療剤。
［３］過活動膀胱が膀胱出口部閉塞を伴うものである、［１］記載の治療剤。
［４］過活動膀胱の治療に使用するためのグリチルレチン酸類又は医薬として許容されるその塩。
［５］哺乳動物に、グリチルレチン酸類又は医薬として許容されるその塩の有効量を投与することを含む、該哺乳動物における過活動膀胱の治療方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の治療剤を用いることにより、過活動膀胱を効果的に治療し得る。特に、膀胱の収縮力を低下させずに、膀胱の過活動を抑制できる点で本発明の治療剤は優れている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、グリチルレチン酸類又は医薬として許容されるその塩を含む、過活動膀胱治療剤を提供する。
【００１１】
グリチルレチン酸類としては、グリチルレチン酸、グリチルレチン酸のエステル、グリチルレチン酸の糖抱合体、グリチルレチン酸の糖抱合体のエステル等を挙げることができる。グリチルレチン酸としては、α−グリチルレチン酸、β−グリチルレチン酸を挙げることができる。グリチルレチン酸のエステルとしては、α−グリチルレチン酸ステアリル、β−グリチルレチン酸ステアリル、α−グリチルレチン酸ピリドキシン、β−グリチルレチン酸ピリドキシン、α−グリチルレチン酸グリセリン、β−グリチルレチン酸グリセリン等を挙げることができる。グリチルレチン酸の糖抱合体としては、グリチルリチン酸（α−グリチルリチン酸又はβ−グリチルリチン酸）等を挙げることができる。グリチルレチン酸の糖抱合体のエステルとしては、α−グリチルリチン酸メチルエステル、β−グリチルリチン酸メチルエステル等を挙げることが出来る。
【００１２】
グリチルレチン酸類の医薬として許容される塩には、例えば、無機塩基又は有機塩基との塩が含まれる。前記無機塩基としては、例えば、アンモニア、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム等の水酸化物、炭酸塩、又は重炭酸塩等である。前記有機塩基との塩としては、例えば、モノ−、ジ−、若しくはトリ−アルキルアミン塩（例えば、メチルアミン、ジメチルアミン、トリエチルアミンなど）、ヒドロキシルアミン塩、グアニジン塩、Ｎ−メチルグルコサミン塩、又はアミノ酸塩等を挙げることができる。グリチルレチン酸類の医薬として許容される塩の好ましい具体例としては、α−グリチルリチン酸トリナトリウム、α−グリチルリチン酸モノカリウム、α−グリチルリチン酸ジカリウム、α−グリチルリチン酸モノアンモニウム、β−グリチルリチン酸トリナトリウム、β−グリチルリチン酸モノカリウム、β−グリチルリチン酸ジカリウム、または、β−グリチルリチン酸モノアンモニウム等を挙げることが出来る。
【００１３】
哺乳動物に、グリチルレチン酸類又は医薬として許容されるその塩の有効量を投与することにより、該哺乳動物における過活動膀胱を治療し得る。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物；ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜；イヌ、ネコ等のペット；ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることができる。
【００１４】
過活動膀胱とは、突然、止めようのない強い尿意が出現する“尿意切迫感”を有する状態をいう。通常、過活動膀胱は頻尿（昼間８回以上、夜間１回以上）を伴うが、切迫性尿失禁の有無は問わない（２００２年の国際禁制学会で定義）。過活動膀胱には、その原因により神経原性の過活動膀胱と、筋原性の過活動膀胱とに分類される。神経原性の過活動膀胱とは、脳から膀胱（尿道）排尿筋の神経受容体に至る神経回路上の異常により生じる過活動膀胱をいう。筋原性の過活動膀胱とは、排尿筋自身の興奮性の亢進により生じる過活動膀胱をいう。本発明の治療剤は、これらのいずれの型の過活動膀胱にも有効であるが、特に筋原性の過活動膀胱に有利である。
【００１５】
また、過活動膀胱は、脳卒中や脳梗塞などの脳血管障害、パーキンソン病などの脳の障害、脊髄損傷や多発性硬化症などの脊髄の障害の後遺症として生じたり、前立腺肥大症等の膀胱出口部閉塞に随伴して発症する。本発明の治療剤は、これらのいずれの型の過活動膀胱にも有効であるが、グリチルレチン酸類は、膀胱収縮力の低下を引き起こすことなく膀胱の過活動を抑制することが可能であるため、本発明の治療剤はとりわけ膀胱出口部閉塞を伴う過活動膀胱に有効である。
【００１６】
本発明の治療剤は、グリチルレチン酸類又は医薬として許容されるその塩と医薬として許容される担体とを混合して、常套手段に従って製剤化することができる。
【００１７】
例えば、グリチルレチン酸類又は医薬として許容されるその塩は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に使用できる。あるいは、グリチルレチン酸類又は医薬として許容されるその塩は、水もしくはそれ以外の医薬として許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤又は膀胱内注入剤の形で非経口的に使用できる。これらの製剤は、例えば、グリチルレチン酸類又は医薬として許容されるその塩を、医薬として許容される公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに、一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。
【００１８】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射剤又は膀胱内注入剤のための無菌組成物は、活性成分を、適切な無菌の水溶液や油性液中に溶解又は懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例：エタノール）、ポリアルコール（例：プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例：ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
【００１９】
また、本発明の治療剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射剤や膀胱内注入剤は通常、適当なアンプルに充填される。
【００２０】
また、グリチルレチン酸類又は医薬として許容されるその塩を含有するデルマクリン、ハイデルマート、強力ミノファーゲンＣ、グリチロン等の市販された医薬を本発明の治療剤に適用してもよい。
【００２１】
本発明の治療剤におけるグリチルレチン酸類又は医薬として許容されるその塩の含有量は、製剤の形態によって相違するが、経口製剤の場合、通常、製剤全体に対して約０．１〜９９．９重量％、好ましくは約１〜９９重量％、さらに好ましくは約１０〜９０重量％程度であり、非経口製剤の場合、通常、製剤全体に対して約０．１〜９９．９重量％、好ましくは約１〜９９重量％、さらに好ましくは約１０〜９０重量％程度である。
【００２２】
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、上記の哺乳動物に対して投与することができる。
【００２３】
グリチルレチン酸類又は医薬として許容されるその塩の投与量は、投与ルート、症状、患者の年令などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、過活動膀胱の患者（体重６０ｋｇ）においては、一日につき約１〜２０００μｇ／ｋｇ程度、好ましくは約５〜１０００μｇ／ｋｇ程度を投与するのが好都合である。また、非経口投与の場合、一般的に例えば、過活動膀胱の患者（体重６０ｋｇ）においては、一日につき約１〜２０００μｇ／ｋｇ程度、好ましくは約５〜１０００μｇ／ｋｇ程度を投与するのが好都合である。
【００２４】
以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００２５】
［実施例１］
原料及び方法
（試薬）
ディスパーゼは合同酒精（東京、日本）から、ＩＶ型コラゲナーゼ及びα−グリチルレチン酸（ＧＡ）はSigma（セントルイス、ＭＯ）から、ＰＤ９８０５９はCalbiochem（サンディエゴ、ＣＡ）から、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜はMillipore（ベッドフォード、ＭＡ）から、そしてジアミノベンチジン テトラヒドロクロライド（DAB）はDojindo Laboratories（熊本、日本）から購入した。組換えヒトｂＦＧＦは科研製薬株式会社（東京、日本）から提供を受けた。
【００２６】
抗体は以下に記載した製造者から購入した：抗カルポニン、抗β−アクチン（Sigma）、抗ｂＦＧＦ（Upstate、レイクプラシッド、ＮＹ）、抗コネキシン４３（Zymed, サンフランシスコ、ＣＡ）、抗コネキシン４５（Chemicon, テメクラ、ＣＡ）、ＨＲＰ抱合抗マウス及び抗ウサギ抗体（Pierce,ロックフォード、ＩＬ）、ビオチン化抗ウサギ抗体（Vector Laboratories, バーリンガム、ＣＡ）、ＦＩＴＣ抱合抗マウス抗体（Dako、グロストラップ、デンマーク）。Alexa Fluor 555抱合ストレプトアビジンは、Molecular Probes（ユージーン、ＯＲ）から購入した。
【００２７】
ＢｉｏＲａｄプロテインアッセイキットは、BioRad Laboratories（ハーキュルス、ＣＡ）から、SuperSignal West Pico ケミルミネッセンスサブストレイトはPierce（ロックフォード、ＩＬ）から、Vectastain Elite ABC Kit （マウスＩｇＧ）は、Vector Laboratoriesから購入した。
【００２８】
（細胞培養）
膀胱平滑筋細胞を９週齢メスＳＤラット（Japan Slc Inc., 静岡、日本）から、以前記載した方法を用いて単離した（Am J Physiol Renal Physiol, 293: F1007-1017, 2007；Am J Pathol, 166: 565-573, 2005）。２回継代後の細胞を、ウェスタンブロット解析用は６ウェルプレートに、免疫蛍光法試験用はチャンバースライドに、２×１０４個／ｍｌで播き、各アッセイの前に０．５％ウシ血清を含む低血清ＤＭＥＭ中で培養することで、血清の影響を除外した。細胞をｂＦＧＦで４日間刺激した（０、１０又は５０ｎｇ／ｍｌ、ｎ＝３）。ｂＦＧＦの下流の経路を調べるため、細胞を１０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ＋１０μｇ／ｍｌ抗ｂＦＧＦ抗体又は５μＭ ＰＤ９８０５９で２日間刺激した（ｎ＝３）。コネキシン４３の発現を、ウェスタンブロット及び免疫蛍光法により評価した。
【００２９】
（動物）
Japan Slc Inc.から体重１７０〜１９０ｇの７週齢メスＳＤラットを購入した。動物はＮＩＨ動物ケアガイドラインに従って取り扱い、全ての実験は京都大学動物実験委員会により承認された。
【００３０】
（ラット膀胱閉塞モデル）
６匹のラットにおいて、膀胱閉塞（bladder outlet obstruction: ＢＯＯ）を以前記載した方法に従い作製した（J Urol, 170: 1427-1431, 2003；J Urol, 170: 1022-1026, 2003）。方法を簡潔に述べると、まず近位尿道を膣壁から剥離し、長軸方向に切断した２ｍｍ長ＰＥ２００ポリエチレンカテーテル（BD Intramedic、スパークス、ＭＤ）を近位尿道を覆うように留置した。偽手術群の６匹のラットでは、同様の処置を施行後、カテーテルを留置せず取り除いた。４週間後、全てのラットから膀胱を摘出し、重量を計測して肥大を確認した。膀胱から筋切片を作製し、カルバコールに対する筋切片の収縮性を測定した。免疫組織化学検査を行い、ｂＦＧＦの発現を評価した。免疫蛍光法試験を行い、コネキシン４３の発現を評価した。
【００３１】
（ゼラチンハイドロゲルを放出担体として用いた、ｂＦＧＦのラット膀胱に対する動物実験効果）
ゼラチンハイドロゲルシートを以前記載した方法に従い作製した（Am J Physiol Renal Physiol, 293: F1007-1017, 2007；Biomaterials, 19: 807-815, 1998）。シートを凍結乾燥し、長方形（８×５ｍｍ）にカットし、ｂＦＧＦ水溶液を浸透させることにより、ｂＦＧＦ含浸ゼラチンハイドロゲルを得た。ラットを５０ｍｇ／ｋｇケタミン及び１０ｍｇ／ｋｇキシラジンで麻酔した後、腹部正中切開を加え膀胱を露出した。ｂＦＧＦ含浸ゼラチンハイドロゲル（０、１、５又は１０μｇ／部位、ｎ＝１２）を、４本の8-0ナイロン縫合糸により、各膀胱の腹側に固定した。これらの縫合糸は、検体回収時のマーキングとして用いた。偽手術群（ｎ＝１２）では、ゼラチンハイドロゲル処置を行わなかった。１４日後に犠牲死させた後、各群の６匹のラットについては、ハイドロゲル固定部位の膀胱から筋切片を作製し、カルバコールに対する筋切片の収縮性を計測した。膀胱同部位におけるコネキシン４３及びコネキシン４５の発現を、ウェスタンブロットにより評価した。コネキシン４３の発現は免疫蛍光法試験でも評価した。各群における他の６匹のラットに対しては蓄尿時膀胱内圧測定（Filling cystometry）を行った。
【００３２】
（免疫ブロッティング）
プロテアーゼ阻害剤を含む放射性免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）緩衝液を用いて、膀胱組織及び培養細胞から、細胞ライセートを抽出した。細胞ライセート中のタンパク量は、BioRad Protein Assayキットを用いて測定した。細胞ライセートをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、Immobilon-Pメンブレンに転写した。メンブレンをコネキシン４３抗体（１：２００）、コネキシン４５抗体（１：５００）、そして内部コントロールとしてβ−アクチン抗体（１：２０００）でインキュベートした。ＨＲＰ−抱合抗マウス又抗ウサギ二次抗体でのインキュベーション後、目的タンパクと結合した抗体をSuperSignal West Picoケミルミネッセンス基質を用いて検出した。
【００３３】
（免疫組織化学検査）
膀胱組織を４％パラホルムアルデヒド中で固定し、パラフィン包埋した後、５μｍの切片を作製した。切片を、抗原修復のために０．０１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で２０分間加熱した。すべての試料を、ｂＦＧＦに対する抗体（１：１００）により１２時間、４℃にてインキュベートした。陰性対照切片は、一次抗体なしでインキュベートした。さらにVectastain Elite ABC kit（マウスＩｇＧ）で処理した後、切片を引き続きＤＡＢでインキュベートすることにより抗体を検出し、ヘマトキシリンにより対比染色した。
【００３４】
（免疫蛍光法試験）
培養細胞は、ＰＢＳで２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定した。動物組織は、４％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋し、５μｍ切片にカットした後、抗原修復のため、切片を０．０１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で２０分間加熱した。全ての検体は、コネキシン４３抗体（１：１００）またカルポニン抗体（１：１０００）で１２時間４℃でインキュベートした。陰性対照切片は、一次抗体なしでインキュベートした。コネキシン４３抗体結合は、ビオチン化抗ウサギ二次抗体及びAlexa Fluor 555抱合ストレプトアビジンを用いて検出した。カルポニン抗体結合は、ＦＩＴＣ抱合抗マウス二次抗体を用いて検出した。
【００３５】
（筋切片試験）
収縮力測定は以前記載した方法に従い行った（Am J Physiol Renal Physiol, 293: F1007-1017, 2007；J Urol, 170: 1633-1638, 2003）。膀胱検体から２〜３ｍｍ幅の筋切片を作製した。ホルダーに固定した切片を、３７℃クレブス液で満たされた組織浴槽中にセットした。切片は、０．５ｇの力をかけて１時間平衡状態にした後で、カルバコールで刺激した。１０μｇ／部位 ｂＦＧＦ群では、ギャップジャンクション活性を阻害するために、α−ＧＡの存在下で刺激する切片を、別に作製した。これらの筋切片は、通常のカルバコール刺激の後にクレブス液で３回洗浄し、３０μＭのα−ＧＡを含むクレブス液中に留置し、カルバコールで刺激した。試験の最後にそれぞれの筋切片の重量を測定した。収縮力は１００ｍｇ組織重量あたりのグラム張力で表した。用量反応曲線（０．０１〜１００μＭ）により最大張力が１０μＭカルバコールで生じることが明らかとなったため、１０μＭカルバコールでの筋収縮力を、最大反応である１００％として規定した。各筋切片についてのＥＣ５０値を、ＳＡＳ８．２ソフトウェア（SAS Institute, カリー、ＮＣ）を用いて非線形回帰により算出した。
【００３６】
（蓄尿時膀胱内圧測定（Filling cystometry））
蓄尿時膀胱内圧測定を以前記載した方法に従い行った（Am J Physiol Renal Physiol, 293: F1007-1017, 2007；J Urol, 170: 1633-1638, 2003）。９００ｍｇ／ｋｇウレタン麻酔下にて、２．８ｍｌ／時間の速度でラット膀胱中に生理食塩水を注入した。各試験において、少なくとも２時間にわたり排尿を記録した。最終収縮時における排尿及び残尿量を、シリンジで尿を吸引することにより測定した。膀胱容量は、排尿量に残尿量を加えたものを膀胱容量と定義した。
【００３７】
（統計学的解析）
全てのデータは、平均値±標準偏差にて表した。データは、SAS 8.2ソフトウェアを用いて、unpaired Studen’s t-test又はDunnett’S testにて解析した。ｐ＜０．０５を統計学的に有意な差として判定した。
【００３８】
結果
（閉塞膀胱は、尿路上皮でのｂＦＧＦ発現亢進、平滑筋でのコネキシン４３発現亢進を示す。）
閉塞膀胱ラットでは、膀胱重量が有意に増加していた（偽手術 ６６．５±１４．３ｍｇ、閉塞膀胱 ２２７．７±３７．９ｍｇ、ｐ＜０．０５）。免疫組織化学検査では、閉塞膀胱の尿路上皮層において、偽手術群の膀胱よりもｂＦＧＦが強発現していた。免疫蛍光法試験では、閉塞膀胱群において、偽手術群よりもコネキシン４３が強発現していた。そしてほとんどのコネキシン４３陽性細胞は、平滑筋マーカーであるカルポニンに対しても陽性であった（図１Ａ）。
【００３９】
（閉塞膀胱は、コリン作動性刺激に対する感受性亢進を示す。）
以前の研究（Urology, 50: 57-57; discussion 68-73, 1997、J Urol, 138: 1461-1466, 1987）によると、用量反応曲線の左方向へのシフト、及びＥＣ５０値の減少は筋原性のコリン感受性亢進の証拠と考えられる。筋切片試験を行った結果、閉塞膀胱の用量反応曲線は、偽手術膀胱の曲線と比較して左へシフトした（図１Ｂ）。閉塞膀胱のＥＣ５０値も、偽手術膀胱の値と比較して減少した（図１Ｃ）。
【００４０】
（ｂＦＧＦはＥＲＫ１／２経路を介してラット膀胱平滑筋細胞におけるコネキシン４３の発現を増強する。）
ウェスタンブロッティングでは、抗コネキシン４３抗体は複数のバンド（非リン酸化（４１ｋＤａ）及びリン酸化（４３〜４６ｋＤａ））を検出した。ウェスタンブロッティングの結果、２〜４日間の１０もしくは５０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ刺激により、膀胱平滑筋細胞におけるコネキシン４３の発現が顕著に増強した。コネキシン４３のリン酸化も同様に増強した（図２Ａ）。ラット膀胱平滑筋細胞において、このｂＦＧＦの効果を制御するシグナルを検討するために、ＥＲＫ１／２シグナルを特異的阻害剤により遮断した。ウェスタンブロッティングの結果、抗ｂＦＧＦ中和抗体での処理と同様に、ＭＥＫ阻害剤であるＰＤ９８０５９でＥＲＫ１／２の上流を遮断することにより、コネキシン４３の発現増強が阻害された（図２Ｂ）。免疫蛍光法試験の結果、２日間の１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ刺激で膀胱平滑筋細胞におけるコネキシン４３の発現が増強した。この効果はＰＤ９８０５９及び抗ｂＦＧＦ抗体により阻害された（図２Ｃ）。
【００４１】
（ｂＦＧＦはギャップジャンクション合成を介してラット膀胱での筋原性のコリン感受性亢進を引き起こす。）
筋切片試験の結果、１、５（データ示さず）、又は１０μｇ／部位のｂＦＧＦ投与群において、用量反応曲線が偽手術群と比較して左へシフトした（図３Ａ）。１０μｇ／部位のｂＦＧＦ投与群のＥＣ５０値は、偽手術群の膀胱と比較して有意に減少した（図３Ｂ）。今回認めた筋原性の感受性亢進がギャップジャンクションにより制御されているかどうかを調べるため、偽手術群および１０μｇ／部位ｂＦＧＦ投与群に対して、ギャップジャンクション阻害剤であるα−ＧＡの存在下にカルバコールで刺激した。α−ＧＡにより、１０μｇ／部位ｂＦＧＦ群における用量反応曲線の左方向シフトは認めなくなったが、偽手術群の用量反応曲線への影響は認めなかった（図３Ｃ）。α−ＧＡにより、１０μｇ／部位ｂＦＧＦ投与群でのＥＣ５０値は有意に増加した（図３Ｄ）。偽手術群および１０μｇ／部位ｂＦＧＦ投与群いずれにおいても、α−ＧＡは最大収縮力に影響を及ぼさなかった（図５）。
これらの結果に基づき、１０μｇ／部位ｂＦＧＦ投与群でのコネキシン発現を評価した。ウェスタンブロッティングでは、１０μｇ／部位ｂＦＧＦ群において偽手術群と比較して、コネキシン４３の発現は増強したが、コネキシン４５の発現は不変であった（図３Ｅ）。免疫蛍光法試験では、１０μｇ／部位ｂＦＧＦ群において偽手術群と比較して、平滑筋でのコネキシン４３の発現が増強した（図３Ｆ）。
【００４２】
（ｂＦＧＦはラット膀胱における排尿筋過活動を誘導する）
膀胱内圧測定では、１０μｇ／部位ｂＦＧＦ投与群は偽手術群と比較して、排尿筋過活動を示した（図４Ａ）。ｂＦＧＦ投与群の排尿回数は、偽手術群よりも有意に多かった（図４Ｂ）。ｂＦＧＦ投与群における膀胱容量は、偽手術群よりも有意に低かった（図４Ｃ）。残尿量は、全群においてごく少量であった（データ示さず）。ｂＦＧＦ投与群の最大排尿圧は偽手術群よりも有意に低かった（図４Ｄ）。ｂＦＧＦ投与群の膀胱コンプライアンスは偽手術群と比較して有意な変化はなかった（図４Ｅ）。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明の治療剤を用いることにより、過活動膀胱を効果的に治療し得る。特に、膀胱の収縮力を低下させずに、膀胱の過活動を抑制できる点で本発明の治療剤は優れている。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】閉塞膀胱におけるｂＦＧＦ発現、コネキシン４３発現及びコリン作動性刺激に対する感受性亢進。Ａ：ラット閉塞膀胱におけるｂＦＧＦ及びコネキシン４３の発現。膀胱切片（５μｍ厚）を抗ｂＦＧＦ抗体（１：１００）で処理し、ＤＡＢで染色した（ｎ＝６）。一段目の図では、ｂＦＧＦ陽性所見を褐色で示す。ｂＦＧＦは、偽手術群と比較して、閉塞膀胱の尿路上皮において顕著に発現していた。さらに膀胱切片をコネキシン４３抗体（１：１００）及びカルポニン抗体（１：１０００）により二重染色した（ｎ＝６）。二段目の図ではコネキシン４３陽性所見を赤で示し、三段目の図ではカルポニン陽性所見を緑で示し、四段目の図では合成所見を示す。閉塞膀胱群の排尿筋層では、偽手術群と比較して、コネキシン４３の発現が増強していた。（スケールバーは５０μｍ）Ｂ、Ｃ：閉塞膀胱ラットにおける筋切片試験。筋切片の収縮力を、閉塞膀胱群及び偽手術群において、カルバコール刺激下で検討した（ｎ＝６）。閉塞膀胱群での用量反応曲線は、偽手術群と比較して左方向にシフトした（Ｂ）。閉塞膀胱群におけるＥＣ５０値は、偽手術群と比較して有意に減少した（Ｃ）。*Ｐ＜０．０５で統計学的に有意差あり。
【図２】ｂＦＧＦ刺激による膀胱平滑筋細胞でのコネキシン４３発現。Ａ，Ｂ：膀胱平滑筋細胞におけるコネキシン４３発現：ウェスタンブロット解析。膀胱平滑筋細胞から細胞ライセートを採取した（ｎ＝３）。コネキシン４３抗体は非リン酸化（４１ｋＤａ）及びリン酸化（４３〜４６ｋＤａ）の複数の陽性バンドを示した。全コネキシン４３発現及びリン酸化コネキシン４３発現は、ｂＦＧＦ刺激により増強した（Ａ）。ＰＤ９８０５９（ＥＲＫ１／２阻害剤）及び抗ｂＦＧＦ中和抗体は、ｂＦＧＦによるコネキシン４３の発現増強を阻害した。Ｃ：膀胱平滑筋細胞におけるコネキシン４３発現：免疫蛍光法試験。膀胱平滑筋細胞を、２日間培養した（ｎ＝３）。上段の図ではコネキシン４３陽性所見を赤で示し、中段の図ではカルポニン陽性所見を緑で示し、下段の図では合成所見を示す。ｂＦＧＦ刺激により、膀胱平滑筋細胞におけるコネキシン４３発現は増強した。ＰＤ９８０５９及び抗ｂＦＧＦ中和抗体は、ｂＦＧＦによるコネキシン４３の発現増強を阻害した。（スケールバーは２０μｍ）
【図３】ｂＦＧＦ投与膀胱におけるギャップジャンクションを介したコリン感受性亢進。Ａ，Ｂ：ｂＦＧＦ投与膀胱における筋切片試験。ｂＦＧＦ投与膀胱に対して、筋切片の収縮力をカルバコール刺激下で測定した（ｎ＝６）。ｂＦＧＦ投与群（１０μｇ／部位）の膀胱では、偽手術群と比較して、用量反応曲線は左方向にシフトした（Ａ）。またｂＦＧＦ投与群（１０μｇ／部位）のＥＣ５０値は、偽手術群と比較して有意に減少した（Ｂ）。Ｃ、Ｄ：筋切片試験におけるギャップジャンクション活性の阻害。３０μＭのα−ＧＡ（ギャップジャンクション阻害剤）を含むクレブス液中で筋切片試験を行った（ｎ＝６）。α−ＧＡの存在下では、ｂＦＧＦ投与群（１０μｇ／部位）の用量反応曲線は左にシフトせず、偽手術群の曲線とほぼ同様であった（Ｃ）。ｂＦＧＦ投与群（１０μｇ／部位）のＥＣ５０値については、α−ＧＡありの条件では、α−ＧＡなしの条件と比較して有意に増加した（Ｄ）。Ｅ：膀胱におけるコネキシン４３及びコネキシン４５発現：ウェスタンブロット解析。ｂＦＧＦ投与１４日後の膀胱から細胞ライセートを採取した（ｎ＝６）。１０μｇ／部位ｂＦＧＦ投与群では、全コネキシン４３の発現およびリン酸化コネキシン４３の発現が増強した。一方で、コネキシン４５の発現は変化しなかった。Ｆ：膀胱におけるコネキシン４３発現：免疫蛍光法試験。ｂＦＧＦ投与１４日後の膀胱から組織を摘出した。上段の図ではコネキシン４３陽性所見を赤で示し、中段の図ではカルポニン陽性所見を緑で示し、下段の図では合成所見を示す。ｂＦＧＦにより、平滑筋層におけるコネキシン４３の発現が増強した。（スケールバーは５０μｍ）
【図４】ｂＦＧＦ投与膀胱における蓄尿時膀胱内圧測定。Ａ：膀胱内圧測定の所見。偽手術群、０μｇ／部位 ｂＦＧＦ群及び１０μｇ／部位 ｂＦＧＦ群について膀胱内圧測定を行った。Ｂ：排尿回数。ｂＦＧＦ投与群（１０μｇ／部位）では、偽手術群と比較して、排尿回数は有意に増加した。Ｃ：膀胱容量。ｂＦＧＦ投与群（１０μｇ／部位）では、偽手術群と比較して、容量が有意に減少した。Ｄ：最大排尿圧。ｂＦＧＦ投与群（１０μｇ／部位）では、偽手術群と比較して、最大排尿圧は有意に減少した。Ｅ：膀胱コンプライアンス。ｂＦＧＦ投与群（１０μｇ／部位）では、偽手術群と比較して、コンプライアンスは変化しなかった。*Ｐ＜０．０５で統計学的に有意差あり。
【図５】１０μｇ／部位ｂＦＧＦ投与群および偽手術群における、α−ＧＡの膀胱最大収縮力に対する効果。α−ＧＡなし条件下の最大収縮力に対する、α−ＧＡあり条件下の最大収縮力の割合（％）を示す。α−ＧＡは、両群において、最大収縮力にほとんど影響しなかった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グリチルレチン酸類の新規医薬用途に関する。具体的には、本発明はグリチルレチン酸類を含む過活動膀胱治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
過活動膀胱は、前立腺肥大症などの膀胱出口部閉塞によりしばしば引き起こされる、有病率の高い臨床症状である。
【０００３】
過活動膀胱の要因としては、神経原性と筋原性の２つが考えられている（非特許文献１及び２）。従来から、神経原性の要因については研究が進んでおり、様々な神経伝達物質や神経成長因子の関与が明らかになっている（非特許文献３及び４）。神経原性の要因に対しては、抗コリン剤（商品名：ポラキス、バップフォー、ベシケア、デトルシトール、ウリトス、ステーブラ等）が有効であるが、膀胱収縮力低下を引き起こすために、前立腺肥大症などの閉塞膀胱症例では使用できない難点がある（非特許文献５）。従って、膀胱収縮力の低下を引き起こさない、新たな過活動膀胱の治療薬の開発が望まれている。
【０００４】
一方で、筋原性の要因に関しては未解明な部分が多い。これまでに、過活動膀胱では、細胞細胞間電気的結合を形成するギャップジャンクションの構成タンパク質コネキシン４３の発現が増強することが報告されているが、過活動膀胱との明確な因果関係は証明されていない（非特許文献６〜８）。
【０００５】
本発明者らはこれまでに、過活動を呈する閉塞膀胱において、ｂＦＧＦが病態を制御していることを明らかにしている（非特許文献９）。
【非特許文献１】Ouslander, J.G., N Engl J Med, 2004. 350(8): p.786-799
【非特許文献２】Yoshimura, N. and M.B. Chancellor, J Urol, 2002. 168(5): p.1897-1913
【非特許文献３】de Groat, W.C., Urology, 1997. 50(6A Suppl): p.36-52; discussion 53-56
【非特許文献４】Yoshimura, N. Neurourol Urodyn, 2007. 26(6 Suppl): p.908-913
【非特許文献５】Abrams, P. and K.E. Andersson, BJU Int, 2007. 100(5): p.987-1006
【非特許文献６】Haefliger, J.A., et al., Exp Cell Res, 2002. 274(2): p.216-225
【非特許文献７】Haferkamp, A., et al., Eur Urol, 2004. 46(6):p.799-805
【非特許文献８】Li, L., et al., Am J Physiol Cell Physiol, 2007. 293(5): p. C1627-1635
【非特許文献９】Imamura, M., Am J Physiol Renal Physiol, 2007. 293(4): p.F1007-1017
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、膀胱収縮力の低下を引き起こさない、優れた過活動膀胱の治療剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ｂＦＧＦ徐放製剤を膀胱に投与することによりラット過活動膀胱モデルを作製した上で、筋原性要因としてのギャップジャンクションの関与を明らかにし、過活動膀胱の新たな治療方法の確立を目指した。
その結果、過活動膀胱においては、ｂＦＧＦにより膀胱筋層においてギャップジャンクションの構成タンパク質であるコネキシン４３の発現が上昇し、グリチルレチン酸によりギャップジャンクションの機能を抑制することで、膀胱の過活動を抑制し得ることを見出した。驚くべきことに、グリチルレチン酸は膀胱の収縮力を低下させなかった。
以上の知見に基づき、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明は以下に関する。
［１］グリチルレチン酸類又は医薬として許容されるその塩を含む、過活動膀胱治療剤。
［２］過活動膀胱が筋原性のものである、［１］記載の治療剤。
［３］過活動膀胱が膀胱出口部閉塞を伴うものである、［１］記載の治療剤。
［４］過活動膀胱の治療に使用するためのグリチルレチン酸類又は医薬として許容されるその塩。
［５］哺乳動物に、グリチルレチン酸類又は医薬として許容されるその塩の有効量を投与することを含む、該哺乳動物における過活動膀胱の治療方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の治療剤を用いることにより、過活動膀胱を効果的に治療し得る。特に、膀胱の収縮力を低下させずに、膀胱の過活動を抑制できる点で本発明の治療剤は優れている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、グリチルレチン酸類又は医薬として許容されるその塩を含む、過活動膀胱治療剤を提供する。
【００１１】
グリチルレチン酸類としては、グリチルレチン酸、グリチルレチン酸のエステル、グリチルレチン酸の糖抱合体、グリチルレチン酸の糖抱合体のエステル等を挙げることができる。グリチルレチン酸としては、α−グリチルレチン酸、β−グリチルレチン酸を挙げることができる。グリチルレチン酸のエステルとしては、α−グリチルレチン酸ステアリル、β−グリチルレチン酸ステアリル、α−グリチルレチン酸ピリドキシン、β−グリチルレチン酸ピリドキシン、α−グリチルレチン酸グリセリン、β−グリチルレチン酸グリセリン等を挙げることができる。グリチルレチン酸の糖抱合体としては、グリチルリチン酸（α−グリチルリチン酸又はβ−グリチルリチン酸）等を挙げることができる。グリチルレチン酸の糖抱合体のエステルとしては、α−グリチルリチン酸メチルエステル、β−グリチルリチン酸メチルエステル等を挙げることが出来る。
【００１２】
グリチルレチン酸類の医薬として許容される塩には、例えば、無機塩基又は有機塩基との塩が含まれる。前記無機塩基としては、例えば、アンモニア、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム等の水酸化物、炭酸塩、又は重炭酸塩等である。前記有機塩基との塩としては、例えば、モノ−、ジ−、若しくはトリ−アルキルアミン塩（例えば、メチルアミン、ジメチルアミン、トリエチルアミンなど）、ヒドロキシルアミン塩、グアニジン塩、Ｎ−メチルグルコサミン塩、又はアミノ酸塩等を挙げることができる。グリチルレチン酸類の医薬として許容される塩の好ましい具体例としては、α−グリチルリチン酸トリナトリウム、α−グリチルリチン酸モノカリウム、α−グリチルリチン酸ジカリウム、α−グリチルリチン酸モノアンモニウム、β−グリチルリチン酸トリナトリウム、β−グリチルリチン酸モノカリウム、β−グリチルリチン酸ジカリウム、または、β−グリチルリチン酸モノアンモニウム等を挙げることが出来る。
【００１３】
哺乳動物に、グリチルレチン酸類又は医薬として許容されるその塩の有効量を投与することにより、該哺乳動物における過活動膀胱を治療し得る。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物；ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜；イヌ、ネコ等のペット；ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることができる。
【００１４】
過活動膀胱とは、突然、止めようのない強い尿意が出現する“尿意切迫感”を有する状態をいう。通常、過活動膀胱は頻尿（昼間８回以上、夜間１回以上）を伴うが、切迫性尿失禁の有無は問わない（２００２年の国際禁制学会で定義）。過活動膀胱には、その原因により神経原性の過活動膀胱と、筋原性の過活動膀胱とに分類される。神経原性の過活動膀胱とは、脳から膀胱（尿道）排尿筋の神経受容体に至る神経回路上の異常により生じる過活動膀胱をいう。筋原性の過活動膀胱とは、排尿筋自身の興奮性の亢進により生じる過活動膀胱をいう。本発明の治療剤は、これらのいずれの型の過活動膀胱にも有効であるが、特に筋原性の過活動膀胱に有利である。
【００１５】
また、過活動膀胱は、脳卒中や脳梗塞などの脳血管障害、パーキンソン病などの脳の障害、脊髄損傷や多発性硬化症などの脊髄の障害の後遺症として生じたり、前立腺肥大症等の膀胱出口部閉塞に随伴して発症する。本発明の治療剤は、これらのいずれの型の過活動膀胱にも有効であるが、グリチルレチン酸類は、膀胱収縮力の低下を引き起こすことなく膀胱の過活動を抑制することが可能であるため、本発明の治療剤はとりわけ膀胱出口部閉塞を伴う過活動膀胱に有効である。
【００１６】
本発明の治療剤は、グリチルレチン酸類又は医薬として許容されるその塩と医薬として許容される担体とを混合して、常套手段に従って製剤化することができる。
【００１７】
例えば、グリチルレチン酸類又は医薬として許容されるその塩は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に使用できる。あるいは、グリチルレチン酸類又は医薬として許容されるその塩は、水もしくはそれ以外の医薬として許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤又は膀胱内注入剤の形で非経口的に使用できる。これらの製剤は、例えば、グリチルレチン酸類又は医薬として許容されるその塩を、医薬として許容される公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに、一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。
【００１８】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射剤又は膀胱内注入剤のための無菌組成物は、活性成分を、適切な無菌の水溶液や油性液中に溶解又は懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例：エタノール）、ポリアルコール（例：プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例：ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
【００１９】
また、本発明の治療剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射剤や膀胱内注入剤は通常、適当なアンプルに充填される。
【００２０】
また、グリチルレチン酸類又は医薬として許容されるその塩を含有するデルマクリン、ハイデルマート、強力ミノファーゲンＣ、グリチロン等の市販された医薬を本発明の治療剤に適用してもよい。
【００２１】
本発明の治療剤におけるグリチルレチン酸類又は医薬として許容されるその塩の含有量は、製剤の形態によって相違するが、経口製剤の場合、通常、製剤全体に対して約０．１〜９９．９重量％、好ましくは約１〜９９重量％、さらに好ましくは約１０〜９０重量％程度であり、非経口製剤の場合、通常、製剤全体に対して約０．１〜９９．９重量％、好ましくは約１〜９９重量％、さらに好ましくは約１０〜９０重量％程度である。
【００２２】
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、上記の哺乳動物に対して投与することができる。
【００２３】
グリチルレチン酸類又は医薬として許容されるその塩の投与量は、投与ルート、症状、患者の年令などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、過活動膀胱の患者（体重６０ｋｇ）においては、一日につき約１〜２０００μｇ／ｋｇ程度、好ましくは約５〜１０００μｇ／ｋｇ程度を投与するのが好都合である。また、非経口投与の場合、一般的に例えば、過活動膀胱の患者（体重６０ｋｇ）においては、一日につき約１〜２０００μｇ／ｋｇ程度、好ましくは約５〜１０００μｇ／ｋｇ程度を投与するのが好都合である。
【００２４】
以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００２５】
［実施例１］
原料及び方法
（試薬）
ディスパーゼは合同酒精（東京、日本）から、ＩＶ型コラゲナーゼ及びα−グリチルレチン酸（ＧＡ）はSigma（セントルイス、ＭＯ）から、ＰＤ９８０５９はCalbiochem（サンディエゴ、ＣＡ）から、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜はMillipore（ベッドフォード、ＭＡ）から、そしてジアミノベンチジン テトラヒドロクロライド（DAB）はDojindo Laboratories（熊本、日本）から購入した。組換えヒトｂＦＧＦは科研製薬株式会社（東京、日本）から提供を受けた。
【００２６】
抗体は以下に記載した製造者から購入した：抗カルポニン、抗β−アクチン（Sigma）、抗ｂＦＧＦ（Upstate、レイクプラシッド、ＮＹ）、抗コネキシン４３（Zymed, サンフランシスコ、ＣＡ）、抗コネキシン４５（Chemicon, テメクラ、ＣＡ）、ＨＲＰ抱合抗マウス及び抗ウサギ抗体（Pierce,ロックフォード、ＩＬ）、ビオチン化抗ウサギ抗体（Vector Laboratories, バーリンガム、ＣＡ）、ＦＩＴＣ抱合抗マウス抗体（Dako、グロストラップ、デンマーク）。Alexa Fluor 555抱合ストレプトアビジンは、Molecular Probes（ユージーン、ＯＲ）から購入した。
【００２７】
ＢｉｏＲａｄプロテインアッセイキットは、BioRad Laboratories（ハーキュルス、ＣＡ）から、SuperSignal West Pico ケミルミネッセンスサブストレイトはPierce（ロックフォード、ＩＬ）から、Vectastain Elite ABC Kit （マウスＩｇＧ）は、Vector Laboratoriesから購入した。
【００２８】
（細胞培養）
膀胱平滑筋細胞を９週齢メスＳＤラット（Japan Slc Inc., 静岡、日本）から、以前記載した方法を用いて単離した（Am J Physiol Renal Physiol, 293: F1007-1017, 2007；Am J Pathol, 166: 565-573, 2005）。２回継代後の細胞を、ウェスタンブロット解析用は６ウェルプレートに、免疫蛍光法試験用はチャンバースライドに、２×１０４個／ｍｌで播き、各アッセイの前に０．５％ウシ血清を含む低血清ＤＭＥＭ中で培養することで、血清の影響を除外した。細胞をｂＦＧＦで４日間刺激した（０、１０又は５０ｎｇ／ｍｌ、ｎ＝３）。ｂＦＧＦの下流の経路を調べるため、細胞を１０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ＋１０μｇ／ｍｌ抗ｂＦＧＦ抗体又は５μＭ ＰＤ９８０５９で２日間刺激した（ｎ＝３）。コネキシン４３の発現を、ウェスタンブロット及び免疫蛍光法により評価した。
【００２９】
（動物）
Japan Slc Inc.から体重１７０〜１９０ｇの７週齢メスＳＤラットを購入した。動物はＮＩＨ動物ケアガイドラインに従って取り扱い、全ての実験は京都大学動物実験委員会により承認された。
【００３０】
（ラット膀胱閉塞モデル）
６匹のラットにおいて、膀胱閉塞（bladder outlet obstruction: ＢＯＯ）を以前記載した方法に従い作製した（J Urol, 170: 1427-1431, 2003；J Urol, 170: 1022-1026, 2003）。方法を簡潔に述べると、まず近位尿道を膣壁から剥離し、長軸方向に切断した２ｍｍ長ＰＥ２００ポリエチレンカテーテル（BD Intramedic、スパークス、ＭＤ）を近位尿道を覆うように留置した。偽手術群の６匹のラットでは、同様の処置を施行後、カテーテルを留置せず取り除いた。４週間後、全てのラットから膀胱を摘出し、重量を計測して肥大を確認した。膀胱から筋切片を作製し、カルバコールに対する筋切片の収縮性を測定した。免疫組織化学検査を行い、ｂＦＧＦの発現を評価した。免疫蛍光法試験を行い、コネキシン４３の発現を評価した。
【００３１】
（ゼラチンハイドロゲルを放出担体として用いた、ｂＦＧＦのラット膀胱に対する動物実験効果）
ゼラチンハイドロゲルシートを以前記載した方法に従い作製した（Am J Physiol Renal Physiol, 293: F1007-1017, 2007；Biomaterials, 19: 807-815, 1998）。シートを凍結乾燥し、長方形（８×５ｍｍ）にカットし、ｂＦＧＦ水溶液を浸透させることにより、ｂＦＧＦ含浸ゼラチンハイドロゲルを得た。ラットを５０ｍｇ／ｋｇケタミン及び１０ｍｇ／ｋｇキシラジンで麻酔した後、腹部正中切開を加え膀胱を露出した。ｂＦＧＦ含浸ゼラチンハイドロゲル（０、１、５又は１０μｇ／部位、ｎ＝１２）を、４本の8-0ナイロン縫合糸により、各膀胱の腹側に固定した。これらの縫合糸は、検体回収時のマーキングとして用いた。偽手術群（ｎ＝１２）では、ゼラチンハイドロゲル処置を行わなかった。１４日後に犠牲死させた後、各群の６匹のラットについては、ハイドロゲル固定部位の膀胱から筋切片を作製し、カルバコールに対する筋切片の収縮性を計測した。膀胱同部位におけるコネキシン４３及びコネキシン４５の発現を、ウェスタンブロットにより評価した。コネキシン４３の発現は免疫蛍光法試験でも評価した。各群における他の６匹のラットに対しては蓄尿時膀胱内圧測定（Filling cystometry）を行った。
【００３２】
（免疫ブロッティング）
プロテアーゼ阻害剤を含む放射性免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）緩衝液を用いて、膀胱組織及び培養細胞から、細胞ライセートを抽出した。細胞ライセート中のタンパク量は、BioRad Protein Assayキットを用いて測定した。細胞ライセートをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、Immobilon-Pメンブレンに転写した。メンブレンをコネキシン４３抗体（１：２００）、コネキシン４５抗体（１：５００）、そして内部コントロールとしてβ−アクチン抗体（１：２０００）でインキュベートした。ＨＲＰ−抱合抗マウス又抗ウサギ二次抗体でのインキュベーション後、目的タンパクと結合した抗体をSuperSignal West Picoケミルミネッセンス基質を用いて検出した。
【００３３】
（免疫組織化学検査）
膀胱組織を４％パラホルムアルデヒド中で固定し、パラフィン包埋した後、５μｍの切片を作製した。切片を、抗原修復のために０．０１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で２０分間加熱した。すべての試料を、ｂＦＧＦに対する抗体（１：１００）により１２時間、４℃にてインキュベートした。陰性対照切片は、一次抗体なしでインキュベートした。さらにVectastain Elite ABC kit（マウスＩｇＧ）で処理した後、切片を引き続きＤＡＢでインキュベートすることにより抗体を検出し、ヘマトキシリンにより対比染色した。
【００３４】
（免疫蛍光法試験）
培養細胞は、ＰＢＳで２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定した。動物組織は、４％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋し、５μｍ切片にカットした後、抗原修復のため、切片を０．０１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で２０分間加熱した。全ての検体は、コネキシン４３抗体（１：１００）またカルポニン抗体（１：１０００）で１２時間４℃でインキュベートした。陰性対照切片は、一次抗体なしでインキュベートした。コネキシン４３抗体結合は、ビオチン化抗ウサギ二次抗体及びAlexa Fluor 555抱合ストレプトアビジンを用いて検出した。カルポニン抗体結合は、ＦＩＴＣ抱合抗マウス二次抗体を用いて検出した。
【００３５】
（筋切片試験）
収縮力測定は以前記載した方法に従い行った（Am J Physiol Renal Physiol, 293: F1007-1017, 2007；J Urol, 170: 1633-1638, 2003）。膀胱検体から２〜３ｍｍ幅の筋切片を作製した。ホルダーに固定した切片を、３７℃クレブス液で満たされた組織浴槽中にセットした。切片は、０．５ｇの力をかけて１時間平衡状態にした後で、カルバコールで刺激した。１０μｇ／部位 ｂＦＧＦ群では、ギャップジャンクション活性を阻害するために、α−ＧＡの存在下で刺激する切片を、別に作製した。これらの筋切片は、通常のカルバコール刺激の後にクレブス液で３回洗浄し、３０μＭのα−ＧＡを含むクレブス液中に留置し、カルバコールで刺激した。試験の最後にそれぞれの筋切片の重量を測定した。収縮力は１００ｍｇ組織重量あたりのグラム張力で表した。用量反応曲線（０．０１〜１００μＭ）により最大張力が１０μＭカルバコールで生じることが明らかとなったため、１０μＭカルバコールでの筋収縮力を、最大反応である１００％として規定した。各筋切片についてのＥＣ５０値を、ＳＡＳ８．２ソフトウェア（SAS Institute, カリー、ＮＣ）を用いて非線形回帰により算出した。
【００３６】
（蓄尿時膀胱内圧測定（Filling cystometry））
蓄尿時膀胱内圧測定を以前記載した方法に従い行った（Am J Physiol Renal Physiol, 293: F1007-1017, 2007；J Urol, 170: 1633-1638, 2003）。９００ｍｇ／ｋｇウレタン麻酔下にて、２．８ｍｌ／時間の速度でラット膀胱中に生理食塩水を注入した。各試験において、少なくとも２時間にわたり排尿を記録した。最終収縮時における排尿及び残尿量を、シリンジで尿を吸引することにより測定した。膀胱容量は、排尿量に残尿量を加えたものを膀胱容量と定義した。
【００３７】
（統計学的解析）
全てのデータは、平均値±標準偏差にて表した。データは、SAS 8.2ソフトウェアを用いて、unpaired Studen’s t-test又はDunnett’S testにて解析した。ｐ＜０．０５を統計学的に有意な差として判定した。
【００３８】
結果
（閉塞膀胱は、尿路上皮でのｂＦＧＦ発現亢進、平滑筋でのコネキシン４３発現亢進を示す。）
閉塞膀胱ラットでは、膀胱重量が有意に増加していた（偽手術 ６６．５±１４．３ｍｇ、閉塞膀胱 ２２７．７±３７．９ｍｇ、ｐ＜０．０５）。免疫組織化学検査では、閉塞膀胱の尿路上皮層において、偽手術群の膀胱よりもｂＦＧＦが強発現していた。免疫蛍光法試験では、閉塞膀胱群において、偽手術群よりもコネキシン４３が強発現していた。そしてほとんどのコネキシン４３陽性細胞は、平滑筋マーカーであるカルポニンに対しても陽性であった（図１Ａ）。
【００３９】
（閉塞膀胱は、コリン作動性刺激に対する感受性亢進を示す。）
以前の研究（Urology, 50: 57-57; discussion 68-73, 1997、J Urol, 138: 1461-1466, 1987）によると、用量反応曲線の左方向へのシフト、及びＥＣ５０値の減少は筋原性のコリン感受性亢進の証拠と考えられる。筋切片試験を行った結果、閉塞膀胱の用量反応曲線は、偽手術膀胱の曲線と比較して左へシフトした（図１Ｂ）。閉塞膀胱のＥＣ５０値も、偽手術膀胱の値と比較して減少した（図１Ｃ）。
【００４０】
（ｂＦＧＦはＥＲＫ１／２経路を介してラット膀胱平滑筋細胞におけるコネキシン４３の発現を増強する。）
ウェスタンブロッティングでは、抗コネキシン４３抗体は複数のバンド（非リン酸化（４１ｋＤａ）及びリン酸化（４３〜４６ｋＤａ））を検出した。ウェスタンブロッティングの結果、２〜４日間の１０もしくは５０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ刺激により、膀胱平滑筋細胞におけるコネキシン４３の発現が顕著に増強した。コネキシン４３のリン酸化も同様に増強した（図２Ａ）。ラット膀胱平滑筋細胞において、このｂＦＧＦの効果を制御するシグナルを検討するために、ＥＲＫ１／２シグナルを特異的阻害剤により遮断した。ウェスタンブロッティングの結果、抗ｂＦＧＦ中和抗体での処理と同様に、ＭＥＫ阻害剤であるＰＤ９８０５９でＥＲＫ１／２の上流を遮断することにより、コネキシン４３の発現増強が阻害された（図２Ｂ）。免疫蛍光法試験の結果、２日間の１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ刺激で膀胱平滑筋細胞におけるコネキシン４３の発現が増強した。この効果はＰＤ９８０５９及び抗ｂＦＧＦ抗体により阻害された（図２Ｃ）。
【００４１】
（ｂＦＧＦはギャップジャンクション合成を介してラット膀胱での筋原性のコリン感受性亢進を引き起こす。）
筋切片試験の結果、１、５（データ示さず）、又は１０μｇ／部位のｂＦＧＦ投与群において、用量反応曲線が偽手術群と比較して左へシフトした（図３Ａ）。１０μｇ／部位のｂＦＧＦ投与群のＥＣ５０値は、偽手術群の膀胱と比較して有意に減少した（図３Ｂ）。今回認めた筋原性の感受性亢進がギャップジャンクションにより制御されているかどうかを調べるため、偽手術群および１０μｇ／部位ｂＦＧＦ投与群に対して、ギャップジャンクション阻害剤であるα−ＧＡの存在下にカルバコールで刺激した。α−ＧＡにより、１０μｇ／部位ｂＦＧＦ群における用量反応曲線の左方向シフトは認めなくなったが、偽手術群の用量反応曲線への影響は認めなかった（図３Ｃ）。α−ＧＡにより、１０μｇ／部位ｂＦＧＦ投与群でのＥＣ５０値は有意に増加した（図３Ｄ）。偽手術群および１０μｇ／部位ｂＦＧＦ投与群いずれにおいても、α−ＧＡは最大収縮力に影響を及ぼさなかった（図５）。
これらの結果に基づき、１０μｇ／部位ｂＦＧＦ投与群でのコネキシン発現を評価した。ウェスタンブロッティングでは、１０μｇ／部位ｂＦＧＦ群において偽手術群と比較して、コネキシン４３の発現は増強したが、コネキシン４５の発現は不変であった（図３Ｅ）。免疫蛍光法試験では、１０μｇ／部位ｂＦＧＦ群において偽手術群と比較して、平滑筋でのコネキシン４３の発現が増強した（図３Ｆ）。
【００４２】
（ｂＦＧＦはラット膀胱における排尿筋過活動を誘導する）
膀胱内圧測定では、１０μｇ／部位ｂＦＧＦ投与群は偽手術群と比較して、排尿筋過活動を示した（図４Ａ）。ｂＦＧＦ投与群の排尿回数は、偽手術群よりも有意に多かった（図４Ｂ）。ｂＦＧＦ投与群における膀胱容量は、偽手術群よりも有意に低かった（図４Ｃ）。残尿量は、全群においてごく少量であった（データ示さず）。ｂＦＧＦ投与群の最大排尿圧は偽手術群よりも有意に低かった（図４Ｄ）。ｂＦＧＦ投与群の膀胱コンプライアンスは偽手術群と比較して有意な変化はなかった（図４Ｅ）。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明の治療剤を用いることにより、過活動膀胱を効果的に治療し得る。特に、膀胱の収縮力を低下させずに、膀胱の過活動を抑制できる点で本発明の治療剤は優れている。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】閉塞膀胱におけるｂＦＧＦ発現、コネキシン４３発現及びコリン作動性刺激に対する感受性亢進。Ａ：ラット閉塞膀胱におけるｂＦＧＦ及びコネキシン４３の発現。膀胱切片（５μｍ厚）を抗ｂＦＧＦ抗体（１：１００）で処理し、ＤＡＢで染色した（ｎ＝６）。一段目の図では、ｂＦＧＦ陽性所見を褐色で示す。ｂＦＧＦは、偽手術群と比較して、閉塞膀胱の尿路上皮において顕著に発現していた。さらに膀胱切片をコネキシン４３抗体（１：１００）及びカルポニン抗体（１：１０００）により二重染色した（ｎ＝６）。二段目の図ではコネキシン４３陽性所見を赤で示し、三段目の図ではカルポニン陽性所見を緑で示し、四段目の図では合成所見を示す。閉塞膀胱群の排尿筋層では、偽手術群と比較して、コネキシン４３の発現が増強していた。（スケールバーは５０μｍ）Ｂ、Ｃ：閉塞膀胱ラットにおける筋切片試験。筋切片の収縮力を、閉塞膀胱群及び偽手術群において、カルバコール刺激下で検討した（ｎ＝６）。閉塞膀胱群での用量反応曲線は、偽手術群と比較して左方向にシフトした（Ｂ）。閉塞膀胱群におけるＥＣ５０値は、偽手術群と比較して有意に減少した（Ｃ）。*Ｐ＜０．０５で統計学的に有意差あり。
【図２】ｂＦＧＦ刺激による膀胱平滑筋細胞でのコネキシン４３発現。Ａ，Ｂ：膀胱平滑筋細胞におけるコネキシン４３発現：ウェスタンブロット解析。膀胱平滑筋細胞から細胞ライセートを採取した（ｎ＝３）。コネキシン４３抗体は非リン酸化（４１ｋＤａ）及びリン酸化（４３〜４６ｋＤａ）の複数の陽性バンドを示した。全コネキシン４３発現及びリン酸化コネキシン４３発現は、ｂＦＧＦ刺激により増強した（Ａ）。ＰＤ９８０５９（ＥＲＫ１／２阻害剤）及び抗ｂＦＧＦ中和抗体は、ｂＦＧＦによるコネキシン４３の発現増強を阻害した。Ｃ：膀胱平滑筋細胞におけるコネキシン４３発現：免疫蛍光法試験。膀胱平滑筋細胞を、２日間培養した（ｎ＝３）。上段の図ではコネキシン４３陽性所見を赤で示し、中段の図ではカルポニン陽性所見を緑で示し、下段の図では合成所見を示す。ｂＦＧＦ刺激により、膀胱平滑筋細胞におけるコネキシン４３発現は増強した。ＰＤ９８０５９及び抗ｂＦＧＦ中和抗体は、ｂＦＧＦによるコネキシン４３の発現増強を阻害した。（スケールバーは２０μｍ）
【図３】ｂＦＧＦ投与膀胱におけるギャップジャンクションを介したコリン感受性亢進。Ａ，Ｂ：ｂＦＧＦ投与膀胱における筋切片試験。ｂＦＧＦ投与膀胱に対して、筋切片の収縮力をカルバコール刺激下で測定した（ｎ＝６）。ｂＦＧＦ投与群（１０μｇ／部位）の膀胱では、偽手術群と比較して、用量反応曲線は左方向にシフトした（Ａ）。またｂＦＧＦ投与群（１０μｇ／部位）のＥＣ５０値は、偽手術群と比較して有意に減少した（Ｂ）。Ｃ、Ｄ：筋切片試験におけるギャップジャンクション活性の阻害。３０μＭのα−ＧＡ（ギャップジャンクション阻害剤）を含むクレブス液中で筋切片試験を行った（ｎ＝６）。α−ＧＡの存在下では、ｂＦＧＦ投与群（１０μｇ／部位）の用量反応曲線は左にシフトせず、偽手術群の曲線とほぼ同様であった（Ｃ）。ｂＦＧＦ投与群（１０μｇ／部位）のＥＣ５０値については、α−ＧＡありの条件では、α−ＧＡなしの条件と比較して有意に増加した（Ｄ）。Ｅ：膀胱におけるコネキシン４３及びコネキシン４５発現：ウェスタンブロット解析。ｂＦＧＦ投与１４日後の膀胱から細胞ライセートを採取した（ｎ＝６）。１０μｇ／部位ｂＦＧＦ投与群では、全コネキシン４３の発現およびリン酸化コネキシン４３の発現が増強した。一方で、コネキシン４５の発現は変化しなかった。Ｆ：膀胱におけるコネキシン４３発現：免疫蛍光法試験。ｂＦＧＦ投与１４日後の膀胱から組織を摘出した。上段の図ではコネキシン４３陽性所見を赤で示し、中段の図ではカルポニン陽性所見を緑で示し、下段の図では合成所見を示す。ｂＦＧＦにより、平滑筋層におけるコネキシン４３の発現が増強した。（スケールバーは５０μｍ）
【図４】ｂＦＧＦ投与膀胱における蓄尿時膀胱内圧測定。Ａ：膀胱内圧測定の所見。偽手術群、０μｇ／部位 ｂＦＧＦ群及び１０μｇ／部位 ｂＦＧＦ群について膀胱内圧測定を行った。Ｂ：排尿回数。ｂＦＧＦ投与群（１０μｇ／部位）では、偽手術群と比較して、排尿回数は有意に増加した。Ｃ：膀胱容量。ｂＦＧＦ投与群（１０μｇ／部位）では、偽手術群と比較して、容量が有意に減少した。Ｄ：最大排尿圧。ｂＦＧＦ投与群（１０μｇ／部位）では、偽手術群と比較して、最大排尿圧は有意に減少した。Ｅ：膀胱コンプライアンス。ｂＦＧＦ投与群（１０μｇ／部位）では、偽手術群と比較して、コンプライアンスは変化しなかった。*Ｐ＜０．０５で統計学的に有意差あり。
【図５】１０μｇ／部位ｂＦＧＦ投与群および偽手術群における、α−ＧＡの膀胱最大収縮力に対する効果。α−ＧＡなし条件下の最大収縮力に対する、α−ＧＡあり条件下の最大収縮力の割合（％）を示す。α−ＧＡは、両群において、最大収縮力にほとんど影響しなかった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリチルレチン酸類又は医薬として許容されるその塩を含む、過活動膀胱治療剤。
【請求項２】
過活動膀胱が筋原性のものである、請求項１記載の治療剤。
【請求項３】
過活動膀胱が膀胱出口部閉塞を伴うものである、請求項１記載の治療剤。
【請求項１】
グリチルレチン酸類又は医薬として許容されるその塩を含む、過活動膀胱治療剤。
【請求項２】
過活動膀胱が筋原性のものである、請求項１記載の治療剤。
【請求項３】
過活動膀胱が膀胱出口部閉塞を伴うものである、請求項１記載の治療剤。
【図４】
【図５】
【図１】
【図２】
【図３】
【図５】
【図１】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００９−２９２７９７（Ｐ２００９−２９２７９７Ａ）
【公開日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１５０９３７（Ｐ２００８−１５０９３７）
【出願日】平成２０年６月９日（２００８．６．９）
【出願人】（５０４１３２２７２）国立大学法人京都大学 (1,269)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月９日（２００８．６．９）
【出願人】（５０４１３２２７２）国立大学法人京都大学 (1,269)
【Ｆターム（参考）】
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