過酸化水素検出具、４−アミノアンチピリン法による過酸化水素検出方法及び水素供与体検出具
【課題】前処理の手間を軽減可能であり、特別の器具等を使用することなく何人も簡単に操作をすることができる過酸化水素検出具及び過酸化水素検出方法、水素供与体検出具の提供することを目的とする。
【解決手段】過酸化水素検出具１は、４−アミノアンチピリン法による過酸化水素の検出に用いるための４―アミノアンチピリン又はその誘導体、水素供与体、または、ぺルオキシダーゼのうち、少なくともぺルオキシダーゼが担持されている担持体３を備えている構成にしてある。
【解決手段】過酸化水素検出具１は、４−アミノアンチピリン法による過酸化水素の検出に用いるための４―アミノアンチピリン又はその誘導体、水素供与体、または、ぺルオキシダーゼのうち、少なくともぺルオキシダーゼが担持されている担持体３を備えている構成にしてある。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、過酸化水素検出具、過酸化水素検出方法及び水素供与体検出具に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
シラス干しなどの食品の加工に用いる器具や機械、装置などを殺菌洗浄する際、過酸化水素を用いた洗浄を行う場合がある。しかし、この過酸化水素については発ガン性により、食品衛生法において最終製品の完成前に過酸化水素を分解又は除去することと規定されている。
【０００３】
このため、加工食品に過酸化水素が残存していないかどうかを検査する必要があり、かかる過酸化水素の検出方法としては、硫酸チタンや硫酸バナジウムを用い過酸化水素を含む検液を発色させる方法や、ぺルオキシダーゼの存在下過酸化水素によって４−アミノアンチピリンとフェノールなどの水素供与体とを酸化縮合させ、被検査物を含む検液を発色させる方法（４−アミノアンチピリン法）、同じくぺルオキシダーゼの存在下４−メトキシ−１−ナフトールを添加することで検液を発色させる方法（メトキシナフトール法）等がある。また、更に他の方法として、過マンガン酸カリウム法やヨウ素法などの滴定法がある。
【０００４】
下記特許文献１には、４−アミノアンチピリン法で用いる試薬に、両性界面活性剤を配合することで試薬を安定化する方法に関する開示がある。
【０００５】
また、下記特許文献２には、過酸化水素に固有の酸化還元電位について電極間に生じる電圧或いは電流を検出する装置を用いて、過酸化水素を簡易にかつ精度よく検出する酸素電極法が開示されている。
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−１０７１１号公報
【０００７】
【特許文献２】特開２００６−３３３０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、硫酸チタンや硫酸バナジウムを用い過酸化水素を含む検液を発色させる方法では、過酸化水素の検出限界が１０ｐｐｍと感度が悪く、また、過マンガン酸カリウム法やヨウ素法などの滴定法は過酸化水素以外の物質を過酸化水素として検出してしまうので特異性がなく、蛋白質を除去する等の前処理を必要としかかる作業は非常に煩雑である。
【０００９】
また、従来の４−アミノアンチピリン法による検出では、０．０５ｐｐｍという微量の過酸化水素の検出を行っているために濃縮などの前処理に非常に手間がかかるとともに、発色した検液の吸光度を測定するため高額な分析機器を必要とする。そして、酸素電極法による検出においても、４−アミノアンチピリン法と同様、前処理の手間や高額な分析機器を必要とする。よって、製造業者等の過酸化水素や水素供与体の検査を行い者が例えば食品製造の都度このような過酸化水素の検出作業を行うことは困難である。
【００１０】
本発明は、上記した従来の問題点に鑑みてなされたものであって、前処理の手間を軽減可能であり、特別の器具等を使用することなく何人も簡単に操作をすることができる過酸化水素検出具及び過酸化水素検出方法、水素供与体検出具の提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成するために、本発明に係る過酸化水素検出具は、４−アミノアンチピリン法による過酸化水素の検出に用いるための４−アミノアンチピリン又はその誘導体、水素供与体、または、ぺルオキシダーゼのうち、少なくともぺルオキシダーゼが担持されている担持体を備えている構成にしてある。
【００１２】
また、前記構成において、担持体が膜状部材であるものである。
【００１３】
そして、前記した構成において、膜状部材がニトロセルロ−ス膜であるものである。
【００１４】
更に、本発明に係る４−アミノアンチピリン法による過酸化水素検出方法は、被検査物を含む検液に、ペルオキシダーゼ、水素供与体、及び４−アミノアンチピリンを添加して被検査物に含まれている過酸化水素を検出する４−アミノアンチピリン法による過酸化水素検出方法であって、ペルオキシダーゼが担持された担持体を検液に浸漬することを特徴とする被検査物を含む検液に、ペルオキシダーゼ、水素供与体、及び４−アミノアンチピリンを添加して被検査物に含まれている過酸化水素を検出する過酸化水素検出方法であって、ペルオキシダーゼが担持された担持体を検液に浸漬することを特徴とするものである。
【００１５】
更に、本発明に係る水素供与体検出具は、水素供与体の検出に用いるための４−アミノアンチピリン又はその誘導体、過酸化水素、または、ぺルオキシダーゼのうち、少なくともぺルオキシダーゼが担持されている担持体を備えていることを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１６】
本発明に係る過酸化水素検出具によれば、４−アミノアンチピリン法による過酸化水素の検出に用いるための４−アミノアンチピリン又はその誘導体、水素供与体、または、ぺルオキシダーゼのうち、少なくともぺルオキシダーゼが担持されている担持体を備えているので、該担持体を被検査物を含む検液に浸漬することで、過酸化水素の有無を検出でき、特別の器具等を使用することなく簡単な操作を行うだけでよく、前処理の手間を軽減可能である。
【００１７】
また、担持体が膜状部材である場合は、過酸化水素検出具の取り扱いが容易となる。
【００１８】
そして、膜状部材がニトロセルロ−ス膜である場合には、過酸化水素検出具を検液に浸漬した際ペルオキシダーゼが担持体から検液中に溶出することなく、ニトロセルロ−ス膜に担持されたままの状態で発色するので、ペルオキシダーゼが検液中に溶解するために濃度が低下するといったことなく、担持体において濃い色で発色するため、過酸化水素の有無の判定が容易となる。
【００１９】
更に、本発明に係る過酸化水素検出方法は、被検査物を含む検液に、ペルオキシダーゼ、水素供与体、及び４−アミノアンチピリンを添加して被検査物に含まれている過酸化水素を検出する４−アミノアンチピリン法による過酸化水素検出方法であって、ペルオキシダーゼが担持された担持体を検液に浸漬することを特徴とするので、特別の器具等を使用することなく簡単な操作で容易に過酸化水素の検出を行うことができる。
【００２０】
更に、本発明に係る水素供与体検出具によれば、水素供与体の検出に用いるための４−アミノアンチピリン又はその誘導体、過酸化水素、または、ぺルオキシダーゼのうち、少なくともぺルオキシダーゼが担持されている担持体を備えているので、該担持体を被検査物を含む検液に浸漬することで、水素供与体の有無を検出でき、特別の器具等を使用することなく簡単な操作を行うだけでよく、前処理の手間を軽減可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明の最良の実施形態を図面に基づいて説明する。ここに、図１は本発明の一実施形態に係る過酸化水素検出具の斜視図、図２は前記過酸化水素検出具を用いた過酸化水素検出方法の操作手順を示す図である。
図１において、この実施形態に係る過酸化水素検出具１は、担持体３に４−アミノアンチピリン法による過酸化水素の検出に用いるための４−アミノアンチピリン又はその誘導体、水素供与体、または、ぺルオキシダーゼのうち、少なくともぺルオキシダーゼが担持されている担持部２を備えている。尚、図１〜３では担持部２を１箇所のみとしたが、これに限定されず、２箇所以上としても構わない。
【００２２】
担持体３には少なくともペルオキシダーゼが担持されていればよく、４−アミノアンチピリン又はその誘導体、水素供与体のいずれか又は双方が担持体３に担持されなくても構わない。このように４−アミノアンチピリン又はその誘導体、水素供与体のいずれか又は双方が担持体３に担持されない場合には、この担持されていない物質を別途所定量を検液へ添加する必要がある。
【００２３】
担持体３に４−アミノアンチピリン又はその誘導体、及び／または水素供与体が担持されていない場合のこれらの物質の検液への添加方法は、４−アミノアンチピリン又はその誘導体、または水素供与体のそれぞれの原液をそのまま添加してもよく、水などの溶媒により希釈した希釈液を添加してもよい。また、４−アミノアンチピリン又はその誘導体と水素供与体とを混合した後で検液に添加してもよい。
【００２４】
そして、４−アミノアンチピリン又はその誘導体、及び水素供与体の原液又は希釈液中に、過酸化水素検出具１とは別の担持体を各々浸漬するなどして、該別の担持体に担持させたものを添加してもよい。更には、４−アミノアンチピリン、又は水素供与体を凍結乾燥し、粉末状としたものを用いてもよい。
【００２５】
４−アミノアンチピリン又はその誘導体は、後述する水素供与体と酸化縮合反応して発色する物質であれば特に限定されないが、特に汎用性があり、良好な発色性を示す点で４−アミノアンチピリンが好ましい。４−アミノアンチピリン又はその誘導体の濃度は、特に限定されないが、通常、被検査物に対し0.05重量％〜１重量％程度が好ましい。
【００２６】
水素供与体は、例えば、フェノール、２−クロロフェノール、４−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノールなどのフェノール類、アニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎーゼチルアニリン、Ｎ，Ｎーゼチル−ｍ−トルイジン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ'−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ'−サクシニルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジンなどのアニリン類が用いられる。
水素供与体の濃度は特に限定されないが、被検査物に対し0.5重量％〜８重量％程度が好ましい。
【００２７】
ぺルオキシダーゼは、その起源、由来に特に限定はなく、植物、動物、微生物から得られるペルオキシダーゼが、１種若しくは要すれば２種以上組み合わせて用いられる。また、その使用量は目的に応じて適宜定められ、特に限定されないが、例えば、被検査物に対し１ppm〜100ppm 程度が好ましい。
【００２８】
担持体３は、有機、無機のいずれの材質でもよく、例えば、無機系の担持体３としては、ケイソウ土、カオリナイトーゼオライト、多孔質ガラス、セラミック等を、有機系の担持体３としては、ナイロン樹脂、ポリエチレン樹脂、アクリル樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリエステル樹脂、セルロース樹脂等を挙げることができる。
【００２９】
図１においては操作性が良好である点から担持体３として膜状部材を示したが、これに限定されず、他の形状、例えば、粒状部材等であってもよい。担持体３が膜状部材の場合、例えば、濾紙、ガラス繊維膜、多孔性又は非多孔性の高分子膜等を用いることができる。高分子膜として、ナイロン膜、ポリエチレン膜、ポリエチレンテレフタレート膜、ポリプロピレン膜、ポリビニリデンフルオライド（PVDF）膜、ニトロセルロース膜や酢酸セルロース膜等のセルロース類膜などが挙げられる。
【００３０】
膜状部材を用いる場合、その大きさは特に限定されないが、容易に処理及び保管可能であることが好ましい。例えば、縦１０ｍｍ〜５０ｍｍ、横８ｍｍ〜１５ｍｍ、厚さ０．０５ｍｍ〜２．０ｍｍ程度であれば、作成及び取り扱いが容易となり好ましい。
【００３１】
そして、上記膜状部材の中でも特にニトロセルロース膜が好ましい。ニトロセルロース膜は、過酸化水素検出具を検液に浸漬した際ペルオキシダーゼが担持体から検液中に溶出することなく、ニトロセルロ−ス膜に担持されたままの状態で発色するので、ペルオキシダーゼが検液中に溶解するために濃度が低下するといったことなく、担持体で濃い色の発色をするため、過酸化水素の有無の判定が容易となる。
【００３２】
また、４−アミノアンチピリン又はその誘導体、水素供与体、またはペルオキシダーゼの担持部２への担持方法は、化学結合であってもよく、物理的な相互作用であってもよい。例えば、担持体３表面の所定箇所にこれらの物質をピペットなどにより所定量滴下し、自然乾燥させる方法等があげられる。その際、ペルオキシダーゼ以外に４−アミノアンチピリン又はその誘導体及び／または水素供与体を担持体３に担持する場合には、４−アミノアンチピリン又はその誘導体及び／または水素供与体をペルオキシダーゼより先に担持部２に担持させた後、ペルオキシダーゼを担持されることが好ましい。理由は、ペルオキシダーゼが表面側にあることにより過酸化水素に直接接触しやすいためと考えられる。
【００３３】
固定化の温度は酵素が失活しない温度であれば限定されないが、５℃から３０℃が好ましい。
【００３４】
また担持体には、４−アミノアンチピリン又はその誘導体、水素供与体、または、ぺルオキシダーゼの他、酵素活性を維持するための、ｐＨ調整剤や酵素活性保護剤等を担持させてもよい。例えばｐＨ調整剤には、一般的な緩衝剤を用いる方法を適用できる。緩衝剤としては、公知の試薬組成物に用いられているいずれのものであってもよく、例えば、ｐＨを５〜８に維持することができるリン酸、グリシン、トリス及びグッドの緩衝液を挙げることができる。ｐＨ調整剤を加える場合その濃度は特に限定されないが、通常、0.1M〜１M程度が好ましい。また、上記ｐＨ調整剤や酵素活性保護剤等を担持体に担持しない場合であっても、過酸化水素の検出を行う際検液に上記ｐＨ調整剤や酵素活性保護剤等を添加することとしてもよい。
【００３５】
検液中に過酸化水素が存在すると、ペルオキシダーゼが過酸化水素を分解して活性な酸素を放出し、この活性な酸素により水素供与体と４−アミノアンチピリン又はその誘導体とを酸化縮合させ、発色する芳香環を化合物であるキノン色素を生成させる。係る反応式の一例を下記に示す。
【００３６】
【化１】
上記反応式は、ペルオキシダーゼ存在下、過酸化水素、４−アミノアンチピリン又はその誘導体としての４−アミノアンチピリン、水素供与体としてのフェノールとが酸化縮合反応し、水を生成することを示している。
【００３７】
過酸化水素検出具１は、過酸化水素検出操作を行う際、その都度作成し、作成後すぐに使用することしてもよいが、冷蔵庫内で保管することにより例えば２〜３ヶ月といった所定期間の保存が可能である。冷蔵庫内で保管する際には、密閉容器内で窒素を封入し、シリカゲル等の乾燥剤とともに保管することが好ましい。これにより、過酸化水素検出具１が空気中の酸素と反応するといったことなく、より長期間の保存が可能となる。
【００３８】
ここで、過酸化水素検出具１を用いて過酸化水素の検出を行う被検査物としては、過酸化水素の検出を必要とする物質、例えば、シラス干し、チリメン、カマボコ、うどんが挙げられる。ここで、シラス干しとは、カタクチイワシ、マイワシ、ウナギ、アユ等の稚魚を釜ゆで後、乾燥したものである。
【００３９】
引続き、過酸化水素検出具を用いた過酸化水素の検出方法につき、以下に説明する。図２は、本実施形態に係る過酸化水素検出方法の操作手順を示す図である。図２では、被検査物４の一例としてシラス干しを用いた例を示す。まず、図２（ａ）に示す被検査物４を（ｂ）に示すように複数の小片に裁断し、（ｃ）において所定量の検液５に添加する。被検査物４と検液５との割合は、被検査物に対する検液の重量が、２〜８程度が好ましく、例えば被検査物５ｇに対し検液としての0.2Mリン酸緩衝液が２５ｍｌである。
【００４０】
次に、（ｄ）に示すように被検査物４を含む検液５中に過酸化水素検出具１を添加し、常温常圧下で所定時間、例えば、５分〜３０分程度放置する。図２に示す方法では、担持体３に４−アミノアンチピリン又はその誘導体、水素供与体、及びぺルオキシダーゼの全てが担持された過酸化水素検出具１を用いている。その後、（ｅ）に示すように過酸化水素検出具１を検液５から取り出し、水洗し、（ｆ）においてペルオキシダーゼの発色の有無を判断する。
【００４１】
この結果、図２（ｆ）の過酸化水素検出具１ａのように、担持部２ａが発色しない場合には、１ｐｐｍ以上の過酸化水素は検出されなかったこととなる。これに対し、過酸化水素検出具１ｂのように、ペルオキシダーゼを担持した担持部２ｂが赤色に発色していれば、被検査物４に１ｐｐｍ以上の過酸化水素が検出されたこととなる。
【００４２】
図２では、担持体３の担持部２には、４−アミノアンチピリン又はその誘導体、水素供与体及びペルオキシダーゼの全てが担持された過酸化水素検出具１を用いた例を示したが、他の実施形態として、過酸化水素検出具１の担持部２にペルオキシダーゼのみ担持し、水素供与体及び４−アミノアンチピリンは担持しない例を以下に示す。
【００４３】
図３は、４−アミノアンチピリン又はその誘導体、及び水素供与体を担持していない過酸化水素検出具１ｃを用いて、過酸化水素の検出を行う場合の操作手順の一部を示す。４−アミノアンチピリン又はその誘導体、及び水素供与体が過酸化水素検出具１ｃに担持されない場合にも、図２に示す（ａ）（ｂ）と同様の工程を行って、被検査物４を複数の小片に裁断し、所定量の検液５に添加する。その後、図２の（ｃ）〜（ｆ）の工程に替えて図３（ｃ’）〜（ｆ’）の工程を行う。
【００４４】
図３の（ｃ’）において、例えば、過酸化水素検出具１ｃとは別の担持体６，７にそれぞれ担持された４−アミノアンチピリン又はその誘導体及び水素供与体を、ペルオキシダーゼを担持部２に担持する過酸化水素検出具１ｃとともに検液５ｃに添加する。
【００４５】
図３（ｄ’）に示す状態で、５分〜２０分程度の所定時間経過すると、担持体６，７から４−アミノアンチピリン及び水素供与体がそれぞれ検液中に溶出する。そして、図３（ｅ’）に示すように、過酸化水素検出具１ｃを取り出し、水洗する。検液中に過酸化水素がない場合または、１ｐｐｍより少ない場合には図３（ｆ’）の過酸化水素検出具１ｄに示すように、担持部２ｄが発色しない。これに対し、検液が１ｐｐｍ以上の過酸化水素を含有する場合には過酸化水素検出具１ｅのように、ペルオキシダーゼを担持する担持部２ｅが赤色に発色する。これにより被検査物から１ｐｐｍ以上の過酸化水素が検出されたことを判断可能である。
【００４６】
以上より、従来、４−アミノアンチピリン法により、吸光度測定機器を用いて過酸化水素の検出を行った場合には、過酸化水素が検出されるかどうかの判断に約１日かかっていたところ、５〜２０分で判断可能であるので、時間の大幅の短縮が可能となる。これにより、食品加工業者が工場内で簡易に過酸化水素の検出する際の手間を省くことができる。
【００４７】
尚、本発明の過酸化水素検出具及び過酸化水素検出方法に用いるぺルオキシダーゼが担持されている担持体３は、過酸化水素の存在下、４−アミノアンチピリンと水素供与体と結合してキノン色素を生成する性質を有しているので、これを過酸化水素検出具としてだけではなく、水素供与体の検出用として用いてもよい。このような目的で使用する場合、水素供与体検出具の担持体には４−アミノアンチピリン又はその誘導体、過酸化水素、または、ぺルオキシダーゼのうち、少なくともぺルオキシダーゼが担持され、被検査物に水素供与体が検出された場合に、担持部が発色する構造とする。そして、水素供与体検出具は、４−アミノアンチピリン又はその誘導体、過酸化水素を担持体に担持しなくてもよく、水素供与体の検出操作を行う際これら物質を別途添加する構造としてもよい。水素供与体の担持体に担持するペルオキシターゼの使用濃度としては、通常１ppm〜100ppm、好ましくは４０ｐｐｍ〜６０ｐｐｍである。
【実施例１】
【００４８】
過酸化水素を0.2Mリン酸緩衝液に溶解し濃度を５．０ｐｐｍとした検液２ｍＬと、過酸化水素を添加しない0.2Mリン酸緩衝液のみの検液２ｍＬとを用い、本発明に係る過酸化水素検出具の発色の状態を比較した。担持体は、縦１８ｍｍ〜２０ｍｍ、横８ｍｍ〜１０ｍｍに裁断したバイオラド社製ニトロセルロース膜（厚さ０．１ｍｍ）を用いた。ペルオキシダーゼを５ｐｐｍに調整し、エッペンドルフ社製マイクロピペット（型番リファレンス4910）により前記担持体の表面に、１箇所につき２０μＬずつを２箇所に滴下し、自然乾燥を行うため室温で２０分間放置した。このようにして、ペルオキシダーゼのみが担持体の２箇所の担持部に円形状に担持されている過酸化水素検出具を作成した。
【００４９】
そして、０．４重量％４−アミノアンチピリン０．１ｍＬと、水素供与体として１．９重量％フェノール０．３ｍＬとをそれぞれ検液に添加すると共に、上記のように作成した過酸化水素検出具を検液中に浸漬した。過酸化水素検出具の浸漬より２０分経過した時点で、担持体を検液から取り出し蒸留水により洗浄し、発色の状態を島津製作所製デンシトメーターＣＳ９０００を用いて測定した。測定条件は、波長を５２０ｎｍした。
（比較例１）
【００５０】
過酸化水素の検出方法として４−アミノアンチピリン法と、メトキシナフトール法との比較を行うため、上記実施例１と同様の条件で５ｐｐｍペルオキシダーゼ２０μＬを２箇所の担持部に滴下し、担持されて作成した過酸化水素検出具を用いると共に、上記実施例１に係る４−アミノアンチピリン及びフェノールに替えて、０．１５重量％４−メトキシ−１−ナフトールを０．４ｍＬ検液に添加し、その後の処理は上記実施例１と同様の条件で試験を行った。実施例１及び比較例１の結果を表１及び図４に以下に示す。
【００５１】
【表１】
【００５２】
表１において各数値は担持部の発色の濃淡の測定値であり、数値が高い程担持部が濃い発色となっていることを示す。これらの数値は各々の条件において得られた複数の測定値の平均値を示している。また、図４は縦軸に表１に示す数値をとり、横軸に各条件をとったものであり、横軸に示した文字ＢＬは過酸化水素を添加しない場合であり、ＳＴ５ｐｐｍは５．０ｐｐｍの過酸化水素を添加した場合である。更に、図４には、検出試験の結果得られた過酸化水素検出具の発色状態を示している。
【００５３】
表１及び図４に示すように、比較例１に係る４−メトキシ−１−ナフトールを添加した担持体は、過酸化水素を添加しない検液に浸漬した場合にも薄い青色の発色を示した。これに対し、実施例１に係る４−アミノアンチピリン及び水素供与体を添加した検液の担持体は過酸化水素を含有しない検液は全く発色せず、５．０ｐｐｍの過酸化水素を添加した検液では赤く発色するという適正な結果が得られた。
【実施例２】
【００５４】
担持体の材質の検討を行うため、担持体として、上記実施例１のバイオラド社製ニトロセルロース膜の他、アドバンテック社製濾紙（厚さ０．２ｍｍ）、アドバンテック社製ガラス繊維（厚さ０．５ｍｍ）、ミリポア社製親水性ＰＶＤＦ膜（厚さ０．１ｍｍ）の４種を用い、５．０ｐｐｍの過酸化水素を検液２ｍＬとして、上記実施例１と同様の条件で試験を行った。検液に担持体を浸漬した後約２０分間放置した時点の検液及び過酸化水素検出具を図５に示す。
【００５５】
図５より、いずれの担持体も赤色に発色した。特に、濾紙については担持体全体が薄い色に発色するとともに検液自体も薄い赤色に発色した。ガラス繊維膜、ＰＶＤＦ膜については担持体全体が濃い色に発色すると共に、検液自体も濾紙を浸漬させた検液よりも濃い赤色に発色した。
【００５６】
これに対し、ニトロセルロース膜は担持体のペルオキシダーゼを担持させた担持部のみ円形状に赤色に発色し、担持部以外は発色しなかった。また、検液が発色することもなかった。これは、濾紙、ガラス繊維膜、ＰＶＤＦ膜では、ペルオキシダーゼが担持体から検液中に溶出したと考えられ、ニトロセルロース膜では担持体から検液中に溶出することなく、担持体に担持されたままであると考えられる。
【実施例３】
【００５７】
水素供与体としてのフェノールの濃度を変更し、担持体の発色状況を試験した。フェノールの濃度範囲は０．５重量％〜８．０重量％とし、他の条件は５．０ｐｐｍの過酸化水素を検液２ｍＬとした上記実施例１と同様とした。結果を表２に示す。
【表２】
【００５８】
表２より、０．５重量％〜８．０重量％の全範囲で発色が認められる良好な結果が得られた。特に水素供与体の濃度が高い程、濃い色に発色する傾向となり、８．０重量％の値が４９ｍｍと最も良かった。これより、実施例１と同様の条件で作成した５ｐｐｍのぺルオキシダーゼのみが担持されてなる担持体を、水素供与体の検出を行う際にも利用可能であることが分かった。即ち、ペルオキシダーゼを担持させてなる担持体を水素供与体の検出を行いたい検液中に浸漬すると共に、所定量の過酸化水素及び４−アミノアンチピリンを該検液に添加することで水素供与体の検出が可能となる。
【実施例４】
【００５９】
４−アミノアンチピリンの濃度を０．０５重量％〜１．０重量％の範囲で変更すると共に、１．９重量％フェノールに替えて８．０重量％フェノールを用いた以外は５．００ｐｐｍ過酸化水素を検液とした上記実施例１と同様に担持体の発色状況を試験した。結果を表３に示す。
【表３】
【００６０】
表３より、全ての範囲で発色が認められる良好な結果が得られ、特に、０．１重量％で最も濃い発色となった。
【実施例５】
【００６１】
ペルオキシダーゼの濃度を１ｐｐｍ〜１００ｐｐｍの範囲で変更すると共に、１．９重量％フェノールに替えて８．０重量％フェノールを、０．４重量％４−アミノアンチピリンに替えて０．１重量％４−アミノアンチピリンを用いた以外は５．００ｐｐｍ過酸化水素を検液とした上記実施例１と同様に担持体の発色状態を測定した。結果を表４に示す。
【表４】
【００６２】
この結果全範囲で発色が認められる良好な結果が得られ、特に５〜１００ｐｐｍにおいてより濃い発色となる結果が得られ、この範囲内では余り差が認められなかった。
【実施例６】
【００６３】
担持体に担持させるペルオキシダーゼの量を検討するため、実施例１では５ｐｐｍペルオキシダーゼ２０μＬを担持体に担持させたところ、５ｐｐｍペルオキシダーゼを用い１箇所の滴下量を５μＬ〜５０μＬの範囲で変更し、また、１．９重量％フェノールに替えて８．０重量％フェノールを、０．４重量％４−アミノアンチピリンに替えて０．１重量％４−アミノアンチピリンを用いた以外は５．００ｐｐｍ過酸化水素を検液とした上記実施例１と同様とした。結果を表５に示す。
【表５】
【００６４】
表５より、全範囲で発色が認められる良好な結果が得られた。再現性に関しては２０μＬが最も良い結果となり、７回測定を行ったところ標準偏差３．７、変動係数３．４％であった。
【実施例７】
【００６５】
担持部の発色状態の変化を確認するため、５．０ｐｐｍの過酸化水素２ｍＬに、８．０重量％のフェノール０．３ｍＬ、０．１重量％４−アミノアンチピリン０．１ｍＬを添加した検液に、５ｐｐｍのペルオキシダーゼ２０μＬずつを２箇所に担持した担持体を浸漬した。１５分間の浸漬後、担持体を検液から取り出して蒸留水で１分間洗浄し、ろ紙にはさんで水分を除き、１０分間放置した。この時点での発色状態を測定し、得られた数値を基準とし、１５分〜４２０分までの間の各時点で発色状態を測定した場合の担持部の濃さの割合を算出した。結果を表６に示す。
【表６】
【００６６】
表６より、担持体が湿っている状態の１５分の時点では、色が濃く見えるために数値が安定しないが、担持体が乾燥する２０分以後は数値がほぼ一定となり、２０分〜４２０分経過後について発色状態にほとんど変化が見られなかった。
【実施例８】
【００６７】
担持体の発色に要する時間を測定するため、ペルオキシダーゼを担持させた担持体を検液中に浸漬する際の浸漬時間を５〜３０分の間で変更した。また、フェノールの濃度を１．９重量％に替えて８．０重量％に、０．４重量％４−アミノアンチピリンに替えて０．１重量％４−アミノアンチピリンとし、他の条件は５．００ｐｐｍ過酸化水素を検液とした上記実施例１と同様とした。結果を表７に示す。
【表７】
【００６８】
表７より、５分〜３０分の範囲でいずれも良好な発色状態であり、全範囲でほとんど差は見られなかった。これより、約５分で反応が終了していると考えられる。
【実施例９】
【００６９】
担持体の過酸化水素の検出限界となる濃度を確認するため、過酸化水素の濃度を０．１〜１０ｐｐｍの範囲で変更し、また、フェノールの濃度を１．９重量％に替えて８．０重量％に、０．４重量％４−アミノアンチピリンに替えて０．１重量％４−アミノアンチピリンとし、他の条件は５．００ｐｐｍ過酸化水素を検液とした上記実施例１と同様とした。結果を表８及び図３に示す。
【表８】
【００７０】
表８より、発色の程度は低いものの０．１ｐｐｍから担持部の発色が確認でき、３ｐｐｍまでは直線性が認められ、それ以上の範囲では十分濃い色の発色が確認できた。
【実施例１０】
【００７１】
ペルオキシダーゼ等の物質を担持させ、検出具を作成後、直ちに検出を行うのではなく、暫く保管した後に検出を行う際にも適正な結果が得られるかどうか、保存安定性の確認試験を行った。即ち、上記実施例１と同様の条件で過酸化水素検出具を作成した。作成直後及び３０度の室温において５時間放置後の過酸化水素検出具を用いて、５ｐｐｍの過酸化水素の発色試験を行った。尚、発色試験は検液に添加するフェノールの濃度を１．９重量％に替えて、８．０重量％に、０．４重量％４−アミノアンチピリンに替えて０．１重量％４−アミノアンチピリンとした以外は上記実施例１と同様の条件とした。
【００７２】
また、３０度の室温において５時間の放置の際の保存方法は、１．そのまま放置、２．密閉容器内に酸素吸収剤（アイ・エス・オー社製A-500HS、４g入／袋、以下同じ）と保存、３．密閉容器内に窒素を充填し酸素吸収剤と共に保存、４．密閉容器内に窒素を充填し保存、５．密閉容器内にシリカゲル（豊田化工株式会社製乾燥剤5g入／袋、以下同じ）と保存、６．密閉容器内に窒素を充填しシリカゲルと共に保存、７．密閉容器内に五酸化リンと保存の７種類の条件とした。結果を表９に示す。
【表９】
【００７３】
表９では、各条件における発色の濃さを示す数値とともに、過酸化水素検出具の作成直後の発色状態を１００％とし、これに対する５時間放置後の検出具の発色状態の変化の割合を算出したものを示している。表９より、そのまま室内で放置した場合には発色の状態が２０．７％にまで低下していた。この原因としては、空気中の酸素によって過酸化水素検出具が酸化されたか、又は空気中の水分が過酸化水素検出具に何らかの影響を与えていると考えられる。
【００７４】
そこで、まず、空気中の酸素による酸化を防止するため密閉容器内に酸素吸収剤と保存した場合には２９．６％、密閉容器内に窒素を充填し酸素吸収剤と共に保存した場合は２７．８％、密閉容器内に窒素を充填し保存した場合は５３．３％という結果が得られ、そのまま放置した場合に比較して、発色状態は、酸素吸収剤使用では同程度であったが、窒素充填のみで保存すると、２倍の改善が認められた。
【００７５】
次に、空気中の水分を排除した状態で保存するため、過酸化水素検出具を、密閉容器内にシリカゲルと保存した場合、密閉容器内に窒素を充填しシリカゲルと共に保存した場合、密閉容器内に五酸化リンと保存した場合には、６４．４％〜７５．２％の発色状態が維持可能であることが分かった。よって、空気中の水分を排除した状態で保存することにより、予め多数の過酸化水素検出具を作成し必要量を複数回に分けて使用したいような場合にも、適正な検出結果を得ることが可能であることが確認できた。
【実施例１１】
【００７６】
実施例１０にかかる保存安定性について、担持体に担持させるペルオキシダーゼの濃度を高くすることで発色状態の低下防止の効果があるかどうか確認するため、ペルオキシダーゼの濃度を５ｐｐｍ及び５０ｐｐｍの２種類とした以外は上記実施例１０と同様の条件で過酸化水素検出具を作成し、約３０℃の室温で５時間放置した。放置の際は密閉容器内に窒素を充填し、シリカゲルと共に保存することとした。結果を表１０に示す。
【表１０】
【００７７】
表１０よりペルオキシダーゼの濃度を５０ｐｐｍとすることで、検出具作成の後５時間放置後においても良好な発色性を示すことが分かった。尚、上記実施例５において過酸化水素検出具を作成した直後に使用する場合には、ペルオキシダーゼの濃度が５〜１００ｐｐｍの範囲内では余り差が認められていない。よって、過酸化水素検出具を作成後直ちに使用する場合には担持させるペルオキシダーゼの濃度は５ｐｐｍ、５０ｐｐｍのいずれでもほぼ同じ結果が得られるが、暫く保存後使用する場合には５０ｐｐｍとした方がよりよいことが分かる。
【実施例１２】
【００７８】
過酸化水素検出具の保存の際の温度による影響を確認するため上記実施例１１における約３０度の室温で保存に替えて、約４℃の冷蔵庫内、−３０℃及び−８０℃の冷凍庫内で、それぞれ過酸化水素検出具の作成後１０日間保存した。結果を表１１に示す。
【表１１】
【００７９】
表１１より、過酸化水素検出具を−８０℃〜４℃の低温にて保存することで１０日経過後においても発色の状態がほとんど低下しないという良好な結果が得られた。これより、本発明に係る過酸化水素検出具を作成直後に使用せず、所定期間経過後使用する場合には、食品加工業者では通常設置されている冷蔵庫又は冷凍庫にて保存することで保存安定性を維持できることが分かった。
【実施例１３】
【００８０】
実施例１２では１０日間程度の保存安定性について試験したが、更に長期間の保存状態を確認するため以下の試験を行った。即ち、実施例１２と同様に、５０ｐｐｍのペルオキシダーゼ２０μＬをニトロセルロース膜からなる担持体に担持させ、密閉容器内に窒素を充填し、シリカゲルと共に、約４℃の冷蔵庫内で作成直後〜１２ヶ月間保存した。
【００８１】
また、水素供与体及び４−アミノアンチピリンについても担持体に担持させた状態での保存を行った。水素供与体としてのフェノールはアドバンテック社製濾紙（厚さ０．２ｍｍ）を縦２ｃｍ、横２ｃｍに裁断してなる担持体に、２４重量％エタノール溶液１００μＬを吸収させ、室内で放置し自然乾燥させた。４−アミノアンチピリンは水素供与体と同じアドバンテック社製濾紙を縦２ｃｍ、横１ｃｍに裁断してなる担持体に、０．２重量％４−アミノアンチピリン水溶液を５０μＬ吸収させた後、冷蔵庫（４℃）で乾燥させた。
【００８２】
その後、該フェノール及び４−アミノアンチピリンをそれぞれ担持した担持体を密閉容器内に窒素を充填し、シリカゲルと共に、約４℃の冷蔵庫内で保存した。
【００８３】
更に、ペルオキシダーゼと共に、水素供与体及び４−アミノアンチピリンを一個の担持体に担持させた過酸化水素検出具についても上記と同様の試験を行った。即ち、バイオラド社製ニトロセルロース膜（厚さ０．１ｍｍ）に８．０重量％フェノール１５μＬをエッペンドルフ社製マイクロピペット（型番リファレンス4910）により滴下し、乾燥した後、０．１重量％４−アミノアンチピリン５μＬを同様に滴下、乾燥し、更に、５０ｐｐｍペルオキシダーゼ２０μＬを同様に滴下、乾燥し、過酸化水素検出具を作成した。該過酸化水素検出具を上記同様、密閉容器内に窒素を充填し、シリカゲルと共に、４℃の冷蔵庫内で作成直後〜１２ヶ月保存を行った。結果を表１２に示す。
【表１２】
【００８４】
表１２より、ペルオキシダーゼ、フェノール及び４−アミノアンチピリンをそれぞれ異なる担持体に担持させた場合、及びこれらを全て一個の担持体に担持させた場合の双方において６ヶ月間保存した際にも発色状態を約１００％維持可能であり、１２ヶ月保存した場合においても発色性がほとんど低下せず、長期保存が可能であることが分かった。
【実施例１４】
【００８５】
試験用シラスを作成し、該試験用シラスについて本発明に係る過酸化水素検出具と、酸素電極法との過酸化水素検出のための比較実験を行った。試験用シラスは、沸騰水１Ｌに食塩２０ｇと過酸化水素標準液を５，０００μｇ〜１００，０００μｇ添加し、ここに水道水でよく洗浄した生シラス１２０ｇを添加し５分間煮沸した。その後、ザルに取り出して水切りを行い、１０分間放冷することにより作成した。得られた試験用シラス５ｇを
すりつぶし、0.2Mリン酸緩衝液２５ｍＬに添加した。ここに上記実施例１３のペルオキシダーゼ、フェノール及び４−アミノアンチピリンの各々の担持体と同様の条件で作成した過酸化水素検出具を浸漬させ１０分間放置した後、蒸留水で洗浄した。発色の状態を、島津製作所製デンシトメーターＣＳ９０００により算出した。
（比較例２）
【００８６】
上記実施例１４と同様の条件で作成した試験用シラス５ｇの過酸化水素濃度を酸素電極法により測定するため、以下の試験を行った。実施例１４と同様の条件で作成した試験用シラスをホモジナイズし、その５ｇを秤量し0.5%臭素酸カリウム含有0.2Mリン酸緩衝液を加えて５０ｍＬとし、その溶液をろ過し、ろ液を酸素電極法により測定した。測定機器は、セントラル科学社製高感度過酸化水素計スーパーオリテクターモデル５（ＳＵＰＥＲ ＯＲＩＴＥＣＴＯＲ ＭＯＤＥＬ５）を用い、測定条件をRangを0.1、サンプル液量を２ｍL、窒素流量を６５mL/min、カタラーゼ液量を２５μLとした。実施例１４及び比較例２の結果を表１３に示す。
【表１３】
【００８７】
表１３より、本発明に係る過酸化水素検出具を用いた過酸化水素の検出結果と、酸素電極法による検出結果はほぼ等しいものであった。これより、本発明に係る過酸化水素検出具を用いた試験はデータの信頼性が十分高いことが確認できた。
【実施例１５】
【００８８】
市販のシラス干し１０検体について、本発明に係る過酸化水素検出具を用いた簡易検出方法及び酸素電極法で過酸化水素の含有量の比較試験を行った。結果を表１４に示す。
【表１４】
【００８９】
表１４より、本発明に係る過酸化水素検出具は酸素電極法により得られた過酸化水素濃度と略同じ程度の値を示しめすことが確認できた。よって、食品に１ｐｐｍ前後以上の過酸化水素が含有されているかどうか確認することができ、食品製造業者の食品の衛生管理に要する負担を軽減可能である。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】本発明の一実施形態に係る過酸化水素検出具の斜視図である。
【図２】本発明の一実施形態に係る過酸化水素の検出方法を示す図である。
【図３】本発明の他の実施形態に係る過酸化水素の検出方法を示す図である。
【図４】前記他の実施形態にかかる過酸化水素検出具の実施例及び比較例の発色状態を示す図である。
【図５】前記他の実施形態にかかる複数の過酸化水素検出具の発色状態を示す図である。
【符号の説明】
【００９１】
１１ａ，１ｂ，１ｃ，１ｄ，１ｅ 過酸化水素検出具
３ 担持体
４，４ａ 被検査物
５，５ｃ 検液
【技術分野】
【０００１】
本発明は、過酸化水素検出具、過酸化水素検出方法及び水素供与体検出具に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
シラス干しなどの食品の加工に用いる器具や機械、装置などを殺菌洗浄する際、過酸化水素を用いた洗浄を行う場合がある。しかし、この過酸化水素については発ガン性により、食品衛生法において最終製品の完成前に過酸化水素を分解又は除去することと規定されている。
【０００３】
このため、加工食品に過酸化水素が残存していないかどうかを検査する必要があり、かかる過酸化水素の検出方法としては、硫酸チタンや硫酸バナジウムを用い過酸化水素を含む検液を発色させる方法や、ぺルオキシダーゼの存在下過酸化水素によって４−アミノアンチピリンとフェノールなどの水素供与体とを酸化縮合させ、被検査物を含む検液を発色させる方法（４−アミノアンチピリン法）、同じくぺルオキシダーゼの存在下４−メトキシ−１−ナフトールを添加することで検液を発色させる方法（メトキシナフトール法）等がある。また、更に他の方法として、過マンガン酸カリウム法やヨウ素法などの滴定法がある。
【０００４】
下記特許文献１には、４−アミノアンチピリン法で用いる試薬に、両性界面活性剤を配合することで試薬を安定化する方法に関する開示がある。
【０００５】
また、下記特許文献２には、過酸化水素に固有の酸化還元電位について電極間に生じる電圧或いは電流を検出する装置を用いて、過酸化水素を簡易にかつ精度よく検出する酸素電極法が開示されている。
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−１０７１１号公報
【０００７】
【特許文献２】特開２００６−３３３０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、硫酸チタンや硫酸バナジウムを用い過酸化水素を含む検液を発色させる方法では、過酸化水素の検出限界が１０ｐｐｍと感度が悪く、また、過マンガン酸カリウム法やヨウ素法などの滴定法は過酸化水素以外の物質を過酸化水素として検出してしまうので特異性がなく、蛋白質を除去する等の前処理を必要としかかる作業は非常に煩雑である。
【０００９】
また、従来の４−アミノアンチピリン法による検出では、０．０５ｐｐｍという微量の過酸化水素の検出を行っているために濃縮などの前処理に非常に手間がかかるとともに、発色した検液の吸光度を測定するため高額な分析機器を必要とする。そして、酸素電極法による検出においても、４−アミノアンチピリン法と同様、前処理の手間や高額な分析機器を必要とする。よって、製造業者等の過酸化水素や水素供与体の検査を行い者が例えば食品製造の都度このような過酸化水素の検出作業を行うことは困難である。
【００１０】
本発明は、上記した従来の問題点に鑑みてなされたものであって、前処理の手間を軽減可能であり、特別の器具等を使用することなく何人も簡単に操作をすることができる過酸化水素検出具及び過酸化水素検出方法、水素供与体検出具の提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成するために、本発明に係る過酸化水素検出具は、４−アミノアンチピリン法による過酸化水素の検出に用いるための４−アミノアンチピリン又はその誘導体、水素供与体、または、ぺルオキシダーゼのうち、少なくともぺルオキシダーゼが担持されている担持体を備えている構成にしてある。
【００１２】
また、前記構成において、担持体が膜状部材であるものである。
【００１３】
そして、前記した構成において、膜状部材がニトロセルロ−ス膜であるものである。
【００１４】
更に、本発明に係る４−アミノアンチピリン法による過酸化水素検出方法は、被検査物を含む検液に、ペルオキシダーゼ、水素供与体、及び４−アミノアンチピリンを添加して被検査物に含まれている過酸化水素を検出する４−アミノアンチピリン法による過酸化水素検出方法であって、ペルオキシダーゼが担持された担持体を検液に浸漬することを特徴とする被検査物を含む検液に、ペルオキシダーゼ、水素供与体、及び４−アミノアンチピリンを添加して被検査物に含まれている過酸化水素を検出する過酸化水素検出方法であって、ペルオキシダーゼが担持された担持体を検液に浸漬することを特徴とするものである。
【００１５】
更に、本発明に係る水素供与体検出具は、水素供与体の検出に用いるための４−アミノアンチピリン又はその誘導体、過酸化水素、または、ぺルオキシダーゼのうち、少なくともぺルオキシダーゼが担持されている担持体を備えていることを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１６】
本発明に係る過酸化水素検出具によれば、４−アミノアンチピリン法による過酸化水素の検出に用いるための４−アミノアンチピリン又はその誘導体、水素供与体、または、ぺルオキシダーゼのうち、少なくともぺルオキシダーゼが担持されている担持体を備えているので、該担持体を被検査物を含む検液に浸漬することで、過酸化水素の有無を検出でき、特別の器具等を使用することなく簡単な操作を行うだけでよく、前処理の手間を軽減可能である。
【００１７】
また、担持体が膜状部材である場合は、過酸化水素検出具の取り扱いが容易となる。
【００１８】
そして、膜状部材がニトロセルロ−ス膜である場合には、過酸化水素検出具を検液に浸漬した際ペルオキシダーゼが担持体から検液中に溶出することなく、ニトロセルロ−ス膜に担持されたままの状態で発色するので、ペルオキシダーゼが検液中に溶解するために濃度が低下するといったことなく、担持体において濃い色で発色するため、過酸化水素の有無の判定が容易となる。
【００１９】
更に、本発明に係る過酸化水素検出方法は、被検査物を含む検液に、ペルオキシダーゼ、水素供与体、及び４−アミノアンチピリンを添加して被検査物に含まれている過酸化水素を検出する４−アミノアンチピリン法による過酸化水素検出方法であって、ペルオキシダーゼが担持された担持体を検液に浸漬することを特徴とするので、特別の器具等を使用することなく簡単な操作で容易に過酸化水素の検出を行うことができる。
【００２０】
更に、本発明に係る水素供与体検出具によれば、水素供与体の検出に用いるための４−アミノアンチピリン又はその誘導体、過酸化水素、または、ぺルオキシダーゼのうち、少なくともぺルオキシダーゼが担持されている担持体を備えているので、該担持体を被検査物を含む検液に浸漬することで、水素供与体の有無を検出でき、特別の器具等を使用することなく簡単な操作を行うだけでよく、前処理の手間を軽減可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明の最良の実施形態を図面に基づいて説明する。ここに、図１は本発明の一実施形態に係る過酸化水素検出具の斜視図、図２は前記過酸化水素検出具を用いた過酸化水素検出方法の操作手順を示す図である。
図１において、この実施形態に係る過酸化水素検出具１は、担持体３に４−アミノアンチピリン法による過酸化水素の検出に用いるための４−アミノアンチピリン又はその誘導体、水素供与体、または、ぺルオキシダーゼのうち、少なくともぺルオキシダーゼが担持されている担持部２を備えている。尚、図１〜３では担持部２を１箇所のみとしたが、これに限定されず、２箇所以上としても構わない。
【００２２】
担持体３には少なくともペルオキシダーゼが担持されていればよく、４−アミノアンチピリン又はその誘導体、水素供与体のいずれか又は双方が担持体３に担持されなくても構わない。このように４−アミノアンチピリン又はその誘導体、水素供与体のいずれか又は双方が担持体３に担持されない場合には、この担持されていない物質を別途所定量を検液へ添加する必要がある。
【００２３】
担持体３に４−アミノアンチピリン又はその誘導体、及び／または水素供与体が担持されていない場合のこれらの物質の検液への添加方法は、４−アミノアンチピリン又はその誘導体、または水素供与体のそれぞれの原液をそのまま添加してもよく、水などの溶媒により希釈した希釈液を添加してもよい。また、４−アミノアンチピリン又はその誘導体と水素供与体とを混合した後で検液に添加してもよい。
【００２４】
そして、４−アミノアンチピリン又はその誘導体、及び水素供与体の原液又は希釈液中に、過酸化水素検出具１とは別の担持体を各々浸漬するなどして、該別の担持体に担持させたものを添加してもよい。更には、４−アミノアンチピリン、又は水素供与体を凍結乾燥し、粉末状としたものを用いてもよい。
【００２５】
４−アミノアンチピリン又はその誘導体は、後述する水素供与体と酸化縮合反応して発色する物質であれば特に限定されないが、特に汎用性があり、良好な発色性を示す点で４−アミノアンチピリンが好ましい。４−アミノアンチピリン又はその誘導体の濃度は、特に限定されないが、通常、被検査物に対し0.05重量％〜１重量％程度が好ましい。
【００２６】
水素供与体は、例えば、フェノール、２−クロロフェノール、４−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノールなどのフェノール類、アニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎーゼチルアニリン、Ｎ，Ｎーゼチル−ｍ−トルイジン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ'−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ'−サクシニルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジンなどのアニリン類が用いられる。
水素供与体の濃度は特に限定されないが、被検査物に対し0.5重量％〜８重量％程度が好ましい。
【００２７】
ぺルオキシダーゼは、その起源、由来に特に限定はなく、植物、動物、微生物から得られるペルオキシダーゼが、１種若しくは要すれば２種以上組み合わせて用いられる。また、その使用量は目的に応じて適宜定められ、特に限定されないが、例えば、被検査物に対し１ppm〜100ppm 程度が好ましい。
【００２８】
担持体３は、有機、無機のいずれの材質でもよく、例えば、無機系の担持体３としては、ケイソウ土、カオリナイトーゼオライト、多孔質ガラス、セラミック等を、有機系の担持体３としては、ナイロン樹脂、ポリエチレン樹脂、アクリル樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリエステル樹脂、セルロース樹脂等を挙げることができる。
【００２９】
図１においては操作性が良好である点から担持体３として膜状部材を示したが、これに限定されず、他の形状、例えば、粒状部材等であってもよい。担持体３が膜状部材の場合、例えば、濾紙、ガラス繊維膜、多孔性又は非多孔性の高分子膜等を用いることができる。高分子膜として、ナイロン膜、ポリエチレン膜、ポリエチレンテレフタレート膜、ポリプロピレン膜、ポリビニリデンフルオライド（PVDF）膜、ニトロセルロース膜や酢酸セルロース膜等のセルロース類膜などが挙げられる。
【００３０】
膜状部材を用いる場合、その大きさは特に限定されないが、容易に処理及び保管可能であることが好ましい。例えば、縦１０ｍｍ〜５０ｍｍ、横８ｍｍ〜１５ｍｍ、厚さ０．０５ｍｍ〜２．０ｍｍ程度であれば、作成及び取り扱いが容易となり好ましい。
【００３１】
そして、上記膜状部材の中でも特にニトロセルロース膜が好ましい。ニトロセルロース膜は、過酸化水素検出具を検液に浸漬した際ペルオキシダーゼが担持体から検液中に溶出することなく、ニトロセルロ−ス膜に担持されたままの状態で発色するので、ペルオキシダーゼが検液中に溶解するために濃度が低下するといったことなく、担持体で濃い色の発色をするため、過酸化水素の有無の判定が容易となる。
【００３２】
また、４−アミノアンチピリン又はその誘導体、水素供与体、またはペルオキシダーゼの担持部２への担持方法は、化学結合であってもよく、物理的な相互作用であってもよい。例えば、担持体３表面の所定箇所にこれらの物質をピペットなどにより所定量滴下し、自然乾燥させる方法等があげられる。その際、ペルオキシダーゼ以外に４−アミノアンチピリン又はその誘導体及び／または水素供与体を担持体３に担持する場合には、４−アミノアンチピリン又はその誘導体及び／または水素供与体をペルオキシダーゼより先に担持部２に担持させた後、ペルオキシダーゼを担持されることが好ましい。理由は、ペルオキシダーゼが表面側にあることにより過酸化水素に直接接触しやすいためと考えられる。
【００３３】
固定化の温度は酵素が失活しない温度であれば限定されないが、５℃から３０℃が好ましい。
【００３４】
また担持体には、４−アミノアンチピリン又はその誘導体、水素供与体、または、ぺルオキシダーゼの他、酵素活性を維持するための、ｐＨ調整剤や酵素活性保護剤等を担持させてもよい。例えばｐＨ調整剤には、一般的な緩衝剤を用いる方法を適用できる。緩衝剤としては、公知の試薬組成物に用いられているいずれのものであってもよく、例えば、ｐＨを５〜８に維持することができるリン酸、グリシン、トリス及びグッドの緩衝液を挙げることができる。ｐＨ調整剤を加える場合その濃度は特に限定されないが、通常、0.1M〜１M程度が好ましい。また、上記ｐＨ調整剤や酵素活性保護剤等を担持体に担持しない場合であっても、過酸化水素の検出を行う際検液に上記ｐＨ調整剤や酵素活性保護剤等を添加することとしてもよい。
【００３５】
検液中に過酸化水素が存在すると、ペルオキシダーゼが過酸化水素を分解して活性な酸素を放出し、この活性な酸素により水素供与体と４−アミノアンチピリン又はその誘導体とを酸化縮合させ、発色する芳香環を化合物であるキノン色素を生成させる。係る反応式の一例を下記に示す。
【００３６】
【化１】
上記反応式は、ペルオキシダーゼ存在下、過酸化水素、４−アミノアンチピリン又はその誘導体としての４−アミノアンチピリン、水素供与体としてのフェノールとが酸化縮合反応し、水を生成することを示している。
【００３７】
過酸化水素検出具１は、過酸化水素検出操作を行う際、その都度作成し、作成後すぐに使用することしてもよいが、冷蔵庫内で保管することにより例えば２〜３ヶ月といった所定期間の保存が可能である。冷蔵庫内で保管する際には、密閉容器内で窒素を封入し、シリカゲル等の乾燥剤とともに保管することが好ましい。これにより、過酸化水素検出具１が空気中の酸素と反応するといったことなく、より長期間の保存が可能となる。
【００３８】
ここで、過酸化水素検出具１を用いて過酸化水素の検出を行う被検査物としては、過酸化水素の検出を必要とする物質、例えば、シラス干し、チリメン、カマボコ、うどんが挙げられる。ここで、シラス干しとは、カタクチイワシ、マイワシ、ウナギ、アユ等の稚魚を釜ゆで後、乾燥したものである。
【００３９】
引続き、過酸化水素検出具を用いた過酸化水素の検出方法につき、以下に説明する。図２は、本実施形態に係る過酸化水素検出方法の操作手順を示す図である。図２では、被検査物４の一例としてシラス干しを用いた例を示す。まず、図２（ａ）に示す被検査物４を（ｂ）に示すように複数の小片に裁断し、（ｃ）において所定量の検液５に添加する。被検査物４と検液５との割合は、被検査物に対する検液の重量が、２〜８程度が好ましく、例えば被検査物５ｇに対し検液としての0.2Mリン酸緩衝液が２５ｍｌである。
【００４０】
次に、（ｄ）に示すように被検査物４を含む検液５中に過酸化水素検出具１を添加し、常温常圧下で所定時間、例えば、５分〜３０分程度放置する。図２に示す方法では、担持体３に４−アミノアンチピリン又はその誘導体、水素供与体、及びぺルオキシダーゼの全てが担持された過酸化水素検出具１を用いている。その後、（ｅ）に示すように過酸化水素検出具１を検液５から取り出し、水洗し、（ｆ）においてペルオキシダーゼの発色の有無を判断する。
【００４１】
この結果、図２（ｆ）の過酸化水素検出具１ａのように、担持部２ａが発色しない場合には、１ｐｐｍ以上の過酸化水素は検出されなかったこととなる。これに対し、過酸化水素検出具１ｂのように、ペルオキシダーゼを担持した担持部２ｂが赤色に発色していれば、被検査物４に１ｐｐｍ以上の過酸化水素が検出されたこととなる。
【００４２】
図２では、担持体３の担持部２には、４−アミノアンチピリン又はその誘導体、水素供与体及びペルオキシダーゼの全てが担持された過酸化水素検出具１を用いた例を示したが、他の実施形態として、過酸化水素検出具１の担持部２にペルオキシダーゼのみ担持し、水素供与体及び４−アミノアンチピリンは担持しない例を以下に示す。
【００４３】
図３は、４−アミノアンチピリン又はその誘導体、及び水素供与体を担持していない過酸化水素検出具１ｃを用いて、過酸化水素の検出を行う場合の操作手順の一部を示す。４−アミノアンチピリン又はその誘導体、及び水素供与体が過酸化水素検出具１ｃに担持されない場合にも、図２に示す（ａ）（ｂ）と同様の工程を行って、被検査物４を複数の小片に裁断し、所定量の検液５に添加する。その後、図２の（ｃ）〜（ｆ）の工程に替えて図３（ｃ’）〜（ｆ’）の工程を行う。
【００４４】
図３の（ｃ’）において、例えば、過酸化水素検出具１ｃとは別の担持体６，７にそれぞれ担持された４−アミノアンチピリン又はその誘導体及び水素供与体を、ペルオキシダーゼを担持部２に担持する過酸化水素検出具１ｃとともに検液５ｃに添加する。
【００４５】
図３（ｄ’）に示す状態で、５分〜２０分程度の所定時間経過すると、担持体６，７から４−アミノアンチピリン及び水素供与体がそれぞれ検液中に溶出する。そして、図３（ｅ’）に示すように、過酸化水素検出具１ｃを取り出し、水洗する。検液中に過酸化水素がない場合または、１ｐｐｍより少ない場合には図３（ｆ’）の過酸化水素検出具１ｄに示すように、担持部２ｄが発色しない。これに対し、検液が１ｐｐｍ以上の過酸化水素を含有する場合には過酸化水素検出具１ｅのように、ペルオキシダーゼを担持する担持部２ｅが赤色に発色する。これにより被検査物から１ｐｐｍ以上の過酸化水素が検出されたことを判断可能である。
【００４６】
以上より、従来、４−アミノアンチピリン法により、吸光度測定機器を用いて過酸化水素の検出を行った場合には、過酸化水素が検出されるかどうかの判断に約１日かかっていたところ、５〜２０分で判断可能であるので、時間の大幅の短縮が可能となる。これにより、食品加工業者が工場内で簡易に過酸化水素の検出する際の手間を省くことができる。
【００４７】
尚、本発明の過酸化水素検出具及び過酸化水素検出方法に用いるぺルオキシダーゼが担持されている担持体３は、過酸化水素の存在下、４−アミノアンチピリンと水素供与体と結合してキノン色素を生成する性質を有しているので、これを過酸化水素検出具としてだけではなく、水素供与体の検出用として用いてもよい。このような目的で使用する場合、水素供与体検出具の担持体には４−アミノアンチピリン又はその誘導体、過酸化水素、または、ぺルオキシダーゼのうち、少なくともぺルオキシダーゼが担持され、被検査物に水素供与体が検出された場合に、担持部が発色する構造とする。そして、水素供与体検出具は、４−アミノアンチピリン又はその誘導体、過酸化水素を担持体に担持しなくてもよく、水素供与体の検出操作を行う際これら物質を別途添加する構造としてもよい。水素供与体の担持体に担持するペルオキシターゼの使用濃度としては、通常１ppm〜100ppm、好ましくは４０ｐｐｍ〜６０ｐｐｍである。
【実施例１】
【００４８】
過酸化水素を0.2Mリン酸緩衝液に溶解し濃度を５．０ｐｐｍとした検液２ｍＬと、過酸化水素を添加しない0.2Mリン酸緩衝液のみの検液２ｍＬとを用い、本発明に係る過酸化水素検出具の発色の状態を比較した。担持体は、縦１８ｍｍ〜２０ｍｍ、横８ｍｍ〜１０ｍｍに裁断したバイオラド社製ニトロセルロース膜（厚さ０．１ｍｍ）を用いた。ペルオキシダーゼを５ｐｐｍに調整し、エッペンドルフ社製マイクロピペット（型番リファレンス4910）により前記担持体の表面に、１箇所につき２０μＬずつを２箇所に滴下し、自然乾燥を行うため室温で２０分間放置した。このようにして、ペルオキシダーゼのみが担持体の２箇所の担持部に円形状に担持されている過酸化水素検出具を作成した。
【００４９】
そして、０．４重量％４−アミノアンチピリン０．１ｍＬと、水素供与体として１．９重量％フェノール０．３ｍＬとをそれぞれ検液に添加すると共に、上記のように作成した過酸化水素検出具を検液中に浸漬した。過酸化水素検出具の浸漬より２０分経過した時点で、担持体を検液から取り出し蒸留水により洗浄し、発色の状態を島津製作所製デンシトメーターＣＳ９０００を用いて測定した。測定条件は、波長を５２０ｎｍした。
（比較例１）
【００５０】
過酸化水素の検出方法として４−アミノアンチピリン法と、メトキシナフトール法との比較を行うため、上記実施例１と同様の条件で５ｐｐｍペルオキシダーゼ２０μＬを２箇所の担持部に滴下し、担持されて作成した過酸化水素検出具を用いると共に、上記実施例１に係る４−アミノアンチピリン及びフェノールに替えて、０．１５重量％４−メトキシ−１−ナフトールを０．４ｍＬ検液に添加し、その後の処理は上記実施例１と同様の条件で試験を行った。実施例１及び比較例１の結果を表１及び図４に以下に示す。
【００５１】
【表１】
【００５２】
表１において各数値は担持部の発色の濃淡の測定値であり、数値が高い程担持部が濃い発色となっていることを示す。これらの数値は各々の条件において得られた複数の測定値の平均値を示している。また、図４は縦軸に表１に示す数値をとり、横軸に各条件をとったものであり、横軸に示した文字ＢＬは過酸化水素を添加しない場合であり、ＳＴ５ｐｐｍは５．０ｐｐｍの過酸化水素を添加した場合である。更に、図４には、検出試験の結果得られた過酸化水素検出具の発色状態を示している。
【００５３】
表１及び図４に示すように、比較例１に係る４−メトキシ−１−ナフトールを添加した担持体は、過酸化水素を添加しない検液に浸漬した場合にも薄い青色の発色を示した。これに対し、実施例１に係る４−アミノアンチピリン及び水素供与体を添加した検液の担持体は過酸化水素を含有しない検液は全く発色せず、５．０ｐｐｍの過酸化水素を添加した検液では赤く発色するという適正な結果が得られた。
【実施例２】
【００５４】
担持体の材質の検討を行うため、担持体として、上記実施例１のバイオラド社製ニトロセルロース膜の他、アドバンテック社製濾紙（厚さ０．２ｍｍ）、アドバンテック社製ガラス繊維（厚さ０．５ｍｍ）、ミリポア社製親水性ＰＶＤＦ膜（厚さ０．１ｍｍ）の４種を用い、５．０ｐｐｍの過酸化水素を検液２ｍＬとして、上記実施例１と同様の条件で試験を行った。検液に担持体を浸漬した後約２０分間放置した時点の検液及び過酸化水素検出具を図５に示す。
【００５５】
図５より、いずれの担持体も赤色に発色した。特に、濾紙については担持体全体が薄い色に発色するとともに検液自体も薄い赤色に発色した。ガラス繊維膜、ＰＶＤＦ膜については担持体全体が濃い色に発色すると共に、検液自体も濾紙を浸漬させた検液よりも濃い赤色に発色した。
【００５６】
これに対し、ニトロセルロース膜は担持体のペルオキシダーゼを担持させた担持部のみ円形状に赤色に発色し、担持部以外は発色しなかった。また、検液が発色することもなかった。これは、濾紙、ガラス繊維膜、ＰＶＤＦ膜では、ペルオキシダーゼが担持体から検液中に溶出したと考えられ、ニトロセルロース膜では担持体から検液中に溶出することなく、担持体に担持されたままであると考えられる。
【実施例３】
【００５７】
水素供与体としてのフェノールの濃度を変更し、担持体の発色状況を試験した。フェノールの濃度範囲は０．５重量％〜８．０重量％とし、他の条件は５．０ｐｐｍの過酸化水素を検液２ｍＬとした上記実施例１と同様とした。結果を表２に示す。
【表２】
【００５８】
表２より、０．５重量％〜８．０重量％の全範囲で発色が認められる良好な結果が得られた。特に水素供与体の濃度が高い程、濃い色に発色する傾向となり、８．０重量％の値が４９ｍｍと最も良かった。これより、実施例１と同様の条件で作成した５ｐｐｍのぺルオキシダーゼのみが担持されてなる担持体を、水素供与体の検出を行う際にも利用可能であることが分かった。即ち、ペルオキシダーゼを担持させてなる担持体を水素供与体の検出を行いたい検液中に浸漬すると共に、所定量の過酸化水素及び４−アミノアンチピリンを該検液に添加することで水素供与体の検出が可能となる。
【実施例４】
【００５９】
４−アミノアンチピリンの濃度を０．０５重量％〜１．０重量％の範囲で変更すると共に、１．９重量％フェノールに替えて８．０重量％フェノールを用いた以外は５．００ｐｐｍ過酸化水素を検液とした上記実施例１と同様に担持体の発色状況を試験した。結果を表３に示す。
【表３】
【００６０】
表３より、全ての範囲で発色が認められる良好な結果が得られ、特に、０．１重量％で最も濃い発色となった。
【実施例５】
【００６１】
ペルオキシダーゼの濃度を１ｐｐｍ〜１００ｐｐｍの範囲で変更すると共に、１．９重量％フェノールに替えて８．０重量％フェノールを、０．４重量％４−アミノアンチピリンに替えて０．１重量％４−アミノアンチピリンを用いた以外は５．００ｐｐｍ過酸化水素を検液とした上記実施例１と同様に担持体の発色状態を測定した。結果を表４に示す。
【表４】
【００６２】
この結果全範囲で発色が認められる良好な結果が得られ、特に５〜１００ｐｐｍにおいてより濃い発色となる結果が得られ、この範囲内では余り差が認められなかった。
【実施例６】
【００６３】
担持体に担持させるペルオキシダーゼの量を検討するため、実施例１では５ｐｐｍペルオキシダーゼ２０μＬを担持体に担持させたところ、５ｐｐｍペルオキシダーゼを用い１箇所の滴下量を５μＬ〜５０μＬの範囲で変更し、また、１．９重量％フェノールに替えて８．０重量％フェノールを、０．４重量％４−アミノアンチピリンに替えて０．１重量％４−アミノアンチピリンを用いた以外は５．００ｐｐｍ過酸化水素を検液とした上記実施例１と同様とした。結果を表５に示す。
【表５】
【００６４】
表５より、全範囲で発色が認められる良好な結果が得られた。再現性に関しては２０μＬが最も良い結果となり、７回測定を行ったところ標準偏差３．７、変動係数３．４％であった。
【実施例７】
【００６５】
担持部の発色状態の変化を確認するため、５．０ｐｐｍの過酸化水素２ｍＬに、８．０重量％のフェノール０．３ｍＬ、０．１重量％４−アミノアンチピリン０．１ｍＬを添加した検液に、５ｐｐｍのペルオキシダーゼ２０μＬずつを２箇所に担持した担持体を浸漬した。１５分間の浸漬後、担持体を検液から取り出して蒸留水で１分間洗浄し、ろ紙にはさんで水分を除き、１０分間放置した。この時点での発色状態を測定し、得られた数値を基準とし、１５分〜４２０分までの間の各時点で発色状態を測定した場合の担持部の濃さの割合を算出した。結果を表６に示す。
【表６】
【００６６】
表６より、担持体が湿っている状態の１５分の時点では、色が濃く見えるために数値が安定しないが、担持体が乾燥する２０分以後は数値がほぼ一定となり、２０分〜４２０分経過後について発色状態にほとんど変化が見られなかった。
【実施例８】
【００６７】
担持体の発色に要する時間を測定するため、ペルオキシダーゼを担持させた担持体を検液中に浸漬する際の浸漬時間を５〜３０分の間で変更した。また、フェノールの濃度を１．９重量％に替えて８．０重量％に、０．４重量％４−アミノアンチピリンに替えて０．１重量％４−アミノアンチピリンとし、他の条件は５．００ｐｐｍ過酸化水素を検液とした上記実施例１と同様とした。結果を表７に示す。
【表７】
【００６８】
表７より、５分〜３０分の範囲でいずれも良好な発色状態であり、全範囲でほとんど差は見られなかった。これより、約５分で反応が終了していると考えられる。
【実施例９】
【００６９】
担持体の過酸化水素の検出限界となる濃度を確認するため、過酸化水素の濃度を０．１〜１０ｐｐｍの範囲で変更し、また、フェノールの濃度を１．９重量％に替えて８．０重量％に、０．４重量％４−アミノアンチピリンに替えて０．１重量％４−アミノアンチピリンとし、他の条件は５．００ｐｐｍ過酸化水素を検液とした上記実施例１と同様とした。結果を表８及び図３に示す。
【表８】
【００７０】
表８より、発色の程度は低いものの０．１ｐｐｍから担持部の発色が確認でき、３ｐｐｍまでは直線性が認められ、それ以上の範囲では十分濃い色の発色が確認できた。
【実施例１０】
【００７１】
ペルオキシダーゼ等の物質を担持させ、検出具を作成後、直ちに検出を行うのではなく、暫く保管した後に検出を行う際にも適正な結果が得られるかどうか、保存安定性の確認試験を行った。即ち、上記実施例１と同様の条件で過酸化水素検出具を作成した。作成直後及び３０度の室温において５時間放置後の過酸化水素検出具を用いて、５ｐｐｍの過酸化水素の発色試験を行った。尚、発色試験は検液に添加するフェノールの濃度を１．９重量％に替えて、８．０重量％に、０．４重量％４−アミノアンチピリンに替えて０．１重量％４−アミノアンチピリンとした以外は上記実施例１と同様の条件とした。
【００７２】
また、３０度の室温において５時間の放置の際の保存方法は、１．そのまま放置、２．密閉容器内に酸素吸収剤（アイ・エス・オー社製A-500HS、４g入／袋、以下同じ）と保存、３．密閉容器内に窒素を充填し酸素吸収剤と共に保存、４．密閉容器内に窒素を充填し保存、５．密閉容器内にシリカゲル（豊田化工株式会社製乾燥剤5g入／袋、以下同じ）と保存、６．密閉容器内に窒素を充填しシリカゲルと共に保存、７．密閉容器内に五酸化リンと保存の７種類の条件とした。結果を表９に示す。
【表９】
【００７３】
表９では、各条件における発色の濃さを示す数値とともに、過酸化水素検出具の作成直後の発色状態を１００％とし、これに対する５時間放置後の検出具の発色状態の変化の割合を算出したものを示している。表９より、そのまま室内で放置した場合には発色の状態が２０．７％にまで低下していた。この原因としては、空気中の酸素によって過酸化水素検出具が酸化されたか、又は空気中の水分が過酸化水素検出具に何らかの影響を与えていると考えられる。
【００７４】
そこで、まず、空気中の酸素による酸化を防止するため密閉容器内に酸素吸収剤と保存した場合には２９．６％、密閉容器内に窒素を充填し酸素吸収剤と共に保存した場合は２７．８％、密閉容器内に窒素を充填し保存した場合は５３．３％という結果が得られ、そのまま放置した場合に比較して、発色状態は、酸素吸収剤使用では同程度であったが、窒素充填のみで保存すると、２倍の改善が認められた。
【００７５】
次に、空気中の水分を排除した状態で保存するため、過酸化水素検出具を、密閉容器内にシリカゲルと保存した場合、密閉容器内に窒素を充填しシリカゲルと共に保存した場合、密閉容器内に五酸化リンと保存した場合には、６４．４％〜７５．２％の発色状態が維持可能であることが分かった。よって、空気中の水分を排除した状態で保存することにより、予め多数の過酸化水素検出具を作成し必要量を複数回に分けて使用したいような場合にも、適正な検出結果を得ることが可能であることが確認できた。
【実施例１１】
【００７６】
実施例１０にかかる保存安定性について、担持体に担持させるペルオキシダーゼの濃度を高くすることで発色状態の低下防止の効果があるかどうか確認するため、ペルオキシダーゼの濃度を５ｐｐｍ及び５０ｐｐｍの２種類とした以外は上記実施例１０と同様の条件で過酸化水素検出具を作成し、約３０℃の室温で５時間放置した。放置の際は密閉容器内に窒素を充填し、シリカゲルと共に保存することとした。結果を表１０に示す。
【表１０】
【００７７】
表１０よりペルオキシダーゼの濃度を５０ｐｐｍとすることで、検出具作成の後５時間放置後においても良好な発色性を示すことが分かった。尚、上記実施例５において過酸化水素検出具を作成した直後に使用する場合には、ペルオキシダーゼの濃度が５〜１００ｐｐｍの範囲内では余り差が認められていない。よって、過酸化水素検出具を作成後直ちに使用する場合には担持させるペルオキシダーゼの濃度は５ｐｐｍ、５０ｐｐｍのいずれでもほぼ同じ結果が得られるが、暫く保存後使用する場合には５０ｐｐｍとした方がよりよいことが分かる。
【実施例１２】
【００７８】
過酸化水素検出具の保存の際の温度による影響を確認するため上記実施例１１における約３０度の室温で保存に替えて、約４℃の冷蔵庫内、−３０℃及び−８０℃の冷凍庫内で、それぞれ過酸化水素検出具の作成後１０日間保存した。結果を表１１に示す。
【表１１】
【００７９】
表１１より、過酸化水素検出具を−８０℃〜４℃の低温にて保存することで１０日経過後においても発色の状態がほとんど低下しないという良好な結果が得られた。これより、本発明に係る過酸化水素検出具を作成直後に使用せず、所定期間経過後使用する場合には、食品加工業者では通常設置されている冷蔵庫又は冷凍庫にて保存することで保存安定性を維持できることが分かった。
【実施例１３】
【００８０】
実施例１２では１０日間程度の保存安定性について試験したが、更に長期間の保存状態を確認するため以下の試験を行った。即ち、実施例１２と同様に、５０ｐｐｍのペルオキシダーゼ２０μＬをニトロセルロース膜からなる担持体に担持させ、密閉容器内に窒素を充填し、シリカゲルと共に、約４℃の冷蔵庫内で作成直後〜１２ヶ月間保存した。
【００８１】
また、水素供与体及び４−アミノアンチピリンについても担持体に担持させた状態での保存を行った。水素供与体としてのフェノールはアドバンテック社製濾紙（厚さ０．２ｍｍ）を縦２ｃｍ、横２ｃｍに裁断してなる担持体に、２４重量％エタノール溶液１００μＬを吸収させ、室内で放置し自然乾燥させた。４−アミノアンチピリンは水素供与体と同じアドバンテック社製濾紙を縦２ｃｍ、横１ｃｍに裁断してなる担持体に、０．２重量％４−アミノアンチピリン水溶液を５０μＬ吸収させた後、冷蔵庫（４℃）で乾燥させた。
【００８２】
その後、該フェノール及び４−アミノアンチピリンをそれぞれ担持した担持体を密閉容器内に窒素を充填し、シリカゲルと共に、約４℃の冷蔵庫内で保存した。
【００８３】
更に、ペルオキシダーゼと共に、水素供与体及び４−アミノアンチピリンを一個の担持体に担持させた過酸化水素検出具についても上記と同様の試験を行った。即ち、バイオラド社製ニトロセルロース膜（厚さ０．１ｍｍ）に８．０重量％フェノール１５μＬをエッペンドルフ社製マイクロピペット（型番リファレンス4910）により滴下し、乾燥した後、０．１重量％４−アミノアンチピリン５μＬを同様に滴下、乾燥し、更に、５０ｐｐｍペルオキシダーゼ２０μＬを同様に滴下、乾燥し、過酸化水素検出具を作成した。該過酸化水素検出具を上記同様、密閉容器内に窒素を充填し、シリカゲルと共に、４℃の冷蔵庫内で作成直後〜１２ヶ月保存を行った。結果を表１２に示す。
【表１２】
【００８４】
表１２より、ペルオキシダーゼ、フェノール及び４−アミノアンチピリンをそれぞれ異なる担持体に担持させた場合、及びこれらを全て一個の担持体に担持させた場合の双方において６ヶ月間保存した際にも発色状態を約１００％維持可能であり、１２ヶ月保存した場合においても発色性がほとんど低下せず、長期保存が可能であることが分かった。
【実施例１４】
【００８５】
試験用シラスを作成し、該試験用シラスについて本発明に係る過酸化水素検出具と、酸素電極法との過酸化水素検出のための比較実験を行った。試験用シラスは、沸騰水１Ｌに食塩２０ｇと過酸化水素標準液を５，０００μｇ〜１００，０００μｇ添加し、ここに水道水でよく洗浄した生シラス１２０ｇを添加し５分間煮沸した。その後、ザルに取り出して水切りを行い、１０分間放冷することにより作成した。得られた試験用シラス５ｇを
すりつぶし、0.2Mリン酸緩衝液２５ｍＬに添加した。ここに上記実施例１３のペルオキシダーゼ、フェノール及び４−アミノアンチピリンの各々の担持体と同様の条件で作成した過酸化水素検出具を浸漬させ１０分間放置した後、蒸留水で洗浄した。発色の状態を、島津製作所製デンシトメーターＣＳ９０００により算出した。
（比較例２）
【００８６】
上記実施例１４と同様の条件で作成した試験用シラス５ｇの過酸化水素濃度を酸素電極法により測定するため、以下の試験を行った。実施例１４と同様の条件で作成した試験用シラスをホモジナイズし、その５ｇを秤量し0.5%臭素酸カリウム含有0.2Mリン酸緩衝液を加えて５０ｍＬとし、その溶液をろ過し、ろ液を酸素電極法により測定した。測定機器は、セントラル科学社製高感度過酸化水素計スーパーオリテクターモデル５（ＳＵＰＥＲ ＯＲＩＴＥＣＴＯＲ ＭＯＤＥＬ５）を用い、測定条件をRangを0.1、サンプル液量を２ｍL、窒素流量を６５mL/min、カタラーゼ液量を２５μLとした。実施例１４及び比較例２の結果を表１３に示す。
【表１３】
【００８７】
表１３より、本発明に係る過酸化水素検出具を用いた過酸化水素の検出結果と、酸素電極法による検出結果はほぼ等しいものであった。これより、本発明に係る過酸化水素検出具を用いた試験はデータの信頼性が十分高いことが確認できた。
【実施例１５】
【００８８】
市販のシラス干し１０検体について、本発明に係る過酸化水素検出具を用いた簡易検出方法及び酸素電極法で過酸化水素の含有量の比較試験を行った。結果を表１４に示す。
【表１４】
【００８９】
表１４より、本発明に係る過酸化水素検出具は酸素電極法により得られた過酸化水素濃度と略同じ程度の値を示しめすことが確認できた。よって、食品に１ｐｐｍ前後以上の過酸化水素が含有されているかどうか確認することができ、食品製造業者の食品の衛生管理に要する負担を軽減可能である。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】本発明の一実施形態に係る過酸化水素検出具の斜視図である。
【図２】本発明の一実施形態に係る過酸化水素の検出方法を示す図である。
【図３】本発明の他の実施形態に係る過酸化水素の検出方法を示す図である。
【図４】前記他の実施形態にかかる過酸化水素検出具の実施例及び比較例の発色状態を示す図である。
【図５】前記他の実施形態にかかる複数の過酸化水素検出具の発色状態を示す図である。
【符号の説明】
【００９１】
１１ａ，１ｂ，１ｃ，１ｄ，１ｅ 過酸化水素検出具
３ 担持体
４，４ａ 被検査物
５，５ｃ 検液
【特許請求の範囲】
【請求項１】
４−アミノアンチピリン法による過酸化水素の検出に用いるための４―アミノアンチピリン又はその誘導体、水素供与体、または、ぺルオキシターゼのうち、少なくともぺルオキシターゼが担持されてなる担持体を備えてなることを特徴とする過酸化水素検出具。
【請求項２】
担持体が膜状部材であることを特徴とする請求項１に記載の過酸化水素検出具。
【請求項３】
膜状部材がニトロセルロ−ス膜であることを特徴とする請求項２に記載の過酸化水素検出具。
【請求項４】
被検査物を含む検液に、ペルオキシターゼ、水素供与体、及び４―アミノアンチピリンを添加して被検査物に含まれている過酸化水素を検出する４−アミノアンチピリン法による過酸化水素検出方法であって、
ペルオキシターゼが担持された担持体を検液に浸漬することを特徴とする４−アミノアンチピリン法による過酸化水素検出方法。
【請求項５】
水素供与体の検出に用いるための４―アミノアンチピリン又はその誘導体、過酸化水素、または、ぺルオキシターゼのうち、少なくともぺルオキシターゼが担持されてなる担持体を備えてなることを特徴とする水素供与体検出具。
【請求項１】
４−アミノアンチピリン法による過酸化水素の検出に用いるための４―アミノアンチピリン又はその誘導体、水素供与体、または、ぺルオキシターゼのうち、少なくともぺルオキシターゼが担持されてなる担持体を備えてなることを特徴とする過酸化水素検出具。
【請求項２】
担持体が膜状部材であることを特徴とする請求項１に記載の過酸化水素検出具。
【請求項３】
膜状部材がニトロセルロ−ス膜であることを特徴とする請求項２に記載の過酸化水素検出具。
【請求項４】
被検査物を含む検液に、ペルオキシターゼ、水素供与体、及び４―アミノアンチピリンを添加して被検査物に含まれている過酸化水素を検出する４−アミノアンチピリン法による過酸化水素検出方法であって、
ペルオキシターゼが担持された担持体を検液に浸漬することを特徴とする４−アミノアンチピリン法による過酸化水素検出方法。
【請求項５】
水素供与体の検出に用いるための４―アミノアンチピリン又はその誘導体、過酸化水素、または、ぺルオキシターゼのうち、少なくともぺルオキシターゼが担持されてなる担持体を備えてなることを特徴とする水素供与体検出具。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１０−１２７８８８（Ｐ２０１０−１２７８８８Ａ）
【公開日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３０６２４８（Ｐ２００８−３０６２４８）
【出願日】平成２０年１２月１日（２００８．１２．１）
【出願人】（５９１０２３５９４）和歌山県 (62)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月１日（２００８．１２．１）
【出願人】（５９１０２３５９４）和歌山県 (62)
【Ｆターム（参考）】
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