過酸化脂質の定量分析方法
【課題】顔の皮膚表面に存在する過酸化脂質の量を効率的かつ精度良く計測するための定量分析方法を提供する。
【解決手段】顔の所定部位における過酸化脂質の量を測定する方法であって、顔の所定部位に密着させ皮膚表面にある表皮物質を吸着させた濾紙をメタノールに浸漬し、その後、該メタノールにジフェニル−１−ピレニルホスフィンを加え、生成したジフェニル−１−ピレニルホスフィンオキシドの蛍光強度を測定することにより過酸化脂質の量を測定することを特徴とする過酸化脂質の定量分析方法。
【解決手段】顔の所定部位における過酸化脂質の量を測定する方法であって、顔の所定部位に密着させ皮膚表面にある表皮物質を吸着させた濾紙をメタノールに浸漬し、その後、該メタノールにジフェニル−１−ピレニルホスフィンを加え、生成したジフェニル−１−ピレニルホスフィンオキシドの蛍光強度を測定することにより過酸化脂質の量を測定することを特徴とする過酸化脂質の定量分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顔の所定部位における過酸化脂質の量を測定するための過酸化脂質の定量分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の研究によれば、紫外線が皮膚に過度に照射されると、フリーラジカルや活性酸素を生じ、これらの物質が皮脂を酸化することで過酸化脂質が生成されることが報告されている。過酸化脂質は、アトピー性皮膚炎や接触皮膚炎、乾癬などの皮膚疾患に関与すると考えられており、いったん過酸化脂質が生成されると、酸化は連鎖的に進行し、皮膚表面に刺激を与えるだけにとどまらず、さらには分解して反応性の高いアルデヒドとなり、それが角層のタンパク質と結合することでカルボニル基を有する酸化タンパク質が生成し角質層の奥まで入り込んで細胞にダメージを与える。これらの角層酸化タンパク質は、皮膚の加齢に伴う老化や光老化を引き起こす要因であると考えられている。
【０００３】
このように過酸化脂質は、ヒトの皮膚の老化現象に影響を与えることが知られており、顔の表皮に存在する過酸化脂質の量を精度良く測定し、過酸化脂質の量と皮膚の各種現象との関連性を検討することは皮膚科学分野において重要な課題となっている。
【０００４】
顔の表皮に存在する過酸化脂質を測定する分析方法として、本発明者らは高感度の測定が可能なジフェニル−１−ピレニルホスフィンを蛍光試薬に用いた蛍光検出法を採用するが、過酸化脂質を抽出する過程においては、従来より、所定の溶媒を用いて被験者の皮膚から表皮物質を抽出し、かかる溶媒を濃縮乾固し、その後濃縮乾固物を再溶解して分析が可能な程度にまで過酸化脂質の濃度を高め(濃縮乾固及び再溶解)、これを検体とする方法が確立されていた。
【０００５】
しかしながら、本発明者らの研究から溶媒の濃縮乾固過程においては一部の過酸化脂質が分解し、前記の分析方法では過酸化脂質の定量に誤差が生じる可能性があることが確認された(図２)。また、濾紙で表皮物質を吸着しこれを溶媒で抽出する際、使用する溶媒によっては蛍光強度に誤差が生じ得ることも確認された(図３)。
【０００６】
さらに、表皮物質(過酸化脂質)の量は、個人による差が大きく(図１)、過酸化脂質の定量においては多数の被験者を測定する必要があるが、抽出溶媒の濃縮乾固等の操作には長時間を要することから、定量分析を効率的に行うことは困難であった。
【０００７】
本発明は、過酸化脂質を測定する定量分析法として蛍光検出法を採用し、従来における抽出方法の問題点を解消しつつ、特に顔の皮膚表面に存在する過酸化脂質の量を精度良く、効率的に測定するための定量分析方法を確立するものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００２−１２２５９３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、顔の皮膚表面に存在する過酸化脂質の量を精度良くかつ効率的に測定するための定量分析方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記課題を解決するために本発明者らが検討を行った結果、顔の皮膚表面にある表皮物質を濾紙で吸着し、かかる濾紙をメタノールに浸漬し、その後該メタノールにジフェニル−１−ピレニルホスフィン(ＤＰＰＰ)を加え、生成したジフェニル−１−ピレニルホスフィンオキシド(ＤＰＰＰ＝Ｏ)の蛍光強度を測定することにより、効率的かつ精度良く過酸化脂質の量を分析できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち本発明は、顔の所定部位における過酸化脂質の量を測定する方法であって、顔の所定部位に密着させ皮膚表面にある表皮物質を吸着させた濾紙をメタノールに浸漬し、その後、該メタノールにジフェニル−１−ピレニルホスフィン(ＤＰＰＰ)を加え、生成したジフェニル−１−ピレニルホスフィンオキシド(ＤＰＰＰ＝Ｏ)の蛍光強度を測定することにより過酸化脂質の量を測定することを特徴とする過酸化脂質の定量分析方法である。
【００１２】
さらに本発明は、メタノールが、純度が９９．８質量％以上で、水分含有量が０．０５質量％以下、不揮発成分の含有量が２質量ｐｐｍ以下であることを特徴とする過酸化脂質の定量分析方法である。
【００１３】
さらに本発明は、額部分の過酸化脂質の量を分析するときは、表皮物質を吸着させた濾紙を、濾紙１ｃｍ２ あたり２００〜１０００μＬ、特に好ましくは２００〜４００μＬに相当する量のメタノールに浸漬することを特徴とする過酸化脂質の定量分析方法である。
【００１４】
また本発明は、鼻部分の過酸化脂質の量を分析するときは、表皮物質を吸着させた濾紙を、濾紙１ｃｍ２ あたり２００〜１６００μＬ、特に好ましくは２００〜５００μＬに相当する量のメタノールに浸漬することを特徴とする過酸化脂質の定量分析方法である。
【００１５】
また本発明は、頬部分の過酸化脂質の量を分析するときは、表皮物質を吸着させた濾紙を、濾紙１ｃｍ２ あたり２００〜１２００μＬ、特に好ましくは２００〜６００μＬに相当する量のメタノールに浸漬することを特徴とする過酸化脂質の定量分析方法である。
【００１６】
さらに本発明は、濾紙を浸漬した後のメタノールを濃縮乾固することなく、これにジフェニル−１−ピレニルホスフィン(ＤＰＰＰ)を加えることを特徴とする過酸化脂質の定量分析方法である。
【００１７】
さらに本発明は、濾紙の厚さが、０．１８〜０．２３ｍｍであることを特徴とする過酸化脂質の定量分析方法である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の定量分析方法によれば、顔の所定部位における過酸化脂質の量を精度良く定量分析することができる。
【００１９】
また、所定の純度を有するメタノールで過酸化脂質を抽出することにより、蛍光強度の誤差を無くし精度良い定量分析が可能となる。
【００２０】
顔の所定部位に応じて所定量のメタノールで抽出することにより定量限度を上回る濃度の抽出溶媒を得ることができ、溶媒を濃縮乾固することなく分析することができるため、過酸化脂質が分解することなく正確に測定することができる。また、溶媒を濃縮乾固及び再溶解する工程が不要であることから分析時間を短縮することができ、効率的な定量分析が可能となる。
【００２１】
顔に密着させる濾紙を所定の大きさにすることにより、顔の皮膚に密着させやすく、また、メタノールに浸漬する際には、小さい容量のバイアル瓶の底に沈め、必要最少量のメタノールに浸漬することができる。このため、溶媒中の過酸化脂質の濃度を高めるための濃縮乾固・再溶解工程を採る必要が無く、精度の高い分析を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】女性パネル２４名の過酸化脂質濃度を示すグラフ
【図２】抽出溶媒の濃縮乾固が回収率に及ぼす影響を示すグラフ
【図３】抽出溶媒が過酸化脂質濃度に及ぼす影響を示すグラフ
【図４】抽出溶媒の量が回収率に及ぼす影響を示すグラフ
【図５】顔の各部位における過酸化脂質の濃度を示すグラフ
【図６】定量分析の工程を示す概念図
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の実施の形態を以下に詳しく説明する。
【００２４】
表皮物質の採取は、濾紙を皮膚に密着させ、濾紙に表皮物質を吸着させることにより行う。濾紙で表皮物質を採取することとしたのは、濾紙が実験用素材であり品質が一定であること、皮膚への影響が少ない天然素材であるセルロース繊維からなること、また、表皮物質を吸着しやすく、採取した表皮物質を溶媒を用いて抽出する際、溶媒と相互作用を生じることが少ないためである。
【００２５】
濾紙は、化学分析に使用できるものであれば、特に限定されるものではなく、市販品を使用することができる。市販品としては、例えばＡＤＶＡＮＴＥＣ社製の濾紙「定量分析用５種Ｃ」があり、これを所定の大きさに裁断して使用することができる。
【００２６】
顔に密着させる濾紙の面積は、測定する部位や目的に応じて、０．１〜１０ｃｍ２ の範囲で適宜選定することが好ましい。また、実施例に示すように、過酸化脂質を採取した濾紙を１ｃｍ２あたり、額部分であれば２００〜１０００μＬの溶媒に浸漬(鼻部分であれば２００〜１６００μＬ、頬部分であれば２００〜１２００μＬの溶媒に浸漬)することにより、蛍光検出法による定量分析が可能な濃度の過酸化脂質の抽出溶媒を得ることができる。
【００２７】
このようにして抽出溶媒を得ることで、一般的に行われる溶媒の濃縮乾固及び再溶解を行う必要が無く、定量分析の効率化を図ることができると共に、濃縮乾固による過酸化脂質の分解が無く、精度の高い定量を行うことが可能となる。
【００２８】
また、実施例で濾紙を短辺５ｍｍ×長辺１０ｍｍの長方形の切片としこれを２枚使用したのは、小型のバイアル瓶の中で溶媒に浸漬することを可能とするためである。すなわち、小型のバイアル瓶の口頸の内径は約７ｍｍであり、底面直径は約１５ｍｍであることから、バイアル瓶の底面付近にある少量の溶媒に浸漬することができるよう、口頸を通過し底に沈めることができる形状としたものである。このように少量の溶媒に浸漬することにより、本発明者らが用いた蛍光検出法の定量限界値である０．０６ｐｐｍを超える濃度の抽出溶媒を濃縮乾固及び再溶解することなく得ることが可能となる。
【００２９】
このように顔に密着させる濾紙は、バイアル瓶の大きさに応じて適宜裁断し、これを複数枚使用するなどして表皮物質を採取することが好ましい。
【００３０】
濾紙の厚さは、０．１８〜０．２３ｍｍであることが好ましい。０．１８ｍｍより薄いと、表皮物質を十分に吸着できない可能性がある。一方、０．２３ｍｍより厚いと浸漬するメタノールの量を増やす必要があるため検体の濃度が低くなり、分析に必要な濃度の検体が得られない可能性がある。
【００３１】
濾紙で吸着した過酸化脂質は、濾紙をメタノールに浸漬し、メタノールにより抽出する。メタノールは、純度が９９．８質量％以上で、不揮発成分の含有量が２ｐｐｍ以下、水分含有量が０．０５％以下であることが好ましい。このような純度の高いメタノールは、本発明で使用するジフェニル−１−ピレニルホスフィン(ＤＰＰＰ)やジフェニル−１−ピレニルホスフィンオキシド(ＤＰＰＰ＝Ｏ)等の試薬との相互作用が無く、正確な分析を行うことができる。また、皮膚に密着する濾紙及びバイアル瓶を予め純度の高い前記のメタノールで予め洗浄しておけば、さら精度の高い分析値が得られることが期待される。メタノールの純度に関する試験結果は実施例にて詳述する。
【００３２】
純度が９９．８質量％以上で、不揮発成分の含有量が２ｐｐｍ以下、水分含有量が０．０５％以下のメタノールは、環境分析用として市販されているものを使用することができ、例えば、和光純薬工業株式会社製の環境分析用メタノール(純度が９９．８質量％以上、水分含有量が０．０５質量％以下、不揮発成分の含有量が１質量ｐｐｍ以下を規格とする)や純正化学株式会社製の製品名「メタノール５０００」(純度が９９．８質量％以上、水分含有量が０．０５質量％以下、不揮発成分の含有量が２質量ｐｐｍ以下を規格とする)等を使用することができる。
【００３３】
表皮物質を吸着させた濾紙をメタノールに浸漬し、表皮物質(過酸化脂質)を抽出したメタノールにジフェニル−１−ピレニルホスフィン(ＤＰＰＰ)を加えて過酸化脂質のヒドロキシペルオキシドと反応させ、得られた蛍光化合物ジフェニル−１−ピレニルホスフィンオキシド(ＤＰＰＰ＝Ｏ)の蛍光強度を測定することにより定量する。
【００３４】
ジフェニル−１−ピレニルホスフィン(ＤＰＰＰ)は、過酸化物と化学量論的に反応して、蛍光性を有するジフェニル−１−ピレニルホスフィンオキシド(ＤＰＰＰ＝Ｏ)を生成する。ジフェニル−１−ピレニルホスフィン(ＤＰＰＰ)は蛍光性を有しないが、ジフェニル−１−ピレニルホスフィンオキシド(ＤＰＰＰ＝Ｏ)は蛍光性を有するので、その蛍光強度を測定することにより、検体中の過酸化物の量を測定することができる。
【００３５】
ジフェニル−１−ピレニルホスフィンオキシド(ＤＰＰＰ＝Ｏ)を検出するには、励起光として３５２ｎｍの光を照射し、３８０ｎｍ付近にピークを有する蛍光のピーク強度を検出する。蛍光強度(ピーク強度)は、市販の適当な検出器を用いて測定すればよい。蛍光強度は被検体の過酸化脂質の存在量を表す指標として評価することができる。
【００３６】
本発明で用いるジフェニル−１−ピレニルホスフィン(ＤＰＰＰ)自体は公知化合物であり、市販品などから容易に入手できる。市販品としては、例えば、同仁化学社製「ＤＰＰＰ」等がある。本発明では検体中の過酸化脂質と反応させ、得られたジフェニル−１−ピレニルホスフィンオキシド(ＤＰＰＰ＝Ｏ)の蛍光強度を定量することにより検体中にある過酸化脂質の量を測定する。ジフェニル−１−ピレニルホスフィン(ＤＰＰＰ)を含む試薬の形態は特に限定されず、固体でも液体（溶液、懸濁液など)でもよい。液体の場合には適当な溶媒(好ましくはジフェニル−１−ピレニルホスフィン(ＤＰＰＰ)が一定の溶解度を示す有機溶媒など)に溶解または懸濁することによって試薬を調製することができる。
【実施例】
【００３７】
図１は、女性被験者２４名の顔から採取した過酸化脂質の濃度を示すものである。濾紙(ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製「定量分析用５種Ｃ」)を短辺５ｍｍ×長辺１０ｍｍの長方形の切片に裁断し、この切片２枚を被験者の顔に密着させて表皮物質を吸着させた後、メタノール２００μＬに浸漬・抽出した。このようにして得た抽出液を検体とし、これにジフェニル−１−ピレニルホスフィン(ＤＰＰＰ)(同仁化学社製「ＤＰＰＰ」)を加え、生成したジフェニル−１−ピレニルホスフィンオキシド(ＤＰＰＰ＝Ｏ)の蛍光強度を測定したものである。尚、ジフェニル−１−ピレニルホスフィン(ＤＰＰＰ)は、ＨＰＬＣ用メタノールに２．５ｍｇ／Ｌになるように溶解したものであり、フローインジェクション分析システムを用い、検体とシステム中で反応させた。
【００３８】
図１に示すように過酸化脂質の量は個人差が大きく、皮膚の各種現象との関連性について有意性のあるデータを取得するためには相当数のサンプルが必要である。本発明者らは、高感度で測定できる蛍光検出法を採用するが、本法による定量限界は０．０６ｐｐｍであるため、この数値を下回る被験者は定量データとして採用することはできない。
【００３９】
検体の濃度を高める方法としては、従来より抽出溶媒(メタノール)を減圧下で遠心し、溶媒を揮散させて濃縮乾固し、これを再溶解して対象物質の濃度を高め(濃縮乾固及び再溶解)、これを検体とする方法がある。
【００４０】
しかしながら、過酸化脂質を抽出した抽出溶媒(メタノール)を濃縮乾固することにより含有する過酸化脂質が分解され、定量測定値に誤差が生じる可能性があることを見出した。図２は、標準の過酸化脂質を濾紙にしみ込ませ、これをメタノールに浸漬して抽出し、抽出したメタノールを濃縮乾固せずにジフェニル−１−ピレニルホスフィン(ＤＰＰＰ)を加えてジフェニル−１−ピレニルホスフィンオキシド(ＤＰＰＰ＝Ｏ)を生成し、蛍光強度を測定して回収率を測定したものと、抽出したメタノールを減圧下で遠心し溶媒を揮散させて濃縮乾固し、これをメタノール１００μＬで再溶解して検体とし、これにジフェニル−１−ピレニルホスフィン(ＤＰＰＰ)を加え、回収率を測定したものとを比較した結果である。尚、標準の過酸化脂質とは、リノール酸メチルに紫外線(ＵＶ)を照射してその一部を過酸化脂質とし、溶媒に溶解し、濃度を検定したものである(過酸化脂質濃度０．７７ｐｐｍ)。また、ジフェニル−１−ピレニルホスフィン(ＤＰＰＰ)は、メタノールに溶解し、２．５質量ｐｐｍのメタノール溶液として添加した。
【００４１】
図２の結果から、溶媒の濃縮乾固過程により、過酸化脂質の回収率は低下することが確認された(回収率約６０％)。この結果から、過酸化脂質の定量分析において、その精度を高めるためには抽出溶媒を濃縮乾固することなく、ジフェニル−１−ピレニルホスフィン(ＤＰＰＰ)を加えることが重要であることがわかる。
【００４２】
つぎに、過酸化脂質を抽出する溶媒の種類について検討した。
図３は、各溶媒で洗浄した未使用の濾紙(１ｃｍ２)を、新たな各溶媒１ｍＬに２４時間浸漬し、浸漬後の各溶媒にジフェニル−１−ピレニルホスフィン(ＤＰＰＰ)を加え、蛍光強度を測定したものである。ここで、特級メタノールとは、純度９９．８質量％以上で、水分含有量が０．１質量％以下、不揮発物が５質量ｐｐｍ以下のメタノール(和光純薬工業株式会社製の試薬特級メタノール)であり、環境分析用メタノールとは、純度が９９．８質量％以上で、水分含有量が０．０５質量％以下、不揮発成分の含有量が１質量ｐｐｍ以下のメタノール(和光純薬工業株式会社製の試薬特級メタノール)である。尚、図３中、「洗浄なし」とは、濾紙を溶媒で洗浄することなく、環境分析用メタノールに浸漬したものである。
【００４３】
図３の結果から、未使用の濾紙でありながら、アセトンあるいは特級メタノールで洗浄し浸漬すると、浸漬したこれらの溶媒からは過酸化脂質の含有を示す蛍光が検出された。また、洗浄しない未使用の濾紙も浸漬した環境分析用メタノールから過酸化脂質の含有を示す蛍光が検出された。一方、環境分析用メタノールで洗浄し浸漬すると、浸漬した環境分析用メタノールからは蛍光は検出されなかった。このことから、環境分析用メタノール(純度が９９．８質量％以上で、水分含有量が０．０５質量％以下、不揮発成分の含有量が１質量ｐｐｍ以下のメタノール)で濾紙を洗浄した後、環境分析用メタノールで抽出することにより、濾紙あるいは溶媒に由来する過酸化脂質濃度の分析誤差を解消することができることが確認された。
【００４４】
これらの結果から過酸化脂質の定量分析の精度を高めるためには、抽出溶媒を濃縮乾固することなく定量分析すること、また溶媒としては所定の純度のメタノールを使用することが重要であることが確認された。そして抽出溶媒を濃縮乾固せずに定量分析するためには、抽出した過酸化脂質の濃度が本発明者らが用いた蛍光検出法による定量限界濃度(０．０６ｐｐｍ)を超える必要がある。このため、濾紙から過酸化脂質を抽出するための溶媒の適切な量について検討した。
【００４５】
図４は、濾紙(短辺５ｍｍ×長辺１０ｍｍの長方形の切片２枚)に標準品(０．７７ｐｐｍ)１０μＬを吸着させ、これを環境分析用メタノールに浸漬し、標準品の回収率を測定した結果を示すものである。
【００４６】
図４に示すように、２００μＬ以上の溶媒で抽出することにより、標準品を１００％回収できたが、１００μＬでは数値のバラツキが大きく、回収率が低い結果であった。この結果から、抽出する溶媒(環境分析用メタノール)の量としては２００μＬ以上が必要であることが確認された。尚、１００μＬで回収率が低い原因としては、濾紙が溶媒に完全に浸漬せず、標準品を十分に抽出できなかったことによるものと考察される。
【００４７】
つぎにヒトの各部位(額、鼻、頬、内腕)における過酸化脂質の量を測定した。
【００４８】
「試験方法」
定量分析の概略工程を図６に示す。
１）濾紙を裁断して得た短辺５ｍｍ×長辺１０ｍｍの切片を複数用意し、環境分析用メタノールで洗浄し乾燥した。
２）採取する各部位を洗浄し、２時間経過後に、濾紙の切片２枚を測定部位の皮膚に長辺が向かい合うように並べ、５０ｇで荷重し表皮物質を採取した(各部位につき被験者３名)。
３）採取後は、小型のバイアル瓶に濾紙切片２枚を収容し、環境分析用メタノール２００μＬを添加して過酸化脂質を抽出した。
４）抽出溶媒は、濃縮することなくジフェニル−１−ピレニルホスフィン(ＤＰＰＰ)を加え、過酸化脂質との反応により生成したジフェニル−１−ピレニルホスフィンオキシド(ＤＰＰＰ＝Ｏ)の蛍光強度を測定した。
【００４９】
「試験結果」
図５に示すように、額部では、平均で約０．３ｐｐｍの過酸化脂質を測定することができた。また、最も少ない被験者は、約０．１２ｐｐｍであった。この数値は、溶媒２００μＬ中の濃度を示すものであり、蛍光検出法による定量限界値は０．０６ｐｐｍであることを考慮すると、例えば溶媒の量を４００μＬとしても、すべての被験者のデータが取得可能である(最少の被験者の濃度であっても０．０６ｐｐｍを超えることができる)。さらに溶媒の量を１０００μＬとしても、平均の過酸化脂質量であれば定量可能であり、このことは、被験者の過酸化脂質量が正規分布に従うと仮定すると、約半数の被験者のデータを取得できることを意味する。したがって、図４の結果とあわせると、額部の過酸化脂質を定量するためには、濾紙１ｃｍ２あたり環境分析用メタノール２００〜１０００μＬで抽出することが好適であり、特に２００〜４００μＬで抽出することが好適であることがわかる。
【００５０】
鼻部についてみると、過酸化脂質の濃度は平均で約０．４８ｐｐｍである。また、最少値は約０．１５ｐｐｍである。額部と同様の考察をすれば、鼻部の過酸化脂質を定量するためには、濾紙１ｃｍ２あたり環境分析用メタノール２００〜１６００μＬで抽出することが好適であり、特に２００〜５００μＬで抽出することが好適である。
【００５１】
頬部では、過酸化脂質の濃度は平均で約０．３６ｐｐｍである。また、最少値０．１８ｐｐｍである。前記と同様の考察をすれば、頬部の過酸化脂質を定量するためには、濾紙１ｃｍ２あたり環境分析用メタノール２００〜１２００μＬで抽出することが好適であり、特に２００〜６００μＬで抽出することが好適である。
【００５２】
尚、内腕部の過酸化脂質は、蛍光検出法における定量限界値より低い濃度であるため、本発明による定量分析法により定量することは不適であることが確認できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顔の所定部位における過酸化脂質の量を測定するための過酸化脂質の定量分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の研究によれば、紫外線が皮膚に過度に照射されると、フリーラジカルや活性酸素を生じ、これらの物質が皮脂を酸化することで過酸化脂質が生成されることが報告されている。過酸化脂質は、アトピー性皮膚炎や接触皮膚炎、乾癬などの皮膚疾患に関与すると考えられており、いったん過酸化脂質が生成されると、酸化は連鎖的に進行し、皮膚表面に刺激を与えるだけにとどまらず、さらには分解して反応性の高いアルデヒドとなり、それが角層のタンパク質と結合することでカルボニル基を有する酸化タンパク質が生成し角質層の奥まで入り込んで細胞にダメージを与える。これらの角層酸化タンパク質は、皮膚の加齢に伴う老化や光老化を引き起こす要因であると考えられている。
【０００３】
このように過酸化脂質は、ヒトの皮膚の老化現象に影響を与えることが知られており、顔の表皮に存在する過酸化脂質の量を精度良く測定し、過酸化脂質の量と皮膚の各種現象との関連性を検討することは皮膚科学分野において重要な課題となっている。
【０００４】
顔の表皮に存在する過酸化脂質を測定する分析方法として、本発明者らは高感度の測定が可能なジフェニル−１−ピレニルホスフィンを蛍光試薬に用いた蛍光検出法を採用するが、過酸化脂質を抽出する過程においては、従来より、所定の溶媒を用いて被験者の皮膚から表皮物質を抽出し、かかる溶媒を濃縮乾固し、その後濃縮乾固物を再溶解して分析が可能な程度にまで過酸化脂質の濃度を高め(濃縮乾固及び再溶解)、これを検体とする方法が確立されていた。
【０００５】
しかしながら、本発明者らの研究から溶媒の濃縮乾固過程においては一部の過酸化脂質が分解し、前記の分析方法では過酸化脂質の定量に誤差が生じる可能性があることが確認された(図２)。また、濾紙で表皮物質を吸着しこれを溶媒で抽出する際、使用する溶媒によっては蛍光強度に誤差が生じ得ることも確認された(図３)。
【０００６】
さらに、表皮物質(過酸化脂質)の量は、個人による差が大きく(図１)、過酸化脂質の定量においては多数の被験者を測定する必要があるが、抽出溶媒の濃縮乾固等の操作には長時間を要することから、定量分析を効率的に行うことは困難であった。
【０００７】
本発明は、過酸化脂質を測定する定量分析法として蛍光検出法を採用し、従来における抽出方法の問題点を解消しつつ、特に顔の皮膚表面に存在する過酸化脂質の量を精度良く、効率的に測定するための定量分析方法を確立するものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００２−１２２５９３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、顔の皮膚表面に存在する過酸化脂質の量を精度良くかつ効率的に測定するための定量分析方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記課題を解決するために本発明者らが検討を行った結果、顔の皮膚表面にある表皮物質を濾紙で吸着し、かかる濾紙をメタノールに浸漬し、その後該メタノールにジフェニル−１−ピレニルホスフィン(ＤＰＰＰ)を加え、生成したジフェニル−１−ピレニルホスフィンオキシド(ＤＰＰＰ＝Ｏ)の蛍光強度を測定することにより、効率的かつ精度良く過酸化脂質の量を分析できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち本発明は、顔の所定部位における過酸化脂質の量を測定する方法であって、顔の所定部位に密着させ皮膚表面にある表皮物質を吸着させた濾紙をメタノールに浸漬し、その後、該メタノールにジフェニル−１−ピレニルホスフィン(ＤＰＰＰ)を加え、生成したジフェニル−１−ピレニルホスフィンオキシド(ＤＰＰＰ＝Ｏ)の蛍光強度を測定することにより過酸化脂質の量を測定することを特徴とする過酸化脂質の定量分析方法である。
【００１２】
さらに本発明は、メタノールが、純度が９９．８質量％以上で、水分含有量が０．０５質量％以下、不揮発成分の含有量が２質量ｐｐｍ以下であることを特徴とする過酸化脂質の定量分析方法である。
【００１３】
さらに本発明は、額部分の過酸化脂質の量を分析するときは、表皮物質を吸着させた濾紙を、濾紙１ｃｍ２ あたり２００〜１０００μＬ、特に好ましくは２００〜４００μＬに相当する量のメタノールに浸漬することを特徴とする過酸化脂質の定量分析方法である。
【００１４】
また本発明は、鼻部分の過酸化脂質の量を分析するときは、表皮物質を吸着させた濾紙を、濾紙１ｃｍ２ あたり２００〜１６００μＬ、特に好ましくは２００〜５００μＬに相当する量のメタノールに浸漬することを特徴とする過酸化脂質の定量分析方法である。
【００１５】
また本発明は、頬部分の過酸化脂質の量を分析するときは、表皮物質を吸着させた濾紙を、濾紙１ｃｍ２ あたり２００〜１２００μＬ、特に好ましくは２００〜６００μＬに相当する量のメタノールに浸漬することを特徴とする過酸化脂質の定量分析方法である。
【００１６】
さらに本発明は、濾紙を浸漬した後のメタノールを濃縮乾固することなく、これにジフェニル−１−ピレニルホスフィン(ＤＰＰＰ)を加えることを特徴とする過酸化脂質の定量分析方法である。
【００１７】
さらに本発明は、濾紙の厚さが、０．１８〜０．２３ｍｍであることを特徴とする過酸化脂質の定量分析方法である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の定量分析方法によれば、顔の所定部位における過酸化脂質の量を精度良く定量分析することができる。
【００１９】
また、所定の純度を有するメタノールで過酸化脂質を抽出することにより、蛍光強度の誤差を無くし精度良い定量分析が可能となる。
【００２０】
顔の所定部位に応じて所定量のメタノールで抽出することにより定量限度を上回る濃度の抽出溶媒を得ることができ、溶媒を濃縮乾固することなく分析することができるため、過酸化脂質が分解することなく正確に測定することができる。また、溶媒を濃縮乾固及び再溶解する工程が不要であることから分析時間を短縮することができ、効率的な定量分析が可能となる。
【００２１】
顔に密着させる濾紙を所定の大きさにすることにより、顔の皮膚に密着させやすく、また、メタノールに浸漬する際には、小さい容量のバイアル瓶の底に沈め、必要最少量のメタノールに浸漬することができる。このため、溶媒中の過酸化脂質の濃度を高めるための濃縮乾固・再溶解工程を採る必要が無く、精度の高い分析を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】女性パネル２４名の過酸化脂質濃度を示すグラフ
【図２】抽出溶媒の濃縮乾固が回収率に及ぼす影響を示すグラフ
【図３】抽出溶媒が過酸化脂質濃度に及ぼす影響を示すグラフ
【図４】抽出溶媒の量が回収率に及ぼす影響を示すグラフ
【図５】顔の各部位における過酸化脂質の濃度を示すグラフ
【図６】定量分析の工程を示す概念図
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の実施の形態を以下に詳しく説明する。
【００２４】
表皮物質の採取は、濾紙を皮膚に密着させ、濾紙に表皮物質を吸着させることにより行う。濾紙で表皮物質を採取することとしたのは、濾紙が実験用素材であり品質が一定であること、皮膚への影響が少ない天然素材であるセルロース繊維からなること、また、表皮物質を吸着しやすく、採取した表皮物質を溶媒を用いて抽出する際、溶媒と相互作用を生じることが少ないためである。
【００２５】
濾紙は、化学分析に使用できるものであれば、特に限定されるものではなく、市販品を使用することができる。市販品としては、例えばＡＤＶＡＮＴＥＣ社製の濾紙「定量分析用５種Ｃ」があり、これを所定の大きさに裁断して使用することができる。
【００２６】
顔に密着させる濾紙の面積は、測定する部位や目的に応じて、０．１〜１０ｃｍ２ の範囲で適宜選定することが好ましい。また、実施例に示すように、過酸化脂質を採取した濾紙を１ｃｍ２あたり、額部分であれば２００〜１０００μＬの溶媒に浸漬(鼻部分であれば２００〜１６００μＬ、頬部分であれば２００〜１２００μＬの溶媒に浸漬)することにより、蛍光検出法による定量分析が可能な濃度の過酸化脂質の抽出溶媒を得ることができる。
【００２７】
このようにして抽出溶媒を得ることで、一般的に行われる溶媒の濃縮乾固及び再溶解を行う必要が無く、定量分析の効率化を図ることができると共に、濃縮乾固による過酸化脂質の分解が無く、精度の高い定量を行うことが可能となる。
【００２８】
また、実施例で濾紙を短辺５ｍｍ×長辺１０ｍｍの長方形の切片としこれを２枚使用したのは、小型のバイアル瓶の中で溶媒に浸漬することを可能とするためである。すなわち、小型のバイアル瓶の口頸の内径は約７ｍｍであり、底面直径は約１５ｍｍであることから、バイアル瓶の底面付近にある少量の溶媒に浸漬することができるよう、口頸を通過し底に沈めることができる形状としたものである。このように少量の溶媒に浸漬することにより、本発明者らが用いた蛍光検出法の定量限界値である０．０６ｐｐｍを超える濃度の抽出溶媒を濃縮乾固及び再溶解することなく得ることが可能となる。
【００２９】
このように顔に密着させる濾紙は、バイアル瓶の大きさに応じて適宜裁断し、これを複数枚使用するなどして表皮物質を採取することが好ましい。
【００３０】
濾紙の厚さは、０．１８〜０．２３ｍｍであることが好ましい。０．１８ｍｍより薄いと、表皮物質を十分に吸着できない可能性がある。一方、０．２３ｍｍより厚いと浸漬するメタノールの量を増やす必要があるため検体の濃度が低くなり、分析に必要な濃度の検体が得られない可能性がある。
【００３１】
濾紙で吸着した過酸化脂質は、濾紙をメタノールに浸漬し、メタノールにより抽出する。メタノールは、純度が９９．８質量％以上で、不揮発成分の含有量が２ｐｐｍ以下、水分含有量が０．０５％以下であることが好ましい。このような純度の高いメタノールは、本発明で使用するジフェニル−１−ピレニルホスフィン(ＤＰＰＰ)やジフェニル−１−ピレニルホスフィンオキシド(ＤＰＰＰ＝Ｏ)等の試薬との相互作用が無く、正確な分析を行うことができる。また、皮膚に密着する濾紙及びバイアル瓶を予め純度の高い前記のメタノールで予め洗浄しておけば、さら精度の高い分析値が得られることが期待される。メタノールの純度に関する試験結果は実施例にて詳述する。
【００３２】
純度が９９．８質量％以上で、不揮発成分の含有量が２ｐｐｍ以下、水分含有量が０．０５％以下のメタノールは、環境分析用として市販されているものを使用することができ、例えば、和光純薬工業株式会社製の環境分析用メタノール(純度が９９．８質量％以上、水分含有量が０．０５質量％以下、不揮発成分の含有量が１質量ｐｐｍ以下を規格とする)や純正化学株式会社製の製品名「メタノール５０００」(純度が９９．８質量％以上、水分含有量が０．０５質量％以下、不揮発成分の含有量が２質量ｐｐｍ以下を規格とする)等を使用することができる。
【００３３】
表皮物質を吸着させた濾紙をメタノールに浸漬し、表皮物質(過酸化脂質)を抽出したメタノールにジフェニル−１−ピレニルホスフィン(ＤＰＰＰ)を加えて過酸化脂質のヒドロキシペルオキシドと反応させ、得られた蛍光化合物ジフェニル−１−ピレニルホスフィンオキシド(ＤＰＰＰ＝Ｏ)の蛍光強度を測定することにより定量する。
【００３４】
ジフェニル−１−ピレニルホスフィン(ＤＰＰＰ)は、過酸化物と化学量論的に反応して、蛍光性を有するジフェニル−１−ピレニルホスフィンオキシド(ＤＰＰＰ＝Ｏ)を生成する。ジフェニル−１−ピレニルホスフィン(ＤＰＰＰ)は蛍光性を有しないが、ジフェニル−１−ピレニルホスフィンオキシド(ＤＰＰＰ＝Ｏ)は蛍光性を有するので、その蛍光強度を測定することにより、検体中の過酸化物の量を測定することができる。
【００３５】
ジフェニル−１−ピレニルホスフィンオキシド(ＤＰＰＰ＝Ｏ)を検出するには、励起光として３５２ｎｍの光を照射し、３８０ｎｍ付近にピークを有する蛍光のピーク強度を検出する。蛍光強度(ピーク強度)は、市販の適当な検出器を用いて測定すればよい。蛍光強度は被検体の過酸化脂質の存在量を表す指標として評価することができる。
【００３６】
本発明で用いるジフェニル−１−ピレニルホスフィン(ＤＰＰＰ)自体は公知化合物であり、市販品などから容易に入手できる。市販品としては、例えば、同仁化学社製「ＤＰＰＰ」等がある。本発明では検体中の過酸化脂質と反応させ、得られたジフェニル−１−ピレニルホスフィンオキシド(ＤＰＰＰ＝Ｏ)の蛍光強度を定量することにより検体中にある過酸化脂質の量を測定する。ジフェニル−１−ピレニルホスフィン(ＤＰＰＰ)を含む試薬の形態は特に限定されず、固体でも液体（溶液、懸濁液など)でもよい。液体の場合には適当な溶媒(好ましくはジフェニル−１−ピレニルホスフィン(ＤＰＰＰ)が一定の溶解度を示す有機溶媒など)に溶解または懸濁することによって試薬を調製することができる。
【実施例】
【００３７】
図１は、女性被験者２４名の顔から採取した過酸化脂質の濃度を示すものである。濾紙(ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製「定量分析用５種Ｃ」)を短辺５ｍｍ×長辺１０ｍｍの長方形の切片に裁断し、この切片２枚を被験者の顔に密着させて表皮物質を吸着させた後、メタノール２００μＬに浸漬・抽出した。このようにして得た抽出液を検体とし、これにジフェニル−１−ピレニルホスフィン(ＤＰＰＰ)(同仁化学社製「ＤＰＰＰ」)を加え、生成したジフェニル−１−ピレニルホスフィンオキシド(ＤＰＰＰ＝Ｏ)の蛍光強度を測定したものである。尚、ジフェニル−１−ピレニルホスフィン(ＤＰＰＰ)は、ＨＰＬＣ用メタノールに２．５ｍｇ／Ｌになるように溶解したものであり、フローインジェクション分析システムを用い、検体とシステム中で反応させた。
【００３８】
図１に示すように過酸化脂質の量は個人差が大きく、皮膚の各種現象との関連性について有意性のあるデータを取得するためには相当数のサンプルが必要である。本発明者らは、高感度で測定できる蛍光検出法を採用するが、本法による定量限界は０．０６ｐｐｍであるため、この数値を下回る被験者は定量データとして採用することはできない。
【００３９】
検体の濃度を高める方法としては、従来より抽出溶媒(メタノール)を減圧下で遠心し、溶媒を揮散させて濃縮乾固し、これを再溶解して対象物質の濃度を高め(濃縮乾固及び再溶解)、これを検体とする方法がある。
【００４０】
しかしながら、過酸化脂質を抽出した抽出溶媒(メタノール)を濃縮乾固することにより含有する過酸化脂質が分解され、定量測定値に誤差が生じる可能性があることを見出した。図２は、標準の過酸化脂質を濾紙にしみ込ませ、これをメタノールに浸漬して抽出し、抽出したメタノールを濃縮乾固せずにジフェニル−１−ピレニルホスフィン(ＤＰＰＰ)を加えてジフェニル−１−ピレニルホスフィンオキシド(ＤＰＰＰ＝Ｏ)を生成し、蛍光強度を測定して回収率を測定したものと、抽出したメタノールを減圧下で遠心し溶媒を揮散させて濃縮乾固し、これをメタノール１００μＬで再溶解して検体とし、これにジフェニル−１−ピレニルホスフィン(ＤＰＰＰ)を加え、回収率を測定したものとを比較した結果である。尚、標準の過酸化脂質とは、リノール酸メチルに紫外線(ＵＶ)を照射してその一部を過酸化脂質とし、溶媒に溶解し、濃度を検定したものである(過酸化脂質濃度０．７７ｐｐｍ)。また、ジフェニル−１−ピレニルホスフィン(ＤＰＰＰ)は、メタノールに溶解し、２．５質量ｐｐｍのメタノール溶液として添加した。
【００４１】
図２の結果から、溶媒の濃縮乾固過程により、過酸化脂質の回収率は低下することが確認された(回収率約６０％)。この結果から、過酸化脂質の定量分析において、その精度を高めるためには抽出溶媒を濃縮乾固することなく、ジフェニル−１−ピレニルホスフィン(ＤＰＰＰ)を加えることが重要であることがわかる。
【００４２】
つぎに、過酸化脂質を抽出する溶媒の種類について検討した。
図３は、各溶媒で洗浄した未使用の濾紙(１ｃｍ２)を、新たな各溶媒１ｍＬに２４時間浸漬し、浸漬後の各溶媒にジフェニル−１−ピレニルホスフィン(ＤＰＰＰ)を加え、蛍光強度を測定したものである。ここで、特級メタノールとは、純度９９．８質量％以上で、水分含有量が０．１質量％以下、不揮発物が５質量ｐｐｍ以下のメタノール(和光純薬工業株式会社製の試薬特級メタノール)であり、環境分析用メタノールとは、純度が９９．８質量％以上で、水分含有量が０．０５質量％以下、不揮発成分の含有量が１質量ｐｐｍ以下のメタノール(和光純薬工業株式会社製の試薬特級メタノール)である。尚、図３中、「洗浄なし」とは、濾紙を溶媒で洗浄することなく、環境分析用メタノールに浸漬したものである。
【００４３】
図３の結果から、未使用の濾紙でありながら、アセトンあるいは特級メタノールで洗浄し浸漬すると、浸漬したこれらの溶媒からは過酸化脂質の含有を示す蛍光が検出された。また、洗浄しない未使用の濾紙も浸漬した環境分析用メタノールから過酸化脂質の含有を示す蛍光が検出された。一方、環境分析用メタノールで洗浄し浸漬すると、浸漬した環境分析用メタノールからは蛍光は検出されなかった。このことから、環境分析用メタノール(純度が９９．８質量％以上で、水分含有量が０．０５質量％以下、不揮発成分の含有量が１質量ｐｐｍ以下のメタノール)で濾紙を洗浄した後、環境分析用メタノールで抽出することにより、濾紙あるいは溶媒に由来する過酸化脂質濃度の分析誤差を解消することができることが確認された。
【００４４】
これらの結果から過酸化脂質の定量分析の精度を高めるためには、抽出溶媒を濃縮乾固することなく定量分析すること、また溶媒としては所定の純度のメタノールを使用することが重要であることが確認された。そして抽出溶媒を濃縮乾固せずに定量分析するためには、抽出した過酸化脂質の濃度が本発明者らが用いた蛍光検出法による定量限界濃度(０．０６ｐｐｍ)を超える必要がある。このため、濾紙から過酸化脂質を抽出するための溶媒の適切な量について検討した。
【００４５】
図４は、濾紙(短辺５ｍｍ×長辺１０ｍｍの長方形の切片２枚)に標準品(０．７７ｐｐｍ)１０μＬを吸着させ、これを環境分析用メタノールに浸漬し、標準品の回収率を測定した結果を示すものである。
【００４６】
図４に示すように、２００μＬ以上の溶媒で抽出することにより、標準品を１００％回収できたが、１００μＬでは数値のバラツキが大きく、回収率が低い結果であった。この結果から、抽出する溶媒(環境分析用メタノール)の量としては２００μＬ以上が必要であることが確認された。尚、１００μＬで回収率が低い原因としては、濾紙が溶媒に完全に浸漬せず、標準品を十分に抽出できなかったことによるものと考察される。
【００４７】
つぎにヒトの各部位(額、鼻、頬、内腕)における過酸化脂質の量を測定した。
【００４８】
「試験方法」
定量分析の概略工程を図６に示す。
１）濾紙を裁断して得た短辺５ｍｍ×長辺１０ｍｍの切片を複数用意し、環境分析用メタノールで洗浄し乾燥した。
２）採取する各部位を洗浄し、２時間経過後に、濾紙の切片２枚を測定部位の皮膚に長辺が向かい合うように並べ、５０ｇで荷重し表皮物質を採取した(各部位につき被験者３名)。
３）採取後は、小型のバイアル瓶に濾紙切片２枚を収容し、環境分析用メタノール２００μＬを添加して過酸化脂質を抽出した。
４）抽出溶媒は、濃縮することなくジフェニル−１−ピレニルホスフィン(ＤＰＰＰ)を加え、過酸化脂質との反応により生成したジフェニル−１−ピレニルホスフィンオキシド(ＤＰＰＰ＝Ｏ)の蛍光強度を測定した。
【００４９】
「試験結果」
図５に示すように、額部では、平均で約０．３ｐｐｍの過酸化脂質を測定することができた。また、最も少ない被験者は、約０．１２ｐｐｍであった。この数値は、溶媒２００μＬ中の濃度を示すものであり、蛍光検出法による定量限界値は０．０６ｐｐｍであることを考慮すると、例えば溶媒の量を４００μＬとしても、すべての被験者のデータが取得可能である(最少の被験者の濃度であっても０．０６ｐｐｍを超えることができる)。さらに溶媒の量を１０００μＬとしても、平均の過酸化脂質量であれば定量可能であり、このことは、被験者の過酸化脂質量が正規分布に従うと仮定すると、約半数の被験者のデータを取得できることを意味する。したがって、図４の結果とあわせると、額部の過酸化脂質を定量するためには、濾紙１ｃｍ２あたり環境分析用メタノール２００〜１０００μＬで抽出することが好適であり、特に２００〜４００μＬで抽出することが好適であることがわかる。
【００５０】
鼻部についてみると、過酸化脂質の濃度は平均で約０．４８ｐｐｍである。また、最少値は約０．１５ｐｐｍである。額部と同様の考察をすれば、鼻部の過酸化脂質を定量するためには、濾紙１ｃｍ２あたり環境分析用メタノール２００〜１６００μＬで抽出することが好適であり、特に２００〜５００μＬで抽出することが好適である。
【００５１】
頬部では、過酸化脂質の濃度は平均で約０．３６ｐｐｍである。また、最少値０．１８ｐｐｍである。前記と同様の考察をすれば、頬部の過酸化脂質を定量するためには、濾紙１ｃｍ２あたり環境分析用メタノール２００〜１２００μＬで抽出することが好適であり、特に２００〜６００μＬで抽出することが好適である。
【００５２】
尚、内腕部の過酸化脂質は、蛍光検出法における定量限界値より低い濃度であるため、本発明による定量分析法により定量することは不適であることが確認できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
顔の所定部位における過酸化脂質の量を測定する方法であって、顔の所定部位に密着させ皮膚表面にある表皮物質を吸着させた濾紙をメタノールに浸漬し、その後、該メタノールにジフェニル−１−ピレニルホスフィンを加え、生成したジフェニル−１−ピレニルホスフィンオキシドの蛍光強度を測定することにより過酸化脂質の量を測定することを特徴とする過酸化脂質の定量分析方法。
【請求項２】
メタノールは、純度が９９．８質量％以上で、水分含有量が０．０５質量％以下、不揮発成分の含有量が２質量ｐｐｍ以下であることを特徴とする請求項１記載の過酸化脂質の定量分析方法。
【請求項３】
額部分の過酸化脂質の量を分析するときは、表皮物質を吸着させた濾紙を、濾紙１ｃｍ２ あたり２００〜１０００μＬに相当する量のメタノールに浸漬することを特徴とする請求項１又は２記載の過酸化脂質の定量分析方法。
【請求項４】
鼻部分の過酸化脂質の量を分析するときは、表皮物質を吸着させた濾紙を、濾紙１ｃｍ２ あたり２００〜１６００μＬに相当する量のメタノールに浸漬することを特徴とする請求項１又は２記載の過酸化脂質の定量分析方法。
【請求項５】
頬部分の過酸化脂質の量を分析するときは、表皮物質を吸着させた濾紙を、濾紙１ｃｍ２ あたり２００〜１２００μＬに相当する量のメタノールに浸漬することを特徴とする請求項１又は２記載の過酸化脂質の定量分析方法。
【請求項６】
濾紙を浸漬した後のメタノールを濃縮乾固することなく、これにジフェニル−１−ピレニルホスフィンを加えることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の過酸化脂質の定量分析方法。
【請求項７】
濾紙の厚さが、０．１８〜０．２３ｍｍであることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の過酸化脂質の定量分析方法。
【請求項１】
顔の所定部位における過酸化脂質の量を測定する方法であって、顔の所定部位に密着させ皮膚表面にある表皮物質を吸着させた濾紙をメタノールに浸漬し、その後、該メタノールにジフェニル−１−ピレニルホスフィンを加え、生成したジフェニル−１−ピレニルホスフィンオキシドの蛍光強度を測定することにより過酸化脂質の量を測定することを特徴とする過酸化脂質の定量分析方法。
【請求項２】
メタノールは、純度が９９．８質量％以上で、水分含有量が０．０５質量％以下、不揮発成分の含有量が２質量ｐｐｍ以下であることを特徴とする請求項１記載の過酸化脂質の定量分析方法。
【請求項３】
額部分の過酸化脂質の量を分析するときは、表皮物質を吸着させた濾紙を、濾紙１ｃｍ２ あたり２００〜１０００μＬに相当する量のメタノールに浸漬することを特徴とする請求項１又は２記載の過酸化脂質の定量分析方法。
【請求項４】
鼻部分の過酸化脂質の量を分析するときは、表皮物質を吸着させた濾紙を、濾紙１ｃｍ２ あたり２００〜１６００μＬに相当する量のメタノールに浸漬することを特徴とする請求項１又は２記載の過酸化脂質の定量分析方法。
【請求項５】
頬部分の過酸化脂質の量を分析するときは、表皮物質を吸着させた濾紙を、濾紙１ｃｍ２ あたり２００〜１２００μＬに相当する量のメタノールに浸漬することを特徴とする請求項１又は２記載の過酸化脂質の定量分析方法。
【請求項６】
濾紙を浸漬した後のメタノールを濃縮乾固することなく、これにジフェニル−１−ピレニルホスフィンを加えることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の過酸化脂質の定量分析方法。
【請求項７】
濾紙の厚さが、０．１８〜０．２３ｍｍであることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の過酸化脂質の定量分析方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１２−２２９９２４（Ｐ２０１２−２２９９２４Ａ）
【公開日】平成２４年１１月２２日（２０１２．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−９６７８３（Ｐ２０１１−９６７８３）
【出願日】平成２３年４月２５日（２０１１．４．２５）
【出願人】（０００００１９５９）株式会社 資生堂 (1,748)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月２２日（２０１２．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年４月２５日（２０１１．４．２５）
【出願人】（０００００１９５９）株式会社 資生堂 (1,748)
【Ｆターム（参考）】
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