選択マーカーとして多糖分解酵素遺伝子を含むベクター、このベクターにより形質転換された宿主、形質転換体の選抜方法、形質転換体の選抜用培地及びその製造方法
本発明は、選択マーカーとして多糖分解酵素遺伝子を含むベクターとそのベクターにより形質転換された宿主と、本発明のベクターを用いて外来遺伝子が導入された形質転換体を選抜する方法と、選択培地及び選択培地の製造方法に関する。本発明によるベクターは、従来のβ-ガラクトシダーゼを選択マーカーとして含むベクターに比べ使用方法が簡便である。色の発現のために使用される試薬を含めて全体の費用が非常に安価である。広範の宿主細胞に利用できるという利点を有する。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野 本発明は、多糖分解酵素遺伝子を選択マーカーとして含むベクター、そのベクターにより形質転換された宿主、形質転換体を選抜するための方法及び培地、並びに形質転換体の選抜用培地を製造するための方法に関する。
背景技術 一般に、クローニングベクター（cloning vector）あるいはサブクローニングベクターは、組換えＤＮＡの生成の初期の段階において標的となるＤＮＡフラグメントを導入するために使用される。このため、このベクターにはいくつかの性質が要求される。
第一に、ベクターをクローニングする工程は、例えば、ＰＣＲ、配列決定及びサブクローニングのような実験の完成段階ではなく、初期段階において使用されるため、迅速かつ正確に実施される必要がある。多量のＤＮＡを得るために、コピーの数（copy number）も多くなければならないし、クローニングの結果の早い確認が可能であることが好ましい。
【０００２】
第二に、クローニングベクターは、種々の実験の初期段階において多量に、かつ繰り返し使用されるので、経済的な負担が少なくなければならない。そうでなければ、クローニングベクターを使用する追加の実験の費用が高くなるであろう。
【０００３】
従来から種々のクローニングベクターが開発、かつ使用されており、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等が挙げられる。これらのクローニングベクターには、コピーの数が多い点と、選択マーカー（selection marker）としてβ-ガラクトシダーゼ（galactosidase）（ｌａｃＺ）を使用する点とに共通点がある。
【０００４】
β-ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）が選択マーカーとして使用される理由は、組換えベクターを含む形質転換体が無色であり、非−形質転換体の青色との区別が容易にできる点にある。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）の選択は、宿主中においてα−ペプチドが欠損した変異型β−ガラクトシダーゼタンパク質をベクター中のα−ペプチドと結合して、機能的酵素分子を生成することによって行われる。
【０００５】
このベクターは、ｌａｃＺの全序列（full sequence）を含んではいないが、ベクターは、β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）の選択マーカーを使用する。その結果、使用されるベクターのサイズを減らす効果を奏することとなる。
【０００６】
しかし、β-ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）の選択マーカーとしての使用は、いくつかの問題点を有している。第一に、ｘ−ｇａｌの価格が非常に高いので、実験に要する費用が増大する点が挙げられる。第２に、ｘ−ｇａｌの溶媒であるＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドが宿主の細菌に毒性を表すことである。形質転換体をプレートにスプレッド（spreading）する前に、先ずｘ−ｇａｌを３乃至４時間の間スプレッドしなくてはならないので、実験の操作上煩わしさを伴うこととなる。第３に、この時に使用されるｘ−ｇａｌ保存液（stock solution）の濃度は２０ｍｇ／ｍｌであり、１個のプレート当りこの溶液が４０μｌずつスプレッドされる。もしこの時にｘ−ｇａｌが均一にスプレッドされないと、選抜の結果も不正確なものになる。第４に、ｘ−ｇａｌは別途に調製されて、後に添加されるため、プレートが汚染に曝される時間を増加させる可能性もある。第５に、β−ガラクトシダーゼを用いるベクターは、β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）の変異がなされる宿主においてのみ使用されるので、その使用できる宿主の範囲が限られている。
発明の開示 よって、本発明の目的は、既存のβ-ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）を選択マーカーとして用いるベクターの限界を克服して、経済的、かつ簡便に使用できるクローニングベクターを提供することにある。
【０００７】
本発明の他の目的は、本発明のクローニングベクターを使用して形質転換された宿主細胞を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、本発明のクローニングベクターを使用して様々な宿主細胞を高効率で形質転換させることができる形質転換体の選抜方法を提供することである。
【０００８】
本発明のさらに他の目的は、多糖分解酵素遺伝子を選択マーカーとして含むプラスミドの選別に有効に使用される培地を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、多糖分解酵素遺伝子を選択マーカーとして含むプラスミドの選別に有効に使用される培地の製造方法を提供することである。
【０００９】
本発明により、選択マーカーとして多糖分解酵素遺伝子を含むベクターが提供される。
発明を実施するための最良の形態 本発明によるプラスミドは、選択マーカーとして多糖分解酵素遺伝子を含む。よって、本発明のプラスミドが導入された形質転換体は、導入された多糖分解酵素の発現によりそれに該当する多糖を分解するため、分解された多糖に対する発色試薬によりプラスミドが導入されているか否かを判断することができる。但し、宿主が導入される多糖分解酵素を自体的に生産する場合には、形質転換の前に該酵素を不活性化させなければならない。
【００１０】
本発明において、プラスミドに導入される多糖分解酵素としては、セルラーゼ（cellulase）、アミラーゼ（amylase）又はキシラナーゼ（xylanase）等を使用することができる。
【００１１】
これらの多糖分解酵素の遺伝子は公知の方法でプラスミドに導入される。このように導入されたプラスミドは選択マーカーとして多糖分解酵素遺伝子を含むこととなる。よって、本発明のプラスミドに所望の遺伝子を導入し、得られたプラスミドで宿主を形質転換することにより調製された形質転換した宿主の多糖分解能を判断することにより、外来遺伝子で形質転換された宿主が判別できる。
【００１２】
本発明のプラスミドで形質転換される宿主としては、例えば大腸菌、酵母及び乳酸菌等が含まれるが、プラスミドの導入及び発現における使用に関しては、これらに限定されるものではない。
【００１３】
別の実施形態において、本発明は、選択マーカーとして多糖分解酵素遺伝子を含むベクターを使用して形質転換体を選抜する方法を提供する。該方法は、選択マーカーとして多糖分解酵素遺伝子を含むベクターに目的の外来遺伝子を導入する工程と、該ベクターで宿主を形質転換させる工程と、該宿主細胞を多糖を含むプレートに塗抹して培養する工程と、該プレートに発色試薬を添加する工程と、変色の存在を検出して外来遺伝子を含む形質転換体を選抜する工程とを含んでいる。
【００１４】
本発明の方法において、先ず、多糖分解酵素の遺伝子が導入されたベクターに目的の外来遺伝子を導入する。この組換えベクターを使用してベクターの導入及び発現が容易な宿主細胞を形質転換させる。この時、宿主自体が多糖分解酵素を有している場合には、これを不活性化させなければならない。
【００１５】
形質転換が試みられた宿主細胞はプラスミドに導入された多糖分解酵素の遺伝子の発現により分泌される酵素で分解可能な多糖を含む平面のプレートに塗抹される。即ち、プラスミドにセルラーゼ遺伝子が導入されていると、プレートにもセルロースが含まれていなければならないし、プラスミドにアミラーゼ又はキシラナーゼ遺伝子が導入されていると、プレートにもアミロース又はキシロースが含まれていなければならない。
【００１６】
形質転換体を一定の時間培養した後、プレート中において分解された糖と反応して色の変化を起こす試薬を添加する。例えば、セルラーゼの分解作用によりセルロースが分解されてグルコースとなった場合には、濃赤色から淡橙色へと変化する発色試薬を添加する。ここで、発色試薬は宿主を培地で培養した後に添加しても良く、培地に試薬が添加された状態で宿主を培養しても良い。
【００１７】
一方、導入される多糖がアミロースである場合にはヨード試薬を、キシロースである場合にはコンゴレッド試薬を使用する。該試薬により培地の色が変化し、変色（ハロー生成（formation of a halo））した部位のコロニーが所望の外来遺伝子を含んでいることを示す。よって、所望の遺伝子が導入された形質転換体が選抜できる。
【００１８】
下記の実施例では、導入されたプラスミドのセルラーゼが形質転換体において発現されるかを確認するために、セルロースと発色試薬を含む培地内におけるハローの生成を確認した。クローニングベクターとしての利用可能性は、セルラーゼ遺伝子内に外来遺伝子を挿入してセルラーゼ遺伝子が破壊されるか否かを検出する実験により証明した。また、このようにして得られたセルラーゼ酵素が発現されない形質転換体から、該形質転換体をランダムに選んでプラスミドＤＮＡを分離した。プラズミドＤＮＡは制限酵素を用いて処理され、プラスミドのセルラーゼ遺伝子内に外来遺伝子が挿入されたか否かを確認した。
【００１９】
別の実施形態において、本発明は、多糖分解酵素遺伝子を選択マーカーとして含むプラスミドで形質転換された宿主細胞の選抜において、多糖類及びその多糖類の分解産物により培地が色変を起こす発色試薬を含む培地が提供される。
【００２０】
この実施形態において、多糖分解酵素に関する遺伝子を含むプラスミドに目的とする外来遺伝子を導入する。外来遺伝子が導入されたプラスミドを用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母又は乳酸菌のような宿主細胞を形質転換させる。実際にプラスミドが宿主細胞内へ導入されて形質転換が成された形質転換体を選抜するために本発明の培地が使用される。
【００２１】
上述したように、形質転換された宿主細胞から分泌される多糖分解酵素により分解を起こす必要があるので、本発明の培地は該当酵素により分解され得る多糖類を含んでいる。該培地はまた、該多糖類の分解産物により変色されて可視的に色の変化を感知し得る染料を含んでいる。
【００２２】
よって、本発明による培地は、多糖類と発色試薬とを含み、多糖類としてはカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、又はセルロースを含む多糖類等が挙げられる。即ち、多糖分解酵素により分解され得る基質は、本発明の培地の構成要素として使用される。
【００２３】
また、発色試薬として、トリパンブルー（Trypan blue）、コンゴレッド（Congo red）、メチレンブルー（Methylene blue）、ビスマルクブラウン（Bismark brown）、ブリリアントクレシルブルー（Brilliant cresyl blue）、ヤンスグリーン（Jans green）、イントラビタム（Intra vitam）等が含まれる。
【００２４】
培地には、全培地の重量を基準として、多糖が０.１乃至１.５重量％、発色試薬が０.０１乃至０.１９重量％の割合で含まれることが好ましく、残りは基本的な基質として寒天、ＬＢ培地等が含まれている。多糖類及び発色試薬の含有量が前記下限値の未満であるか上限値の以上であれば、ハロー生成を可視的に識別することが困難になる。
【００２５】
本発明の別の実施形態において、選択マーカーとして多糖分解酵素遺伝子を含むプラスミドで形質転換された形質転換体の選択培地を製造する方法が提供される。該方法は、全混合物の重量を基準として多糖類０.５乃至１.５重量％、発色試薬０.０１乃至０.１９重量％を含む混合物を調製する工程と、前記混合物を４０乃至４５℃の温度で加熱しながら寒天が含有されたＬＢ培地と混合する工程と、前記混合物を滅菌する工程と、前記混合物を常温に冷却させる工程とを含んでいる。
【００２６】
好ましくは、全培地の重量を基準として多糖類が０.１乃至１.５重量％、発色試薬が０.０５乃至０.１重量％含まれている。
混合物を４０乃至４５℃で加熱して均質に混合させた後、寒天を含有するＬＢ培地とさらに混合した後に加圧滅菌し、冷却させる。アンピシリン抵抗遺伝子を含んでいるプラスミドの場合、冷却した培地に１００μｇ／ｍｌの濃度のアンピシリンを添加して、本発明による培地を調製する。
実施例１（１）宿主細胞及びプラスミド 宿主細胞として一般に多用される六種の大腸菌菌株を用いた。これらの菌株の種類と遺伝的マーカー及び入手先を以下の表１及び２に示す。
【００２７】
【表１】
【００２８】
【表２】
（２）ｐＣＥＬ１作製（construction）
Ｔ−ｅａｓｙベクター、ｐＴＣＥＬＡをＥｃｏＲＩ制限酵素で切断して１.４ｋｂのセルラーゼ遺伝子フラグメントを得た。このフラグメントをＥｃｏＲＩ制限酵素によりｐＵＣ１８の切断部位に挿入させた。セルラーゼ遺伝子が選択マーカーとしての機能を有するようにベクター内にあった既存のマーカーであるｌａｚＺを除去するためにセルラーゼ酵素遺伝子を含むベクターをＮｄｅＩ及びＳｍａＩ制限酵素でカットした。切断されたベクターをＤＮＡアガロースゲル上にて流し（run）、ＬａｚＺ遺伝子を含む約０.２ｋｂのフラグメントとＡｐｒ遺伝子、ＣｏｌＥ１由来（origin）、セルラーゼ遺伝子を含む３.８ｋｂのフラグメントを分離した。３.８ｋｂフラグメントのみをＤＮＡアガロースゲル上から取り出し、ＤＮＡゲル精製で処理した。得られたＤＮＡフラグメントを平滑末端化させ（blunted）、自己結合（self ligation）させた。該フラグメントは形質転換させた後に確認した。
【００２９】
この実験を行うことで、ｌａｃＺが除去されると共に、既存のベクター内に存在していたマルチプルクローニング部位の相当部分(ＳｍａＩ,ＢａｍＨＩ，ＸｂａＩ，ＳａｌＩ，ＰｓｔＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ)が除去された。よって、セルラーゼ遺伝子内の酵素部位（enzyme site）をワン-カット部位（one cut site）に作って外来遺伝子の挿入を容易とした。こうして得られたベクターがｐＣＥＬ１であり、その大きさは３.８ｋｂとなった(図１参照)。
（３）ｐＣＥＬ１による形質転換及び形質転換体の選抜 ｐＣＥＬ１プラスミドを大腸菌菌株(ＸＬ１−ｂｌｕｅ)にエレクトロポレーション（electroporation）により導入した。形質転換体を選抜するために、得られた形質転換細胞をセルロースと発色試薬(コンゴレッド)を添加したＬＢ寒天平坦培地に接種して３７℃で１６時間培養した。選択されたコロニーはＬＢ培養液中にて培養された。ｐＣＥＬ１の所望の形質転換体を確認するためにｐＣＥＬ１ＤＮＡを精製した。得られた形質転換体は、１９９９年４月６日付にてＫｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍにブダペスト条約の下に寄託されており、２０００年４月２８日付にて交換された(微生物の名称：Ｅ．ｃｏｌｉ／ＸＬ−Ｂｌｕｅ：ｐＣＥＬ１,寄託番号：ＫＣＣＭ−１０１８６)。
（４）ｐＣＥＬ１のクローニングベクターとしての機能確認 ｐＣＥＬ１プラスミドのセルラーゼ遺伝子内のＢａｍＨＩ部位をカットした。様々な大きさのγＤＮＡのＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントをカットされたプラスミドと結合（ligation）させた。この組換えベクターは、ＸＬ１−ｂｌｕｅコンピテント細胞（competent cell）にエレクトロポレーションで形質転換させた。１時間後にセルラーゼと発色試薬が含有されているＬＢプレートに形質転換された細胞をスプレッドした。
【００３０】
１２時間培養した後、ハローを生成したコロニーと生成していないコロニーとが確認されており（図２参照）、各々のコロニーを液体培養した。プラスミド分離方法により培養液からプラスミドＤＮＡを精製した。ＤＮＡは、制限酵素（ＮｇｏＭＩＶ）によって切断され、外来遺伝子の存在を確認した(図３参照)。これにより、ｐＣＥＬ１のみが含有されているコロニー、即ち、外来遺伝子が含有されていないコロニーはハローを生成し、外来遺伝子が挿入されたｐＣＥｌ１はハローを生成しないことが証明された。
（５）広範の宿主における利用可能性の確認 様々な大腸菌菌株においてｐＣＥＬ１が使用可能であるかを確認するために、実験上一般に広く使われる六種の大腸菌菌株に対し本発明のプラスミドによる形質転換を実験した。即ち、六種の大腸菌菌株のコンピテント細胞(ＸＬ１−ｂｌｕｅ、ＤＨ５α、ＪＭ１０５、ＪＭ１０９、ＨＢ１０１、ＭＣ１０６１)をそれぞれ調製した。プラスミドｐＣＥＬ１を各々のコンピテント細胞にエレクトロポレーションにより形質転換させた。その結果、六種の全てにおいてハローを生成しており、プラスミドｐＣＥＬ１は、ｐＵＣ１８よりは広範の菌株に使用できることが証明された。
【００３１】
よって、本発明のベクターが既存のベクターより広範囲の宿主菌株に利用可能であることは、既存のプラスミドｐＵＣ１８、即ち遺伝的な特性により、既存の選択マーカーとしてβ-ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）を有しているベクターであるｐＵＣ１８では選択が不可能な菌株であるＨＢ１０１又はＭＣ１０６１を使用することによって確認された。
（６）酵母におけるセルロース遺伝子の選択マーカーとしての機能確認 ｐＣＥＬ１プラスミドに酵母複製開始点を挿入した。組換えベクターを酵母にエレクトロポレーションにより導入した。得られた酵母形質転換体は、セルロースと発色試薬（コンゴレッド）を含むＹＰＤ寒天プレートに接種して３０℃で２４時間培養した。ハローの認められた形質転換体は、酵母の形質転換体として選択された（図４参照)。よって、酵母においてもセルロース遺伝子を選択マーカーとして使用し得ることが確認された。
（７）乳酸菌におけるセルラーゼ遺伝子の選択マーカーとしての機能確認 ｐＣＥＬ１プラスミドに乳酸菌複製開始点を挿入した。組換えベクターを乳酸菌にエレクトロポレーションにより導入した。得られた形質転換体は、セルロースと発色試薬(コンゴレッド)を含むＭ１７寒天プレートに接種して３０℃で２４時間培養した。ハローの認められた形質転換体は、乳酸菌の形質転換体として選択された。以下の表３に示す通り、セルラーゼ遺伝子が含まれたベクターで形質転換された乳酸菌のみでセルロースを含む培地においてハローが生成されることが確認された。この実験において、セルロース遺伝子を酵母において選択マーカーとして使用し得ることが確認された。
【００３２】
【表３】
調製例１ 全培地の重量を基準として、ＣＭＣ(カルボキシメチルセルロース)０.５重量％とトリパンブルー０.０５重量％とを混合した。混合物を十分に混合するために４０℃乃至４５℃で３０分間加熱した後、１.５重量％の寒天を含有しているE.coli用ＬＢ培地(１リットル当りバクトトリプトン（Bactotrypton)１０g、イースト抽出物（Yeast Extract）、１０g、NaCl１０g)とさらに混合した。混合物を１２１℃で１５分間オートクレーブにて加圧滅菌して冷却した。培地にアンピシリン(１００μｇ／ｍｌ)を添加して本発明のプレート型培地を得た。
調製例２ 調製例１におけるＣＭＣの濃度を０．５重量％に代えて１.０重量％で添加したことを除いては、調製例１の方法により本発明のプレート型培地を調製した。
調製例３ 調製例１におけるＣＭＣの濃度を０．５重量％に代えて１.５重量％で添加したことを除いては、調製例１の方法により本発明のプレート型培地を調製した。
調製例４ 調製例１におけるＣＭＣの濃度を０．５重量％に代えて２.０重量％で添加したことを除いては、調製例１の方法により本発明のプレート型培地を調製した。
調製例５ 調製例１におけるトリパンブルーの濃度を０．５重量％に代えて０.０７重量％で添加したことを除いては、調製例１の方法により本発明のプレート型培地を調製した。
調製例６ 調製例１におけるトリパンブルーの濃度を０．５重量％に代えて０.１重量％で添加したことを除いては、調製例１の方法により本発明のプレート型培地を調製した。
調製例７ 調製例１におけるトリパンブルーの濃度を０．５重量％に代えて０.２重量％で添加したことを除いては、調製例１の方法により本発明のプレート型培地を調製した。
実施例２ 形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ／ＸＬ１−Ｂｌｕｅ：ｐＣＥＬ１を調製例１の培地に塗抹し、３７℃で１２時間培養した。培養の結果、形質転換体の領域でハローが観察され、ハローのサイズを計測した。その結果を表１に示す。
実施例３ 形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ／ＸＬ１−Ｂｌｕｅ：ｐＣＥＬ１を調製例２の培地に塗抹し、３７℃で１２時間培養し、ハローの生成及びそのサイズを観察した。その結果を表１に示す。
実施例４ 形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ／ＸＬ１−Ｂｌｕｅ：ｐＣＥＬ１を調製例３の培地に塗抹し、３７℃で１２時間培養し、ハローの生成及びそのサイズを観察した。その結果を表１に示す。
実施例５ 形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ／ＸＬ１−Ｂｌｕｅ：ｐＣＥＬ１を調製例４の培地に塗抹し、３７℃で１２時間培養し、ハローの生成及びそのサイズを観察した。その結果を表１に示す。
実施例６ 形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ／ＸＬ１−Ｂｌｕｅ：ｐＣＥＬ１を調製例５の培地に塗抹し、３７℃で１２時間培養し、ハローの生成及びそのサイズを観察した。その結果を表２に示す。
実施例７ 形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ／ＸＬ１−Ｂｌｕｅ：ｐＣＥＬ１を調製例６の培地に塗抹し、３７℃で１２時間培養し、ハローの生成及びそのサイズを観察した。その結果を表２に示す。
実施例８ 形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ／ＸＬ１−Ｂｌｕｅ：ｐＣＥＬ１を調製例７の培地に塗抹し、３７℃で１２時間培養し、ハローの生成及びそのサイズを観察した。その結果を表２に示す。
【００３３】
【表４】
【００３４】
【表５】
実施例９ ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）の濃度を１.５重量％、トリパンブルーの濃度を０.０５乃至０.１重量％で混合して乳酸菌用のＭＲＳ培地を調製した。セルラーゼ遺伝子を含むベクターで形質転換された乳酸菌を前記調製したＭＲＳ培地に塗抹して、２４時間培養した。ハローの生成が観察された。
実施例１０ ＣＭＣの（カルボキシメチルセルロース）濃度を１.５重量％、トリパンブルーの濃度を０.０５乃至０.１重量％で混合して酵母用のＹＰＤ培地を調製した。セルラーゼ遺伝子を含むベクターで形質転換された酵母を前記ＹＰＤ培地に塗抹して、２４時間培養した。ハローの生成が観察された。
産業上の利用可能性 以上の説明から明らかなように、多糖分解酵素の遺伝子を含む本発明の改良された形質転換体は、外来遺伝子が導入されているか否かを決定し得る選択マーカーとして使用できる。よって、本発明の選択マーカーは、種々の実験に対する使用可能な選択の幅が拡大することは勿論、従来のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）に比べ非常に低コストで優れた選択機能が発揮できるという長所がある。実際、本発明の試薬は、ｌａｃＺに比べ約１／１０，０００−１／１００，０００倍も安価なので、本発明の試薬を用いると費用を大幅に削減することができる。
【００３５】
また、本発明の選択マーカーは、宿主細胞に対する毒性も無く、更なる工程に係る様々な煩わしさを無くすことができる。
特に、ほとんどの大腸菌菌株にはセルラーゼ遺伝子が無いため、本発明によるベクターは、先に実験した六種の大腸菌の菌株は勿論のこと、実質的にほぼ全ての大腸菌で使用し得る広範のクローニングベクターである。更に、該ベクターは、既存のクローニングベクターと比較して、外来遺伝子のクローニングを確認することや形質転換の効率においても同等である。
【００３６】
また、本発明のセルラーゼ遺伝子は、遺伝子が形質転換体を選抜するために使用されるので、酵母及び乳酸菌のクローニングにおいても有効な選択マーカーとして使用できる。よって、セルラーゼをマーカーとして使用するプラスミドでクローニングを行った時、本発明の培地は分解産物の色変により、迅速かつ容易に形質転換体を選抜することができる。また、セルラーゼマーカーを含む外来遺伝子が挿入されたプラスミドにより得られた形質転換体は、容易、迅速、かつ正確に探すことができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【図１】 プラスミドｐＣＥＬ１の制限酵素の位置を示す地図である。
【図２】 プラスミドｐＣＥＬ１のセルラーゼ遺伝子中に様々なサイズのＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩで切断されたλＤＮＡフラグメントを導入して形質転換体を調製した後、培養された形質転換体から分離され、ＮｇｏＭＩＶ制限酵素で切ることにより得られたプラスミドを示す電気泳動写真である。
【図３】 図２の形質転換体の発色状態を撮影した写真である。
【図４】 本発明のプラスミドｐＣＥＬ１で修飾された酵母用ベクターで該酵母宿主を形質転換させた後における、ハローの生成示す写真である。
【０００１】
技術分野 本発明は、多糖分解酵素遺伝子を選択マーカーとして含むベクター、そのベクターにより形質転換された宿主、形質転換体を選抜するための方法及び培地、並びに形質転換体の選抜用培地を製造するための方法に関する。
背景技術 一般に、クローニングベクター（cloning vector）あるいはサブクローニングベクターは、組換えＤＮＡの生成の初期の段階において標的となるＤＮＡフラグメントを導入するために使用される。このため、このベクターにはいくつかの性質が要求される。
第一に、ベクターをクローニングする工程は、例えば、ＰＣＲ、配列決定及びサブクローニングのような実験の完成段階ではなく、初期段階において使用されるため、迅速かつ正確に実施される必要がある。多量のＤＮＡを得るために、コピーの数（copy number）も多くなければならないし、クローニングの結果の早い確認が可能であることが好ましい。
【０００２】
第二に、クローニングベクターは、種々の実験の初期段階において多量に、かつ繰り返し使用されるので、経済的な負担が少なくなければならない。そうでなければ、クローニングベクターを使用する追加の実験の費用が高くなるであろう。
【０００３】
従来から種々のクローニングベクターが開発、かつ使用されており、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等が挙げられる。これらのクローニングベクターには、コピーの数が多い点と、選択マーカー（selection marker）としてβ-ガラクトシダーゼ（galactosidase）（ｌａｃＺ）を使用する点とに共通点がある。
【０００４】
β-ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）が選択マーカーとして使用される理由は、組換えベクターを含む形質転換体が無色であり、非−形質転換体の青色との区別が容易にできる点にある。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）の選択は、宿主中においてα−ペプチドが欠損した変異型β−ガラクトシダーゼタンパク質をベクター中のα−ペプチドと結合して、機能的酵素分子を生成することによって行われる。
【０００５】
このベクターは、ｌａｃＺの全序列（full sequence）を含んではいないが、ベクターは、β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）の選択マーカーを使用する。その結果、使用されるベクターのサイズを減らす効果を奏することとなる。
【０００６】
しかし、β-ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）の選択マーカーとしての使用は、いくつかの問題点を有している。第一に、ｘ−ｇａｌの価格が非常に高いので、実験に要する費用が増大する点が挙げられる。第２に、ｘ−ｇａｌの溶媒であるＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドが宿主の細菌に毒性を表すことである。形質転換体をプレートにスプレッド（spreading）する前に、先ずｘ−ｇａｌを３乃至４時間の間スプレッドしなくてはならないので、実験の操作上煩わしさを伴うこととなる。第３に、この時に使用されるｘ−ｇａｌ保存液（stock solution）の濃度は２０ｍｇ／ｍｌであり、１個のプレート当りこの溶液が４０μｌずつスプレッドされる。もしこの時にｘ−ｇａｌが均一にスプレッドされないと、選抜の結果も不正確なものになる。第４に、ｘ−ｇａｌは別途に調製されて、後に添加されるため、プレートが汚染に曝される時間を増加させる可能性もある。第５に、β−ガラクトシダーゼを用いるベクターは、β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）の変異がなされる宿主においてのみ使用されるので、その使用できる宿主の範囲が限られている。
発明の開示 よって、本発明の目的は、既存のβ-ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）を選択マーカーとして用いるベクターの限界を克服して、経済的、かつ簡便に使用できるクローニングベクターを提供することにある。
【０００７】
本発明の他の目的は、本発明のクローニングベクターを使用して形質転換された宿主細胞を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、本発明のクローニングベクターを使用して様々な宿主細胞を高効率で形質転換させることができる形質転換体の選抜方法を提供することである。
【０００８】
本発明のさらに他の目的は、多糖分解酵素遺伝子を選択マーカーとして含むプラスミドの選別に有効に使用される培地を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、多糖分解酵素遺伝子を選択マーカーとして含むプラスミドの選別に有効に使用される培地の製造方法を提供することである。
【０００９】
本発明により、選択マーカーとして多糖分解酵素遺伝子を含むベクターが提供される。
発明を実施するための最良の形態 本発明によるプラスミドは、選択マーカーとして多糖分解酵素遺伝子を含む。よって、本発明のプラスミドが導入された形質転換体は、導入された多糖分解酵素の発現によりそれに該当する多糖を分解するため、分解された多糖に対する発色試薬によりプラスミドが導入されているか否かを判断することができる。但し、宿主が導入される多糖分解酵素を自体的に生産する場合には、形質転換の前に該酵素を不活性化させなければならない。
【００１０】
本発明において、プラスミドに導入される多糖分解酵素としては、セルラーゼ（cellulase）、アミラーゼ（amylase）又はキシラナーゼ（xylanase）等を使用することができる。
【００１１】
これらの多糖分解酵素の遺伝子は公知の方法でプラスミドに導入される。このように導入されたプラスミドは選択マーカーとして多糖分解酵素遺伝子を含むこととなる。よって、本発明のプラスミドに所望の遺伝子を導入し、得られたプラスミドで宿主を形質転換することにより調製された形質転換した宿主の多糖分解能を判断することにより、外来遺伝子で形質転換された宿主が判別できる。
【００１２】
本発明のプラスミドで形質転換される宿主としては、例えば大腸菌、酵母及び乳酸菌等が含まれるが、プラスミドの導入及び発現における使用に関しては、これらに限定されるものではない。
【００１３】
別の実施形態において、本発明は、選択マーカーとして多糖分解酵素遺伝子を含むベクターを使用して形質転換体を選抜する方法を提供する。該方法は、選択マーカーとして多糖分解酵素遺伝子を含むベクターに目的の外来遺伝子を導入する工程と、該ベクターで宿主を形質転換させる工程と、該宿主細胞を多糖を含むプレートに塗抹して培養する工程と、該プレートに発色試薬を添加する工程と、変色の存在を検出して外来遺伝子を含む形質転換体を選抜する工程とを含んでいる。
【００１４】
本発明の方法において、先ず、多糖分解酵素の遺伝子が導入されたベクターに目的の外来遺伝子を導入する。この組換えベクターを使用してベクターの導入及び発現が容易な宿主細胞を形質転換させる。この時、宿主自体が多糖分解酵素を有している場合には、これを不活性化させなければならない。
【００１５】
形質転換が試みられた宿主細胞はプラスミドに導入された多糖分解酵素の遺伝子の発現により分泌される酵素で分解可能な多糖を含む平面のプレートに塗抹される。即ち、プラスミドにセルラーゼ遺伝子が導入されていると、プレートにもセルロースが含まれていなければならないし、プラスミドにアミラーゼ又はキシラナーゼ遺伝子が導入されていると、プレートにもアミロース又はキシロースが含まれていなければならない。
【００１６】
形質転換体を一定の時間培養した後、プレート中において分解された糖と反応して色の変化を起こす試薬を添加する。例えば、セルラーゼの分解作用によりセルロースが分解されてグルコースとなった場合には、濃赤色から淡橙色へと変化する発色試薬を添加する。ここで、発色試薬は宿主を培地で培養した後に添加しても良く、培地に試薬が添加された状態で宿主を培養しても良い。
【００１７】
一方、導入される多糖がアミロースである場合にはヨード試薬を、キシロースである場合にはコンゴレッド試薬を使用する。該試薬により培地の色が変化し、変色（ハロー生成（formation of a halo））した部位のコロニーが所望の外来遺伝子を含んでいることを示す。よって、所望の遺伝子が導入された形質転換体が選抜できる。
【００１８】
下記の実施例では、導入されたプラスミドのセルラーゼが形質転換体において発現されるかを確認するために、セルロースと発色試薬を含む培地内におけるハローの生成を確認した。クローニングベクターとしての利用可能性は、セルラーゼ遺伝子内に外来遺伝子を挿入してセルラーゼ遺伝子が破壊されるか否かを検出する実験により証明した。また、このようにして得られたセルラーゼ酵素が発現されない形質転換体から、該形質転換体をランダムに選んでプラスミドＤＮＡを分離した。プラズミドＤＮＡは制限酵素を用いて処理され、プラスミドのセルラーゼ遺伝子内に外来遺伝子が挿入されたか否かを確認した。
【００１９】
別の実施形態において、本発明は、多糖分解酵素遺伝子を選択マーカーとして含むプラスミドで形質転換された宿主細胞の選抜において、多糖類及びその多糖類の分解産物により培地が色変を起こす発色試薬を含む培地が提供される。
【００２０】
この実施形態において、多糖分解酵素に関する遺伝子を含むプラスミドに目的とする外来遺伝子を導入する。外来遺伝子が導入されたプラスミドを用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母又は乳酸菌のような宿主細胞を形質転換させる。実際にプラスミドが宿主細胞内へ導入されて形質転換が成された形質転換体を選抜するために本発明の培地が使用される。
【００２１】
上述したように、形質転換された宿主細胞から分泌される多糖分解酵素により分解を起こす必要があるので、本発明の培地は該当酵素により分解され得る多糖類を含んでいる。該培地はまた、該多糖類の分解産物により変色されて可視的に色の変化を感知し得る染料を含んでいる。
【００２２】
よって、本発明による培地は、多糖類と発色試薬とを含み、多糖類としてはカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、又はセルロースを含む多糖類等が挙げられる。即ち、多糖分解酵素により分解され得る基質は、本発明の培地の構成要素として使用される。
【００２３】
また、発色試薬として、トリパンブルー（Trypan blue）、コンゴレッド（Congo red）、メチレンブルー（Methylene blue）、ビスマルクブラウン（Bismark brown）、ブリリアントクレシルブルー（Brilliant cresyl blue）、ヤンスグリーン（Jans green）、イントラビタム（Intra vitam）等が含まれる。
【００２４】
培地には、全培地の重量を基準として、多糖が０.１乃至１.５重量％、発色試薬が０.０１乃至０.１９重量％の割合で含まれることが好ましく、残りは基本的な基質として寒天、ＬＢ培地等が含まれている。多糖類及び発色試薬の含有量が前記下限値の未満であるか上限値の以上であれば、ハロー生成を可視的に識別することが困難になる。
【００２５】
本発明の別の実施形態において、選択マーカーとして多糖分解酵素遺伝子を含むプラスミドで形質転換された形質転換体の選択培地を製造する方法が提供される。該方法は、全混合物の重量を基準として多糖類０.５乃至１.５重量％、発色試薬０.０１乃至０.１９重量％を含む混合物を調製する工程と、前記混合物を４０乃至４５℃の温度で加熱しながら寒天が含有されたＬＢ培地と混合する工程と、前記混合物を滅菌する工程と、前記混合物を常温に冷却させる工程とを含んでいる。
【００２６】
好ましくは、全培地の重量を基準として多糖類が０.１乃至１.５重量％、発色試薬が０.０５乃至０.１重量％含まれている。
混合物を４０乃至４５℃で加熱して均質に混合させた後、寒天を含有するＬＢ培地とさらに混合した後に加圧滅菌し、冷却させる。アンピシリン抵抗遺伝子を含んでいるプラスミドの場合、冷却した培地に１００μｇ／ｍｌの濃度のアンピシリンを添加して、本発明による培地を調製する。
実施例１（１）宿主細胞及びプラスミド 宿主細胞として一般に多用される六種の大腸菌菌株を用いた。これらの菌株の種類と遺伝的マーカー及び入手先を以下の表１及び２に示す。
【００２７】
【表１】
【００２８】
【表２】
（２）ｐＣＥＬ１作製（construction）
Ｔ−ｅａｓｙベクター、ｐＴＣＥＬＡをＥｃｏＲＩ制限酵素で切断して１.４ｋｂのセルラーゼ遺伝子フラグメントを得た。このフラグメントをＥｃｏＲＩ制限酵素によりｐＵＣ１８の切断部位に挿入させた。セルラーゼ遺伝子が選択マーカーとしての機能を有するようにベクター内にあった既存のマーカーであるｌａｚＺを除去するためにセルラーゼ酵素遺伝子を含むベクターをＮｄｅＩ及びＳｍａＩ制限酵素でカットした。切断されたベクターをＤＮＡアガロースゲル上にて流し（run）、ＬａｚＺ遺伝子を含む約０.２ｋｂのフラグメントとＡｐｒ遺伝子、ＣｏｌＥ１由来（origin）、セルラーゼ遺伝子を含む３.８ｋｂのフラグメントを分離した。３.８ｋｂフラグメントのみをＤＮＡアガロースゲル上から取り出し、ＤＮＡゲル精製で処理した。得られたＤＮＡフラグメントを平滑末端化させ（blunted）、自己結合（self ligation）させた。該フラグメントは形質転換させた後に確認した。
【００２９】
この実験を行うことで、ｌａｃＺが除去されると共に、既存のベクター内に存在していたマルチプルクローニング部位の相当部分(ＳｍａＩ,ＢａｍＨＩ，ＸｂａＩ，ＳａｌＩ，ＰｓｔＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ)が除去された。よって、セルラーゼ遺伝子内の酵素部位（enzyme site）をワン-カット部位（one cut site）に作って外来遺伝子の挿入を容易とした。こうして得られたベクターがｐＣＥＬ１であり、その大きさは３.８ｋｂとなった(図１参照)。
（３）ｐＣＥＬ１による形質転換及び形質転換体の選抜 ｐＣＥＬ１プラスミドを大腸菌菌株(ＸＬ１−ｂｌｕｅ)にエレクトロポレーション（electroporation）により導入した。形質転換体を選抜するために、得られた形質転換細胞をセルロースと発色試薬(コンゴレッド)を添加したＬＢ寒天平坦培地に接種して３７℃で１６時間培養した。選択されたコロニーはＬＢ培養液中にて培養された。ｐＣＥＬ１の所望の形質転換体を確認するためにｐＣＥＬ１ＤＮＡを精製した。得られた形質転換体は、１９９９年４月６日付にてＫｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍにブダペスト条約の下に寄託されており、２０００年４月２８日付にて交換された(微生物の名称：Ｅ．ｃｏｌｉ／ＸＬ−Ｂｌｕｅ：ｐＣＥＬ１,寄託番号：ＫＣＣＭ−１０１８６)。
（４）ｐＣＥＬ１のクローニングベクターとしての機能確認 ｐＣＥＬ１プラスミドのセルラーゼ遺伝子内のＢａｍＨＩ部位をカットした。様々な大きさのγＤＮＡのＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントをカットされたプラスミドと結合（ligation）させた。この組換えベクターは、ＸＬ１−ｂｌｕｅコンピテント細胞（competent cell）にエレクトロポレーションで形質転換させた。１時間後にセルラーゼと発色試薬が含有されているＬＢプレートに形質転換された細胞をスプレッドした。
【００３０】
１２時間培養した後、ハローを生成したコロニーと生成していないコロニーとが確認されており（図２参照）、各々のコロニーを液体培養した。プラスミド分離方法により培養液からプラスミドＤＮＡを精製した。ＤＮＡは、制限酵素（ＮｇｏＭＩＶ）によって切断され、外来遺伝子の存在を確認した(図３参照)。これにより、ｐＣＥＬ１のみが含有されているコロニー、即ち、外来遺伝子が含有されていないコロニーはハローを生成し、外来遺伝子が挿入されたｐＣＥｌ１はハローを生成しないことが証明された。
（５）広範の宿主における利用可能性の確認 様々な大腸菌菌株においてｐＣＥＬ１が使用可能であるかを確認するために、実験上一般に広く使われる六種の大腸菌菌株に対し本発明のプラスミドによる形質転換を実験した。即ち、六種の大腸菌菌株のコンピテント細胞(ＸＬ１−ｂｌｕｅ、ＤＨ５α、ＪＭ１０５、ＪＭ１０９、ＨＢ１０１、ＭＣ１０６１)をそれぞれ調製した。プラスミドｐＣＥＬ１を各々のコンピテント細胞にエレクトロポレーションにより形質転換させた。その結果、六種の全てにおいてハローを生成しており、プラスミドｐＣＥＬ１は、ｐＵＣ１８よりは広範の菌株に使用できることが証明された。
【００３１】
よって、本発明のベクターが既存のベクターより広範囲の宿主菌株に利用可能であることは、既存のプラスミドｐＵＣ１８、即ち遺伝的な特性により、既存の選択マーカーとしてβ-ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）を有しているベクターであるｐＵＣ１８では選択が不可能な菌株であるＨＢ１０１又はＭＣ１０６１を使用することによって確認された。
（６）酵母におけるセルロース遺伝子の選択マーカーとしての機能確認 ｐＣＥＬ１プラスミドに酵母複製開始点を挿入した。組換えベクターを酵母にエレクトロポレーションにより導入した。得られた酵母形質転換体は、セルロースと発色試薬（コンゴレッド）を含むＹＰＤ寒天プレートに接種して３０℃で２４時間培養した。ハローの認められた形質転換体は、酵母の形質転換体として選択された（図４参照)。よって、酵母においてもセルロース遺伝子を選択マーカーとして使用し得ることが確認された。
（７）乳酸菌におけるセルラーゼ遺伝子の選択マーカーとしての機能確認 ｐＣＥＬ１プラスミドに乳酸菌複製開始点を挿入した。組換えベクターを乳酸菌にエレクトロポレーションにより導入した。得られた形質転換体は、セルロースと発色試薬(コンゴレッド)を含むＭ１７寒天プレートに接種して３０℃で２４時間培養した。ハローの認められた形質転換体は、乳酸菌の形質転換体として選択された。以下の表３に示す通り、セルラーゼ遺伝子が含まれたベクターで形質転換された乳酸菌のみでセルロースを含む培地においてハローが生成されることが確認された。この実験において、セルロース遺伝子を酵母において選択マーカーとして使用し得ることが確認された。
【００３２】
【表３】
調製例１ 全培地の重量を基準として、ＣＭＣ(カルボキシメチルセルロース)０.５重量％とトリパンブルー０.０５重量％とを混合した。混合物を十分に混合するために４０℃乃至４５℃で３０分間加熱した後、１.５重量％の寒天を含有しているE.coli用ＬＢ培地(１リットル当りバクトトリプトン（Bactotrypton)１０g、イースト抽出物（Yeast Extract）、１０g、NaCl１０g)とさらに混合した。混合物を１２１℃で１５分間オートクレーブにて加圧滅菌して冷却した。培地にアンピシリン(１００μｇ／ｍｌ)を添加して本発明のプレート型培地を得た。
調製例２ 調製例１におけるＣＭＣの濃度を０．５重量％に代えて１.０重量％で添加したことを除いては、調製例１の方法により本発明のプレート型培地を調製した。
調製例３ 調製例１におけるＣＭＣの濃度を０．５重量％に代えて１.５重量％で添加したことを除いては、調製例１の方法により本発明のプレート型培地を調製した。
調製例４ 調製例１におけるＣＭＣの濃度を０．５重量％に代えて２.０重量％で添加したことを除いては、調製例１の方法により本発明のプレート型培地を調製した。
調製例５ 調製例１におけるトリパンブルーの濃度を０．５重量％に代えて０.０７重量％で添加したことを除いては、調製例１の方法により本発明のプレート型培地を調製した。
調製例６ 調製例１におけるトリパンブルーの濃度を０．５重量％に代えて０.１重量％で添加したことを除いては、調製例１の方法により本発明のプレート型培地を調製した。
調製例７ 調製例１におけるトリパンブルーの濃度を０．５重量％に代えて０.２重量％で添加したことを除いては、調製例１の方法により本発明のプレート型培地を調製した。
実施例２ 形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ／ＸＬ１−Ｂｌｕｅ：ｐＣＥＬ１を調製例１の培地に塗抹し、３７℃で１２時間培養した。培養の結果、形質転換体の領域でハローが観察され、ハローのサイズを計測した。その結果を表１に示す。
実施例３ 形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ／ＸＬ１−Ｂｌｕｅ：ｐＣＥＬ１を調製例２の培地に塗抹し、３７℃で１２時間培養し、ハローの生成及びそのサイズを観察した。その結果を表１に示す。
実施例４ 形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ／ＸＬ１−Ｂｌｕｅ：ｐＣＥＬ１を調製例３の培地に塗抹し、３７℃で１２時間培養し、ハローの生成及びそのサイズを観察した。その結果を表１に示す。
実施例５ 形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ／ＸＬ１−Ｂｌｕｅ：ｐＣＥＬ１を調製例４の培地に塗抹し、３７℃で１２時間培養し、ハローの生成及びそのサイズを観察した。その結果を表１に示す。
実施例６ 形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ／ＸＬ１−Ｂｌｕｅ：ｐＣＥＬ１を調製例５の培地に塗抹し、３７℃で１２時間培養し、ハローの生成及びそのサイズを観察した。その結果を表２に示す。
実施例７ 形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ／ＸＬ１−Ｂｌｕｅ：ｐＣＥＬ１を調製例６の培地に塗抹し、３７℃で１２時間培養し、ハローの生成及びそのサイズを観察した。その結果を表２に示す。
実施例８ 形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ／ＸＬ１−Ｂｌｕｅ：ｐＣＥＬ１を調製例７の培地に塗抹し、３７℃で１２時間培養し、ハローの生成及びそのサイズを観察した。その結果を表２に示す。
【００３３】
【表４】
【００３４】
【表５】
実施例９ ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）の濃度を１.５重量％、トリパンブルーの濃度を０.０５乃至０.１重量％で混合して乳酸菌用のＭＲＳ培地を調製した。セルラーゼ遺伝子を含むベクターで形質転換された乳酸菌を前記調製したＭＲＳ培地に塗抹して、２４時間培養した。ハローの生成が観察された。
実施例１０ ＣＭＣの（カルボキシメチルセルロース）濃度を１.５重量％、トリパンブルーの濃度を０.０５乃至０.１重量％で混合して酵母用のＹＰＤ培地を調製した。セルラーゼ遺伝子を含むベクターで形質転換された酵母を前記ＹＰＤ培地に塗抹して、２４時間培養した。ハローの生成が観察された。
産業上の利用可能性 以上の説明から明らかなように、多糖分解酵素の遺伝子を含む本発明の改良された形質転換体は、外来遺伝子が導入されているか否かを決定し得る選択マーカーとして使用できる。よって、本発明の選択マーカーは、種々の実験に対する使用可能な選択の幅が拡大することは勿論、従来のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）に比べ非常に低コストで優れた選択機能が発揮できるという長所がある。実際、本発明の試薬は、ｌａｃＺに比べ約１／１０，０００−１／１００，０００倍も安価なので、本発明の試薬を用いると費用を大幅に削減することができる。
【００３５】
また、本発明の選択マーカーは、宿主細胞に対する毒性も無く、更なる工程に係る様々な煩わしさを無くすことができる。
特に、ほとんどの大腸菌菌株にはセルラーゼ遺伝子が無いため、本発明によるベクターは、先に実験した六種の大腸菌の菌株は勿論のこと、実質的にほぼ全ての大腸菌で使用し得る広範のクローニングベクターである。更に、該ベクターは、既存のクローニングベクターと比較して、外来遺伝子のクローニングを確認することや形質転換の効率においても同等である。
【００３６】
また、本発明のセルラーゼ遺伝子は、遺伝子が形質転換体を選抜するために使用されるので、酵母及び乳酸菌のクローニングにおいても有効な選択マーカーとして使用できる。よって、セルラーゼをマーカーとして使用するプラスミドでクローニングを行った時、本発明の培地は分解産物の色変により、迅速かつ容易に形質転換体を選抜することができる。また、セルラーゼマーカーを含む外来遺伝子が挿入されたプラスミドにより得られた形質転換体は、容易、迅速、かつ正確に探すことができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【図１】 プラスミドｐＣＥＬ１の制限酵素の位置を示す地図である。
【図２】 プラスミドｐＣＥＬ１のセルラーゼ遺伝子中に様々なサイズのＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩで切断されたλＤＮＡフラグメントを導入して形質転換体を調製した後、培養された形質転換体から分離され、ＮｇｏＭＩＶ制限酵素で切ることにより得られたプラスミドを示す電気泳動写真である。
【図３】 図２の形質転換体の発色状態を撮影した写真である。
【図４】 本発明のプラスミドｐＣＥＬ１で修飾された酵母用ベクターで該酵母宿主を形質転換させた後における、ハローの生成示す写真である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】 選択マーカーとして多糖分解酵素遺伝子を含むベクター。
【請求項２】 前記多糖分解酵素遺伝子がセルラーゼ、アミラーゼ及びキシラナーゼで構成された群から選択されることを特徴とする請求項１に記載のベクター。
【請求項３】 選択マーカーとして多糖分解遺伝子を含むベクターにより形質転換された宿主。
【請求項４】 前記宿主が大腸菌、酵母及び乳酸菌で構成された群から選択されることを特徴とする請求項３に記載の宿主。
【請求項５】 選択マーカーとして多糖分解酵素遺伝子を含むベクターに目的の外来遺伝子を導入する工程と、 前記ベクターで宿主を形質転換させる工程と、 前記宿主を多糖を含む培地に塗抹して培養する工程と、 前記培地に発色試薬を添加する工程と、 変色の存在を検出して外来遺伝子が導入された形質転換体を選抜する工程とを含む、選択マーカーとして多糖分解酵素遺伝子を含むベクターを用いて形質転換体を選抜する方法。
【請求項６】 多糖分解酵素遺伝子を選択マーカーとして含むプラスミドで形質転換された宿主を選抜するために、多糖類及びその多糖類の分解産物により色変を起こす発色試薬を含む培地。
【請求項７】 前記多糖類がカルボキシメチルセルロース及びセルロースを含む基質で構成された群から選択されることを特徴とする請求項６に記載の培地。
【請求項８】 前記多糖類が全培地の重量を基準として、０.１乃至１.９重量％の濃度で添加されることを特徴とする請求項７に記載の培地。
【請求項９】 前記発色試薬がトリパンブルー、コンゴレッド、メチレンブルー、ビスマルクブラウン、ブリリアントクレシルブルー、ヤンスグリーン、及びイントラビタムで構成された群から選択されることを特徴とする請求項６に記載の培地。
【請求項１０】 前記発色試薬が全培地の重量を基準として、０.０１乃至０.１９重量％の濃度で添加されることを特徴とする請求項９に記載の培地。
【請求項１１】 全混合物の重量を基準として、多糖類０.５乃至１.５重量％と、発色試薬０.０５乃至０.１重量％と基礎の基質とを含む混合物を調製する工程と、 前記混合物を４０乃至４５℃の温度で加熱する工程と、 前記混合物を滅菌する工程と、 前記混合物を常温に冷却させる工程と含む、選択マーカーとして多糖分解酵素遺伝子を含むプラスミドで形質転換された形質転換体の選抜用培地を製造する方法。
【請求項１】 選択マーカーとして多糖分解酵素遺伝子を含むベクター。
【請求項２】 前記多糖分解酵素遺伝子がセルラーゼ、アミラーゼ及びキシラナーゼで構成された群から選択されることを特徴とする請求項１に記載のベクター。
【請求項３】 選択マーカーとして多糖分解遺伝子を含むベクターにより形質転換された宿主。
【請求項４】 前記宿主が大腸菌、酵母及び乳酸菌で構成された群から選択されることを特徴とする請求項３に記載の宿主。
【請求項５】 選択マーカーとして多糖分解酵素遺伝子を含むベクターに目的の外来遺伝子を導入する工程と、 前記ベクターで宿主を形質転換させる工程と、 前記宿主を多糖を含む培地に塗抹して培養する工程と、 前記培地に発色試薬を添加する工程と、 変色の存在を検出して外来遺伝子が導入された形質転換体を選抜する工程とを含む、選択マーカーとして多糖分解酵素遺伝子を含むベクターを用いて形質転換体を選抜する方法。
【請求項６】 多糖分解酵素遺伝子を選択マーカーとして含むプラスミドで形質転換された宿主を選抜するために、多糖類及びその多糖類の分解産物により色変を起こす発色試薬を含む培地。
【請求項７】 前記多糖類がカルボキシメチルセルロース及びセルロースを含む基質で構成された群から選択されることを特徴とする請求項６に記載の培地。
【請求項８】 前記多糖類が全培地の重量を基準として、０.１乃至１.９重量％の濃度で添加されることを特徴とする請求項７に記載の培地。
【請求項９】 前記発色試薬がトリパンブルー、コンゴレッド、メチレンブルー、ビスマルクブラウン、ブリリアントクレシルブルー、ヤンスグリーン、及びイントラビタムで構成された群から選択されることを特徴とする請求項６に記載の培地。
【請求項１０】 前記発色試薬が全培地の重量を基準として、０.０１乃至０.１９重量％の濃度で添加されることを特徴とする請求項９に記載の培地。
【請求項１１】 全混合物の重量を基準として、多糖類０.５乃至１.５重量％と、発色試薬０.０５乃至０.１重量％と基礎の基質とを含む混合物を調製する工程と、 前記混合物を４０乃至４５℃の温度で加熱する工程と、 前記混合物を滅菌する工程と、 前記混合物を常温に冷却させる工程と含む、選択マーカーとして多糖分解酵素遺伝子を含むプラスミドで形質転換された形質転換体の選抜用培地を製造する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２００３−５１９４６９（Ｐ２００３−５１９４６９Ａ）
【公表日】平成１５年６月２４日（２００３．６．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００１−５００７８４（Ｐ２００１−５００７８４）
【出願日】平成１２年４月２９日（２０００．４．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ００／００４０９
【国際公開番号】ＷＯ００／０７３４７２
【国際公開日】平成１２年１２月７日（２０００．１２．７）
【出願人】
【氏名又は名称】チャン、デ キュン
【氏名又は名称原語表記】ＣＨＵＮＧ，Ｄａｅ Ｋｙｕｎ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１５年６月２４日（２００３．６．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１２年４月２９日（２０００．４．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ００／００４０９
【国際公開番号】ＷＯ００／０７３４７２
【国際公開日】平成１２年１２月７日（２０００．１２．７）
【出願人】
【氏名又は名称】チャン、デ キュン
【氏名又は名称原語表記】ＣＨＵＮＧ，Ｄａｅ Ｋｙｕｎ
【Ｆターム（参考）】
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