選択的な制限断片増幅：一般的なＤＮＡフィンガプリント法
【課題】本発明は、所定の特定の制限エンドヌクレアーゼに対する制限部位を複数含むと共に、その核酸の少なくとも一部分は未知である出発ＤＮＡの少なくとも一部分を制御増幅する方法に係わる。本発明方法は、ヒト、動物または植物のＤＮＡフィンガープリント形成、制限断片長さ多形性の同定に適用される。本発明を適用するためのキットも提供される。
【解決手段】本発明は、生物のＤＮＡを少なくとも１種の制限酵素で切断した後に得られる制限断片をＰＣＲ法により増幅させる新規な方法を提供する。この新規なＰＣＲ法の使用において、使用するオリゴヌクレオチドは公知のＤＮＡ配列には指向せずに制限断片の末端を識別するように設計される。
【解決手段】本発明は、生物のＤＮＡを少なくとも１種の制限酵素で切断した後に得られる制限断片をＰＣＲ法により増幅させる新規な方法を提供する。この新規なＰＣＲ法の使用において、使用するオリゴヌクレオチドは公知のＤＮＡ配列には指向せずに制限断片の末端を識別するように設計される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、限定はしないが植物および動物の育種、品種もしくは栽培変種の同定、診断医薬、動物および植物における病気の診断、ヒトにおける遺伝病の同定、家族関係の分析、法医学的分析および微生物分類を包含する種々異なる多くの分野におけるＤＮＡフィンガプリント法およびＤＮＡマーカーの使用に関する。
【０００２】
より詳細には本発明は、ＤＮＡフィンガプリント法（ＤＮＡ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ）および微生物から高等な植物、動物およびヒトに至る範囲のゲノムにおける特定ＤＮＡマーカーの検出方法に関する。さらに本発明は、種々異なる応用分野にて本発明の方法に使用される合成ＤＮＡ分子およびそれに基づく生産物に関する。
【背景技術】
【０００３】
１．ＤＮＡフィンガプリント法
ＤＮＡフィンガプリントまたはＤＮＡ分類、並びに他の遺伝子型分類や特性化やＤＮＡ同定の方法は個人、変種もしくは種族または品種の遺伝子構成もしくはゲノムにおける類似性または１つ以上の区別的な特徴を特性化することを意味する。一般的規則は遺伝子関係が近縁であるほど同一性が大となり或いはゲノムの類似性が一層充分となり、その結果ゲノムにおける区別的な特徴がより稀となる。これらの類似した或いは区別的な特徴は、ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで切断した後に生物のＤＮＡを分析して示すことができる。制限エンドヌクレアーゼは、短いヌクレオチド配列（一般に長さ４〜８塩基）を認識すると共に２個のＤＮＡ鎖を切断して別個の長さを有するＤＮＡ断片を生成させる酵素である。制限エンドヌクレアーゼは、その高度の配列特異性により、ＤＮＡ分子を極めて特異的に切断する。その結果、再現しうるＤＮＡ断片群が生成される。ＤＮＡ断片は、その長さに応じ多孔質マトリックスもしくはゲルで分画して典型的なバンドパターンを生じ、生物の遺伝子構成におけるＤＮＡフィンガプリントを構成することができる。
【０００４】
２．ＤＮＡ多形性
極めて近縁の品種、変種もしくは種族のフィンガプリントを比較すると、ＤＮＡフィンガプリントは同一であるか或いは極めて類似する。同一のＤＮＡフィンガプリントにも拘らず相違点が観察される場合、これら相違点はＤＮＡ多形性と呼ばれる。これらは、フィンガプリントに出現する新たなＤＮＡ断片である。ＤＮＡはその位置にて多形性であると言われ、この新規なＤＮＡ断片はＤＮＡマーカーとして使用することができる。制限酵素切断により得られるＤＮＡフィンガプリントで検出されるＤＮＡ多形性は、制限エンドヌクレアーゼ標的部位を破壊する突然変異、新規な標的部位を形成する突然変異、挿入、欠失または２つの制限部位の間の逆位のようなＤＮＡ配列における変化から生じうる。
【０００５】
この種のＤＮＡ多形性は一般にＲＦＬＰ、すなわち制限断片長さ多形性と呼ばれる。この種の突然変異的変化は、メンデルの法則で遺伝する場合、真正な遺伝子マーカーとして挙動する。その結果、ＤＮＡ多形性を他の遺伝子マーカーと全く同様に血統分析、形質の遺伝に関する遺伝子研究、個体の同定などに遺伝子マーカーとして使用することができる。
【０００６】
３．ＤＮＡフィンガプリント技術
ウィルスを除く殆ど全ての生存する生物につき、これら生物の全ゲノムＤＮＡの制限消化物は、個々のバンドを評価することができないほど多くのバンドをもたらす。したがって、全てのＤＮＡフィンガプリント法は、小割合のＤＮＡ断片のみを可視化させてＤＮＡフィンガプリントを構成する単純なバンドパターンを得ると言う原理に基づいている。
【０００７】
最も広く使用されている方法は、生物のＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで消化し、制限断片をゲル電気泳動により分画し、分画されたＤＮＡ断片を膜上に移動させると共に結合させ、次いでこの膜を特定ＤＮＡ断片（「プローブ」）とハイブリダイズさせることを含む。ＤＮＡ断片は二本鎖ＤＮＡ分子を形成すると共に、膜上のＤＮＡ断片は相補的ヌクレオチド配列を有する。プローブを可視化可能なマーカーで標識すれば、プローブが結合したＤＮＡ断片を可視化することができる。この手法は一般に「サザンハイブリダイゼーション」と呼ばれる。近縁のゲノムＤＮＡ分子においてプローブが結合した対応の制限断片の寸法に差が観察されれば、これらの差はＤＮＡ多形性、より詳細には制限断片長さ多形性と呼ばれる。制限断片長さの差は、ＤＮＡプローブにより認識される遺伝子座の種々異なる対立型に対応する。ＤＮＡフィンガプリント法のためのサザンハイブリダイゼーションも広く使用されているが、この方法は面倒であって時間がかかる。
【０００８】
さらに、この方法は解像能が低く、せいぜい単一の反応における単一の遺伝子座もしくは２〜３の遺伝子座を評価するにしか使用することができない。
【０００９】
４．ポリメラーゼ連鎖反応
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術は、インビトロにて特定ＤＮＡ断片を合成するための方法である。この方法は、ＤＮＡ分子上の独特の配列に結合する特定のオリゴヌクレオチドおよび熱安定性のＤＮＡポリメラーゼを使用することに基づく。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡの対向鎖にアニールしてそれぞれ新たなＤＮＡ鎖の合成を指令するようＤＮＡ合成反応でプライマとして作用するように設計される。したがって、１ラウンドの合成においてはプライマー間でＤＮＡ分子の完全コピーが作成され、プライマー間のＤＮＡが複製される。各ラウンドのＤＮＡ合成の結果、二倍量のＤＮＡが生じて２個のプライマー間で構成されるＤＮＡの増幅をもたらす。その結果、ＰＣＲ技術は少量の「基質ＤＮＡ」を用いて正確なＤＮＡセグメントを合成することを可能にする。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、生物のＤＮＡを少なくとも１種の制限酵素で切断した後に得られる制限断片をＰＣＲ法により増幅させる新規な方法を提供する。この新規なＰＣＲ法の使用において、使用するオリゴヌクレオチドは公知のＤＮＡ配列には指向せずに制限断片の末端を識別するように設計される。このためには、オリゴヌクレオチドリンカー（もしくはアダプタ）を制限断片の末端に付加させることにより該末端を改変する必要がある。この理由は、制限酵素の末端が一般に極く僅かのヌクレオチド（すなわち２〜８個のヌクレオチド）しか持たず、ＰＣＲ増幅用のプライマーを設計するために使用するには短か過ぎるからである。
【００１１】
本発明は、ゲノムＤＮＡ分子を制限エンドヌクレアーゼで消化して得られたＤＮＡ断片の複雑な混合物から１個もしくはそれ以上の制限断片を増幅させるためのポリメラーゼ連鎖反応技術（ＰＣＲ）の新規な使用に基づく。本発明の１つの特定の利点は、制限断片の５’および３’末端におけるヌクレオチド配列が決定されない状況においてＤＮＡ制限断片の増幅を可能にすることである。このような場合、増幅すべき制限断片の各鎖にハイブリダイズする通常の配列特異的プライマーは規定することができず、したがって増幅目的に当業界で知られた方法を使用することができない。
【００１２】
本発明の方法はたとえば２種の異なる方法で使用することができ、２種の異なる使用をもたらす：
（１）ＰＣＲ技術により増幅すべき１個もしくはそれ以上の制限断片のサブセットをランダムに選択することによるゲノムのＤＮＡフィンガプリント法。さらに本発明は、上記方法に用いるための合成オリゴヌクレオチドをも包含し、さらにこれら方法は法医学的型分類、微生物同定、変種同定、血統分析、および遺伝子形質に関連したＤＮＡマーカーのスクリーニング等に使用とすることができる。
（２）多形性でありうる１種もしくはそれ以上の予備選択されたＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅により同定するための方法。さらに本発明は、前記方法に使用するための特定の合成オリゴヌクレオチドをも包含し、さらにこれら方法はヒトの遺伝病のスクリーニング、植物および動物の育種における耕種学的形質の遺伝の監視、および病気における感染物質の検出等に使用することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
１．定義
以下の説明および実施例においては多くの用語を使用する。これら用語に与えるべき範囲を含め本明細書および請求の範囲を明瞭かつ一貫して理解するため、次の定義を設ける。
−制限エンドヌクレアーゼ：制限エンドヌクレアーゼもしくは制限酵素は二本鎖ＤＮＡ分子における特定塩基配列（標的部位）を認識する酵素であって、各標的部位にてＤＮＡ分子の両ストランドを切断する。
−制限断片：制限エンドヌクレアーゼによる切断により産生されるＤＮＡ分子を制限断片と称する。任意所定のゲノムは特定の制限エンドヌクレアーゼにより個々の制限断片群に消化される。制限エンドヌクレアーゼ切断によって生ずるＤＮＡ断片を分離して、ゲル電気泳動により検出する。
−制限断片長さ多形性（ＲＦＬＰ）：たとえば２種の近縁生物のゲノムＤＮＡは、多くの部位でそのヌクレオチド配列組成の相違点を示す。これらの相違点が制限エンドヌクレアーゼに関する標的部位に存在すれば、改変された標的部位はその箇所で切断されないだろう。同様に、ヌクレオチド配列変化は他の生物には存在しない新たな標的部位を導入し、その箇所で制限酵素によるＤＮＡの切断を引き起こす。或いは、１種の生物で生ずる、制限エンドヌクレアーゼ用の２つの標的部位の間でのヌクレオチドの挿入もしくは欠失は、これら標的部位の間の間隔を改変する。このために、２種の生物ＤＮＡの消化により異なる長さを有する制限断片が生成する。２種の生物のＤＮＡの消化によって生ずる制限断片の長さに多形性が生ずる。
【００１４】
−ゲル電気泳動：制限断片を検出するため、寸法を基礎とした二本鎖ＤＮＡ分子を分画する分析法が必要とされる。この種の分画を達成する最も一般的に用いられる技術は電気泳動である。この種のゲル内でＤＮＡ断片が移動する速度はその寸法に依存する。したがって移動距離は、断片長が増大するにつれて減少する。ゲル電気泳動により分画されたＤＮＡ断片は、パターンに含まれる断片の個数が少なければ染色法によって直接可視化することができる。
【００１５】
−合成オリゴヌクレオチド：好ましくは約１０〜約５０塩基を有する化学的に合成しうる一本鎖ＤＮＡ分子を合成オリゴヌクレオチドと称する。一般に、これら合成ＤＮＡ分子は独特のヌクレオチド配列を有するよう設計されるが、関連配列を有すると共にヌクレオチド配列内の特定位置に異なるヌクレオチド組成を有する分子ファミリーを合成することもできる。合成オリゴヌクレオチドと言う用語は、独特なヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子を意味するよう用いられる。混合合成オリゴヌクレオチドと言う用語は、関連する合成オリゴヌクレオチドのファミリーを意味すべく用いられる。
【００１６】
−連結：２個の二本鎖ＤＮＡ分子を互いに共有結合させる酵素リガーゼによって触媒される酵素反応を連結（ｌｉｇａｔｉｏｎ）と称する。一般に両ＤＮＡ鎖は互いに共有結合するが、一方の末端の化学的もしくは酵素的改変により２個のストランドの一方の連結を防止することもできる。その場合、２個のＤＮＡ鎖の一方にのみ共有結合が生ずる。
【００１７】
−アダプター：たとえば長さ１０〜３０塩基対のような限られた個数の塩基対を有する、制限断片の末端に連結しうるよう設計される短い二本鎖ＤＮＡ分子をアダプターと称する。これらアダプターは、部分的に互いに相補的であるヌクレオチド配列を持った２個の合成オリゴヌクレオチドで構成される。２個の合成オリゴヌクレオチドを混合すれば、適当な条件下で溶液中で二本鎖構造が形成されるだろう。アダプター分子の一方の末端は制限断片の末端に連結しうるよう設計され、他方の末端は連結しえないよう設計される。
【００１８】
−ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）：インビトロにて基質ＤＮＡからＤＮＡ断片を合成する酵素反応をＰＣＲと称する。この反応は、数百〜数千塩基対という短い間隔で分離されるＤＮＡ分子におけるヌクレオチド配列に相補的な２個の合成オリゴヌクレオチドの使用、および熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの使用を含む。連鎖反応は、たとえば１０〜３０サイクルのシリーズで構成される。各サイクルでは、先ず最初に基質ＤＮＡを高温度で変性させる。冷却した後、大過剰で存在する合成オリゴヌクレオチドは、溶液中の基質ＤＮＡ分子と、相補的ヌクレオチド配列を有する基質ＤＮＡ分子上の特定部位で二本鎖構造を形成する。次いでオリゴヌクレオチド−基質ＤＮＡ複合体はＤＮＡポリメラーゼにより触媒されるＤＮＡ合成反応の開始部位として作用し、その結果、基質ＤＮＡ鎖に相補的な新たなＤＮＡ鎖が合成される。
【００１９】
−ＤＮＡ増幅：ＤＮＡ増幅と言う用語は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いるインビトロでの二本鎖ＤＮＡ分子の合成を意味すべく使用される。ＰＣＲ反応の生成物を増幅ＤＮＡ断片と称する。
【００２０】
−プライマー：一般に、プライマーと言う用語はＤＮＡの合成を開始させうるＤＮＡ鎖を意味する。ＤＮＡポリメラーゼはプライマーなしには新たにＤＮＡを合成することができない。これらは存在するＤＮＡ鎖を、組立てるべきヌクレオチドの順序を指令する鋳型として相補鎖が使用される反応において伸長させうるだけである。ＰＣＲ反応に使用される合成オリゴヌクレオチド分子をプライマーと呼ぶ。
【００２１】
−サザンハイブリダイゼーション：サザンブロッティングとも称するサザンハイブリダイゼーションの目的は、アガロースゲル電気泳動により分画されたＤＮＡを、分画過程から生じたＤＮＡ断片の相対位置を保持させながら、たとえばナイロン膜もしくはニトロセルロース紙のような支持体上に物理的に移動させることにある。アガロースゲルから支持体への移動を達成すべく用いられる方法は、ＤＮＡをゲルから支持体中へ毛細管作用により移動させることである。
【００２２】
−核酸ハイブリダイゼーション：核酸ハイブリダイゼーションは、たとえばナイロン膜もしくはニトロセルロース紙のような支持体上で一本鎖ＤＮＡのハイブリダイゼーションにより関連ＤＮＡ配列を検出するために用いられる。相補的塩基配列を有する核酸分子は、適切な条件下で溶液中にて混合すれば二本鎖構造を再形成する。二本鎖構造は、たとえ一方が支持体に固定化されたとしても２個の相補的一本鎖核酸の間で形成される。サザンハイブリダイゼーション法においては後者が生ずる。
【００２３】
−ハイブリダイゼーションプローブ：サザンハイブリダイゼーション法で特定のＤＮＡ配列を検出するには、標識されたＤＮＡ分子またはハイブリダイゼーションプローブをたとえばナイロン膜もしくはニトロセルロースフィルターのような支持体に結合した分画ＤＮＡに対し反応させる。標識されたＤＮＡプローブに相補的なＤＮＡ配列を有するフィルター上の領域は、再アニーリング反応の結果としてそれ自身も標識される。次いでこの種の標識を示すフィルターの領域を、用いる標識の種類に応じて検出することができる。ハイブリダイゼーションプローブは一般に、トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）ゲノムからの特定ＤＮＡ配列の分子クローニングによって生成される。
【００２４】
［発明の実施の形態］
２．好適実施態様の説明
本発明はより詳細には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を長さ多形性（ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）を含む制限断片多形性（ＲＦＰ）の検出に用いうる方法および手段に関する。本発明はＲＦＰを検出する方法、本発明の方法に使用するための合成オリゴヌクレオチド、ＲＦＰを検出するための手段を含むキット、並びに植物および動物の育種、遺伝病の診断、生物の同定、および法医学的型分類などへの本発明の方法および手法の使用を包含する。
【００２５】
詳細には本発明は、個々のゲノム制限断片または、任意の生物、微生物、植物、動物もしくはヒトからの個々に１個もしくはそれ以上の特定の形質に遺伝子的に関連し或いは総合的に生物、変種もしくは個体を同定すべく使用しうるゲノムのフィンガプリントを与える１群のゲノム制限断片を同定するための手段を提供する。
【００２６】
制限断片の産生および同定のための本発明による一般的方法は制限エンドヌクレアーゼの使用、制限断片に対する合成オリゴヌクレオチドの結合、および制限断片のＰＣＲ増幅（図１）を含む。制限エンドヌクレアーゼは特定部位、すなわち標的部位でゲノムＤＮＡ分子を切断することにより制限断片を生成させる。
【００２７】
制限断片における末端のヌクレオチド配列が既知であってもなくても制限断片のＰＣＲ増幅は、本発明によれば、先ず最初に合成オリゴヌクレオチド（アダプター）を制限断片の末端に結合させてＰＣＲ増幅で使用されるプライマーのアンカー塩基として作用する２個の共通標識を各制限断片に付与することにより達成することができる。
【００２８】
典型的には、制限酵素は両ストランドの末端ヌクレオチドが塩基対形成するフラッシュ末端（ｆｌｕｓｈ ｅｎｄｓ）、または２本のストランドの一方が突出して短い一本鎖伸長を与えるスタッガー末端（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ ｅｎｄｓ）をもたらす（図２）。フラッシュ末端を有する制限断片の場合は、アダプターを１フラッシュ末端と共に使用する。スタッガー末端を有する制限断片の場合は、制限断片の一本鎖伸長に相補的である一本鎖伸長を持ったアダプターを使用する。その結果、それぞれの種類の制限断片につき特定アダプターを使用し、これらアタプターは一方の末端においてのみ相違してアダプターを制限断片に連結させうるようにする。典型的には、用いるアダプターは互いに部分的に相補的な２種の合成オリゴヌクレオチドで構成され、これらオリゴヌクレオチドは一般に長さ約１０〜３０ヌクレオチド、好ましくは長さ１２〜２２ヌクレオチドであると共に、溶液中で互いに混合すれば二本鎖構造を形成する。酵素リガーゼを用いて各アダプターを制限断片の混合物に連結させる。制限断片に対し大モル過剰のアダプターを用いれば、全制限断片が両末端でアダプターを保持して終端するよう確保される。この方法により作成される制限断片を標識制限断片と称し、この方法をさらに制限断片標識化と称する。
【００２９】
これらアダプターはかくして、後続のＰＣＲ増幅反応に用いる上記特徴を備えたプライマーの鋳型として使用することができる。本発明の好適具体例において、制限断片はその両末端に同じアタプターを有し、単一のＰＣＲプライマーを用いて図３に示すように制限断片を増幅することができる。この種の場合、全制限断片が同様に標識されるので、標識制限断片の混合物のＰＣＲ増幅は同時様式（ｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓ ｆａｓｈｉｏｎ）で全制限断片を増幅することが明らかである。２種の異なる制限酵素を用いてＤＮＡを切断する他の具体例においては、２種の異なるアダプターを制限断片の各末端に連結させる。この場合、２種の異なるＰＣＲプライマーを用いてこの種の制限断片を増幅することができる。２種の制限酵素を用いる他の好適具体例においては、一方の酵素末端に対するアダプターをビオチニル化する。これは制限断片の複雑な混合物からこの制限酵素用に少なくとも１端部を有する制限断片を選択することを可能にし、その際ビオチニル化された分子を分離する常法を用いる。この工程は制限断片の出発混合物の複雑性を減少させると共にＰＣＲ増幅に先行する濃縮工程を構成し、或る場合にはこれによってバックグランドを減少させる。数種の異なる断片の同時的増幅はしばしば多重ＰＣＲと呼ばれる。多重制限断片増幅の原理については図４に示す。
【００３０】
さらに本発明は制御された増幅が可能となるようＰＣＲ増幅反応を指令するための特異的に設計されたプライマーおよび特定の方法に基づくものであって、本発明の特定具体例によれば小サブセットの標識制限断片のみが増幅されるようにする。
【００３１】
一般にゲノムＤＮＡ、特に動物、植物もしくはヒトのゲノムＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ消化物は極めて多数の制限断片をもたらす。制限断片の個数はゲノムの寸法、並びにゲノムにおける制限エンドヌクレアーゼ標的部位の存在頻度に依存し、この存在頻度は次いで主として標的部位におけるヌクレオチドの数により決定される。一般的に使用される制限エンドヌクレアーゼの標的部位におけるヌクレオチドの数は４〜８個の範囲である。生物のゲノム寸法は、微生物の場合における数百万塩基対から動物および植物における数千万塩基対の範囲で広範囲に変化することができる。したがって、制限酵素によりゲノムＤＮＡ分子を切断した後に得られる制限断片の個数は数百〜数百万の範囲で変化することができる。一般に制限断片の個数は、ゲル電気泳動により分画されたゲノムＤＮＡ消化物において個々の制限断片を同定しえないほど大である。この種の消化物は一般にバンドの汚れをもたらす。
【００３２】
したがって標識制限断片のＰＣＲ増幅は、全断片が同時的にＰＣＲ反応で同時増幅するため、バンドの汚れをもたらす。大寸法のゲノムＤＮＡに対し適用しうる本発明の好適具体例においては、増幅すべき制限断片の個数を制限する一般的原理を用いた。これは、比較的少数の標識制限断片のみがＰＣＲ増幅反応に際し増幅されるようサブセットの標識制限断片を予備選択することにより行われる。
【００３３】
本発明のこの具体例で規定される選択的原理は、図５に示すように、ＰＣＲ増幅用のプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドの設計である。
【００３４】
標識制限断片は次の一般的構造を有する：逆ＤＮＡ配列（一定配列）により両側にフランキングする可変ＤＮＡ配列（標識前の制限断片に対応）。逆ＤＮＡ配列（一定ＤＮＡ配列）は、制限エンドヌクレアーゼの標的配列の部分と制限断片の両末端に結合したアダプターの配列の部分で構成される。一定ＤＮＡ配列の間に含まれる制限断片の可変配列は一般に未知であり、したがってランダム配列組成を有する。その結果、一定ＤＮＡ配列にフランキングするヌクレオチド配列は制限断片の大混合物中で全体的にランダムである。
【００３５】
したがって本発明は一定ヌクレオチド配列部分を含む特定ＰＣＲプライマーをも提供し、さらに得られる制限断片の制限サブセットの増幅に依存する本発明の実施態様においては可変配列部分をも含む。一定配列部分においてヌクレオチド配列は、プライマーが制限断片の末端における一方のＤＮＡ鎖の一定ＤＮＡ配列と完全に塩基対形成するよう設計される。可変配列部分は、選択した１〜１０塩基の範囲のランダムに選択したヌクレオチド配列で構成される。
【００３６】
「可変配列（ｖａｒｉａｂｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」と言う用語は一層正確には、サブセットの制限断片を増幅する目的で一定に留まる配列を形成する選択ヌクレオチドよりなる配列を意味する。本発明の特定具体例においては、選択塩基よりなる数種の配列を用いて数種の別個のプライマーを規定することができる。この種の場合、プライマーは同じ一定配列と、形成されるプライマー間で異なる選択塩基により構成される可変配列とを有することができる。
【００３７】
ＰＣＲ工程で増幅される標識制限断片の予備選択を指令するのは、プライマーの３’末端へのこれら可変（選択）配列の付加である。ＰＣＲ反応を適する条件下で行う場合、プライマはこれら標識制限断片に対しＤＮＡ合成のみを開始させ、ここで可変ＤＮＡ配列は図５に示したように標識制限断片の鋳型ストランドと完全に塩基対を形成することができる。
【００３８】
選択は、プライマーの可変配列部分に存在するヌクレオチドの数により決定される。プライマーの選択性は可変（選択）配列部分におけるヌクレオチド数に伴って増加する。さらに選択性塩基と言う用語は可変配列部分におけるヌクレオチドを意味し、これら塩基の選択がプライマーを選択性にすることを示す。使用したプライマーの選択性塩基が断片の末端にて両相補的配列を認識する場合、標識制限断片のみが増幅されることを理解されねばならない。プライマーが１末端にのみ適合（ｍａｔｃｈ）してアニーリングする場合、増幅は対数的でなく直線的となり、生成物は未検出のままとなろう。
【００３９】
予め異なる個数の選択性塩基を有する可変配列で得られる選択性の程度を推定することができ、一般式４２ｎ［ここでｎは選択性塩基の個数に等しい］を用いる。１個の選択性塩基を用いて１６個の標識断片のうち１個が増幅され、２個の選択性塩基を用いて２５６個のうち１個が増幅され、３個の選択性塩基を用いて４，０９６個のうち１個が増幅され、さらに４個の選択性塩基を用いて６５，５３６個のうち１個が増幅され、以下同様である。本発明の１好適具体例は、用いる制限酵素により生成される断片の個数とは無関係に、ランダムサブセットの標識制限断片を任意のゲノムＤＮＡ消化物から選択的に増幅することを可能にする。
【００４０】
好適具体例において、選択性ヌクレオチドの個数は、増幅される制限断片の個数を５〜２００個に制限するよう選択される。この個数は断片の個数を４２ｎで割算して計算しうるが、正確な予測は可能でない。何故なら、必ずしも全ての制限断片を等しい効率で増幅しえないからである。したがって、実際には理論的に予想されるよりも少ない断片が増幅される。さらに、２種（もしくはそれ以上）のプライマーの混合物を用いうることも指摘すべきである。これは各プライマーにより認識される断片の増幅を可能にし、さらに２個のプライマーにより認識される断片の増幅を可能にする。最後に、プライマーの選択性ヌクレオチドと相補的鋳型との間の塩基対形式に基づく選択は、ＰＣＲ反応におけるアニーリング工程において選択される温度により強く影響を受けることも指摘すべきであり、この温度がプライマー／鋳型複合体の融解温度よりも低く或いはそれに近接すれば、プライマーは不完全な組合わせで鋳型配列にアニーリングして、複合体に誤った組合わせ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）を生ぜしめる。これは、予想よりも多い断片の増幅をもたらして一層多い変動結果を生ぜしめるため回避されるべきである。
【００４１】
本発明により得られるＰＣＲ生成物は、寸法によりＤＮＡ分子を分離した後にＤＮＡ分子を適する試薬で染色する標準的な分画法を用いて同定することができる。或いは、ＰＣＲ増幅に用いるプライマーを適する放射性標識もしくは蛍光性発色団で標識して、サイズ分画の後に反応生成物を同定することもできる。本発明の好適具体例において、ＰＣＲ生成物は限定はしないがたとえばアガロース、ポリアクリルアミドまたは混合アガロース／ポリアクリルアミドのような標準的ゲルマトリックスを用いるゲル電気泳動により分画される。本発明により得られるＰＣＲ生成物は、増幅制限断片（ＡＲＦ）と言う用語でも示される。
【００４２】
本発明の手段および方法を用いて、任意の複雑なゲノムの制限消化物から１群のＡＲＦを生成させることができる。本発明は、得られる制限断片の個数をＡＲＦを分離すべく使用するゲル分画システムの解像力に応じて調節することができる。１特定具体例において、選択的プライマーは５〜１０個のＡＲＦを生成するよう設計され、次いでこれらをアガロースゲル電気泳動により分離する。他の特定具体例は、２０〜５０個のＡＲＦを生成するよう設計された選択性プライマーの使用を含み、次いでこれらＡＲＦを限定はしないがたとえばポリアクリルアミドゲルもしくは混合アクリルアミド−アガロースゲルのような高分解能のゲル電気泳動システムによって分離する。
【００４３】
１好適具体例において、制限酵素は２０〜１０００塩基対の寸法範囲にて制限断片をもたらすよう選択される。何故なら、ＰＣＲ増幅に関して一般的に知られるように、この断片寸法範囲が最も効果的に増幅されるからである。各種の標準ゲルマトリックスでずっと多くの断片を分画しうるが、ＤＮＡ配列決定に関して現在使用されているような変性ポリアクリルアミドゲル系での分画により最も良好な結果が得られる。
【００４４】
本発明によれば、ＰＣＲ増幅反応にてそれぞれ異なる選択性プライマーを用い種々異なる群のＡＲＦが得られる。分離後に同定されるＡＲＦのパターンは、ゲノムＤＮＡの独特な完全に再現性のあるフィンガプリントを構成する。この種のフィンガプリントは、限定はしないがたとえば法医学的分類、生物の診断的同定、並びに品種、種族、変種もしくは個体の確認のような数種の用途を有する。同定のレベルは、特定群の種々異なる構成員により示される類似性の程度（変動性の程度）により決定される。変動性もしくは類似性は、関連ゲノムにおけるヌクレオチド組成の変動程度によって決定される。本発明の基礎となる原理は、各増幅制限断片にて図９に示すように所定間隔で互いに分離された２種のヌクレオチド配列を検出する点にある。２種のヌクレオチド配列のそれぞれは２つの部分で構成される：すなわち（ａ）制限エンドヌクレアーゼのための標的部位、および（ｂ）選択性プライマーに含まれる標的部位に隣接したヌクレオチド配列。関連する生物、品種、変種、種族もしくは個体において、これら配列要素およびその相対的間隔はより大きい或いはより小さい程度で保持される。したがってフィンガプリントは、ゲノム間の配列関係の程度を決定するための基礎を構成する。他方、ＡＲＦパターンにおける差を用いて、各ゲノムを互いに区別することもできる。ゲノムの他のフィンガプリント法に優る本発明の特定の利点は、この方法で得られる高い分解能（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）である。数十もしくは数百のＡＲＦを同時に比較することができる。
【００４５】
本発明の他の特定応用は、制限断片多形性（ＲＦＰ）のスクリーニングおよび同定を含む。ゲノムＤＮＡのヌクレオチド組成の変化は、しばしば制限断片の多形性をもたらす。挿入もしくは欠失はこれらを有する制限断片の寸法に影響を及ぼし（図１０）、ヌクレオチド変化は制限エンドヌクレアーゼ標的部位の除去または新たな制限エンドヌクレアーゼ標的部位の形成（図１１）をもたらしうる。この種の変化を確認するため最も一般的に使用される技術、はクローン化されたＤＮＡプローブを用いるサザンブロッティング実験であり、すなわち一般に制限断片長さ多形性（ＲＦＬＰ）検出と呼ばれる技術である。この技術は、種々異なるゲノムにおける関連ＲＦＬＰのためのサザンブロッティング実験におけるランダムにクローン化されたＤＮＡ断片の徹底的なスクリーニングを含む。本発明の方法によれば、ＲＦＰを種々異なるゲノムから得られたＡＲＦを比較して直接に同定することができる。原理的に、本発明の方法はＲＦＰを検出するための感度がより大である。何故なら、制限エンドヌクレアーゼの標的部位における差が検出されるだけでなく、隣接ヌクレオチド配列における差が選択性ＰＣＲプライマーに含まれるからである。その結果、本発明の方法はＲＦＬＰを検出するためのずっと優秀な方法を構成する。
【００４６】
ＲＦＬＰは法医学的型分類、ヒトにおける遺伝病の監視、並びに植物および動物の育種における耕種学的形質の遺伝の監視を含む数種の用途に現在使用されている。基礎となる原理は、特定の遺伝子特性に密接に関連した或る種のＤＮＡ多形性を用いて特定の遺伝子特性の存在もしくは不存在を監視しうる点にある。
【００４７】
本発明の方法によれば、ＡＲＦパターンの分析を用いて特定の遺伝子特性に対する多形性ＡＲＦの遺伝的関係を規定することができる。さらに、この種の多形性ＡＲＦは増幅断片長さ多形性（ＡＦＬＰ）と呼ばれ、これらをクローン化ＤＮＡプローブを用いてサザンブロッティング実験で検出されるＲＦＬＰ型ＤＮＡ多形性から区別することができる。
【００４８】
本発明の１特定用途は、特定遺伝子特性に関連したＡＦＬＰの検出を含む。この用途は、特定遺伝子特性における差を示す近縁個体のゲノムＤＮＡの制限消化物における異なる選択性プライマーで得られたＡＲＦパターンの分析、並びに１種もしくはそれ以上のＡＦＬＰの遺伝と特定遺伝子特性により示される表現型との間の相関関係を見出しうる分析技術の使用を包含する。
【００４９】
第２の好適な本発明の実施態様は、１種もしくはそれ以上の特定制限断片を同定するための本発明方法の使用を含む。１つの特定制限断片は、先ず最初に制限断片の各末端における最初の８〜１２塩基のヌクレオチド配列を決定することにより標識制限断片の複雑な混合物から増幅させることができる。これら配列に基づき２種のプライマーを設計することができ、それぞれ５〜１０個の選択性ヌクレオチドは制限断片の相補鎖の制限部位にフランキングする配列に相補的な配列を示す。各群のプライマーを用いて、ＰＣＲ増幅の後に単一の増幅断片を得ることができる。この方法に用いる制限断片はクローン化制限断片または増幅制限断片のいずれかとすることができる。必ずしも多くの制限断片は極めて効率的に増幅しえないので、多形性ＤＮＡマーカーを同定するための本発明の好適方法は先ず最初にランダムに選択された断片群を増幅させ、次いでＰＣＲ増幅の後に強いバンドをもたらすＡＦＬＰを同定する。これらＡＦＬＰは、制限断片特異性プライマーを開発するべく配列決定して特性化することができる。典型的には、ＡＦＬＰは対応のＤＮＡバンドをゲルから切除し、次いで両末端におけるヌクレオチド配列を決定して制限エンドヌクレアーゼ標的部位に隣接した最初の５〜１０ヌクレオチドの配列を確認することにより分離される。これらヌクレオチド配列が知られた後、ゲノムＤＮＡ消化物から単一の制限断片のみを増幅する制限断片特異性プライマーを設計することができる。本発明によるこの特定具体例において、２種の異なる選択性プライマーのうち１組を用いて特定制限断片を検出することができる。１組の２種の選択性プライマーのそれぞれにおいて、選択塩基は制限エンドヌクレアーゼ標的部位に隣接したヌクレオチド配列に相補的となるよう選択され、これを図８に示す。各プライマーに含ませる選択塩基の個数は、制限エンドヌクレアーゼ断片混合物の複雑性に依存する。
【００５０】
ＰＣＲ技術は過去数年間にわたり著しく発展し、ヒトの健康管理における最も広く用いられる診断法の１つに急速になりつつある。その用途は特に感染症の検出および遺伝病の検出を含む。各診断試験は２種の特定合成オリゴヌクレオチドの使用に基づくものであり、これらオリゴヌクレオチドをＰＣＲ反応におけるプライマーとして用いることにより特定長さの１種もしくはそれ以上のＤＮＡ断片を得る。病気検出において試験は１試料当り１個程度に少ないＤＮＡ分子の存在を検出して、特徴的ＤＮＡ断片を得る。遺伝病の場合には、生成物を正常の対立遺伝子と病気の対立遺伝子を区別しうるようプライマーを設計する。区別は、プライマーに対し相補的なゲノム内のＤＮＡセグメントの配列差に依存するか或いは２種のプライマー間における間隔差に依存する。
【００５１】
プライマーは極めて高程度の特異性を示すので種々異なる病気を同時に監視することができ、しばしば多重ＰＣＲと呼ばれる方法である。しかしながら多重ＰＣＲ法は、一般に僅か数種（５〜８）の異なる形質しか同時に監視しえない点で限界を有する。この限界の科学的根拠は、ＰＣＲ増幅の最適条件（アニーリング温度、Ｍｇ＋濃度、プライマー濃度など）が用いるプライマー対に応じて相当に変化する点である。多重ＰＣＲにおいては、全プライマー対が検出可能な生成物を生成する妥協条件を確立せねばならない。さらに、この現象に加えて、種々異なる断片の増幅効率に強力な差が生じる現象がある。その結果、しばしば或る種のプライマー対の生成物が多重ＰＣＲ反応では検出しえないという問題に遭遇する。
【００５２】
本発明の方法は本質的に多重ＰＣＲのこれら限界を解消する。何故なら、本発明に用いる全プライマーはそのヌクレオチド配列の実質的部分を共通して有するからである。さらに、ＡＦＬＰを選択することにより、等しい効率で増幅されるＤＮＡマーカーが選択される。したがって、異なる選択性プライマのための最適なＰＣＲ増幅条件は、一般的に使用される配列特異性プライマーで観察されるよりもずっと低い変動を示す。本質的に、合成オリゴヌクレオチドにおける塩基（これら塩基は複雑なゲノムにおける所定寸法の単一ＤＮＡ断片を検出する所要の特異性を得るのに必要である）の個数（これは上記のように計算する）と、効率的なＰＣＲ増幅にとって最適であるオリゴヌクレオチドの長さおよび組成との間の理想的妥協点が存在する。したがって、本発明の方法は多重ＰＣＲのかなり優秀な方法を提供する。
【００５３】
本発明は、任意のゲノムからＤＮＡマーカーを分離すると共にこの種のＤＮＡマーカーをあらゆる可能なＤＮＡフィンガプリント法の用途に使用するための一般的方法を提供する。
【００５４】
以下、限定はしないが実施例および図面により本発明をさらに説明する。
【実施例】
【００５５】
実施例１：ＰＳＴＩを使用するトマトＤＮＡの選択的制限フラグメント増幅
Ａ）ＤＮＡの単離及び修飾
全トマトＤＮＡ（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ ｃ．ｖ．Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒ）をＢｅｒｎａｔｚｓｋｉ及びＴａｎｋｓｌｅｙ（Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７２，３１４−３２１）に記載の如く幼葉から単離した。典型的な収量は、新鮮な葉物質１グラム当たりＤＮＡ ５０−１００μｇであった。ＤＮＡをＰｓｔＩ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で制限し、二重鎖（ｄｓ）ＰｓｔＩアダプターを以下に記載の方法に従って制限フラグメントに連結した。これらのアダプターは以下の構造：
5- CTCGTAGACTGCGTACATGCA -3
3- CATCTGACGCATGT -5
を有していた。これらのアダプター内の３’ＴＧＣＡ−の突出端をＰｓｔＩにより作った付着端にアニールする。５’Ｃ−残基がＡに置き換わっているので、ＰｓｔＩ認識配列ＣＴＧＣＡＧは、このアダプターの連結により修復されない。連結反応は、得られる末端が殆どＤＮＡフラグメント−アダプター分子であるような方法で設計されていた。これは、
１．アダプター−アダプターの連結を排除する非ホスホリル化アダプターを使用する、
２．同時に連結及び制限反応を実施する
ことにより実施した。後者の方法により、任意のフラグメント−フラグメントの連結産物が制限でき、これによりこれらの産物を殆ど完全に除去できた。ＰｓｔＩ認識配列はこれらの産物中で修復されないので、アダプター−フラグメント連結産物は制限酵素により制限され得ない。アダプター連結に使用する反応条件は以下の通りであった。
【００５６】
２μｇ トマトＤＮＡ
０．２μｇ アダプター
２０単位 ＰｓｔＩ
１単位 Ｔ４ ＤＮＡ−リガーゼ
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＡｃ ｐＨ ７．５，１０ｍＭ ＭｇＡｃ，５０ｍＭ ＫＡｃ，
２ｍＭ ジチオトレイトール，０．５ｍＭ ＡＴＰ
連結反応を反応容積２０μｌ中３７℃で３時間実施した。アダプター連結後、非連結アダプターを選択的に沈殿させることにより除去した。この目的のため、反応混合物を１００μｌに増やし、ＮＨ４Ａｃを終濃度２．５Ｍで添加した。−２０℃のエタノール（１００μｌ）を添加し、混合物を室温で５分間インキュベートした。４℃に冷却したエッペンドルフ遠心分離機中、１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離してＤＮＡを集めた。ＤＮＡペレットを室温で７０％エタノール０．５ｍｌで１回洗浄し、Ｔ０．１Ｅ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ ８．０，０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）４０μｌに溶解させた。ＤＮＡを−２０℃で貯蔵した。本明細書中に記載する選択的沈殿法により、反応混合物から非連結アダプターを効率良く除去したが、小さなＤＮＡフラグメント（＜２００ｂｐ）も失ってしまった。
【００５７】
Ｂ）増幅方法
上記方法で製造したＤＮＡをＰｓｔＩフラグメントを増幅するための鋳型として使用した。ＰＣＲの反応混合物は、
１ｎｇ 鋳型ＤＮＡ
１５０ｎｇ プライマー
１単位 Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）
２００μＭ 全４ｄＮＴＰ
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ ８．５，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２，５０ｍＭ ＫＣｌ
Ｈ２Ｏ （全容量が５０μｌになるまで）
を含んでいた。増幅反応中の蒸発を防ぐために、反応混合物を軽質鉱油（ｌｉｇｈｔ ｍｉｎｅｒａｌ ｏｉｌ）２０μｌで被覆した。以下のサイクルプロフィール：９４℃で１分、６０℃で１分、６０℃から７２℃に温度を１℃／５秒の速度で上昇及び７２℃で２．５分を使用してＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ上でＰＣＲを実施した。全部で３３サイクル実施した。反応後、クロロホルム２０μｌ及び充填染料１０μｌ、この場合染料Ｏｒａｎｇｅ Ｇ（Ｍｅｒｃｋ）０．１％ ｗ／ｖと一緒に５０％蔗糖を添加した。次いでこれを反応混合物と十分に混合し、充填染料を補った反応混合物から有機相（鉱油及びクロロホルム）を分離するために軽く遠心分離した。この反応混合物２０μｌを１．０％アガロースゲル上で分析した。
【００５８】
Ｃ）選択性の高いプライマーを使用するトマトＤＮＡの増幅
ＰｓｔＩで制限し、次いでＰｓｔＩアダプターをつけたトマトＤＮＡを上記条件を使用して増幅した。以下の配列：
１． 5-CTCGTAGACTGCGTACA-3
２． 5-GACTGCGTACAtgcagA-3
３． 5-GACTGCGTACAtgcagAC-3
４． 5-GACTGCGTACAtgcagACC-3
をもつ４つのプライマーを選択した。プライマー１はＤＮＡを修飾するのに使用するアダプターのトップストランドの一部なので、全ＰｓｔＩフラグメントを増幅しなければならない。プライマー２はアダプター配列の一部、ＰｓｔＩ認識配列（小文字）及び１個の選択的ヌクレオチド（大文字）を含むので、理論的には全ＰｓｔＩフラグメントの約１／１６部分を増幅しなければならない。プライマー３及び４はプライマー２に似ているが、選択的ヌクレオチドをそれぞれ２つ及び３つ含んでいるので、ＰｓｔＩフラグメントの約１／２５６及び１／４０９６を増幅すると予想される。反応混合物の一部を１．０％アガロースゲル上で分析し、結果を図１１に示す。この図面のレーン１及び６はＤＮＡマーカーを含んでおり、そのサイズを左側に示す。レーン２、３、４及び５は各々プライマー１、２、３及び４で得られたＰＣＲを含んでいる。この結果は、３つの選択的ヌクレオチドを使用したプライマーの場合にのみ、はっきりしたバンドパターンの増幅フラグメント数が得られることを示している。他の３つのプライマーはアガロースゲル上に溶解できなかったバンドパターンを与えたが、これは多くのＰＣＲ産物が生成したためである。これらの多くのＰＣＲ産物内でも、常に幾つかのフラグメントが目立っており、他のＰＣＲ産物の不鮮明なバックグラウンド上でもバンドとして検出される。恐らくこれらの強い産物は、トマト遺伝子上に高コピー数で存在するか、または他の産物よりもずっと効率的に増幅するのだろう。トマト遺伝子ＤＮＡのＰｓｔＩフラグメントの総数（２０，０００〜１００，０００）により、３つの選択的ヌクレオチドをもつプライマーが使用されてアガロースゲル上で鮮明なバンドパターンを作ったに違いないと予想された。
【００５９】
Ｄ）サザンブロット上の増幅フラグメントの分析
増幅フラグメントが同一サイズの真正制限フラグメントに対応することを立証するために、これらの増幅フラグメントをサザンブロット上で試験した。この目的のために、プライマー４で得られた４つの個々のフラグメントをアガロースゲルから切り出した。これらのゲル切片からＤＮＡをガラスビーズ（Ｇｅｎｅ Ｃｌｅａｎ，製造業者Ｂｉｏ １０１）に吸着させることにより精製し、精製ＤＮＡの一部を再増幅して４つのＤＮＡフラグメントを各々約１μｇ得た。続いて再増幅反応を１．０％分取アガロースゲル上で電気泳動させ、所望のＤＮＡフラグメントを精製した。各フラグメント２００ｎｇを、製造業者（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）により推奨された方法に従ってランダムヘキサマー標識キットを使用して（α−３２Ｐ）ｄＡＴＰで標識した。全トマトＤＮＡをＰｓｔＩで制限し、１．０％アガロースゲル上で電気泳動にかけた。制限ＤＮＡを約３μｇ含む４つのはっきりと分離したレーンを使用した。次に、アガロースゲルを、製造業者（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）により示された遺伝子スクリーン＋ハイブリダイゼーション膜にブロットした。ブロット後、ゲルをＰｓｔＩで制限したトマトＤＮＡを１レーン含む４つの切片に切断した。これらの４つの切片をＫｌｅｉｎ−Ｌａｎｋｈｏｒｓｔら（Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｌｌ．Ｇｅｎｅｔ．８１，６６１−６６７）に記載の方法に従って４つのＤＮＡプローブの一つに各々ハイブリダイズさせた。ハイブリダイズしたブロットをＫｏｄａｋ ＸＡＲ５フィルムを使用してオートラジオグラフに４０時間かけた。得られた結果は、４つのＤＮＡプローブにより識別された全てのゲノムＤＮＡフラグメントはこれらのプローブと同一の長さを持つことを示した。これは、プローブとして使用した増幅フラグメントはブロット上で検出されたフラグメント由来であることを示していた。
【００６０】
Ｅ）単一制限フラグメントの選択的増幅
プライマーの３セットをトマト遺伝子ＤＮＡ由来の３つの対応するランダムＰｓｔＩ−フラグメント用にデザインしたが、その中でもＰｓｔＩ−認識配列に隣接する配列が公知であった。５つの選択的ヌクレオチドを持つプライマーのセットを以下に示すように製造した。
【００６１】
プライマーセット１：
配列１：
5-ctgcagCAGTACCAGC----CCGGCACCTGctgcag-3
5-TGCGTAACATtgcagCAGTA-3 3-TGGACgacgtACATGCGT-5
プライマー１．１ プライマー１．２
【００６２】
プライマーセット２：
配列２：
5-ctgcagCCGAATCTCT-----AGTGAGTTAGctgcag-3
5-TGCGTACAtgcagCCGAA-3 3-CAATCgacgtACATGCGT-5
プライマー２．１ プライマー２．２
【００６３】
プライマーセット３：
配列１：
5-ctgcagAATACCAAGA-----GCAAGCACAGctgcag-3
5-TGCGTACAtgcagTTATG-3 3-GTGTCgacgtACATGCGT-5
プライマー３．１ プライマー３．２
【００６４】
トマトＤＮＡをＰｓｔＩで消化し、アダプターを上記の如く制限フラグメントの末端に連結した。このＤＮＡを上記セクションの条件のひとつを使用して、プライマーセット１または２または３を使用するＰＣＲの鋳型として使用した。各ＰＣＲの反応産物を１．０％アガロースゲル上で分析した。このゲルは図１２に示されている。図１２は１３個のレーンを示しているが、レーン１、２、１２及び１３はＤＮＡマーカーである。これらのマーカーのｋｂの大きさをゲルの両側に示す。レーン３、６及び９は、ベクターフラグメント、ｐＵＣ１８（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら，Ｇｅｎｅ ３３，１０３−１１９）及び挿入ＰｓｔＩフラグメントを産生する、ＰｓｔＩで制限した３つのＰｓｔＩフラグメントを各々含むプラスミドＤＮＡを示す。レーン４及び５は、各々全ゲノムＤＮＡ１ｎｇ及び対応するプラスミドＤＮＡ５ｆｇのプライマーセット１での増幅を示す。レーン７及び８は、全ゲノムＤＮＡ及びプラスミドＤＮＡのプライマーセット２での増幅を示し、レーン１０及び１１は、プライマーセット３での増幅を示す。これらの結果は、５つの選択的ヌクレオチドをもつプライマーでの選択的制限フラグメント増幅方法を使用すると少なくとも２０，０００フラグメントの混合物から単一のＰｓｔＩフラグメントを増幅し得ることを示している。
【００６５】
Ｆ）ＳＲＦＡを使用するＤＮＡ多型現象の識別
先のセクションにおいて、選択的制限フラグメント増幅法を使用すれば、配列情報が入手可能な場合、ランダムまたは特定のフラグメントのいずれかにおいて制限フラグメントを増幅し得ることが明示された。従って、同一種の２つの個体間で制限部位多型現象に関して調査可能である。非常に近縁であるが系の一方にはネコブセンチュウ耐性遺伝子、Ｍｉが存在するという点が異なる２つのトマト系に関してこのことを以下に記載する。このＭｉ−遺伝子はＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ、食用トマトＬ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍの遠縁種に由来する。これを、交雑、次いでＬ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ親に１２回戻し交雑し、さらにＭｉ−遺伝子の存在に関して子孫を選択することによりＬ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ系に導入した。従って、２つのトマト系は、その遺伝子物質の小さな部分だけ、即ちＭｉ−遺伝子及び周囲領域が異なる。古典的遺伝学方法を使用して、Ｍｉ−領域がこの系のゲノムの＜１％を構築すると計算した。
【００６６】
ＤＮＡを２種類のトマト系（系８３Ｍ−７１３９２，Ｍｉ−感受性及び系８３Ｍ−７１３９８，Ｍｉ−耐性；Ｄｅ Ｒｕｉｔｅｒ Ｓｅｅｄｓ，Ｂｌｅｉｓｗｉｊｋ，オランダ）から単離し、続いてＰｓｔＩで制限し、上記の如くアダプターをつけた。選択的ヌクレオチドの伸長が異なるプライマーを使用して増幅反応を多数回実施した。３つの選択的ヌクレオチドを使用し、単一プライマーの他に異なる２つのプライマーの組み合わせを使用した。反応物を混合ポリアクリルアミド／アガロースゲル上で分析した。その際、アクリルアミド対ビスアクリルアミド２０：１の割合で２．５％ポリアクリルアミド及び１．０％アガロースを使用した。１．５ｍｍのスペーサーを使用してＰｒｏｔｅａｎ ＩＩゲルユニット（Ｂｉｏｒａｄ）上にゲルを流した。全部で１６の異なるプライマーを使用すると、単一プライマーに関しては１６の反応となり、２つのプライマーの考え得る全部の組み合わせに関しては１２０の反応となる。これらの組み合わせの６つを使用するゲルの典型例を図１３に示す。このゲルのレーン１及び１４はＤＮＡマーカーを含んでおり、そのサイズをゲルの右側にｋｂで示す。レーン２及び３、４及び５、６及び７などは、２つのトマト系のプライマー対または特異的プライマーでの増幅を含んでいる。制限部位多型現象に関するスクリーニングから多くのフラグメントが産生したが、そのうちの３つは非常に顕著であり、これらは図１３のレーン９、１１及び１２に示されている（小さな丸で示されている）。同一プライマーが両方の反応に存在するので（違いはレーン１１の第２プライマーの存在である）、レーン９及び１１の多型現象のバンドは同一であると予測した。レーン１１及び１２の２つの多型現象フラグメントをゲルから切り出し、ゲル切片を１８ゲージ針に押し通して壊し、ＤＮＡを１００ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ ８．０，１０ｍＭ ＥＤＴＡの２００μｌ中で拡散させることにより溶離してゲル切片から溶出させた。上記の如くこれらのフラグメントの再増幅用に２μｌを使用した。Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを使用して各フラグメント２００ｎｇをブラント端とし、続いてＳｍａＩで制限したプラスミドベクターｐＵＣ１８（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら，Ｇｅｎｅ ３３，１０３−１０９）１００ｎｇに連結した。連結混合物をＥ．ｃｏｌｉに形質転換し、各フラグメントに関して１つの組換えＥ．ｃｏｌｉクローンを配列分析用に選択した。これらの取り扱い操作は全て、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＭａｎｉａｔｉｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載の標準法を使用して実施した。
【００６７】
６つの選択的ヌクレオチドを持つプライマー２セットを、上記の如く２つのフラグメントの配列をベースとして合成した。本発明者は、これらのプライマーセットを使用して各フラグメントを特異的に増幅し得た。トマト系からフラグメント（トマト系由来）だけを増幅した。しかしながら、これらのプライマーセットは、この多型現象を発見するのに使用した３つの選択的ヌクレオチドを持つプライマーに関して当初知見されたのと同一の多型現象を示した。
【００６８】
実施例２：２つの制限酵素を使用するトマトＤＮＡの選択的制限フラグメント増幅
実施例１では、選択的制限フラグメント増幅（ＳＲＤＡ）の原理は、トマトＤＮＡ及び制限酵素ＰｓｔＩを用いて例証されている。本実施例では、２つの制限酵素、ＰｓｔＩ及びＭｓｅＩを使用してＳＲＦＡを説明する。
【００６９】
ＤＮＡの単離及び修飾
全トマトＤＮＡを実施例１に記載の如く、幼葉から単離した。所謂、同一遺伝子系の２対、ＧｅｍＲ及びＧｅｍＳ、各々ＧＣＲ２６及びＧＣＲ１５１［これらの系は、以下の文献に記載されている：Ｄｅｎｂｙ及びＷｉｌｌｉａｍｓ，（１９６２），Ｃａｎ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．４２，６８１−６８５，Ｓｍｉｔｈ及びＲｉｔｃｈｉｅ，（１９８３），Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．１，４１−４５］をＤＮＡ源として使用した。同一遺伝子の各対の２つの個体は遺伝子的に非常に似ているが、真菌病原体Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ａｌｂｏ−ａｔｒａｔｕｍに対する耐性を与える特徴の存在が異なる。
【００７０】
ＤＮＡの修飾の第１段階は、２つの酵素ＰｓｔＩ及びＭｓｅＩでＤＮＡを制限することを含んでいた。ＤＮＡの制限及び続くＤＮＡフラグメントへのアダプターの連結を、ＲＬ−緩衝液（制限−連結緩衝液）と名付けられ、かつ１０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＡｃ／１０ｍＭ ＭｇＡｃ／５０ｍＭ ＫＡｃ／５ｍＭ ＤＴＴ， ｐＨ ７．５を含む同一緩衝液中で実施した。
【００７１】
ＰｓｔＩ及びＭｓｅＩによるＤＮＡの制限
２．５μｇ ＤＮＡ
１２．５単位 ＰｓｔＩ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，１０単位／μｌ）
１２．５単位 ＭｓｅＩ（Ｎ．Ｅ．Ｂｉｏｌａｂｓ，４単位／μｌ）
５μｌ １０×ＲＬ−緩衝液
５０μｌになるまでの量のＨ２Ｏ
インキュベーションを３７℃で１時間実施した。
【００７２】
ＤＮＡの修飾の次段階は、ＤＮＡフラグメントの末端へのアダプター分子の連結である。まず、好適な二重鎖アダプター分子を製造しなければならなかった。
【００７３】
アダプターの製造
ＭｓｅＩアダプター： 5-GACGATGAGTCCTGAG-3
3-TACTCAGGACTCAT-5
【００７４】
このアダプター５０ｐＭｏｌｅ／μｌの溶液を製造するために、
１６マー、5-GACGATGAGTCCTGAG-3 ８μｇ（１４３０ ｐＭｏｌｅｓ）を全容量Ｈ２Ｏ ２８．６μｌ中の１４マー、5-TACTCAGGACTCAT-3 ７μｇ（１４３０ ｐＭｏｌｅｓ）と混合した。
ＰｓｔＩアダプター：5-ビオ-CTCGTAGACTGCGTACATGCA-3
3-CATCTGACGCATGT-5
【００７５】
このアダプター５ｐＭｏｌｅｓ／μｌの溶液を製造するために、ビオチニル化２１マー、5-ビオ-CTCGTAGACTGCGTACATGCA-3 ５．２５μｇ（７１５ ｐＭｏｌｅｓ）を全容量Ｈ２Ｏ １４３μｌ中の１４マー、5-TGTACGCAGTCTAC-3 ３．５μｇ（７１５ ｐＭｏｌｅｓ）と混合した。
【００７６】
アダプター分子の連結
制限ＤＮＡに、以下のもの：
１μｌ ＰｓｔＩ ビオ−アダプター（＝５ ｐＭｏｌ）
１μｌ ＭｓｅＩ アダプター（＝５０ ｐＭｏｌ）
１．２μｌ １０ｍＭ ＡＴＰ
１μｌ １０×ＲＬ−緩衝液
１単位 Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，５単位／μｌ）
１０μｌになるまでの量のＨ２Ｏ
を含む混合物１０μｌを添加した。
【００７７】
得られた反応混合物６０μｌを３７℃で３時間インキュベートした。
【００７８】
制限部位が連結後に修復されないようにアダプターをデザインした。制限酵素が連結反応時にまだ活性であるから、フラグメントコンカテマーが制限され、故に、この方法ではフラグメント−フラグメント連結を避けられた。アダプターはホスホリル化されていなかったので、アダプター−アダプター連結はできなかった（実施例１参照）。
【００７９】
ビオチニル化ＤＮＡフラグメントの選択
２つの制限酵素を使用するＳＲＦＡ用の鋳型−ＤＮＡの製造は、通常、単一酵素を用いるＳＲＦＡを使用する際には使用しない追加の段階を含んでいた。この段階において、ビオチニル化アダプターに連結するＤＮＡフラグメントを他のすべてのフラグメントから分離した。
【００８０】
ビオチニル化フラグメントをこの段階で非−ビオチニル化フラグメント（ＭｓｅＩ−ＭｓｅＩ−フラグメント）から常磁性ストレプトアビジンビーズ（Ｄｙｎａｌ）に結合させることにより分離した。１０μｌビーズを１００μｌ ＳＴＥＸ（１００ｍＭ ＮａＣｌ／１０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ／１ｍＭ ＥＤＴＡ／０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ｐＨ ８．０）中で洗浄し、１４０μｌ ＳＴＥＸ中に再懸濁させた。次いでビーズを連結混合物に添加すると、終容量２００μｌとなった。これを緩やかに撹拌しながら室温で３０分間インキュベートすると、ビオチニル化ＤＮＡフラグメントが正しくビーズに結合できた。マグネットをビーズを含むチューブを近づけることによってこのビーズを集めた。こうすると、上清を他のチューブにピペットで移す際にビーズが移されない。ビーズを１度洗浄し、続いて新しいチューブに移した。次いでビーズを２００μｌ ＳＴＥＸで３回洗浄した。最終的にビーズを２００μｌ Ｔ０１．Ｅ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／０．１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ ８．０）中に再懸濁させ、新しいチューブに移した。ＤＮＡを４℃で保持した。
【００８１】
制限酵素で制限し、アダプターをつけ、常磁性ストレプトアビジンビーズにつけ、上記の如く製造したＭｓｅＩ−ＭｓｅＩフラグメントから精製したＤＮＡを、以下の段階で鋳型ＤＮＡと呼称する。
【００８２】
ＰｓｔＩ−ＭｓｅＩフラグメントの増幅
上記の如く製造した鋳型ＤＮＡは、記載のトマト系からの全ＰｓｔＩ−ＭｓｅＩフラグメント、さらに全く内部ＭｓｅＩ−フラグメントを含まない少量のＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ−フラグメントを含まなければならない。この実験において、これらの多くのＰｓｔＩ−ＭｓｅＩフラグメントが、実施例１に記載の如く本質的に増幅により可視化された。この実施例に記載の方法により得られたフラグメントの種類は実施例１に記載のフラグメントよりもずっと小さかったので、増幅産生物のゲル分析は変性アクリルアミドゲル（Ｍａｘａｍ及びＧｉｌｖｅｒｔ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７４，５６０−５６４）上で実施した。さらにこの種のゲルはレーン１つあたり１００個以上のバンドに分離できた。これは、実施例１に記載のアガロースゲルの約１０倍以上であった。フラグメントは、（γ−３２Ｐ）ＡＴＰ及びポリヌクレオチドキナーゼで５’末端でＰＣＲプライマーの一つを標識することにより可視化できた。
【００８３】
ＰＣＲプライマーの標識
標識用に選択したプライマーは、ＭｓｅＩプライマー１と名付けられた１９マー、５−ＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＴＡＡｇａａ−３であり、選択的ヌクレオチドは小文字で表されている。標識は、以下の方法により実施した。
【００８４】
３．０μｌ １８マー（５０ｎｇ／μｌ＝１５０ｎｇの溶液から）
５．０μｌ （γ−３２Ｐ）ＡＴＰ（１０μＣｉ／μｌ＝５０μＣｉの溶液から）
３．０μｌ ２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ／１００ｍＭ ＭｇＣｌ２／５０ｍＭ ＤＴＴ，ｐＨ ７．５
０．５μｌ Ｔ４−キナーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ １０単位／μｌ）
１８．５μｌ Ｈ２Ｏ
【００８５】
これにより総容量は３０μｌとなり、これを３７℃で３０分間インキュベートした。各ＰＣＲに関しては、この５’標識プライマー１μｌを添加した。
【００８６】
全部で２８回ＰＣＲを実施し、４つの鋳型ＤＮＡを各々７つのプライマーの組み合わせで増幅した。各プライマーの組み合わせは同一ＭｓｅＩプライマー（上記のＭｓｅＩプライマー１）を含んでいたが、ＰｓｔＩプライマーの選択に応じて変動した。全部で７つのプライマーを選択した（ＭｓｅＩプライマーに関しては、選択的ヌクレオチドは小文字で表されている）。
【００８７】
ＰｓｔＩプライマー１：5-GACTGCGTACATGCAGga-3
ＰｓｔＩプライマー２：5-GACTGCGTACATGCAGgt-3
ＰｓｔＩプライマー３：5-GACTGCGTACATGCAGgg-3
ＰｓｔＩプライマー４：5-GACTGCGTACATGCAGag-3
ＰｓｔＩプライマー５：5-GACTGCGTACATGCAGat-3
ＰｓｔＩプライマー６：5-GACTGCGTACATGCAGct-3
ＰｓｔＩプライマー７：5-GACTGCGTACATGCAGta-3
全ＰＳＲプライマーは、濃度５０ｎｇ／μｌでＨ２Ｏに溶解した。
【００８８】
増幅反応
ＰＣＲ混合物は、以下のものを含んでいた。
２．０μｌ 鋳型ＤＮＡ
１．０μｌ ５’標識ＭｓｅＩプライマー（５ｎｇ）
０．５μｌ 未標識ＭｓｅＩプライマー（２５ｎｇ）
０．６μｌ ＰｓｔＩプライマー（３０ｎｇ）
２．０μｌ １００ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ／１５ｍＭ ＭｇＣｌ２／５００ｍＭ ＫＣｌ，ｐＨ ８．５
０．８μｌ ５ｍＭ ｄＮＴＰ
０．１μｌ Ｔａｑ ポリメラーゼ（Ｃｅｔｕｓ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，５単位／μｌ）１３．０μｌ Ｈ２Ｏ
全ての反応成分を添加し、十分に混合し、ＰＣＲの重要成分、通常酵素を最後に添加した。続いて反応をできるだけ迅速に開始した。
【００８９】
増幅をＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ９６００ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ上で実施した。サイクルプロフィールは以下の通りであった。
１サイクル：変性： ９４℃で３０秒
アニーリング： ６５℃で３０秒
伸長： ７２℃で６０秒
１１サイクル：変性： ９４℃で３０秒
アニーリング温度を各サイクルごとに０．７℃ずつ下げて行く。６４．３℃，６３．６℃，６２．９℃，６２．２℃，６１．５℃，６０．８℃，６０．１℃，５９．４℃，５８．７℃，５８．０℃，５７．３℃．各温度で３０秒ずつインキュベートする。
【００９０】
伸長： ７２℃で６０秒
２３サイクル：変性： ９４℃で３０秒
アニーリング： ５６℃で３０秒
伸長： ７２℃で６０秒
【００９１】
増幅フラグメントのゲル分析
反応産物を４．５％変性ポリアクリルアミドゲル上で実施した。５０×３８ｃｍゲルを使用し、これらのゲルを製造するためにゲルカセットをＢｉｏｒａｄから入手した。４．５％ ｗ／ｖ アクリルアミド／０．２２５％ ｗ／ｖ ビスアクリルアミド／７．５Ｍ 尿素／５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／５０ｍＭ ホウ酸／１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ ８．３を含むゲル溶液１００ｍｌを使用した。ゲルにキャストする直前に、１００ｍｌゲル溶液を５００μｌ １０％ 過硫酸アンモニウム及び１００μｌ ＴＥＭＥＤと混合した。Ｔｒｉｓ／ホウ酸／ＥＤＴＡ−緩衝液を電気泳動緩衝液として使用した。これらは１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／１００ｍＭ ホウ酸／２ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ ８．３を含んでいた。反応混合物を９８％ ホルムアミド／１０ｍＭ ＥＤＴＡ／０．０１％ ｗ／ｖブロモフェノールブルー／０．０１％ ｗ／ｖキシレンシアノールの等量（２０μｌ）と混合した。得られた混合物を９５℃で３分間加熱し、次いですぐに氷冷した。各サンプル２μｌをゲル上に載せた。電気泳動時、ゲルに一定の電圧１１０ワットをかけると、一定の発熱（ｔｈｅｒｍａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）があった。これらの条件下のゲルの磁場強度は、４０〜５０ボルト／ｃｍに相当した。
【００９２】
ＳＲＦＡ反応の結果を図１４に示す。レーンを１〜２８まで番号付け、各々、７つのプライマー組み合わせの１つを持つ４種類のトマト系を含んでいる。ゲル上のトマト系の順番は、１．ＧＣＲ２６、２．ＧＣＲ１５１、３．ＧｅｍＲ、４．ＧｅｍＳであった。レーン１〜４はＭｓｅＩプライマー１及びＰｓｔＩプライマー１で増幅したこれらのＤＮＡを含み、レーン５〜８はＭｓｅＩプライマー１及びＰｓｔＩプライマー２で増幅したこれらのＤＮＡを含み、レーンを９〜１２はＭｓｅＩプライマー１及びＰｓｔＩプライマー３で増幅したこれらのＤＮＡを含み、レーン１３〜１６はＭｓｅＩプライマー１及びＰｓｔＩプライマー４で増幅したこれらのＤＮＡを含み、レーン１７〜２０はＭｓｅＩプライマー１及びＰｓｔＩプライマー５で増幅したこれらのＤＮＡを含み、レーン２１〜２４はＭｓｅＩプライマー１及びＰｓｔＩプライマー６で増幅したこれらのＤＮＡを含み、並びにレーン２５〜２８はＭｓｅＩプライマー１及びＰｓｔＩプライマー７で増幅したこれらのＤＮＡを含む。ゲルはサイズマーカーを含まないが、ＤＮＡフラグメントを図の下部に±２００ヌクレオチド、上部に±５００ヌクレオチドに対応して可視化させた。
【００９３】
実施例３
２種の制限酵素を用いた種々のＬＡＣＴＵＣＡ種のＤＮＡの選択的制限フラグメント増幅
実施例２ではトマトＤＮＡにおいて、２種の制限酵素を使用する選択的制限フラグメント（ＳＲＦＡ）増幅の原理を例証した。この実施例においては、同じ２種の制限酵素ＰｓｔＩ及びＭｓｅＩを使用して種々のＬａｃｔｕｃａ種のＤＮＡについても同様の結果が得られることを示す。
【００９４】
ＤＮＡの単離及び修飾
種々のＬａｃｔｕｃａ種の幼葉材料を使用し、実施例１に記載のごとくＤＮＡを単離した。下記に示すように、かかる植物には市販用レタス品種（Ｌ．ｓａｔｉｖａ）と、２種の野生Ｌａｃｔｕｃａ種Ｌ．ｓａｌｉｇｎａ及びＬ．ｖｉｒｏｓａとが含まれていた。植物は下記のごとき恣意的番号で示す。
１．Ｌ．ｓａｌｉｇｎａ，ｎｒ．２１，植物１
２．Ｌ．ｓａｌｉｇｎａ，ｎｒ．２１，植物２
３．Ｌ．ｓａｌｉｇｎａ，ｎｒ．２２，植物１
４．Ｌ．ｓａｌｉｇｎａ，ｎｒ．２２，植物２
５．Ｌ．ｖｉｒｏｓａ， ｎｒ．０１，植物１
６．Ｌ．ｖｉｒｏｓａ， ｎｒ．０１，植物２
７．Ｌ．ｖｉｒｏｓａ， ｎｒ．０２
８．Ｌ．ｖｉｒｏｓａ， ｎｒ．０３，植物１
９．Ｌ．ｖｉｒｏｓａ， ｎｒ．０３，植物２
１０．Ｌ．ｓａｔｉｖａ，市販用バターヘッド（ｂｕｔｔｅｒｈｅａｄ）品種
【００９５】
分析した遺伝物質は、４種の植物で２つの異なる個体を含み、６種の植物タイプを示した。
【００９６】
ＬａｃｔｕｃａＤＮＡを修飾してＳＲＦＡの鋳型を生成するのは、実施例２に記載の方法と同様に実施した。
【００９７】
ＰｓｔＩ−ＭｓｅＩフラグメントの増幅
上述のごとく調製したＤＮＡをＳＲＦＡ反応の鋳型として使用した。１つのＭｓｅＩプライマーと２つの異なるＰｓｔＩプライマーとを用い、２種のプライマーの組合せを使用した。かかるプライマーは下記の通りである（選択的ヌクレオチドは小文字で示した）：
ＭｓｅＩプライマー ：5-GATGAGTCCTGAGTAAaca-3
ＰｓｔＩプライマー１：5-GACTGCGTACATGCAGaa-3
ＰｓｔＩプライマー２：5-GACTGCGTACATGCAGca-3
【００９８】
上記プライマーを使用したＰｓｔＩ−ＭｓｅＩフラグメントの増幅は、実施例２に記載したのと全く同様に実施し、実施例２に記載のごとく変性ポリアクリルアミドゲル上で、生成されたフラグメントを可視化した。得られたバンドパターンを図１５に示す。レーン１〜１０は、ＰｓｔＩプライマー１と組合わせたＭｓｅＩプライマーを用いて増幅したＤＮＡ １〜１０を示し、レーン１１〜２０は、ＰｓｔＩプライマー２と組合わせたＭｓｅＩプライマーを用いて増幅したＤＮＡ １〜１０を示す。ヌクレオチド内のサイズマーカー（この図では見えない）はゲルの右側に示されている。バンドパターンの差異は、種々の植物の類縁関係の差異を反映している。
【００９９】
実施例４：種々の制限酵素の組合せによるトウモロコシ同系交配系の選択的制限フラグメント増幅
実施例２及び３ではそれぞれトマトＤＮＡ及びレタス（Ｌａｃｔｕｃａ種）ＤＮＡを使用し、２種の制限酵素を使用する選択的制限フラグメント（ＳＲＦＡ）増幅の原理を例証した。この実施例においては、トウモロコシ（Ｚｅａトウモロコシ）系においても同様の結果が得られることを示す。更に、種々の制限酵素の組合せを使用し、この場合にはトウモロコシ系のＤＮＡフィンガープリントが得られることも示す。
【０１００】
ＤＮＡの単離及び増幅
番号１及び２を付した２種のトウモロコシ同系交配系を使用した。かかるトウモロコシ系源は、本発明者らの経験によれば選択した任意の系がＳＲＦＡを使用して優れたＤＮＡフィンガープリントを与えるので、重要でない。Ｓａｇｈａｉ−Ｍａｈｏｏｆ ｅｔ ａｌ．，（１９８４），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１，８０１４−８０１８に記載のごとく、幼葉材料からかかる系のＤＮＡを単離した。以下の制限酵素の組合せ（ＥＫｓ）を使用して鋳型ＤＮＡを作製した：ＰｓｔＩ／ＴａｑＩ、ＥｃｏＲＩ／ＴａｑＩ、ＡｓｅＩ／ＴａｑＩ、Ｓｓｅ８３８７−Ｉ／ＴａｑＩ。全ての酵素はＰｈａｒｍａｃｉａから購入したが、但しＡｓｅＩはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから購入し、Ｓｓｅ８３８７ＩはＡｍｅｒｓｈａｍから購入した。鋳型ＤＮＡは実質的に実施例２及び３に記載のごとく調製したが、但し下記の点が異なる。
【０１０１】
まずＴａｑＩと一緒に６５℃で１時間インキュベートし、次いで第２の酵素、即ちＰｓｔＩ、ＡｓｅＩ、ＥｃｏＲＩまたはＳｓｅ８３８７Ｉと一緒に３７℃で更に１時間インキュベートすることにより、ＤＮＡの制限を実施した。アダプターの連結は、下記のアダプターを使用して実施例２に記載のごとく実施した：
ＴａｑＩアダプター：5-GACGATGAGTCCTGAC-3
3-TACTCAGGACTGGC-5
ＰａｔＩ及びＳｓｅ８３８７Ｉアダプター：
5-bio-CTCGTAGACTGCGTACATGCA-3
3-CATCTGACGCATGT-5
ＡｓｅＩアダプター：5-bio-CTCGTAGACTGCGTACC-3
3-CTGACGCATGGAT-5
ＥｃｏＲＩアダプター：5-bio-CTCGTAGACTGCGTACC-3
3-CTGACGCATGGTTAA-5
【０１０２】
制限フラグメントの増幅
実施例２に記載のごとく制限フラグメントを増幅した。増幅産物を標識するために選択したプライマーは、（小文字で示した）３つの選択的ヌクレオチドを有する下記のＴａｑＩプライマーであった：
ＴａｑＩプライマー １．5-TGAGTCCTGACCGAacc-3
（５’標識） ２．5-TGAGTCCTGACCGAaca-3
３．5-TGAGTCCTGACCGAcaa-3
４．5-TGAGTCCTGACCGAcac-3
【０１０３】
上記４つのプライマーを、４種類全ての酵素の組合せを用いた増幅産物の検出に使用した。各酵素の組合せにおいて、他方の酵素に対して４つのプライマーを選択し、各酵素に対して全部で１６種の組合せを与えた。これらのプライマーを下記に示す（選択的ヌクレオチドは小文字で示す）。ＥｃｏＲＩ及びＡｓｅＩに対しては３つの選択的ヌクレオチドを含むプライマーを選択し、ＰｓｔＩに対しては２つの選択ヌクレオチドを含むプライマーを選択し、ＳｓｅＩに対しては単一の選択ヌクレオチドを含むプライマーを選択した。トウモロコシゲノムＤＮＡを切断する頻度の少ない酵素に対しては、選択的ヌクレオチドのより少ない伸長部を含むプライマーを選択した。
ＥｃｏＲＩプライマー：１．5-CTGCGTTACCAATTCcaa-3
２．5-CTGCGTTACCAATTCaca-3
３．5-CTGCGTTACCAATTCaac-3
４．5-CTGCGTTACCAATTCcag-3
ＡｓｅＩプライマー： １．5-GACTGCGTACCTAATaac-3
２．5-GACTGCGTACCTAATaag-3
３．5-GACTGCGTACCTAATacc-3
４．5-GACTGCGTACCTAATgaa-3
ＰｓｔＩプライマー： １．5-GACTGCGTACATGCAGac-3
２．5-GACTGCGTACATGCAGaa-3
３．5-GACTGCGTACATGCAGca-3
４．5-GACTGCGTACATGCAGcc-3
Ｓｓｅ８３８７Ｉプライマー：１．5-GACTGCGTACATGCAGGa-3
２．5-GACTGCGTACATGCAGGg-3
３．5-GACTGCGTACATGCAGGc-3
４．5-GACTGCGTACATGCAGGt-3
【０１０４】
実施例２に記載の方法に従って全部で１２８種のＰＣＲを実施した（２ＤＮＡ×４酵素の組合せ×１６プライマーの組合せ）。これらのＰＣＲ反応産物を実施例２に記載のごとき（４８レーン／ゲルを含む）３種のゲルにおいて分析した。全てのプライマーの組合せで、１レーン当たり５０〜１００バンドのＤＮＡフィンガープリントが得られたが、但しＳｓｅＩ／ＴａｑＩの組合せにおいては１レーン当たり１０〜１５のバンドしか得られなかった。１つのゲルの例を図１６に示す。この図は、ＰｓｔＩ／ＴａｑＩ及びＥｃｏＲＩ／ＴａｑＩの酵素の組合せを用いて得られたＤＮＡフィンガープリントの分析におけるゲルの一部を示している。レーン１〜８はそれぞれＴａｑＩプライマー３とＰｓｔＩプライマー１、２、３及び４とを用いたＳＲＦＡにより得られた２種のトウモロコシＤＮＡのＤＮＡフィンガープリントを示しており、レーン９〜１６はそれぞれＴａｑＩプライマー４とＰｓｔＩプライマー１、２、３及び４とを用いたＳＲＦＡにより得られた２種のトウモロコシＤＮＡのＤＮＡフィンガープリントを示しており、レーン１７はＰｓｔＩを用いて制限したサイズマーカーλＤＮＡを示しており〔ヌクレオチド内のフラグメントの幾つかのサイズは右側に示してある〕、レーン１８〜２５はそれぞれＴａｑＩプライマー１とＥｃｏＲＩプライマー１、２、３及び４とを用いたＳＲＦＡにより得られた２種のトウモロコシＤＮＡのＤＮＡフィンガープリントを示している。
【０１０５】
実施例５：細菌ＤＮＡの選択的制限フラグメント
実施例２、３及び４においてはそれぞれトマト、レタス（Ｌａｃｔｕｃａ種）及びトウモロコシのＤＮＡにおいて、２種の制限酵素を使用する選択的制限フラグメント（ＳＲＦＡ）増幅の原理を例証した。この実施例においては、この方法を使用して細菌ＤＮＡを特性分析し得ることを示す。細菌における本発明方法の有用性を示すため、ベルギーのＧｅｎｔにあるｔｈｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙから多数のＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ株を入手した。
【０１０６】
ＤＮＡの単離及び増幅
全てのＤＮＡは、種々の資源、ほとんどは感染植物から単離したＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ株から調製した。番号１〜２６を付したこれらの株を下記に列挙する。これらの株はベルギーのＧｈｅｎｔにあるｔｈｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙから入手し得る。
【０１０７】
ＤＮＡ 亜種 ｐａｔｈｏｖａｒ 単離体
１． ａｌｂｉｌｉｎｅａｎｓ ４９４
２． ｆｒａｇａｒｉａｅ ７０８
３． ｏｒｙｚａｅ ｏｒｙｚａｅ ５０４７
４． ｏｒｙｚａｅ ｐｏｐｕｌｉ ５７４３
５． ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ ９５８
６． ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ５６８
７． ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ａｌｆａｌｆａｅ ４９７
８． ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｃｏｒａｃａｎａｅ ６８６
９． ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｃｉｔｒｉ ８６５５
１０． ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｃｉｔｒｉ ９６５８
１１． ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｃｉｔｒｉ ９１８１
１２． ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｃｉｔｒｉ ８６５７
１３． ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｃｉｔｒｉ ８６５４
１４． ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｃｉｔｒｉ ８６５０
１５． ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｃｉｔｒｉ ６８２
１６． ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｃｉｔｒｉ ６８１
１７． ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｃｉｔｒｉ ９３２５
１８． ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｃｉｔｒｉ ９３２１
１９． ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｃｉｔｒｉ ９１７６
２０． ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｃｉｔｒｉ ９６７１
２１． ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｃｉｔｒｉ ９６６５
２２． ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｃｉｔｒｉ ９１８２
２３． ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｃｉｔｒｉ ５６８
２４． ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｃｉｔｒｉ ９１６７
２５． ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｃｉｔｒｉ ９１７５
２６． ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｃｉｔｒｉ ９１６０
【０１０８】
上記細菌株のＤＮＡをＭａｒｍｕｒ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３，２０８〜２１８）によって記載されているように単離した。実質的に実施例４に記載のごとくＤＮＡを制限したが、但し制限酵素としてＴａｑＩ及びＡｐａＩを選択した。アダプターの連結は、下記のアダプターを使用して実施例４に記載のごとく実施した：
ＴａｑＩアダプター：5-GACGATGAGTCCTGAC-3
3-TACTCAGGACTGGC-5
ＡｐａＩアダプター：5-bio-TCGTAGACTGCGTACAGGCC-3
3-CATCTGACGCATGT-5
【０１０９】
制限フラグメントの増幅
実施例２に記載のごとく制限フラグメントを増幅した。ＳＲＦＡに選択したプライマーは、ＴａｑＩプライマー 5-CGATGAGTCCTGACCGAg-3（小文字で示した１つの選択的ヌクレオチドを有する）と、ＡｐａＩプライマー 5-GACTGCGTACAGGCCCg-3（小文字で示した１つの選択的ヌクレオチドを有する）であった。実施例２に記載のごとく増幅フラグメントを検出するために、ＡｐａＩプライマーの５’末端を標識した。
【０１１０】
上述のプライマーを使用して２６種のＤＮＡの各々を増幅した。増幅条件は実施例２に記載の通りであったが、但し、実施例２、３及び４の植物ＤＮＡと比較してＤＮＡの複雑性がより低いため、ＰＣＲの最後の９サイクルは省略した。
【０１１１】
この実施例に記載の細菌ＤＮＡを用いて得られたＤＮＡフィンガープリントを図１７に示す。レーン１〜２６は細菌ＤＮＡ１〜２６を示す。ヌクレオチド内のマーカーＤＮＡのサイズ（ゲル上には見えない）はゲルの右側に示されている。この図は、細菌株の類縁関係がバンドパターンの類似性に反映されることを明らかに示している。
【０１１２】
実施例６
２種の制限酵素を用いた種々の動物のＤＮＡの選択的制限フラグメント増幅
先の実施例では種々の資源の植物ＤＮＡにおいて、選択的制限フラグメント増幅（ＳＲＦＡ）を例証した。ここでは、種々の家畜から得られるランダムなＤＮＡ試料を使用し、本発明方法の有効性を説明する。試験した動物種は：Ｇａｌｌｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ（ニワトリ）；Ｓｕｓｓｃｒｏｆａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ Ｌ．（ブタ）；Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ（ウシ）；Ｅｑｕｕｓ ｃａｂａｌｌｕｓ（ウマ）であった。使用した制限酵素はＳｓｅ８３８７Ｉ及びＭｓｅＩであった。
【０１１３】
ＤＮＡの単離及び修飾
Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８９）によって記載された方法に従い、血液試料からＤＮＡを単離した。ＤＮＡ試料１〜３（ニワトリ）、４〜７（ブタ）、８〜１１（ウシ）及び１２〜１５（ウマ）を制限酵素Ｓｓｅ８３８７Ｉ及びＭｓｅＩによって消化した。実施例２に記載のごとく、ＤＮＡフラグメントをアダプターに連結した。制限酵素Ｓｓｅ８３８７Ｉ及びＰｓｔＩは互換性のある３’突出部を生成するので、本発明者らは実施例２に記載のごときＰｓｔＩ及びＭｓｅＩアダプターを使用し得た。
【０１１４】
制限フラグメントの増幅
上記のごとく番号を与え、実施例２に記載のごとく調製した鋳型ＤＮＡはＳＲＦＡ反応における鋳型として作用した。使用したプライマーの組合せは、１つのＭｓｅＩプライマーと異なるＳｓｅＩプライマーからなった：
ＭｓｅＩプライマー： 5-GATGAGTCCTGAGTAAtac-3
Ｓｓｅ８３８７Ｉプライマー１：5-GACTGCGTACATGCAGGaa-3
Ｓｓｅ８３８７Ｉプライマー２：5-GACTGCGTACATGCAGGag-3
【０１１５】
上述のプライマー対を使用したＳｓｅ８３８７Ｉ−ＭｓｅＩフラグメントの増幅は、実施例２に記載の方法を使用して実施した。反応生成物を、実施例２に記載の変性ポリアクリルアミドゲルにおいて試験した。上記試料のフィンガープリントを示すオートラジオグラフを図１８に示す。レーン１〜１５は、Ｓｓｅ８３８７Ｉプライマー１と組合わせたＭｓｅＩプライマーを用いて増幅したＤＮＡ１〜１５のフィンガープリントを示し、レーン１６〜３０は、Ｓｓｅ８３８７Ｉプライマー２と組合わせたＭｓｅＩプライマーを用いて得られた同様のパターンを示している。同一種の動物間のフィンガープリントの差異は動物集団内の不均一性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）を反映しているが、総合的なパターンは特定の種に特徴的である。
【０１１６】
特定の実施態様において、本発明は、所定の特定の（特異的）制限エンドヌクレアーゼに対する制限部位を複数含むと共に、その核酸配列の少なくとも一部分が未知である出発ＤＮＡの少なくとも一部分を制御増幅する方法であって、
（ａ）前記出発ＤＮＡを前記特定の制限エンドヌクレアーゼを用いて消化し、それを、それぞれ５’末端及び３’末端を含む対応する一連の制限フラグメントに断片化し、
（ｂ）後述する５’及び３’アダプターがまだ独立した形態になっていないならば、前記特定のエンドヌクレアーゼに対するただ１つの部位をそのヌクレオチド配列内に含む所定の二重鎖オリゴヌクレオチドリンカーを、前記特定のエンドヌクレアーゼを用いて消化し、それぞれかかる５’及び３’アダプターに切断し、
（ｃ）出発ＤＮＡから得られた制限フラグメントを、それらの５’及び３’末端で、それぞれ前記３’及び５’アダプターに連結し、それによって、タグをそれぞれ５’及び３’末端に有する、出発ＤＮＡのタグ付き制限フラグメント〔そのタグのヌクレオチド配列は、前記特定の制限部位内に含まれるヌクレオチドを含む３’及び５’アダプター配列を含有する〕を生成し、
（ｄ）プライマーに適した鋳型を与えるのに適当であれば、先の連結に先立って前記５’及び３’アダプターが、所定の一定配列のオリゴヌクレオチドセグメントをそれぞれ５’及び３’末端に付加することにより伸長されていない場合、同じ目的で適当であれば、前記タグ付き制限フラグメントの対応末端を前記オリゴヌクレオチドを用いて伸長させ、それによって、前記一定配列によって両末端が伸長されたタグ付き制限フラグメントを得、
（ｅ）前記タグ付きまたは適当であれば伸長された制限フラグメントをハイブリダイジング条件下で２種のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させ、
（ｆ）前記プライマーが、前記タグ付きまたは適当であれば伸長された制限フラグメントの５’及び３’末端の鎖〔それ自体は前記プライマーの鋳型として作用する鎖と相補的である〕の末端部分と同じヌクレオチド配列を有する配列を含む場合、前記プライマーはそれぞれ、鋳型鎖の前記所定の特定の制限エンドヌクレアーゼに対する部位の形成に関与するものと相補的なヌクレオチドを含んでおり、
（ｇ）前記プライマーにハイブリダイズした伸長制限フラグメントを、要求されるヌクレオチド及びポリメラーゼの存在下にＰＣＲまたは同様の方法により増幅し、ハイブリダイズしたプライマーを、該プライマーが最初にハイブリダイズした出発ＤＮＡの制限フラグメントに沿ってそれらの全長にわたって伸長させ、
（ｈ）前記最後に述べた制限フラグメントを同定または回収する
ことからなる。
【０１１７】
本発明方法の特定の実施態様においては、少なくとも１つの前記プライマーの求められる伸長方向で最後のヌクレオチドが、前記特定のエンドヌクレアーゼに対する制限部位内に含まれる最後のヌクレオチドに対応しており、該方法は、増幅された出発ＤＮＡの制限フラグメントを同定または回収することを含む。
【０１１８】
本発明の別の特定の実施態様においては、少なくとも１つの前記プライマーは、増幅ステップの間、対応制限フラグメント内で、前記特定のエンドヌクレアーゼに対する制限部位内に含まれる最後のヌクレオチドを超えて、それ自身の伸長の方向に伸びる所定数（１つまたは幾つか）のヌクレオチドからなる選択された配列を含む。
【０１１９】
上述の方法の特定の実施態様においては、二重鎖ＤＮＡリンカーは、全てが相互に異なる特定のエンドヌクレアーゼに対する部位を幾つか含んでおり、該方法は、同じ出発ＤＮＡにおいて、かかる制限エンドヌクレアーゼの１種と、もう１種の特定のエンドヌクレアーゼとを使用し、他の特定のエンドヌクレアーゼについては、上記説明において定義したようにヌクレオチド配列が選択されたプライマーを使用し、上述のステップを繰り返すことからなる。
【０１２０】
上述の方法または本発明のオリゴヌクレオチドは、同じ生体種由来の所定のＤＮＡ、例えば細菌、植物、もしくはヒトを含む動物のゲノムＤＮＡまたはそのフラグメントにおいて、それらのなかでのまたは対応する所定の標準ＤＮＡに対しての多型現象の同定に適している。これは、調査対象ＤＮＡに該方法を実施する、即ち増幅または伸長反応し得る条件下に該オリゴヌクレオチドと接触させ、前記各ＤＮＡ及び必要によっては前記標準ＤＮＡから出発して得られた制限パターンを比較し、ＤＮＡ多型現象の存在及び適当であればその位置を、種々のＤＮＡの制限フラグメントのサイズ間に認められ差異と相関させることからなる。
【０１２１】
本発明は更に、その種々のフラグメントが、未切断出発ＤＮＡの初期消化物〔これは、同じ所定の特定のエンドヌクレアーゼを用いて当該ＤＮＡから生成される〕に対応する配列を有するフラグメント化ＤＮＡであって、前記フラグメントの全てが５’及び３’末端にそれぞれ、所定アダプター〔つまり、前記特定のエンドヌクレアーゼに対するただ１つの制限部位を当初含んでいた同じ出発ＤＮＡリンカーの切断部分に対応し、更に必要によっては所定の一定配列を用いて伸長された、所定の３’及び５’アダプター〕によってタグが付けられていることを特徴とするフラグメント化ＤＮＡに係わる。フラグメント化ＤＮＡは、フラグメントを電場の作用下に最初に移動させた適当な支持体、例えばゲル支持体上の移動バンドパターンの形態であり得る。
【０１２２】
フラグメント化ＤＮＡは更に、５’末端から出発して下記の組成を特徴とするオリゴヌクレオチドを含む末端部分を含み得る：
（ｉ）アダプターとして使用される所定のＤＮＡ配列と相補的な、１０塩基以上且つ３０塩基以下のヌクレオチド配列（一定配列）、この直ぐ後に、
（ｉｉ）ヌクレオチド配列またはその一部が（ｉｉ）に含まれない限り、ステップ（ａ）で使用された特定の制限エンドヌクレアーゼのターゲット部位と相補的なヌクレオチド配列、この直ぐ後に、
（ｉｉｉ）選択された１以上且つ１０未満、例えば長さ１〜５のヌクレオチド配列。
【０１２３】
本発明は、少なくとも１つの特定の制限エンドヌクレアーゼによって所定のＤＮＡをフラグメントに断片化し、かかるフラグメントを分析するためのキットであって、次のものを含む。
【０１２４】
−特定の制限エンドヌクレアーゼ；
−前記特定のエンドヌクレアーゼに対するただ１つの部位をそのヌクレオチド配列内に含み、それによって、それぞれ対応する５’及び３’アダプターに切断される二重鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドリンカーであって、あとでこのキットのＰＣＲプライマー用鋳型を与え得る５’及び３’部分を与えるに十分なサイズを有する二重鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドリンカー；
−一方では、あとで該プライマーの鋳型として作用する鎖と相補的な５’及び３’アダプターの鎖と同じ配列をそれぞれ有するＰＣＲプライマーであって、更に、鋳型鎖内の前記所定の特定の制限部位に対する部位の形成に関与するものと相補的なヌクレオチドを含むプライマー；
−前記リンカーを前記特定の制限エンドヌクレアーゼによって消化してそれぞれ前記５’及び３’アダプターを作製する前に、前記５’アダプターの５’末端もしくは前記３’アダプターの３’末端または両方を伸長するために、或いは、前記５’及び３’アダプターを出発ＤＮＡのフラグメントの末端に連結してその後得られたタグ付きフラグメントの伸長のため、前記プライマーを用いたハイブリダイゼーションに十分な長さの部位を生成するための所定（一定）配列のオリゴヌクレオチドセグメント（適当な場合）；
−前記特定のエンドヌクレアーゼを用いて消化することにより得られる、断片化試験を実施する所定のＤＮＡに対応するフラグメント化標準ＤＮＡ（必要による）。
【０１２５】
上記キットの特定の実施態様は、前記５’及び３’アダプターまたはタグ付きＤＮＡフラグメントの５’及び３’末端の伸長のための前記オリゴヌクレオチドセグメントが同一のヌクレオチド配列を有するものである。
【０１２６】
別の実施態様においては、該キットのリンカーは、全てが相互に異なる特定のエンドヌクレアーゼに対する固有の部位を幾つか含んでおり、該キットは更に、前記種々の特定のエンドヌクレアーゼを用いて前記リンカーを切断することによりそれぞれ形成される３’及び５アダプターの各々に対応するプライマーを含んでいる。これらのプライマーは、前記リンカーにおいて、前記特定のエンドヌクレアーゼの各々により切断することにより生成される３’及び５’アダプターに関して、請求項８に記載のようなものである。
【０１２７】
特定の実施態様においては、キットは対応する特定の制限エンドヌクレアーゼに関して上述のごときフラグメント化標準ＤＮＡを含み得、各フラグメント化標準ＤＮＡは、所定の特定の制限酵素の各々に関係している。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】ゲノムＤＮＡ分子を制限酵素で切断して得られた標識制限断片の一般的なＰＣＲ増幅法の概略図である。
【図２】制限断片の異なる末端、すなわちフラッシュ末端およびスタッガー末端に対するアダプターの結合を示す。
【図３】標識制限断片のＰＣＲ増幅を示し、ボックス領域は制限断片に結合するアダプターとＰＣＲ増幅に用いるプライマーとを示し、矢印はＤＮＡ合成の方向を示す。
【図４】標識制限断片のＰＣＲ増幅に関する概略図を示す。
【図５】標識制限断片のＰＣＲ増幅に用いる選択的プライマーの一般的設計を示し、矢印は制限断片の各末端における逆反復配列を示し、プライマーの選択性についてはそれぞれ選択的塩基配列と制限断片鋳型ＤＮＡの配列との間に完全な整合および全体的な不整合が存在する２つの例で示す。
【図６】アダプター配列に隣接してトリヌクレオチド配列を有する鋳型ＤＮＡ分子を選択するＰＣＲプライマーを用いた選択的ＰＣＲ増幅の原理を示す。
【図７】標識制限断片の選択的ＰＣＲ増幅を示す。
【図８】それぞれ６個の選択的塩基からなる２個のＰＣＲプライマーの組合せ物を用いた断片特異的増幅の原理を示し、各プライマーは制限断片の異なる鎖中に二本鎖構造を形成し、これによってＤＮＡ合成を開始させうるプライマー／鋳型複合体を形成する（矢印で示す）。
【図９】選択的制限断片増幅の方法により認識される一般的な配列要素を示し、図はさらに、認識される２つのヌクレオチド配列およびこれら２つの配列を分離する間隔を含む。
【図１０】増幅された断片長さ多形性の確認方法で検出されるヌクレオチド配列変化の種類を示す。
【図１１】選択性を増大するプライマーを用いるＰｓｔＩで制限したトマトＤＮＡの増幅結果の分析を含む１．０％アガロースゲルを示す。
【図１２】図１２は、断片特異的プライマーを用いるトマトＤＮＡの３種の異なるＰｓｔＩ断片に関する特異的増幅結果の分析を含む１．０％アガロースゲルを示す。
【図１３】２種のトマト品種の選択的制限断片増幅により得られるＤＮＡフィンガプリントを有する２．５％ポリアクリルアミド／１％アガロースゲルを示す。
【図１４】酵素組合せＰｓｔＩ／ＭｓｅＩと共にＳＲＦＡを用いる４種のトマト品種のＤＮＡフィンガプリントを有する４．５％変性ポリアクリルアミドゲル部分を示す。
【図１５】酵素組合せＰｓｔＩ／ＭｓｅＩと共にＳＲＦＡを用いる１０種のＬａｃｔｕｃａ品種のＤＮＡフィンガプリントを有する４．５％変性ポリアクリルアミドゲル部分を示す。
【図１６】酵素組合せＰｓｔＩ／ＴａｑＩおよびＥｃｏＲＩ／ＴａｑＩと共にＳＲＦＡを用いる２種のコーン品種のＤＮＡフィンガプリントを有する４．５％変性ポリアクリルアミドゲル部分を示す。
【図１７】酵素組合せＡｐａＩ／ＴａｑＩと共にＳＲＦＡを用いる２６種のキサントモナス・キャンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）株のＤＮＡフィンガプリントを有する４．５％変性ポリアクリルアミドゲル部分を示す。
【図１８】酵素組合せＳｓｅＩ／ＭｓｅＩと共にＳＲＦＡを用いる４種の家畜動物、すなわちニワトリ、ブタ、ウシおよびウマの種々異なる個体のＤＮＡフィンガプリントを有する４．５％変性ポリアクリルアミドゲル部分を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、限定はしないが植物および動物の育種、品種もしくは栽培変種の同定、診断医薬、動物および植物における病気の診断、ヒトにおける遺伝病の同定、家族関係の分析、法医学的分析および微生物分類を包含する種々異なる多くの分野におけるＤＮＡフィンガプリント法およびＤＮＡマーカーの使用に関する。
【０００２】
より詳細には本発明は、ＤＮＡフィンガプリント法（ＤＮＡ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ）および微生物から高等な植物、動物およびヒトに至る範囲のゲノムにおける特定ＤＮＡマーカーの検出方法に関する。さらに本発明は、種々異なる応用分野にて本発明の方法に使用される合成ＤＮＡ分子およびそれに基づく生産物に関する。
【背景技術】
【０００３】
１．ＤＮＡフィンガプリント法
ＤＮＡフィンガプリントまたはＤＮＡ分類、並びに他の遺伝子型分類や特性化やＤＮＡ同定の方法は個人、変種もしくは種族または品種の遺伝子構成もしくはゲノムにおける類似性または１つ以上の区別的な特徴を特性化することを意味する。一般的規則は遺伝子関係が近縁であるほど同一性が大となり或いはゲノムの類似性が一層充分となり、その結果ゲノムにおける区別的な特徴がより稀となる。これらの類似した或いは区別的な特徴は、ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで切断した後に生物のＤＮＡを分析して示すことができる。制限エンドヌクレアーゼは、短いヌクレオチド配列（一般に長さ４〜８塩基）を認識すると共に２個のＤＮＡ鎖を切断して別個の長さを有するＤＮＡ断片を生成させる酵素である。制限エンドヌクレアーゼは、その高度の配列特異性により、ＤＮＡ分子を極めて特異的に切断する。その結果、再現しうるＤＮＡ断片群が生成される。ＤＮＡ断片は、その長さに応じ多孔質マトリックスもしくはゲルで分画して典型的なバンドパターンを生じ、生物の遺伝子構成におけるＤＮＡフィンガプリントを構成することができる。
【０００４】
２．ＤＮＡ多形性
極めて近縁の品種、変種もしくは種族のフィンガプリントを比較すると、ＤＮＡフィンガプリントは同一であるか或いは極めて類似する。同一のＤＮＡフィンガプリントにも拘らず相違点が観察される場合、これら相違点はＤＮＡ多形性と呼ばれる。これらは、フィンガプリントに出現する新たなＤＮＡ断片である。ＤＮＡはその位置にて多形性であると言われ、この新規なＤＮＡ断片はＤＮＡマーカーとして使用することができる。制限酵素切断により得られるＤＮＡフィンガプリントで検出されるＤＮＡ多形性は、制限エンドヌクレアーゼ標的部位を破壊する突然変異、新規な標的部位を形成する突然変異、挿入、欠失または２つの制限部位の間の逆位のようなＤＮＡ配列における変化から生じうる。
【０００５】
この種のＤＮＡ多形性は一般にＲＦＬＰ、すなわち制限断片長さ多形性と呼ばれる。この種の突然変異的変化は、メンデルの法則で遺伝する場合、真正な遺伝子マーカーとして挙動する。その結果、ＤＮＡ多形性を他の遺伝子マーカーと全く同様に血統分析、形質の遺伝に関する遺伝子研究、個体の同定などに遺伝子マーカーとして使用することができる。
【０００６】
３．ＤＮＡフィンガプリント技術
ウィルスを除く殆ど全ての生存する生物につき、これら生物の全ゲノムＤＮＡの制限消化物は、個々のバンドを評価することができないほど多くのバンドをもたらす。したがって、全てのＤＮＡフィンガプリント法は、小割合のＤＮＡ断片のみを可視化させてＤＮＡフィンガプリントを構成する単純なバンドパターンを得ると言う原理に基づいている。
【０００７】
最も広く使用されている方法は、生物のＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで消化し、制限断片をゲル電気泳動により分画し、分画されたＤＮＡ断片を膜上に移動させると共に結合させ、次いでこの膜を特定ＤＮＡ断片（「プローブ」）とハイブリダイズさせることを含む。ＤＮＡ断片は二本鎖ＤＮＡ分子を形成すると共に、膜上のＤＮＡ断片は相補的ヌクレオチド配列を有する。プローブを可視化可能なマーカーで標識すれば、プローブが結合したＤＮＡ断片を可視化することができる。この手法は一般に「サザンハイブリダイゼーション」と呼ばれる。近縁のゲノムＤＮＡ分子においてプローブが結合した対応の制限断片の寸法に差が観察されれば、これらの差はＤＮＡ多形性、より詳細には制限断片長さ多形性と呼ばれる。制限断片長さの差は、ＤＮＡプローブにより認識される遺伝子座の種々異なる対立型に対応する。ＤＮＡフィンガプリント法のためのサザンハイブリダイゼーションも広く使用されているが、この方法は面倒であって時間がかかる。
【０００８】
さらに、この方法は解像能が低く、せいぜい単一の反応における単一の遺伝子座もしくは２〜３の遺伝子座を評価するにしか使用することができない。
【０００９】
４．ポリメラーゼ連鎖反応
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術は、インビトロにて特定ＤＮＡ断片を合成するための方法である。この方法は、ＤＮＡ分子上の独特の配列に結合する特定のオリゴヌクレオチドおよび熱安定性のＤＮＡポリメラーゼを使用することに基づく。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡの対向鎖にアニールしてそれぞれ新たなＤＮＡ鎖の合成を指令するようＤＮＡ合成反応でプライマとして作用するように設計される。したがって、１ラウンドの合成においてはプライマー間でＤＮＡ分子の完全コピーが作成され、プライマー間のＤＮＡが複製される。各ラウンドのＤＮＡ合成の結果、二倍量のＤＮＡが生じて２個のプライマー間で構成されるＤＮＡの増幅をもたらす。その結果、ＰＣＲ技術は少量の「基質ＤＮＡ」を用いて正確なＤＮＡセグメントを合成することを可能にする。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、生物のＤＮＡを少なくとも１種の制限酵素で切断した後に得られる制限断片をＰＣＲ法により増幅させる新規な方法を提供する。この新規なＰＣＲ法の使用において、使用するオリゴヌクレオチドは公知のＤＮＡ配列には指向せずに制限断片の末端を識別するように設計される。このためには、オリゴヌクレオチドリンカー（もしくはアダプタ）を制限断片の末端に付加させることにより該末端を改変する必要がある。この理由は、制限酵素の末端が一般に極く僅かのヌクレオチド（すなわち２〜８個のヌクレオチド）しか持たず、ＰＣＲ増幅用のプライマーを設計するために使用するには短か過ぎるからである。
【００１１】
本発明は、ゲノムＤＮＡ分子を制限エンドヌクレアーゼで消化して得られたＤＮＡ断片の複雑な混合物から１個もしくはそれ以上の制限断片を増幅させるためのポリメラーゼ連鎖反応技術（ＰＣＲ）の新規な使用に基づく。本発明の１つの特定の利点は、制限断片の５’および３’末端におけるヌクレオチド配列が決定されない状況においてＤＮＡ制限断片の増幅を可能にすることである。このような場合、増幅すべき制限断片の各鎖にハイブリダイズする通常の配列特異的プライマーは規定することができず、したがって増幅目的に当業界で知られた方法を使用することができない。
【００１２】
本発明の方法はたとえば２種の異なる方法で使用することができ、２種の異なる使用をもたらす：
（１）ＰＣＲ技術により増幅すべき１個もしくはそれ以上の制限断片のサブセットをランダムに選択することによるゲノムのＤＮＡフィンガプリント法。さらに本発明は、上記方法に用いるための合成オリゴヌクレオチドをも包含し、さらにこれら方法は法医学的型分類、微生物同定、変種同定、血統分析、および遺伝子形質に関連したＤＮＡマーカーのスクリーニング等に使用とすることができる。
（２）多形性でありうる１種もしくはそれ以上の予備選択されたＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅により同定するための方法。さらに本発明は、前記方法に使用するための特定の合成オリゴヌクレオチドをも包含し、さらにこれら方法はヒトの遺伝病のスクリーニング、植物および動物の育種における耕種学的形質の遺伝の監視、および病気における感染物質の検出等に使用することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
１．定義
以下の説明および実施例においては多くの用語を使用する。これら用語に与えるべき範囲を含め本明細書および請求の範囲を明瞭かつ一貫して理解するため、次の定義を設ける。
−制限エンドヌクレアーゼ：制限エンドヌクレアーゼもしくは制限酵素は二本鎖ＤＮＡ分子における特定塩基配列（標的部位）を認識する酵素であって、各標的部位にてＤＮＡ分子の両ストランドを切断する。
−制限断片：制限エンドヌクレアーゼによる切断により産生されるＤＮＡ分子を制限断片と称する。任意所定のゲノムは特定の制限エンドヌクレアーゼにより個々の制限断片群に消化される。制限エンドヌクレアーゼ切断によって生ずるＤＮＡ断片を分離して、ゲル電気泳動により検出する。
−制限断片長さ多形性（ＲＦＬＰ）：たとえば２種の近縁生物のゲノムＤＮＡは、多くの部位でそのヌクレオチド配列組成の相違点を示す。これらの相違点が制限エンドヌクレアーゼに関する標的部位に存在すれば、改変された標的部位はその箇所で切断されないだろう。同様に、ヌクレオチド配列変化は他の生物には存在しない新たな標的部位を導入し、その箇所で制限酵素によるＤＮＡの切断を引き起こす。或いは、１種の生物で生ずる、制限エンドヌクレアーゼ用の２つの標的部位の間でのヌクレオチドの挿入もしくは欠失は、これら標的部位の間の間隔を改変する。このために、２種の生物ＤＮＡの消化により異なる長さを有する制限断片が生成する。２種の生物のＤＮＡの消化によって生ずる制限断片の長さに多形性が生ずる。
【００１４】
−ゲル電気泳動：制限断片を検出するため、寸法を基礎とした二本鎖ＤＮＡ分子を分画する分析法が必要とされる。この種の分画を達成する最も一般的に用いられる技術は電気泳動である。この種のゲル内でＤＮＡ断片が移動する速度はその寸法に依存する。したがって移動距離は、断片長が増大するにつれて減少する。ゲル電気泳動により分画されたＤＮＡ断片は、パターンに含まれる断片の個数が少なければ染色法によって直接可視化することができる。
【００１５】
−合成オリゴヌクレオチド：好ましくは約１０〜約５０塩基を有する化学的に合成しうる一本鎖ＤＮＡ分子を合成オリゴヌクレオチドと称する。一般に、これら合成ＤＮＡ分子は独特のヌクレオチド配列を有するよう設計されるが、関連配列を有すると共にヌクレオチド配列内の特定位置に異なるヌクレオチド組成を有する分子ファミリーを合成することもできる。合成オリゴヌクレオチドと言う用語は、独特なヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子を意味するよう用いられる。混合合成オリゴヌクレオチドと言う用語は、関連する合成オリゴヌクレオチドのファミリーを意味すべく用いられる。
【００１６】
−連結：２個の二本鎖ＤＮＡ分子を互いに共有結合させる酵素リガーゼによって触媒される酵素反応を連結（ｌｉｇａｔｉｏｎ）と称する。一般に両ＤＮＡ鎖は互いに共有結合するが、一方の末端の化学的もしくは酵素的改変により２個のストランドの一方の連結を防止することもできる。その場合、２個のＤＮＡ鎖の一方にのみ共有結合が生ずる。
【００１７】
−アダプター：たとえば長さ１０〜３０塩基対のような限られた個数の塩基対を有する、制限断片の末端に連結しうるよう設計される短い二本鎖ＤＮＡ分子をアダプターと称する。これらアダプターは、部分的に互いに相補的であるヌクレオチド配列を持った２個の合成オリゴヌクレオチドで構成される。２個の合成オリゴヌクレオチドを混合すれば、適当な条件下で溶液中で二本鎖構造が形成されるだろう。アダプター分子の一方の末端は制限断片の末端に連結しうるよう設計され、他方の末端は連結しえないよう設計される。
【００１８】
−ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）：インビトロにて基質ＤＮＡからＤＮＡ断片を合成する酵素反応をＰＣＲと称する。この反応は、数百〜数千塩基対という短い間隔で分離されるＤＮＡ分子におけるヌクレオチド配列に相補的な２個の合成オリゴヌクレオチドの使用、および熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの使用を含む。連鎖反応は、たとえば１０〜３０サイクルのシリーズで構成される。各サイクルでは、先ず最初に基質ＤＮＡを高温度で変性させる。冷却した後、大過剰で存在する合成オリゴヌクレオチドは、溶液中の基質ＤＮＡ分子と、相補的ヌクレオチド配列を有する基質ＤＮＡ分子上の特定部位で二本鎖構造を形成する。次いでオリゴヌクレオチド−基質ＤＮＡ複合体はＤＮＡポリメラーゼにより触媒されるＤＮＡ合成反応の開始部位として作用し、その結果、基質ＤＮＡ鎖に相補的な新たなＤＮＡ鎖が合成される。
【００１９】
−ＤＮＡ増幅：ＤＮＡ増幅と言う用語は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いるインビトロでの二本鎖ＤＮＡ分子の合成を意味すべく使用される。ＰＣＲ反応の生成物を増幅ＤＮＡ断片と称する。
【００２０】
−プライマー：一般に、プライマーと言う用語はＤＮＡの合成を開始させうるＤＮＡ鎖を意味する。ＤＮＡポリメラーゼはプライマーなしには新たにＤＮＡを合成することができない。これらは存在するＤＮＡ鎖を、組立てるべきヌクレオチドの順序を指令する鋳型として相補鎖が使用される反応において伸長させうるだけである。ＰＣＲ反応に使用される合成オリゴヌクレオチド分子をプライマーと呼ぶ。
【００２１】
−サザンハイブリダイゼーション：サザンブロッティングとも称するサザンハイブリダイゼーションの目的は、アガロースゲル電気泳動により分画されたＤＮＡを、分画過程から生じたＤＮＡ断片の相対位置を保持させながら、たとえばナイロン膜もしくはニトロセルロース紙のような支持体上に物理的に移動させることにある。アガロースゲルから支持体への移動を達成すべく用いられる方法は、ＤＮＡをゲルから支持体中へ毛細管作用により移動させることである。
【００２２】
−核酸ハイブリダイゼーション：核酸ハイブリダイゼーションは、たとえばナイロン膜もしくはニトロセルロース紙のような支持体上で一本鎖ＤＮＡのハイブリダイゼーションにより関連ＤＮＡ配列を検出するために用いられる。相補的塩基配列を有する核酸分子は、適切な条件下で溶液中にて混合すれば二本鎖構造を再形成する。二本鎖構造は、たとえ一方が支持体に固定化されたとしても２個の相補的一本鎖核酸の間で形成される。サザンハイブリダイゼーション法においては後者が生ずる。
【００２３】
−ハイブリダイゼーションプローブ：サザンハイブリダイゼーション法で特定のＤＮＡ配列を検出するには、標識されたＤＮＡ分子またはハイブリダイゼーションプローブをたとえばナイロン膜もしくはニトロセルロースフィルターのような支持体に結合した分画ＤＮＡに対し反応させる。標識されたＤＮＡプローブに相補的なＤＮＡ配列を有するフィルター上の領域は、再アニーリング反応の結果としてそれ自身も標識される。次いでこの種の標識を示すフィルターの領域を、用いる標識の種類に応じて検出することができる。ハイブリダイゼーションプローブは一般に、トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）ゲノムからの特定ＤＮＡ配列の分子クローニングによって生成される。
【００２４】
［発明の実施の形態］
２．好適実施態様の説明
本発明はより詳細には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を長さ多形性（ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）を含む制限断片多形性（ＲＦＰ）の検出に用いうる方法および手段に関する。本発明はＲＦＰを検出する方法、本発明の方法に使用するための合成オリゴヌクレオチド、ＲＦＰを検出するための手段を含むキット、並びに植物および動物の育種、遺伝病の診断、生物の同定、および法医学的型分類などへの本発明の方法および手法の使用を包含する。
【００２５】
詳細には本発明は、個々のゲノム制限断片または、任意の生物、微生物、植物、動物もしくはヒトからの個々に１個もしくはそれ以上の特定の形質に遺伝子的に関連し或いは総合的に生物、変種もしくは個体を同定すべく使用しうるゲノムのフィンガプリントを与える１群のゲノム制限断片を同定するための手段を提供する。
【００２６】
制限断片の産生および同定のための本発明による一般的方法は制限エンドヌクレアーゼの使用、制限断片に対する合成オリゴヌクレオチドの結合、および制限断片のＰＣＲ増幅（図１）を含む。制限エンドヌクレアーゼは特定部位、すなわち標的部位でゲノムＤＮＡ分子を切断することにより制限断片を生成させる。
【００２７】
制限断片における末端のヌクレオチド配列が既知であってもなくても制限断片のＰＣＲ増幅は、本発明によれば、先ず最初に合成オリゴヌクレオチド（アダプター）を制限断片の末端に結合させてＰＣＲ増幅で使用されるプライマーのアンカー塩基として作用する２個の共通標識を各制限断片に付与することにより達成することができる。
【００２８】
典型的には、制限酵素は両ストランドの末端ヌクレオチドが塩基対形成するフラッシュ末端（ｆｌｕｓｈ ｅｎｄｓ）、または２本のストランドの一方が突出して短い一本鎖伸長を与えるスタッガー末端（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ ｅｎｄｓ）をもたらす（図２）。フラッシュ末端を有する制限断片の場合は、アダプターを１フラッシュ末端と共に使用する。スタッガー末端を有する制限断片の場合は、制限断片の一本鎖伸長に相補的である一本鎖伸長を持ったアダプターを使用する。その結果、それぞれの種類の制限断片につき特定アダプターを使用し、これらアタプターは一方の末端においてのみ相違してアダプターを制限断片に連結させうるようにする。典型的には、用いるアダプターは互いに部分的に相補的な２種の合成オリゴヌクレオチドで構成され、これらオリゴヌクレオチドは一般に長さ約１０〜３０ヌクレオチド、好ましくは長さ１２〜２２ヌクレオチドであると共に、溶液中で互いに混合すれば二本鎖構造を形成する。酵素リガーゼを用いて各アダプターを制限断片の混合物に連結させる。制限断片に対し大モル過剰のアダプターを用いれば、全制限断片が両末端でアダプターを保持して終端するよう確保される。この方法により作成される制限断片を標識制限断片と称し、この方法をさらに制限断片標識化と称する。
【００２９】
これらアダプターはかくして、後続のＰＣＲ増幅反応に用いる上記特徴を備えたプライマーの鋳型として使用することができる。本発明の好適具体例において、制限断片はその両末端に同じアタプターを有し、単一のＰＣＲプライマーを用いて図３に示すように制限断片を増幅することができる。この種の場合、全制限断片が同様に標識されるので、標識制限断片の混合物のＰＣＲ増幅は同時様式（ｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓ ｆａｓｈｉｏｎ）で全制限断片を増幅することが明らかである。２種の異なる制限酵素を用いてＤＮＡを切断する他の具体例においては、２種の異なるアダプターを制限断片の各末端に連結させる。この場合、２種の異なるＰＣＲプライマーを用いてこの種の制限断片を増幅することができる。２種の制限酵素を用いる他の好適具体例においては、一方の酵素末端に対するアダプターをビオチニル化する。これは制限断片の複雑な混合物からこの制限酵素用に少なくとも１端部を有する制限断片を選択することを可能にし、その際ビオチニル化された分子を分離する常法を用いる。この工程は制限断片の出発混合物の複雑性を減少させると共にＰＣＲ増幅に先行する濃縮工程を構成し、或る場合にはこれによってバックグランドを減少させる。数種の異なる断片の同時的増幅はしばしば多重ＰＣＲと呼ばれる。多重制限断片増幅の原理については図４に示す。
【００３０】
さらに本発明は制御された増幅が可能となるようＰＣＲ増幅反応を指令するための特異的に設計されたプライマーおよび特定の方法に基づくものであって、本発明の特定具体例によれば小サブセットの標識制限断片のみが増幅されるようにする。
【００３１】
一般にゲノムＤＮＡ、特に動物、植物もしくはヒトのゲノムＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ消化物は極めて多数の制限断片をもたらす。制限断片の個数はゲノムの寸法、並びにゲノムにおける制限エンドヌクレアーゼ標的部位の存在頻度に依存し、この存在頻度は次いで主として標的部位におけるヌクレオチドの数により決定される。一般的に使用される制限エンドヌクレアーゼの標的部位におけるヌクレオチドの数は４〜８個の範囲である。生物のゲノム寸法は、微生物の場合における数百万塩基対から動物および植物における数千万塩基対の範囲で広範囲に変化することができる。したがって、制限酵素によりゲノムＤＮＡ分子を切断した後に得られる制限断片の個数は数百〜数百万の範囲で変化することができる。一般に制限断片の個数は、ゲル電気泳動により分画されたゲノムＤＮＡ消化物において個々の制限断片を同定しえないほど大である。この種の消化物は一般にバンドの汚れをもたらす。
【００３２】
したがって標識制限断片のＰＣＲ増幅は、全断片が同時的にＰＣＲ反応で同時増幅するため、バンドの汚れをもたらす。大寸法のゲノムＤＮＡに対し適用しうる本発明の好適具体例においては、増幅すべき制限断片の個数を制限する一般的原理を用いた。これは、比較的少数の標識制限断片のみがＰＣＲ増幅反応に際し増幅されるようサブセットの標識制限断片を予備選択することにより行われる。
【００３３】
本発明のこの具体例で規定される選択的原理は、図５に示すように、ＰＣＲ増幅用のプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドの設計である。
【００３４】
標識制限断片は次の一般的構造を有する：逆ＤＮＡ配列（一定配列）により両側にフランキングする可変ＤＮＡ配列（標識前の制限断片に対応）。逆ＤＮＡ配列（一定ＤＮＡ配列）は、制限エンドヌクレアーゼの標的配列の部分と制限断片の両末端に結合したアダプターの配列の部分で構成される。一定ＤＮＡ配列の間に含まれる制限断片の可変配列は一般に未知であり、したがってランダム配列組成を有する。その結果、一定ＤＮＡ配列にフランキングするヌクレオチド配列は制限断片の大混合物中で全体的にランダムである。
【００３５】
したがって本発明は一定ヌクレオチド配列部分を含む特定ＰＣＲプライマーをも提供し、さらに得られる制限断片の制限サブセットの増幅に依存する本発明の実施態様においては可変配列部分をも含む。一定配列部分においてヌクレオチド配列は、プライマーが制限断片の末端における一方のＤＮＡ鎖の一定ＤＮＡ配列と完全に塩基対形成するよう設計される。可変配列部分は、選択した１〜１０塩基の範囲のランダムに選択したヌクレオチド配列で構成される。
【００３６】
「可変配列（ｖａｒｉａｂｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」と言う用語は一層正確には、サブセットの制限断片を増幅する目的で一定に留まる配列を形成する選択ヌクレオチドよりなる配列を意味する。本発明の特定具体例においては、選択塩基よりなる数種の配列を用いて数種の別個のプライマーを規定することができる。この種の場合、プライマーは同じ一定配列と、形成されるプライマー間で異なる選択塩基により構成される可変配列とを有することができる。
【００３７】
ＰＣＲ工程で増幅される標識制限断片の予備選択を指令するのは、プライマーの３’末端へのこれら可変（選択）配列の付加である。ＰＣＲ反応を適する条件下で行う場合、プライマはこれら標識制限断片に対しＤＮＡ合成のみを開始させ、ここで可変ＤＮＡ配列は図５に示したように標識制限断片の鋳型ストランドと完全に塩基対を形成することができる。
【００３８】
選択は、プライマーの可変配列部分に存在するヌクレオチドの数により決定される。プライマーの選択性は可変（選択）配列部分におけるヌクレオチド数に伴って増加する。さらに選択性塩基と言う用語は可変配列部分におけるヌクレオチドを意味し、これら塩基の選択がプライマーを選択性にすることを示す。使用したプライマーの選択性塩基が断片の末端にて両相補的配列を認識する場合、標識制限断片のみが増幅されることを理解されねばならない。プライマーが１末端にのみ適合（ｍａｔｃｈ）してアニーリングする場合、増幅は対数的でなく直線的となり、生成物は未検出のままとなろう。
【００３９】
予め異なる個数の選択性塩基を有する可変配列で得られる選択性の程度を推定することができ、一般式４２ｎ［ここでｎは選択性塩基の個数に等しい］を用いる。１個の選択性塩基を用いて１６個の標識断片のうち１個が増幅され、２個の選択性塩基を用いて２５６個のうち１個が増幅され、３個の選択性塩基を用いて４，０９６個のうち１個が増幅され、さらに４個の選択性塩基を用いて６５，５３６個のうち１個が増幅され、以下同様である。本発明の１好適具体例は、用いる制限酵素により生成される断片の個数とは無関係に、ランダムサブセットの標識制限断片を任意のゲノムＤＮＡ消化物から選択的に増幅することを可能にする。
【００４０】
好適具体例において、選択性ヌクレオチドの個数は、増幅される制限断片の個数を５〜２００個に制限するよう選択される。この個数は断片の個数を４２ｎで割算して計算しうるが、正確な予測は可能でない。何故なら、必ずしも全ての制限断片を等しい効率で増幅しえないからである。したがって、実際には理論的に予想されるよりも少ない断片が増幅される。さらに、２種（もしくはそれ以上）のプライマーの混合物を用いうることも指摘すべきである。これは各プライマーにより認識される断片の増幅を可能にし、さらに２個のプライマーにより認識される断片の増幅を可能にする。最後に、プライマーの選択性ヌクレオチドと相補的鋳型との間の塩基対形式に基づく選択は、ＰＣＲ反応におけるアニーリング工程において選択される温度により強く影響を受けることも指摘すべきであり、この温度がプライマー／鋳型複合体の融解温度よりも低く或いはそれに近接すれば、プライマーは不完全な組合わせで鋳型配列にアニーリングして、複合体に誤った組合わせ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）を生ぜしめる。これは、予想よりも多い断片の増幅をもたらして一層多い変動結果を生ぜしめるため回避されるべきである。
【００４１】
本発明により得られるＰＣＲ生成物は、寸法によりＤＮＡ分子を分離した後にＤＮＡ分子を適する試薬で染色する標準的な分画法を用いて同定することができる。或いは、ＰＣＲ増幅に用いるプライマーを適する放射性標識もしくは蛍光性発色団で標識して、サイズ分画の後に反応生成物を同定することもできる。本発明の好適具体例において、ＰＣＲ生成物は限定はしないがたとえばアガロース、ポリアクリルアミドまたは混合アガロース／ポリアクリルアミドのような標準的ゲルマトリックスを用いるゲル電気泳動により分画される。本発明により得られるＰＣＲ生成物は、増幅制限断片（ＡＲＦ）と言う用語でも示される。
【００４２】
本発明の手段および方法を用いて、任意の複雑なゲノムの制限消化物から１群のＡＲＦを生成させることができる。本発明は、得られる制限断片の個数をＡＲＦを分離すべく使用するゲル分画システムの解像力に応じて調節することができる。１特定具体例において、選択的プライマーは５〜１０個のＡＲＦを生成するよう設計され、次いでこれらをアガロースゲル電気泳動により分離する。他の特定具体例は、２０〜５０個のＡＲＦを生成するよう設計された選択性プライマーの使用を含み、次いでこれらＡＲＦを限定はしないがたとえばポリアクリルアミドゲルもしくは混合アクリルアミド−アガロースゲルのような高分解能のゲル電気泳動システムによって分離する。
【００４３】
１好適具体例において、制限酵素は２０〜１０００塩基対の寸法範囲にて制限断片をもたらすよう選択される。何故なら、ＰＣＲ増幅に関して一般的に知られるように、この断片寸法範囲が最も効果的に増幅されるからである。各種の標準ゲルマトリックスでずっと多くの断片を分画しうるが、ＤＮＡ配列決定に関して現在使用されているような変性ポリアクリルアミドゲル系での分画により最も良好な結果が得られる。
【００４４】
本発明によれば、ＰＣＲ増幅反応にてそれぞれ異なる選択性プライマーを用い種々異なる群のＡＲＦが得られる。分離後に同定されるＡＲＦのパターンは、ゲノムＤＮＡの独特な完全に再現性のあるフィンガプリントを構成する。この種のフィンガプリントは、限定はしないがたとえば法医学的分類、生物の診断的同定、並びに品種、種族、変種もしくは個体の確認のような数種の用途を有する。同定のレベルは、特定群の種々異なる構成員により示される類似性の程度（変動性の程度）により決定される。変動性もしくは類似性は、関連ゲノムにおけるヌクレオチド組成の変動程度によって決定される。本発明の基礎となる原理は、各増幅制限断片にて図９に示すように所定間隔で互いに分離された２種のヌクレオチド配列を検出する点にある。２種のヌクレオチド配列のそれぞれは２つの部分で構成される：すなわち（ａ）制限エンドヌクレアーゼのための標的部位、および（ｂ）選択性プライマーに含まれる標的部位に隣接したヌクレオチド配列。関連する生物、品種、変種、種族もしくは個体において、これら配列要素およびその相対的間隔はより大きい或いはより小さい程度で保持される。したがってフィンガプリントは、ゲノム間の配列関係の程度を決定するための基礎を構成する。他方、ＡＲＦパターンにおける差を用いて、各ゲノムを互いに区別することもできる。ゲノムの他のフィンガプリント法に優る本発明の特定の利点は、この方法で得られる高い分解能（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）である。数十もしくは数百のＡＲＦを同時に比較することができる。
【００４５】
本発明の他の特定応用は、制限断片多形性（ＲＦＰ）のスクリーニングおよび同定を含む。ゲノムＤＮＡのヌクレオチド組成の変化は、しばしば制限断片の多形性をもたらす。挿入もしくは欠失はこれらを有する制限断片の寸法に影響を及ぼし（図１０）、ヌクレオチド変化は制限エンドヌクレアーゼ標的部位の除去または新たな制限エンドヌクレアーゼ標的部位の形成（図１１）をもたらしうる。この種の変化を確認するため最も一般的に使用される技術、はクローン化されたＤＮＡプローブを用いるサザンブロッティング実験であり、すなわち一般に制限断片長さ多形性（ＲＦＬＰ）検出と呼ばれる技術である。この技術は、種々異なるゲノムにおける関連ＲＦＬＰのためのサザンブロッティング実験におけるランダムにクローン化されたＤＮＡ断片の徹底的なスクリーニングを含む。本発明の方法によれば、ＲＦＰを種々異なるゲノムから得られたＡＲＦを比較して直接に同定することができる。原理的に、本発明の方法はＲＦＰを検出するための感度がより大である。何故なら、制限エンドヌクレアーゼの標的部位における差が検出されるだけでなく、隣接ヌクレオチド配列における差が選択性ＰＣＲプライマーに含まれるからである。その結果、本発明の方法はＲＦＬＰを検出するためのずっと優秀な方法を構成する。
【００４６】
ＲＦＬＰは法医学的型分類、ヒトにおける遺伝病の監視、並びに植物および動物の育種における耕種学的形質の遺伝の監視を含む数種の用途に現在使用されている。基礎となる原理は、特定の遺伝子特性に密接に関連した或る種のＤＮＡ多形性を用いて特定の遺伝子特性の存在もしくは不存在を監視しうる点にある。
【００４７】
本発明の方法によれば、ＡＲＦパターンの分析を用いて特定の遺伝子特性に対する多形性ＡＲＦの遺伝的関係を規定することができる。さらに、この種の多形性ＡＲＦは増幅断片長さ多形性（ＡＦＬＰ）と呼ばれ、これらをクローン化ＤＮＡプローブを用いてサザンブロッティング実験で検出されるＲＦＬＰ型ＤＮＡ多形性から区別することができる。
【００４８】
本発明の１特定用途は、特定遺伝子特性に関連したＡＦＬＰの検出を含む。この用途は、特定遺伝子特性における差を示す近縁個体のゲノムＤＮＡの制限消化物における異なる選択性プライマーで得られたＡＲＦパターンの分析、並びに１種もしくはそれ以上のＡＦＬＰの遺伝と特定遺伝子特性により示される表現型との間の相関関係を見出しうる分析技術の使用を包含する。
【００４９】
第２の好適な本発明の実施態様は、１種もしくはそれ以上の特定制限断片を同定するための本発明方法の使用を含む。１つの特定制限断片は、先ず最初に制限断片の各末端における最初の８〜１２塩基のヌクレオチド配列を決定することにより標識制限断片の複雑な混合物から増幅させることができる。これら配列に基づき２種のプライマーを設計することができ、それぞれ５〜１０個の選択性ヌクレオチドは制限断片の相補鎖の制限部位にフランキングする配列に相補的な配列を示す。各群のプライマーを用いて、ＰＣＲ増幅の後に単一の増幅断片を得ることができる。この方法に用いる制限断片はクローン化制限断片または増幅制限断片のいずれかとすることができる。必ずしも多くの制限断片は極めて効率的に増幅しえないので、多形性ＤＮＡマーカーを同定するための本発明の好適方法は先ず最初にランダムに選択された断片群を増幅させ、次いでＰＣＲ増幅の後に強いバンドをもたらすＡＦＬＰを同定する。これらＡＦＬＰは、制限断片特異性プライマーを開発するべく配列決定して特性化することができる。典型的には、ＡＦＬＰは対応のＤＮＡバンドをゲルから切除し、次いで両末端におけるヌクレオチド配列を決定して制限エンドヌクレアーゼ標的部位に隣接した最初の５〜１０ヌクレオチドの配列を確認することにより分離される。これらヌクレオチド配列が知られた後、ゲノムＤＮＡ消化物から単一の制限断片のみを増幅する制限断片特異性プライマーを設計することができる。本発明によるこの特定具体例において、２種の異なる選択性プライマーのうち１組を用いて特定制限断片を検出することができる。１組の２種の選択性プライマーのそれぞれにおいて、選択塩基は制限エンドヌクレアーゼ標的部位に隣接したヌクレオチド配列に相補的となるよう選択され、これを図８に示す。各プライマーに含ませる選択塩基の個数は、制限エンドヌクレアーゼ断片混合物の複雑性に依存する。
【００５０】
ＰＣＲ技術は過去数年間にわたり著しく発展し、ヒトの健康管理における最も広く用いられる診断法の１つに急速になりつつある。その用途は特に感染症の検出および遺伝病の検出を含む。各診断試験は２種の特定合成オリゴヌクレオチドの使用に基づくものであり、これらオリゴヌクレオチドをＰＣＲ反応におけるプライマーとして用いることにより特定長さの１種もしくはそれ以上のＤＮＡ断片を得る。病気検出において試験は１試料当り１個程度に少ないＤＮＡ分子の存在を検出して、特徴的ＤＮＡ断片を得る。遺伝病の場合には、生成物を正常の対立遺伝子と病気の対立遺伝子を区別しうるようプライマーを設計する。区別は、プライマーに対し相補的なゲノム内のＤＮＡセグメントの配列差に依存するか或いは２種のプライマー間における間隔差に依存する。
【００５１】
プライマーは極めて高程度の特異性を示すので種々異なる病気を同時に監視することができ、しばしば多重ＰＣＲと呼ばれる方法である。しかしながら多重ＰＣＲ法は、一般に僅か数種（５〜８）の異なる形質しか同時に監視しえない点で限界を有する。この限界の科学的根拠は、ＰＣＲ増幅の最適条件（アニーリング温度、Ｍｇ＋濃度、プライマー濃度など）が用いるプライマー対に応じて相当に変化する点である。多重ＰＣＲにおいては、全プライマー対が検出可能な生成物を生成する妥協条件を確立せねばならない。さらに、この現象に加えて、種々異なる断片の増幅効率に強力な差が生じる現象がある。その結果、しばしば或る種のプライマー対の生成物が多重ＰＣＲ反応では検出しえないという問題に遭遇する。
【００５２】
本発明の方法は本質的に多重ＰＣＲのこれら限界を解消する。何故なら、本発明に用いる全プライマーはそのヌクレオチド配列の実質的部分を共通して有するからである。さらに、ＡＦＬＰを選択することにより、等しい効率で増幅されるＤＮＡマーカーが選択される。したがって、異なる選択性プライマのための最適なＰＣＲ増幅条件は、一般的に使用される配列特異性プライマーで観察されるよりもずっと低い変動を示す。本質的に、合成オリゴヌクレオチドにおける塩基（これら塩基は複雑なゲノムにおける所定寸法の単一ＤＮＡ断片を検出する所要の特異性を得るのに必要である）の個数（これは上記のように計算する）と、効率的なＰＣＲ増幅にとって最適であるオリゴヌクレオチドの長さおよび組成との間の理想的妥協点が存在する。したがって、本発明の方法は多重ＰＣＲのかなり優秀な方法を提供する。
【００５３】
本発明は、任意のゲノムからＤＮＡマーカーを分離すると共にこの種のＤＮＡマーカーをあらゆる可能なＤＮＡフィンガプリント法の用途に使用するための一般的方法を提供する。
【００５４】
以下、限定はしないが実施例および図面により本発明をさらに説明する。
【実施例】
【００５５】
実施例１：ＰＳＴＩを使用するトマトＤＮＡの選択的制限フラグメント増幅
Ａ）ＤＮＡの単離及び修飾
全トマトＤＮＡ（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ ｃ．ｖ．Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒ）をＢｅｒｎａｔｚｓｋｉ及びＴａｎｋｓｌｅｙ（Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７２，３１４−３２１）に記載の如く幼葉から単離した。典型的な収量は、新鮮な葉物質１グラム当たりＤＮＡ ５０−１００μｇであった。ＤＮＡをＰｓｔＩ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で制限し、二重鎖（ｄｓ）ＰｓｔＩアダプターを以下に記載の方法に従って制限フラグメントに連結した。これらのアダプターは以下の構造：
5- CTCGTAGACTGCGTACATGCA -3
3- CATCTGACGCATGT -5
を有していた。これらのアダプター内の３’ＴＧＣＡ−の突出端をＰｓｔＩにより作った付着端にアニールする。５’Ｃ−残基がＡに置き換わっているので、ＰｓｔＩ認識配列ＣＴＧＣＡＧは、このアダプターの連結により修復されない。連結反応は、得られる末端が殆どＤＮＡフラグメント−アダプター分子であるような方法で設計されていた。これは、
１．アダプター−アダプターの連結を排除する非ホスホリル化アダプターを使用する、
２．同時に連結及び制限反応を実施する
ことにより実施した。後者の方法により、任意のフラグメント−フラグメントの連結産物が制限でき、これによりこれらの産物を殆ど完全に除去できた。ＰｓｔＩ認識配列はこれらの産物中で修復されないので、アダプター−フラグメント連結産物は制限酵素により制限され得ない。アダプター連結に使用する反応条件は以下の通りであった。
【００５６】
２μｇ トマトＤＮＡ
０．２μｇ アダプター
２０単位 ＰｓｔＩ
１単位 Ｔ４ ＤＮＡ−リガーゼ
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＡｃ ｐＨ ７．５，１０ｍＭ ＭｇＡｃ，５０ｍＭ ＫＡｃ，
２ｍＭ ジチオトレイトール，０．５ｍＭ ＡＴＰ
連結反応を反応容積２０μｌ中３７℃で３時間実施した。アダプター連結後、非連結アダプターを選択的に沈殿させることにより除去した。この目的のため、反応混合物を１００μｌに増やし、ＮＨ４Ａｃを終濃度２．５Ｍで添加した。−２０℃のエタノール（１００μｌ）を添加し、混合物を室温で５分間インキュベートした。４℃に冷却したエッペンドルフ遠心分離機中、１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離してＤＮＡを集めた。ＤＮＡペレットを室温で７０％エタノール０．５ｍｌで１回洗浄し、Ｔ０．１Ｅ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ ８．０，０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）４０μｌに溶解させた。ＤＮＡを−２０℃で貯蔵した。本明細書中に記載する選択的沈殿法により、反応混合物から非連結アダプターを効率良く除去したが、小さなＤＮＡフラグメント（＜２００ｂｐ）も失ってしまった。
【００５７】
Ｂ）増幅方法
上記方法で製造したＤＮＡをＰｓｔＩフラグメントを増幅するための鋳型として使用した。ＰＣＲの反応混合物は、
１ｎｇ 鋳型ＤＮＡ
１５０ｎｇ プライマー
１単位 Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）
２００μＭ 全４ｄＮＴＰ
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ ８．５，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２，５０ｍＭ ＫＣｌ
Ｈ２Ｏ （全容量が５０μｌになるまで）
を含んでいた。増幅反応中の蒸発を防ぐために、反応混合物を軽質鉱油（ｌｉｇｈｔ ｍｉｎｅｒａｌ ｏｉｌ）２０μｌで被覆した。以下のサイクルプロフィール：９４℃で１分、６０℃で１分、６０℃から７２℃に温度を１℃／５秒の速度で上昇及び７２℃で２．５分を使用してＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ上でＰＣＲを実施した。全部で３３サイクル実施した。反応後、クロロホルム２０μｌ及び充填染料１０μｌ、この場合染料Ｏｒａｎｇｅ Ｇ（Ｍｅｒｃｋ）０．１％ ｗ／ｖと一緒に５０％蔗糖を添加した。次いでこれを反応混合物と十分に混合し、充填染料を補った反応混合物から有機相（鉱油及びクロロホルム）を分離するために軽く遠心分離した。この反応混合物２０μｌを１．０％アガロースゲル上で分析した。
【００５８】
Ｃ）選択性の高いプライマーを使用するトマトＤＮＡの増幅
ＰｓｔＩで制限し、次いでＰｓｔＩアダプターをつけたトマトＤＮＡを上記条件を使用して増幅した。以下の配列：
１． 5-CTCGTAGACTGCGTACA-3
２． 5-GACTGCGTACAtgcagA-3
３． 5-GACTGCGTACAtgcagAC-3
４． 5-GACTGCGTACAtgcagACC-3
をもつ４つのプライマーを選択した。プライマー１はＤＮＡを修飾するのに使用するアダプターのトップストランドの一部なので、全ＰｓｔＩフラグメントを増幅しなければならない。プライマー２はアダプター配列の一部、ＰｓｔＩ認識配列（小文字）及び１個の選択的ヌクレオチド（大文字）を含むので、理論的には全ＰｓｔＩフラグメントの約１／１６部分を増幅しなければならない。プライマー３及び４はプライマー２に似ているが、選択的ヌクレオチドをそれぞれ２つ及び３つ含んでいるので、ＰｓｔＩフラグメントの約１／２５６及び１／４０９６を増幅すると予想される。反応混合物の一部を１．０％アガロースゲル上で分析し、結果を図１１に示す。この図面のレーン１及び６はＤＮＡマーカーを含んでおり、そのサイズを左側に示す。レーン２、３、４及び５は各々プライマー１、２、３及び４で得られたＰＣＲを含んでいる。この結果は、３つの選択的ヌクレオチドを使用したプライマーの場合にのみ、はっきりしたバンドパターンの増幅フラグメント数が得られることを示している。他の３つのプライマーはアガロースゲル上に溶解できなかったバンドパターンを与えたが、これは多くのＰＣＲ産物が生成したためである。これらの多くのＰＣＲ産物内でも、常に幾つかのフラグメントが目立っており、他のＰＣＲ産物の不鮮明なバックグラウンド上でもバンドとして検出される。恐らくこれらの強い産物は、トマト遺伝子上に高コピー数で存在するか、または他の産物よりもずっと効率的に増幅するのだろう。トマト遺伝子ＤＮＡのＰｓｔＩフラグメントの総数（２０，０００〜１００，０００）により、３つの選択的ヌクレオチドをもつプライマーが使用されてアガロースゲル上で鮮明なバンドパターンを作ったに違いないと予想された。
【００５９】
Ｄ）サザンブロット上の増幅フラグメントの分析
増幅フラグメントが同一サイズの真正制限フラグメントに対応することを立証するために、これらの増幅フラグメントをサザンブロット上で試験した。この目的のために、プライマー４で得られた４つの個々のフラグメントをアガロースゲルから切り出した。これらのゲル切片からＤＮＡをガラスビーズ（Ｇｅｎｅ Ｃｌｅａｎ，製造業者Ｂｉｏ １０１）に吸着させることにより精製し、精製ＤＮＡの一部を再増幅して４つのＤＮＡフラグメントを各々約１μｇ得た。続いて再増幅反応を１．０％分取アガロースゲル上で電気泳動させ、所望のＤＮＡフラグメントを精製した。各フラグメント２００ｎｇを、製造業者（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）により推奨された方法に従ってランダムヘキサマー標識キットを使用して（α−３２Ｐ）ｄＡＴＰで標識した。全トマトＤＮＡをＰｓｔＩで制限し、１．０％アガロースゲル上で電気泳動にかけた。制限ＤＮＡを約３μｇ含む４つのはっきりと分離したレーンを使用した。次に、アガロースゲルを、製造業者（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）により示された遺伝子スクリーン＋ハイブリダイゼーション膜にブロットした。ブロット後、ゲルをＰｓｔＩで制限したトマトＤＮＡを１レーン含む４つの切片に切断した。これらの４つの切片をＫｌｅｉｎ−Ｌａｎｋｈｏｒｓｔら（Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｌｌ．Ｇｅｎｅｔ．８１，６６１−６６７）に記載の方法に従って４つのＤＮＡプローブの一つに各々ハイブリダイズさせた。ハイブリダイズしたブロットをＫｏｄａｋ ＸＡＲ５フィルムを使用してオートラジオグラフに４０時間かけた。得られた結果は、４つのＤＮＡプローブにより識別された全てのゲノムＤＮＡフラグメントはこれらのプローブと同一の長さを持つことを示した。これは、プローブとして使用した増幅フラグメントはブロット上で検出されたフラグメント由来であることを示していた。
【００６０】
Ｅ）単一制限フラグメントの選択的増幅
プライマーの３セットをトマト遺伝子ＤＮＡ由来の３つの対応するランダムＰｓｔＩ−フラグメント用にデザインしたが、その中でもＰｓｔＩ−認識配列に隣接する配列が公知であった。５つの選択的ヌクレオチドを持つプライマーのセットを以下に示すように製造した。
【００６１】
プライマーセット１：
配列１：
5-ctgcagCAGTACCAGC----CCGGCACCTGctgcag-3
5-TGCGTAACATtgcagCAGTA-3 3-TGGACgacgtACATGCGT-5
プライマー１．１ プライマー１．２
【００６２】
プライマーセット２：
配列２：
5-ctgcagCCGAATCTCT-----AGTGAGTTAGctgcag-3
5-TGCGTACAtgcagCCGAA-3 3-CAATCgacgtACATGCGT-5
プライマー２．１ プライマー２．２
【００６３】
プライマーセット３：
配列１：
5-ctgcagAATACCAAGA-----GCAAGCACAGctgcag-3
5-TGCGTACAtgcagTTATG-3 3-GTGTCgacgtACATGCGT-5
プライマー３．１ プライマー３．２
【００６４】
トマトＤＮＡをＰｓｔＩで消化し、アダプターを上記の如く制限フラグメントの末端に連結した。このＤＮＡを上記セクションの条件のひとつを使用して、プライマーセット１または２または３を使用するＰＣＲの鋳型として使用した。各ＰＣＲの反応産物を１．０％アガロースゲル上で分析した。このゲルは図１２に示されている。図１２は１３個のレーンを示しているが、レーン１、２、１２及び１３はＤＮＡマーカーである。これらのマーカーのｋｂの大きさをゲルの両側に示す。レーン３、６及び９は、ベクターフラグメント、ｐＵＣ１８（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら，Ｇｅｎｅ ３３，１０３−１１９）及び挿入ＰｓｔＩフラグメントを産生する、ＰｓｔＩで制限した３つのＰｓｔＩフラグメントを各々含むプラスミドＤＮＡを示す。レーン４及び５は、各々全ゲノムＤＮＡ１ｎｇ及び対応するプラスミドＤＮＡ５ｆｇのプライマーセット１での増幅を示す。レーン７及び８は、全ゲノムＤＮＡ及びプラスミドＤＮＡのプライマーセット２での増幅を示し、レーン１０及び１１は、プライマーセット３での増幅を示す。これらの結果は、５つの選択的ヌクレオチドをもつプライマーでの選択的制限フラグメント増幅方法を使用すると少なくとも２０，０００フラグメントの混合物から単一のＰｓｔＩフラグメントを増幅し得ることを示している。
【００６５】
Ｆ）ＳＲＦＡを使用するＤＮＡ多型現象の識別
先のセクションにおいて、選択的制限フラグメント増幅法を使用すれば、配列情報が入手可能な場合、ランダムまたは特定のフラグメントのいずれかにおいて制限フラグメントを増幅し得ることが明示された。従って、同一種の２つの個体間で制限部位多型現象に関して調査可能である。非常に近縁であるが系の一方にはネコブセンチュウ耐性遺伝子、Ｍｉが存在するという点が異なる２つのトマト系に関してこのことを以下に記載する。このＭｉ−遺伝子はＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ、食用トマトＬ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍの遠縁種に由来する。これを、交雑、次いでＬ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ親に１２回戻し交雑し、さらにＭｉ−遺伝子の存在に関して子孫を選択することによりＬ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ系に導入した。従って、２つのトマト系は、その遺伝子物質の小さな部分だけ、即ちＭｉ−遺伝子及び周囲領域が異なる。古典的遺伝学方法を使用して、Ｍｉ−領域がこの系のゲノムの＜１％を構築すると計算した。
【００６６】
ＤＮＡを２種類のトマト系（系８３Ｍ−７１３９２，Ｍｉ−感受性及び系８３Ｍ−７１３９８，Ｍｉ−耐性；Ｄｅ Ｒｕｉｔｅｒ Ｓｅｅｄｓ，Ｂｌｅｉｓｗｉｊｋ，オランダ）から単離し、続いてＰｓｔＩで制限し、上記の如くアダプターをつけた。選択的ヌクレオチドの伸長が異なるプライマーを使用して増幅反応を多数回実施した。３つの選択的ヌクレオチドを使用し、単一プライマーの他に異なる２つのプライマーの組み合わせを使用した。反応物を混合ポリアクリルアミド／アガロースゲル上で分析した。その際、アクリルアミド対ビスアクリルアミド２０：１の割合で２．５％ポリアクリルアミド及び１．０％アガロースを使用した。１．５ｍｍのスペーサーを使用してＰｒｏｔｅａｎ ＩＩゲルユニット（Ｂｉｏｒａｄ）上にゲルを流した。全部で１６の異なるプライマーを使用すると、単一プライマーに関しては１６の反応となり、２つのプライマーの考え得る全部の組み合わせに関しては１２０の反応となる。これらの組み合わせの６つを使用するゲルの典型例を図１３に示す。このゲルのレーン１及び１４はＤＮＡマーカーを含んでおり、そのサイズをゲルの右側にｋｂで示す。レーン２及び３、４及び５、６及び７などは、２つのトマト系のプライマー対または特異的プライマーでの増幅を含んでいる。制限部位多型現象に関するスクリーニングから多くのフラグメントが産生したが、そのうちの３つは非常に顕著であり、これらは図１３のレーン９、１１及び１２に示されている（小さな丸で示されている）。同一プライマーが両方の反応に存在するので（違いはレーン１１の第２プライマーの存在である）、レーン９及び１１の多型現象のバンドは同一であると予測した。レーン１１及び１２の２つの多型現象フラグメントをゲルから切り出し、ゲル切片を１８ゲージ針に押し通して壊し、ＤＮＡを１００ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ ８．０，１０ｍＭ ＥＤＴＡの２００μｌ中で拡散させることにより溶離してゲル切片から溶出させた。上記の如くこれらのフラグメントの再増幅用に２μｌを使用した。Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを使用して各フラグメント２００ｎｇをブラント端とし、続いてＳｍａＩで制限したプラスミドベクターｐＵＣ１８（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら，Ｇｅｎｅ ３３，１０３−１０９）１００ｎｇに連結した。連結混合物をＥ．ｃｏｌｉに形質転換し、各フラグメントに関して１つの組換えＥ．ｃｏｌｉクローンを配列分析用に選択した。これらの取り扱い操作は全て、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＭａｎｉａｔｉｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載の標準法を使用して実施した。
【００６７】
６つの選択的ヌクレオチドを持つプライマー２セットを、上記の如く２つのフラグメントの配列をベースとして合成した。本発明者は、これらのプライマーセットを使用して各フラグメントを特異的に増幅し得た。トマト系からフラグメント（トマト系由来）だけを増幅した。しかしながら、これらのプライマーセットは、この多型現象を発見するのに使用した３つの選択的ヌクレオチドを持つプライマーに関して当初知見されたのと同一の多型現象を示した。
【００６８】
実施例２：２つの制限酵素を使用するトマトＤＮＡの選択的制限フラグメント増幅
実施例１では、選択的制限フラグメント増幅（ＳＲＤＡ）の原理は、トマトＤＮＡ及び制限酵素ＰｓｔＩを用いて例証されている。本実施例では、２つの制限酵素、ＰｓｔＩ及びＭｓｅＩを使用してＳＲＦＡを説明する。
【００６９】
ＤＮＡの単離及び修飾
全トマトＤＮＡを実施例１に記載の如く、幼葉から単離した。所謂、同一遺伝子系の２対、ＧｅｍＲ及びＧｅｍＳ、各々ＧＣＲ２６及びＧＣＲ１５１［これらの系は、以下の文献に記載されている：Ｄｅｎｂｙ及びＷｉｌｌｉａｍｓ，（１９６２），Ｃａｎ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．４２，６８１−６８５，Ｓｍｉｔｈ及びＲｉｔｃｈｉｅ，（１９８３），Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．１，４１−４５］をＤＮＡ源として使用した。同一遺伝子の各対の２つの個体は遺伝子的に非常に似ているが、真菌病原体Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ａｌｂｏ−ａｔｒａｔｕｍに対する耐性を与える特徴の存在が異なる。
【００７０】
ＤＮＡの修飾の第１段階は、２つの酵素ＰｓｔＩ及びＭｓｅＩでＤＮＡを制限することを含んでいた。ＤＮＡの制限及び続くＤＮＡフラグメントへのアダプターの連結を、ＲＬ−緩衝液（制限−連結緩衝液）と名付けられ、かつ１０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＡｃ／１０ｍＭ ＭｇＡｃ／５０ｍＭ ＫＡｃ／５ｍＭ ＤＴＴ， ｐＨ ７．５を含む同一緩衝液中で実施した。
【００７１】
ＰｓｔＩ及びＭｓｅＩによるＤＮＡの制限
２．５μｇ ＤＮＡ
１２．５単位 ＰｓｔＩ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，１０単位／μｌ）
１２．５単位 ＭｓｅＩ（Ｎ．Ｅ．Ｂｉｏｌａｂｓ，４単位／μｌ）
５μｌ １０×ＲＬ−緩衝液
５０μｌになるまでの量のＨ２Ｏ
インキュベーションを３７℃で１時間実施した。
【００７２】
ＤＮＡの修飾の次段階は、ＤＮＡフラグメントの末端へのアダプター分子の連結である。まず、好適な二重鎖アダプター分子を製造しなければならなかった。
【００７３】
アダプターの製造
ＭｓｅＩアダプター： 5-GACGATGAGTCCTGAG-3
3-TACTCAGGACTCAT-5
【００７４】
このアダプター５０ｐＭｏｌｅ／μｌの溶液を製造するために、
１６マー、5-GACGATGAGTCCTGAG-3 ８μｇ（１４３０ ｐＭｏｌｅｓ）を全容量Ｈ２Ｏ ２８．６μｌ中の１４マー、5-TACTCAGGACTCAT-3 ７μｇ（１４３０ ｐＭｏｌｅｓ）と混合した。
ＰｓｔＩアダプター：5-ビオ-CTCGTAGACTGCGTACATGCA-3
3-CATCTGACGCATGT-5
【００７５】
このアダプター５ｐＭｏｌｅｓ／μｌの溶液を製造するために、ビオチニル化２１マー、5-ビオ-CTCGTAGACTGCGTACATGCA-3 ５．２５μｇ（７１５ ｐＭｏｌｅｓ）を全容量Ｈ２Ｏ １４３μｌ中の１４マー、5-TGTACGCAGTCTAC-3 ３．５μｇ（７１５ ｐＭｏｌｅｓ）と混合した。
【００７６】
アダプター分子の連結
制限ＤＮＡに、以下のもの：
１μｌ ＰｓｔＩ ビオ−アダプター（＝５ ｐＭｏｌ）
１μｌ ＭｓｅＩ アダプター（＝５０ ｐＭｏｌ）
１．２μｌ １０ｍＭ ＡＴＰ
１μｌ １０×ＲＬ−緩衝液
１単位 Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，５単位／μｌ）
１０μｌになるまでの量のＨ２Ｏ
を含む混合物１０μｌを添加した。
【００７７】
得られた反応混合物６０μｌを３７℃で３時間インキュベートした。
【００７８】
制限部位が連結後に修復されないようにアダプターをデザインした。制限酵素が連結反応時にまだ活性であるから、フラグメントコンカテマーが制限され、故に、この方法ではフラグメント−フラグメント連結を避けられた。アダプターはホスホリル化されていなかったので、アダプター−アダプター連結はできなかった（実施例１参照）。
【００７９】
ビオチニル化ＤＮＡフラグメントの選択
２つの制限酵素を使用するＳＲＦＡ用の鋳型−ＤＮＡの製造は、通常、単一酵素を用いるＳＲＦＡを使用する際には使用しない追加の段階を含んでいた。この段階において、ビオチニル化アダプターに連結するＤＮＡフラグメントを他のすべてのフラグメントから分離した。
【００８０】
ビオチニル化フラグメントをこの段階で非−ビオチニル化フラグメント（ＭｓｅＩ−ＭｓｅＩ−フラグメント）から常磁性ストレプトアビジンビーズ（Ｄｙｎａｌ）に結合させることにより分離した。１０μｌビーズを１００μｌ ＳＴＥＸ（１００ｍＭ ＮａＣｌ／１０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ／１ｍＭ ＥＤＴＡ／０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ｐＨ ８．０）中で洗浄し、１４０μｌ ＳＴＥＸ中に再懸濁させた。次いでビーズを連結混合物に添加すると、終容量２００μｌとなった。これを緩やかに撹拌しながら室温で３０分間インキュベートすると、ビオチニル化ＤＮＡフラグメントが正しくビーズに結合できた。マグネットをビーズを含むチューブを近づけることによってこのビーズを集めた。こうすると、上清を他のチューブにピペットで移す際にビーズが移されない。ビーズを１度洗浄し、続いて新しいチューブに移した。次いでビーズを２００μｌ ＳＴＥＸで３回洗浄した。最終的にビーズを２００μｌ Ｔ０１．Ｅ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／０．１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ ８．０）中に再懸濁させ、新しいチューブに移した。ＤＮＡを４℃で保持した。
【００８１】
制限酵素で制限し、アダプターをつけ、常磁性ストレプトアビジンビーズにつけ、上記の如く製造したＭｓｅＩ−ＭｓｅＩフラグメントから精製したＤＮＡを、以下の段階で鋳型ＤＮＡと呼称する。
【００８２】
ＰｓｔＩ−ＭｓｅＩフラグメントの増幅
上記の如く製造した鋳型ＤＮＡは、記載のトマト系からの全ＰｓｔＩ−ＭｓｅＩフラグメント、さらに全く内部ＭｓｅＩ−フラグメントを含まない少量のＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ−フラグメントを含まなければならない。この実験において、これらの多くのＰｓｔＩ−ＭｓｅＩフラグメントが、実施例１に記載の如く本質的に増幅により可視化された。この実施例に記載の方法により得られたフラグメントの種類は実施例１に記載のフラグメントよりもずっと小さかったので、増幅産生物のゲル分析は変性アクリルアミドゲル（Ｍａｘａｍ及びＧｉｌｖｅｒｔ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７４，５６０−５６４）上で実施した。さらにこの種のゲルはレーン１つあたり１００個以上のバンドに分離できた。これは、実施例１に記載のアガロースゲルの約１０倍以上であった。フラグメントは、（γ−３２Ｐ）ＡＴＰ及びポリヌクレオチドキナーゼで５’末端でＰＣＲプライマーの一つを標識することにより可視化できた。
【００８３】
ＰＣＲプライマーの標識
標識用に選択したプライマーは、ＭｓｅＩプライマー１と名付けられた１９マー、５−ＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＴＡＡｇａａ−３であり、選択的ヌクレオチドは小文字で表されている。標識は、以下の方法により実施した。
【００８４】
３．０μｌ １８マー（５０ｎｇ／μｌ＝１５０ｎｇの溶液から）
５．０μｌ （γ−３２Ｐ）ＡＴＰ（１０μＣｉ／μｌ＝５０μＣｉの溶液から）
３．０μｌ ２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ／１００ｍＭ ＭｇＣｌ２／５０ｍＭ ＤＴＴ，ｐＨ ７．５
０．５μｌ Ｔ４−キナーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ １０単位／μｌ）
１８．５μｌ Ｈ２Ｏ
【００８５】
これにより総容量は３０μｌとなり、これを３７℃で３０分間インキュベートした。各ＰＣＲに関しては、この５’標識プライマー１μｌを添加した。
【００８６】
全部で２８回ＰＣＲを実施し、４つの鋳型ＤＮＡを各々７つのプライマーの組み合わせで増幅した。各プライマーの組み合わせは同一ＭｓｅＩプライマー（上記のＭｓｅＩプライマー１）を含んでいたが、ＰｓｔＩプライマーの選択に応じて変動した。全部で７つのプライマーを選択した（ＭｓｅＩプライマーに関しては、選択的ヌクレオチドは小文字で表されている）。
【００８７】
ＰｓｔＩプライマー１：5-GACTGCGTACATGCAGga-3
ＰｓｔＩプライマー２：5-GACTGCGTACATGCAGgt-3
ＰｓｔＩプライマー３：5-GACTGCGTACATGCAGgg-3
ＰｓｔＩプライマー４：5-GACTGCGTACATGCAGag-3
ＰｓｔＩプライマー５：5-GACTGCGTACATGCAGat-3
ＰｓｔＩプライマー６：5-GACTGCGTACATGCAGct-3
ＰｓｔＩプライマー７：5-GACTGCGTACATGCAGta-3
全ＰＳＲプライマーは、濃度５０ｎｇ／μｌでＨ２Ｏに溶解した。
【００８８】
増幅反応
ＰＣＲ混合物は、以下のものを含んでいた。
２．０μｌ 鋳型ＤＮＡ
１．０μｌ ５’標識ＭｓｅＩプライマー（５ｎｇ）
０．５μｌ 未標識ＭｓｅＩプライマー（２５ｎｇ）
０．６μｌ ＰｓｔＩプライマー（３０ｎｇ）
２．０μｌ １００ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ／１５ｍＭ ＭｇＣｌ２／５００ｍＭ ＫＣｌ，ｐＨ ８．５
０．８μｌ ５ｍＭ ｄＮＴＰ
０．１μｌ Ｔａｑ ポリメラーゼ（Ｃｅｔｕｓ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，５単位／μｌ）１３．０μｌ Ｈ２Ｏ
全ての反応成分を添加し、十分に混合し、ＰＣＲの重要成分、通常酵素を最後に添加した。続いて反応をできるだけ迅速に開始した。
【００８９】
増幅をＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ９６００ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ上で実施した。サイクルプロフィールは以下の通りであった。
１サイクル：変性： ９４℃で３０秒
アニーリング： ６５℃で３０秒
伸長： ７２℃で６０秒
１１サイクル：変性： ９４℃で３０秒
アニーリング温度を各サイクルごとに０．７℃ずつ下げて行く。６４．３℃，６３．６℃，６２．９℃，６２．２℃，６１．５℃，６０．８℃，６０．１℃，５９．４℃，５８．７℃，５８．０℃，５７．３℃．各温度で３０秒ずつインキュベートする。
【００９０】
伸長： ７２℃で６０秒
２３サイクル：変性： ９４℃で３０秒
アニーリング： ５６℃で３０秒
伸長： ７２℃で６０秒
【００９１】
増幅フラグメントのゲル分析
反応産物を４．５％変性ポリアクリルアミドゲル上で実施した。５０×３８ｃｍゲルを使用し、これらのゲルを製造するためにゲルカセットをＢｉｏｒａｄから入手した。４．５％ ｗ／ｖ アクリルアミド／０．２２５％ ｗ／ｖ ビスアクリルアミド／７．５Ｍ 尿素／５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／５０ｍＭ ホウ酸／１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ ８．３を含むゲル溶液１００ｍｌを使用した。ゲルにキャストする直前に、１００ｍｌゲル溶液を５００μｌ １０％ 過硫酸アンモニウム及び１００μｌ ＴＥＭＥＤと混合した。Ｔｒｉｓ／ホウ酸／ＥＤＴＡ−緩衝液を電気泳動緩衝液として使用した。これらは１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／１００ｍＭ ホウ酸／２ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ ８．３を含んでいた。反応混合物を９８％ ホルムアミド／１０ｍＭ ＥＤＴＡ／０．０１％ ｗ／ｖブロモフェノールブルー／０．０１％ ｗ／ｖキシレンシアノールの等量（２０μｌ）と混合した。得られた混合物を９５℃で３分間加熱し、次いですぐに氷冷した。各サンプル２μｌをゲル上に載せた。電気泳動時、ゲルに一定の電圧１１０ワットをかけると、一定の発熱（ｔｈｅｒｍａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）があった。これらの条件下のゲルの磁場強度は、４０〜５０ボルト／ｃｍに相当した。
【００９２】
ＳＲＦＡ反応の結果を図１４に示す。レーンを１〜２８まで番号付け、各々、７つのプライマー組み合わせの１つを持つ４種類のトマト系を含んでいる。ゲル上のトマト系の順番は、１．ＧＣＲ２６、２．ＧＣＲ１５１、３．ＧｅｍＲ、４．ＧｅｍＳであった。レーン１〜４はＭｓｅＩプライマー１及びＰｓｔＩプライマー１で増幅したこれらのＤＮＡを含み、レーン５〜８はＭｓｅＩプライマー１及びＰｓｔＩプライマー２で増幅したこれらのＤＮＡを含み、レーンを９〜１２はＭｓｅＩプライマー１及びＰｓｔＩプライマー３で増幅したこれらのＤＮＡを含み、レーン１３〜１６はＭｓｅＩプライマー１及びＰｓｔＩプライマー４で増幅したこれらのＤＮＡを含み、レーン１７〜２０はＭｓｅＩプライマー１及びＰｓｔＩプライマー５で増幅したこれらのＤＮＡを含み、レーン２１〜２４はＭｓｅＩプライマー１及びＰｓｔＩプライマー６で増幅したこれらのＤＮＡを含み、並びにレーン２５〜２８はＭｓｅＩプライマー１及びＰｓｔＩプライマー７で増幅したこれらのＤＮＡを含む。ゲルはサイズマーカーを含まないが、ＤＮＡフラグメントを図の下部に±２００ヌクレオチド、上部に±５００ヌクレオチドに対応して可視化させた。
【００９３】
実施例３
２種の制限酵素を用いた種々のＬＡＣＴＵＣＡ種のＤＮＡの選択的制限フラグメント増幅
実施例２ではトマトＤＮＡにおいて、２種の制限酵素を使用する選択的制限フラグメント（ＳＲＦＡ）増幅の原理を例証した。この実施例においては、同じ２種の制限酵素ＰｓｔＩ及びＭｓｅＩを使用して種々のＬａｃｔｕｃａ種のＤＮＡについても同様の結果が得られることを示す。
【００９４】
ＤＮＡの単離及び修飾
種々のＬａｃｔｕｃａ種の幼葉材料を使用し、実施例１に記載のごとくＤＮＡを単離した。下記に示すように、かかる植物には市販用レタス品種（Ｌ．ｓａｔｉｖａ）と、２種の野生Ｌａｃｔｕｃａ種Ｌ．ｓａｌｉｇｎａ及びＬ．ｖｉｒｏｓａとが含まれていた。植物は下記のごとき恣意的番号で示す。
１．Ｌ．ｓａｌｉｇｎａ，ｎｒ．２１，植物１
２．Ｌ．ｓａｌｉｇｎａ，ｎｒ．２１，植物２
３．Ｌ．ｓａｌｉｇｎａ，ｎｒ．２２，植物１
４．Ｌ．ｓａｌｉｇｎａ，ｎｒ．２２，植物２
５．Ｌ．ｖｉｒｏｓａ， ｎｒ．０１，植物１
６．Ｌ．ｖｉｒｏｓａ， ｎｒ．０１，植物２
７．Ｌ．ｖｉｒｏｓａ， ｎｒ．０２
８．Ｌ．ｖｉｒｏｓａ， ｎｒ．０３，植物１
９．Ｌ．ｖｉｒｏｓａ， ｎｒ．０３，植物２
１０．Ｌ．ｓａｔｉｖａ，市販用バターヘッド（ｂｕｔｔｅｒｈｅａｄ）品種
【００９５】
分析した遺伝物質は、４種の植物で２つの異なる個体を含み、６種の植物タイプを示した。
【００９６】
ＬａｃｔｕｃａＤＮＡを修飾してＳＲＦＡの鋳型を生成するのは、実施例２に記載の方法と同様に実施した。
【００９７】
ＰｓｔＩ−ＭｓｅＩフラグメントの増幅
上述のごとく調製したＤＮＡをＳＲＦＡ反応の鋳型として使用した。１つのＭｓｅＩプライマーと２つの異なるＰｓｔＩプライマーとを用い、２種のプライマーの組合せを使用した。かかるプライマーは下記の通りである（選択的ヌクレオチドは小文字で示した）：
ＭｓｅＩプライマー ：5-GATGAGTCCTGAGTAAaca-3
ＰｓｔＩプライマー１：5-GACTGCGTACATGCAGaa-3
ＰｓｔＩプライマー２：5-GACTGCGTACATGCAGca-3
【００９８】
上記プライマーを使用したＰｓｔＩ−ＭｓｅＩフラグメントの増幅は、実施例２に記載したのと全く同様に実施し、実施例２に記載のごとく変性ポリアクリルアミドゲル上で、生成されたフラグメントを可視化した。得られたバンドパターンを図１５に示す。レーン１〜１０は、ＰｓｔＩプライマー１と組合わせたＭｓｅＩプライマーを用いて増幅したＤＮＡ １〜１０を示し、レーン１１〜２０は、ＰｓｔＩプライマー２と組合わせたＭｓｅＩプライマーを用いて増幅したＤＮＡ １〜１０を示す。ヌクレオチド内のサイズマーカー（この図では見えない）はゲルの右側に示されている。バンドパターンの差異は、種々の植物の類縁関係の差異を反映している。
【００９９】
実施例４：種々の制限酵素の組合せによるトウモロコシ同系交配系の選択的制限フラグメント増幅
実施例２及び３ではそれぞれトマトＤＮＡ及びレタス（Ｌａｃｔｕｃａ種）ＤＮＡを使用し、２種の制限酵素を使用する選択的制限フラグメント（ＳＲＦＡ）増幅の原理を例証した。この実施例においては、トウモロコシ（Ｚｅａトウモロコシ）系においても同様の結果が得られることを示す。更に、種々の制限酵素の組合せを使用し、この場合にはトウモロコシ系のＤＮＡフィンガープリントが得られることも示す。
【０１００】
ＤＮＡの単離及び増幅
番号１及び２を付した２種のトウモロコシ同系交配系を使用した。かかるトウモロコシ系源は、本発明者らの経験によれば選択した任意の系がＳＲＦＡを使用して優れたＤＮＡフィンガープリントを与えるので、重要でない。Ｓａｇｈａｉ−Ｍａｈｏｏｆ ｅｔ ａｌ．，（１９８４），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１，８０１４−８０１８に記載のごとく、幼葉材料からかかる系のＤＮＡを単離した。以下の制限酵素の組合せ（ＥＫｓ）を使用して鋳型ＤＮＡを作製した：ＰｓｔＩ／ＴａｑＩ、ＥｃｏＲＩ／ＴａｑＩ、ＡｓｅＩ／ＴａｑＩ、Ｓｓｅ８３８７−Ｉ／ＴａｑＩ。全ての酵素はＰｈａｒｍａｃｉａから購入したが、但しＡｓｅＩはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから購入し、Ｓｓｅ８３８７ＩはＡｍｅｒｓｈａｍから購入した。鋳型ＤＮＡは実質的に実施例２及び３に記載のごとく調製したが、但し下記の点が異なる。
【０１０１】
まずＴａｑＩと一緒に６５℃で１時間インキュベートし、次いで第２の酵素、即ちＰｓｔＩ、ＡｓｅＩ、ＥｃｏＲＩまたはＳｓｅ８３８７Ｉと一緒に３７℃で更に１時間インキュベートすることにより、ＤＮＡの制限を実施した。アダプターの連結は、下記のアダプターを使用して実施例２に記載のごとく実施した：
ＴａｑＩアダプター：5-GACGATGAGTCCTGAC-3
3-TACTCAGGACTGGC-5
ＰａｔＩ及びＳｓｅ８３８７Ｉアダプター：
5-bio-CTCGTAGACTGCGTACATGCA-3
3-CATCTGACGCATGT-5
ＡｓｅＩアダプター：5-bio-CTCGTAGACTGCGTACC-3
3-CTGACGCATGGAT-5
ＥｃｏＲＩアダプター：5-bio-CTCGTAGACTGCGTACC-3
3-CTGACGCATGGTTAA-5
【０１０２】
制限フラグメントの増幅
実施例２に記載のごとく制限フラグメントを増幅した。増幅産物を標識するために選択したプライマーは、（小文字で示した）３つの選択的ヌクレオチドを有する下記のＴａｑＩプライマーであった：
ＴａｑＩプライマー １．5-TGAGTCCTGACCGAacc-3
（５’標識） ２．5-TGAGTCCTGACCGAaca-3
３．5-TGAGTCCTGACCGAcaa-3
４．5-TGAGTCCTGACCGAcac-3
【０１０３】
上記４つのプライマーを、４種類全ての酵素の組合せを用いた増幅産物の検出に使用した。各酵素の組合せにおいて、他方の酵素に対して４つのプライマーを選択し、各酵素に対して全部で１６種の組合せを与えた。これらのプライマーを下記に示す（選択的ヌクレオチドは小文字で示す）。ＥｃｏＲＩ及びＡｓｅＩに対しては３つの選択的ヌクレオチドを含むプライマーを選択し、ＰｓｔＩに対しては２つの選択ヌクレオチドを含むプライマーを選択し、ＳｓｅＩに対しては単一の選択ヌクレオチドを含むプライマーを選択した。トウモロコシゲノムＤＮＡを切断する頻度の少ない酵素に対しては、選択的ヌクレオチドのより少ない伸長部を含むプライマーを選択した。
ＥｃｏＲＩプライマー：１．5-CTGCGTTACCAATTCcaa-3
２．5-CTGCGTTACCAATTCaca-3
３．5-CTGCGTTACCAATTCaac-3
４．5-CTGCGTTACCAATTCcag-3
ＡｓｅＩプライマー： １．5-GACTGCGTACCTAATaac-3
２．5-GACTGCGTACCTAATaag-3
３．5-GACTGCGTACCTAATacc-3
４．5-GACTGCGTACCTAATgaa-3
ＰｓｔＩプライマー： １．5-GACTGCGTACATGCAGac-3
２．5-GACTGCGTACATGCAGaa-3
３．5-GACTGCGTACATGCAGca-3
４．5-GACTGCGTACATGCAGcc-3
Ｓｓｅ８３８７Ｉプライマー：１．5-GACTGCGTACATGCAGGa-3
２．5-GACTGCGTACATGCAGGg-3
３．5-GACTGCGTACATGCAGGc-3
４．5-GACTGCGTACATGCAGGt-3
【０１０４】
実施例２に記載の方法に従って全部で１２８種のＰＣＲを実施した（２ＤＮＡ×４酵素の組合せ×１６プライマーの組合せ）。これらのＰＣＲ反応産物を実施例２に記載のごとき（４８レーン／ゲルを含む）３種のゲルにおいて分析した。全てのプライマーの組合せで、１レーン当たり５０〜１００バンドのＤＮＡフィンガープリントが得られたが、但しＳｓｅＩ／ＴａｑＩの組合せにおいては１レーン当たり１０〜１５のバンドしか得られなかった。１つのゲルの例を図１６に示す。この図は、ＰｓｔＩ／ＴａｑＩ及びＥｃｏＲＩ／ＴａｑＩの酵素の組合せを用いて得られたＤＮＡフィンガープリントの分析におけるゲルの一部を示している。レーン１〜８はそれぞれＴａｑＩプライマー３とＰｓｔＩプライマー１、２、３及び４とを用いたＳＲＦＡにより得られた２種のトウモロコシＤＮＡのＤＮＡフィンガープリントを示しており、レーン９〜１６はそれぞれＴａｑＩプライマー４とＰｓｔＩプライマー１、２、３及び４とを用いたＳＲＦＡにより得られた２種のトウモロコシＤＮＡのＤＮＡフィンガープリントを示しており、レーン１７はＰｓｔＩを用いて制限したサイズマーカーλＤＮＡを示しており〔ヌクレオチド内のフラグメントの幾つかのサイズは右側に示してある〕、レーン１８〜２５はそれぞれＴａｑＩプライマー１とＥｃｏＲＩプライマー１、２、３及び４とを用いたＳＲＦＡにより得られた２種のトウモロコシＤＮＡのＤＮＡフィンガープリントを示している。
【０１０５】
実施例５：細菌ＤＮＡの選択的制限フラグメント
実施例２、３及び４においてはそれぞれトマト、レタス（Ｌａｃｔｕｃａ種）及びトウモロコシのＤＮＡにおいて、２種の制限酵素を使用する選択的制限フラグメント（ＳＲＦＡ）増幅の原理を例証した。この実施例においては、この方法を使用して細菌ＤＮＡを特性分析し得ることを示す。細菌における本発明方法の有用性を示すため、ベルギーのＧｅｎｔにあるｔｈｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙから多数のＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ株を入手した。
【０１０６】
ＤＮＡの単離及び増幅
全てのＤＮＡは、種々の資源、ほとんどは感染植物から単離したＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ株から調製した。番号１〜２６を付したこれらの株を下記に列挙する。これらの株はベルギーのＧｈｅｎｔにあるｔｈｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙから入手し得る。
【０１０７】
ＤＮＡ 亜種 ｐａｔｈｏｖａｒ 単離体
１． ａｌｂｉｌｉｎｅａｎｓ ４９４
２． ｆｒａｇａｒｉａｅ ７０８
３． ｏｒｙｚａｅ ｏｒｙｚａｅ ５０４７
４． ｏｒｙｚａｅ ｐｏｐｕｌｉ ５７４３
５． ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ ９５８
６． ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ５６８
７． ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ａｌｆａｌｆａｅ ４９７
８． ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｃｏｒａｃａｎａｅ ６８６
９． ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｃｉｔｒｉ ８６５５
１０． ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｃｉｔｒｉ ９６５８
１１． ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｃｉｔｒｉ ９１８１
１２． ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｃｉｔｒｉ ８６５７
１３． ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｃｉｔｒｉ ８６５４
１４． ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｃｉｔｒｉ ８６５０
１５． ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｃｉｔｒｉ ６８２
１６． ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｃｉｔｒｉ ６８１
１７． ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｃｉｔｒｉ ９３２５
１８． ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｃｉｔｒｉ ９３２１
１９． ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｃｉｔｒｉ ９１７６
２０． ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｃｉｔｒｉ ９６７１
２１． ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｃｉｔｒｉ ９６６５
２２． ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｃｉｔｒｉ ９１８２
２３． ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｃｉｔｒｉ ５６８
２４． ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｃｉｔｒｉ ９１６７
２５． ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｃｉｔｒｉ ９１７５
２６． ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｃｉｔｒｉ ９１６０
【０１０８】
上記細菌株のＤＮＡをＭａｒｍｕｒ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３，２０８〜２１８）によって記載されているように単離した。実質的に実施例４に記載のごとくＤＮＡを制限したが、但し制限酵素としてＴａｑＩ及びＡｐａＩを選択した。アダプターの連結は、下記のアダプターを使用して実施例４に記載のごとく実施した：
ＴａｑＩアダプター：5-GACGATGAGTCCTGAC-3
3-TACTCAGGACTGGC-5
ＡｐａＩアダプター：5-bio-TCGTAGACTGCGTACAGGCC-3
3-CATCTGACGCATGT-5
【０１０９】
制限フラグメントの増幅
実施例２に記載のごとく制限フラグメントを増幅した。ＳＲＦＡに選択したプライマーは、ＴａｑＩプライマー 5-CGATGAGTCCTGACCGAg-3（小文字で示した１つの選択的ヌクレオチドを有する）と、ＡｐａＩプライマー 5-GACTGCGTACAGGCCCg-3（小文字で示した１つの選択的ヌクレオチドを有する）であった。実施例２に記載のごとく増幅フラグメントを検出するために、ＡｐａＩプライマーの５’末端を標識した。
【０１１０】
上述のプライマーを使用して２６種のＤＮＡの各々を増幅した。増幅条件は実施例２に記載の通りであったが、但し、実施例２、３及び４の植物ＤＮＡと比較してＤＮＡの複雑性がより低いため、ＰＣＲの最後の９サイクルは省略した。
【０１１１】
この実施例に記載の細菌ＤＮＡを用いて得られたＤＮＡフィンガープリントを図１７に示す。レーン１〜２６は細菌ＤＮＡ１〜２６を示す。ヌクレオチド内のマーカーＤＮＡのサイズ（ゲル上には見えない）はゲルの右側に示されている。この図は、細菌株の類縁関係がバンドパターンの類似性に反映されることを明らかに示している。
【０１１２】
実施例６
２種の制限酵素を用いた種々の動物のＤＮＡの選択的制限フラグメント増幅
先の実施例では種々の資源の植物ＤＮＡにおいて、選択的制限フラグメント増幅（ＳＲＦＡ）を例証した。ここでは、種々の家畜から得られるランダムなＤＮＡ試料を使用し、本発明方法の有効性を説明する。試験した動物種は：Ｇａｌｌｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ（ニワトリ）；Ｓｕｓｓｃｒｏｆａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ Ｌ．（ブタ）；Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ（ウシ）；Ｅｑｕｕｓ ｃａｂａｌｌｕｓ（ウマ）であった。使用した制限酵素はＳｓｅ８３８７Ｉ及びＭｓｅＩであった。
【０１１３】
ＤＮＡの単離及び修飾
Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８９）によって記載された方法に従い、血液試料からＤＮＡを単離した。ＤＮＡ試料１〜３（ニワトリ）、４〜７（ブタ）、８〜１１（ウシ）及び１２〜１５（ウマ）を制限酵素Ｓｓｅ８３８７Ｉ及びＭｓｅＩによって消化した。実施例２に記載のごとく、ＤＮＡフラグメントをアダプターに連結した。制限酵素Ｓｓｅ８３８７Ｉ及びＰｓｔＩは互換性のある３’突出部を生成するので、本発明者らは実施例２に記載のごときＰｓｔＩ及びＭｓｅＩアダプターを使用し得た。
【０１１４】
制限フラグメントの増幅
上記のごとく番号を与え、実施例２に記載のごとく調製した鋳型ＤＮＡはＳＲＦＡ反応における鋳型として作用した。使用したプライマーの組合せは、１つのＭｓｅＩプライマーと異なるＳｓｅＩプライマーからなった：
ＭｓｅＩプライマー： 5-GATGAGTCCTGAGTAAtac-3
Ｓｓｅ８３８７Ｉプライマー１：5-GACTGCGTACATGCAGGaa-3
Ｓｓｅ８３８７Ｉプライマー２：5-GACTGCGTACATGCAGGag-3
【０１１５】
上述のプライマー対を使用したＳｓｅ８３８７Ｉ−ＭｓｅＩフラグメントの増幅は、実施例２に記載の方法を使用して実施した。反応生成物を、実施例２に記載の変性ポリアクリルアミドゲルにおいて試験した。上記試料のフィンガープリントを示すオートラジオグラフを図１８に示す。レーン１〜１５は、Ｓｓｅ８３８７Ｉプライマー１と組合わせたＭｓｅＩプライマーを用いて増幅したＤＮＡ１〜１５のフィンガープリントを示し、レーン１６〜３０は、Ｓｓｅ８３８７Ｉプライマー２と組合わせたＭｓｅＩプライマーを用いて得られた同様のパターンを示している。同一種の動物間のフィンガープリントの差異は動物集団内の不均一性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）を反映しているが、総合的なパターンは特定の種に特徴的である。
【０１１６】
特定の実施態様において、本発明は、所定の特定の（特異的）制限エンドヌクレアーゼに対する制限部位を複数含むと共に、その核酸配列の少なくとも一部分が未知である出発ＤＮＡの少なくとも一部分を制御増幅する方法であって、
（ａ）前記出発ＤＮＡを前記特定の制限エンドヌクレアーゼを用いて消化し、それを、それぞれ５’末端及び３’末端を含む対応する一連の制限フラグメントに断片化し、
（ｂ）後述する５’及び３’アダプターがまだ独立した形態になっていないならば、前記特定のエンドヌクレアーゼに対するただ１つの部位をそのヌクレオチド配列内に含む所定の二重鎖オリゴヌクレオチドリンカーを、前記特定のエンドヌクレアーゼを用いて消化し、それぞれかかる５’及び３’アダプターに切断し、
（ｃ）出発ＤＮＡから得られた制限フラグメントを、それらの５’及び３’末端で、それぞれ前記３’及び５’アダプターに連結し、それによって、タグをそれぞれ５’及び３’末端に有する、出発ＤＮＡのタグ付き制限フラグメント〔そのタグのヌクレオチド配列は、前記特定の制限部位内に含まれるヌクレオチドを含む３’及び５’アダプター配列を含有する〕を生成し、
（ｄ）プライマーに適した鋳型を与えるのに適当であれば、先の連結に先立って前記５’及び３’アダプターが、所定の一定配列のオリゴヌクレオチドセグメントをそれぞれ５’及び３’末端に付加することにより伸長されていない場合、同じ目的で適当であれば、前記タグ付き制限フラグメントの対応末端を前記オリゴヌクレオチドを用いて伸長させ、それによって、前記一定配列によって両末端が伸長されたタグ付き制限フラグメントを得、
（ｅ）前記タグ付きまたは適当であれば伸長された制限フラグメントをハイブリダイジング条件下で２種のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させ、
（ｆ）前記プライマーが、前記タグ付きまたは適当であれば伸長された制限フラグメントの５’及び３’末端の鎖〔それ自体は前記プライマーの鋳型として作用する鎖と相補的である〕の末端部分と同じヌクレオチド配列を有する配列を含む場合、前記プライマーはそれぞれ、鋳型鎖の前記所定の特定の制限エンドヌクレアーゼに対する部位の形成に関与するものと相補的なヌクレオチドを含んでおり、
（ｇ）前記プライマーにハイブリダイズした伸長制限フラグメントを、要求されるヌクレオチド及びポリメラーゼの存在下にＰＣＲまたは同様の方法により増幅し、ハイブリダイズしたプライマーを、該プライマーが最初にハイブリダイズした出発ＤＮＡの制限フラグメントに沿ってそれらの全長にわたって伸長させ、
（ｈ）前記最後に述べた制限フラグメントを同定または回収する
ことからなる。
【０１１７】
本発明方法の特定の実施態様においては、少なくとも１つの前記プライマーの求められる伸長方向で最後のヌクレオチドが、前記特定のエンドヌクレアーゼに対する制限部位内に含まれる最後のヌクレオチドに対応しており、該方法は、増幅された出発ＤＮＡの制限フラグメントを同定または回収することを含む。
【０１１８】
本発明の別の特定の実施態様においては、少なくとも１つの前記プライマーは、増幅ステップの間、対応制限フラグメント内で、前記特定のエンドヌクレアーゼに対する制限部位内に含まれる最後のヌクレオチドを超えて、それ自身の伸長の方向に伸びる所定数（１つまたは幾つか）のヌクレオチドからなる選択された配列を含む。
【０１１９】
上述の方法の特定の実施態様においては、二重鎖ＤＮＡリンカーは、全てが相互に異なる特定のエンドヌクレアーゼに対する部位を幾つか含んでおり、該方法は、同じ出発ＤＮＡにおいて、かかる制限エンドヌクレアーゼの１種と、もう１種の特定のエンドヌクレアーゼとを使用し、他の特定のエンドヌクレアーゼについては、上記説明において定義したようにヌクレオチド配列が選択されたプライマーを使用し、上述のステップを繰り返すことからなる。
【０１２０】
上述の方法または本発明のオリゴヌクレオチドは、同じ生体種由来の所定のＤＮＡ、例えば細菌、植物、もしくはヒトを含む動物のゲノムＤＮＡまたはそのフラグメントにおいて、それらのなかでのまたは対応する所定の標準ＤＮＡに対しての多型現象の同定に適している。これは、調査対象ＤＮＡに該方法を実施する、即ち増幅または伸長反応し得る条件下に該オリゴヌクレオチドと接触させ、前記各ＤＮＡ及び必要によっては前記標準ＤＮＡから出発して得られた制限パターンを比較し、ＤＮＡ多型現象の存在及び適当であればその位置を、種々のＤＮＡの制限フラグメントのサイズ間に認められ差異と相関させることからなる。
【０１２１】
本発明は更に、その種々のフラグメントが、未切断出発ＤＮＡの初期消化物〔これは、同じ所定の特定のエンドヌクレアーゼを用いて当該ＤＮＡから生成される〕に対応する配列を有するフラグメント化ＤＮＡであって、前記フラグメントの全てが５’及び３’末端にそれぞれ、所定アダプター〔つまり、前記特定のエンドヌクレアーゼに対するただ１つの制限部位を当初含んでいた同じ出発ＤＮＡリンカーの切断部分に対応し、更に必要によっては所定の一定配列を用いて伸長された、所定の３’及び５’アダプター〕によってタグが付けられていることを特徴とするフラグメント化ＤＮＡに係わる。フラグメント化ＤＮＡは、フラグメントを電場の作用下に最初に移動させた適当な支持体、例えばゲル支持体上の移動バンドパターンの形態であり得る。
【０１２２】
フラグメント化ＤＮＡは更に、５’末端から出発して下記の組成を特徴とするオリゴヌクレオチドを含む末端部分を含み得る：
（ｉ）アダプターとして使用される所定のＤＮＡ配列と相補的な、１０塩基以上且つ３０塩基以下のヌクレオチド配列（一定配列）、この直ぐ後に、
（ｉｉ）ヌクレオチド配列またはその一部が（ｉｉ）に含まれない限り、ステップ（ａ）で使用された特定の制限エンドヌクレアーゼのターゲット部位と相補的なヌクレオチド配列、この直ぐ後に、
（ｉｉｉ）選択された１以上且つ１０未満、例えば長さ１〜５のヌクレオチド配列。
【０１２３】
本発明は、少なくとも１つの特定の制限エンドヌクレアーゼによって所定のＤＮＡをフラグメントに断片化し、かかるフラグメントを分析するためのキットであって、次のものを含む。
【０１２４】
−特定の制限エンドヌクレアーゼ；
−前記特定のエンドヌクレアーゼに対するただ１つの部位をそのヌクレオチド配列内に含み、それによって、それぞれ対応する５’及び３’アダプターに切断される二重鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドリンカーであって、あとでこのキットのＰＣＲプライマー用鋳型を与え得る５’及び３’部分を与えるに十分なサイズを有する二重鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドリンカー；
−一方では、あとで該プライマーの鋳型として作用する鎖と相補的な５’及び３’アダプターの鎖と同じ配列をそれぞれ有するＰＣＲプライマーであって、更に、鋳型鎖内の前記所定の特定の制限部位に対する部位の形成に関与するものと相補的なヌクレオチドを含むプライマー；
−前記リンカーを前記特定の制限エンドヌクレアーゼによって消化してそれぞれ前記５’及び３’アダプターを作製する前に、前記５’アダプターの５’末端もしくは前記３’アダプターの３’末端または両方を伸長するために、或いは、前記５’及び３’アダプターを出発ＤＮＡのフラグメントの末端に連結してその後得られたタグ付きフラグメントの伸長のため、前記プライマーを用いたハイブリダイゼーションに十分な長さの部位を生成するための所定（一定）配列のオリゴヌクレオチドセグメント（適当な場合）；
−前記特定のエンドヌクレアーゼを用いて消化することにより得られる、断片化試験を実施する所定のＤＮＡに対応するフラグメント化標準ＤＮＡ（必要による）。
【０１２５】
上記キットの特定の実施態様は、前記５’及び３’アダプターまたはタグ付きＤＮＡフラグメントの５’及び３’末端の伸長のための前記オリゴヌクレオチドセグメントが同一のヌクレオチド配列を有するものである。
【０１２６】
別の実施態様においては、該キットのリンカーは、全てが相互に異なる特定のエンドヌクレアーゼに対する固有の部位を幾つか含んでおり、該キットは更に、前記種々の特定のエンドヌクレアーゼを用いて前記リンカーを切断することによりそれぞれ形成される３’及び５アダプターの各々に対応するプライマーを含んでいる。これらのプライマーは、前記リンカーにおいて、前記特定のエンドヌクレアーゼの各々により切断することにより生成される３’及び５’アダプターに関して、請求項８に記載のようなものである。
【０１２７】
特定の実施態様においては、キットは対応する特定の制限エンドヌクレアーゼに関して上述のごときフラグメント化標準ＤＮＡを含み得、各フラグメント化標準ＤＮＡは、所定の特定の制限酵素の各々に関係している。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】ゲノムＤＮＡ分子を制限酵素で切断して得られた標識制限断片の一般的なＰＣＲ増幅法の概略図である。
【図２】制限断片の異なる末端、すなわちフラッシュ末端およびスタッガー末端に対するアダプターの結合を示す。
【図３】標識制限断片のＰＣＲ増幅を示し、ボックス領域は制限断片に結合するアダプターとＰＣＲ増幅に用いるプライマーとを示し、矢印はＤＮＡ合成の方向を示す。
【図４】標識制限断片のＰＣＲ増幅に関する概略図を示す。
【図５】標識制限断片のＰＣＲ増幅に用いる選択的プライマーの一般的設計を示し、矢印は制限断片の各末端における逆反復配列を示し、プライマーの選択性についてはそれぞれ選択的塩基配列と制限断片鋳型ＤＮＡの配列との間に完全な整合および全体的な不整合が存在する２つの例で示す。
【図６】アダプター配列に隣接してトリヌクレオチド配列を有する鋳型ＤＮＡ分子を選択するＰＣＲプライマーを用いた選択的ＰＣＲ増幅の原理を示す。
【図７】標識制限断片の選択的ＰＣＲ増幅を示す。
【図８】それぞれ６個の選択的塩基からなる２個のＰＣＲプライマーの組合せ物を用いた断片特異的増幅の原理を示し、各プライマーは制限断片の異なる鎖中に二本鎖構造を形成し、これによってＤＮＡ合成を開始させうるプライマー／鋳型複合体を形成する（矢印で示す）。
【図９】選択的制限断片増幅の方法により認識される一般的な配列要素を示し、図はさらに、認識される２つのヌクレオチド配列およびこれら２つの配列を分離する間隔を含む。
【図１０】増幅された断片長さ多形性の確認方法で検出されるヌクレオチド配列変化の種類を示す。
【図１１】選択性を増大するプライマーを用いるＰｓｔＩで制限したトマトＤＮＡの増幅結果の分析を含む１．０％アガロースゲルを示す。
【図１２】図１２は、断片特異的プライマーを用いるトマトＤＮＡの３種の異なるＰｓｔＩ断片に関する特異的増幅結果の分析を含む１．０％アガロースゲルを示す。
【図１３】２種のトマト品種の選択的制限断片増幅により得られるＤＮＡフィンガプリントを有する２．５％ポリアクリルアミド／１％アガロースゲルを示す。
【図１４】酵素組合せＰｓｔＩ／ＭｓｅＩと共にＳＲＦＡを用いる４種のトマト品種のＤＮＡフィンガプリントを有する４．５％変性ポリアクリルアミドゲル部分を示す。
【図１５】酵素組合せＰｓｔＩ／ＭｓｅＩと共にＳＲＦＡを用いる１０種のＬａｃｔｕｃａ品種のＤＮＡフィンガプリントを有する４．５％変性ポリアクリルアミドゲル部分を示す。
【図１６】酵素組合せＰｓｔＩ／ＴａｑＩおよびＥｃｏＲＩ／ＴａｑＩと共にＳＲＦＡを用いる２種のコーン品種のＤＮＡフィンガプリントを有する４．５％変性ポリアクリルアミドゲル部分を示す。
【図１７】酵素組合せＡｐａＩ／ＴａｑＩと共にＳＲＦＡを用いる２６種のキサントモナス・キャンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）株のＤＮＡフィンガプリントを有する４．５％変性ポリアクリルアミドゲル部分を示す。
【図１８】酵素組合せＳｓｅＩ／ＭｓｅＩと共にＳＲＦＡを用いる４種の家畜動物、すなわちニワトリ、ブタ、ウシおよびウマの種々異なる個体のＤＮＡフィンガプリントを有する４．５％変性ポリアクリルアミドゲル部分を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ＤＮＡから得られる制限フラグメントのサブセットを増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、ただし該制限フラグメントはアダプター配列と連結されており、該オリゴヌクレオチドプライマーが前記アダプター配列に相補的な配列、制限エンドヌクレアーゼで消化した後に残る制限部位の部分に相補的な配列、および該標的配列の３’末端に直ぐ隣接した、制限フラグメントのサブセットの選択的増幅を可能にする１〜１０個の選択性ヌクレオチドから成り、下記：
・ＰｓｔＩアダプターと連結した制限フラグメントの増幅を可能にするプライマー：
【化１】
・ＭｓｅＩアダプターと連結した制限フラグメントの増幅を可能にするプライマー：
【化２】
・ＴａｑＩアダプターと連結した制限フラグメントの増幅を可能にするプライマー：
【化３】
・ＥｃｏＲＩアダプターと連結した制限フラグメントの増幅を可能にするプライマー：
【化４】
・ＡｓｅＩアダプターと連結した制限フラグメントの増幅を可能にするプライマー：
【化５】
・Ｓｓｅ８３８７Ｉアダプターと連結した制限フラグメントの増幅を可能にするプライマー：
【化６】
・ＡｐａＩアダプターと連結した制限フラグメントの増幅を可能にするプライマー：
【化７】
から選択されるヌクレオチド配列を有することを特徴とする、前記オリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項２】
標的ＤＮＡから得られる制限フラグメントのサブセットを増幅するためのプライマーのセットであって、該制限フラグメントはアダプター配列と連結されており、該プライマーのセットは請求項１に記載の少なくとも２つのプライマーを含む、前記プライマーのセット。
【請求項３】
標的ＤＮＡから得られる制限フラグメントのサブセットを増幅するためのアダプターおよびプライマーのセットであって、該アダプターおよびプライマーのセットは制限フラグメントに連結する少なくとも１つのアダプター並びに１０〜５０ヌクレオチドを有する少なくとも１つのプライマーを含み、該アダプターおよびプライマーは、下記の群（ｉ）〜（ｖｉｉ）：
（ｉ）ＰｓｔＩ−アダプター
【化８】
（ｉｉ）ＰｓｔＩ−アダプター
【化９】
（ｉｉｉ）ＭｓｅＩ−アダプター
【化１０】
（ｉｖ）ＭｓｅＩ−アダプター
【化１１】
（ｖ）ＴａｑＩ−アダプター
【化１２】
（ｖｉ）ＴａｑＩ−アダプター
【化１３】
（ｖｉｉ）ＰｓｔＩ−アダプター
【化１４】
の中から選択されることを特徴とする、前記アダプターおよびプライマーのセット。
【請求項４】
標的ＤＮＡから得られる制限フラグメントのサブセットを増幅するためのキットであって、該制限フラグメントはアダプター配列と連結されており、該キットは請求項１に記載の少なくとも１つのプライマーを含むことを特徴とする前記キット。
【請求項５】
請求項２に記載のプライマーセットを含む請求項４に記載のキット。
【請求項６】
更に、１種または複数種の制限エンドヌクレアーゼを含む請求項５に記載のキット。
【請求項７】
更に、ＤＮＡポリメラーゼおよび／またはｄＮＴＰ、および／または緩衝液溶液を含む請求項６に記載のキット。
【請求項８】
ＤＮＡポリメラーゼがＴａｑポリメラーゼである請求項７に記載のキット。
【請求項９】
遺伝子分析のための請求項４〜８に記載の診断用キット。
【請求項１０】
ヒトの法医学的分類のための請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
動物または植物の形質の遺伝を検出するための請求項９に記載のキット。
【請求項１２】
増幅された制限フラグメントのセットであって、
（ａ） 出発ＤＮＡを少なくとも１種の制限エンドヌクレアーゼを用いて消化して、制限フラグメントに断片化し、
（ｂ） 得られた制限フラグメントを、該制限フラグメントの一端または両端に連結するのに適合した一端を有する少なくとも１種の２本鎖合成オリゴヌクレオチドアダプターに連結し、それによって標識付き制限フラグメントを生成し、
（ｃ） 前記標識付き制限フラグメントを、ハイブリダイゼーション条件下に、少なくとも１種のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させ、ここで前記プライマーおよびアダプターは、請求項２に記載のものの中から選択され、
（ｄ） 前記１種または複数種のプライマーにハイブリダイズした前記標識付き制限フラグメントを必要なヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼの存在下に増幅するか、またはハイブリダイズしたプライマーを前記標識付き制限フラグメントに沿って伸長させ、
（ｅ） ステップ（ｄ）で作製した増幅または伸長したＤＮＡフラグメントを同定または回収する、
ことを含む方法により得られる、増幅された制限フラグメントのセット。
【請求項１３】
ゲル、膜またはフィルム上に存在する請求項１２に記載の増幅された制限フラグメントのセット。
【請求項１４】
少なくとも１種の制限エンドヌクレアーゼを用いて標的ＤＮＡから得られる制限フラグメントのサブセットを増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、該オリゴヌクレオチドプライマーが、下記：
・ＰｓｔＩで消化した後に得られる制限フラグメントの増幅を可能にするプライマー：
【化１５】
・ＭｓｅＩで消化した後に得られる制限フラグメントの増幅を可能にするプライマー：
【化１６】
・ＴａｑＩで消化した後に得られる制限フラグメントの増幅を可能にするプライマー：
【化１７】
・ＥｃｏＲＩで消化した後に得られる制限フラグメントの増幅を可能にするプライマー：
【化１８】
・ＡｓｅＩで消化した後に得られる制限フラグメントの増幅を可能にするプライマー：
【化１９】
・Ｓｓｅ８３８７Ｉで消化した後に得られる制限フラグメントの増幅を可能にするプライマー：
【化２０】
・ＡｐａＩで消化した後に得られる制限フラグメントの増幅を可能にするプライマー：
【化２１】
から選択されるヌクレオチド配列を有することを特徴とする、前記オリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項１】
標的ＤＮＡから得られる制限フラグメントのサブセットを増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、ただし該制限フラグメントはアダプター配列と連結されており、該オリゴヌクレオチドプライマーが前記アダプター配列に相補的な配列、制限エンドヌクレアーゼで消化した後に残る制限部位の部分に相補的な配列、および該標的配列の３’末端に直ぐ隣接した、制限フラグメントのサブセットの選択的増幅を可能にする１〜１０個の選択性ヌクレオチドから成り、下記：
・ＰｓｔＩアダプターと連結した制限フラグメントの増幅を可能にするプライマー：
【化１】
・ＭｓｅＩアダプターと連結した制限フラグメントの増幅を可能にするプライマー：
【化２】
・ＴａｑＩアダプターと連結した制限フラグメントの増幅を可能にするプライマー：
【化３】
・ＥｃｏＲＩアダプターと連結した制限フラグメントの増幅を可能にするプライマー：
【化４】
・ＡｓｅＩアダプターと連結した制限フラグメントの増幅を可能にするプライマー：
【化５】
・Ｓｓｅ８３８７Ｉアダプターと連結した制限フラグメントの増幅を可能にするプライマー：
【化６】
・ＡｐａＩアダプターと連結した制限フラグメントの増幅を可能にするプライマー：
【化７】
から選択されるヌクレオチド配列を有することを特徴とする、前記オリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項２】
標的ＤＮＡから得られる制限フラグメントのサブセットを増幅するためのプライマーのセットであって、該制限フラグメントはアダプター配列と連結されており、該プライマーのセットは請求項１に記載の少なくとも２つのプライマーを含む、前記プライマーのセット。
【請求項３】
標的ＤＮＡから得られる制限フラグメントのサブセットを増幅するためのアダプターおよびプライマーのセットであって、該アダプターおよびプライマーのセットは制限フラグメントに連結する少なくとも１つのアダプター並びに１０〜５０ヌクレオチドを有する少なくとも１つのプライマーを含み、該アダプターおよびプライマーは、下記の群（ｉ）〜（ｖｉｉ）：
（ｉ）ＰｓｔＩ−アダプター
【化８】
（ｉｉ）ＰｓｔＩ−アダプター
【化９】
（ｉｉｉ）ＭｓｅＩ−アダプター
【化１０】
（ｉｖ）ＭｓｅＩ−アダプター
【化１１】
（ｖ）ＴａｑＩ−アダプター
【化１２】
（ｖｉ）ＴａｑＩ−アダプター
【化１３】
（ｖｉｉ）ＰｓｔＩ−アダプター
【化１４】
の中から選択されることを特徴とする、前記アダプターおよびプライマーのセット。
【請求項４】
標的ＤＮＡから得られる制限フラグメントのサブセットを増幅するためのキットであって、該制限フラグメントはアダプター配列と連結されており、該キットは請求項１に記載の少なくとも１つのプライマーを含むことを特徴とする前記キット。
【請求項５】
請求項２に記載のプライマーセットを含む請求項４に記載のキット。
【請求項６】
更に、１種または複数種の制限エンドヌクレアーゼを含む請求項５に記載のキット。
【請求項７】
更に、ＤＮＡポリメラーゼおよび／またはｄＮＴＰ、および／または緩衝液溶液を含む請求項６に記載のキット。
【請求項８】
ＤＮＡポリメラーゼがＴａｑポリメラーゼである請求項７に記載のキット。
【請求項９】
遺伝子分析のための請求項４〜８に記載の診断用キット。
【請求項１０】
ヒトの法医学的分類のための請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
動物または植物の形質の遺伝を検出するための請求項９に記載のキット。
【請求項１２】
増幅された制限フラグメントのセットであって、
（ａ） 出発ＤＮＡを少なくとも１種の制限エンドヌクレアーゼを用いて消化して、制限フラグメントに断片化し、
（ｂ） 得られた制限フラグメントを、該制限フラグメントの一端または両端に連結するのに適合した一端を有する少なくとも１種の２本鎖合成オリゴヌクレオチドアダプターに連結し、それによって標識付き制限フラグメントを生成し、
（ｃ） 前記標識付き制限フラグメントを、ハイブリダイゼーション条件下に、少なくとも１種のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させ、ここで前記プライマーおよびアダプターは、請求項２に記載のものの中から選択され、
（ｄ） 前記１種または複数種のプライマーにハイブリダイズした前記標識付き制限フラグメントを必要なヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼの存在下に増幅するか、またはハイブリダイズしたプライマーを前記標識付き制限フラグメントに沿って伸長させ、
（ｅ） ステップ（ｄ）で作製した増幅または伸長したＤＮＡフラグメントを同定または回収する、
ことを含む方法により得られる、増幅された制限フラグメントのセット。
【請求項１３】
ゲル、膜またはフィルム上に存在する請求項１２に記載の増幅された制限フラグメントのセット。
【請求項１４】
少なくとも１種の制限エンドヌクレアーゼを用いて標的ＤＮＡから得られる制限フラグメントのサブセットを増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、該オリゴヌクレオチドプライマーが、下記：
・ＰｓｔＩで消化した後に得られる制限フラグメントの増幅を可能にするプライマー：
【化１５】
・ＭｓｅＩで消化した後に得られる制限フラグメントの増幅を可能にするプライマー：
【化１６】
・ＴａｑＩで消化した後に得られる制限フラグメントの増幅を可能にするプライマー：
【化１７】
・ＥｃｏＲＩで消化した後に得られる制限フラグメントの増幅を可能にするプライマー：
【化１８】
・ＡｓｅＩで消化した後に得られる制限フラグメントの増幅を可能にするプライマー：
【化１９】
・Ｓｓｅ８３８７Ｉで消化した後に得られる制限フラグメントの増幅を可能にするプライマー：
【化２０】
・ＡｐａＩで消化した後に得られる制限フラグメントの増幅を可能にするプライマー：
【化２１】
から選択されるヌクレオチド配列を有することを特徴とする、前記オリゴヌクレオチドプライマー。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【公開番号】特開２００８−１３１９４７（Ｐ２００８−１３１９４７Ａ）
【公開日】平成２０年６月１２日（２００８．６．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３２９８３３（Ｐ２００７−３２９８３３）
【出願日】平成１９年１２月２１日（２００７．１２．２１）
【分割の表示】特願２０００−２２４１８７（Ｐ２０００−２２４１８７）の分割
【原出願日】平成４年９月２４日（１９９２．９．２４）
【出願人】（５００３４５１８０）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年６月１２日（２００８．６．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月２１日（２００７．１２．２１）
【分割の表示】特願２０００−２２４１８７（Ｐ２０００−２２４１８７）の分割
【原出願日】平成４年９月２４日（１９９２．９．２４）
【出願人】（５００３４５１８０）
【Ｆターム（参考）】
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