選択的シグナル阻害剤を用いた非分離アッセイ
試料中の被検体を測定するための方法、試薬、キット、およびシステムが開示されており、このアッセイ法は、化学発光標識された、固定化された特異的結合メンバー、アクチベーター標識特異的結合メンバー、選択的シグナル阻害剤、および試料を添加することによって、水溶液中で反応混合物を形成するステップであって、化学発光標識された、固定化された特異的結合メンバー、およびアクチベーター標識特異的結合メンバーは、試料中に存在する被検体に結合することによって、結合複合体を形成するステップと、反応混合物中に存在する、被検体が結合した結合複合体の量に相関した、検出可能な化学発光シグナルを放出するために、トリガー溶液を反応混合物に添加するステップを含む。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
特異的結合アッセイは、物質の量の存在を検出するための試験方法であり、特異的結合パートナーの特異的な認識およびこれとの結合に基づく。イムノアッセイは、特異的結合アッセイの例であり、抗体が特定のタンパク質または化合物に結合する。この例では、抗体は、特異的結合対メンバーの一メンバーである。核酸結合アッセイは、別の型であり、相補的核酸鎖が特異的結合対である。特異的結合アッセイは、技術の広く、成長しつつある分野を占め、これは、疾患状態、感染性の生物、および乱用薬物の正確な検出を可能にする。要求される感度、ダイナミックレンジ、ロバスト性、自動化のための広い適用性および適正を有するアッセイおよびアッセイ法を考案するために、多くの研究が過去数十年にわたって捧げられている。これらの方法は、２つのカテゴリーに広く分類することができる。
【０００２】
ホモジニアス法は、被検体特異的結合反応を利用することによって、被検体特異的反応物と被検体非特異的反応物の間の分離ステップを必要とすることなく、検出可能なシグナルを調節し、または作り出す。ヘテロジニアス形式は、被検体が結合した、および遊離した（被検体に結合していない）検出可能な程度に標識された特異的結合パートナーの物理的な分離に依拠する。分離は一般に、極めて重要な反応物が、いくつかの型の物理的プロセス、例えば、濾過、沈殿、凝集、または磁気分離を使用することができるように、いくつかの型の固体基材上に固定されることを必要とし、一般に、遊離した検出可能な程度に標識された特定の結合パートナーを除去するために、洗浄ステップも必要とする。
【０００３】
化学発光シグナルの生成に依拠し、これを被検体の量に関連づけるアッセイ法は、ますます使用されてきている。そのような方法は、相対的に単純な機器を用いて実施され、それでも良好な分析特性を示すことができる。特に、被検体のために酵素標識特異的結合パートナー（ｅｎｚｙｍｅ−ｌａｂｅｌｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐａｒｔｎｅｒ）、および検出のために化学発光酵素基質を使用する方法は、広範な用途がある。一般的な標識酵素には、アルカリホスファターゼ、および西洋わさびペルオキシダーゼが含まれる。
【０００４】
特許文献１は、第１の膜上の増感剤または増感剤標識プローブに結合したポリヌクレオチド被検体を検出する方法を開示している。この膜は、固定化された化学発光前駆体を有する第２の膜と接触している。サンドイッチ状になった膜中の増感剤が励起されると一重項酸素が生成し、これは、化学発光前駆体と反応することによって、第２の膜上に作動可能な（ｔｒｉｇｇｅｒａｂｌｅ）化学発光化合物を生成する。作動可能な化学発光化合物は、試薬と反応することによって、第２の膜上で、被検体を検出するための化学発光を生じさせる。これらの方法は、反応物を接触させるための特異的結合反応に依拠せず、むしろ第２の膜は、試薬送達デバイスとして機能を果たす。
【０００５】
特許文献２は、被検体が、光感受性物質および化学発光化合物をごく接近させるような条件下で、被検体を含有する疑いのある媒質を処理するステップを含むアッセイ法を開示している。光増感剤は、光源で照射されると一重項酸素を生成し、一重項酸素は、溶液を通じて拡散し、化学発光化合物がごく近くにあるとき、化学発光化合物を活性化する。活性化された化学発光化合物は、引き続いて光を生成する。生成される光の量は、媒質中の被検体の量に関係する。一実施形態では、光増感剤または化学発光化合物の少なくとも１つは、懸濁可能な（ｓｕｓｐｅｎｄｉｂｌｅ）粒子と結合し、特異的な結合対メンバーがそれに結合する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第６，９１１，３０５号明細書
【特許文献２】米国特許第６，４０６，９１３号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
米国特許出願公開第ＵＳ２００７０２６４６６４号、および同第ＵＳ２００７０２６４６６５号は、固定化された化学発光化合物と、特異的な結合反応によって反応性の配置にされたアクチベーター化合物との反応を伴う、特異的結合対アッセイを実施するためのアッセイ法を開示している。過剰の非結合の化学発光化合物またはアクチベーターの分離または除去をまったく必要としない。これらのアッセイ形式は、従来技術のアッセイ技法と比較して、自動化における優れた操作の利便性および柔軟性をもたらす。これらの利点にもかかわらず、アッセイ設計および性能の追加の改善は、依然としてアッセイ開発者の目標となっている。本開示のアッセイ法は、改善された感度の単純なアッセイ法を提供することによって、これらの必要性に対処する。
【０００８】
定義
アルキル −− １〜２０個の炭素を含有する分枝、直鎖、または環状の炭化水素基であり、これは、Ｈ以外の１つ以上の置換基と置換されていてもよい。低級アルキルは、本明細書で使用する場合、最大８個の炭素を含有するアルキル基を指す。
【０００９】
被検体 −− アッセイにおいて検出されるべき試料中の物質。被検体への特異的な結合親和性を有する１つ以上の物質が、被検体を検出するのに使用される。被検体は、タンパク質、ペプチド、抗体またはハプテン（それに結合する抗体が作られ得る）とすることができる。被検体は、相補的な核酸またはオリゴヌクレオチドによって結合される核酸またはオリゴヌクレオチドであってもよい。被検体は、特異的結合対のメンバーを形成する任意の他の物質とすることができる。他の例示的な型の被検体として、ステロイドなどの薬物、ホルモン、タンパク質、糖タンパク質、ムコタンパク質、核タンパク質、リンタンパク質、乱用薬物、ビタミン、抗菌薬、抗真菌薬、抗ウイルス剤、プリン、抗腫瘍薬、アンフェタミン、アゼピン化合物、ヌクレオチド、およびプロスタグランジン、ならびにこれらの薬物のいずれかの代謝産物、農薬および農薬の代謝産物、ならびに受容体が挙げられる。被検体には、細胞、ウイルス、細菌、および真菌も含まれる。
【００１０】
アクチベーター：トリガーの存在下で、化学発光が生じるような化学発光化合物の活性化をもたらす、標識と呼ばれる場合もある化合物。
【００１１】
アクチベーター標識ｓｂｍ、またはアクチベーター特異的結合メンバーコンジュゲート − 連結している配置で少なくとも以下のものを含むアッセイミックス中の反応物：ａ）被検体のための特異的結合メンバー、およびｂ）化学発光化合物の活性化をもたらすアクチベーター化合物または標識。
【００１２】
抗体 −− 天然および操作された完全免疫グロブリン、ならびにその天然および操作された一部および断片を含む。
【００１３】
アラルキル −− アリール基で置換されたアルキル基。例には、ベンジル、ベンズヒドリル（ｂｅｎｚｙｈｙｄｒｙｌ）、トリチル、およびフェニルエチルが含まれる。
【００１４】
アリール −− Ｈ以外の１つ以上の置換基で置換されている場合がある、１〜５個の炭素環式芳香環を含有する芳香環含有基。
【００１５】
生体物質 −− 例えば、全血、抗凝固処理全血（ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｔｅｄ ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ）、血漿、血清、組織、動物細胞および植物細胞、細胞の内容物、ウイルス、ならびに真菌を含む。
【００１６】
化学発光化合物 −− 例えば、電子励起状態において形成される別の化合物に変換されることによって、光の放出を引き起こすように反応を起こす、標識と呼ばれる場合もある化合物。励起状態は、一重項励起状態であっても、三重項励起状態であってもよい。励起状態は、基底状態に緩和すると光を直接放出することができ、または放出性エネルギーアクセプター（ｅｍｉｓｓｉｖｅ ｅｎｅｒｇｙ ａｃｃｅｐｔｏｒ）に励起エネルギーを移し、それによって基底状態に戻ることができる。エネルギーアクセプターは、このプロセスにおいて励起状態に上げられ、光を放出する。
【００１７】
化学発光標識固定ｓｂｍ（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ−ｌａｂｅｌｅｄ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｓｂｍ）：連結している配置で少なくとも以下のものを含むアッセイミックス中の反応物：ａ）被検体のための特異的結合メンバー、ｂ）化学発光化合物または標識、およびｃ）固相。
【００１８】
連結している −− 本明細書で使用する場合、２つ以上の化学種または支持体材料（ｓｕｐｐｏｒｔ ｍａｔｅｒｉａｌ）が、例えば、１つ以上の共有結合によって化学的に連結され、または例えば、吸着、イオン引力、もしくは親和結合などの特異的結合プロセスによって受動的に結合されていることを示す。そのような種または物質が互いに連結されているとき、１つを超える型の連結を伴っていてもよい。
【００１９】
ヘテロアルキル −− 環または非末端鎖炭素原子の少なくとも１つが、Ｎ、Ｏ、またはＳから選択されるヘテロ原子で置換されているアルキル基。
【００２０】
ヘテロアリール −− 環炭素原子の１〜３個が、Ｎ、Ｏ、またはＳから選択されるヘテロ原子で置換されているアリール基。例示的な基には、ピリジル、ピロリル、チエニル、フリル、キノリル、およびアクリジニル基が含まれる。
【００２１】
磁性粒子 −− 本明細書で使用する場合、磁気応答性成分を有する微粒子材料を包含する。磁気応答性には、強磁性材料、常磁性材料、および超常磁性材料が含まれる。一例示的な磁気応答性材料は、磁鉄鉱である。粒子は、磁気応答性であり、１つ以上の非磁気応答性層によって囲繞されている固体コア部分を有することができる。交互に（ａｌｔｅｒｎａｔｅｌｙ）、磁気応答性部分は、非磁気応答性コアの周囲の層とすることができ、または非磁気応答性コア内に配置された粒子とすることができる。
【００２２】
試料 −− アッセイにおいて測定される被検体を含有するか、または含有する疑いのある混合物。被検体として、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、ホルモン、抗体、薬物、およびステロイドが挙げられる。本開示の方法において使用することができる典型的な試料として、体液、例えば、収集された血液試料中に一般に見出されるような抗凝固処理血液であってもよい血液、血漿、血清、尿、精液、唾液、細胞培養物、組織抽出物などが挙げられる。他の型の試料として、溶媒、海水、工業用水試料、食物試料、および土壌または水などの環境試料、植物材料、真核生物、細菌、プラスミド、ウイルス、真菌、および原核生物に由来する細胞が挙げられる。
【００２３】
ＳＳＩＡ、（選択的シグナル阻害剤（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｓｉｇｎａｌ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ Ａｇｅｎｔ）） − 非特異的なシグナルまたはバックグラウンドシグナルが、アッセイ反応混合物の化学発光生成反応から生じる被検体特異的シグナルより大きい量で低減されるように、本開示のアッセイ反応混合物で提供される化合物。
【００２４】
固体支持体 −− アッセイ成分が固定化される表面を有する物質。物質は、粒子、微粒子、ナノ粒子、金属コロイド、繊維、シート、ビーズ、膜、フィルター、ならびに他の支持体、例えば、試験管、マイクロウェル、チップ、ガラススライド、およびマイクロアレイなどの形態とすることができる。
【００２５】
可溶性の、溶解度、可溶化する − １つの物質が、別の物質と均一にブレンドする能力または傾向。本開示では、溶解度および関連用語は一般に、液体中の固体、例えば、水性緩衝液中のＳＳＩＡの特性を指す。固体は、これらがその結晶形態を失い、溶媒（例えば、液体）中に、分子的またはイオン的に溶解または分散した状態になることによって真の溶液を形成する程度に可溶性である。対照的に：１つの相が、沈殿を阻止するように安定化されていても、安定化されていなくても、バルク物質全体にわたって分布した小さい粒子（微粒子またはコロイドサイズの粒子を含む）からなる２相系。
【００２６】
置換された −− １つの基上の少なくとも１つの水素原子の、非水素基による置換を指す。置換される基に関して、別段の明らかな指示のない限り、複数の置換箇所が存在し得ることが意図されていることに留意すべきである。
【００２７】
試験デバイス −− 本発明によるアッセイの試料および他の成分を含めるための容器または装置。例えば、様々なサイズおよび形状の試験管、マイクロウェルプレート、上にアレイが形成またはプリントされるチップおよびスライド、試験紙および膜が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１Ａ】図１Ａは、実施例１０に記載したような本方法の化学発光反応におけるバックグラウンド化学発光に対するｐＨの影響を実証するプロットである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、実施例１０に記載したような本方法の化学発光反応における特異的シグナル化学発光に対するｐＨの影響を実証するプロットである。
【図２Ａ】図２Ａは、実施例１７に記載したようなイムノアッセイ法におけるｃＴｎＩの検出を例示するプロットである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、実施例１７に記載したようなイムノアッセイ法における希釈系列中のｃＴｎＩの検出を例示するプロットである。
【図２Ｃ】図２Ｃは、実施例１７に記載したようなイムノアッセイ法における希釈系列中のｃＴｎＩの検出を例示するプロットである。
【図３】図３は、実施例１８に記載したような参照方法の結果と比較した、本発明の方法によって行われたｃＴｎＩアッセイの結果の比較を例示するプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本開示は、試料中の被検体を測定するための、改善されたアッセイ法を提供する。特に、本開示は、分離ステップを必要としない被検体特異的結合アッセイを記述し、非特異的シグナルまたはバックグラウンドに対する被検体特異的シグナル応答の改善を提供する。
【００３０】
目ざましいことに、出願人らは、そのようなアッセイ法は、選択的シグナル阻害剤（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｓｉｇｎａｌ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ Ａｇｅｎｔ）、ＳＳＩＡを使用することによって、さらに改善することができることを発見した。本方法では、過剰のアクチベーターおよび／または過剰の化学発光化合物が除去されないアッセイシステムにＳＳＩＡを添加することにより、感度のよい、特異的な、被検体濃度依存性結合アッセイを実施する能力が著しく改善される。それによって、アッセイの精度および感度が改善され、より信頼でき、有用な試験をもたらす。この改善は、予期されておらず、または予測可能でなかった。ＳＳＩＡを使用することによって、共に、被検体との標識された特異的結合対メンバーの複合体中に結合した、固定された化学発光標識とアクチベーター標識との反応によって生じるシグナルと、存在するが、そのような複合体中ではない標識からのシグナルとの比は、劇的に改善される。さらに、低レベルの被検体でのバックグラウンド効果が最小化される。
【００３１】
米国特許出願公開第ＵＳ２００７０２６４６６４号、および同第ＵＳ２００７０２６４６６５号において以前に開示された方法は、被検体特異的結合反応を使用することによって、物質の存在、位置、または量を検出するための、改善された、迅速で単純なアッセイ法を提供した。このアッセイ法は、固定化された化学発光化合物と、被検体に媒介される特異的な結合反応によって反応性の配置にされたアクチベーター化合物との反応を伴う。アッセイおよび方法は、複合体中に結合した特異的結合パートナーから遊離の特異的結合パートナーを分離することなく実施される。
【００３２】
本方法は、化学発光標識に連結している、固定された被検体特異的結合メンバー、化学発光標識と反応するためのアクチベーターに連結している被検体のための、固定されていない被検体特異的結合メンバー、および選択的シグナル阻害剤の使用を必要とする。トリガー溶液の添加により、被検体を検出するための化学発光の放出が開始される。アッセイおよび方法は、複合体中に結合した特異的結合パートナーから遊離の特異的結合パートナーを分離することなく実施される。
【００３３】
本開示は、被検体特異的結合反応によって、物質の存在、位置、または量を検出するための、改善された、迅速で単純なアッセイ法に関する。この方法は、固定された被検体特異的結合メンバー、および被検体のための固定されていない被検体特異的結合メンバーの使用を必要とする。一方の被検体特異的結合メンバーは、化学発光標識と結合している一方で、他方の被検体特異的結合メンバーは、アクチベーターと結合している。多くの実施形態では、化学発光反応を誘導するアクチベーター化合物は、被検体、エンハンサー、選択的シグナル阻害剤、およびトリガー溶液を含有する水溶液中で、被検体に結合している被検体特異的結合メンバーのいずれか、または両方によって媒介される場合、固体支持体上の化学発光標識と近接した状態にされ、それによって、被検体濃度に関係する検出可能な化学発光シグナルを生成する。他の実施形態では、固体支持体上で、化学発光反応を誘導するアクチベーター化合物は、被検体、エンハンサー、選択的シグナル阻害剤、およびトリガー溶液を含有する水溶液中で、他方の被検体特異的結合メンバーへの結合を被検体と競合する一方の被検体特異的結合メンバーによって媒介される場合、化学発光標識と近接になることを妨げられ、それによって、被検体濃度に逆に関係する検出可能な化学発光シグナルを生成する。
【００３４】
多くの実施形態では、一方の被検体特異的結合メンバー（「ｓｂｍ」）は、固体支持体および化学発光標識（「化学発光標識固定ｓｂｍ」）に連結されている一方で、別の被検体特異的結合メンバーは、水溶液中で固定化されていないアクチベーターと連結されている（「アクチベーター標識ｓｂｍ」）。化学発光標識固定ｓｂｍ、アクチベーター標識ｓｂｍ、エンハンサー、選択的シグナル阻害剤、試料、およびトリガー溶液は、アクチベーターが、トリガー溶液を添加すると化学発光を生じさせる反応を活性化するのに有効であるように、固定化された化学発光化合物に作動可能に近接した状態にされるとき、検出可能なシグナルを生成する。作動可能な近接とは、化学発光化合物およびアクチベーターが、最大で物理的接触を含めて、これらが反応することができるほど十分に近いことを意味する。多くの実施形態では、アクチベーター標識特異的結合メンバーは、被検体の存在、位置、または濃度を決定するのに必要な量に対して過剰にシステムに供給される。
【００３５】
一態様では、本方法は、化学発光化合物およびアクチベーターが、トリガー溶液を添加すると化学発光反応が実施されるのを可能にするように、固体支持体において作動可能に近接された１つ以上の被検体特異的結合メンバーの被検体特異的結合反応を介して、共に空間的に束縛されているという点で、ほとんどの従来の試験方法と異なる。一般に、自己の特許出願ＰＣＴ ＷＯ２００７／０１３３９８は、過剰の固定されていない、または固定されたメンバーの存在により、除去されない場合でも、感度のよい特異的結合アッセイを実施する能力を無効にされないアッセイ法を教示している。例えば、固定化されていないアクチベーターは、トリガー溶液の添加および検出の前に除去されず、その理由は、その存在は、化学発光検出シグナルが被検体の量と相関することを妨げないためである。
【００３６】
アッセイ感度の改善におけるＳＳＩＡの機能は、スキーム１を参照して理解される。遊離した、および複合体形成した、化学発光標識ｓｂｍ、およびアクチベーター標識ｓｂｍの組合せが、トリガー溶液が添加されるとき、観察される化学発光シグナルに寄与することができる。
【００３７】
スキーム１
１ 結合−Ａｃｔ＋結合−ＣＬ→特異的シグナル
２ 結合−Ａｃｔ＋遊離−ＣＬ→非特異的シグナル
３ 遊離−Ａｃｔ＋結合−ＣＬ→非特異的シグナル
４ 遊離−Ａｃｔ＋遊離−ＣＬ→非特異的シグナル
スキームに示したように、反応１は、アッセイにおいて被検体の量に関係づけられるシグナルを生成する。ＳＳＩＡは、少なくとも部分的には、反応１からのシグナルの量と関連して、反応２からのシグナルの量を選択的に阻害または抑制することによって、その目ざましい機能を実現する。ＳＳＩＡは、外因性干渉物質からのシグナル生成を抑制することによって、シグナル：バックグラウンドの比を改善することもできる。
【００３８】
一実施形態では、アッセイ法、特に、結合アッセイ法であって、化学発光標識固定ｓｂｍ化合物、アクチベーター標識ｓｂｍが、被検体の存在による少なくとも１つの特異的結合反応を介して、作動可能に近接され、ここで、結合したアクチベーターコンジュゲートが、被検体の存在、位置、または量を検出するために、選択的シグナル阻害剤およびエンハンサーの存在下でトリガー溶液を添加すると、化学発光を生成する反応を活性化する、アッセイ法が提供される。
【００３９】
いくつかの他の実施形態では、アクチベーター標識ｓｂｍが、化学発光標識固定ｓｂｍと結合することに対して被検体と競合する競合アッセイ形式が利用され、それによって、被検体濃度または競合アッセイと逆の関係で化学発光を生じさせる。そのような実施形態では、アクチベーターは、化学発光標識固定ｓｂｍに結合しているアクチベーター標識ｓｂｍによって、固定化された化学発光化合物に作動可能に近接した状態にされることによって、エンハンサーの存在下でトリガー溶液を添加すると化学発光を生じさせる反応を活性化する。化学発光シグナルは、被検体濃度が増大するにつれて減少し、それによって、化学発光標識固定ｓｂｍに結合するアクチベーター標識ｓｂｍの結合を競合的にブロックする。
【００４０】
アッセイ成分、例えば、被検体を含有する試料、アクチベーター標識ｓｂｍ、化学発光標識固定ｓｂｍ、選択的シグナル阻害剤、およびエンハンサーなどは、洗浄も分離もすることなく、試験容器に様々な順序および組合せで添加することができ、トリガー溶液を添加すると発光を読み取ることができる。一実施形態では、例えば、試料ならびにアクチベーター標識ｓｂｍおよび／または化学発光標識固定ｓｂｍは、予め混合することができる。一実施形態では、ＳＳＩＡは、アクチベーター標識ｓｂｍおよび／または化学発光標識固定ｓｂｍおよび／または試料とのプレミックス中に含めることができる。エンハンサーを、プレミックス中に含め、またはトリガー溶液と共に添加することができる。過剰の非結合の反応物の洗浄も分離もまったく必要としない。
【００４１】
化学発光基質、および酵素標識コンジュゲートを使用する従来のアッセイは、標識酵素の量に対して大過剰で化学発光基質を供給する。しばしば、基質／酵素のモル比は、１０の９乗、すなわち、１０億倍過剰を超える場合がある。連続的な酵素ターンオーバーのために基質の適切な供給を確実にし、このプロセスがアッセイ法において適切な検出感度を保証するために、そのような非常に大過剰の化学発光化合物を供給することが、従来のアッセイにおいて必要であると考えられている。出願人らは、化学発光化合物とアクチベーターの比を数桁低減する高感度のアッセイ法を考案することが可能であることを見出した。この点において、本明細書に記載されるこれらの方法は、公知の酵素連結アッセイ法と基本的に異なる。
【００４２】
上記したように、かつ以下に記載される例示的なアッセイにおいて実証されるように、洗浄ステップおよび分離ステップの排除は、アッセイプロトコールの設計を単純化する機会をもたらす。操作ステップの数の低減は、アッセイ時間、不完全な洗浄に由来するアッセイ間ばらつき、および費用を減少させる。同時に、これは、自動化および小型化に付帯的な固有の利点のすべてを伴って、アッセイの実行を自動化および小型化する能力を増強する。
【００４３】
一般に、本方法によって実施されるアッセイでは、対象とする被検体を特異的に捕捉するために、固体支持体が試験デバイス内に提供される。固体支持体は、検出される被検体に直接または間接的に結合するための、固定化された特異的結合メンバーとともに提供される。固体支持体は、その上に固定化される標識、多くの実施形態では、化学発光標識とともにさらに提供される。
【００４４】
アクチベーター標識ｓｂｍも試験デバイスに導入される。アクチベーター標識ｓｂｍおよび化学発光標識固定ｓｂｍは、被検体を含有する試料の存在下で、特異的結合複合体を形成することが可能になる。試料、アクチベーター標識ｓｂｍ、化学発光標識固定ｓｂｍ、ＳＳＩＡ、およびエンハンサーは、任意の順序で別個に、もしくは同時に添加することができ、または予め混合し、組合せとして添加することができる。反応を誘導する前に、結合反応を起こさせる時間期間（「インキュベーション」）を、任意の添加の間または後に挿入することができる。
【００４５】
最後に、トリガー溶液が添加されることによって、被検体を検出するための化学発光が生じ、化学発光が検出される。トリガー溶液は、以下にさらに記載されるように過酸化物を最小限で含有するが、エンハンサー、および時折ＳＳＩＡも含有することができる。一般に、ピーク光強度レベル、指定された時間期間にわたる全ＲＬＵ、または全積分光強度のいずれかが測定される。光の量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）は、一般に公知の方法に従って較正曲線を構築することによって、被検体の量（ａｍｏｕｎｔ）と関連付けることができる。発光が、トリガー溶液を添加すると急速に引き続いて起こる場合、適当な注射器を用いての添加に対する測定の開始の時間を機械的に調節し、または検出器にすでに曝された試験デバイスを用いて添加を実施することが望ましい。反応物の最適量、体積、希釈、特異的結合対反応のためのインキュベーション時間、反応物の濃度などは、日常の実験によって、特異的結合アッセイを実施する方法に対する標準的な論文を参照することによって、および以下に詳細に記載される具体例を指針として使用して容易に決定することができる。
【００４６】
本方法およびアッセイにおいて使用される被検体特異的結合メンバーの濃度または量は、被検体濃度、所望の結合の速度／アッセイ時間、費用、およびコンジュゲートの利用可能性、被検体特異的結合メンバーの非特異的結合の程度などの要因に依存する。通常、被検体特異的結合メンバーは、最小の予測される被検体濃度に少なくとも等しく、より通常には、少なくとも予期される最高の被検体濃度で存在し、非競合的アッセイについては、濃度は、最高被検体濃度の１０〜１０６倍である場合があるが、通常、１０−４Ｍ未満、好ましくは１０−６Ｍ未満、しばしば１０−１１〜１０−７Ｍの間である。ｓｂｍメンバーと連結されるアクチベーターまたは化学発光化合物の量は、通常、被検体特異的結合メンバー当たり少なくとも１つの分子であり、アクチベーターまたは化学発光分子が粒子に固定されている場合、１０５ほどの多さ、通常少なくとも１０〜１０４もの多さとなり得る。アクチベーターと化学発光化合物の例示的な比は、加工した実施例に提供されている。
【００４７】
選択的シグナル阻害剤（ＳＳＩＡ）
本発明の選択的シグナル阻害剤は、遊離した、および／または被検体が結合した化学発光標識ｓｂｍ、遊離した、および／または被検体が結合したアクチベーター標識ｓｂｍ、エンハンサー、ならびにトリガー溶液を含むアッセイ反応混合物中に含められる場合、被検体が結合した標識ｓｂｍメンバーから得られるシグナルが、ＳＳＩＡの不存在下で起こるより、有意に大きい程度でバックグラウンドシグナルを超えるような化合物である。
【００４８】
１つ以上の選択的シグナル阻害剤が、１０−６Ｍ〜１０−１Ｍの間、しばしば１０−６Ｍ〜１０−２Ｍの間、多くの場合１０−５Ｍ〜１０−３Ｍの間、時折１０−５Ｍ〜１０−４Ｍの間の濃度で、反応方法において存在する。いくつかの実施形態では、選択的シグナル阻害剤は、５×１０−６Ｍ〜５×１０−４Ｍの間で、本方法による反応において存在する。なおさらなる実施形態では、選択的シグナル阻害剤は、５×１０−５Ｍ〜５×１０−４Ｍの間で、本方法による反応において存在する。
【００４９】
選択的シグナル阻害剤は、反応溶液中で意図されるより高い濃度で、別個の試薬または溶液として供給することができる。この実施形態では、測定された量の作業溶液（ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）が反応溶液中に投与されることによって、所望の反応濃度が実現される。別の実施形態では、選択的シグナル阻害剤は、標識ｓｂｍメンバーの１つ以上を含有する溶液中に合わされる。別の実施形態では、選択的シグナル阻害剤は、トリガー溶液の成分として提供される。
【００５０】
選択的シグナル阻害剤が、シグナル：バックグラウンド比を改善する程度は、他の要因の中でも、化合物の素性、およびこれが使用される濃度に応じて変化する。この程度は、改善係数の観点からその枠を決めることができ、この観点では、アッセイが選択的シグナル阻害剤を用いて実施される、特定の被検体濃度でのアッセイのシグナル：バックグラウンド比が、選択的シグナル阻害剤を用いない、同じ被検体濃度でのアッセイのシグナル：バックグラウンド比と比較される。改善係数＞１は、改善されたアッセイの尺度、および選択的シグナル阻害剤の有益な効果の証拠である。本発明の実施形態では、少なくとも５など、および少なくとも１０、または少なくとも５０を含めた少なくとも２の改善係数が実現される。以下の実施例を参照すると、改善係数は、被検体濃度の関数としてアッセイ内で変化し得ることが分かる。例えば、改善係数は、被検体濃度が増大するにつれて増大する場合がある。別の実施形態では、濃度間の改善係数の変動は、より直線的な較正曲線、すなわち、化学発光強度対被検体濃度のプロットをもたらす場合がある。
【００５１】
以下の表は、選択的シグナル阻害剤として有効に機能することができる化合物を、限定することなく列挙する。明確に列挙されていない追加の化合物は、実施例に記載されるアッセイおよびスクリーニング検査方法の通常の適用によるものを含めて、本開示の技法を使用して見出すことができる。
【００５２】
【表１−１】
【００５３】
【表１−２】
【００５４】
いくつかの実施形態では、選択的シグナル阻害剤は、ジアルキルヒドロキシアミンから選択される。いくつかの実施形態では、選択的シグナル阻害剤は、オルトまたはパラ関係に配向した少なくとも２つのヒドロキシル基を有する芳香族化合物から選択される。例示的な化合物は、以下のものを含む。
【００５５】
【化１】
【００５６】
いくつかの他の実施形態では、選択的シグナル阻害剤は、オルトまたはパラ関係に配向した、少なくとも１つのヒドロキシル基および１つのアミノ基を有する芳香族化合物から選択される。例示的な化合物は、以下のものを含む。
【００５７】
【化２】
【００５８】
さらに他の実施形態では、選択的シグナル阻害剤は、エンジオールとしても公知である、Ｃ−Ｃ二重結合上で置換された少なくとも２つのヒドロキシル基を有する化合物から選択される。例示的な化合物は、以下のものを含む。
【００５９】
【化３】
【００６０】
一実施形態では、選択的シグナル阻害剤は、窒素複素環式化合物から選択される。例示的な化合物は、以下のものを含む。
【００６１】
【化４】
【００６２】
一実施形態では、選択的シグナル阻害剤は、過酸化物と接触すると活性ＳＳＩＡに変換可能な化合物として、マスクされた形態で供給される。適当なマスクされたＳＳＩＡ化合物は、例えば、ヒドロキシル置換またはアミノ置換アリールボロン酸化合物から選択される。例示的な化合物は、以下のものを含む。
【００６３】
【化５】
【００６４】
一実施形態では、選択的シグナル阻害剤は、
【００６５】
【化６】
【００６６】
から選択される。
【００６７】
様々な実施形態では、上記選択的シグナル阻害剤の１つ以上が、本開示のアッセイ法、アッセイ、またはキットにおいて組み合わせて使用される。
【００６８】
いくつかの実施形態では、選択的シグナル阻害剤は、水溶液中で１０倍作業溶液の溶解度を有する。作業溶液は、濃縮溶液の一部が反応混合物に添加されることによって、トリガー溶液を添加した後に必要とされる最終濃度を与えるような濃縮水溶液として定義される。
【００６９】
選択的シグナル阻害剤の作業溶液のための適当な水溶液は、以下の追加の成分のうちの１つ以上を含む：塩、生物学的緩衝液、エタノール、メタノール、グリコールを含めたアルコール、および界面活性剤。いくつかの実施形態では、水溶液には、緩衝液ＩＩ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｂｒｅａ ＣＡから市販されている、ＴＲＩＳ緩衝食塩水、界面活性剤、＜０．１％のアジ化ナトリウム、および０．１％のＰｒｏＣｌｉｎ３００（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ））、２５％のエタノール／７５％の緩衝液ＩＩ、２５％のエタノール／７５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（１％）、または１０％の０．１ＮのＮａＯＨ／９０％の緩衝液ＩＩなどのＴｒｉｓ緩衝水溶液が含まれる。
【００７０】
固相支持体
本開示の方法の多くの実施形態では、化学発光標識は、試験システムの成分に固定化される。標識は、以下により詳細に記載されるように、いくつかの異なる方法で提供することができる。各改変体において、標識は、それを固定された状態にする様式で物質または材料に安定に、または不可逆的に結合される。「不可逆的に」とは、標識が、意図されたアッセイにおける使用条件下で、固体支持体から実質的に除去されないことを意図する。受動的結合または非共有結合的な結合も企図され、ただし、標識は、使用条件下で固体支持体上に、安定に結合および保持される。これは、いくつかの方法のいずれでも実現することができる。
【００７１】
アッセイを実施するための本開示の実施形態では、化学発光標識は、固体支持体の表面に固定化された状態になる。被検体は、例えば、未標識の被検体特異的結合メンバーによって、固体支持体の表面に結合される。化学発光標識は、固体支持体に結合した、固定化された化学発光標識付近にアクチベーターを運ぶ特異的結合反応によって、アクチベーターと反応性の配置にされる。次いで、トリガー溶液が添加され、化学発光が測定される。
【００７２】
一実施形態では、化学発光標識は、固定化された被検体特異的結合メンバーに共有結合でつながれる。一例は、マイクロプレートのウェル上、または粒子上に固定化された、標識された捕捉抗体または抗体断片である。被検体特異的結合メンバーの固定化は、共有結合（ｃｏｖａｌｅｎｔ ｌｉｎｋａｇｅ）または吸着プロセスによるものとすることができる。この形式では、化学発光標識は、「サンドイッチ」形式で被検体を共に結合している２つの特異的結合パートナーによって、アクチベーターと反応性の配置にされる。
【００７３】
別の実施形態では、化学発光標識は、ランダムな様式で固体支持体上に固定化された補助物質（ａｕｘｉｌｉａｒｙ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）に共有結合でつながれる。補助物質の固定化は、共有結合または吸着プロセスによるものとすることができる。それによって標識は、固体支持体の表面のまわりに大体均一に分布される。被検体は、例えば、未標識の被検体特異的結合メンバーによって、固体支持体の表面に結合される。化学発光標識は、支持体の表面上に結合され、または受動的にコーティングされた補助物質に結合した化学発光標識付近にアクチベーターを運ぶ特異的結合反応によって、アクチベーターと反応性の配置にされる。
【００７４】
別の実施形態では、化学発光標識は、被検体特異的捕捉抗体に対して結合親和性を有する、固定化されたユニバーサル抗体に共有結合でつながれる。
【００７５】
別の実施形態では、化学発光標識が共有結合でつながれる補助物質は、タンパク質またはペプチドである。例示的なタンパク質には、アルブミンまたはストレプトアビジン（ＳＡ）が含まれる。化学発光化合物は、ビオチン−化学発光化合物コンジュゲートを使用することによる固定化のために提供される場合がある。この型のアッセイ形式は、ビオチンコンジュゲートとして、または固体支持体への直接固定化、もしくは種特異的抗免疫グロブリンなどの一般的な捕捉成分を通じた間接的な結合によって、被検体特異的結合メンバーを提供することができる。
【００７６】
別の実施形態では、化学発光標識が共有結合でつながれる補助物質は、合成ポリマーである。化学発光化合物を固定化するためにポリマー助剤を使用するアッセイ形式は、ビオチンコンジュゲートとして、または固体支持体への直接固定化、もしくは種特異的免疫グロブリンなどの一般的な捕捉成分を通じた間接的な結合によって、被検体特異的結合メンバーを提供することができる。
【００７７】
別の実施形態では、化学発光標識は、固体支持体の表面に共有結合でつながれる。そのような実施形態では、それによって標識は、固体支持体の表面のまわりに大体均一に分布される。被検体は、例えば、未標識被検体特異的結合メンバーによって、固体支持体の表面に結合される。化学発光標識は、支持体の表面に直接結合した化学発光標識付近にアクチベーターを運ぶ特異的結合反応によって、アクチベーターと反応性の配置にされる。次いで、洗浄も分離もすることなく、トリガー溶液が添加され、化学発光が測定される。
【００７８】
別の実施形態では、被検体の類似体が使用され、アクチベーター−被検体類似体コンジュゲートを構成する。別の実施形態では、標識された被検体が使用され、アクチベーター−被検体コンジュゲートを構成する。アクチベーター−被検体類似体コンジュゲートまたはアクチベーター−被検体コンジュゲート、および被検体は、被検体特異的結合メンバーと競合的に結合する。この型のアッセイ法において、試料中の被検体の量と化学発光の強度の間に負の相関が生じることは明らかである。
【００７９】
抗原もしくは他のタンパク質に結合するための抗体、またはイムノアッセイを介した他の抗体を通じた化学発光標識の結合に加えて、本方法は、相補的核酸の結合を通じて核酸を検出するための化学発光標識核酸を使用することができる。この点において、使用は、核酸のサイズに関して特に限定されず、唯一の基準は、相補性パートナーが、安定なハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な長さのものであることである。核酸には、本明細書で使用する場合、遺伝子長の核酸、核酸のより短い断片、ポリヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドが含まれ、そのいずれも一本鎖であっても二本鎖であってもよい。被検体特異的結合メンバーとして核酸を使用して本開示を実施する際、核酸は、被検体核酸を捕捉するために、固体支持体の表面上に共有結合している（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ａｔｔａｃｈｅｄ）か、または物理的に固定化されている。化学発光標識は、捕捉核酸に結合することができ、または標識は、上記に説明したように、支持体に連結することができる。捕捉核酸は、被検体核酸の配列領域と完全、または実質的に完全な配列相補性を有する。
【００８０】
実質的に相補性である場合、捕捉核酸は、被検体と相補性でない末端オーバーハンギング部分、末端ループ部分、または内部ループ部分を有することができ、ただしこれは、被検体とのハイブリダイゼーションを妨害または阻止しない。逆の状況も起こり得、この場合、オーバーハングまたはループは、被検体核酸内に属する。捕捉核酸、被検体核酸、アクチベーターのコンジュゲート、および第３の核酸が、ハイブリダイズさせられる。第３の核酸は、捕捉核酸と相補性の配列領域とは異なる、被検体核酸の配列領域と実質的に相補性である。捕捉核酸およびアクチベーターコンジュゲート核酸の被検体とのハイブリダイゼーションは、いずれの順序でも連続して、または同時に実施することができる。このプロセスの結果として、化学発光標識は、支持体の表面に結合した化学発光標識付近にアクチベーターを運ぶ特異的なハイブリダイゼーション反応によって、アクチベーターと結合した状態になる。上記したように、トリガー溶液が供給され、化学発光が検出される。
【００８１】
別の実施形態は、被検体のアクチベーターとのコンジュゲートが使用される変形を含む。被検体核酸−アクチベーターコンジュゲートおよび被検体核酸は、被検体特異的結合メンバーと競合的に結合する。この型のアッセイ法において、試料中の被検体の量と化学発光の強度の間に負の相関が生じることは明らかである。
【００８２】
抗体に基づくシステムおよび核酸に基づくシステムに加えて、結合アッセイの当業者に一般に公知であるような他の特異的結合対も、本開示による試験方法の基礎として機能を果たすことができる。抗体−ハプテン対も使用することができる。フルオレセイン／抗フルオレセイン、ジゴキシゲニン／抗ジゴキシゲニン、およびニトロフェニル／抗ニトロフェニルの対は、例示的である。さらなる例として、周知の（ストレプト）アビジン／ビオチン結合対を利用することができる。この結合対を使用することができる一方法を例示するために、ストレプトアビジン−化学発光標識コンジュゲートは、固体支持体上に共有結合でつなぐことができるか、または吸着することができる。次いで、ビオチン標識被検体およびアクチベーターコンジュゲートが添加され、コンジュゲートは、抗ビオチン抗体または抗被検体抗体に結合される。複合体が形成させられた後、上記のようにトリガー溶液が添加され、検出が行われる。別の実施形態では、アビジンまたはストレプトアビジンが固体支持体上に堆積される。ビオチン−化学発光化合物コンジュゲートは、アビジンに結合され、ビオチン化抗体も結合される。別の実施形態では、ビオチンは、固体支持体につながれ、アビジンまたはストレプトアビジンを捕捉するのに使用される。ビオチン化抗体も結合される。化学発光化合物は、ビオチン−化学発光化合物コンジュゲートを（ストレプト）アビジンに結合させることによって、または化学発光化合物で表面に直接標識することによって、固体支持体に固定することができる。当技術分野で公知の追加の被検体特異的結合メンバーとして、抗体のＦａｂ部分、レクチン−炭水化物、プロテインＡ−ＩｇＧ、およびホルモン−ホルモン受容体が挙げられる。固体支持体への化学発光化合物の間接的結合を、本開示の取り扱いにおいて使用することができることが理解されるべきである。これらの例および当業者が考えつく他の例は、本発明の方法の範囲内であると見なされる。
【００８３】
本開示を実施するのに有用な固体支持体は、様々な材料、多孔度、形状、およびサイズのものとすることができる。９６ウェル、３８４ウェル、またはより多い数の種類のマイクロウェルプレート、試験管、試料カップ、プラスチック球、セルロース、紙またはプラスチックの試験紙、ラテックス粒子、０．１０〜５０μｍの直径を有するポリマー粒子、０．１０〜５０μｍの直径を有するシリカ粒子、磁性粒子、特に０．１〜１０μｍの平均直径を有するもの、様々な材料のナノ粒子、および金属コロイドを含めた結合アッセイに既に使用されている材料はすべて、化学発光標識を結合するため、および被検体特異的結合メンバーを固定化するための有用な固体支持体をもたらすことができる。磁性粒子は、磁性金属、金属酸化物、または金属硫化物コアを含むことができ、これらは、磁気成分を遮蔽するための、吸着的に結合したかまたは共有結合した層によって一般に囲繞されている。磁気成分は、鉄、酸化鉄、または硫化鉄とすることができ、鉄は、Ｆｅ２＋もしくはＦｅ３＋、または両方である。このクラスにおいて使用可能な材料には、例えば、磁鉄鉱、磁赤鉄鉱、および黄鉄鉱が含まれる。他の磁性金属酸化物には、ＭｎＦｅ２Ｏ４、ＮｉＦｅ２Ｏ４、およびＣｏＦｅ２Ｏ４が含まれる。磁性成分は、例えば、非磁性シェルによって囲繞された固体コアとすることができ、または散在した磁性材料および非磁性材料のコアとすることができ、または別の非磁性シェルによって必要に応じて囲繞された、非磁性コアを囲繞している層とすることができる。そのような磁性粒子中の非磁性材料は、シリカ、ポリスチレンなどの合成ポリマー、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂、ポリアクリレートもしくはスチレン−アクリレートコポリマーとすることができ、またはこれは、アガロースもしくはデキストランなどの天然ポリマーであってもよい。
【００８４】
本開示は、本アッセイ法において使用するために、そのような材料を機能化する方法を教示する。特に、化学発光標識化化合物（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）、および抗体などの被検体特異的結合メンバーの両方を、同じ表面、特にマイクロプレートのウェルまたは微粒子に結合させるための方法が開示される。アッセイにおいて使用される適当な支持体として、合成ポリマー支持体、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、置換ポリスチレン（例えば、アミノ化またはカルボキシル化ポリスチレン）、ポリアクリルアミド、ポリアミド、ポリ塩化ビニルなど、ガラスビーズ、シリカ粒子、官能性シリカ粒子、金属コロイド、アガロース、ニトロセルロース、ナイロン、ポリビニリデンジフルオリド、表面修飾ナイロンなどが挙げられる。
【００８５】
アクチベーター標識
アクチベーター化合物は、アクチベーター標識ｓｂｍの一部を形成し、これは、アクチベーター−特異的結合メンバーコンジュゲートと呼ばれる場合もある。アクチベーター標識ｓｂｍは、二重の機能を果たす：１）直接に、または中間の特異的結合パートナーを通じて、特異的結合パートナー部分を通じて、アッセイにおける被検体の量に比例した特異的結合反応を起こし、かつ２）アクチベーター部分を通じて化学発光化合物を活性化する。アクチベーター標識ｓｂｍのアクチベーター部分は、トリガー溶液の存在下で化学発光が生じるように、化学発光化合物の活性化を起こす化合物である。アクチベーター標識として機能を果たすことができる化合物には、遷移金属の塩および錯体ならびに酵素を含めたペルオキシダーゼ様活性を有する化合物、特に遷移金属含有酵素、最も特に、ペルオキシダーゼ酵素が含まれる。アクチベーター化合物において有用な遷移金属として、周期表の３〜１２族のもの、特に、鉄、銅、コバルト、亜鉛、マンガン、クロム、およびバナジウムが挙げられる。
【００８６】
化学発光反応を起こすことができるペルオキシダーゼ酵素として、例えば、ラクトペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、バナジウムブロモペルオキシダーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、真菌ペルオキシダーゼ類、リグニンペルオキシダーゼ、Ａｒｔｈｒｏｍｙｃｅｓ ｒａｍｏｓｕｓに由来するペルオキシダーゼ、白色腐朽菌（ｗｈｉｔｅ ｒｏｔ ｆｕｎｇｉ）で産生されるＭｎ依存性ペルオキシダーゼ、およびダイズペルオキシダーゼが挙げられる。ｈｅｍｅなどの鉄錯体、およびＭｎ−ＴＰＰＳ４を含めた、酵素でないが、ペルオキシダーゼ様活性を有する他のペルオキシダーゼ模倣化合物も公知である（Ｙ．−Ｘ． Ｃｉら、Ｍｉｋｒｏｃｈｅｍ． Ｊ．、５２巻、２５７〜６２頁（１９９５年））。これらは、基質の化学発光酸化を触媒し、本明細書で使用する場合、ペルオキシダーゼの意味の範囲内であると明確に見なされる。
【００８７】
いくつかの実施形態では、アクチベーター標識ｓｂｍは、化学発光を生じさせるための方法において、ペルオキシダーゼおよび生体分子のコンジュゲートまたは複合体を含むことができ、唯一の条件は、コンジュゲートがペルオキシダーゼ活性またはペルオキシダーゼ様活性を示すことである。ペルオキシダーゼの１つ以上の分子にコンジュゲートすることができる生体分子として、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体断片、抗体−ＤＮＡキメラ、抗原、ハプテン、タンパク質、ペプチド、レクチン、アビジン、ストレプトアビジン、およびビオチンが挙げられる。ペルオキシダーゼを含む、または組み込んでいる複合体、例えば、生体分子への結合に関して機能化されているリポソーム、ミセル、ベシクル、およびポリマーなども、本開示の方法において使用することができる。
【００８８】
トリガー溶液＆エンハンサー
トリガー溶液は、化学発光に必要な励起状態の化合物を生成するのに必要な反応物を提供する。反応物は、化学発光標識と直接反応することによって化学発光反応を実施するのに必要なものとすることができる。これは、この機能の代わりに、またはこの機能に加えて、アクチベーター化合物の作用を促進する機能を果たすことができる。これは、例えば、アクチベーターがペルオキシダーゼ酵素である場合、そのようになる。一実施形態では、トリガー溶液は、過酸化物化合物を含む。過酸化物成分は、ペルオキシダーゼと反応することができる、任意の過酸化物またはアルキルヒドロペルオキシドである。例示的な過酸化物には、過酸化水素、尿素過酸化物、および過ホウ酸塩が含まれる。トリガー溶液中に使用される過酸化物の濃度は、一般に約１０−８Ｍ〜約３Ｍ、より一般に約１０−３Ｍ〜約１０−１Ｍという値の範囲内で変更することができる。別の実施形態では、トリガー溶液は、過酸化物、およびペルオキシダーゼ活性を有するアクチベーターの触媒ターンオーバーを促進するエンハンサー化合物を含む。代表的な実施形態では、アクチベーターとしてのペルオキシダーゼコンジュゲート、被検体のアクリダン標識特異的結合パートナー（ここで、アクリダン標識は、以下に記載されるように、特異的結合パートナーをアクリダン標識化化合物と反応させることによって提供される）、および過酸化水素を含むトリガー溶液が使用される。過酸化物は、ペルオキシダーゼと反応することによって、おそらく、酵素の活性部位における鉄の酸化状態を、異なる酸化状態に変化させる。この変化した状態の酵素は、エンハンサー分子と反応することによって、酵素の触媒ターンオーバーを促進する。エンハンサーまたは酵素から形成される反応性種は、酵素に近接して維持されたアクリダン標識と反応する。化学発光反応は、化学発光化合物から形成される中間体と過酸化物とのさらなる反応を含み、最終反応生成物および光を生成する。
【００８９】
ある特定のエンハンサー化合物をトリガー溶液中に取り込むことにより、酵素の反応性が促進され、もしくはバックグラウンドシグナルが低減され、または両方の機能が実施される。これらのエンハンサーの中に含まれるのは、ペルオキシダーゼ反応を増強することが公知であるフェノール化合物および芳香族アミンである。米国特許第５，１７１，６６８号に開示されているような、フェノキサジン化合物またはフェノチアジン化合物の、インドフェノール化合物またはインドアニリン化合物との混合物を、本発明においてエンハンサーとして使用することができる。置換ヒドロキシベンゾオキサゾール、２−ヒドロキシ−９−フルオレノン、および米国特許第５，２０６，１４９号に開示されているような化合物、
【００９０】
【化７】
【００９１】
も、本発明においてエンハンサーとして使用することができる。米国特許第５，５１２，４５１号に開示されているような置換および非置換のアリールボロン酸化合物、ならびにこれらのエステルおよびアンヒドリド誘導体も、本開示において有用なエンハンサーの範囲内であると見なされる。例示的なフェノールエンハンサーとして、それだけに限らないが、ｐ−フェニルフェノール、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−ブロモフェノール、ｐ−ヒドロキシケイ皮酸、ｐ−イミダゾリルフェノール、アセトアミノフェン、２，４−ジクロロフェノール、２−ナフトール、および６−ブロモ−２−ナフトールが挙げられる。上記したクラスからの１つを超えるエンハンサーの混合物も使用することができる。
【００９２】
本発明を実施するのに有用な追加のエンハンサー、および誘導体には、ヒドロキシベンゾチアゾール化合物、ならびに以下の式を有するフェノキサジン化合物およびフェノチアジン化合物が含まれる。
【００９３】
【化８】
【００９４】
フェノキサジンエンハンサーおよびフェノチアジンエンハンサーの窒素原子上で置換されたＲ基には、１〜８炭素原子のアルキル、およびスルホン酸塩またはカルボン酸塩の基で置換された１〜８炭素原子のアルキルが含まれる。例示的なエンハンサーとして、３−（Ｎ−フェノチアジニル）−プロパンスルホン酸塩、３−（Ｎ−フェノキサジニル）プロパンスルホン酸塩、４−（Ｎ−フェノキサジニル）ブタンスルホン酸塩、５−（Ｎ−フェノキサジニル）−ペンタン酸塩、およびＮ−メチルフェノキサジン、ならびに関連同族体が挙げられる。トリガー溶液中で使用されるエンハンサーの濃度は、一般に約１０−５Ｍ〜約１０−１Ｍ、より一般に約１０−４Ｍ〜約１０−２Ｍという値の範囲内で変更することができる。
【００９５】
本開示の検出反応は、一般に水性緩衝液であるトリガー溶液を用いて実施される。適当な緩衝液には、化学発光反応の進行を可能にする環境を維持することができる、任意の一般に使用される緩衝液が含まれる。一般に、トリガー溶液は、約５〜約１０．５の範囲内のｐＨを有する。例示的な緩衝液として、ホスフェート、ボレート、アセテート、カーボネート、ｔｒｉｓ（ヒドロキシ−メチルアミノ）メタン［ｔｒｉｓ］、グリシン、トリシン、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、ジエタノールアミン、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳなどが挙げられる。
【００９６】
トリガー溶液は、光生成反応の発光効率を増強し、またはアッセイのシグナル／ノイズ比を改善するために、１つ以上の界面活性剤またはポリマー界面活性剤も含有することができる。本開示を実施するのに有用な非イオン性界面活性剤には、例として、ポリオキシエチレン化（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎａｔｅｄ）アルキルフェノール、ポリオキシエチレン化アルコール、ポリオキシエチレン化エーテル、およびポリオキシエチレン化ソルビトールエステルが含まれる。ＣＴＡＢなどの４級アンモニウム塩化合物、および４級ホスホニウム塩化合物を含めた、モノマーの陽イオン性界面活性剤を使用することができる。４級アンモニウム塩およびホスホニウム塩の基を含むものを含めた、ポリマーの陽イオン性界面活性剤も、この目的のために使用することができる。
【００９７】
一実施形態では、トリガー溶液は、水性緩衝液、約１０−５Ｍ〜約１Ｍの濃度の過酸化物、および約１０−５Ｍ〜約１０−１Ｍの濃度のエンハンサーを含む組成物である。この組成物は、界面活性剤、金属キレート化剤、および微生物混入を予防し、または最小限にするための保存剤を含めた添加剤を必要に応じて含有することができる。
【００９８】
特異的結合対
特異的結合対メンバーまたは特異的結合パートナー（ｓｂｍ）は、別の物質に対して特異的な結合親和性を有する、生体分子を含めた分子として本明細書で定義される。特異的結合対メンバーとして、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体断片、抗体−ＤＮＡキメラ、抗原、ハプテン、タンパク質、ペプチド、レクチン、アビジン、ストレプトアビジン、およびビオチンが挙げられる。特異的結合対の各特異的結合対メンバーは、同じ物質（例えば、被検体）に対して特異的な結合親和性を有する。各特異的結合対メンバーは、少なくとも、被検体上の同じまたは重複結合部位を競合するべきでないという点で、特異的結合対中の他の特異的結合対メンバーと非同一である。例えば、特異的結合対が２つの抗体からなる場合、各ｓｂｍ抗体は、被検体上に、異なる、非競合エピトープを有する。
【００９９】
特異的な結合物質として、限定することなく、抗体および抗体断片、抗原、ハプテンおよびその同族抗体、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン、プロテインＡおよびＩｇＧ、相補的核酸またはオリゴヌクレオチド、レクチンおよび炭水化物が挙げられる。
【０１００】
上記の抗原−抗体、ハプテン−抗体、または抗体−抗体対に加えて、特異的結合対として、相補性のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、アビジン−ビオチン、ストレプトアビジン−ビオチン、ホルモン−受容体、レクチン−炭水化物、ＩｇＧプロテインＡ、結合タンパク質−受容体、核酸−核酸結合タンパク質、および核酸−抗核酸抗体も挙げることができる。薬物候補のスクリーニングにおいて使用される受容体アッセイは、本方法についての使用の別の範囲である。これらの結合対のいずれも、上記した３成分サンドイッチ技法または２成分競合技法によって、本方法において使用するのに適応することができる。
【０１０１】
化学発光化合物
本開示の実施において化学発光標識として使用される化合物は、一般式ＣＬ−Ｌ−ＲＧを有し、式中、ＣＬは、化学発光部分を表し、Ｌは、化学発光部分と反応基を連結するための連結部分（ｌｉｎｋｉｎｇ ｍｏｉｅｔｙ）を表し、ＲＧは、別の物質にカップリングするための反応基部分を表す。用語「化学発光基」および「化学発光部分」は、用語「連結部分」および「連結基（ｌｉｎｋｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）」と同様に互換的に使用される。化学発光部分ＣＬは、アクチベーターと反応を起こし、活性化された化合物に変換される化合物を含む。活性化された化合物とトリガー溶液の反応により、電子励起状態化合物が形成される。励起状態は、一重項励起状態であっても、三重項励起状態であってもよい。励起状態は、基底状態に緩和すると光を直接放出することができ、または放出性エネルギーアクセプターに励起エネルギーを移し、それによって基底状態に戻ることができる。エネルギーアクセプターは、このプロセスにおいて励起状態に上げられ、光を放出する。ＣＬ基、アクチベーター、およびトリガー溶液の化学発光反応は急速であり、非常に短期間で起こることが望ましいが、必須ではなく、一実施形態では、数秒以内にピーク強度に到達する。
【０１０２】
本開示の一実施形態では、化学発光化合物は、アクチベーターおよびトリガー溶液の存在下で、酸化されることによって化学発光を生じることができる。リンカーおよび反応基を取り込むことによって、化学発光標識として機能することができる化合物の例示的なクラスとして、イソルミノール、アミノブチルエチルイソルミノール（ＡＢＥＩ）、アミノヘキシルエチルイソルミノール（ＡＨＥＩ）、７−ジメチルアミノナフタレン−１，２−ジカルボン酸ヒドラジド、環置換アミノフタルヒドラジド、アントラセン−２，３−ジカルボン酸ヒドラジド、フェナントレン−１，２−ジカルボン酸ヒドラジド、ピレンジカルボン酸ヒドラジド、５−ヒドロキシフタルヒドラジド、６−ヒドロキシフタルヒドラジド、ならびにＭａｓｕｙａらへの米国特許第５，４２０，２７５号およびＹａｍａｇｕｃｈｉへの米国特許第５，３２４，８３５号において開示された他のフタラジンジオン類似体を含めた、ルミノールならびに構造的に関連した環状ヒドラジドなどの芳香族環状ジアシルヒドラジドが挙げられる。
【０１０３】
過酸化水素およびペルオキシダーゼの作用によって化学発光を生じることが公知である任意の化合物が、本開示において使用される化学発光標識化合物の化学発光部分として機能すると考えられる。キサンテン色素（例えば、フルオレセイン色素、エオシン色素、ローダミン色素、またはロドール色素など）、芳香族アミン、および複素環式アミンを含めた、様々な構造上のクラスの多数のそのような化合物が、これらの条件下で化学発光を生じることが当技術分野で公知である。別の例は、化合物ＭＣＬＡ、２−メチル−６−（ｐ−メトキシフェニル）−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オンである。別の例はインドール酢酸であり、別の例はイソブチルアルデヒドであり、後者は一般に、可視光の出力を増大させるための蛍光エネルギーアクセプターを伴っている。トリヒドロキシ芳香族化合物のピロガロール、フロログルシノール、およびプルプロガリンは、個々に、または組合せて、本開示の化学発光標識化化合物中の化学発光部分として機能を果たすことができる化合物の他の例である。
【０１０４】
一実施形態では、本開示の方法において有用なアクリダンケテンジチオアセタール（ＡＫ）を含む一群の化学発光標識化合物は、式ＩＶを有するアクリダン化合物
【０１０５】
【化９】
【０１０６】
を含み、式中、基Ｒ１〜Ｒ１１の少なくとも１つは、式−Ｌ−ＲＧの標識化置換基であり、Ｌは、結合、または別の二価もしくは多価の基となり得る連結基であり、ＲＧは、化学発光標識化化合物が別の化合物に結合することを可能にする反応基であり、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、１〜５０の非水素原子を含有する有機基であり、Ｒ４〜Ｒ１１のそれぞれは、水素、または干渉しない置換基である。標識化置換基−Ｌ−ＲＧは、Ｒ１またはＲ２の１つに存在することができるが、これは、Ｒ３またはＲ４〜Ｒ１１の１つに置換基として存在することもできる。
【０１０７】
式ＩＶの化合物中の基Ｒ１およびＲ２は、光生成を可能にするＣ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、Ｓｉ、およびハロゲン原子から選択される、１〜約５０の非水素原子を含有する任意の有機基とすることができる。後者とは、式Ｉの化合物が本開示の反応を起こすとき、励起状態生成物の化合物が生成され、１つ以上の化学発光中間体の生成を含むことができることを意味する。励起状態生成物は、直接光を放出することができ、またはエネルギー移動を通じて蛍光アクセプターに励起エネルギーを移し、この蛍光アクセプターから光を放出させることができる。一実施形態では、Ｒ１およびＲ２は、１〜２０炭素原子の、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアルケニル、置換または非置換のアルキニル、置換または非置換のアリール、および置換または非置換のアラルキル基から選択される。Ｒ１またはＲ２が置換された基である場合、これは、カルボニル基、カルボキシル基、トリ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）シリル基、ＳＯ３−基、ＯＳＯ３−２基、グリコシル基、ＰＯ３−基、ＯＰＯ３−２基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＮＨ２、４級アンモニウム基、および４級ホスホニウム基から選択される１〜３個の基で置換されていてもよい。一実施形態では、Ｒ１またはＲ２は、式−Ｌ−ＲＧの標識化置換基で置換されており、式中、Ｌは連結基であり、ＲＧは反応基である。
【０１０８】
基Ｒ３は、基内の原子の価数を満たすのに要求される必要な数のＨ原子に加えて、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、Ｓｉ、およびハロゲンから選択される１〜５０の非水素原子を含有する有機基である。一実施形態では、Ｒ３は、１〜２０の非水素原子を含有する。別の実施形態では、有機基は、１〜２０炭素原子の、アルキル、置換アルキル、置換または非置換のアルケニル、置換または非置換のアルキニル、置換または非置換のアリール、および置換または非置換のアラルキル基からなる群から選択される。別の実施形態では、Ｒ３についての基には、置換または非置換のＣ１〜Ｃ４アルキル基、フェニル、置換または非置換のベンジル基、アルコキシアルキル、カルボキシアルキル、およびアルキルスルホン酸基が含まれる。Ｒ３が置換された基である場合、これは、カルボニル基、カルボキシル基、トリ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）シリル基、ＳＯ３−基、ＯＳＯ３−２基、グリコシル基、ＰＯ３−基、ＯＰＯ３−２基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＮＨ２、４級アンモニウム基、および４級ホスホニウム基から選択される１〜３個の基で置換されていてもよい。基Ｒ３は、５または６員環を完成するために、Ｒ７またはＲ８に結合することができる。一実施形態では、Ｒ３は、式−Ｌ−ＲＧの標識化置換基で置換されている。
【０１０９】
式ＩＶの化合物では、基Ｒ４〜Ｒ１１はそれぞれ、独立してＨ、または励起状態生成物が生成されるのを可能にし、一般にＣ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、Ｓｉ、およびハロゲンから選択される１〜５０の原子を含有する置換基である。存在することができる代表的な置換基として、限定することなく、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリールオキシ、ハロゲン、アミノ、置換アミノ、カルボキシル、カルボアルコキシ、カルボキサミド、シアノ、およびスルホネート基が挙げられる。隣接する基の対、例えば、Ｒ４−Ｒ８またはＲ８−Ｒ６は、一緒に結合することによって、この２つの基が結合されている環に縮合した少なくとも１つの５員環または６員環を含む炭素環系または複素環系を形成することができる。そのような縮合複素環は、Ｎ、Ｏ、またはＳ原子を含有することができ、上記したものなどのＨ以外の環置換基を含有することができる。基Ｒ４〜Ｒ１１の１つ以上は、式−Ｌ−ＲＧの標識化置換基とすることができる。一実施形態では、Ｒ４〜Ｒ１１は、水素、ハロゲン、およびアルコキシ基、例えば、メトキシ、エトキシ、ｔ−ブトキシなどから選択される。別の実施形態では、一群の化合物は、ハロゲンとしてＲ８、Ｒ６、Ｒ９、またはＲ１０の１つを有し、Ｒ４〜Ｒ１１の他のものは、水素原子である。
【０１１０】
置換基は、化合物の特性を改変し、または合成の利便性をもたらすために、様々な量で、アクリダン環内の選択された環または鎖の位置で組み込むことができる。そのような特性として、例えば、化学発光量子収率、酵素との反応速度、最大光強度、発光の継続時間、発光波長、および反応媒質中の溶解度が挙げられる。特定の置換基およびこれらの効果は、以下の具体例において例示されているが、これは、本開示の範囲を限定すると決して見なされるべきではない。合成の便宜のために、式Ｉの化合物は、水素原子としてＲ４〜Ｒ１１のそれぞれを有することが望ましい。
【０１１１】
別の実施形態では、一群の化合物は式Ｖを有し、式中、Ｒ４〜Ｒ１１のそれぞれは水素である。基Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は上記に定義された通りである。
【０１１２】
【化１０】
【０１１３】
式ＩＶまたはＶの標識化化合物は、基Ｒ１またはＲ２上に置換基として基−Ｌ−ＲＧを有する。一実施形態では、標識化化合物は、式ＶＩを有する。
【０１１４】
【化１１】
【０１１５】
代表的な標識化化合物は、以下の構造を有する。追加の例示的な化合物、ならびに他の分子および固体表面への結合におけるこれらの使用は、以下の具体例において記載されている。以下に示された構造は、式ＣＬ−Ｌ−ＲＧの例示的な化合物を例示する。
【０１１６】
【化１２】
【０１１７】
上記の特定のＡＫ化合物、ならびに上に示された一般式ＩＶ、Ｖ、およびＶＩの化合物は、公開された出願ＵＳ２００７／０１７２８７８に開示された方法を含む、一般に公知の方法を使用して、熟練した有機化学者によって調製することができる。例示的な方法では、Ｎ−置換、かつ必要に応じて環置換アクリダン環化合物は、強塩基、その後にＣＳ２と反応されることによって、アクリダンジチオカルボキシレートを形成する。ジチオカルボキシレートは、従来法によってエステル化されることによって、Ｒ１と命名した置換基の１つが組み込まれる。得られたアクリダンジチオエステルは、非プロトン性溶媒中で、ｎ−ＢｕＬｉまたはＮａＨなどの強塩基を用いて再び脱プロトン化され、脱離基およびＲ２部分を含有する適当な試薬を用いてＳ−アルキル化される。Ｒ２部分は、適当な反応基を組み込むためにさらなる操作にかけることができることが、有機化学における当業者に容易に明らかである。
【０１１８】
別のクラスの化学発光部分には、米国特許第５，４９１，０７２号；同第５，５２３，２１２号；同第５，５９３，８４５号；および同第６，０３０，８０３号に開示された、アクリダンエステル、チオエステル、およびスルホンアミドが含まれる。このクラスにおける化学発光標識化化合物は、以下の式ＶＩＩの化学発光部分ＣＬを有し、式中、Ｚは、Ｏ、Ｓ、またはＮＲ１１ＳＯ２Ａｒであり、Ｒ１１は、アルキルまたはアリールであり、Ａｒは、アリール、またはアルキル置換アリールであり、Ｒ１は、Ｃ１〜８アルキル、ハロ置換Ｃ１〜８アルキル、アラルキル、アリール、またはアルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、アリール、アルコキシ、アルコキシアルキル、ハロゲン、カルボニル、カルボキシル、カルボキサミド、シアノ、トリフルオロメチル、トリアルキルアンモニウム、ニトロ、ヒドロキシ、アミノ、およびメルカプト基で置換されたアリールであり、Ｒ２は、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、およびアラルキル基から選択され、Ｒ３〜１０はそれぞれ、水素であり、または１もしくは２個の置換基が、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、およびハロゲンから選択され、Ｒ３〜１０の残りは水素である。一実施形態では、Ｒ３〜１０のそれぞれは水素であり、Ｒ１は標識化置換基である。別の実施形態では、Ｒ３〜１０の１つは標識化置換基であり、Ｒ３〜１０の他のものは水素である。
【０１１９】
【化１３−１】
【０１２０】
別のクラスの化学発光部分には、米国特許第５，９２２，５５８号；同第６，６９６，５６９号；、および同第６，８９１，０５７号に開示された複素環式化合物が含まれる。一実施形態では、この化合物は、窒素、酸素、または硫黄を含有する５員もしくは６員の環、または複数の環基を含む複素環式環を含み、これに環外の二重結合が結合しており、その末端炭素は、酸素および硫黄原子から選択される２つの原子で置換されている。
【０１２１】
別の実施形態では、化学発光標識化合物は、以下の式ＶＩＩＩの化学発光アクリダンエノール誘導体を含み、式中、Ｒ１は、１〜２０炭素原子のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、およびアラルキル基から選択され、そのいずれも、カルボニル基、カルボキシル基、トリ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）シリル基、ＳＯ３−基、ＯＳＯ３−２基、グリコシル基、ＰＯ３−基、ＯＰＯ３−２基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、４級アンモニウム基、または４級ホスホニウム基から選択される１〜３個の基で置換されていてもよく、Ｘは、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、アリール、アラルキル基、１〜２０炭素原子を有するアルキルカルボキシル基またはアリールカルボキシル基、トリ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）シリル基、ＳＯ３−基、グリコシル基、および式ＰＯ（ＯＲ’）（ＯＲ’’）のホスホリル基（式中、Ｒ’およびＲ’’は独立して、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、シアノアルキル、アリール、およびアラルキル基、トリアルキルシリル基、アルカリ金属陽イオン、アルカリ土類陽イオン、アンモニウム陽イオンおよびトリアルキルホスホニウム陽イオンから選択される）から選択され、Ｚは、ＯおよびＳ原子から選択され、Ｒ６は、置換または非置換のＣ１〜Ｃ４アルキル、フェニル、ベンジル、アルコキシアルキル、およびカルボキシアルキル基から選択され、Ｒ７〜１４はそれぞれ、水素であり、または１もしくは２個の置換基が、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、およびハロゲンから選択され、Ｒ７〜１４の残りは水素である。一実施形態では、Ｒ７〜１４のそれぞれは水素であり、Ｒ１は標識化置換基である。別の実施形態では、Ｒ７〜１４の１つは標識化置換基であり、Ｒ７〜１４の他のものは水素である。
【０１２２】
【化１３−２】
【０１２３】
別の実施形態では、化学発光標識化化合物は、以下の式ＩＸの化学発光化合物を含み、式中、Ｒ１は、１〜２０炭素原子のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、およびアラルキル基から選択され、そのいずれも、カルボニル基、カルボキシル基、トリ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）シリル基、ＳＯ３−基、ＯＳＯ３−２基、グリコシル基、ＰＯ３−基、ＯＰＯ３−２基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、４級アンモニウム基、または４級ホスホニウム基から選択される１〜３個の基で置換されていてもよく、Ｘは、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、アリール、アラルキル基、１〜２０炭素原子を有するアルキルカルボキシル基またはアリールカルボキシル基、トリ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）シリル基、ＳＯ３−基、グリコシル基、および式ＰＯ（ＯＲ’）（ＯＲ’’）のホスホリル基（式中、Ｒ’およびＲ’’は独立して、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、シアノアルキル、アリール、およびアラルキル基、トリアルキルシリル基、アルカリ金属陽イオン、アルカリ土類陽イオン、アンモニウム陽イオンおよびトリアルキルホスホニウム陽イオンから選択される）から選択され、Ｚ１およびＺ２はそれぞれ、ＯおよびＳ原子から選択され、Ｒ２およびＲ３は独立して、水素およびＣ１〜Ｃ８アルキルから選択される。
【０１２４】
【化１４】
【０１２５】
連結基（Ｌ）。本開示において使用される任意の化学発光化合物における連結基は、結合、原子、二価の基、および多価の基、またはいくつかは環状構造の一部となり得る、直鎖もしくは分枝鎖の原子とすることができる。置換基は通常、１〜約５０の非水素原子、より通常には１〜約３０の非水素原子を含有する。別の実施形態では、鎖を構成する原子は、Ｃ、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｐ、Ｓｉ、Ｂ、およびＳｅ原子から選択される。別の実施形態では、鎖を構成する原子は、Ｃ、Ｏ、Ｎ、Ｐ、およびＳ原子から選択される。鎖中の炭素以外の原子の数は、通常０〜１０である。ハロゲン原子は、鎖または環上の置換基として存在することができる。連結置換基を構成する典型的な官能基として、アルキレン、アリーレン、アルケニレン、エーテル、過酸化物、カルボニル（ケトン、エステル、炭酸エステル、チオエステル、またはアミド基としての）、アミン、アミジン、カルバメート、尿素、イミン、イミド、イミデート、カルボジイミド、ヒドラジノ、ジアゾ、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホン酸エステル、チオエーテル、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン、スルホン酸エステル、硫酸エステル、およびチオ尿素基が挙げられる。別の実施形態では、基は、−ＣＨ２−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−ＮＲ−、−ＳｉＯ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＳＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−、−ＮＲＣ（＝Ｏ）−、−ＮＲＣ（＝Ｓ）−、または−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ−基で終止する１〜２０原子のアルキレン鎖であり、式中、ＲはＣ１〜８アルキルである。別の実施形態では、連結基は、−ＣＨ２−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−ＮＲ−、−ＳｉＯ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＳＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−、−ＮＲＣ（＝Ｏ）−、−ＮＲＣ（＝Ｓ）−、または−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ−基で終止する３〜３０原子のポリ（アルキレン−オキシ）鎖であり、式中、ＲはＣ１〜８アルキルである。
【０１２６】
反応基。反応基ＲＧは、その存在が、共有結合または物理的な力による別の分子への結合を促進する原子または基である。いくつかの実施形態では、本開示の化学発光標識化化合物の、別の化合物または物質への結合は、例えば、反応基が、ハロゲン原子またはトシレート基などの脱離基である場合、反応基から１つ以上の原子を失うことになり、化学発光標識化化合物は、求核置換反応によって別の化合物に共有結合的に結合している。
【０１２７】
一実施形態では、ＲＧは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル基である。当業者は、ＮＨＳエステル基を含むそのような標識化化合物で標識される物質は、その物質上の部分、一般にアミン基と、エステルのＣ−Ｏ結合を分割し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを放出し、その物質の原子（アミン基の場合Ｎ）と、標識化化合物のカルボニル炭素との間に新しい結合を形成するプロセスにおいて反応することを容易に理解する。
【０１２８】
別の実施形態では、ＲＧは、ヒドラジン部分、−ＮＨＮＨ２である。当技術分野で公知であるように、この基は、標識される物質中のカルボニル基と反応することによって、ヒドラジド結合を形成する。
【０１２９】
他の実施形態では、化学発光標識化化合物の、共有結合形成による別の化合物への結合は、マイケル付加などの付加反応において起こる場合、または反応基がイソシアネートまたはイソチオシアネート基である場合、反応基内の結合の再編成を伴う。さらに他の実施形態では、結合は、共有結合形成を伴わず、むしろ物理的な力を伴い、この場合、反応基は変化しないままである。物理的な力とは、引力、例えば、水素結合、静電気引力またはイオン引力、塩基スタッキングなどの疎水性引力など、ならびに特定の親和性相互作用、例えば、ビオチン−ストレプトアビジン、抗原−抗体、およびヌクレオチド−ヌクレオチド相互作用などを意味する。
【０１３０】
標識が有機分子および生体分子に化学結合するための反応基として、それだけに限らないが、以下のものが挙げられる：ａ）アミン反応基：−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ、−ＳＯ２Ｃｌ、−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、−ＳＯ２ＣＨ２ＣＦ３；Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル；ｂ）チオール反応基：−Ｓ−Ｓ−Ｒ；ｃ）カルボン酸反応基：−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨＮＨ２；ｄ）ヒドロキシル反応基：−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ、−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、−ＳＯ２Ｃｌ、−ＳＯ２ＣＨ２ＣＦ３；ｅ）アルデヒド／ケトン反応基：−ＮＨ２、−ＯＮＨ２、−ＮＨＮＨ２；およびｆ）他の反応基、例えば、Ｒ−Ｎ３、Ｒ−Ｃ≡ＣＨ。
【０１３１】
一実施形態では、反応基として、ＯＨ、ＮＨ２、ＯＮＨ２、ＮＨＮＨ２、ＣＯＯＨ、ＳＯ２ＣＨ２ＣＦ３、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエーテル、およびマレイミド基が挙げられる。
【０１３２】
二官能性カップリング試薬も、適度に反応性の基を有する有機分子および生体分子に標識をカップリングさせるのに使用することができる（Ｌ． Ｊ． Ｋｒｉｃｋａ、Ｌｉｇａｎｄ−Ｂｉｎｄｅｒ Ａｓｓａｙｓ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８５年、１８〜２０頁、表２．２、およびＴ． Ｈ Ｊｉ、「Ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、９１巻、５８０〜６０９頁（１９８３年）を参照）。２つの型の二官能性試薬、すなわち、最終的な構造中に組み込まれた状態になるもの、および組み込まれず、２つの反応物をカップリングするためだけに機能を果たすものが存在する。
【０１３３】
水溶液
本開示において使用するのに適した水溶液は、一般に、５０％超の水を含有する溶液である。反応混合物、試料希釈物、キャリブレーター溶液、化学発光標識ｓｂｐ溶液、アクチベーター標識ｓｂｐ溶液、エンハンサー溶液、ならびにトリガー溶液、または化学発光標識ｓｂｐ、アクチベーター標識ｓｂｐ、エンハンサー、トリガー、試料、および／もしくは選択的シグナル阻害剤の１つもしくは複数の濃縮溶液を含めて、本明細書に記載される水溶液は、使用に適している。多くの実施形態では、水溶液は緩衝水溶液である。適当な水性緩衝液には、水溶液中の環境を維持し、被検体の溶解度を維持し、反応物の溶解度を維持し、および化学発光反応を進行させることができる、一般に使用される緩衝液のいずれも含まれる。例示的な緩衝液として、ホスフェート、ボレート、アセテート、カーボネート、ｔｒｉｓ（ヒドロキシ−メチルアミノ）メタン（ｔｒｉｓ）、グリシン、トリシン、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、ジエタノールアミン、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳなどが挙げられる。一般に、本開示によって使用するための水溶液は、約５〜約１０．５の範囲内のｐＨを有する。
【０１３４】
適当な水溶液は、以下の追加の成分の１つ以上を含むことができる：塩、生物学的緩衝液、エタノール、メタノール、グリコールを含めたアルコール、および界面活性剤。いくつかの実施形態では、水溶液には、緩衝液ＩＩ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）などのＴｒｉｓ緩衝水溶液が含まれる。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、ヒト血清を模倣する水溶液が利用される。１つのそのような合成マトリクスは、０．１％のＰｒｏＣｌｉｎ３００を含む、２０ｍＭのＰＢＳ、７％のＢＳＡ、ｐＨ７．５である。合成マトリクスは、それだけに限らないが、試料希釈液、キャリブレーター溶液、化学発光標識ｓｂｐ溶液、アクチベーター標識ｓｂｐ溶液、エンハンサー溶液、およびトリガー溶液に使用することができる。用語「ＰＢＳ」は、慣例的な意味において、当技術分野で公知であるような、リン酸緩衝食塩水を指す。用語「ＢＳＡ」は、慣例的な意味において、当技術分野で公知であるような、ウシ血清アルブミンを指す。
【０１３６】
検出
本方法によって放出される光は、任意の適当な公知のデバイスまたは技術、例えば、ルミノメーター、Ｘ線フィルム、高速写真フィルム、ＣＣＤカメラ、シンチレーションカウンター、化学光量計、または視覚的などによって検出することができる。各検出デバイスまたは技術は、異なるスペクトル感度を有する。ヒトの眼は、緑色光に対して最適に感度がよく、ＣＣＤカメラは、赤色光に対して最大感度を示し、ＵＶから青色光または緑色光に最大応答を有するＸ線フィルムは、利用可能である。検出デバイスの選択は、用途、および費用の考慮、利便性、および永続的な記録の作成が必要とされるかどうかによって支配される。発光の時間過程が急速である実施形態では、検出デバイスの存在下で、化学発光を生じさせるためのトリガー反応を実施することが有利である。例として、検出反応は、ルミノメーター内に収容された試験管またはマイクロウェルプレート、または試験管もしくはマイクロウェルプレートを受け入れるように適応した収納容器内のＣＣＤカメラの前に配置された試験管またはマイクロウェルプレートで実施することができる。
【０１３７】
用途
本アッセイ法は、多くの型の特異的結合対アッセイにおいて適用性を見出す。これらの中で主要なのは、ＥＬＩＳＡなどの化学発光酵素結合イムノアッセイである。免疫化学的ステップを実施するための様々なアッセイ形式およびプロトコールは、当技術分野で周知であり、競合アッセイおよびサンドイッチアッセイの両方を含む。本開示によるイムノアッセイによってアッセイすることができる物質の型には、タンパク質、ペプチド、抗体、ハプテン、薬物、ステロイド、およびイムノアッセイの技術分野で一般に公知である他の物質が含まれる。
【０１３８】
本開示の方法は、核酸の検出にも有用である。一実施形態では、一方法は、酵素標識核酸プローブを使用する。例示的な方法として、溶液ハイブリダイゼーションアッセイ、サザンブロット法におけるＤＮＡ検出、ノーザンブロット法によるＲＮＡ、ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡフィンガープリント法、コロニーハイブリダイゼーション、およびプラークリフトが挙げられ、その実施は、当業者に周知である。
【０１３９】
アッセイ材料およびキット
本開示は、本開示の方法に従ってアッセイを実施するためのキットを提供することも企図する。キットは、パッケージされた組合せで、トリガー溶液および使用するための指示書と共に、遊離標識化化合物、化学発光標識被検体特異的結合メンバー、化学発光誘導体化された固体支持体、例えば粒子もしくはマイクロプレート、またはブロッキングタンパク質などの化学発光標識補助物質として化学発光標識を含むことができる。キットは、化学発光標識化がユーザーによって実施される場合、アクチベーターコンジュゲート、被検体キャリブレーター、および対照、希釈剤、および反応緩衝液も必要に応じて含むことができる。
【０１４０】
本開示の別の実施形態では、化学発光化合物を上に固定化された固体支持体を含むアッセイ材料が提供される。一実施形態では、化学発光化合物は、上記した化学発光化合物の群のいずれかから選択される。別の実施形態では、化学発光化合物は、ペルオキシダーゼ酵素についての基質である。固体支持体上に固定化された化学発光化合物の量は、様々な負荷密度の範囲にわたって変化し得る。例として、固体支持体が微粒子材料である場合、粒子１ｍｇ当たり、１００〜０．０１μｇの範囲の化学発光化合物の負荷を使用することができる。別の例では、粒子１ｍｇ当たり、５〜０．１μｇの範囲の化学発光化合物の負荷を使用することができる。化学発光化合物は一般に、固体支持体上にランダムまたは均一に分布している。これは、固体支持体の表面上、またはアクセス可能な孔内に固定化することができる。化学発光化合物は、共有結合（ｃｏｖａｌｅｎｔ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）によって固体支持体上に固定化することができる。この実施形態では、反応基を有する化学発光標識化化合物が、固体支持体上に存在する官能基と反応することによって、化学発光化合物と固体支持体の間で共有結合（ｃｏｖａｌｅｎｔ ｂｏｎｄ）を形成する。代替の実施形態では、化学発光化合物は、１つ以上の中間物質を使用することによって、固体支持体上に固定化することができる。ビオチンが固体支持体に共有結合している一例では、共有結合されたビオチンがストレプトアビジンに結合され、次いで、ビオチン−化学発光化合物コンジュゲートが結合される。別の例では、ストレプトアビジンが固体支持体上に吸着され、次いで、ビオチン−化学発光化合物コンジュゲートが結合される。別の例では、アルブミンなどの補助タンパク質にコンジュゲートされた化学発光化合物が、固体支持体上に吸着、または共有結合でつながれる。別の例では、抗体にコンジュゲートされた化学発光化合物が、固体支持体上に吸着、または共有結合でつながれる。
【０１４１】
固体支持体は、９６ウェル、３８４ウェル、またはより多い数のウェルを有するマイクロウェルプレート、試験管、試料カップ、プラスチック球、セルロース、紙またはプラスチックの試験紙、ラテックス粒子、０．１０〜５０μｍの直径を有するポリマー粒子、０．１０〜５０μｍの直径を有するシリカ粒子、磁性粒子、特に０．１〜１０μｍの平均直径を有するもの、およびナノ粒子など、様々な材料、多孔度、形状、およびサイズのものとすることができる。一実施形態では、固体支持体は、０．１０〜５０μｍの直径を有するポリマー粒子またはシリカ粒子を含み、上記したような磁性粒子であってもよい。
【０１４２】
本開示の固定化された化学発光化合物は、固体支持体に固定された化学発光標識を含み、この化学発光標識は、一般式ＣＬ−Ｌ−ＲＧを有する化学発光標識化化合物によって提供され、式中、ＣＬは、化学発光部分を表し、Ｌは、化学発光部分と反応基を連結するための連結部分（ｌｉｎｋｉｎｇ ｍｏｉｅｔｙ）を表し、ＲＧは、別の材料にカップリングするための反応基部分を表す。化学発光部分ＣＬは、アクチベーターと反応を起こし、活性化された化合物に変換される化合物を含む。活性化された化合物とトリガー溶液の反応により、電子励起状態化合物が形成される。化学発光部分には、限定することなく、ルミノール、および構造的に関係した環状ヒドラジド、アクリダンエステル、チオエステル、およびスルホンアミド、ならびにアクリダンケテンジチオアセタール化合物を含めて、表題「化学発光標識化合物」の下で上記した各クラスの化合物が含まれる。
【０１４３】
本開示の別の実施形態では、化学発光化合物、および被検体に対して特異的な結合親和性を有し、または被検体に対して特異的な結合親和性を有する別の物質に対して特異的な結合親和性を有する、少なくとも１つの特異的な結合物質が上に固定化された固体支持体を含むアッセイ材料が提供される。これらの実施形態では、固定化された化学発光化合物は、上に固定化された化学発光化合物を有する固体支持体を含む実施形態について、直前に記載した通りである。固定化された特異的な結合物質は、１つ以上の特異的親和結合反応を通じて被検体に、直接または間接的に結合する。特異的な結合物質として、限定することなく、抗体および抗体断片、抗原、ハプテンおよびその同族抗体、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン、プロテインＡおよびＩｇＧ、相補的核酸またはオリゴヌクレオチド、レクチンおよび炭水化物が挙げられる。
【０１４４】
本開示の別の実施形態は、１）化学発光化合物、２）被検体に対して特異的な結合親和性を有し、または被検体に対して特異的な結合親和性を有する別の物質に対して特異的な結合親和性を有する、少なくとも１つの特異的な結合物質、３）被検体、および４）アクチベーターコンジュゲートが上に固定化された固体支持体を含むアッセイにおいて形成されるシグナル伝達システムを含む。用語「固体支持体」、「化学発光化合物」、および「特異的な結合物質」の意味、ならびにこれらの用語によって包含される実施形態は、本開示の組成物として見なされるアッセイ材料について上記に確立した意味および実施形態と同一である。本シグナル伝達システムのエレメントを形成することができる被検体には、上記に特定された任意の被検体が含まれ、その存在、位置、または量は、アッセイにおいて決定されるべきものである。アクチベーターコンジュゲートは、被検体−特異的結合パートナーコンジュゲートに結合したアクチベーター化合物を含む。このコンジュゲートは、二重の機能を果たす：１）直接に、または中間の被検体特異的結合メンバーを通じて、被検体特異的結合メンバー部分を通じて、アッセイにおける被検体に特異的に結合し、かつ２）アクチベーター部分を通じて化学発光化合物を活性化する。このコンジュゲートのアクチベーター化合物部分は、トリガー溶液の存在下で化学発光が生じるように、化学発光化合物の活性化を起こす化合物である。アクチベーターとして機能を果たすことができる化合物には、遷移金属の塩および錯体ならびに酵素を含めたペルオキシダーゼ様活性を有する化合物、特に遷移金属含有酵素、特に、ペルオキシダーゼ酵素が含まれる。アクチベーター化合物において有用な遷移金属として、周期表の３〜１２族のもの、特に、鉄、銅、コバルト、亜鉛、マンガン、およびクロムが挙げられる。化学発光反応を起こすことができるペルオキシダーゼとして、例えば、ラクトペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、バナジウムブロモペルオキシダーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、真菌ペルオキシダーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、Ａｒｔｈｒｏｍｙｃｅｓ ｒａｍｏｓｕｓに由来するペルオキシダーゼ、白色腐朽菌（ｗｈｉｔｅ ｒｏｔ ｆｕｎｇｉ）で産生されるＭｎ依存性ペルオキシダーゼ、およびダイズペルオキシダーゼが挙げられる。ペルオキシダーゼ様活性を有する他の化合物には、ｈｅｍｅなどの鉄錯体、およびＭｎ−ＴＰＰＳ４が含まれる。
【０１４５】
システム
本開示において記載されるアッセイ法は、システムを使用することによって、迅速に実行するために自動化することができる。本開示のアッセイを実施するためのシステムは、他の反応物を含有する反応容器にトリガー溶液をアリコートおよび送達し、得られる化学発光シグナルを読むための流体取り扱い能力を必要とする。そのようなシステムの実施形態では、ルミノメーターが、トリガー溶液注入の時点および箇所で、反応容器の近位に配置される。さらに、本開示のアッセイを実施するための自動システムは、他の反応物および試料を反応容器にアリコートおよび送達するための流体取り扱い能力を有する。
【０１４６】
改変ＤＸＩ８００機器は、本開示のアッセイ法を実施するために改変された。改変されていないＤＸＩ８００機器のさらなる説明は、参照により本明細書に組み込まれている、ＵｎｉＣｅｌ ＤＸＩ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ、（著作権）２００７年、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒにおいて入手可能である。本明細書に記載される方法を実施するのに使用するために、ＤＸＩ（登録商標）８００イムノアッセイ機器は、トリガー溶液注入の間、および注入直後に、反応容器の位置付近（反応容器から約１９ｍｍ）で検出するために配置された光子計数ルミノメーター（市販のＤＸＩ８００機器において使用されるのと同じモデル）を組み込むことによって改変された。
【０１４７】
ＤＸＩ（登録商標）８００イムノアッセイ内の基質送達システムが、トリガー溶液を送達するのに使用された。本明細書に記載される方法によるアッセイに必要でない、ＤＸＩ（登録商標）８００イムノアッセイ機器のいくつかの追加のコンポーネント、例えば、従来のイムノアッセイに必要であるが、本発明の方法において使用されない、分離および洗浄のために使用される磁石および吸引システムは、便宜上取り除かれた。改変ＤＸＩ（登録商標）８００イムノアッセイ機器は、反応容器の取り扱い、試薬のピペッティング、検出を自動化することにおいて便宜上利用され、温度制御を３７℃で施された。他の市販の計測装置も、機器が、トリガー溶液を反応容器中に注入し、同時またはほぼ同時の様式で化学発光シグナルの検出を開始するように改変することができ、または改変されてもよい限り、本明細書に記載されるアッセイ法を実施するために、同様に利用することができる。化学発光シグナルの検出は、非常に短い継続時間、すなわち、光電子増倍管（ＰＭＴ）の１周期などの数ミリ秒のものとすることができ、または数秒間に延長することもできる。収集されるシグナルのすべてまたは一部を、後続のデータ分析に使用することができる。
【０１４８】
化学発光シグナルの検出は、非常に短い継続時間、すなわち、光電子増倍管（ＰＭＴ）の１周期などの数ミリ秒のものとすることができ、または数秒間に延長することもできる。収集されるシグナルのすべてまたは一部を、後続のデータ分析に使用することができる。例えば、以下に記載される一般的な手順では、光強度は、閃光に集中させて０．２５秒間合計され、他の手順では、光強度は、注入を最初の０．５秒遅らせて、５秒間合計される。
【実施例】
【０１４９】
用語集：
ＡＨＴＬ：Ｎ−アセチルホモシステインラクトン
ＡＫ：アクリダン
ＣＫＭＢ：クレアチンキナーゼイソエンザイム
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＥＤＣ：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
ＨＲＰ：西洋わさびペルオキシダーゼ
ＭＳ−ＰＥＧ：末端メチル基を有するアミン反応性直鎖状ポリエチレングリコールポリマー
Ｎａ２ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸のナトリウム塩
ＮＨＳ：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
ＰＥＧ：ポリエチレングリコール；特に、分子量＜２０，０００ｇ／ｍｏｌのオリゴマーまたはポリマー
ＰＥＯ：ポリエチレンオキシド；特に、分子量＞２０，０００ｇ／ｍｏｌのポリマー
ＰＭＰ：１−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン
ＰＳＡ：前立腺特異的抗原
Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ：スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート
ＴＢＳ：Ｔｒｉｓ緩衝食塩水
ＴｎＩ：トロポニンＩ；ｃＴｎＩは心臓トロポニンＩである。
Ｔｒｉｓ：２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−プロパン−１，３−ジオール、ｔｒｉｓ−（ヒドロキシメチル）アミノメタンとしても公知
Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０：ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン（ｓｏｄｉｕｍ）モノラウレート；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ（ＭＯ）から市販されている。
【０１５０】
材料：
エンハンサーを含むトリガー溶液：以下の実施例の多くで使用したトリガー水溶液を、トリガー溶液Ａと呼ぶ。トリガー溶液Ａは、ｐＨ８．０の、２５ｍＭのＴｒｉｓの緩衝水溶液中に、８ｍＭのｐ−ヒドロキシケイ皮酸、１ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ、１０５ｍＭの尿素過酸化物、３％のエタノール、および０．２％のＴｗｅｅｎ（登録商標）−２０を含有する。すべての成分は、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯなどの様々な供給者から市販されている。
【０１５１】
緩衝液ＩＩ：（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｂｒｅａ ＣＡから市販されている、ＴＲＩＳ緩衝食塩水、界面活性剤、＜０．１％のアジ化ナトリウム、および０．１％のＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ））。
【０１５２】
機器：
改変ＤｘＩ（登録商標）８００イムノアッセイ機器（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）：改変ＤＸＩ（登録商標）８００機器を、以下のいくつかの実施例において記載されるアッセイ法を実施するのに使用し、そこで注記した。本明細書に記載される方法を実施するのに使用するために、ＤＸＩ（登録商標）８００機器は、トリガー溶液注入の間、および注入直後に、反応容器の位置付近（反応容器から約１９ｍｍ）で検出するために配置された光子計数（ｐｈｏｔｏ−ｃｏｕｎｔｉｎｇ）ルミノメーター（市販のＤＸＩ（登録商標）８００機器において使用されるのと同じモデル）を組み込むことによって改変した。ＤＸＩ（登録商標）８００イムノアッセイ内の基質送達システムを、トリガー溶液を送達するのに使用した。本明細書に記載される方法によるアッセイに必要でない、ＤＸＩ（登録商標）８００イムノアッセイ機器のいくつかの追加のコンポーネント、例えば、従来のイムノアッセイに必要であるが、本発明の方法において使用されない、分離および洗浄のために使用される磁石および吸引システムは、便宜上取り除いた。改変ＤＸＩ（登録商標）８００イムノアッセイ機器は、反応容器の取り扱い、試薬のピペッティング、検出を自動化することにおいて便宜上利用され、温度制御を３７℃で施した。他の市販の計測装置も、機器が、トリガー溶液を反応容器中に注入し、同時またはほぼ同時の様式で化学発光シグナルの検出を開始するように改変することができ、または改変されてもよい限り、本明細書に記載されるアッセイ法を実施するために、同様に利用することができる。他の例の機器は、以下に列挙されている。化学発光シグナルの検出は、非常に短い継続時間、すなわち、光電子増倍管（ＰＭＴ）の１周期などの数ミリ秒のものとすることができ、または数秒間に延長することもできる。収集されるシグナルのすべてまたは一部を、後続のデータ分析に使用することができる。
【０１５３】
化学発光シグナルの検出は、非常に短い継続時間、すなわち、光電子増倍管（ＰＭＴ）の１周期などの数ミリ秒のものとすることができ、または数秒間に延長することもできる。収集されるシグナルのすべてまたは一部を、後続のデータ分析に使用することができる。例えば、以下に記載される一般的な手順では、光強度は、閃光に集中させて０．２５秒間合計され、他の手順では、光強度は、注入を最初の０．５秒遅らせて、５秒間合計される。
【０１５４】
Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ（登録商標）プレートルミノメーター、（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）。改変されていない。室温で実施された方法。
【０１５５】
ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｌマイクロプレートルミノメーター、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）。改変されていない。高速読取りキネティックモードを使用して、室温で実施された方法。
【０１５６】
（実施例１）
モデル系を使用するＳＳＩＡの選択
モデル系も開発および使用することによって、本開示のアッセイにおいて選択的シグナル阻害剤として機能する特性を有する化合物をスクリーニングおよび選択した。このモデル系は、ストレプトアビジンおよび化学発光標識ｓｂｐとして、アクリダンケテンジチオアセタール化学発光標識（ＡＫ１）を標識されたＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ならびにアクチベーター標識特異的結合対としてビオチン化ＨＲＰにコンジュゲートした微粒子を使用する。このモデル系では、様々な量のＢｔｎ−ＨＲＰを、化学発光標識特異的結合対に、０、１、１０、１００、および２５０ｎｇ／ｍＬで添加する。各反応混合物中で、５００ｎｇ／ｍＬの濃度の全ＨＲＰに到達するために、追加の未標識ＨＲＰを添加する。アクチベーター標識ｓｂｐと組み合わせた未標識ＨＲＰを化学発光標識ｓｂｐ微粒子に供給することによって、試料を模倣した。ＳＳＩＡとして評価するための化合物も添加した。次いでこのモデル系のこの反応混合物を、本開示のアッセイの様式で、トリガー溶液を添加することによってトリガーした。
【０１５７】
モデル系のための材料の調製：
微粒子上に化学発光標識ｓｂｐを調製するために、４倍モル過剰のビオチン−ＬＣ−ｓｕｌｆｏＮＨＳ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）を用いてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をビオチン化した。非結合反応物を脱塩または透析によって除去した。次いで、ビオチン−ＢＳＡを、ｐＨ７．２の２０ｍＭのリン酸ナトリウム：ＤＭＳＯ（７５：２５、ｖ／ｖ）中の５倍モル過剰のアクリダンケテンジチオアセタールＡＫ１と反応させ、その後、同じ緩衝液中で脱塩した。次いで二重標識（ビオチンおよびＡＫ１）ＢＳＡを、トシル活性化Ｍ２８０微粒子（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）と、ｐＨ９．５の０．１Ｍのホウ酸塩緩衝液中で、微粒子１ｍｇ当たり標識されたＢＳＡ約２０μｇの濃度で、４０℃で１６〜２４時間カップリングさせた。カップリングした後、微粒子を、０．２ＭのＴＲＩＳ塩基、２％のＳＤＳ、ｐＨ約１１を用いて４０℃で１時間ストリップした。ストリッピングプロセスをさらに１回繰り返した。次いで微粒子を０．１％のＢＳＡ／ＴＲＩＳ緩衝食塩水（ＢＳＡ／ＴＢＳ）緩衝液中に懸濁させ、ストレプトアビジン（ＳＡ）を、微粒子１ｍｇ当たりＳＡ約１５μｇで添加した。ストレプトアビジンを、室温で４５〜５０分間微粒子と混合した。次いで微粒子を、同じＢＳＡ／ＴＢＳ中で３回洗浄し、懸濁させた。試験により、これらのベース微粒子は、微粒子１ｍｇ当たり、ビオチン化タンパク質約５μｇを結合することができることが示された。
【０１５８】
ＨＲＰ、（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ、ＵＳＡ）を、４倍モル過剰のビオチン−ＬＣ−ｓｕｌｆｏＮＨＳ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）を用いてビオチン化した。非結合反応物は、脱塩または透析によって除去した。
【０１５９】
評価のための各ＳＳＩＡ化合物を、反応混合物の最終濃度の少なくとも１０倍の濃度で緩衝液ＩＩ中に溶解させた（トリガー溶液を添加した後）。
【０１６０】
常磁性粒子（ＰＭＰ）：（Ｍ２８０）−（ｂｔｎ−ＢＳＡ−ＡＫ）−（ストレプトアビジ）；
試料エミュレーター：Ｂ−ＨＲＰ：ＨＲＰ；Ｂｔｎ−ＨＲＰの変化：０、１、１０、１００、および２５０ｎｇ／ｍＬを伴って、５００ｎｇ／ｍＬの全ＨＲＰ濃度でＢ−ＨＲＰ：ＨＲＰを滴定して、合計５００ｎｇ／ｍＬ。
【０１６１】
ＳＳＩＡ：１００μＭの最終濃度を与えるように目標としたＢＵＦＦＥＲ ＩＩ中で、以下の表による。
【０１６２】
トリガー溶液Ａは上記に定義されている。
モデル系を使用する試験手順
１ｍｇ／ｍｌの二重標識（ビオチンおよびＡＫ１）ＢＳＡ Ｍ２８０粒子２５μｌを、緩衝液ＩＩ中の作業濃度のＳＳＩＡ ４５μｌと混合した。アッセイ体積を、緩衝液ＩＩ １５μｌを添加することによって８５μｌにした。様々な比のＢｔｎ−ＨＲＰ：ＨＲＰ（ビオチン化ＨＲＰの量は、０から、１、１０、１００、および２５０ｎｇ／ｍＬで変更した）を含有する試料１５μｌを添加した。反応混合物を３７℃で３０分間インキュベートし、次いでトリガー溶液１００μＬを添加し、光強度を記録した。トリガー溶液を含む反応混合物の全体積は２００μＬであり、ＳＳＩＡの最終濃度は１００μＭであった。
【０１６３】
【表２】
【０１６４】
【表３】
【０１６５】
【表４−１】
【０１６６】
【表４−２】
【０１６７】
結論
ＳＳＩＡとして有用性を実証する化合物には、アスコルビン酸、アスコルビン酸の６−パルミテート誘導体および５，６−イソプロピリデン誘導体、およびＴＲＯＬＯＸ、トコフェロールの誘導体、２−アミノフェノール、４−アミノ−３−ヒドロキシ−安息香酸、４−アミノレソルシノールヒドロクロリド、４−クロロカテコール、ならびに２−クロロ−１，４−ジヒドロキシベンゼンが含まれ、Ｓ０値を対照と比較することによって示されるバックグラウンドシグナルの低減、およびＳ１／Ｓ０値の増加によって実証されるシグナル対ノイズの改善を伴う。
【０１６８】
モデル系において効果を示さなかった化合物は、グルタチオン、システイン、Ｎ−アセチルシステイン、リポ酸（ジスルフィド）、ペグ化トコフェロール、メラトニン（トリプタミン誘導体）、ＴＥＭＰＯＬ（安定な窒素酸化物）、ニコチン酸ヒドラジド、ニコチン酸、および２つのアクリルアミド／ビスアクリルアミド溶液である。αおよびγ−トコフェロール、尿酸、ならびにフェルラ酸を含む、第２の分類の化合物は、７５〜８８％の範囲でＳ０シグナルの低減を示すが、１０ｎｇ／ｍＬのＢｔｎ−ＨＲＰでの第３のキャリブレーターレベルまでＳ／Ｓ０の増大を示さない。
【０１６９】
（実施例２）
ホモジニアスＰＳＡイムノアッセイによるＳＳＩＡのスクリーニング
この実施例は、本開示のアッセイにおけるＳＳＩＡとしての機能性について、候補化合物を試験するのに使用した一方法を示す。試験は、タンパク質ＰＳＡのモデルスクリーニングイムノアッセイにおいて行った。マウス抗−ＰＳＡ試験は、９６ウェルマイクロタイタープレート形式を使用して行った。マウス抗−ＰＳＡ−ＡＫ１ ３０μＬ（６６ｎｇ）、マウス抗−ＰＳＡ−ＨＲＰコンジュゲート３０μＬ（７．８ｎｇ）、ヒト女性の血清３６μＬ、およびＰＳＡキャリブレーター２４μＬを含有する溶液を、ピペットで各ウェルに入れた。プレートを３７℃で１０分間インキュベートした。試験化合物のアリコート５μＬ（様々な濃度）を各ウェルに添加した。化学発光は、トリガー溶液Ａの溶液１００μＬを添加することによってトリガーした。化学発光の閃光は、Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎ Ａｓｅｎｔ（登録商標）プレートルミノメーター、（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して、トリガー溶液を添加した後に５秒間積分した。
【０１７０】
各候補化合物は、少なくとも２つレベルのＰＳＡ、すなわち、ゼロ、ならびに１２９ｎｇのＰＳＡ／ｍＬ（キャリブレーターＳ５）および／または２ｎｇのＰＳＡ／ｍＬ（キャリブレーターＳ２）で試験した。簡潔さのために、各候補化合物の１つの代表的な濃度の結果のみを示した。Ｓ５／Ｓ０が、対照との関連で改善されている場合、化合物は、アッセイ性能の改善に有効であると見なされる。本スクリーニングにおいて、改善係数は、少なくとも２（Ｓ５／Ｓ０≧約２０〜３０）であることが望ましく、改善係数は、少なくとも５（Ｓ５／Ｓ０≧約５０）であることがより望ましく、Ｓ５／Ｓ０は、≧１００であることがさらにより望ましい。多くの化合物は、このスクリーニング検査においてＳＳＩＡとして有効性を示すことが見出され、他の化合物は、効果的でないか、または限定された効果を有することが見出された。
【０１７１】
【表５−１】
【０１７２】
【表５−２】
【０１７３】
【表５−３】
【０１７４】
【表５−４】
【０１７５】
（実施例３）
ＡＫ１およびＡＢ１を有する粒子の調製
この実施例では、ＡＫ化学発光標識および特異的結合対のメンバー、Ａｂ１を有する固体表面（ＬｏｄｅＳｔａｒｓ（商標）カルボキシル常磁性粒子、「ＬｏｄｅＳｔａｒ ＰＭＰ」）を調製するための方法を記載する。Ａｂ１は、後続の実施例において示される被検体（ＣＫ−ＭＢ、βｈＣＧ、ミオグロビン、ｃＴｎＩ、およびＰＳＡ）についてのモノクローナル抗体である。当技術分野で慣例的であるように、数値または文字識別子が必要に応じて後に続く用語「Ａｂ」は、指定された数値または文字名称を有する抗体を指す。同様に、用語「Ａｇ」は、抗体−抗原相互作用との関連で抗原を指す。
【０１７６】
Ｌｏｄｅｓｔａｒ ＰＭＰ（３０ｍｇ／ｍＬで８．３３ｍｌ）を、０．１ＭのＭＥＳ／ＤＭＳＯ（７５：２５）（９．９５ｍｌ）中に懸濁させた。ＥＺ−Ｌｉｎｋビオチン−ＰＥＯ４−ヒドラジド（２０ｍｇ／ｍＬで３１．６μｌ）、ＥＤＣ（２５ｍｇ／ｍＬの最終濃度）、およびヒドラジド標識化部分を有するＡＫ４（８０ｍｍｏｌ／Ｌで１５．６μＬ）を、Ｌｏｄｅｓｔａｒ ＰＭＰに添加し、室温で、１４０〜１６０ＲＰＭで１分間、次いで４℃で一晩（１６〜２４時間）撹拌した。次いでこの粒子をＢＵＦＦＥＲ ＩＩ中で洗浄し、再懸濁させた。ＳＡ２１ストレプトアビジン−Ｐｌｕｓ（１０．２ｍｇ／ｍＬで０．４９ｍＬ）をＰＭＰに添加することによって、ＡＫ−ストレプトアビジンＬｏｄｅｓｔａｒ粒子を形成した。
【０１７７】
２つの代表的なプロトコールのうちの１つを使用して、抗体をビオチン標識した。
１）１０倍モル過剰のＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ ＩＬ）を抗ｃＴｎＩモノクローナル抗体に添加し、この混合物を室温で２時間インキュベートした。ビオチン化抗体を、ｐＨ７．２のＰＢＳ中で、透析によって精製した。ビオチン：抗体のモル比は、市販のビオチン定量化キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して決定した場合、４．９であった。または
２）ＤＭＳＯ中で２ｍｇ／ｍＬに溶解させた、６倍モル過剰のＮＨＳ−（ＰＥＯ）４−ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を、ＭｘＰＳＡ抗体（ｐＨ７．４のＰＢＳ中で７．６ｍｇ／ｍＬ）６ｍｇに添加することによって、ビオチン化ＰＳＡ抗体を調製した。周囲温度で６０分間インキュベートした後、ビオチン化抗体を、製造者の指示書に従って、ｐＨ７．４のＰＢＳ中で平衡化した、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を通して精製した。
【０１７８】
ＡＫ−ストレプトアビジンＬｏｄｅｓｔａｒ粒子（５ｍｇ／ｍＬ）をＢＵＦＦＥＲ ＩＩ中に入れた。Ａｂ１の必要量を計算し、ＡＫ−ストレプトアビジンＬｏｄｅｓｔａｒ粒子（１０μｇ／ｍｇであったβｈＣＧを除いて、通常５μｇ／ｍｇ）に添加した。反応混合物をボルテックスし、４℃で一晩インキュベートし、それによってＡＫ−Ａｂ１粒子を形成した。
【０１７９】
（実施例４）
ＨＲＰ−Ａｂ２コンジュゲートの調製
ＨＲＰ−Ａｂ２コンジュゲートを、当技術分野で公知の方法を使用して調製した。ＨＲＰ−Ａｂ２コンジュゲートを生成するために、ＨＲＰを抗体にコンジュゲートする詳細な方法は、例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、４巻、３号、１９８３年、２０９〜３２１頁に提供されている。Ａｂ２は、後続の実施例において示される被検体（ＣＫ−ＭＢ、βｈＣＧ、ミオグロビン、およびＴｎＩ）についてのモノクローナル抗体であり、これは、Ａｂ−１とは異なる、被検体上の抗原部位に結合する。
【０１８０】
一般に、生成物依存性濃度のＮ−アセチル−ＤＬ−ホモシステインチオラクトン（ＡＨＴＬ）を使用して、遊離チオールを抗体（Ａｂ２）に結合させた。脱塩によって過剰のＡＨＴＬを抗体から除去した。モル過剰のスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ）を使用して、マレイミドをＨＲＰに結合させた。脱塩によって過剰のｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣをＨＲＰから除去した。抗体およびＨＲＰを、４ＨＲＰと１ Ａｂ２のモル比で合わせ、反応物の基同士間で共有結合を形成した。ＨＲＰを過剰に維持しながら、抗体を計量してＨＲＰ中に供給した。適切な時間量の間インキュベートした後、β−メルカプトエタノール（βＭＥ）およびＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）を用いて未反応の官能基をブロックすることによって反応を停止した。コンジュゲーション生成物（ＨＲＰ−Ａｂ２コンジュゲート）を濃縮し、ゲル濾過によって、任意の凝集したコンジュゲーション生成物および未反応の抗体またはＨＲＰから分離した。コンジュゲーション生成物を、ＯＤ２８０およびＯＤ４０３活性に基づいてプールした。
【０１８１】
（実施例５）
ＣＫ−ＭＢ
この実施例は、実施例３に示したように調製したＡＫ−Ａｂ１粒子、および実施例４に示したように調製したＨＲＰ−Ａｂ２コンジュゲートを使用して、ＣＫ−ＭＢ（クレアチンキナーゼ心筋型）を検出する方法を記載し、この場合、Ａｂ２は、ＣＫ−ＭＢに対する抗体を表す。この方法は、アスコルビン酸を使用することによってバックグラウンドシグナルを減少させた。
【０１８２】
ＨＲＰ−Ａｂ２コンジュゲート懸濁液は、１．０μｇ／ｍＬで調製し、０または１ｍＭのアスコルビン酸を含有した。試料は、指定量（ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｍｏｕｎｔｓ）のＣＫ−ＭＢを添加された、または対照としてＣＫ−ＭＢをまったく含まないヒト血清試料から構成した。試験手順は、１．０μｇ／ｍＬのＨＲＰ−Ａｂ２コンジュゲート１５μＬ、ならびに１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡおよび１ｍｇ／ｍＬのＭＩｇＧを含有するｐＨ５．９のＭＥＳ緩衝液３５μＬを反応容器に添加するステップから構成した。次に、患者の血清試料２５μＬを添加し、その後、１．０ｍｇ／ｍＬのＡＫ−Ａｂ１コンジュゲート懸濁液２５μＬを添加し、それによって、反応容器内で１００μＬの全体積を得た。１５．２分後に、トリガー溶液Ａ １００μＬを反応容器に添加し、光強度を改変ＤｘＩ機器で記録した。化学発光強度を相対光単位（ＲＬＵ）で表す。
【０１８３】
【表６】
【０１８４】
（実施例６）
βＨＣＧ
この実施例は、実施例３に示したように調製したＡＫ−Ａｂ１粒子、および実施例４に示したように調製したＨＲＰ−Ａｂ２コンジュゲートを使用して、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン（βｈＣＧ）を検出する方法を記載し、この場合、Ａｂ２は、βｈＣＧに対する抗体を表す。この方法は、アスコルビン酸を使用することによってバックグラウンドシグナルを減少させた。
【０１８５】
ＨＲＰ−Ａｂ２コンジュゲート懸濁液は、１．０μｇ／ｍＬで調製し、０または１ｍＭのアスコルビン酸を含有した。試料は、指定量のβｈＣＧを添加された、または対照としてβｈＣＧをまったく含まないヒト血清試料から構成した。試験手順は、１．０μｇ／ｍＬのＨＲＰ−Ａｂ２コンジュゲート２０μＬ、ならびに１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡおよび１ｍｇ／ｍＬのＭＩｇＧを含有するｐＨ５．９のＭＥＳ緩衝液３０μＬを反応容器に添加するステップから構成した。次に、患者の血清試料２５μＬを添加し、その後、１０ｍｇ／ｍＬのＡＫ−Ａｂ１コンジュゲート懸濁液２５μＬを添加し、それによって、反応容器内で１００μＬの全体積を得た。１５．２分後に、トリガー溶液Ａ １００μＬを反応容器に添加し、光強度を改変ＤｘＩ機器で記録した。化学発光強度を相対光単位（ＲＬＵ）で表す。
【０１８６】
【表７】
【０１８７】
（実施例７）
ミオグロビン
この実施例は、実施例３に示したように調製したＡＫ−Ａｂ１粒子、および実施例４に示したように調製したＨＲＰ−Ａｂ２コンジュゲートを使用して、ミオグロビンを検出する方法を記載し、この場合、Ａｂ２は、ミオグロビンに対する抗体を表す。この方法は、アスコルビン酸を使用することによってバックグラウンドシグナルを減少させた。
【０１８８】
ＨＲＰ−Ａｂ２コンジュゲート懸濁液は、１．０μｇ／ｍＬで調製し、０または１ｍＭのアスコルビン酸を含有した。試料は、指定量のミオグロビンを添加された、または対照としてミオグロビンをまったく含まないヒト血清試料から構成した。試験手順は、１．０μｇ／ｍＬのＨＲＰ−Ａｂ２コンジュゲート２０μＬ、ならびに１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡおよび１ｍｇ／ｍＬのＭＩｇＧを含有するｐＨ５．９のＭＥＳ緩衝液３０μＬを反応容器に添加するステップから構成した。次に、患者の血清試料２５μＬを添加し、その後、５．０ｍｇ／ｍＬのＡＫ−Ａｂ１コンジュゲート懸濁液２５μＬを添加し、それによって、反応容器内で１００μＬの全体積を得た。１５．２分後に、トリガー溶液Ａ １００μＬを反応容器に添加し、光強度を改変ＤｘＩ機器で記録した。化学発光強度を相対光単位（ＲＬＵ）で表す。
【０１８９】
【表８】
【０１９０】
（実施例８）
ヘテロジニアスアッセイを介したｃＴｎＩ検出
この実施例は、例えば、実施例３に示したように調製したＡＫ−Ａｂ１粒子、および例えば、実施例４に示したように調製したＨＲＰ−Ａｂ２コンジュゲートを使用して、ｃＴｎＩ（心臓トロポニンＩ）を検出する方法を記載し、この場合、Ａｂ２は、ｃＴｎＩに対する抗体を表す。バックグラウンドシグナルに対するアスコルビン酸の効果を調査した。
【０１９１】
ＨＲＰ−Ａｂ２コンジュゲート懸濁液は、１．０μｇ／ｍＬで調製し、０または１ｍＭのアスコルビン酸を含有した。試料は、指定量のｃＴｎＩを添加された、または対照としてｃＴｎＩをまったく含まないヒト血清試料から構成した。試験手順は、１．０μｇ／ｍＬのＨＲＰ−Ａｂ２コンジュゲート２０μＬ、ならびに１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡおよび１ｍｇ／ｍＬのＭＩｇＧを含有するｐＨ５．９のＭＥＳ緩衝液３０μＬを反応容器に添加するステップから構成した。次に、患者の血清試料２５μＬを添加し、その後、１．０ｍｇ／ｍＬのＡＫ−Ａｂ１コンジュゲート懸濁液２５μＬを添加し、それによって、反応容器内で１００μＬの全体積を得た。１５．２分後に、トリガー溶液Ａ １００μＬを反応容器に添加し、光強度を改変ＤｘＩ機器で記録した。化学発光強度を相対光単位（ＲＬＵ）で表す。以下の表に示した結果は、アスコルビン酸の存在下で、バックグラウンドシグナルの有意な低減を示す。
【０１９２】
【表９】
【０１９３】
（実施例９）
ＧＭ−ＣＳＦについてのヘテロジニアスアッセイ
用語「ＧＭ−ＣＳＦ」は、ヒト遺伝子地図座位５ｑ３１．１を有する、造血前駆細胞の生存、増殖、および分化に必要なタンパク質である、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｃｏｌｏｎ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）を指す。ＧＭ−ＣＳＦに対する様々な抗体が市販されている。
【０１９４】
ＧＭ−ＣＳＦに関するヘテロジニアス相アッセイは、実施例３に記載したようなＡＫ４およびビオチン／ストレプトアビジンで標識されたＬｏｄｅＳｔａｒｓ ＰＭＰ（ＡＫ−ＰＭＰ−ＳＡ）、抗体−ビオチンコンジュゲート、ならびにＧＭ−ＣＳＦに結合する抗体−ＨＲＰコンジュゲートを使用して行った。抗体−ＨＲＰコンジュゲート、（抗ＧＭ−ＣＳＦ−ＨＲＰ）は、Ａｎｔｉｇｅｎｉｘから購入した。
【０１９５】
抗体−ビオチン（抗ＧＭ−ＣＳＦ−ビオチン）コンジュゲートは、ＤＭＦ中に溶解した（１ｍｇ／ｍＬ）、２５倍モル過剰（９．２８μｇ）のスルホＮＨＳ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）を、ｐＨ８．２５の０．１Ｍのホウ酸ナトリウム０．１ｍＬ中の抗体（Ａｎｔｉｇｅｎｉｘ）０．１ｍｇに添加することによって合成した。周囲温度で６０分間インキュベートした後、反応物を放置して４℃で一晩インキュベートした。ビオチン化抗体を、製造者の指示書に従って、ｐＨ７．４のＰＢＳ中で平衡化した、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を通して精製した。
【０１９６】
ヘテロジニアスアッセイを実施するために、抗ＧＭ−ＣＳＦ−ビオチンコンジュゲート溶液３０μＬ（０．７５μｇ／ｍＬ、２２．５ｎｇ）、０〜３０，０００ｐｇ／ｍＬの範囲内でＧＭ−ＣＳＦを有するキャリブレーター溶液３０μＬ、抗ＧＭ−ＣＳＦ−ＨＲＰコンジュゲート３０μＬ（２．２５μｇ／ｍＬ、６７ｎｇ）、およびＡＫ−ストレプトアビジン磁性粒子溶液３０μＬ（粒子１０μｇ）を、白色マイクロタイタープレートのウェル中にピペットで入れた。プレートを室温で６０分間インキュベートした。２−アミノフェノール溶液５μＬ（１１ｍＭ、５５ｎｍｏｌｅｓ）をＳＳＩＡとして添加した。プレートを、注入プレートルミノメーター内に配置した。トリガー溶液Ａ １００μＬを、ルミノメーターによって添加し、化学発光シグナルを５秒間読み取った。
【０１９７】
反応混合物中のＧＭ−ＣＳＦの濃度の関数としての、化学発光の平均強度（ＲＬＵ）、および反応混合物中にＧＭ−ＣＳＦが存在しないものと比べた比（Ｓ／Ｓ０）を、以下の表に提供する。
【０１９８】
【表１０】
【０１９９】
（実施例１０）
トリガー溶液のｐＨの効果
Ａ．ヘテロジニアス固相アッセイの性能に対するｐＨの効果を、実施例３に記載したようなＡＫ４およびビオチンヒドラジドで直接コンジュゲートされたＬｏｄｅＳｔａｒｓ粒子に対して、実施例１のビオチン−ＨＲＰモデル系を使用するモデルアッセイにおいて評価した。次いで、上記したように、粒子にＳＡを受動的にオーバーコートし、その後すすぐことによって、ビオチンに結合しなかったＳＡを除去した。緩衝塩は、６〜９の範囲のｐＨをもたらすように選択した。ｐＨの関数としての、アッセイのバックグラウンド化学発光に対する効果を、図１Ａに示す。１６：１８４のｂｔｎ−ＨＲＰ：ＨＲＰの比を使用した特定のシグナルに対するｐＨの効果を、図１Ｂに表す。
Ｂ．様々な試験アッセイシステムに対するトリガー溶液のｐＨの効果を決定するために、一連の実験を、トリガーのｐＨを変更して行った。以下の表１１Ａは、６．２〜８．４のｐＨ範囲内でＬｏｄｅＳｔａｒｓ粒子上のＰＳＡを使用するアッセイにおける、ＰＳＡ濃度の関数としての平均化学発光強度を提供する。表１１Ｂは、５．９〜８．６のｐＨ範囲内での、ＬｏｄｅＳｔａｒ粒子上のＣＫ−ＭＢについての対応する結果を提供する。表１１Ｃは、５．９〜８．７のｐＨ範囲内での、ＬｏｄｅＳｔａｒ粒子上のＴｎＩについての対応する結果を提供する。これらの表において、２つのｐＨ値を各データセットについて列挙する。第１のｐＨは、反応混合物に添加された緩衝液試料のｐＨである。第２のｐＨは、最終的な反応ミックスの得られたｐＨである。
【０２００】
【表１１Ａ】
【０２０１】
【表１１Ｂ】
【０２０２】
【表１１Ｃ】
【０２０３】
（実施例１１）
ＰＭＰモデル系におけるアッセイシグナルに対するｐＨの効果
ヘテロジニアス固相アッセイの性能に対するｐＨの効果を、実施例１に一般に記載したようなビオチン−ＨＲＰを伴うモデル系における、Ｄｙｎａｌ Ｍ−２８０およびＬｏｄｅＳｔａｒｓ粒子を用いたアッセイについてさらに調査した。ＡＫ１−ストレプトアビジン−ＰＭＰで標識されたＬｏｄｅＳｔａｒｓ粒子は、実施例３に記載した通りであった。トシル活性化Ｍ−２８０粒子は、実施例１に記載したようなＡＫ−ＢＳＡ−ビオチン、その後にストレプトアビジンを共有結合性にカップリングすることによって標識した。
【０２０４】
緩衝液
表１２を参照して、緩衝液は、緩衝液イオンが１００ｍＭ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００が０．２％、およびＮａＣｌが１５０ｍＭであった。「トリガー後」のｐＨは、緩衝液が１部（１ ｐａｒｔ）、ｐＨ８の２５ｍＭのトリスが１部、およびトリガー溶液Ａが２部の組合せによって決定した。ｐＨを読み取るための温度は、３７．４℃であった。
【０２０５】
【表１２】
【０２０６】
この実験についての試料のｐＨ、トリガー後のｐＨ、相対的化学発光、およびシグナル対ノイズ（Ｓ／Ｎ）の結果を、ＬｏｄｅＳｔａｒｓ ＰＭＰおよびＤｙｎａｌ Ｍ−２８０ ＰＭＰについてそれぞれ表１３Ａおよび１３Ｂにおいて表にする。
【０２０７】
【表１３Ａ】
【０２０８】
【表１３Ｂ】
【０２０９】
結論
ｐＨは、ＬｏｄｅＳｔａｒｓ ＰＭＰおよびＤｙｎａｌ Ｍ−２８０ ＰＭＰの両方について、化学発光に大いに影響し、その効果は、ＰＭＰの型の間である程度異なることが観察された。
【０２１０】
（実施例１２）
化学発光に対するアスコルビン酸インキュベーション時間の効果
化学発光強度の観察される低減に対する、試料がアスコルビン酸に曝される時間の長さの効果を、実施例１１に記載したＤｙｎａｌ Ｍ−２８０ ＰＭＰ粒子およびビオチン−ＨＲＰ系を使用して、一連の実験において調査した。簡単に言えば、ビオチン標識ＰＭＰ、および様々なビオチン−ＨＲＰ／ＨＲＰ溶液を結合させ、アスコルビン酸溶液を添加した。８０〜３３０秒の範囲の遅延期間の後、トリガー溶液Ａを注入し、化学発光強度を積分した。ビオチン−ＨＲＰ／ＨＲＰ溶液は、比率１：２００、８：１９２、および３２：１６８のビオチン−ＨＲＰ：ＨＲＰで、合計２００ｎｇ／ｍＬのＨＲＰを含有した。０、２５、５０、１００、および２００μＭで、水中の試料として様々な濃度のアスコルビン酸を使用して試験を行った。
【０２１１】
これらの調査の結果は、８０〜３３０秒の範囲内のアスコルビン酸インキュベーション時間は、観察される化学発光に対して有意な効果を引き起こすように現われないことを実証した。結果は、ビオチン−ＨＲＰ／ＨＲＰの比に無関係に、本質的に同じであった。
【０２１２】
（実施例１３）
ｃＴｎＩアッセイに対するアスコルビン酸の効果の詳細化
微粒子形式でのアッセイ性能の改善におけるアスコルビン酸の有効性を、様々な磁性粒子を含むｃＴｎＩ被検体を使用して調査した。評価した磁性粒子には、ＬｏｄｅＳｔａｒｓ ＰＭＰ、ラテックスＰＭＰ、およびカルボキシレート改変ポリスチレンラテックスＰＭＰが含まれていた。「ロットＢの磁性粒子」は、６．２μｍの直径のカルボキシルＰＭＰ（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｆｉｓｈｅｒｓ、ＩＮ）である。「ロットＤの磁性粒子」は、８．１μｍの直径のカルボキシルＰＭＰ（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）である。「ロットＦのラテックス粒子」は、３．１μｍの直径のカルボキシルＰＭＰ（Ｓｅｒａｄｙｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）である。「ＣＭＬ ＰＭＰ」は、２．９μｍの直径のカルボキシレート改変ラテックス粒子（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）である。ＬｏｄｅＳｔａｒｓ ＰＭＰを、実施例３の一般的なプロトコールに従って、ＥＤＣカップリングによってＡＫ４およびビオチンで標識し、ストレプトアビジンでオーバーコートした。ロットＢ、Ｄ、およびＦ、ならびにＣＭＬ ＰＭＰを、実施例１に従ってＡＫ−ＢＳＡ−ビオチンで標識した。次いで、粒子をストレプトアビジンでコーティングし、ビオチン標識抗ｃＴｎＩに結合させた。実験プロトコールは、実施例８に一般に記載した通りであり、インキュベーション時間は１０．２分であった。ｃＴｎＩ（すなわち、Ｓ０〜Ｓ６）の濃度は、表９に提供した通りであった。
【０２１３】
結果
初期の実験において、ｃＴｎＩアッセイを、反応物ミックス中にアスコルビン酸を用いないで実施した。表１４に示したように、ＬｏｄｅＳｔａｒｓ粒子は、最高の特異的シグナルを有するが、バックグラウンドシグナルが、低キャリブレーターシグナルの多くを圧倒する。
【０２１４】
【表１４−１】
【０２１５】
【表１４−２】
【０２１６】
トリガーを添加する前に１５０μＭのアスコルビン酸を用いて実験を繰り返す場合、表１５に示す結果が得られる。この場合、ＬｏｄｅＳｔａｒｓ粒子は、他の粒子タイプよりはるかに多くの特異的シグナルを保持し、それでもバックグラウンドは、ほとんど３００％減少する。
【０２１７】
【表１５−１】
【０２１８】
【表１５−２】
【０２１９】
結論
この実施例でもたらされる結果は、アッセイ反応混合物中にアスコルビン酸を含めることにより、アッセイ感度が著しく改善されることを実証する。
【０２２０】
（実施例１４）
粒子タイプの効果の調査
本明細書に記載されるアッセイに対する特定の固相粒子の効果をさらに調査するために、シリカ、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）を含めた、様々な粒子タイプの比較を行った。カルボキシル改変ＰＭＭＡ粒子（ＰｏｌｙＡｎ ＧｍｂＨ、Ｂｅｒｌｉｎ）を、実施例３に記載したようにＡＫおよびビオチンで標識し、その後、ストレプトアビジンでコーティングした。シリカ粒子を、１ｍＭの酢酸中の３−アミノプロピルシロキサンと反応させることによって、アミン反応基を提供した。アミン官能基をＡＫ−３およびビオチン−ＬＣ−ｓｕｌｆｏＮＨＳと反応させ、その後、ストレプトアビジンでコーティングした。
【０２２１】
シリカおよびＰＭＭＡ粒子を用いたシグナル生成。実施例１に一般に記載されるような、ＨＲＰモデル系を使用するアッセイを、反応混合物中にアスコルビン酸を含めて、および含めずに、シリカ粒子およびＰＭＭＡ粒子で行った。アッセイは、上記したような改変ＤｘＩ機器で実施した。アッセイ条件は、ＢＵＦＦＥＲ ＩＩ（アスコルビン酸を含む、または含まない）４５μＬ、粒子懸濁液２５μＬ、および試料１５μＬを合わせるステップと、３０分間インキュベートするステップから構成した。次いで、トリガー溶液Ａ １００μＬを反応容器に添加し、光強度を記録した。
【０２２２】
結果を、表中に示した濃度条件と共に、表１５Ａ（シリカ）および表１５Ｂ（ＰＭＭＡ）に提供する。
【０２２３】
【表１６Ａ】
【０２２４】
【表１６Ｂ】
【０２２５】
（実施例１５）
粒子タイプの効果の調査
シリカおよびＰＭＭＡ粒子を用いたシグナル生成。Ｄｙｎａｌ Ｍ−２８０、３μｍのＣＭＬ、６μｍのＣＭＬ、ＰＭＭＡ、シリカ、およびＬｏｄｅＳｔａｒｓ粒子の比較を、上記したｃＴｎＩアッセイを使用して行った。ストレプトアビジンのコーティングを有する各粒子の調製は、前述の実施例に記載されている。アスコルビン酸は、存在する場合、１５０μＭであった。結果を以下の表１７に提供する。試験した各粒子系において、１５０μＭのアスコルビン酸の存在により、最高のキャリブレーター（ｃａｌｉｂｔｒａｔｏｒ）レベルでＳ／Ｓ０が著しく改善され、最低レベルで試験した場合も同様であった。
【０２２６】
【表１７−１】
【０２２７】
【表１７−２】
【０２２８】
（実施例１６）
アスコルビン酸濃度の効果の調査
様々な粒子を使用する、ｃＴｎＩアッセイに対するアスコルビン酸の効果。化学発光に対する、１５０μＭ〜９．４μＭの範囲内でアスコルビン酸濃度を変更することの効果を、Ｄｙｎａｌ Ｍ−２８０、６μｍのＣＭＬ、およびＬｏｄｅＳｔａｒｓ粒子を使用するアッセイについて調査した。ｃＴｎＩについてのアッセイは、実施例８に一般に記載した通りであり、濃度は、表１８Ａ〜Ｃに提供した通りであった。試験した各粒子タイプは、すべての濃度のアスコルビン酸により、シグナル／バックグラウンドを増大させることによって分析感度が改善されることを明らかにした。
【０２２９】
【表１８Ａ】
【０２３０】
【表１８Ｂ】
【０２３１】
【表１８Ｃ】
【０２３２】
（実施例１７）
ｃＴｎＩ分析のための方法の比較：アッセイの線形性
限定されないが、バックグラウンドシグナルの低減、アッセイに必要とされる時間の減少、望まれない化学的相互作用の排除などのために追加の試薬を含めることを含めた、本明細書に記載されるアッセイ手順の改変は、当業者に利用可能である。したがって、本明細書に記載されるような被検体検出のための方法をさらに特徴づけるために、アッセイ成分が以下に記載される通りである一連の実験を行った。
【０２３３】
ＰＭＰは、実施例３における一般的な手順によって調製された、ＡＫ１およびｃＴｎＩに対する抗体（Ａｂ１）とコンジュゲートされた、１００ｍＭのＴｒｉｓ、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．２％のＴｗｅｅｎ２０、１％のＢＳＡ、０．１％のＰｒｏｃｌｉｎ、ｐＨ８．０中の１ｍｇ／ｍＬのＬｏｄｅＳｔａｒｓであった。製造者のプロトコールに従って、Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ−Ｌｉｎｋ（商標）方法（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯ）を用いて得られたＨＲＰ−Ａｂ２コンジュゲートを、５０μｇ／ｍＬのＰｏｌｙＭａｋ−３３（Ｒｏｃｈｅ）、１ｍｇ／ｍＬのＭＩｇＧ（マウスＩｇＧ）、および０．５ＭのＮａＣｌと組み合わせて、１μｇ／ｍＬで使用した。標準的なＴｎＩ溶液（ＳＣＩＰＡＣ）および正常な臨床的ヒト試料を用意した。キャリブレーターのＴｎＩ値は、ＡｃｃｕＴｎＩアッセイ（Ｂｅｃｋｍａｎ ｃｏｕｌｔｅｒ）によって決定した。
【０２３４】
ｃＴｎＩアッセイプロトコールは、１ｍｇ／ｍＬのＡＫ−Ａｂ１粒子懸濁液２５μＬ、３３３μＭのアスコルビン酸４５μＬ、１μｇ／ｍＬのＨＲＰ−Ａｂ２ １５μＬ、および試料１５μＬをピペッティングするステップから構成した。混合物を、３７℃で５分間インキュベートした。次いで、トリガー溶液Ａ １００μＬを注入することによってトリガーする。得られる閃光を、トリガー添加直後から始めて２５０ミリ秒間にわたって測定する。
【０２３５】
図２Ａに表した結果を伴う代表的な実験において、一連のｃＴｎＩ較正標準物質（濃度範囲：０〜２５．９２ｎｇ／ｍＬ）を、上記した手順によって分析した。実験条件下で、この濃度範囲内で、線形の結果（Ｒ２＝０．９９９９）が観察される。
【０２３６】
応答の線形性に対する試料希釈の効果を、陽性のｃＴｎＩ試料を希釈し（２×）、次いで、０：１０、１：９、２：８、３：７、４：６、５：５、６：４、７：３、８：２、９：１、および１０：０のシリーズで試料を系統的に希釈することによって調査した。１０：０希釈（すなわち、最大のｃＴｎＩ濃度）で、ＲＬＵの絶対値は４１８，２５６であった。これは、約９．６ｎｇ／ｍＬの濃度に対応する。図２Ｂに示したように、良好な線形性（すなわち、Ｒ２＝０．９９４８）が、これらの希釈条件下で、ＲＬＵの観察値と予測値の間で見出される。
【０２３７】
希釈試験プロトコールを、図１１Ｂについて記載した系統的な希釈スキームと共に、８倍希釈の陽性のｃＴｎＩ試料を使用することによって、さらに調査した。これらの条件下で、８倍希釈された試料は、約７６，８３２のＲＬＵ値をもたらした。これは、約１．８ｎｇ／ｍＬのｃＴｎＩの濃度に対応する。図２Ｃに示したように、そのような希釈条件下でさえ、妥当な線形性（Ｒ２＝０．９７８５）が観察される。
【０２３８】
アッセイの分析感度を、ゼロ被検体キャリブレーターの２０の複製物を作製し、引き続いて２倍標準偏差を計算することによって測定した。２倍標準偏差は、既知の濃度のｃＴｎＩを用いて収集された較正曲線に対する幅（ｓｗａｔｈ）として見積もられ、この手順についての０．００５ｎｇ／ｍＬのｃＴｎＩの感度の推定値をもたらす。
【０２３９】
（実施例１８）
ｃＴｎＩ分析方法のＡＣＣＥＳＳ ＡＣＣＵＴＮＩとの比較
本発明の方法によって行われたｃＴｎＩアッセイの結果を、参照方法、すなわちＡｃｃｅｓｓ ＡｃｃｕＴｎＩシステム（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）の結果と比較した。アスコルビン酸試薬を、反応物ミックス中に５００μＭのアスコルビン酸４５μＬとして添加したことを除いて、先の実施例で記載したように本方法を実施した。
【０２４０】
臨床試料を、以下のように得た：被検体（ｃＴｎＩ）が存在しない（２５試料）、陽性のリチウムヘパリン血漿患者試料、陽性の血清、ならびに同じ患者（Ｎ＝１５）からのマッチングされた血漿および血清試料。標準的なｃＴｎＩ溶液を使用し、０〜１７．４８ｎｇ／ｍＬの範囲内のｃＴｎＩ投与を提供した。
【０２４１】
５４の血漿試料および４１の血清試料を含む９５の臨床試料の分析を、上記した手順（３回の反復）、およびＡｃｃｅｓｓ ＡｃｃｕＴｎＩ手順（２回の反復）を使用して行った。Ａｃｃｅｓｓ ＡｃｃｕＴｎＩシステムの結果は、製造者の指示書に従って得た。本手順についての被検体濃度は、標準的なキャリブレーター濃度のｃＴｎＩと比較することによって作製した。
【０２４２】
本手順およびＡｃｃｅｓｓ ＡｃｃｕＴｎ手順についての対にした結果の散布図を図３に表す。この図において、縦軸は、本手順を用いて観察されたｃＴｎＩの濃度であり、横軸は、Ａｃｃｅｓｓ ＡｃｃｕＴｎＩ手順を用いて決定したｃＴｎＩの対応する濃度である。図１２に提供されたデータの、当技術分野で公知であるようなＤｅｍｉｎｇ回帰分析により、Ｒ２＝０．９１６９およびＲ＝０．９５８（Ｎ＝９５）を得た。
【０２４３】
（実施例１９）
ｄｎａ被検体についてのヘテロジニアスアッセイ
磁性粒子を使用し、２８６８塩基対のｐＵＣ１８プラスミドＤＮＡに関するヘテロジニアス相アッセイを、ＡＫおよびストレプトアビジンで標識した常磁性粒子（ＡＫ−ＰＭＰ−ＳＡ）、２つのビオチン化捕捉オリゴヌクレオチド、一連のフルオレセイン標識レポーターオリゴヌクレオチド、ならびに抗フルオレセイン−ＨＲＰコンジュゲートを使用して行った。ＡＫ−ストレプトアビジン常磁性粒子コンジュゲートは、実施例１および２に一般に記載したように作製した。ビオチンおよびフルオレセイン標識オリゴヌクレオチドは、カスタム合成によって調製し、鋳型に相補性であるように設計した。抗体−ＨＲＰコンジュゲートは、市販されていた（Ｒｏｃｈｅ）。ヒトｇＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ）を、陰性対照として使用した。アニーリング緩衝液は、ｐＨ８．３の１０ｍＭのＴＲＩＳ．Ｃｌ、５０ｍＭのＫＣｌ、および１．５ｍＭのＭｇＣｌ２を含有した。ハイブリダイゼーション緩衝液は、ｐＨ７の６×ＳＳＣ（ＮａＯＨでｐＨ調整した塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）、０．１％のＳＤＳ、２４％のホルムアミド、０．３７％の酢酸、および１μｇ／ｍＬのビオチンを含有した。
【０２４４】
手順
１．ビオチン標識ｏｌｉｇｏの粒子への結合。ｐＨ７．４の１×ＰＢＳ緩衝液１５０μＬ中で、２つのｏｌｉｇｏ（１００ｎｇ／μＬの溶液のそれぞれ１０μＬ）および粒子（ＬｏｄｅＳｔａｒｓの５μｇ／μＬの懸濁液１μＬ）を、ボルテックス混合し、シェーカーインキュベーター内に、３７℃で３０分間置いた。粒子を磁石で管の側部に引き寄せ、上澄みを廃棄した。粒子を、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有する１×ＰＢＳで２回洗浄した。粒子をアニーリング緩衝液１４０μＬ中に再懸濁させ、１から６のラベルを付けた６本の１．５ｍＬのマイクロチューブ内に２０μＬ／管でアリコートした。
２．オリゴヌクレオチド−鋳型ハイブリダイゼーションおよび捕捉。以下のアニーリング反応を、２５０μＬの管内で進めた。管を９５℃で５分間加熱し、５０℃で保持した。５０℃で５分後、ハイブリダイゼーション緩衝液２００μＬを各管に添加し、混合した。アニーリング反応物を、ビオチン標識ｏｌｉｇｏに結合した粒子２０μＬを含む、対応して番号を付けた１．５ｍＬの管に移した。混合物を、シェーカーインキュベーター内で、３７℃で１時間ハイブリダイズした。管を磁石上に１分間配置し、ハイブリダイゼーション緩衝液を除去した。
【０２４５】
０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含む１×ＰＢＳ中に再懸濁することによって非結合の核酸を除去するために、粒子を３回洗浄し、磁気分離した。
【０２４６】
【表１９Ａ】
【０２４７】
３．抗フルオレセイン−ＨＲＰ抗体の、ハイブリダイズしたフルオレセインｏｌｉｇｏへの結合。ステップ２からの洗浄した粒子を、１：１５０，０００希釈の抗フルオレセイン−ＨＲＰ抗体中に再懸濁させ、穏やかに振盪しながら室温で３０分間インキュベートした。非結合の抗体を磁気分離によって除去した。粒子を、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含む１×ＰＢＳ中で再懸濁させ、磁石上で１分間保持し、洗浄緩衝液を除去することによって３回洗浄した。
４．化学発光ＳＰＡＲＣＬ検出。ステップ３からの洗浄した粒子を、１×ＰＢＳ １００μＬ中に再懸濁させた。粒子を、白色マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）の２つのウェル中に等しく分割した（それぞれ約４８μＬ）。化学発光は、Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎルミノメーター（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）内にプレートを配置し、トリガー溶液（ｐＨ８．０の２５ｍＭのＴＲＩＳ、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０、１ｍＭのＥＤＴＡ、８ｍＭのｐ−ヒドロキシケイ皮酸、１００ｍＭの尿素過酸化物）１００μＬを注入し、注入して直ちに５秒間読み取ることによって測定した。
【０２４８】
【表１９Ｂ】
【０２４９】
（実施例２０）
ＡＫ化学発光標識および抗ＰＳＡ抗体で標識されたシリカ粒子の調製
３−アミノプロピルシロキサン（Ｓｉｌｉｃｙｃｌｅ Ｑｕｅｂｅｃ Ｃｉｔｙ、Ｃａｎａｄａ）で誘導体化されたシリカ粒子（５．０ｇ）を、ＤＭＦ ５０ｍＬ中で、ＡＫ標識化化合物ＡＫ３（２．５ｍｇ）およびトリエチルアミン１ｍＬと、Ａｒ下で撹拌しながら一晩反応させた。混合物を濾過し、粒子をＤＭＦ、次いで１：１のＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨで洗浄した後、空気乾燥させた。出発粒子は、１．７７ｍｍｏｌ／ｇのＮＨ２×５ｇ＝８．８５ｍｍｏｌのＮＨ２を含有した。使用したＡＫ標識化合物は、２．５ｍｇ／６５９ｍｇ／ｍｍｏｌ＝３．８μｍｏｌであった。したがって、アミド結合の形成による標識の取り込みは、利用可能なＮＨ２基の０．０５％未満であった。
【０２５０】
【化１５】
【０２５１】
ＡＫ標識粒子の２５ｍｇ部分を、マイクロチューブ内で、２％のトリエチルアミンを含有するＤＭＦ １．０ｍＬに添加し、管を１０分間振盪し、溶媒をデカントした。粒子をＤＭＦで洗浄し、ＤＭＦ １．２ｍＬ中の二官能性リンカーＤＳＳ ５０ｍｇの溶液中に懸濁させた。振盪機上で３０分インキュベートした後、溶液をデカントし、粒子をＤＭＦで洗浄した。活性化された粒子を、ｐＨ８．２５のホウ酸緩衝液１．０ｍＬ中に希釈された、９．０ｍｇ／ｍＬの抗体ストック２５μＬの溶液と、４℃で２０時間反応させることによって、マウス抗−ＰＳＡ（ＭｘＰＳＡ、Ｂｅｃｋｍａｎ）に結合させた。
【０２５２】
（実施例２１）
化学発光検出およびＳＳＩＡとしてＥｔ２ＮＯＨを用いた、ヘテロジニアス（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｓ）ＰＳＡイムノアッセイ
材料
実施例１９の標識された粒子（１×ＰＢＳ中、３．３ｍｇ／ｍＬの溶液）
アッセイ緩衝液：１×ＰＢＳ中、０．２％のＢＳＡ、０．２％のスクロース、０．２％のＴｗｅｅｎ−２０
１×ＰＢＳ中、Ｅｔ２ＮＯＨの９．７３ｍＭの溶液
ＭｘＰＳＡ−ＨＲＰコンジュゲート（アッセイ緩衝液中、０．０１５２μｇ／ｍＬ）
ＰＳＡキャリブレーター：Ｓ０、Ｓ１、Ｓ５
トリガー溶液Ａ（実施例１）
１×ＰＢＳ中の０．２％のＢＳＡ、０．２％のスクロースで予めブロックした管に、標識した粒子３０μＬ、ＭｘＰＳＡ−ＨＲＰコンジュゲート３０μＬ、アッセイ緩衝液３６μＬ、ＰＳＡキャリブレーター２４μＬ、およびＥｔ２ＮＯＨ溶液２０μＬをチャージした。単一の管をルミノメーター内に配置し、コンピューター制御された注入およびデータ収集を行った。トリガー溶液Ａ（１００μＬ）を注入し、注入を最初の０．５秒遅らせて、光強度を５秒間合計した。結果は、二つ組の測定値の平均である。
【０２５３】
【表２０】
【０２５４】
本明細書におけるすべての刊行物および特許出願は、本発明が属する技術分野における通常の技術のレベルを示し、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０２５５】
上記した様々な実施形態は、例示としてのみ提供され、本発明を限定すると解釈されるべきでない。当業者は、本明細書に例示および記載された実施形態例および用途例に従うことなく、本明細書に例示および記載された実施形態例および用途例に従うことなく本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、以下の特許請求の範囲に示される本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、本発明に行うことができる様々な改変および変更を容易に認識する。
【背景技術】
【０００１】
特異的結合アッセイは、物質の量の存在を検出するための試験方法であり、特異的結合パートナーの特異的な認識およびこれとの結合に基づく。イムノアッセイは、特異的結合アッセイの例であり、抗体が特定のタンパク質または化合物に結合する。この例では、抗体は、特異的結合対メンバーの一メンバーである。核酸結合アッセイは、別の型であり、相補的核酸鎖が特異的結合対である。特異的結合アッセイは、技術の広く、成長しつつある分野を占め、これは、疾患状態、感染性の生物、および乱用薬物の正確な検出を可能にする。要求される感度、ダイナミックレンジ、ロバスト性、自動化のための広い適用性および適正を有するアッセイおよびアッセイ法を考案するために、多くの研究が過去数十年にわたって捧げられている。これらの方法は、２つのカテゴリーに広く分類することができる。
【０００２】
ホモジニアス法は、被検体特異的結合反応を利用することによって、被検体特異的反応物と被検体非特異的反応物の間の分離ステップを必要とすることなく、検出可能なシグナルを調節し、または作り出す。ヘテロジニアス形式は、被検体が結合した、および遊離した（被検体に結合していない）検出可能な程度に標識された特異的結合パートナーの物理的な分離に依拠する。分離は一般に、極めて重要な反応物が、いくつかの型の物理的プロセス、例えば、濾過、沈殿、凝集、または磁気分離を使用することができるように、いくつかの型の固体基材上に固定されることを必要とし、一般に、遊離した検出可能な程度に標識された特定の結合パートナーを除去するために、洗浄ステップも必要とする。
【０００３】
化学発光シグナルの生成に依拠し、これを被検体の量に関連づけるアッセイ法は、ますます使用されてきている。そのような方法は、相対的に単純な機器を用いて実施され、それでも良好な分析特性を示すことができる。特に、被検体のために酵素標識特異的結合パートナー（ｅｎｚｙｍｅ−ｌａｂｅｌｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐａｒｔｎｅｒ）、および検出のために化学発光酵素基質を使用する方法は、広範な用途がある。一般的な標識酵素には、アルカリホスファターゼ、および西洋わさびペルオキシダーゼが含まれる。
【０００４】
特許文献１は、第１の膜上の増感剤または増感剤標識プローブに結合したポリヌクレオチド被検体を検出する方法を開示している。この膜は、固定化された化学発光前駆体を有する第２の膜と接触している。サンドイッチ状になった膜中の増感剤が励起されると一重項酸素が生成し、これは、化学発光前駆体と反応することによって、第２の膜上に作動可能な（ｔｒｉｇｇｅｒａｂｌｅ）化学発光化合物を生成する。作動可能な化学発光化合物は、試薬と反応することによって、第２の膜上で、被検体を検出するための化学発光を生じさせる。これらの方法は、反応物を接触させるための特異的結合反応に依拠せず、むしろ第２の膜は、試薬送達デバイスとして機能を果たす。
【０００５】
特許文献２は、被検体が、光感受性物質および化学発光化合物をごく接近させるような条件下で、被検体を含有する疑いのある媒質を処理するステップを含むアッセイ法を開示している。光増感剤は、光源で照射されると一重項酸素を生成し、一重項酸素は、溶液を通じて拡散し、化学発光化合物がごく近くにあるとき、化学発光化合物を活性化する。活性化された化学発光化合物は、引き続いて光を生成する。生成される光の量は、媒質中の被検体の量に関係する。一実施形態では、光増感剤または化学発光化合物の少なくとも１つは、懸濁可能な（ｓｕｓｐｅｎｄｉｂｌｅ）粒子と結合し、特異的な結合対メンバーがそれに結合する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第６，９１１，３０５号明細書
【特許文献２】米国特許第６，４０６，９１３号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
米国特許出願公開第ＵＳ２００７０２６４６６４号、および同第ＵＳ２００７０２６４６６５号は、固定化された化学発光化合物と、特異的な結合反応によって反応性の配置にされたアクチベーター化合物との反応を伴う、特異的結合対アッセイを実施するためのアッセイ法を開示している。過剰の非結合の化学発光化合物またはアクチベーターの分離または除去をまったく必要としない。これらのアッセイ形式は、従来技術のアッセイ技法と比較して、自動化における優れた操作の利便性および柔軟性をもたらす。これらの利点にもかかわらず、アッセイ設計および性能の追加の改善は、依然としてアッセイ開発者の目標となっている。本開示のアッセイ法は、改善された感度の単純なアッセイ法を提供することによって、これらの必要性に対処する。
【０００８】
定義
アルキル −− １〜２０個の炭素を含有する分枝、直鎖、または環状の炭化水素基であり、これは、Ｈ以外の１つ以上の置換基と置換されていてもよい。低級アルキルは、本明細書で使用する場合、最大８個の炭素を含有するアルキル基を指す。
【０００９】
被検体 −− アッセイにおいて検出されるべき試料中の物質。被検体への特異的な結合親和性を有する１つ以上の物質が、被検体を検出するのに使用される。被検体は、タンパク質、ペプチド、抗体またはハプテン（それに結合する抗体が作られ得る）とすることができる。被検体は、相補的な核酸またはオリゴヌクレオチドによって結合される核酸またはオリゴヌクレオチドであってもよい。被検体は、特異的結合対のメンバーを形成する任意の他の物質とすることができる。他の例示的な型の被検体として、ステロイドなどの薬物、ホルモン、タンパク質、糖タンパク質、ムコタンパク質、核タンパク質、リンタンパク質、乱用薬物、ビタミン、抗菌薬、抗真菌薬、抗ウイルス剤、プリン、抗腫瘍薬、アンフェタミン、アゼピン化合物、ヌクレオチド、およびプロスタグランジン、ならびにこれらの薬物のいずれかの代謝産物、農薬および農薬の代謝産物、ならびに受容体が挙げられる。被検体には、細胞、ウイルス、細菌、および真菌も含まれる。
【００１０】
アクチベーター：トリガーの存在下で、化学発光が生じるような化学発光化合物の活性化をもたらす、標識と呼ばれる場合もある化合物。
【００１１】
アクチベーター標識ｓｂｍ、またはアクチベーター特異的結合メンバーコンジュゲート − 連結している配置で少なくとも以下のものを含むアッセイミックス中の反応物：ａ）被検体のための特異的結合メンバー、およびｂ）化学発光化合物の活性化をもたらすアクチベーター化合物または標識。
【００１２】
抗体 −− 天然および操作された完全免疫グロブリン、ならびにその天然および操作された一部および断片を含む。
【００１３】
アラルキル −− アリール基で置換されたアルキル基。例には、ベンジル、ベンズヒドリル（ｂｅｎｚｙｈｙｄｒｙｌ）、トリチル、およびフェニルエチルが含まれる。
【００１４】
アリール −− Ｈ以外の１つ以上の置換基で置換されている場合がある、１〜５個の炭素環式芳香環を含有する芳香環含有基。
【００１５】
生体物質 −− 例えば、全血、抗凝固処理全血（ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｔｅｄ ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ）、血漿、血清、組織、動物細胞および植物細胞、細胞の内容物、ウイルス、ならびに真菌を含む。
【００１６】
化学発光化合物 −− 例えば、電子励起状態において形成される別の化合物に変換されることによって、光の放出を引き起こすように反応を起こす、標識と呼ばれる場合もある化合物。励起状態は、一重項励起状態であっても、三重項励起状態であってもよい。励起状態は、基底状態に緩和すると光を直接放出することができ、または放出性エネルギーアクセプター（ｅｍｉｓｓｉｖｅ ｅｎｅｒｇｙ ａｃｃｅｐｔｏｒ）に励起エネルギーを移し、それによって基底状態に戻ることができる。エネルギーアクセプターは、このプロセスにおいて励起状態に上げられ、光を放出する。
【００１７】
化学発光標識固定ｓｂｍ（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ−ｌａｂｅｌｅｄ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｓｂｍ）：連結している配置で少なくとも以下のものを含むアッセイミックス中の反応物：ａ）被検体のための特異的結合メンバー、ｂ）化学発光化合物または標識、およびｃ）固相。
【００１８】
連結している −− 本明細書で使用する場合、２つ以上の化学種または支持体材料（ｓｕｐｐｏｒｔ ｍａｔｅｒｉａｌ）が、例えば、１つ以上の共有結合によって化学的に連結され、または例えば、吸着、イオン引力、もしくは親和結合などの特異的結合プロセスによって受動的に結合されていることを示す。そのような種または物質が互いに連結されているとき、１つを超える型の連結を伴っていてもよい。
【００１９】
ヘテロアルキル −− 環または非末端鎖炭素原子の少なくとも１つが、Ｎ、Ｏ、またはＳから選択されるヘテロ原子で置換されているアルキル基。
【００２０】
ヘテロアリール −− 環炭素原子の１〜３個が、Ｎ、Ｏ、またはＳから選択されるヘテロ原子で置換されているアリール基。例示的な基には、ピリジル、ピロリル、チエニル、フリル、キノリル、およびアクリジニル基が含まれる。
【００２１】
磁性粒子 −− 本明細書で使用する場合、磁気応答性成分を有する微粒子材料を包含する。磁気応答性には、強磁性材料、常磁性材料、および超常磁性材料が含まれる。一例示的な磁気応答性材料は、磁鉄鉱である。粒子は、磁気応答性であり、１つ以上の非磁気応答性層によって囲繞されている固体コア部分を有することができる。交互に（ａｌｔｅｒｎａｔｅｌｙ）、磁気応答性部分は、非磁気応答性コアの周囲の層とすることができ、または非磁気応答性コア内に配置された粒子とすることができる。
【００２２】
試料 −− アッセイにおいて測定される被検体を含有するか、または含有する疑いのある混合物。被検体として、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、ホルモン、抗体、薬物、およびステロイドが挙げられる。本開示の方法において使用することができる典型的な試料として、体液、例えば、収集された血液試料中に一般に見出されるような抗凝固処理血液であってもよい血液、血漿、血清、尿、精液、唾液、細胞培養物、組織抽出物などが挙げられる。他の型の試料として、溶媒、海水、工業用水試料、食物試料、および土壌または水などの環境試料、植物材料、真核生物、細菌、プラスミド、ウイルス、真菌、および原核生物に由来する細胞が挙げられる。
【００２３】
ＳＳＩＡ、（選択的シグナル阻害剤（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｓｉｇｎａｌ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ Ａｇｅｎｔ）） − 非特異的なシグナルまたはバックグラウンドシグナルが、アッセイ反応混合物の化学発光生成反応から生じる被検体特異的シグナルより大きい量で低減されるように、本開示のアッセイ反応混合物で提供される化合物。
【００２４】
固体支持体 −− アッセイ成分が固定化される表面を有する物質。物質は、粒子、微粒子、ナノ粒子、金属コロイド、繊維、シート、ビーズ、膜、フィルター、ならびに他の支持体、例えば、試験管、マイクロウェル、チップ、ガラススライド、およびマイクロアレイなどの形態とすることができる。
【００２５】
可溶性の、溶解度、可溶化する − １つの物質が、別の物質と均一にブレンドする能力または傾向。本開示では、溶解度および関連用語は一般に、液体中の固体、例えば、水性緩衝液中のＳＳＩＡの特性を指す。固体は、これらがその結晶形態を失い、溶媒（例えば、液体）中に、分子的またはイオン的に溶解または分散した状態になることによって真の溶液を形成する程度に可溶性である。対照的に：１つの相が、沈殿を阻止するように安定化されていても、安定化されていなくても、バルク物質全体にわたって分布した小さい粒子（微粒子またはコロイドサイズの粒子を含む）からなる２相系。
【００２６】
置換された −− １つの基上の少なくとも１つの水素原子の、非水素基による置換を指す。置換される基に関して、別段の明らかな指示のない限り、複数の置換箇所が存在し得ることが意図されていることに留意すべきである。
【００２７】
試験デバイス −− 本発明によるアッセイの試料および他の成分を含めるための容器または装置。例えば、様々なサイズおよび形状の試験管、マイクロウェルプレート、上にアレイが形成またはプリントされるチップおよびスライド、試験紙および膜が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１Ａ】図１Ａは、実施例１０に記載したような本方法の化学発光反応におけるバックグラウンド化学発光に対するｐＨの影響を実証するプロットである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、実施例１０に記載したような本方法の化学発光反応における特異的シグナル化学発光に対するｐＨの影響を実証するプロットである。
【図２Ａ】図２Ａは、実施例１７に記載したようなイムノアッセイ法におけるｃＴｎＩの検出を例示するプロットである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、実施例１７に記載したようなイムノアッセイ法における希釈系列中のｃＴｎＩの検出を例示するプロットである。
【図２Ｃ】図２Ｃは、実施例１７に記載したようなイムノアッセイ法における希釈系列中のｃＴｎＩの検出を例示するプロットである。
【図３】図３は、実施例１８に記載したような参照方法の結果と比較した、本発明の方法によって行われたｃＴｎＩアッセイの結果の比較を例示するプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本開示は、試料中の被検体を測定するための、改善されたアッセイ法を提供する。特に、本開示は、分離ステップを必要としない被検体特異的結合アッセイを記述し、非特異的シグナルまたはバックグラウンドに対する被検体特異的シグナル応答の改善を提供する。
【００３０】
目ざましいことに、出願人らは、そのようなアッセイ法は、選択的シグナル阻害剤（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｓｉｇｎａｌ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ Ａｇｅｎｔ）、ＳＳＩＡを使用することによって、さらに改善することができることを発見した。本方法では、過剰のアクチベーターおよび／または過剰の化学発光化合物が除去されないアッセイシステムにＳＳＩＡを添加することにより、感度のよい、特異的な、被検体濃度依存性結合アッセイを実施する能力が著しく改善される。それによって、アッセイの精度および感度が改善され、より信頼でき、有用な試験をもたらす。この改善は、予期されておらず、または予測可能でなかった。ＳＳＩＡを使用することによって、共に、被検体との標識された特異的結合対メンバーの複合体中に結合した、固定された化学発光標識とアクチベーター標識との反応によって生じるシグナルと、存在するが、そのような複合体中ではない標識からのシグナルとの比は、劇的に改善される。さらに、低レベルの被検体でのバックグラウンド効果が最小化される。
【００３１】
米国特許出願公開第ＵＳ２００７０２６４６６４号、および同第ＵＳ２００７０２６４６６５号において以前に開示された方法は、被検体特異的結合反応を使用することによって、物質の存在、位置、または量を検出するための、改善された、迅速で単純なアッセイ法を提供した。このアッセイ法は、固定化された化学発光化合物と、被検体に媒介される特異的な結合反応によって反応性の配置にされたアクチベーター化合物との反応を伴う。アッセイおよび方法は、複合体中に結合した特異的結合パートナーから遊離の特異的結合パートナーを分離することなく実施される。
【００３２】
本方法は、化学発光標識に連結している、固定された被検体特異的結合メンバー、化学発光標識と反応するためのアクチベーターに連結している被検体のための、固定されていない被検体特異的結合メンバー、および選択的シグナル阻害剤の使用を必要とする。トリガー溶液の添加により、被検体を検出するための化学発光の放出が開始される。アッセイおよび方法は、複合体中に結合した特異的結合パートナーから遊離の特異的結合パートナーを分離することなく実施される。
【００３３】
本開示は、被検体特異的結合反応によって、物質の存在、位置、または量を検出するための、改善された、迅速で単純なアッセイ法に関する。この方法は、固定された被検体特異的結合メンバー、および被検体のための固定されていない被検体特異的結合メンバーの使用を必要とする。一方の被検体特異的結合メンバーは、化学発光標識と結合している一方で、他方の被検体特異的結合メンバーは、アクチベーターと結合している。多くの実施形態では、化学発光反応を誘導するアクチベーター化合物は、被検体、エンハンサー、選択的シグナル阻害剤、およびトリガー溶液を含有する水溶液中で、被検体に結合している被検体特異的結合メンバーのいずれか、または両方によって媒介される場合、固体支持体上の化学発光標識と近接した状態にされ、それによって、被検体濃度に関係する検出可能な化学発光シグナルを生成する。他の実施形態では、固体支持体上で、化学発光反応を誘導するアクチベーター化合物は、被検体、エンハンサー、選択的シグナル阻害剤、およびトリガー溶液を含有する水溶液中で、他方の被検体特異的結合メンバーへの結合を被検体と競合する一方の被検体特異的結合メンバーによって媒介される場合、化学発光標識と近接になることを妨げられ、それによって、被検体濃度に逆に関係する検出可能な化学発光シグナルを生成する。
【００３４】
多くの実施形態では、一方の被検体特異的結合メンバー（「ｓｂｍ」）は、固体支持体および化学発光標識（「化学発光標識固定ｓｂｍ」）に連結されている一方で、別の被検体特異的結合メンバーは、水溶液中で固定化されていないアクチベーターと連結されている（「アクチベーター標識ｓｂｍ」）。化学発光標識固定ｓｂｍ、アクチベーター標識ｓｂｍ、エンハンサー、選択的シグナル阻害剤、試料、およびトリガー溶液は、アクチベーターが、トリガー溶液を添加すると化学発光を生じさせる反応を活性化するのに有効であるように、固定化された化学発光化合物に作動可能に近接した状態にされるとき、検出可能なシグナルを生成する。作動可能な近接とは、化学発光化合物およびアクチベーターが、最大で物理的接触を含めて、これらが反応することができるほど十分に近いことを意味する。多くの実施形態では、アクチベーター標識特異的結合メンバーは、被検体の存在、位置、または濃度を決定するのに必要な量に対して過剰にシステムに供給される。
【００３５】
一態様では、本方法は、化学発光化合物およびアクチベーターが、トリガー溶液を添加すると化学発光反応が実施されるのを可能にするように、固体支持体において作動可能に近接された１つ以上の被検体特異的結合メンバーの被検体特異的結合反応を介して、共に空間的に束縛されているという点で、ほとんどの従来の試験方法と異なる。一般に、自己の特許出願ＰＣＴ ＷＯ２００７／０１３３９８は、過剰の固定されていない、または固定されたメンバーの存在により、除去されない場合でも、感度のよい特異的結合アッセイを実施する能力を無効にされないアッセイ法を教示している。例えば、固定化されていないアクチベーターは、トリガー溶液の添加および検出の前に除去されず、その理由は、その存在は、化学発光検出シグナルが被検体の量と相関することを妨げないためである。
【００３６】
アッセイ感度の改善におけるＳＳＩＡの機能は、スキーム１を参照して理解される。遊離した、および複合体形成した、化学発光標識ｓｂｍ、およびアクチベーター標識ｓｂｍの組合せが、トリガー溶液が添加されるとき、観察される化学発光シグナルに寄与することができる。
【００３７】
スキーム１
１ 結合−Ａｃｔ＋結合−ＣＬ→特異的シグナル
２ 結合−Ａｃｔ＋遊離−ＣＬ→非特異的シグナル
３ 遊離−Ａｃｔ＋結合−ＣＬ→非特異的シグナル
４ 遊離−Ａｃｔ＋遊離−ＣＬ→非特異的シグナル
スキームに示したように、反応１は、アッセイにおいて被検体の量に関係づけられるシグナルを生成する。ＳＳＩＡは、少なくとも部分的には、反応１からのシグナルの量と関連して、反応２からのシグナルの量を選択的に阻害または抑制することによって、その目ざましい機能を実現する。ＳＳＩＡは、外因性干渉物質からのシグナル生成を抑制することによって、シグナル：バックグラウンドの比を改善することもできる。
【００３８】
一実施形態では、アッセイ法、特に、結合アッセイ法であって、化学発光標識固定ｓｂｍ化合物、アクチベーター標識ｓｂｍが、被検体の存在による少なくとも１つの特異的結合反応を介して、作動可能に近接され、ここで、結合したアクチベーターコンジュゲートが、被検体の存在、位置、または量を検出するために、選択的シグナル阻害剤およびエンハンサーの存在下でトリガー溶液を添加すると、化学発光を生成する反応を活性化する、アッセイ法が提供される。
【００３９】
いくつかの他の実施形態では、アクチベーター標識ｓｂｍが、化学発光標識固定ｓｂｍと結合することに対して被検体と競合する競合アッセイ形式が利用され、それによって、被検体濃度または競合アッセイと逆の関係で化学発光を生じさせる。そのような実施形態では、アクチベーターは、化学発光標識固定ｓｂｍに結合しているアクチベーター標識ｓｂｍによって、固定化された化学発光化合物に作動可能に近接した状態にされることによって、エンハンサーの存在下でトリガー溶液を添加すると化学発光を生じさせる反応を活性化する。化学発光シグナルは、被検体濃度が増大するにつれて減少し、それによって、化学発光標識固定ｓｂｍに結合するアクチベーター標識ｓｂｍの結合を競合的にブロックする。
【００４０】
アッセイ成分、例えば、被検体を含有する試料、アクチベーター標識ｓｂｍ、化学発光標識固定ｓｂｍ、選択的シグナル阻害剤、およびエンハンサーなどは、洗浄も分離もすることなく、試験容器に様々な順序および組合せで添加することができ、トリガー溶液を添加すると発光を読み取ることができる。一実施形態では、例えば、試料ならびにアクチベーター標識ｓｂｍおよび／または化学発光標識固定ｓｂｍは、予め混合することができる。一実施形態では、ＳＳＩＡは、アクチベーター標識ｓｂｍおよび／または化学発光標識固定ｓｂｍおよび／または試料とのプレミックス中に含めることができる。エンハンサーを、プレミックス中に含め、またはトリガー溶液と共に添加することができる。過剰の非結合の反応物の洗浄も分離もまったく必要としない。
【００４１】
化学発光基質、および酵素標識コンジュゲートを使用する従来のアッセイは、標識酵素の量に対して大過剰で化学発光基質を供給する。しばしば、基質／酵素のモル比は、１０の９乗、すなわち、１０億倍過剰を超える場合がある。連続的な酵素ターンオーバーのために基質の適切な供給を確実にし、このプロセスがアッセイ法において適切な検出感度を保証するために、そのような非常に大過剰の化学発光化合物を供給することが、従来のアッセイにおいて必要であると考えられている。出願人らは、化学発光化合物とアクチベーターの比を数桁低減する高感度のアッセイ法を考案することが可能であることを見出した。この点において、本明細書に記載されるこれらの方法は、公知の酵素連結アッセイ法と基本的に異なる。
【００４２】
上記したように、かつ以下に記載される例示的なアッセイにおいて実証されるように、洗浄ステップおよび分離ステップの排除は、アッセイプロトコールの設計を単純化する機会をもたらす。操作ステップの数の低減は、アッセイ時間、不完全な洗浄に由来するアッセイ間ばらつき、および費用を減少させる。同時に、これは、自動化および小型化に付帯的な固有の利点のすべてを伴って、アッセイの実行を自動化および小型化する能力を増強する。
【００４３】
一般に、本方法によって実施されるアッセイでは、対象とする被検体を特異的に捕捉するために、固体支持体が試験デバイス内に提供される。固体支持体は、検出される被検体に直接または間接的に結合するための、固定化された特異的結合メンバーとともに提供される。固体支持体は、その上に固定化される標識、多くの実施形態では、化学発光標識とともにさらに提供される。
【００４４】
アクチベーター標識ｓｂｍも試験デバイスに導入される。アクチベーター標識ｓｂｍおよび化学発光標識固定ｓｂｍは、被検体を含有する試料の存在下で、特異的結合複合体を形成することが可能になる。試料、アクチベーター標識ｓｂｍ、化学発光標識固定ｓｂｍ、ＳＳＩＡ、およびエンハンサーは、任意の順序で別個に、もしくは同時に添加することができ、または予め混合し、組合せとして添加することができる。反応を誘導する前に、結合反応を起こさせる時間期間（「インキュベーション」）を、任意の添加の間または後に挿入することができる。
【００４５】
最後に、トリガー溶液が添加されることによって、被検体を検出するための化学発光が生じ、化学発光が検出される。トリガー溶液は、以下にさらに記載されるように過酸化物を最小限で含有するが、エンハンサー、および時折ＳＳＩＡも含有することができる。一般に、ピーク光強度レベル、指定された時間期間にわたる全ＲＬＵ、または全積分光強度のいずれかが測定される。光の量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）は、一般に公知の方法に従って較正曲線を構築することによって、被検体の量（ａｍｏｕｎｔ）と関連付けることができる。発光が、トリガー溶液を添加すると急速に引き続いて起こる場合、適当な注射器を用いての添加に対する測定の開始の時間を機械的に調節し、または検出器にすでに曝された試験デバイスを用いて添加を実施することが望ましい。反応物の最適量、体積、希釈、特異的結合対反応のためのインキュベーション時間、反応物の濃度などは、日常の実験によって、特異的結合アッセイを実施する方法に対する標準的な論文を参照することによって、および以下に詳細に記載される具体例を指針として使用して容易に決定することができる。
【００４６】
本方法およびアッセイにおいて使用される被検体特異的結合メンバーの濃度または量は、被検体濃度、所望の結合の速度／アッセイ時間、費用、およびコンジュゲートの利用可能性、被検体特異的結合メンバーの非特異的結合の程度などの要因に依存する。通常、被検体特異的結合メンバーは、最小の予測される被検体濃度に少なくとも等しく、より通常には、少なくとも予期される最高の被検体濃度で存在し、非競合的アッセイについては、濃度は、最高被検体濃度の１０〜１０６倍である場合があるが、通常、１０−４Ｍ未満、好ましくは１０−６Ｍ未満、しばしば１０−１１〜１０−７Ｍの間である。ｓｂｍメンバーと連結されるアクチベーターまたは化学発光化合物の量は、通常、被検体特異的結合メンバー当たり少なくとも１つの分子であり、アクチベーターまたは化学発光分子が粒子に固定されている場合、１０５ほどの多さ、通常少なくとも１０〜１０４もの多さとなり得る。アクチベーターと化学発光化合物の例示的な比は、加工した実施例に提供されている。
【００４７】
選択的シグナル阻害剤（ＳＳＩＡ）
本発明の選択的シグナル阻害剤は、遊離した、および／または被検体が結合した化学発光標識ｓｂｍ、遊離した、および／または被検体が結合したアクチベーター標識ｓｂｍ、エンハンサー、ならびにトリガー溶液を含むアッセイ反応混合物中に含められる場合、被検体が結合した標識ｓｂｍメンバーから得られるシグナルが、ＳＳＩＡの不存在下で起こるより、有意に大きい程度でバックグラウンドシグナルを超えるような化合物である。
【００４８】
１つ以上の選択的シグナル阻害剤が、１０−６Ｍ〜１０−１Ｍの間、しばしば１０−６Ｍ〜１０−２Ｍの間、多くの場合１０−５Ｍ〜１０−３Ｍの間、時折１０−５Ｍ〜１０−４Ｍの間の濃度で、反応方法において存在する。いくつかの実施形態では、選択的シグナル阻害剤は、５×１０−６Ｍ〜５×１０−４Ｍの間で、本方法による反応において存在する。なおさらなる実施形態では、選択的シグナル阻害剤は、５×１０−５Ｍ〜５×１０−４Ｍの間で、本方法による反応において存在する。
【００４９】
選択的シグナル阻害剤は、反応溶液中で意図されるより高い濃度で、別個の試薬または溶液として供給することができる。この実施形態では、測定された量の作業溶液（ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）が反応溶液中に投与されることによって、所望の反応濃度が実現される。別の実施形態では、選択的シグナル阻害剤は、標識ｓｂｍメンバーの１つ以上を含有する溶液中に合わされる。別の実施形態では、選択的シグナル阻害剤は、トリガー溶液の成分として提供される。
【００５０】
選択的シグナル阻害剤が、シグナル：バックグラウンド比を改善する程度は、他の要因の中でも、化合物の素性、およびこれが使用される濃度に応じて変化する。この程度は、改善係数の観点からその枠を決めることができ、この観点では、アッセイが選択的シグナル阻害剤を用いて実施される、特定の被検体濃度でのアッセイのシグナル：バックグラウンド比が、選択的シグナル阻害剤を用いない、同じ被検体濃度でのアッセイのシグナル：バックグラウンド比と比較される。改善係数＞１は、改善されたアッセイの尺度、および選択的シグナル阻害剤の有益な効果の証拠である。本発明の実施形態では、少なくとも５など、および少なくとも１０、または少なくとも５０を含めた少なくとも２の改善係数が実現される。以下の実施例を参照すると、改善係数は、被検体濃度の関数としてアッセイ内で変化し得ることが分かる。例えば、改善係数は、被検体濃度が増大するにつれて増大する場合がある。別の実施形態では、濃度間の改善係数の変動は、より直線的な較正曲線、すなわち、化学発光強度対被検体濃度のプロットをもたらす場合がある。
【００５１】
以下の表は、選択的シグナル阻害剤として有効に機能することができる化合物を、限定することなく列挙する。明確に列挙されていない追加の化合物は、実施例に記載されるアッセイおよびスクリーニング検査方法の通常の適用によるものを含めて、本開示の技法を使用して見出すことができる。
【００５２】
【表１−１】
【００５３】
【表１−２】
【００５４】
いくつかの実施形態では、選択的シグナル阻害剤は、ジアルキルヒドロキシアミンから選択される。いくつかの実施形態では、選択的シグナル阻害剤は、オルトまたはパラ関係に配向した少なくとも２つのヒドロキシル基を有する芳香族化合物から選択される。例示的な化合物は、以下のものを含む。
【００５５】
【化１】
【００５６】
いくつかの他の実施形態では、選択的シグナル阻害剤は、オルトまたはパラ関係に配向した、少なくとも１つのヒドロキシル基および１つのアミノ基を有する芳香族化合物から選択される。例示的な化合物は、以下のものを含む。
【００５７】
【化２】
【００５８】
さらに他の実施形態では、選択的シグナル阻害剤は、エンジオールとしても公知である、Ｃ−Ｃ二重結合上で置換された少なくとも２つのヒドロキシル基を有する化合物から選択される。例示的な化合物は、以下のものを含む。
【００５９】
【化３】
【００６０】
一実施形態では、選択的シグナル阻害剤は、窒素複素環式化合物から選択される。例示的な化合物は、以下のものを含む。
【００６１】
【化４】
【００６２】
一実施形態では、選択的シグナル阻害剤は、過酸化物と接触すると活性ＳＳＩＡに変換可能な化合物として、マスクされた形態で供給される。適当なマスクされたＳＳＩＡ化合物は、例えば、ヒドロキシル置換またはアミノ置換アリールボロン酸化合物から選択される。例示的な化合物は、以下のものを含む。
【００６３】
【化５】
【００６４】
一実施形態では、選択的シグナル阻害剤は、
【００６５】
【化６】
【００６６】
から選択される。
【００６７】
様々な実施形態では、上記選択的シグナル阻害剤の１つ以上が、本開示のアッセイ法、アッセイ、またはキットにおいて組み合わせて使用される。
【００６８】
いくつかの実施形態では、選択的シグナル阻害剤は、水溶液中で１０倍作業溶液の溶解度を有する。作業溶液は、濃縮溶液の一部が反応混合物に添加されることによって、トリガー溶液を添加した後に必要とされる最終濃度を与えるような濃縮水溶液として定義される。
【００６９】
選択的シグナル阻害剤の作業溶液のための適当な水溶液は、以下の追加の成分のうちの１つ以上を含む：塩、生物学的緩衝液、エタノール、メタノール、グリコールを含めたアルコール、および界面活性剤。いくつかの実施形態では、水溶液には、緩衝液ＩＩ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｂｒｅａ ＣＡから市販されている、ＴＲＩＳ緩衝食塩水、界面活性剤、＜０．１％のアジ化ナトリウム、および０．１％のＰｒｏＣｌｉｎ３００（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ））、２５％のエタノール／７５％の緩衝液ＩＩ、２５％のエタノール／７５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（１％）、または１０％の０．１ＮのＮａＯＨ／９０％の緩衝液ＩＩなどのＴｒｉｓ緩衝水溶液が含まれる。
【００７０】
固相支持体
本開示の方法の多くの実施形態では、化学発光標識は、試験システムの成分に固定化される。標識は、以下により詳細に記載されるように、いくつかの異なる方法で提供することができる。各改変体において、標識は、それを固定された状態にする様式で物質または材料に安定に、または不可逆的に結合される。「不可逆的に」とは、標識が、意図されたアッセイにおける使用条件下で、固体支持体から実質的に除去されないことを意図する。受動的結合または非共有結合的な結合も企図され、ただし、標識は、使用条件下で固体支持体上に、安定に結合および保持される。これは、いくつかの方法のいずれでも実現することができる。
【００７１】
アッセイを実施するための本開示の実施形態では、化学発光標識は、固体支持体の表面に固定化された状態になる。被検体は、例えば、未標識の被検体特異的結合メンバーによって、固体支持体の表面に結合される。化学発光標識は、固体支持体に結合した、固定化された化学発光標識付近にアクチベーターを運ぶ特異的結合反応によって、アクチベーターと反応性の配置にされる。次いで、トリガー溶液が添加され、化学発光が測定される。
【００７２】
一実施形態では、化学発光標識は、固定化された被検体特異的結合メンバーに共有結合でつながれる。一例は、マイクロプレートのウェル上、または粒子上に固定化された、標識された捕捉抗体または抗体断片である。被検体特異的結合メンバーの固定化は、共有結合（ｃｏｖａｌｅｎｔ ｌｉｎｋａｇｅ）または吸着プロセスによるものとすることができる。この形式では、化学発光標識は、「サンドイッチ」形式で被検体を共に結合している２つの特異的結合パートナーによって、アクチベーターと反応性の配置にされる。
【００７３】
別の実施形態では、化学発光標識は、ランダムな様式で固体支持体上に固定化された補助物質（ａｕｘｉｌｉａｒｙ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）に共有結合でつながれる。補助物質の固定化は、共有結合または吸着プロセスによるものとすることができる。それによって標識は、固体支持体の表面のまわりに大体均一に分布される。被検体は、例えば、未標識の被検体特異的結合メンバーによって、固体支持体の表面に結合される。化学発光標識は、支持体の表面上に結合され、または受動的にコーティングされた補助物質に結合した化学発光標識付近にアクチベーターを運ぶ特異的結合反応によって、アクチベーターと反応性の配置にされる。
【００７４】
別の実施形態では、化学発光標識は、被検体特異的捕捉抗体に対して結合親和性を有する、固定化されたユニバーサル抗体に共有結合でつながれる。
【００７５】
別の実施形態では、化学発光標識が共有結合でつながれる補助物質は、タンパク質またはペプチドである。例示的なタンパク質には、アルブミンまたはストレプトアビジン（ＳＡ）が含まれる。化学発光化合物は、ビオチン−化学発光化合物コンジュゲートを使用することによる固定化のために提供される場合がある。この型のアッセイ形式は、ビオチンコンジュゲートとして、または固体支持体への直接固定化、もしくは種特異的抗免疫グロブリンなどの一般的な捕捉成分を通じた間接的な結合によって、被検体特異的結合メンバーを提供することができる。
【００７６】
別の実施形態では、化学発光標識が共有結合でつながれる補助物質は、合成ポリマーである。化学発光化合物を固定化するためにポリマー助剤を使用するアッセイ形式は、ビオチンコンジュゲートとして、または固体支持体への直接固定化、もしくは種特異的免疫グロブリンなどの一般的な捕捉成分を通じた間接的な結合によって、被検体特異的結合メンバーを提供することができる。
【００７７】
別の実施形態では、化学発光標識は、固体支持体の表面に共有結合でつながれる。そのような実施形態では、それによって標識は、固体支持体の表面のまわりに大体均一に分布される。被検体は、例えば、未標識被検体特異的結合メンバーによって、固体支持体の表面に結合される。化学発光標識は、支持体の表面に直接結合した化学発光標識付近にアクチベーターを運ぶ特異的結合反応によって、アクチベーターと反応性の配置にされる。次いで、洗浄も分離もすることなく、トリガー溶液が添加され、化学発光が測定される。
【００７８】
別の実施形態では、被検体の類似体が使用され、アクチベーター−被検体類似体コンジュゲートを構成する。別の実施形態では、標識された被検体が使用され、アクチベーター−被検体コンジュゲートを構成する。アクチベーター−被検体類似体コンジュゲートまたはアクチベーター−被検体コンジュゲート、および被検体は、被検体特異的結合メンバーと競合的に結合する。この型のアッセイ法において、試料中の被検体の量と化学発光の強度の間に負の相関が生じることは明らかである。
【００７９】
抗原もしくは他のタンパク質に結合するための抗体、またはイムノアッセイを介した他の抗体を通じた化学発光標識の結合に加えて、本方法は、相補的核酸の結合を通じて核酸を検出するための化学発光標識核酸を使用することができる。この点において、使用は、核酸のサイズに関して特に限定されず、唯一の基準は、相補性パートナーが、安定なハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な長さのものであることである。核酸には、本明細書で使用する場合、遺伝子長の核酸、核酸のより短い断片、ポリヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドが含まれ、そのいずれも一本鎖であっても二本鎖であってもよい。被検体特異的結合メンバーとして核酸を使用して本開示を実施する際、核酸は、被検体核酸を捕捉するために、固体支持体の表面上に共有結合している（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ａｔｔａｃｈｅｄ）か、または物理的に固定化されている。化学発光標識は、捕捉核酸に結合することができ、または標識は、上記に説明したように、支持体に連結することができる。捕捉核酸は、被検体核酸の配列領域と完全、または実質的に完全な配列相補性を有する。
【００８０】
実質的に相補性である場合、捕捉核酸は、被検体と相補性でない末端オーバーハンギング部分、末端ループ部分、または内部ループ部分を有することができ、ただしこれは、被検体とのハイブリダイゼーションを妨害または阻止しない。逆の状況も起こり得、この場合、オーバーハングまたはループは、被検体核酸内に属する。捕捉核酸、被検体核酸、アクチベーターのコンジュゲート、および第３の核酸が、ハイブリダイズさせられる。第３の核酸は、捕捉核酸と相補性の配列領域とは異なる、被検体核酸の配列領域と実質的に相補性である。捕捉核酸およびアクチベーターコンジュゲート核酸の被検体とのハイブリダイゼーションは、いずれの順序でも連続して、または同時に実施することができる。このプロセスの結果として、化学発光標識は、支持体の表面に結合した化学発光標識付近にアクチベーターを運ぶ特異的なハイブリダイゼーション反応によって、アクチベーターと結合した状態になる。上記したように、トリガー溶液が供給され、化学発光が検出される。
【００８１】
別の実施形態は、被検体のアクチベーターとのコンジュゲートが使用される変形を含む。被検体核酸−アクチベーターコンジュゲートおよび被検体核酸は、被検体特異的結合メンバーと競合的に結合する。この型のアッセイ法において、試料中の被検体の量と化学発光の強度の間に負の相関が生じることは明らかである。
【００８２】
抗体に基づくシステムおよび核酸に基づくシステムに加えて、結合アッセイの当業者に一般に公知であるような他の特異的結合対も、本開示による試験方法の基礎として機能を果たすことができる。抗体−ハプテン対も使用することができる。フルオレセイン／抗フルオレセイン、ジゴキシゲニン／抗ジゴキシゲニン、およびニトロフェニル／抗ニトロフェニルの対は、例示的である。さらなる例として、周知の（ストレプト）アビジン／ビオチン結合対を利用することができる。この結合対を使用することができる一方法を例示するために、ストレプトアビジン−化学発光標識コンジュゲートは、固体支持体上に共有結合でつなぐことができるか、または吸着することができる。次いで、ビオチン標識被検体およびアクチベーターコンジュゲートが添加され、コンジュゲートは、抗ビオチン抗体または抗被検体抗体に結合される。複合体が形成させられた後、上記のようにトリガー溶液が添加され、検出が行われる。別の実施形態では、アビジンまたはストレプトアビジンが固体支持体上に堆積される。ビオチン−化学発光化合物コンジュゲートは、アビジンに結合され、ビオチン化抗体も結合される。別の実施形態では、ビオチンは、固体支持体につながれ、アビジンまたはストレプトアビジンを捕捉するのに使用される。ビオチン化抗体も結合される。化学発光化合物は、ビオチン−化学発光化合物コンジュゲートを（ストレプト）アビジンに結合させることによって、または化学発光化合物で表面に直接標識することによって、固体支持体に固定することができる。当技術分野で公知の追加の被検体特異的結合メンバーとして、抗体のＦａｂ部分、レクチン−炭水化物、プロテインＡ−ＩｇＧ、およびホルモン−ホルモン受容体が挙げられる。固体支持体への化学発光化合物の間接的結合を、本開示の取り扱いにおいて使用することができることが理解されるべきである。これらの例および当業者が考えつく他の例は、本発明の方法の範囲内であると見なされる。
【００８３】
本開示を実施するのに有用な固体支持体は、様々な材料、多孔度、形状、およびサイズのものとすることができる。９６ウェル、３８４ウェル、またはより多い数の種類のマイクロウェルプレート、試験管、試料カップ、プラスチック球、セルロース、紙またはプラスチックの試験紙、ラテックス粒子、０．１０〜５０μｍの直径を有するポリマー粒子、０．１０〜５０μｍの直径を有するシリカ粒子、磁性粒子、特に０．１〜１０μｍの平均直径を有するもの、様々な材料のナノ粒子、および金属コロイドを含めた結合アッセイに既に使用されている材料はすべて、化学発光標識を結合するため、および被検体特異的結合メンバーを固定化するための有用な固体支持体をもたらすことができる。磁性粒子は、磁性金属、金属酸化物、または金属硫化物コアを含むことができ、これらは、磁気成分を遮蔽するための、吸着的に結合したかまたは共有結合した層によって一般に囲繞されている。磁気成分は、鉄、酸化鉄、または硫化鉄とすることができ、鉄は、Ｆｅ２＋もしくはＦｅ３＋、または両方である。このクラスにおいて使用可能な材料には、例えば、磁鉄鉱、磁赤鉄鉱、および黄鉄鉱が含まれる。他の磁性金属酸化物には、ＭｎＦｅ２Ｏ４、ＮｉＦｅ２Ｏ４、およびＣｏＦｅ２Ｏ４が含まれる。磁性成分は、例えば、非磁性シェルによって囲繞された固体コアとすることができ、または散在した磁性材料および非磁性材料のコアとすることができ、または別の非磁性シェルによって必要に応じて囲繞された、非磁性コアを囲繞している層とすることができる。そのような磁性粒子中の非磁性材料は、シリカ、ポリスチレンなどの合成ポリマー、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂、ポリアクリレートもしくはスチレン−アクリレートコポリマーとすることができ、またはこれは、アガロースもしくはデキストランなどの天然ポリマーであってもよい。
【００８４】
本開示は、本アッセイ法において使用するために、そのような材料を機能化する方法を教示する。特に、化学発光標識化化合物（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）、および抗体などの被検体特異的結合メンバーの両方を、同じ表面、特にマイクロプレートのウェルまたは微粒子に結合させるための方法が開示される。アッセイにおいて使用される適当な支持体として、合成ポリマー支持体、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、置換ポリスチレン（例えば、アミノ化またはカルボキシル化ポリスチレン）、ポリアクリルアミド、ポリアミド、ポリ塩化ビニルなど、ガラスビーズ、シリカ粒子、官能性シリカ粒子、金属コロイド、アガロース、ニトロセルロース、ナイロン、ポリビニリデンジフルオリド、表面修飾ナイロンなどが挙げられる。
【００８５】
アクチベーター標識
アクチベーター化合物は、アクチベーター標識ｓｂｍの一部を形成し、これは、アクチベーター−特異的結合メンバーコンジュゲートと呼ばれる場合もある。アクチベーター標識ｓｂｍは、二重の機能を果たす：１）直接に、または中間の特異的結合パートナーを通じて、特異的結合パートナー部分を通じて、アッセイにおける被検体の量に比例した特異的結合反応を起こし、かつ２）アクチベーター部分を通じて化学発光化合物を活性化する。アクチベーター標識ｓｂｍのアクチベーター部分は、トリガー溶液の存在下で化学発光が生じるように、化学発光化合物の活性化を起こす化合物である。アクチベーター標識として機能を果たすことができる化合物には、遷移金属の塩および錯体ならびに酵素を含めたペルオキシダーゼ様活性を有する化合物、特に遷移金属含有酵素、最も特に、ペルオキシダーゼ酵素が含まれる。アクチベーター化合物において有用な遷移金属として、周期表の３〜１２族のもの、特に、鉄、銅、コバルト、亜鉛、マンガン、クロム、およびバナジウムが挙げられる。
【００８６】
化学発光反応を起こすことができるペルオキシダーゼ酵素として、例えば、ラクトペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、バナジウムブロモペルオキシダーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、真菌ペルオキシダーゼ類、リグニンペルオキシダーゼ、Ａｒｔｈｒｏｍｙｃｅｓ ｒａｍｏｓｕｓに由来するペルオキシダーゼ、白色腐朽菌（ｗｈｉｔｅ ｒｏｔ ｆｕｎｇｉ）で産生されるＭｎ依存性ペルオキシダーゼ、およびダイズペルオキシダーゼが挙げられる。ｈｅｍｅなどの鉄錯体、およびＭｎ−ＴＰＰＳ４を含めた、酵素でないが、ペルオキシダーゼ様活性を有する他のペルオキシダーゼ模倣化合物も公知である（Ｙ．−Ｘ． Ｃｉら、Ｍｉｋｒｏｃｈｅｍ． Ｊ．、５２巻、２５７〜６２頁（１９９５年））。これらは、基質の化学発光酸化を触媒し、本明細書で使用する場合、ペルオキシダーゼの意味の範囲内であると明確に見なされる。
【００８７】
いくつかの実施形態では、アクチベーター標識ｓｂｍは、化学発光を生じさせるための方法において、ペルオキシダーゼおよび生体分子のコンジュゲートまたは複合体を含むことができ、唯一の条件は、コンジュゲートがペルオキシダーゼ活性またはペルオキシダーゼ様活性を示すことである。ペルオキシダーゼの１つ以上の分子にコンジュゲートすることができる生体分子として、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体断片、抗体−ＤＮＡキメラ、抗原、ハプテン、タンパク質、ペプチド、レクチン、アビジン、ストレプトアビジン、およびビオチンが挙げられる。ペルオキシダーゼを含む、または組み込んでいる複合体、例えば、生体分子への結合に関して機能化されているリポソーム、ミセル、ベシクル、およびポリマーなども、本開示の方法において使用することができる。
【００８８】
トリガー溶液＆エンハンサー
トリガー溶液は、化学発光に必要な励起状態の化合物を生成するのに必要な反応物を提供する。反応物は、化学発光標識と直接反応することによって化学発光反応を実施するのに必要なものとすることができる。これは、この機能の代わりに、またはこの機能に加えて、アクチベーター化合物の作用を促進する機能を果たすことができる。これは、例えば、アクチベーターがペルオキシダーゼ酵素である場合、そのようになる。一実施形態では、トリガー溶液は、過酸化物化合物を含む。過酸化物成分は、ペルオキシダーゼと反応することができる、任意の過酸化物またはアルキルヒドロペルオキシドである。例示的な過酸化物には、過酸化水素、尿素過酸化物、および過ホウ酸塩が含まれる。トリガー溶液中に使用される過酸化物の濃度は、一般に約１０−８Ｍ〜約３Ｍ、より一般に約１０−３Ｍ〜約１０−１Ｍという値の範囲内で変更することができる。別の実施形態では、トリガー溶液は、過酸化物、およびペルオキシダーゼ活性を有するアクチベーターの触媒ターンオーバーを促進するエンハンサー化合物を含む。代表的な実施形態では、アクチベーターとしてのペルオキシダーゼコンジュゲート、被検体のアクリダン標識特異的結合パートナー（ここで、アクリダン標識は、以下に記載されるように、特異的結合パートナーをアクリダン標識化化合物と反応させることによって提供される）、および過酸化水素を含むトリガー溶液が使用される。過酸化物は、ペルオキシダーゼと反応することによって、おそらく、酵素の活性部位における鉄の酸化状態を、異なる酸化状態に変化させる。この変化した状態の酵素は、エンハンサー分子と反応することによって、酵素の触媒ターンオーバーを促進する。エンハンサーまたは酵素から形成される反応性種は、酵素に近接して維持されたアクリダン標識と反応する。化学発光反応は、化学発光化合物から形成される中間体と過酸化物とのさらなる反応を含み、最終反応生成物および光を生成する。
【００８９】
ある特定のエンハンサー化合物をトリガー溶液中に取り込むことにより、酵素の反応性が促進され、もしくはバックグラウンドシグナルが低減され、または両方の機能が実施される。これらのエンハンサーの中に含まれるのは、ペルオキシダーゼ反応を増強することが公知であるフェノール化合物および芳香族アミンである。米国特許第５，１７１，６６８号に開示されているような、フェノキサジン化合物またはフェノチアジン化合物の、インドフェノール化合物またはインドアニリン化合物との混合物を、本発明においてエンハンサーとして使用することができる。置換ヒドロキシベンゾオキサゾール、２−ヒドロキシ−９−フルオレノン、および米国特許第５，２０６，１４９号に開示されているような化合物、
【００９０】
【化７】
【００９１】
も、本発明においてエンハンサーとして使用することができる。米国特許第５，５１２，４５１号に開示されているような置換および非置換のアリールボロン酸化合物、ならびにこれらのエステルおよびアンヒドリド誘導体も、本開示において有用なエンハンサーの範囲内であると見なされる。例示的なフェノールエンハンサーとして、それだけに限らないが、ｐ−フェニルフェノール、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−ブロモフェノール、ｐ−ヒドロキシケイ皮酸、ｐ−イミダゾリルフェノール、アセトアミノフェン、２，４−ジクロロフェノール、２−ナフトール、および６−ブロモ−２−ナフトールが挙げられる。上記したクラスからの１つを超えるエンハンサーの混合物も使用することができる。
【００９２】
本発明を実施するのに有用な追加のエンハンサー、および誘導体には、ヒドロキシベンゾチアゾール化合物、ならびに以下の式を有するフェノキサジン化合物およびフェノチアジン化合物が含まれる。
【００９３】
【化８】
【００９４】
フェノキサジンエンハンサーおよびフェノチアジンエンハンサーの窒素原子上で置換されたＲ基には、１〜８炭素原子のアルキル、およびスルホン酸塩またはカルボン酸塩の基で置換された１〜８炭素原子のアルキルが含まれる。例示的なエンハンサーとして、３−（Ｎ−フェノチアジニル）−プロパンスルホン酸塩、３−（Ｎ−フェノキサジニル）プロパンスルホン酸塩、４−（Ｎ−フェノキサジニル）ブタンスルホン酸塩、５−（Ｎ−フェノキサジニル）−ペンタン酸塩、およびＮ−メチルフェノキサジン、ならびに関連同族体が挙げられる。トリガー溶液中で使用されるエンハンサーの濃度は、一般に約１０−５Ｍ〜約１０−１Ｍ、より一般に約１０−４Ｍ〜約１０−２Ｍという値の範囲内で変更することができる。
【００９５】
本開示の検出反応は、一般に水性緩衝液であるトリガー溶液を用いて実施される。適当な緩衝液には、化学発光反応の進行を可能にする環境を維持することができる、任意の一般に使用される緩衝液が含まれる。一般に、トリガー溶液は、約５〜約１０．５の範囲内のｐＨを有する。例示的な緩衝液として、ホスフェート、ボレート、アセテート、カーボネート、ｔｒｉｓ（ヒドロキシ−メチルアミノ）メタン［ｔｒｉｓ］、グリシン、トリシン、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、ジエタノールアミン、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳなどが挙げられる。
【００９６】
トリガー溶液は、光生成反応の発光効率を増強し、またはアッセイのシグナル／ノイズ比を改善するために、１つ以上の界面活性剤またはポリマー界面活性剤も含有することができる。本開示を実施するのに有用な非イオン性界面活性剤には、例として、ポリオキシエチレン化（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎａｔｅｄ）アルキルフェノール、ポリオキシエチレン化アルコール、ポリオキシエチレン化エーテル、およびポリオキシエチレン化ソルビトールエステルが含まれる。ＣＴＡＢなどの４級アンモニウム塩化合物、および４級ホスホニウム塩化合物を含めた、モノマーの陽イオン性界面活性剤を使用することができる。４級アンモニウム塩およびホスホニウム塩の基を含むものを含めた、ポリマーの陽イオン性界面活性剤も、この目的のために使用することができる。
【００９７】
一実施形態では、トリガー溶液は、水性緩衝液、約１０−５Ｍ〜約１Ｍの濃度の過酸化物、および約１０−５Ｍ〜約１０−１Ｍの濃度のエンハンサーを含む組成物である。この組成物は、界面活性剤、金属キレート化剤、および微生物混入を予防し、または最小限にするための保存剤を含めた添加剤を必要に応じて含有することができる。
【００９８】
特異的結合対
特異的結合対メンバーまたは特異的結合パートナー（ｓｂｍ）は、別の物質に対して特異的な結合親和性を有する、生体分子を含めた分子として本明細書で定義される。特異的結合対メンバーとして、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体断片、抗体−ＤＮＡキメラ、抗原、ハプテン、タンパク質、ペプチド、レクチン、アビジン、ストレプトアビジン、およびビオチンが挙げられる。特異的結合対の各特異的結合対メンバーは、同じ物質（例えば、被検体）に対して特異的な結合親和性を有する。各特異的結合対メンバーは、少なくとも、被検体上の同じまたは重複結合部位を競合するべきでないという点で、特異的結合対中の他の特異的結合対メンバーと非同一である。例えば、特異的結合対が２つの抗体からなる場合、各ｓｂｍ抗体は、被検体上に、異なる、非競合エピトープを有する。
【００９９】
特異的な結合物質として、限定することなく、抗体および抗体断片、抗原、ハプテンおよびその同族抗体、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン、プロテインＡおよびＩｇＧ、相補的核酸またはオリゴヌクレオチド、レクチンおよび炭水化物が挙げられる。
【０１００】
上記の抗原−抗体、ハプテン−抗体、または抗体−抗体対に加えて、特異的結合対として、相補性のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、アビジン−ビオチン、ストレプトアビジン−ビオチン、ホルモン−受容体、レクチン−炭水化物、ＩｇＧプロテインＡ、結合タンパク質−受容体、核酸−核酸結合タンパク質、および核酸−抗核酸抗体も挙げることができる。薬物候補のスクリーニングにおいて使用される受容体アッセイは、本方法についての使用の別の範囲である。これらの結合対のいずれも、上記した３成分サンドイッチ技法または２成分競合技法によって、本方法において使用するのに適応することができる。
【０１０１】
化学発光化合物
本開示の実施において化学発光標識として使用される化合物は、一般式ＣＬ−Ｌ−ＲＧを有し、式中、ＣＬは、化学発光部分を表し、Ｌは、化学発光部分と反応基を連結するための連結部分（ｌｉｎｋｉｎｇ ｍｏｉｅｔｙ）を表し、ＲＧは、別の物質にカップリングするための反応基部分を表す。用語「化学発光基」および「化学発光部分」は、用語「連結部分」および「連結基（ｌｉｎｋｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）」と同様に互換的に使用される。化学発光部分ＣＬは、アクチベーターと反応を起こし、活性化された化合物に変換される化合物を含む。活性化された化合物とトリガー溶液の反応により、電子励起状態化合物が形成される。励起状態は、一重項励起状態であっても、三重項励起状態であってもよい。励起状態は、基底状態に緩和すると光を直接放出することができ、または放出性エネルギーアクセプターに励起エネルギーを移し、それによって基底状態に戻ることができる。エネルギーアクセプターは、このプロセスにおいて励起状態に上げられ、光を放出する。ＣＬ基、アクチベーター、およびトリガー溶液の化学発光反応は急速であり、非常に短期間で起こることが望ましいが、必須ではなく、一実施形態では、数秒以内にピーク強度に到達する。
【０１０２】
本開示の一実施形態では、化学発光化合物は、アクチベーターおよびトリガー溶液の存在下で、酸化されることによって化学発光を生じることができる。リンカーおよび反応基を取り込むことによって、化学発光標識として機能することができる化合物の例示的なクラスとして、イソルミノール、アミノブチルエチルイソルミノール（ＡＢＥＩ）、アミノヘキシルエチルイソルミノール（ＡＨＥＩ）、７−ジメチルアミノナフタレン−１，２−ジカルボン酸ヒドラジド、環置換アミノフタルヒドラジド、アントラセン−２，３−ジカルボン酸ヒドラジド、フェナントレン−１，２−ジカルボン酸ヒドラジド、ピレンジカルボン酸ヒドラジド、５−ヒドロキシフタルヒドラジド、６−ヒドロキシフタルヒドラジド、ならびにＭａｓｕｙａらへの米国特許第５，４２０，２７５号およびＹａｍａｇｕｃｈｉへの米国特許第５，３２４，８３５号において開示された他のフタラジンジオン類似体を含めた、ルミノールならびに構造的に関連した環状ヒドラジドなどの芳香族環状ジアシルヒドラジドが挙げられる。
【０１０３】
過酸化水素およびペルオキシダーゼの作用によって化学発光を生じることが公知である任意の化合物が、本開示において使用される化学発光標識化合物の化学発光部分として機能すると考えられる。キサンテン色素（例えば、フルオレセイン色素、エオシン色素、ローダミン色素、またはロドール色素など）、芳香族アミン、および複素環式アミンを含めた、様々な構造上のクラスの多数のそのような化合物が、これらの条件下で化学発光を生じることが当技術分野で公知である。別の例は、化合物ＭＣＬＡ、２−メチル−６−（ｐ−メトキシフェニル）−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オンである。別の例はインドール酢酸であり、別の例はイソブチルアルデヒドであり、後者は一般に、可視光の出力を増大させるための蛍光エネルギーアクセプターを伴っている。トリヒドロキシ芳香族化合物のピロガロール、フロログルシノール、およびプルプロガリンは、個々に、または組合せて、本開示の化学発光標識化化合物中の化学発光部分として機能を果たすことができる化合物の他の例である。
【０１０４】
一実施形態では、本開示の方法において有用なアクリダンケテンジチオアセタール（ＡＫ）を含む一群の化学発光標識化合物は、式ＩＶを有するアクリダン化合物
【０１０５】
【化９】
【０１０６】
を含み、式中、基Ｒ１〜Ｒ１１の少なくとも１つは、式−Ｌ−ＲＧの標識化置換基であり、Ｌは、結合、または別の二価もしくは多価の基となり得る連結基であり、ＲＧは、化学発光標識化化合物が別の化合物に結合することを可能にする反応基であり、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、１〜５０の非水素原子を含有する有機基であり、Ｒ４〜Ｒ１１のそれぞれは、水素、または干渉しない置換基である。標識化置換基−Ｌ−ＲＧは、Ｒ１またはＲ２の１つに存在することができるが、これは、Ｒ３またはＲ４〜Ｒ１１の１つに置換基として存在することもできる。
【０１０７】
式ＩＶの化合物中の基Ｒ１およびＲ２は、光生成を可能にするＣ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、Ｓｉ、およびハロゲン原子から選択される、１〜約５０の非水素原子を含有する任意の有機基とすることができる。後者とは、式Ｉの化合物が本開示の反応を起こすとき、励起状態生成物の化合物が生成され、１つ以上の化学発光中間体の生成を含むことができることを意味する。励起状態生成物は、直接光を放出することができ、またはエネルギー移動を通じて蛍光アクセプターに励起エネルギーを移し、この蛍光アクセプターから光を放出させることができる。一実施形態では、Ｒ１およびＲ２は、１〜２０炭素原子の、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のアルケニル、置換または非置換のアルキニル、置換または非置換のアリール、および置換または非置換のアラルキル基から選択される。Ｒ１またはＲ２が置換された基である場合、これは、カルボニル基、カルボキシル基、トリ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）シリル基、ＳＯ３−基、ＯＳＯ３−２基、グリコシル基、ＰＯ３−基、ＯＰＯ３−２基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＮＨ２、４級アンモニウム基、および４級ホスホニウム基から選択される１〜３個の基で置換されていてもよい。一実施形態では、Ｒ１またはＲ２は、式−Ｌ−ＲＧの標識化置換基で置換されており、式中、Ｌは連結基であり、ＲＧは反応基である。
【０１０８】
基Ｒ３は、基内の原子の価数を満たすのに要求される必要な数のＨ原子に加えて、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、Ｓｉ、およびハロゲンから選択される１〜５０の非水素原子を含有する有機基である。一実施形態では、Ｒ３は、１〜２０の非水素原子を含有する。別の実施形態では、有機基は、１〜２０炭素原子の、アルキル、置換アルキル、置換または非置換のアルケニル、置換または非置換のアルキニル、置換または非置換のアリール、および置換または非置換のアラルキル基からなる群から選択される。別の実施形態では、Ｒ３についての基には、置換または非置換のＣ１〜Ｃ４アルキル基、フェニル、置換または非置換のベンジル基、アルコキシアルキル、カルボキシアルキル、およびアルキルスルホン酸基が含まれる。Ｒ３が置換された基である場合、これは、カルボニル基、カルボキシル基、トリ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）シリル基、ＳＯ３−基、ＯＳＯ３−２基、グリコシル基、ＰＯ３−基、ＯＰＯ３−２基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＮＨ２、４級アンモニウム基、および４級ホスホニウム基から選択される１〜３個の基で置換されていてもよい。基Ｒ３は、５または６員環を完成するために、Ｒ７またはＲ８に結合することができる。一実施形態では、Ｒ３は、式−Ｌ−ＲＧの標識化置換基で置換されている。
【０１０９】
式ＩＶの化合物では、基Ｒ４〜Ｒ１１はそれぞれ、独立してＨ、または励起状態生成物が生成されるのを可能にし、一般にＣ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、Ｓｉ、およびハロゲンから選択される１〜５０の原子を含有する置換基である。存在することができる代表的な置換基として、限定することなく、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリールオキシ、ハロゲン、アミノ、置換アミノ、カルボキシル、カルボアルコキシ、カルボキサミド、シアノ、およびスルホネート基が挙げられる。隣接する基の対、例えば、Ｒ４−Ｒ８またはＲ８−Ｒ６は、一緒に結合することによって、この２つの基が結合されている環に縮合した少なくとも１つの５員環または６員環を含む炭素環系または複素環系を形成することができる。そのような縮合複素環は、Ｎ、Ｏ、またはＳ原子を含有することができ、上記したものなどのＨ以外の環置換基を含有することができる。基Ｒ４〜Ｒ１１の１つ以上は、式−Ｌ−ＲＧの標識化置換基とすることができる。一実施形態では、Ｒ４〜Ｒ１１は、水素、ハロゲン、およびアルコキシ基、例えば、メトキシ、エトキシ、ｔ−ブトキシなどから選択される。別の実施形態では、一群の化合物は、ハロゲンとしてＲ８、Ｒ６、Ｒ９、またはＲ１０の１つを有し、Ｒ４〜Ｒ１１の他のものは、水素原子である。
【０１１０】
置換基は、化合物の特性を改変し、または合成の利便性をもたらすために、様々な量で、アクリダン環内の選択された環または鎖の位置で組み込むことができる。そのような特性として、例えば、化学発光量子収率、酵素との反応速度、最大光強度、発光の継続時間、発光波長、および反応媒質中の溶解度が挙げられる。特定の置換基およびこれらの効果は、以下の具体例において例示されているが、これは、本開示の範囲を限定すると決して見なされるべきではない。合成の便宜のために、式Ｉの化合物は、水素原子としてＲ４〜Ｒ１１のそれぞれを有することが望ましい。
【０１１１】
別の実施形態では、一群の化合物は式Ｖを有し、式中、Ｒ４〜Ｒ１１のそれぞれは水素である。基Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は上記に定義された通りである。
【０１１２】
【化１０】
【０１１３】
式ＩＶまたはＶの標識化化合物は、基Ｒ１またはＲ２上に置換基として基−Ｌ−ＲＧを有する。一実施形態では、標識化化合物は、式ＶＩを有する。
【０１１４】
【化１１】
【０１１５】
代表的な標識化化合物は、以下の構造を有する。追加の例示的な化合物、ならびに他の分子および固体表面への結合におけるこれらの使用は、以下の具体例において記載されている。以下に示された構造は、式ＣＬ−Ｌ−ＲＧの例示的な化合物を例示する。
【０１１６】
【化１２】
【０１１７】
上記の特定のＡＫ化合物、ならびに上に示された一般式ＩＶ、Ｖ、およびＶＩの化合物は、公開された出願ＵＳ２００７／０１７２８７８に開示された方法を含む、一般に公知の方法を使用して、熟練した有機化学者によって調製することができる。例示的な方法では、Ｎ−置換、かつ必要に応じて環置換アクリダン環化合物は、強塩基、その後にＣＳ２と反応されることによって、アクリダンジチオカルボキシレートを形成する。ジチオカルボキシレートは、従来法によってエステル化されることによって、Ｒ１と命名した置換基の１つが組み込まれる。得られたアクリダンジチオエステルは、非プロトン性溶媒中で、ｎ−ＢｕＬｉまたはＮａＨなどの強塩基を用いて再び脱プロトン化され、脱離基およびＲ２部分を含有する適当な試薬を用いてＳ−アルキル化される。Ｒ２部分は、適当な反応基を組み込むためにさらなる操作にかけることができることが、有機化学における当業者に容易に明らかである。
【０１１８】
別のクラスの化学発光部分には、米国特許第５，４９１，０７２号；同第５，５２３，２１２号；同第５，５９３，８４５号；および同第６，０３０，８０３号に開示された、アクリダンエステル、チオエステル、およびスルホンアミドが含まれる。このクラスにおける化学発光標識化化合物は、以下の式ＶＩＩの化学発光部分ＣＬを有し、式中、Ｚは、Ｏ、Ｓ、またはＮＲ１１ＳＯ２Ａｒであり、Ｒ１１は、アルキルまたはアリールであり、Ａｒは、アリール、またはアルキル置換アリールであり、Ｒ１は、Ｃ１〜８アルキル、ハロ置換Ｃ１〜８アルキル、アラルキル、アリール、またはアルキル、アルケニル、アルキニル、アラルキル、アリール、アルコキシ、アルコキシアルキル、ハロゲン、カルボニル、カルボキシル、カルボキサミド、シアノ、トリフルオロメチル、トリアルキルアンモニウム、ニトロ、ヒドロキシ、アミノ、およびメルカプト基で置換されたアリールであり、Ｒ２は、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、およびアラルキル基から選択され、Ｒ３〜１０はそれぞれ、水素であり、または１もしくは２個の置換基が、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、およびハロゲンから選択され、Ｒ３〜１０の残りは水素である。一実施形態では、Ｒ３〜１０のそれぞれは水素であり、Ｒ１は標識化置換基である。別の実施形態では、Ｒ３〜１０の１つは標識化置換基であり、Ｒ３〜１０の他のものは水素である。
【０１１９】
【化１３−１】
【０１２０】
別のクラスの化学発光部分には、米国特許第５，９２２，５５８号；同第６，６９６，５６９号；、および同第６，８９１，０５７号に開示された複素環式化合物が含まれる。一実施形態では、この化合物は、窒素、酸素、または硫黄を含有する５員もしくは６員の環、または複数の環基を含む複素環式環を含み、これに環外の二重結合が結合しており、その末端炭素は、酸素および硫黄原子から選択される２つの原子で置換されている。
【０１２１】
別の実施形態では、化学発光標識化合物は、以下の式ＶＩＩＩの化学発光アクリダンエノール誘導体を含み、式中、Ｒ１は、１〜２０炭素原子のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、およびアラルキル基から選択され、そのいずれも、カルボニル基、カルボキシル基、トリ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）シリル基、ＳＯ３−基、ＯＳＯ３−２基、グリコシル基、ＰＯ３−基、ＯＰＯ３−２基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、４級アンモニウム基、または４級ホスホニウム基から選択される１〜３個の基で置換されていてもよく、Ｘは、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、アリール、アラルキル基、１〜２０炭素原子を有するアルキルカルボキシル基またはアリールカルボキシル基、トリ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）シリル基、ＳＯ３−基、グリコシル基、および式ＰＯ（ＯＲ’）（ＯＲ’’）のホスホリル基（式中、Ｒ’およびＲ’’は独立して、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、シアノアルキル、アリール、およびアラルキル基、トリアルキルシリル基、アルカリ金属陽イオン、アルカリ土類陽イオン、アンモニウム陽イオンおよびトリアルキルホスホニウム陽イオンから選択される）から選択され、Ｚは、ＯおよびＳ原子から選択され、Ｒ６は、置換または非置換のＣ１〜Ｃ４アルキル、フェニル、ベンジル、アルコキシアルキル、およびカルボキシアルキル基から選択され、Ｒ７〜１４はそれぞれ、水素であり、または１もしくは２個の置換基が、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、およびハロゲンから選択され、Ｒ７〜１４の残りは水素である。一実施形態では、Ｒ７〜１４のそれぞれは水素であり、Ｒ１は標識化置換基である。別の実施形態では、Ｒ７〜１４の１つは標識化置換基であり、Ｒ７〜１４の他のものは水素である。
【０１２２】
【化１３−２】
【０１２３】
別の実施形態では、化学発光標識化化合物は、以下の式ＩＸの化学発光化合物を含み、式中、Ｒ１は、１〜２０炭素原子のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、およびアラルキル基から選択され、そのいずれも、カルボニル基、カルボキシル基、トリ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）シリル基、ＳＯ３−基、ＯＳＯ３−２基、グリコシル基、ＰＯ３−基、ＯＰＯ３−２基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、４級アンモニウム基、または４級ホスホニウム基から選択される１〜３個の基で置換されていてもよく、Ｘは、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、アリール、アラルキル基、１〜２０炭素原子を有するアルキルカルボキシル基またはアリールカルボキシル基、トリ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）シリル基、ＳＯ３−基、グリコシル基、および式ＰＯ（ＯＲ’）（ＯＲ’’）のホスホリル基（式中、Ｒ’およびＲ’’は独立して、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、シアノアルキル、アリール、およびアラルキル基、トリアルキルシリル基、アルカリ金属陽イオン、アルカリ土類陽イオン、アンモニウム陽イオンおよびトリアルキルホスホニウム陽イオンから選択される）から選択され、Ｚ１およびＺ２はそれぞれ、ＯおよびＳ原子から選択され、Ｒ２およびＲ３は独立して、水素およびＣ１〜Ｃ８アルキルから選択される。
【０１２４】
【化１４】
【０１２５】
連結基（Ｌ）。本開示において使用される任意の化学発光化合物における連結基は、結合、原子、二価の基、および多価の基、またはいくつかは環状構造の一部となり得る、直鎖もしくは分枝鎖の原子とすることができる。置換基は通常、１〜約５０の非水素原子、より通常には１〜約３０の非水素原子を含有する。別の実施形態では、鎖を構成する原子は、Ｃ、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｐ、Ｓｉ、Ｂ、およびＳｅ原子から選択される。別の実施形態では、鎖を構成する原子は、Ｃ、Ｏ、Ｎ、Ｐ、およびＳ原子から選択される。鎖中の炭素以外の原子の数は、通常０〜１０である。ハロゲン原子は、鎖または環上の置換基として存在することができる。連結置換基を構成する典型的な官能基として、アルキレン、アリーレン、アルケニレン、エーテル、過酸化物、カルボニル（ケトン、エステル、炭酸エステル、チオエステル、またはアミド基としての）、アミン、アミジン、カルバメート、尿素、イミン、イミド、イミデート、カルボジイミド、ヒドラジノ、ジアゾ、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホン酸エステル、チオエーテル、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン、スルホン酸エステル、硫酸エステル、およびチオ尿素基が挙げられる。別の実施形態では、基は、−ＣＨ２−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−ＮＲ−、−ＳｉＯ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＳＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−、−ＮＲＣ（＝Ｏ）−、−ＮＲＣ（＝Ｓ）−、または−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ−基で終止する１〜２０原子のアルキレン鎖であり、式中、ＲはＣ１〜８アルキルである。別の実施形態では、連結基は、−ＣＨ２−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−ＮＲ−、−ＳｉＯ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＳＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−、−ＮＲＣ（＝Ｏ）−、−ＮＲＣ（＝Ｓ）−、または−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ−基で終止する３〜３０原子のポリ（アルキレン−オキシ）鎖であり、式中、ＲはＣ１〜８アルキルである。
【０１２６】
反応基。反応基ＲＧは、その存在が、共有結合または物理的な力による別の分子への結合を促進する原子または基である。いくつかの実施形態では、本開示の化学発光標識化化合物の、別の化合物または物質への結合は、例えば、反応基が、ハロゲン原子またはトシレート基などの脱離基である場合、反応基から１つ以上の原子を失うことになり、化学発光標識化化合物は、求核置換反応によって別の化合物に共有結合的に結合している。
【０１２７】
一実施形態では、ＲＧは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル基である。当業者は、ＮＨＳエステル基を含むそのような標識化化合物で標識される物質は、その物質上の部分、一般にアミン基と、エステルのＣ−Ｏ結合を分割し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを放出し、その物質の原子（アミン基の場合Ｎ）と、標識化化合物のカルボニル炭素との間に新しい結合を形成するプロセスにおいて反応することを容易に理解する。
【０１２８】
別の実施形態では、ＲＧは、ヒドラジン部分、−ＮＨＮＨ２である。当技術分野で公知であるように、この基は、標識される物質中のカルボニル基と反応することによって、ヒドラジド結合を形成する。
【０１２９】
他の実施形態では、化学発光標識化化合物の、共有結合形成による別の化合物への結合は、マイケル付加などの付加反応において起こる場合、または反応基がイソシアネートまたはイソチオシアネート基である場合、反応基内の結合の再編成を伴う。さらに他の実施形態では、結合は、共有結合形成を伴わず、むしろ物理的な力を伴い、この場合、反応基は変化しないままである。物理的な力とは、引力、例えば、水素結合、静電気引力またはイオン引力、塩基スタッキングなどの疎水性引力など、ならびに特定の親和性相互作用、例えば、ビオチン−ストレプトアビジン、抗原−抗体、およびヌクレオチド−ヌクレオチド相互作用などを意味する。
【０１３０】
標識が有機分子および生体分子に化学結合するための反応基として、それだけに限らないが、以下のものが挙げられる：ａ）アミン反応基：−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ、−ＳＯ２Ｃｌ、−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、−ＳＯ２ＣＨ２ＣＦ３；Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル；ｂ）チオール反応基：−Ｓ−Ｓ−Ｒ；ｃ）カルボン酸反応基：−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨＮＨ２；ｄ）ヒドロキシル反応基：−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ、−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、−ＳＯ２Ｃｌ、−ＳＯ２ＣＨ２ＣＦ３；ｅ）アルデヒド／ケトン反応基：−ＮＨ２、−ＯＮＨ２、−ＮＨＮＨ２；およびｆ）他の反応基、例えば、Ｒ−Ｎ３、Ｒ−Ｃ≡ＣＨ。
【０１３１】
一実施形態では、反応基として、ＯＨ、ＮＨ２、ＯＮＨ２、ＮＨＮＨ２、ＣＯＯＨ、ＳＯ２ＣＨ２ＣＦ３、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエーテル、およびマレイミド基が挙げられる。
【０１３２】
二官能性カップリング試薬も、適度に反応性の基を有する有機分子および生体分子に標識をカップリングさせるのに使用することができる（Ｌ． Ｊ． Ｋｒｉｃｋａ、Ｌｉｇａｎｄ−Ｂｉｎｄｅｒ Ａｓｓａｙｓ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８５年、１８〜２０頁、表２．２、およびＴ． Ｈ Ｊｉ、「Ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、９１巻、５８０〜６０９頁（１９８３年）を参照）。２つの型の二官能性試薬、すなわち、最終的な構造中に組み込まれた状態になるもの、および組み込まれず、２つの反応物をカップリングするためだけに機能を果たすものが存在する。
【０１３３】
水溶液
本開示において使用するのに適した水溶液は、一般に、５０％超の水を含有する溶液である。反応混合物、試料希釈物、キャリブレーター溶液、化学発光標識ｓｂｐ溶液、アクチベーター標識ｓｂｐ溶液、エンハンサー溶液、ならびにトリガー溶液、または化学発光標識ｓｂｐ、アクチベーター標識ｓｂｐ、エンハンサー、トリガー、試料、および／もしくは選択的シグナル阻害剤の１つもしくは複数の濃縮溶液を含めて、本明細書に記載される水溶液は、使用に適している。多くの実施形態では、水溶液は緩衝水溶液である。適当な水性緩衝液には、水溶液中の環境を維持し、被検体の溶解度を維持し、反応物の溶解度を維持し、および化学発光反応を進行させることができる、一般に使用される緩衝液のいずれも含まれる。例示的な緩衝液として、ホスフェート、ボレート、アセテート、カーボネート、ｔｒｉｓ（ヒドロキシ−メチルアミノ）メタン（ｔｒｉｓ）、グリシン、トリシン、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、ジエタノールアミン、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳなどが挙げられる。一般に、本開示によって使用するための水溶液は、約５〜約１０．５の範囲内のｐＨを有する。
【０１３４】
適当な水溶液は、以下の追加の成分の１つ以上を含むことができる：塩、生物学的緩衝液、エタノール、メタノール、グリコールを含めたアルコール、および界面活性剤。いくつかの実施形態では、水溶液には、緩衝液ＩＩ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）などのＴｒｉｓ緩衝水溶液が含まれる。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、ヒト血清を模倣する水溶液が利用される。１つのそのような合成マトリクスは、０．１％のＰｒｏＣｌｉｎ３００を含む、２０ｍＭのＰＢＳ、７％のＢＳＡ、ｐＨ７．５である。合成マトリクスは、それだけに限らないが、試料希釈液、キャリブレーター溶液、化学発光標識ｓｂｐ溶液、アクチベーター標識ｓｂｐ溶液、エンハンサー溶液、およびトリガー溶液に使用することができる。用語「ＰＢＳ」は、慣例的な意味において、当技術分野で公知であるような、リン酸緩衝食塩水を指す。用語「ＢＳＡ」は、慣例的な意味において、当技術分野で公知であるような、ウシ血清アルブミンを指す。
【０１３６】
検出
本方法によって放出される光は、任意の適当な公知のデバイスまたは技術、例えば、ルミノメーター、Ｘ線フィルム、高速写真フィルム、ＣＣＤカメラ、シンチレーションカウンター、化学光量計、または視覚的などによって検出することができる。各検出デバイスまたは技術は、異なるスペクトル感度を有する。ヒトの眼は、緑色光に対して最適に感度がよく、ＣＣＤカメラは、赤色光に対して最大感度を示し、ＵＶから青色光または緑色光に最大応答を有するＸ線フィルムは、利用可能である。検出デバイスの選択は、用途、および費用の考慮、利便性、および永続的な記録の作成が必要とされるかどうかによって支配される。発光の時間過程が急速である実施形態では、検出デバイスの存在下で、化学発光を生じさせるためのトリガー反応を実施することが有利である。例として、検出反応は、ルミノメーター内に収容された試験管またはマイクロウェルプレート、または試験管もしくはマイクロウェルプレートを受け入れるように適応した収納容器内のＣＣＤカメラの前に配置された試験管またはマイクロウェルプレートで実施することができる。
【０１３７】
用途
本アッセイ法は、多くの型の特異的結合対アッセイにおいて適用性を見出す。これらの中で主要なのは、ＥＬＩＳＡなどの化学発光酵素結合イムノアッセイである。免疫化学的ステップを実施するための様々なアッセイ形式およびプロトコールは、当技術分野で周知であり、競合アッセイおよびサンドイッチアッセイの両方を含む。本開示によるイムノアッセイによってアッセイすることができる物質の型には、タンパク質、ペプチド、抗体、ハプテン、薬物、ステロイド、およびイムノアッセイの技術分野で一般に公知である他の物質が含まれる。
【０１３８】
本開示の方法は、核酸の検出にも有用である。一実施形態では、一方法は、酵素標識核酸プローブを使用する。例示的な方法として、溶液ハイブリダイゼーションアッセイ、サザンブロット法におけるＤＮＡ検出、ノーザンブロット法によるＲＮＡ、ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡフィンガープリント法、コロニーハイブリダイゼーション、およびプラークリフトが挙げられ、その実施は、当業者に周知である。
【０１３９】
アッセイ材料およびキット
本開示は、本開示の方法に従ってアッセイを実施するためのキットを提供することも企図する。キットは、パッケージされた組合せで、トリガー溶液および使用するための指示書と共に、遊離標識化化合物、化学発光標識被検体特異的結合メンバー、化学発光誘導体化された固体支持体、例えば粒子もしくはマイクロプレート、またはブロッキングタンパク質などの化学発光標識補助物質として化学発光標識を含むことができる。キットは、化学発光標識化がユーザーによって実施される場合、アクチベーターコンジュゲート、被検体キャリブレーター、および対照、希釈剤、および反応緩衝液も必要に応じて含むことができる。
【０１４０】
本開示の別の実施形態では、化学発光化合物を上に固定化された固体支持体を含むアッセイ材料が提供される。一実施形態では、化学発光化合物は、上記した化学発光化合物の群のいずれかから選択される。別の実施形態では、化学発光化合物は、ペルオキシダーゼ酵素についての基質である。固体支持体上に固定化された化学発光化合物の量は、様々な負荷密度の範囲にわたって変化し得る。例として、固体支持体が微粒子材料である場合、粒子１ｍｇ当たり、１００〜０．０１μｇの範囲の化学発光化合物の負荷を使用することができる。別の例では、粒子１ｍｇ当たり、５〜０．１μｇの範囲の化学発光化合物の負荷を使用することができる。化学発光化合物は一般に、固体支持体上にランダムまたは均一に分布している。これは、固体支持体の表面上、またはアクセス可能な孔内に固定化することができる。化学発光化合物は、共有結合（ｃｏｖａｌｅｎｔ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）によって固体支持体上に固定化することができる。この実施形態では、反応基を有する化学発光標識化化合物が、固体支持体上に存在する官能基と反応することによって、化学発光化合物と固体支持体の間で共有結合（ｃｏｖａｌｅｎｔ ｂｏｎｄ）を形成する。代替の実施形態では、化学発光化合物は、１つ以上の中間物質を使用することによって、固体支持体上に固定化することができる。ビオチンが固体支持体に共有結合している一例では、共有結合されたビオチンがストレプトアビジンに結合され、次いで、ビオチン−化学発光化合物コンジュゲートが結合される。別の例では、ストレプトアビジンが固体支持体上に吸着され、次いで、ビオチン−化学発光化合物コンジュゲートが結合される。別の例では、アルブミンなどの補助タンパク質にコンジュゲートされた化学発光化合物が、固体支持体上に吸着、または共有結合でつながれる。別の例では、抗体にコンジュゲートされた化学発光化合物が、固体支持体上に吸着、または共有結合でつながれる。
【０１４１】
固体支持体は、９６ウェル、３８４ウェル、またはより多い数のウェルを有するマイクロウェルプレート、試験管、試料カップ、プラスチック球、セルロース、紙またはプラスチックの試験紙、ラテックス粒子、０．１０〜５０μｍの直径を有するポリマー粒子、０．１０〜５０μｍの直径を有するシリカ粒子、磁性粒子、特に０．１〜１０μｍの平均直径を有するもの、およびナノ粒子など、様々な材料、多孔度、形状、およびサイズのものとすることができる。一実施形態では、固体支持体は、０．１０〜５０μｍの直径を有するポリマー粒子またはシリカ粒子を含み、上記したような磁性粒子であってもよい。
【０１４２】
本開示の固定化された化学発光化合物は、固体支持体に固定された化学発光標識を含み、この化学発光標識は、一般式ＣＬ−Ｌ−ＲＧを有する化学発光標識化化合物によって提供され、式中、ＣＬは、化学発光部分を表し、Ｌは、化学発光部分と反応基を連結するための連結部分（ｌｉｎｋｉｎｇ ｍｏｉｅｔｙ）を表し、ＲＧは、別の材料にカップリングするための反応基部分を表す。化学発光部分ＣＬは、アクチベーターと反応を起こし、活性化された化合物に変換される化合物を含む。活性化された化合物とトリガー溶液の反応により、電子励起状態化合物が形成される。化学発光部分には、限定することなく、ルミノール、および構造的に関係した環状ヒドラジド、アクリダンエステル、チオエステル、およびスルホンアミド、ならびにアクリダンケテンジチオアセタール化合物を含めて、表題「化学発光標識化合物」の下で上記した各クラスの化合物が含まれる。
【０１４３】
本開示の別の実施形態では、化学発光化合物、および被検体に対して特異的な結合親和性を有し、または被検体に対して特異的な結合親和性を有する別の物質に対して特異的な結合親和性を有する、少なくとも１つの特異的な結合物質が上に固定化された固体支持体を含むアッセイ材料が提供される。これらの実施形態では、固定化された化学発光化合物は、上に固定化された化学発光化合物を有する固体支持体を含む実施形態について、直前に記載した通りである。固定化された特異的な結合物質は、１つ以上の特異的親和結合反応を通じて被検体に、直接または間接的に結合する。特異的な結合物質として、限定することなく、抗体および抗体断片、抗原、ハプテンおよびその同族抗体、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン、プロテインＡおよびＩｇＧ、相補的核酸またはオリゴヌクレオチド、レクチンおよび炭水化物が挙げられる。
【０１４４】
本開示の別の実施形態は、１）化学発光化合物、２）被検体に対して特異的な結合親和性を有し、または被検体に対して特異的な結合親和性を有する別の物質に対して特異的な結合親和性を有する、少なくとも１つの特異的な結合物質、３）被検体、および４）アクチベーターコンジュゲートが上に固定化された固体支持体を含むアッセイにおいて形成されるシグナル伝達システムを含む。用語「固体支持体」、「化学発光化合物」、および「特異的な結合物質」の意味、ならびにこれらの用語によって包含される実施形態は、本開示の組成物として見なされるアッセイ材料について上記に確立した意味および実施形態と同一である。本シグナル伝達システムのエレメントを形成することができる被検体には、上記に特定された任意の被検体が含まれ、その存在、位置、または量は、アッセイにおいて決定されるべきものである。アクチベーターコンジュゲートは、被検体−特異的結合パートナーコンジュゲートに結合したアクチベーター化合物を含む。このコンジュゲートは、二重の機能を果たす：１）直接に、または中間の被検体特異的結合メンバーを通じて、被検体特異的結合メンバー部分を通じて、アッセイにおける被検体に特異的に結合し、かつ２）アクチベーター部分を通じて化学発光化合物を活性化する。このコンジュゲートのアクチベーター化合物部分は、トリガー溶液の存在下で化学発光が生じるように、化学発光化合物の活性化を起こす化合物である。アクチベーターとして機能を果たすことができる化合物には、遷移金属の塩および錯体ならびに酵素を含めたペルオキシダーゼ様活性を有する化合物、特に遷移金属含有酵素、特に、ペルオキシダーゼ酵素が含まれる。アクチベーター化合物において有用な遷移金属として、周期表の３〜１２族のもの、特に、鉄、銅、コバルト、亜鉛、マンガン、およびクロムが挙げられる。化学発光反応を起こすことができるペルオキシダーゼとして、例えば、ラクトペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、バナジウムブロモペルオキシダーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、真菌ペルオキシダーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、Ａｒｔｈｒｏｍｙｃｅｓ ｒａｍｏｓｕｓに由来するペルオキシダーゼ、白色腐朽菌（ｗｈｉｔｅ ｒｏｔ ｆｕｎｇｉ）で産生されるＭｎ依存性ペルオキシダーゼ、およびダイズペルオキシダーゼが挙げられる。ペルオキシダーゼ様活性を有する他の化合物には、ｈｅｍｅなどの鉄錯体、およびＭｎ−ＴＰＰＳ４が含まれる。
【０１４５】
システム
本開示において記載されるアッセイ法は、システムを使用することによって、迅速に実行するために自動化することができる。本開示のアッセイを実施するためのシステムは、他の反応物を含有する反応容器にトリガー溶液をアリコートおよび送達し、得られる化学発光シグナルを読むための流体取り扱い能力を必要とする。そのようなシステムの実施形態では、ルミノメーターが、トリガー溶液注入の時点および箇所で、反応容器の近位に配置される。さらに、本開示のアッセイを実施するための自動システムは、他の反応物および試料を反応容器にアリコートおよび送達するための流体取り扱い能力を有する。
【０１４６】
改変ＤＸＩ８００機器は、本開示のアッセイ法を実施するために改変された。改変されていないＤＸＩ８００機器のさらなる説明は、参照により本明細書に組み込まれている、ＵｎｉＣｅｌ ＤＸＩ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ、（著作権）２００７年、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒにおいて入手可能である。本明細書に記載される方法を実施するのに使用するために、ＤＸＩ（登録商標）８００イムノアッセイ機器は、トリガー溶液注入の間、および注入直後に、反応容器の位置付近（反応容器から約１９ｍｍ）で検出するために配置された光子計数ルミノメーター（市販のＤＸＩ８００機器において使用されるのと同じモデル）を組み込むことによって改変された。
【０１４７】
ＤＸＩ（登録商標）８００イムノアッセイ内の基質送達システムが、トリガー溶液を送達するのに使用された。本明細書に記載される方法によるアッセイに必要でない、ＤＸＩ（登録商標）８００イムノアッセイ機器のいくつかの追加のコンポーネント、例えば、従来のイムノアッセイに必要であるが、本発明の方法において使用されない、分離および洗浄のために使用される磁石および吸引システムは、便宜上取り除かれた。改変ＤＸＩ（登録商標）８００イムノアッセイ機器は、反応容器の取り扱い、試薬のピペッティング、検出を自動化することにおいて便宜上利用され、温度制御を３７℃で施された。他の市販の計測装置も、機器が、トリガー溶液を反応容器中に注入し、同時またはほぼ同時の様式で化学発光シグナルの検出を開始するように改変することができ、または改変されてもよい限り、本明細書に記載されるアッセイ法を実施するために、同様に利用することができる。化学発光シグナルの検出は、非常に短い継続時間、すなわち、光電子増倍管（ＰＭＴ）の１周期などの数ミリ秒のものとすることができ、または数秒間に延長することもできる。収集されるシグナルのすべてまたは一部を、後続のデータ分析に使用することができる。
【０１４８】
化学発光シグナルの検出は、非常に短い継続時間、すなわち、光電子増倍管（ＰＭＴ）の１周期などの数ミリ秒のものとすることができ、または数秒間に延長することもできる。収集されるシグナルのすべてまたは一部を、後続のデータ分析に使用することができる。例えば、以下に記載される一般的な手順では、光強度は、閃光に集中させて０．２５秒間合計され、他の手順では、光強度は、注入を最初の０．５秒遅らせて、５秒間合計される。
【実施例】
【０１４９】
用語集：
ＡＨＴＬ：Ｎ−アセチルホモシステインラクトン
ＡＫ：アクリダン
ＣＫＭＢ：クレアチンキナーゼイソエンザイム
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＥＤＣ：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
ＨＲＰ：西洋わさびペルオキシダーゼ
ＭＳ−ＰＥＧ：末端メチル基を有するアミン反応性直鎖状ポリエチレングリコールポリマー
Ｎａ２ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸のナトリウム塩
ＮＨＳ：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
ＰＥＧ：ポリエチレングリコール；特に、分子量＜２０，０００ｇ／ｍｏｌのオリゴマーまたはポリマー
ＰＥＯ：ポリエチレンオキシド；特に、分子量＞２０，０００ｇ／ｍｏｌのポリマー
ＰＭＰ：１−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン
ＰＳＡ：前立腺特異的抗原
Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ：スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート
ＴＢＳ：Ｔｒｉｓ緩衝食塩水
ＴｎＩ：トロポニンＩ；ｃＴｎＩは心臓トロポニンＩである。
Ｔｒｉｓ：２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−プロパン−１，３−ジオール、ｔｒｉｓ−（ヒドロキシメチル）アミノメタンとしても公知
Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０：ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン（ｓｏｄｉｕｍ）モノラウレート；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ（ＭＯ）から市販されている。
【０１５０】
材料：
エンハンサーを含むトリガー溶液：以下の実施例の多くで使用したトリガー水溶液を、トリガー溶液Ａと呼ぶ。トリガー溶液Ａは、ｐＨ８．０の、２５ｍＭのＴｒｉｓの緩衝水溶液中に、８ｍＭのｐ−ヒドロキシケイ皮酸、１ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ、１０５ｍＭの尿素過酸化物、３％のエタノール、および０．２％のＴｗｅｅｎ（登録商標）−２０を含有する。すべての成分は、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯなどの様々な供給者から市販されている。
【０１５１】
緩衝液ＩＩ：（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｂｒｅａ ＣＡから市販されている、ＴＲＩＳ緩衝食塩水、界面活性剤、＜０．１％のアジ化ナトリウム、および０．１％のＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ））。
【０１５２】
機器：
改変ＤｘＩ（登録商標）８００イムノアッセイ機器（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）：改変ＤＸＩ（登録商標）８００機器を、以下のいくつかの実施例において記載されるアッセイ法を実施するのに使用し、そこで注記した。本明細書に記載される方法を実施するのに使用するために、ＤＸＩ（登録商標）８００機器は、トリガー溶液注入の間、および注入直後に、反応容器の位置付近（反応容器から約１９ｍｍ）で検出するために配置された光子計数（ｐｈｏｔｏ−ｃｏｕｎｔｉｎｇ）ルミノメーター（市販のＤＸＩ（登録商標）８００機器において使用されるのと同じモデル）を組み込むことによって改変した。ＤＸＩ（登録商標）８００イムノアッセイ内の基質送達システムを、トリガー溶液を送達するのに使用した。本明細書に記載される方法によるアッセイに必要でない、ＤＸＩ（登録商標）８００イムノアッセイ機器のいくつかの追加のコンポーネント、例えば、従来のイムノアッセイに必要であるが、本発明の方法において使用されない、分離および洗浄のために使用される磁石および吸引システムは、便宜上取り除いた。改変ＤＸＩ（登録商標）８００イムノアッセイ機器は、反応容器の取り扱い、試薬のピペッティング、検出を自動化することにおいて便宜上利用され、温度制御を３７℃で施した。他の市販の計測装置も、機器が、トリガー溶液を反応容器中に注入し、同時またはほぼ同時の様式で化学発光シグナルの検出を開始するように改変することができ、または改変されてもよい限り、本明細書に記載されるアッセイ法を実施するために、同様に利用することができる。他の例の機器は、以下に列挙されている。化学発光シグナルの検出は、非常に短い継続時間、すなわち、光電子増倍管（ＰＭＴ）の１周期などの数ミリ秒のものとすることができ、または数秒間に延長することもできる。収集されるシグナルのすべてまたは一部を、後続のデータ分析に使用することができる。
【０１５３】
化学発光シグナルの検出は、非常に短い継続時間、すなわち、光電子増倍管（ＰＭＴ）の１周期などの数ミリ秒のものとすることができ、または数秒間に延長することもできる。収集されるシグナルのすべてまたは一部を、後続のデータ分析に使用することができる。例えば、以下に記載される一般的な手順では、光強度は、閃光に集中させて０．２５秒間合計され、他の手順では、光強度は、注入を最初の０．５秒遅らせて、５秒間合計される。
【０１５４】
Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ（登録商標）プレートルミノメーター、（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）。改変されていない。室温で実施された方法。
【０１５５】
ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｌマイクロプレートルミノメーター、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）。改変されていない。高速読取りキネティックモードを使用して、室温で実施された方法。
【０１５６】
（実施例１）
モデル系を使用するＳＳＩＡの選択
モデル系も開発および使用することによって、本開示のアッセイにおいて選択的シグナル阻害剤として機能する特性を有する化合物をスクリーニングおよび選択した。このモデル系は、ストレプトアビジンおよび化学発光標識ｓｂｐとして、アクリダンケテンジチオアセタール化学発光標識（ＡＫ１）を標識されたＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ならびにアクチベーター標識特異的結合対としてビオチン化ＨＲＰにコンジュゲートした微粒子を使用する。このモデル系では、様々な量のＢｔｎ−ＨＲＰを、化学発光標識特異的結合対に、０、１、１０、１００、および２５０ｎｇ／ｍＬで添加する。各反応混合物中で、５００ｎｇ／ｍＬの濃度の全ＨＲＰに到達するために、追加の未標識ＨＲＰを添加する。アクチベーター標識ｓｂｐと組み合わせた未標識ＨＲＰを化学発光標識ｓｂｐ微粒子に供給することによって、試料を模倣した。ＳＳＩＡとして評価するための化合物も添加した。次いでこのモデル系のこの反応混合物を、本開示のアッセイの様式で、トリガー溶液を添加することによってトリガーした。
【０１５７】
モデル系のための材料の調製：
微粒子上に化学発光標識ｓｂｐを調製するために、４倍モル過剰のビオチン−ＬＣ−ｓｕｌｆｏＮＨＳ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）を用いてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をビオチン化した。非結合反応物を脱塩または透析によって除去した。次いで、ビオチン−ＢＳＡを、ｐＨ７．２の２０ｍＭのリン酸ナトリウム：ＤＭＳＯ（７５：２５、ｖ／ｖ）中の５倍モル過剰のアクリダンケテンジチオアセタールＡＫ１と反応させ、その後、同じ緩衝液中で脱塩した。次いで二重標識（ビオチンおよびＡＫ１）ＢＳＡを、トシル活性化Ｍ２８０微粒子（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）と、ｐＨ９．５の０．１Ｍのホウ酸塩緩衝液中で、微粒子１ｍｇ当たり標識されたＢＳＡ約２０μｇの濃度で、４０℃で１６〜２４時間カップリングさせた。カップリングした後、微粒子を、０．２ＭのＴＲＩＳ塩基、２％のＳＤＳ、ｐＨ約１１を用いて４０℃で１時間ストリップした。ストリッピングプロセスをさらに１回繰り返した。次いで微粒子を０．１％のＢＳＡ／ＴＲＩＳ緩衝食塩水（ＢＳＡ／ＴＢＳ）緩衝液中に懸濁させ、ストレプトアビジン（ＳＡ）を、微粒子１ｍｇ当たりＳＡ約１５μｇで添加した。ストレプトアビジンを、室温で４５〜５０分間微粒子と混合した。次いで微粒子を、同じＢＳＡ／ＴＢＳ中で３回洗浄し、懸濁させた。試験により、これらのベース微粒子は、微粒子１ｍｇ当たり、ビオチン化タンパク質約５μｇを結合することができることが示された。
【０１５８】
ＨＲＰ、（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ、ＵＳＡ）を、４倍モル過剰のビオチン−ＬＣ−ｓｕｌｆｏＮＨＳ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）を用いてビオチン化した。非結合反応物は、脱塩または透析によって除去した。
【０１５９】
評価のための各ＳＳＩＡ化合物を、反応混合物の最終濃度の少なくとも１０倍の濃度で緩衝液ＩＩ中に溶解させた（トリガー溶液を添加した後）。
【０１６０】
常磁性粒子（ＰＭＰ）：（Ｍ２８０）−（ｂｔｎ−ＢＳＡ−ＡＫ）−（ストレプトアビジ）；
試料エミュレーター：Ｂ−ＨＲＰ：ＨＲＰ；Ｂｔｎ−ＨＲＰの変化：０、１、１０、１００、および２５０ｎｇ／ｍＬを伴って、５００ｎｇ／ｍＬの全ＨＲＰ濃度でＢ−ＨＲＰ：ＨＲＰを滴定して、合計５００ｎｇ／ｍＬ。
【０１６１】
ＳＳＩＡ：１００μＭの最終濃度を与えるように目標としたＢＵＦＦＥＲ ＩＩ中で、以下の表による。
【０１６２】
トリガー溶液Ａは上記に定義されている。
モデル系を使用する試験手順
１ｍｇ／ｍｌの二重標識（ビオチンおよびＡＫ１）ＢＳＡ Ｍ２８０粒子２５μｌを、緩衝液ＩＩ中の作業濃度のＳＳＩＡ ４５μｌと混合した。アッセイ体積を、緩衝液ＩＩ １５μｌを添加することによって８５μｌにした。様々な比のＢｔｎ−ＨＲＰ：ＨＲＰ（ビオチン化ＨＲＰの量は、０から、１、１０、１００、および２５０ｎｇ／ｍＬで変更した）を含有する試料１５μｌを添加した。反応混合物を３７℃で３０分間インキュベートし、次いでトリガー溶液１００μＬを添加し、光強度を記録した。トリガー溶液を含む反応混合物の全体積は２００μＬであり、ＳＳＩＡの最終濃度は１００μＭであった。
【０１６３】
【表２】
【０１６４】
【表３】
【０１６５】
【表４−１】
【０１６６】
【表４−２】
【０１６７】
結論
ＳＳＩＡとして有用性を実証する化合物には、アスコルビン酸、アスコルビン酸の６−パルミテート誘導体および５，６−イソプロピリデン誘導体、およびＴＲＯＬＯＸ、トコフェロールの誘導体、２−アミノフェノール、４−アミノ−３−ヒドロキシ−安息香酸、４−アミノレソルシノールヒドロクロリド、４−クロロカテコール、ならびに２−クロロ−１，４−ジヒドロキシベンゼンが含まれ、Ｓ０値を対照と比較することによって示されるバックグラウンドシグナルの低減、およびＳ１／Ｓ０値の増加によって実証されるシグナル対ノイズの改善を伴う。
【０１６８】
モデル系において効果を示さなかった化合物は、グルタチオン、システイン、Ｎ−アセチルシステイン、リポ酸（ジスルフィド）、ペグ化トコフェロール、メラトニン（トリプタミン誘導体）、ＴＥＭＰＯＬ（安定な窒素酸化物）、ニコチン酸ヒドラジド、ニコチン酸、および２つのアクリルアミド／ビスアクリルアミド溶液である。αおよびγ−トコフェロール、尿酸、ならびにフェルラ酸を含む、第２の分類の化合物は、７５〜８８％の範囲でＳ０シグナルの低減を示すが、１０ｎｇ／ｍＬのＢｔｎ−ＨＲＰでの第３のキャリブレーターレベルまでＳ／Ｓ０の増大を示さない。
【０１６９】
（実施例２）
ホモジニアスＰＳＡイムノアッセイによるＳＳＩＡのスクリーニング
この実施例は、本開示のアッセイにおけるＳＳＩＡとしての機能性について、候補化合物を試験するのに使用した一方法を示す。試験は、タンパク質ＰＳＡのモデルスクリーニングイムノアッセイにおいて行った。マウス抗−ＰＳＡ試験は、９６ウェルマイクロタイタープレート形式を使用して行った。マウス抗−ＰＳＡ−ＡＫ１ ３０μＬ（６６ｎｇ）、マウス抗−ＰＳＡ−ＨＲＰコンジュゲート３０μＬ（７．８ｎｇ）、ヒト女性の血清３６μＬ、およびＰＳＡキャリブレーター２４μＬを含有する溶液を、ピペットで各ウェルに入れた。プレートを３７℃で１０分間インキュベートした。試験化合物のアリコート５μＬ（様々な濃度）を各ウェルに添加した。化学発光は、トリガー溶液Ａの溶液１００μＬを添加することによってトリガーした。化学発光の閃光は、Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎ Ａｓｅｎｔ（登録商標）プレートルミノメーター、（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して、トリガー溶液を添加した後に５秒間積分した。
【０１７０】
各候補化合物は、少なくとも２つレベルのＰＳＡ、すなわち、ゼロ、ならびに１２９ｎｇのＰＳＡ／ｍＬ（キャリブレーターＳ５）および／または２ｎｇのＰＳＡ／ｍＬ（キャリブレーターＳ２）で試験した。簡潔さのために、各候補化合物の１つの代表的な濃度の結果のみを示した。Ｓ５／Ｓ０が、対照との関連で改善されている場合、化合物は、アッセイ性能の改善に有効であると見なされる。本スクリーニングにおいて、改善係数は、少なくとも２（Ｓ５／Ｓ０≧約２０〜３０）であることが望ましく、改善係数は、少なくとも５（Ｓ５／Ｓ０≧約５０）であることがより望ましく、Ｓ５／Ｓ０は、≧１００であることがさらにより望ましい。多くの化合物は、このスクリーニング検査においてＳＳＩＡとして有効性を示すことが見出され、他の化合物は、効果的でないか、または限定された効果を有することが見出された。
【０１７１】
【表５−１】
【０１７２】
【表５−２】
【０１７３】
【表５−３】
【０１７４】
【表５−４】
【０１７５】
（実施例３）
ＡＫ１およびＡＢ１を有する粒子の調製
この実施例では、ＡＫ化学発光標識および特異的結合対のメンバー、Ａｂ１を有する固体表面（ＬｏｄｅＳｔａｒｓ（商標）カルボキシル常磁性粒子、「ＬｏｄｅＳｔａｒ ＰＭＰ」）を調製するための方法を記載する。Ａｂ１は、後続の実施例において示される被検体（ＣＫ−ＭＢ、βｈＣＧ、ミオグロビン、ｃＴｎＩ、およびＰＳＡ）についてのモノクローナル抗体である。当技術分野で慣例的であるように、数値または文字識別子が必要に応じて後に続く用語「Ａｂ」は、指定された数値または文字名称を有する抗体を指す。同様に、用語「Ａｇ」は、抗体−抗原相互作用との関連で抗原を指す。
【０１７６】
Ｌｏｄｅｓｔａｒ ＰＭＰ（３０ｍｇ／ｍＬで８．３３ｍｌ）を、０．１ＭのＭＥＳ／ＤＭＳＯ（７５：２５）（９．９５ｍｌ）中に懸濁させた。ＥＺ−Ｌｉｎｋビオチン−ＰＥＯ４−ヒドラジド（２０ｍｇ／ｍＬで３１．６μｌ）、ＥＤＣ（２５ｍｇ／ｍＬの最終濃度）、およびヒドラジド標識化部分を有するＡＫ４（８０ｍｍｏｌ／Ｌで１５．６μＬ）を、Ｌｏｄｅｓｔａｒ ＰＭＰに添加し、室温で、１４０〜１６０ＲＰＭで１分間、次いで４℃で一晩（１６〜２４時間）撹拌した。次いでこの粒子をＢＵＦＦＥＲ ＩＩ中で洗浄し、再懸濁させた。ＳＡ２１ストレプトアビジン−Ｐｌｕｓ（１０．２ｍｇ／ｍＬで０．４９ｍＬ）をＰＭＰに添加することによって、ＡＫ−ストレプトアビジンＬｏｄｅｓｔａｒ粒子を形成した。
【０１７７】
２つの代表的なプロトコールのうちの１つを使用して、抗体をビオチン標識した。
１）１０倍モル過剰のＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ ＩＬ）を抗ｃＴｎＩモノクローナル抗体に添加し、この混合物を室温で２時間インキュベートした。ビオチン化抗体を、ｐＨ７．２のＰＢＳ中で、透析によって精製した。ビオチン：抗体のモル比は、市販のビオチン定量化キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して決定した場合、４．９であった。または
２）ＤＭＳＯ中で２ｍｇ／ｍＬに溶解させた、６倍モル過剰のＮＨＳ−（ＰＥＯ）４−ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を、ＭｘＰＳＡ抗体（ｐＨ７．４のＰＢＳ中で７．６ｍｇ／ｍＬ）６ｍｇに添加することによって、ビオチン化ＰＳＡ抗体を調製した。周囲温度で６０分間インキュベートした後、ビオチン化抗体を、製造者の指示書に従って、ｐＨ７．４のＰＢＳ中で平衡化した、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を通して精製した。
【０１７８】
ＡＫ−ストレプトアビジンＬｏｄｅｓｔａｒ粒子（５ｍｇ／ｍＬ）をＢＵＦＦＥＲ ＩＩ中に入れた。Ａｂ１の必要量を計算し、ＡＫ−ストレプトアビジンＬｏｄｅｓｔａｒ粒子（１０μｇ／ｍｇであったβｈＣＧを除いて、通常５μｇ／ｍｇ）に添加した。反応混合物をボルテックスし、４℃で一晩インキュベートし、それによってＡＫ−Ａｂ１粒子を形成した。
【０１７９】
（実施例４）
ＨＲＰ−Ａｂ２コンジュゲートの調製
ＨＲＰ−Ａｂ２コンジュゲートを、当技術分野で公知の方法を使用して調製した。ＨＲＰ−Ａｂ２コンジュゲートを生成するために、ＨＲＰを抗体にコンジュゲートする詳細な方法は、例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、４巻、３号、１９８３年、２０９〜３２１頁に提供されている。Ａｂ２は、後続の実施例において示される被検体（ＣＫ−ＭＢ、βｈＣＧ、ミオグロビン、およびＴｎＩ）についてのモノクローナル抗体であり、これは、Ａｂ−１とは異なる、被検体上の抗原部位に結合する。
【０１８０】
一般に、生成物依存性濃度のＮ−アセチル−ＤＬ−ホモシステインチオラクトン（ＡＨＴＬ）を使用して、遊離チオールを抗体（Ａｂ２）に結合させた。脱塩によって過剰のＡＨＴＬを抗体から除去した。モル過剰のスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ）を使用して、マレイミドをＨＲＰに結合させた。脱塩によって過剰のｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣをＨＲＰから除去した。抗体およびＨＲＰを、４ＨＲＰと１ Ａｂ２のモル比で合わせ、反応物の基同士間で共有結合を形成した。ＨＲＰを過剰に維持しながら、抗体を計量してＨＲＰ中に供給した。適切な時間量の間インキュベートした後、β−メルカプトエタノール（βＭＥ）およびＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）を用いて未反応の官能基をブロックすることによって反応を停止した。コンジュゲーション生成物（ＨＲＰ−Ａｂ２コンジュゲート）を濃縮し、ゲル濾過によって、任意の凝集したコンジュゲーション生成物および未反応の抗体またはＨＲＰから分離した。コンジュゲーション生成物を、ＯＤ２８０およびＯＤ４０３活性に基づいてプールした。
【０１８１】
（実施例５）
ＣＫ−ＭＢ
この実施例は、実施例３に示したように調製したＡＫ−Ａｂ１粒子、および実施例４に示したように調製したＨＲＰ−Ａｂ２コンジュゲートを使用して、ＣＫ−ＭＢ（クレアチンキナーゼ心筋型）を検出する方法を記載し、この場合、Ａｂ２は、ＣＫ−ＭＢに対する抗体を表す。この方法は、アスコルビン酸を使用することによってバックグラウンドシグナルを減少させた。
【０１８２】
ＨＲＰ−Ａｂ２コンジュゲート懸濁液は、１．０μｇ／ｍＬで調製し、０または１ｍＭのアスコルビン酸を含有した。試料は、指定量（ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｍｏｕｎｔｓ）のＣＫ−ＭＢを添加された、または対照としてＣＫ−ＭＢをまったく含まないヒト血清試料から構成した。試験手順は、１．０μｇ／ｍＬのＨＲＰ−Ａｂ２コンジュゲート１５μＬ、ならびに１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡおよび１ｍｇ／ｍＬのＭＩｇＧを含有するｐＨ５．９のＭＥＳ緩衝液３５μＬを反応容器に添加するステップから構成した。次に、患者の血清試料２５μＬを添加し、その後、１．０ｍｇ／ｍＬのＡＫ−Ａｂ１コンジュゲート懸濁液２５μＬを添加し、それによって、反応容器内で１００μＬの全体積を得た。１５．２分後に、トリガー溶液Ａ １００μＬを反応容器に添加し、光強度を改変ＤｘＩ機器で記録した。化学発光強度を相対光単位（ＲＬＵ）で表す。
【０１８３】
【表６】
【０１８４】
（実施例６）
βＨＣＧ
この実施例は、実施例３に示したように調製したＡＫ−Ａｂ１粒子、および実施例４に示したように調製したＨＲＰ−Ａｂ２コンジュゲートを使用して、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン（βｈＣＧ）を検出する方法を記載し、この場合、Ａｂ２は、βｈＣＧに対する抗体を表す。この方法は、アスコルビン酸を使用することによってバックグラウンドシグナルを減少させた。
【０１８５】
ＨＲＰ−Ａｂ２コンジュゲート懸濁液は、１．０μｇ／ｍＬで調製し、０または１ｍＭのアスコルビン酸を含有した。試料は、指定量のβｈＣＧを添加された、または対照としてβｈＣＧをまったく含まないヒト血清試料から構成した。試験手順は、１．０μｇ／ｍＬのＨＲＰ−Ａｂ２コンジュゲート２０μＬ、ならびに１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡおよび１ｍｇ／ｍＬのＭＩｇＧを含有するｐＨ５．９のＭＥＳ緩衝液３０μＬを反応容器に添加するステップから構成した。次に、患者の血清試料２５μＬを添加し、その後、１０ｍｇ／ｍＬのＡＫ−Ａｂ１コンジュゲート懸濁液２５μＬを添加し、それによって、反応容器内で１００μＬの全体積を得た。１５．２分後に、トリガー溶液Ａ １００μＬを反応容器に添加し、光強度を改変ＤｘＩ機器で記録した。化学発光強度を相対光単位（ＲＬＵ）で表す。
【０１８６】
【表７】
【０１８７】
（実施例７）
ミオグロビン
この実施例は、実施例３に示したように調製したＡＫ−Ａｂ１粒子、および実施例４に示したように調製したＨＲＰ−Ａｂ２コンジュゲートを使用して、ミオグロビンを検出する方法を記載し、この場合、Ａｂ２は、ミオグロビンに対する抗体を表す。この方法は、アスコルビン酸を使用することによってバックグラウンドシグナルを減少させた。
【０１８８】
ＨＲＰ−Ａｂ２コンジュゲート懸濁液は、１．０μｇ／ｍＬで調製し、０または１ｍＭのアスコルビン酸を含有した。試料は、指定量のミオグロビンを添加された、または対照としてミオグロビンをまったく含まないヒト血清試料から構成した。試験手順は、１．０μｇ／ｍＬのＨＲＰ−Ａｂ２コンジュゲート２０μＬ、ならびに１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡおよび１ｍｇ／ｍＬのＭＩｇＧを含有するｐＨ５．９のＭＥＳ緩衝液３０μＬを反応容器に添加するステップから構成した。次に、患者の血清試料２５μＬを添加し、その後、５．０ｍｇ／ｍＬのＡＫ−Ａｂ１コンジュゲート懸濁液２５μＬを添加し、それによって、反応容器内で１００μＬの全体積を得た。１５．２分後に、トリガー溶液Ａ １００μＬを反応容器に添加し、光強度を改変ＤｘＩ機器で記録した。化学発光強度を相対光単位（ＲＬＵ）で表す。
【０１８９】
【表８】
【０１９０】
（実施例８）
ヘテロジニアスアッセイを介したｃＴｎＩ検出
この実施例は、例えば、実施例３に示したように調製したＡＫ−Ａｂ１粒子、および例えば、実施例４に示したように調製したＨＲＰ−Ａｂ２コンジュゲートを使用して、ｃＴｎＩ（心臓トロポニンＩ）を検出する方法を記載し、この場合、Ａｂ２は、ｃＴｎＩに対する抗体を表す。バックグラウンドシグナルに対するアスコルビン酸の効果を調査した。
【０１９１】
ＨＲＰ−Ａｂ２コンジュゲート懸濁液は、１．０μｇ／ｍＬで調製し、０または１ｍＭのアスコルビン酸を含有した。試料は、指定量のｃＴｎＩを添加された、または対照としてｃＴｎＩをまったく含まないヒト血清試料から構成した。試験手順は、１．０μｇ／ｍＬのＨＲＰ−Ａｂ２コンジュゲート２０μＬ、ならびに１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡおよび１ｍｇ／ｍＬのＭＩｇＧを含有するｐＨ５．９のＭＥＳ緩衝液３０μＬを反応容器に添加するステップから構成した。次に、患者の血清試料２５μＬを添加し、その後、１．０ｍｇ／ｍＬのＡＫ−Ａｂ１コンジュゲート懸濁液２５μＬを添加し、それによって、反応容器内で１００μＬの全体積を得た。１５．２分後に、トリガー溶液Ａ １００μＬを反応容器に添加し、光強度を改変ＤｘＩ機器で記録した。化学発光強度を相対光単位（ＲＬＵ）で表す。以下の表に示した結果は、アスコルビン酸の存在下で、バックグラウンドシグナルの有意な低減を示す。
【０１９２】
【表９】
【０１９３】
（実施例９）
ＧＭ−ＣＳＦについてのヘテロジニアスアッセイ
用語「ＧＭ−ＣＳＦ」は、ヒト遺伝子地図座位５ｑ３１．１を有する、造血前駆細胞の生存、増殖、および分化に必要なタンパク質である、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｃｏｌｏｎ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）を指す。ＧＭ−ＣＳＦに対する様々な抗体が市販されている。
【０１９４】
ＧＭ−ＣＳＦに関するヘテロジニアス相アッセイは、実施例３に記載したようなＡＫ４およびビオチン／ストレプトアビジンで標識されたＬｏｄｅＳｔａｒｓ ＰＭＰ（ＡＫ−ＰＭＰ−ＳＡ）、抗体−ビオチンコンジュゲート、ならびにＧＭ−ＣＳＦに結合する抗体−ＨＲＰコンジュゲートを使用して行った。抗体−ＨＲＰコンジュゲート、（抗ＧＭ−ＣＳＦ−ＨＲＰ）は、Ａｎｔｉｇｅｎｉｘから購入した。
【０１９５】
抗体−ビオチン（抗ＧＭ−ＣＳＦ−ビオチン）コンジュゲートは、ＤＭＦ中に溶解した（１ｍｇ／ｍＬ）、２５倍モル過剰（９．２８μｇ）のスルホＮＨＳ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）を、ｐＨ８．２５の０．１Ｍのホウ酸ナトリウム０．１ｍＬ中の抗体（Ａｎｔｉｇｅｎｉｘ）０．１ｍｇに添加することによって合成した。周囲温度で６０分間インキュベートした後、反応物を放置して４℃で一晩インキュベートした。ビオチン化抗体を、製造者の指示書に従って、ｐＨ７．４のＰＢＳ中で平衡化した、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を通して精製した。
【０１９６】
ヘテロジニアスアッセイを実施するために、抗ＧＭ−ＣＳＦ−ビオチンコンジュゲート溶液３０μＬ（０．７５μｇ／ｍＬ、２２．５ｎｇ）、０〜３０，０００ｐｇ／ｍＬの範囲内でＧＭ−ＣＳＦを有するキャリブレーター溶液３０μＬ、抗ＧＭ−ＣＳＦ−ＨＲＰコンジュゲート３０μＬ（２．２５μｇ／ｍＬ、６７ｎｇ）、およびＡＫ−ストレプトアビジン磁性粒子溶液３０μＬ（粒子１０μｇ）を、白色マイクロタイタープレートのウェル中にピペットで入れた。プレートを室温で６０分間インキュベートした。２−アミノフェノール溶液５μＬ（１１ｍＭ、５５ｎｍｏｌｅｓ）をＳＳＩＡとして添加した。プレートを、注入プレートルミノメーター内に配置した。トリガー溶液Ａ １００μＬを、ルミノメーターによって添加し、化学発光シグナルを５秒間読み取った。
【０１９７】
反応混合物中のＧＭ−ＣＳＦの濃度の関数としての、化学発光の平均強度（ＲＬＵ）、および反応混合物中にＧＭ−ＣＳＦが存在しないものと比べた比（Ｓ／Ｓ０）を、以下の表に提供する。
【０１９８】
【表１０】
【０１９９】
（実施例１０）
トリガー溶液のｐＨの効果
Ａ．ヘテロジニアス固相アッセイの性能に対するｐＨの効果を、実施例３に記載したようなＡＫ４およびビオチンヒドラジドで直接コンジュゲートされたＬｏｄｅＳｔａｒｓ粒子に対して、実施例１のビオチン−ＨＲＰモデル系を使用するモデルアッセイにおいて評価した。次いで、上記したように、粒子にＳＡを受動的にオーバーコートし、その後すすぐことによって、ビオチンに結合しなかったＳＡを除去した。緩衝塩は、６〜９の範囲のｐＨをもたらすように選択した。ｐＨの関数としての、アッセイのバックグラウンド化学発光に対する効果を、図１Ａに示す。１６：１８４のｂｔｎ−ＨＲＰ：ＨＲＰの比を使用した特定のシグナルに対するｐＨの効果を、図１Ｂに表す。
Ｂ．様々な試験アッセイシステムに対するトリガー溶液のｐＨの効果を決定するために、一連の実験を、トリガーのｐＨを変更して行った。以下の表１１Ａは、６．２〜８．４のｐＨ範囲内でＬｏｄｅＳｔａｒｓ粒子上のＰＳＡを使用するアッセイにおける、ＰＳＡ濃度の関数としての平均化学発光強度を提供する。表１１Ｂは、５．９〜８．６のｐＨ範囲内での、ＬｏｄｅＳｔａｒ粒子上のＣＫ−ＭＢについての対応する結果を提供する。表１１Ｃは、５．９〜８．７のｐＨ範囲内での、ＬｏｄｅＳｔａｒ粒子上のＴｎＩについての対応する結果を提供する。これらの表において、２つのｐＨ値を各データセットについて列挙する。第１のｐＨは、反応混合物に添加された緩衝液試料のｐＨである。第２のｐＨは、最終的な反応ミックスの得られたｐＨである。
【０２００】
【表１１Ａ】
【０２０１】
【表１１Ｂ】
【０２０２】
【表１１Ｃ】
【０２０３】
（実施例１１）
ＰＭＰモデル系におけるアッセイシグナルに対するｐＨの効果
ヘテロジニアス固相アッセイの性能に対するｐＨの効果を、実施例１に一般に記載したようなビオチン−ＨＲＰを伴うモデル系における、Ｄｙｎａｌ Ｍ−２８０およびＬｏｄｅＳｔａｒｓ粒子を用いたアッセイについてさらに調査した。ＡＫ１−ストレプトアビジン−ＰＭＰで標識されたＬｏｄｅＳｔａｒｓ粒子は、実施例３に記載した通りであった。トシル活性化Ｍ−２８０粒子は、実施例１に記載したようなＡＫ−ＢＳＡ−ビオチン、その後にストレプトアビジンを共有結合性にカップリングすることによって標識した。
【０２０４】
緩衝液
表１２を参照して、緩衝液は、緩衝液イオンが１００ｍＭ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００が０．２％、およびＮａＣｌが１５０ｍＭであった。「トリガー後」のｐＨは、緩衝液が１部（１ ｐａｒｔ）、ｐＨ８の２５ｍＭのトリスが１部、およびトリガー溶液Ａが２部の組合せによって決定した。ｐＨを読み取るための温度は、３７．４℃であった。
【０２０５】
【表１２】
【０２０６】
この実験についての試料のｐＨ、トリガー後のｐＨ、相対的化学発光、およびシグナル対ノイズ（Ｓ／Ｎ）の結果を、ＬｏｄｅＳｔａｒｓ ＰＭＰおよびＤｙｎａｌ Ｍ−２８０ ＰＭＰについてそれぞれ表１３Ａおよび１３Ｂにおいて表にする。
【０２０７】
【表１３Ａ】
【０２０８】
【表１３Ｂ】
【０２０９】
結論
ｐＨは、ＬｏｄｅＳｔａｒｓ ＰＭＰおよびＤｙｎａｌ Ｍ−２８０ ＰＭＰの両方について、化学発光に大いに影響し、その効果は、ＰＭＰの型の間である程度異なることが観察された。
【０２１０】
（実施例１２）
化学発光に対するアスコルビン酸インキュベーション時間の効果
化学発光強度の観察される低減に対する、試料がアスコルビン酸に曝される時間の長さの効果を、実施例１１に記載したＤｙｎａｌ Ｍ−２８０ ＰＭＰ粒子およびビオチン−ＨＲＰ系を使用して、一連の実験において調査した。簡単に言えば、ビオチン標識ＰＭＰ、および様々なビオチン−ＨＲＰ／ＨＲＰ溶液を結合させ、アスコルビン酸溶液を添加した。８０〜３３０秒の範囲の遅延期間の後、トリガー溶液Ａを注入し、化学発光強度を積分した。ビオチン−ＨＲＰ／ＨＲＰ溶液は、比率１：２００、８：１９２、および３２：１６８のビオチン−ＨＲＰ：ＨＲＰで、合計２００ｎｇ／ｍＬのＨＲＰを含有した。０、２５、５０、１００、および２００μＭで、水中の試料として様々な濃度のアスコルビン酸を使用して試験を行った。
【０２１１】
これらの調査の結果は、８０〜３３０秒の範囲内のアスコルビン酸インキュベーション時間は、観察される化学発光に対して有意な効果を引き起こすように現われないことを実証した。結果は、ビオチン−ＨＲＰ／ＨＲＰの比に無関係に、本質的に同じであった。
【０２１２】
（実施例１３）
ｃＴｎＩアッセイに対するアスコルビン酸の効果の詳細化
微粒子形式でのアッセイ性能の改善におけるアスコルビン酸の有効性を、様々な磁性粒子を含むｃＴｎＩ被検体を使用して調査した。評価した磁性粒子には、ＬｏｄｅＳｔａｒｓ ＰＭＰ、ラテックスＰＭＰ、およびカルボキシレート改変ポリスチレンラテックスＰＭＰが含まれていた。「ロットＢの磁性粒子」は、６．２μｍの直径のカルボキシルＰＭＰ（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｆｉｓｈｅｒｓ、ＩＮ）である。「ロットＤの磁性粒子」は、８．１μｍの直径のカルボキシルＰＭＰ（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）である。「ロットＦのラテックス粒子」は、３．１μｍの直径のカルボキシルＰＭＰ（Ｓｅｒａｄｙｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）である。「ＣＭＬ ＰＭＰ」は、２．９μｍの直径のカルボキシレート改変ラテックス粒子（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）である。ＬｏｄｅＳｔａｒｓ ＰＭＰを、実施例３の一般的なプロトコールに従って、ＥＤＣカップリングによってＡＫ４およびビオチンで標識し、ストレプトアビジンでオーバーコートした。ロットＢ、Ｄ、およびＦ、ならびにＣＭＬ ＰＭＰを、実施例１に従ってＡＫ−ＢＳＡ−ビオチンで標識した。次いで、粒子をストレプトアビジンでコーティングし、ビオチン標識抗ｃＴｎＩに結合させた。実験プロトコールは、実施例８に一般に記載した通りであり、インキュベーション時間は１０．２分であった。ｃＴｎＩ（すなわち、Ｓ０〜Ｓ６）の濃度は、表９に提供した通りであった。
【０２１３】
結果
初期の実験において、ｃＴｎＩアッセイを、反応物ミックス中にアスコルビン酸を用いないで実施した。表１４に示したように、ＬｏｄｅＳｔａｒｓ粒子は、最高の特異的シグナルを有するが、バックグラウンドシグナルが、低キャリブレーターシグナルの多くを圧倒する。
【０２１４】
【表１４−１】
【０２１５】
【表１４−２】
【０２１６】
トリガーを添加する前に１５０μＭのアスコルビン酸を用いて実験を繰り返す場合、表１５に示す結果が得られる。この場合、ＬｏｄｅＳｔａｒｓ粒子は、他の粒子タイプよりはるかに多くの特異的シグナルを保持し、それでもバックグラウンドは、ほとんど３００％減少する。
【０２１７】
【表１５−１】
【０２１８】
【表１５−２】
【０２１９】
結論
この実施例でもたらされる結果は、アッセイ反応混合物中にアスコルビン酸を含めることにより、アッセイ感度が著しく改善されることを実証する。
【０２２０】
（実施例１４）
粒子タイプの効果の調査
本明細書に記載されるアッセイに対する特定の固相粒子の効果をさらに調査するために、シリカ、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）を含めた、様々な粒子タイプの比較を行った。カルボキシル改変ＰＭＭＡ粒子（ＰｏｌｙＡｎ ＧｍｂＨ、Ｂｅｒｌｉｎ）を、実施例３に記載したようにＡＫおよびビオチンで標識し、その後、ストレプトアビジンでコーティングした。シリカ粒子を、１ｍＭの酢酸中の３−アミノプロピルシロキサンと反応させることによって、アミン反応基を提供した。アミン官能基をＡＫ−３およびビオチン−ＬＣ−ｓｕｌｆｏＮＨＳと反応させ、その後、ストレプトアビジンでコーティングした。
【０２２１】
シリカおよびＰＭＭＡ粒子を用いたシグナル生成。実施例１に一般に記載されるような、ＨＲＰモデル系を使用するアッセイを、反応混合物中にアスコルビン酸を含めて、および含めずに、シリカ粒子およびＰＭＭＡ粒子で行った。アッセイは、上記したような改変ＤｘＩ機器で実施した。アッセイ条件は、ＢＵＦＦＥＲ ＩＩ（アスコルビン酸を含む、または含まない）４５μＬ、粒子懸濁液２５μＬ、および試料１５μＬを合わせるステップと、３０分間インキュベートするステップから構成した。次いで、トリガー溶液Ａ １００μＬを反応容器に添加し、光強度を記録した。
【０２２２】
結果を、表中に示した濃度条件と共に、表１５Ａ（シリカ）および表１５Ｂ（ＰＭＭＡ）に提供する。
【０２２３】
【表１６Ａ】
【０２２４】
【表１６Ｂ】
【０２２５】
（実施例１５）
粒子タイプの効果の調査
シリカおよびＰＭＭＡ粒子を用いたシグナル生成。Ｄｙｎａｌ Ｍ−２８０、３μｍのＣＭＬ、６μｍのＣＭＬ、ＰＭＭＡ、シリカ、およびＬｏｄｅＳｔａｒｓ粒子の比較を、上記したｃＴｎＩアッセイを使用して行った。ストレプトアビジンのコーティングを有する各粒子の調製は、前述の実施例に記載されている。アスコルビン酸は、存在する場合、１５０μＭであった。結果を以下の表１７に提供する。試験した各粒子系において、１５０μＭのアスコルビン酸の存在により、最高のキャリブレーター（ｃａｌｉｂｔｒａｔｏｒ）レベルでＳ／Ｓ０が著しく改善され、最低レベルで試験した場合も同様であった。
【０２２６】
【表１７−１】
【０２２７】
【表１７−２】
【０２２８】
（実施例１６）
アスコルビン酸濃度の効果の調査
様々な粒子を使用する、ｃＴｎＩアッセイに対するアスコルビン酸の効果。化学発光に対する、１５０μＭ〜９．４μＭの範囲内でアスコルビン酸濃度を変更することの効果を、Ｄｙｎａｌ Ｍ−２８０、６μｍのＣＭＬ、およびＬｏｄｅＳｔａｒｓ粒子を使用するアッセイについて調査した。ｃＴｎＩについてのアッセイは、実施例８に一般に記載した通りであり、濃度は、表１８Ａ〜Ｃに提供した通りであった。試験した各粒子タイプは、すべての濃度のアスコルビン酸により、シグナル／バックグラウンドを増大させることによって分析感度が改善されることを明らかにした。
【０２２９】
【表１８Ａ】
【０２３０】
【表１８Ｂ】
【０２３１】
【表１８Ｃ】
【０２３２】
（実施例１７）
ｃＴｎＩ分析のための方法の比較：アッセイの線形性
限定されないが、バックグラウンドシグナルの低減、アッセイに必要とされる時間の減少、望まれない化学的相互作用の排除などのために追加の試薬を含めることを含めた、本明細書に記載されるアッセイ手順の改変は、当業者に利用可能である。したがって、本明細書に記載されるような被検体検出のための方法をさらに特徴づけるために、アッセイ成分が以下に記載される通りである一連の実験を行った。
【０２３３】
ＰＭＰは、実施例３における一般的な手順によって調製された、ＡＫ１およびｃＴｎＩに対する抗体（Ａｂ１）とコンジュゲートされた、１００ｍＭのＴｒｉｓ、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．２％のＴｗｅｅｎ２０、１％のＢＳＡ、０．１％のＰｒｏｃｌｉｎ、ｐＨ８．０中の１ｍｇ／ｍＬのＬｏｄｅＳｔａｒｓであった。製造者のプロトコールに従って、Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ−Ｌｉｎｋ（商標）方法（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯ）を用いて得られたＨＲＰ−Ａｂ２コンジュゲートを、５０μｇ／ｍＬのＰｏｌｙＭａｋ−３３（Ｒｏｃｈｅ）、１ｍｇ／ｍＬのＭＩｇＧ（マウスＩｇＧ）、および０．５ＭのＮａＣｌと組み合わせて、１μｇ／ｍＬで使用した。標準的なＴｎＩ溶液（ＳＣＩＰＡＣ）および正常な臨床的ヒト試料を用意した。キャリブレーターのＴｎＩ値は、ＡｃｃｕＴｎＩアッセイ（Ｂｅｃｋｍａｎ ｃｏｕｌｔｅｒ）によって決定した。
【０２３４】
ｃＴｎＩアッセイプロトコールは、１ｍｇ／ｍＬのＡＫ−Ａｂ１粒子懸濁液２５μＬ、３３３μＭのアスコルビン酸４５μＬ、１μｇ／ｍＬのＨＲＰ−Ａｂ２ １５μＬ、および試料１５μＬをピペッティングするステップから構成した。混合物を、３７℃で５分間インキュベートした。次いで、トリガー溶液Ａ １００μＬを注入することによってトリガーする。得られる閃光を、トリガー添加直後から始めて２５０ミリ秒間にわたって測定する。
【０２３５】
図２Ａに表した結果を伴う代表的な実験において、一連のｃＴｎＩ較正標準物質（濃度範囲：０〜２５．９２ｎｇ／ｍＬ）を、上記した手順によって分析した。実験条件下で、この濃度範囲内で、線形の結果（Ｒ２＝０．９９９９）が観察される。
【０２３６】
応答の線形性に対する試料希釈の効果を、陽性のｃＴｎＩ試料を希釈し（２×）、次いで、０：１０、１：９、２：８、３：７、４：６、５：５、６：４、７：３、８：２、９：１、および１０：０のシリーズで試料を系統的に希釈することによって調査した。１０：０希釈（すなわち、最大のｃＴｎＩ濃度）で、ＲＬＵの絶対値は４１８，２５６であった。これは、約９．６ｎｇ／ｍＬの濃度に対応する。図２Ｂに示したように、良好な線形性（すなわち、Ｒ２＝０．９９４８）が、これらの希釈条件下で、ＲＬＵの観察値と予測値の間で見出される。
【０２３７】
希釈試験プロトコールを、図１１Ｂについて記載した系統的な希釈スキームと共に、８倍希釈の陽性のｃＴｎＩ試料を使用することによって、さらに調査した。これらの条件下で、８倍希釈された試料は、約７６，８３２のＲＬＵ値をもたらした。これは、約１．８ｎｇ／ｍＬのｃＴｎＩの濃度に対応する。図２Ｃに示したように、そのような希釈条件下でさえ、妥当な線形性（Ｒ２＝０．９７８５）が観察される。
【０２３８】
アッセイの分析感度を、ゼロ被検体キャリブレーターの２０の複製物を作製し、引き続いて２倍標準偏差を計算することによって測定した。２倍標準偏差は、既知の濃度のｃＴｎＩを用いて収集された較正曲線に対する幅（ｓｗａｔｈ）として見積もられ、この手順についての０．００５ｎｇ／ｍＬのｃＴｎＩの感度の推定値をもたらす。
【０２３９】
（実施例１８）
ｃＴｎＩ分析方法のＡＣＣＥＳＳ ＡＣＣＵＴＮＩとの比較
本発明の方法によって行われたｃＴｎＩアッセイの結果を、参照方法、すなわちＡｃｃｅｓｓ ＡｃｃｕＴｎＩシステム（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）の結果と比較した。アスコルビン酸試薬を、反応物ミックス中に５００μＭのアスコルビン酸４５μＬとして添加したことを除いて、先の実施例で記載したように本方法を実施した。
【０２４０】
臨床試料を、以下のように得た：被検体（ｃＴｎＩ）が存在しない（２５試料）、陽性のリチウムヘパリン血漿患者試料、陽性の血清、ならびに同じ患者（Ｎ＝１５）からのマッチングされた血漿および血清試料。標準的なｃＴｎＩ溶液を使用し、０〜１７．４８ｎｇ／ｍＬの範囲内のｃＴｎＩ投与を提供した。
【０２４１】
５４の血漿試料および４１の血清試料を含む９５の臨床試料の分析を、上記した手順（３回の反復）、およびＡｃｃｅｓｓ ＡｃｃｕＴｎＩ手順（２回の反復）を使用して行った。Ａｃｃｅｓｓ ＡｃｃｕＴｎＩシステムの結果は、製造者の指示書に従って得た。本手順についての被検体濃度は、標準的なキャリブレーター濃度のｃＴｎＩと比較することによって作製した。
【０２４２】
本手順およびＡｃｃｅｓｓ ＡｃｃｕＴｎ手順についての対にした結果の散布図を図３に表す。この図において、縦軸は、本手順を用いて観察されたｃＴｎＩの濃度であり、横軸は、Ａｃｃｅｓｓ ＡｃｃｕＴｎＩ手順を用いて決定したｃＴｎＩの対応する濃度である。図１２に提供されたデータの、当技術分野で公知であるようなＤｅｍｉｎｇ回帰分析により、Ｒ２＝０．９１６９およびＲ＝０．９５８（Ｎ＝９５）を得た。
【０２４３】
（実施例１９）
ｄｎａ被検体についてのヘテロジニアスアッセイ
磁性粒子を使用し、２８６８塩基対のｐＵＣ１８プラスミドＤＮＡに関するヘテロジニアス相アッセイを、ＡＫおよびストレプトアビジンで標識した常磁性粒子（ＡＫ−ＰＭＰ−ＳＡ）、２つのビオチン化捕捉オリゴヌクレオチド、一連のフルオレセイン標識レポーターオリゴヌクレオチド、ならびに抗フルオレセイン−ＨＲＰコンジュゲートを使用して行った。ＡＫ−ストレプトアビジン常磁性粒子コンジュゲートは、実施例１および２に一般に記載したように作製した。ビオチンおよびフルオレセイン標識オリゴヌクレオチドは、カスタム合成によって調製し、鋳型に相補性であるように設計した。抗体−ＨＲＰコンジュゲートは、市販されていた（Ｒｏｃｈｅ）。ヒトｇＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ）を、陰性対照として使用した。アニーリング緩衝液は、ｐＨ８．３の１０ｍＭのＴＲＩＳ．Ｃｌ、５０ｍＭのＫＣｌ、および１．５ｍＭのＭｇＣｌ２を含有した。ハイブリダイゼーション緩衝液は、ｐＨ７の６×ＳＳＣ（ＮａＯＨでｐＨ調整した塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）、０．１％のＳＤＳ、２４％のホルムアミド、０．３７％の酢酸、および１μｇ／ｍＬのビオチンを含有した。
【０２４４】
手順
１．ビオチン標識ｏｌｉｇｏの粒子への結合。ｐＨ７．４の１×ＰＢＳ緩衝液１５０μＬ中で、２つのｏｌｉｇｏ（１００ｎｇ／μＬの溶液のそれぞれ１０μＬ）および粒子（ＬｏｄｅＳｔａｒｓの５μｇ／μＬの懸濁液１μＬ）を、ボルテックス混合し、シェーカーインキュベーター内に、３７℃で３０分間置いた。粒子を磁石で管の側部に引き寄せ、上澄みを廃棄した。粒子を、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有する１×ＰＢＳで２回洗浄した。粒子をアニーリング緩衝液１４０μＬ中に再懸濁させ、１から６のラベルを付けた６本の１．５ｍＬのマイクロチューブ内に２０μＬ／管でアリコートした。
２．オリゴヌクレオチド−鋳型ハイブリダイゼーションおよび捕捉。以下のアニーリング反応を、２５０μＬの管内で進めた。管を９５℃で５分間加熱し、５０℃で保持した。５０℃で５分後、ハイブリダイゼーション緩衝液２００μＬを各管に添加し、混合した。アニーリング反応物を、ビオチン標識ｏｌｉｇｏに結合した粒子２０μＬを含む、対応して番号を付けた１．５ｍＬの管に移した。混合物を、シェーカーインキュベーター内で、３７℃で１時間ハイブリダイズした。管を磁石上に１分間配置し、ハイブリダイゼーション緩衝液を除去した。
【０２４５】
０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含む１×ＰＢＳ中に再懸濁することによって非結合の核酸を除去するために、粒子を３回洗浄し、磁気分離した。
【０２４６】
【表１９Ａ】
【０２４７】
３．抗フルオレセイン−ＨＲＰ抗体の、ハイブリダイズしたフルオレセインｏｌｉｇｏへの結合。ステップ２からの洗浄した粒子を、１：１５０，０００希釈の抗フルオレセイン−ＨＲＰ抗体中に再懸濁させ、穏やかに振盪しながら室温で３０分間インキュベートした。非結合の抗体を磁気分離によって除去した。粒子を、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含む１×ＰＢＳ中で再懸濁させ、磁石上で１分間保持し、洗浄緩衝液を除去することによって３回洗浄した。
４．化学発光ＳＰＡＲＣＬ検出。ステップ３からの洗浄した粒子を、１×ＰＢＳ １００μＬ中に再懸濁させた。粒子を、白色マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）の２つのウェル中に等しく分割した（それぞれ約４８μＬ）。化学発光は、Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎルミノメーター（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）内にプレートを配置し、トリガー溶液（ｐＨ８．０の２５ｍＭのＴＲＩＳ、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０、１ｍＭのＥＤＴＡ、８ｍＭのｐ−ヒドロキシケイ皮酸、１００ｍＭの尿素過酸化物）１００μＬを注入し、注入して直ちに５秒間読み取ることによって測定した。
【０２４８】
【表１９Ｂ】
【０２４９】
（実施例２０）
ＡＫ化学発光標識および抗ＰＳＡ抗体で標識されたシリカ粒子の調製
３−アミノプロピルシロキサン（Ｓｉｌｉｃｙｃｌｅ Ｑｕｅｂｅｃ Ｃｉｔｙ、Ｃａｎａｄａ）で誘導体化されたシリカ粒子（５．０ｇ）を、ＤＭＦ ５０ｍＬ中で、ＡＫ標識化化合物ＡＫ３（２．５ｍｇ）およびトリエチルアミン１ｍＬと、Ａｒ下で撹拌しながら一晩反応させた。混合物を濾過し、粒子をＤＭＦ、次いで１：１のＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨで洗浄した後、空気乾燥させた。出発粒子は、１．７７ｍｍｏｌ／ｇのＮＨ２×５ｇ＝８．８５ｍｍｏｌのＮＨ２を含有した。使用したＡＫ標識化合物は、２．５ｍｇ／６５９ｍｇ／ｍｍｏｌ＝３．８μｍｏｌであった。したがって、アミド結合の形成による標識の取り込みは、利用可能なＮＨ２基の０．０５％未満であった。
【０２５０】
【化１５】
【０２５１】
ＡＫ標識粒子の２５ｍｇ部分を、マイクロチューブ内で、２％のトリエチルアミンを含有するＤＭＦ １．０ｍＬに添加し、管を１０分間振盪し、溶媒をデカントした。粒子をＤＭＦで洗浄し、ＤＭＦ １．２ｍＬ中の二官能性リンカーＤＳＳ ５０ｍｇの溶液中に懸濁させた。振盪機上で３０分インキュベートした後、溶液をデカントし、粒子をＤＭＦで洗浄した。活性化された粒子を、ｐＨ８．２５のホウ酸緩衝液１．０ｍＬ中に希釈された、９．０ｍｇ／ｍＬの抗体ストック２５μＬの溶液と、４℃で２０時間反応させることによって、マウス抗−ＰＳＡ（ＭｘＰＳＡ、Ｂｅｃｋｍａｎ）に結合させた。
【０２５２】
（実施例２１）
化学発光検出およびＳＳＩＡとしてＥｔ２ＮＯＨを用いた、ヘテロジニアス（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｓ）ＰＳＡイムノアッセイ
材料
実施例１９の標識された粒子（１×ＰＢＳ中、３．３ｍｇ／ｍＬの溶液）
アッセイ緩衝液：１×ＰＢＳ中、０．２％のＢＳＡ、０．２％のスクロース、０．２％のＴｗｅｅｎ−２０
１×ＰＢＳ中、Ｅｔ２ＮＯＨの９．７３ｍＭの溶液
ＭｘＰＳＡ−ＨＲＰコンジュゲート（アッセイ緩衝液中、０．０１５２μｇ／ｍＬ）
ＰＳＡキャリブレーター：Ｓ０、Ｓ１、Ｓ５
トリガー溶液Ａ（実施例１）
１×ＰＢＳ中の０．２％のＢＳＡ、０．２％のスクロースで予めブロックした管に、標識した粒子３０μＬ、ＭｘＰＳＡ−ＨＲＰコンジュゲート３０μＬ、アッセイ緩衝液３６μＬ、ＰＳＡキャリブレーター２４μＬ、およびＥｔ２ＮＯＨ溶液２０μＬをチャージした。単一の管をルミノメーター内に配置し、コンピューター制御された注入およびデータ収集を行った。トリガー溶液Ａ（１００μＬ）を注入し、注入を最初の０．５秒遅らせて、光強度を５秒間合計した。結果は、二つ組の測定値の平均である。
【０２５３】
【表２０】
【０２５４】
本明細書におけるすべての刊行物および特許出願は、本発明が属する技術分野における通常の技術のレベルを示し、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０２５５】
上記した様々な実施形態は、例示としてのみ提供され、本発明を限定すると解釈されるべきでない。当業者は、本明細書に例示および記載された実施形態例および用途例に従うことなく、本明細書に例示および記載された実施形態例および用途例に従うことなく本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、以下の特許請求の範囲に示される本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、本発明に行うことができる様々な改変および変更を容易に認識する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の被検体のためのアッセイ法であって、
固体支持体を含み、前記固体支持体にコンジュゲートされた第１の被検体特異的結合メンバー、および前記固体支持体または第１の被検体特異的結合メンバーに連結している化学発光標識を含む、化学発光標識された、固定化された特異的結合メンバー、
第２の被検体特異的結合メンバー、および前記第２の被検体特異的結合メンバーに連結しているアクチベーターを含むアクチベーター標識特異的結合メンバー、
選択的シグナル阻害剤、および
試料
を任意の順序で、または同時に添加することによって、水溶液中で反応混合物を形成するステップであって、
前記化学発光標識された、固定化された特異的結合メンバー、および前記アクチベーター標識特異的結合メンバーは、前記試料中に存在する被検体に結合することによって、結合複合体を形成するステップと、
前記反応混合物にトリガー溶液を添加するステップであって、前記トリガー溶液は、前記反応混合物中に存在する、前記被検体が結合した結合複合体の量に相関した、検出可能な化学発光シグナルを放出するステップと
を含む方法。
【請求項２】
アクチベーター標識特異的結合メンバーが、前記被検体の類似体に連結しているアクチベーターを含み、前記被検体および前記アクチベーター標識類似体が、前記化学発光標識された、固定化された特異的結合パートナーと競合して結合する、請求項１のいずれかに記載の方法。
【請求項３】
化学発光標識特異的結合メンバーが、前記被検体の類似体である第１の被検体特異的結合メンバーを含み、前記被検体および前記化学発光標識特異的結合メンバーが、前記アクチベーター標識された、固定化された特異的結合メンバーと競合して結合する、請求項１のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
任意の順序で、または同時に、反応混合物を形成するステップが、エンハンサーをさらに含む、試料中の被検体についての、請求項１から３のいずれかに記載のアッセイ法。
【請求項５】
前記選択的シグナル阻害剤が、前記結合複合体中でない場合の化学発光標識とアクチベーターとの反応からのシグナルを超える、前記被検体との前記結合複合体中の、化学発光標識とアクチベーターとの反応によって生じる前記シグナルの割合を引き起こす、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記選択的シグナル阻害剤が、オルトまたはパラ関係に配向した少なくとも２つのヒドロキシル基を有する芳香族化合物、オルトまたはパラ関係に配向した、少なくとも１つのヒドロキシル基および１つのアミノ基を有する芳香族化合物、Ｃ−Ｃ二重結合上で置換された少なくとも２つのヒドロキシル基を有する化合物、ならびに窒素複素環式化合物からなる群から選択される、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
選択的シグナル阻害剤が、アスコルベート、イソアスコルベート、Ｔｒｏｌｏｘ、Ｌ−アスコルビン酸６−パルミテート、５，６−イソプロピリデン−Ｌ−アスコルビン酸、ＢＨＴ、グルタチオン、尿酸、トコフェロール、およびカテキンからなる群から選択される、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記化学発光標識固定特異的結合メンバーが、特異的結合メンバーに直接または間接的に連結している化学発光標識化合物を含み、前記化学発光標識が、芳香族環状ジアシルヒドラジド、トリヒドロキシ芳香族化合物、アクリダンケテンジチオアセタール化合物、アクリダンエステル、アクリダンチオエステル、アクリダンスルホンアミド、アクリダンエノール誘導体、および下記式の化合物
【化１６】
［式中、Ｒ１は、炭素原子１〜２０個のアルキル、炭素原子１〜２０個のアルケニル、炭素原子１〜２０個のアルキニル、炭素原子１〜２０個のアリール、および炭素原子１〜２０個のアラルキル基から選択され、そのいずれもカルボニル基、カルボキシル基、トリ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）シリル基、ＳＯ３−基、ＯＳＯ３−２基、グリコシル基、ＰＯ３−基、ＯＰＯ３−２基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、４級アンモニウム基、または４級ホスホニウム基から選択される１〜３個の基で置換されていてもよく、Ｘは、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、アリール、アラルキル基、１〜２０個の炭素原子を有するアルキルカルボキシル基またはアリールカルボキシル基、トリ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）シリル基、ＳＯ３−基、グリコシル基、および式ＰＯ（ＯＲ’）（ＯＲ’’）のホスホリル基（式中、Ｒ’およびＲ’’は独立してＣ１〜Ｃ８アルキル、シアノアルキル、アリールおよびアラルキル基、トリアルキルシリル基、アルカリ金属陽イオン、アルカリ土類陽イオン、アンモニウムおよびトリアルキルホスホニウム陽イオンから選択される）から選択され、Ｚ１およびＺ２はそれぞれ、ＯおよびＳ原子から選択され、Ｒ２およびＲ３は独立して、水素およびＣ１〜Ｃ８アルキルから選択される］から選択される、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記化学発光標識された、固定化された特異的結合メンバーが、特異的結合メンバーに直接または間接的に連結している化学発光標識化合物を含み、前記化学発光標識が、式
【化１７】
［式中、
【化１７−１】
は、前記化学発光標識の前記特異的結合メンバーへの結合箇所を指定し、Ｒ１およびＲ２は独立して、炭素原子１〜２０個の置換または非置換のアルキル、炭素原子１〜２０個の置換または非置換のアルケニル、炭素原子１〜２０個の置換または非置換のアルキニル、炭素原子１〜２０個の置換または非置換のアリール、および炭素原子１〜２０個の置換または非置換のアラルキル基から選択され、Ｒ１またはＲ２が置換された基である場合、これは、カルボニル基、カルボキシル基、トリ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）シリル基、ＳＯ３−基、ＯＳＯ３−２基、グリコシル基、ＰＯ３−基、ＯＰＯ３−２基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＮＨ２、４級アンモニウム基、および４級ホスホニウム基から選択される１〜３個の基で置換されていてもよく、Ｒ３は、炭素原子１〜２０個のアルキル、炭素原子１〜２０個の置換アルキル、炭素原子１〜２０個の置換または非置換のアルケニル、炭素原子１〜２０個の置換または非置換のアルキニル、炭素原子１〜２０個の置換または非置換のアリール、炭素原子１〜２０個の置換または非置換のアラルキル基や、フェニル、置換または非置換のベンジル基、アルコキシアルキル、カルボキシアルキルおよびアルキルスルホン酸基からなる群から選択され、Ｒ３が置換された基である場合、これは、カルボニル基、カルボキシル基、トリ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）シリル基、ＳＯ３−基、ＯＳＯ３−２基、グリコシル基、ＰＯ３−基、ＯＰＯ３−２基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＮＨ２、４級アンモニウム基、および４級ホスホニウム基から選択される１〜３個の基で置換されていてもよい］
の化合物である、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記アクチベーター標識特異的結合メンバーが、特異的結合メンバーに直接または間接的に連結しているアクチベーター化合物を含み、前記アクチベーター標識が、遷移金属塩、遷移金属錯体、および酵素から選択され、前記アクチベーター標識がペルオキシダーゼ活性を有する、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記アクチベーターがペルオキシダーゼ酵素である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記化学発光標識固定特異的結合メンバーおよび前記アクチベーター標識特異的結合メンバーの少なくとも１つが、可溶性タンパク質、ストレプトアビジン、アビジン、ニュートラビジン、ビオチン、陽イオン化されたＢＳＡ、ｆｏｓ、ｊｕｎ、可溶性合成デンドリマー、可溶性合成ポリマー、可溶性天然ポリマー、多糖、デキストラン、オリゴヌクレオチド、リポソーム、ミセル、およびベシクルから選択される補助物質を含む、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記エンハンサーが、ペルオキシダーゼ活性を有するアクチベーターの触媒ターンオーバーを促進する化合物または化合物の混合物である、請求項４から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記エンハンサーが、フェノール化合物、芳香族アミン、ベンゾオキサゾール、ヒドロキシベンゾチアゾール、アリールボロン酸、およびこれらの混合物から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記トリガー溶液が過酸化物化合物を含む、請求項１から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記トリガー溶液が、フェノール化合物、芳香族アミン、ベンゾオキサゾール、ヒドロキシベンゾチアゾール、アリールボロン酸、およびこれらの混合物から選択されるエンハンサーを含む、請求項１から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
試料中の被検体を検出するためのキットであって、
前記被検体のための第１の特異的結合パートナーと；
前記第１の特異的結合パートナーにコンジュゲートされる化学発光化合物と；
前記被検体のための第２の特異的結合パートナーと；
前記第２の特異的結合パートナーにコンジュゲートされるアクチベーター化合物と；
前記化学発光化合物−第１の特異的結合パートナーコンジュゲート、または第２の特異的結合パートナー−アクチベーター化合物コンジュゲートに連結している固体支持体と；
選択的シグナル阻害剤と；
トリガー溶液と
を含むキット。
【請求項１８】
前記選択的シグナル阻害剤が、オルトまたはパラ関係に配向した少なくとも２つのヒドロキシル基を有する芳香族化合物、オルトまたはパラ関係に配向した、少なくとも１つのヒドロキシル基および１つのアミノ基を有する芳香族化合物、Ｃ−Ｃ二重結合上で置換された少なくとも２つのヒドロキシル基を有する化合物、ならびに窒素複素環式化合物からなる群から選択される、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記化学発光化合物が、芳香族環状ジアシルヒドラジド、トリヒドロキシ芳香族化合物、アクリダンケテンジチオアセタール化合物、アクリダンエステル、アクリダンチオエステル、アクリダンスルホンアミド、アクリダンエノール誘導体、および下記式の化合物
【化１８】
［式中、Ｒ１は、炭素原子１〜２０個のアルキル、炭素原子１〜２０個のアルケニル、炭素原子１〜２０個のアルキニル、炭素原子１〜２０個のアリール、および炭素原子１〜２０個のアラルキル基から選択され、そのいずれもカルボニル基、カルボキシル基、トリ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）シリル基、ＳＯ３−基、ＯＳＯ３−２基、グリコシル基、ＰＯ３−基、ＯＰＯ３−２基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、４級アンモニウム基、または４級ホスホニウム基から選択される１〜３個の基で置換されていてもよく、Ｘは、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、アリール、アラルキル基、炭素原子１〜２０個を有するアルキルカルボキシル基またはアリールカルボキシル基、トリ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）シリル基、ＳＯ３−基、グリコシル基、および式ＰＯ（ＯＲ’）（ＯＲ’’）のホスホリル基（式中、Ｒ’およびＲ’’は独立して、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、シアノアルキル、アリールおよびアラルキル基、トリアルキルシリル基、アルカリ金属陽イオン、アルカリ土類陽イオン、アンモニウム陽イオンおよびトリアルキルホスホニウム陽イオンから選択される）から選択され、Ｚ１およびＺ２はそれぞれ、ＯおよびＳ原子から選択され、Ｒ２およびＲ３は独立して、水素およびＣ１〜Ｃ８アルキルから選択される］
から選択される、請求項１７または１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記化学発光標識された、固定化された特異的結合メンバーが、特異的結合メンバーに直接または間接的に連結している化学発光標識化合物を含み、前記化学発光標識が、式
【化１９】
［式中、
【化２０】
は、前記化学発光標識の前記特異的結合メンバーへの結合箇所を指定し、Ｒ１およびＲ２は独立して、炭素原子１〜２０個の置換または非置換のアルキル、炭素原子１〜２０個の置換または非置換のアルケニル、炭素原子１〜２０個の置換または非置換のアルキニル、炭素原子１〜２０個の置換または非置換のアリール、および炭素原子１〜２０個の置換または非置換のアラルキル基から選択され、Ｒ１またはＲ２が置換された基である場合、これは、カルボニル基、カルボキシル基、トリ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）シリル基、ＳＯ３−基、ＯＳＯ３−２基、グリコシル基、ＰＯ３−基、ＯＰＯ３−２基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＮＨ２、４級アンモニウム基、および４級ホスホニウム基から選択される１〜３個の基で置換されていてもよく、Ｒ３は、炭素原子１〜２０個のアルキル、炭素原子１〜２０個の置換アルキル、炭素原子１〜２０個の置換または非置換のアルケニル、炭素原子１〜２０個の置換または非置換のアルキニル、炭素原子１〜２０個の置換または非置換のアリール、炭素原子１〜２０個の置換または非置換のアラルキル基や、フェニル、置換または非置換のベンジル基、アルコキシアルキル、カルボキシアルキルおよびアルキルスルホン酸基からなる群から選択され、Ｒ３が置換された基である場合、これは、カルボニル基、カルボキシル基、トリ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）シリル基、ＳＯ３−基、ＯＳＯ３−２基、グリコシル基、ＰＯ３−基、ＯＰＯ３−２基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＮＨ２、４級アンモニウム基、および４級ホスホニウム基から選択される１〜３個の基で置換されていてもよい］
の化合物である、請求項１７または１８に記載のキット。
【請求項２１】
前記アクチベーター化合物が、遷移金属塩、遷移金属錯体、および酵素から選択され、前記アクチベーター標識がペルオキシダーゼ活性を有する、請求項１７から２０のいずれかに記載のキット。
【請求項２２】
前記トリガー溶液が、過酸化水素、尿素過酸化物、および過ホウ酸塩から選択される過酸化物を含む、請求項１７から２１のいずれかに記載のキット。
【請求項２３】
前記トリガー溶液が、フェノール化合物、芳香族アミン、ベンゾオキサゾール、ヒドロキシベンゾチアゾール、アリールボロン酸、およびこれらの混合物から選択されるエンハンサーを含む、請求項１７から２２のいずれかに記載のキット。
【請求項１】
試料中の被検体のためのアッセイ法であって、
固体支持体を含み、前記固体支持体にコンジュゲートされた第１の被検体特異的結合メンバー、および前記固体支持体または第１の被検体特異的結合メンバーに連結している化学発光標識を含む、化学発光標識された、固定化された特異的結合メンバー、
第２の被検体特異的結合メンバー、および前記第２の被検体特異的結合メンバーに連結しているアクチベーターを含むアクチベーター標識特異的結合メンバー、
選択的シグナル阻害剤、および
試料
を任意の順序で、または同時に添加することによって、水溶液中で反応混合物を形成するステップであって、
前記化学発光標識された、固定化された特異的結合メンバー、および前記アクチベーター標識特異的結合メンバーは、前記試料中に存在する被検体に結合することによって、結合複合体を形成するステップと、
前記反応混合物にトリガー溶液を添加するステップであって、前記トリガー溶液は、前記反応混合物中に存在する、前記被検体が結合した結合複合体の量に相関した、検出可能な化学発光シグナルを放出するステップと
を含む方法。
【請求項２】
アクチベーター標識特異的結合メンバーが、前記被検体の類似体に連結しているアクチベーターを含み、前記被検体および前記アクチベーター標識類似体が、前記化学発光標識された、固定化された特異的結合パートナーと競合して結合する、請求項１のいずれかに記載の方法。
【請求項３】
化学発光標識特異的結合メンバーが、前記被検体の類似体である第１の被検体特異的結合メンバーを含み、前記被検体および前記化学発光標識特異的結合メンバーが、前記アクチベーター標識された、固定化された特異的結合メンバーと競合して結合する、請求項１のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
任意の順序で、または同時に、反応混合物を形成するステップが、エンハンサーをさらに含む、試料中の被検体についての、請求項１から３のいずれかに記載のアッセイ法。
【請求項５】
前記選択的シグナル阻害剤が、前記結合複合体中でない場合の化学発光標識とアクチベーターとの反応からのシグナルを超える、前記被検体との前記結合複合体中の、化学発光標識とアクチベーターとの反応によって生じる前記シグナルの割合を引き起こす、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記選択的シグナル阻害剤が、オルトまたはパラ関係に配向した少なくとも２つのヒドロキシル基を有する芳香族化合物、オルトまたはパラ関係に配向した、少なくとも１つのヒドロキシル基および１つのアミノ基を有する芳香族化合物、Ｃ−Ｃ二重結合上で置換された少なくとも２つのヒドロキシル基を有する化合物、ならびに窒素複素環式化合物からなる群から選択される、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
選択的シグナル阻害剤が、アスコルベート、イソアスコルベート、Ｔｒｏｌｏｘ、Ｌ−アスコルビン酸６−パルミテート、５，６−イソプロピリデン−Ｌ−アスコルビン酸、ＢＨＴ、グルタチオン、尿酸、トコフェロール、およびカテキンからなる群から選択される、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記化学発光標識固定特異的結合メンバーが、特異的結合メンバーに直接または間接的に連結している化学発光標識化合物を含み、前記化学発光標識が、芳香族環状ジアシルヒドラジド、トリヒドロキシ芳香族化合物、アクリダンケテンジチオアセタール化合物、アクリダンエステル、アクリダンチオエステル、アクリダンスルホンアミド、アクリダンエノール誘導体、および下記式の化合物
【化１６】
［式中、Ｒ１は、炭素原子１〜２０個のアルキル、炭素原子１〜２０個のアルケニル、炭素原子１〜２０個のアルキニル、炭素原子１〜２０個のアリール、および炭素原子１〜２０個のアラルキル基から選択され、そのいずれもカルボニル基、カルボキシル基、トリ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）シリル基、ＳＯ３−基、ＯＳＯ３−２基、グリコシル基、ＰＯ３−基、ＯＰＯ３−２基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、４級アンモニウム基、または４級ホスホニウム基から選択される１〜３個の基で置換されていてもよく、Ｘは、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、アリール、アラルキル基、１〜２０個の炭素原子を有するアルキルカルボキシル基またはアリールカルボキシル基、トリ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）シリル基、ＳＯ３−基、グリコシル基、および式ＰＯ（ＯＲ’）（ＯＲ’’）のホスホリル基（式中、Ｒ’およびＲ’’は独立してＣ１〜Ｃ８アルキル、シアノアルキル、アリールおよびアラルキル基、トリアルキルシリル基、アルカリ金属陽イオン、アルカリ土類陽イオン、アンモニウムおよびトリアルキルホスホニウム陽イオンから選択される）から選択され、Ｚ１およびＺ２はそれぞれ、ＯおよびＳ原子から選択され、Ｒ２およびＲ３は独立して、水素およびＣ１〜Ｃ８アルキルから選択される］から選択される、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記化学発光標識された、固定化された特異的結合メンバーが、特異的結合メンバーに直接または間接的に連結している化学発光標識化合物を含み、前記化学発光標識が、式
【化１７】
［式中、
【化１７−１】
は、前記化学発光標識の前記特異的結合メンバーへの結合箇所を指定し、Ｒ１およびＲ２は独立して、炭素原子１〜２０個の置換または非置換のアルキル、炭素原子１〜２０個の置換または非置換のアルケニル、炭素原子１〜２０個の置換または非置換のアルキニル、炭素原子１〜２０個の置換または非置換のアリール、および炭素原子１〜２０個の置換または非置換のアラルキル基から選択され、Ｒ１またはＲ２が置換された基である場合、これは、カルボニル基、カルボキシル基、トリ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）シリル基、ＳＯ３−基、ＯＳＯ３−２基、グリコシル基、ＰＯ３−基、ＯＰＯ３−２基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＮＨ２、４級アンモニウム基、および４級ホスホニウム基から選択される１〜３個の基で置換されていてもよく、Ｒ３は、炭素原子１〜２０個のアルキル、炭素原子１〜２０個の置換アルキル、炭素原子１〜２０個の置換または非置換のアルケニル、炭素原子１〜２０個の置換または非置換のアルキニル、炭素原子１〜２０個の置換または非置換のアリール、炭素原子１〜２０個の置換または非置換のアラルキル基や、フェニル、置換または非置換のベンジル基、アルコキシアルキル、カルボキシアルキルおよびアルキルスルホン酸基からなる群から選択され、Ｒ３が置換された基である場合、これは、カルボニル基、カルボキシル基、トリ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）シリル基、ＳＯ３−基、ＯＳＯ３−２基、グリコシル基、ＰＯ３−基、ＯＰＯ３−２基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＮＨ２、４級アンモニウム基、および４級ホスホニウム基から選択される１〜３個の基で置換されていてもよい］
の化合物である、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記アクチベーター標識特異的結合メンバーが、特異的結合メンバーに直接または間接的に連結しているアクチベーター化合物を含み、前記アクチベーター標識が、遷移金属塩、遷移金属錯体、および酵素から選択され、前記アクチベーター標識がペルオキシダーゼ活性を有する、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記アクチベーターがペルオキシダーゼ酵素である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記化学発光標識固定特異的結合メンバーおよび前記アクチベーター標識特異的結合メンバーの少なくとも１つが、可溶性タンパク質、ストレプトアビジン、アビジン、ニュートラビジン、ビオチン、陽イオン化されたＢＳＡ、ｆｏｓ、ｊｕｎ、可溶性合成デンドリマー、可溶性合成ポリマー、可溶性天然ポリマー、多糖、デキストラン、オリゴヌクレオチド、リポソーム、ミセル、およびベシクルから選択される補助物質を含む、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記エンハンサーが、ペルオキシダーゼ活性を有するアクチベーターの触媒ターンオーバーを促進する化合物または化合物の混合物である、請求項４から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記エンハンサーが、フェノール化合物、芳香族アミン、ベンゾオキサゾール、ヒドロキシベンゾチアゾール、アリールボロン酸、およびこれらの混合物から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記トリガー溶液が過酸化物化合物を含む、請求項１から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記トリガー溶液が、フェノール化合物、芳香族アミン、ベンゾオキサゾール、ヒドロキシベンゾチアゾール、アリールボロン酸、およびこれらの混合物から選択されるエンハンサーを含む、請求項１から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
試料中の被検体を検出するためのキットであって、
前記被検体のための第１の特異的結合パートナーと；
前記第１の特異的結合パートナーにコンジュゲートされる化学発光化合物と；
前記被検体のための第２の特異的結合パートナーと；
前記第２の特異的結合パートナーにコンジュゲートされるアクチベーター化合物と；
前記化学発光化合物−第１の特異的結合パートナーコンジュゲート、または第２の特異的結合パートナー−アクチベーター化合物コンジュゲートに連結している固体支持体と；
選択的シグナル阻害剤と；
トリガー溶液と
を含むキット。
【請求項１８】
前記選択的シグナル阻害剤が、オルトまたはパラ関係に配向した少なくとも２つのヒドロキシル基を有する芳香族化合物、オルトまたはパラ関係に配向した、少なくとも１つのヒドロキシル基および１つのアミノ基を有する芳香族化合物、Ｃ−Ｃ二重結合上で置換された少なくとも２つのヒドロキシル基を有する化合物、ならびに窒素複素環式化合物からなる群から選択される、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記化学発光化合物が、芳香族環状ジアシルヒドラジド、トリヒドロキシ芳香族化合物、アクリダンケテンジチオアセタール化合物、アクリダンエステル、アクリダンチオエステル、アクリダンスルホンアミド、アクリダンエノール誘導体、および下記式の化合物
【化１８】
［式中、Ｒ１は、炭素原子１〜２０個のアルキル、炭素原子１〜２０個のアルケニル、炭素原子１〜２０個のアルキニル、炭素原子１〜２０個のアリール、および炭素原子１〜２０個のアラルキル基から選択され、そのいずれもカルボニル基、カルボキシル基、トリ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）シリル基、ＳＯ３−基、ＯＳＯ３−２基、グリコシル基、ＰＯ３−基、ＯＰＯ３−２基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、４級アンモニウム基、または４級ホスホニウム基から選択される１〜３個の基で置換されていてもよく、Ｘは、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、アリール、アラルキル基、炭素原子１〜２０個を有するアルキルカルボキシル基またはアリールカルボキシル基、トリ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）シリル基、ＳＯ３−基、グリコシル基、および式ＰＯ（ＯＲ’）（ＯＲ’’）のホスホリル基（式中、Ｒ’およびＲ’’は独立して、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、シアノアルキル、アリールおよびアラルキル基、トリアルキルシリル基、アルカリ金属陽イオン、アルカリ土類陽イオン、アンモニウム陽イオンおよびトリアルキルホスホニウム陽イオンから選択される）から選択され、Ｚ１およびＺ２はそれぞれ、ＯおよびＳ原子から選択され、Ｒ２およびＲ３は独立して、水素およびＣ１〜Ｃ８アルキルから選択される］
から選択される、請求項１７または１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記化学発光標識された、固定化された特異的結合メンバーが、特異的結合メンバーに直接または間接的に連結している化学発光標識化合物を含み、前記化学発光標識が、式
【化１９】
［式中、
【化２０】
は、前記化学発光標識の前記特異的結合メンバーへの結合箇所を指定し、Ｒ１およびＲ２は独立して、炭素原子１〜２０個の置換または非置換のアルキル、炭素原子１〜２０個の置換または非置換のアルケニル、炭素原子１〜２０個の置換または非置換のアルキニル、炭素原子１〜２０個の置換または非置換のアリール、および炭素原子１〜２０個の置換または非置換のアラルキル基から選択され、Ｒ１またはＲ２が置換された基である場合、これは、カルボニル基、カルボキシル基、トリ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）シリル基、ＳＯ３−基、ＯＳＯ３−２基、グリコシル基、ＰＯ３−基、ＯＰＯ３−２基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＮＨ２、４級アンモニウム基、および４級ホスホニウム基から選択される１〜３個の基で置換されていてもよく、Ｒ３は、炭素原子１〜２０個のアルキル、炭素原子１〜２０個の置換アルキル、炭素原子１〜２０個の置換または非置換のアルケニル、炭素原子１〜２０個の置換または非置換のアルキニル、炭素原子１〜２０個の置換または非置換のアリール、炭素原子１〜２０個の置換または非置換のアラルキル基や、フェニル、置換または非置換のベンジル基、アルコキシアルキル、カルボキシアルキルおよびアルキルスルホン酸基からなる群から選択され、Ｒ３が置換された基である場合、これは、カルボニル基、カルボキシル基、トリ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）シリル基、ＳＯ３−基、ＯＳＯ３−２基、グリコシル基、ＰＯ３−基、ＯＰＯ３−２基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＮＨ２、４級アンモニウム基、および４級ホスホニウム基から選択される１〜３個の基で置換されていてもよい］
の化合物である、請求項１７または１８に記載のキット。
【請求項２１】
前記アクチベーター化合物が、遷移金属塩、遷移金属錯体、および酵素から選択され、前記アクチベーター標識がペルオキシダーゼ活性を有する、請求項１７から２０のいずれかに記載のキット。
【請求項２２】
前記トリガー溶液が、過酸化水素、尿素過酸化物、および過ホウ酸塩から選択される過酸化物を含む、請求項１７から２１のいずれかに記載のキット。
【請求項２３】
前記トリガー溶液が、フェノール化合物、芳香族アミン、ベンゾオキサゾール、ヒドロキシベンゾチアゾール、アリールボロン酸、およびこれらの混合物から選択されるエンハンサーを含む、請求項１７から２２のいずれかに記載のキット。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３】
【公表番号】特表２０１２−５１９２８４（Ｐ２０１２−５１９２８４Ａ）
【公表日】平成２４年８月２３日（２０１２．８．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５５２１９９（Ｐ２０１１−５５２１９９）
【出願日】平成２２年２月２６日（２０１０．２．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２５６４５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０９９４７９
【国際公開日】平成２２年９月２日（２０１０．９．２）
【出願人】（５１０００５８８９）ベックマン コールター， インコーポレイテッド (174)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年８月２３日（２０１２．８．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月２６日（２０１０．２．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２５６４５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０９９４７９
【国際公開日】平成２２年９月２日（２０１０．９．２）
【出願人】（５１０００５８８９）ベックマン コールター， インコーポレイテッド (174)
【Ｆターム（参考）】
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