遺伝子の検出方法
【課題】操作が簡便で、可視領域で測定が可能な遺伝子の検出方法を提供すること。
【解決手段】ホスホリルコリン基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する不溶性担体にＤＮＡ鎖を固定化させて、検出対象のＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片をハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしたＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片に酵素を導入し、酵素の働きにより発色試薬を発色させ、発色の度合いにより検出対象のＤＮＡ断片又はＲＮＡの断片の含有状況を判定する遺伝子の検出方法。
【解決手段】ホスホリルコリン基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する不溶性担体にＤＮＡ鎖を固定化させて、検出対象のＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片をハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしたＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片に酵素を導入し、酵素の働きにより発色試薬を発色させ、発色の度合いにより検出対象のＤＮＡ断片又はＲＮＡの断片の含有状況を判定する遺伝子の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ鎖を所定の担体表面に固定化して、固定化したＤＮＡ鎖とハイブリダイズしたＤＮＡ断片又はＲＮＡ断片の有無および量を可視光領域で判定する遺伝子の検出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子の発現状況や、菌やウィルスの同定等遺伝子を用いた検出や診断が生化学の分野では、日常に行なわれている。従来遺伝子の検出には、電気泳動による方法が行なわれてきたが、近年になってＤＮＡマイクロアレイにより複数の遺伝子を同時にみることが行なわれている。
従来からの電気泳動による方法では、ＰＣＲによる増幅反応や電気泳動時間等検出までに時間を要し、また電気泳動の操作に煩わしさがある。
また、マイクロアレイによる遺伝子検出においては、検出に高価な蛍光試薬を使用しなければならず、また検出にマイクロアレイ専用の高価な検出機を必要とし、使用も研究分野の一部の研究機関に限られ、臨床の検査分野や、食品検査等の分野ではなかなか使用されるまでいたっていない。
【０００３】
上記、問題を解決するために、可視による遺伝子の検出方法が、特許文献１に開示されている。本特許文献に記載されている方法は、ＬＡＭＰ法により遺伝子の増幅を行い、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉなどインターカレーターを用いて可視化を行うものであるが、本方法では、検出目的となる遺伝子の有無は判るが、検体中に存在する遺伝子の量の比較を行うことはできない。
【特許文献１】特開２００４−１５４００８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、操作が簡便で、可視領域における測定が可能な定量性のある、遺伝子の検出方法を提供することにある。
本発明者らは、表面に所定の高分子物質を有する担体を用いることにより、ハイブリダイズの効率が高くかつ高い酵素反応効率により、発色効率が高く、感度の高い可視化による検出が可能であることを見出し本発明の完成に至った。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、
（１）ホスホリルコリン基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する不溶性担体を用いて、
（ａ）前記不溶性担体表面にＤＮＡ鎖を固定化させてＤＮＡ固定化担体を作製する工程、
（ｂ）前記ＤＮＡ固定化担体上に遺伝子のＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片を含有する溶液を添加し、前記ＤＮＡ鎖とハイブリダイズさせる工程、
（ｃ）ハイブリダイズしたＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片に酵素を標識する工程、
（ｄ）発色基質を含有する溶液を添加し前記酵素の反応により発色基質を発色させる工程、
を含み、発色の度合いにより工程（ｂ）における溶液中のＤＮＡ断片又はＲＮＡの含有状況を判定することを特徴とする遺伝子の検出方法、
（２）工程（ｂ）においてＤＮＡ断片又はＲＮＡ断片に予めビオチンが標識されていて、工程（ｃ）において酵素標識されたアビジンを含む溶液を担体表面に接触させて、
ＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片に酵素を標識するものである（１）記載の遺伝子の検出方法、
（３）ＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片に標識される酵素が酸化又は還元酵素である（１）又は（２）記載の遺伝子の検出方法、
（４）標識される酵素が、ペルオキシダーゼ又はアルカリフォスファターゼである（１）〜（３）いずれか記載の遺伝子の検出方法、
（５）工程（ａ）においてＤＮＡ鎖が、前記担体表面のカルボン酸誘導基の部位で共有結合して、前記担体表面に固定化されるものである（１）〜（４）いずれか記載の遺伝子の検出方法、
（６）前記高分子物質が更にブチルメタクリレート基を含む第三単位を有するものである（１）〜（５）いずれか記載の遺伝子の検出方法、
（７）前記担体表面に前記高分子物質に加えて、ホスホリルコリン基を含む第一単位と、ブチルメタクリレート基を含む第三単位とを有する第二の高分子物質を有する（１）〜（６）いずれか記載の遺伝子の検出方法、
（８）前記担体がプラスチック材料からなるものである（１）〜（７）いずれか記載の遺伝子の検出方法、
（９）発色した色素がＤＮＡ断片およびその近傍の担体表面に付着し、色素の付着の度合いを色の濃さとして測定することを特徴とする（１）〜（８）いずれか記載の遺伝子の検出方法、
（１０）前記担体が板状をなし、板状表面に前記ＤＮＡ鎖がスポット状に点着し固定されていることを特徴とする（９）記載の遺伝子の検出方法。
（１１）発色の度合いを吸光により測定することを特徴とする（１）〜（８）いずれか記載の遺伝子の検出方法、
である。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の検出方法によれば、電気泳動などの操作をすることなく簡便に、かつ、蛍光色素を用いることなく、可視領域で、特別な読み取り装置を用いることなく、遺伝子の検出が可能となる、さらに従来の遺伝子の有無の判定のみならず、定量することも可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の遺伝子の検出方法は、ホスホリルコリン基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合して活性化されたカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する担体に、ＤＮＡ鎖を固定化させ、サンプル中のＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片鎖をハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしたＤＮＡ断片鎖またはＲＮＡ断片鎖に酵素標識を施し、酵素反応により発色基質を発色させ、可視領域によりサンプル中の検出対象となるＤＮＡまたはＲＮＡ配列の有無の判定および定量を行うことを特徴とする。
【０００８】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
【０００９】
先ず、担体の表面にＤＮＡ鎖を固定させる。
【００１０】
ここで使用される担体に表面には、ホスホリルコリン基を有する第一単位とカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質が存在するようになっている。
【００１１】
このホスホリルコリン基を含む第一単位とカルボン酸誘導基を含む第二単位とを有する高分子物質は、ＤＮＡ鎖およびＲＮＡ鎖の非特異的吸着を抑制する性質とＤＮＡ鎖を固定化する性質とを併せ持つポリマーである。特に、第一単位に含まれるホスホリルコリン基は鋳型ＲＮＡ断片の非特異的吸着を抑制する役割を果たし、第二単位に含まれるカルボン酸誘導基はＤＮＡ鎖を化学的に固定化する役割を果たす。すなわち、プライマーは、前記このコーティング層の活性エステル基の部位で共有結合して、当該担体の表面に固定化される。
【００１２】
第一の単位は、たとえば、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基、６−メタクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン基等の（メタ）アクリロイルオキシアルキルホスホリルコリン基；
２−メタクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン基および１０−メタクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン基等の（メタ）アクリロイルオキシアルコキシアルキルホスホリルコリン基；
アリルホスホリルコリン基、ブテニルホスホリルコリン基、ヘキセニルホスホリルコリン基、オクテニルホスホリルコリン基、およびデセニルホスホリルコリン基等のアルケニルホスホリルコリン基；
等の基を有し、ホスホリルコリン基がこれらの基中に含まれている構成とすることができる。
【００１３】
また、これらの基のうち、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが好ましい。第一単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを有する構成とすることにより、担体表面におけるＲＮＡ断片の非特異的吸着をより一層確実に抑制することができる。
【００１４】
カルボン酸誘導体は、カルボン酸のカルボキシル基が活性化されたものであり、Ｃ＝Ｏを介して脱離基を有するカルボン酸である。カルボン酸誘導体は、具体的には、アルコキシル基よりも電子求引性の高い基がカルボニル基に結合して求核反応が活性化された化合物である。カルボン酸誘導基は、アミノ基、チオール基、水酸基等に対する反応性を有する化合物である。
【００１５】
活性化されたカルボン酸誘導体として、さらに具体的には、カルボン酸であるアクリル酸、メタクリル酸、クロトン酸、マレイン酸、フマル酸などのカルボキシル基が、酸無水物、酸ハロゲン化物、活性エステル、活性化アミドに変換された化合物が挙げられる。カルボン酸誘導基は、こうした化合物に由来する活性化された基であり、たとえば、ｐ−ニトロフェニル基やＮ−ヒドロキシスクシンイミド基等の活性エステル基；
―Ｃｌ、−Ｆ等のハロゲン；
等の基を有することができる。
【００１６】
また、カルボン酸誘導基は、下記式（１）に示される基とすることができる。
【００１７】
【化１】
（ただし、上記式（１）において、Ａは水酸基を除く脱離基である。）
【００１８】
上記式（１）に示される一価の基は、たとえば下記式（ｐ）または式（ｑ）から選択されるいずれかの基とすることができる。
【００１９】
【化２】
【００２０】
（ただし、上記式（ｐ）および式（ｑ）において、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して、一価の有機基であり、直鎖状、分岐状、および環状のいずれであってもよい。また、上記式（ｐ）において、Ｒ1はＣとともに環を形成する二価の基であってもよい。また、上記式（ｑ）において、Ｒ2はＮとともに環を形成する二価の基であってもよい。）
【００２１】
上記式（ｐ）に示される基として、たとえば下記式（ｒ）、（ｓ）、および（ｗ）に示される基が挙げられる。また、上記式（ｑ）に示される基として、たとえば下記式（ｕ）に示される基が挙げられる。
【００２２】
上記式（１）に示される基は、たとえば下記式（ｒ）、式（ｓ）等に示される酸無水物由来の基；
下記式（ｔ）に示される酸ハロゲン化物由来の基；
下記式（ｕ）、式（ｗ）に示される活性エステル由来の基；または
下記式（ｖ）に示される活性化アミド由来の基とすることができる。
【化３】
【００２３】
カルボン酸誘導基のうち、活性エステル基は、穏やかな条件における反応性に優れるため、好ましく用いられる。穏やかな条件としては、たとえば中性またはアルカリ性の条件、具体的にはｐＨ７．０以上１０．０以下、さらに具体的にはｐＨ７．６以上９．０以下、さらにまた具体的にはｐＨ８．０とすることができる。
【００２４】
また、本明細書において規定するところの「活性エステル基」は、その定義について厳密な規定はなされていないが、慣用の技術表現としては、エステル基のアルコール側に酸性度の高い電子求引性基を有して求核反応を活性化するエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基を意味するものとして、各種の化学合成、たとえば高分子化学、ペプチド合成等の分野で慣用されているものである。なお、ペプチド合成の分野においては、泉屋信夫、加藤哲夫、青柳東彦、脇道典著、「ペプチド合成の基礎と実験」、１９８５年発行、丸善、に記載されているように、活性エステル法はアミノ酸またはペプチドのＣ末端を活性化する方法の一つとして用いられている。
【００２５】
実際的には、エステル基のアルコール側に、電子求引性の基を有し、アルキルエステルよりも活性化されたエステル基である。活性エステル基は、アミノ基、チオール基、水酸基等の基に対する反応性を有する。さらに具体的には、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、Ｎ−ヒドロキシアミンエステル類、シアノメチルエステル、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有する活性エステル基として知られている。
【００２６】
ここでは、高分子物質中の活性化カルボン酸誘導体基が活性エステル基である場合を例に、説明する。活性エステル基としては、たとえばｐ−ニトロフェニル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、コハク酸イミド基、フタル酸イミド基、5−ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド基等が挙げられるが、たとえばｐ−ニトロフェニル基が好ましく用いられる。
【００２７】
表面にプライマーが固定化される担体の場合、第一単位と第二単位のさらに具体的な構成の組み合わせとして、たとえば、ホスホリルコリン基を含む第一単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を有し、活性エステル基がｐ−ニトロフェニル基である構成とすることができる。
【００２８】
また、本実施形態の担体のコーティング層に使用される高分子物質は、ホスホリルコリン基およびカルボン酸誘導基以外に他の基を含んでもよい。また、高分子物質は共重合体とすることができる。具体的には、高分子物質がブチルメタクリレート基を含む共重合体であることが好ましい。こうすることにより、高分子物質を適度に疎水化し、この高分子物質の担体表面への吸着性をさらに好適に確保することができる。
【００２９】
具体的には、高分子物質を、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）基を有する第一単量体と、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート（ＮＰＭＡ）基を有する第二単量体と、ブチルメタリレート（ＢＭＡ）基を有する第三単量体との共重合体とすることができる。これらの共重合体であるｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＢＭＡ−ｃｏ−ＮＰＭＡ）（ＰＭＢＮ）は、模式的に下記一般式（２）で示される。
【００３０】
【化４】
２−メタクリロイルオキシホスホリルコリンおよびｎ−ブチルメタクリレートおよびｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレートよりなる重合体ポリマー
【００３１】
ただし、上記一般式（２）において、ａ、ｂ、およびｃは、それぞれ独立して、正の整数である。また、上記一般式（２）において、第一〜第三単量体がブロック共重合していてもよいし、これらの単量体がランダムに共重合していてもよい。
【００３２】
上記一般式（２）で示される共重合体は、高分子物質の適度な疎水化と、ハイブリダイズさせるＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片の非特異吸着を抑制する性質と、ＤＮＡ鎖を固定化する性質とのバランスとに、より一層優れた構成である。このため、このような共重合体を用いることにより、担体表面をより一層確実に高分子物質で被覆するとともに、高分子物質がコーティングされた担体上へのサンプルＤＮＡ又はＲＮＡ断片の非特異的吸着を抑制しつつ、ＤＮＡ鎖をさらに確実に共有結合により固定化して担体上に導入することができる。
【００３３】
なお、上記一般式（２）で示される共重合体は、ＭＰＣ、ＢＭＡ、およびＮＰＭＡの各単量体を混合し、ラジカル重合等の公知の重合方法により得ることができる。上記一般式（２）で示される共重合体をラジカル重合により作製する場合、たとえば、Ａｒ等の不活性ガス雰囲気にて、３０℃以上９０℃以下の温度条件で溶液重合を行うことができる。
【００３４】
溶液重合に使用される溶媒は適宜選択されるが、たとえば、メタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコールや、ジエチルエーテル等のエーテル、クロロホルム等の有機溶媒を単独でまたは複数混合して用いることができる。具体的には、ジエチルエーテルとクロロホルムを体積比で８対２とした混合溶媒とすることができる。
【００３５】
また、ラジカル重合反応に使用されるラジカル重合開始剤としては、通常使用されるものを用いることができる。たとえば、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、アゾビスバレロニトリル等のアゾ系開始剤；
過酸化ラウロイル、過酸化ベンゾイル、ｔ−ブチルペルオキシネオデカノエート、ｔ−ブチルペルオキシピバレート等の油溶性の有機過酸化物；
などが用いられる。
【００３６】
さらに具体的には、ジエチルエーテルとクロロホルムを体積比で８対２とした混合溶媒およびＡＩＢＮを用い、Ａｒ中、６０℃にて２〜６時間程度重合を行うことができる。
【００３７】
なお、本実施形態では、高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を有する例を説明したが、ホスホリルコリン基を含む第一単位とカルボン酸誘導基を含む第二単位とを有する高分子物質を第一の高分子物質とし、これに加えて、ホスホリルコリン基を含む第一単位とブチルメタクリレート基を含む第三単位とを有する第二の高分子物質を含んでいてもよい。
【００３８】
なお、上記第一の高分子物質の第一単位と上記第二の高分子物質の第一単位とは同一構造であってもよいし、異なる構造であってもよい。また、上記第一の高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を含むとき、この第一の高分子物質の第三単位と上記第二の高分子物質の第三単位とは同一構造であってもよいし、異なる構造であってもよい。
【００３９】
このような第二の高分子物質は、鋳型ＤＮＡ断片の非特異的吸着を抑制するポリマーとして用いられる。このようなポリマーとしては、たとえばホスホリルコリン基が３０モル％、ブチルメタクリレート基が７０モル％の割合で含まれているものであるＭＰＣポリマー（日本油脂社製）を用いることができる。
【００４０】
なお、高分子物質が上記第一の高分子物質、第二の高分子物質からなる場合、これらの高分子物質が混合されている構成とすることができる。各々の高分子物質のポリマーは、たとえばエタノール溶液に溶解できるため、それぞれのポリマー溶液を混合することにより容易に混合ポリマーを得ることができる。
【００４１】
以上のような高分子物質からなるコーティング層を表面に含む担体は、所定の形状に加工された担体の表面に高分子物質を含む液体を塗布し、乾燥することにより得られる。また、高分子物質を含む液体中に担体を浸漬し、乾燥してもよい。
【００４２】
また、担体として、プラスチック材料を用いた場合には、形状やサイズの変更に対する柔軟性が確保される上に、ガラス基板のものに比べて安価で提供することができるという観点から好ましい。このようなプラスチック材料としては、表面処理の容易性および量産性の観点から、熱可塑性樹脂を用いることができる。
【００４３】
熱可塑性樹脂としては、ある程度耐熱性があれば特に制限はない、耐熱性のある樹脂としてたとえば、ポリエチレン、ポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン；環状ポリオレフィン；含フッ素樹脂；
等を用いることができる。上記樹脂の中でも、飽和環状ポリオレフィンは、耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、透明性および成形性に特に優れるため、光学的な分析に好適であり、担体の材料として好ましく用いられる。
【００４４】
以上のような高分子物質を表面に含むプラスチック材料からなる担体は、所定の形状に加工された担体の表面に高分子物質を含む液体を塗布し、乾燥することにより得られる。また、高分子物質を含む液体中に担体を浸漬し、乾燥してもよい。
【００４５】
なお、担体の材料をプラスチックとした場合、形状は板状には限られず、９６穴や３８４穴に代表されるマイクロタイタープレートの形状、スライドグラスに代表される基板状のもの、またビーズ状のもの、あるいはシート状のもの等特が上げられる。
【００４６】
次に、担体の表面へのＤＮＡ鎖の固定化方法について説明する。
例えば、（ｉ）担体上の高分子物質に含まれる複数の活性エステル基のうち、少なくとも一部の活性エステル基とプライマーとを反応させて共有結合を形成させることにより、担体表面でプライマーを固定化し、続いて（ｉｉ）プライマーを固定化した以外の担体表面の活性エステル基を不活性化する、すなわち残りの活性エステル基を不活性化することにより、プライマーを担体の表面に固定することができる。以下、それぞれの工程について説明する。
【００４７】
上記工程（ｉ）において、担体形状が、基板状の場合は、ＤＮＡ鎖を基板上に固定化する際には、ＤＮＡ鎖を溶解または分散した液体を点着する方法が好ましい。高分子物質に含まれる活性エステル基の一部がＤＮＡと反応して、ＤＮＡの間で共有結合が形成される。
【００４８】
このＤＮＡを溶解または分散した液体は、例えば中性からアルカリ性、例えばｐＨが７．６以上とすることができる。
【００４９】
また、点着後、担体表面に固定化されなかったＤＮＡを除去するため、純水や緩衝液で洗浄してもよい。
【００５０】
また、上記工程（ｉｉ）に示したように、洗浄後はＤＮＡを固定化した以外のプラスチック担体表面の活性エステルの不活性化処理をアルカリ化合物、あるいは一級アミノ基を有する化合物で行う。
【００５１】
アルカリ化合物としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、ホウ酸ナトリウム、水酸化リチウム、リン酸カリウムなどを用いることができる。
【００５２】
一級アミノ基を有する化合物としては、グリシン、９−アミノアクアジン、アミノブタノール、４−アミノ酪酸、アミノカプリル酸、アミノエタノール、５−アミノ２，３−ジヒドロー１，４−ペンタノール、アミノエタンチオール塩酸塩、アミノエタンチオール硫酸、２−（２−アミノエチルアミノ）エタノール、リン酸二水素２−アミノエチル、硫酸水素アミノエチル、４−（２−アミノエチル）モルホリン、５-アミノフルオレセイン、６−アミノヘキサン酸、アミノヘキシルセルロース、ｐ−アミノ馬尿酸、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、５−アミノイソフタル酸、アミノメタン、アミノフェノール、２−アミノオクタン、２−アミノオクタン酸、１−アミノ２−プロパノール、３−アミノ−１−プロパノール、３−アミノプロペン、３−アミノプロピオニトリル、アミノピリジン、１１−アミノウンデカン酸、アミノサリチル酸、アミノキノリン、４−アミノフタロニトリル、３−アミノフタルイミド、ｐ−アミノプロピオフェノン、アミノフェニル酢酸、アミノナフタレンなどを用いることができる。これらのうち、アミノエタノール、グリシンを用いることが好ましい。
【００５３】
また、担体に固定化するＤＮＡ鎖は、塩基数が１００以下のオリゴＤＮＡを用いることが好ましいが、無修飾のオリゴＤＮＡを用いても固定化が可能であり、さらには、アミノ基を導入しておくとオリゴＤＮＡの固定化効率が高くなる。アミノ基は活性エステル基との反応性に優れるため、アミノ基が導入されたオリゴＤＮＡを用いることにより、効率よくかつ強固に担体の表面上にプライマーを固定化することができる。アミノ基の導入位置はＤＮＡ鎖の分子鎖末端あるいは側鎖であってもよいが、分子鎖末端に導入されていることが、相補的なＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片とのハイブリダイズをより一層効率よく行うことができるという観点からは、好ましい。
【００５４】
以上により、担体の表面上にＤＮＡ鎖が固定化されたアレイが得られる。
【００５５】
次に、担体の表面に固定化されたＤＮＡ鎖にハイブリダイズさせるＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片を含むサンプル溶液を準備する。
【００５６】
以下、ＤＮＡサンプル溶液の調製例について記載する。
細胞中の遺伝子の発現状況をみる場合、細胞から全ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ法によりＤＮＡを増幅しサンプル溶液とする。ＰＣＲによるＤＮＡ鎖の増幅の際、ビオチン標識を施した塩基を用いることにより、ビオチン標識したＤＮＡ鎖を得る。このビオチン標識されたＤＮＡ鎖を含む溶液をサンプル溶液とする。
【００５７】
次に、上記サンプル溶液を上記ＤＮＡ鎖を固定化した担体表面に供給し、ハイブリダイゼーションを行う。これにより、担体表面に固定化されたＤＮＡ鎖と相補するサンプル溶液中のＤＮＡ鎖の一部がハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション後、例えば0.1%SDS含有2XSSC溶液、0.2XSSC溶液、0.02XSSCに順に浸漬し洗浄を行ってハイブリダイゼーション作業を終了する。
【００５８】
本発明では、発色試薬を発色させる酵素を導入し、導入した酵素により発色基質を発色することを特徴とする。以下酵素導入から発色についての一例を記載する。
【００５９】
上記、ハイブリダイゼーション終了後、酵素を標識したアビジンを含む溶液を供給し、いわゆるビオチン−アビジン反応により、ハイブリダイズしたＤＮＡ断片に酵素が導入される。導入する酵素として発色試薬を発色させる酵素が選択され、発色試薬に何を用いるかによるが、ペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼは、従来から発色試薬用酵素として使用されており、これらを用いることは、発色試薬の入手のしやすさを考慮すると好適である。
【００６０】
発色試薬としては、ウェスタンブロットなどのメンブレンの発色によく用いられるNBT/BICP発色試薬やELISAの分野での発色によく用いられるTMBZ、OPDなどを用いることができる。
【００６１】
発色試薬による発色の度合いは、ハイブリダイズしたＤＮＡ断片に導入された酵素量、すなわちＤＮＡ断片の量に応じたものとなる。NBT/BICP発色試薬は、ハイブリダイズしたＤＮＡ断片や固定化しておいたＤＮＡ鎖に付着し、ＤＮＡ鎖を点着した部分が着色する。この着色像を目視で確認し、検出対象となる遺伝子の有無を確認できる。また、この着色像を画像スキャナーやCCDカメラにより取り込み、画像処理ソフト（例えばNIHイメージなど）で発色の度合いを数値化し、検出対象となる遺伝子量を比較することが出来る。
【００６２】
また、担体としてELISAに用いる９６穴のマイクロタイタープレートを用いることによって、EKISAと同様にマイクロプレートリーダーにより吸光度による測定も可能である。また、近年、1μｌ程度の試料溶液で吸光度の測定が可能な分光吸光光度計も市販されており、担体に微細流路や微細ウェルを有するものを用いて吸光度を測定し、検出対象となる遺伝子量を比較することができる。
【実施例】
【００６３】
（PMBNコート基板の作製）
飽和環状ポリオレフィン樹脂（５−メチル−２ノルボルネンの開環重合体の水素添加物
、ＭＦＲ（Melt flow rate）：２１ｇ/１０分、水素添加率：実質的に１００％、熱変形
温度１２３℃）を用い、射出成形によりスライドガラス形状の基板を得た。この基板を２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−p−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート共重合体（ｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＢＭＡ−ｃｏ−ＮＰＭＡ）（ＰＭＢＮ）、各基は、モル％で２５：７４：１）の０．５重量％エタノール溶液に浸漬することにより、基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を導入して、プラスチック基板（PMBNコート基板）を得た。
【００６４】
（アルデヒド基板の作製）
飽和環状ポリオレフィン樹脂（５−メチル−２ノルボルネンの開環重合体の水素添加物、ＭＦＲ：２１ｇ／１０分、水素添加率：実質的に１００％、熱変形温度温度：１２３℃）を用い、射出成形によりスライドグラス状の基板を得た。この成形物に低温酸素プラズマ処理により表面に親水化処理を施した。次に、アミノアルキルシランとしてγ−アミノプロピルトリエトキシシランをメタノール中に５重量％の濃度で溶解させたものをアミノ基導入処理液として調製し、この溶液の中に２時間浸漬の後、基板を溶液から取り出し、超純水中に浸漬し放置後基板を取り出し乾燥した。グルタルアルデヒドをＰＢＳ（−）中に２重量％の濃度で溶解させてグルタルアルデヒド溶液を調製し、アミノアルキルシラン処理を行なった基板をグルタルアルデヒド溶液中に浸漬し、４時間放置した後、基板を取り出して超純水中に浸漬し、洗浄乾燥した。これにより、表面にアルデヒド基を有するアルデヒド基板を得た。
【００６５】
（基板へのＤＮＡの固定）
配列ACTCCCGGATTGCGCのDNA鎖（１５塩基）、配列AAACTCCCGGATTGCGCTCCのDNAプライマー（２０塩基）、配列TGTAAACTCCCGGATTGCGCTCCCTのDNAプライマー（２５塩基）を０．２５Ｍ炭酸バッファ（ｐＨ９．０）を用いて溶解し、１０μＭのオリゴＤＮＡ溶液を調製した。この溶液をスポッタ（日立ソフトウェアーエンジニアリング製Marks-I）を用い、１００μｍ径クロスカットピンでPNBNコート基板およびアルデヒド基板の表面上に、それぞれスポットした。オリゴＤＮＡをスポットした各基板を、２００μｌの０．２５Ｍリン酸バッファ（ｐＨ８．５）で内部を湿らせた密閉容器（１０ｃｍ×１５ｃｍ×３ｃｍ）中で一昼夜放置して、オリゴＤＮＡを固定化させた。その後、各々の基板について、ブロッキング処理を施した。
【００６６】
（ハイブリダイゼーション）
ＤＮＡ断片として、ビオチン標識した配列AAGGCGGGAGGGAGCGCAATCCGGGAGTTTACAAATGGACAAACTTCTAT ５０塩基のＤＮＡ断片の濃度が０．２μＭとなるように溶液を調製した。このＤＮＡ溶液を上記オリゴＤＮＡ固定化済み基板上に供給し、ＤＮＡマイクロアレイ用ハイブリダイゼーション用チャンバーにより密閉状態とした。続いて、６５℃３時間放置し、ハイブリダイゼーションを行い。0.1%SDS含有2XSSC溶液、0.2XSSC溶液、0.02XSSCに順に浸漬して洗浄を行った。
【００６７】
（発色反応）
上記ハイブリダイゼーションの後、ストレプトアビジンを標識したアルカリフォスファターゼを１００ｍMリン酸buffer(pH7.0)にて希釈し、基板表面に展開し、３７℃３０分間
放置し、2XSSC溶液、0.2XSSC溶液、0.02XSSCに順に浸漬し洗浄を行った後、BCIP/NBT溶液（パーキンエルマーNEL937）を基板表面に供給し、３０分間放置した後、0.2XSSCに浸漬し洗浄した。
アルデヒド基板ではＤＮＡ鎖の点着部分の着色は肉眼では殆ど観察できないが、PNBM基板では明確に点着部分への着色が観察できた。
基板のＤＮＡ鎖の点着部分の着色像をCCDカメラにより取り込み、取り込んだデジタルデータを画像処理ソフト（NIHイメージ）により処理し、着色度合いを数値化した。結果を表１に示す。
【００６８】
【表１】
【００６９】
所定の高分子物質で表面処理したＰＮＢＭ基板では、基板上でのハイブリダイズによるＤＮＡ断片が検出された一方で、この高分子物質による表面処理がなされていないアルデヒド基板ではハイブリダイズ効率が悪くまた酵素反応効率が悪く、発色基質の発色反応効率が悪くＤＮＡ断片の検出ができなかった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ鎖を所定の担体表面に固定化して、固定化したＤＮＡ鎖とハイブリダイズしたＤＮＡ断片又はＲＮＡ断片の有無および量を可視光領域で判定する遺伝子の検出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子の発現状況や、菌やウィルスの同定等遺伝子を用いた検出や診断が生化学の分野では、日常に行なわれている。従来遺伝子の検出には、電気泳動による方法が行なわれてきたが、近年になってＤＮＡマイクロアレイにより複数の遺伝子を同時にみることが行なわれている。
従来からの電気泳動による方法では、ＰＣＲによる増幅反応や電気泳動時間等検出までに時間を要し、また電気泳動の操作に煩わしさがある。
また、マイクロアレイによる遺伝子検出においては、検出に高価な蛍光試薬を使用しなければならず、また検出にマイクロアレイ専用の高価な検出機を必要とし、使用も研究分野の一部の研究機関に限られ、臨床の検査分野や、食品検査等の分野ではなかなか使用されるまでいたっていない。
【０００３】
上記、問題を解決するために、可視による遺伝子の検出方法が、特許文献１に開示されている。本特許文献に記載されている方法は、ＬＡＭＰ法により遺伝子の増幅を行い、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉなどインターカレーターを用いて可視化を行うものであるが、本方法では、検出目的となる遺伝子の有無は判るが、検体中に存在する遺伝子の量の比較を行うことはできない。
【特許文献１】特開２００４−１５４００８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、操作が簡便で、可視領域における測定が可能な定量性のある、遺伝子の検出方法を提供することにある。
本発明者らは、表面に所定の高分子物質を有する担体を用いることにより、ハイブリダイズの効率が高くかつ高い酵素反応効率により、発色効率が高く、感度の高い可視化による検出が可能であることを見出し本発明の完成に至った。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、
（１）ホスホリルコリン基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する不溶性担体を用いて、
（ａ）前記不溶性担体表面にＤＮＡ鎖を固定化させてＤＮＡ固定化担体を作製する工程、
（ｂ）前記ＤＮＡ固定化担体上に遺伝子のＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片を含有する溶液を添加し、前記ＤＮＡ鎖とハイブリダイズさせる工程、
（ｃ）ハイブリダイズしたＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片に酵素を標識する工程、
（ｄ）発色基質を含有する溶液を添加し前記酵素の反応により発色基質を発色させる工程、
を含み、発色の度合いにより工程（ｂ）における溶液中のＤＮＡ断片又はＲＮＡの含有状況を判定することを特徴とする遺伝子の検出方法、
（２）工程（ｂ）においてＤＮＡ断片又はＲＮＡ断片に予めビオチンが標識されていて、工程（ｃ）において酵素標識されたアビジンを含む溶液を担体表面に接触させて、
ＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片に酵素を標識するものである（１）記載の遺伝子の検出方法、
（３）ＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片に標識される酵素が酸化又は還元酵素である（１）又は（２）記載の遺伝子の検出方法、
（４）標識される酵素が、ペルオキシダーゼ又はアルカリフォスファターゼである（１）〜（３）いずれか記載の遺伝子の検出方法、
（５）工程（ａ）においてＤＮＡ鎖が、前記担体表面のカルボン酸誘導基の部位で共有結合して、前記担体表面に固定化されるものである（１）〜（４）いずれか記載の遺伝子の検出方法、
（６）前記高分子物質が更にブチルメタクリレート基を含む第三単位を有するものである（１）〜（５）いずれか記載の遺伝子の検出方法、
（７）前記担体表面に前記高分子物質に加えて、ホスホリルコリン基を含む第一単位と、ブチルメタクリレート基を含む第三単位とを有する第二の高分子物質を有する（１）〜（６）いずれか記載の遺伝子の検出方法、
（８）前記担体がプラスチック材料からなるものである（１）〜（７）いずれか記載の遺伝子の検出方法、
（９）発色した色素がＤＮＡ断片およびその近傍の担体表面に付着し、色素の付着の度合いを色の濃さとして測定することを特徴とする（１）〜（８）いずれか記載の遺伝子の検出方法、
（１０）前記担体が板状をなし、板状表面に前記ＤＮＡ鎖がスポット状に点着し固定されていることを特徴とする（９）記載の遺伝子の検出方法。
（１１）発色の度合いを吸光により測定することを特徴とする（１）〜（８）いずれか記載の遺伝子の検出方法、
である。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の検出方法によれば、電気泳動などの操作をすることなく簡便に、かつ、蛍光色素を用いることなく、可視領域で、特別な読み取り装置を用いることなく、遺伝子の検出が可能となる、さらに従来の遺伝子の有無の判定のみならず、定量することも可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の遺伝子の検出方法は、ホスホリルコリン基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合して活性化されたカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する担体に、ＤＮＡ鎖を固定化させ、サンプル中のＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片鎖をハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしたＤＮＡ断片鎖またはＲＮＡ断片鎖に酵素標識を施し、酵素反応により発色基質を発色させ、可視領域によりサンプル中の検出対象となるＤＮＡまたはＲＮＡ配列の有無の判定および定量を行うことを特徴とする。
【０００８】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
【０００９】
先ず、担体の表面にＤＮＡ鎖を固定させる。
【００１０】
ここで使用される担体に表面には、ホスホリルコリン基を有する第一単位とカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質が存在するようになっている。
【００１１】
このホスホリルコリン基を含む第一単位とカルボン酸誘導基を含む第二単位とを有する高分子物質は、ＤＮＡ鎖およびＲＮＡ鎖の非特異的吸着を抑制する性質とＤＮＡ鎖を固定化する性質とを併せ持つポリマーである。特に、第一単位に含まれるホスホリルコリン基は鋳型ＲＮＡ断片の非特異的吸着を抑制する役割を果たし、第二単位に含まれるカルボン酸誘導基はＤＮＡ鎖を化学的に固定化する役割を果たす。すなわち、プライマーは、前記このコーティング層の活性エステル基の部位で共有結合して、当該担体の表面に固定化される。
【００１２】
第一の単位は、たとえば、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基、６−メタクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン基等の（メタ）アクリロイルオキシアルキルホスホリルコリン基；
２−メタクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン基および１０−メタクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン基等の（メタ）アクリロイルオキシアルコキシアルキルホスホリルコリン基；
アリルホスホリルコリン基、ブテニルホスホリルコリン基、ヘキセニルホスホリルコリン基、オクテニルホスホリルコリン基、およびデセニルホスホリルコリン基等のアルケニルホスホリルコリン基；
等の基を有し、ホスホリルコリン基がこれらの基中に含まれている構成とすることができる。
【００１３】
また、これらの基のうち、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが好ましい。第一単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを有する構成とすることにより、担体表面におけるＲＮＡ断片の非特異的吸着をより一層確実に抑制することができる。
【００１４】
カルボン酸誘導体は、カルボン酸のカルボキシル基が活性化されたものであり、Ｃ＝Ｏを介して脱離基を有するカルボン酸である。カルボン酸誘導体は、具体的には、アルコキシル基よりも電子求引性の高い基がカルボニル基に結合して求核反応が活性化された化合物である。カルボン酸誘導基は、アミノ基、チオール基、水酸基等に対する反応性を有する化合物である。
【００１５】
活性化されたカルボン酸誘導体として、さらに具体的には、カルボン酸であるアクリル酸、メタクリル酸、クロトン酸、マレイン酸、フマル酸などのカルボキシル基が、酸無水物、酸ハロゲン化物、活性エステル、活性化アミドに変換された化合物が挙げられる。カルボン酸誘導基は、こうした化合物に由来する活性化された基であり、たとえば、ｐ−ニトロフェニル基やＮ−ヒドロキシスクシンイミド基等の活性エステル基；
―Ｃｌ、−Ｆ等のハロゲン；
等の基を有することができる。
【００１６】
また、カルボン酸誘導基は、下記式（１）に示される基とすることができる。
【００１７】
【化１】
（ただし、上記式（１）において、Ａは水酸基を除く脱離基である。）
【００１８】
上記式（１）に示される一価の基は、たとえば下記式（ｐ）または式（ｑ）から選択されるいずれかの基とすることができる。
【００１９】
【化２】
【００２０】
（ただし、上記式（ｐ）および式（ｑ）において、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して、一価の有機基であり、直鎖状、分岐状、および環状のいずれであってもよい。また、上記式（ｐ）において、Ｒ1はＣとともに環を形成する二価の基であってもよい。また、上記式（ｑ）において、Ｒ2はＮとともに環を形成する二価の基であってもよい。）
【００２１】
上記式（ｐ）に示される基として、たとえば下記式（ｒ）、（ｓ）、および（ｗ）に示される基が挙げられる。また、上記式（ｑ）に示される基として、たとえば下記式（ｕ）に示される基が挙げられる。
【００２２】
上記式（１）に示される基は、たとえば下記式（ｒ）、式（ｓ）等に示される酸無水物由来の基；
下記式（ｔ）に示される酸ハロゲン化物由来の基；
下記式（ｕ）、式（ｗ）に示される活性エステル由来の基；または
下記式（ｖ）に示される活性化アミド由来の基とすることができる。
【化３】
【００２３】
カルボン酸誘導基のうち、活性エステル基は、穏やかな条件における反応性に優れるため、好ましく用いられる。穏やかな条件としては、たとえば中性またはアルカリ性の条件、具体的にはｐＨ７．０以上１０．０以下、さらに具体的にはｐＨ７．６以上９．０以下、さらにまた具体的にはｐＨ８．０とすることができる。
【００２４】
また、本明細書において規定するところの「活性エステル基」は、その定義について厳密な規定はなされていないが、慣用の技術表現としては、エステル基のアルコール側に酸性度の高い電子求引性基を有して求核反応を活性化するエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基を意味するものとして、各種の化学合成、たとえば高分子化学、ペプチド合成等の分野で慣用されているものである。なお、ペプチド合成の分野においては、泉屋信夫、加藤哲夫、青柳東彦、脇道典著、「ペプチド合成の基礎と実験」、１９８５年発行、丸善、に記載されているように、活性エステル法はアミノ酸またはペプチドのＣ末端を活性化する方法の一つとして用いられている。
【００２５】
実際的には、エステル基のアルコール側に、電子求引性の基を有し、アルキルエステルよりも活性化されたエステル基である。活性エステル基は、アミノ基、チオール基、水酸基等の基に対する反応性を有する。さらに具体的には、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、Ｎ−ヒドロキシアミンエステル類、シアノメチルエステル、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有する活性エステル基として知られている。
【００２６】
ここでは、高分子物質中の活性化カルボン酸誘導体基が活性エステル基である場合を例に、説明する。活性エステル基としては、たとえばｐ−ニトロフェニル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、コハク酸イミド基、フタル酸イミド基、5−ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド基等が挙げられるが、たとえばｐ−ニトロフェニル基が好ましく用いられる。
【００２７】
表面にプライマーが固定化される担体の場合、第一単位と第二単位のさらに具体的な構成の組み合わせとして、たとえば、ホスホリルコリン基を含む第一単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を有し、活性エステル基がｐ−ニトロフェニル基である構成とすることができる。
【００２８】
また、本実施形態の担体のコーティング層に使用される高分子物質は、ホスホリルコリン基およびカルボン酸誘導基以外に他の基を含んでもよい。また、高分子物質は共重合体とすることができる。具体的には、高分子物質がブチルメタクリレート基を含む共重合体であることが好ましい。こうすることにより、高分子物質を適度に疎水化し、この高分子物質の担体表面への吸着性をさらに好適に確保することができる。
【００２９】
具体的には、高分子物質を、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）基を有する第一単量体と、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート（ＮＰＭＡ）基を有する第二単量体と、ブチルメタリレート（ＢＭＡ）基を有する第三単量体との共重合体とすることができる。これらの共重合体であるｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＢＭＡ−ｃｏ−ＮＰＭＡ）（ＰＭＢＮ）は、模式的に下記一般式（２）で示される。
【００３０】
【化４】
２−メタクリロイルオキシホスホリルコリンおよびｎ−ブチルメタクリレートおよびｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレートよりなる重合体ポリマー
【００３１】
ただし、上記一般式（２）において、ａ、ｂ、およびｃは、それぞれ独立して、正の整数である。また、上記一般式（２）において、第一〜第三単量体がブロック共重合していてもよいし、これらの単量体がランダムに共重合していてもよい。
【００３２】
上記一般式（２）で示される共重合体は、高分子物質の適度な疎水化と、ハイブリダイズさせるＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片の非特異吸着を抑制する性質と、ＤＮＡ鎖を固定化する性質とのバランスとに、より一層優れた構成である。このため、このような共重合体を用いることにより、担体表面をより一層確実に高分子物質で被覆するとともに、高分子物質がコーティングされた担体上へのサンプルＤＮＡ又はＲＮＡ断片の非特異的吸着を抑制しつつ、ＤＮＡ鎖をさらに確実に共有結合により固定化して担体上に導入することができる。
【００３３】
なお、上記一般式（２）で示される共重合体は、ＭＰＣ、ＢＭＡ、およびＮＰＭＡの各単量体を混合し、ラジカル重合等の公知の重合方法により得ることができる。上記一般式（２）で示される共重合体をラジカル重合により作製する場合、たとえば、Ａｒ等の不活性ガス雰囲気にて、３０℃以上９０℃以下の温度条件で溶液重合を行うことができる。
【００３４】
溶液重合に使用される溶媒は適宜選択されるが、たとえば、メタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコールや、ジエチルエーテル等のエーテル、クロロホルム等の有機溶媒を単独でまたは複数混合して用いることができる。具体的には、ジエチルエーテルとクロロホルムを体積比で８対２とした混合溶媒とすることができる。
【００３５】
また、ラジカル重合反応に使用されるラジカル重合開始剤としては、通常使用されるものを用いることができる。たとえば、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、アゾビスバレロニトリル等のアゾ系開始剤；
過酸化ラウロイル、過酸化ベンゾイル、ｔ−ブチルペルオキシネオデカノエート、ｔ−ブチルペルオキシピバレート等の油溶性の有機過酸化物；
などが用いられる。
【００３６】
さらに具体的には、ジエチルエーテルとクロロホルムを体積比で８対２とした混合溶媒およびＡＩＢＮを用い、Ａｒ中、６０℃にて２〜６時間程度重合を行うことができる。
【００３７】
なお、本実施形態では、高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を有する例を説明したが、ホスホリルコリン基を含む第一単位とカルボン酸誘導基を含む第二単位とを有する高分子物質を第一の高分子物質とし、これに加えて、ホスホリルコリン基を含む第一単位とブチルメタクリレート基を含む第三単位とを有する第二の高分子物質を含んでいてもよい。
【００３８】
なお、上記第一の高分子物質の第一単位と上記第二の高分子物質の第一単位とは同一構造であってもよいし、異なる構造であってもよい。また、上記第一の高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を含むとき、この第一の高分子物質の第三単位と上記第二の高分子物質の第三単位とは同一構造であってもよいし、異なる構造であってもよい。
【００３９】
このような第二の高分子物質は、鋳型ＤＮＡ断片の非特異的吸着を抑制するポリマーとして用いられる。このようなポリマーとしては、たとえばホスホリルコリン基が３０モル％、ブチルメタクリレート基が７０モル％の割合で含まれているものであるＭＰＣポリマー（日本油脂社製）を用いることができる。
【００４０】
なお、高分子物質が上記第一の高分子物質、第二の高分子物質からなる場合、これらの高分子物質が混合されている構成とすることができる。各々の高分子物質のポリマーは、たとえばエタノール溶液に溶解できるため、それぞれのポリマー溶液を混合することにより容易に混合ポリマーを得ることができる。
【００４１】
以上のような高分子物質からなるコーティング層を表面に含む担体は、所定の形状に加工された担体の表面に高分子物質を含む液体を塗布し、乾燥することにより得られる。また、高分子物質を含む液体中に担体を浸漬し、乾燥してもよい。
【００４２】
また、担体として、プラスチック材料を用いた場合には、形状やサイズの変更に対する柔軟性が確保される上に、ガラス基板のものに比べて安価で提供することができるという観点から好ましい。このようなプラスチック材料としては、表面処理の容易性および量産性の観点から、熱可塑性樹脂を用いることができる。
【００４３】
熱可塑性樹脂としては、ある程度耐熱性があれば特に制限はない、耐熱性のある樹脂としてたとえば、ポリエチレン、ポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン；環状ポリオレフィン；含フッ素樹脂；
等を用いることができる。上記樹脂の中でも、飽和環状ポリオレフィンは、耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、透明性および成形性に特に優れるため、光学的な分析に好適であり、担体の材料として好ましく用いられる。
【００４４】
以上のような高分子物質を表面に含むプラスチック材料からなる担体は、所定の形状に加工された担体の表面に高分子物質を含む液体を塗布し、乾燥することにより得られる。また、高分子物質を含む液体中に担体を浸漬し、乾燥してもよい。
【００４５】
なお、担体の材料をプラスチックとした場合、形状は板状には限られず、９６穴や３８４穴に代表されるマイクロタイタープレートの形状、スライドグラスに代表される基板状のもの、またビーズ状のもの、あるいはシート状のもの等特が上げられる。
【００４６】
次に、担体の表面へのＤＮＡ鎖の固定化方法について説明する。
例えば、（ｉ）担体上の高分子物質に含まれる複数の活性エステル基のうち、少なくとも一部の活性エステル基とプライマーとを反応させて共有結合を形成させることにより、担体表面でプライマーを固定化し、続いて（ｉｉ）プライマーを固定化した以外の担体表面の活性エステル基を不活性化する、すなわち残りの活性エステル基を不活性化することにより、プライマーを担体の表面に固定することができる。以下、それぞれの工程について説明する。
【００４７】
上記工程（ｉ）において、担体形状が、基板状の場合は、ＤＮＡ鎖を基板上に固定化する際には、ＤＮＡ鎖を溶解または分散した液体を点着する方法が好ましい。高分子物質に含まれる活性エステル基の一部がＤＮＡと反応して、ＤＮＡの間で共有結合が形成される。
【００４８】
このＤＮＡを溶解または分散した液体は、例えば中性からアルカリ性、例えばｐＨが７．６以上とすることができる。
【００４９】
また、点着後、担体表面に固定化されなかったＤＮＡを除去するため、純水や緩衝液で洗浄してもよい。
【００５０】
また、上記工程（ｉｉ）に示したように、洗浄後はＤＮＡを固定化した以外のプラスチック担体表面の活性エステルの不活性化処理をアルカリ化合物、あるいは一級アミノ基を有する化合物で行う。
【００５１】
アルカリ化合物としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、ホウ酸ナトリウム、水酸化リチウム、リン酸カリウムなどを用いることができる。
【００５２】
一級アミノ基を有する化合物としては、グリシン、９−アミノアクアジン、アミノブタノール、４−アミノ酪酸、アミノカプリル酸、アミノエタノール、５−アミノ２，３−ジヒドロー１，４−ペンタノール、アミノエタンチオール塩酸塩、アミノエタンチオール硫酸、２−（２−アミノエチルアミノ）エタノール、リン酸二水素２−アミノエチル、硫酸水素アミノエチル、４−（２−アミノエチル）モルホリン、５-アミノフルオレセイン、６−アミノヘキサン酸、アミノヘキシルセルロース、ｐ−アミノ馬尿酸、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、５−アミノイソフタル酸、アミノメタン、アミノフェノール、２−アミノオクタン、２−アミノオクタン酸、１−アミノ２−プロパノール、３−アミノ−１−プロパノール、３−アミノプロペン、３−アミノプロピオニトリル、アミノピリジン、１１−アミノウンデカン酸、アミノサリチル酸、アミノキノリン、４−アミノフタロニトリル、３−アミノフタルイミド、ｐ−アミノプロピオフェノン、アミノフェニル酢酸、アミノナフタレンなどを用いることができる。これらのうち、アミノエタノール、グリシンを用いることが好ましい。
【００５３】
また、担体に固定化するＤＮＡ鎖は、塩基数が１００以下のオリゴＤＮＡを用いることが好ましいが、無修飾のオリゴＤＮＡを用いても固定化が可能であり、さらには、アミノ基を導入しておくとオリゴＤＮＡの固定化効率が高くなる。アミノ基は活性エステル基との反応性に優れるため、アミノ基が導入されたオリゴＤＮＡを用いることにより、効率よくかつ強固に担体の表面上にプライマーを固定化することができる。アミノ基の導入位置はＤＮＡ鎖の分子鎖末端あるいは側鎖であってもよいが、分子鎖末端に導入されていることが、相補的なＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片とのハイブリダイズをより一層効率よく行うことができるという観点からは、好ましい。
【００５４】
以上により、担体の表面上にＤＮＡ鎖が固定化されたアレイが得られる。
【００５５】
次に、担体の表面に固定化されたＤＮＡ鎖にハイブリダイズさせるＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片を含むサンプル溶液を準備する。
【００５６】
以下、ＤＮＡサンプル溶液の調製例について記載する。
細胞中の遺伝子の発現状況をみる場合、細胞から全ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ法によりＤＮＡを増幅しサンプル溶液とする。ＰＣＲによるＤＮＡ鎖の増幅の際、ビオチン標識を施した塩基を用いることにより、ビオチン標識したＤＮＡ鎖を得る。このビオチン標識されたＤＮＡ鎖を含む溶液をサンプル溶液とする。
【００５７】
次に、上記サンプル溶液を上記ＤＮＡ鎖を固定化した担体表面に供給し、ハイブリダイゼーションを行う。これにより、担体表面に固定化されたＤＮＡ鎖と相補するサンプル溶液中のＤＮＡ鎖の一部がハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション後、例えば0.1%SDS含有2XSSC溶液、0.2XSSC溶液、0.02XSSCに順に浸漬し洗浄を行ってハイブリダイゼーション作業を終了する。
【００５８】
本発明では、発色試薬を発色させる酵素を導入し、導入した酵素により発色基質を発色することを特徴とする。以下酵素導入から発色についての一例を記載する。
【００５９】
上記、ハイブリダイゼーション終了後、酵素を標識したアビジンを含む溶液を供給し、いわゆるビオチン−アビジン反応により、ハイブリダイズしたＤＮＡ断片に酵素が導入される。導入する酵素として発色試薬を発色させる酵素が選択され、発色試薬に何を用いるかによるが、ペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼは、従来から発色試薬用酵素として使用されており、これらを用いることは、発色試薬の入手のしやすさを考慮すると好適である。
【００６０】
発色試薬としては、ウェスタンブロットなどのメンブレンの発色によく用いられるNBT/BICP発色試薬やELISAの分野での発色によく用いられるTMBZ、OPDなどを用いることができる。
【００６１】
発色試薬による発色の度合いは、ハイブリダイズしたＤＮＡ断片に導入された酵素量、すなわちＤＮＡ断片の量に応じたものとなる。NBT/BICP発色試薬は、ハイブリダイズしたＤＮＡ断片や固定化しておいたＤＮＡ鎖に付着し、ＤＮＡ鎖を点着した部分が着色する。この着色像を目視で確認し、検出対象となる遺伝子の有無を確認できる。また、この着色像を画像スキャナーやCCDカメラにより取り込み、画像処理ソフト（例えばNIHイメージなど）で発色の度合いを数値化し、検出対象となる遺伝子量を比較することが出来る。
【００６２】
また、担体としてELISAに用いる９６穴のマイクロタイタープレートを用いることによって、EKISAと同様にマイクロプレートリーダーにより吸光度による測定も可能である。また、近年、1μｌ程度の試料溶液で吸光度の測定が可能な分光吸光光度計も市販されており、担体に微細流路や微細ウェルを有するものを用いて吸光度を測定し、検出対象となる遺伝子量を比較することができる。
【実施例】
【００６３】
（PMBNコート基板の作製）
飽和環状ポリオレフィン樹脂（５−メチル−２ノルボルネンの開環重合体の水素添加物
、ＭＦＲ（Melt flow rate）：２１ｇ/１０分、水素添加率：実質的に１００％、熱変形
温度１２３℃）を用い、射出成形によりスライドガラス形状の基板を得た。この基板を２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−p−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート共重合体（ｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＢＭＡ−ｃｏ−ＮＰＭＡ）（ＰＭＢＮ）、各基は、モル％で２５：７４：１）の０．５重量％エタノール溶液に浸漬することにより、基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を導入して、プラスチック基板（PMBNコート基板）を得た。
【００６４】
（アルデヒド基板の作製）
飽和環状ポリオレフィン樹脂（５−メチル−２ノルボルネンの開環重合体の水素添加物、ＭＦＲ：２１ｇ／１０分、水素添加率：実質的に１００％、熱変形温度温度：１２３℃）を用い、射出成形によりスライドグラス状の基板を得た。この成形物に低温酸素プラズマ処理により表面に親水化処理を施した。次に、アミノアルキルシランとしてγ−アミノプロピルトリエトキシシランをメタノール中に５重量％の濃度で溶解させたものをアミノ基導入処理液として調製し、この溶液の中に２時間浸漬の後、基板を溶液から取り出し、超純水中に浸漬し放置後基板を取り出し乾燥した。グルタルアルデヒドをＰＢＳ（−）中に２重量％の濃度で溶解させてグルタルアルデヒド溶液を調製し、アミノアルキルシラン処理を行なった基板をグルタルアルデヒド溶液中に浸漬し、４時間放置した後、基板を取り出して超純水中に浸漬し、洗浄乾燥した。これにより、表面にアルデヒド基を有するアルデヒド基板を得た。
【００６５】
（基板へのＤＮＡの固定）
配列ACTCCCGGATTGCGCのDNA鎖（１５塩基）、配列AAACTCCCGGATTGCGCTCCのDNAプライマー（２０塩基）、配列TGTAAACTCCCGGATTGCGCTCCCTのDNAプライマー（２５塩基）を０．２５Ｍ炭酸バッファ（ｐＨ９．０）を用いて溶解し、１０μＭのオリゴＤＮＡ溶液を調製した。この溶液をスポッタ（日立ソフトウェアーエンジニアリング製Marks-I）を用い、１００μｍ径クロスカットピンでPNBNコート基板およびアルデヒド基板の表面上に、それぞれスポットした。オリゴＤＮＡをスポットした各基板を、２００μｌの０．２５Ｍリン酸バッファ（ｐＨ８．５）で内部を湿らせた密閉容器（１０ｃｍ×１５ｃｍ×３ｃｍ）中で一昼夜放置して、オリゴＤＮＡを固定化させた。その後、各々の基板について、ブロッキング処理を施した。
【００６６】
（ハイブリダイゼーション）
ＤＮＡ断片として、ビオチン標識した配列AAGGCGGGAGGGAGCGCAATCCGGGAGTTTACAAATGGACAAACTTCTAT ５０塩基のＤＮＡ断片の濃度が０．２μＭとなるように溶液を調製した。このＤＮＡ溶液を上記オリゴＤＮＡ固定化済み基板上に供給し、ＤＮＡマイクロアレイ用ハイブリダイゼーション用チャンバーにより密閉状態とした。続いて、６５℃３時間放置し、ハイブリダイゼーションを行い。0.1%SDS含有2XSSC溶液、0.2XSSC溶液、0.02XSSCに順に浸漬して洗浄を行った。
【００６７】
（発色反応）
上記ハイブリダイゼーションの後、ストレプトアビジンを標識したアルカリフォスファターゼを１００ｍMリン酸buffer(pH7.0)にて希釈し、基板表面に展開し、３７℃３０分間
放置し、2XSSC溶液、0.2XSSC溶液、0.02XSSCに順に浸漬し洗浄を行った後、BCIP/NBT溶液（パーキンエルマーNEL937）を基板表面に供給し、３０分間放置した後、0.2XSSCに浸漬し洗浄した。
アルデヒド基板ではＤＮＡ鎖の点着部分の着色は肉眼では殆ど観察できないが、PNBM基板では明確に点着部分への着色が観察できた。
基板のＤＮＡ鎖の点着部分の着色像をCCDカメラにより取り込み、取り込んだデジタルデータを画像処理ソフト（NIHイメージ）により処理し、着色度合いを数値化した。結果を表１に示す。
【００６８】
【表１】
【００６９】
所定の高分子物質で表面処理したＰＮＢＭ基板では、基板上でのハイブリダイズによるＤＮＡ断片が検出された一方で、この高分子物質による表面処理がなされていないアルデヒド基板ではハイブリダイズ効率が悪くまた酵素反応効率が悪く、発色基質の発色反応効率が悪くＤＮＡ断片の検出ができなかった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスホリルコリン基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する不溶性担体を用いて、
（ａ）前記不溶性担体表面にＤＮＡ鎖を固定化させてＤＮＡ固定化担体を作製する工程、
（ｂ）前記ＤＮＡ固定化担体上に遺伝子のＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片を含有する溶液を添加し、前記ＤＮＡ鎖とハイブリダイズさせる工程、
（ｃ）ハイブリダイズしたＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片に酵素を標識する工程、
（ｄ）発色基質を含有する溶液を添加し前記酵素の反応により発色基質を発色させる工程、を含み、発色の度合いにより工程（ｂ）における溶液中のＤＮＡ断片又はＲＮＡの含有状況を判定することを特徴とする遺伝子の検出方法。
【請求項２】
工程（ｂ）においてＤＮＡ断片又はＲＮＡ断片に予めビオチンが標識されていて、工程（ｃ）において酵素標識されたアビジンを含む溶液を担体表面に接触させて、
ＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片に酵素を標識するものである請求項１記載の遺伝子の検出方法。
【請求項３】
ＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片に標識される酵素が酸化又は還元酵素である請求項１又は２記載の遺伝子の検出方法。
【請求項４】
標識される酵素が、ペルオキシダーゼ又はアルカリフォスファターゼである請求項１〜３いずれか記載の遺伝子の検出方法。
【請求項５】
工程（ａ）においてＤＮＡ鎖が、前記担体表面のカルボン酸誘導基の部位で共有結合して、前記担体表面に固定化されるものである請求項１〜４いずれか記載の遺伝子の検出方法。
【請求項６】
前記高分子物質が更にブチルメタクリレート基を含む第三単位を有するものである請求項１〜５いずれか記載の遺伝子の検出方法。
【請求項７】
前記担体表面に前記高分子物質に加えて、ホスホリルコリン基を含む第一単位と、ブチルメタクリレート基を含む第三単位とを有する第二の高分子物質を有する請求項１〜６いずれか記載の遺伝子の検出方法。
【請求項８】
前記担体がプラスチック材料からなるものである請求項１〜７いずれか記載の遺伝子の検出方法。
【請求項９】
発色した色素がＤＮＡ断片およびその近傍の担体表面に付着し、色素の付着の度合いを色の濃さとして測定することを特徴とする請求項１〜８いずれか記載の遺伝子の検出方法。
【請求項１０】
前記担体が板状をなし、板状表面に前記ＤＮＡ鎖がスポット状に点着し固定されていることを特徴とする請求項９記載の遺伝子の検出方法。
【請求項１１】
発色の度合いを吸光により測定することを特徴とする請求項１〜８いずれか記載の遺伝子の検出方法。
【請求項１】
ホスホリルコリン基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する不溶性担体を用いて、
（ａ）前記不溶性担体表面にＤＮＡ鎖を固定化させてＤＮＡ固定化担体を作製する工程、
（ｂ）前記ＤＮＡ固定化担体上に遺伝子のＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片を含有する溶液を添加し、前記ＤＮＡ鎖とハイブリダイズさせる工程、
（ｃ）ハイブリダイズしたＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片に酵素を標識する工程、
（ｄ）発色基質を含有する溶液を添加し前記酵素の反応により発色基質を発色させる工程、を含み、発色の度合いにより工程（ｂ）における溶液中のＤＮＡ断片又はＲＮＡの含有状況を判定することを特徴とする遺伝子の検出方法。
【請求項２】
工程（ｂ）においてＤＮＡ断片又はＲＮＡ断片に予めビオチンが標識されていて、工程（ｃ）において酵素標識されたアビジンを含む溶液を担体表面に接触させて、
ＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片に酵素を標識するものである請求項１記載の遺伝子の検出方法。
【請求項３】
ＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片に標識される酵素が酸化又は還元酵素である請求項１又は２記載の遺伝子の検出方法。
【請求項４】
標識される酵素が、ペルオキシダーゼ又はアルカリフォスファターゼである請求項１〜３いずれか記載の遺伝子の検出方法。
【請求項５】
工程（ａ）においてＤＮＡ鎖が、前記担体表面のカルボン酸誘導基の部位で共有結合して、前記担体表面に固定化されるものである請求項１〜４いずれか記載の遺伝子の検出方法。
【請求項６】
前記高分子物質が更にブチルメタクリレート基を含む第三単位を有するものである請求項１〜５いずれか記載の遺伝子の検出方法。
【請求項７】
前記担体表面に前記高分子物質に加えて、ホスホリルコリン基を含む第一単位と、ブチルメタクリレート基を含む第三単位とを有する第二の高分子物質を有する請求項１〜６いずれか記載の遺伝子の検出方法。
【請求項８】
前記担体がプラスチック材料からなるものである請求項１〜７いずれか記載の遺伝子の検出方法。
【請求項９】
発色した色素がＤＮＡ断片およびその近傍の担体表面に付着し、色素の付着の度合いを色の濃さとして測定することを特徴とする請求項１〜８いずれか記載の遺伝子の検出方法。
【請求項１０】
前記担体が板状をなし、板状表面に前記ＤＮＡ鎖がスポット状に点着し固定されていることを特徴とする請求項９記載の遺伝子の検出方法。
【請求項１１】
発色の度合いを吸光により測定することを特徴とする請求項１〜８いずれか記載の遺伝子の検出方法。
【公開番号】特開２００６−３２２７３９（Ｐ２００６−３２２７３９Ａ）
【公開日】平成１８年１１月３０日（２００６．１１．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１４４１０７（Ｐ２００５−１４４１０７）
【出願日】平成１７年５月１７日（２００５．５．１７）
【出願人】（０００００２１４１）住友ベークライト株式会社 (2,927)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１１月３０日（２００６．１１．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年５月１７日（２００５．５．１７）
【出願人】（０００００２１４１）住友ベークライト株式会社 (2,927)
【Ｆターム（参考）】
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