遺伝子増幅によるリジン産生の増加
【課題】宿主細胞染色体におけるアミノ酸生合成経路遺伝子の増幅によって、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種からのアミノ酸の産生を増加する方法を提供する。
【解決手段】Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ等の宿主細胞染色体におけるアミノ酸生合成経路遺伝子の増幅、特にそのプロモーター強度の増加によって、リジン産生を増強する新規なプロセス。および該宿主のＬ−リジン生合成経路の新規な単離された核酸分子。
【解決手段】Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ等の宿主細胞染色体におけるアミノ酸生合成経路遺伝子の増幅、特にそのプロモーター強度の増加によって、リジン産生を増強する新規なプロセス。および該宿主のＬ−リジン生合成経路の新規な単離された核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、微生物遺伝子学および組換えＤＮＡ技術の領域に関する。本発明は、Ｌ−リジンの産生に有用な遺伝子配列、ベクター、微生物、プロモーターおよび調節タンパク質を提供する。本発明はさらに、Ｌ−リジンの産生を増加するための方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
（関連分野）
Ｌ−リジンは、主にグラム陽性Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍおよびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍを利用する産業スケールでの発酵によって得られる、重要な経済的な生成物である（Ｋｌｅｅｍａｎｎ，Ａ．ら、Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２Ａ巻、５７−９７頁、Ｗｅｉｎｈａｍ：ＶＣＨ−Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ（１９８５））。
【０００３】
発酵によって産生されるアミノ酸の立体特異性は、合成プロセスと比較したプロセス上の利点を生じ；一般に、Ｌ−型アミノ酸は、微生物発酵プロセスによって生成される。安価な炭素源（例えば、糖蜜、グルコース、酢酸およびエタノール）を利用する、発酵を介するＬ−リジンおよび他のアミノ酸の産生は、比較的安価な産生手段である。
【０００４】
アミノ酸産生のための微生物プロセスにおいて使用される微生物は、以下の４つのクラスに分けられ得る：野生型株、栄養要求性の変異体、調節性変異体および栄養要求性の調節性変異体（Ｋ．Ｎａｋａｙａｍａら、Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｆｏｏｄ ａｎｄ ｆｅｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｍ．Ｆｒｉｅｄｍａｎ編（１９７８）、６４９−６６１頁）。
【０００５】
栄養要求性特性または耐性特性について単離された種々の株を利用する、いくつかの発酵プロセスが、Ｌ−リジンの産生について当該分野で公知である：米国特許第２，９７９，４３９号は、アミノ酸補充（ホモセリン、またはＬ−メチオニンおよびＬ−トレオニン）を必要とする変異体を開示する；米国特許第３，７００，５５７号は、Ｌ−トレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−シスチンまたはＬ−システインに対する栄養要求性を有する変異体を開示する；米国特許第３，７０７，４４１号は、Ｌ−リジンアナログに対する耐性を有する変異体を開示する；米国特許第３，６８７，８１０号は、Ｌ−リジンを産生する能力およびバシトラシン、ペニシリンＧまたはポリミキシンに対する耐性の両方を有する変異体を開示する；米国特許第３，７０８，３９５号は、ホモセリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トレオニンおよびＬ−メチオニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシンまたはそれらの混合物に対する栄養要求性およびＬ−リジン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−イソロイシンまたはそれらのアナログに対する耐性を有する変異体を開示する；米国特許第３，８２５，４７２号は、Ｌ−リジンアナログに対する耐性を有する変異体を開示する；米国特許第４，１６９，７６３号は、Ｌ−リジンを産生しかつアスパラギンアナログおよびスルファ薬剤の少なくとも１つに対して耐性であるＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍの変異株を開示する；米国特許第５，８４６，７９０号は、いかなるビオチン作用抑制剤の非存在下においてＬ−グルタミン酸およびＬ−リジンを産生し得る変異株を開示する；そして米国特許第５，６５０，３０４号は、４−Ｎ−（Ｄ−アラニル）−２，４−ジアミノ−２，４−ジデオキシ−Ｌ−アラビノース２，４−ジデオキシ−Ｌ−アラビノースまたはその誘導体に対して耐性である、Ｌ−リジンの産生のためのＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属またはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する株を開示する。
【０００６】
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種におけるＬ−リジン合成のための生化学的経路に関して多くのことが知られている（Ｓａｈｍら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８２：２５−３９（１９９６）によって近年概説されている）。Ｌ−リジン経路の入口は、Ｌ−アスパラギン酸で開始し（図１を参照のこと）、Ｌ−アスパラギン酸自体は、オギザロ酢酸のアミノ基転移によって産生される。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの特別な特徴は、Ｌ−リジン中間体であるピペリジン２，６−ジカルボン酸からジアミノピメリン酸へ転換するその能力である。この転換は、以下の２つの経路、すなわち、スクシニル化中間体が関与する反応またはジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼの単一の反応によって生じる。全体として、この経路への炭素フラックスは、以下の２つの点：第１に、Ｌ−トレオニンおよびＬ−リジンの両方のレベルによるアスパラギン酸キナーゼのフィードバック阻害を介して；および第２に、ジヒドロジピコリン酸シンターゼのレベルの制御を介して、調節される。従って、Ｌ−リジンの産生の増加は、これらの２つの酵素の活性を調節解除および増加することによって、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種において得られ得る。
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種におけるＬ−リジン発酵産生の領域におけるより近年の発達は、Ｌ−リジン産生を増強するための分子生物学的技術の使用を含む。この分野の例示として、以下の例を提供する：特許文献１および特許文献２は、Ｓ−（２−アミノエチル）−システインに感受性の宿主ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ種微生物を組換えＤＮＡ分子（ここで、Ｓ−（２−アミノエチル）−システインに対する耐性およびＬ−リジン産生能の両方を付与するＤＮＡフラグメントが、ベクターＤＮＡにされている）で形質転換することによって得られた、Ｌ−リジン産生変異株を開示する；特許文献３は、アスパルトキナーゼをコードする遺伝子（これは、Ｌ−リジンおよびＬ−トレオニンによるフィードバック阻害が脱感作された、コリネ型細菌由来である）を、漏出型ホモセリンデヒドロゲナーゼを保持するＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種細菌またはホモセリンデヒドロゲナーゼ遺伝子欠損のＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種の染色体ＤＮＡに組み込むことによって産生された変異株を開示する；増加されたＬ−リジン産生は、プラスミドベクターまたは遺伝子置換ストラテジーの使用による、遺伝子増幅によって得られる。特許文献４および特許文献５の両方は、プラスミドコピー数に基づく遺伝子増幅による、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種におけるＬ−リジンの産生の増加を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第４，５６０，６５４号明細書
【特許文献２】米国特許第５，２３６，８３１号明細書
【特許文献３】米国特許第５，７６６，９２５号明細書
【特許文献４】欧州特許出願公開第０ ８１１ ６８２ Ａ２号明細書
【特許文献５】欧州特許出願公開第０ ８５４ １８９ Ａ２号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１） 配列番号２のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
（項目２） 項目１に記載される前記ポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
（項目３） 項目２に記載の単離されたポリヌクレオチド分子であって、配列番号１の配列を有する核酸を含む、ポリヌクレオチド分子。
（項目４） 項目２に記載される単離されたポリヌクレオチド分子を含む、ベクター。
（項目５） 項目４に記載されるベクターを含む、宿主細胞。
（項目６） 方法であって、以下：
（ａ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種の宿主細胞を、項目２に記載されるポリヌクレオチド分子を用いて形質転換する工程であって、ここで、該単離されたポリヌクレオチド分子が該宿主細胞の染色体に組み込まれ、これによって該宿主細胞染色体中のアミノ酸生合成経路遺伝子の総数を増加させる、工程；および
（ｂ）形質転換された宿主細胞を選択する工程、
を包含する、方法。
（項目７） 項目６に記載の方法であって、増加したアミノ酸産生についてスクリーニングする工程をさらに包含する、方法。
（項目８） 項目６に記載の方法であって、ここで、前記ポリヌクレオチド分子が、さらに、以下：
（ａ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ａｓｄアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｂ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ｄａｐＡアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｃ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ｄａｐＢアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｄ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ｄｄｈアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｅ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路‘ｌｙｓＡアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｆ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ｌｙｓＡアミノ酸配列をコードする、核酸分子；および
（ｇ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする、核酸分子、
のうちの少なくとも１つを含む、方法。
（項目９） 項目８に記載の方法であって、さらに、増加したアミノ酸産生についてスクリーニングする工程を包含する、方法。
（項目１０） 項目６に記載の方法であって、ここで、前記単離されたポリヌクレオチド分子が、さらに、以下：
（ａ）配列番号４のａｓｄアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｂ）配列番号６のｄａｐＡアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｃ）配列番号８のｄａｐＢアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｄ）配列番号１０のｄｄｈアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｅ）配列番号２１の‘ｌｙｓＡアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｆ）配列番号１４のｌｙｓＡアミノ酸配列をコードする、核酸分子；および
（ｇ）配列番号１６のＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする、核酸分子、
のうちの少なくとも１つを含む、方法。
（項目１１） 項目６に記載の方法であって、ここで、前記単離されたポリヌクレオチド分子が、さらに、以下：
（ａ）配列番号４のａｓｄアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｂ）配列番号６のｄａｐＡアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｃ）配列番号８のｄａｐＢアミノ酸配列をコードする、核酸分子；および
（ｄ）配列番号１６のＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする、核酸分子、
を含む、方法。
（項目１２） 項目６に記載の方法であって、ここで、前記単離されたポリヌクレオチド分子が、さらに、以下：
（ａ）配列番号４のａｓｄアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｂ）配列番号６のｄａｐＡアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｃ）配列番号８のｄａｐＢアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｄ）配列番号１０のｄｄｈアミノ酸配列をコードする、核酸分子；および
（ｅ）配列番号１６のＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする、核酸分子、
を含む、方法。
（項目１３） 項目６に記載の方法であって、ここで、前記単離されたポリヌクレオチド分子が、さらに、以下：
（ａ）配列番号４のａｓｄアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｂ）配列番号６のｄａｐＡアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｃ）配列番号８のｄａｐＢアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｄ）配列番号１０のｄｄｈアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｅ）配列番号２１の‘ｌｙｓＡアミノ酸配列をコードする、核酸分子；および
（ｆ）配列番号１６のＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする、核酸分子、
を含む、方法。
（項目１４） 項目６に記載の方法であって、ここで、前記単離されたポリヌクレオチド分子が、さらに、以下：
（ａ）配列番号４のａｓｄアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｂ）配列番号６のｄａｐＡアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｃ）配列番号８のｄａｐＢアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｄ）配列番号１０のｄｄｈアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｅ）配列番号１４のｌｙｓＡアミノ酸配列をコードする、核酸分子；および
（ｆ）配列番号１６のＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする、核酸分子、
を含む、方法。
（項目１５） 項目６に記載の方法であって、さらに、以下：
（ａ）前記形質転換された宿主細胞を培地中で増殖させる工程；および
（ｂ）該形質転換された宿主細胞によって産生されるアミノ酸を精製する工程、
を包含する、方法。
（項目１６） 単離されたポリヌクレオチド分子であって、以下：
（ａ）項目２に記載されるポリヌクレオチド分子；ならびに
（ｂ）以下の（ｉ）〜（ｖｉｉ）：
（ｉ）ａｓｄポリペプチドをコードする、核酸分子；
（ｉｉ）ｄａｐＡポリペプチドをコードする、核酸分子；
（ｉｉｉ）ｄａｐＢポリペプチドをコードする、核酸分子；
（ｉｖ）ｄｄｈポリペプチドをコードする、核酸分子；
（ｖ）‘ｌｙｓＡポリペプチドをコードする、核酸分子；
（ｖｉ）ｌｙｓＡポリペプチドをコードする、核酸分子；および
（ｖｉｉ）ＯＲＦ２ポリペプチドをコードする、核酸分子、
からなる群より選択される、少なくとも１つのさらなるＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路遺伝子、
を含む、ポリヌクレオチド分子。
（項目１７） 項目１６に記載の単離された核酸分子であって、ここで：
（ａ）前記ａｓｄポリペプチドが配列番号４であり；
（ｂ）前記ｄａｐＡポリペプチドが配列番号６であり；
（ｃ）前記ｄａｐＢポリペプチドが配列番号８であり；
（ｄ）前記ｄｄｈポリペプチドが配列番号１０であり；
（ｅ）前記‘ｌｙｓＡポリペプチドが配列番号２１であり；
（ｆ）前記ｌｙｓＡポリペプチドが配列番号１４であり；そして
（ｇ）前記ＯＲＦ２ポリペプチドが配列番号１６である、
核酸分子。
（項目１８） 単離されたポリヌクレオチド分子であって、以下：
（ａ）項目２に記載のポリヌクレオチド分子；
（ｂ）配列番号４のａｓｄアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｃ）配列番号６のｄａｐＡアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｄ）配列番号８のｄａｐＢアミノ酸配列をコードする、核酸分子；および
（ｅ）配列番号１６のＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする、核酸分子、
を含む、ポリヌクレオチド分子。
（項目１９） 単離されたポリヌクレオチド分子であって、以下：
（ａ）項目２に記載のポリヌクレオチド分子；
（ｂ）配列番号４のａｓｄアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｃ）配列番号６のｄａｐＡアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｄ）配列番号８のｄａｐＢアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｅ）配列番号１０のｄｄｈアミノ酸配列をコードする、核酸分子；および
（ｆ）配列番号１６のＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする、核酸分子、
を含む、ポリヌクレオチド分子。
（項目２０） 単離されたポリヌクレオチド分子であって、以下：
（ａ）項目２に記載のポリヌクレオチド分子；
（ｂ）配列番号４のａｓｄアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｃ）配列番号６のｄａｐＡアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｄ）配列番号８のｄａｐＢアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｅ）配列番号１０のｄｄｈアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｆ）配列番号２１の‘ｌｙｓＡアミノ酸配列をコードする、核酸分子；および
（ｇ）配列番号１６のＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする、核酸分子、
を含む、ポリヌクレオチド分子。
（項目２１） 単離されたポリヌクレオチド分子であって、以下：
（ａ）項目２に記載のポリヌクレオチド分子；
（ｂ）配列番号４のａｓｄアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｃ）配列番号６のｄａｐＡアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｄ）配列番号８のｄａｐＢアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｅ）配列番号１０のｄｄｈアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｆ）配列番号１４のｌｙｓＡアミノ酸配列をコードする、核酸分子；および
（ｇ）配列番号１６のＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする、核酸分子、
を含む、ポリヌクレオチド分子。
（項目２２） ｐＫ１８４−ＫＤＡＢを含む、項目１８に記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
（項目２３） ｐＤ１１−ＫＤＡＢＨ’Ｌを含む、項目２０に記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
（項目２４） ｐＤ２−ＫＤＡＢＨＬを含む、項目２１に記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
（項目２５） 項目１６に記載されるポリヌクレオチド分子を含む、ベクター。
（項目２６） 項目２５に記載されるベクターを含む、宿主細胞。
（項目２７） 項目２６に記載の宿主細胞であって、ここで、該宿主細胞が、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２１８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２１９、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２２０、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２２１、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２２２、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２３４およびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２３５からなる群より選択されるＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍである、宿主細胞。
（項目２８） 項目２６に記載の宿主細胞であって、該宿主細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α ＭＣＲ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２２８である、宿主細胞。
（項目２９） 項目２６に記載の宿主細胞であって、ここで、該宿主細胞が、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２３６およびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２３７からなる群より選択されるＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである、宿主細胞。
（項目３０） リジンを産生する方法であって、該方法が項目５に記載される宿主細胞を培養する工程を包含し、ここで、前記宿主細胞が、以下：
（ａ）遺伝子改変されていない宿主細胞と比較した１以上のリジン生合成経路酵素の酵素活性の増加；
（ｂ）リジン生合成経路酵素をコードする各遺伝子の１以上のコピー；および
（ｃ）リジン生合成経路酵素をコードする１以上の遺伝子の転写を調節する１以上の転写因子の改変、
のうちの１以上を含み、ここで、該宿主細胞は、該培養培地中でリジンを産生する、方法。
（項目３１） 項目３０に記載の方法であって、ここで、前記増加した酵素活性が、１以上のリジン生合成経路酵素をコードする１以上の遺伝子の過剰発現を含む、方法。
（項目３２） 項目３１に記載の方法であって、ここで、前記１以上の遺伝子が、１以上のプロモーター配列に直接的にまたは間接的に作動可能に連結される、方法。
（項目３３） 項目３２に記載の方法であって、ここで、前記作動可能に連結されたプロモーター配列が、異種、内因性、またはハイブリッドである、方法。
（項目３４） 項目３３に記載の方法であって、ここで、前記プロモーター配列が、以下：Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍに内因性の遺伝子の５’末端由来のプロモーター配列、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいて複製するプラスミド由来のプロモーター配列、およびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍに感染するファージのゲノム由来のプロモーター配列、の１つ以上である、方法。
（項目３５） 項目３３または３４に記載の方法であって、ここで、前記プロモーター配列の１つ以上が、改変されている、方法。
（項目３６） 項目３５に記載の方法であって、ここで、前記改変が、５’末端における短縮、３’末端における短縮、１つ以上のヌクレオチドの非末端挿入、１つ以上のヌクレオチドの非末端欠失、５’末端における１つ以上のヌクレオチドの付加、３’末端における１つ以上のヌクレオチドの付加、およびこれらの組み合わせを含む、方法。
（項目３７） 項目３０に記載の方法であって、ここで、前記増加した酵素活性が、１つ以上の改変されたリジン生合成経路酵素の活性から生じ、ここで、該酵素活性の改変が、その改変を欠いている酵素と比較した、反応速度論的パラメーター、アロステリック調節またはその両方における変化を生じる、方法。
（項目３８） 項目３７に記載の方法であって、ここで、前記反応速度論的パラメーターにおける変化が、Ｋｍ、Ｖｍａｘまたはその両方における変化である、方法。
（項目３９） 項目３７に記載の方法であって、ここで、前記アロステリック調節における変化が、１つ以上の酵素アロステリック調節部位における変化である、方法。
（項目４０） 項目３７に記載の方法であって、ここで、前記改変が、前記酵素をコードするヌクレオチド配列における変化の結果である、方法。
（項目４１） 項目４０に記載の方法であって、ここで、前記ヌクレオチド配列における前記変化が、１つ以上のヌクレオチドの付加、挿入、欠失、置換、またはそれらの組み合わせである、方法。
（項目４２） 項目３０に記載の方法であって、前記１つ以上の転写因子の改変が、転写インヒビタータンパク質における１以上の変異、転写アクチベータータンパク質における１以上の変異、あるいはその両方を含み、ここで、該１以上の変異は、該改変を欠いている該１以上の転写因子による転写と比較して、標的ヌクレオチド配列の転写を増加する、方法。
（項目４３） 項目４２に記載の方法であって、前記１つ以上の変異が、前記転写因子をコードする前記ヌクレオチド配列における変化である、方法。
（項目４４） 項目４３に記載の方法であって、ここで、前記ヌクレオチド配列における前記変化が、１つ以上のヌクレオチドの付加、挿入、欠失、置換、またはそれらの組み合わせである、方法。
（項目４５） 単離されたポリペプチドであって、ここで、該ポリペプチドが、配列番号１９のアミノ酸配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
（項目４６） 項目４５に記載のポリペプチドであって、ここで、該ポリペプチドが、配列番号１９のアミノ酸配列を有する、ポリペプチド。
（項目４７） 項目４５に記載されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
（項目４８） 配列番号１８の配列を有する核酸を含む、項目４７に記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
（項目４９） 項目４７に記載されるポリヌクレオチド分子を含む、ベクター。
（項目５０） 項目４９に記載されるベクターを含む、宿主細胞。
（項目５１） 項目５０に記載の宿主細胞であって、ここで、該宿主細胞が、ＮＲＲＬ Ｂ３０３６０である、宿主細胞。
（項目５２） 方法であって、以下：
（ａ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種の宿主細胞を、項目４７に記載されるポリヌクレオチド分子を用いて形質転換する工程、および
（ｂ）形質転換された宿主細胞を選択する工程、
を包含する、方法。
（項目５３） 単離されたポリペプチドであって、ここで、該ポリペプチドが、配列番号２１のアミノ酸配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、ポリペプチド。
（項目５４） 配列番号２１のアミノ酸配列を有する、項目５３に記載のポリペプチド。
（項目５５） 項目５３に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
（項目５６） 配列番号２０の配列を有する核酸を含む、項目５５に記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
（項目５７） 項目５５に記載のポリヌクレオチド分子を含む、ベクター。
（項目５８） 項目５７に記載のベクターを含む、宿主細胞。
（項目５９） 項目５８に記載の宿主細胞であって、ここで、該宿主細胞が、ＮＲＲＬ Ｂ３０２１８、ＮＲＲＬ Ｂ３０２２０、およびＮＲＲＬ Ｂ３０２２２からなる群より選択される、宿主細胞。
（項目６０） 方法であって、以下：
（ａ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種の宿主細胞を、項目５５に記載されるポリヌクレオチド分子を用いて形質転換する工程、および
（ｂ）形質転換された宿主細胞を選択する工程、
を包含する、方法。
（項目６１） 項目２に記載の単離されたポリヌクレオチド分子であって、さらに、プロモーター配列を含み、ここで、該プロモーター配列が、配列番号１７に対する少なくとも９５％の配列同一性を有する、ポリヌクレオチド分子。
（項目６２） 項目６１に記載のポリヌクレオチドであって、ここで、前記プロモーター配列が、配列番号１７のヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド。
（項目６３） 項目６１に記載の単離されたポリヌクレオチド分子であって、ここで、前記プロモーターが、ＬｙｓＡ遺伝子に作動可能に直接連結されている、ポリヌクレオチド分子。
（項目６４） 項目６１に記載される単離されたポリヌクレオチドを含む、ベクター。
（項目６５） 項目６４に記載されるベクターを含む、宿主細胞。
（項目６６） 項目６５に記載の宿主細胞であって、ここで、該宿主細胞が、ＮＲＲＬ Ｂ３０３５９である、宿主細胞。
（項目６７） 方法であって、以下：
（ａ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種の宿主細胞を、項目６１に記載されるポリヌクレオチド分子を用いて形質転換する工程、および
（ｂ）形質転換された宿主細胞を選択する工程、
を包含する、方法。
本発明の目的は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種におけるアミノ酸の産生を増加する方法を提供することであり、これは、宿主細胞におけるアミノ酸生合成経路の遺伝子（単数または複数）の数を増幅（すなわち、増加）することによる。特に好ましいＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種としては、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍおよびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍが挙げられる。
【０００９】
本発明の目的は、単離されたフィードバック耐性アスパルトキナーゼ酵素を提供することであり、ここで、このフィードバック感受性形態における天然に存在するトレオニンアミノ酸残基３８０が、ＡＴＣＣ２１５２９のａｓｋ遺伝子においてイソロイシンに変化されている。本発明の目的は、配列番号２のアミノ酸配列を含む単離されたａｓｋポリペプチドを提供することである。本発明の別の目的は、配列番号２のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子を提供することである。本発明の別の目的は、配列番号１の配列を有する核酸を含む、単離されたポリヌクレオチド分子を提供することである。
【００１０】
本発明の別の目的は、以下の工程を含む方法を提供することである：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種宿主細胞を、配列番号２のアミノ酸を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子で形質転換する工程であって、この単離されたポリヌクレオチド分子は、この宿主細胞の染色体に組み込まれ、これによって、この宿主細胞染色体におけるこのアミノ酸生合成経路遺伝子の総数を増加する、工程、および形質転換された宿主細胞を選択する工程。本発明のさらなる目的は、増加されたアミノ酸産生についてスクリーニングする工程を包含する方法を提供することである。この方法はさらに、この形質転換された宿主細胞を培地中で増殖させる工程およびこの形質転換された宿主細胞によって産生されたアミノ酸を精製する工程を包含する。
【００１１】
別の実施形態において、アミノ酸の産生を増加するための方法は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種宿主細胞を、配列番号２のアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子で形質転換する工程、および形質転換された宿主細胞を選択する工程、を包含する方法であって、ここで、この単離された核酸分子は、この宿主細胞染色体に組み込まれ、それによって、この宿主細胞染色体におけるこのアミノ酸の生合成経路遺伝子の総数を増加し、かつここで、この単離された核酸分子は、以下のうちの少なくとも１つをさらに含む：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路のａｓｄアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路のｄａｐＡアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路のｄａｐＢアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路のｄｄｈアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路の‘ｌｙｓＡアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路のｌｙｓＡアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路のＯＲＦ２アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。この方法はさらに、この形質転換された宿主細胞を培地中で増殖させる工程およびこの形質転換された宿主細胞によって産生されたアミノ酸を精製する工程を包含する。
【００１２】
用語「‘ｌｙｓＡ」とは、出願人によって使用されかつ以下に記載される、短縮型ｌｙｓＡの遺伝子またはアミノ酸配列をいう。用語「ｌｙｓＡ」とは、出願人によって使用されかつ以下に記載される、全長ｌｙｓＡの遺伝子またはアミノ酸配列をいう。
【００１３】
本発明の別の目的は、単離されたポリヌクレオチド分子を提供することであって、このポリヌクレオチドは、配列番号２のＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍリジン経路のａｓｋアミノ酸配列をコードする核酸分子；および以下からなる群より選択される少なくとも１つのさらなるＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種のリジン経路遺伝子を含む：ａｓｄポリペプチドをコードする核酸分子、ｄａｐＡポリペプチドをコードする核酸分子、ｄａｐＢポリペプチドをコードする核酸分子、ｄｄｈポリペプチドをコードする核酸分子、‘ｌｙｓＡポリペプチドをコードする核酸分子、ｌｙｓＡポリペプチドをコードする核酸分子およびＯＲＦ２ポリペプチドをコードする核酸分子。本発明の好ましい実施形態において、この単離されたポリヌクレオチド分子は、ｐＫ１８４−ＫＤＡＢＨ’Ｌを含む。本発明の別の好ましい実施形態において、この単離された核酸分子は、ｐＫ１８４−ＫＤＡＢを含む。本発明の別の好ましい実施形態において、この単離された核酸分子は、ｐＤ２−ＫＤＡＢＨＬを含む。本発明の別の好ましい実施形態において、この単離された核酸分子は、ｐＤ１１−ＫＤＡＢＨ’Ｌを含む。
【００１４】
本発明の別の目的は、単離されたポリヌクレオチド分子で形質転換された宿主細胞であって、このポリヌクレオチド分子が、配列番号２のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、宿主細胞を提供することであり、ここで、この単離された核酸分子は、この宿主細胞染色体に組み込まれ、それによって、この宿主細胞染色体中のアミノ酸生合成経路遺伝子の総数を増加する。１つの実施形態において、このポリヌクレオチドは、以下からなる群より選択される少なくとも１つのさらなるＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種のリジン経路遺伝子をさらに含む：ａｓｄポリペプチドをコードする核酸分子；ｄａｐＡポリペプチドをコードする核酸分子；ｄａｐＢポリペプチドをコードする核酸分子；ｄｄｈポリペプチドをコードする核酸分子；‘ｌｙｓＡポリペプチドをコードする核酸分子；ｌｙｓＡポリペプチドをコードする核酸分子；およびＯＲＦ２ポリペプチドをコードする核酸分子。
【００１５】
別の実施形態において、このポリヌクレオチドは、このａｓｄポリペプチドが配列番号４であり；このｄａｐＡポリペプチドが配列番号６であり；このｄａｐＢポリペプチドが配列番号８であり；このｄｄｈポリペプチドが配列番号１０であり；この‘ｌｙｓＡポリペプチドが配列番号２１であり；このｌｙｓＡポリペプチドが配列番号１４であり；そしてこのＯＲＦ２ポリペプチドが配列番号１６である、ポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む。
【００１６】
別の実施形態において、このポリヌクレオチドは、このａｓｄポリペプチドが配列番号４であり；このｄａｐＡポリペプチドが配列番号６であり；このｄａｐＢポリペプチドが配列番号８であり；このｄｄｈポリペプチドが配列番号１０であり；この‘ｌｙｓＡポリペプチドが配列番号２１であり；このｌｙｓＡポリペプチドが配列番号１４であり；そしてこのＯＲＦ２ポリペプチドが配列番号１６である、核酸分子をさらに含む。
【００１７】
別の実施形態において、このポリヌクレオチドは、配列番号４のａｓｄアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号６のｄａｐＡアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号８のｄａｐＢアミノ酸配列をコードする核酸分子；および配列番号１６のＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする核酸分子をさらに含む。
【００１８】
別の実施形態において、このポリヌクレオチドは、配列番号４のａｓｄアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号６のｄａｐＡアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号８のｄａｐＢアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号１０のｄｄｈアミノ酸配列をコードする核酸分子；および配列番号１６のＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする核酸分子をさらに含む。
【００１９】
別の実施形態において、このポリヌクレオチドは、配列番号４のａｓｄアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号６のｄａｐＡアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号８のｄａｐＢアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号１０のｄｄｈアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号２１の‘ｌｙｓＡアミノ酸配列をコードする核酸分子；および配列番号１６のＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする核酸分子をさらに含む。
【００２０】
別の実施形態において、このポリヌクレオチドは、配列番号４のａｓｄアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号６のｄａｐＡアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号８のｄａｐＢアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号１０のｄｄｈアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号１４のｌｙｓＡアミノ酸配列をコードする核酸分子；および配列番号１６のＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする核酸分子をさらに含む。
【００２１】
１つの実施形態において、形質転換された宿主細胞は、以下からなる群より選択されるＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍである：Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２１８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２１９、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２２０、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２２１、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２２２、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２３４およびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２３５。別の実施形態において、宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α ＭＣＲ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２２８である。別の実施形態において、宿主細胞は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２３６およびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２３７からなる群より選択されるＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである。
【００２２】
本発明の別の目的は、リジンを産生する方法を提供することであり、この方法は、配列番号２のアミノ酸配列を含む宿主細胞を培養する工程を包含し、ここで、この宿主細胞は、（ａ）遺伝子改変されていない非ヒト宿主細胞と比較した１以上のリジン生合成経路酵素の酵素活性の増加；（ｂ）リジン生合成経路酵素をコードする各遺伝子の１以上のコピー；および（ｃ）リジン生合成経路酵素をコードする１以上の遺伝子の転写を調節する１以上の転写因子の改変、のうちの１以上を含み、ここで、この宿主細胞は、この培養培地中でリジンを産生する。本発明の１つの実施形態において、この酵素活性の増加としては、１以上のリジン生合成経路酵素をコードする１以上の遺伝子の過剰発現が含まれる。本発明の別の実施形態において、この酵素活性の増加は、１以上の改変されたリジン生合成経路酵素の活性から生じ、ここで、この酵素の改変は、その改変を欠いている酵素と比較した、反応速度パラメーター、アロステリック調節またはその両方における変化を生じる。本発明の別の実施形態において、１以上の転写因子の改変としては、転写インヒビタータンパク質における１以上の変異、転写アクチベータータンパク質における１以上の変異、あるいはその両方を含み、ここで、この１以上の変異は、この改変を欠いているこの１以上の転写因子による転写と比較して、標的ヌクレオチド配列の転写を増加する。
【００２３】
本発明の目的は、単離されたポリペプチドを提供することであり、このポリペプチドは、配列番号１９のアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。本発明のさらなる目的は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供することである。本発明のさらなる目的は、配列番号１８の配列を有する核酸を含む単離されたポリヌクレオチドを提供することである。本発明の別の目的は、宿主細胞ＮＲＲＬ Ｂ３０３６０を提供することである。
【００２４】
本発明の目的は、単離されたポリペプチドを提供することであり、このポリペプチドは、配列番号２１のアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。本発明のさらなる目的は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供することである。本発明のさらなる目的は、配列番号２０の配列を有する核酸を含むポリヌクレオチド分子を提供することである。
【００２５】
本発明の目的は、単離されたポリヌクレオチド分子を提供することであり、このポリヌクレオチド分子は、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、プロモーター配列をさらに含み、ここで、このプロモーター配列は、配列番号１７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。本発明のさらなる目的は、単離されたポリヌクレオチド分子を提供することであり、このポリヌクレオチド分子は、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、このポリヌクレオチド分子は、配列番号１７の配列をさらに含む。本発明のさらなる目的は、宿主細胞ＮＲＲＬ Ｂ３０３５９を提供することである。
本発明のさらなる目的および利点は、以下の説明から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるＬ−リジン生合成経路（Ｓａｈｍら）の図。
【図２】ａｓｋ（ＡＴＣＣ ２１５２９配列）のヌクレオチド配列（配列番号１）。
【図３Ａ】ａｓｋ（ＡＴＣＣ ２１５２９配列）のアミノ酸配列（配列番号２）。
【図３Ｂ】ａｓｋ（ＡＴＣＣ ２１５２９配列）のアミノ酸配列（配列番号２）。
【図４】ａｓｄ（ＡＴＣＣ ２１５２９配列）のヌクレオチド配列（配列番号３）。
【図５Ａ】ａｓｄ（ＡＴＣＣ ２１５２９配列）のアミノ酸配列（配列番号４）。
【図５Ｂ】ａｓｄ（ＡＴＣＣ ２１５２９配列）のアミノ酸配列（配列番号４）。
【図６】ｄａｐＡ（ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４）のヌクレオチド配列（配列番号５）。
【図７Ａ】ｄａｐＡ（ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４）のアミノ酸配列（配列番号６）。
【図７Ｂ】ｄａｐＡ（ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４）のアミノ酸配列（配列番号６）。
【図８】ｄａｐＢ（ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４）のヌクレオチド配列（配列番号７）。
【図９】ｄａｐＢ（ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４）のアミノ酸配列（配列番号８）。
【図１０】ｄｄｈ（ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４）のヌクレオチド配列（配列番号９）。
【図１１Ａ】ｄｄｈ（ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４）のアミノ酸配列（配列番号１０）。
【図１１Ｂ】ｄｄｈ（ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４）のアミノ酸配列（配列番号１０）。
【図１２】短縮型ｌｙｓＡ（‘ｌｙｓＡ）ヌクレオチド配列を得るために使用した全長ｌｙｓＡ（ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４）のヌクレオチド配列（配列番号１１）。下線を付した領域にｌｙｓＡプライマーがアニーリングする。
【図１３】短縮型ｌｙｓＡ（‘ｌｙｓＡ）アミノ酸配列（配列番号２１）を含む全長ｌｙｓＡ（ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４）のアミノ酸配列（配列番号１２）。下線を付したＬ：ｌｙｓＡの最後のアミノ酸残基がこの短縮型ＰＣＲ産物にコードされる。
【図１４】全長ｌｙｓＡ（ｐＲＳ６）のヌクレオチド配列（配列番号１３）。
【図１５Ａ】全長ｌｙｓＡ（ｐＲＳ６）のアミノ酸配列（配列番号１４）。
【図１５Ｂ】全長ｌｙｓＡ（ｐＲＳ６）のアミノ酸配列（配列番号１４）。
【図１５Ｃ】全長ｌｙｓＡ（ｐＲＳ６）のアミノ酸配列（配列番号１４）。
【図１６】ＯＲＦ２（ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４）のヌクレオチド配列（配列番号１５）。
【図１７】ＯＲＦ２（ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４）のアミノ酸配列（配列番号１６）。
【図１８】本発明の５および６リジン経路遺伝子の構築物の模式図。
【図１９】ＡＴＣＣ１３０３２、Ｎ１３およびＡＴＣＣ２１５２９由来のアスパルトキナーゼ（ａｓｋ）アミノ酸配列の比較。
【図２０】Ｐ１プロモーターを含むｐＲＳ６由来のＨｐａＩ−ＰｖｕＩＩフラグメントのヌクレオチド配列（配列番号１７）。
【図２１Ａ】ｐＤＥｌｉａ２−ＫＤＡＢＨＰ１Ｌ構築物の構築の模式図。
【図２１Ｂ】ｐＤＥｌｉａ２−ＫＤＡＢＨＰ１Ｌ構築物の構築の模式図。
【図２２】ｐＤＥｌｉａ２ＦＣ５−ＫＤＢＨＬ構築物の構築の模式図。
【図２３】短縮型ＯＲＦ２のヌクレオチド配列（配列番号１８）。
【図２４】短縮型ＯＲＦ２のアミノ酸配列（配列番号１９）。
【図２５】短縮型ＬｙｓＡ（‘ｌｙｓＡ）（ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４）のヌクレオチド配列（配列番号２０）。
【図２６】短縮型ＬｙｓＡ（‘ＬｙｓＡ）（ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４）のアミノ酸配列（配列番号２１）。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
（Ａ．定義）
本明細書および特許請求の範囲（このような用語に与えられる範囲を含む）の明確でかつ整合性のある理解を提供するために、以下の定義を提供する。用語「ａ」または「ａｎ」という構成要素が、一つ以上の構成要素を言及することもまた、注目されるべきである；例えば、「ポリヌクレオチド」という表現は、一つ以上のポリヌクレオチドを表わすことが理解される。
【００２８】
（アロステリック調節）
本明細書中で使用される場合、この用語は、一つ以上のリガンド（アロステリックエフェクター）が一つ以上の結合部位に結合することによる、酵素活性の調節を表している。このリガンドは、同じ分子または、異なった分子であり得る。これらの分子は、酵素活性部位以外の酵素上の結合部位で結合する。結合の結果、コンフォメーション変化が酵素の中で誘導され、これは基質または他のリガンドに対する活性部位の親和性を調節する。アロステリックエフェクターは、触媒部位の基質親和性を増大する（アロステリックアクチベーター）役割または親和性を減少する（アロステリックレプレッサー）役割を果たし得る。アロステリックエフェクターは、例えばフィードバックループのような、代謝制御機構の基礎を形成する（Ｃｏｐｅｌａｎｄ，Ｒｏｂｅｒｔ Ａ．、Ｅｎｚｙｍｅｓ．Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａ１ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ、ａｎｄ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ，２７９〜２９６頁、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９６）を参照のこと）。
【００２９】
（アミノ酸生合成経路遺伝子）
本明細書中で使用される場合、用語「アミノ酸生合成経路遺伝子」は、直接アミノ酸合成に関与する、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、および酵素をコードする、遺伝子および遺伝子フラグメントを含むことを意味する。これらの遺伝子は、宿主細胞の中で天然に存在して、宿主細胞の中でアミノ酸（特にリジン）の合成に関わる遺伝子と同一である。あるいは、このような遺伝子の改変体または変異体が存在し得、例えば、この遺伝子はこのコードされるタンパク質の活性に有意な影響を与えない改変体および変異体を含み得る。例えば、天然の遺伝子は、変異誘発、または一つ以上のヌクレオチドの導入もしくは置換、またはこの遺伝子の非必須領域を欠失させることにより改変され得る。
【００３０】
（栄養素要求株）
本明細書中で使用される場合、この用語は、増殖のために獲得性の遺伝子欠陥のために合成され得ない特定の代謝産物の外部の供給源を必要とする、微生物の株をいう。
【００３１】
（アミノ酸補充物）
本明細書中で使用される場合、この用語は、増殖のために必要とされ、そして栄養素要求株の増殖を支持するために、最少培地に添加される、アミノ酸をいう。
【００３２】
（染色体組込み）
本明細書中で使用される場合、この用語は外因性ＤＮＡフラグメントを、宿主生物の染色体へ挿入することをいい、より具体的には、この用語は、外因性ＤＮＡフラグメントと宿主細胞の染色体の適切な領域との間での相同組換えのために使用される。
【００３３】
（エンハンサー）
本明細書中で使用される場合、この用語は、プロモーター活性を刺激し、そして、そのレベル（すなわち、プロモーターの強さ）を増大させるために挿入された内因性エレメントまたは異種起源のエレメントであり得る、ＤＮＡ配列をいう。
【００３４】
（高収率誘導体）
本明細書中で使用される場合、この用語は、それが由来する親株と比較した場合、ブドウ糖から特定のアミノ酸を高収率を産生する、微生物の株をいう。
【００３５】
（宿主細胞）
本明細書中で使用される場合、用語「宿主細胞」は、用語「微生物」と置換え可能であると意図される。違いが意図される場合は、その違いは明確にされる。
【００３６】
（単離された核酸分子）
本明細書中で使用される場合、この用語は、天然の環境から取り出された、核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを意味することを意図される。例えば、ベクターの中に含まれる組換えＤＮＡ分子は、本発明の目的のために単離されると考えられる。単離されたＤＮＡ分子のさらなる例は、異種の宿主細胞において保持された組換えＤＮＡ分子、または（部分的に、または実質的に）精製された溶液中の組換えＤＮＡ分子を含む。単離されたＲＮＡ分子は、インビボまたはインビトロでの本発明のＤＮＡ分子のＲＮＡ転写物を含む。本発明に従う単離された核酸分子は合成的につくられたこのような分子をさらに含む。
【００３７】
（リジン生合成経路タンパク質）
本明細書中で使用される場合、用語「リジン生合成経路タンパク質」は、アスパラギン酸塩からリジンの合成に直接関与する、これらのペプチド、ポリペプチド、タンパク質、および酵素を含むことを意味する。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）がリジン生合成経路オペロンに関係している場合、ＯＲＦにコードされるアミノ酸配列もまた、含まれる。これらのタンパク質は、宿主細胞の中で天然に存在し、そして宿主細胞の中でリジンの合成に関与する、タンパク質と同一である。あるいは、このようなタンパク質の改変体または変異体も存在し得、例えば、このタンパク質はこのタンパク質の生物学的活性に有意な影響を与えない、改変体または変異体を含む。例えば、天然のタンパク質は、突然変異により、または一つ以上のアミノ酸を導入もしくは置換することにより、好ましくは、保存的アミノ酸置換により、またはこのタンパク質の非必須領域を除去することにより、改変され得る。このような改変は、標準的な技術により容易に行なわれる。あるいは、リジン生合成タンパク質は特定の宿主細胞に対しては、異種であり得る。このようなタンパク質は、同じまたは類似の生合成的な役割を有するタンパク質をコードする遺伝子を有する任意の生物由来であり得る。
【００３８】
（変異誘発）
本明細書中で使用される場合、この用語は、ＤＮＡ中に変異が生じるプロセスをいう。「ランダム」変異誘発を用いた場合、変異の正確な部位は予測不可能であり、微生物のゲノムの任意の場所で起こり、そして変異は、放射線または化学的処置のような因子により生じた物理的な損傷の結果生じる。ｒＤＮＡ変異誘発は、クローン化された目的のＤＮＡを対象とし、そしてこの変異誘発は、ランダムであるか、または部位特異的であり得る。
【００３９】
（変異）
本明細書中で使用される場合、この用語は、目的のヌクレオチド配列中における、一つ以上の塩基対変化、挿入もしくは欠失、またはそれらの組合せをいう。
【００４０】
（作動可能に連結される）
本明細書中で使用される場合、用語「作動可能に連結される」とは、機能的な関係にあるポリヌクレオチドエレメントの連結をいう。核酸が、別の核酸配列と機能的な関係に置かれた場合、核酸は「作動可能に連結」される。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、これがコード配列の転写に影響を与える場合、コード配列に作動可能に連結される。作動可能に連結されるとは、連結しているＤＮＡ配列が代表的には連続であって、必要であれば、連続でありかつ読取り枠中にあるように、２つのタンパク質コード領域を連結することを意味する。しかし、エンハンサーは一般に、プロモーターから数キロベース離れていて、そしてイントロン性（ｉｎｔｒｏｎｉｃ）配列が様々な長さであり得る場合に、機能するのため、いくつかのポリヌクレオチドエレメントは作動可能に連結し得るが連続ではない。
【００４１】
（オペロン）
本明細書中で使用される場合、この用語は、転写複合体（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｌｅｘ）の連続な部分をいい、この中ではポリペプチドをコードする２つ以上のオープンリーディングフレームが、シス作用するプロモーターおよび効率的な転写にとって必要なシス作用する配列、ならびに効率的な転写および翻訳にとって重要な、さらなるシス作用する配列（例えば、ｍＲＮＡ安定性調節領域および転写終結領域）により制御される多シストロン性（ｍｕｌｔｉ−ｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）のメッセンジャーＲＮＡとして、転写される。この用語はまた、一般に、遺伝子の発現および調節（ＤＮＡ中の、構造遺伝子および調節エレメントを含む）の単位を言う。
【００４２】
（親株）
本明細書中で使用される場合、この用語は、本発明の宿主細胞を生み出すように処置のいくつかの形態を受けた、宿主細胞の株をいう。
【００４３】
（ブドウ糖からの収率パーセント）
本明細書中で使用される場合、この用語は、以下の式で定義されたブドウ糖からのアミノ酸の収率をいう：［（産生されたアミノ酸（ｇ）／消費されたブドウ糖（ｇ））＊１００］＝パーセント収率。
【００４４】
（表現型）
本明細書中で使用される場合、この用語は、宿主細胞の遺伝子構成に依存的な観察可能な身体的な特徴をいう。
【００４５】
（プロモーター）
本明細書中で使用される場合、用語「プロモーター」は、当該分野で認識された意味を有し、ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写の開始を提供するＤＮＡ配列を含む遺伝子の部分を示し、従って、コード配列または機能的なＲＮＡの発現を制御し得るＤＮＡ配列をいう。プロモーター配列は一般に、しかし常にではないが、遺伝子の５’非コード領域に見出される。一般に、コード配列はプロモーター配列に対して３’に位置する。転写開始において機能するプロモーター内の配列エレメントはしばしば、コンセンサスヌクレオチド配列により特徴付けられる。プロモーター配列は、近位および、より遠位の上流エレメント（エンハンサー）からなる。本明細書中で使用される場合、用語「内因性プロモーター」は、宿主微生物中に天然に存在するプロモータ−配列であるプロモーター配列をいう。用語「異種プロモーター」とは、その宿主微生物中に天然に存在しないプロモータ−配列であるプロモーター配列をいう。異種として存在するプロモーター配列は、任意の原核生物または真核生物由来であり得る。合成プロモーターは、プロモーター活性を有するが、天然には通常は見出されない、ヌクレオチド配列である。
【００４６】
プロモーターは全体として、天然の遺伝子に由来し得るか、またはハイブリッドプロモーターであり得る。ハイブリッドプロモーターは、天然において見出される異なるプロモーターに由来する異なるエレメントから構成されるか、または合成ＤＮＡセグメントを含みさえする。ハイブリッドプロモーターは、構成的、誘導的または環境応答的であり得る。
【００４７】
有用なプロモーターは構成的および誘導的プロモーターを含む。多くのこのようなプロモーター配列は当該分野で公知である。例えば、米国特許第４，９８０，２８５号；同５，６３１，１５０号；同５，７０７，８２８号；同５，７５９，８２８号；同５，８８８，７８３号；同５，９１９，６７０号およびＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照のこと。他の有用なプロモーターは、ある特定の（または公知の）インデューサー分子に対して構成的でも応答的でもないプロモーターを含む。このようなプロモーターは、発生上の手掛かり（例えば、培養の増殖期）、または環境的な手掛かり（例えばｐＨ、浸透圧（ｏｓｍｏｔｉｃｕｍ）、熱、または細胞密度）に応答するプロモーターを含み得る。
【００４８】
誘導的プロモーターにより転写に影響を与え得る環境条件の例としては、嫌気性条件、上昇した温度、または光の存在が挙げられる。異なったプロモーターが異なった細胞のタイプにおいて、または異なった環境条件に応答して、遺伝子の発現を方向づけ得ることが、当業者に理解される。ほとんどの時間で、ほとんどの細胞のタイプにおいて遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」として言及される。多くの場合において、調節配列の正確な境界は、完全に規定されていないので、異なった長さのＤＮＡフラグメントが同一または類似のプロモーター活性を有し得ることが、さらに認識される。
【００４９】
（相対的増殖）
本明細書中で使用される場合、この用語は、規定した時間および規定した培地において、親株の増殖と子孫株の増殖を直接的に比較することにより、増殖の評価を提供する測定をいう。
【００５０】
（転写因子）
本明細書中で使用される場合、用語「転写因子」は、ＲＮＡポリメラーゼ、および、ＤＮＡと配列特異的な様式で相互作用して転写調節効果を発揮する他のタンパク質をいう。転写因子は、転写阻害タンパク質または転写アクチベータータンパク質であり得る。本発明における状況で、転写因子（または、転写複合体）についての結合部位はしばしば、転写調節エレメントに含まれる。
【００５１】
（転写因子認識部位）
本明細書中で使用される場合、「転写因子認識部位」および「転写因子結合部位」は、頻繁に直接的なタンパク質−ＤＮＡ結合の形態をとる、一つ以上の転写因子の配列特異的相互作用のための部位として同定されるポリヌクレオチド配列また配列モチーフをいう。代表的には、転写因子結合部位は、ＤＮＡフットプリンティング、ゲル移動度シフトアッセイ（ｇｅｌ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｓｈｉｆｔ ａｓｓａｙｓ）などにより同定され得、そして／または公知のコンセンサス配列モチーフに基づいて、もしくは他の当業者に公知の方法により予測され得る。
【００５２】
（転写複合体）
本明細書中で使用される場合、用語「転写単位」または「転写複合体」は、構造遺伝子（一つ以上のエキソン）、シス作用的に連結するプロモーターおよび構造配列の効率的な転写に必要な一つ以上の別のシス作用する配列、この構造配列の適切な転写に必要な遠位の調節エレメント、ならびに効率的な転写または翻訳に重要なさらなるシス配列（例えば、ポリアデニル部位、ｍＲＮＡ安定性調節配列）を含む、ポリヌクレオチド配列をいう。例えば、米国特許第６，０５７，２９９号を参照のこと。
【００５３】
（転写調節エレメント）
本明細書中で使用される場合、用語「転写調節エレメント」は、単独または一つ以上の他のＤＮＡと組合せて転写を活性化するＤＮＡ配列をいう。転写調節エレメントとして、例えば、プロモーター、応答エレメント、ネガティブ調節エレメント、サイレンサーエレメント、遺伝子サプレッサ−および／またはエンハンサーが挙げられる。例えば、米国特許第６，０５７，２９９号を参照のこと。
【００５４】
（Ｂ．微生物および組換えＤＮＡの方法論）
本明細書中で提供されたような本発明は、微生物学および組換えＤＮＡ技術の当業者に公知の、いくつかの方法および技術を使用する。細菌細胞の増殖、単離したＤＮＡ分子の宿主細胞への導入、ならびに単離した核酸分子の単離、クローニング、および塩基配列決定などについての、方法および技術は、このような方法および技術のわずかばかりの例である。これらの方法および技術は、例えば以下に示すような多くの標準的な実験室マニュアルに記載されている：Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９８６）、Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９７２）；Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ、Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）；Ｍ．ＳｉｎｇｅｒおよびＰ．Ｂｅｒｇ、Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｇｅｎｏｍｅｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｏｏｋｓ、Ｍｉｌｌ Ｖａｌｌｅｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９１）；Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ｐ．Ｂ．Ｋａｕｆｍａｎら、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａ（１９９５）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂ．Ｒ．ＧｌｉｃｋおよびＪ．Ｅ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａ（１９９３）；ならびにＰ．Ｆ．Ｓｍｉｔｈ−Ｋｅａｒｙ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｔｈｅ Ｇｕｉｌｆｏｒｄ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ（１９８９）。これらは、本明細書中で全体が参考として援用される。
【００５５】
別段に示されなければ、本明細書中で新たに記載される全てのヌクレオチド配列は、自動ＤＮＡシークエンサー（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．製ｔｈｅ Ｍｏｄｅｌ ３７３）を使用して決定された。それゆえに、当該分野で公知のように、この自動化されたアプローチにより決定された任意のＤＮＡ配列について、本明細書中で決定された任意のヌクレオチド配列は、いくつかの誤差を含み得る。自動化により決定されたヌクレオチド配列は、配列決定されたＤＮＡ分子の現実のヌクレオチド配列に対して、代表的には、少なくとも約９０％同一であり、より代表的には少なくとも約９５％〜少なくとも約９９．９％同一である。現実の配列は、当該分野で周知の手動によるＤＮＡ配列決定方法を含む別のアプローチにより、より正確に決定され得る。
【００５６】
特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１７、配列番号１８および配列番号２０、またはこれらの相補的な配列からなる群より選択された配列に少なくとも、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一な配列の核酸を含む。
【００５７】
核酸の配列が、参照したヌクレオチド配列に対して少なくとも、例えば、９５％同一である、核酸を含むヌクレオチドにより、この核酸配列が、参照した核酸配列の各１００ヌクレオチドあたり５つのミスマッチまでを含み得るをことを除いては、参照配列に同一であることが意図される。換言すれば、核酸の配列が参照する核酸配列に対して、少なくとも９５％同一である核酸を得るために、参照配列中での５％までヌクレオチドが、欠失もしくは別のヌクレオチドで置換され得るか、または参照した配列の中の、全ヌクレオチドの５％までの数のヌクレオチドが、参照配列に挿入され得る。参照（問合せ）配列は、以下に記載するように、配列番号１７、配列番号１８、もしくは配列番号２０に示された全ヌクレオチド配列の任意の１つの配列、またはこれらの配列中の任意のものの任意のフラグメントである。
【００５８】
実際的な問題として、任意の特定の核酸配列が、例えば、配列番号１７、配列番号１８、もしくは配列番号２０、またはこれらに相補的な配列からなるヌクレオチド配列に対して、少なくとも、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である否かは、従来どおり、ＯＭＩＧＡ（登録商標）のＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用のＶｅｒｓｉｏｎ２．０（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ、Ｌｔｄ．（Ｏｘｆｏｒｄ、Ｕ．Ｋ．）で入手可能）のような配列解析コンピュータプログラムを使用することにより決定され得る。ＯＭＩＧＡは、オープンギャップペナルティーが１０、そして伸長ギャップペナルティが５．０である初期設定値で、遅い完全な（ｓｌｏｗ ｆｕｌｌ）ダイナミックプログラミングアライメント法を用いるＣＬＵＳＴＡＬ Ｗアライメントアルゴリズムを、２つのヌクレオチド配列間における最良のアライメントを求めるために使用する。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗまたは任意の他の配列アライメントプログラムを使用して、特定の配列が、例えば、本発明に関する参照配列に対して９５％同一であるか否かを決定する場合、当然、参照配列中のヌクレオチドの総数の５％までのギャップ、ミスマッチ、または挿入が認められるように、参照配列の全長に亘って同一性パーセントを計算するように、パラメータを設定する。当該分野で公知である他の配列解析プログラムが、本発明の実施において使用され得る。
【００５９】
本発明のこの実施形態は、核酸を含むポリヌクレオチドに関し、この核酸の配列は、これらが機能的な活性を有しているか否かは関係がなく、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号２０、またはこれらの相補配列の核酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。これは、たとえ特定のポリヌクレオチドが機能的活性を有していない場合でさえ、当業者は、例えば、ハイブリダイゼーションプローブ、Ｓ１ヌクレアーゼマッピングプローブ、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーをとして、この核酸分子の使用の方法を知っているからである。
【００６０】
しかし、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号２０、あるいはこれらの相補配列の核酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である、核酸配列であって、実際にＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種において、での機能活性を有する核酸配列を含有する、ポリヌクレオチドが好ましい。
【００６１】
例えば、ポリペプチドの参照核酸配列に対して少なくとも、９５％「同一」なアミノ酸配列を有するポリペプチドにより、以下のことが意図される：請求されるポリペプチド配列が、そのポリペプチドの参照アミノ酸配列の各１００アミノ酸当たり５つまでのアミノ酸の改変を含み得ることを除いては、特許請求されるポリペプチドのアミノ酸配列が参照配列と同一である。換言すると、参照配列に対して少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、参照配列内でアミノ酸残基５％までが欠失または別のアミノ酸と置換され得るか、あるいは、参照配列中の全アミノ酸残基における５％までの複数のアミノ酸が、参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの改変は、参照アミノ酸配列のアミノ末端位置またはカルボキシ末端位置あるいはこれらの末端位置間の任意の位置で起こり得、参照配列中の残基間で個々に、または参照配列中の一つ以上の連続した群のいずれかに散在する。
【００６２】
実際的な問題として、任意の特定ポリペプチドが、例えば、配列番号２で示されたアミノ酸配列または核酸によりコードされたアミノ酸配列に対して、少なくとも、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるか否かは、Ｂｅｓｔｆｉｔ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標）， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ５３７１１）のような公知のコンピュータプログラムを使用して慣用的に決定され得る。Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列アライメントプログラムを使用して、特定の配列が、例えば、本発明に従った参照配列に対して９５％同一か否かを決定する場合、当然、同一性パーセントを、参照アミノ酸配列の全長に亘って計算し、参照配列のアミノ酸残基の総数の５％までの相同性におけるギャップが認められるように、パラメータを設定する。
【００６３】
特定の実施形態において、参照配列（問合せ配列、本発明の配列）と対象配列（ｓｕｂｊｅｃｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）との間の同一性はまた、グローバル配列アライメントと呼ばれ、Ｂｒｕｔｌａｇらのアルゴリズム（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０））に基づいたＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを用いて、決定される。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸アライメントで使用される好ましいパラメータは、以下である：マトリックス＝ＰＡＭ ０、ｋ−タプル（ｋ−ｔｕｐｌｅ）＝２、ミスマッチペナルティ（Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ）＝ｌ、結合ペナルティ（Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ）＝２０、乱雑化グループ長（Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ）＝０、カットオフスコア＝ｌ、ウインドウサイズ＝配列長、ギャップペナルティ＝５、ギャップサイズペナルティ＝０．０５、ウインドウサイズ＝５００あるいは対象アミノ酸配列の長さのうち、どちらか短い方。
【００６４】
この実施形態に従って、対象配列が、内部欠失に起因したわけではなく、Ｎ末端またはＣ末端の欠失に起因して、問合せ配列より短い場合、ＦＡＳＴＤＢプログラムは、グローバルの同一性パーセントを計算する際に、対象配列のＮおよびＣ末端が打ち切られることを考慮しないという事実を考慮して、手動による修正が結果に対して行われる。ＮおよびＣ末端が打ち切られた対象配列について、問合せ配列に関して、同一性パーセントは、対応する対象残基と一致／アライメントされていない、対象配列のＮおよびＣ末端である問合せ配列の残基数を、問合せ配列の全塩基のパーセントとして、計算することにより修正される。残基が一致／アライメントしたか否かの決定は、ＦＡＳＴＤＢ配列アライメントの結果によって決定される。次いで、このパーセントを、特定のパラメータを使用して上記のＦＡＳＴＤＢプログラムにより計算された、同一性パーセントから差し引くことにより、最終的な同一性パーセントの値に帰着する。この最終的な同一性パーセント値が、この実施形態の目的のために使用されるものである。問合せ配列と一致／アライメントがなされていない、対象配列のＮおよびＣ末端に対する残基のみが、同一性パーセント値を手動で調節する目的のために考慮される。すなわち、問合せ残基のみが、対象配列の最も遠位にあるＮ末端およびＣ末端残基の外側に位置する。例えば、９０アミノ酸残基の対象配列は１００残基の問合せ配列とアライメントして、同一性パーセントを決定する。欠失が対象配列のＮ末端において起こり、そして、それゆえにＦＡＳＴＤＢアライメントは、Ｎ末端における最初の１０残基の一致／アライメントを示さない。１０つの不対残基は、この配列の１０％を表す（Ｎ末端およびＣ末端の不一致である残基数／問合せ配列における残基の総数）。従って、１０％が、ＦＡＳＴＤＢプログラムにより計算された同一性パーセント値から差し引かれる。仮に残りの９０残基が完全に一致していた場合、最終的な同一性パーセントは９０％となる。別の実施例において、９０残基の対象配列は、１００残基の問合せ配列と比較される。この時、欠失が内部欠失であるので、問合せ配列と一致／アライメントをしない対象配列のＮまたはＣ末端において残基は存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢにより計算された同一性パーセントは、手動により修正されない。今一度、これらは問合せ配列と一致／アライメントしていない対象配列のＮおよびＣ末端の外側に位置する残基のみが、ＦＡＳＴＤＢアライメントにおいて示されているように、手動で修正される。他の手動による修正は、この実施形態の目的のためになされない。
【００６５】
（Ｃ．本発明の方法およびプロセス）
本発明の種々の実施形態は、アミノ酸の産生を増加させるための方法、およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種宿主細胞由来のアミノ酸の産生のためのプロセスを提供する。特に、本発明の方法およびプロセスの好ましいＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種としては、当該分野で公知のＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、ならびに他のＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ種およびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａ種が挙げられる。
【００６６】
当業者によって理解されるように、用語「Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種」は、以前に、文献中で「Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ種」として同定されたそれらの生物（例えば、現在ではＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に種別変更されたＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍおよびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）を含む（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．４１：２５５（１９８１））。
【００６７】
本明細書に記載される方法およびプロセスによって具体化されるアミノ酸生合成経路遺伝子は、Ｌ−グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−チロシン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、およびＬ−バリンの生合成についての遺伝子を含む。特に好ましい実施形態は、Ｌ−リジン（Ｓａｈｍら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８２：２５−３９（１９９６））、Ｌ−トレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−トリプトファン、およびＬ−バリンについての生合成経路遺伝子に関する。
【００６８】
例示の目的で、リジン生合成についてのアミノ酸経路は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種におけるアミノ酸生産の当業者に周知である。Ｌ−アスパラギンのＬ−リジンへの変換のために重要である酵素をコードする遺伝子は、ａｓｋ遺伝子、ａｓｄ遺伝子、ｄａｐＡ遺伝子、ｄａｐＢ遺伝子、ｄｄｈ遺伝子およびｌｙｓＡ遺伝子を含む（図１）。従って、本発明は、本明細書中において、例示的な目的のみのために、Ｌ−リジン生合成経路遺伝子を利用する特定の実施形態を提供する。他のアミノ酸の合成についての生合成経路遺伝子の使用に関する他の実施形態はまた、本明細書中に記載される本発明によって含まれる。
【００６９】
アミノ酸の産生を増加させるための方法および本発明のアミノ酸の産生のためのプロセスは両方とも、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種宿主細胞への、単離された核酸分子の形質転換を必要とする工程を利用する。当業者に公知のように、単離された核酸分子の宿主細胞への形質転換は、エレクトロポレーション、形質導入または他の方法によってもたらされ得る。これらの方法は、本明細書において参考および援用されかつ組み込まれる多数の標準的な実験室取り扱い説明書中に記載される。
【００７０】
アミノ酸の産生を増加させるための方法および本発明のアミノ酸の産生のためのプロセスは両方とも、少なくとも１つのアミノ酸生合成経路遺伝子の増幅を必要とする工程を利用する。当業者に対して公知のように、用語「増幅」は、アミノ酸生合成経路の遺伝子の数を、当該分野で公知の任意の手段によって増加させることを意味する。特に増幅の好ましい手段としては、以下が挙げられる：（１）挿入による（例えば、相同組換えによる）、生合成経路の遺伝子のコピーを含む単離された核酸分子の宿主細胞の染色体への付加、および（２）自己複製する染色体外ベクター（例えばプラスミド）による、生合成経路の遺伝子のコピーを含む単離された核酸分子の宿主細胞への付加。
【００７１】
アミノ酸の産生を増加させる本発明の別の方法は、少なくとも１つのアミノ酸生合成経路遺伝子の発現を増加させる工程を包含する。発現を増加させる好ましい方法は、異種プロモーター、調節されたプロモーター、調節されていないプロモーター、およびこれらの組み合わせを使用する工程を包含する。
【００７２】
単離された核酸分子を宿主細胞の染色体へ挿入する方法は、当業者に公知である。例えば、単離された核酸分子のＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種の染色体への挿入は、Ｊｏｂｌｉｎｇ，Ｍ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １８（１７）：５３１５−５３１６（１９９０提出）によって記載されるｐＫ１８４プラスミドを利用して行われ得る。これらのベクターはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種の複製の起点を欠失し、かつカナマイシン（ｋａｎ）のような選択マーカーを含むので、このベクターが相同組換えによって宿主細胞染色体へ挿入される場合、細胞は選択下で成長することのみ可能である。
【００７３】
代替の実施形態において、本発明はまた、アミノ酸産生を増加させるための方法およびアミノ酸の産生のためのプロセスを提供し、ここで生合成経路遺伝子の増幅は、アミノ酸生合成経路遺伝子をコードする単離された核酸分子を含む自己複製する染色体外ベクター（例えば、プラスミド）の宿主細胞への導入を通じて達成される。これらの実施形態について適切なプラスミドは、ｐＳＲ１、およびｐＳＲ１の他の誘導体を含む（Ａｒｃｈｅｒ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３９：１７５３−１７５９（１９９３））。
【００７４】
アミノ酸の産生を増加させるための方法に関する本発明の種々の実施形態について、アミノ酸（例えば、Ｌ−リジン）の増加された産生をスクリーニングする工程は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種宿主株によって培養物中に産生されたＬ−リジンの量を、アミノ酸生合成遺伝子が増幅されるＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種の形質転換された宿主細胞株の量と直接的に比較することによって決定され得る。選択されたアミノ酸の産生のレベルは、ブドウ糖から生成されるパーセントを計算するための以下の式によって簡便に決定され得る：［（ｇアミノ酸／Ｌ）／（ｇ消費されたブドウ糖／Ｌ）］＊１００。
【００７５】
１つの実施形態において、本発明は、以下の工程を包含するアミノ酸の産生を増加させるための方法を提供する：（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子で、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種宿主細胞を形質転換する工程；（ｂ）上記宿主細胞の染色体中の、少なくとも１つの上記アミノ酸についての生合成経路遺伝子の数を増幅する工程；（ｃ）形質転換された宿主細胞を選択する工程；および（ｄ）上記形質転換された宿主細胞由来のアミノ酸の、上記宿主細胞と比較して増加された生産についてスクリーニングする工程。
【００７６】
特に好ましい実施形態において、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含みかつさらに以下の少なくとも１つを含む単離されたポリヌクレオチド分子で、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種宿主細胞を形質転換する工程を包含するアミノ酸の産生の増加させるための方法を提供する：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ａｓｄアミノ酸配列をコードする核酸分子；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ｄａｐＡアミノ酸配列をコードする核酸分子；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ｄａｐＢアミノ酸配列をコードする核酸分子；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ｄｄｈアミノ酸配列をコードする核酸分子；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路‘ｌｙｓＡアミノ酸配列をコードする核酸分子；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ｌｙｓＡアミノ酸配列をコードする核酸分子；およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする核酸分子。
【００７７】
本方法の別の特定の実施形態において、単離されたポリヌクレオチド分子はさらに、以下の少なくとも１つを含む：配列番号４のａｓｄアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号６のｄａｐＡアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号８のｄａｐＢアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号１０のｄｄｈアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号２１の‘ｌｙｓＡアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号１４のｌｙｓＡアミノ酸配列をコードする核酸分子；および配列番号１６のＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする核酸分子。
【００７８】
本方法の別の特定の実施形態において、単離されたポリヌクレオチド分子はさらに、以下を含む：配列番号４のａｓｄアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号６のｄａｐＡアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号８のｄａｐＢアミノ酸配列をコードする核酸分子；および配列番号１６のＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする核酸分子。
【００７９】
本方法の別の特定の実施形態において、単離されたポリヌクレオチド分子はさらに、以下を含む：配列番号４のａｓｄアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号６のｄａｐＡアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号８のｄａｐＢアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号１０のｄｄｈアミノ酸配列をコードする核酸分子；および配列番号１６のＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする核酸分子。
【００８０】
本方法の別の特定の実施形態において、単離されたポリヌクレオチド分子はさらに、以下を含む：配列番号４のａｓｄアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号６のｄａｐＡアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号８のｄａｐＢアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号１０のｄｄｈアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号２１の‘ｌｙｓＡアミノ酸配列をコードする核酸分子；および配列番号１６のＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする核酸分子。
【００８１】
本方法の別の特定の実施形態において、ポリヌクレオチド分子はさらに、以下を含む：配列番号４のａｓｄアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号６のｄａｐＡアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号８のｄａｐＢアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号１０のｄｄｈアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号１４のｌｙｓＡアミノ酸配列をコードする核酸配列；および配列番号１６のＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする核酸分子。
【００８２】
本方法の別の実施形態において、この方法はさらに、培地中の上記形質転換された宿主細胞を増殖させる工程；および上記形質転換された宿主細胞によって産生されたアミノ酸を精製する工程を包含する。
【００８３】
本発明の別の目的は、以下を含むポリヌクレオチド分子を含む単離されたポリヌクレオチドを提供することである：配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；ならびに、ａｓｄポリペプチドをコードする核酸分子、ｄａｐＡポリペプチドをコードする核酸分子、ｄａｐＢポリペプチドをコードする核酸分子、ｄｄｈポリペプチドをコードする核酸分子、‘ｌｙｓＡポリペプチドをコードする核酸分子、ｌｙｓＡポリペプチドをコードする核酸分子、ＯＲＦ２ポリペプチドをコードする核酸分子からなる群から選択される少なくとも１つのさらなるＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路遺伝子。好ましい実施形態において、上記ａｓｄポリペプチドは配列番号４；上記ｄａｐＡポリペプチドは配列番号６；上記ｄａｐＢポリペプチドは配列番号８；上記ｄｄｈポリペプチドは配列番号１０；上記‘ｌｙｓＡポリペプチドは配列番号２１；上記ｌｙｓＡポリペプチドは配列番号１４；および上記ＯＲＦ２ポリペプチドは配列番号１６である。
【００８４】
本発明の別の目的は、以下を含むポリヌクレオチド分子を含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供することである：配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；配列番号４のａｓｄアミノ酸配列をコードする核酸分子、配列番号６のｄａｐＡアミノ酸配列をコードする核酸分子、配列番号８のｄａｐＢアミノ酸配列をコードする核酸分子、および配列番号１６のＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする核酸分子。
【００８５】
本発明の別の目的は、以下を含むポリヌクレオチド分子を含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供することである：配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；配列番号４のａｓｄアミノ酸配列をコードする核酸分子、配列番号６のｄａｐＡアミノ酸配列をコードする核酸分子、配列番号８のｄａｐＢアミノ酸配列をコードする核酸分子、配列番号１０のｄｄｈアミノ酸配列をコードする核酸分子、および配列番号１６のＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする核酸分子。
【００８６】
本発明の別の目的は、以下を含むポリヌクレオチド分子を含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供することである：配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；配列番号４のａｓｄアミノ酸配列をコードする核酸分子、配列番号６のｄａｐＡアミノ酸配列をコードする核酸分子、配列番号８のｄａｐＢアミノ酸配列をコードする核酸分子、配列番号１０のｄｄｈアミノ酸配列をコードする核酸分子、配列番号２１の‘ｌｙｓＡアミノ酸配列をコードする核酸配列、および配列番号１６のＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする核酸分子。
【００８７】
本発明の別の目的は、以下を含むポリヌクレオチド分子を含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供することである：配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；配列番号４のａｓｄアミノ酸配列をコードする核酸分子、配列番号６のｄａｐＡアミノ酸配列をコードする核酸分子、配列番号８のｄａｐＢアミノ酸配列をコードする核酸分子、配列番号１０のｄｄｈアミノ酸配列をコードする核酸分子、配列番号１４のｌｙｓＡアミノ酸配列をコードする核酸配列、および配列番号１６のＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする核酸分子。
【００８８】
本発明のさらなる目的は、ｐＫ１８４−ＫＤＡＢを含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供することである。本発明のさらなる目的は、ｐＫ１８４−ＫＤＡＢＨ’Ｌを含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供することである。本発明のさらなる目的は、ｐＤ１１−ＫＤＡＢＨ’Ｌを含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供することである。本発明のさらなる目的は、ｐＤ２−ＫＤＡＢＨＬを含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供することである。
【００８９】
本発明のさらなる目的は、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子を含みかつさらに以下からなる群から選択される少なくとも１つのさらなるＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路遺伝子を含むベクターを提供することである：ａｓｄポリペプチドをコードする核酸分子；ｄａｐＡポリペプチドをコードする核酸分子；ｄａｐＢポリペプチドをコードする核酸分子；ｄｄｈポリペプチドをコードする核酸分子；‘ｌｙｓＡポリペプチドをコードする核酸分子；ｌｙｓＡポリペプチドをコードする核酸分子；およびＯＲＦ２ポリペプチドをコードする核酸分子。
【００９０】
さらなる目的は、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子含みかつさらに以下からなる群から選択される少なくとも１つのさらなるＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路遺伝子を含むベクターを含む宿主細胞を提供することである：ａｓｄポリペプチドをコードする核酸分子；ｄａｐＡポリペプチドをコードする核酸分子；ｄａｐＢポリペプチドをコードする核酸分子；ｄｄｈポリペプチドをコードする核酸分子；‘ｌｙｓＡポリペプチドをコードする核酸分子；ｌｙｓＡポリペプチドをコードする核酸分子；およびＯＲＦ２ポリペプチドをコードする核酸分子。
【００９１】
さらなる目的は、宿主細胞を提供することであり、ここでこの宿主細胞は、以下からなる群から選択されるＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍである：Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２１８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２１９、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２２０、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２２１、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２２２、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２３４およびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２３５。別の実施形態において、宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５αＭＣＲ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２２８である。別の実施形態において、宿主細胞は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２３６およびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２３７からなる群から選択されるＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである。
【００９２】
本発明はアミノ酸の産生のためのプロセスを提供する。１つの実施形態において、本発明は、以下の工程を包含するアミノ酸を生産するためのプロセスを提供する：（ａ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種宿主細胞を単離された核酸分子で形質転換する工程；（ｂ）上記核酸に対する少なくとも１つの生合成経路遺伝子の染色体コピーの数を増幅する工程；（ｃ）形質転換された宿主細胞を選択する工程；（ｄ）培地中で上記形質転換された細胞を増殖させる工程；および（ｅ）上記アミノ残を精製する工程。
【００９３】
本発明はまた、配列番号１９のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドに関する。本発明の１つの実施形態において、このポリペプチドは、配列番号１９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。本発明はまた、配列番号１９のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子に関する。１つの実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１８の配列を有する核酸を含む。
【００９４】
本発明はまた、配列番号１９のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含むベクターに関する。１つの実施形態において、本発明は、配列番号１９のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするベクターを含む宿主細胞に関する。１つの実施形態において、この宿主細胞は、ＮＲＲＬ Ｂ３０３６０である。
【００９５】
本発明はまた、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種宿主細胞を、配列番号１９のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子で形質転換する工程、および形質転換された宿主細胞を選択する工程を包含する方法に関する。１つの実施形態において、本方法はさらに、増加されたアミノ酸産物をスクリーニングする工程を包含する。好ましい実施形態において、スクリーニングされるアミノ酸は、リジンである。１つの実施形態において、ポリヌクレオチド分子は、上記宿主細胞の染色体に結合され、それにより、上記宿主細胞の染色体中の上記アミノ酸生合成経路遺伝子の総数を増加させる。
【００９６】
別の実施形態において、ポリヌクレオチド分子はさらに、以下の少なくとも１つを含む：（ａ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ａｓｋアミノ酸配列をコードする核酸分子；（ｂ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ａｓｄアミノ酸配列をコードする核酸分子；（ｃ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ｄａｐＡアミノ酸配列をコードする核酸分子；（ｄ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ｄａｐＢアミノ酸配列をコードする核酸分子；（ｅ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ｄｄｈアミノ酸配列をコードする核酸分子；（ｆ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路‘ｌｙｓＡアミノ酸配列をコードする核酸分子；（ｇ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ｌｙｓＡアミノ酸配列をコードする核酸分子；および（ｈ）配列番号１６を有するＯＲＦ２ポリヌクレオチドをコードする核酸分子。この実施形態において、本方法はさらに、増加されたアミノ酸産物をスクリーニングする工程を包含する。別の実施形態において、スクリーニングされるアミノ酸は、リジンである。
【００９７】
本方法の別の実施形態において、ポリヌクレオチド分子は、さらに以下を含む：（ａ）配列番号２を有するａｓｋアミノ酸配列をコードする核酸分子；（ｂ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ａｓｄアミノ酸配列をコードする核酸分子；（ｃ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ｄａｐＢアミノ酸配列をコードする核酸分子；（ｄ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ｄｄｈアミノ酸配列をコードする核酸分子；および（ｅ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ｌｙｓＡアミノ酸配列をコードする核酸分子。この方法の１つの実施形態において、本方法はさらに、増加されたアミノ酸産物をスクリーニングする工程を包含する。
【００９８】
本発明はまた、配列番号２１のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドに関する。１つの実施形態において、このポリペプチドは、配列番号２１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。本発明はまた、配列番号２１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを含む。本発明はさらに、配列番号２０の配列を有する核酸を含むポリヌクレオチド分子を含む。１つの実施形態において、本発明は、配列番号２１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含むベクターを含む。本発明は、さらに、配列番号２１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含むベクターを含む宿主細胞を含む。
【００９９】
１つの実施形態において、本発明は、ＮＲＲＬ Ｂ３０２１８、ＮＲＲＬ Ｂ３０２２０およびＮＲＲＬ Ｂ３０２２２からなる群より選択される宿主細胞を含む。
【０１００】
本発明は、さらに配列番号２１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子でＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種宿主細胞を形質転換する工程、および形質転換された宿主細胞を選択する工程を包含する方法に関する。この方法はさらに、増加されたアミノ酸産物、特に、リジン産物をスクリーニングする工程を包含する。１つの実施形態において、ポリヌクレオチド分子は、上記宿主細胞の染色体に結合され、それにより、上記宿主細胞の染色体中の上記アミノ酸生合成経路遺伝子の総数を増加させる。１つの実施形態において、本方法はさらに、以下の少なくとも１つを含むポリヌクレオチド分子を含む：（ａ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ａｓｋアミノ酸配列をコードする核酸分子；（ｂ）配列番号２を有するＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ａｓｋアミノ酸配列をコードする核酸分子；（ｃ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ａｓｄアミノ酸配列をコードする核酸分子；（ｄ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ｄａｐＡアミノ酸配列をコードする核酸分子；（ｅ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ｄａｐＢアミノ酸配列をコードする核酸分子；（ｆ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ｄｄｈアミノ酸配列をコードする核酸分子；（ｇ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする核酸分子；および（ｈ）短縮型Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする核酸分子。１つの実施形態において、本方法はさらに、増加されたアミノ酸産物をスクリーニングする工程を包含する。別の実施形態において、スクリーニングされるアミノ酸は、リジンである。
【０１０１】
本発明の別の実施形態はまた、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子に関し、ここで、このポリヌクレオチド分子はさらに、配列番号１７を有するプロモーター配列を含む。１つの実施形態において、このプロモーター配列は、配列番号１７に対して少なくとも９５％同一な配列を有する。１つの実施形態において、配列番号１７に対して少なくとも９５％同一な配列を有するこのプロモーター配列は、ＬｙｓＡ遺伝子に作動可能に直接連結される。本発明の別の実施形態において、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子を含むベクターが存在し、ここで、このポリヌクレオチド分子はさらに、プロモーター配列を含み、ここで、このプロモーター配列は、配列番号１７に対して少なくとも９５％同一な配列を有する。本発明の別の局面において、ベクター（配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子を含む）を含む宿主細胞が存在し、ここで、このポリヌクレオチド分子はさらに、配列番号１７に対して少なくとも９５％同一な配列を有するプロモーター配列を含む。１つの実施形態において、宿主細胞は、ＮＲＲＬ Ｂ３０３５９である。
【０１０２】
本発明はまた、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種の宿主細胞を配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を用いて形質転換する工程、そして形質転換された宿主細胞を選択する工程を包含する方法に関し、ここで、このポリヌクレオチド分子はさらに、配列番号１７に対して少なくとも９５％同一な配列を有するプロモーターを含む。１つの実施形態において、本方法はさらに、増加したアミノ酸産物をスクリーニングする工程を包含する。別の実施形態において、スクリーニングされたアミノ酸は、リジンである。本方法の別の実施形態において、ポリヌクレオチド分子は、この宿主細胞の染色体に組込まれ、それによってこの宿主細胞の染色体においてアミノ酸生合成経路の遺伝子の総数を増加する。本方法の別の実施形態において、このポリヌクレオチド分子はさらに、以下の少なくとも１つを含む：（ａ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ａｓｄアミノ酸配列をコードする核酸分子；（ｂ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ｄａｐＡアミノ酸配列をコードする核酸分子；（ｃ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ｄａｐＢアミノ酸配列をコードする核酸分子；（ｄ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ｄｄｈアミノ酸配列をコードする核酸分子；（ｅ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする核酸分子；（ｆ）短縮型Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする核酸分子；（ｇ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ｌｙｓＡアミノ酸配列をコードする核酸分子；および、（ｈ）短縮型Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ｌｙｓＡアミノ酸配列をコードする核酸分子。この実施形態において、本方法はさらに、増加したアミノ酸産物；特に、リジン産物についてスクリーニングする工程を包含する。
【０１０３】
本方法の異なる実施形態において、ポリヌクレオチド分子は、以下を含む：（ａ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ａｓｄアミノ酸配列をコードする核酸分子；（ｂ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ｄａｐＡアミノ酸配列をコードする核酸分子；（ｃ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ｄａｐＢアミノ酸配列をコードする核酸分子；（ｄ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ｄｄｈアミノ酸配列をコードする核酸分子；（ｅ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする核酸分子；および（ｆ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ｌｙｓＡアミノ酸配列をコードする核酸分子。この実施形態において、本方法はさらに、増加したアミノ酸産物をスクリーニングする工程を包含する。好ましい実施形態において、このアミノ酸は、リジンである。
【０１０４】
当業者に公知の種々の培地を用いて、アミノ酸産生のための細胞の増殖を補助し得る。適切な炭素源の具体的な例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：炭水化物（例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、デンプン水解物、セルロース水解物、および糖蜜）；有機酸（例えば、酢酸、プロピオン酸、ギ酸、リンゴ酸、クエン酸、およびフマル酸）；ならびに、アルコール（例えば、グリセロール）。適切な窒素源の具体的な例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アンモニア（アンモニアガスおよびアンモニア水を含む）；無機酸のアンモニア塩または有機酸のアンモニア塩（例えば、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウムおよび酢酸アンモニウム）；ならびに他の窒素含有供給源（食肉抽出物、ペプトン、コーンスティープリカー、カゼイン水解物、大豆粕水解物、尿素および酵母抽出物を含む）。
【０１０５】
アミノ酸の産生に関する（ｄｒａｗｎ ｔｏ）本発明のプロセスにおいて利用され得る種々の発酵技術が、当該分野で公知である。一般に、アミノ酸は、発酵プロセス（例えば、回分型または流加（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）型）において、本発明から商業的に産生され得る。回分型発酵において、全ての栄養素は、発酵開始時に添加される。流加型発酵または長時間（ｅｘｔｅｎｄｅｄ）流加型発酵において、発酵の最初からかまたは培養物が熟成（ｃｅｒｔａｉｎ ａｇｅ）に達した後にか、あるいは供給される栄養素が培養液から消耗された場合に、１つかまたは多数の栄養素が培養液中へ持続的に供給される。流加型発酵である長時間回分（ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｂａｔｃｈ）の改変型は、反復流加発酵または満杯時汲み出し（ｆｉｌｌ−ａｎｄ−ｄｒａｗ）発酵であって、ここで、例えば、発酵槽が満杯の場合、発酵槽の内容物の一部はそのうち除去されるが、栄養素の供給は続けられる。この方法において、発酵は、長期間延長され得る。
【０１０６】
別の型の発酵（持続的発酵またはケモスタット培養）では、完全培地の持続的供給を用いるが、培養液は、発酵槽におけるブロスの容量がおよそ一定であるように、持続的または半持続的に廃棄され得る。持続的発酵は、原則として無限に継続され得る。
【０１０７】
回分発酵において、生物体は、培地において必須栄養素のうちの１つが消耗されてしまうまでか、または、発酵条件が好ましくなくなる（例えば、ｐＨが微生物の増殖に対して阻害性の値まで低下する）まで増殖する。通常、流加発酵において、（例えば、ｐＨの制御を用いることによって）好ましい増殖条件を継続するように措置がなされ、そして培養物へこれらの栄養素を供給することによって、１つ以上の必須栄養素の消耗が妨げられる。微生物は、栄養素の供給速度によって決定づけられる増殖速度で成長し続ける。一般に、単一の栄養素（頻繁には、炭素源）が、増殖を制限するようになる。同じ原理が持続的発酵に適用され、通常、培地に供給される１つの栄養素が限定され、他の栄養素全ては過剰にある。この限定される栄養素は、非常に低い（しばしば、測定不可能な低い）濃度で培養液中に存在する。種々の型の栄養素の限定が、利用され得る。炭素源の限定が、最も頻繁に用いられる。他の例としては、窒素源による限定、酸素による限定、特定の栄養素（例えば、ビタミンまたはアミノ酸（微生物がこのような化合物に対する栄養素要求株である場合））による限定、硫黄による限定、およびリンによる限定が挙げられる。
【０１０８】
アミノ酸は、当該分野で公知の任意の方法によって回収され得る。具体的な手順は、以下において提供される：Ｖａｎ Ｗａｌｓｅｍ，Ｈ．Ｊ．＆Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｍ．Ｃ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５９：１２７−１３２（１９９７）、および米国特許第３，５６５，９５１号、これらの両方は、本明細書において参考として援用される。
【０１０９】
本明細書において記載される本発明は、少なくとも１つのＬ−リジンアミノ酸生合成遺伝子を含む単離された核酸分子を提供する。他に示されない限り、本明細書において記載される全てのヌクレオチド配列は、自動化ＤＮＡシーケンサー（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．からのＭｏｄｅｌ ３７３）を用いて決定され、そして本明細書において記載されるＤＮＡ分子によってコードされるポリペプチドの全てのアミノ酸配列は、関連ＤＮＡ配列の翻訳によって予測された。従って、当該分野で公知であるように、この自動化アプローチによって決定された任意のＤＮＡ配列について、本明細書において決定された任意のヌクレオチド配列は、いくつかのエラーを含み得る。自動化によって決定されたヌクレオチド配列は、代表的には、配列決定されたＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列に対して少なくとも約９０％同一、より代表的には、少なくとも約９５％〜少なくとも約９９．９％同一である。実際の配列は、当該分野で周知の手動のＤＮＡ配列決定方法を含む他のアプローチによってより正確に決定され得る。
【０１１０】
当該分野で公知であるように、実際の配列と比較して決定されたヌクレオチド配列における単一の挿入または欠失は、ヌクレオチド配列の翻訳においてフレームシフトを引き起こし、その結果、決定されたヌクレオチド配列によってコードされる推定アミノ酸配列が、このような挿入または欠失の箇所を起点として、配列決定されたＤＮＡ分子によって正確にコードされるアミノ酸配列とは完全に異なる。
【０１１１】
本発明は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの少なくとも１つのＬ−リジンアミノ酸生合成経路遺伝子を含むいくつかの単離された核酸分子を提供する。より詳細には、本発明は、以下の単離された核酸分子を提供する：ＡＴＣＣ ２１５２９株由来のａｓｋ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）；ＡＴＣＣ ２１５２９株由来のａｓｄ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号３）；ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４株由来のｄａｐＡ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号５）；ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４株由来のｄａｐＢ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号７）；ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４株由来のｄｄｈ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号９）、およびＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４株由来のＯＲＦ２遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１５）。さらに、プラスミドｐＲＳ６由来のｌｙｓＡ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１３）がまた、本明細書において提供される（Ｍａｒｃｅｌ，Ｔ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ４：１８１９−１８３０（１９９０））。
【０１１２】
アミノ酸が一つ以上のコドン（コード縮重）によって核酸レベルでコードされることは、当該分野で公知である。選り抜きのコドンが特定のアミノ酸配列（タンパク質、ポリペプチドなど）の発現に影響し得ることはまた、当該分野で公知である。従って、本発明はさらに、配列番号２のａｓｋアミノ酸配列をコードする核酸分子に関し、ここで、この核酸分子は、特定のアミノ酸をコードすることが公知である任意のコドンを含む。本発明はまたさらに、タンパク質またはポリペプチドの発現が最適となるように代替コドンを含む核酸配列（配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１８、および配列番号２０）に関する。
【０１１３】
上記の単離された核酸分子に加えて、本発明はまた、１つより多いＬ−リジンＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ生合成遺伝子を含む単離された核酸分子を提供する。このような単離された核酸分子は、「カセット」構築物といわれる。これらのカセット構築物は、専門家のために、Ｌ−リジン生合成遺伝子の遺伝子増幅を達成するために要求される組換えＤＮＡ操作の数を簡略化する。
【０１１４】
カセット構築物に関する１つの実施形態において、本発明は、以下を含む単離された核酸分子を提供する：（ａ）配列番号２のＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ Ｌ−リジン経路ａｓｋアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；ならびに（ｂ）以下からなる群より選択される少なくとも１つのさらなるＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種Ｌ−リジン経路遺伝子：（１）ａｓｄポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；（２）ｄａｐＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；（３）ｄａｐＢポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；（４）ｄｄｈポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；（５）‘ｌｙｓＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および（６）ＯＲＦ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【０１１５】
本発明の単離された核酸分子は、好ましくは、適切な核酸ベクターにおいて、増殖および保持される。本発明の単離された核酸分子の単離およびクローニングのための方法は、組換えＤＮＡ技術の当業者に周知である。原核生物宿主および真核生物宿主を用いる使用のために適切なベクターおよび方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９年、によって記載され、この開示は、本明細書において参考として援用される。
【０１１６】
多種多様なベクターは、本発明において使用され得る。このようなベクターとしては、染色体のベクター、エピソームのベクターおよびウイルス由来ベクター（例えば、細菌性プラスミド由来ベクターおよびバクテリオファージ由来ベクター、ならびにそれらの組合せ由来のベクター（例えば、プラスミドおよびバクテリオファージの遺伝要素（例えば、コスミドおよびファージミド）由来のベクター）））が挙げられ、これらのベクターの全てが本発明のこの局面に従って使用され得る。一般に、細菌宿主においてポリヌクレオチドを保持および増殖させるために適切である任意のベクターは、この点において使用され得る。
【０１１７】
細菌における使用のための適切な大多数のベクターおよびプロモーターは、公知であり、これらの多くが市販されている。好ましい原核生物ベクターとしては、プラスミド（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、ｐＢＲ３２２、ＣｏｌＥｌ、ｐＳＣ１０１、ｐＡＣＹＣ１８４、πＶＸ）において複製可能なベクター）が挙げられる。このようなプラスミドは、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．らによるＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｆｉｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８２）に開示される。以下のベクターは、例示の目的で提供される：ｐＥＴ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＢｓ、ｐｈａｇｅｓｃｉｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐＢｓＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。
【０１１８】
本発明の単離された核酸分子に好ましいベクターは、コンビナトリアルクローニングベクター（Ｌｏｎｓｄａｌｅ，Ｄ．Ｍ．ら，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ １３：３４３−３４５（１９９５））のｐＦＣ１〜ｐＦＣ７の新規ファミリー、ｐＫ１８４ベクター（Ｊｏｂｌｉｎｇ，Ｍ．Ｇ．およびＨｏｍｅｓ，Ｒ．Ｋ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １８：５３１５−５３１６（１９９０））を含む。
【０１１９】
好ましいベクターの別の群は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種において自律的複製可能であるベクターである。このようなベクターは、微生物発酵の目的でのアミノ酸産生の当業者に周知であり、これらの例としては、ｐＳＲＩ、ｐＭＦ１０１４αおよびこれら由来のベクターが挙げられる。
【０１２０】
本発明は、ＡＴＣＣ ２１５２９株のａｓｋポリペプチドの単離されたアミノ酸配列（配列番号２）を提供する。本明細書において開示された単離されたａｓｋアミノ配列は、培養培地中のＬ−リジンおよびＬ−スレオニンの蓄積されたレベルに対するａｓｋ酵素活性のフィードバック抵抗に関する独特の性質を保有する。他のＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ａｓｋ−ａｓｄ遺伝子配列のＤＮＡ配列と比較される場合、本発明は、フィードバック阻害に対して抵抗性を生じるアミノ酸残基３８０でのスレオニンからイソロイシンへの変化を開示する。本発明はまた、Ｌ−スレオニンおよび／またはＬ−リジンに対するａｓｋ酵素の感受性の減少を生じる残基３８０での他のアミノ酸の変化を含む。
【０１２１】
さらに、本明細書においてより詳細に記載されるように、ベクターは、発現を調節ならびに発現を引き起こす制御領域を含み得る。一般に、このような領域は、転写を制御することによって作動する（例えば、とりわけ、インデューサー結合部位またはリプレッサー結合部位およびエンハンサー）。
【０１２２】
本発明のベクターは、一般に選択マーカーを含む。このようなマーカーはまた、増幅に適切であり得るか、またはこれらのベクターは、本目的のためにさらなるマーカーを含み得る。この点において、ベクターは、好ましくは、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型形質を提供するために１つ以上の選択マーカー遺伝子を含む。このようなマーカーは、以下を含むが、これらに限定されない：抗生物質耐性遺伝子（例えば、クロラムフェニコール耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、もしくはカナマイシン耐性遺伝子）、または、宿主細胞株が、正常に栄養要求性であるのに対して、栄養素の欠乏においても宿主細胞が増殖することを可能にする自己栄養遺伝子。
【０１２３】
このベクターが宿主細胞の染色体外に保持されるべきことが意図される場合、このベクターがＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種の宿主細胞において複製することを可能にするさらなる複製起点を含む。あるいは、ベクターがＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種の染色体中に組込まれることを所望する場合、このベクターは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ中で複製され得ないように構築される。例えば、このようなベクターは、別の生物体（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）において増殖可能であり得るが、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍにおいて増殖されるための適切な複製起点を欠く。この実施形態の別の局面において、このベクターは、１つより多い宿主細胞種において複製し得、そして保持され得るシャトルベクターである（例えば、このようなシャトルベクターは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主細胞（例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞）において、そしてＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞においてもまた、複製可能であり得る）。
【０１２４】
本発明はさらに、以下の単離されたアミノ酸配列を提供する：ＡＴＣＣ ２１５２９株のａｓｄポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号４）；ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４株のｄａｐＡポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号６）；ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４株のｄａｐＢポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号８）；ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４株のｄｄｈポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１０）、およびＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４株のＯＲＦ２ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１６）。さらに、ｌｙｓＡ（ｐＲＳ６）のアミノ酸配列がまた、本明細書において提供される（Ｍａｒｃｅｌ，Ｔ．ら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４：８１９−８３０（１９９０））（配列番号１４）。
【０１２５】
上記に開示される特定の配列開示によって規定される単離されたポリペプチド配列に加えて、本発明はまた、寄託されたクローンによってコードされるアミノ酸配列を提供する。
【０１２６】
本発明のいくつかのアミノ酸配列が本明細書に開示されたタンパク質の構造または機能に顕著な影響を与えることなくに変化され得ることは、当該分野において認識される。含まれる改変体は、酵素活性が顕著に影響されない限り、欠失、挿入、転換、反復、および型置換を構成し得る。表現型的にサイレントであるべきようなアミノ酸の変化を考慮する手引きは、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら，「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）において見出され得る。
【０１２７】
本発明のこれらの株は、当業者において公知でかつ利用可能な任意の方法および技術によって調製され得る。本発明の遺伝子構築物の宿主細胞への導入は、エレクトロポレーション、形質導入、または他の方法によってもたらされ得る。これらの方法は、本明細書において参照され、かつ援用される多数の標準的な実験室マニュアルにおいて記載される。
【０１２８】
本発明の種々の実施形態は、遺伝子増幅の結果として増加したＬ−リジン産生を有する株を提供する。遺伝子増幅によって、２個、３個、４個、５個、１０個以上のコピーの因子によりコピー数をＬ−リジン生合成経路遺伝子の正常な単一コピー数より多く増加させることが、意味される。
【０１２９】
本発明の１つの実施形態において、Ｌ−リジン生合成経路遺伝子のさらなるコピーが、染色体中に組込まれ得る。本発明の別の実施形態は、Ｌ−リジン生合成経路遺伝子のさらなるコピーが染色体外に保有されることを提供する。５個以下の因子による増幅は、単一事象の相同組換えの目的で宿主株の染色体中にさらなる遺伝子コピーを導入することによって得られ得る。最も好ましい実施形態において、この組換え事象は、目的の遺伝子のコピーのさらなる１つのコピーの導入を生じる。５個よりも多い遺伝子のコピーが所望される場合、次いで、本発明はまた、本発明の組換えＤＮＡ構築物を保有する多コピープラスミドの使用について提供する。
【０１３０】
本発明の単離された核酸分子に対して適切な宿主の代表的な例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：細菌細胞（例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ細胞およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｆｎ細胞）；および、真菌細胞（例えば、酵母細胞）。上記の宿主細胞について適切な培養培地および培養条件は、当該分野において公知である。
【０１３１】
本発明の特に好ましい宿主細胞としては、以下が挙げられる：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍおよびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ。
【０１３２】
出願人は、特許手続の目的のために、ｔｈｅ Ｂｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙ ｏｎ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｐｏｓｉｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓに従って、受託可能なＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｅｐｏｓｉｔａｒｙ ＡｕｔｈｏｒｉｔｙでｐＫ１８４−ＫＤＡＢＨ’Ｌ多重遺伝子構築物を保有するクローンを寄託した。この寄託物は、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＮＲＲＬ），１８１５ Ｎｏｒｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｐｅｏｒｉａ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ ６１６０４で作製されている。宿主細胞の染色体中に組込まれたｐＫ１８４−ＫＤＡＢまたはｐＫ１８４−ＫＤＡＢＨ’Ｌの多重遺伝子構築物において作製された寄託物としては、以下が挙げられる：（１）ＮＲＲＬ−Ｂ３０２１９およびＮＲＲＬ−Ｂ３０２２１として寄託された、ｐＫ１８４−ＫＤＡＢプラスミド（染色体中に組込まれる）、ならびに（２）ＮＲＲＬ−Ｂ３０２１８、ＮＲＲＬ−Ｂ３０２２０、およびＮＲＲＬ−Ｂ３０２２２として寄託された、ｐＫ１８４−ＫＤＡＢＨ’Ｌプラスミド（染色体中に組込まれる）。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αＭＣＲに保有された、プラスミド構成中のｐＫ１８４−ＫＤＡＢＨ’Ｌ多重遺伝子の構築物は、ＮＲＲＬ−Ｂ３０２２８として寄託された。６個の遺伝子構築物（ｐＤＥｌｉａ２−ＫＤＡＢＨＬ）は、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＮＲＲＬ−Ｂ３０２３３）において寄託された。ｐＫ１８４−ＫＤＡＢＨ’Ｌを含むＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍは、ＮＲＲＬ−Ｂ３０２３６として寄託された。ｐＫ１８４−ＫＤＡＢＨＬを含むＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍは、ＮＲＲＬ−Ｂ３０２３７として寄託された。ｐＤＥｌｉａ２−ＫＤＡＢＨＬを含むＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍは、ＮＲＲＬ−Ｂ３０２３４として寄託された。ｐＤＥｌｉａ２−ＫＤＡＢＨＬを含むＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｆｎｎｅｎｔｕｍは、ＮＲＲＬ−Ｂ３０３２５として寄託された。
【０１３３】
配列番号２のアミノ酸配列を含む宿主細胞を培養する工程を包含するリジンを産生する方法を提供することが、本発明の目的であって、ここで、この宿主細胞は、以下：（ａ）遺伝的に変更されていない宿主細胞と比較して１つ以上のリジン生合成経路酵素の増加した酵素活性；（ｂ）リジン生合成経路酵素をコードする各遺伝子の１つ以上のコピー；（ｃ）リジン生合成経路酵素をコードする１つ以上の酵素の転写を調節する１つ以上の転写因子の変更、を含み、ここで、この宿主細胞は、この培養培地中にリジンを産生する。本方法の１つの実施形態のおいて、この増加した酵素活性は、１つ以上のリジン生合成経路酵素をコードする１つ以上の遺伝子を過剰発現させる工程を包含する。本方法の１つの実施形態において、この１つ以上の遺伝子は、１つ以上のプロモーター配列に対して、直接的にかまたは間接的に作動可能に連結される。本方法の別の実施形態において、この作動可能に連結されたプロモーター配列は、異種性であるか、内在性であるか、またはハイブリッドである。本方法の好ましい実施形態において、このプロモーター配列は、以下の１つ以上である：Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍに対して内在性である遺伝子の５’末端由来のプロモーター配列、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいて複製するプラスミド由来のプロモーター配列、およびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍを感染するファージのゲノム由来のプロモーター配列。本方法の好ましい実施形態において、１つ以上のこのプロモーター配列は、改変される。別の好ましい実施形態において、この改変は、以下を含む：５’末端での短縮、３’末端での短縮、１つ以上のヌクレオチドの非末端の挿入、１つ以上のヌクレオチドの非末端の欠失、５’末端での１つ以上のヌクレオチドの付加、３’末端での１つ以上のヌクレオチドの付加、およびこれらの組合せ。
【０１３４】
本方法の別の実施形態において、この増加した活性は、１つ以上の改変されたリジン生合成経路酵素の活性から生じ、ここで、この酵素改変は、この改変を欠く酵素と比較して、動力学的パラメーター、アロステリック調節、またはこれらの両方において、変化を生じる。本方法の１つの実施形態における、動力学的パラメーターにおけるこの変化は、Ｋｍ、Ｖｍａｘ、またはその両方における変化である。本方法の別の実施形態において、アロステリック調節におけるこの変化は、１つ以上の酵素アロステリック調節部位における変化である。１つの実施形態における、アロステリック調節におけるこの変化は、リガンドに対する１つ以上の酵素アロステリック調節部位の親和性における変化である。これらのリガンドは、同一であり得るかまたは異なり得る。１つの実施形態において、この酵素改変は、この酵素をコードするヌクレオチド配列における変化の結果である。１つの実施形態において、このヌクレオチド配列のこの変化は、１つ以上のヌクレオチドの付加、挿入、欠失、置換、またはこれらの組合せである。
【０１３５】
この方法の別の実施形態において、１つ以上の転写因子のこの改変は、転写インヒビタータンパク質における１つ以上の変異、転写アクチベータータンパク質における１つ以上の変異またはその両方を含む。ここで、この１つ以上の変異は、この改変を欠く１つ以上の転写因子による転写と比較して、標的ヌクレオチド配列の転写を増大する。１つの実施形態において、この１つ以上の変異は、この転写因子をコードするこのヌクレオチド配列における改変である。別の実施形態において、このヌクレオチド配列におけるこの改変は、１つ以上のヌクレオチドの付加、挿入、欠失、置換、またはその組み合わせである。
【０１３６】
本明細書中で言及されるすべての特許および刊行物は、その全体が参考として明確に援用される。
【実施例】
【０１３７】
（実施例）
（実施例１：Ｌ−リジン経路多重遺伝子構築物ｐＫ１８４−ＫＤＡＢおよびｐＫ１８４−ＫＤＡＢＨ’Ｌの調製）
出願人は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種の染色体におけるＬ−リジンアミノ酸生合成経路の１つ以上の遺伝子の数を増幅するためにＬ−リジンアミノ酸生合成経路多重遺伝子構築物を作製した。また、ＡＴＣＣ２１５２９株のＬ−リジン生合成遺伝子の注意深い研究を通じて、出願人は、ＡＴＣＣ２１５２９のａｓｋ遺伝子のアミノ酸残基３８０におけるスレオニンからイソロイシンのアミノ酸改変を同定した。他のＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ａｓｋ遺伝子のＤＮＡ配列と比較して、アミノ酸残基３８０におけるスレオニンからイソロイシンへの改変が認められた（図１９）。これは、アスパラギン酸キナーゼ酵素調節に関する異常なフィードバック抵抗性の性質の原因である。
【０１３８】
本発明において使用されるアミノ酸生合成経路遺伝子である、Ｌ−リジンをコードする単離された核酸分子は、以下の供給源由来である。
【０１３９】
【表１】
当業者が理解するように、本発明の単離した核酸分子に関して、本発明は、出願人が示す特定の株の起源に限定されない。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種の任意の株（特にＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの株）を、核酸分子の単離に利用し得、この核酸分子を染色体に位置されるアミノ酸生合成経路遺伝子の数を増幅するのに使用する。特に好ましい株として、以下が挙げられる：ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４、ＡＴＣＣ２１７９９、ＡＴＣＣ２１５２９、ＡＴＣＣ２１５４３およびＥ１２。
【０１４０】
本明細書中に引用および援用される多くの実験手引き書（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）に見られるように）に見られ得るような、組換えＤＮＡ技術の分野に共通の方法と技術を、本発明の多重遺伝子の構築物の作製に使用した。
【０１４１】
ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）技術を、本発明の多重遺伝子構築物の作製において広く使用する。典型的な反応において、標準１０×ストック溶液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５００ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２）を、１×に希釈して使用する。ＰＣＲ増幅のために、以下の典型的な反応条件を使用した：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０１％ ゼラチン、２００μＭ デオキシヌクレオチド、０．２〜１．０μＭ プライマーおよび２．５Ｕ／１００μｌ ｐｆｕ ポリメラーゼ。以下の標準サイクルパラメーターをまた、ＰＣＲ反応において使用した：テンプレート変性を９４℃で１分間行い；５５℃のアニーリング温度（または特定のプライマーの対に適切なアニーリング温度）を１分間行い；産生物の伸長を７２℃で１分間（産物が、＜５００ｂｐである場合）、３分間（産物が＞５００ｂｐである場合）行った；これらを３０サイクル、およびサイクルの最後に、７２℃、７分間の最後の伸長を行った。
【０１４２】
クローニング実験に使用されるプライマーとして、以下が挙げられる：
【０１４３】
【表２】
内部的にｌｙｓＡにアニーリングするプライマー（ｌｙｓＡの端から約５００ｂｐ上流）。‘ＬｙｓＡは、ｌｙｓＡから得られた短縮型形態である。
【０１４４】
出願人は、ａｓｋ−ａｓｄ、ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ、ｄｄｈ、‘ｌｙｓＡおよびｌｙｓＡのコード領域のクローニングにおいて標準ＰＣＲおよびサブクローニング手順を利用した。構築手順および中間体プラスミドを、図１８に示す。出願人は、Ｌ−リジン生合成経路に使用される以下のベクターの構築において、以下の工程（図１８）を実行した：
１．ｐＧＥＭＴ−ａｓｋ−ａｓｄ：プライマーａｓｋおよびａｓｄを使用するＡＴＣＣ２１５２９のａｓｋ−ａｓｄオペロンを含むおよそ２．６ＫｂのＰＣＲ産物を、ｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ ｐＧＥＭ−Ｔ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ）にクローニングした；
２．ｐＡＤＭ２１：ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４ ｄｄｈコード領域のおよそ１．３ＫｂのＰＣＲ産物（両プライマー上に操作されたＫｐｎｌ部位を有する）をｐＡＤＭ２０にクローニングした；
３．ｐＵＣ１ ８−ｄｄｈ：ｄｄｈ（ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４）を含むｐＡＤＭ２１のおよそ１．３ＫｂのＫｐｎＩフラグメントを、ｐＵＣ１８のＫｐｎＩ部位にサブクローニングした；
４．ｐＬＩＣ１．７−ａｒｇＳ−‘ｌｙｓＡ：テンプレートＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４ゲノムＤＮＡならびにプライマーａｒｇＳおよびｌｙｓＡを使用するＰＣＲ産物を、ｐＰＭＧ−ＬＩＣクローニングベクター（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）にクローニングした；
５．ｐＭ４−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ：プライマーｄａｐＢおよびｄａｐＡを使用するおよそ３ＫｂのＰＣＲ産物をｐＭ４のＸｂａＩ部位にクローニングした；
６．ｐＦＣ３−ａｓｋ−ａｓｄ：ｐＧＥＮＴ−ａｓｋ−ａｓｄのおよそ２．６ＫｂのＮｓｉＩ−ＡｐａＩフラグメントを、ＰｓｔＩおよびＡｐａＩで切ったｐＦＣ３にクローニングした；
７．ｐＦＣ１−ｄｄｈ：ｐＵＣ１８−ｄｄｈの約１．３ＫｂのＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを、ＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩで切ったｐＦＣ１にクローニングした；
８．ｐＦＣ１−ｄｄｈ−‘ｌｙｓＡ：ｐＬＩＣ１．７−ａｒｇＳ−‘ｌｙｓＡのおよそ１．５ＫｂのＥｃｏＲＩフラグメント（短縮型ｌｙｓＡ ＤＮＡを含む）を、ｐＦＣ１−ｄｄｈのＥｃｏＲＩ部位にクローニングした；
９．ｐＦＣ５−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ：ｐＭ４−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡのおよそ３．４ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢｇＩＩＩフラグメントをｐＦＣ５のＢａｍＨＩ部位にクローニングした；
１０．ｐＦＣ５−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ−ｄｄｈ−‘ｌｙｓＡ：ｐＦＣＩ−ｄｄｈ−‘ｌｙｓＡの約２．８ＫｂのＮｈｅＩフラグメントを、ｐＦＣ５−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡのＮｈｅＩ部位にクローニングした；
１１．ｐＦＣ−３−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ−ｄｄｈ−‘ｌｙｓＡ：ｐＦＣ５−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ−ｄｄｈ−‘ｌｙｓＡの約６．２ＫｂのＮｏｔＩフラグメントを、ｐＦＣ３−ａｓｋ−ａｓｄのＮｏｔＩ部位にクローニングした；
１２．ｐＤＥｌｉａ９−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ−ｄｄｈ−‘ｌｙｓＡ（ｐＤＥｌｉａ９−ＫＤＡＢＨ’Ｌ）：ｐＦＣ３−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ−ｄｄｈ−‘ｌｙｓＡの約８．８ｋｂのＰｍｅＩフラグメントを、ｐＤＥｌｉａ９のＥｃｏＲＶ部位にクローニングした；そして
１３．ｐＫ１８４−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ−ｄｄｈ−‘ｌｙｓＡ（ｐＫ１８４−ＫＤＡＢＨ’Ｌ）：ｐＦＣ３−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ−ｄｄｈ−‘ｌｙｓＡのおよそ８．８ＫｂのＰｍｅＩフラグメントを、ｐＫ１８４のＨｉｎｃＩＩ部位またはＳｍａＩ部位にクローニングした。
【０１４５】
１４．ｐＦＣ５−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ（ｐＦＣ５−ＫＤＡＢ）：ｐＦＣ３−ａｓｋ−ａｓｄの約２．６ＫｂのＫｐｎＩ−ＳｍａＩフラグメントを、ＫｐｎＩおよびＳｍａＩで切ったｐＦＣ５−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡにクローニングしたプラスミド。
【０１４６】
１５．ｐＫ１８４−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ（ｐＫ１８４−ＫＤＡＢ）：ｐＦＣ５−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡの約７ＫｂのＫｐｎＩ−ＰｍｅＩフラグメントを、ＫｐｎＩとＨｉｎｃＩＩで切ったｐＫ１８４にクローニングしたプラスミド。
【０１４７】
従って、出願人は、以下のＬ−リジン多重遺伝子構築物を作製した。
【０１４８】
１．ｐＫ１８４−ＫＤＡＢＨ’Ｌ、ここで、「Ｋ」は、ａｓｋポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す；「Ｄ」は、ａｓｄポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す；「Ａ」は、ｄａｐＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す；「Ｂ」は、ｄａｐＢポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す；「Ｈ’」は、ｄｄｈポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す；そして「’Ｌ」は、‘ｌｙｓＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す。この構築物を、短縮型６遺伝子構築物と称する。以下で構築された、ｐＫ１８４−ＫＤＡＢＨＬ構築物を、全長６遺伝子構築物と称する。
【０１４９】
２．ｐＫ１８４−ＫＤＡＢ、ここで、「Ｋ」は、ａｓｋポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す；「Ｄ」は、ａｓｄポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す；「Ａ」は、ｄａｐＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す；そして「Ｂ」は、ｄａｐＢポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す。この構築物を、４遺伝子構築物と称する。
【０１５０】
ｐＫ１８４−ＫＤＡＢＨ’ＬおよびｐＫ１８４−ＫＤＡＢの両方は、本明細書中で言及される他の構築物がそうであるように、ＯＲＦ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１５１】
「Ｋ」、「Ｄ」、「Ａ」、「Ｂ」、「Ｈ」、「Ｌ」および「‘Ｌ」によって示される単離された核酸配列によってコードされる示されたポリペプチド配列に加えて、これらの単離された核酸配列はまた、本明細書中に示されたオペロンのための天然のプロモーターエレメントを含むことが、記述されるべきである。従って、ａｓｋ−ａｓｄ配列を、それぞれ、以下の天然のプロモーターエレメントを含む様式においてクローニングした；ｄａｐＡおよびｄａｐＢ配列（オペロンｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡを表す）を、それぞれのプロモーターエレメントを含む様式においてクローニングした；ｄｄｈ配列を、それぞれの天然のプロモーターエレメントを含む様式においてクローニングした、そしてｌｙｓＡおよび‘ｌｙｓＡの配列を、天然のプロモーターエレメントを含む様式においてクローニングした。
【０１５２】
選択的遺伝子プロモーターエレメントは、本発明の構築物において利用され得る。例えば、本発明においてこの使用に適切な公知の細菌のプロモーターは、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＩおよびｌａｃＺプロモーター、Ｔ３およびＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、ｌａｍｂｄａＰＲおよびＰＬプロモーター、ｔｒｐプロモーターまたは本発明の細菌細胞に内在性のプロモーターを含む。本発明に有用な他のプロモーターは、制御されたプロモーター、制御されていないプロモーターおよび異種なプロモーターを含む。このようなプロモーターの多くは、当業者に公知である。Ｓａｍｂｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）を参照のこと。
【０１５３】
（実施例２：Ｌ−リジンアミノ酸生合成経路遺伝子の２倍増幅）
例示的な目的に関してのみ、出願人は、本明細書中の実施例を提供する。ここで、少なくとも１つのＬ−リジンアミノ酸生合成経路遺伝子を、以下よって２倍に増幅する：（ａ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞への単離された核酸分子の導入、そして（ｂ）このＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞の染色体へのこの単離された核酸分子を導入する後の単一交叉相同組換え現象。
【０１５４】
当業者に理解されるように、少なくとも１または２または３または４または５または６または７または８または９または１０またはそれ以上のアミノ酸生合成経路遺伝子を、増幅し得る（すなわち、本明細書中の実施例の少数の改変体に少なくとも１または２または３または４または５または６または７または８または９または１０倍の因子まで数を増大し得る）。
【０１５５】
ｐＫ１８４−ＫＤＡＢプラスミド、ｐＫ１８４−ＫＤＡＢＨ’ＬプラスミドおよびｐＤ２−ＫＤＡＢＨＬプラスミド（実施例４において構築された全長６遺伝子の構築物）を、本発明の高収量誘導化細胞株の構築において使用した。これを、単一交叉相同組換え現象を介する宿主細胞の染色体へのｐＫ１８４−ＫＤＡＢ、ｐＫ１８４−ＫＤＡＢＨ’ＬまたはｐＤ２−ＫＤＡＢＨＬの取り込みを生じる、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種に、プラスミドｐＫ１８４−ＫＤＡＢ、ｐＫ１８４−ＫＤＡＢＨ’ＬおよびｐＤ２−ＫＤＡＢＨＬ ＤＮＡを導入する方法によって達成した。本発明のプラスミド構築物の染色体性の組込みによるアミノ酸生合成経路遺伝子の増幅は、いくつかのＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株において増大したＬ−リジン産生を提供する。
【０１５６】
本発明の単離された核酸分子を用いる細胞形質転換実験に関して、コンピテント細胞の増殖および調製を、以下の手順に従って行ない得る：（１）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの新鮮な、シングルコロニーを選ぶ工程、そして攪拌しながら３０℃で、２５０ｍＬ攪拌フラスコ中の１０ｍＬ ＣＭ（ＳＭ１）において、一晩培養物を増殖する工程；（２）５００ｍＬ 攪拌フラスコ中での６６０ｎｍの光学密度（Ｏ．Ｄ．）が０．１になるまで一晩培養した培養物を、２００ｍＬの「増殖培地」に播種する工程；（３）攪拌しながら３０℃で５〜６時間、培養物を増殖する工程；（４）冷却、密封、滅菌した２５０ｍＬの遠心管に培養物を注ぐ工程；４℃で、Ｒｅｆｒｉｇｅｒａｔｅｄ Ｓｏｒｖａｌｌにおいて８〜１０Ｋで、１０分間遠心分離をする工程；（５）徹底的に上清を流す工程そして等量の氷冷、滅菌した脱イオン水で細胞ペレットを再懸濁する工程；（６）同じ条件下で再度、サンプルを遠心分離する工程；（７）全てのものを氷冷し続けることを忘れずに水で洗浄を繰り返す工程；（８）徹底的に上清を流す工程そして１ｍＬの氷冷、滅菌した１０％グリセロール中に細胞ペレットを再懸濁する工程そして冷却、滅菌した１．５ｍＬの微小遠心チューブに細胞を移す工程；（９）冷却遠心において１０分間サンプルを遠心する工程；（１０）上清をピペッティングする工程そして捨てる工程、そしてペレット容積（２００〜４００μｌ）の２〜３倍の１０％グリセロールでペレットを再懸濁する工程；そして（１１）必要ならば、冷却したチューブに細胞をアリコートし、そして−７０℃で凍結する工程。
【０１５７】
ｐＫ１８４−ＫＤＡＢ、ｐＫ１８４−ＫＤＡＢＨ’ＬおよびｐＤ２−ＫＤＡＢＨＬプラスミドＤＮＡを、以下のエレクトロポレーション手順によってＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞に導入した：（１）冷却した０．１ｃｍエレクトロキュベットの側壁に３５μＬ細胞／グリセロール溶液をピペッティングする工程；（２）溶液に約２〜４μＬのプラスミドをピペッティングする工程そして穏やかな上下のピペッティングによってサンプルを混合する工程；（３）泡の発生をさけるように、穏やかなタッピングによってエレクトロキュベットの底に全溶液を移す工程（４）電気ショックの工程の準備ができるまで氷上にサンプルを置いておく工程、電気ショックを与える前にエレクトロキュベットの外壁の任意の曇りを拭く工程そして１度に１．５ｋＶ、２００Ω、２５μＦで、細胞にショックを与える工程。
【０１５８】
細胞を、以下の工程によってエレクトロポレーションからの回復を可能にする：（１）即座に、エレクトロキュベットに１ｍＬの温めた「回復培地」をピペッティングする工程、そして徹底的に、ピペッティングによって溶液を混合する工程；（２）抗生物質抵抗性発現および細胞の回復のために少なくとも３時間、３０℃で溶液を（エレクトロキュベット内で）インキュベートする工程そして（３）選択培地にプレートする工程そして３０℃で、３日間インキュベートする工程。
【０１５９】
（実施例３：Ｌ−リジン産生が改善された株のスクリーニングおよび選択）
３日間の増殖後、抗生物質抵抗性の細胞のシングルコロニーを、個々に選択し、親の宿主細胞株による産生を越えてＬ−リジン産生が増大しているかを決定する。
【０１６０】
これらの実験で使用した全ての培地の調製法は、表１および表２に見られる。Ｌ−リジン産生を、攪拌フラスコ内で増殖した形質転換された、抗生物質抵抗性細胞培養物において決定する。簡潔には、播種培地（表１）を、深いバッフル付き（ｂａｆｆｌｅｄ）２５０ｍｌ Ｂｅｌｌｃｏ攪拌フラスコに２０ｍｌのアリコートに分配し、そして２０分間オートクレイブした。室温まで冷した後、次いで、これらの播種フラスコに、試験するべき株を播種し、そしてロータリーシェーカーに設置した。これらを、一晩攪拌しながら、３０℃でインキュベートし、翌朝に、各播種の光学密度（波長＝６６０ｎｍ）を記録し、そして各播種フラスコからの２ｍｌの培養物を２１ｍｌアリコートのＦＭ３培地（また深いバッファル攪拌フラスコ内に）に移した。次いで、これらの「主」フラスコを、シェーカーに戻し、そして３０℃でインキュベートした。
【０１６１】
４８時間のインキュベーション後、１ｍｌの主培養物を各フラスコから除去し、そして、フラスコを、直ぐにシャーカーに戻した。１ｍｌのサンプルに関して、光学密度を、０．１ＮのＨＣｌで１：５０に希釈することによって決定し、培地に存在する炭酸カルシウムを溶かした。次いで、各サンプルの残りを遠心分離し、細胞および炭酸カルシウムをペレット化した。上清の１：５０の希釈には、水を使用し、ブドウ糖濃度を、この希釈物から決定した。細胞外Ｌ−リジン濃度をまた、ＨＰＬＣによって、この時点で決定した。
【０１６２】
高収量の誘導化細胞を、ブドウ糖からの収量パーセント（すなわち、式［（産生されたアミノ酸ｇ／消費されたブドウ糖ｇ）＊１００］＝％収量によって定義されるブドウ糖からのアミノ酸収量）を決定することによって簡便に同定し得る。結果を、以下に示す。ここで、親株のＥ１２。ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４およびＡＴＣＣ２１７９９を、ｐＫ１８４−ＫＤＡ、ｐＫ１８４−ＫＤＡＢＨ’ＬおよびｐＤ（Ｅｌｉａ）２−ＫＤＡＢＨＬとして同定された本発明の単離されたＬ−リジン多重遺伝子の核酸分子で形質転換する。ｐＤ２−ＫＤＡＢＨＬ構築物を、実施例４と同様に作製した。
【０１６３】
【表３】
一旦、高収量の誘導化細胞の系統を、同定したら、この細胞の系統を、さらに、スクリーニングし、アミノ酸生合成経路遺伝子の増幅が、起こっていることを決定する。増幅スクリーニングを、（１）遺伝子のコピー数を決定するための標準サザンブロット法によってか、または（２）宿主細胞に導入された、単離された核酸分子のそれぞれの生合成経路遺伝子によってコードされた酵素の全酵素活性の決定によってかのいずれかによって簡便に達成し得る。
【０１６４】
サザンブロット法による遺伝子コピー数の決定は、本明細書中に参照および援用される実験手引書に記載されるような（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）に見られるような）、組換えＤＮＡ技術の分野で公知の標準の手順を利用して行われる。
【０１６５】
【表４】
【０１６６】
【表５】
（実施例４）
（Ｌ−リジン経路多重遺伝子構築物の調製）
本発明は、ＰＣＲ技術を用いて構築される、さらなるＬ−リジン多重遺伝子構築物をさらに含む。上述のように、標準のＰＣＲ手順およびサブクローニング手順を利用し、実施例１におけるものと同様の５遺伝子構築物を生成した。本実施例の構築物は、抗生物質耐性遺伝子、クロラムフェニコールアシルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）を含む。ＣＡＴ遺伝子を、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａにおける発現のためにＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａホスホフルクトキナーゼプロモーターに作動可能に連結した。
【０１６７】
以下の工程を、ＣＡＴ遺伝子を含む以下の構築物を構築することにおいて実施した：
１．ｐＧＥＭＴ−ａｓｋ−ａｓｄ：プライマーａｓｋおよびａｓｄを用いたＡＴＣＣ２１５２９のａｓｋ−ａｓｄオペロンを含む約２．６ＫｂのＰＣＲ産物を、ｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ ｐＧＥＭ−Ｔベクター系）にクローン化した；
２．ｐＵＣ１８−ｄｄｈ：ｄｄｈを含むｐＡＤＭ２１の約１．３Ｋｂ ＫｐｎＩフラグメント（ＮＲＲＬ Ｂ１１４７４）を、ｐＵＣ１８へ、ＫｐｎＩ部位においてサブクローン化した；
３．ｐＬＩＣ１．７−ａｒｇＳ−‘ｌｙｓＡ：テンプレートＢＦ１００ゲノムＤＮＡならびにプライマーａｒｇＳおよびｌｙｓＡを用いた約３ＫｂのＰＣＲ産物を、ｐＰＭＧ−ＬＩＣクローニングベクター（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）へクローン化した；
４．ｐＭ４−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ：プライマーｄａｐＢおよびｄａｐＡを用いた約３ＫｂのＰＣＲ産物を、ｐＭ４へ、平滑末端ＸｂａＩ部位においてクローン化した；
５．ｐＦＣ３−ａｓｋ−ａｓｄ：ｐＧＥＭＴ−ａｓｋ−ａｓｄの約２．６ＫｂのＮｓｉＩ−ＡｐａＩフラグメントを、ＰｓｔＩおよびＡｐａＩを用いて切断したｐＦＣ３へクローン化した；
６．ｐＦＣ１−ｄｄｈ：ｐＵＣ１８−ｄｄｈの約１．３ＫｂのＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを、ＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩを用いて切断したｐＦＣ１へクローン化した；
７．ｐＦＣ１−ｄｄｈ−‘ｌｙｓＡ：ｐＬＩＣ１．７−ａｒｇＳ−‘ｌｙｓＡの約１．５ＫｂのＥｃｏＲＩフラグメント（短縮型ｌｙｓＡ ＤＮＡを含む）を、ｐＦＣＩ−ｄｄｈへ、ＥｃｏＲＩ部位においてクローン化した；
８．ｐＦＣ１−ｄｄｈ−ｌｙｓＡ：ｐＲＳ６の約２．１ＫｂのＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩフラグメント（インタクトなｌｙｓＡ ＤＮＡを含む）を、ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩを用いて切断したｐＦＣ１−ｄｄｈへクローン化した；
９．ｐＦＣ５−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ：ｐＭ４−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡの約３．４ＫｂのＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントを、ｐＦＣ５へ、ＢａｍＨＩ部位においてクローン化した；
１０．ｐＦＣ５−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ−ｄｄｈ−‘ｌｙｓＡ：ｐＦＣ１−ｄｄｈ−‘ｌｙｓＡの約２．８ＫｂのＮｈｅＩフラグメントを、ｐＦＣ５−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡへ、ＮｈｅＩ部位においてクローン化した；
１１．ｐＦＣ５−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ−ｄｄｈ−ｌｙｓＡ：ｐＦＣ１−ｄｄｈ−ｌｙｓＡの約３．４ＫｂのＮｈｅＩフラグメントを、ｐＦＣ５−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡへ、ＮｈｅＩ部位においてクローン化した；
１２．ｐＦＣ３−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ−ｄｄｈ−‘ｌｙｓＡ（ｐＦＣ３−ＫＤＡＢＨ’Ｌ）：ｐＦＣ５−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ−ｄｄｈ−‘ｌｙｓＡの約６．２ＫｂのＮｏｔＩフラグメントを、ｐＦＣ３−ａｓｋ−ａｓｄへ、ＮｏｔＩ部位においてクローン化した；
１３．ｐＦＣ３−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ−ｄｄｈ−ｌｙｓＡ（ｐＦＣ３−ＫＤＡＢＨＬ）：ｐＦＣ５−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ−ｄｄｈ−ｌｙｓＡの約６．８ＫｂのＮｏｔＩフラグメントを、ｐＦＣ３−ａｓｋ−ａｓｄへＮｏｔＩ部位においてクローン化した；
１４．ｐＫ１８４−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ−ｄｄｈ−‘ｌｙｓＡ（ｐＫ１８４−ＫＤＡＢＨ’Ｌ）：ｐＦＣ３−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ−ｄｄｈ−‘ｌｙｓＡの約８．８ＫｂのＰｍｅＩフラグメントを、ｐＫ１８４へＨｉｎｃＩＩまたはＳｍａＩ部位においてクローン化した；
１５．ｐＤＥｌｉａ２−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ−ｄｄｈ−ｌｙｓＡ（ｐＤ２−ＫＤＡＢＨＬ）：ｐＦＣ３−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ−ｄｄｈ−ｌｙｓＡの約９．４ＫｂのＰｍｅＩフラグメントを、ｐＤＥｌｉａ２へ、ＨｉｎｃＩＩ部位においてクローン化した（ｋａｎ遺伝子を含む；全長６遺伝子構築物である）；
１６．ｐＤＥｌｉａ１１−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ−ｄｄｈ−‘ｌｙｓＡ（ｐＤ１１−ＫＤＡＢＨ’Ｌ）：ｐＦＣ３−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ−ｄｄｈ−‘ｌｙｓＡの約８．８ＫｂのＰｍｅＩフラグメントを、ｐＤＥｌｉａ１１へ、ＨｉｎｃＩＩまたはＳｍａＩ部位においてクローン化した（ＣＡＴ遺伝子を含む；短縮型６遺伝子構築物である）；
１７．ｐＤＥｌｉａ１１−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ−ｄｄｈ−ｌｙｓＡ（ｐＤ１１−ＫＤＡＢＨＬ）：ｐＦＣ３−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ−ｄｄｈ−ｌｙｓＡの約９．４ＫｂのＰｍｅＩフラグメントを、ｐＤＥｌｉａ１１へ、ＨｉｎｃＩＩ部位においてクローン化した（ＣＡＴ遺伝子を含む；全長６遺伝子構築物である）；
１８．ｐＤＥｌｉａ２：ｐＵＣ１９の約１．７５ＫｂのＤｒａＩ−ＳｓｐＩフラグメントに連結されたｐＵＣ４Ｋの約１．２４Ｋｂの平滑末端ＰｓｔＩフラグメント；
１９．ｐＤＥｌｉａ１１：Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ｆｄａプロモーターによって発現されるクロラムフェニコールアシルトランスフェラーゼ遺伝子を含む約１ＫｂのＰＣＲ産物を、プライマーＵＣｄｒａＩおよびＵＣｓｓｐＩならびにテンプレートとしてｐＭ４を用いて得て、そしてｐＵＣ１９の約１．７５ＫｂのＤｒａＩ−ＳｓｐＩフラグメントと連結した；
クローニング手順のために利用されたプライマーは、以下を含んだ：
【０１６８】
【表６】
ｌｙｓＡに対して内部的（ｌｙｓＡの末端に対して約５００ｂｐ上流）にアニールするプライマー。
【０１６９】
【表７】
「Ｋ」、「Ｄ」、「Ａ」、「Ｂ」、「Ｈ」、「Ｌ」および「‘Ｌ」は、上記と同じ意味を持つ。
【０１７０】
（実施例５：Ｌ−リジンアミノ酸生合成経路遺伝子の３倍増幅）
例示の目的のためにのみ、出願人らは、本明細書において、少なくとも１つのＬ−リジンアミノ酸生合成経路遺伝子が３倍に増幅される例を提供する。
【０１７１】
プラスミドｐＤ１１−ＫＤＡＢＨ’Ｌ（実施例４において構築された）を本発明の高収量誘導細胞株の構築に用いた。本発明の単離された核酸分子を用いる細胞形質転換実験のために、コンピテント細胞の増殖調製、および相対的な増殖の決定は、上記のような手順にしたがって実施し得る。
【０１７２】
プラスミドｐＤ１１−ＫＤＡＢＨ’Ｌ ＤＮＡをＮＲＲＬ−Ｂ３０２２０（ｐＫ１８４−ＫＤＡＢＨ’Ｌを含む）へ上記のエレクトロポレーション法を用いて導入した。ｐＤ１１−ＫＤＡＢＨ’ＬプラスミドＤＮＡのＮＲＲＬ−Ｂ３０２２０への導入は、単一交差相同組換え事象を経て宿主細胞染色体への１コピーのｐＤ１１−ＫＤＡＢＨ’Ｌの取り込みを生じた。２コピーの５遺伝子（ｐＤ１１−ＫＤＡＢＨ’ＬおよびｐＫ１８４−ＫＤＡＢＨ’Ｌ）を含む宿主細胞をＮＲＲＬ−Ｂ３０２２２として寄託した。
【０１７３】
３コピーの５遺伝子（１つの内因性コピーならびにｐＤ１１−ＫＤＡＢＨ’ＬおよびｐＫ１８４−ＫＤＡＢＨ’Ｌの各々の１コピー）を有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ２１７９９宿主細胞によって生産されるリジンの量を、以下に示す。
【０１７４】
【表８】
（実施例６）
本実施例は、上記のこれらの６遺伝子の各々の発現レベルを増大させるためのプロモーターの変更を記載する。Ｌ−アスパラギン酸からＬ−リジンへの生合成経路の６つの異なる酵素をコードする６つの遺伝子が、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの染色体に挿入されている。各遺伝子のさらなるコピーは、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株由来である。各遺伝子についての発現のレベルを調節するヌクレオチド配列（プロモーター）は、ネイティブの座においてＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ染色体上で見出されるものと同じであった。
【０１７５】
発現の増大は、酵素の比活性の増大、およびアスパラギン酸からリジンへの炭素の流動の改善を生じ得る。グルコースからのリジンの収率は、本技術によって改善され得る。
【０１７６】
プロモーター配列由来の発現のレベルは、強さと呼ばれる。強いプロモーターは、弱いものより高い発現を示す。プロモーターの強さを決定する機構は、記載されている（Ｒｅｃｏｒｄ，Ｍ．Ｔ．ら「大腸菌ＲＮＡポリメラーゼ、プロモーターおよび転写開始段階の速度論」Ｅｓｃｈｅｒｉｄｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ：Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ（１９９６），ｐｐ７９２〜８８１）。プロモーター源は、以下に由来するヌクレオチド配列を含む：Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ染色体に対してネイティブな遺伝子の５’末端、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいて複製するプラスミド上の配列、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍに感染するファージのゲノム中の配列、またはヒトによって構築されそして天然には見出されない配列（ｔａｃ、ｔｒｃ）。リボソームタンパク質の遺伝子、リボソームＲＮＡおよび延長因子は、高い発現レベルを示す。これらの遺伝子のプロモーターは、アミノ酸生合成経路遺伝子の発現を増大させるための候補である。
【０１７７】
生合成経路における遺伝子のプロモーターを変更する別の理由は、この経路を野生型生物においてこの経路を制御する因子から独立させることである。例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのリジン生合成経路のジアミノピメレート（ｄｉａｍｉｎｏｐｉｍｅｌａｔｅ）脱炭酸酵素を含むオペロンのネイティブプロモーターは、増殖培地においてアルギニンまたはリジンに応答し得る。アルギニンは、転写を３倍増大し、そしてリジンは、転写を３分の１減じた（Ｏｇｕｉｚａら，Ｊ Ｂａｃｔ．１７５：７３５６〜７３６２（１９９３））。ジアミノピメレート脱炭酸酵素活性は、１０ｍｍＭリジンを補充した最小培地で増殖される細胞において６０％減少した（Ｃｒｅｍｅｒら，Ｊ Ｇｅｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３４：３２２１〜３２２９（１９８８））。ジアミノピメレート脱炭酸酵素をコードするｌｙｓＡのプロモーターを置換することは、リジン生合成を培地中のアルギニンレベルおよびリジンレベルから独立させる１つの方法である。
【０１７８】
（実施例６Ａ）
アスパラギン酸キナーゼ（アスパラギン酸からリジンへの経路中の第１の酵素）についての遺伝子を調節するａｓｋＰ１プロモーターより強いプロモーターの例を、以下に示す。
【０１７９】
【表９】
Ｅ１２は、リジンを生産しないＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株である。Ｅ１２は、ＡＴＣＣ１３０５９由来の実験室株である。ＢＦ１００は、高レベルのリジン生産者である（ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４）。ＴＡＣは、商業的に利用可能なプロモーターであり、これは強いプロモーターの例として用いられる。ネイティブのアスパルトキナーゼプロモーターより強いＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ染色体由来の４つのプロモーターおよびファージ由来の３つのプロモーターが同定された。
【０１８０】
（実施例６Ｂ）
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいて発現される場合にアスパルトキナーゼの酵素比活性を増大させる強いプロモーターの例を、以下に示す。
【０１８１】
【表１０】
（実施例６Ｃ）
振盪フラスコ中のリジン生産に対するｌａｃＩ／ｔｒｃ−ａｓｋの影響の例を以下に示す。
【０１８２】
【表１１】
ＢＦ１００によるリジンの生産は、アスパルトキナーゼプロモーターの強さを増大することによって改善された。
【０１８３】
（実施例７）
本実施例は、本発明の高収率細胞株の構築におけるベクターｐＤＥｌｉａ２−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＡ−ＯＲＦ２−ｄａｐＢ−ｄｄｈ−Ｐ１ｌｙｓＡ（ｐＤＥｌｉａ２ＫＤＡＢＨＰ１Ｌ）の使用を示す。Ｐ１プロモーターを含むＨｐａＩ−ＰｖａＩＩフラグメントを、Ｍａｒｃｅｌ Ｔ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ４：１８１９〜１８３０（１９９０）に記載されるように調製した。出願人らは、上記のように標準ＰＣＲおよび標準サブクローニング手順を利用した。本発明の単離された核酸分子を用いた細胞形質転換実験のために、コンピテント細胞の増殖調製、および相対的増殖の決定を上記のような手順にしたがって実施し得る。
【０１８４】
出願人らは、Ｌ−リジン生合成経路において用いられる以下のベクターを構築することにおいて以下の工程を実施した。
【０１８５】
１．ｐＧＥＭＴ−ａｓｋ−ａｓｄ：プライマーａｓｋおよびａｓｄを用いてＡＴＣＣ２１５２９のａｓｋ−ａｓｄオペロンを含む約２．６ＫｂのＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ ｐＧＥＭ−Ｔベクター系）にクローン化した。
【０１８６】
２．ｐＵＣ１８−ｄｄｈ：ｄｄｈを含むｐＡＤＭ２１の約１．３Ｋｂ ＫｐｎＩフラグメント（ＢＦ１００座）をｐＵＣ１８へ、ＫｐｎＩ部位においてサブクローン化した。
【０１８７】
３．ｐＦＣ３−ａｓｋ−ａｓｄ：ｐＧＥＭＴ−ａｓｋ−ａｓｄの約２．６ＫｂのＮｓｉＩ−ＡｐａＩフラグメントをＰｓｔＩおよびＡｐａＩを用いて切断したｐＦＣ３へクローン化した。
【０１８８】
４．ｐＦＣ３−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ：ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４のｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡコード領域の約２．９ＫｂのＰＣＲ産物をｐＦＣ３へ、ＥｃｏＲＶ部位においてクローン化した。
【０１８９】
５．ｐＦＣ１−ｄｄｈ：ｐＵＣ１８−ｄｄｈの約１．３ＫｂのＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントをＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩを用いて切断したｐＦＣ１へクローン化した。
【０１９０】
６．ｐＵＣ１９−Ｐ１：ｐＲＳ６のＨｐａＩ−ＰｖｕＩＩフラグメント約５５０ｂｐ（ａｒｇＳ−ｌｙｓＡオペロンの第１のプロモーター（Ｐ１）を含む）をｐＵＣ１９へ、ＳｍａＩ部位においてクローン化した。
【０１９１】
７．ｐＵＣ１９−Ｐ１ｌｙｓＡ：プライマーＬｙｓＡ（ＡＴＧ）およびＬｙｓＡ３Ｂを用いた、ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４ ｌｙｓＡコード領域のＰＣＲ産物約１．４５Ｋｂ（プロモータを含まない）をｐＵＣ１９−Ｐ１へ、ＨｉｎｃＩＩ部位においてクローン化する。
【０１９２】
８．ｐＦＣ１−Ｐ１ｌｙｓＡ：ｐＵＣ１９−Ｐ１ｌｙｓＡの約２ＫｂのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて切断したｐＦＣ１へクローン化した。
【０１９３】
９．ｐＦＣ１−Ｐ１ｌｙｓＡ−ｄｄｈ：ｐＦＣ１−ｄｄｈの約１．３ＫｂのＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩフラグメントをＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩを用いて切断したｐＦＣ１−Ｐ１ｌｙｓＡへクローン化した。
【０１９４】
１０．ｐＦＣ１−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄｄｈ−Ｐ１ｌｙｓＡ：ｐＦＣ３−ａｓｋ−ａｓｄの約２．６ＫｂのＳｗａＩ−ＦｓｅＩフラグメントをＳｗａＩおよびＦｓｅＩを用いて切断したｐＦＣ１−ｄｄｈ−Ｐ１ｌｙｓＡへクローン化した。
【０１９５】
１１．ｐＦＣ３−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ−ｄｄｈ−Ｐ１ｌｙｓＡ（ｐＦＣ３−ＫＤＡＢＨＰ１Ｌ）：ｐＦＣ１−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄｄｈ−Ｐ１ｌｙｓＡの約５．９ＫｂのＳｐｅＩフラグメントを、ｐＦＣ３−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡへ、ＳｐｅＩ部位においてクローン化した。
【０１９６】
１２．ｐＤＥｌｉａ２−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ−ｄｄｈ−Ｐ１ｌｙｓＡ（ｐＤＥｌｉａ２−ＫＤＡＢＨＰ１Ｌ）：ｐＦＣ３−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ−ｄｄｈ−Ｐ１ｌｙｓＡの約８．８ＫｂのＰｍｅＩフラグメントをｐＤＥｌｉａ２へ、ＨｉｎｃＩＩ部位においてクローン化した。
【０１９７】
【表１２】
プロモータＰ１を含むＨｐａＩ−ＰｖｕＩＩフラグメントのヌクレオチド配列（配列番号１７）を図２０に示す。ｐＤＥｌｉａ２−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＡ−ＯＲＦ２−ｄａｐＢ−ｄｄｈ−Ｐ１ｌｙｓＡ（ｐＤＥｌｉａ２−ＫＤＡＢＨＰ１Ｌ）構築物を含むＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４におけるリジン生成の結果を以下に示す。
【０１９８】
【表１３】
（実施例８）
本実施例は、本発明の高収率細胞株の構築におけるベクターｐＤＥｌｉａ２ＦＣ５−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＢ−ｄｄｈ−ｌｙｓＡ（ｐＤＥｌｉａ２ＦＣ５ＫＤＢＨＬ）の使用を示す。ｐＤＥｌｉａ２ＦＣ５ＫＤＢＨＬベクターは、短縮型ＯＲＦ２遺伝子を含み、そしてｄａｐＡ遺伝子を欠く。ＯＲＦ２遺伝子を、内部ＣｌａＩ部位において切断し、３’領域およびｄａｐＡ遺伝子を除いた。プロモーターのないｌｙｓＡ遺伝子をＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４より得た。本発明の単離された核酸分子を用いた細胞形質転換実験のために、コンピテント細胞の増殖調製、および相対的増殖の決定を上記の手順にしたがって実施し得る。出願人らは、Ｌ−リジン生合成経路において用いられる以下のベクターを構築することにおいて以下の工程を実施した。
【０１９９】
１．ｐＧＥＭＴ−ａｓｋ−ａｓｄ：プライマーａｓｋおよびａｓｄを用いてＡＴＣＣ２１５２９のａｓｋ−ａｓｄオペロンを含む約２．６ＫｂのＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ ｐＧＥＭ−Ｔベクター系）にクローン化した。
【０２００】
２．ｐＦＣ３−ａｓｋ−ａｓｄ：ｐＧＥＭＴ−ａｓｋ−ａｓｄの約２．６ＫｂのＮｓｉＩ−ＡｐａＩフラグメントをＰｓｔＩおよびＡｐａＩを用いて切断したｐＦＣ３へクローン化した。
【０２０１】
３．ｐＦＣ３−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ：ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４のｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡコード領域の約２．９ＫｂのＰＣＲ産物をｐＦＣ３へ、ＥｃｏＲＶ部位においてクローン化した。
【０２０２】
４．ｐＦＣ３−ｄａｐＢ：ｐＦＣ３−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡの大きなＣｌａＩフラグメントを再連結した。
【０２０３】
５．ｐＵＣ１８−ｄｄｈ：ｄｄｈを含むｐＡＤＭ２１の約１．３ＫｂのＫｐｎＩフラグメント（ＮＲＲＬ Ｂ１１４７４座）をｐＵＣ１８へ、ＫｐｎＩ部位においてサブクローン化した。
【０２０４】
６．ｐＦＣ１−ｄｄｈ：ｐＵＣ１８−ｄｄｈの約１．３ＫｂのＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントをＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩを用いて切断したｐＦＣ１へクローン化した。
【０２０５】
７．ｐＦＣ１−ｄｄｈ−ｌｙｓＡ：ｐＲＳ６の約２．１ＫｂのＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩフラグメント（インタクトのｌｙｓＡ ＤＮＡを含む）をＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩを用いて切断したｐＦＣ１−ｄｄｈへクローン化した。
【０２０６】
８．ｐＦＣ１−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄｄｈ−ｌｙｓＡ：ｐＦＣ３−ａｓｋ−ａｓｄの約２．６ＫｂＳｗａＩ−ＦｓｅＩフラグメントをＳｗａＩおよびＦｓｅＩを用いて切断したｐＦＣ１−ｄｄｈ−ｌｙｓＡへ、クローン化した。
【０２０７】
９．ｐＦＣ３−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＢ−ｄｄｈ−ｌｙｓＡ：ｐＦＣ１−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄｄｈ−ｌｙｓＡの約６ＫｂのＳｐｅＩフラグメントをｐＦＣ３−ｄａｐＢへ、ＳｐｅＩ部位においてクローン化した。
【０２０８】
１０．ｐＤＥｌｉａ２ＦＣ５−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＢ−ｄｄｈ−ｌｙｓＡ（ｐＤＥｌｉａ２ＦＣ５−ＫＤＢＨＬ）：ｐＦＣ３−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＢ−ｄｄｈ−ｌｙｓＡの約７．３ＫｂのＮｏｔＩ−ＰｍｅＩフラグメントをＮｏｔＩおよびＰｍｅＩを用いて切断したｐＤＥｌｉａ２ＦＣ５へクローン化した。
【０２０９】
１１．ｐＤＥｌｉａ２ＦＣ５：ｐＦＣ５の小さなＰｖｕＩＩフラグメントをｐＤＥｌｉａ２の大きなＰｖｕＩＩフラグメントと連結した。
【０２１０】
ｐＤＥｌｉａ２ＦＣ５−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＢ−ｄｄｈ−ｌｙｓＡ（ｐＤＥｌｉａ２ＦＣ５ＫＤＢＨＬ）を含むＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４におけるリジン生成の結果を以下に示す。
【０２１１】
【表１４】
理解を明確にすることを目的として例証および実施例によって、いくぶん詳細に本発明を十分に記載しているが、同じことが、これらの条件、形態、および他のパラメータの広くかつ等価な範囲を伴って本発明を改変または変更することによって実施され得ること、およびこのような改変または変更は、添付される請求項の範囲に含まれることが意図されることは、当業者にとって明らかである。
【０２１２】
本明細書において言及される全ての刊行物、特許および特許出願は、本発明が属する当業者の技術水準を示し、かつ各個々の刊行物、特許または特許出願が、参考として援用されるように詳細かつ個別に示したものと同じ程度に、本明細書において参考として援用される。
【０２１３】
【表１５】
【０２１４】
【表１６】
【０２１５】
【表１７】
【０２１６】
【表１８】
【０２１７】
【表１９】
【０２１８】
【表２０】
【０２１９】
【表２１】
【０２２０】
【表２２】
【０２２１】
【表２３】
【０２２２】
【表２４】
【０２２３】
【表２５】
【０２２４】
【表２６】
【０２２５】
【表２７】
【０２２６】
【数１】
【数２】
【数３】
【数４】
【数５】
【数６】
【数７】
【数８】
【数９】
【数１０】
【数１１】
【数１２】
【数１３】
【数１４】
【数１５】
【数１６】
【数１７】
【数１８】
【数１９】
【数２０】
【数２１】
【数２２】
【数２３】
【数２４】
【数２５】
【数２６】
【数２７】
【数２８】
【数２９】
【数３０】
【数３１】
【数３２】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、微生物遺伝子学および組換えＤＮＡ技術の領域に関する。本発明は、Ｌ−リジンの産生に有用な遺伝子配列、ベクター、微生物、プロモーターおよび調節タンパク質を提供する。本発明はさらに、Ｌ−リジンの産生を増加するための方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
（関連分野）
Ｌ−リジンは、主にグラム陽性Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍおよびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍを利用する産業スケールでの発酵によって得られる、重要な経済的な生成物である（Ｋｌｅｅｍａｎｎ，Ａ．ら、Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２Ａ巻、５７−９７頁、Ｗｅｉｎｈａｍ：ＶＣＨ−Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ（１９８５））。
【０００３】
発酵によって産生されるアミノ酸の立体特異性は、合成プロセスと比較したプロセス上の利点を生じ；一般に、Ｌ−型アミノ酸は、微生物発酵プロセスによって生成される。安価な炭素源（例えば、糖蜜、グルコース、酢酸およびエタノール）を利用する、発酵を介するＬ−リジンおよび他のアミノ酸の産生は、比較的安価な産生手段である。
【０００４】
アミノ酸産生のための微生物プロセスにおいて使用される微生物は、以下の４つのクラスに分けられ得る：野生型株、栄養要求性の変異体、調節性変異体および栄養要求性の調節性変異体（Ｋ．Ｎａｋａｙａｍａら、Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｆｏｏｄ ａｎｄ ｆｅｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｍ．Ｆｒｉｅｄｍａｎ編（１９７８）、６４９−６６１頁）。
【０００５】
栄養要求性特性または耐性特性について単離された種々の株を利用する、いくつかの発酵プロセスが、Ｌ−リジンの産生について当該分野で公知である：米国特許第２，９７９，４３９号は、アミノ酸補充（ホモセリン、またはＬ−メチオニンおよびＬ−トレオニン）を必要とする変異体を開示する；米国特許第３，７００，５５７号は、Ｌ−トレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−シスチンまたはＬ−システインに対する栄養要求性を有する変異体を開示する；米国特許第３，７０７，４４１号は、Ｌ−リジンアナログに対する耐性を有する変異体を開示する；米国特許第３，６８７，８１０号は、Ｌ−リジンを産生する能力およびバシトラシン、ペニシリンＧまたはポリミキシンに対する耐性の両方を有する変異体を開示する；米国特許第３，７０８，３９５号は、ホモセリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トレオニンおよびＬ−メチオニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシンまたはそれらの混合物に対する栄養要求性およびＬ−リジン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−イソロイシンまたはそれらのアナログに対する耐性を有する変異体を開示する；米国特許第３，８２５，４７２号は、Ｌ−リジンアナログに対する耐性を有する変異体を開示する；米国特許第４，１６９，７６３号は、Ｌ−リジンを産生しかつアスパラギンアナログおよびスルファ薬剤の少なくとも１つに対して耐性であるＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍの変異株を開示する；米国特許第５，８４６，７９０号は、いかなるビオチン作用抑制剤の非存在下においてＬ−グルタミン酸およびＬ−リジンを産生し得る変異株を開示する；そして米国特許第５，６５０，３０４号は、４−Ｎ−（Ｄ−アラニル）−２，４−ジアミノ−２，４−ジデオキシ−Ｌ−アラビノース２，４−ジデオキシ−Ｌ−アラビノースまたはその誘導体に対して耐性である、Ｌ−リジンの産生のためのＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属またはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する株を開示する。
【０００６】
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種におけるＬ−リジン合成のための生化学的経路に関して多くのことが知られている（Ｓａｈｍら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８２：２５−３９（１９９６）によって近年概説されている）。Ｌ−リジン経路の入口は、Ｌ−アスパラギン酸で開始し（図１を参照のこと）、Ｌ−アスパラギン酸自体は、オギザロ酢酸のアミノ基転移によって産生される。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの特別な特徴は、Ｌ−リジン中間体であるピペリジン２，６−ジカルボン酸からジアミノピメリン酸へ転換するその能力である。この転換は、以下の２つの経路、すなわち、スクシニル化中間体が関与する反応またはジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼの単一の反応によって生じる。全体として、この経路への炭素フラックスは、以下の２つの点：第１に、Ｌ−トレオニンおよびＬ−リジンの両方のレベルによるアスパラギン酸キナーゼのフィードバック阻害を介して；および第２に、ジヒドロジピコリン酸シンターゼのレベルの制御を介して、調節される。従って、Ｌ−リジンの産生の増加は、これらの２つの酵素の活性を調節解除および増加することによって、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種において得られ得る。
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種におけるＬ−リジン発酵産生の領域におけるより近年の発達は、Ｌ−リジン産生を増強するための分子生物学的技術の使用を含む。この分野の例示として、以下の例を提供する：特許文献１および特許文献２は、Ｓ−（２−アミノエチル）−システインに感受性の宿主ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ種微生物を組換えＤＮＡ分子（ここで、Ｓ−（２−アミノエチル）−システインに対する耐性およびＬ−リジン産生能の両方を付与するＤＮＡフラグメントが、ベクターＤＮＡにされている）で形質転換することによって得られた、Ｌ−リジン産生変異株を開示する；特許文献３は、アスパルトキナーゼをコードする遺伝子（これは、Ｌ−リジンおよびＬ−トレオニンによるフィードバック阻害が脱感作された、コリネ型細菌由来である）を、漏出型ホモセリンデヒドロゲナーゼを保持するＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種細菌またはホモセリンデヒドロゲナーゼ遺伝子欠損のＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種の染色体ＤＮＡに組み込むことによって産生された変異株を開示する；増加されたＬ−リジン産生は、プラスミドベクターまたは遺伝子置換ストラテジーの使用による、遺伝子増幅によって得られる。特許文献４および特許文献５の両方は、プラスミドコピー数に基づく遺伝子増幅による、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種におけるＬ−リジンの産生の増加を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第４，５６０，６５４号明細書
【特許文献２】米国特許第５，２３６，８３１号明細書
【特許文献３】米国特許第５，７６６，９２５号明細書
【特許文献４】欧州特許出願公開第０ ８１１ ６８２ Ａ２号明細書
【特許文献５】欧州特許出願公開第０ ８５４ １８９ Ａ２号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１） 配列番号２のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
（項目２） 項目１に記載される前記ポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
（項目３） 項目２に記載の単離されたポリヌクレオチド分子であって、配列番号１の配列を有する核酸を含む、ポリヌクレオチド分子。
（項目４） 項目２に記載される単離されたポリヌクレオチド分子を含む、ベクター。
（項目５） 項目４に記載されるベクターを含む、宿主細胞。
（項目６） 方法であって、以下：
（ａ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種の宿主細胞を、項目２に記載されるポリヌクレオチド分子を用いて形質転換する工程であって、ここで、該単離されたポリヌクレオチド分子が該宿主細胞の染色体に組み込まれ、これによって該宿主細胞染色体中のアミノ酸生合成経路遺伝子の総数を増加させる、工程；および
（ｂ）形質転換された宿主細胞を選択する工程、
を包含する、方法。
（項目７） 項目６に記載の方法であって、増加したアミノ酸産生についてスクリーニングする工程をさらに包含する、方法。
（項目８） 項目６に記載の方法であって、ここで、前記ポリヌクレオチド分子が、さらに、以下：
（ａ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ａｓｄアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｂ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ｄａｐＡアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｃ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ｄａｐＢアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｄ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ｄｄｈアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｅ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路‘ｌｙｓＡアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｆ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ｌｙｓＡアミノ酸配列をコードする、核酸分子；および
（ｇ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする、核酸分子、
のうちの少なくとも１つを含む、方法。
（項目９） 項目８に記載の方法であって、さらに、増加したアミノ酸産生についてスクリーニングする工程を包含する、方法。
（項目１０） 項目６に記載の方法であって、ここで、前記単離されたポリヌクレオチド分子が、さらに、以下：
（ａ）配列番号４のａｓｄアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｂ）配列番号６のｄａｐＡアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｃ）配列番号８のｄａｐＢアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｄ）配列番号１０のｄｄｈアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｅ）配列番号２１の‘ｌｙｓＡアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｆ）配列番号１４のｌｙｓＡアミノ酸配列をコードする、核酸分子；および
（ｇ）配列番号１６のＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする、核酸分子、
のうちの少なくとも１つを含む、方法。
（項目１１） 項目６に記載の方法であって、ここで、前記単離されたポリヌクレオチド分子が、さらに、以下：
（ａ）配列番号４のａｓｄアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｂ）配列番号６のｄａｐＡアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｃ）配列番号８のｄａｐＢアミノ酸配列をコードする、核酸分子；および
（ｄ）配列番号１６のＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする、核酸分子、
を含む、方法。
（項目１２） 項目６に記載の方法であって、ここで、前記単離されたポリヌクレオチド分子が、さらに、以下：
（ａ）配列番号４のａｓｄアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｂ）配列番号６のｄａｐＡアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｃ）配列番号８のｄａｐＢアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｄ）配列番号１０のｄｄｈアミノ酸配列をコードする、核酸分子；および
（ｅ）配列番号１６のＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする、核酸分子、
を含む、方法。
（項目１３） 項目６に記載の方法であって、ここで、前記単離されたポリヌクレオチド分子が、さらに、以下：
（ａ）配列番号４のａｓｄアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｂ）配列番号６のｄａｐＡアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｃ）配列番号８のｄａｐＢアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｄ）配列番号１０のｄｄｈアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｅ）配列番号２１の‘ｌｙｓＡアミノ酸配列をコードする、核酸分子；および
（ｆ）配列番号１６のＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする、核酸分子、
を含む、方法。
（項目１４） 項目６に記載の方法であって、ここで、前記単離されたポリヌクレオチド分子が、さらに、以下：
（ａ）配列番号４のａｓｄアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｂ）配列番号６のｄａｐＡアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｃ）配列番号８のｄａｐＢアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｄ）配列番号１０のｄｄｈアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｅ）配列番号１４のｌｙｓＡアミノ酸配列をコードする、核酸分子；および
（ｆ）配列番号１６のＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする、核酸分子、
を含む、方法。
（項目１５） 項目６に記載の方法であって、さらに、以下：
（ａ）前記形質転換された宿主細胞を培地中で増殖させる工程；および
（ｂ）該形質転換された宿主細胞によって産生されるアミノ酸を精製する工程、
を包含する、方法。
（項目１６） 単離されたポリヌクレオチド分子であって、以下：
（ａ）項目２に記載されるポリヌクレオチド分子；ならびに
（ｂ）以下の（ｉ）〜（ｖｉｉ）：
（ｉ）ａｓｄポリペプチドをコードする、核酸分子；
（ｉｉ）ｄａｐＡポリペプチドをコードする、核酸分子；
（ｉｉｉ）ｄａｐＢポリペプチドをコードする、核酸分子；
（ｉｖ）ｄｄｈポリペプチドをコードする、核酸分子；
（ｖ）‘ｌｙｓＡポリペプチドをコードする、核酸分子；
（ｖｉ）ｌｙｓＡポリペプチドをコードする、核酸分子；および
（ｖｉｉ）ＯＲＦ２ポリペプチドをコードする、核酸分子、
からなる群より選択される、少なくとも１つのさらなるＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路遺伝子、
を含む、ポリヌクレオチド分子。
（項目１７） 項目１６に記載の単離された核酸分子であって、ここで：
（ａ）前記ａｓｄポリペプチドが配列番号４であり；
（ｂ）前記ｄａｐＡポリペプチドが配列番号６であり；
（ｃ）前記ｄａｐＢポリペプチドが配列番号８であり；
（ｄ）前記ｄｄｈポリペプチドが配列番号１０であり；
（ｅ）前記‘ｌｙｓＡポリペプチドが配列番号２１であり；
（ｆ）前記ｌｙｓＡポリペプチドが配列番号１４であり；そして
（ｇ）前記ＯＲＦ２ポリペプチドが配列番号１６である、
核酸分子。
（項目１８） 単離されたポリヌクレオチド分子であって、以下：
（ａ）項目２に記載のポリヌクレオチド分子；
（ｂ）配列番号４のａｓｄアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｃ）配列番号６のｄａｐＡアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｄ）配列番号８のｄａｐＢアミノ酸配列をコードする、核酸分子；および
（ｅ）配列番号１６のＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする、核酸分子、
を含む、ポリヌクレオチド分子。
（項目１９） 単離されたポリヌクレオチド分子であって、以下：
（ａ）項目２に記載のポリヌクレオチド分子；
（ｂ）配列番号４のａｓｄアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｃ）配列番号６のｄａｐＡアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｄ）配列番号８のｄａｐＢアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｅ）配列番号１０のｄｄｈアミノ酸配列をコードする、核酸分子；および
（ｆ）配列番号１６のＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする、核酸分子、
を含む、ポリヌクレオチド分子。
（項目２０） 単離されたポリヌクレオチド分子であって、以下：
（ａ）項目２に記載のポリヌクレオチド分子；
（ｂ）配列番号４のａｓｄアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｃ）配列番号６のｄａｐＡアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｄ）配列番号８のｄａｐＢアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｅ）配列番号１０のｄｄｈアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｆ）配列番号２１の‘ｌｙｓＡアミノ酸配列をコードする、核酸分子；および
（ｇ）配列番号１６のＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする、核酸分子、
を含む、ポリヌクレオチド分子。
（項目２１） 単離されたポリヌクレオチド分子であって、以下：
（ａ）項目２に記載のポリヌクレオチド分子；
（ｂ）配列番号４のａｓｄアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｃ）配列番号６のｄａｐＡアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｄ）配列番号８のｄａｐＢアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｅ）配列番号１０のｄｄｈアミノ酸配列をコードする、核酸分子；
（ｆ）配列番号１４のｌｙｓＡアミノ酸配列をコードする、核酸分子；および
（ｇ）配列番号１６のＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする、核酸分子、
を含む、ポリヌクレオチド分子。
（項目２２） ｐＫ１８４−ＫＤＡＢを含む、項目１８に記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
（項目２３） ｐＤ１１−ＫＤＡＢＨ’Ｌを含む、項目２０に記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
（項目２４） ｐＤ２−ＫＤＡＢＨＬを含む、項目２１に記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
（項目２５） 項目１６に記載されるポリヌクレオチド分子を含む、ベクター。
（項目２６） 項目２５に記載されるベクターを含む、宿主細胞。
（項目２７） 項目２６に記載の宿主細胞であって、ここで、該宿主細胞が、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２１８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２１９、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２２０、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２２１、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２２２、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２３４およびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２３５からなる群より選択されるＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍである、宿主細胞。
（項目２８） 項目２６に記載の宿主細胞であって、該宿主細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α ＭＣＲ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２２８である、宿主細胞。
（項目２９） 項目２６に記載の宿主細胞であって、ここで、該宿主細胞が、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２３６およびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２３７からなる群より選択されるＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである、宿主細胞。
（項目３０） リジンを産生する方法であって、該方法が項目５に記載される宿主細胞を培養する工程を包含し、ここで、前記宿主細胞が、以下：
（ａ）遺伝子改変されていない宿主細胞と比較した１以上のリジン生合成経路酵素の酵素活性の増加；
（ｂ）リジン生合成経路酵素をコードする各遺伝子の１以上のコピー；および
（ｃ）リジン生合成経路酵素をコードする１以上の遺伝子の転写を調節する１以上の転写因子の改変、
のうちの１以上を含み、ここで、該宿主細胞は、該培養培地中でリジンを産生する、方法。
（項目３１） 項目３０に記載の方法であって、ここで、前記増加した酵素活性が、１以上のリジン生合成経路酵素をコードする１以上の遺伝子の過剰発現を含む、方法。
（項目３２） 項目３１に記載の方法であって、ここで、前記１以上の遺伝子が、１以上のプロモーター配列に直接的にまたは間接的に作動可能に連結される、方法。
（項目３３） 項目３２に記載の方法であって、ここで、前記作動可能に連結されたプロモーター配列が、異種、内因性、またはハイブリッドである、方法。
（項目３４） 項目３３に記載の方法であって、ここで、前記プロモーター配列が、以下：Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍに内因性の遺伝子の５’末端由来のプロモーター配列、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいて複製するプラスミド由来のプロモーター配列、およびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍに感染するファージのゲノム由来のプロモーター配列、の１つ以上である、方法。
（項目３５） 項目３３または３４に記載の方法であって、ここで、前記プロモーター配列の１つ以上が、改変されている、方法。
（項目３６） 項目３５に記載の方法であって、ここで、前記改変が、５’末端における短縮、３’末端における短縮、１つ以上のヌクレオチドの非末端挿入、１つ以上のヌクレオチドの非末端欠失、５’末端における１つ以上のヌクレオチドの付加、３’末端における１つ以上のヌクレオチドの付加、およびこれらの組み合わせを含む、方法。
（項目３７） 項目３０に記載の方法であって、ここで、前記増加した酵素活性が、１つ以上の改変されたリジン生合成経路酵素の活性から生じ、ここで、該酵素活性の改変が、その改変を欠いている酵素と比較した、反応速度論的パラメーター、アロステリック調節またはその両方における変化を生じる、方法。
（項目３８） 項目３７に記載の方法であって、ここで、前記反応速度論的パラメーターにおける変化が、Ｋｍ、Ｖｍａｘまたはその両方における変化である、方法。
（項目３９） 項目３７に記載の方法であって、ここで、前記アロステリック調節における変化が、１つ以上の酵素アロステリック調節部位における変化である、方法。
（項目４０） 項目３７に記載の方法であって、ここで、前記改変が、前記酵素をコードするヌクレオチド配列における変化の結果である、方法。
（項目４１） 項目４０に記載の方法であって、ここで、前記ヌクレオチド配列における前記変化が、１つ以上のヌクレオチドの付加、挿入、欠失、置換、またはそれらの組み合わせである、方法。
（項目４２） 項目３０に記載の方法であって、前記１つ以上の転写因子の改変が、転写インヒビタータンパク質における１以上の変異、転写アクチベータータンパク質における１以上の変異、あるいはその両方を含み、ここで、該１以上の変異は、該改変を欠いている該１以上の転写因子による転写と比較して、標的ヌクレオチド配列の転写を増加する、方法。
（項目４３） 項目４２に記載の方法であって、前記１つ以上の変異が、前記転写因子をコードする前記ヌクレオチド配列における変化である、方法。
（項目４４） 項目４３に記載の方法であって、ここで、前記ヌクレオチド配列における前記変化が、１つ以上のヌクレオチドの付加、挿入、欠失、置換、またはそれらの組み合わせである、方法。
（項目４５） 単離されたポリペプチドであって、ここで、該ポリペプチドが、配列番号１９のアミノ酸配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
（項目４６） 項目４５に記載のポリペプチドであって、ここで、該ポリペプチドが、配列番号１９のアミノ酸配列を有する、ポリペプチド。
（項目４７） 項目４５に記載されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
（項目４８） 配列番号１８の配列を有する核酸を含む、項目４７に記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
（項目４９） 項目４７に記載されるポリヌクレオチド分子を含む、ベクター。
（項目５０） 項目４９に記載されるベクターを含む、宿主細胞。
（項目５１） 項目５０に記載の宿主細胞であって、ここで、該宿主細胞が、ＮＲＲＬ Ｂ３０３６０である、宿主細胞。
（項目５２） 方法であって、以下：
（ａ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種の宿主細胞を、項目４７に記載されるポリヌクレオチド分子を用いて形質転換する工程、および
（ｂ）形質転換された宿主細胞を選択する工程、
を包含する、方法。
（項目５３） 単離されたポリペプチドであって、ここで、該ポリペプチドが、配列番号２１のアミノ酸配列に対する少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、ポリペプチド。
（項目５４） 配列番号２１のアミノ酸配列を有する、項目５３に記載のポリペプチド。
（項目５５） 項目５３に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
（項目５６） 配列番号２０の配列を有する核酸を含む、項目５５に記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
（項目５７） 項目５５に記載のポリヌクレオチド分子を含む、ベクター。
（項目５８） 項目５７に記載のベクターを含む、宿主細胞。
（項目５９） 項目５８に記載の宿主細胞であって、ここで、該宿主細胞が、ＮＲＲＬ Ｂ３０２１８、ＮＲＲＬ Ｂ３０２２０、およびＮＲＲＬ Ｂ３０２２２からなる群より選択される、宿主細胞。
（項目６０） 方法であって、以下：
（ａ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種の宿主細胞を、項目５５に記載されるポリヌクレオチド分子を用いて形質転換する工程、および
（ｂ）形質転換された宿主細胞を選択する工程、
を包含する、方法。
（項目６１） 項目２に記載の単離されたポリヌクレオチド分子であって、さらに、プロモーター配列を含み、ここで、該プロモーター配列が、配列番号１７に対する少なくとも９５％の配列同一性を有する、ポリヌクレオチド分子。
（項目６２） 項目６１に記載のポリヌクレオチドであって、ここで、前記プロモーター配列が、配列番号１７のヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド。
（項目６３） 項目６１に記載の単離されたポリヌクレオチド分子であって、ここで、前記プロモーターが、ＬｙｓＡ遺伝子に作動可能に直接連結されている、ポリヌクレオチド分子。
（項目６４） 項目６１に記載される単離されたポリヌクレオチドを含む、ベクター。
（項目６５） 項目６４に記載されるベクターを含む、宿主細胞。
（項目６６） 項目６５に記載の宿主細胞であって、ここで、該宿主細胞が、ＮＲＲＬ Ｂ３０３５９である、宿主細胞。
（項目６７） 方法であって、以下：
（ａ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種の宿主細胞を、項目６１に記載されるポリヌクレオチド分子を用いて形質転換する工程、および
（ｂ）形質転換された宿主細胞を選択する工程、
を包含する、方法。
本発明の目的は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種におけるアミノ酸の産生を増加する方法を提供することであり、これは、宿主細胞におけるアミノ酸生合成経路の遺伝子（単数または複数）の数を増幅（すなわち、増加）することによる。特に好ましいＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種としては、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍおよびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍが挙げられる。
【０００９】
本発明の目的は、単離されたフィードバック耐性アスパルトキナーゼ酵素を提供することであり、ここで、このフィードバック感受性形態における天然に存在するトレオニンアミノ酸残基３８０が、ＡＴＣＣ２１５２９のａｓｋ遺伝子においてイソロイシンに変化されている。本発明の目的は、配列番号２のアミノ酸配列を含む単離されたａｓｋポリペプチドを提供することである。本発明の別の目的は、配列番号２のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子を提供することである。本発明の別の目的は、配列番号１の配列を有する核酸を含む、単離されたポリヌクレオチド分子を提供することである。
【００１０】
本発明の別の目的は、以下の工程を含む方法を提供することである：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種宿主細胞を、配列番号２のアミノ酸を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子で形質転換する工程であって、この単離されたポリヌクレオチド分子は、この宿主細胞の染色体に組み込まれ、これによって、この宿主細胞染色体におけるこのアミノ酸生合成経路遺伝子の総数を増加する、工程、および形質転換された宿主細胞を選択する工程。本発明のさらなる目的は、増加されたアミノ酸産生についてスクリーニングする工程を包含する方法を提供することである。この方法はさらに、この形質転換された宿主細胞を培地中で増殖させる工程およびこの形質転換された宿主細胞によって産生されたアミノ酸を精製する工程を包含する。
【００１１】
別の実施形態において、アミノ酸の産生を増加するための方法は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種宿主細胞を、配列番号２のアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子で形質転換する工程、および形質転換された宿主細胞を選択する工程、を包含する方法であって、ここで、この単離された核酸分子は、この宿主細胞染色体に組み込まれ、それによって、この宿主細胞染色体におけるこのアミノ酸の生合成経路遺伝子の総数を増加し、かつここで、この単離された核酸分子は、以下のうちの少なくとも１つをさらに含む：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路のａｓｄアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路のｄａｐＡアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路のｄａｐＢアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路のｄｄｈアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路の‘ｌｙｓＡアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路のｌｙｓＡアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路のＯＲＦ２アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。この方法はさらに、この形質転換された宿主細胞を培地中で増殖させる工程およびこの形質転換された宿主細胞によって産生されたアミノ酸を精製する工程を包含する。
【００１２】
用語「‘ｌｙｓＡ」とは、出願人によって使用されかつ以下に記載される、短縮型ｌｙｓＡの遺伝子またはアミノ酸配列をいう。用語「ｌｙｓＡ」とは、出願人によって使用されかつ以下に記載される、全長ｌｙｓＡの遺伝子またはアミノ酸配列をいう。
【００１３】
本発明の別の目的は、単離されたポリヌクレオチド分子を提供することであって、このポリヌクレオチドは、配列番号２のＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍリジン経路のａｓｋアミノ酸配列をコードする核酸分子；および以下からなる群より選択される少なくとも１つのさらなるＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種のリジン経路遺伝子を含む：ａｓｄポリペプチドをコードする核酸分子、ｄａｐＡポリペプチドをコードする核酸分子、ｄａｐＢポリペプチドをコードする核酸分子、ｄｄｈポリペプチドをコードする核酸分子、‘ｌｙｓＡポリペプチドをコードする核酸分子、ｌｙｓＡポリペプチドをコードする核酸分子およびＯＲＦ２ポリペプチドをコードする核酸分子。本発明の好ましい実施形態において、この単離されたポリヌクレオチド分子は、ｐＫ１８４−ＫＤＡＢＨ’Ｌを含む。本発明の別の好ましい実施形態において、この単離された核酸分子は、ｐＫ１８４−ＫＤＡＢを含む。本発明の別の好ましい実施形態において、この単離された核酸分子は、ｐＤ２−ＫＤＡＢＨＬを含む。本発明の別の好ましい実施形態において、この単離された核酸分子は、ｐＤ１１−ＫＤＡＢＨ’Ｌを含む。
【００１４】
本発明の別の目的は、単離されたポリヌクレオチド分子で形質転換された宿主細胞であって、このポリヌクレオチド分子が、配列番号２のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、宿主細胞を提供することであり、ここで、この単離された核酸分子は、この宿主細胞染色体に組み込まれ、それによって、この宿主細胞染色体中のアミノ酸生合成経路遺伝子の総数を増加する。１つの実施形態において、このポリヌクレオチドは、以下からなる群より選択される少なくとも１つのさらなるＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種のリジン経路遺伝子をさらに含む：ａｓｄポリペプチドをコードする核酸分子；ｄａｐＡポリペプチドをコードする核酸分子；ｄａｐＢポリペプチドをコードする核酸分子；ｄｄｈポリペプチドをコードする核酸分子；‘ｌｙｓＡポリペプチドをコードする核酸分子；ｌｙｓＡポリペプチドをコードする核酸分子；およびＯＲＦ２ポリペプチドをコードする核酸分子。
【００１５】
別の実施形態において、このポリヌクレオチドは、このａｓｄポリペプチドが配列番号４であり；このｄａｐＡポリペプチドが配列番号６であり；このｄａｐＢポリペプチドが配列番号８であり；このｄｄｈポリペプチドが配列番号１０であり；この‘ｌｙｓＡポリペプチドが配列番号２１であり；このｌｙｓＡポリペプチドが配列番号１４であり；そしてこのＯＲＦ２ポリペプチドが配列番号１６である、ポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む。
【００１６】
別の実施形態において、このポリヌクレオチドは、このａｓｄポリペプチドが配列番号４であり；このｄａｐＡポリペプチドが配列番号６であり；このｄａｐＢポリペプチドが配列番号８であり；このｄｄｈポリペプチドが配列番号１０であり；この‘ｌｙｓＡポリペプチドが配列番号２１であり；このｌｙｓＡポリペプチドが配列番号１４であり；そしてこのＯＲＦ２ポリペプチドが配列番号１６である、核酸分子をさらに含む。
【００１７】
別の実施形態において、このポリヌクレオチドは、配列番号４のａｓｄアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号６のｄａｐＡアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号８のｄａｐＢアミノ酸配列をコードする核酸分子；および配列番号１６のＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする核酸分子をさらに含む。
【００１８】
別の実施形態において、このポリヌクレオチドは、配列番号４のａｓｄアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号６のｄａｐＡアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号８のｄａｐＢアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号１０のｄｄｈアミノ酸配列をコードする核酸分子；および配列番号１６のＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする核酸分子をさらに含む。
【００１９】
別の実施形態において、このポリヌクレオチドは、配列番号４のａｓｄアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号６のｄａｐＡアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号８のｄａｐＢアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号１０のｄｄｈアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号２１の‘ｌｙｓＡアミノ酸配列をコードする核酸分子；および配列番号１６のＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする核酸分子をさらに含む。
【００２０】
別の実施形態において、このポリヌクレオチドは、配列番号４のａｓｄアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号６のｄａｐＡアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号８のｄａｐＢアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号１０のｄｄｈアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号１４のｌｙｓＡアミノ酸配列をコードする核酸分子；および配列番号１６のＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする核酸分子をさらに含む。
【００２１】
１つの実施形態において、形質転換された宿主細胞は、以下からなる群より選択されるＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍである：Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２１８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２１９、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２２０、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２２１、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２２２、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２３４およびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２３５。別の実施形態において、宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α ＭＣＲ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２２８である。別の実施形態において、宿主細胞は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２３６およびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２３７からなる群より選択されるＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである。
【００２２】
本発明の別の目的は、リジンを産生する方法を提供することであり、この方法は、配列番号２のアミノ酸配列を含む宿主細胞を培養する工程を包含し、ここで、この宿主細胞は、（ａ）遺伝子改変されていない非ヒト宿主細胞と比較した１以上のリジン生合成経路酵素の酵素活性の増加；（ｂ）リジン生合成経路酵素をコードする各遺伝子の１以上のコピー；および（ｃ）リジン生合成経路酵素をコードする１以上の遺伝子の転写を調節する１以上の転写因子の改変、のうちの１以上を含み、ここで、この宿主細胞は、この培養培地中でリジンを産生する。本発明の１つの実施形態において、この酵素活性の増加としては、１以上のリジン生合成経路酵素をコードする１以上の遺伝子の過剰発現が含まれる。本発明の別の実施形態において、この酵素活性の増加は、１以上の改変されたリジン生合成経路酵素の活性から生じ、ここで、この酵素の改変は、その改変を欠いている酵素と比較した、反応速度パラメーター、アロステリック調節またはその両方における変化を生じる。本発明の別の実施形態において、１以上の転写因子の改変としては、転写インヒビタータンパク質における１以上の変異、転写アクチベータータンパク質における１以上の変異、あるいはその両方を含み、ここで、この１以上の変異は、この改変を欠いているこの１以上の転写因子による転写と比較して、標的ヌクレオチド配列の転写を増加する。
【００２３】
本発明の目的は、単離されたポリペプチドを提供することであり、このポリペプチドは、配列番号１９のアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。本発明のさらなる目的は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供することである。本発明のさらなる目的は、配列番号１８の配列を有する核酸を含む単離されたポリヌクレオチドを提供することである。本発明の別の目的は、宿主細胞ＮＲＲＬ Ｂ３０３６０を提供することである。
【００２４】
本発明の目的は、単離されたポリペプチドを提供することであり、このポリペプチドは、配列番号２１のアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。本発明のさらなる目的は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供することである。本発明のさらなる目的は、配列番号２０の配列を有する核酸を含むポリヌクレオチド分子を提供することである。
【００２５】
本発明の目的は、単離されたポリヌクレオチド分子を提供することであり、このポリヌクレオチド分子は、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、プロモーター配列をさらに含み、ここで、このプロモーター配列は、配列番号１７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。本発明のさらなる目的は、単離されたポリヌクレオチド分子を提供することであり、このポリヌクレオチド分子は、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、このポリヌクレオチド分子は、配列番号１７の配列をさらに含む。本発明のさらなる目的は、宿主細胞ＮＲＲＬ Ｂ３０３５９を提供することである。
本発明のさらなる目的および利点は、以下の説明から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるＬ−リジン生合成経路（Ｓａｈｍら）の図。
【図２】ａｓｋ（ＡＴＣＣ ２１５２９配列）のヌクレオチド配列（配列番号１）。
【図３Ａ】ａｓｋ（ＡＴＣＣ ２１５２９配列）のアミノ酸配列（配列番号２）。
【図３Ｂ】ａｓｋ（ＡＴＣＣ ２１５２９配列）のアミノ酸配列（配列番号２）。
【図４】ａｓｄ（ＡＴＣＣ ２１５２９配列）のヌクレオチド配列（配列番号３）。
【図５Ａ】ａｓｄ（ＡＴＣＣ ２１５２９配列）のアミノ酸配列（配列番号４）。
【図５Ｂ】ａｓｄ（ＡＴＣＣ ２１５２９配列）のアミノ酸配列（配列番号４）。
【図６】ｄａｐＡ（ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４）のヌクレオチド配列（配列番号５）。
【図７Ａ】ｄａｐＡ（ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４）のアミノ酸配列（配列番号６）。
【図７Ｂ】ｄａｐＡ（ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４）のアミノ酸配列（配列番号６）。
【図８】ｄａｐＢ（ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４）のヌクレオチド配列（配列番号７）。
【図９】ｄａｐＢ（ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４）のアミノ酸配列（配列番号８）。
【図１０】ｄｄｈ（ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４）のヌクレオチド配列（配列番号９）。
【図１１Ａ】ｄｄｈ（ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４）のアミノ酸配列（配列番号１０）。
【図１１Ｂ】ｄｄｈ（ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４）のアミノ酸配列（配列番号１０）。
【図１２】短縮型ｌｙｓＡ（‘ｌｙｓＡ）ヌクレオチド配列を得るために使用した全長ｌｙｓＡ（ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４）のヌクレオチド配列（配列番号１１）。下線を付した領域にｌｙｓＡプライマーがアニーリングする。
【図１３】短縮型ｌｙｓＡ（‘ｌｙｓＡ）アミノ酸配列（配列番号２１）を含む全長ｌｙｓＡ（ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４）のアミノ酸配列（配列番号１２）。下線を付したＬ：ｌｙｓＡの最後のアミノ酸残基がこの短縮型ＰＣＲ産物にコードされる。
【図１４】全長ｌｙｓＡ（ｐＲＳ６）のヌクレオチド配列（配列番号１３）。
【図１５Ａ】全長ｌｙｓＡ（ｐＲＳ６）のアミノ酸配列（配列番号１４）。
【図１５Ｂ】全長ｌｙｓＡ（ｐＲＳ６）のアミノ酸配列（配列番号１４）。
【図１５Ｃ】全長ｌｙｓＡ（ｐＲＳ６）のアミノ酸配列（配列番号１４）。
【図１６】ＯＲＦ２（ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４）のヌクレオチド配列（配列番号１５）。
【図１７】ＯＲＦ２（ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４）のアミノ酸配列（配列番号１６）。
【図１８】本発明の５および６リジン経路遺伝子の構築物の模式図。
【図１９】ＡＴＣＣ１３０３２、Ｎ１３およびＡＴＣＣ２１５２９由来のアスパルトキナーゼ（ａｓｋ）アミノ酸配列の比較。
【図２０】Ｐ１プロモーターを含むｐＲＳ６由来のＨｐａＩ−ＰｖｕＩＩフラグメントのヌクレオチド配列（配列番号１７）。
【図２１Ａ】ｐＤＥｌｉａ２−ＫＤＡＢＨＰ１Ｌ構築物の構築の模式図。
【図２１Ｂ】ｐＤＥｌｉａ２−ＫＤＡＢＨＰ１Ｌ構築物の構築の模式図。
【図２２】ｐＤＥｌｉａ２ＦＣ５−ＫＤＢＨＬ構築物の構築の模式図。
【図２３】短縮型ＯＲＦ２のヌクレオチド配列（配列番号１８）。
【図２４】短縮型ＯＲＦ２のアミノ酸配列（配列番号１９）。
【図２５】短縮型ＬｙｓＡ（‘ｌｙｓＡ）（ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４）のヌクレオチド配列（配列番号２０）。
【図２６】短縮型ＬｙｓＡ（‘ＬｙｓＡ）（ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４）のアミノ酸配列（配列番号２１）。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
（Ａ．定義）
本明細書および特許請求の範囲（このような用語に与えられる範囲を含む）の明確でかつ整合性のある理解を提供するために、以下の定義を提供する。用語「ａ」または「ａｎ」という構成要素が、一つ以上の構成要素を言及することもまた、注目されるべきである；例えば、「ポリヌクレオチド」という表現は、一つ以上のポリヌクレオチドを表わすことが理解される。
【００２８】
（アロステリック調節）
本明細書中で使用される場合、この用語は、一つ以上のリガンド（アロステリックエフェクター）が一つ以上の結合部位に結合することによる、酵素活性の調節を表している。このリガンドは、同じ分子または、異なった分子であり得る。これらの分子は、酵素活性部位以外の酵素上の結合部位で結合する。結合の結果、コンフォメーション変化が酵素の中で誘導され、これは基質または他のリガンドに対する活性部位の親和性を調節する。アロステリックエフェクターは、触媒部位の基質親和性を増大する（アロステリックアクチベーター）役割または親和性を減少する（アロステリックレプレッサー）役割を果たし得る。アロステリックエフェクターは、例えばフィードバックループのような、代謝制御機構の基礎を形成する（Ｃｏｐｅｌａｎｄ，Ｒｏｂｅｒｔ Ａ．、Ｅｎｚｙｍｅｓ．Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａ１ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ、ａｎｄ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ，２７９〜２９６頁、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９６）を参照のこと）。
【００２９】
（アミノ酸生合成経路遺伝子）
本明細書中で使用される場合、用語「アミノ酸生合成経路遺伝子」は、直接アミノ酸合成に関与する、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、および酵素をコードする、遺伝子および遺伝子フラグメントを含むことを意味する。これらの遺伝子は、宿主細胞の中で天然に存在して、宿主細胞の中でアミノ酸（特にリジン）の合成に関わる遺伝子と同一である。あるいは、このような遺伝子の改変体または変異体が存在し得、例えば、この遺伝子はこのコードされるタンパク質の活性に有意な影響を与えない改変体および変異体を含み得る。例えば、天然の遺伝子は、変異誘発、または一つ以上のヌクレオチドの導入もしくは置換、またはこの遺伝子の非必須領域を欠失させることにより改変され得る。
【００３０】
（栄養素要求株）
本明細書中で使用される場合、この用語は、増殖のために獲得性の遺伝子欠陥のために合成され得ない特定の代謝産物の外部の供給源を必要とする、微生物の株をいう。
【００３１】
（アミノ酸補充物）
本明細書中で使用される場合、この用語は、増殖のために必要とされ、そして栄養素要求株の増殖を支持するために、最少培地に添加される、アミノ酸をいう。
【００３２】
（染色体組込み）
本明細書中で使用される場合、この用語は外因性ＤＮＡフラグメントを、宿主生物の染色体へ挿入することをいい、より具体的には、この用語は、外因性ＤＮＡフラグメントと宿主細胞の染色体の適切な領域との間での相同組換えのために使用される。
【００３３】
（エンハンサー）
本明細書中で使用される場合、この用語は、プロモーター活性を刺激し、そして、そのレベル（すなわち、プロモーターの強さ）を増大させるために挿入された内因性エレメントまたは異種起源のエレメントであり得る、ＤＮＡ配列をいう。
【００３４】
（高収率誘導体）
本明細書中で使用される場合、この用語は、それが由来する親株と比較した場合、ブドウ糖から特定のアミノ酸を高収率を産生する、微生物の株をいう。
【００３５】
（宿主細胞）
本明細書中で使用される場合、用語「宿主細胞」は、用語「微生物」と置換え可能であると意図される。違いが意図される場合は、その違いは明確にされる。
【００３６】
（単離された核酸分子）
本明細書中で使用される場合、この用語は、天然の環境から取り出された、核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを意味することを意図される。例えば、ベクターの中に含まれる組換えＤＮＡ分子は、本発明の目的のために単離されると考えられる。単離されたＤＮＡ分子のさらなる例は、異種の宿主細胞において保持された組換えＤＮＡ分子、または（部分的に、または実質的に）精製された溶液中の組換えＤＮＡ分子を含む。単離されたＲＮＡ分子は、インビボまたはインビトロでの本発明のＤＮＡ分子のＲＮＡ転写物を含む。本発明に従う単離された核酸分子は合成的につくられたこのような分子をさらに含む。
【００３７】
（リジン生合成経路タンパク質）
本明細書中で使用される場合、用語「リジン生合成経路タンパク質」は、アスパラギン酸塩からリジンの合成に直接関与する、これらのペプチド、ポリペプチド、タンパク質、および酵素を含むことを意味する。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）がリジン生合成経路オペロンに関係している場合、ＯＲＦにコードされるアミノ酸配列もまた、含まれる。これらのタンパク質は、宿主細胞の中で天然に存在し、そして宿主細胞の中でリジンの合成に関与する、タンパク質と同一である。あるいは、このようなタンパク質の改変体または変異体も存在し得、例えば、このタンパク質はこのタンパク質の生物学的活性に有意な影響を与えない、改変体または変異体を含む。例えば、天然のタンパク質は、突然変異により、または一つ以上のアミノ酸を導入もしくは置換することにより、好ましくは、保存的アミノ酸置換により、またはこのタンパク質の非必須領域を除去することにより、改変され得る。このような改変は、標準的な技術により容易に行なわれる。あるいは、リジン生合成タンパク質は特定の宿主細胞に対しては、異種であり得る。このようなタンパク質は、同じまたは類似の生合成的な役割を有するタンパク質をコードする遺伝子を有する任意の生物由来であり得る。
【００３８】
（変異誘発）
本明細書中で使用される場合、この用語は、ＤＮＡ中に変異が生じるプロセスをいう。「ランダム」変異誘発を用いた場合、変異の正確な部位は予測不可能であり、微生物のゲノムの任意の場所で起こり、そして変異は、放射線または化学的処置のような因子により生じた物理的な損傷の結果生じる。ｒＤＮＡ変異誘発は、クローン化された目的のＤＮＡを対象とし、そしてこの変異誘発は、ランダムであるか、または部位特異的であり得る。
【００３９】
（変異）
本明細書中で使用される場合、この用語は、目的のヌクレオチド配列中における、一つ以上の塩基対変化、挿入もしくは欠失、またはそれらの組合せをいう。
【００４０】
（作動可能に連結される）
本明細書中で使用される場合、用語「作動可能に連結される」とは、機能的な関係にあるポリヌクレオチドエレメントの連結をいう。核酸が、別の核酸配列と機能的な関係に置かれた場合、核酸は「作動可能に連結」される。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、これがコード配列の転写に影響を与える場合、コード配列に作動可能に連結される。作動可能に連結されるとは、連結しているＤＮＡ配列が代表的には連続であって、必要であれば、連続でありかつ読取り枠中にあるように、２つのタンパク質コード領域を連結することを意味する。しかし、エンハンサーは一般に、プロモーターから数キロベース離れていて、そしてイントロン性（ｉｎｔｒｏｎｉｃ）配列が様々な長さであり得る場合に、機能するのため、いくつかのポリヌクレオチドエレメントは作動可能に連結し得るが連続ではない。
【００４１】
（オペロン）
本明細書中で使用される場合、この用語は、転写複合体（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｌｅｘ）の連続な部分をいい、この中ではポリペプチドをコードする２つ以上のオープンリーディングフレームが、シス作用するプロモーターおよび効率的な転写にとって必要なシス作用する配列、ならびに効率的な転写および翻訳にとって重要な、さらなるシス作用する配列（例えば、ｍＲＮＡ安定性調節領域および転写終結領域）により制御される多シストロン性（ｍｕｌｔｉ−ｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）のメッセンジャーＲＮＡとして、転写される。この用語はまた、一般に、遺伝子の発現および調節（ＤＮＡ中の、構造遺伝子および調節エレメントを含む）の単位を言う。
【００４２】
（親株）
本明細書中で使用される場合、この用語は、本発明の宿主細胞を生み出すように処置のいくつかの形態を受けた、宿主細胞の株をいう。
【００４３】
（ブドウ糖からの収率パーセント）
本明細書中で使用される場合、この用語は、以下の式で定義されたブドウ糖からのアミノ酸の収率をいう：［（産生されたアミノ酸（ｇ）／消費されたブドウ糖（ｇ））＊１００］＝パーセント収率。
【００４４】
（表現型）
本明細書中で使用される場合、この用語は、宿主細胞の遺伝子構成に依存的な観察可能な身体的な特徴をいう。
【００４５】
（プロモーター）
本明細書中で使用される場合、用語「プロモーター」は、当該分野で認識された意味を有し、ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写の開始を提供するＤＮＡ配列を含む遺伝子の部分を示し、従って、コード配列または機能的なＲＮＡの発現を制御し得るＤＮＡ配列をいう。プロモーター配列は一般に、しかし常にではないが、遺伝子の５’非コード領域に見出される。一般に、コード配列はプロモーター配列に対して３’に位置する。転写開始において機能するプロモーター内の配列エレメントはしばしば、コンセンサスヌクレオチド配列により特徴付けられる。プロモーター配列は、近位および、より遠位の上流エレメント（エンハンサー）からなる。本明細書中で使用される場合、用語「内因性プロモーター」は、宿主微生物中に天然に存在するプロモータ−配列であるプロモーター配列をいう。用語「異種プロモーター」とは、その宿主微生物中に天然に存在しないプロモータ−配列であるプロモーター配列をいう。異種として存在するプロモーター配列は、任意の原核生物または真核生物由来であり得る。合成プロモーターは、プロモーター活性を有するが、天然には通常は見出されない、ヌクレオチド配列である。
【００４６】
プロモーターは全体として、天然の遺伝子に由来し得るか、またはハイブリッドプロモーターであり得る。ハイブリッドプロモーターは、天然において見出される異なるプロモーターに由来する異なるエレメントから構成されるか、または合成ＤＮＡセグメントを含みさえする。ハイブリッドプロモーターは、構成的、誘導的または環境応答的であり得る。
【００４７】
有用なプロモーターは構成的および誘導的プロモーターを含む。多くのこのようなプロモーター配列は当該分野で公知である。例えば、米国特許第４，９８０，２８５号；同５，６３１，１５０号；同５，７０７，８２８号；同５，７５９，８２８号；同５，８８８，７８３号；同５，９１９，６７０号およびＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照のこと。他の有用なプロモーターは、ある特定の（または公知の）インデューサー分子に対して構成的でも応答的でもないプロモーターを含む。このようなプロモーターは、発生上の手掛かり（例えば、培養の増殖期）、または環境的な手掛かり（例えばｐＨ、浸透圧（ｏｓｍｏｔｉｃｕｍ）、熱、または細胞密度）に応答するプロモーターを含み得る。
【００４８】
誘導的プロモーターにより転写に影響を与え得る環境条件の例としては、嫌気性条件、上昇した温度、または光の存在が挙げられる。異なったプロモーターが異なった細胞のタイプにおいて、または異なった環境条件に応答して、遺伝子の発現を方向づけ得ることが、当業者に理解される。ほとんどの時間で、ほとんどの細胞のタイプにおいて遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」として言及される。多くの場合において、調節配列の正確な境界は、完全に規定されていないので、異なった長さのＤＮＡフラグメントが同一または類似のプロモーター活性を有し得ることが、さらに認識される。
【００４９】
（相対的増殖）
本明細書中で使用される場合、この用語は、規定した時間および規定した培地において、親株の増殖と子孫株の増殖を直接的に比較することにより、増殖の評価を提供する測定をいう。
【００５０】
（転写因子）
本明細書中で使用される場合、用語「転写因子」は、ＲＮＡポリメラーゼ、および、ＤＮＡと配列特異的な様式で相互作用して転写調節効果を発揮する他のタンパク質をいう。転写因子は、転写阻害タンパク質または転写アクチベータータンパク質であり得る。本発明における状況で、転写因子（または、転写複合体）についての結合部位はしばしば、転写調節エレメントに含まれる。
【００５１】
（転写因子認識部位）
本明細書中で使用される場合、「転写因子認識部位」および「転写因子結合部位」は、頻繁に直接的なタンパク質−ＤＮＡ結合の形態をとる、一つ以上の転写因子の配列特異的相互作用のための部位として同定されるポリヌクレオチド配列また配列モチーフをいう。代表的には、転写因子結合部位は、ＤＮＡフットプリンティング、ゲル移動度シフトアッセイ（ｇｅｌ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｓｈｉｆｔ ａｓｓａｙｓ）などにより同定され得、そして／または公知のコンセンサス配列モチーフに基づいて、もしくは他の当業者に公知の方法により予測され得る。
【００５２】
（転写複合体）
本明細書中で使用される場合、用語「転写単位」または「転写複合体」は、構造遺伝子（一つ以上のエキソン）、シス作用的に連結するプロモーターおよび構造配列の効率的な転写に必要な一つ以上の別のシス作用する配列、この構造配列の適切な転写に必要な遠位の調節エレメント、ならびに効率的な転写または翻訳に重要なさらなるシス配列（例えば、ポリアデニル部位、ｍＲＮＡ安定性調節配列）を含む、ポリヌクレオチド配列をいう。例えば、米国特許第６，０５７，２９９号を参照のこと。
【００５３】
（転写調節エレメント）
本明細書中で使用される場合、用語「転写調節エレメント」は、単独または一つ以上の他のＤＮＡと組合せて転写を活性化するＤＮＡ配列をいう。転写調節エレメントとして、例えば、プロモーター、応答エレメント、ネガティブ調節エレメント、サイレンサーエレメント、遺伝子サプレッサ−および／またはエンハンサーが挙げられる。例えば、米国特許第６，０５７，２９９号を参照のこと。
【００５４】
（Ｂ．微生物および組換えＤＮＡの方法論）
本明細書中で提供されたような本発明は、微生物学および組換えＤＮＡ技術の当業者に公知の、いくつかの方法および技術を使用する。細菌細胞の増殖、単離したＤＮＡ分子の宿主細胞への導入、ならびに単離した核酸分子の単離、クローニング、および塩基配列決定などについての、方法および技術は、このような方法および技術のわずかばかりの例である。これらの方法および技術は、例えば以下に示すような多くの標準的な実験室マニュアルに記載されている：Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９８６）、Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９７２）；Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ、Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）；Ｍ．ＳｉｎｇｅｒおよびＰ．Ｂｅｒｇ、Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｇｅｎｏｍｅｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｏｏｋｓ、Ｍｉｌｌ Ｖａｌｌｅｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９１）；Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ｐ．Ｂ．Ｋａｕｆｍａｎら、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａ（１９９５）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂ．Ｒ．ＧｌｉｃｋおよびＪ．Ｅ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａ（１９９３）；ならびにＰ．Ｆ．Ｓｍｉｔｈ−Ｋｅａｒｙ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｔｈｅ Ｇｕｉｌｆｏｒｄ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ（１９８９）。これらは、本明細書中で全体が参考として援用される。
【００５５】
別段に示されなければ、本明細書中で新たに記載される全てのヌクレオチド配列は、自動ＤＮＡシークエンサー（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．製ｔｈｅ Ｍｏｄｅｌ ３７３）を使用して決定された。それゆえに、当該分野で公知のように、この自動化されたアプローチにより決定された任意のＤＮＡ配列について、本明細書中で決定された任意のヌクレオチド配列は、いくつかの誤差を含み得る。自動化により決定されたヌクレオチド配列は、配列決定されたＤＮＡ分子の現実のヌクレオチド配列に対して、代表的には、少なくとも約９０％同一であり、より代表的には少なくとも約９５％〜少なくとも約９９．９％同一である。現実の配列は、当該分野で周知の手動によるＤＮＡ配列決定方法を含む別のアプローチにより、より正確に決定され得る。
【００５６】
特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１７、配列番号１８および配列番号２０、またはこれらの相補的な配列からなる群より選択された配列に少なくとも、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一な配列の核酸を含む。
【００５７】
核酸の配列が、参照したヌクレオチド配列に対して少なくとも、例えば、９５％同一である、核酸を含むヌクレオチドにより、この核酸配列が、参照した核酸配列の各１００ヌクレオチドあたり５つのミスマッチまでを含み得るをことを除いては、参照配列に同一であることが意図される。換言すれば、核酸の配列が参照する核酸配列に対して、少なくとも９５％同一である核酸を得るために、参照配列中での５％までヌクレオチドが、欠失もしくは別のヌクレオチドで置換され得るか、または参照した配列の中の、全ヌクレオチドの５％までの数のヌクレオチドが、参照配列に挿入され得る。参照（問合せ）配列は、以下に記載するように、配列番号１７、配列番号１８、もしくは配列番号２０に示された全ヌクレオチド配列の任意の１つの配列、またはこれらの配列中の任意のものの任意のフラグメントである。
【００５８】
実際的な問題として、任意の特定の核酸配列が、例えば、配列番号１７、配列番号１８、もしくは配列番号２０、またはこれらに相補的な配列からなるヌクレオチド配列に対して、少なくとも、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である否かは、従来どおり、ＯＭＩＧＡ（登録商標）のＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用のＶｅｒｓｉｏｎ２．０（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ、Ｌｔｄ．（Ｏｘｆｏｒｄ、Ｕ．Ｋ．）で入手可能）のような配列解析コンピュータプログラムを使用することにより決定され得る。ＯＭＩＧＡは、オープンギャップペナルティーが１０、そして伸長ギャップペナルティが５．０である初期設定値で、遅い完全な（ｓｌｏｗ ｆｕｌｌ）ダイナミックプログラミングアライメント法を用いるＣＬＵＳＴＡＬ Ｗアライメントアルゴリズムを、２つのヌクレオチド配列間における最良のアライメントを求めるために使用する。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗまたは任意の他の配列アライメントプログラムを使用して、特定の配列が、例えば、本発明に関する参照配列に対して９５％同一であるか否かを決定する場合、当然、参照配列中のヌクレオチドの総数の５％までのギャップ、ミスマッチ、または挿入が認められるように、参照配列の全長に亘って同一性パーセントを計算するように、パラメータを設定する。当該分野で公知である他の配列解析プログラムが、本発明の実施において使用され得る。
【００５９】
本発明のこの実施形態は、核酸を含むポリヌクレオチドに関し、この核酸の配列は、これらが機能的な活性を有しているか否かは関係がなく、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号２０、またはこれらの相補配列の核酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。これは、たとえ特定のポリヌクレオチドが機能的活性を有していない場合でさえ、当業者は、例えば、ハイブリダイゼーションプローブ、Ｓ１ヌクレアーゼマッピングプローブ、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーをとして、この核酸分子の使用の方法を知っているからである。
【００６０】
しかし、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号２０、あるいはこれらの相補配列の核酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である、核酸配列であって、実際にＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種において、での機能活性を有する核酸配列を含有する、ポリヌクレオチドが好ましい。
【００６１】
例えば、ポリペプチドの参照核酸配列に対して少なくとも、９５％「同一」なアミノ酸配列を有するポリペプチドにより、以下のことが意図される：請求されるポリペプチド配列が、そのポリペプチドの参照アミノ酸配列の各１００アミノ酸当たり５つまでのアミノ酸の改変を含み得ることを除いては、特許請求されるポリペプチドのアミノ酸配列が参照配列と同一である。換言すると、参照配列に対して少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、参照配列内でアミノ酸残基５％までが欠失または別のアミノ酸と置換され得るか、あるいは、参照配列中の全アミノ酸残基における５％までの複数のアミノ酸が、参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの改変は、参照アミノ酸配列のアミノ末端位置またはカルボキシ末端位置あるいはこれらの末端位置間の任意の位置で起こり得、参照配列中の残基間で個々に、または参照配列中の一つ以上の連続した群のいずれかに散在する。
【００６２】
実際的な問題として、任意の特定ポリペプチドが、例えば、配列番号２で示されたアミノ酸配列または核酸によりコードされたアミノ酸配列に対して、少なくとも、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるか否かは、Ｂｅｓｔｆｉｔ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標）， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ５３７１１）のような公知のコンピュータプログラムを使用して慣用的に決定され得る。Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列アライメントプログラムを使用して、特定の配列が、例えば、本発明に従った参照配列に対して９５％同一か否かを決定する場合、当然、同一性パーセントを、参照アミノ酸配列の全長に亘って計算し、参照配列のアミノ酸残基の総数の５％までの相同性におけるギャップが認められるように、パラメータを設定する。
【００６３】
特定の実施形態において、参照配列（問合せ配列、本発明の配列）と対象配列（ｓｕｂｊｅｃｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）との間の同一性はまた、グローバル配列アライメントと呼ばれ、Ｂｒｕｔｌａｇらのアルゴリズム（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０））に基づいたＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを用いて、決定される。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸アライメントで使用される好ましいパラメータは、以下である：マトリックス＝ＰＡＭ ０、ｋ−タプル（ｋ−ｔｕｐｌｅ）＝２、ミスマッチペナルティ（Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ）＝ｌ、結合ペナルティ（Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ）＝２０、乱雑化グループ長（Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ）＝０、カットオフスコア＝ｌ、ウインドウサイズ＝配列長、ギャップペナルティ＝５、ギャップサイズペナルティ＝０．０５、ウインドウサイズ＝５００あるいは対象アミノ酸配列の長さのうち、どちらか短い方。
【００６４】
この実施形態に従って、対象配列が、内部欠失に起因したわけではなく、Ｎ末端またはＣ末端の欠失に起因して、問合せ配列より短い場合、ＦＡＳＴＤＢプログラムは、グローバルの同一性パーセントを計算する際に、対象配列のＮおよびＣ末端が打ち切られることを考慮しないという事実を考慮して、手動による修正が結果に対して行われる。ＮおよびＣ末端が打ち切られた対象配列について、問合せ配列に関して、同一性パーセントは、対応する対象残基と一致／アライメントされていない、対象配列のＮおよびＣ末端である問合せ配列の残基数を、問合せ配列の全塩基のパーセントとして、計算することにより修正される。残基が一致／アライメントしたか否かの決定は、ＦＡＳＴＤＢ配列アライメントの結果によって決定される。次いで、このパーセントを、特定のパラメータを使用して上記のＦＡＳＴＤＢプログラムにより計算された、同一性パーセントから差し引くことにより、最終的な同一性パーセントの値に帰着する。この最終的な同一性パーセント値が、この実施形態の目的のために使用されるものである。問合せ配列と一致／アライメントがなされていない、対象配列のＮおよびＣ末端に対する残基のみが、同一性パーセント値を手動で調節する目的のために考慮される。すなわち、問合せ残基のみが、対象配列の最も遠位にあるＮ末端およびＣ末端残基の外側に位置する。例えば、９０アミノ酸残基の対象配列は１００残基の問合せ配列とアライメントして、同一性パーセントを決定する。欠失が対象配列のＮ末端において起こり、そして、それゆえにＦＡＳＴＤＢアライメントは、Ｎ末端における最初の１０残基の一致／アライメントを示さない。１０つの不対残基は、この配列の１０％を表す（Ｎ末端およびＣ末端の不一致である残基数／問合せ配列における残基の総数）。従って、１０％が、ＦＡＳＴＤＢプログラムにより計算された同一性パーセント値から差し引かれる。仮に残りの９０残基が完全に一致していた場合、最終的な同一性パーセントは９０％となる。別の実施例において、９０残基の対象配列は、１００残基の問合せ配列と比較される。この時、欠失が内部欠失であるので、問合せ配列と一致／アライメントをしない対象配列のＮまたはＣ末端において残基は存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢにより計算された同一性パーセントは、手動により修正されない。今一度、これらは問合せ配列と一致／アライメントしていない対象配列のＮおよびＣ末端の外側に位置する残基のみが、ＦＡＳＴＤＢアライメントにおいて示されているように、手動で修正される。他の手動による修正は、この実施形態の目的のためになされない。
【００６５】
（Ｃ．本発明の方法およびプロセス）
本発明の種々の実施形態は、アミノ酸の産生を増加させるための方法、およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種宿主細胞由来のアミノ酸の産生のためのプロセスを提供する。特に、本発明の方法およびプロセスの好ましいＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種としては、当該分野で公知のＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、ならびに他のＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ種およびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａ種が挙げられる。
【００６６】
当業者によって理解されるように、用語「Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種」は、以前に、文献中で「Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ種」として同定されたそれらの生物（例えば、現在ではＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に種別変更されたＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍおよびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）を含む（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．４１：２５５（１９８１））。
【００６７】
本明細書に記載される方法およびプロセスによって具体化されるアミノ酸生合成経路遺伝子は、Ｌ−グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−チロシン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、およびＬ−バリンの生合成についての遺伝子を含む。特に好ましい実施形態は、Ｌ−リジン（Ｓａｈｍら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８２：２５−３９（１９９６））、Ｌ−トレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−トリプトファン、およびＬ−バリンについての生合成経路遺伝子に関する。
【００６８】
例示の目的で、リジン生合成についてのアミノ酸経路は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種におけるアミノ酸生産の当業者に周知である。Ｌ−アスパラギンのＬ−リジンへの変換のために重要である酵素をコードする遺伝子は、ａｓｋ遺伝子、ａｓｄ遺伝子、ｄａｐＡ遺伝子、ｄａｐＢ遺伝子、ｄｄｈ遺伝子およびｌｙｓＡ遺伝子を含む（図１）。従って、本発明は、本明細書中において、例示的な目的のみのために、Ｌ−リジン生合成経路遺伝子を利用する特定の実施形態を提供する。他のアミノ酸の合成についての生合成経路遺伝子の使用に関する他の実施形態はまた、本明細書中に記載される本発明によって含まれる。
【００６９】
アミノ酸の産生を増加させるための方法および本発明のアミノ酸の産生のためのプロセスは両方とも、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種宿主細胞への、単離された核酸分子の形質転換を必要とする工程を利用する。当業者に公知のように、単離された核酸分子の宿主細胞への形質転換は、エレクトロポレーション、形質導入または他の方法によってもたらされ得る。これらの方法は、本明細書において参考および援用されかつ組み込まれる多数の標準的な実験室取り扱い説明書中に記載される。
【００７０】
アミノ酸の産生を増加させるための方法および本発明のアミノ酸の産生のためのプロセスは両方とも、少なくとも１つのアミノ酸生合成経路遺伝子の増幅を必要とする工程を利用する。当業者に対して公知のように、用語「増幅」は、アミノ酸生合成経路の遺伝子の数を、当該分野で公知の任意の手段によって増加させることを意味する。特に増幅の好ましい手段としては、以下が挙げられる：（１）挿入による（例えば、相同組換えによる）、生合成経路の遺伝子のコピーを含む単離された核酸分子の宿主細胞の染色体への付加、および（２）自己複製する染色体外ベクター（例えばプラスミド）による、生合成経路の遺伝子のコピーを含む単離された核酸分子の宿主細胞への付加。
【００７１】
アミノ酸の産生を増加させる本発明の別の方法は、少なくとも１つのアミノ酸生合成経路遺伝子の発現を増加させる工程を包含する。発現を増加させる好ましい方法は、異種プロモーター、調節されたプロモーター、調節されていないプロモーター、およびこれらの組み合わせを使用する工程を包含する。
【００７２】
単離された核酸分子を宿主細胞の染色体へ挿入する方法は、当業者に公知である。例えば、単離された核酸分子のＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種の染色体への挿入は、Ｊｏｂｌｉｎｇ，Ｍ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １８（１７）：５３１５−５３１６（１９９０提出）によって記載されるｐＫ１８４プラスミドを利用して行われ得る。これらのベクターはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種の複製の起点を欠失し、かつカナマイシン（ｋａｎ）のような選択マーカーを含むので、このベクターが相同組換えによって宿主細胞染色体へ挿入される場合、細胞は選択下で成長することのみ可能である。
【００７３】
代替の実施形態において、本発明はまた、アミノ酸産生を増加させるための方法およびアミノ酸の産生のためのプロセスを提供し、ここで生合成経路遺伝子の増幅は、アミノ酸生合成経路遺伝子をコードする単離された核酸分子を含む自己複製する染色体外ベクター（例えば、プラスミド）の宿主細胞への導入を通じて達成される。これらの実施形態について適切なプラスミドは、ｐＳＲ１、およびｐＳＲ１の他の誘導体を含む（Ａｒｃｈｅｒ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３９：１７５３−１７５９（１９９３））。
【００７４】
アミノ酸の産生を増加させるための方法に関する本発明の種々の実施形態について、アミノ酸（例えば、Ｌ−リジン）の増加された産生をスクリーニングする工程は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種宿主株によって培養物中に産生されたＬ−リジンの量を、アミノ酸生合成遺伝子が増幅されるＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種の形質転換された宿主細胞株の量と直接的に比較することによって決定され得る。選択されたアミノ酸の産生のレベルは、ブドウ糖から生成されるパーセントを計算するための以下の式によって簡便に決定され得る：［（ｇアミノ酸／Ｌ）／（ｇ消費されたブドウ糖／Ｌ）］＊１００。
【００７５】
１つの実施形態において、本発明は、以下の工程を包含するアミノ酸の産生を増加させるための方法を提供する：（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子で、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種宿主細胞を形質転換する工程；（ｂ）上記宿主細胞の染色体中の、少なくとも１つの上記アミノ酸についての生合成経路遺伝子の数を増幅する工程；（ｃ）形質転換された宿主細胞を選択する工程；および（ｄ）上記形質転換された宿主細胞由来のアミノ酸の、上記宿主細胞と比較して増加された生産についてスクリーニングする工程。
【００７６】
特に好ましい実施形態において、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含みかつさらに以下の少なくとも１つを含む単離されたポリヌクレオチド分子で、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種宿主細胞を形質転換する工程を包含するアミノ酸の産生の増加させるための方法を提供する：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ａｓｄアミノ酸配列をコードする核酸分子；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ｄａｐＡアミノ酸配列をコードする核酸分子；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ｄａｐＢアミノ酸配列をコードする核酸分子；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ｄｄｈアミノ酸配列をコードする核酸分子；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路‘ｌｙｓＡアミノ酸配列をコードする核酸分子；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ｌｙｓＡアミノ酸配列をコードする核酸分子；およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする核酸分子。
【００７７】
本方法の別の特定の実施形態において、単離されたポリヌクレオチド分子はさらに、以下の少なくとも１つを含む：配列番号４のａｓｄアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号６のｄａｐＡアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号８のｄａｐＢアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号１０のｄｄｈアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号２１の‘ｌｙｓＡアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号１４のｌｙｓＡアミノ酸配列をコードする核酸分子；および配列番号１６のＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする核酸分子。
【００７８】
本方法の別の特定の実施形態において、単離されたポリヌクレオチド分子はさらに、以下を含む：配列番号４のａｓｄアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号６のｄａｐＡアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号８のｄａｐＢアミノ酸配列をコードする核酸分子；および配列番号１６のＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする核酸分子。
【００７９】
本方法の別の特定の実施形態において、単離されたポリヌクレオチド分子はさらに、以下を含む：配列番号４のａｓｄアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号６のｄａｐＡアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号８のｄａｐＢアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号１０のｄｄｈアミノ酸配列をコードする核酸分子；および配列番号１６のＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする核酸分子。
【００８０】
本方法の別の特定の実施形態において、単離されたポリヌクレオチド分子はさらに、以下を含む：配列番号４のａｓｄアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号６のｄａｐＡアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号８のｄａｐＢアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号１０のｄｄｈアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号２１の‘ｌｙｓＡアミノ酸配列をコードする核酸分子；および配列番号１６のＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする核酸分子。
【００８１】
本方法の別の特定の実施形態において、ポリヌクレオチド分子はさらに、以下を含む：配列番号４のａｓｄアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号６のｄａｐＡアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号８のｄａｐＢアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号１０のｄｄｈアミノ酸配列をコードする核酸分子；配列番号１４のｌｙｓＡアミノ酸配列をコードする核酸配列；および配列番号１６のＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする核酸分子。
【００８２】
本方法の別の実施形態において、この方法はさらに、培地中の上記形質転換された宿主細胞を増殖させる工程；および上記形質転換された宿主細胞によって産生されたアミノ酸を精製する工程を包含する。
【００８３】
本発明の別の目的は、以下を含むポリヌクレオチド分子を含む単離されたポリヌクレオチドを提供することである：配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；ならびに、ａｓｄポリペプチドをコードする核酸分子、ｄａｐＡポリペプチドをコードする核酸分子、ｄａｐＢポリペプチドをコードする核酸分子、ｄｄｈポリペプチドをコードする核酸分子、‘ｌｙｓＡポリペプチドをコードする核酸分子、ｌｙｓＡポリペプチドをコードする核酸分子、ＯＲＦ２ポリペプチドをコードする核酸分子からなる群から選択される少なくとも１つのさらなるＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路遺伝子。好ましい実施形態において、上記ａｓｄポリペプチドは配列番号４；上記ｄａｐＡポリペプチドは配列番号６；上記ｄａｐＢポリペプチドは配列番号８；上記ｄｄｈポリペプチドは配列番号１０；上記‘ｌｙｓＡポリペプチドは配列番号２１；上記ｌｙｓＡポリペプチドは配列番号１４；および上記ＯＲＦ２ポリペプチドは配列番号１６である。
【００８４】
本発明の別の目的は、以下を含むポリヌクレオチド分子を含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供することである：配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；配列番号４のａｓｄアミノ酸配列をコードする核酸分子、配列番号６のｄａｐＡアミノ酸配列をコードする核酸分子、配列番号８のｄａｐＢアミノ酸配列をコードする核酸分子、および配列番号１６のＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする核酸分子。
【００８５】
本発明の別の目的は、以下を含むポリヌクレオチド分子を含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供することである：配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；配列番号４のａｓｄアミノ酸配列をコードする核酸分子、配列番号６のｄａｐＡアミノ酸配列をコードする核酸分子、配列番号８のｄａｐＢアミノ酸配列をコードする核酸分子、配列番号１０のｄｄｈアミノ酸配列をコードする核酸分子、および配列番号１６のＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする核酸分子。
【００８６】
本発明の別の目的は、以下を含むポリヌクレオチド分子を含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供することである：配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；配列番号４のａｓｄアミノ酸配列をコードする核酸分子、配列番号６のｄａｐＡアミノ酸配列をコードする核酸分子、配列番号８のｄａｐＢアミノ酸配列をコードする核酸分子、配列番号１０のｄｄｈアミノ酸配列をコードする核酸分子、配列番号２１の‘ｌｙｓＡアミノ酸配列をコードする核酸配列、および配列番号１６のＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする核酸分子。
【００８７】
本発明の別の目的は、以下を含むポリヌクレオチド分子を含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供することである：配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；配列番号４のａｓｄアミノ酸配列をコードする核酸分子、配列番号６のｄａｐＡアミノ酸配列をコードする核酸分子、配列番号８のｄａｐＢアミノ酸配列をコードする核酸分子、配列番号１０のｄｄｈアミノ酸配列をコードする核酸分子、配列番号１４のｌｙｓＡアミノ酸配列をコードする核酸配列、および配列番号１６のＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする核酸分子。
【００８８】
本発明のさらなる目的は、ｐＫ１８４−ＫＤＡＢを含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供することである。本発明のさらなる目的は、ｐＫ１８４−ＫＤＡＢＨ’Ｌを含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供することである。本発明のさらなる目的は、ｐＤ１１−ＫＤＡＢＨ’Ｌを含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供することである。本発明のさらなる目的は、ｐＤ２−ＫＤＡＢＨＬを含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供することである。
【００８９】
本発明のさらなる目的は、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子を含みかつさらに以下からなる群から選択される少なくとも１つのさらなるＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路遺伝子を含むベクターを提供することである：ａｓｄポリペプチドをコードする核酸分子；ｄａｐＡポリペプチドをコードする核酸分子；ｄａｐＢポリペプチドをコードする核酸分子；ｄｄｈポリペプチドをコードする核酸分子；‘ｌｙｓＡポリペプチドをコードする核酸分子；ｌｙｓＡポリペプチドをコードする核酸分子；およびＯＲＦ２ポリペプチドをコードする核酸分子。
【００９０】
さらなる目的は、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子含みかつさらに以下からなる群から選択される少なくとも１つのさらなるＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路遺伝子を含むベクターを含む宿主細胞を提供することである：ａｓｄポリペプチドをコードする核酸分子；ｄａｐＡポリペプチドをコードする核酸分子；ｄａｐＢポリペプチドをコードする核酸分子；ｄｄｈポリペプチドをコードする核酸分子；‘ｌｙｓＡポリペプチドをコードする核酸分子；ｌｙｓＡポリペプチドをコードする核酸分子；およびＯＲＦ２ポリペプチドをコードする核酸分子。
【００９１】
さらなる目的は、宿主細胞を提供することであり、ここでこの宿主細胞は、以下からなる群から選択されるＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍである：Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２１８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２１９、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２２０、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２２１、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２２２、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２３４およびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２３５。別の実施形態において、宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５αＭＣＲ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２２８である。別の実施形態において、宿主細胞は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２３６およびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＮＲＲＬ−Ｂ３０２３７からなる群から選択されるＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである。
【００９２】
本発明はアミノ酸の産生のためのプロセスを提供する。１つの実施形態において、本発明は、以下の工程を包含するアミノ酸を生産するためのプロセスを提供する：（ａ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種宿主細胞を単離された核酸分子で形質転換する工程；（ｂ）上記核酸に対する少なくとも１つの生合成経路遺伝子の染色体コピーの数を増幅する工程；（ｃ）形質転換された宿主細胞を選択する工程；（ｄ）培地中で上記形質転換された細胞を増殖させる工程；および（ｅ）上記アミノ残を精製する工程。
【００９３】
本発明はまた、配列番号１９のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドに関する。本発明の１つの実施形態において、このポリペプチドは、配列番号１９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。本発明はまた、配列番号１９のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子に関する。１つの実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１８の配列を有する核酸を含む。
【００９４】
本発明はまた、配列番号１９のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含むベクターに関する。１つの実施形態において、本発明は、配列番号１９のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするベクターを含む宿主細胞に関する。１つの実施形態において、この宿主細胞は、ＮＲＲＬ Ｂ３０３６０である。
【００９５】
本発明はまた、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種宿主細胞を、配列番号１９のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子で形質転換する工程、および形質転換された宿主細胞を選択する工程を包含する方法に関する。１つの実施形態において、本方法はさらに、増加されたアミノ酸産物をスクリーニングする工程を包含する。好ましい実施形態において、スクリーニングされるアミノ酸は、リジンである。１つの実施形態において、ポリヌクレオチド分子は、上記宿主細胞の染色体に結合され、それにより、上記宿主細胞の染色体中の上記アミノ酸生合成経路遺伝子の総数を増加させる。
【００９６】
別の実施形態において、ポリヌクレオチド分子はさらに、以下の少なくとも１つを含む：（ａ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ａｓｋアミノ酸配列をコードする核酸分子；（ｂ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ａｓｄアミノ酸配列をコードする核酸分子；（ｃ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ｄａｐＡアミノ酸配列をコードする核酸分子；（ｄ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ｄａｐＢアミノ酸配列をコードする核酸分子；（ｅ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ｄｄｈアミノ酸配列をコードする核酸分子；（ｆ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路‘ｌｙｓＡアミノ酸配列をコードする核酸分子；（ｇ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ｌｙｓＡアミノ酸配列をコードする核酸分子；および（ｈ）配列番号１６を有するＯＲＦ２ポリヌクレオチドをコードする核酸分子。この実施形態において、本方法はさらに、増加されたアミノ酸産物をスクリーニングする工程を包含する。別の実施形態において、スクリーニングされるアミノ酸は、リジンである。
【００９７】
本方法の別の実施形態において、ポリヌクレオチド分子は、さらに以下を含む：（ａ）配列番号２を有するａｓｋアミノ酸配列をコードする核酸分子；（ｂ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ａｓｄアミノ酸配列をコードする核酸分子；（ｃ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ｄａｐＢアミノ酸配列をコードする核酸分子；（ｄ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ｄｄｈアミノ酸配列をコードする核酸分子；および（ｅ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ｌｙｓＡアミノ酸配列をコードする核酸分子。この方法の１つの実施形態において、本方法はさらに、増加されたアミノ酸産物をスクリーニングする工程を包含する。
【００９８】
本発明はまた、配列番号２１のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドに関する。１つの実施形態において、このポリペプチドは、配列番号２１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。本発明はまた、配列番号２１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを含む。本発明はさらに、配列番号２０の配列を有する核酸を含むポリヌクレオチド分子を含む。１つの実施形態において、本発明は、配列番号２１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含むベクターを含む。本発明は、さらに、配列番号２１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含むベクターを含む宿主細胞を含む。
【００９９】
１つの実施形態において、本発明は、ＮＲＲＬ Ｂ３０２１８、ＮＲＲＬ Ｂ３０２２０およびＮＲＲＬ Ｂ３０２２２からなる群より選択される宿主細胞を含む。
【０１００】
本発明は、さらに配列番号２１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子でＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種宿主細胞を形質転換する工程、および形質転換された宿主細胞を選択する工程を包含する方法に関する。この方法はさらに、増加されたアミノ酸産物、特に、リジン産物をスクリーニングする工程を包含する。１つの実施形態において、ポリヌクレオチド分子は、上記宿主細胞の染色体に結合され、それにより、上記宿主細胞の染色体中の上記アミノ酸生合成経路遺伝子の総数を増加させる。１つの実施形態において、本方法はさらに、以下の少なくとも１つを含むポリヌクレオチド分子を含む：（ａ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ａｓｋアミノ酸配列をコードする核酸分子；（ｂ）配列番号２を有するＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ａｓｋアミノ酸配列をコードする核酸分子；（ｃ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ａｓｄアミノ酸配列をコードする核酸分子；（ｄ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ｄａｐＡアミノ酸配列をコードする核酸分子；（ｅ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ｄａｐＢアミノ酸配列をコードする核酸分子；（ｆ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ｄｄｈアミノ酸配列をコードする核酸分子；（ｇ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする核酸分子；および（ｈ）短縮型Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする核酸分子。１つの実施形態において、本方法はさらに、増加されたアミノ酸産物をスクリーニングする工程を包含する。別の実施形態において、スクリーニングされるアミノ酸は、リジンである。
【０１０１】
本発明の別の実施形態はまた、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子に関し、ここで、このポリヌクレオチド分子はさらに、配列番号１７を有するプロモーター配列を含む。１つの実施形態において、このプロモーター配列は、配列番号１７に対して少なくとも９５％同一な配列を有する。１つの実施形態において、配列番号１７に対して少なくとも９５％同一な配列を有するこのプロモーター配列は、ＬｙｓＡ遺伝子に作動可能に直接連結される。本発明の別の実施形態において、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子を含むベクターが存在し、ここで、このポリヌクレオチド分子はさらに、プロモーター配列を含み、ここで、このプロモーター配列は、配列番号１７に対して少なくとも９５％同一な配列を有する。本発明の別の局面において、ベクター（配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子を含む）を含む宿主細胞が存在し、ここで、このポリヌクレオチド分子はさらに、配列番号１７に対して少なくとも９５％同一な配列を有するプロモーター配列を含む。１つの実施形態において、宿主細胞は、ＮＲＲＬ Ｂ３０３５９である。
【０１０２】
本発明はまた、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種の宿主細胞を配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を用いて形質転換する工程、そして形質転換された宿主細胞を選択する工程を包含する方法に関し、ここで、このポリヌクレオチド分子はさらに、配列番号１７に対して少なくとも９５％同一な配列を有するプロモーターを含む。１つの実施形態において、本方法はさらに、増加したアミノ酸産物をスクリーニングする工程を包含する。別の実施形態において、スクリーニングされたアミノ酸は、リジンである。本方法の別の実施形態において、ポリヌクレオチド分子は、この宿主細胞の染色体に組込まれ、それによってこの宿主細胞の染色体においてアミノ酸生合成経路の遺伝子の総数を増加する。本方法の別の実施形態において、このポリヌクレオチド分子はさらに、以下の少なくとも１つを含む：（ａ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ａｓｄアミノ酸配列をコードする核酸分子；（ｂ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ｄａｐＡアミノ酸配列をコードする核酸分子；（ｃ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ｄａｐＢアミノ酸配列をコードする核酸分子；（ｄ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ｄｄｈアミノ酸配列をコードする核酸分子；（ｅ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする核酸分子；（ｆ）短縮型Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする核酸分子；（ｇ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ｌｙｓＡアミノ酸配列をコードする核酸分子；および、（ｈ）短縮型Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ｌｙｓＡアミノ酸配列をコードする核酸分子。この実施形態において、本方法はさらに、増加したアミノ酸産物；特に、リジン産物についてスクリーニングする工程を包含する。
【０１０３】
本方法の異なる実施形態において、ポリヌクレオチド分子は、以下を含む：（ａ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ａｓｄアミノ酸配列をコードする核酸分子；（ｂ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ｄａｐＡアミノ酸配列をコードする核酸分子；（ｃ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ｄａｐＢアミノ酸配列をコードする核酸分子；（ｄ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ｄｄｈアミノ酸配列をコードする核酸分子；（ｅ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ＯＲＦ２アミノ酸配列をコードする核酸分子；および（ｆ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種リジン経路ｌｙｓＡアミノ酸配列をコードする核酸分子。この実施形態において、本方法はさらに、増加したアミノ酸産物をスクリーニングする工程を包含する。好ましい実施形態において、このアミノ酸は、リジンである。
【０１０４】
当業者に公知の種々の培地を用いて、アミノ酸産生のための細胞の増殖を補助し得る。適切な炭素源の具体的な例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：炭水化物（例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、デンプン水解物、セルロース水解物、および糖蜜）；有機酸（例えば、酢酸、プロピオン酸、ギ酸、リンゴ酸、クエン酸、およびフマル酸）；ならびに、アルコール（例えば、グリセロール）。適切な窒素源の具体的な例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アンモニア（アンモニアガスおよびアンモニア水を含む）；無機酸のアンモニア塩または有機酸のアンモニア塩（例えば、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウムおよび酢酸アンモニウム）；ならびに他の窒素含有供給源（食肉抽出物、ペプトン、コーンスティープリカー、カゼイン水解物、大豆粕水解物、尿素および酵母抽出物を含む）。
【０１０５】
アミノ酸の産生に関する（ｄｒａｗｎ ｔｏ）本発明のプロセスにおいて利用され得る種々の発酵技術が、当該分野で公知である。一般に、アミノ酸は、発酵プロセス（例えば、回分型または流加（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）型）において、本発明から商業的に産生され得る。回分型発酵において、全ての栄養素は、発酵開始時に添加される。流加型発酵または長時間（ｅｘｔｅｎｄｅｄ）流加型発酵において、発酵の最初からかまたは培養物が熟成（ｃｅｒｔａｉｎ ａｇｅ）に達した後にか、あるいは供給される栄養素が培養液から消耗された場合に、１つかまたは多数の栄養素が培養液中へ持続的に供給される。流加型発酵である長時間回分（ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｂａｔｃｈ）の改変型は、反復流加発酵または満杯時汲み出し（ｆｉｌｌ−ａｎｄ−ｄｒａｗ）発酵であって、ここで、例えば、発酵槽が満杯の場合、発酵槽の内容物の一部はそのうち除去されるが、栄養素の供給は続けられる。この方法において、発酵は、長期間延長され得る。
【０１０６】
別の型の発酵（持続的発酵またはケモスタット培養）では、完全培地の持続的供給を用いるが、培養液は、発酵槽におけるブロスの容量がおよそ一定であるように、持続的または半持続的に廃棄され得る。持続的発酵は、原則として無限に継続され得る。
【０１０７】
回分発酵において、生物体は、培地において必須栄養素のうちの１つが消耗されてしまうまでか、または、発酵条件が好ましくなくなる（例えば、ｐＨが微生物の増殖に対して阻害性の値まで低下する）まで増殖する。通常、流加発酵において、（例えば、ｐＨの制御を用いることによって）好ましい増殖条件を継続するように措置がなされ、そして培養物へこれらの栄養素を供給することによって、１つ以上の必須栄養素の消耗が妨げられる。微生物は、栄養素の供給速度によって決定づけられる増殖速度で成長し続ける。一般に、単一の栄養素（頻繁には、炭素源）が、増殖を制限するようになる。同じ原理が持続的発酵に適用され、通常、培地に供給される１つの栄養素が限定され、他の栄養素全ては過剰にある。この限定される栄養素は、非常に低い（しばしば、測定不可能な低い）濃度で培養液中に存在する。種々の型の栄養素の限定が、利用され得る。炭素源の限定が、最も頻繁に用いられる。他の例としては、窒素源による限定、酸素による限定、特定の栄養素（例えば、ビタミンまたはアミノ酸（微生物がこのような化合物に対する栄養素要求株である場合））による限定、硫黄による限定、およびリンによる限定が挙げられる。
【０１０８】
アミノ酸は、当該分野で公知の任意の方法によって回収され得る。具体的な手順は、以下において提供される：Ｖａｎ Ｗａｌｓｅｍ，Ｈ．Ｊ．＆Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｍ．Ｃ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５９：１２７−１３２（１９９７）、および米国特許第３，５６５，９５１号、これらの両方は、本明細書において参考として援用される。
【０１０９】
本明細書において記載される本発明は、少なくとも１つのＬ−リジンアミノ酸生合成遺伝子を含む単離された核酸分子を提供する。他に示されない限り、本明細書において記載される全てのヌクレオチド配列は、自動化ＤＮＡシーケンサー（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．からのＭｏｄｅｌ ３７３）を用いて決定され、そして本明細書において記載されるＤＮＡ分子によってコードされるポリペプチドの全てのアミノ酸配列は、関連ＤＮＡ配列の翻訳によって予測された。従って、当該分野で公知であるように、この自動化アプローチによって決定された任意のＤＮＡ配列について、本明細書において決定された任意のヌクレオチド配列は、いくつかのエラーを含み得る。自動化によって決定されたヌクレオチド配列は、代表的には、配列決定されたＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列に対して少なくとも約９０％同一、より代表的には、少なくとも約９５％〜少なくとも約９９．９％同一である。実際の配列は、当該分野で周知の手動のＤＮＡ配列決定方法を含む他のアプローチによってより正確に決定され得る。
【０１１０】
当該分野で公知であるように、実際の配列と比較して決定されたヌクレオチド配列における単一の挿入または欠失は、ヌクレオチド配列の翻訳においてフレームシフトを引き起こし、その結果、決定されたヌクレオチド配列によってコードされる推定アミノ酸配列が、このような挿入または欠失の箇所を起点として、配列決定されたＤＮＡ分子によって正確にコードされるアミノ酸配列とは完全に異なる。
【０１１１】
本発明は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの少なくとも１つのＬ−リジンアミノ酸生合成経路遺伝子を含むいくつかの単離された核酸分子を提供する。より詳細には、本発明は、以下の単離された核酸分子を提供する：ＡＴＣＣ ２１５２９株由来のａｓｋ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）；ＡＴＣＣ ２１５２９株由来のａｓｄ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号３）；ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４株由来のｄａｐＡ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号５）；ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４株由来のｄａｐＢ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号７）；ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４株由来のｄｄｈ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号９）、およびＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４株由来のＯＲＦ２遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１５）。さらに、プラスミドｐＲＳ６由来のｌｙｓＡ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１３）がまた、本明細書において提供される（Ｍａｒｃｅｌ，Ｔ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ４：１８１９−１８３０（１９９０））。
【０１１２】
アミノ酸が一つ以上のコドン（コード縮重）によって核酸レベルでコードされることは、当該分野で公知である。選り抜きのコドンが特定のアミノ酸配列（タンパク質、ポリペプチドなど）の発現に影響し得ることはまた、当該分野で公知である。従って、本発明はさらに、配列番号２のａｓｋアミノ酸配列をコードする核酸分子に関し、ここで、この核酸分子は、特定のアミノ酸をコードすることが公知である任意のコドンを含む。本発明はまたさらに、タンパク質またはポリペプチドの発現が最適となるように代替コドンを含む核酸配列（配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１８、および配列番号２０）に関する。
【０１１３】
上記の単離された核酸分子に加えて、本発明はまた、１つより多いＬ−リジンＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ生合成遺伝子を含む単離された核酸分子を提供する。このような単離された核酸分子は、「カセット」構築物といわれる。これらのカセット構築物は、専門家のために、Ｌ−リジン生合成遺伝子の遺伝子増幅を達成するために要求される組換えＤＮＡ操作の数を簡略化する。
【０１１４】
カセット構築物に関する１つの実施形態において、本発明は、以下を含む単離された核酸分子を提供する：（ａ）配列番号２のＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ Ｌ−リジン経路ａｓｋアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；ならびに（ｂ）以下からなる群より選択される少なくとも１つのさらなるＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種Ｌ−リジン経路遺伝子：（１）ａｓｄポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；（２）ｄａｐＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；（３）ｄａｐＢポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；（４）ｄｄｈポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；（５）‘ｌｙｓＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および（６）ＯＲＦ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【０１１５】
本発明の単離された核酸分子は、好ましくは、適切な核酸ベクターにおいて、増殖および保持される。本発明の単離された核酸分子の単離およびクローニングのための方法は、組換えＤＮＡ技術の当業者に周知である。原核生物宿主および真核生物宿主を用いる使用のために適切なベクターおよび方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９年、によって記載され、この開示は、本明細書において参考として援用される。
【０１１６】
多種多様なベクターは、本発明において使用され得る。このようなベクターとしては、染色体のベクター、エピソームのベクターおよびウイルス由来ベクター（例えば、細菌性プラスミド由来ベクターおよびバクテリオファージ由来ベクター、ならびにそれらの組合せ由来のベクター（例えば、プラスミドおよびバクテリオファージの遺伝要素（例えば、コスミドおよびファージミド）由来のベクター）））が挙げられ、これらのベクターの全てが本発明のこの局面に従って使用され得る。一般に、細菌宿主においてポリヌクレオチドを保持および増殖させるために適切である任意のベクターは、この点において使用され得る。
【０１１７】
細菌における使用のための適切な大多数のベクターおよびプロモーターは、公知であり、これらの多くが市販されている。好ましい原核生物ベクターとしては、プラスミド（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、ｐＢＲ３２２、ＣｏｌＥｌ、ｐＳＣ１０１、ｐＡＣＹＣ１８４、πＶＸ）において複製可能なベクター）が挙げられる。このようなプラスミドは、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．らによるＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｆｉｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８２）に開示される。以下のベクターは、例示の目的で提供される：ｐＥＴ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＢｓ、ｐｈａｇｅｓｃｉｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐＢｓＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。
【０１１８】
本発明の単離された核酸分子に好ましいベクターは、コンビナトリアルクローニングベクター（Ｌｏｎｓｄａｌｅ，Ｄ．Ｍ．ら，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ １３：３４３−３４５（１９９５））のｐＦＣ１〜ｐＦＣ７の新規ファミリー、ｐＫ１８４ベクター（Ｊｏｂｌｉｎｇ，Ｍ．Ｇ．およびＨｏｍｅｓ，Ｒ．Ｋ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １８：５３１５−５３１６（１９９０））を含む。
【０１１９】
好ましいベクターの別の群は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種において自律的複製可能であるベクターである。このようなベクターは、微生物発酵の目的でのアミノ酸産生の当業者に周知であり、これらの例としては、ｐＳＲＩ、ｐＭＦ１０１４αおよびこれら由来のベクターが挙げられる。
【０１２０】
本発明は、ＡＴＣＣ ２１５２９株のａｓｋポリペプチドの単離されたアミノ酸配列（配列番号２）を提供する。本明細書において開示された単離されたａｓｋアミノ配列は、培養培地中のＬ−リジンおよびＬ−スレオニンの蓄積されたレベルに対するａｓｋ酵素活性のフィードバック抵抗に関する独特の性質を保有する。他のＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ａｓｋ−ａｓｄ遺伝子配列のＤＮＡ配列と比較される場合、本発明は、フィードバック阻害に対して抵抗性を生じるアミノ酸残基３８０でのスレオニンからイソロイシンへの変化を開示する。本発明はまた、Ｌ−スレオニンおよび／またはＬ−リジンに対するａｓｋ酵素の感受性の減少を生じる残基３８０での他のアミノ酸の変化を含む。
【０１２１】
さらに、本明細書においてより詳細に記載されるように、ベクターは、発現を調節ならびに発現を引き起こす制御領域を含み得る。一般に、このような領域は、転写を制御することによって作動する（例えば、とりわけ、インデューサー結合部位またはリプレッサー結合部位およびエンハンサー）。
【０１２２】
本発明のベクターは、一般に選択マーカーを含む。このようなマーカーはまた、増幅に適切であり得るか、またはこれらのベクターは、本目的のためにさらなるマーカーを含み得る。この点において、ベクターは、好ましくは、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型形質を提供するために１つ以上の選択マーカー遺伝子を含む。このようなマーカーは、以下を含むが、これらに限定されない：抗生物質耐性遺伝子（例えば、クロラムフェニコール耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、もしくはカナマイシン耐性遺伝子）、または、宿主細胞株が、正常に栄養要求性であるのに対して、栄養素の欠乏においても宿主細胞が増殖することを可能にする自己栄養遺伝子。
【０１２３】
このベクターが宿主細胞の染色体外に保持されるべきことが意図される場合、このベクターがＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種の宿主細胞において複製することを可能にするさらなる複製起点を含む。あるいは、ベクターがＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種の染色体中に組込まれることを所望する場合、このベクターは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ中で複製され得ないように構築される。例えば、このようなベクターは、別の生物体（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）において増殖可能であり得るが、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍにおいて増殖されるための適切な複製起点を欠く。この実施形態の別の局面において、このベクターは、１つより多い宿主細胞種において複製し得、そして保持され得るシャトルベクターである（例えば、このようなシャトルベクターは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主細胞（例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞）において、そしてＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞においてもまた、複製可能であり得る）。
【０１２４】
本発明はさらに、以下の単離されたアミノ酸配列を提供する：ＡＴＣＣ ２１５２９株のａｓｄポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号４）；ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４株のｄａｐＡポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号６）；ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４株のｄａｐＢポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号８）；ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４株のｄｄｈポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１０）、およびＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４株のＯＲＦ２ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１６）。さらに、ｌｙｓＡ（ｐＲＳ６）のアミノ酸配列がまた、本明細書において提供される（Ｍａｒｃｅｌ，Ｔ．ら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４：８１９−８３０（１９９０））（配列番号１４）。
【０１２５】
上記に開示される特定の配列開示によって規定される単離されたポリペプチド配列に加えて、本発明はまた、寄託されたクローンによってコードされるアミノ酸配列を提供する。
【０１２６】
本発明のいくつかのアミノ酸配列が本明細書に開示されたタンパク質の構造または機能に顕著な影響を与えることなくに変化され得ることは、当該分野において認識される。含まれる改変体は、酵素活性が顕著に影響されない限り、欠失、挿入、転換、反復、および型置換を構成し得る。表現型的にサイレントであるべきようなアミノ酸の変化を考慮する手引きは、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら，「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）において見出され得る。
【０１２７】
本発明のこれらの株は、当業者において公知でかつ利用可能な任意の方法および技術によって調製され得る。本発明の遺伝子構築物の宿主細胞への導入は、エレクトロポレーション、形質導入、または他の方法によってもたらされ得る。これらの方法は、本明細書において参照され、かつ援用される多数の標準的な実験室マニュアルにおいて記載される。
【０１２８】
本発明の種々の実施形態は、遺伝子増幅の結果として増加したＬ−リジン産生を有する株を提供する。遺伝子増幅によって、２個、３個、４個、５個、１０個以上のコピーの因子によりコピー数をＬ−リジン生合成経路遺伝子の正常な単一コピー数より多く増加させることが、意味される。
【０１２９】
本発明の１つの実施形態において、Ｌ−リジン生合成経路遺伝子のさらなるコピーが、染色体中に組込まれ得る。本発明の別の実施形態は、Ｌ−リジン生合成経路遺伝子のさらなるコピーが染色体外に保有されることを提供する。５個以下の因子による増幅は、単一事象の相同組換えの目的で宿主株の染色体中にさらなる遺伝子コピーを導入することによって得られ得る。最も好ましい実施形態において、この組換え事象は、目的の遺伝子のコピーのさらなる１つのコピーの導入を生じる。５個よりも多い遺伝子のコピーが所望される場合、次いで、本発明はまた、本発明の組換えＤＮＡ構築物を保有する多コピープラスミドの使用について提供する。
【０１３０】
本発明の単離された核酸分子に対して適切な宿主の代表的な例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：細菌細胞（例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ細胞およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｆｎ細胞）；および、真菌細胞（例えば、酵母細胞）。上記の宿主細胞について適切な培養培地および培養条件は、当該分野において公知である。
【０１３１】
本発明の特に好ましい宿主細胞としては、以下が挙げられる：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍおよびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ。
【０１３２】
出願人は、特許手続の目的のために、ｔｈｅ Ｂｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙ ｏｎ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｐｏｓｉｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓに従って、受託可能なＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｅｐｏｓｉｔａｒｙ ＡｕｔｈｏｒｉｔｙでｐＫ１８４−ＫＤＡＢＨ’Ｌ多重遺伝子構築物を保有するクローンを寄託した。この寄託物は、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＮＲＲＬ），１８１５ Ｎｏｒｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｐｅｏｒｉａ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ ６１６０４で作製されている。宿主細胞の染色体中に組込まれたｐＫ１８４−ＫＤＡＢまたはｐＫ１８４−ＫＤＡＢＨ’Ｌの多重遺伝子構築物において作製された寄託物としては、以下が挙げられる：（１）ＮＲＲＬ−Ｂ３０２１９およびＮＲＲＬ−Ｂ３０２２１として寄託された、ｐＫ１８４−ＫＤＡＢプラスミド（染色体中に組込まれる）、ならびに（２）ＮＲＲＬ−Ｂ３０２１８、ＮＲＲＬ−Ｂ３０２２０、およびＮＲＲＬ−Ｂ３０２２２として寄託された、ｐＫ１８４−ＫＤＡＢＨ’Ｌプラスミド（染色体中に組込まれる）。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αＭＣＲに保有された、プラスミド構成中のｐＫ１８４−ＫＤＡＢＨ’Ｌ多重遺伝子の構築物は、ＮＲＲＬ−Ｂ３０２２８として寄託された。６個の遺伝子構築物（ｐＤＥｌｉａ２−ＫＤＡＢＨＬ）は、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＮＲＲＬ−Ｂ３０２３３）において寄託された。ｐＫ１８４−ＫＤＡＢＨ’Ｌを含むＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍは、ＮＲＲＬ−Ｂ３０２３６として寄託された。ｐＫ１８４−ＫＤＡＢＨＬを含むＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍは、ＮＲＲＬ−Ｂ３０２３７として寄託された。ｐＤＥｌｉａ２−ＫＤＡＢＨＬを含むＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍは、ＮＲＲＬ−Ｂ３０２３４として寄託された。ｐＤＥｌｉａ２−ＫＤＡＢＨＬを含むＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｆｎｎｅｎｔｕｍは、ＮＲＲＬ−Ｂ３０３２５として寄託された。
【０１３３】
配列番号２のアミノ酸配列を含む宿主細胞を培養する工程を包含するリジンを産生する方法を提供することが、本発明の目的であって、ここで、この宿主細胞は、以下：（ａ）遺伝的に変更されていない宿主細胞と比較して１つ以上のリジン生合成経路酵素の増加した酵素活性；（ｂ）リジン生合成経路酵素をコードする各遺伝子の１つ以上のコピー；（ｃ）リジン生合成経路酵素をコードする１つ以上の酵素の転写を調節する１つ以上の転写因子の変更、を含み、ここで、この宿主細胞は、この培養培地中にリジンを産生する。本方法の１つの実施形態のおいて、この増加した酵素活性は、１つ以上のリジン生合成経路酵素をコードする１つ以上の遺伝子を過剰発現させる工程を包含する。本方法の１つの実施形態において、この１つ以上の遺伝子は、１つ以上のプロモーター配列に対して、直接的にかまたは間接的に作動可能に連結される。本方法の別の実施形態において、この作動可能に連結されたプロモーター配列は、異種性であるか、内在性であるか、またはハイブリッドである。本方法の好ましい実施形態において、このプロモーター配列は、以下の１つ以上である：Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍに対して内在性である遺伝子の５’末端由来のプロモーター配列、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいて複製するプラスミド由来のプロモーター配列、およびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍを感染するファージのゲノム由来のプロモーター配列。本方法の好ましい実施形態において、１つ以上のこのプロモーター配列は、改変される。別の好ましい実施形態において、この改変は、以下を含む：５’末端での短縮、３’末端での短縮、１つ以上のヌクレオチドの非末端の挿入、１つ以上のヌクレオチドの非末端の欠失、５’末端での１つ以上のヌクレオチドの付加、３’末端での１つ以上のヌクレオチドの付加、およびこれらの組合せ。
【０１３４】
本方法の別の実施形態において、この増加した活性は、１つ以上の改変されたリジン生合成経路酵素の活性から生じ、ここで、この酵素改変は、この改変を欠く酵素と比較して、動力学的パラメーター、アロステリック調節、またはこれらの両方において、変化を生じる。本方法の１つの実施形態における、動力学的パラメーターにおけるこの変化は、Ｋｍ、Ｖｍａｘ、またはその両方における変化である。本方法の別の実施形態において、アロステリック調節におけるこの変化は、１つ以上の酵素アロステリック調節部位における変化である。１つの実施形態における、アロステリック調節におけるこの変化は、リガンドに対する１つ以上の酵素アロステリック調節部位の親和性における変化である。これらのリガンドは、同一であり得るかまたは異なり得る。１つの実施形態において、この酵素改変は、この酵素をコードするヌクレオチド配列における変化の結果である。１つの実施形態において、このヌクレオチド配列のこの変化は、１つ以上のヌクレオチドの付加、挿入、欠失、置換、またはこれらの組合せである。
【０１３５】
この方法の別の実施形態において、１つ以上の転写因子のこの改変は、転写インヒビタータンパク質における１つ以上の変異、転写アクチベータータンパク質における１つ以上の変異またはその両方を含む。ここで、この１つ以上の変異は、この改変を欠く１つ以上の転写因子による転写と比較して、標的ヌクレオチド配列の転写を増大する。１つの実施形態において、この１つ以上の変異は、この転写因子をコードするこのヌクレオチド配列における改変である。別の実施形態において、このヌクレオチド配列におけるこの改変は、１つ以上のヌクレオチドの付加、挿入、欠失、置換、またはその組み合わせである。
【０１３６】
本明細書中で言及されるすべての特許および刊行物は、その全体が参考として明確に援用される。
【実施例】
【０１３７】
（実施例）
（実施例１：Ｌ−リジン経路多重遺伝子構築物ｐＫ１８４−ＫＤＡＢおよびｐＫ１８４−ＫＤＡＢＨ’Ｌの調製）
出願人は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種の染色体におけるＬ−リジンアミノ酸生合成経路の１つ以上の遺伝子の数を増幅するためにＬ−リジンアミノ酸生合成経路多重遺伝子構築物を作製した。また、ＡＴＣＣ２１５２９株のＬ−リジン生合成遺伝子の注意深い研究を通じて、出願人は、ＡＴＣＣ２１５２９のａｓｋ遺伝子のアミノ酸残基３８０におけるスレオニンからイソロイシンのアミノ酸改変を同定した。他のＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ａｓｋ遺伝子のＤＮＡ配列と比較して、アミノ酸残基３８０におけるスレオニンからイソロイシンへの改変が認められた（図１９）。これは、アスパラギン酸キナーゼ酵素調節に関する異常なフィードバック抵抗性の性質の原因である。
【０１３８】
本発明において使用されるアミノ酸生合成経路遺伝子である、Ｌ−リジンをコードする単離された核酸分子は、以下の供給源由来である。
【０１３９】
【表１】
当業者が理解するように、本発明の単離した核酸分子に関して、本発明は、出願人が示す特定の株の起源に限定されない。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種の任意の株（特にＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの株）を、核酸分子の単離に利用し得、この核酸分子を染色体に位置されるアミノ酸生合成経路遺伝子の数を増幅するのに使用する。特に好ましい株として、以下が挙げられる：ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４、ＡＴＣＣ２１７９９、ＡＴＣＣ２１５２９、ＡＴＣＣ２１５４３およびＥ１２。
【０１４０】
本明細書中に引用および援用される多くの実験手引き書（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）に見られるように）に見られ得るような、組換えＤＮＡ技術の分野に共通の方法と技術を、本発明の多重遺伝子の構築物の作製に使用した。
【０１４１】
ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）技術を、本発明の多重遺伝子構築物の作製において広く使用する。典型的な反応において、標準１０×ストック溶液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５００ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２）を、１×に希釈して使用する。ＰＣＲ増幅のために、以下の典型的な反応条件を使用した：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０１％ ゼラチン、２００μＭ デオキシヌクレオチド、０．２〜１．０μＭ プライマーおよび２．５Ｕ／１００μｌ ｐｆｕ ポリメラーゼ。以下の標準サイクルパラメーターをまた、ＰＣＲ反応において使用した：テンプレート変性を９４℃で１分間行い；５５℃のアニーリング温度（または特定のプライマーの対に適切なアニーリング温度）を１分間行い；産生物の伸長を７２℃で１分間（産物が、＜５００ｂｐである場合）、３分間（産物が＞５００ｂｐである場合）行った；これらを３０サイクル、およびサイクルの最後に、７２℃、７分間の最後の伸長を行った。
【０１４２】
クローニング実験に使用されるプライマーとして、以下が挙げられる：
【０１４３】
【表２】
内部的にｌｙｓＡにアニーリングするプライマー（ｌｙｓＡの端から約５００ｂｐ上流）。‘ＬｙｓＡは、ｌｙｓＡから得られた短縮型形態である。
【０１４４】
出願人は、ａｓｋ−ａｓｄ、ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ、ｄｄｈ、‘ｌｙｓＡおよびｌｙｓＡのコード領域のクローニングにおいて標準ＰＣＲおよびサブクローニング手順を利用した。構築手順および中間体プラスミドを、図１８に示す。出願人は、Ｌ−リジン生合成経路に使用される以下のベクターの構築において、以下の工程（図１８）を実行した：
１．ｐＧＥＭＴ−ａｓｋ−ａｓｄ：プライマーａｓｋおよびａｓｄを使用するＡＴＣＣ２１５２９のａｓｋ−ａｓｄオペロンを含むおよそ２．６ＫｂのＰＣＲ産物を、ｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ ｐＧＥＭ−Ｔ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ）にクローニングした；
２．ｐＡＤＭ２１：ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４ ｄｄｈコード領域のおよそ１．３ＫｂのＰＣＲ産物（両プライマー上に操作されたＫｐｎｌ部位を有する）をｐＡＤＭ２０にクローニングした；
３．ｐＵＣ１ ８−ｄｄｈ：ｄｄｈ（ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４）を含むｐＡＤＭ２１のおよそ１．３ＫｂのＫｐｎＩフラグメントを、ｐＵＣ１８のＫｐｎＩ部位にサブクローニングした；
４．ｐＬＩＣ１．７−ａｒｇＳ−‘ｌｙｓＡ：テンプレートＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４ゲノムＤＮＡならびにプライマーａｒｇＳおよびｌｙｓＡを使用するＰＣＲ産物を、ｐＰＭＧ−ＬＩＣクローニングベクター（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）にクローニングした；
５．ｐＭ４−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ：プライマーｄａｐＢおよびｄａｐＡを使用するおよそ３ＫｂのＰＣＲ産物をｐＭ４のＸｂａＩ部位にクローニングした；
６．ｐＦＣ３−ａｓｋ−ａｓｄ：ｐＧＥＮＴ−ａｓｋ−ａｓｄのおよそ２．６ＫｂのＮｓｉＩ−ＡｐａＩフラグメントを、ＰｓｔＩおよびＡｐａＩで切ったｐＦＣ３にクローニングした；
７．ｐＦＣ１−ｄｄｈ：ｐＵＣ１８−ｄｄｈの約１．３ＫｂのＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを、ＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩで切ったｐＦＣ１にクローニングした；
８．ｐＦＣ１−ｄｄｈ−‘ｌｙｓＡ：ｐＬＩＣ１．７−ａｒｇＳ−‘ｌｙｓＡのおよそ１．５ＫｂのＥｃｏＲＩフラグメント（短縮型ｌｙｓＡ ＤＮＡを含む）を、ｐＦＣ１−ｄｄｈのＥｃｏＲＩ部位にクローニングした；
９．ｐＦＣ５−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ：ｐＭ４−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡのおよそ３．４ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢｇＩＩＩフラグメントをｐＦＣ５のＢａｍＨＩ部位にクローニングした；
１０．ｐＦＣ５−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ−ｄｄｈ−‘ｌｙｓＡ：ｐＦＣＩ−ｄｄｈ−‘ｌｙｓＡの約２．８ＫｂのＮｈｅＩフラグメントを、ｐＦＣ５−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡのＮｈｅＩ部位にクローニングした；
１１．ｐＦＣ−３−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ−ｄｄｈ−‘ｌｙｓＡ：ｐＦＣ５−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ−ｄｄｈ−‘ｌｙｓＡの約６．２ＫｂのＮｏｔＩフラグメントを、ｐＦＣ３−ａｓｋ−ａｓｄのＮｏｔＩ部位にクローニングした；
１２．ｐＤＥｌｉａ９−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ−ｄｄｈ−‘ｌｙｓＡ（ｐＤＥｌｉａ９−ＫＤＡＢＨ’Ｌ）：ｐＦＣ３−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ−ｄｄｈ−‘ｌｙｓＡの約８．８ｋｂのＰｍｅＩフラグメントを、ｐＤＥｌｉａ９のＥｃｏＲＶ部位にクローニングした；そして
１３．ｐＫ１８４−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ−ｄｄｈ−‘ｌｙｓＡ（ｐＫ１８４−ＫＤＡＢＨ’Ｌ）：ｐＦＣ３−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ−ｄｄｈ−‘ｌｙｓＡのおよそ８．８ＫｂのＰｍｅＩフラグメントを、ｐＫ１８４のＨｉｎｃＩＩ部位またはＳｍａＩ部位にクローニングした。
【０１４５】
１４．ｐＦＣ５−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ（ｐＦＣ５−ＫＤＡＢ）：ｐＦＣ３−ａｓｋ−ａｓｄの約２．６ＫｂのＫｐｎＩ−ＳｍａＩフラグメントを、ＫｐｎＩおよびＳｍａＩで切ったｐＦＣ５−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡにクローニングしたプラスミド。
【０１４６】
１５．ｐＫ１８４−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ（ｐＫ１８４−ＫＤＡＢ）：ｐＦＣ５−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡの約７ＫｂのＫｐｎＩ−ＰｍｅＩフラグメントを、ＫｐｎＩとＨｉｎｃＩＩで切ったｐＫ１８４にクローニングしたプラスミド。
【０１４７】
従って、出願人は、以下のＬ−リジン多重遺伝子構築物を作製した。
【０１４８】
１．ｐＫ１８４−ＫＤＡＢＨ’Ｌ、ここで、「Ｋ」は、ａｓｋポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す；「Ｄ」は、ａｓｄポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す；「Ａ」は、ｄａｐＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す；「Ｂ」は、ｄａｐＢポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す；「Ｈ’」は、ｄｄｈポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す；そして「’Ｌ」は、‘ｌｙｓＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す。この構築物を、短縮型６遺伝子構築物と称する。以下で構築された、ｐＫ１８４−ＫＤＡＢＨＬ構築物を、全長６遺伝子構築物と称する。
【０１４９】
２．ｐＫ１８４−ＫＤＡＢ、ここで、「Ｋ」は、ａｓｋポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す；「Ｄ」は、ａｓｄポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す；「Ａ」は、ｄａｐＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す；そして「Ｂ」は、ｄａｐＢポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す。この構築物を、４遺伝子構築物と称する。
【０１５０】
ｐＫ１８４−ＫＤＡＢＨ’ＬおよびｐＫ１８４−ＫＤＡＢの両方は、本明細書中で言及される他の構築物がそうであるように、ＯＲＦ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１５１】
「Ｋ」、「Ｄ」、「Ａ」、「Ｂ」、「Ｈ」、「Ｌ」および「‘Ｌ」によって示される単離された核酸配列によってコードされる示されたポリペプチド配列に加えて、これらの単離された核酸配列はまた、本明細書中に示されたオペロンのための天然のプロモーターエレメントを含むことが、記述されるべきである。従って、ａｓｋ−ａｓｄ配列を、それぞれ、以下の天然のプロモーターエレメントを含む様式においてクローニングした；ｄａｐＡおよびｄａｐＢ配列（オペロンｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡを表す）を、それぞれのプロモーターエレメントを含む様式においてクローニングした；ｄｄｈ配列を、それぞれの天然のプロモーターエレメントを含む様式においてクローニングした、そしてｌｙｓＡおよび‘ｌｙｓＡの配列を、天然のプロモーターエレメントを含む様式においてクローニングした。
【０１５２】
選択的遺伝子プロモーターエレメントは、本発明の構築物において利用され得る。例えば、本発明においてこの使用に適切な公知の細菌のプロモーターは、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＩおよびｌａｃＺプロモーター、Ｔ３およびＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、ｌａｍｂｄａＰＲおよびＰＬプロモーター、ｔｒｐプロモーターまたは本発明の細菌細胞に内在性のプロモーターを含む。本発明に有用な他のプロモーターは、制御されたプロモーター、制御されていないプロモーターおよび異種なプロモーターを含む。このようなプロモーターの多くは、当業者に公知である。Ｓａｍｂｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）を参照のこと。
【０１５３】
（実施例２：Ｌ−リジンアミノ酸生合成経路遺伝子の２倍増幅）
例示的な目的に関してのみ、出願人は、本明細書中の実施例を提供する。ここで、少なくとも１つのＬ−リジンアミノ酸生合成経路遺伝子を、以下よって２倍に増幅する：（ａ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞への単離された核酸分子の導入、そして（ｂ）このＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞の染色体へのこの単離された核酸分子を導入する後の単一交叉相同組換え現象。
【０１５４】
当業者に理解されるように、少なくとも１または２または３または４または５または６または７または８または９または１０またはそれ以上のアミノ酸生合成経路遺伝子を、増幅し得る（すなわち、本明細書中の実施例の少数の改変体に少なくとも１または２または３または４または５または６または７または８または９または１０倍の因子まで数を増大し得る）。
【０１５５】
ｐＫ１８４−ＫＤＡＢプラスミド、ｐＫ１８４−ＫＤＡＢＨ’ＬプラスミドおよびｐＤ２−ＫＤＡＢＨＬプラスミド（実施例４において構築された全長６遺伝子の構築物）を、本発明の高収量誘導化細胞株の構築において使用した。これを、単一交叉相同組換え現象を介する宿主細胞の染色体へのｐＫ１８４−ＫＤＡＢ、ｐＫ１８４−ＫＤＡＢＨ’ＬまたはｐＤ２−ＫＤＡＢＨＬの取り込みを生じる、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種に、プラスミドｐＫ１８４−ＫＤＡＢ、ｐＫ１８４−ＫＤＡＢＨ’ＬおよびｐＤ２−ＫＤＡＢＨＬ ＤＮＡを導入する方法によって達成した。本発明のプラスミド構築物の染色体性の組込みによるアミノ酸生合成経路遺伝子の増幅は、いくつかのＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株において増大したＬ−リジン産生を提供する。
【０１５６】
本発明の単離された核酸分子を用いる細胞形質転換実験に関して、コンピテント細胞の増殖および調製を、以下の手順に従って行ない得る：（１）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの新鮮な、シングルコロニーを選ぶ工程、そして攪拌しながら３０℃で、２５０ｍＬ攪拌フラスコ中の１０ｍＬ ＣＭ（ＳＭ１）において、一晩培養物を増殖する工程；（２）５００ｍＬ 攪拌フラスコ中での６６０ｎｍの光学密度（Ｏ．Ｄ．）が０．１になるまで一晩培養した培養物を、２００ｍＬの「増殖培地」に播種する工程；（３）攪拌しながら３０℃で５〜６時間、培養物を増殖する工程；（４）冷却、密封、滅菌した２５０ｍＬの遠心管に培養物を注ぐ工程；４℃で、Ｒｅｆｒｉｇｅｒａｔｅｄ Ｓｏｒｖａｌｌにおいて８〜１０Ｋで、１０分間遠心分離をする工程；（５）徹底的に上清を流す工程そして等量の氷冷、滅菌した脱イオン水で細胞ペレットを再懸濁する工程；（６）同じ条件下で再度、サンプルを遠心分離する工程；（７）全てのものを氷冷し続けることを忘れずに水で洗浄を繰り返す工程；（８）徹底的に上清を流す工程そして１ｍＬの氷冷、滅菌した１０％グリセロール中に細胞ペレットを再懸濁する工程そして冷却、滅菌した１．５ｍＬの微小遠心チューブに細胞を移す工程；（９）冷却遠心において１０分間サンプルを遠心する工程；（１０）上清をピペッティングする工程そして捨てる工程、そしてペレット容積（２００〜４００μｌ）の２〜３倍の１０％グリセロールでペレットを再懸濁する工程；そして（１１）必要ならば、冷却したチューブに細胞をアリコートし、そして−７０℃で凍結する工程。
【０１５７】
ｐＫ１８４−ＫＤＡＢ、ｐＫ１８４−ＫＤＡＢＨ’ＬおよびｐＤ２−ＫＤＡＢＨＬプラスミドＤＮＡを、以下のエレクトロポレーション手順によってＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞に導入した：（１）冷却した０．１ｃｍエレクトロキュベットの側壁に３５μＬ細胞／グリセロール溶液をピペッティングする工程；（２）溶液に約２〜４μＬのプラスミドをピペッティングする工程そして穏やかな上下のピペッティングによってサンプルを混合する工程；（３）泡の発生をさけるように、穏やかなタッピングによってエレクトロキュベットの底に全溶液を移す工程（４）電気ショックの工程の準備ができるまで氷上にサンプルを置いておく工程、電気ショックを与える前にエレクトロキュベットの外壁の任意の曇りを拭く工程そして１度に１．５ｋＶ、２００Ω、２５μＦで、細胞にショックを与える工程。
【０１５８】
細胞を、以下の工程によってエレクトロポレーションからの回復を可能にする：（１）即座に、エレクトロキュベットに１ｍＬの温めた「回復培地」をピペッティングする工程、そして徹底的に、ピペッティングによって溶液を混合する工程；（２）抗生物質抵抗性発現および細胞の回復のために少なくとも３時間、３０℃で溶液を（エレクトロキュベット内で）インキュベートする工程そして（３）選択培地にプレートする工程そして３０℃で、３日間インキュベートする工程。
【０１５９】
（実施例３：Ｌ−リジン産生が改善された株のスクリーニングおよび選択）
３日間の増殖後、抗生物質抵抗性の細胞のシングルコロニーを、個々に選択し、親の宿主細胞株による産生を越えてＬ−リジン産生が増大しているかを決定する。
【０１６０】
これらの実験で使用した全ての培地の調製法は、表１および表２に見られる。Ｌ−リジン産生を、攪拌フラスコ内で増殖した形質転換された、抗生物質抵抗性細胞培養物において決定する。簡潔には、播種培地（表１）を、深いバッフル付き（ｂａｆｆｌｅｄ）２５０ｍｌ Ｂｅｌｌｃｏ攪拌フラスコに２０ｍｌのアリコートに分配し、そして２０分間オートクレイブした。室温まで冷した後、次いで、これらの播種フラスコに、試験するべき株を播種し、そしてロータリーシェーカーに設置した。これらを、一晩攪拌しながら、３０℃でインキュベートし、翌朝に、各播種の光学密度（波長＝６６０ｎｍ）を記録し、そして各播種フラスコからの２ｍｌの培養物を２１ｍｌアリコートのＦＭ３培地（また深いバッファル攪拌フラスコ内に）に移した。次いで、これらの「主」フラスコを、シェーカーに戻し、そして３０℃でインキュベートした。
【０１６１】
４８時間のインキュベーション後、１ｍｌの主培養物を各フラスコから除去し、そして、フラスコを、直ぐにシャーカーに戻した。１ｍｌのサンプルに関して、光学密度を、０．１ＮのＨＣｌで１：５０に希釈することによって決定し、培地に存在する炭酸カルシウムを溶かした。次いで、各サンプルの残りを遠心分離し、細胞および炭酸カルシウムをペレット化した。上清の１：５０の希釈には、水を使用し、ブドウ糖濃度を、この希釈物から決定した。細胞外Ｌ−リジン濃度をまた、ＨＰＬＣによって、この時点で決定した。
【０１６２】
高収量の誘導化細胞を、ブドウ糖からの収量パーセント（すなわち、式［（産生されたアミノ酸ｇ／消費されたブドウ糖ｇ）＊１００］＝％収量によって定義されるブドウ糖からのアミノ酸収量）を決定することによって簡便に同定し得る。結果を、以下に示す。ここで、親株のＥ１２。ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４およびＡＴＣＣ２１７９９を、ｐＫ１８４−ＫＤＡ、ｐＫ１８４−ＫＤＡＢＨ’ＬおよびｐＤ（Ｅｌｉａ）２−ＫＤＡＢＨＬとして同定された本発明の単離されたＬ−リジン多重遺伝子の核酸分子で形質転換する。ｐＤ２−ＫＤＡＢＨＬ構築物を、実施例４と同様に作製した。
【０１６３】
【表３】
一旦、高収量の誘導化細胞の系統を、同定したら、この細胞の系統を、さらに、スクリーニングし、アミノ酸生合成経路遺伝子の増幅が、起こっていることを決定する。増幅スクリーニングを、（１）遺伝子のコピー数を決定するための標準サザンブロット法によってか、または（２）宿主細胞に導入された、単離された核酸分子のそれぞれの生合成経路遺伝子によってコードされた酵素の全酵素活性の決定によってかのいずれかによって簡便に達成し得る。
【０１６４】
サザンブロット法による遺伝子コピー数の決定は、本明細書中に参照および援用される実験手引書に記載されるような（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）に見られるような）、組換えＤＮＡ技術の分野で公知の標準の手順を利用して行われる。
【０１６５】
【表４】
【０１６６】
【表５】
（実施例４）
（Ｌ−リジン経路多重遺伝子構築物の調製）
本発明は、ＰＣＲ技術を用いて構築される、さらなるＬ−リジン多重遺伝子構築物をさらに含む。上述のように、標準のＰＣＲ手順およびサブクローニング手順を利用し、実施例１におけるものと同様の５遺伝子構築物を生成した。本実施例の構築物は、抗生物質耐性遺伝子、クロラムフェニコールアシルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）を含む。ＣＡＴ遺伝子を、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａにおける発現のためにＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａホスホフルクトキナーゼプロモーターに作動可能に連結した。
【０１６７】
以下の工程を、ＣＡＴ遺伝子を含む以下の構築物を構築することにおいて実施した：
１．ｐＧＥＭＴ−ａｓｋ−ａｓｄ：プライマーａｓｋおよびａｓｄを用いたＡＴＣＣ２１５２９のａｓｋ−ａｓｄオペロンを含む約２．６ＫｂのＰＣＲ産物を、ｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ ｐＧＥＭ−Ｔベクター系）にクローン化した；
２．ｐＵＣ１８−ｄｄｈ：ｄｄｈを含むｐＡＤＭ２１の約１．３Ｋｂ ＫｐｎＩフラグメント（ＮＲＲＬ Ｂ１１４７４）を、ｐＵＣ１８へ、ＫｐｎＩ部位においてサブクローン化した；
３．ｐＬＩＣ１．７−ａｒｇＳ−‘ｌｙｓＡ：テンプレートＢＦ１００ゲノムＤＮＡならびにプライマーａｒｇＳおよびｌｙｓＡを用いた約３ＫｂのＰＣＲ産物を、ｐＰＭＧ−ＬＩＣクローニングベクター（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）へクローン化した；
４．ｐＭ４−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ：プライマーｄａｐＢおよびｄａｐＡを用いた約３ＫｂのＰＣＲ産物を、ｐＭ４へ、平滑末端ＸｂａＩ部位においてクローン化した；
５．ｐＦＣ３−ａｓｋ−ａｓｄ：ｐＧＥＭＴ−ａｓｋ−ａｓｄの約２．６ＫｂのＮｓｉＩ−ＡｐａＩフラグメントを、ＰｓｔＩおよびＡｐａＩを用いて切断したｐＦＣ３へクローン化した；
６．ｐＦＣ１−ｄｄｈ：ｐＵＣ１８−ｄｄｈの約１．３ＫｂのＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを、ＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩを用いて切断したｐＦＣ１へクローン化した；
７．ｐＦＣ１−ｄｄｈ−‘ｌｙｓＡ：ｐＬＩＣ１．７−ａｒｇＳ−‘ｌｙｓＡの約１．５ＫｂのＥｃｏＲＩフラグメント（短縮型ｌｙｓＡ ＤＮＡを含む）を、ｐＦＣＩ−ｄｄｈへ、ＥｃｏＲＩ部位においてクローン化した；
８．ｐＦＣ１−ｄｄｈ−ｌｙｓＡ：ｐＲＳ６の約２．１ＫｂのＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩフラグメント（インタクトなｌｙｓＡ ＤＮＡを含む）を、ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩを用いて切断したｐＦＣ１−ｄｄｈへクローン化した；
９．ｐＦＣ５−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ：ｐＭ４−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡの約３．４ＫｂのＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントを、ｐＦＣ５へ、ＢａｍＨＩ部位においてクローン化した；
１０．ｐＦＣ５−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ−ｄｄｈ−‘ｌｙｓＡ：ｐＦＣ１−ｄｄｈ−‘ｌｙｓＡの約２．８ＫｂのＮｈｅＩフラグメントを、ｐＦＣ５−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡへ、ＮｈｅＩ部位においてクローン化した；
１１．ｐＦＣ５−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ−ｄｄｈ−ｌｙｓＡ：ｐＦＣ１−ｄｄｈ−ｌｙｓＡの約３．４ＫｂのＮｈｅＩフラグメントを、ｐＦＣ５−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡへ、ＮｈｅＩ部位においてクローン化した；
１２．ｐＦＣ３−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ−ｄｄｈ−‘ｌｙｓＡ（ｐＦＣ３−ＫＤＡＢＨ’Ｌ）：ｐＦＣ５−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ−ｄｄｈ−‘ｌｙｓＡの約６．２ＫｂのＮｏｔＩフラグメントを、ｐＦＣ３−ａｓｋ−ａｓｄへ、ＮｏｔＩ部位においてクローン化した；
１３．ｐＦＣ３−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ−ｄｄｈ−ｌｙｓＡ（ｐＦＣ３−ＫＤＡＢＨＬ）：ｐＦＣ５−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ−ｄｄｈ−ｌｙｓＡの約６．８ＫｂのＮｏｔＩフラグメントを、ｐＦＣ３−ａｓｋ−ａｓｄへＮｏｔＩ部位においてクローン化した；
１４．ｐＫ１８４−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ−ｄｄｈ−‘ｌｙｓＡ（ｐＫ１８４−ＫＤＡＢＨ’Ｌ）：ｐＦＣ３−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ−ｄｄｈ−‘ｌｙｓＡの約８．８ＫｂのＰｍｅＩフラグメントを、ｐＫ１８４へＨｉｎｃＩＩまたはＳｍａＩ部位においてクローン化した；
１５．ｐＤＥｌｉａ２−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ−ｄｄｈ−ｌｙｓＡ（ｐＤ２−ＫＤＡＢＨＬ）：ｐＦＣ３−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ−ｄｄｈ−ｌｙｓＡの約９．４ＫｂのＰｍｅＩフラグメントを、ｐＤＥｌｉａ２へ、ＨｉｎｃＩＩ部位においてクローン化した（ｋａｎ遺伝子を含む；全長６遺伝子構築物である）；
１６．ｐＤＥｌｉａ１１−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ−ｄｄｈ−‘ｌｙｓＡ（ｐＤ１１−ＫＤＡＢＨ’Ｌ）：ｐＦＣ３−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ−ｄｄｈ−‘ｌｙｓＡの約８．８ＫｂのＰｍｅＩフラグメントを、ｐＤＥｌｉａ１１へ、ＨｉｎｃＩＩまたはＳｍａＩ部位においてクローン化した（ＣＡＴ遺伝子を含む；短縮型６遺伝子構築物である）；
１７．ｐＤＥｌｉａ１１−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ−ｄｄｈ−ｌｙｓＡ（ｐＤ１１−ＫＤＡＢＨＬ）：ｐＦＣ３−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ−ｄｄｈ−ｌｙｓＡの約９．４ＫｂのＰｍｅＩフラグメントを、ｐＤＥｌｉａ１１へ、ＨｉｎｃＩＩ部位においてクローン化した（ＣＡＴ遺伝子を含む；全長６遺伝子構築物である）；
１８．ｐＤＥｌｉａ２：ｐＵＣ１９の約１．７５ＫｂのＤｒａＩ−ＳｓｐＩフラグメントに連結されたｐＵＣ４Ｋの約１．２４Ｋｂの平滑末端ＰｓｔＩフラグメント；
１９．ｐＤＥｌｉａ１１：Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ｆｄａプロモーターによって発現されるクロラムフェニコールアシルトランスフェラーゼ遺伝子を含む約１ＫｂのＰＣＲ産物を、プライマーＵＣｄｒａＩおよびＵＣｓｓｐＩならびにテンプレートとしてｐＭ４を用いて得て、そしてｐＵＣ１９の約１．７５ＫｂのＤｒａＩ−ＳｓｐＩフラグメントと連結した；
クローニング手順のために利用されたプライマーは、以下を含んだ：
【０１６８】
【表６】
ｌｙｓＡに対して内部的（ｌｙｓＡの末端に対して約５００ｂｐ上流）にアニールするプライマー。
【０１６９】
【表７】
「Ｋ」、「Ｄ」、「Ａ」、「Ｂ」、「Ｈ」、「Ｌ」および「‘Ｌ」は、上記と同じ意味を持つ。
【０１７０】
（実施例５：Ｌ−リジンアミノ酸生合成経路遺伝子の３倍増幅）
例示の目的のためにのみ、出願人らは、本明細書において、少なくとも１つのＬ−リジンアミノ酸生合成経路遺伝子が３倍に増幅される例を提供する。
【０１７１】
プラスミドｐＤ１１−ＫＤＡＢＨ’Ｌ（実施例４において構築された）を本発明の高収量誘導細胞株の構築に用いた。本発明の単離された核酸分子を用いる細胞形質転換実験のために、コンピテント細胞の増殖調製、および相対的な増殖の決定は、上記のような手順にしたがって実施し得る。
【０１７２】
プラスミドｐＤ１１−ＫＤＡＢＨ’Ｌ ＤＮＡをＮＲＲＬ−Ｂ３０２２０（ｐＫ１８４−ＫＤＡＢＨ’Ｌを含む）へ上記のエレクトロポレーション法を用いて導入した。ｐＤ１１−ＫＤＡＢＨ’ＬプラスミドＤＮＡのＮＲＲＬ−Ｂ３０２２０への導入は、単一交差相同組換え事象を経て宿主細胞染色体への１コピーのｐＤ１１−ＫＤＡＢＨ’Ｌの取り込みを生じた。２コピーの５遺伝子（ｐＤ１１−ＫＤＡＢＨ’ＬおよびｐＫ１８４−ＫＤＡＢＨ’Ｌ）を含む宿主細胞をＮＲＲＬ−Ｂ３０２２２として寄託した。
【０１７３】
３コピーの５遺伝子（１つの内因性コピーならびにｐＤ１１−ＫＤＡＢＨ’ＬおよびｐＫ１８４−ＫＤＡＢＨ’Ｌの各々の１コピー）を有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ２１７９９宿主細胞によって生産されるリジンの量を、以下に示す。
【０１７４】
【表８】
（実施例６）
本実施例は、上記のこれらの６遺伝子の各々の発現レベルを増大させるためのプロモーターの変更を記載する。Ｌ−アスパラギン酸からＬ−リジンへの生合成経路の６つの異なる酵素をコードする６つの遺伝子が、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの染色体に挿入されている。各遺伝子のさらなるコピーは、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株由来である。各遺伝子についての発現のレベルを調節するヌクレオチド配列（プロモーター）は、ネイティブの座においてＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ染色体上で見出されるものと同じであった。
【０１７５】
発現の増大は、酵素の比活性の増大、およびアスパラギン酸からリジンへの炭素の流動の改善を生じ得る。グルコースからのリジンの収率は、本技術によって改善され得る。
【０１７６】
プロモーター配列由来の発現のレベルは、強さと呼ばれる。強いプロモーターは、弱いものより高い発現を示す。プロモーターの強さを決定する機構は、記載されている（Ｒｅｃｏｒｄ，Ｍ．Ｔ．ら「大腸菌ＲＮＡポリメラーゼ、プロモーターおよび転写開始段階の速度論」Ｅｓｃｈｅｒｉｄｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ：Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ（１９９６），ｐｐ７９２〜８８１）。プロモーター源は、以下に由来するヌクレオチド配列を含む：Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ染色体に対してネイティブな遺伝子の５’末端、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいて複製するプラスミド上の配列、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍに感染するファージのゲノム中の配列、またはヒトによって構築されそして天然には見出されない配列（ｔａｃ、ｔｒｃ）。リボソームタンパク質の遺伝子、リボソームＲＮＡおよび延長因子は、高い発現レベルを示す。これらの遺伝子のプロモーターは、アミノ酸生合成経路遺伝子の発現を増大させるための候補である。
【０１７７】
生合成経路における遺伝子のプロモーターを変更する別の理由は、この経路を野生型生物においてこの経路を制御する因子から独立させることである。例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのリジン生合成経路のジアミノピメレート（ｄｉａｍｉｎｏｐｉｍｅｌａｔｅ）脱炭酸酵素を含むオペロンのネイティブプロモーターは、増殖培地においてアルギニンまたはリジンに応答し得る。アルギニンは、転写を３倍増大し、そしてリジンは、転写を３分の１減じた（Ｏｇｕｉｚａら，Ｊ Ｂａｃｔ．１７５：７３５６〜７３６２（１９９３））。ジアミノピメレート脱炭酸酵素活性は、１０ｍｍＭリジンを補充した最小培地で増殖される細胞において６０％減少した（Ｃｒｅｍｅｒら，Ｊ Ｇｅｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３４：３２２１〜３２２９（１９８８））。ジアミノピメレート脱炭酸酵素をコードするｌｙｓＡのプロモーターを置換することは、リジン生合成を培地中のアルギニンレベルおよびリジンレベルから独立させる１つの方法である。
【０１７８】
（実施例６Ａ）
アスパラギン酸キナーゼ（アスパラギン酸からリジンへの経路中の第１の酵素）についての遺伝子を調節するａｓｋＰ１プロモーターより強いプロモーターの例を、以下に示す。
【０１７９】
【表９】
Ｅ１２は、リジンを生産しないＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株である。Ｅ１２は、ＡＴＣＣ１３０５９由来の実験室株である。ＢＦ１００は、高レベルのリジン生産者である（ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４）。ＴＡＣは、商業的に利用可能なプロモーターであり、これは強いプロモーターの例として用いられる。ネイティブのアスパルトキナーゼプロモーターより強いＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ染色体由来の４つのプロモーターおよびファージ由来の３つのプロモーターが同定された。
【０１８０】
（実施例６Ｂ）
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいて発現される場合にアスパルトキナーゼの酵素比活性を増大させる強いプロモーターの例を、以下に示す。
【０１８１】
【表１０】
（実施例６Ｃ）
振盪フラスコ中のリジン生産に対するｌａｃＩ／ｔｒｃ−ａｓｋの影響の例を以下に示す。
【０１８２】
【表１１】
ＢＦ１００によるリジンの生産は、アスパルトキナーゼプロモーターの強さを増大することによって改善された。
【０１８３】
（実施例７）
本実施例は、本発明の高収率細胞株の構築におけるベクターｐＤＥｌｉａ２−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＡ−ＯＲＦ２−ｄａｐＢ−ｄｄｈ−Ｐ１ｌｙｓＡ（ｐＤＥｌｉａ２ＫＤＡＢＨＰ１Ｌ）の使用を示す。Ｐ１プロモーターを含むＨｐａＩ−ＰｖａＩＩフラグメントを、Ｍａｒｃｅｌ Ｔ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ４：１８１９〜１８３０（１９９０）に記載されるように調製した。出願人らは、上記のように標準ＰＣＲおよび標準サブクローニング手順を利用した。本発明の単離された核酸分子を用いた細胞形質転換実験のために、コンピテント細胞の増殖調製、および相対的増殖の決定を上記のような手順にしたがって実施し得る。
【０１８４】
出願人らは、Ｌ−リジン生合成経路において用いられる以下のベクターを構築することにおいて以下の工程を実施した。
【０１８５】
１．ｐＧＥＭＴ−ａｓｋ−ａｓｄ：プライマーａｓｋおよびａｓｄを用いてＡＴＣＣ２１５２９のａｓｋ−ａｓｄオペロンを含む約２．６ＫｂのＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ ｐＧＥＭ−Ｔベクター系）にクローン化した。
【０１８６】
２．ｐＵＣ１８−ｄｄｈ：ｄｄｈを含むｐＡＤＭ２１の約１．３Ｋｂ ＫｐｎＩフラグメント（ＢＦ１００座）をｐＵＣ１８へ、ＫｐｎＩ部位においてサブクローン化した。
【０１８７】
３．ｐＦＣ３−ａｓｋ−ａｓｄ：ｐＧＥＭＴ−ａｓｋ−ａｓｄの約２．６ＫｂのＮｓｉＩ−ＡｐａＩフラグメントをＰｓｔＩおよびＡｐａＩを用いて切断したｐＦＣ３へクローン化した。
【０１８８】
４．ｐＦＣ３−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ：ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４のｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡコード領域の約２．９ＫｂのＰＣＲ産物をｐＦＣ３へ、ＥｃｏＲＶ部位においてクローン化した。
【０１８９】
５．ｐＦＣ１−ｄｄｈ：ｐＵＣ１８−ｄｄｈの約１．３ＫｂのＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントをＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩを用いて切断したｐＦＣ１へクローン化した。
【０１９０】
６．ｐＵＣ１９−Ｐ１：ｐＲＳ６のＨｐａＩ−ＰｖｕＩＩフラグメント約５５０ｂｐ（ａｒｇＳ−ｌｙｓＡオペロンの第１のプロモーター（Ｐ１）を含む）をｐＵＣ１９へ、ＳｍａＩ部位においてクローン化した。
【０１９１】
７．ｐＵＣ１９−Ｐ１ｌｙｓＡ：プライマーＬｙｓＡ（ＡＴＧ）およびＬｙｓＡ３Ｂを用いた、ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４ ｌｙｓＡコード領域のＰＣＲ産物約１．４５Ｋｂ（プロモータを含まない）をｐＵＣ１９−Ｐ１へ、ＨｉｎｃＩＩ部位においてクローン化する。
【０１９２】
８．ｐＦＣ１−Ｐ１ｌｙｓＡ：ｐＵＣ１９−Ｐ１ｌｙｓＡの約２ＫｂのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて切断したｐＦＣ１へクローン化した。
【０１９３】
９．ｐＦＣ１−Ｐ１ｌｙｓＡ−ｄｄｈ：ｐＦＣ１−ｄｄｈの約１．３ＫｂのＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩフラグメントをＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩを用いて切断したｐＦＣ１−Ｐ１ｌｙｓＡへクローン化した。
【０１９４】
１０．ｐＦＣ１−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄｄｈ−Ｐ１ｌｙｓＡ：ｐＦＣ３−ａｓｋ−ａｓｄの約２．６ＫｂのＳｗａＩ−ＦｓｅＩフラグメントをＳｗａＩおよびＦｓｅＩを用いて切断したｐＦＣ１−ｄｄｈ−Ｐ１ｌｙｓＡへクローン化した。
【０１９５】
１１．ｐＦＣ３−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ−ｄｄｈ−Ｐ１ｌｙｓＡ（ｐＦＣ３−ＫＤＡＢＨＰ１Ｌ）：ｐＦＣ１−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄｄｈ−Ｐ１ｌｙｓＡの約５．９ＫｂのＳｐｅＩフラグメントを、ｐＦＣ３−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡへ、ＳｐｅＩ部位においてクローン化した。
【０１９６】
１２．ｐＤＥｌｉａ２−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ−ｄｄｈ−Ｐ１ｌｙｓＡ（ｐＤＥｌｉａ２−ＫＤＡＢＨＰ１Ｌ）：ｐＦＣ３−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ−ｄｄｈ−Ｐ１ｌｙｓＡの約８．８ＫｂのＰｍｅＩフラグメントをｐＤＥｌｉａ２へ、ＨｉｎｃＩＩ部位においてクローン化した。
【０１９７】
【表１２】
プロモータＰ１を含むＨｐａＩ−ＰｖｕＩＩフラグメントのヌクレオチド配列（配列番号１７）を図２０に示す。ｐＤＥｌｉａ２−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＡ−ＯＲＦ２−ｄａｐＢ−ｄｄｈ−Ｐ１ｌｙｓＡ（ｐＤＥｌｉａ２−ＫＤＡＢＨＰ１Ｌ）構築物を含むＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４におけるリジン生成の結果を以下に示す。
【０１９８】
【表１３】
（実施例８）
本実施例は、本発明の高収率細胞株の構築におけるベクターｐＤＥｌｉａ２ＦＣ５−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＢ−ｄｄｈ−ｌｙｓＡ（ｐＤＥｌｉａ２ＦＣ５ＫＤＢＨＬ）の使用を示す。ｐＤＥｌｉａ２ＦＣ５ＫＤＢＨＬベクターは、短縮型ＯＲＦ２遺伝子を含み、そしてｄａｐＡ遺伝子を欠く。ＯＲＦ２遺伝子を、内部ＣｌａＩ部位において切断し、３’領域およびｄａｐＡ遺伝子を除いた。プロモーターのないｌｙｓＡ遺伝子をＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４より得た。本発明の単離された核酸分子を用いた細胞形質転換実験のために、コンピテント細胞の増殖調製、および相対的増殖の決定を上記の手順にしたがって実施し得る。出願人らは、Ｌ−リジン生合成経路において用いられる以下のベクターを構築することにおいて以下の工程を実施した。
【０１９９】
１．ｐＧＥＭＴ−ａｓｋ−ａｓｄ：プライマーａｓｋおよびａｓｄを用いてＡＴＣＣ２１５２９のａｓｋ−ａｓｄオペロンを含む約２．６ＫｂのＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ ｐＧＥＭ−Ｔベクター系）にクローン化した。
【０２００】
２．ｐＦＣ３−ａｓｋ−ａｓｄ：ｐＧＥＭＴ−ａｓｋ−ａｓｄの約２．６ＫｂのＮｓｉＩ−ＡｐａＩフラグメントをＰｓｔＩおよびＡｐａＩを用いて切断したｐＦＣ３へクローン化した。
【０２０１】
３．ｐＦＣ３−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ：ＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４のｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡコード領域の約２．９ＫｂのＰＣＲ産物をｐＦＣ３へ、ＥｃｏＲＶ部位においてクローン化した。
【０２０２】
４．ｐＦＣ３−ｄａｐＢ：ｐＦＣ３−ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡの大きなＣｌａＩフラグメントを再連結した。
【０２０３】
５．ｐＵＣ１８−ｄｄｈ：ｄｄｈを含むｐＡＤＭ２１の約１．３ＫｂのＫｐｎＩフラグメント（ＮＲＲＬ Ｂ１１４７４座）をｐＵＣ１８へ、ＫｐｎＩ部位においてサブクローン化した。
【０２０４】
６．ｐＦＣ１−ｄｄｈ：ｐＵＣ１８−ｄｄｈの約１．３ＫｂのＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントをＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩを用いて切断したｐＦＣ１へクローン化した。
【０２０５】
７．ｐＦＣ１−ｄｄｈ−ｌｙｓＡ：ｐＲＳ６の約２．１ＫｂのＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩフラグメント（インタクトのｌｙｓＡ ＤＮＡを含む）をＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩを用いて切断したｐＦＣ１−ｄｄｈへクローン化した。
【０２０６】
８．ｐＦＣ１−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄｄｈ−ｌｙｓＡ：ｐＦＣ３−ａｓｋ−ａｓｄの約２．６ＫｂＳｗａＩ−ＦｓｅＩフラグメントをＳｗａＩおよびＦｓｅＩを用いて切断したｐＦＣ１−ｄｄｈ−ｌｙｓＡへ、クローン化した。
【０２０７】
９．ｐＦＣ３−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＢ−ｄｄｈ−ｌｙｓＡ：ｐＦＣ１−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄｄｈ−ｌｙｓＡの約６ＫｂのＳｐｅＩフラグメントをｐＦＣ３−ｄａｐＢへ、ＳｐｅＩ部位においてクローン化した。
【０２０８】
１０．ｐＤＥｌｉａ２ＦＣ５−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＢ−ｄｄｈ−ｌｙｓＡ（ｐＤＥｌｉａ２ＦＣ５−ＫＤＢＨＬ）：ｐＦＣ３−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＢ−ｄｄｈ−ｌｙｓＡの約７．３ＫｂのＮｏｔＩ−ＰｍｅＩフラグメントをＮｏｔＩおよびＰｍｅＩを用いて切断したｐＤＥｌｉａ２ＦＣ５へクローン化した。
【０２０９】
１１．ｐＤＥｌｉａ２ＦＣ５：ｐＦＣ５の小さなＰｖｕＩＩフラグメントをｐＤＥｌｉａ２の大きなＰｖｕＩＩフラグメントと連結した。
【０２１０】
ｐＤＥｌｉａ２ＦＣ５−ａｓｋ−ａｓｄ−ｄａｐＢ−ｄｄｈ−ｌｙｓＡ（ｐＤＥｌｉａ２ＦＣ５ＫＤＢＨＬ）を含むＮＲＲＬ−Ｂ１１４７４におけるリジン生成の結果を以下に示す。
【０２１１】
【表１４】
理解を明確にすることを目的として例証および実施例によって、いくぶん詳細に本発明を十分に記載しているが、同じことが、これらの条件、形態、および他のパラメータの広くかつ等価な範囲を伴って本発明を改変または変更することによって実施され得ること、およびこのような改変または変更は、添付される請求項の範囲に含まれることが意図されることは、当業者にとって明らかである。
【０２１２】
本明細書において言及される全ての刊行物、特許および特許出願は、本発明が属する当業者の技術水準を示し、かつ各個々の刊行物、特許または特許出願が、参考として援用されるように詳細かつ個別に示したものと同じ程度に、本明細書において参考として援用される。
【０２１３】
【表１５】
【０２１４】
【表１６】
【０２１５】
【表１７】
【０２１６】
【表１８】
【０２１７】
【表１９】
【０２１８】
【表２０】
【０２１９】
【表２１】
【０２２０】
【表２２】
【０２２１】
【表２３】
【０２２２】
【表２４】
【０２２３】
【表２５】
【０２２４】
【表２６】
【０２２５】
【表２７】
【０２２６】
【数１】
【数２】
【数３】
【数４】
【数５】
【数６】
【数７】
【数８】
【数９】
【数１０】
【数１１】
【数１２】
【数１３】
【数１４】
【数１５】
【数１６】
【数１７】
【数１８】
【数１９】
【数２０】
【数２１】
【数２２】
【数２３】
【数２４】
【数２５】
【数２６】
【数２７】
【数２８】
【数２９】
【数３０】
【数３１】
【数３２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１５Ｃ】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１５Ｃ】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【公開番号】特開２０１２−１２０５３６（Ｐ２０１２−１２０５３６Ａ）
【公開日】平成２４年６月２８日（２０１２．６．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−２７４４５（Ｐ２０１２−２７４４５）
【出願日】平成２４年２月１０日（２０１２．２．１０）
【分割の表示】特願２０１１−１５４５（Ｐ２０１１−１５４５）の分割
【原出願日】平成１２年１２月２９日（２０００．１２．２９）
【出願人】（５０７３０３３０９）アーチャー・ダニエルズ・ミッドランド カンパニー (16)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年６月２８日（２０１２．６．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年２月１０日（２０１２．２．１０）
【分割の表示】特願２０１１−１５４５（Ｐ２０１１−１５４５）の分割
【原出願日】平成１２年１２月２９日（２０００．１２．２９）
【出願人】（５０７３０３３０９）アーチャー・ダニエルズ・ミッドランド カンパニー (16)
【Ｆターム（参考）】
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