遺伝子導入剤の製造方法
【課題】分岐鎖の側鎖を短時間で加水分解し、血清を含む培地において優れた遺伝子導入活性を示す遺伝子導入剤を効率的に製造することができる遺伝子導入剤の製造方法を提供する。
【解決手段】分岐鎖を有する分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤を製造する方法において、芳香環に該芳香環から放射状に伸延する、少なくとも２−Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノアルキルメタクリレート及び／又はその誘導体を重合してなる複数の分岐鎖を導入することにより分岐型重合体を製造する分岐型重合体製造工程と、得られた分岐型重合体を加水分解する加水分解工程とを有する遺伝子導入剤の製造方法であって、該加水分解工程は、サイズ排除カラムに、該分岐型重合体を含む溶液を通液する工程を含むことを特徴とする。
【解決手段】分岐鎖を有する分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤を製造する方法において、芳香環に該芳香環から放射状に伸延する、少なくとも２−Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノアルキルメタクリレート及び／又はその誘導体を重合してなる複数の分岐鎖を導入することにより分岐型重合体を製造する分岐型重合体製造工程と、得られた分岐型重合体を加水分解する加水分解工程とを有する遺伝子導入剤の製造方法であって、該加水分解工程は、サイズ排除カラムに、該分岐型重合体を含む溶液を通液する工程を含むことを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分岐鎖を有する分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤の製造方法に係り、詳しくは、血清を含む培地において優れた遺伝子導入活性を示す遺伝子導入剤を短時間で効率的に製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒト疾患の分子遺伝学的要因が明らかになるにつれ、遺伝子治療研究がますます重要視されている。遺伝子治療法は標的とする部位でのＤＮＡの発現を目的としており、いかにＤＮＡを標的部位に到達させるか、いかにＤＮＡを標的部位に効率的に導入し、当該部位で機能的に発現させるかということが重要となる。外来ＤＮＡの導入のためのベクターとして、合成高分子ベクター、カチオン性脂質ベクターが研究開発されている。
【０００３】
本出願人らは、ＤＮＡを細胞中に運搬するための合成高分子ベクターとして、ベンゼンなどの芳香環を核としてカチオン性ポリマー鎖が放射状に伸延する分岐構造のベクターがＤＮＡを高密度で凝縮させて小さな核酸複合体微粒子を形成させ、効率良く細胞へ遺伝子導入できることを見出し、先に特許出願した（特許文献１，２）。
【０００４】
上記特許文献１，２に記載されるベンゼン環から放射状にポリマー鎖が伸延する遺伝子導入剤は、同じモノマーユニットからなる線形ポリマーと比較して、その構造上、電荷密度を高く配置することが可能である。このため、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸との複合体をより強く凝集させることが可能であり、より強く酵素などの作用から核酸を保護できるポリプレックス粒子を形成させることができ、遺伝子導入活性が向上した。しかしながら、このカチオン性ポリマーを含む遺伝子導入剤は、細胞を培養するのに最適な環境である血清を含む培地において、高い遺伝子導入活性を示さない。これは、上述のカチオン性ポリマーを含む遺伝子導入剤が、ｐＨが７程度の中性条件下にあっても高いゼーター電位を有しているため、核酸を凝集することができるが、血清中のアニオン性のタンパクなども吸着・凝集してマクロ粒子を形成してしまい、細胞内に取り込まれにくくなったり、ＤＮＡがトランスポーターに認識されにくくなるためであると考えられる。
【０００５】
本出願人らは、血清を含む培地においても効率的に遺伝子を導入することができる遺伝子導入剤として、所定温度未満ではカチオン性を示し、所定温度以上では遺伝子導入剤全体として親水性を示す感温性カチオン性ポリマーからなる遺伝子導入剤を見出し、先に特許出願した（特許文献３）。
【０００６】
特許文献３に記載される遺伝子導入剤は、少なくとも２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体を重合してなる重合体を分岐型重合体の分岐鎖として導入し、この分岐鎖の一部を加水分解しているため、血清を含む培地において細胞に遺伝子を導入する場合であっても、効率的に遺伝子を導入することができる。即ち、この特許文献３の遺伝子導入剤にあっては、加水分解により生成したアニオン性官能基の効果により、遺伝子導入剤全体としては親水性を示すようになるため、これにより、血清を含む培地においても、アニオン性タンパクや、血清中の脂質などを吸着することなく、高い遺伝子導入活性を示す。この特許文献３の実施例では、前述の加水分解を、ＲＯ水を透析液として、２５℃で１２０時間透析することにより行っている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ２００４／０９２３８８号公報
【特許文献２】特開２００７−７０５７９号公報
【特許文献３】特願２００９−２２７４０５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
この特許文献３に記載される遺伝子導入剤は、優れた遺伝子導入活性を示すものであり、遺伝子導入剤としての有用性が高いものであるが、製造に必要な時間が長いため、製造時間を短縮することが望まれる。即ち、一般的な加水分解では、反応溶液を加温することにより反応を促進させることができるが、特許文献３に係る分岐型重合体は、加温すると当該分岐型重合体が水中で脱溶媒和され、グロビュール構造のコロイド粒子を形成し、水との親和性が低下するため、分子全体を均一に加水分解することができなくなると共に、特にコロイド粒子の内郭部分の加水分解が進行しにくくなる。従って、特許文献３では、分岐型重合体が水に対して均一に溶解する温度で透析することにより加水分解を行っているが、この温度では加水分解が進行しにくく、製造に時間がかかるため、更なる改善が望まれている。
【０００９】
本発明は上記従来の実状に鑑みてなされたものであり、特許文献３におけるような分岐型重合体の加水分解に要する時間を短縮し、血清を含む培地において優れた遺伝子導入活性を示す遺伝子導入剤を効率的に製造することができる遺伝子導入剤の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明（請求項１）の遺伝子導入剤の製造方法は、分岐鎖を有する分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤を製造する方法において、芳香環に該芳香環から放射状に伸延する、少なくとも２−Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノアルキルメタクリレート及び／又はその誘導体を重合してなる複数の分岐鎖を導入することにより分岐型重合体を製造する分岐型重合体製造工程と、得られた分岐型重合体を加水分解する加水分解工程とを有する遺伝子導入剤の製造方法であって、該加水分解工程は、サイズ排除カラムに、該分岐型重合体を含む溶液を通液する工程を含むことを特徴とするものである。
【００１１】
請求項２の遺伝子導入剤の製造方法は、請求項１において、前記サイズ排除カラム内の圧力が３０〜８０ｋｇ／ｃｍ２であることを特徴とするものである。
【００１２】
請求項３の遺伝子導入剤の製造方法は、請求項１又は２において、前記サイズ排除カラムは、多孔性ポリマー粒子が充填されたものであることを特徴とするものである。
【００１３】
請求項４の遺伝子導入剤の製造方法は、請求項３において、前記多孔性のポリマー粒子は、粒径が１０μｍ以下であることを特徴とするものである。
【００１４】
請求項５の遺伝子導入剤の製造方法は、請求項３又は４において、前記多孔性ポリマー粒子は、スチレン／ジビニルベンゼン共重合体、ポリビニルアルコール、及びポリアクリルアミドからなる群から選択される１種以上であることを特徴とするものである。
【００１５】
請求項６の遺伝子導入剤の製造方法は、請求項５において、前記多孔性ポリマー粒子がスチレン／ジビニルベンゼン共重合体であり、サイズ排除カラム内の圧力が４０〜８０ｋｇ／ｃｍ２であることを特徴とするものである。
【００１６】
請求項７の遺伝子導入剤の製造方法は、請求項５において、前記多孔性ポリマー粒子がポリビニルアルコールであり、サイズ排除カラム内の圧力が３０〜４０ｋｇ／ｃｍ２であることを特徴とするものである。
【００１７】
請求項８の遺伝子導入剤の製造方法は、請求項１ないし７のいずれか１項において、前記サイズ排除カラムの理論段数が、１，０００／１０ｃｍ以上であることを特徴とするものである。
【００１８】
請求項９の遺伝子導入剤の製造方法は、請求項１ないし８のいずれか１項において、前記遺伝子導入剤のＬＣＳＴ（Lower Critical Solution Temperature）が、３７〜６０℃であることを特徴とするものである。
【００１９】
請求項１０の遺伝子導入剤の製造方法は、請求項１ないし９のいずれか１項において、前記分岐型重合体は、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これに少なくとも前記２−Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノアルキルメタクリレート及び／又はその誘導体を光照射リビング重合させてなるものであることを特徴とするものである。
【００２０】
請求項１１の遺伝子導入剤の製造方法は、請求項１０において、前記Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物は、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が結合したものであることを特徴とするものである。
【００２１】
請求項１２の遺伝子導入剤の製造方法は、請求項１ないし１１のいずれか１項において、前記遺伝子導入剤の分子量は、２，０００〜６００，０００であることを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の遺伝子導入剤の製造方法では、少なくとも２−Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノアルキルメタクリレート及び／又はその誘導体（以下、２−Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノアルキルメタクリレート及び／又はその誘導体を、「ＤＡＡＡＭ」と称す場合がある。）を重合してなる分岐鎖のＤＡＡＡＭ由来の構成単位（以下、ＤＡＡＡＭ由来の構成単位を、「ＤＡＡＡＭ単位」と称す場合がある。）の加水分解を、サイズ排除カラムを利用して、短時間で行うことができる。また、加水分解をサイズ排除カラムで行うため、加水分解と同時に遺伝子導入剤を精製することもできる。
【００２３】
前記圧力は、３０〜８０ｋｇ／ｃｍ２であることが好ましい（請求項２）。圧力が前記範囲内であれば、より一層加水分解の時間の短縮を図ることができる。
【００２４】
前記サイズ排除カラムとしては、多孔性ポリマー粒子が充填されたものであることが好ましく（請求項３）、この多孔性のポリマー粒子は、粒径が１０μｍ以下であることが好ましい（請求項４）。
【００２５】
前記多孔性ポリマー粒子は、スチレン／ジビニルベンゼン共重合体、ポリビニルアルコール、及びポリアクリルアミドからなる群から選択される１種以上であることが好ましい（請求項５）。
【００２６】
前記多孔性ポリマー粒子として、スチレン／ジビニルベンゼン共重合体の粒子を用いた場合、サイズ排除カラム内の圧力は４０〜８０ｋｇ／ｃｍ２であることが好ましく（請求項６）、多孔性ポリマー粒子としてポリビニルアルコールの粒子を用いた場合、サイズ排除カラム内の圧力は３０〜４０ｋｇ／ｃｍ２が好ましい（請求項７）。
【００２７】
前記サイズ排除カラムの理論段数は、１，０００／１０ｃｍ以上であることが好ましい（請求項８）。理論段数が前記範囲内であれば、短時間で加水分解を行うことができると共に、加水分解により生じたアルコールと、目的とする遺伝子導入剤とを分離することができる。
【００２８】
前記遺伝子導入剤のＬＣＳＴ（Lower Critical Solution Temperature）は、３７〜６０℃であることが好ましい（請求項９）。遺伝子導入剤のＬＣＳＴが、３６℃以上、特に３７〜６０℃であると、細胞を培養するために最適な温度である３５〜３７℃の条件において、遺伝子導入剤が部分的には疎水性を示すが、全体としては親水性を示し、遺伝子導入剤同士の凝集が生じない。これにより、この遺伝子導入剤からなる核酸複合体も、血清中の疎水性物質や、核酸複合体同士の凝集も生じにくくなり、また、血清に含まれるコレステロールやアルブミンなどの疎水性物質を可溶化する成分などの影響も受けにくくなり、さらに、疎水性のポリスチレン製シャーレへの吸着も防止される。
【００２９】
前記分岐型重合体は、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これに少なくとも前記ＤＡＡＡＭを光照射リビング重合させてなるものであることが好ましく（請求項１０）、前記Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物は、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が結合したものであることが好ましい（請求項１１）。
【００３０】
前記遺伝子導入剤の分子量は、２，０００〜６００，０００であることが好ましい（請求項１２）。遺伝子導入剤の分子量が上記範囲内であると、高分子量化を抑えた上で、より効率的に遺伝子導入剤と核酸とを複合化させることができ、低分子量で遺伝子導入効率に優れた遺伝子導入剤を得ることができる。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下に、本発明の実施の形態を詳細に説明する。
【００３２】
［１］遺伝子導入剤の製造方法
本発明の遺伝子導入剤の製造方法は、芳香環に放射状に伸延する、ＤＡＡＡＭを重合してなる複数の分岐鎖を導入する分岐型重合体製造工程と、この工程により得られた分岐型重合体を加水分解する加水分解工程とを有するものであって、この加水分解工程が、サイズ排除カラムに該分岐型重合体を含む溶液を通液する工程を含むことを特徴とする。
【００３３】
本発明の遺伝子導入剤の製造方法によれば、分岐型重合体を含む溶液をサイズ排除カラムに通液するという簡単な操作で、短時間で、目的とする遺伝子導入剤を得ることができると共に、精製を行うこともできる。
【００３４】
本発明の遺伝子導入剤の製造方法を説明するにあたり、まず、加水分解工程について説明し、次いで、分岐型重合体製造工程について説明する。
【００３５】
［加水分解工程］
本発明の遺伝子導入剤の製造方法に係る加水分解工程においては、具体的には、分岐型重合体を含む溶液を、多孔性ポリマー粒子を充填したサイズ排除カラムに通液することにより、分岐型重合体の加水分解を行うことができる。
【００３６】
本発明における分岐型重合体を含む溶液の通液速度は、０．１ｍＬ／分以上、例えば０．１〜１０ｍＬ／分程度、特に０．５〜５．０ｍＬ／分程度であることが好ましく、サイズ排除カラム内の圧力は、一般的に３０ｋｇ／ｃｍ２以上、特に５０〜７０ｋｇ／ｃｍ２程度とすることが好ましい。また、前記多孔性ポリマー粒子として、スチレン／ジビニルベンゼン共重合体からなる粒子を用いた場合には、サイズ排除カラム内の圧力を４０〜８０ｋｇ／ｃｍ２に調整することが好ましく、多孔性ポリマー粒子としてポリビニルアルコールからなる粒子を用いた場合にあっては、サイズ排除カラム内の圧力を３０〜４０ｋｇ／ｃｍ２に調整することが好ましい。通液速度、圧力が前記範囲内であれば、より短時間で加水分解を行うことができる。前記溶液の分岐型重合体の濃度は、１〜３００ｇ／Ｌ、１０〜１００ｇ／Ｌ程度が好ましい。分岐型重合体の濃度が高いと、圧力が高くなり過ぎたり、サイズ排除カラムが閉塞する場合があり、濃度が低いと１回の加水分解工程で加水分解することができる分岐型重合体の量が低下するため効率的ではない。
【００３７】
本発明に用いるサイズ排除カラムの直径は、５〜４０ｍｍ程度が好ましく、サイズ排除カラムの長さは、１５０〜６００ｍｍ程度が好ましい。カラムの直径及び長さが前記範囲より大きいと、大きい設備が必要になると共に使用する溶媒の量が多くなるためコストが上昇し、前記範囲より小さいと、通液させることができる分岐型重合体の量が制限されるため、製造効率が低くなる。
【００３８】
多孔性ポリマー粒子の粒径としては、１０μｍ以下、特に３〜８μｍ程度が好ましい。多孔性ポリマー粒子の粒径が大きい場合は、サイズ排除カラム内の圧力が上がりにくくなる。粒径が前記範囲を超える場合であっても、通液速度やサイズ排除カラムの長さを調節することにより、圧力を高くすることができるが、使用する溶媒の量、多孔性ポリマー粒子の量が多くなったり、大きな設備が必要になるため好ましくない。この加水分解工程においては、加水分解による側鎖の分解の他に、せん断応力によって側鎖が切断される分解も生じていると考えられる。このせん断応力は、粒径が前記範囲内である多孔性ポリマー粒子を用いた場合に、より効率的に生じると考えられる。
【００３９】
サイズ排除カラムの理論段数は、１，０００〜６，０００／１０ｃｍ程度が好ましい。理論段数が大きいと、より純度が高い遺伝子導入剤を得ることができるが、加水分解工程に要する時間が長くなり、理論段数が小さいと、得られる遺伝子導入剤の純度が低下する場合がある。このようなサイズ排除カラムは１種を単独で用いてよく、異なる種類の２種以上のサイズ排除カラムを連結して用いてもよい。
【００４０】
本発明のサイズ排除カラムを用いる加水分解における処理条件は、サイズ排除カラムに充填されている多孔性ポリマー粒子の種類により個々に異なり、また、同じ多孔性ポリマー粒子を用いた場合であっても、用いる溶媒等に応じて、都度、効率的な加水分解を行うことができるように条件設定を行う必要があり、一概に規定することはできないが、例えば、以下（１），（２）における処理条件を利用することができる。なお、以下（１），（２）は、本発明における処理条件の一例を挙げるものであり、本発明に係る加水分解工程は、サイズ排除カラムを用いて、前述の分岐型重合体の加水分解を行う範囲において何ら、以下のものに限定されるものではない。
【００４１】
（１）多孔性ポリマー粒子が、スチレン/ジビニルベンゼン共重合体からなる場合
≪移動相（溶媒）≫
スチレン/ジビニルベンゼン共重合体からなる多孔性ポリマー粒子が充填されたサイズ排除カラムを用いる場合の溶媒としては、ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）、酢酸エチル、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、ジオキサン、ジメチルアセトアミド、キシレン、トルエンが好ましい。この多孔性ポリマー粒子は、他の多孔性ポリマー粒子に比べて硬いため、このような溶媒を用いることにより、サイズ排除カラム内の圧力を上昇させやすい。
【００４２】
≪多孔性ポリマー粒子の孔径≫
スチレン／ジビニルベンゼン共重合体からなる多孔性ポリマーの孔径は、５〜１，０００ｎｍ程度、特に３０〜６００ｎｍ程度が好ましい。
【００４３】
≪温度≫
サイズ排除カラムの温度としては、３０℃以上、例えば４０〜８０℃程度、特に４０〜６０℃程度が好ましい。温度を前記範囲内とすることにより、室温との差が適当であるため温度制御が容易であり、トラブルなく安定して分離が行える。なお、温度を上げることで移動相の粘度が下がり、カラム内圧が低下するが、流速を上げる又は粘度の高い移動相を利用するなど当業者により適宜調整を行うことが可能である。
【００４４】
（２）多孔性ポリマーがポリビニルアルコールやポリアクリルアミドなどの親水性ポリマー基材からなる場合
≪移動相（溶媒）≫
ポリビニルアルコールやポリアクリルアミドなどからなる多孔性ポリマーが充填されたサイズ排除カラムを用いる場合の溶媒としては、水、メタノール、エタノール、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ＤＭＳＯ、ＤＭＦが好ましい。この多孔性ポリマーは、他の多孔性ポリマーに比べて極性溶媒との親和性が高く、このような溶媒を用いることにより、サイズ排除カラム内の圧力を上昇させやすい。さらに、臭化リチウムなどの無機塩類を５０ｍＭ以下の範囲で混合することでも移動相の粘度が上昇し、サイズ排除カラム内の圧力を上昇させやすい。過剰に無機塩類を混合すると回収した遺伝子導入剤の精製が複雑になる可能性が高く好ましくない。
【００４５】
≪多孔性ポリマーの孔径≫
ポリビニルアルコールやポリアクリルアミドなどからなる多孔性ポリマーの孔径は、５０〜５，０００ｎｍ程度、特に１００〜１，０００ｎｍ程度が好ましい。
【００４６】
≪温度≫
サイズ排除カラムの温度としては、前記のスチレン／ジビニルベンゼン共重合体からなる多孔性ポリマーを使用した場合におけるサイズ排除カラムの温度と同じ温度にすることが好ましい。
【００４７】
本発明においては、移動相にジエチルアミンなどの２級アミンや、エタノールアミンなどの１級アミンを添加してもよい。特に、移動相として、トルエンやクロロホルムなどの無極性溶媒を用いた場合に前記アミンを添加することが好ましい。このようなアミンは、分岐鎖の一部を分解する際の良好なプロトン供与体として作用し、多孔性ポリマーからの水素引き抜き反応や、ポリマー鎖同士での水素引き抜き反応を抑制するため、分岐鎖の分解反応が優先的に生じると考えられる。また、このようなアミンを用いることは、ＤＡＡＡＭに含まれる３級アミンを保護することができる点、及び低分子量で沸点が低く、カチオン性ポリマーの側鎖と化学的に結合することもないので、回収した遺伝子導入剤を容易に精製できる点で好ましい。
【００４８】
本発明においては、水を使用することなく製造することができるため、加水分解工程終了後に生じる加水分解を極力抑えることができる。即ち、水を用いる透析により加水分解を行う場合には、加水分解工程終了後、水による意図しない加水分解反応が進行してしまうことがあり、この加水分解により生じたアルコールが遺伝子導入剤に混入し、遺伝子導入剤の純度が低下する場合があったが、本発明によればこの問題を回避することができる。
【００４９】
この方法により製造された遺伝子導入剤は、前述の通り、ＤＡＡＡＭに由来する構成単位を含むポリマー鎖よりなる分岐鎖を有するものであり、この分岐鎖中のＤＡＡＡＭ単位の一部が加水分解されているため、この加水分解により生成したアニオン性の官能基により、遺伝子導入剤全体が親水性を示し、血清中のアニオン性タンパクや、脂質を吸着することが少なく、血清を含む培地であっても、効率的に遺伝子を導入することができる。
【００５０】
［分岐型重合体製造工程］
本発明において用いる分岐型重合体は、Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、このイニファターに少なくともＤＡＡＡＭを光照射リビング重合させたものが好ましい。
【００５１】
なお、本明細書において、イニファターとは、光照射によりラジカルを発生させる重合開始剤、連鎖移動剤としての機能と共に、成長末端と結合して成長を停止する機能、さらに光照射が停止すると重合を停止させる重合開始・重合停止剤として機能する分子のことである。
【００５２】
この分岐型重合体製造工程に用いるＤＡＡＡＭ、すなわち、２−Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノアルキルメタクリレートは、炭素数１〜３程度の２つのアルキル基と、炭素数１又は２のアルキレン基を有するジアルキルアミノアルキルアルコールと、メタクリル酸とのエステルであることが好ましい。このようなジアルキルアミノアルキルメタクリレートとしては、前述の２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及びその誘導体が好ましい。
【００５３】
イニファターとなるＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する芳香族化合物としては、ベンゼン環に該Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基、好ましくはＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が３個以上分岐鎖として結合しているものが好適であり、具体的には次が例示される。即ち、３分岐鎖化合物としては、１，３，５−トリ（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，３，５−トリ（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、４分岐鎖化合物としては、１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、６分岐鎖化合物としては、ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られるヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンが挙げられる。なお、ここで、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基に含まれるジアルキル部分のアルキル基としては、エチル基等の炭素数２〜１８個のアルキル基が好ましいが、アルキル基に限らず、フェニル基など芳香族系の炭化水素基であっても構わない。即ち、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基に限らず、Ｎ，Ｎ−ジアリールジチオカルバミルメチル基等を含む、脂肪族炭化水素基及び／又は芳香族炭化水素基で置換されたＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基であれば目的を達成することができる。
【００５４】
上記のイニファターは、アルコール等の極性溶媒に対しては殆ど不溶であるが、非極性溶媒には易溶である。この非極性溶媒としては炭化水素、ハロゲン化アルキル又はハロゲン化アルキレンが好適であり、特に、ベンゼン、トルエン、クロロホルム又は塩化メチレン特にトルエンが好適である。
【００５５】
イニファターと上記ＤＡＡＡＭとを反応させるには、イニファター、及びＤＡＡＡＭを含んでなる原料溶液を調製し、これに光照射することによって、イニファターに対し、ＤＡＡＡＭが結合した反応生成物を生成させる。
【００５６】
該原料溶液中のＤＡＡＡＭの濃度は０．５Ｍ以上、例えば０．５Ｍ〜２．５Ｍが好適であり、イニファターの濃度は１〜２０ｍＭ程度が好適である。
【００５７】
照射する光の波長は２５０〜４００ｎｍが好適であり、例えばショートアークキセノンランプ、低圧水銀灯、高圧水銀灯などを用いることができる。光の照射時間は照射強度にも依存するが、１〜９０分程度が好適であり、１μＷ／ｃｍ２〜１０ｍＷ／ｃｍ２程度の低い照射強度で１〜６０分程度が特に好適である。
【００５８】
この光照射により、反応液中に目的とする分岐型重合体が生成するので、必要に応じ精製することにより、分岐鎖部分にＤＡＡＡＭ単位よりなるポリマー鎖が導入され、分岐鎖の末端がＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基であるホモポリマーを得る。
【００５９】
この分岐型重合体の分岐鎖の１本当たりの分子量としては、３００〜１００，０００程度、特に３，０００〜６０，０００程度が好ましい。この分子量は、光照射の時間を制御することにより調整することができる。即ち、反応時間を長くすることにより、重合反応を進行させて分子量の大きい分岐型重合体を得ることができる。
【００６０】
なお、本明細書において、分子量とは、ＧＰＣ（ゲルパーミエーションクロマトグラフィー）によるポリエチレングリコール換算の数平均分子量をさす。
【００６１】
本発明に係る分岐型重合体の分岐鎖は、前述のＤＡＡＡＭのみからなるホモポリマーであることが好ましいが、ＤＡＡＡＭとＤＡＡＡＭとは異なる１種以上のモノマーを導入したブロックコポリマー又はランダムコポリマーであってもよい。
【００６２】
この場合の他のモノマーとしては、アクリル酸誘導体、スチレン誘導体等のビニル系モノマーが好適であり、具体的には、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣ３Ｈ６Ｎ（ＣＨ３）２、４−Ｎ，Ｎ-ジメチルアミノスチレン、及び４−アミノスチレンの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種のビニル系モノマーが挙げられ、特に、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣ３Ｈ６Ｎ（ＣＨ３）２等のカチオン性ビニル系モノマーが好ましい。これらのビニル系モノマーは１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
【００６３】
イニファターとＤＡＡＡＭとＤＡＡＡＭとは異なるモノマーとを反応させるには、前述のイニファターとＤＡＡＡＭとを反応させる場合と同様に、イニファター、ＤＡＡＡＭ、及びＤＡＡＡＭ以外のモノマーを含んでなる原料溶液を調製し、これに光照射することによって、イニファターに対し、ＤＡＡＡＭ及びＤＡＡＡＭ以外のモノマーが結合したランダムコポリマーを得る。
【００６４】
また、上記イニファターに対し、まず、ＤＡＡＡＭをブロック重合させて、ホモポリマーを形成し、その後、このホモポリマーに３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドをブロック重合させ、分岐鎖の基端側をＤＡＡＡＭのブロックポリマー、分岐鎖の先端側を３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドブロックポリマーで構成した分岐鎖としてもよい。このように、分岐鎖を２種類以上のモノマーのブロックコポリマーとする場合、イニファターに対する重合の順序は任意である。いずれの場合も分岐鎖の末端は、Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基となる。
【００６５】
［２］遺伝子導入剤
本発明の遺伝子導入剤の製造方法により製造される遺伝子導入剤（加水分解後の分岐型重合体）は、ＬＣＳＴ（Lower Critical Solution Temperature）が、３６℃以上であることが好ましく、特に３７〜６０℃程度、とりわけ４０〜５０℃程度であることが好ましい。このＬＣＳＴが上記下限未満であると、細胞培養環境下において、遺伝子導入剤が疎水性を示すため、この遺伝子導入剤と核酸とからなる核酸複合体同士、もしくは、核酸複合体と血清に含まれる疎水性物質とが凝集することにより遺伝子導入効率が低下する。また、核酸複合体が血清中の疎水性物質可溶化成分の影響を受ける場合や、ポリスチレン製シャーレに吸着されやすくなるなどの不具合が生じるおそれがある。また、ＬＣＳＴが上記上限を超える場合は、遺伝子導入剤が遺伝子導入剤の分子内及び／又は分子間でイオン結合性に凝集したり、遺伝子導入剤がアニオン性高分子である核酸と複合体を形成しにくくなる。なお、前記加水分解を過度に行うと、側鎖のアニオン性部位が多くなり、本来、カチオン性高分子である遺伝子導入剤がアニオン性に変化し、ＬＣＳＴが上記上限を超え易くなる。従って、ＬＣＳＴが上記範囲内、即ち３６℃以上であれば効率的に細胞に遺伝子を導入することができる。なお、ＬＣＳＴの測定方法は、後述の実施例の項に記載される通りである。
【００６６】
遺伝子導入剤（加水分解工程後の分岐型重合体）の分岐鎖１本当たりの分子量としては、３００〜１００，０００程度、特に１，０００〜６０，０００程度が好ましいが、この遺伝子導入剤に含まれるＤＡＡＡＭ単位の合計の分子量は、分岐鎖の鎖数にもよるが、１，２００〜５９０，０００程度、特に１０，０００〜２５０，０００程度が好ましい。この場合の遺伝子導入剤に含まれるＤＡＡＡＭ単位の合計の分子量とは、加水分解されていないＤＡＡＡＭ単位と、加水分解されたＤＡＡＡＭ単位の合計の分子量である。
【００６７】
なお、この遺伝子導入剤（加水分解後の分岐型重合体）に含まれるＤＡＡＡＭ単位のうち、加水分解されているＤＡＡＡＭの割合は、上述のＬＣＳＴを満足し得る程度であればよく、特に制限はない。即ち、本発明においては、前述の分岐型重合体を上述のＬＣＳＴを満たすように加水分解を行うことが好ましい。この加水分解の程度は、上述の透析による加水分解において、透析時間を調整することにより容易に制御することができ、即ち、透析時間が長い程、加水分解率が高く、従って、ＬＣＳＴが高く、親水性の高い遺伝子導入剤を得ることができる。
【００６８】
また、遺伝子導入剤の分子量としては、２，０００〜６００，０００程度、特に１０，０００〜３００，０００程度が好ましい。
【００６９】
［３］核酸複合体
上記の遺伝子導入剤（ベクター）が核酸を核酸含有複合体として包囲することによって、生体内の酵素による核酸の失活、分解を抑制することができる。
【００７０】
上記遺伝子導入剤と核酸とを複合させるには、遺伝子導入剤の濃度０．１〜１０００μｇ／ｍＬ程度の溶液に対し、核酸を添加し、混合すればよい。核酸に対して遺伝子導入剤を過剰量添加し、核酸に対して遺伝子導入剤を飽和状態にして遺伝子導入剤と核酸とを複合化することが好ましい。
【００７１】
核酸の好ましい例としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子），ｐ５３癌抑制遺伝子及びＢＲＣＡ１癌抑制遺伝子やサイトカイン遺伝子としてＴＮＦ−α遺伝子，ＩＬ−２遺伝子，ＩＬ−４遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子，ＩＬ−７遺伝子，ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子，ＩＦＮ−γ遺伝子及びＩＬ−１２遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｇｐ−１００，ＭＡＲＴ−１及びＭＡＧＥ−１などの癌抗原ペプチド遺伝子が癌治療に利用できる。
【００７２】
また、ＶＥＧＦ遺伝子，ＨＧＦ遺伝子及びＦＧＦ遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｃ−ｍｙｃアンチセンス，ｃ−ｍｙｂアンチセンス，ｃｄｃ２キナーゼアンチセンス，ＰＣＮＡアンチセンス，Ｅ２Ｆデコイやｐ２１（ｓｄｉ−１）遺伝子が血管治療に利用できる。かかる一連の遺伝子は当業者には良く知られたものである。
【００７３】
核酸複合体の粒径は５０〜４００ｎｍ程度が好適である。この粒径は、例えばレーザを用いた動的光散乱法によって測定される。粒径がこれよりも小さいと、核酸複合体内部の核酸にまで酵素の作用が及ぶおそれ、あるいは腎臓にて濾過排出されるおそれがある。また、これよりも大きいと、細胞に導入されにくくなるおそれがある。
【００７４】
核酸は、細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で用いる。例えばＤＮＡの場合、導入された細胞内で当該ＤＮＡが転写され、それにコードされるポリペプチドの産生を経て機能発現されるように当該ＤＮＡが配置されたプラスミドとして用いる。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、所望の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列されている。
【００７５】
所望により２種以上の核酸をひとつのプラスミドに含めることも可能である。
【００７６】
核酸を導入する対象として望ましい「細胞」としては、当該核酸の機能発現が求められるものであり、このような細胞としては、例えば使用する核酸（すなわちその機能）に応じて種々選択され、例えば心筋細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、骨格筋細胞、血管内皮細胞、骨髄細胞、骨細胞、血球幹細胞、血球細胞等が挙げられる。また、単球、樹状細胞、マクロファージ、組織球、クッパー細胞、破骨細胞、滑膜Ａ細胞、小膠細胞、ランゲルハンス細胞、類上皮細胞、多核巨細胞等、消化管上皮細胞・尿細管上皮細胞などである。
【００７７】
この核酸複合体は培養試験に用いるほか、任意の方法で生体に投与することができる。
【００７８】
生体への投与方法としては静脈内又は動脈内への注入が特に好ましいが、筋肉内、脂肪組織内、皮下、皮内、リンパ管内、リンパ節内、体腔（心膜腔、胸腔、腹腔、脳脊髄腔等）内、骨髄内への投与の他に病変組織内に直接投与することも可能である。
【００７９】
この核酸複合体を有効成分とする医薬は、更に必要に応じて製剤上許容し得る担体（浸透圧調整剤，安定化剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤等）と混合することが可能である。これら担体は公知のものが使用できる。
【００８０】
また、この核酸複合体を有効成分とする医薬は、含まれる核酸の種類が異なる２種以上の核酸含有複合体を含めたものも包含される。このような複数の治療目的を併せ持つ医薬は、多様化する遺伝子治療の分野で特に有用である。
【００８１】
投与量としては、動物、特にヒトに投与される用量は目的の核酸、投与方法および治療される特定部位等、種々の要因によって変化する。しかしながら、その投与量は治療的応答をもたらすに十分であるべきである。
【００８２】
この核酸複合体は、好ましくは遺伝子治療に適用される。適用可能な疾患としては、当該複合体に含められる核酸の種類によって異なるが、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、動脈拡張術後再狭窄等の病変を生じる循環器領域での疾患に加え、癌（悪性黒色腫、脳腫瘍、転移性悪性腫瘍、乳癌等）、感染症（ＨＩＶ等）、単一遺伝病（嚢胞性線維症、慢性肉芽腫、α１−アンチトリプシン欠損症、Gaucher病等）等が挙げられる。
【実施例】
【００８３】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。
【００８４】
ｉ）イニファターの合成
イニファターとしての１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンを次のようにして合成した。
【００８５】
１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチルベンゼン）５．０ｇとＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム３４．０ｇをエタノール１００ｍＬ中へ加え、遮光下、室温で４日間攪拌した。沈殿物を濾過し、３Ｌのメタノール中に投入して３０分間攪拌した後、濾過した。この操作を繰り返し合計４回行った。沈殿物をトルエン２００ｍＬへ溶解した後、１００ｍＬのメタノールを加えて５０℃に加温し、冷蔵庫内で１５時間保管して再結晶させ、結晶を濾別後に大量のメタノールで洗浄した。結晶を室温で減圧乾燥して、白色の１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンの針状結晶を得た（収率９０％）。高速液体クロマトグラフィーにより、原料ピークが消失し、精製物が単一物質であることを確認した。
【００８６】
１Ｈ−ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）の測定結果は、δ１．２６−１．３１ｐｐｍ（ｔ，２４Ｈ，ＣＨ２ＣＨ３），δ３．６９−３．７７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ３．９９−４．０７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ４．５７ｐｐｍ（ｓ，８Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２），δ７．４９ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）であった。
【００８７】
【化１】
【００８８】
ii)４分岐型スター型重合体よりなる感温性カチオン性ホモポリマーの光重合による合成
２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートをモノマーとして用い、１，２，４，５−テトラキス［（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）ポリ（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）−メチル］ベンゼン（以下、ｐＤＭＡＥＭＡＡと記載することがある。）よりなる感温性カチオン性ホモポリマーの合成を行った。
【００８９】
即ち、上記ｉ)により合成した１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン４５．６ｍｇを２０ｍＬのトルエンへ溶解し、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート８．５ｇを加えて混合し、全量をトルエンで５０ｍＬに調整した。３ｍｍ厚軟質ガラスセル中で激しく攪拌しながら高純度窒素ガスで１０分間パージした後に、３００Ｗショートアークキセノンランプ（朝日分光社製、ＭＡＸ−３０１）で、波長２５０〜４００ｎｍの混合紫外線を６０分間照射した。照射強度は、ウシオ電機社のＵＩＴ−１５０へＵＶＤ−Ｃ４０５（検出波長範囲３２０〜４７０ｎｍ）を装着して２．５ｍＷ／ｃｍ２に調整した。重合溶液をエバポレーターで濃縮し、ｎ−ヘキサンで重合物を再沈殿させ、クロロホルム／ｎ−ヘキサン系で３回再沈殿を繰り返して精製し、ｎ−ヘキサンを蒸散させた後に少量のベンゼンへ溶解し、０．２μｍフィルターで濾過した後、凍結乾燥させて、目的とする４分岐型スター型重合体（ｐＤＭＡＥＭＡＡ）よりなる感温性カチオン性ホモポリマーを得た。この感温性カチオン性ホモポリマーのポリエチレングリコールを標準物質とした数平均分子量は、ＧＰＣにより、１１，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．４）と測定された。また、計算により分岐鎖１本当たりの分子量は、２５７０であることが分かった。
【００９０】
１Ｈ−ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤ３ＯＤ）の測定結果は、δ０．８−１．２ｐｐｍ（ｂｒ，３Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ３−），δ１．６−２．０ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ３−），δ２．２−２．４ｐｐｍ(ｂｒ，６Ｈ，Ｎ−ＣＨ３)，δ２．５−２．７ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＣＨ２−Ｎ），δ４．０−４．２ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，Ｏ−ＣＨ２）であった。
【００９１】
【化２】
【００９２】
iii)４分岐型スター型重合体よりなる感温性カチオン性ホモポリマーの側鎖の部分加水分解
＜液体クロマトグラフ装置による加水分解＞
上記ii）で合成した感温性カチオン性ホモポリマー０．３ｇを３ｍＬのクロロホルムへ溶解し、この溶液を高速液体クロマトグラフ装置（島津製作所製「ＬＣ−１０Ａｖｐシリーズ」）を用いて、表１に示すＰｒｏｔｏｃｏｌ−Ａ１〜Ａ５及びＢ１〜Ｂ６の条件で処理することにより側鎖の部分加水分解を行った。なお、いずれのＰｒｏｔｏｃｏｌにおいても、Ｓｈｏｄｅｘ社製のカラム２本を連結して用いた。各カラムの特性を表２に示す。
【００９３】
いずれのＰｒｏｔｏｃｏｌにおいても、ポリマー総溶出時間のうち、溶出開始から１０％、及び溶出終了から手前１０％以外の時間において溶出したポリマー成分を回収した。ポリマー成分の回収は４０分内に完了した。
【００９４】
＜ポリマーの精製＞
各Ｐｒｏｔｏｃｏｌにおいて、回収したポリマー溶液をそれぞれエバポレーターで濃縮し、ｎ−ヘキサン／ジエチルエーテル系で再沈殿させることにより、ポリマー成分を得、それぞれ少量のベンゼンに溶解させてから凍結乾燥することで各ポリマーの粉末を得た。各Ｐｒｏｔｏｃｏｌで得られた遺伝子導入剤の分子量、及びこの分子量より遺伝子導入剤の分岐鎖１本当たりの分子量を計算により求めた。結果をそれぞれ表１に示す。なお、Ｐｒｏｔｏｃｏｌ−Ａ５（比較例１−２）及びＢ６（比較例２−３）のポリマーは、溶媒に対して溶解しないものであったため、これらのポリマーについては分子量の測定及び後述の曇点の測定を行わなかった。
【００９５】
＜曇点の測定＞
各Ｐｒｏｔｏｃｏｌにより得られたポリマーの水溶液を調製し、この水溶液の温度を上昇させることにより溶液が白濁する温度（ＬＣＳＴ：曇点）の測定を行った。
【００９６】
即ち、各ホモポリマーの３重量％水溶液を調製し、これらの水溶液の２０〜６０℃の温度範囲における波長６００ｎｍの光の吸光度を測定した。結果を表１に示す。なお、加水分解を行っていない未処理のポリマーは、３２．０℃付近にＬＣＳＴを有していた。
【００９７】
【表１】
【００９８】
【表２】
【００９９】
表１より明らかなように、各Ｐｒｏｔｏｃｏｌにおいて、カラム内の圧力が大きく異なっていた。各カラムに充填される多孔性ポリマーの粒子径、移動相の種類、粘度、通液速度及びカラム温度の差異が、圧力損失に影響したと考えられる。
【０１００】
なお、ii）において合成した感温性カチオン性ホモポリマーの分岐鎖の予想される加水分解の化学式を示す。この化学式は、分岐鎖に含まれる２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート由来の構成単位１個分の加水分解を示したものである。
【０１０１】
【化３】
【０１０２】
＜考察＞
Ｐｒｏｔｏｃｏｌ−Ａ１，Ｂ１，Ｂ２（比較例１−１，２−１，２−２）は、カラム内の圧力が低く、ポリマー側鎖の分解が起こらなかったため、曇点（ＬＣＳＴ）に変化がなかったと考えられる。これに対して、Ｐｒｏｔｏｃｏｌ−Ａ３，Ａ４，Ｂ３，Ｂ４，Ｂ５（実施例１−２，１−３，２−１，２−２，２−３）は、圧力が高く、カラム内で分解が生じたため曇点（ＬＣＳＴ）が上昇したと考えられる。即ち、側鎖の部分的な加水分解によりアニオン性の官能基が露出し、温度の変化によりアミンが脱溶媒和しても親水性が維持されたため、水への溶解性が高まったと考えられる。
【０１０３】
なお、Ｐｒｏｔｏｃｏｌ−Ａ５，Ｂ６（比較例１−２，２−３）では、回収したポリマー成分が室温でも水に溶解しなかった。これは側鎖の加水分解が進行し過ぎて、ポリマー同士がイオン結合的に架橋、凝集し、ゲル化した、又は分解と同時に架橋反応がカラム内で生じ、水不溶性の成分となったためであると考えられる。Ｐｒｏｔｏｃｏｌ−Ａ５、Ｂ６により加水分解した重合体は、水への溶解性が低いことから、遺伝子導入剤として使用するのは困難であると考えられる。
【０１０４】
加水分解工程を透析により行う製造方法では、分岐型重合体を回収してから目的とする遺伝子導入剤を得るまでに５日程度要するが、本発明の遺伝子導入剤の製造方法によれば、１時間程度で済む。即ち、本発明の製造方法によれば、容易に、かつ短時間でポリマー側鎖の部分加水分解を行うことができ、目的とする遺伝子導入剤を得ることができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分岐鎖を有する分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤の製造方法に係り、詳しくは、血清を含む培地において優れた遺伝子導入活性を示す遺伝子導入剤を短時間で効率的に製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒト疾患の分子遺伝学的要因が明らかになるにつれ、遺伝子治療研究がますます重要視されている。遺伝子治療法は標的とする部位でのＤＮＡの発現を目的としており、いかにＤＮＡを標的部位に到達させるか、いかにＤＮＡを標的部位に効率的に導入し、当該部位で機能的に発現させるかということが重要となる。外来ＤＮＡの導入のためのベクターとして、合成高分子ベクター、カチオン性脂質ベクターが研究開発されている。
【０００３】
本出願人らは、ＤＮＡを細胞中に運搬するための合成高分子ベクターとして、ベンゼンなどの芳香環を核としてカチオン性ポリマー鎖が放射状に伸延する分岐構造のベクターがＤＮＡを高密度で凝縮させて小さな核酸複合体微粒子を形成させ、効率良く細胞へ遺伝子導入できることを見出し、先に特許出願した（特許文献１，２）。
【０００４】
上記特許文献１，２に記載されるベンゼン環から放射状にポリマー鎖が伸延する遺伝子導入剤は、同じモノマーユニットからなる線形ポリマーと比較して、その構造上、電荷密度を高く配置することが可能である。このため、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸との複合体をより強く凝集させることが可能であり、より強く酵素などの作用から核酸を保護できるポリプレックス粒子を形成させることができ、遺伝子導入活性が向上した。しかしながら、このカチオン性ポリマーを含む遺伝子導入剤は、細胞を培養するのに最適な環境である血清を含む培地において、高い遺伝子導入活性を示さない。これは、上述のカチオン性ポリマーを含む遺伝子導入剤が、ｐＨが７程度の中性条件下にあっても高いゼーター電位を有しているため、核酸を凝集することができるが、血清中のアニオン性のタンパクなども吸着・凝集してマクロ粒子を形成してしまい、細胞内に取り込まれにくくなったり、ＤＮＡがトランスポーターに認識されにくくなるためであると考えられる。
【０００５】
本出願人らは、血清を含む培地においても効率的に遺伝子を導入することができる遺伝子導入剤として、所定温度未満ではカチオン性を示し、所定温度以上では遺伝子導入剤全体として親水性を示す感温性カチオン性ポリマーからなる遺伝子導入剤を見出し、先に特許出願した（特許文献３）。
【０００６】
特許文献３に記載される遺伝子導入剤は、少なくとも２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体を重合してなる重合体を分岐型重合体の分岐鎖として導入し、この分岐鎖の一部を加水分解しているため、血清を含む培地において細胞に遺伝子を導入する場合であっても、効率的に遺伝子を導入することができる。即ち、この特許文献３の遺伝子導入剤にあっては、加水分解により生成したアニオン性官能基の効果により、遺伝子導入剤全体としては親水性を示すようになるため、これにより、血清を含む培地においても、アニオン性タンパクや、血清中の脂質などを吸着することなく、高い遺伝子導入活性を示す。この特許文献３の実施例では、前述の加水分解を、ＲＯ水を透析液として、２５℃で１２０時間透析することにより行っている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ２００４／０９２３８８号公報
【特許文献２】特開２００７−７０５７９号公報
【特許文献３】特願２００９−２２７４０５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
この特許文献３に記載される遺伝子導入剤は、優れた遺伝子導入活性を示すものであり、遺伝子導入剤としての有用性が高いものであるが、製造に必要な時間が長いため、製造時間を短縮することが望まれる。即ち、一般的な加水分解では、反応溶液を加温することにより反応を促進させることができるが、特許文献３に係る分岐型重合体は、加温すると当該分岐型重合体が水中で脱溶媒和され、グロビュール構造のコロイド粒子を形成し、水との親和性が低下するため、分子全体を均一に加水分解することができなくなると共に、特にコロイド粒子の内郭部分の加水分解が進行しにくくなる。従って、特許文献３では、分岐型重合体が水に対して均一に溶解する温度で透析することにより加水分解を行っているが、この温度では加水分解が進行しにくく、製造に時間がかかるため、更なる改善が望まれている。
【０００９】
本発明は上記従来の実状に鑑みてなされたものであり、特許文献３におけるような分岐型重合体の加水分解に要する時間を短縮し、血清を含む培地において優れた遺伝子導入活性を示す遺伝子導入剤を効率的に製造することができる遺伝子導入剤の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明（請求項１）の遺伝子導入剤の製造方法は、分岐鎖を有する分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤を製造する方法において、芳香環に該芳香環から放射状に伸延する、少なくとも２−Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノアルキルメタクリレート及び／又はその誘導体を重合してなる複数の分岐鎖を導入することにより分岐型重合体を製造する分岐型重合体製造工程と、得られた分岐型重合体を加水分解する加水分解工程とを有する遺伝子導入剤の製造方法であって、該加水分解工程は、サイズ排除カラムに、該分岐型重合体を含む溶液を通液する工程を含むことを特徴とするものである。
【００１１】
請求項２の遺伝子導入剤の製造方法は、請求項１において、前記サイズ排除カラム内の圧力が３０〜８０ｋｇ／ｃｍ２であることを特徴とするものである。
【００１２】
請求項３の遺伝子導入剤の製造方法は、請求項１又は２において、前記サイズ排除カラムは、多孔性ポリマー粒子が充填されたものであることを特徴とするものである。
【００１３】
請求項４の遺伝子導入剤の製造方法は、請求項３において、前記多孔性のポリマー粒子は、粒径が１０μｍ以下であることを特徴とするものである。
【００１４】
請求項５の遺伝子導入剤の製造方法は、請求項３又は４において、前記多孔性ポリマー粒子は、スチレン／ジビニルベンゼン共重合体、ポリビニルアルコール、及びポリアクリルアミドからなる群から選択される１種以上であることを特徴とするものである。
【００１５】
請求項６の遺伝子導入剤の製造方法は、請求項５において、前記多孔性ポリマー粒子がスチレン／ジビニルベンゼン共重合体であり、サイズ排除カラム内の圧力が４０〜８０ｋｇ／ｃｍ２であることを特徴とするものである。
【００１６】
請求項７の遺伝子導入剤の製造方法は、請求項５において、前記多孔性ポリマー粒子がポリビニルアルコールであり、サイズ排除カラム内の圧力が３０〜４０ｋｇ／ｃｍ２であることを特徴とするものである。
【００１７】
請求項８の遺伝子導入剤の製造方法は、請求項１ないし７のいずれか１項において、前記サイズ排除カラムの理論段数が、１，０００／１０ｃｍ以上であることを特徴とするものである。
【００１８】
請求項９の遺伝子導入剤の製造方法は、請求項１ないし８のいずれか１項において、前記遺伝子導入剤のＬＣＳＴ（Lower Critical Solution Temperature）が、３７〜６０℃であることを特徴とするものである。
【００１９】
請求項１０の遺伝子導入剤の製造方法は、請求項１ないし９のいずれか１項において、前記分岐型重合体は、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これに少なくとも前記２−Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノアルキルメタクリレート及び／又はその誘導体を光照射リビング重合させてなるものであることを特徴とするものである。
【００２０】
請求項１１の遺伝子導入剤の製造方法は、請求項１０において、前記Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物は、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が結合したものであることを特徴とするものである。
【００２１】
請求項１２の遺伝子導入剤の製造方法は、請求項１ないし１１のいずれか１項において、前記遺伝子導入剤の分子量は、２，０００〜６００，０００であることを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の遺伝子導入剤の製造方法では、少なくとも２−Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノアルキルメタクリレート及び／又はその誘導体（以下、２−Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノアルキルメタクリレート及び／又はその誘導体を、「ＤＡＡＡＭ」と称す場合がある。）を重合してなる分岐鎖のＤＡＡＡＭ由来の構成単位（以下、ＤＡＡＡＭ由来の構成単位を、「ＤＡＡＡＭ単位」と称す場合がある。）の加水分解を、サイズ排除カラムを利用して、短時間で行うことができる。また、加水分解をサイズ排除カラムで行うため、加水分解と同時に遺伝子導入剤を精製することもできる。
【００２３】
前記圧力は、３０〜８０ｋｇ／ｃｍ２であることが好ましい（請求項２）。圧力が前記範囲内であれば、より一層加水分解の時間の短縮を図ることができる。
【００２４】
前記サイズ排除カラムとしては、多孔性ポリマー粒子が充填されたものであることが好ましく（請求項３）、この多孔性のポリマー粒子は、粒径が１０μｍ以下であることが好ましい（請求項４）。
【００２５】
前記多孔性ポリマー粒子は、スチレン／ジビニルベンゼン共重合体、ポリビニルアルコール、及びポリアクリルアミドからなる群から選択される１種以上であることが好ましい（請求項５）。
【００２６】
前記多孔性ポリマー粒子として、スチレン／ジビニルベンゼン共重合体の粒子を用いた場合、サイズ排除カラム内の圧力は４０〜８０ｋｇ／ｃｍ２であることが好ましく（請求項６）、多孔性ポリマー粒子としてポリビニルアルコールの粒子を用いた場合、サイズ排除カラム内の圧力は３０〜４０ｋｇ／ｃｍ２が好ましい（請求項７）。
【００２７】
前記サイズ排除カラムの理論段数は、１，０００／１０ｃｍ以上であることが好ましい（請求項８）。理論段数が前記範囲内であれば、短時間で加水分解を行うことができると共に、加水分解により生じたアルコールと、目的とする遺伝子導入剤とを分離することができる。
【００２８】
前記遺伝子導入剤のＬＣＳＴ（Lower Critical Solution Temperature）は、３７〜６０℃であることが好ましい（請求項９）。遺伝子導入剤のＬＣＳＴが、３６℃以上、特に３７〜６０℃であると、細胞を培養するために最適な温度である３５〜３７℃の条件において、遺伝子導入剤が部分的には疎水性を示すが、全体としては親水性を示し、遺伝子導入剤同士の凝集が生じない。これにより、この遺伝子導入剤からなる核酸複合体も、血清中の疎水性物質や、核酸複合体同士の凝集も生じにくくなり、また、血清に含まれるコレステロールやアルブミンなどの疎水性物質を可溶化する成分などの影響も受けにくくなり、さらに、疎水性のポリスチレン製シャーレへの吸着も防止される。
【００２９】
前記分岐型重合体は、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これに少なくとも前記ＤＡＡＡＭを光照射リビング重合させてなるものであることが好ましく（請求項１０）、前記Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物は、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が結合したものであることが好ましい（請求項１１）。
【００３０】
前記遺伝子導入剤の分子量は、２，０００〜６００，０００であることが好ましい（請求項１２）。遺伝子導入剤の分子量が上記範囲内であると、高分子量化を抑えた上で、より効率的に遺伝子導入剤と核酸とを複合化させることができ、低分子量で遺伝子導入効率に優れた遺伝子導入剤を得ることができる。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下に、本発明の実施の形態を詳細に説明する。
【００３２】
［１］遺伝子導入剤の製造方法
本発明の遺伝子導入剤の製造方法は、芳香環に放射状に伸延する、ＤＡＡＡＭを重合してなる複数の分岐鎖を導入する分岐型重合体製造工程と、この工程により得られた分岐型重合体を加水分解する加水分解工程とを有するものであって、この加水分解工程が、サイズ排除カラムに該分岐型重合体を含む溶液を通液する工程を含むことを特徴とする。
【００３３】
本発明の遺伝子導入剤の製造方法によれば、分岐型重合体を含む溶液をサイズ排除カラムに通液するという簡単な操作で、短時間で、目的とする遺伝子導入剤を得ることができると共に、精製を行うこともできる。
【００３４】
本発明の遺伝子導入剤の製造方法を説明するにあたり、まず、加水分解工程について説明し、次いで、分岐型重合体製造工程について説明する。
【００３５】
［加水分解工程］
本発明の遺伝子導入剤の製造方法に係る加水分解工程においては、具体的には、分岐型重合体を含む溶液を、多孔性ポリマー粒子を充填したサイズ排除カラムに通液することにより、分岐型重合体の加水分解を行うことができる。
【００３６】
本発明における分岐型重合体を含む溶液の通液速度は、０．１ｍＬ／分以上、例えば０．１〜１０ｍＬ／分程度、特に０．５〜５．０ｍＬ／分程度であることが好ましく、サイズ排除カラム内の圧力は、一般的に３０ｋｇ／ｃｍ２以上、特に５０〜７０ｋｇ／ｃｍ２程度とすることが好ましい。また、前記多孔性ポリマー粒子として、スチレン／ジビニルベンゼン共重合体からなる粒子を用いた場合には、サイズ排除カラム内の圧力を４０〜８０ｋｇ／ｃｍ２に調整することが好ましく、多孔性ポリマー粒子としてポリビニルアルコールからなる粒子を用いた場合にあっては、サイズ排除カラム内の圧力を３０〜４０ｋｇ／ｃｍ２に調整することが好ましい。通液速度、圧力が前記範囲内であれば、より短時間で加水分解を行うことができる。前記溶液の分岐型重合体の濃度は、１〜３００ｇ／Ｌ、１０〜１００ｇ／Ｌ程度が好ましい。分岐型重合体の濃度が高いと、圧力が高くなり過ぎたり、サイズ排除カラムが閉塞する場合があり、濃度が低いと１回の加水分解工程で加水分解することができる分岐型重合体の量が低下するため効率的ではない。
【００３７】
本発明に用いるサイズ排除カラムの直径は、５〜４０ｍｍ程度が好ましく、サイズ排除カラムの長さは、１５０〜６００ｍｍ程度が好ましい。カラムの直径及び長さが前記範囲より大きいと、大きい設備が必要になると共に使用する溶媒の量が多くなるためコストが上昇し、前記範囲より小さいと、通液させることができる分岐型重合体の量が制限されるため、製造効率が低くなる。
【００３８】
多孔性ポリマー粒子の粒径としては、１０μｍ以下、特に３〜８μｍ程度が好ましい。多孔性ポリマー粒子の粒径が大きい場合は、サイズ排除カラム内の圧力が上がりにくくなる。粒径が前記範囲を超える場合であっても、通液速度やサイズ排除カラムの長さを調節することにより、圧力を高くすることができるが、使用する溶媒の量、多孔性ポリマー粒子の量が多くなったり、大きな設備が必要になるため好ましくない。この加水分解工程においては、加水分解による側鎖の分解の他に、せん断応力によって側鎖が切断される分解も生じていると考えられる。このせん断応力は、粒径が前記範囲内である多孔性ポリマー粒子を用いた場合に、より効率的に生じると考えられる。
【００３９】
サイズ排除カラムの理論段数は、１，０００〜６，０００／１０ｃｍ程度が好ましい。理論段数が大きいと、より純度が高い遺伝子導入剤を得ることができるが、加水分解工程に要する時間が長くなり、理論段数が小さいと、得られる遺伝子導入剤の純度が低下する場合がある。このようなサイズ排除カラムは１種を単独で用いてよく、異なる種類の２種以上のサイズ排除カラムを連結して用いてもよい。
【００４０】
本発明のサイズ排除カラムを用いる加水分解における処理条件は、サイズ排除カラムに充填されている多孔性ポリマー粒子の種類により個々に異なり、また、同じ多孔性ポリマー粒子を用いた場合であっても、用いる溶媒等に応じて、都度、効率的な加水分解を行うことができるように条件設定を行う必要があり、一概に規定することはできないが、例えば、以下（１），（２）における処理条件を利用することができる。なお、以下（１），（２）は、本発明における処理条件の一例を挙げるものであり、本発明に係る加水分解工程は、サイズ排除カラムを用いて、前述の分岐型重合体の加水分解を行う範囲において何ら、以下のものに限定されるものではない。
【００４１】
（１）多孔性ポリマー粒子が、スチレン/ジビニルベンゼン共重合体からなる場合
≪移動相（溶媒）≫
スチレン/ジビニルベンゼン共重合体からなる多孔性ポリマー粒子が充填されたサイズ排除カラムを用いる場合の溶媒としては、ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）、酢酸エチル、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、ジオキサン、ジメチルアセトアミド、キシレン、トルエンが好ましい。この多孔性ポリマー粒子は、他の多孔性ポリマー粒子に比べて硬いため、このような溶媒を用いることにより、サイズ排除カラム内の圧力を上昇させやすい。
【００４２】
≪多孔性ポリマー粒子の孔径≫
スチレン／ジビニルベンゼン共重合体からなる多孔性ポリマーの孔径は、５〜１，０００ｎｍ程度、特に３０〜６００ｎｍ程度が好ましい。
【００４３】
≪温度≫
サイズ排除カラムの温度としては、３０℃以上、例えば４０〜８０℃程度、特に４０〜６０℃程度が好ましい。温度を前記範囲内とすることにより、室温との差が適当であるため温度制御が容易であり、トラブルなく安定して分離が行える。なお、温度を上げることで移動相の粘度が下がり、カラム内圧が低下するが、流速を上げる又は粘度の高い移動相を利用するなど当業者により適宜調整を行うことが可能である。
【００４４】
（２）多孔性ポリマーがポリビニルアルコールやポリアクリルアミドなどの親水性ポリマー基材からなる場合
≪移動相（溶媒）≫
ポリビニルアルコールやポリアクリルアミドなどからなる多孔性ポリマーが充填されたサイズ排除カラムを用いる場合の溶媒としては、水、メタノール、エタノール、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ＤＭＳＯ、ＤＭＦが好ましい。この多孔性ポリマーは、他の多孔性ポリマーに比べて極性溶媒との親和性が高く、このような溶媒を用いることにより、サイズ排除カラム内の圧力を上昇させやすい。さらに、臭化リチウムなどの無機塩類を５０ｍＭ以下の範囲で混合することでも移動相の粘度が上昇し、サイズ排除カラム内の圧力を上昇させやすい。過剰に無機塩類を混合すると回収した遺伝子導入剤の精製が複雑になる可能性が高く好ましくない。
【００４５】
≪多孔性ポリマーの孔径≫
ポリビニルアルコールやポリアクリルアミドなどからなる多孔性ポリマーの孔径は、５０〜５，０００ｎｍ程度、特に１００〜１，０００ｎｍ程度が好ましい。
【００４６】
≪温度≫
サイズ排除カラムの温度としては、前記のスチレン／ジビニルベンゼン共重合体からなる多孔性ポリマーを使用した場合におけるサイズ排除カラムの温度と同じ温度にすることが好ましい。
【００４７】
本発明においては、移動相にジエチルアミンなどの２級アミンや、エタノールアミンなどの１級アミンを添加してもよい。特に、移動相として、トルエンやクロロホルムなどの無極性溶媒を用いた場合に前記アミンを添加することが好ましい。このようなアミンは、分岐鎖の一部を分解する際の良好なプロトン供与体として作用し、多孔性ポリマーからの水素引き抜き反応や、ポリマー鎖同士での水素引き抜き反応を抑制するため、分岐鎖の分解反応が優先的に生じると考えられる。また、このようなアミンを用いることは、ＤＡＡＡＭに含まれる３級アミンを保護することができる点、及び低分子量で沸点が低く、カチオン性ポリマーの側鎖と化学的に結合することもないので、回収した遺伝子導入剤を容易に精製できる点で好ましい。
【００４８】
本発明においては、水を使用することなく製造することができるため、加水分解工程終了後に生じる加水分解を極力抑えることができる。即ち、水を用いる透析により加水分解を行う場合には、加水分解工程終了後、水による意図しない加水分解反応が進行してしまうことがあり、この加水分解により生じたアルコールが遺伝子導入剤に混入し、遺伝子導入剤の純度が低下する場合があったが、本発明によればこの問題を回避することができる。
【００４９】
この方法により製造された遺伝子導入剤は、前述の通り、ＤＡＡＡＭに由来する構成単位を含むポリマー鎖よりなる分岐鎖を有するものであり、この分岐鎖中のＤＡＡＡＭ単位の一部が加水分解されているため、この加水分解により生成したアニオン性の官能基により、遺伝子導入剤全体が親水性を示し、血清中のアニオン性タンパクや、脂質を吸着することが少なく、血清を含む培地であっても、効率的に遺伝子を導入することができる。
【００５０】
［分岐型重合体製造工程］
本発明において用いる分岐型重合体は、Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、このイニファターに少なくともＤＡＡＡＭを光照射リビング重合させたものが好ましい。
【００５１】
なお、本明細書において、イニファターとは、光照射によりラジカルを発生させる重合開始剤、連鎖移動剤としての機能と共に、成長末端と結合して成長を停止する機能、さらに光照射が停止すると重合を停止させる重合開始・重合停止剤として機能する分子のことである。
【００５２】
この分岐型重合体製造工程に用いるＤＡＡＡＭ、すなわち、２−Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノアルキルメタクリレートは、炭素数１〜３程度の２つのアルキル基と、炭素数１又は２のアルキレン基を有するジアルキルアミノアルキルアルコールと、メタクリル酸とのエステルであることが好ましい。このようなジアルキルアミノアルキルメタクリレートとしては、前述の２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及びその誘導体が好ましい。
【００５３】
イニファターとなるＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する芳香族化合物としては、ベンゼン環に該Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基、好ましくはＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が３個以上分岐鎖として結合しているものが好適であり、具体的には次が例示される。即ち、３分岐鎖化合物としては、１，３，５−トリ（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，３，５−トリ（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、４分岐鎖化合物としては、１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、６分岐鎖化合物としては、ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られるヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンが挙げられる。なお、ここで、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基に含まれるジアルキル部分のアルキル基としては、エチル基等の炭素数２〜１８個のアルキル基が好ましいが、アルキル基に限らず、フェニル基など芳香族系の炭化水素基であっても構わない。即ち、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基に限らず、Ｎ，Ｎ−ジアリールジチオカルバミルメチル基等を含む、脂肪族炭化水素基及び／又は芳香族炭化水素基で置換されたＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基であれば目的を達成することができる。
【００５４】
上記のイニファターは、アルコール等の極性溶媒に対しては殆ど不溶であるが、非極性溶媒には易溶である。この非極性溶媒としては炭化水素、ハロゲン化アルキル又はハロゲン化アルキレンが好適であり、特に、ベンゼン、トルエン、クロロホルム又は塩化メチレン特にトルエンが好適である。
【００５５】
イニファターと上記ＤＡＡＡＭとを反応させるには、イニファター、及びＤＡＡＡＭを含んでなる原料溶液を調製し、これに光照射することによって、イニファターに対し、ＤＡＡＡＭが結合した反応生成物を生成させる。
【００５６】
該原料溶液中のＤＡＡＡＭの濃度は０．５Ｍ以上、例えば０．５Ｍ〜２．５Ｍが好適であり、イニファターの濃度は１〜２０ｍＭ程度が好適である。
【００５７】
照射する光の波長は２５０〜４００ｎｍが好適であり、例えばショートアークキセノンランプ、低圧水銀灯、高圧水銀灯などを用いることができる。光の照射時間は照射強度にも依存するが、１〜９０分程度が好適であり、１μＷ／ｃｍ２〜１０ｍＷ／ｃｍ２程度の低い照射強度で１〜６０分程度が特に好適である。
【００５８】
この光照射により、反応液中に目的とする分岐型重合体が生成するので、必要に応じ精製することにより、分岐鎖部分にＤＡＡＡＭ単位よりなるポリマー鎖が導入され、分岐鎖の末端がＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基であるホモポリマーを得る。
【００５９】
この分岐型重合体の分岐鎖の１本当たりの分子量としては、３００〜１００，０００程度、特に３，０００〜６０，０００程度が好ましい。この分子量は、光照射の時間を制御することにより調整することができる。即ち、反応時間を長くすることにより、重合反応を進行させて分子量の大きい分岐型重合体を得ることができる。
【００６０】
なお、本明細書において、分子量とは、ＧＰＣ（ゲルパーミエーションクロマトグラフィー）によるポリエチレングリコール換算の数平均分子量をさす。
【００６１】
本発明に係る分岐型重合体の分岐鎖は、前述のＤＡＡＡＭのみからなるホモポリマーであることが好ましいが、ＤＡＡＡＭとＤＡＡＡＭとは異なる１種以上のモノマーを導入したブロックコポリマー又はランダムコポリマーであってもよい。
【００６２】
この場合の他のモノマーとしては、アクリル酸誘導体、スチレン誘導体等のビニル系モノマーが好適であり、具体的には、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣ３Ｈ６Ｎ（ＣＨ３）２、４−Ｎ，Ｎ-ジメチルアミノスチレン、及び４−アミノスチレンの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種のビニル系モノマーが挙げられ、特に、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣ３Ｈ６Ｎ（ＣＨ３）２等のカチオン性ビニル系モノマーが好ましい。これらのビニル系モノマーは１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
【００６３】
イニファターとＤＡＡＡＭとＤＡＡＡＭとは異なるモノマーとを反応させるには、前述のイニファターとＤＡＡＡＭとを反応させる場合と同様に、イニファター、ＤＡＡＡＭ、及びＤＡＡＡＭ以外のモノマーを含んでなる原料溶液を調製し、これに光照射することによって、イニファターに対し、ＤＡＡＡＭ及びＤＡＡＡＭ以外のモノマーが結合したランダムコポリマーを得る。
【００６４】
また、上記イニファターに対し、まず、ＤＡＡＡＭをブロック重合させて、ホモポリマーを形成し、その後、このホモポリマーに３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドをブロック重合させ、分岐鎖の基端側をＤＡＡＡＭのブロックポリマー、分岐鎖の先端側を３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドブロックポリマーで構成した分岐鎖としてもよい。このように、分岐鎖を２種類以上のモノマーのブロックコポリマーとする場合、イニファターに対する重合の順序は任意である。いずれの場合も分岐鎖の末端は、Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基となる。
【００６５】
［２］遺伝子導入剤
本発明の遺伝子導入剤の製造方法により製造される遺伝子導入剤（加水分解後の分岐型重合体）は、ＬＣＳＴ（Lower Critical Solution Temperature）が、３６℃以上であることが好ましく、特に３７〜６０℃程度、とりわけ４０〜５０℃程度であることが好ましい。このＬＣＳＴが上記下限未満であると、細胞培養環境下において、遺伝子導入剤が疎水性を示すため、この遺伝子導入剤と核酸とからなる核酸複合体同士、もしくは、核酸複合体と血清に含まれる疎水性物質とが凝集することにより遺伝子導入効率が低下する。また、核酸複合体が血清中の疎水性物質可溶化成分の影響を受ける場合や、ポリスチレン製シャーレに吸着されやすくなるなどの不具合が生じるおそれがある。また、ＬＣＳＴが上記上限を超える場合は、遺伝子導入剤が遺伝子導入剤の分子内及び／又は分子間でイオン結合性に凝集したり、遺伝子導入剤がアニオン性高分子である核酸と複合体を形成しにくくなる。なお、前記加水分解を過度に行うと、側鎖のアニオン性部位が多くなり、本来、カチオン性高分子である遺伝子導入剤がアニオン性に変化し、ＬＣＳＴが上記上限を超え易くなる。従って、ＬＣＳＴが上記範囲内、即ち３６℃以上であれば効率的に細胞に遺伝子を導入することができる。なお、ＬＣＳＴの測定方法は、後述の実施例の項に記載される通りである。
【００６６】
遺伝子導入剤（加水分解工程後の分岐型重合体）の分岐鎖１本当たりの分子量としては、３００〜１００，０００程度、特に１，０００〜６０，０００程度が好ましいが、この遺伝子導入剤に含まれるＤＡＡＡＭ単位の合計の分子量は、分岐鎖の鎖数にもよるが、１，２００〜５９０，０００程度、特に１０，０００〜２５０，０００程度が好ましい。この場合の遺伝子導入剤に含まれるＤＡＡＡＭ単位の合計の分子量とは、加水分解されていないＤＡＡＡＭ単位と、加水分解されたＤＡＡＡＭ単位の合計の分子量である。
【００６７】
なお、この遺伝子導入剤（加水分解後の分岐型重合体）に含まれるＤＡＡＡＭ単位のうち、加水分解されているＤＡＡＡＭの割合は、上述のＬＣＳＴを満足し得る程度であればよく、特に制限はない。即ち、本発明においては、前述の分岐型重合体を上述のＬＣＳＴを満たすように加水分解を行うことが好ましい。この加水分解の程度は、上述の透析による加水分解において、透析時間を調整することにより容易に制御することができ、即ち、透析時間が長い程、加水分解率が高く、従って、ＬＣＳＴが高く、親水性の高い遺伝子導入剤を得ることができる。
【００６８】
また、遺伝子導入剤の分子量としては、２，０００〜６００，０００程度、特に１０，０００〜３００，０００程度が好ましい。
【００６９】
［３］核酸複合体
上記の遺伝子導入剤（ベクター）が核酸を核酸含有複合体として包囲することによって、生体内の酵素による核酸の失活、分解を抑制することができる。
【００７０】
上記遺伝子導入剤と核酸とを複合させるには、遺伝子導入剤の濃度０．１〜１０００μｇ／ｍＬ程度の溶液に対し、核酸を添加し、混合すればよい。核酸に対して遺伝子導入剤を過剰量添加し、核酸に対して遺伝子導入剤を飽和状態にして遺伝子導入剤と核酸とを複合化することが好ましい。
【００７１】
核酸の好ましい例としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子），ｐ５３癌抑制遺伝子及びＢＲＣＡ１癌抑制遺伝子やサイトカイン遺伝子としてＴＮＦ−α遺伝子，ＩＬ−２遺伝子，ＩＬ−４遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子，ＩＬ−７遺伝子，ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子，ＩＦＮ−γ遺伝子及びＩＬ−１２遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｇｐ−１００，ＭＡＲＴ−１及びＭＡＧＥ−１などの癌抗原ペプチド遺伝子が癌治療に利用できる。
【００７２】
また、ＶＥＧＦ遺伝子，ＨＧＦ遺伝子及びＦＧＦ遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｃ−ｍｙｃアンチセンス，ｃ−ｍｙｂアンチセンス，ｃｄｃ２キナーゼアンチセンス，ＰＣＮＡアンチセンス，Ｅ２Ｆデコイやｐ２１（ｓｄｉ−１）遺伝子が血管治療に利用できる。かかる一連の遺伝子は当業者には良く知られたものである。
【００７３】
核酸複合体の粒径は５０〜４００ｎｍ程度が好適である。この粒径は、例えばレーザを用いた動的光散乱法によって測定される。粒径がこれよりも小さいと、核酸複合体内部の核酸にまで酵素の作用が及ぶおそれ、あるいは腎臓にて濾過排出されるおそれがある。また、これよりも大きいと、細胞に導入されにくくなるおそれがある。
【００７４】
核酸は、細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で用いる。例えばＤＮＡの場合、導入された細胞内で当該ＤＮＡが転写され、それにコードされるポリペプチドの産生を経て機能発現されるように当該ＤＮＡが配置されたプラスミドとして用いる。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、所望の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列されている。
【００７５】
所望により２種以上の核酸をひとつのプラスミドに含めることも可能である。
【００７６】
核酸を導入する対象として望ましい「細胞」としては、当該核酸の機能発現が求められるものであり、このような細胞としては、例えば使用する核酸（すなわちその機能）に応じて種々選択され、例えば心筋細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、骨格筋細胞、血管内皮細胞、骨髄細胞、骨細胞、血球幹細胞、血球細胞等が挙げられる。また、単球、樹状細胞、マクロファージ、組織球、クッパー細胞、破骨細胞、滑膜Ａ細胞、小膠細胞、ランゲルハンス細胞、類上皮細胞、多核巨細胞等、消化管上皮細胞・尿細管上皮細胞などである。
【００７７】
この核酸複合体は培養試験に用いるほか、任意の方法で生体に投与することができる。
【００７８】
生体への投与方法としては静脈内又は動脈内への注入が特に好ましいが、筋肉内、脂肪組織内、皮下、皮内、リンパ管内、リンパ節内、体腔（心膜腔、胸腔、腹腔、脳脊髄腔等）内、骨髄内への投与の他に病変組織内に直接投与することも可能である。
【００７９】
この核酸複合体を有効成分とする医薬は、更に必要に応じて製剤上許容し得る担体（浸透圧調整剤，安定化剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤等）と混合することが可能である。これら担体は公知のものが使用できる。
【００８０】
また、この核酸複合体を有効成分とする医薬は、含まれる核酸の種類が異なる２種以上の核酸含有複合体を含めたものも包含される。このような複数の治療目的を併せ持つ医薬は、多様化する遺伝子治療の分野で特に有用である。
【００８１】
投与量としては、動物、特にヒトに投与される用量は目的の核酸、投与方法および治療される特定部位等、種々の要因によって変化する。しかしながら、その投与量は治療的応答をもたらすに十分であるべきである。
【００８２】
この核酸複合体は、好ましくは遺伝子治療に適用される。適用可能な疾患としては、当該複合体に含められる核酸の種類によって異なるが、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、動脈拡張術後再狭窄等の病変を生じる循環器領域での疾患に加え、癌（悪性黒色腫、脳腫瘍、転移性悪性腫瘍、乳癌等）、感染症（ＨＩＶ等）、単一遺伝病（嚢胞性線維症、慢性肉芽腫、α１−アンチトリプシン欠損症、Gaucher病等）等が挙げられる。
【実施例】
【００８３】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。
【００８４】
ｉ）イニファターの合成
イニファターとしての１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンを次のようにして合成した。
【００８５】
１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチルベンゼン）５．０ｇとＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム３４．０ｇをエタノール１００ｍＬ中へ加え、遮光下、室温で４日間攪拌した。沈殿物を濾過し、３Ｌのメタノール中に投入して３０分間攪拌した後、濾過した。この操作を繰り返し合計４回行った。沈殿物をトルエン２００ｍＬへ溶解した後、１００ｍＬのメタノールを加えて５０℃に加温し、冷蔵庫内で１５時間保管して再結晶させ、結晶を濾別後に大量のメタノールで洗浄した。結晶を室温で減圧乾燥して、白色の１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンの針状結晶を得た（収率９０％）。高速液体クロマトグラフィーにより、原料ピークが消失し、精製物が単一物質であることを確認した。
【００８６】
１Ｈ−ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）の測定結果は、δ１．２６−１．３１ｐｐｍ（ｔ，２４Ｈ，ＣＨ２ＣＨ３），δ３．６９−３．７７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ３．９９−４．０７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ４．５７ｐｐｍ（ｓ，８Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２），δ７．４９ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）であった。
【００８７】
【化１】
【００８８】
ii)４分岐型スター型重合体よりなる感温性カチオン性ホモポリマーの光重合による合成
２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートをモノマーとして用い、１，２，４，５−テトラキス［（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）ポリ（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）−メチル］ベンゼン（以下、ｐＤＭＡＥＭＡＡと記載することがある。）よりなる感温性カチオン性ホモポリマーの合成を行った。
【００８９】
即ち、上記ｉ)により合成した１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン４５．６ｍｇを２０ｍＬのトルエンへ溶解し、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート８．５ｇを加えて混合し、全量をトルエンで５０ｍＬに調整した。３ｍｍ厚軟質ガラスセル中で激しく攪拌しながら高純度窒素ガスで１０分間パージした後に、３００Ｗショートアークキセノンランプ（朝日分光社製、ＭＡＸ−３０１）で、波長２５０〜４００ｎｍの混合紫外線を６０分間照射した。照射強度は、ウシオ電機社のＵＩＴ−１５０へＵＶＤ−Ｃ４０５（検出波長範囲３２０〜４７０ｎｍ）を装着して２．５ｍＷ／ｃｍ２に調整した。重合溶液をエバポレーターで濃縮し、ｎ−ヘキサンで重合物を再沈殿させ、クロロホルム／ｎ−ヘキサン系で３回再沈殿を繰り返して精製し、ｎ−ヘキサンを蒸散させた後に少量のベンゼンへ溶解し、０．２μｍフィルターで濾過した後、凍結乾燥させて、目的とする４分岐型スター型重合体（ｐＤＭＡＥＭＡＡ）よりなる感温性カチオン性ホモポリマーを得た。この感温性カチオン性ホモポリマーのポリエチレングリコールを標準物質とした数平均分子量は、ＧＰＣにより、１１，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．４）と測定された。また、計算により分岐鎖１本当たりの分子量は、２５７０であることが分かった。
【００９０】
１Ｈ−ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤ３ＯＤ）の測定結果は、δ０．８−１．２ｐｐｍ（ｂｒ，３Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ３−），δ１．６−２．０ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ３−），δ２．２−２．４ｐｐｍ(ｂｒ，６Ｈ，Ｎ−ＣＨ３)，δ２．５−２．７ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＣＨ２−Ｎ），δ４．０−４．２ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，Ｏ−ＣＨ２）であった。
【００９１】
【化２】
【００９２】
iii)４分岐型スター型重合体よりなる感温性カチオン性ホモポリマーの側鎖の部分加水分解
＜液体クロマトグラフ装置による加水分解＞
上記ii）で合成した感温性カチオン性ホモポリマー０．３ｇを３ｍＬのクロロホルムへ溶解し、この溶液を高速液体クロマトグラフ装置（島津製作所製「ＬＣ−１０Ａｖｐシリーズ」）を用いて、表１に示すＰｒｏｔｏｃｏｌ−Ａ１〜Ａ５及びＢ１〜Ｂ６の条件で処理することにより側鎖の部分加水分解を行った。なお、いずれのＰｒｏｔｏｃｏｌにおいても、Ｓｈｏｄｅｘ社製のカラム２本を連結して用いた。各カラムの特性を表２に示す。
【００９３】
いずれのＰｒｏｔｏｃｏｌにおいても、ポリマー総溶出時間のうち、溶出開始から１０％、及び溶出終了から手前１０％以外の時間において溶出したポリマー成分を回収した。ポリマー成分の回収は４０分内に完了した。
【００９４】
＜ポリマーの精製＞
各Ｐｒｏｔｏｃｏｌにおいて、回収したポリマー溶液をそれぞれエバポレーターで濃縮し、ｎ−ヘキサン／ジエチルエーテル系で再沈殿させることにより、ポリマー成分を得、それぞれ少量のベンゼンに溶解させてから凍結乾燥することで各ポリマーの粉末を得た。各Ｐｒｏｔｏｃｏｌで得られた遺伝子導入剤の分子量、及びこの分子量より遺伝子導入剤の分岐鎖１本当たりの分子量を計算により求めた。結果をそれぞれ表１に示す。なお、Ｐｒｏｔｏｃｏｌ−Ａ５（比較例１−２）及びＢ６（比較例２−３）のポリマーは、溶媒に対して溶解しないものであったため、これらのポリマーについては分子量の測定及び後述の曇点の測定を行わなかった。
【００９５】
＜曇点の測定＞
各Ｐｒｏｔｏｃｏｌにより得られたポリマーの水溶液を調製し、この水溶液の温度を上昇させることにより溶液が白濁する温度（ＬＣＳＴ：曇点）の測定を行った。
【００９６】
即ち、各ホモポリマーの３重量％水溶液を調製し、これらの水溶液の２０〜６０℃の温度範囲における波長６００ｎｍの光の吸光度を測定した。結果を表１に示す。なお、加水分解を行っていない未処理のポリマーは、３２．０℃付近にＬＣＳＴを有していた。
【００９７】
【表１】
【００９８】
【表２】
【００９９】
表１より明らかなように、各Ｐｒｏｔｏｃｏｌにおいて、カラム内の圧力が大きく異なっていた。各カラムに充填される多孔性ポリマーの粒子径、移動相の種類、粘度、通液速度及びカラム温度の差異が、圧力損失に影響したと考えられる。
【０１００】
なお、ii）において合成した感温性カチオン性ホモポリマーの分岐鎖の予想される加水分解の化学式を示す。この化学式は、分岐鎖に含まれる２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート由来の構成単位１個分の加水分解を示したものである。
【０１０１】
【化３】
【０１０２】
＜考察＞
Ｐｒｏｔｏｃｏｌ−Ａ１，Ｂ１，Ｂ２（比較例１−１，２−１，２−２）は、カラム内の圧力が低く、ポリマー側鎖の分解が起こらなかったため、曇点（ＬＣＳＴ）に変化がなかったと考えられる。これに対して、Ｐｒｏｔｏｃｏｌ−Ａ３，Ａ４，Ｂ３，Ｂ４，Ｂ５（実施例１−２，１−３，２−１，２−２，２−３）は、圧力が高く、カラム内で分解が生じたため曇点（ＬＣＳＴ）が上昇したと考えられる。即ち、側鎖の部分的な加水分解によりアニオン性の官能基が露出し、温度の変化によりアミンが脱溶媒和しても親水性が維持されたため、水への溶解性が高まったと考えられる。
【０１０３】
なお、Ｐｒｏｔｏｃｏｌ−Ａ５，Ｂ６（比較例１−２，２−３）では、回収したポリマー成分が室温でも水に溶解しなかった。これは側鎖の加水分解が進行し過ぎて、ポリマー同士がイオン結合的に架橋、凝集し、ゲル化した、又は分解と同時に架橋反応がカラム内で生じ、水不溶性の成分となったためであると考えられる。Ｐｒｏｔｏｃｏｌ−Ａ５、Ｂ６により加水分解した重合体は、水への溶解性が低いことから、遺伝子導入剤として使用するのは困難であると考えられる。
【０１０４】
加水分解工程を透析により行う製造方法では、分岐型重合体を回収してから目的とする遺伝子導入剤を得るまでに５日程度要するが、本発明の遺伝子導入剤の製造方法によれば、１時間程度で済む。即ち、本発明の製造方法によれば、容易に、かつ短時間でポリマー側鎖の部分加水分解を行うことができ、目的とする遺伝子導入剤を得ることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分岐鎖を有する分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤を製造する方法において、
芳香環に該芳香環から放射状に伸延する、少なくとも２−Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノアルキルメタクリレート及び／又はその誘導体を重合してなる複数の分岐鎖を導入することにより分岐型重合体を製造する分岐型重合体製造工程と、
得られた分岐型重合体を加水分解する加水分解工程と、
を有する遺伝子導入剤の製造方法であって、
該加水分解工程は、サイズ排除カラムに、該分岐型重合体を含む溶液を通液する工程を含むことを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項２】
請求項１において、前記サイズ排除カラム内の圧力が３０〜８０ｋｇ／ｃｍ２であることを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項３】
請求項１又は２において、前記サイズ排除カラムは、多孔性ポリマー粒子が充填されたものであることを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項４】
請求項３において、前記多孔性のポリマー粒子は、粒径が１０μｍ以下であることを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項５】
請求項３又は４において、前記多孔性ポリマー粒子は、スチレン／ジビニルベンゼン共重合体、ポリビニルアルコール、及びポリアクリルアミドからなる群から選択される１種以上であることを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項６】
請求項５において、前記多孔性ポリマー粒子がスチレン／ジビニルベンゼン共重合体であり、サイズ排除カラム内の圧力が４０〜８０ｋｇ／ｃｍ２であることを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項７】
請求項５において、前記多孔性ポリマー粒子がポリビニルアルコールであり、サイズ排除カラム内の圧力が３０〜４０ｋｇ／ｃｍ２であることを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項において、前記サイズ排除カラムの理論段数が、１，０００／１０ｃｍ以上であることを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項において、前記遺伝子導入剤のＬＣＳＴ（Lower Critical Solution Temperature）が、３７〜６０℃であることを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれか１項において、前記分岐型重合体は、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これに少なくとも前記２−Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノアルキルメタクリレート及び／又はその誘導体を光照射リビング重合させてなるものであることを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項１１】
請求項１０において、前記Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物は、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が結合したものであることを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項１２】
請求項１ないし１１のいずれか１項において、前記遺伝子導入剤の分子量は、２，０００〜６００，０００であることを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項１】
分岐鎖を有する分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤を製造する方法において、
芳香環に該芳香環から放射状に伸延する、少なくとも２−Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノアルキルメタクリレート及び／又はその誘導体を重合してなる複数の分岐鎖を導入することにより分岐型重合体を製造する分岐型重合体製造工程と、
得られた分岐型重合体を加水分解する加水分解工程と、
を有する遺伝子導入剤の製造方法であって、
該加水分解工程は、サイズ排除カラムに、該分岐型重合体を含む溶液を通液する工程を含むことを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項２】
請求項１において、前記サイズ排除カラム内の圧力が３０〜８０ｋｇ／ｃｍ２であることを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項３】
請求項１又は２において、前記サイズ排除カラムは、多孔性ポリマー粒子が充填されたものであることを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項４】
請求項３において、前記多孔性のポリマー粒子は、粒径が１０μｍ以下であることを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項５】
請求項３又は４において、前記多孔性ポリマー粒子は、スチレン／ジビニルベンゼン共重合体、ポリビニルアルコール、及びポリアクリルアミドからなる群から選択される１種以上であることを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項６】
請求項５において、前記多孔性ポリマー粒子がスチレン／ジビニルベンゼン共重合体であり、サイズ排除カラム内の圧力が４０〜８０ｋｇ／ｃｍ２であることを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項７】
請求項５において、前記多孔性ポリマー粒子がポリビニルアルコールであり、サイズ排除カラム内の圧力が３０〜４０ｋｇ／ｃｍ２であることを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項において、前記サイズ排除カラムの理論段数が、１，０００／１０ｃｍ以上であることを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項において、前記遺伝子導入剤のＬＣＳＴ（Lower Critical Solution Temperature）が、３７〜６０℃であることを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれか１項において、前記分岐型重合体は、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これに少なくとも前記２−Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノアルキルメタクリレート及び／又はその誘導体を光照射リビング重合させてなるものであることを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項１１】
請求項１０において、前記Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物は、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が結合したものであることを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項１２】
請求項１ないし１１のいずれか１項において、前記遺伝子導入剤の分子量は、２，０００〜６００，０００であることを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【公開番号】特開２０１１−２０７８１３（Ｐ２０１１−２０７８１３Ａ）
【公開日】平成２３年１０月２０日（２０１１．１０．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−７７２７９（Ｐ２０１０−７７２７９）
【出願日】平成２２年３月３０日（２０１０．３．３０）
【出願人】（５１００９４７２４）独立行政法人国立循環器病研究センター (52)
【出願人】（０００００５２７８）株式会社ブリヂストン (11,469)
【上記１名の代理人】
【識別番号】１０００８６９１１
【弁理士】
【氏名又は名称】重野 剛
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１０月２０日（２０１１．１０．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月３０日（２０１０．３．３０）
【出願人】（５１００９４７２４）独立行政法人国立循環器病研究センター (52)
【出願人】（０００００５２７８）株式会社ブリヂストン (11,469)
【上記１名の代理人】
【識別番号】１０００８６９１１
【弁理士】
【氏名又は名称】重野 剛
【Ｆターム（参考）】
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