遺伝子導入剤及び核酸複合体
【課題】血清を含む培地において、より効率的に、細胞に遺伝子を導入することができる遺伝子導入剤を提供する。この遺伝子導入剤と核酸とを複合させてなる核酸複合体を提供する。
【解決手段】芳香環を核とし、それから伸延した複数の分岐鎖を有する分岐型重合体を用いた遺伝子導入剤。該分岐鎖は、少なくとも２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体と、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドとをランダム共重合してなる重合体よりなり、該重合体を構成する２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体由来の構成単位と、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド由来の構成単位との合計に対する該３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド由来の構成単位の割合が、３０ｍｏｌ％以下である。この遺伝子導入剤と核酸との核酸複合体。
【解決手段】芳香環を核とし、それから伸延した複数の分岐鎖を有する分岐型重合体を用いた遺伝子導入剤。該分岐鎖は、少なくとも２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体と、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドとをランダム共重合してなる重合体よりなり、該重合体を構成する２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体由来の構成単位と、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド由来の構成単位との合計に対する該３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド由来の構成単位の割合が、３０ｍｏｌ％以下である。この遺伝子導入剤と核酸との核酸複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子導入剤及び核酸複合体に係り、特に分岐型重合体を用いた遺伝子導入剤と、この遺伝子導入剤と核酸とを複合させた核酸複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒト疾患の分子遺伝学的要因が明らかになるにつれ、遺伝子治療研究がますます重要視されている。遺伝子治療法は標的とする部位でのＤＮＡの発現を目的としており、いかにＤＮＡを標的部位に到達させるか、いかにＤＮＡを標的部位に効率的に導入し、当該部位で機能的に発現させるかということが重要となる。外来ＤＮＡの導入のためのベクターとして、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ付随ウイルス、レンチウイルス、センダイウイルス又はヘルペスウイルスを含む多くのウイルスが、治療用遺伝子を運搬するように改変されて、遺伝子治療のヒトの臨床試験に使用されている。しかし、感染及び免疫反応の危険性は依然として残されているため、これらのベクターに代わる遺伝子導入技術として、合成高分子ベクター、カチオン性脂質ベクターが研究開発されている。
【０００３】
本出願人らは、ｐＫａの値が高く、中性条件においてもプロトン化されている３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドを主モノマーとして重合してなる分岐鎖を有する分岐型重合体からなる遺伝子導入剤が、効率よく細胞に遺伝子を導入することができることを見出し、先に特許出願した（特許文献１）。
【０００４】
本出願人らはまた、より分子量が大きく、より複雑な構造を有する分岐型重合体の方が遺伝子導入活性に優れるという知見、及び前記３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドを重合してなる分岐鎖の側鎖は、基端側のアミド基と、先端側のアミノ基との間にプロピレン基を有するため、側鎖間における架橋反応が生じ易いという知見に基き、前記分岐型重合体同士を架橋してなる遺伝子導入剤を提案した（特許文献２）。
【０００５】
このようなカチオン性モノマーを重合してなる分岐鎖を有する遺伝子導入剤にあっては、その構造上、電荷密度を高く配置することが可能であるため、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸をより強く凝集させることが可能であり、より粒子径の小さい微細なポリプレックス粒子を形成させることができるが、以下の問題がある。
【０００６】
即ち、細胞に遺伝子を導入する際の細胞を培養する培地としては、細胞へのストレスを軽減する観点から血清を含む培地を用いるが、前述の高ｐＫａの分岐鎖を有する遺伝子導入剤は、その高いカチオン性により、血清中のアニオン性タンパクを吸着してしまう。従って、この遺伝子導入剤は、血清を含む培地において用いた場合、この遺伝子導入剤と核酸とからなる核酸複合体が血清中のアニオン性タンパクを吸着し、マクロ粒子を形成するため、細胞内に取り込まれにくくなったり、核酸がトランスポーターに認識されにくくなり、細胞に対して遺伝子を効率的に導入することができない。
【０００７】
この問題に対して、本出願人らは、血清を含む培地における遺伝子導入方法として、所定温度（Ｔ）未満ではカチオン性を示すが、所定温度（Ｔ）以上では疎水性を示す２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートを重合してなる感温性カチオン性ポリマー鎖よりなる分岐鎖を有する遺伝子導入剤を用い、この遺伝子導入剤と核酸とを含む溶液を所定温度（Ｔ）未満で混合した後、該溶液を所定温度（Ｔ）以上に加温して、遺伝子導入剤と核酸とを複合させることにより核酸複合体を得、この核酸複合体と細胞とを、血清を含む培地において、該所定温度（Ｔ）以上で接触させて、細胞に遺伝子を導入する遺伝子導入方法を提案した（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ２００４／０９２３８８号公報
【特許文献２】特開２００８−２８９４６８号公報
【特許文献３】特願２００９−１２６７１８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
前記特許文献３に記載される２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートを重合してなる分岐鎖は、ｐＫａの値が低く、中性条件下においてほとんど電荷を持っていないため、ＤＮＡの凝集力が弱いものの、血清に含まれるアニオン性タンパクなどの影響を受けにくい。従って、この２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートを重合してなる分岐鎖を有する遺伝子導入剤は、血清を含まない培地においては、前述の３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドを重合してなる遺伝子導入剤よりも低い遺伝子導入活性を示すものの、血清を含む培地においては、高い遺伝子導入活性を示す。
【００１０】
しかしながら、この２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートは、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドに比べて重合性に乏しいため、遺伝子の導入に有利な、分子量の大きい分岐型重合体を合成することが困難である。また、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートを重合してなる分岐鎖の側鎖は、側鎖の先端側のアミノ基と基端側のエステル結合との間がエチレン基であるため、プロピレン基を有する３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドを重合してなる分岐鎖の側鎖に比べて分岐型重合体同士の架橋反応が起こり難い。従って、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートを重合してなる分岐鎖を有する分岐型重合体は、前述の３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドを重合してなる分岐鎖を有する分岐型重合体のように、分岐型重合体同士を架橋することにより、遺伝子導入活性に優れる分子量の高い架橋分岐型重合体を得ることが困難であった。
【００１１】
本発明は上記従来の課題に鑑みてなされたものであり、血清を含む培地において、より効率的に、細胞に遺伝子を導入することができる遺伝子導入剤を提供することを目的とする。
本発明はまた、この遺伝子導入剤と核酸とを複合させてなる核酸複合体を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明（請求項１）の遺伝子導入剤は、芳香環を核とし、それから伸延した複数の分岐鎖を有する分岐型重合体を用いた遺伝子導入剤において、該分岐鎖は、少なくとも２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体と、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドとをランダム共重合してなる重合体よりなり、該重合体を構成する２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体由来の構成単位と、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド由来の構成単位との合計に対する該３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド由来の構成単位の割合が、３０ｍｏｌ％以下であることを特徴とするものである。
【００１３】
請求項２の遺伝子導入剤は、請求項１において、前記重合体を構成する２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体由来の構成単位と、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド由来の構成単位との合計に対する該３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド由来の構成単位の割合が、１〜１５ｍｏｌ％であることを特徴とするものである。
【００１４】
請求項３の遺伝子導入剤は、請求項１又は２において、前記遺伝子導入剤は、前記分岐型重合体に対して光照射することにより該分岐型重合体同士が架橋した架橋分岐型重合体よりなるものであり、該架橋分岐型重合体の数平均分子量は、該分岐型重合体の数平均分子量の１．２倍以上であることを特徴とするものである。
【００１５】
請求項４の遺伝子導入剤は、請求項３において、前記架橋分岐型重合体の数平均分子量は、前記分岐型重合体の数平均分子量の１．２〜５．０倍であることを特徴とするものである。
【００１６】
請求項５の遺伝子導入剤は、請求項１ないし４のいずれか１項において、前記分岐型重合体は、Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これに少なくとも前記２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体と、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドとを光照射リビング重合させてなるものであることを特徴とするものである。
【００１７】
請求項６の遺伝子導入剤は、請求項５において、前記Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物は、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が結合していることを特徴とするものである。
【００１８】
請求項７の遺伝子導入剤は、請求項５又は６において、前記Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基は、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル基であることを特徴とするものである。
【００１９】
請求項８の遺伝子導入剤は、請求項１ないし７のいずれか１項において、前記分岐鎖が、前記２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体と、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドとのランダム共重合体よりなることを特徴とするものである。
【００２０】
請求項９の遺伝子導入剤は、請求項１ないし８のいずれか１項において、前記分岐鎖の１本当たりの分子量は、３００〜２０，０００であることを特徴とするものである。
【００２１】
請求項１０の遺伝子導入剤は、請求項１ないし９のいずれか１項において、前記分岐型重合体の分子量は、２，０００〜１５０，０００であることを特徴とするものである。
【００２２】
本発明（請求項１１）の核酸複合体は、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の遺伝子導入剤と核酸とを複合させてなるものである。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の遺伝子導入剤が有する分岐鎖は、少なくとも２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体（以下、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又は誘導体を、「ＤＭＡＥＭ」と略記する場合がある。）と、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド（以下、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドを、単に、「ＤＭＡＰＡＡ」と略記する場合がある。）とをランダム共重合してなる重合体であって、この分岐鎖の重合体を構成するＤＭＡＥＭ由来の構成単位（以下、「ＤＭＡＥＭ単位」と称す場合がある。）と、該重合体のＤＭＡＰＡＡ由来の構成単位（以下、「ＤＭＡＰＡＡ単位」と称す場合がある。）との合計に対するＤＭＡＰＡＡ単位の割合（以下、この割合を、単に、「ＤＭＡＰＡＡ単位割合」と称す場合がある。）が、３０ｍｏｌ％以下であることを特徴とする。
【００２４】
本発明の遺伝子導入剤にあっては、その分岐鎖が、少なくともＤＭＡＥＭと、ＤＭＡＰＡＡとをランダム共重合してなるポリマー鎖であるため、アニオン性タンパクなどの影響を受けにくいＤＭＡＥＭ単位に起因する効果と、重合性に富み、分子量が大きい分岐型重合体を合成することができるＤＭＡＰＡＡ単位に起因する効果とを有する。
【００２５】
また、本発明にあっては、前記ＤＭＡＰＡＡ単位割合を３０ｍｏｌ％以下、特に１〜１５ｍｏｌ％（請求項２）としているため、遺伝子導入剤全体としてはＤＭＡＥＭ単位に起因する疎水性を示すことから、この遺伝子導入剤を血清を含む培地で用いた場合であっても、血清に含まれるアニオン性タンパクの影響を受けにくく、細胞に対して効率的に遺伝子を導入することができる。
【００２６】
本発明の遺伝子導入剤は、前記分岐型重合体に対して、光照射することにより該分岐型重合体同士が架橋した架橋分岐型重合体よりなるものであってもよく、この場合の該架橋分岐型重合体の数平均分子量は、該分岐型重合体の数平均分子量の１．２倍以上（請求項３）、特に、１．２〜５．０倍であることが好ましい（請求項４）。前記分岐型重合体を架橋することにより、弱塩基性の２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートを主モノマーとして用いた分岐鎖を有する架橋体分岐型重合体を得ることができる。また、架橋分岐型重合体の数平均分子量が、架橋前の分岐型重合体の数平均分子量の１．２倍以上、特に２．０〜３．０倍であれば、架橋分岐型重合体が複雑なネットワーク構造を備えると共に、架橋前の分岐型重合体が有する水への良好な溶解性を維持するため、核酸をより効率的に包接することが可能となる。
【００２７】
前記分岐型重合体は、Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これに少なくとも前記２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体と、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドとを光照射リビング重合させてなるものであることが好ましく（請求項５）、前記Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物としては、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上のＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が結合していることが好ましく（請求項６）、このＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基としては、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル基であることが好ましい（請求項７）。
【００２８】
前記分岐鎖は、前記ＤＭＡＥＭ単位と、ＤＭＡＰＡＡ単位とのランダム共重合体であることが好ましい（請求項８）。
【００２９】
前記分岐鎖１本当たりの分子量は、３００〜２０，０００であることが好ましい（請求項９）。分岐鎖１本当たりの分子量がこの範囲内であると、遺伝子導入剤の高分子量化を抑えた上で、効率的に遺伝子を導入することができる遺伝子導入剤を得ることができる。また、前記分岐型重合体の分子量は、２，０００〜１５０，０００でることが好ましい（請求項１０）。分岐型重合体の分子量が上記範囲内であると、高分子量化を抑えた上で、より効率的に遺伝子導入剤と核酸とを複合化させることができ、比較的低分子量で遺伝子導入効率に優れた遺伝子導入剤を得ることができる。
【００３０】
本発明の核酸複合体は、前記遺伝子導入剤と核酸とを複合させてなる核酸複合体である（請求項１１）。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】実施例１，２及び比較例１，２の遺伝子導入剤の遺伝子導入活性の評価結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下に本発明の実施の形態を詳細に説明する。
【００３３】
［遺伝子導入剤］
＜分岐型重合体＞
本発明の遺伝子導入剤は、芳香環を核とし、それから伸延した複数の分岐鎖を有する分岐型重合体を用いた遺伝子導入剤において、該分岐鎖が、少なくともＤＭＡＥＭと、ＤＭＡＰＡＡとをランダム共重合してなる重合体であって、前記ＤＭＡＰＡＡ単位割合が、３０ｍｏｌ％以下であることを特徴とする。
【００３４】
本発明の遺伝子導入剤は、前述の通り、分岐鎖が少なくともＤＭＡＥＭ単位とＤＭＡＰＡＡ単位とを含むため、ＤＭＡＰＡＡ単位を分岐鎖に有することによる重合性向上効果により、分岐型重合体の高分子量化、分子構造の複雑化を図ることができ、且つ、ＤＭＡＥＭ単位を分岐鎖に有することによる分岐型重合体の疎水化効果により、アニオン性タンパクなどの影響を受けにくいという特徴を併せ持つため、この遺伝子導入剤は、核酸を包接する能力が高く、且つ、血清を含む培地においても効率的に遺伝子を導入することができる。
【００３５】
本発明において用いる分岐型重合体は、Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、このイニファターに少なくともＤＭＡＥＭ及びＤＭＡＰＡＡを光照射リビング重合によりランダム共重合させたものが好ましい。
【００３６】
なお、本明細書において、イニファターとは、光照射によりラジカルを発生させる重合開始剤、連鎖移動剤としての機能と共に、成長末端と結合して成長を停止する機能、さらに光照射が停止すると重合を停止させる重合開始・重合停止剤として機能する分子のことである。
【００３７】
イニファターとなるＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する芳香族化合物としては、ベンゼン環に該Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基、好ましくはＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が３個以上分岐鎖として結合しているものが好適であり、具体的には次が例示される。即ち、３分岐鎖化合物としては、１，３，５−トリ（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，３，５−トリ（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、４分岐鎖化合物としては、１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、６分岐鎖化合物としては、ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られるヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンが挙げられる。なお、ここで、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基に含まれるジアルキル部分のアルキル基としては、エチル基等の炭素数２〜１８個のアルキル基が好ましいが、アルキル基に限らず、フェニル基など芳香族系の炭化水素基であっても構わない。即ち、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基に限らず、Ｎ，Ｎ−ジアリールジチオカルバミルメチル基等を含む、脂肪族炭化水素基及び／又は芳香族炭化水素基で置換されたＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基であれば目的を達成することができる。
【００３８】
上記のイニファターは、アルコール等の極性溶媒に対しては殆ど不溶であるが、非極性溶媒には易溶である。この非極性溶媒としては炭化水素、ハロゲン化アルキル又はハロゲン化アルキレンが好適であり、特に、ベンゼン、トルエン、クロロホルム又は塩化メチレン、特にトルエンが好適である。
【００３９】
上記イニファターとＤＭＡＥＭ及びＤＭＡＰＡＡとを反応させるには、イニファター、ＤＭＡＥＭ、及びＤＭＡＰＡＡを含んでなる原料溶液を調製し、これに光照射することが好ましく、これにより、イニファターに対し、ＤＭＡＥＭ及びＤＭＡＰＡＡがランダム共重合した分岐鎖を導入することができる。
【００４０】
該原料溶液中のＤＭＡＥＭ及びＤＭＡＰＡＡの合計の濃度は０．５Ｍ以上、例えば０．５Ｍ〜２．５Ｍが好適であり、イニファターの濃度は１〜２０ｍＭ程度が好適である。
【００４１】
照射する光の波長は２５０〜４００ｎｍが好適であり、例えばショートアークキセノンランプ、低圧水銀灯、高圧水銀灯などを用いることができる。光の照射時間は照射強度にも依存するが、１〜９０分程度が好適であり、１μＷ／ｃｍ２〜１０ｍＷ／ｃｍ２程度の低い照射強度で１〜６０分程度が特に好適である。
【００４２】
この光照射により、反応液中に目的とする分岐型重合体が生成するので、必要に応じ精製することにより、分岐鎖部分にＤＭＡＥＭ単位及びＤＭＡＰＡＡ単位よりなるポリマー鎖が導入され、分岐鎖の末端がＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基であるポリマーを得る。
【００４３】
本発明に係る分岐型重合体の分岐鎖は、通常、ＤＭＡＥＭとＤＭＡＰＡＡとをランダム共重合してなるポリマー鎖であるが、ＤＭＡＥＭ及びＤＭＡＰＡＡと、その他の１種以上のモノマーとをランダム共重合してなるポリマー鎖であってもよい。
【００４４】
この場合の他のモノマーとしては、アクリル酸誘導体、スチレン誘導体等のビニル系モノマーが好適であり、具体的には、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、４−Ｎ，Ｎ-ジメチルアミノスチレン、及び４−アミノスチレンの誘導体からなる群から選択されるビニル系モノマーが挙げられる。これらのビニル系モノマーは１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
【００４５】
イニファターと、ＤＭＡＥＭ及びＤＭＡＰＡＡと、その他のモノマーとを反応させるには、前述のイニファターとＤＭＡＥＭ及びＤＭＡＰＡＡとを反応させる場合と同様に、イニファター、ＤＭＡＥＭ、ＤＭＡＰＡＡ、及びその他のモノマーを含んでなる原料溶液を調製し、これに光照射することによって、イニファターに対し、ＤＭＡＥＭ、ＤＭＡＰＡＡ、及びその他のモノマーのランダム共重合体よりなる分岐鎖を導入することができる。
【００４６】
本発明の遺伝子導入剤の分岐鎖は、ＤＭＡＰＡＡ単位割合が３０ｍｏｌ％以下、好ましくは、１〜１５ｍｏｌ％である。ＤＭＡＰＰＡ単位割合が３０ｍｏｌ％を超えると、ＤＭＡＥＭ単位とＤＭＡＰＡＡ単位との合計に対するＤＭＡＥＭ単位の割合が少なくなるため、遺伝子導入剤が疎水性を示しにくくなり、血清を含む培地において、アニオン性タンパクなどの影響を受けやすくなる。ただし、ＤＭＡＰＰＡ単位が少なすぎると、ＤＭＡＰＡＡ単位を導入することによる重合性向上効果を十分に得ることができないため、上記下限以上とすることが好ましい。
【００４７】
また、本発明の遺伝子導入剤の分岐鎖が、ＤＭＡＥＭ単位、ＤＭＡＰＡＡ単位、及びその他のモノマー由来の構成単位により構成される場合、その他のモノマー由来の構成単位の割合は、ＤＭＡＥＭ単位、ＤＭＡＰＡＡ単位、及びその他のモノマー由来の構成単位の合計に対して、１０ｍｏｌ％以下とすることが好ましい。この上限を超えると、分岐鎖にＤＭＡＥＭ単位及びＤＭＡＰＡＡ単位を導入することによる疎水化効果や、重合性向上効果を得にくくなる。
【００４８】
本発明において、このような分岐型重合体の分岐鎖の１本当たりの分子量は、３００〜２０，０００程度、特に１，０００〜１０，０００程度が好ましい。この分子量は、光照射の時間を制御することにより調整することができる。即ち、反応時間を長くすることにより、重合反応を進行させて分子量の大きい分岐型重合体を得ることができる。
【００４９】
また、この分岐型重合体の分子量としては、２，０００〜１５０，０００程度、特に８，０００〜５０，０００程度であることが好ましい。
【００５０】
なお、本明細書において、分子量とは、ＧＰＣ（ゲルパーミエーションクロマトグラフィー）によるポリエチレングリコール換算の数平均分子量をさす。
【００５１】
＜架橋分岐型重合体＞
本発明の遺伝子導入剤は、上述の分岐型重合体を用いるものであるが、本発明の遺伝子導入剤は、この分岐型重合体に対して光照射することにより当該分岐型重合体同士を架橋させた架橋分岐型重合体であってもよい。
【００５２】
上述の分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤であっても、遺伝子導入剤全体として疎水性を示すため、血清を含む培地において高い遺伝子導入活性を示すが、この分岐型重合体を架橋させることにより、より遺伝子導入活性に優れる架橋分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤を得ることができる。
【００５３】
このように前記分岐型重合体に対して光照射することにより架橋してなる架橋分岐型重合体にあっては、前記ＤＭＡＰＡＡ単位の優れた反応性を利用することにより、遺伝子導入剤の高分子量化を図ることができると共に、ＤＭＡＰＡＡ単位の塩基性が遺伝子の導入に与える影響を最小限に抑えることができる。
即ち、前記架橋分岐型重合体は、前記分岐型重合体に比べて複雑なネットワーク構造を有しており、アニオン性タンパクとＤＭＡＰＡＡ単位の３級アミンとがその立体障害により接近し難くいため、結果として、アニオン性タンパクとＤＭＡＰＡＡ単位の３級アミンとの相互作用を抑えることができる。また、架橋反応を行うことにより、ＤＭＡＰＡＡ単位の３級アミン脱離したり、２級アミン、１級アミンなどに変化し、塩基性を消失するため、血清を含む培地においても優れた遺伝子導入活性を示す。
【００５４】
前記分岐型重合体同士を架橋する方法としては、例えば、分岐型重合体及び回転子を滅菌瓶に入れ、容器内部の気体を窒素で置換した後、この滅菌瓶を密封し、回転子などを用いて分岐型重合体を粉砕し、光を照射して分岐型重合体同士を架橋する方法、もしくは、溶媒に前記分岐型重合体を溶解及び／又は分散させ、この溶液及び／又は分散液に光を照射して前記分岐型重合体同士を架橋する方法を採用することができる。
【００５５】
前記分岐型重合体同士を架橋する際の光の照射条件は、光波長１８０〜７００ｎｍ、照射時間１分〜３０，０００時間、照射強度０．００１〜１０，０００μＷ／ｃｍ２程度が好適である。
【００５６】
この分岐型重合体を溶媒に溶解及び／又は分散させて架橋する場合に用いる溶媒としては、アルコールが好ましく、例えば、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノールのような低級アルコールが好ましく、特にメタノール、エタノール及び２−プロパノールが好ましい。また、アルコール以外の溶媒としては、水、クロロホルム、トルエン、ベンゼン、キシレン、ジエチルエーテルなどのエーテル、アセトン、メチルエチルケトン、テトラヒドロフラン、塩化メチレンおよび塩化ベンゼンなどを挙げることができる。これらの溶媒は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００５７】
前記溶媒中の分岐型重合体の濃度は、３〜６０重量％、特に６〜３０重量％であることが好ましい。分岐型重合体の濃度が極端に高いと反応が進行しにくくなり、分岐型重合体の濃度が極端に低いと分岐鎖の末端同士の衝突確率が低くなるため好ましくない。
【００５８】
このように架橋してなる架橋分岐型重合体の数平均分子量は、前記分岐型重合体の数平均分子量の１．２倍以上、特に１．２〜５．０倍、即ち、数平均分子量として１０，０００〜３００，０００程度、特に１５，０００〜２００，０００程度であることが好ましい。架橋分岐型重合体の数平均分子量が、分岐型重合体の分子量の１．２倍未満であると、架橋による構造的な優位性を得ることができず、また、５．０倍を超えると、水への溶解性が低下し、架橋分岐型重合体がゲル化するという問題が生じたり、核酸が細胞内に取り込まれにくくなったり、細胞毒性が発現するおそれがある。また、この架橋分岐型重合体と核酸との複合体を生体血管内へ投与する場合には、代謝、排泄の観点から好ましくない。
【００５９】
［核酸複合体］
上記の本発明の遺伝子導入剤（ベクター）が核酸を核酸含有複合体として包囲することによって、生体内の酵素による核酸の失活、分解を抑制することができる。
【００６０】
上記遺伝子導入剤と核酸とを複合させるには、遺伝子導入剤の濃度０．１〜１０００μｇ／ｍＬ程度の溶液に対し、核酸を添加し、混合すればよい。核酸に対して遺伝子導入剤を過剰量添加し、核酸に対して遺伝子導入剤を飽和状態にして遺伝子導入剤と核酸とを複合化することが好ましい。
【００６１】
核酸の好ましい例としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子），ｐ５３癌抑制遺伝子及びＢＲＣＡ１癌抑制遺伝子やサイトカイン遺伝子としてＴＮＦ−α遺伝子，ＩＬ−２遺伝子，ＩＬ−４遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子，ＩＬ−７遺伝子，ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子，ＩＦＮ−γ遺伝子及びＩＬ−１２遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｇｐ−１００，ＭＡＲＴ−１及びＭＡＧＥ−１などの癌抗原ペプチド遺伝子が癌治療に利用できる。
【００６２】
また、ＶＥＧＦ遺伝子，ＨＧＦ遺伝子及びＦＧＦ遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｃ−ｍｙｃアンチセンス，ｃ−ｍｙｂアンチセンス，ｃｄｃ２キナーゼアンチセンス，ＰＣＮＡアンチセンス，Ｅ２Ｆデコイやｐ２１（ｓｄｉ−１）遺伝子が血管治療に利用できる。かかる一連の遺伝子は当業者には良く知られたものである。
【００６３】
核酸複合体の粒径は５０〜４００ｎｍ程度が好適である。この粒径は、例えばレーザを用いた動的光散乱法によって測定される。粒径がこれよりも小さいと、核酸複合体内部の核酸にまで酵素の作用が及ぶおそれ、あるいは腎臓にて濾過排出されるおそれがある。また、これよりも大きいと、細胞に導入されにくくなるおそれがある。
【００６４】
核酸は、細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で用いる。例えばＤＮＡの場合、導入された細胞内で当該ＤＮＡが転写され、それにコードされるポリペプチドの産生を経て機能発現されるように当該ＤＮＡが配置されたプラスミドとして用いる。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、所望の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列されている。
【００６５】
所望により２種以上の核酸をひとつのプラスミドに含めることも可能である。
【００６６】
本発明において、核酸を導入する対象として望ましい「細胞」としては、当該核酸の機能発現が求められるものであり、このような細胞としては、例えば使用する核酸（すなわちその機能）に応じて種々選択され、例えば心筋細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、骨格筋細胞、血管内皮細胞、骨髄細胞、骨細胞、血球幹細胞、血球細胞等が挙げられる。また、単球、樹状細胞、マクロファージ、組織球、クッパー細胞、破骨細胞、滑膜Ａ細胞、小膠細胞、ランゲルハンス細胞、類上皮細胞、多核巨細胞等、消化管上皮細胞・尿細管上皮細胞などである。
【００６７】
本発明の核酸複合体は培養試験に用いるほか、任意の方法で生体に投与することができる。
【００６８】
生体への投与方法としては静脈内又は動脈内への注入が特に好ましいが、筋肉内、脂肪組織内、皮下、皮内、リンパ管内、リンパ節内、体腔（心膜腔、胸腔、腹腔、脳脊髄腔等）内、骨髄内への投与の他に病変組織内に直接投与することも可能である。
【００６９】
この核酸複合体を有効成分とする医薬は、更に必要に応じて製剤上許容し得る担体（浸透圧調整剤，安定化剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤等）と混合することが可能である。これら担体は公知のものが使用できる。
【００７０】
また、この核酸複合体を有効成分とする医薬は、含まれる核酸の種類が異なる２種以上の核酸含有複合体を含めたものも包含される。このような複数の治療目的を併せ持つ医薬は、多様化する遺伝子治療の分野で特に有用である。
【００７１】
投与量としては、動物、特にヒトに投与される用量は目的の核酸、投与方法および治療される特定部位等、種々の要因によって変化する。しかしながら、その投与量は治療的応答をもたらすに十分であるべきである。
【００７２】
この核酸複合体は、好ましくは遺伝子治療に適用される。適用可能な疾患としては、当該複合体に含められる核酸の種類によって異なるが、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、動脈拡張術後再狭窄等の病変を生じる循環器領域での疾患に加え、癌（悪性黒色腫、脳腫瘍、転移性悪性腫瘍、乳癌等）、感染症（ＨＩＶ等）、単一遺伝病（嚢胞性線維症、慢性肉芽腫、α１−アンチトリプシン欠損症、Gaucher病等）等が挙げられる。
【実施例】
【００７３】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。
【００７４】
ｉ）イニファターの合成
イニファターとしての１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンを次のようにして合成した。
【００７５】
１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチルベンゼン）５．０ｇとＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム３４．０ｇをエタノール１００ｍＬ中へ加え、遮光下、室温で４日間攪拌した。沈殿物を濾過し、３Ｌのメタノール中に投入して３０分間攪拌した後、濾過した。この操作を繰り返し合計４回行った。沈殿物をトルエン２００ｍＬに溶解した後、１００ｍＬのメタノールを加えて５０℃に加温し、冷蔵庫内で１５時間保管して再結晶させ、結晶を濾別後、大量のメタノールで洗浄した。結晶を室温で減圧乾燥して、白色の１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンの針状結晶を得た（収率９０％）。高速液体クロマトグラフィーにより、原料ピークが消失し、精製物が単一物質であることを確認した。
【００７６】
１Ｈ−ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）の測定結果は、δ１．２６−１．３１ｐｐｍ（ｔ，２４Ｈ，ＣＨ２ＣＨ３），δ３．６９−３．７７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ３．９９−４．０７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ４．５７ｐｐｍ（ｓ，８Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２），δ７．４９ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）であった。
【００７７】
【化１】
【００７８】
ii)４分岐型重合体よりなるカチオン性コポリマーの光重合による合成
２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドを混合モノマーとして用い、４分岐型重合体よりなるカチオン性コポリマーの光重合による合成を行った。
【００７９】
即ち、上記ｉ)により合成した１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン４５．６ｍｇを２０ｍＬのトルエンに溶解し、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート８．５ｇ及び３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド１．０ｇを加えて混合し、全量をトルエンで５０ｍＬに調整した。３ｍｍ厚軟質ガラスセル中で激しく攪拌しながら高純度窒素ガスで１０分間パージした後に、３００Ｗショートアークキセノンランプ（朝日分光社製、ＭＡＸ−３０１）で波長２５０〜４００ｎｍの混合紫外線を６０分間照射した。照射強度はウシオ電機社のＵＩＴ−１５０へＵＶＤ−Ｃ４０５（検出波長範囲３２０〜４７０ｎｍ）を装着して２．５ｍＷ／ｃｍ２に調整した。なお、この反応においては、波長が２５０〜４００ｎｍである混合紫外線を照射しているが、反応容器として用いた３ｍｍ厚軟質ガラスセルが、短波長の紫外光を透過しないため、実際には３４０〜４００ｎｍ、波長ごとのガラス透過率も考慮すれば、３５０〜４００ｎｍ程度の波長の光を照射したことになる。光照射後の重合溶液をエバポレーターで濃縮し、３００ｍＬのエーテル／ｎ−ヘキサンの混合溶媒（１／３：ｖ／ｖ）で再沈殿させた。得られた水飴状のポリマーを３００ｍＬのエーテル／ｎ−ヘキサンの混合溶媒（１／３：ｖ／ｖ）で３回抽出して精製し、溶媒を蒸散させた。次いで、得られた固体を少量のベンゼンに溶解し、０．２μｍフィルターで濾過した後、凍結乾燥させて、４分岐型重合体よりなるカチオン性コポリマーを得た。この４分岐型重合体よりなるカチオン性コポリマーのポリエチレングリコールを標準物質とした数平均分子量は、ＧＰＣにより、１３，５００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．４）と測定された。この測定値より、４分岐型重合体の分岐鎖１本当たりの分子量は、３１９５であることが分かった。また、１Ｈ−ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤ３ＯＤ）より共重合比は、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート９３ｍｏｌ％、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド７ｍｏｌ％と計算された。
【００８０】
【化２】
iii)４分岐型重合体よりなるカチオン性コポリマーの光架橋
上記ii)により合成した４分岐型重合体よりなるカチオン性コポリマー０．２ｇと３角柱形の回転子とを１００ｍＬ滅菌瓶に入れ、滅菌瓶の内部の気体を高純度窒素で置換した後、上蓋として３ｍｍ厚軟質ガラス板を用い、この滅菌瓶を密封した。回転子を使用して前記４分岐型重合体を粉末状に粉砕した後、これに３００Ｗショートアークキセノンランプ（朝日分光社製、ＭＡＸ−３０１）を用いて落射式により、波長２５０〜４００ｎｍの混合紫外線を３．５時間照射した。照射強度は、１．０ｍＷ／ｃｍ２に調整した。この光照射により、前記粉末は、若干黄色に変色した。この粉末に対して約３０ｍＬのメタノールを加えたところ、少量の不溶性化合物が生成した。この不溶性化合物を濾別し、濾液をエバポレーターで濃縮した後、この濃縮液をエーテル中に滴下することにより、再沈殿を行った。得られた沈殿物をエーテルで３回洗浄して精製し、溶媒を蒸散させて固体を得た。次いで、この固体を少量のベンゼンに溶解させ、０．２μｍフィルターで濾過した後、凍結乾燥させて、４分岐型重合体よりなるカチオン性コポリマーの光架橋体を得た。この４分岐型重合体よりなるカチオン性コポリマーの光架橋体の数平均分子量は、ＧＰＣにより、２２，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．９）と測定され、ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ）からは、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドへ帰属されるべきジメチルアミノ基のピークが確認されなかった。
【００８１】
iv）４分岐型重合体よりなるカチオン性ホモポリマーの光重合による合成
３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドを用いず、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート７．９ｇをモノマーとして用いたこと以外は、上記ii）と同様の方法で４分岐型重合体よりなるカチオン性ホモポリマーを合成した。得られた４分岐型重合体よりなるカチオン性ホモポリマーは、クロロホルム／ｎ−ヘキサン系により３回再沈殿を行うことにより精製し、得られた固体をベンゼンに溶解させて、この溶液を凍結乾燥することで４分岐型重合体よりなるカチオン性ホモポリマーを得た。この４分岐型重合体よりなるカチオン性ホモポリマーの分子量は、ＧＰＣにより１３，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．３５）と測定された。
【００８２】
１Ｈ−ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤ３ＯＤ）の測定結果は、δ０．８−１．２ｐｐｍ（ｂｒ，３Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ３−），δ１．６−２．０ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ３−），δ２．２−２．４ｐｐｍ(ｂｒ，６Ｈ，Ｎ−ＣＨ３)，δ２．５−２．７ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＣＨ２−Ｎ），δ４．０−４．２ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，Ｏ−ＣＨ２）であった。
【００８３】
【化３】
【００８４】
v）４分岐型重合体よりなるカチオン性ホモポリマーの光架橋の検討
４分岐型重合体よりなるカチオン性コポリマーの代わりに、前記iv）により得られた４分岐型重合体よりなるカチオン性ホモポリマーを用いたこと以外は、前記iii）と同様に光照射を行ったが、光照射後の分子量は、１２，８００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．４０）であり、照射前後で分子量は、ほとんど変化しなかった。
【００８５】
vi）遺伝子導入活性
細胞にはアフリカミドリサル腎細胞の由来のＣＯＳ-１を使用し、ＤＮＡにはｐＧＬ３コントロールベクターを使用した。ＣＯＳ-１細胞は細胞数を４万個／ｍＬに調整して２４Ｗｅｌｌ培養皿へ播種し、培養２４時間後に遺伝子導入を行った。上記ii）において合成したカチオン性コポリマーを実施例１の遺伝子導入剤とし、iii)にて合成した架橋体を実施例２の遺伝子導入剤とし、iv)にて合成したカチオン性ホモポリマーを比較例１の遺伝子導入剤とし、v)において光照射した後のカチオン性ホモポリマーを比較例２の遺伝子導入剤として、それぞれ生理食塩水へ溶解し、濃度（遺伝子導入剤／食塩水）を８μｇ／６０μＬとした。ＤＮＡはＴＥバッフアーへ溶解し、濃度（ＤＮＡ／バッファー）を３μｇ／９０μＬとした。室温で遺伝子導入剤溶液とＤＮＡ溶液を混合した後、温度を３７℃に加温して核酸複合体を形成させた。この核酸複合体２５μＬを１ｍＬの完全培地（ＤＭＥＭ＋１０重量％ＦＣＳ＋抗生物質）へ加え、３０分間インキュベートした。この約１ｍＬの核酸複合体完全培地溶液と、３７℃のＰＢＳで洗浄した培養細胞とを接触させ、４８時間培養を行った。４８時間後、ルシフェラーゼアッセにより遺伝子導入活性の評価を行った（プロメガ社、アッセイキット試薬)。補正はタンパク濃度で行い、タンパク定量はＢｉｏＲａｄ社のＢｒａｄｆｏｒｄ試薬で行った。上記の評価結果を図１に示す。
【００８６】
比較例１，２の遺伝子導入剤は、同程度の遺伝子導入活性を示した。これは、比較例１の分岐型重合体に対して光照射を行っても架橋反応が生じにくく、光照射前後で分子量がほとんど変化しなかったためであると考えられる。これに対して、実施例１の分岐型重合体を架橋した実施例２の架橋分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤は、実施例１に比べて遺伝子導入活性が１０倍程度向上した。これは、光照射により、分岐鎖に含まれるＤＭＡＰＡＡ単位を分岐鎖に有する分岐型重合体同士が、遺伝子の導入に有利な分子量及び構造を備える架橋分岐型重合体に変化したためであると考えられる。
【００８７】
なお、上記実施例１，２及び比較例１，２の遺伝子導入剤を用いて、血清を含まない培地において同様の実験を行ったところ、実施例１の遺伝子導入剤は、比較例１，２の遺伝子導入剤に比べて優れた遺伝子導入活性を示し、実施例２の遺伝子導入剤は、実施例１の遺伝子導入剤に比べて、遺伝子導入活性が４〜６倍程度優れていた。
【００８８】
これらの結果より、ＤＭＡＥＭ単位と共に、ＤＭＡＰＡＡ単位を分岐鎖に有する分岐型重合体は、この分岐型重合体同士を光照射するだけで容易に架橋することができ、この架橋反応により得られる架橋分岐型重合体は、遺伝子導入に有利な構造を備えた化合物であることがわかる。また、血清を含む培地において、実施例２の方が実施例１に比べて優れた遺伝子導入活性を示すのは、血清を含む培地における遺伝子導入の妨げとなるアミン部分が、架橋反応により、アニオン性物質と相互作用しにくい構造に変化したため、もしくは、架橋によりＤＭＡＰＡＡ単位の塩基性が消失したためであると考えられる。即ち、この架橋反応によって、分岐鎖中のＤＭＡＰＡＡ部分が架橋点として寄与することにより、分岐鎖の側鎖の３級アミンが脱離したり、３級アミンから２級アミン、１級アミンへと変化し、塩基性が消失したためであると考えられる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子導入剤及び核酸複合体に係り、特に分岐型重合体を用いた遺伝子導入剤と、この遺伝子導入剤と核酸とを複合させた核酸複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒト疾患の分子遺伝学的要因が明らかになるにつれ、遺伝子治療研究がますます重要視されている。遺伝子治療法は標的とする部位でのＤＮＡの発現を目的としており、いかにＤＮＡを標的部位に到達させるか、いかにＤＮＡを標的部位に効率的に導入し、当該部位で機能的に発現させるかということが重要となる。外来ＤＮＡの導入のためのベクターとして、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ付随ウイルス、レンチウイルス、センダイウイルス又はヘルペスウイルスを含む多くのウイルスが、治療用遺伝子を運搬するように改変されて、遺伝子治療のヒトの臨床試験に使用されている。しかし、感染及び免疫反応の危険性は依然として残されているため、これらのベクターに代わる遺伝子導入技術として、合成高分子ベクター、カチオン性脂質ベクターが研究開発されている。
【０００３】
本出願人らは、ｐＫａの値が高く、中性条件においてもプロトン化されている３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドを主モノマーとして重合してなる分岐鎖を有する分岐型重合体からなる遺伝子導入剤が、効率よく細胞に遺伝子を導入することができることを見出し、先に特許出願した（特許文献１）。
【０００４】
本出願人らはまた、より分子量が大きく、より複雑な構造を有する分岐型重合体の方が遺伝子導入活性に優れるという知見、及び前記３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドを重合してなる分岐鎖の側鎖は、基端側のアミド基と、先端側のアミノ基との間にプロピレン基を有するため、側鎖間における架橋反応が生じ易いという知見に基き、前記分岐型重合体同士を架橋してなる遺伝子導入剤を提案した（特許文献２）。
【０００５】
このようなカチオン性モノマーを重合してなる分岐鎖を有する遺伝子導入剤にあっては、その構造上、電荷密度を高く配置することが可能であるため、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸をより強く凝集させることが可能であり、より粒子径の小さい微細なポリプレックス粒子を形成させることができるが、以下の問題がある。
【０００６】
即ち、細胞に遺伝子を導入する際の細胞を培養する培地としては、細胞へのストレスを軽減する観点から血清を含む培地を用いるが、前述の高ｐＫａの分岐鎖を有する遺伝子導入剤は、その高いカチオン性により、血清中のアニオン性タンパクを吸着してしまう。従って、この遺伝子導入剤は、血清を含む培地において用いた場合、この遺伝子導入剤と核酸とからなる核酸複合体が血清中のアニオン性タンパクを吸着し、マクロ粒子を形成するため、細胞内に取り込まれにくくなったり、核酸がトランスポーターに認識されにくくなり、細胞に対して遺伝子を効率的に導入することができない。
【０００７】
この問題に対して、本出願人らは、血清を含む培地における遺伝子導入方法として、所定温度（Ｔ）未満ではカチオン性を示すが、所定温度（Ｔ）以上では疎水性を示す２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートを重合してなる感温性カチオン性ポリマー鎖よりなる分岐鎖を有する遺伝子導入剤を用い、この遺伝子導入剤と核酸とを含む溶液を所定温度（Ｔ）未満で混合した後、該溶液を所定温度（Ｔ）以上に加温して、遺伝子導入剤と核酸とを複合させることにより核酸複合体を得、この核酸複合体と細胞とを、血清を含む培地において、該所定温度（Ｔ）以上で接触させて、細胞に遺伝子を導入する遺伝子導入方法を提案した（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ２００４／０９２３８８号公報
【特許文献２】特開２００８−２８９４６８号公報
【特許文献３】特願２００９−１２６７１８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
前記特許文献３に記載される２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートを重合してなる分岐鎖は、ｐＫａの値が低く、中性条件下においてほとんど電荷を持っていないため、ＤＮＡの凝集力が弱いものの、血清に含まれるアニオン性タンパクなどの影響を受けにくい。従って、この２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートを重合してなる分岐鎖を有する遺伝子導入剤は、血清を含まない培地においては、前述の３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドを重合してなる遺伝子導入剤よりも低い遺伝子導入活性を示すものの、血清を含む培地においては、高い遺伝子導入活性を示す。
【００１０】
しかしながら、この２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートは、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドに比べて重合性に乏しいため、遺伝子の導入に有利な、分子量の大きい分岐型重合体を合成することが困難である。また、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートを重合してなる分岐鎖の側鎖は、側鎖の先端側のアミノ基と基端側のエステル結合との間がエチレン基であるため、プロピレン基を有する３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドを重合してなる分岐鎖の側鎖に比べて分岐型重合体同士の架橋反応が起こり難い。従って、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートを重合してなる分岐鎖を有する分岐型重合体は、前述の３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドを重合してなる分岐鎖を有する分岐型重合体のように、分岐型重合体同士を架橋することにより、遺伝子導入活性に優れる分子量の高い架橋分岐型重合体を得ることが困難であった。
【００１１】
本発明は上記従来の課題に鑑みてなされたものであり、血清を含む培地において、より効率的に、細胞に遺伝子を導入することができる遺伝子導入剤を提供することを目的とする。
本発明はまた、この遺伝子導入剤と核酸とを複合させてなる核酸複合体を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明（請求項１）の遺伝子導入剤は、芳香環を核とし、それから伸延した複数の分岐鎖を有する分岐型重合体を用いた遺伝子導入剤において、該分岐鎖は、少なくとも２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体と、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドとをランダム共重合してなる重合体よりなり、該重合体を構成する２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体由来の構成単位と、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド由来の構成単位との合計に対する該３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド由来の構成単位の割合が、３０ｍｏｌ％以下であることを特徴とするものである。
【００１３】
請求項２の遺伝子導入剤は、請求項１において、前記重合体を構成する２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体由来の構成単位と、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド由来の構成単位との合計に対する該３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド由来の構成単位の割合が、１〜１５ｍｏｌ％であることを特徴とするものである。
【００１４】
請求項３の遺伝子導入剤は、請求項１又は２において、前記遺伝子導入剤は、前記分岐型重合体に対して光照射することにより該分岐型重合体同士が架橋した架橋分岐型重合体よりなるものであり、該架橋分岐型重合体の数平均分子量は、該分岐型重合体の数平均分子量の１．２倍以上であることを特徴とするものである。
【００１５】
請求項４の遺伝子導入剤は、請求項３において、前記架橋分岐型重合体の数平均分子量は、前記分岐型重合体の数平均分子量の１．２〜５．０倍であることを特徴とするものである。
【００１６】
請求項５の遺伝子導入剤は、請求項１ないし４のいずれか１項において、前記分岐型重合体は、Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これに少なくとも前記２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体と、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドとを光照射リビング重合させてなるものであることを特徴とするものである。
【００１７】
請求項６の遺伝子導入剤は、請求項５において、前記Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物は、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が結合していることを特徴とするものである。
【００１８】
請求項７の遺伝子導入剤は、請求項５又は６において、前記Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基は、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル基であることを特徴とするものである。
【００１９】
請求項８の遺伝子導入剤は、請求項１ないし７のいずれか１項において、前記分岐鎖が、前記２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体と、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドとのランダム共重合体よりなることを特徴とするものである。
【００２０】
請求項９の遺伝子導入剤は、請求項１ないし８のいずれか１項において、前記分岐鎖の１本当たりの分子量は、３００〜２０，０００であることを特徴とするものである。
【００２１】
請求項１０の遺伝子導入剤は、請求項１ないし９のいずれか１項において、前記分岐型重合体の分子量は、２，０００〜１５０，０００であることを特徴とするものである。
【００２２】
本発明（請求項１１）の核酸複合体は、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の遺伝子導入剤と核酸とを複合させてなるものである。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の遺伝子導入剤が有する分岐鎖は、少なくとも２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体（以下、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又は誘導体を、「ＤＭＡＥＭ」と略記する場合がある。）と、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド（以下、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドを、単に、「ＤＭＡＰＡＡ」と略記する場合がある。）とをランダム共重合してなる重合体であって、この分岐鎖の重合体を構成するＤＭＡＥＭ由来の構成単位（以下、「ＤＭＡＥＭ単位」と称す場合がある。）と、該重合体のＤＭＡＰＡＡ由来の構成単位（以下、「ＤＭＡＰＡＡ単位」と称す場合がある。）との合計に対するＤＭＡＰＡＡ単位の割合（以下、この割合を、単に、「ＤＭＡＰＡＡ単位割合」と称す場合がある。）が、３０ｍｏｌ％以下であることを特徴とする。
【００２４】
本発明の遺伝子導入剤にあっては、その分岐鎖が、少なくともＤＭＡＥＭと、ＤＭＡＰＡＡとをランダム共重合してなるポリマー鎖であるため、アニオン性タンパクなどの影響を受けにくいＤＭＡＥＭ単位に起因する効果と、重合性に富み、分子量が大きい分岐型重合体を合成することができるＤＭＡＰＡＡ単位に起因する効果とを有する。
【００２５】
また、本発明にあっては、前記ＤＭＡＰＡＡ単位割合を３０ｍｏｌ％以下、特に１〜１５ｍｏｌ％（請求項２）としているため、遺伝子導入剤全体としてはＤＭＡＥＭ単位に起因する疎水性を示すことから、この遺伝子導入剤を血清を含む培地で用いた場合であっても、血清に含まれるアニオン性タンパクの影響を受けにくく、細胞に対して効率的に遺伝子を導入することができる。
【００２６】
本発明の遺伝子導入剤は、前記分岐型重合体に対して、光照射することにより該分岐型重合体同士が架橋した架橋分岐型重合体よりなるものであってもよく、この場合の該架橋分岐型重合体の数平均分子量は、該分岐型重合体の数平均分子量の１．２倍以上（請求項３）、特に、１．２〜５．０倍であることが好ましい（請求項４）。前記分岐型重合体を架橋することにより、弱塩基性の２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートを主モノマーとして用いた分岐鎖を有する架橋体分岐型重合体を得ることができる。また、架橋分岐型重合体の数平均分子量が、架橋前の分岐型重合体の数平均分子量の１．２倍以上、特に２．０〜３．０倍であれば、架橋分岐型重合体が複雑なネットワーク構造を備えると共に、架橋前の分岐型重合体が有する水への良好な溶解性を維持するため、核酸をより効率的に包接することが可能となる。
【００２７】
前記分岐型重合体は、Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これに少なくとも前記２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体と、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドとを光照射リビング重合させてなるものであることが好ましく（請求項５）、前記Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物としては、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上のＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が結合していることが好ましく（請求項６）、このＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基としては、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル基であることが好ましい（請求項７）。
【００２８】
前記分岐鎖は、前記ＤＭＡＥＭ単位と、ＤＭＡＰＡＡ単位とのランダム共重合体であることが好ましい（請求項８）。
【００２９】
前記分岐鎖１本当たりの分子量は、３００〜２０，０００であることが好ましい（請求項９）。分岐鎖１本当たりの分子量がこの範囲内であると、遺伝子導入剤の高分子量化を抑えた上で、効率的に遺伝子を導入することができる遺伝子導入剤を得ることができる。また、前記分岐型重合体の分子量は、２，０００〜１５０，０００でることが好ましい（請求項１０）。分岐型重合体の分子量が上記範囲内であると、高分子量化を抑えた上で、より効率的に遺伝子導入剤と核酸とを複合化させることができ、比較的低分子量で遺伝子導入効率に優れた遺伝子導入剤を得ることができる。
【００３０】
本発明の核酸複合体は、前記遺伝子導入剤と核酸とを複合させてなる核酸複合体である（請求項１１）。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】実施例１，２及び比較例１，２の遺伝子導入剤の遺伝子導入活性の評価結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下に本発明の実施の形態を詳細に説明する。
【００３３】
［遺伝子導入剤］
＜分岐型重合体＞
本発明の遺伝子導入剤は、芳香環を核とし、それから伸延した複数の分岐鎖を有する分岐型重合体を用いた遺伝子導入剤において、該分岐鎖が、少なくともＤＭＡＥＭと、ＤＭＡＰＡＡとをランダム共重合してなる重合体であって、前記ＤＭＡＰＡＡ単位割合が、３０ｍｏｌ％以下であることを特徴とする。
【００３４】
本発明の遺伝子導入剤は、前述の通り、分岐鎖が少なくともＤＭＡＥＭ単位とＤＭＡＰＡＡ単位とを含むため、ＤＭＡＰＡＡ単位を分岐鎖に有することによる重合性向上効果により、分岐型重合体の高分子量化、分子構造の複雑化を図ることができ、且つ、ＤＭＡＥＭ単位を分岐鎖に有することによる分岐型重合体の疎水化効果により、アニオン性タンパクなどの影響を受けにくいという特徴を併せ持つため、この遺伝子導入剤は、核酸を包接する能力が高く、且つ、血清を含む培地においても効率的に遺伝子を導入することができる。
【００３５】
本発明において用いる分岐型重合体は、Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、このイニファターに少なくともＤＭＡＥＭ及びＤＭＡＰＡＡを光照射リビング重合によりランダム共重合させたものが好ましい。
【００３６】
なお、本明細書において、イニファターとは、光照射によりラジカルを発生させる重合開始剤、連鎖移動剤としての機能と共に、成長末端と結合して成長を停止する機能、さらに光照射が停止すると重合を停止させる重合開始・重合停止剤として機能する分子のことである。
【００３７】
イニファターとなるＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する芳香族化合物としては、ベンゼン環に該Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基、好ましくはＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が３個以上分岐鎖として結合しているものが好適であり、具体的には次が例示される。即ち、３分岐鎖化合物としては、１，３，５−トリ（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，３，５−トリ（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、４分岐鎖化合物としては、１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、６分岐鎖化合物としては、ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られるヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンが挙げられる。なお、ここで、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基に含まれるジアルキル部分のアルキル基としては、エチル基等の炭素数２〜１８個のアルキル基が好ましいが、アルキル基に限らず、フェニル基など芳香族系の炭化水素基であっても構わない。即ち、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基に限らず、Ｎ，Ｎ−ジアリールジチオカルバミルメチル基等を含む、脂肪族炭化水素基及び／又は芳香族炭化水素基で置換されたＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基であれば目的を達成することができる。
【００３８】
上記のイニファターは、アルコール等の極性溶媒に対しては殆ど不溶であるが、非極性溶媒には易溶である。この非極性溶媒としては炭化水素、ハロゲン化アルキル又はハロゲン化アルキレンが好適であり、特に、ベンゼン、トルエン、クロロホルム又は塩化メチレン、特にトルエンが好適である。
【００３９】
上記イニファターとＤＭＡＥＭ及びＤＭＡＰＡＡとを反応させるには、イニファター、ＤＭＡＥＭ、及びＤＭＡＰＡＡを含んでなる原料溶液を調製し、これに光照射することが好ましく、これにより、イニファターに対し、ＤＭＡＥＭ及びＤＭＡＰＡＡがランダム共重合した分岐鎖を導入することができる。
【００４０】
該原料溶液中のＤＭＡＥＭ及びＤＭＡＰＡＡの合計の濃度は０．５Ｍ以上、例えば０．５Ｍ〜２．５Ｍが好適であり、イニファターの濃度は１〜２０ｍＭ程度が好適である。
【００４１】
照射する光の波長は２５０〜４００ｎｍが好適であり、例えばショートアークキセノンランプ、低圧水銀灯、高圧水銀灯などを用いることができる。光の照射時間は照射強度にも依存するが、１〜９０分程度が好適であり、１μＷ／ｃｍ２〜１０ｍＷ／ｃｍ２程度の低い照射強度で１〜６０分程度が特に好適である。
【００４２】
この光照射により、反応液中に目的とする分岐型重合体が生成するので、必要に応じ精製することにより、分岐鎖部分にＤＭＡＥＭ単位及びＤＭＡＰＡＡ単位よりなるポリマー鎖が導入され、分岐鎖の末端がＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基であるポリマーを得る。
【００４３】
本発明に係る分岐型重合体の分岐鎖は、通常、ＤＭＡＥＭとＤＭＡＰＡＡとをランダム共重合してなるポリマー鎖であるが、ＤＭＡＥＭ及びＤＭＡＰＡＡと、その他の１種以上のモノマーとをランダム共重合してなるポリマー鎖であってもよい。
【００４４】
この場合の他のモノマーとしては、アクリル酸誘導体、スチレン誘導体等のビニル系モノマーが好適であり、具体的には、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、４−Ｎ，Ｎ-ジメチルアミノスチレン、及び４−アミノスチレンの誘導体からなる群から選択されるビニル系モノマーが挙げられる。これらのビニル系モノマーは１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
【００４５】
イニファターと、ＤＭＡＥＭ及びＤＭＡＰＡＡと、その他のモノマーとを反応させるには、前述のイニファターとＤＭＡＥＭ及びＤＭＡＰＡＡとを反応させる場合と同様に、イニファター、ＤＭＡＥＭ、ＤＭＡＰＡＡ、及びその他のモノマーを含んでなる原料溶液を調製し、これに光照射することによって、イニファターに対し、ＤＭＡＥＭ、ＤＭＡＰＡＡ、及びその他のモノマーのランダム共重合体よりなる分岐鎖を導入することができる。
【００４６】
本発明の遺伝子導入剤の分岐鎖は、ＤＭＡＰＡＡ単位割合が３０ｍｏｌ％以下、好ましくは、１〜１５ｍｏｌ％である。ＤＭＡＰＰＡ単位割合が３０ｍｏｌ％を超えると、ＤＭＡＥＭ単位とＤＭＡＰＡＡ単位との合計に対するＤＭＡＥＭ単位の割合が少なくなるため、遺伝子導入剤が疎水性を示しにくくなり、血清を含む培地において、アニオン性タンパクなどの影響を受けやすくなる。ただし、ＤＭＡＰＰＡ単位が少なすぎると、ＤＭＡＰＡＡ単位を導入することによる重合性向上効果を十分に得ることができないため、上記下限以上とすることが好ましい。
【００４７】
また、本発明の遺伝子導入剤の分岐鎖が、ＤＭＡＥＭ単位、ＤＭＡＰＡＡ単位、及びその他のモノマー由来の構成単位により構成される場合、その他のモノマー由来の構成単位の割合は、ＤＭＡＥＭ単位、ＤＭＡＰＡＡ単位、及びその他のモノマー由来の構成単位の合計に対して、１０ｍｏｌ％以下とすることが好ましい。この上限を超えると、分岐鎖にＤＭＡＥＭ単位及びＤＭＡＰＡＡ単位を導入することによる疎水化効果や、重合性向上効果を得にくくなる。
【００４８】
本発明において、このような分岐型重合体の分岐鎖の１本当たりの分子量は、３００〜２０，０００程度、特に１，０００〜１０，０００程度が好ましい。この分子量は、光照射の時間を制御することにより調整することができる。即ち、反応時間を長くすることにより、重合反応を進行させて分子量の大きい分岐型重合体を得ることができる。
【００４９】
また、この分岐型重合体の分子量としては、２，０００〜１５０，０００程度、特に８，０００〜５０，０００程度であることが好ましい。
【００５０】
なお、本明細書において、分子量とは、ＧＰＣ（ゲルパーミエーションクロマトグラフィー）によるポリエチレングリコール換算の数平均分子量をさす。
【００５１】
＜架橋分岐型重合体＞
本発明の遺伝子導入剤は、上述の分岐型重合体を用いるものであるが、本発明の遺伝子導入剤は、この分岐型重合体に対して光照射することにより当該分岐型重合体同士を架橋させた架橋分岐型重合体であってもよい。
【００５２】
上述の分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤であっても、遺伝子導入剤全体として疎水性を示すため、血清を含む培地において高い遺伝子導入活性を示すが、この分岐型重合体を架橋させることにより、より遺伝子導入活性に優れる架橋分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤を得ることができる。
【００５３】
このように前記分岐型重合体に対して光照射することにより架橋してなる架橋分岐型重合体にあっては、前記ＤＭＡＰＡＡ単位の優れた反応性を利用することにより、遺伝子導入剤の高分子量化を図ることができると共に、ＤＭＡＰＡＡ単位の塩基性が遺伝子の導入に与える影響を最小限に抑えることができる。
即ち、前記架橋分岐型重合体は、前記分岐型重合体に比べて複雑なネットワーク構造を有しており、アニオン性タンパクとＤＭＡＰＡＡ単位の３級アミンとがその立体障害により接近し難くいため、結果として、アニオン性タンパクとＤＭＡＰＡＡ単位の３級アミンとの相互作用を抑えることができる。また、架橋反応を行うことにより、ＤＭＡＰＡＡ単位の３級アミン脱離したり、２級アミン、１級アミンなどに変化し、塩基性を消失するため、血清を含む培地においても優れた遺伝子導入活性を示す。
【００５４】
前記分岐型重合体同士を架橋する方法としては、例えば、分岐型重合体及び回転子を滅菌瓶に入れ、容器内部の気体を窒素で置換した後、この滅菌瓶を密封し、回転子などを用いて分岐型重合体を粉砕し、光を照射して分岐型重合体同士を架橋する方法、もしくは、溶媒に前記分岐型重合体を溶解及び／又は分散させ、この溶液及び／又は分散液に光を照射して前記分岐型重合体同士を架橋する方法を採用することができる。
【００５５】
前記分岐型重合体同士を架橋する際の光の照射条件は、光波長１８０〜７００ｎｍ、照射時間１分〜３０，０００時間、照射強度０．００１〜１０，０００μＷ／ｃｍ２程度が好適である。
【００５６】
この分岐型重合体を溶媒に溶解及び／又は分散させて架橋する場合に用いる溶媒としては、アルコールが好ましく、例えば、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノールのような低級アルコールが好ましく、特にメタノール、エタノール及び２−プロパノールが好ましい。また、アルコール以外の溶媒としては、水、クロロホルム、トルエン、ベンゼン、キシレン、ジエチルエーテルなどのエーテル、アセトン、メチルエチルケトン、テトラヒドロフラン、塩化メチレンおよび塩化ベンゼンなどを挙げることができる。これらの溶媒は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００５７】
前記溶媒中の分岐型重合体の濃度は、３〜６０重量％、特に６〜３０重量％であることが好ましい。分岐型重合体の濃度が極端に高いと反応が進行しにくくなり、分岐型重合体の濃度が極端に低いと分岐鎖の末端同士の衝突確率が低くなるため好ましくない。
【００５８】
このように架橋してなる架橋分岐型重合体の数平均分子量は、前記分岐型重合体の数平均分子量の１．２倍以上、特に１．２〜５．０倍、即ち、数平均分子量として１０，０００〜３００，０００程度、特に１５，０００〜２００，０００程度であることが好ましい。架橋分岐型重合体の数平均分子量が、分岐型重合体の分子量の１．２倍未満であると、架橋による構造的な優位性を得ることができず、また、５．０倍を超えると、水への溶解性が低下し、架橋分岐型重合体がゲル化するという問題が生じたり、核酸が細胞内に取り込まれにくくなったり、細胞毒性が発現するおそれがある。また、この架橋分岐型重合体と核酸との複合体を生体血管内へ投与する場合には、代謝、排泄の観点から好ましくない。
【００５９】
［核酸複合体］
上記の本発明の遺伝子導入剤（ベクター）が核酸を核酸含有複合体として包囲することによって、生体内の酵素による核酸の失活、分解を抑制することができる。
【００６０】
上記遺伝子導入剤と核酸とを複合させるには、遺伝子導入剤の濃度０．１〜１０００μｇ／ｍＬ程度の溶液に対し、核酸を添加し、混合すればよい。核酸に対して遺伝子導入剤を過剰量添加し、核酸に対して遺伝子導入剤を飽和状態にして遺伝子導入剤と核酸とを複合化することが好ましい。
【００６１】
核酸の好ましい例としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子），ｐ５３癌抑制遺伝子及びＢＲＣＡ１癌抑制遺伝子やサイトカイン遺伝子としてＴＮＦ−α遺伝子，ＩＬ−２遺伝子，ＩＬ−４遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子，ＩＬ−７遺伝子，ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子，ＩＦＮ−γ遺伝子及びＩＬ−１２遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｇｐ−１００，ＭＡＲＴ−１及びＭＡＧＥ−１などの癌抗原ペプチド遺伝子が癌治療に利用できる。
【００６２】
また、ＶＥＧＦ遺伝子，ＨＧＦ遺伝子及びＦＧＦ遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｃ−ｍｙｃアンチセンス，ｃ−ｍｙｂアンチセンス，ｃｄｃ２キナーゼアンチセンス，ＰＣＮＡアンチセンス，Ｅ２Ｆデコイやｐ２１（ｓｄｉ−１）遺伝子が血管治療に利用できる。かかる一連の遺伝子は当業者には良く知られたものである。
【００６３】
核酸複合体の粒径は５０〜４００ｎｍ程度が好適である。この粒径は、例えばレーザを用いた動的光散乱法によって測定される。粒径がこれよりも小さいと、核酸複合体内部の核酸にまで酵素の作用が及ぶおそれ、あるいは腎臓にて濾過排出されるおそれがある。また、これよりも大きいと、細胞に導入されにくくなるおそれがある。
【００６４】
核酸は、細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で用いる。例えばＤＮＡの場合、導入された細胞内で当該ＤＮＡが転写され、それにコードされるポリペプチドの産生を経て機能発現されるように当該ＤＮＡが配置されたプラスミドとして用いる。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、所望の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列されている。
【００６５】
所望により２種以上の核酸をひとつのプラスミドに含めることも可能である。
【００６６】
本発明において、核酸を導入する対象として望ましい「細胞」としては、当該核酸の機能発現が求められるものであり、このような細胞としては、例えば使用する核酸（すなわちその機能）に応じて種々選択され、例えば心筋細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、骨格筋細胞、血管内皮細胞、骨髄細胞、骨細胞、血球幹細胞、血球細胞等が挙げられる。また、単球、樹状細胞、マクロファージ、組織球、クッパー細胞、破骨細胞、滑膜Ａ細胞、小膠細胞、ランゲルハンス細胞、類上皮細胞、多核巨細胞等、消化管上皮細胞・尿細管上皮細胞などである。
【００６７】
本発明の核酸複合体は培養試験に用いるほか、任意の方法で生体に投与することができる。
【００６８】
生体への投与方法としては静脈内又は動脈内への注入が特に好ましいが、筋肉内、脂肪組織内、皮下、皮内、リンパ管内、リンパ節内、体腔（心膜腔、胸腔、腹腔、脳脊髄腔等）内、骨髄内への投与の他に病変組織内に直接投与することも可能である。
【００６９】
この核酸複合体を有効成分とする医薬は、更に必要に応じて製剤上許容し得る担体（浸透圧調整剤，安定化剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤等）と混合することが可能である。これら担体は公知のものが使用できる。
【００７０】
また、この核酸複合体を有効成分とする医薬は、含まれる核酸の種類が異なる２種以上の核酸含有複合体を含めたものも包含される。このような複数の治療目的を併せ持つ医薬は、多様化する遺伝子治療の分野で特に有用である。
【００７１】
投与量としては、動物、特にヒトに投与される用量は目的の核酸、投与方法および治療される特定部位等、種々の要因によって変化する。しかしながら、その投与量は治療的応答をもたらすに十分であるべきである。
【００７２】
この核酸複合体は、好ましくは遺伝子治療に適用される。適用可能な疾患としては、当該複合体に含められる核酸の種類によって異なるが、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、動脈拡張術後再狭窄等の病変を生じる循環器領域での疾患に加え、癌（悪性黒色腫、脳腫瘍、転移性悪性腫瘍、乳癌等）、感染症（ＨＩＶ等）、単一遺伝病（嚢胞性線維症、慢性肉芽腫、α１−アンチトリプシン欠損症、Gaucher病等）等が挙げられる。
【実施例】
【００７３】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。
【００７４】
ｉ）イニファターの合成
イニファターとしての１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンを次のようにして合成した。
【００７５】
１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチルベンゼン）５．０ｇとＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム３４．０ｇをエタノール１００ｍＬ中へ加え、遮光下、室温で４日間攪拌した。沈殿物を濾過し、３Ｌのメタノール中に投入して３０分間攪拌した後、濾過した。この操作を繰り返し合計４回行った。沈殿物をトルエン２００ｍＬに溶解した後、１００ｍＬのメタノールを加えて５０℃に加温し、冷蔵庫内で１５時間保管して再結晶させ、結晶を濾別後、大量のメタノールで洗浄した。結晶を室温で減圧乾燥して、白色の１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンの針状結晶を得た（収率９０％）。高速液体クロマトグラフィーにより、原料ピークが消失し、精製物が単一物質であることを確認した。
【００７６】
１Ｈ−ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）の測定結果は、δ１．２６−１．３１ｐｐｍ（ｔ，２４Ｈ，ＣＨ２ＣＨ３），δ３．６９−３．７７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ３．９９−４．０７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ４．５７ｐｐｍ（ｓ，８Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２），δ７．４９ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）であった。
【００７７】
【化１】
【００７８】
ii)４分岐型重合体よりなるカチオン性コポリマーの光重合による合成
２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドを混合モノマーとして用い、４分岐型重合体よりなるカチオン性コポリマーの光重合による合成を行った。
【００７９】
即ち、上記ｉ)により合成した１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン４５．６ｍｇを２０ｍＬのトルエンに溶解し、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート８．５ｇ及び３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド１．０ｇを加えて混合し、全量をトルエンで５０ｍＬに調整した。３ｍｍ厚軟質ガラスセル中で激しく攪拌しながら高純度窒素ガスで１０分間パージした後に、３００Ｗショートアークキセノンランプ（朝日分光社製、ＭＡＸ−３０１）で波長２５０〜４００ｎｍの混合紫外線を６０分間照射した。照射強度はウシオ電機社のＵＩＴ−１５０へＵＶＤ−Ｃ４０５（検出波長範囲３２０〜４７０ｎｍ）を装着して２．５ｍＷ／ｃｍ２に調整した。なお、この反応においては、波長が２５０〜４００ｎｍである混合紫外線を照射しているが、反応容器として用いた３ｍｍ厚軟質ガラスセルが、短波長の紫外光を透過しないため、実際には３４０〜４００ｎｍ、波長ごとのガラス透過率も考慮すれば、３５０〜４００ｎｍ程度の波長の光を照射したことになる。光照射後の重合溶液をエバポレーターで濃縮し、３００ｍＬのエーテル／ｎ−ヘキサンの混合溶媒（１／３：ｖ／ｖ）で再沈殿させた。得られた水飴状のポリマーを３００ｍＬのエーテル／ｎ−ヘキサンの混合溶媒（１／３：ｖ／ｖ）で３回抽出して精製し、溶媒を蒸散させた。次いで、得られた固体を少量のベンゼンに溶解し、０．２μｍフィルターで濾過した後、凍結乾燥させて、４分岐型重合体よりなるカチオン性コポリマーを得た。この４分岐型重合体よりなるカチオン性コポリマーのポリエチレングリコールを標準物質とした数平均分子量は、ＧＰＣにより、１３，５００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．４）と測定された。この測定値より、４分岐型重合体の分岐鎖１本当たりの分子量は、３１９５であることが分かった。また、１Ｈ−ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤ３ＯＤ）より共重合比は、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート９３ｍｏｌ％、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド７ｍｏｌ％と計算された。
【００８０】
【化２】
iii)４分岐型重合体よりなるカチオン性コポリマーの光架橋
上記ii)により合成した４分岐型重合体よりなるカチオン性コポリマー０．２ｇと３角柱形の回転子とを１００ｍＬ滅菌瓶に入れ、滅菌瓶の内部の気体を高純度窒素で置換した後、上蓋として３ｍｍ厚軟質ガラス板を用い、この滅菌瓶を密封した。回転子を使用して前記４分岐型重合体を粉末状に粉砕した後、これに３００Ｗショートアークキセノンランプ（朝日分光社製、ＭＡＸ−３０１）を用いて落射式により、波長２５０〜４００ｎｍの混合紫外線を３．５時間照射した。照射強度は、１．０ｍＷ／ｃｍ２に調整した。この光照射により、前記粉末は、若干黄色に変色した。この粉末に対して約３０ｍＬのメタノールを加えたところ、少量の不溶性化合物が生成した。この不溶性化合物を濾別し、濾液をエバポレーターで濃縮した後、この濃縮液をエーテル中に滴下することにより、再沈殿を行った。得られた沈殿物をエーテルで３回洗浄して精製し、溶媒を蒸散させて固体を得た。次いで、この固体を少量のベンゼンに溶解させ、０．２μｍフィルターで濾過した後、凍結乾燥させて、４分岐型重合体よりなるカチオン性コポリマーの光架橋体を得た。この４分岐型重合体よりなるカチオン性コポリマーの光架橋体の数平均分子量は、ＧＰＣにより、２２，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．９）と測定され、ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ）からは、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドへ帰属されるべきジメチルアミノ基のピークが確認されなかった。
【００８１】
iv）４分岐型重合体よりなるカチオン性ホモポリマーの光重合による合成
３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドを用いず、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート７．９ｇをモノマーとして用いたこと以外は、上記ii）と同様の方法で４分岐型重合体よりなるカチオン性ホモポリマーを合成した。得られた４分岐型重合体よりなるカチオン性ホモポリマーは、クロロホルム／ｎ−ヘキサン系により３回再沈殿を行うことにより精製し、得られた固体をベンゼンに溶解させて、この溶液を凍結乾燥することで４分岐型重合体よりなるカチオン性ホモポリマーを得た。この４分岐型重合体よりなるカチオン性ホモポリマーの分子量は、ＧＰＣにより１３，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．３５）と測定された。
【００８２】
１Ｈ−ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤ３ＯＤ）の測定結果は、δ０．８−１．２ｐｐｍ（ｂｒ，３Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ３−），δ１．６−２．０ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ３−），δ２．２−２．４ｐｐｍ(ｂｒ，６Ｈ，Ｎ−ＣＨ３)，δ２．５−２．７ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＣＨ２−Ｎ），δ４．０−４．２ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，Ｏ−ＣＨ２）であった。
【００８３】
【化３】
【００８４】
v）４分岐型重合体よりなるカチオン性ホモポリマーの光架橋の検討
４分岐型重合体よりなるカチオン性コポリマーの代わりに、前記iv）により得られた４分岐型重合体よりなるカチオン性ホモポリマーを用いたこと以外は、前記iii）と同様に光照射を行ったが、光照射後の分子量は、１２，８００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．４０）であり、照射前後で分子量は、ほとんど変化しなかった。
【００８５】
vi）遺伝子導入活性
細胞にはアフリカミドリサル腎細胞の由来のＣＯＳ-１を使用し、ＤＮＡにはｐＧＬ３コントロールベクターを使用した。ＣＯＳ-１細胞は細胞数を４万個／ｍＬに調整して２４Ｗｅｌｌ培養皿へ播種し、培養２４時間後に遺伝子導入を行った。上記ii）において合成したカチオン性コポリマーを実施例１の遺伝子導入剤とし、iii)にて合成した架橋体を実施例２の遺伝子導入剤とし、iv)にて合成したカチオン性ホモポリマーを比較例１の遺伝子導入剤とし、v)において光照射した後のカチオン性ホモポリマーを比較例２の遺伝子導入剤として、それぞれ生理食塩水へ溶解し、濃度（遺伝子導入剤／食塩水）を８μｇ／６０μＬとした。ＤＮＡはＴＥバッフアーへ溶解し、濃度（ＤＮＡ／バッファー）を３μｇ／９０μＬとした。室温で遺伝子導入剤溶液とＤＮＡ溶液を混合した後、温度を３７℃に加温して核酸複合体を形成させた。この核酸複合体２５μＬを１ｍＬの完全培地（ＤＭＥＭ＋１０重量％ＦＣＳ＋抗生物質）へ加え、３０分間インキュベートした。この約１ｍＬの核酸複合体完全培地溶液と、３７℃のＰＢＳで洗浄した培養細胞とを接触させ、４８時間培養を行った。４８時間後、ルシフェラーゼアッセにより遺伝子導入活性の評価を行った（プロメガ社、アッセイキット試薬)。補正はタンパク濃度で行い、タンパク定量はＢｉｏＲａｄ社のＢｒａｄｆｏｒｄ試薬で行った。上記の評価結果を図１に示す。
【００８６】
比較例１，２の遺伝子導入剤は、同程度の遺伝子導入活性を示した。これは、比較例１の分岐型重合体に対して光照射を行っても架橋反応が生じにくく、光照射前後で分子量がほとんど変化しなかったためであると考えられる。これに対して、実施例１の分岐型重合体を架橋した実施例２の架橋分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤は、実施例１に比べて遺伝子導入活性が１０倍程度向上した。これは、光照射により、分岐鎖に含まれるＤＭＡＰＡＡ単位を分岐鎖に有する分岐型重合体同士が、遺伝子の導入に有利な分子量及び構造を備える架橋分岐型重合体に変化したためであると考えられる。
【００８７】
なお、上記実施例１，２及び比較例１，２の遺伝子導入剤を用いて、血清を含まない培地において同様の実験を行ったところ、実施例１の遺伝子導入剤は、比較例１，２の遺伝子導入剤に比べて優れた遺伝子導入活性を示し、実施例２の遺伝子導入剤は、実施例１の遺伝子導入剤に比べて、遺伝子導入活性が４〜６倍程度優れていた。
【００８８】
これらの結果より、ＤＭＡＥＭ単位と共に、ＤＭＡＰＡＡ単位を分岐鎖に有する分岐型重合体は、この分岐型重合体同士を光照射するだけで容易に架橋することができ、この架橋反応により得られる架橋分岐型重合体は、遺伝子導入に有利な構造を備えた化合物であることがわかる。また、血清を含む培地において、実施例２の方が実施例１に比べて優れた遺伝子導入活性を示すのは、血清を含む培地における遺伝子導入の妨げとなるアミン部分が、架橋反応により、アニオン性物質と相互作用しにくい構造に変化したため、もしくは、架橋によりＤＭＡＰＡＡ単位の塩基性が消失したためであると考えられる。即ち、この架橋反応によって、分岐鎖中のＤＭＡＰＡＡ部分が架橋点として寄与することにより、分岐鎖の側鎖の３級アミンが脱離したり、３級アミンから２級アミン、１級アミンへと変化し、塩基性が消失したためであると考えられる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
芳香環を核とし、それから伸延した複数の分岐鎖を有する分岐型重合体を用いた遺伝子導入剤において、
該分岐鎖は、少なくとも２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体と、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドとをランダム共重合してなる重合体よりなり、
該重合体を構成する２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体由来の構成単位と、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド由来の構成単位との合計に対する該３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド由来の構成単位の割合が、３０ｍｏｌ％以下であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項２】
請求項１において、前記重合体を構成する２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体由来の構成単位と、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド由来の構成単位との合計に対する該３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド由来の構成単位の割合が、１〜１５ｍｏｌ％であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項３】
請求項１又は２において、前記遺伝子導入剤は、前記分岐型重合体に対して光照射することにより該分岐型重合体同士が架橋した架橋分岐型重合体よりなるものであり、
該架橋分岐型重合体の数平均分子量は、該分岐型重合体の数平均分子量の１．２倍以上であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項４】
請求項３において、前記架橋分岐型重合体の数平均分子量は、前記分岐型重合体の数平均分子量の１．２〜５．０倍であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項において、前記分岐型重合体は、Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これに少なくとも前記２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体と、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドとを光照射リビング重合させてなるものであることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項６】
請求項５において、前記Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物は、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が結合していることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項７】
請求項５又は６において、前記Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基は、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル基であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項において、前記分岐鎖が、前記２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体と、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドのランダム共重合体よりなることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項において、前記分岐鎖の１本当たりの分子量は、３００〜２０，０００であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれか１項において、前記分岐型重合体の分子量は、２，０００〜１５０，０００であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項１１】
請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の遺伝子導入剤と核酸とを複合させてなる核酸複合体。
【請求項１】
芳香環を核とし、それから伸延した複数の分岐鎖を有する分岐型重合体を用いた遺伝子導入剤において、
該分岐鎖は、少なくとも２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体と、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドとをランダム共重合してなる重合体よりなり、
該重合体を構成する２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体由来の構成単位と、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド由来の構成単位との合計に対する該３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド由来の構成単位の割合が、３０ｍｏｌ％以下であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項２】
請求項１において、前記重合体を構成する２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体由来の構成単位と、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド由来の構成単位との合計に対する該３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド由来の構成単位の割合が、１〜１５ｍｏｌ％であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項３】
請求項１又は２において、前記遺伝子導入剤は、前記分岐型重合体に対して光照射することにより該分岐型重合体同士が架橋した架橋分岐型重合体よりなるものであり、
該架橋分岐型重合体の数平均分子量は、該分岐型重合体の数平均分子量の１．２倍以上であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項４】
請求項３において、前記架橋分岐型重合体の数平均分子量は、前記分岐型重合体の数平均分子量の１．２〜５．０倍であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項において、前記分岐型重合体は、Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これに少なくとも前記２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体と、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドとを光照射リビング重合させてなるものであることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項６】
請求項５において、前記Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物は、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が結合していることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項７】
請求項５又は６において、前記Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基は、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル基であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項において、前記分岐鎖が、前記２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体と、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドのランダム共重合体よりなることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項において、前記分岐鎖の１本当たりの分子量は、３００〜２０，０００であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれか１項において、前記分岐型重合体の分子量は、２，０００〜１５０，０００であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項１１】
請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の遺伝子導入剤と核酸とを複合させてなる核酸複合体。
【図１】
【公開番号】特開２０１１−７２２５６（Ｐ２０１１−７２２５６Ａ）
【公開日】平成２３年４月１４日（２０１１．４．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２２７４０４（Ｐ２００９−２２７４０４）
【出願日】平成２１年９月３０日（２００９．９．３０）
【出願人】（５１００９４７２４）独立行政法人国立循環器病研究センター (52)
【出願人】（０００００５２７８）株式会社ブリヂストン (11,469)
【上記１名の代理人】
【識別番号】１０００８６９１１
【弁理士】
【氏名又は名称】重野 剛
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年４月１４日（２０１１．４．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月３０日（２００９．９．３０）
【出願人】（５１００９４７２４）独立行政法人国立循環器病研究センター (52)
【出願人】（０００００５２７８）株式会社ブリヂストン (11,469)
【上記１名の代理人】
【識別番号】１０００８６９１１
【弁理士】
【氏名又は名称】重野 剛
【Ｆターム（参考）】
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