遺伝子操作非ヒト動物、および向精神薬開発法
【課題】自閉症の発生および異常な社会行動を防止する向精神薬の開発等に利用できるｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウト動物、及び向精神薬のスクリーニング方法などを提供すること。
【解決手段】本発明は、相同染色体上のｍｏｔｏｐｓｉｎ遺伝子を破壊することによって、ｍｏｔｏｐｓｉｎの発現が抑制されたノックアウト動物等を提供する。作製したｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスは、行動検査において長時間の社会行動を示す点が認められるなど、ユニークな特徴を有するマウスであった。また、ｍｏｔｏｐｓｉｎを阻害もしくは活性化する物質の探索は、向精神薬のスクリーニング方法として有用である。
【解決手段】本発明は、相同染色体上のｍｏｔｏｐｓｉｎ遺伝子を破壊することによって、ｍｏｔｏｐｓｉｎの発現が抑制されたノックアウト動物等を提供する。作製したｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスは、行動検査において長時間の社会行動を示す点が認められるなど、ユニークな特徴を有するマウスであった。また、ｍｏｔｏｐｓｉｎを阻害もしくは活性化する物質の探索は、向精神薬のスクリーニング方法として有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｍｏｔｏｐｓｉｎ遺伝子欠損動物と向精神薬開発に関し、より詳しくは、正常動物に比し社会行動が亢進しているｍｏｔｏｐｓｉｎ遺伝子欠損非ヒト動物、同遺伝子欠損動物又はｍｏｔｏｐｓｉｎを用いた向精神薬のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｍｏｔｏｐｓｉｎは、一次構造上セリンプロテアーゼの触媒領域において高い相同性を有しながら、プロリンリッチ領域、クリングル領域、スカベンジャーレセプターシステインリッチ領域を含む特徴的な制御領域をもつ蛋白質分解酵素（セリンプロテアーゼ）である。
【０００３】
Ｍｏｔｏｐｓｉｎは、脳や脊髄といった中枢神経系に豊富に含まれるが、肺や腎臓、皮膚にも存在している。ＭｏｔｏｐｓｉｎはＳｏｎｄｅｒｅｇｇｅｒらが我々と同時期にｎｅｕｒｏｔｒｙｐｓｉｎと報告した分子、ＨＵＧＯ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによりｐｒｓｓ１２として認定された分子と同一のものである。特に胎児期後期から新生児期の神経系に高発現することが知られている。Ｍｏｔｏｐｓｉｎは、in vitroにおいてゼラチンやｔｉｓｓｕｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒを分解することが報告されている。また、非症候群性精神遅滞の家系において第7エクソンの４塩基欠損によるナンセンス変異が報告されている。さらに、ショウジョウバエにおいてｍｏｔｏｐｓｉｎオルソローグの欠損が長期記憶を障害することが報告されている。Ｍｏｔｏｐｓｉｎの発現は神経機能の維持に重要であることが軸索傷害実験から示されている。また、ｍｏｔｏｐｓｉｎ蛋白質が主にニューロンの細胞体や樹状突起基部に存在しており、発現量が増加すると軸索にも輸送されることなども報告されている。しかしながら、ほ乳類を含む脊椎動物の脳内機能はほとんど知られておらず、ｍｏｔｏｐｓｉｎ欠損による発達障害発症機構は未だ十分に解明されていない。
【非特許文献１】Mitsui, S., Yamaguchi, N., Osako, Y., Yuri, K., Enzymatic properties and localization of motopsin (PRSS12), a protease whose absence causes mental retardation. Brain Research 1136, 1-12, 2007.
【非特許文献２】Numajiri, T., Mitsui, S., Hisa, Y., Ishida, T., Nishino, K., Yamaguchi, N., The expression of a motoneuron-specific serine protease, motopsin (PRSS12), after facial nerve axotomy in mice. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery 59, 393-397, 2006.
【非特許文献３】Iijima, N., Tanaka, M., Mitsui, S., Yamamura, Y., Yamaguchi, N., Ibata, Y., Expression of a novel serine protease (motopsin PRSS12) mRNA in the mouse brain. :in situ hybridization histochemical study. Mol. Brain Res. 66, 141-149, 1999.
【非特許文献４】Yamamura, Y., Yamashiro, Y., Tsuruoka, N., Nakazato, H., Tsujimura, A., Yamaguchi, N., Molecular cloning of a novel brain-specific serine protease with a kringle-like structure and three scavenger receptor cysteine-rich motifs. Biochemical and Biophyical Research Communications 239, 386-392, 1997.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記のように、ｍｏｔｏｐｓｉｎは中枢神経系の発達や高次機能発現を調節することが示唆されているが、その機能については依然不明な点が多い。ｍｏｔｏｐｓｉｎの機能を解明することは、神経系における細胞外プロテオリシスの仕組みや、情動行動や記憶・学習などの神経活動を総合的に理解し解明することにもつながり、その臨床応用が期待されるものである。
本発明は、上記の問題点に着目してなされたものであり、その目的は、対人関係に関する心的障害の発生を防止する向精神薬の開発等に使用できるｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウト動物を提供すること、また、ｍｏｔｏｐｓｉｎの機能抑制或いは向上、阻害活性の測定による向精神薬のスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
我々は、ｍｏｔｏｐｓｉｎが中枢神経系においてニューロン、特に錐体ニューロン、に特異的に発現していることを見出した。また、顔面神経ニューロンをはじめとする運動ニューロンでのｍｏｔｏｐｓｉｎの発現は、軸索損傷などの細胞傷害で一過的に減少するが、神経機能の回復とともにｍｏｔｏｐｓｉｎの発現も回復することを明らかにした。さらに、ｍｏｔｏｐｓｉｎのノックアウトマウスを作製した。このｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスは、明瞭な形態異常を示さなかったものの、行動検査において社会行動の亢進が認められた。神経解剖学的解析においても野生型とは異なるユニークな特徴を有するマウスであることが見出され、これにより本発明を完成するに至った。
【０００６】
即ち、本発明は第１に、ｍｏｔｏｐｓｉｎ遺伝子のＤＮＡ配列の全部または一部を改変或いは欠損させることにより得られ、相同染色体上の双方のｍｏｔｏｐｓｉｎ遺伝子が破壊され、ｍｏｔｏｐｓｉｎの発現が抑制されたことを特徴とするノックアウト非ヒト動物を提供するものである。
本発明における「ｍｏｔｏｐｓｉｎ遺伝子が破壊され」とは、換言すれば、ｍｏｔｏｐｓｉｎ遺伝子領域の配列が人為的に改変されることによって、ｍｏｔｏｐｓｉｎ遺伝子の正常な発現が阻害されていること、そしてその結果、ｍｏｔｏｐｓｉｎ全長タンパク質の発現が抑制され、生体（特に脳）においてｍｏｔｏｐｓｉｎが正常に機能していないことを意味する。
本発明の「ゲノム中のｍｏｔｏｐｓｉｎ遺伝子のＤＮＡ配列の全部または一部を改変或いは欠損させること」における「全部」とは、ｍｏｔｏｐｓｉｎゲノムＤＮＡのエクソン１の５’端から最後のエクソンの３’端までの領域をいう。また、「一部」とは、この領域の一部であって、ｍｏｔｏｐｓｉｎ遺伝子の正常な発現を阻害するのに必要な範囲・長さの領域、をいう。さらに、「改変」とは、単一または複数のヌクレオチドを置換、欠失、挿入、及び／又は転位させることにより、ゲノムＤＮＡ中の対象領域の塩基配列を他の塩基配列に改変することをいう。
【０００７】
本発明のノックアウト動物は、公知の方法で製作することができる。例えば、後述のように遺伝子ターゲッティング法を用いて作製することができる。同方法において、ｍｏｔｏｐｓｉｎ遺伝子のエクソン１の少なくとも開始コドンを含む領域を相同組み換えにより他の塩基配列に置換することは、ｍｏｔｏｐｓｉｎの正常な発現を阻害できるため、好ましいものである。また、本発明のノックアウト動物は、同方法によって作製されたノックアウト動物のみならず、さらにその子孫をも含むものであり、好ましくは以下の１又は２以上の特徴を有する。
（ａ）野生型動物と比較して社会行動が相対的に亢進している。
（ｂ）野生型動物と比較して海馬および大脳皮質のニューロンにおいて樹状突起スパイン密度が減少している。
本発明のノックアウト動物としては、実験動物として多用されているマウス又はラットであることが好ましいが、これに限定されるものではなく、他の非ヒト哺乳動物であってもよい。
【０００８】
本発明はまた、産業上有用な発明として、下記Ａ）〜Ｄ）の発明を包含するものである。
Ａ） ゲノム中のｍｏｔｏｐｓｉｎ遺伝子のＤＮＡ配列の全部または一部を改変することにより得られ、相同染色体上のｍｏｔｏｐｓｉｎ遺伝子が破壊され、ｍｏｔｏｐｓｉｎの発現が抑制されたことを特徴とするノックアウト動物細胞。
Ｂ）Ｍｏｔｏｐｓｉｎの機能を阻害或いは向上する物質をスクリーニングすることを特徴とする向精神薬のスクリーニング方法。
Ｃ） 向精神薬が、抗自閉症、抗共依存症、又は対人行動改善剤であることを特徴とする上記Ｂ）記載のスクリーニング方法。
Ｄ） 本発明のｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウト動物を用いることを特徴とする上記Ｂ）記載のスクリーニング方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明の実施形態、具体的態様等について説明する。
本発明のｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウト動物は、遺伝子ターゲッティング法などの公知の方法を用いて作製することができる。以下では、遺伝子ターゲッティング法を用いたｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウト動物の作製方法について簡単に説明する（詳細は後述の実施例にて図面を参照しながら説明する。）。
【００１０】
〔１〕ターゲッティングベクターの作製
まず、ターゲッティングベクター（ターゲッティングコンストラクト）の作製のため、対象となる動物のｍｏｔｏｐｓｉｎ遺伝子の一部を単離する。例えば、ノックアウトマウスを作製する場合は、マウスのゲノムＤＮＡライブラリーからｍｏｔｏｐｓｉｎ遺伝子をスクリーニングすればよい。スクリーニングの条件、方法は特に限定されず、スクリーニングに用いるプローブについてもゲノムＤＮＡやｃＤＮＡからＰＣＲ法などを用いて容易に調製することができる。
【００１１】
上記スクリーニングにより得られたゲノムＤＮＡクローンを用いて、相同組み換えのためのターゲッティングベクターを構築する。ゲノムＤＮＡクローンは勿論遺伝子全長である必要はなく、ｍｏｔｏｐｓｉｎ遺伝子を破壊しｍｏｔｏｐｓｉｎの発現を抑制するために必要な領域のみクローニングすればよい。後述の実施例（マウス）においては、ｍｏｔｏｐｓｉｎゲノムＤＮＡのエクソン１（図１）を含む領域をサブクローニングし、開始コドンを含む領域を、相同組み換えにより他の塩基配列に置換することによってノックアウトマウスを作製した。
【００１２】
ターゲッティングベクターは、公知の方法により作製することができ、大略、市販のプラスミドをバックボーンとして、上記ゲノムＤＮＡクローン、ポジティブセレクション用のマーカー（ＰＧＫｎｅｏカセット等）、およびネガティブセレクション用のマーカー（ＤＴ−Ａ遺伝子、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子等）などの各フラグメントを適切に連結することにより作製することができる。このとき、目的とする制限酵素切断部位が適切な位置に配されるようターゲッティングベクターを設計するとよい。また、ターゲッティングの効率は相同領域の長さに依存するので、相同領域はできるだけ長いほうが好ましい。さらに、ターゲッティングベクターは環状より直鎖状のほうが好ましいので、直鎖状化のため相同領域以外の部分に一カ所適当な制限酵素切断部位を設けておくとよい。
【００１３】
〔２〕Ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウト動物の作製
上記方法により作製したターゲッティングベクターを、受精卵、初期胚、又は胚性幹細胞（ＥＳ細胞）などの個体形成能（分化全能性）をもつ細胞にエレクトロポレーション法等により導入し、その後、目的とする相同組み換えが起こった細胞を選別する。選別は、ポジティブ−ネガティブ選択法により薬剤を用いて効率よくスクリーニングできる。選別後、目的とする相同組み換えが起こった細胞を、サザンブロットやＰＣＲ法などによって確認する。最終的に所望の相同組み換えが確認された細胞を、妊娠中の輸卵管または子宮から採取された８細胞期胚または胚盤胞（ブラストシスト）に導入する。８細胞期胚または胚盤胞への細胞の導入は、マイクロインジェクション法等により行うことができるが、これに限定されるものではない。
【００１４】
上記８細胞期胚または胚盤胞を常法に従い仮親に移植する。仮親から生まれた生殖系列キメラ動物（好ましくは雄）と、野生型ｍｏｔｏｐｓｉｎ遺伝子をホモで持つ野生型動物（好ましくは雌）とを交配させることにより、第１世代（Ｆ１）として、相同染色体上の一方のｍｏｔｏｐｓｉｎ遺伝子が相同組み換えにより破壊されたヘテロ接合体を得ることができる。さらに、これらヘテロ接合体同士を交配させることにより、第２世代（Ｆ２）として、相同染色体上の双方のＰＫＮ１ｍｏｔｏｐｓｉｎ遺伝子が破壊されたホモ接合体、即ち本発明のｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウト動物を得ることができる。ホモ接合体の同定は、体の一部（例えば尻尾）を切断し、ＤＮＡを抽出してサザンブロットやＰＣＲ法などによって遺伝子型を調べればよい。また、第２世代（Ｆ２）として、ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウト動物と同腹の野生型動物（野生型遺伝子をホモで持つ）を得ることができるが、この野生型動物は対照実験に好適に用いることができる。
【００１５】
Ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウト動物の対象となる動物は、特に限定されるものではないが、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどの哺乳動物が例示される。これらのうち、実験動物として用いるには、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットが好ましく、なかでも齧歯目がさらに好ましく、近交系が多数作出されており、受精卵の培養、体外受精等の技術が整っているマウス及びラットが、特に好ましい。
【００１６】
以上説明した遺伝子ターゲッティング法は、あくまでその一例を示すものであって、公知の種々の変更が可能であることはいうまでもない。また、本発明以降に新たに開発された方法を使用するものであってもよい。
本発明のノックアウト動物細胞についても、上述した遺伝子ターゲッティング法によって作製可能である。
【００１７】
〔３〕Ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウト動物の利用法（有用性）
本発明のｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウト動物は、中枢神経系におけるｍｏｔｏｐｓｉｎ及びこれを阻害或いは活性化する物質の機能・役割について解析する研究ツールとして有用である。
【００１８】
後述の実施例に示すように、実際にｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスを作製し種々の解析を行った結果、このｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスは明瞭な形態異常を示さず、また行動検査上、嗅覚依存探索行動、短期記憶学習、移動反応（locomotion）や立ち上がり反応（rearing）および不安行動も正常であった。しかしながら、ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスは、ソーシャルレコグニションテストやレジデントイントルーダーテスト等でイントルーダーマウスに対してより長い間接触行動を示した。また、社会行動テストでは、既に提示されたファミリアなマウスに対する探索行動が延長していた。その一方、水迷路検査では野生型マウスと同等の学習能を示す実験結果が得られた。
【００１９】
また、ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスの脳スライス標本を用いた神経解剖的解析では、海馬や大脳皮質において樹状突起のスパイン密度の低下が観察された。
【００２０】
これらの実験結果から、ｍｏｔｏｐｓｉｎは、海馬や大脳皮質におけるシナプス形成あるいは発達・維持に関与し、ｍｏｔｏｐｓｉｎの欠損は海馬や大脳皮質での機能低下が生じ、その結果、ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスでは社会行動が亢進することが推測された。Ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスは、神経細胞数の変化などの著しい形態異常は認められず、そのため、このような社会行動の変化はｍｏｔｏｐｓｉｎの機能的抑制によって生じたものと考えられる。つまり、ｍｏｔｏｐｓｉｎの阻害剤や活性化剤を投与し、社会行動の変化を測定することによって、抗自閉症薬、抗共依存症、対人行動改善剤などの向精神薬の候補物質の選択に用いることができる。
【００２１】
このことは、ｍｏｔｏｐｓｉｎの特異的阻害剤が向精神薬として医薬応用できることを示している。例えば、ｍｏｔｏｐｓｉｎ阻害剤によって自閉症を選択的に抑制する効果が得られ、臨床的には、ｍｏｔｏｐｓｉｎ阻害剤を自閉症改善薬として利用したり、ｍｏｔｏｐｓｉｎ亢進薬を対人依存症の予防薬とするなど、各種の精神神経疾患などに臨床応用することができる。
【００２２】
〔４〕Ｍｏｔｏｐｓｉｎの機能に着目した向精神薬のスクリーニング方法
上記のようにｍｏｔｏｐｓｉｎの機能阻害物質は、自閉症治療薬、その他の心的作用、向精神作用を有する向精神薬として医薬応用し得ることが今回の解析の結果明らかになった。そこで本発明は、ｍｏｔｏｐｓｉｎの機能阻害物質をスクリーニングすることを特徴とする向精神薬のスクリーニング方法を提供するものである。
【００２３】
Ｍｏｔｏｐｓｉｎの機能阻害物質としては、（ａ）ｍｏｔｏｐｓｉｎの酵素活性を阻害する物質のほかに、（ｂ）ｍｏｔｏｐｓｉｎの発現を抑制することによってｍｏｔｏｐｓｉｎの機能を阻害する物質、（ｃ）ｍｏｔｏｐｓｉｎの制御領域とアクチベーター（上流因子）との結合を阻害することによってｍｏｔｏｐｓｉｎの機能を阻害する物質、が挙げられる。
【００２４】
Ｍｏｔｏｐｓｉｎはモザイク型セリンプロテアーゼファミリーであり、機能調節ドメインが各種の物質に結合して機能するので、ｍｏｔｏｐｓｉｎの特異的・選択的阻害剤の探索のため、機能調節ドメインに着目したスクリーニングは好ましい方法である。具体的には、機能調節ドメインとの結合をin vitro又はin vivoにおいて阻害する物質を探索する方法である。
【００２５】
この場合のスクリーニング方法としては、物質間の結合の有無や解離の有無を調べる従来公知の種々の方法を適用することができ、特に限定されるものではない。例えば、ｍｏｔｏｐｓｉｎの機能調節ドメインを大腸菌等を用いて大量に発現させて精製し、試験管内での結合を蛍光基質などによって検出・測定する系を構築することができる。また、阻害剤のマススクリーニングに向けて98 wellまたは384 wellのマイクロタイタープレート等にｍｏｔｏｐｓｉｎを固定し、それに結合したインヒビターを酵素、蛍光色素などで標識した抗体によって検出する系を確立することも可能である。
【００２６】
ｍｏｔｏｐｓｉｎとりわけその機能調節ドメインの高次構造の情報は、ｍｏｔｏｐｓｉｎのニューロン上への局在を特異的に阻害する阻害剤の分子設計に有用であるので、このような情報を利用するものであってもよい。
【００２７】
そのほか、（１）ｍｏｔｏｐｓｉｎの機能調節ドメインをカラムに固定してこれと結合する物質を検索する方法や、（２）免疫沈降免疫ブロット法を用いてｍｏｔｏｐｓｉｎの機能調節ドメインと相互作用蛋白質との結合を阻害する物質を検索する方法、（３）酵母two-hybrid法を用いて、ｍｏｔｏｐｓｉｎの機能調節ドメインとの結合を検出する方法など、物質間の結合の有無や解離の有無を調べる従来公知の種々の方法を本発明のスクリーニング方法に適用可能である。また、本発明以降に新たに開発されたスクリーニング方法を使用するものであってもよい。
【００２８】
Ｍｏｔｏｐｓｉｎの機能調節ドメインとの結合活性をスクリーニングする方法の場合、使用するｍｏｔｏｐｓｉｎは全長蛋白質であってもよいが、上述のように制御領域（又はその一部領域）に相当する部分蛋白質であっても勿論よい。
【００２９】
また、このようなスクリーニング方法によって得られた活性阻害剤について、さらに海馬や大脳皮質のニューロンにおいて樹状突起スパイン密度を増加あるいは減少させる性質の有無を調べることによって、向精神薬を開発する方法は好ましい。
【００３０】
勿論、本発明のスクリーニング方法として、ｍｏｔｏｐｓｉｎの酵素活性を測定して被検物質のｍｏｔｏｐｓｉｎに対する阻害効果、又は活性化効果を調べる方法を採用してもよい。例えば、精製したｍｏｔｏｐｓｉｎとその基質（Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、ゼラチン、ｔｉｓｓｕｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ等）を用いて酵素活性の変化を測定する試験管内活性測定系（cell-free system）でのスクリーニング方法を挙げることができる。この方法の場合、多数の有機化合物のマススクリーニングのため、基質の加水分解の有無を蛍光等で検出する測定系を用いることが好ましい。
【００３１】
精製酵素ではなく、細胞の粗精製画分を用いて、ｍｏｔｏｐｓｉｎの活性測定を行ってもよい。この場合、ｍｏｔｏｐｓｉｎ以外の蛋白質分解酵素も存在するので、ｍｏｔｏｐｓｉｎ特異的な基質の加水分解の有無を検出する系を構築するなどの工夫が必要である。また、上記の方法は、試験管内反応系（cell-free system）でのスクリーニング方法であったが、培養細胞等を用いて細胞内で酵素活性を測定することによりスクリーニングを行ってもよい。
【００３２】
その他、細胞内でのｍｏｔｏｐｓｉｎの発現に影響を与え、その発現量を変化させる物質の探索には、常法に従ってｍｏｔｏｐｓｉｎのｍＲＮＡ量を定量する方法、あるいはｍｏｔｏｐｓｉｎ蛋白質の発現量を定量する方法などを採用することができる。
【実施例】
【００３３】
以下、図面を参照しながら本発明の実施例について説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
〔方法〕
［1-1］Ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスの作製
図１は、本実施例のｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスの作製に使用した遺伝子ターゲッティング法を説明する図である。図中、上から順に、正常のｍｏｔｏｐｓｉｎ遺伝子（Wild type allele）、ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウス作製のためのターゲッティングベクター（Targeting construct）、相同組み換えを起こしたｍｏｔｏｐｓｉｎ遺伝子破壊（変異）アレル（Disrupted allele）の構造をそれぞれ模式的に示す。
【００３４】
まずターゲッティングベクター作製のため、マウスｍｏｔｏｐｓｉｎのゲノムＤＮＡ約１３ｋｂをマウス１２９ＳｖのゲノムＤＮＡのＰＡＣライブラリーよりｃＤＮＡをプローブとしたハイブリダイゼーションによって調製した。得られたクローンをもとに、エクソン１の上流〜３．７ｋｂｐのＡｐａＩ/ＳｓｐＩ ｆｒａｇｍｅｎｔと、下流〜６．８ｋｂｐのＳｐｅＩ/ＢｇｌＩＩｆｒａｇｍｅｎｔをアームとして、Ｎｅｏ耐性遺伝子の両側に挿入し、ターゲッティングベクターを作製した（図１）。なお、このターゲッティングベクターのバックボーンはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔである。
【００３５】
上記ターゲッティングベクターを直鎖化後、１２９Ｓｖ ＥＳ細胞にエレクトロポレーションによって導入した。抗生物質Ｇ４１８耐性クローンをピックアップし、そのゲノムＤＮＡを図１に示す５’プローブ（５’ｐｒｏｂｅ）および３’プローブ（3’ｐｒｏｂｅ）を用いたサザンブロッティングによって解析し、目的の相同組み換えが起こったアレル（Ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ ａｌｌｅｌｅ）を有するクローンを選択した。
【００３６】
相同組み換えが起こった上記ＥＳ細胞のクローンを、公知の方法（Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ８，７０７−７１９， １９９４）に従ってマウス初期胚にマイクロインジェクションすることにより、キメラマウスを得た。さらにこのキメラマウスを野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスと交配し、得られたヘテロ接合体マウスの雌雄を交配することにより、ＥＳ細胞由来の変異アレルをホモで有するｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスを得ることができた。
【００３７】
上記ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスについて、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊとの戻し交配を６回以上繰り返して得られたｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスについて後述の行動実験を行った。
【００３８】
［1-2］免疫化学的解析
抗ｍｏｔｏｐｓｉｎポリクローナル抗体は、マウスｍｏｔｏｐｓｉｎの組換え蛋白質をウサギに免疫して作製した（Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１３６， １−１２， ２００７）。マウスの脳は、９倍量の氷冷した１ｍＭ ＥＤＴＡ， １０μｇ／ｍＬ Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、１０μｇ／ｍＬ Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ，２ｍＭ ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｎａｔｅを含むｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ，ｐＨ７．４）にて、ポリトロンを用いてホモジェナイズし、２倍濃度のＳＤＳ−ｐｏｌｙａｃｒｉｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒと混和した。サンプルをＳＤＳ電気泳動後、ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ膜に転写し、１次抗体として抗ｍｏｔｏｐｓｉｎポリクローナル抗体（２０００倍希釈）、そして２次抗体として、ＡＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（ＣＨＥＭＩＣＯＮ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）をＴＢＳ−Ｔ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ, pH 7.4, ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）で希釈して使用した。免疫反応バンドの検出は、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ発色法によって行った。
【００３９】
［1-3］免疫組織学的検査
組織切片の作製と免疫組織学的な解析は、既述の方法に従った（Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１３６， １−１２， ２００７）。以下に要点を記す。脳を４％パラホルムアルデヒド入りの０．１Ｍリン酸バッファー（ＰＢ，ｐＨ７，４）で灌流固定し、その後１５時間同液で後固定を行った。そして２０％ ｓｕｃｒｏｓｅ ｉｎ ＰＢで２日間置いた後、クリオスタットで２０μｍの切片を調製した。切片は、０．３％ Ｈ２Ｏ２／５０％ Ｍｅｔｈａｎｏｌ ｉｎ ＰＢで処理した後、１次抗体とインキュベートした。
【００４０】
［1-4］ゴルジ染色
ゴルジ染色はＧｉｂｂとＫｏｌｂの方法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ７９， １−４， １９９８）に従って行った。深麻酔下でマウスをＰＢＳで還流した後、脳を摘出してＧｏｌｇｉ−Ｃｏｘ液（１％ニクロム酸カリウム、１％塩化水銀、１％クロム酸カリウム）につけて、暗所にて２週間以上放置する。３０％ｓｕｃｒｏｓｅ ｉｎ ＰＢに２日以上つけた後ビブラトームにて１８０μｍの厚さに薄切してスライドグラスに圧着させる。これをアンモニア水に浸して発色させた後、固定液（富士フイルムｓｕｐｅｒ Ｆｕｊｉ ｆｉｘ）にて固定した。
【００４１】
［1-5］行動学的検査
［1-5-1］オープンフィールドテスト
実験装置は天井部のない立方体の箱であった。側面および床面は厚さ３ｍｍの透明アクリル版製で、内寸は、床部が４０×４０ｃｍ、高さが３０ｃｍであった。実験室は防音されており、実験装置内の被験動物の行動は天井部に設置した行動観察カメラによって撮影した。白熱灯点灯時の実験箱内の照度を床面で１０Ｌｕｘ以下に設定した。
【００４２】
各被験体に１０分間のセッションを与えた。被験体を実験装置の中央部に置いてセッションを開始した。行動指標として、移動距離をビデオ撮影した画像を解析ソフト（エソビジョン）を用いて解析した。またセンタースクエアでの滞在時間を測定した。
【００４３】
［1-5-2］高架式十字迷路テスト
１０Ｌｕｘ以下の実験室に高架式十字（高さ５０、アーム長３０ｃｍ、通路幅５ｃｍ）を設置した。被験マウスを十字中央部に置き１０分間自由に行動をさせて、その様子を天井部ビデオカメラにて撮影記録した。
【００４４】
［1-5-3］ソーシャルレコグニションテスト
被験マウスと卵巣摘出術を施した雌マウスＡを明所下で新しい飼育ケージにいれて１分間天井部のビデオカメラで撮影した後、雌マウスＡを取り出した。５分後に再度雌マウスＡを１分間、被験マウスに１分間提示・ビデオ撮影してとりだす。同様にして雌マウスＡの提示を合計４回行った後、卵巣摘出術を施した別の雌マウスＢを１分間被験マウスに提示して、その行動をビデオ撮影した。遺伝子型についての情報を持たない観察者が被験動物が提示動物に対して探索行動を示した時間を測定し、野生型マウスと比較した。
【００４５】
Ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスの雌マウスＡに対する接触時間と雌マウスＢに対する接触時間は、雌マウスＡ１回目３４．７±２．６秒（平均値±標準誤差、以下同じ）、２回目３９．３±２．４秒、３回目３４．３±２．６秒、４回目３３．０±３．３秒、雌マウスＢ；４６．８±２．３秒であった。一方、野生型マウスにおいては、雌マウスＡ１回目３０．５±４．０秒、２回目３３．１±３．５秒、３回目２６．０±３．８秒、４回目２４．９±３．６秒、雌マウスＢ３５．４±４．１秒であった。
【００４６】
［1-5-4］レジデントイントルーダーテスト
被験マウスを１週間飼育したのち、イントルーダーマウスを被験マウスのケージに入れた。その後１０分間の行動を天井に設置したビデオテープレコーダにて撮影記録した。
【００４７】
Ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスのイントルーダーマウスに対する接触時間および最初の接触までの潜時はそれぞれ、２２８．７±１１．０秒、２１．５±５．４秒であった。一方、野生型マウスでは１６９．４±２８．４秒、３７．９±８．８秒であった。
【００４８】
［1-5-5］社会行動テスト
社会行動テストには、テストボックス（縦４０ｃｍ×横６０ｃｍ×高さ３５ｃｍ）および２個の刺激動物用ワイヤーケージ（ステンレス製、直径１１ｃｍ×高さ１５ｃｍ）を用いた。まず、被験マウスを２個の空ワイヤーケージをいれたテストボックスに入れて１０分間放置する。マウスのテストボックス内への解放はテストボックス中央においた円筒容器（直径１１ｃｍ）にマウスを入れておき、検討容器を取り除くことで行った。一度マウスを円筒容器に戻し、一方のワイヤーケージに刺激用の雄マウス（刺激用マウスＡ）を入れた後、被験動物をテストボックス内を自由に１０分間探索させる。再度、被験マウスを円筒容器に入れてから、空ワイヤーケージに新たに刺激用マウスＢを入れる。円筒容器から試験動物を解放して１０分間テストボックス内を自由に探索させる。以上の３セッションの間、天井よりビデオ撮影を行い、第２セッションでの被験マウスが空ワイヤーケージおよび刺激用マウスＡのワイヤーケージに接触している時間、第３セッションでの刺激用マウスＡ，Ｂのワイヤーケージに接触している時間を計測し、ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスと野生型マウスを比較した。
【００４９】
社会性を検出するセッション２では、野生型マウス、ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスが空ワイヤーケージｖｓ刺激用マウスＡワイヤーケージへ接触していた時間はそれぞれ４．５±１．０秒ｖｓ６６．０±９．０秒、６．０±１．７秒ｖｓ７７．０±８．１秒であった。新規社会に対する好気性を検出する第３セッションでの刺激用マウスＡのワイヤーケージへの接触時間ｖｓ刺激用マウスＢのそれに接触していた時間は、ノックアウトマウス；２８．４±５．７秒ｖｓ４９．０±７．３秒、野生型マウス；９．２±１．４秒ｖｓ３７．５±７．０秒であった。
【００５０】
［1-5-7］探索行動テスト
実験前日に１０Ｌｕｘ以下の照度に設定した実験室にオープンフィールドテストで用いたフィールドを置き、その中に被験マウスを入れて３０分間放置しフィールドに馴化させた。翌日、フィールド内の任意の位置にピンポン球を設置し、被験マウスを入れて１０分間、行動をビデオ撮影する。被験マウスがピンポン球に接するまでの潜時と接している時間を計測した。
【００５１】
Ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスの潜時および接触時間は、３５．０±１４．０秒、８．８±１．４秒、であり、野生型マウスでは４４．４±１１．１秒、１０．５±２．４秒であった。
【００５２】
［1-5-6］嗅覚テスト
被験マウスは実験の１２時間以上前より絶食しておいた。新しい飼育ケージの床敷きの下に飼育用飼料を隠しておいた。被験マウスをこのケージに投入してから、飼料を見つけるまでの潜時、および、飼料を見つけてから食するまでの時間を天井部より撮影したビデオ映像を元に測定した。
【００５３】
Ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスが飼料を見つけるまでの潜時、および見つけてから食するまでの時間は、それぞれ５０．３±６．０秒、２６．６±５．８秒であった。野生型マウスでは、７２．３±１２．９秒、６０．６±１２．４秒であった。
【００５４】
［1-5-5］水迷路学習（WM）
実験装置は円筒形のプールと逃避台からなっていた。プールの内径は１４０ｃｍ、高さは６０ｃｍで、内壁は青色に塗装されていた。逃避台は直径１０ｃｍ、厚さ３ｍｍの円形アクリル版に台座を取り付けたものとした。プールの仮想の東西南北方向には、それぞれ、２０ｃｍ四方の白いアクリル板に黒色の十字を貼り付けたもの（北）、同じく黒三角形を貼り付けたもの（南）、同じく黒正方形（東）、同じく黒丸（西）がプール内から見えるように掲げられていた。逃避台を仮想の北東方向に設置し、水位を逃避台の台面上約１ｃｍに調節した。水はインクで白色に濁らせ、水温は21℃（±1℃）に維持した。
【００５５】
1日1セッション5試行からなる獲得訓練を行った。逃避台のない北東以外の3象限いずれかの壁際から被験体をプールに投入して自由に遊泳させ、逃避台に達するまでの潜時を計測した。被験体が逃避台に載ると、10秒間そこに留めた。プールへ投入後60秒以内に被験体が逃避台に達しない場合は、実験者が逃避台の上へ誘導し、そこに10秒間留めた。投入する象限の順序は被験体毎にランダムとした。試行間間隔（逃避台から取り去ってから次にプールへ投入されるまでの時間）は30秒であった。
【００５６】
最終日の試行セッションが終了して１時間後に避難台を取り除いて、被験マウスをプールに投入して、６０秒間の遊泳させた（プローブテスト）。避難台のあった位置を通過する回数、潜時、および避難台があった象限での滞留割合を測定した。
【００５７】
［1-5-8］Ｙ迷路テスト
被験動物の短期記憶の程度はＹ迷路テストによって行った。照度３０Ｌｕｘの実験室に幅４ｃｍ、長さ４０ｃｍの通路を持つＹ字迷路を設置した。この迷路には高さ１２ｃｍの壁があるが、各壁の色は黄色（Ａ）、グレー（Ｂ）、青色（Ｃ）といったように色彩が異なっている。迷路の中心に被験マウスを入れて８分間行動をビデオ撮影した。マウスは最も以前に進入した場所に進入する傾向があり、各通路への進入を記憶していればその進入順はＡＢＣＡＢＣＡＢＣのようになる。そこで異なる３つの通路に連続して進入した回数（上記の例では７）のその最大数（総進入数−２）に対する割合（％ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ）を短期記憶の程度として判定した。
【００５８】
Ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスは５２．７±５．３％ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎを示し、野生型マウスは５０．１±５．２％ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎを示した。
【００５９】
〔結果〕
［2-1］
脳におけるｍｏｔｏｐｓｉｎの機能を明らかにするため、図１に示すように、エクソン１ａの開始コドンを含む領域をＮｅｏ耐性遺伝子で置き換えるターゲッティングベクターを構築し、ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスを作製した。Ｍｏｔｏｐｓｉｎ遺伝子の欠落はサザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ法によって確認できた。全体的な肉眼的および脳の光学顕微鏡検査において、ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスは野生型マウスと明らかな差を認めなかった。特に中枢神経系に注意して観察を行ったが、皮質・海馬・線条体・小脳・視床・視床下部に明らかに異常な顕微鏡所見を認めなかった。また、仔マウスの遺伝子型は、正常のメンデル遺伝に従っていた。
【００６０】
Ｍｏｔｏｐｓｉｎ ｍＲＮＡの発現は野生型マウスやヘテロマウスではノーザンハイブリダイゼーションによって確認できたが、ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスでは検出されなかった。Ｍｏｔｏｐｓｉｎを認識する抗体を用いた免疫組織化学法の結果では、ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウス脳においては、ｍｏｔｏｐｓｉｎ陽性反応は検出されなかった。野生型マウス脳ではｍｏｔｏｐｓｉｎは海馬、大脳皮質等で検出された（図２）。
【００６１】
［2-2］Ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスにおける情動行動
Ｍｏｔｏｐｓｉｎ欠損が、マウスの基礎的な神経機能に及ぼす影響を検討するため、ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスの行動学的検査を行った。
Ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスおよび野生型マウス用いてオープンフィールドテストを行った結果、それぞれの移動距離はｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスが２８０９．８±１１８．３ｃｍ、野生型マウスが２８００．８±１３６．６ｃｍであった。また、センタースクエアでの滞留時間はそれぞれ１４２．２±２１．１秒、１３９．８±１４．４秒であり、ゲノタイプによる差は認められなかった（図３）。また、高架式十字迷路の結果、ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスのオープンアームでの滞留時間および進入比率は８２．１±２６．０秒、２３．５±３．３％であり、野生型マウスでは５４．９±１５．６秒、１９．６±２．４％であった（図４）。これらのことから、ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスでは不安行動には異常が認められないといえる。
【００６２】
［2-3］Ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスにおける社会行動の異常
次に社会行動に障害があるかどうかを検討するため、ソーシャルレコグニションテスト、レジデントイントルーダーテスト、社会行動テストの３種類を行った（図５−７）。ソーシャルレコグニションテストでは、いずれのマウスも雌マウスＡに対する接触時間がセッションを経るごとに有意に低下し、雌マウスＢに対して有意に接触時間が遅延することから、刺激動物を認識していることが明らかである。しかし、意外なことにいずれの測定時点においてもｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスは野生型マウスに比べて有意に接触時間が長かった。この傾向は、レジデントイントルーダーテストにおいても確認された。
【００６３】
社会行動テストにおいてもｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスは野生型マウスと異なる反応を示した。野生型マウスは第３セッションにおいて第２セッションで既に提示された刺激用マウスＡに対しては接触時間が短くなるのに対して、ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスは有意に長い接触時間を示した。以上の結果から、ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスは社会行動が亢進しており、抗自閉症的な行動を示すことが明らかである。
【００６４】
［2-4］Ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスの探索および嗅覚行動
Ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスにおいて観察された社会行動の亢進が社会的要素に特異的であること、および嗅覚異常に起因するもので無いことを確認するために、探索行動テストと嗅覚テストを行った（図８，９）。探索行動テストでは、無機物質に対する接触時間および最初に接触するまでの潜時にｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスと野生型マウスに差は認められなかった。嗅覚テストにおいても、餌を見つけるまでの時間にゲノタイプ間で有意差は認められなかったが、餌を見つけてから食べるまでの時間はｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスで有意に短かった。Ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスによる無機物に対する野生型マウスと同様の反応性は社会性行動テストのセッション２において、空ケージに対する接触時間が両者において差が認められなかったことからも明らかである。従って、ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスは社会性行動特有の異常を呈すると考えられた。
【００６５】
［2-5］Ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスの空間学習能
Ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスの空間学習能を検討するために、モリス水迷路学習テストとＹ迷路テストを行った（図１０，１１）。モリス水迷路学習テストの獲得訓練では、ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスは野生型マウスと同等の学習能を示した。プローブテストの結果、避難台領域を通過する回数、避難台があった象限での滞留時間も野生型マウスと同等であったが、避難台領域に到達する潜時がｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスでは有意に遅延していた。一方、Ｙ迷路テストではｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスは野生型マウスと同等の％ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎを示したことから、短期記憶については異常が認められないといえる。
【００６６】
［2-5］Ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスのスパイン密度の低下
Ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスが呈する行動学的異常の発症機構を明らかにするためにゴルジ染色によるニューロンの形態観察を行った。その結果、海馬の錐体ニューロンの２０μｍ当たりのスパイン密度はｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスでは、頂上樹状突起では７．７±０．４個であり、基底樹状突起では８．４±０．２個であった。野生型マウスにおいてはそれぞれ、８．９±０．４個、８．３±０．２個であり、頂上樹状突起においてｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスは有意にスパイン密度が減少していた（図１２）。
【００６７】
［2-6］本実施例の結果と考察
今回ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスにおいて、社会行動の亢進や空間記憶能の低下が認められ、また神経解剖学的検査において、海馬錐体ニューロンにおけるスパイン密度が低下するという現象が認められた。
【００６８】
Ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスがこれらの現象を引き起こした分子メカニズムについては今後更なる解析を要するが、近年、精神遅滞の原因遺伝子があいついで同定されてニューロンの細胞内情報伝達機構が乱れることでスパインの形態異常が引き起こされることが一因であると考えられつつある。しかし、従来知られている精神遅滞原因遺伝子が細胞内情報伝達に関わる分子であるのに対してｍｏｔｏｐｓｉｎは細胞外に分泌されるプロテアーゼであることから、薬剤による制御がより容易であり、各種神経疾患に対する新たな治療・診断法を提供することができる。
【００６９】
最近、ｔｅｎａｓｃｉｎＣノックアウトマウスでは社会行動が向上していることが報告された。（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２３， １２５５−１２６５， ２００６）。しかし、このマウスでは不安反応の低下や探索行動の亢進が認められており、社会行動に特異的な変化とは言い難い。また、以前より精神遅滞原因遺伝子の欠損マウスに社会行動の異常が見られると報告されている。例えば、Ｍｅｃｐ２に分断変異を持つマウスやＳｅｃｒｅｔｉｎ受容体ノックアウトマウスでは刺激動物との接触時間が著しく減少することが報告されている（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２６， ３１９−３２７， ２００６、Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５， ３２４１−３２５０， ２００６）。しかし、これらのマウスでは社会行動以外にもロコモーター活性、空間学習能、不安行動等に異常が認められ、社会行動が特異的に亢進しているｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスとは表現型が異なっている。
【００７０】
今回ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスにおいては、社会行動の亢進が認められるものの、不安行動や空間学習能、社会性認識能力、探索行動などは正常であるという現象は非常ユニークである。このことは、ｍｏｔｏｐｓｉｎの特異的阻害薬の探索が、抗自閉症薬など社会適応行動の亢進のための新薬開発につながることを示すものである。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】本発明の実施例に係るｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスの作出に用いた遺伝子ターゲッティング法を説明する図である。
【図２】Ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスにおいてｍｏｔｏｐｓｉｎの発現が認められないことをノーザンハイブリダイゼーションおよび免疫組織化学法によって確認したことを説明する図である。
【図３】オープンフィールドテストにおける移動反応とセンタースクエアでの滞在時間の測定結果を示すグラフである。
【図４】高架式十字迷路におけるオープンアームでの滞留時間および進入割合を示すグラフである。
【図５】ソーシャルレコグニションテストにおいて刺激動物との接触時間の測定結果を示すグラフである。
【図６】レジデントイントルーダーテストにおいて刺激動物との接触時間の測定結果を示すグラフである。
【図７】社会行動テストにおいて、空ワイヤーケージおよび刺激用マウスの入ったワイヤーケージへの接触時間結果を示すグラフである。
【図８】探索行動テストにおいて、無機物質へ接触するまでの潜時と接触時間の測定結果を示すグラフである。
【図９】嗅覚行動テストにおいて、餌を見つけるまでの潜時と見つけてから食するまでの時間の測定結果を示すグラフである。
【図１０】モリス水迷路において、獲得訓練時の避難台への逃避時間の測定結果とプローブテスト時の各象限への滞在時間、仮想避難台への到達するまでの潜時を測定した結果を示すグラフである。
【図１１】Ｙ迷路テストにおける％ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎを示すグラフである。
【図１２】海馬錐体ニューロンにおける樹状突起スパイン密度を計測した結果を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｍｏｔｏｐｓｉｎ遺伝子欠損動物と向精神薬開発に関し、より詳しくは、正常動物に比し社会行動が亢進しているｍｏｔｏｐｓｉｎ遺伝子欠損非ヒト動物、同遺伝子欠損動物又はｍｏｔｏｐｓｉｎを用いた向精神薬のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｍｏｔｏｐｓｉｎは、一次構造上セリンプロテアーゼの触媒領域において高い相同性を有しながら、プロリンリッチ領域、クリングル領域、スカベンジャーレセプターシステインリッチ領域を含む特徴的な制御領域をもつ蛋白質分解酵素（セリンプロテアーゼ）である。
【０００３】
Ｍｏｔｏｐｓｉｎは、脳や脊髄といった中枢神経系に豊富に含まれるが、肺や腎臓、皮膚にも存在している。ＭｏｔｏｐｓｉｎはＳｏｎｄｅｒｅｇｇｅｒらが我々と同時期にｎｅｕｒｏｔｒｙｐｓｉｎと報告した分子、ＨＵＧＯ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによりｐｒｓｓ１２として認定された分子と同一のものである。特に胎児期後期から新生児期の神経系に高発現することが知られている。Ｍｏｔｏｐｓｉｎは、in vitroにおいてゼラチンやｔｉｓｓｕｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒを分解することが報告されている。また、非症候群性精神遅滞の家系において第7エクソンの４塩基欠損によるナンセンス変異が報告されている。さらに、ショウジョウバエにおいてｍｏｔｏｐｓｉｎオルソローグの欠損が長期記憶を障害することが報告されている。Ｍｏｔｏｐｓｉｎの発現は神経機能の維持に重要であることが軸索傷害実験から示されている。また、ｍｏｔｏｐｓｉｎ蛋白質が主にニューロンの細胞体や樹状突起基部に存在しており、発現量が増加すると軸索にも輸送されることなども報告されている。しかしながら、ほ乳類を含む脊椎動物の脳内機能はほとんど知られておらず、ｍｏｔｏｐｓｉｎ欠損による発達障害発症機構は未だ十分に解明されていない。
【非特許文献１】Mitsui, S., Yamaguchi, N., Osako, Y., Yuri, K., Enzymatic properties and localization of motopsin (PRSS12), a protease whose absence causes mental retardation. Brain Research 1136, 1-12, 2007.
【非特許文献２】Numajiri, T., Mitsui, S., Hisa, Y., Ishida, T., Nishino, K., Yamaguchi, N., The expression of a motoneuron-specific serine protease, motopsin (PRSS12), after facial nerve axotomy in mice. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery 59, 393-397, 2006.
【非特許文献３】Iijima, N., Tanaka, M., Mitsui, S., Yamamura, Y., Yamaguchi, N., Ibata, Y., Expression of a novel serine protease (motopsin PRSS12) mRNA in the mouse brain. :in situ hybridization histochemical study. Mol. Brain Res. 66, 141-149, 1999.
【非特許文献４】Yamamura, Y., Yamashiro, Y., Tsuruoka, N., Nakazato, H., Tsujimura, A., Yamaguchi, N., Molecular cloning of a novel brain-specific serine protease with a kringle-like structure and three scavenger receptor cysteine-rich motifs. Biochemical and Biophyical Research Communications 239, 386-392, 1997.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記のように、ｍｏｔｏｐｓｉｎは中枢神経系の発達や高次機能発現を調節することが示唆されているが、その機能については依然不明な点が多い。ｍｏｔｏｐｓｉｎの機能を解明することは、神経系における細胞外プロテオリシスの仕組みや、情動行動や記憶・学習などの神経活動を総合的に理解し解明することにもつながり、その臨床応用が期待されるものである。
本発明は、上記の問題点に着目してなされたものであり、その目的は、対人関係に関する心的障害の発生を防止する向精神薬の開発等に使用できるｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウト動物を提供すること、また、ｍｏｔｏｐｓｉｎの機能抑制或いは向上、阻害活性の測定による向精神薬のスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
我々は、ｍｏｔｏｐｓｉｎが中枢神経系においてニューロン、特に錐体ニューロン、に特異的に発現していることを見出した。また、顔面神経ニューロンをはじめとする運動ニューロンでのｍｏｔｏｐｓｉｎの発現は、軸索損傷などの細胞傷害で一過的に減少するが、神経機能の回復とともにｍｏｔｏｐｓｉｎの発現も回復することを明らかにした。さらに、ｍｏｔｏｐｓｉｎのノックアウトマウスを作製した。このｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスは、明瞭な形態異常を示さなかったものの、行動検査において社会行動の亢進が認められた。神経解剖学的解析においても野生型とは異なるユニークな特徴を有するマウスであることが見出され、これにより本発明を完成するに至った。
【０００６】
即ち、本発明は第１に、ｍｏｔｏｐｓｉｎ遺伝子のＤＮＡ配列の全部または一部を改変或いは欠損させることにより得られ、相同染色体上の双方のｍｏｔｏｐｓｉｎ遺伝子が破壊され、ｍｏｔｏｐｓｉｎの発現が抑制されたことを特徴とするノックアウト非ヒト動物を提供するものである。
本発明における「ｍｏｔｏｐｓｉｎ遺伝子が破壊され」とは、換言すれば、ｍｏｔｏｐｓｉｎ遺伝子領域の配列が人為的に改変されることによって、ｍｏｔｏｐｓｉｎ遺伝子の正常な発現が阻害されていること、そしてその結果、ｍｏｔｏｐｓｉｎ全長タンパク質の発現が抑制され、生体（特に脳）においてｍｏｔｏｐｓｉｎが正常に機能していないことを意味する。
本発明の「ゲノム中のｍｏｔｏｐｓｉｎ遺伝子のＤＮＡ配列の全部または一部を改変或いは欠損させること」における「全部」とは、ｍｏｔｏｐｓｉｎゲノムＤＮＡのエクソン１の５’端から最後のエクソンの３’端までの領域をいう。また、「一部」とは、この領域の一部であって、ｍｏｔｏｐｓｉｎ遺伝子の正常な発現を阻害するのに必要な範囲・長さの領域、をいう。さらに、「改変」とは、単一または複数のヌクレオチドを置換、欠失、挿入、及び／又は転位させることにより、ゲノムＤＮＡ中の対象領域の塩基配列を他の塩基配列に改変することをいう。
【０００７】
本発明のノックアウト動物は、公知の方法で製作することができる。例えば、後述のように遺伝子ターゲッティング法を用いて作製することができる。同方法において、ｍｏｔｏｐｓｉｎ遺伝子のエクソン１の少なくとも開始コドンを含む領域を相同組み換えにより他の塩基配列に置換することは、ｍｏｔｏｐｓｉｎの正常な発現を阻害できるため、好ましいものである。また、本発明のノックアウト動物は、同方法によって作製されたノックアウト動物のみならず、さらにその子孫をも含むものであり、好ましくは以下の１又は２以上の特徴を有する。
（ａ）野生型動物と比較して社会行動が相対的に亢進している。
（ｂ）野生型動物と比較して海馬および大脳皮質のニューロンにおいて樹状突起スパイン密度が減少している。
本発明のノックアウト動物としては、実験動物として多用されているマウス又はラットであることが好ましいが、これに限定されるものではなく、他の非ヒト哺乳動物であってもよい。
【０００８】
本発明はまた、産業上有用な発明として、下記Ａ）〜Ｄ）の発明を包含するものである。
Ａ） ゲノム中のｍｏｔｏｐｓｉｎ遺伝子のＤＮＡ配列の全部または一部を改変することにより得られ、相同染色体上のｍｏｔｏｐｓｉｎ遺伝子が破壊され、ｍｏｔｏｐｓｉｎの発現が抑制されたことを特徴とするノックアウト動物細胞。
Ｂ）Ｍｏｔｏｐｓｉｎの機能を阻害或いは向上する物質をスクリーニングすることを特徴とする向精神薬のスクリーニング方法。
Ｃ） 向精神薬が、抗自閉症、抗共依存症、又は対人行動改善剤であることを特徴とする上記Ｂ）記載のスクリーニング方法。
Ｄ） 本発明のｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウト動物を用いることを特徴とする上記Ｂ）記載のスクリーニング方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明の実施形態、具体的態様等について説明する。
本発明のｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウト動物は、遺伝子ターゲッティング法などの公知の方法を用いて作製することができる。以下では、遺伝子ターゲッティング法を用いたｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウト動物の作製方法について簡単に説明する（詳細は後述の実施例にて図面を参照しながら説明する。）。
【００１０】
〔１〕ターゲッティングベクターの作製
まず、ターゲッティングベクター（ターゲッティングコンストラクト）の作製のため、対象となる動物のｍｏｔｏｐｓｉｎ遺伝子の一部を単離する。例えば、ノックアウトマウスを作製する場合は、マウスのゲノムＤＮＡライブラリーからｍｏｔｏｐｓｉｎ遺伝子をスクリーニングすればよい。スクリーニングの条件、方法は特に限定されず、スクリーニングに用いるプローブについてもゲノムＤＮＡやｃＤＮＡからＰＣＲ法などを用いて容易に調製することができる。
【００１１】
上記スクリーニングにより得られたゲノムＤＮＡクローンを用いて、相同組み換えのためのターゲッティングベクターを構築する。ゲノムＤＮＡクローンは勿論遺伝子全長である必要はなく、ｍｏｔｏｐｓｉｎ遺伝子を破壊しｍｏｔｏｐｓｉｎの発現を抑制するために必要な領域のみクローニングすればよい。後述の実施例（マウス）においては、ｍｏｔｏｐｓｉｎゲノムＤＮＡのエクソン１（図１）を含む領域をサブクローニングし、開始コドンを含む領域を、相同組み換えにより他の塩基配列に置換することによってノックアウトマウスを作製した。
【００１２】
ターゲッティングベクターは、公知の方法により作製することができ、大略、市販のプラスミドをバックボーンとして、上記ゲノムＤＮＡクローン、ポジティブセレクション用のマーカー（ＰＧＫｎｅｏカセット等）、およびネガティブセレクション用のマーカー（ＤＴ−Ａ遺伝子、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子等）などの各フラグメントを適切に連結することにより作製することができる。このとき、目的とする制限酵素切断部位が適切な位置に配されるようターゲッティングベクターを設計するとよい。また、ターゲッティングの効率は相同領域の長さに依存するので、相同領域はできるだけ長いほうが好ましい。さらに、ターゲッティングベクターは環状より直鎖状のほうが好ましいので、直鎖状化のため相同領域以外の部分に一カ所適当な制限酵素切断部位を設けておくとよい。
【００１３】
〔２〕Ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウト動物の作製
上記方法により作製したターゲッティングベクターを、受精卵、初期胚、又は胚性幹細胞（ＥＳ細胞）などの個体形成能（分化全能性）をもつ細胞にエレクトロポレーション法等により導入し、その後、目的とする相同組み換えが起こった細胞を選別する。選別は、ポジティブ−ネガティブ選択法により薬剤を用いて効率よくスクリーニングできる。選別後、目的とする相同組み換えが起こった細胞を、サザンブロットやＰＣＲ法などによって確認する。最終的に所望の相同組み換えが確認された細胞を、妊娠中の輸卵管または子宮から採取された８細胞期胚または胚盤胞（ブラストシスト）に導入する。８細胞期胚または胚盤胞への細胞の導入は、マイクロインジェクション法等により行うことができるが、これに限定されるものではない。
【００１４】
上記８細胞期胚または胚盤胞を常法に従い仮親に移植する。仮親から生まれた生殖系列キメラ動物（好ましくは雄）と、野生型ｍｏｔｏｐｓｉｎ遺伝子をホモで持つ野生型動物（好ましくは雌）とを交配させることにより、第１世代（Ｆ１）として、相同染色体上の一方のｍｏｔｏｐｓｉｎ遺伝子が相同組み換えにより破壊されたヘテロ接合体を得ることができる。さらに、これらヘテロ接合体同士を交配させることにより、第２世代（Ｆ２）として、相同染色体上の双方のＰＫＮ１ｍｏｔｏｐｓｉｎ遺伝子が破壊されたホモ接合体、即ち本発明のｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウト動物を得ることができる。ホモ接合体の同定は、体の一部（例えば尻尾）を切断し、ＤＮＡを抽出してサザンブロットやＰＣＲ法などによって遺伝子型を調べればよい。また、第２世代（Ｆ２）として、ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウト動物と同腹の野生型動物（野生型遺伝子をホモで持つ）を得ることができるが、この野生型動物は対照実験に好適に用いることができる。
【００１５】
Ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウト動物の対象となる動物は、特に限定されるものではないが、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどの哺乳動物が例示される。これらのうち、実験動物として用いるには、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットが好ましく、なかでも齧歯目がさらに好ましく、近交系が多数作出されており、受精卵の培養、体外受精等の技術が整っているマウス及びラットが、特に好ましい。
【００１６】
以上説明した遺伝子ターゲッティング法は、あくまでその一例を示すものであって、公知の種々の変更が可能であることはいうまでもない。また、本発明以降に新たに開発された方法を使用するものであってもよい。
本発明のノックアウト動物細胞についても、上述した遺伝子ターゲッティング法によって作製可能である。
【００１７】
〔３〕Ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウト動物の利用法（有用性）
本発明のｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウト動物は、中枢神経系におけるｍｏｔｏｐｓｉｎ及びこれを阻害或いは活性化する物質の機能・役割について解析する研究ツールとして有用である。
【００１８】
後述の実施例に示すように、実際にｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスを作製し種々の解析を行った結果、このｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスは明瞭な形態異常を示さず、また行動検査上、嗅覚依存探索行動、短期記憶学習、移動反応（locomotion）や立ち上がり反応（rearing）および不安行動も正常であった。しかしながら、ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスは、ソーシャルレコグニションテストやレジデントイントルーダーテスト等でイントルーダーマウスに対してより長い間接触行動を示した。また、社会行動テストでは、既に提示されたファミリアなマウスに対する探索行動が延長していた。その一方、水迷路検査では野生型マウスと同等の学習能を示す実験結果が得られた。
【００１９】
また、ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスの脳スライス標本を用いた神経解剖的解析では、海馬や大脳皮質において樹状突起のスパイン密度の低下が観察された。
【００２０】
これらの実験結果から、ｍｏｔｏｐｓｉｎは、海馬や大脳皮質におけるシナプス形成あるいは発達・維持に関与し、ｍｏｔｏｐｓｉｎの欠損は海馬や大脳皮質での機能低下が生じ、その結果、ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスでは社会行動が亢進することが推測された。Ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスは、神経細胞数の変化などの著しい形態異常は認められず、そのため、このような社会行動の変化はｍｏｔｏｐｓｉｎの機能的抑制によって生じたものと考えられる。つまり、ｍｏｔｏｐｓｉｎの阻害剤や活性化剤を投与し、社会行動の変化を測定することによって、抗自閉症薬、抗共依存症、対人行動改善剤などの向精神薬の候補物質の選択に用いることができる。
【００２１】
このことは、ｍｏｔｏｐｓｉｎの特異的阻害剤が向精神薬として医薬応用できることを示している。例えば、ｍｏｔｏｐｓｉｎ阻害剤によって自閉症を選択的に抑制する効果が得られ、臨床的には、ｍｏｔｏｐｓｉｎ阻害剤を自閉症改善薬として利用したり、ｍｏｔｏｐｓｉｎ亢進薬を対人依存症の予防薬とするなど、各種の精神神経疾患などに臨床応用することができる。
【００２２】
〔４〕Ｍｏｔｏｐｓｉｎの機能に着目した向精神薬のスクリーニング方法
上記のようにｍｏｔｏｐｓｉｎの機能阻害物質は、自閉症治療薬、その他の心的作用、向精神作用を有する向精神薬として医薬応用し得ることが今回の解析の結果明らかになった。そこで本発明は、ｍｏｔｏｐｓｉｎの機能阻害物質をスクリーニングすることを特徴とする向精神薬のスクリーニング方法を提供するものである。
【００２３】
Ｍｏｔｏｐｓｉｎの機能阻害物質としては、（ａ）ｍｏｔｏｐｓｉｎの酵素活性を阻害する物質のほかに、（ｂ）ｍｏｔｏｐｓｉｎの発現を抑制することによってｍｏｔｏｐｓｉｎの機能を阻害する物質、（ｃ）ｍｏｔｏｐｓｉｎの制御領域とアクチベーター（上流因子）との結合を阻害することによってｍｏｔｏｐｓｉｎの機能を阻害する物質、が挙げられる。
【００２４】
Ｍｏｔｏｐｓｉｎはモザイク型セリンプロテアーゼファミリーであり、機能調節ドメインが各種の物質に結合して機能するので、ｍｏｔｏｐｓｉｎの特異的・選択的阻害剤の探索のため、機能調節ドメインに着目したスクリーニングは好ましい方法である。具体的には、機能調節ドメインとの結合をin vitro又はin vivoにおいて阻害する物質を探索する方法である。
【００２５】
この場合のスクリーニング方法としては、物質間の結合の有無や解離の有無を調べる従来公知の種々の方法を適用することができ、特に限定されるものではない。例えば、ｍｏｔｏｐｓｉｎの機能調節ドメインを大腸菌等を用いて大量に発現させて精製し、試験管内での結合を蛍光基質などによって検出・測定する系を構築することができる。また、阻害剤のマススクリーニングに向けて98 wellまたは384 wellのマイクロタイタープレート等にｍｏｔｏｐｓｉｎを固定し、それに結合したインヒビターを酵素、蛍光色素などで標識した抗体によって検出する系を確立することも可能である。
【００２６】
ｍｏｔｏｐｓｉｎとりわけその機能調節ドメインの高次構造の情報は、ｍｏｔｏｐｓｉｎのニューロン上への局在を特異的に阻害する阻害剤の分子設計に有用であるので、このような情報を利用するものであってもよい。
【００２７】
そのほか、（１）ｍｏｔｏｐｓｉｎの機能調節ドメインをカラムに固定してこれと結合する物質を検索する方法や、（２）免疫沈降免疫ブロット法を用いてｍｏｔｏｐｓｉｎの機能調節ドメインと相互作用蛋白質との結合を阻害する物質を検索する方法、（３）酵母two-hybrid法を用いて、ｍｏｔｏｐｓｉｎの機能調節ドメインとの結合を検出する方法など、物質間の結合の有無や解離の有無を調べる従来公知の種々の方法を本発明のスクリーニング方法に適用可能である。また、本発明以降に新たに開発されたスクリーニング方法を使用するものであってもよい。
【００２８】
Ｍｏｔｏｐｓｉｎの機能調節ドメインとの結合活性をスクリーニングする方法の場合、使用するｍｏｔｏｐｓｉｎは全長蛋白質であってもよいが、上述のように制御領域（又はその一部領域）に相当する部分蛋白質であっても勿論よい。
【００２９】
また、このようなスクリーニング方法によって得られた活性阻害剤について、さらに海馬や大脳皮質のニューロンにおいて樹状突起スパイン密度を増加あるいは減少させる性質の有無を調べることによって、向精神薬を開発する方法は好ましい。
【００３０】
勿論、本発明のスクリーニング方法として、ｍｏｔｏｐｓｉｎの酵素活性を測定して被検物質のｍｏｔｏｐｓｉｎに対する阻害効果、又は活性化効果を調べる方法を採用してもよい。例えば、精製したｍｏｔｏｐｓｉｎとその基質（Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、ゼラチン、ｔｉｓｓｕｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ等）を用いて酵素活性の変化を測定する試験管内活性測定系（cell-free system）でのスクリーニング方法を挙げることができる。この方法の場合、多数の有機化合物のマススクリーニングのため、基質の加水分解の有無を蛍光等で検出する測定系を用いることが好ましい。
【００３１】
精製酵素ではなく、細胞の粗精製画分を用いて、ｍｏｔｏｐｓｉｎの活性測定を行ってもよい。この場合、ｍｏｔｏｐｓｉｎ以外の蛋白質分解酵素も存在するので、ｍｏｔｏｐｓｉｎ特異的な基質の加水分解の有無を検出する系を構築するなどの工夫が必要である。また、上記の方法は、試験管内反応系（cell-free system）でのスクリーニング方法であったが、培養細胞等を用いて細胞内で酵素活性を測定することによりスクリーニングを行ってもよい。
【００３２】
その他、細胞内でのｍｏｔｏｐｓｉｎの発現に影響を与え、その発現量を変化させる物質の探索には、常法に従ってｍｏｔｏｐｓｉｎのｍＲＮＡ量を定量する方法、あるいはｍｏｔｏｐｓｉｎ蛋白質の発現量を定量する方法などを採用することができる。
【実施例】
【００３３】
以下、図面を参照しながら本発明の実施例について説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
〔方法〕
［1-1］Ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスの作製
図１は、本実施例のｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスの作製に使用した遺伝子ターゲッティング法を説明する図である。図中、上から順に、正常のｍｏｔｏｐｓｉｎ遺伝子（Wild type allele）、ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウス作製のためのターゲッティングベクター（Targeting construct）、相同組み換えを起こしたｍｏｔｏｐｓｉｎ遺伝子破壊（変異）アレル（Disrupted allele）の構造をそれぞれ模式的に示す。
【００３４】
まずターゲッティングベクター作製のため、マウスｍｏｔｏｐｓｉｎのゲノムＤＮＡ約１３ｋｂをマウス１２９ＳｖのゲノムＤＮＡのＰＡＣライブラリーよりｃＤＮＡをプローブとしたハイブリダイゼーションによって調製した。得られたクローンをもとに、エクソン１の上流〜３．７ｋｂｐのＡｐａＩ/ＳｓｐＩ ｆｒａｇｍｅｎｔと、下流〜６．８ｋｂｐのＳｐｅＩ/ＢｇｌＩＩｆｒａｇｍｅｎｔをアームとして、Ｎｅｏ耐性遺伝子の両側に挿入し、ターゲッティングベクターを作製した（図１）。なお、このターゲッティングベクターのバックボーンはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔである。
【００３５】
上記ターゲッティングベクターを直鎖化後、１２９Ｓｖ ＥＳ細胞にエレクトロポレーションによって導入した。抗生物質Ｇ４１８耐性クローンをピックアップし、そのゲノムＤＮＡを図１に示す５’プローブ（５’ｐｒｏｂｅ）および３’プローブ（3’ｐｒｏｂｅ）を用いたサザンブロッティングによって解析し、目的の相同組み換えが起こったアレル（Ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ ａｌｌｅｌｅ）を有するクローンを選択した。
【００３６】
相同組み換えが起こった上記ＥＳ細胞のクローンを、公知の方法（Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ８，７０７−７１９， １９９４）に従ってマウス初期胚にマイクロインジェクションすることにより、キメラマウスを得た。さらにこのキメラマウスを野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスと交配し、得られたヘテロ接合体マウスの雌雄を交配することにより、ＥＳ細胞由来の変異アレルをホモで有するｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスを得ることができた。
【００３７】
上記ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスについて、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊとの戻し交配を６回以上繰り返して得られたｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスについて後述の行動実験を行った。
【００３８】
［1-2］免疫化学的解析
抗ｍｏｔｏｐｓｉｎポリクローナル抗体は、マウスｍｏｔｏｐｓｉｎの組換え蛋白質をウサギに免疫して作製した（Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１３６， １−１２， ２００７）。マウスの脳は、９倍量の氷冷した１ｍＭ ＥＤＴＡ， １０μｇ／ｍＬ Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、１０μｇ／ｍＬ Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ，２ｍＭ ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｎａｔｅを含むｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ，ｐＨ７．４）にて、ポリトロンを用いてホモジェナイズし、２倍濃度のＳＤＳ−ｐｏｌｙａｃｒｉｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒと混和した。サンプルをＳＤＳ電気泳動後、ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ膜に転写し、１次抗体として抗ｍｏｔｏｐｓｉｎポリクローナル抗体（２０００倍希釈）、そして２次抗体として、ＡＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（ＣＨＥＭＩＣＯＮ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）をＴＢＳ−Ｔ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ, pH 7.4, ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）で希釈して使用した。免疫反応バンドの検出は、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ発色法によって行った。
【００３９】
［1-3］免疫組織学的検査
組織切片の作製と免疫組織学的な解析は、既述の方法に従った（Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１３６， １−１２， ２００７）。以下に要点を記す。脳を４％パラホルムアルデヒド入りの０．１Ｍリン酸バッファー（ＰＢ，ｐＨ７，４）で灌流固定し、その後１５時間同液で後固定を行った。そして２０％ ｓｕｃｒｏｓｅ ｉｎ ＰＢで２日間置いた後、クリオスタットで２０μｍの切片を調製した。切片は、０．３％ Ｈ２Ｏ２／５０％ Ｍｅｔｈａｎｏｌ ｉｎ ＰＢで処理した後、１次抗体とインキュベートした。
【００４０】
［1-4］ゴルジ染色
ゴルジ染色はＧｉｂｂとＫｏｌｂの方法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ７９， １−４， １９９８）に従って行った。深麻酔下でマウスをＰＢＳで還流した後、脳を摘出してＧｏｌｇｉ−Ｃｏｘ液（１％ニクロム酸カリウム、１％塩化水銀、１％クロム酸カリウム）につけて、暗所にて２週間以上放置する。３０％ｓｕｃｒｏｓｅ ｉｎ ＰＢに２日以上つけた後ビブラトームにて１８０μｍの厚さに薄切してスライドグラスに圧着させる。これをアンモニア水に浸して発色させた後、固定液（富士フイルムｓｕｐｅｒ Ｆｕｊｉ ｆｉｘ）にて固定した。
【００４１】
［1-5］行動学的検査
［1-5-1］オープンフィールドテスト
実験装置は天井部のない立方体の箱であった。側面および床面は厚さ３ｍｍの透明アクリル版製で、内寸は、床部が４０×４０ｃｍ、高さが３０ｃｍであった。実験室は防音されており、実験装置内の被験動物の行動は天井部に設置した行動観察カメラによって撮影した。白熱灯点灯時の実験箱内の照度を床面で１０Ｌｕｘ以下に設定した。
【００４２】
各被験体に１０分間のセッションを与えた。被験体を実験装置の中央部に置いてセッションを開始した。行動指標として、移動距離をビデオ撮影した画像を解析ソフト（エソビジョン）を用いて解析した。またセンタースクエアでの滞在時間を測定した。
【００４３】
［1-5-2］高架式十字迷路テスト
１０Ｌｕｘ以下の実験室に高架式十字（高さ５０、アーム長３０ｃｍ、通路幅５ｃｍ）を設置した。被験マウスを十字中央部に置き１０分間自由に行動をさせて、その様子を天井部ビデオカメラにて撮影記録した。
【００４４】
［1-5-3］ソーシャルレコグニションテスト
被験マウスと卵巣摘出術を施した雌マウスＡを明所下で新しい飼育ケージにいれて１分間天井部のビデオカメラで撮影した後、雌マウスＡを取り出した。５分後に再度雌マウスＡを１分間、被験マウスに１分間提示・ビデオ撮影してとりだす。同様にして雌マウスＡの提示を合計４回行った後、卵巣摘出術を施した別の雌マウスＢを１分間被験マウスに提示して、その行動をビデオ撮影した。遺伝子型についての情報を持たない観察者が被験動物が提示動物に対して探索行動を示した時間を測定し、野生型マウスと比較した。
【００４５】
Ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスの雌マウスＡに対する接触時間と雌マウスＢに対する接触時間は、雌マウスＡ１回目３４．７±２．６秒（平均値±標準誤差、以下同じ）、２回目３９．３±２．４秒、３回目３４．３±２．６秒、４回目３３．０±３．３秒、雌マウスＢ；４６．８±２．３秒であった。一方、野生型マウスにおいては、雌マウスＡ１回目３０．５±４．０秒、２回目３３．１±３．５秒、３回目２６．０±３．８秒、４回目２４．９±３．６秒、雌マウスＢ３５．４±４．１秒であった。
【００４６】
［1-5-4］レジデントイントルーダーテスト
被験マウスを１週間飼育したのち、イントルーダーマウスを被験マウスのケージに入れた。その後１０分間の行動を天井に設置したビデオテープレコーダにて撮影記録した。
【００４７】
Ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスのイントルーダーマウスに対する接触時間および最初の接触までの潜時はそれぞれ、２２８．７±１１．０秒、２１．５±５．４秒であった。一方、野生型マウスでは１６９．４±２８．４秒、３７．９±８．８秒であった。
【００４８】
［1-5-5］社会行動テスト
社会行動テストには、テストボックス（縦４０ｃｍ×横６０ｃｍ×高さ３５ｃｍ）および２個の刺激動物用ワイヤーケージ（ステンレス製、直径１１ｃｍ×高さ１５ｃｍ）を用いた。まず、被験マウスを２個の空ワイヤーケージをいれたテストボックスに入れて１０分間放置する。マウスのテストボックス内への解放はテストボックス中央においた円筒容器（直径１１ｃｍ）にマウスを入れておき、検討容器を取り除くことで行った。一度マウスを円筒容器に戻し、一方のワイヤーケージに刺激用の雄マウス（刺激用マウスＡ）を入れた後、被験動物をテストボックス内を自由に１０分間探索させる。再度、被験マウスを円筒容器に入れてから、空ワイヤーケージに新たに刺激用マウスＢを入れる。円筒容器から試験動物を解放して１０分間テストボックス内を自由に探索させる。以上の３セッションの間、天井よりビデオ撮影を行い、第２セッションでの被験マウスが空ワイヤーケージおよび刺激用マウスＡのワイヤーケージに接触している時間、第３セッションでの刺激用マウスＡ，Ｂのワイヤーケージに接触している時間を計測し、ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスと野生型マウスを比較した。
【００４９】
社会性を検出するセッション２では、野生型マウス、ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスが空ワイヤーケージｖｓ刺激用マウスＡワイヤーケージへ接触していた時間はそれぞれ４．５±１．０秒ｖｓ６６．０±９．０秒、６．０±１．７秒ｖｓ７７．０±８．１秒であった。新規社会に対する好気性を検出する第３セッションでの刺激用マウスＡのワイヤーケージへの接触時間ｖｓ刺激用マウスＢのそれに接触していた時間は、ノックアウトマウス；２８．４±５．７秒ｖｓ４９．０±７．３秒、野生型マウス；９．２±１．４秒ｖｓ３７．５±７．０秒であった。
【００５０】
［1-5-7］探索行動テスト
実験前日に１０Ｌｕｘ以下の照度に設定した実験室にオープンフィールドテストで用いたフィールドを置き、その中に被験マウスを入れて３０分間放置しフィールドに馴化させた。翌日、フィールド内の任意の位置にピンポン球を設置し、被験マウスを入れて１０分間、行動をビデオ撮影する。被験マウスがピンポン球に接するまでの潜時と接している時間を計測した。
【００５１】
Ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスの潜時および接触時間は、３５．０±１４．０秒、８．８±１．４秒、であり、野生型マウスでは４４．４±１１．１秒、１０．５±２．４秒であった。
【００５２】
［1-5-6］嗅覚テスト
被験マウスは実験の１２時間以上前より絶食しておいた。新しい飼育ケージの床敷きの下に飼育用飼料を隠しておいた。被験マウスをこのケージに投入してから、飼料を見つけるまでの潜時、および、飼料を見つけてから食するまでの時間を天井部より撮影したビデオ映像を元に測定した。
【００５３】
Ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスが飼料を見つけるまでの潜時、および見つけてから食するまでの時間は、それぞれ５０．３±６．０秒、２６．６±５．８秒であった。野生型マウスでは、７２．３±１２．９秒、６０．６±１２．４秒であった。
【００５４】
［1-5-5］水迷路学習（WM）
実験装置は円筒形のプールと逃避台からなっていた。プールの内径は１４０ｃｍ、高さは６０ｃｍで、内壁は青色に塗装されていた。逃避台は直径１０ｃｍ、厚さ３ｍｍの円形アクリル版に台座を取り付けたものとした。プールの仮想の東西南北方向には、それぞれ、２０ｃｍ四方の白いアクリル板に黒色の十字を貼り付けたもの（北）、同じく黒三角形を貼り付けたもの（南）、同じく黒正方形（東）、同じく黒丸（西）がプール内から見えるように掲げられていた。逃避台を仮想の北東方向に設置し、水位を逃避台の台面上約１ｃｍに調節した。水はインクで白色に濁らせ、水温は21℃（±1℃）に維持した。
【００５５】
1日1セッション5試行からなる獲得訓練を行った。逃避台のない北東以外の3象限いずれかの壁際から被験体をプールに投入して自由に遊泳させ、逃避台に達するまでの潜時を計測した。被験体が逃避台に載ると、10秒間そこに留めた。プールへ投入後60秒以内に被験体が逃避台に達しない場合は、実験者が逃避台の上へ誘導し、そこに10秒間留めた。投入する象限の順序は被験体毎にランダムとした。試行間間隔（逃避台から取り去ってから次にプールへ投入されるまでの時間）は30秒であった。
【００５６】
最終日の試行セッションが終了して１時間後に避難台を取り除いて、被験マウスをプールに投入して、６０秒間の遊泳させた（プローブテスト）。避難台のあった位置を通過する回数、潜時、および避難台があった象限での滞留割合を測定した。
【００５７】
［1-5-8］Ｙ迷路テスト
被験動物の短期記憶の程度はＹ迷路テストによって行った。照度３０Ｌｕｘの実験室に幅４ｃｍ、長さ４０ｃｍの通路を持つＹ字迷路を設置した。この迷路には高さ１２ｃｍの壁があるが、各壁の色は黄色（Ａ）、グレー（Ｂ）、青色（Ｃ）といったように色彩が異なっている。迷路の中心に被験マウスを入れて８分間行動をビデオ撮影した。マウスは最も以前に進入した場所に進入する傾向があり、各通路への進入を記憶していればその進入順はＡＢＣＡＢＣＡＢＣのようになる。そこで異なる３つの通路に連続して進入した回数（上記の例では７）のその最大数（総進入数−２）に対する割合（％ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ）を短期記憶の程度として判定した。
【００５８】
Ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスは５２．７±５．３％ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎを示し、野生型マウスは５０．１±５．２％ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎを示した。
【００５９】
〔結果〕
［2-1］
脳におけるｍｏｔｏｐｓｉｎの機能を明らかにするため、図１に示すように、エクソン１ａの開始コドンを含む領域をＮｅｏ耐性遺伝子で置き換えるターゲッティングベクターを構築し、ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスを作製した。Ｍｏｔｏｐｓｉｎ遺伝子の欠落はサザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ法によって確認できた。全体的な肉眼的および脳の光学顕微鏡検査において、ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスは野生型マウスと明らかな差を認めなかった。特に中枢神経系に注意して観察を行ったが、皮質・海馬・線条体・小脳・視床・視床下部に明らかに異常な顕微鏡所見を認めなかった。また、仔マウスの遺伝子型は、正常のメンデル遺伝に従っていた。
【００６０】
Ｍｏｔｏｐｓｉｎ ｍＲＮＡの発現は野生型マウスやヘテロマウスではノーザンハイブリダイゼーションによって確認できたが、ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスでは検出されなかった。Ｍｏｔｏｐｓｉｎを認識する抗体を用いた免疫組織化学法の結果では、ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウス脳においては、ｍｏｔｏｐｓｉｎ陽性反応は検出されなかった。野生型マウス脳ではｍｏｔｏｐｓｉｎは海馬、大脳皮質等で検出された（図２）。
【００６１】
［2-2］Ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスにおける情動行動
Ｍｏｔｏｐｓｉｎ欠損が、マウスの基礎的な神経機能に及ぼす影響を検討するため、ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスの行動学的検査を行った。
Ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスおよび野生型マウス用いてオープンフィールドテストを行った結果、それぞれの移動距離はｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスが２８０９．８±１１８．３ｃｍ、野生型マウスが２８００．８±１３６．６ｃｍであった。また、センタースクエアでの滞留時間はそれぞれ１４２．２±２１．１秒、１３９．８±１４．４秒であり、ゲノタイプによる差は認められなかった（図３）。また、高架式十字迷路の結果、ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスのオープンアームでの滞留時間および進入比率は８２．１±２６．０秒、２３．５±３．３％であり、野生型マウスでは５４．９±１５．６秒、１９．６±２．４％であった（図４）。これらのことから、ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスでは不安行動には異常が認められないといえる。
【００６２】
［2-3］Ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスにおける社会行動の異常
次に社会行動に障害があるかどうかを検討するため、ソーシャルレコグニションテスト、レジデントイントルーダーテスト、社会行動テストの３種類を行った（図５−７）。ソーシャルレコグニションテストでは、いずれのマウスも雌マウスＡに対する接触時間がセッションを経るごとに有意に低下し、雌マウスＢに対して有意に接触時間が遅延することから、刺激動物を認識していることが明らかである。しかし、意外なことにいずれの測定時点においてもｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスは野生型マウスに比べて有意に接触時間が長かった。この傾向は、レジデントイントルーダーテストにおいても確認された。
【００６３】
社会行動テストにおいてもｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスは野生型マウスと異なる反応を示した。野生型マウスは第３セッションにおいて第２セッションで既に提示された刺激用マウスＡに対しては接触時間が短くなるのに対して、ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスは有意に長い接触時間を示した。以上の結果から、ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスは社会行動が亢進しており、抗自閉症的な行動を示すことが明らかである。
【００６４】
［2-4］Ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスの探索および嗅覚行動
Ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスにおいて観察された社会行動の亢進が社会的要素に特異的であること、および嗅覚異常に起因するもので無いことを確認するために、探索行動テストと嗅覚テストを行った（図８，９）。探索行動テストでは、無機物質に対する接触時間および最初に接触するまでの潜時にｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスと野生型マウスに差は認められなかった。嗅覚テストにおいても、餌を見つけるまでの時間にゲノタイプ間で有意差は認められなかったが、餌を見つけてから食べるまでの時間はｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスで有意に短かった。Ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスによる無機物に対する野生型マウスと同様の反応性は社会性行動テストのセッション２において、空ケージに対する接触時間が両者において差が認められなかったことからも明らかである。従って、ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスは社会性行動特有の異常を呈すると考えられた。
【００６５】
［2-5］Ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスの空間学習能
Ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスの空間学習能を検討するために、モリス水迷路学習テストとＹ迷路テストを行った（図１０，１１）。モリス水迷路学習テストの獲得訓練では、ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスは野生型マウスと同等の学習能を示した。プローブテストの結果、避難台領域を通過する回数、避難台があった象限での滞留時間も野生型マウスと同等であったが、避難台領域に到達する潜時がｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスでは有意に遅延していた。一方、Ｙ迷路テストではｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスは野生型マウスと同等の％ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎを示したことから、短期記憶については異常が認められないといえる。
【００６６】
［2-5］Ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスのスパイン密度の低下
Ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスが呈する行動学的異常の発症機構を明らかにするためにゴルジ染色によるニューロンの形態観察を行った。その結果、海馬の錐体ニューロンの２０μｍ当たりのスパイン密度はｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスでは、頂上樹状突起では７．７±０．４個であり、基底樹状突起では８．４±０．２個であった。野生型マウスにおいてはそれぞれ、８．９±０．４個、８．３±０．２個であり、頂上樹状突起においてｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスは有意にスパイン密度が減少していた（図１２）。
【００６７】
［2-6］本実施例の結果と考察
今回ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスにおいて、社会行動の亢進や空間記憶能の低下が認められ、また神経解剖学的検査において、海馬錐体ニューロンにおけるスパイン密度が低下するという現象が認められた。
【００６８】
Ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスがこれらの現象を引き起こした分子メカニズムについては今後更なる解析を要するが、近年、精神遅滞の原因遺伝子があいついで同定されてニューロンの細胞内情報伝達機構が乱れることでスパインの形態異常が引き起こされることが一因であると考えられつつある。しかし、従来知られている精神遅滞原因遺伝子が細胞内情報伝達に関わる分子であるのに対してｍｏｔｏｐｓｉｎは細胞外に分泌されるプロテアーゼであることから、薬剤による制御がより容易であり、各種神経疾患に対する新たな治療・診断法を提供することができる。
【００６９】
最近、ｔｅｎａｓｃｉｎＣノックアウトマウスでは社会行動が向上していることが報告された。（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２３， １２５５−１２６５， ２００６）。しかし、このマウスでは不安反応の低下や探索行動の亢進が認められており、社会行動に特異的な変化とは言い難い。また、以前より精神遅滞原因遺伝子の欠損マウスに社会行動の異常が見られると報告されている。例えば、Ｍｅｃｐ２に分断変異を持つマウスやＳｅｃｒｅｔｉｎ受容体ノックアウトマウスでは刺激動物との接触時間が著しく減少することが報告されている（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２６， ３１９−３２７， ２００６、Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５， ３２４１−３２５０， ２００６）。しかし、これらのマウスでは社会行動以外にもロコモーター活性、空間学習能、不安行動等に異常が認められ、社会行動が特異的に亢進しているｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスとは表現型が異なっている。
【００７０】
今回ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスにおいては、社会行動の亢進が認められるものの、不安行動や空間学習能、社会性認識能力、探索行動などは正常であるという現象は非常ユニークである。このことは、ｍｏｔｏｐｓｉｎの特異的阻害薬の探索が、抗自閉症薬など社会適応行動の亢進のための新薬開発につながることを示すものである。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】本発明の実施例に係るｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスの作出に用いた遺伝子ターゲッティング法を説明する図である。
【図２】Ｍｏｔｏｐｓｉｎノックアウトマウスにおいてｍｏｔｏｐｓｉｎの発現が認められないことをノーザンハイブリダイゼーションおよび免疫組織化学法によって確認したことを説明する図である。
【図３】オープンフィールドテストにおける移動反応とセンタースクエアでの滞在時間の測定結果を示すグラフである。
【図４】高架式十字迷路におけるオープンアームでの滞留時間および進入割合を示すグラフである。
【図５】ソーシャルレコグニションテストにおいて刺激動物との接触時間の測定結果を示すグラフである。
【図６】レジデントイントルーダーテストにおいて刺激動物との接触時間の測定結果を示すグラフである。
【図７】社会行動テストにおいて、空ワイヤーケージおよび刺激用マウスの入ったワイヤーケージへの接触時間結果を示すグラフである。
【図８】探索行動テストにおいて、無機物質へ接触するまでの潜時と接触時間の測定結果を示すグラフである。
【図９】嗅覚行動テストにおいて、餌を見つけるまでの潜時と見つけてから食するまでの時間の測定結果を示すグラフである。
【図１０】モリス水迷路において、獲得訓練時の避難台への逃避時間の測定結果とプローブテスト時の各象限への滞在時間、仮想避難台への到達するまでの潜時を測定した結果を示すグラフである。
【図１１】Ｙ迷路テストにおける％ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎを示すグラフである。
【図１２】海馬錐体ニューロンにおける樹状突起スパイン密度を計測した結果を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
相同染色体上のｍｏｔｏｐｓｉｎ遺伝子の一部又は全部の改変或いは欠損のため、ｍｏｔｏｐｓｉｎ遺伝子が正常に機能しないノックアウト非ヒト動物。
【請求項２】
Mｏｔｏｐｓｉｎ遺伝子のエクソン１の少なくとも開始コドンを含む領域を、相同組み換えにより他の塩基配列に置換することにより作製されたことを特徴とする請求項１記載のノックアウト動物。
【請求項３】
正常動物に比し、刺激動物への接触行動が亢進していることを特徴とする請求項１記載のノックアウト動物。
【請求項４】
正常動物に比し、接触を伴わなくとも刺激動物への探索行動が亢進していることを特徴とする請求項１記載のノックアウト動物。
【請求項５】
正常動物に比し、既に提示された刺激動物への接触行動または探索行動が減衰しないことを特徴とする請求項１記載のノックアウト動物。
【請求項６】
正常動物に比し、海馬または大脳皮質のニューロンの樹状突起スパイン密度が低下していることを特徴とする請求項１記載のノックアウト動物。
【請求項７】
マウス又はラットであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のノックアウト動物。
【請求項８】
相同染色体上のｍｏｔｏｐｓｉｎ遺伝子の全部または一部が欠損又は改変され、ｍｏｔｏｐｓｉｎの発現が抑制されていることを特徴とする動物細胞。
【請求項９】
Ｍｏｔｏｐｓｉｎを活性化又は阻害する物質をスクリーニングすることを特徴とする向精神薬のスクリーニング方法。
【請求項１０】
向精神薬が、抗自閉症、抗共依存症、又は対人行動改善剤であることを特徴とする請求項９記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
請求項１記載のノックアウト動物を用いることを特徴とする請求項９記載のスクリーニング方法。
【請求項１】
相同染色体上のｍｏｔｏｐｓｉｎ遺伝子の一部又は全部の改変或いは欠損のため、ｍｏｔｏｐｓｉｎ遺伝子が正常に機能しないノックアウト非ヒト動物。
【請求項２】
Mｏｔｏｐｓｉｎ遺伝子のエクソン１の少なくとも開始コドンを含む領域を、相同組み換えにより他の塩基配列に置換することにより作製されたことを特徴とする請求項１記載のノックアウト動物。
【請求項３】
正常動物に比し、刺激動物への接触行動が亢進していることを特徴とする請求項１記載のノックアウト動物。
【請求項４】
正常動物に比し、接触を伴わなくとも刺激動物への探索行動が亢進していることを特徴とする請求項１記載のノックアウト動物。
【請求項５】
正常動物に比し、既に提示された刺激動物への接触行動または探索行動が減衰しないことを特徴とする請求項１記載のノックアウト動物。
【請求項６】
正常動物に比し、海馬または大脳皮質のニューロンの樹状突起スパイン密度が低下していることを特徴とする請求項１記載のノックアウト動物。
【請求項７】
マウス又はラットであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のノックアウト動物。
【請求項８】
相同染色体上のｍｏｔｏｐｓｉｎ遺伝子の全部または一部が欠損又は改変され、ｍｏｔｏｐｓｉｎの発現が抑制されていることを特徴とする動物細胞。
【請求項９】
Ｍｏｔｏｐｓｉｎを活性化又は阻害する物質をスクリーニングすることを特徴とする向精神薬のスクリーニング方法。
【請求項１０】
向精神薬が、抗自閉症、抗共依存症、又は対人行動改善剤であることを特徴とする請求項９記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
請求項１記載のノックアウト動物を用いることを特徴とする請求項９記載のスクリーニング方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２００８−２３７０７２（Ｐ２００８−２３７０７２Ａ）
【公開日】平成２０年１０月９日（２００８．１０．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−８０５４３（Ｐ２００７−８０５４３）
【出願日】平成１９年３月２７日（２００７．３．２７）
【出願人】（５０４１７４１８０）国立大学法人高知大学 (174)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月９日（２００８．１０．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月２７日（２００７．３．２７）
【出願人】（５０４１７４１８０）国立大学法人高知大学 (174)
【Ｆターム（参考）】
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