遺伝子検出方法
【課題】 電気的活性基を有する有機金属錯体を用いる手段によって、電極上での電子の授受を効率良く行わせる事が可能な方法を提供する。さらに、本発明は前記電気化学的な測定は、電極に対して電圧を印加し前記電気化学的に活性である物質による電気化学発光量の測定を提供する。
【解決手段】 電気化学発光法において、フェロセンに代表される有機金属錯体による自己組織化膜を用いた発光は、金電極のみで発光させるよりも高効率に発光を行わせる事が可能となる。
【解決手段】 電気化学発光法において、フェロセンに代表される有機金属錯体による自己組織化膜を用いた発光は、金電極のみで発光させるよりも高効率に発光を行わせる事が可能となる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に存在する特定の遺伝子配列を、高感度に検出するための遺伝子検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の、電気化学的に特定の遺伝子配列を検出するＤＮＡチップは、検出すべき目的遺伝子に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを電極表面に固定化し、該核酸プローブと一本鎖に変性された目的遺伝子サンプルとをハイブリダイズさせた後、該核酸プローブと目的遺伝子サンプルとで形成された二本鎖核酸に特異的に結合し且つ電気化学的に活性な標識剤を、該核酸プローブと遺伝子サンプルとの反応系に添加し、電極を介した電気化学的な測定により、前記二本鎖核酸に結合した標識剤を検出することで、目的遺伝子サンプルとハイブリダイズした前記核酸プローブを検出し、目的とする遺伝子の存在を確認する（例えば、特許文献１及び特許文献２参照）。
【０００３】
ここで、前記標識剤とは、前記二本鎖の核酸を認識して、該二本鎖核酸と特異的に結合する物質を指す。前記標識剤は、何れも分子中にフェニル基等の平板状挿入基を有し、該挿入基が二本鎖核酸の塩基対と塩基対との間に挿入することによって、二本鎖核酸と結合する。この標識剤と二本鎖核酸との結合は、静電気的相互作用あるいは疎水的相互作用での結合であって、前記標識剤の二本鎖核酸の塩基対間への挿入、及びその塩基対間からの離脱が一定の速度で繰り返される平衡反応による結合である。
【０００４】
また、従来生化学アッセイに用いられる光の測定法には、吸光・蛍光法や発光法等がある。この内発光法による測定は、高感度に測定が可能であることが知られている。この内電気エネルギーによって励起され発光する現象を、電気化学発光と呼ぶ。電気化学発光する物質としてルテニウム錯体やオスミウム錯体が挙げられる。電気化学発光の反応は、例えば電気化学発光を示す代表的な物質にルテニウムビピリジル錯体（Ｒｕ（ｂｐｙ）3）2+ がある。電気化学発光の作用機序は、電極上でトリプロピルアミン等によりラジカルを発生させ、ルテニウムビピリジル錯体に電子を渡し、励起状態（Ｒｕ（ｂｐｙ）3）３＋となり、基底状態（Ｒｕ（ｂｐｙ）3）２＋に戻る時に発光を生じる（例えば、非特許文献１及び非特許文献２参照）。この様に電気化学発光は、電気化学エネルギーにより発光種を励起し、その励起状態が放射失括する際に可視光線を放出する。発光種の励起には電気化学エネルギーを利用するため、吸光法や蛍光法に比べバックグランドノイズを減らすことが可能である。このため、電気化学発光法は、吸光法や蛍光法よりも高感度に測定が可能となる。電気化学発光による測定は、ＤＮＡ等の核酸測定や、抗原や抗体の測定として種々のアッセイに利用されつつある（例えば、特許文献３参照）。しかし電気化学発光は、電気二重層と呼ばれる電極表面から数ｎｍの領域といった非常に狭い範囲で行われるため、電気化学発光物質の利用効率が悪いという課題があった。
【特許文献１】特開平５−１９９８９８号公報
【特許文献２】特開平９−２８８０８０号公報
【特許文献３】特開２００２−３４５６１号公報
【非特許文献１】Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２００４，７６，５３７９−５３８６
【非特許文献２】Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，２００４，１０４，３００３−３０３６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来、電気化学発光を行う場合では、電極付近で電子の授受を行わせる必要があり、電子の授受が可能な領域は電気二重層と呼ばれる非常に狭い範囲であった。本発明は、電気的活性基を有する有機金属錯体を用いる事により、電極上での電子の授受を効率良く行わせる事が可能な方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記課題を解決するため、本発明の遺伝子検出方法は、特定の配列を有する遺伝子を検出する遺伝子検出方法であって、前記検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の捕捉プローブを作製し、該捕捉プローブを固相に固定化する固定化工程と、
前記検出すべき遺伝子を一本鎖に変性して遺伝子サンプルを作製する遺伝子サンプル作製工程と、前記遺伝子サンプルに電気化学的に活性である物質を添加し、前記遺伝子サンプルと該電気化学的に活性である物質とを化学結合させる、電気化学的に活性である物質結合遺伝子サンプル作製工程と、前記電気化学的に活性である物質が結合した遺伝子サンプルと前記固相に固定された一本鎖の捕捉プローブとをハイブリダイズさせ、前記遺伝子サンプルを前記固相に捕捉させる遺伝子サンプル捕捉工程と、前記固相に固定された前記遺伝子サンプルに結合した前記電気化学的に活性である物質を、電気化学的な測定により検出する検出工程と、を含むものである。
【０００７】
これにより、前記遺伝子サンプルが微量でも電気化学的に活性である物質を複数結合させることができるので、高感度検出が可能となる。また、検体ごとに標識プローブの設計を行う必要もなくなる。
【０００８】
また、本発明の遺伝子検出方法は、検体試料中の特定の配列を有する遺伝子を検出する遺伝子検出方法であって、前記検出すべき遺伝子を一本鎖に変性して遺伝子サンプルを作製する遺伝子サンプル作製工程と、前記遺伝子サンプルに電気化学的に活性である物質を添加し、前記遺伝子サンプルと該電気化学的に活性である物質とを化学結合させる、電気化学的に活性である物質結合遺伝子サンプル作製工程と、前記検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の捕捉プローブを作製し、前記電気化学的に活性である物質が結合した遺伝子サンプルとハイブリダイズさせ、二本鎖核酸を形成する二本鎖核酸形成工程と、前記二本鎖核酸を形成した捕捉プローブを固相に固定化する固定化工程と、前記固相に固定された前記遺伝子サンプルに結合した前記電気化学的に活性である物質を、電気化学的な測定により検出する検出工程と、を含むものである。
【０００９】
これにより、前記遺伝子サンプルが微量でも電気化学的に活性である物質を複数結合させることができるので、高感度検出が可能となる。また、検体ごとに標識プローブの設計を行う必要もなくなる。
【００１０】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記電気的活性基を有する有機金属錯体は、フェロセン分子であるものである。
【００１１】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記電気的活性基を有する有機金属錯体は、電気的活性基を有する分子とチオール分子からなり、チオール分子により電極上に自己組織化膜を形成するものである。
【００１２】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、電気的活性基を有する分子とチオール分子は、メチレン基（−ＣＨ２−）ｎをスペーサーとし、ｎ数は２〜１１であるものである。電気化学発光は酸化還元性を有する化合物である。
【００１３】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記酸化還元性を有する化合物は、電気化学発光を示す化合物である。
【００１４】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記電気化学発光を示す化合物は、配位子に複素環系化合物を有する金属錯体、ルブレン、アントラセン、コロネン、ピレン、フルオランテン、クリセン、フェナントレン、ペリレン、ビナフチル、あるいはオクタテトラエンのいずれかである。
【００１５】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体は、配位子にピリジン部位を有する金属錯体である。
【００１６】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記配位子にピリジン部位を有する金属錯体は、金属ビピリジン錯体、あるいは金属フェナントロリン錯体のいずれかであるものである。
【００１７】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記電気化学発光を示す化合物は、金属錯体である。
【００１８】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記金属錯体の中心金属は、ルテニウム、あるいはオスニウムのいずれかである。
【００１９】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、ルテニウムを有する有機金属錯体を、核酸またはタンパク質にラベル化することにより、電気化学発光量によりラベル化された核酸量またはタンパク質を定量する。
【００２０】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記磁気ビーズの粒径が、１ｎｍ以上、前記磁気ビーズの平均粒径以下（もしくは５００ｎｍ以下）である。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の遺伝子検出方法によれば、電気化学測定の際に、電解液に分散した導電性物質を介して、電気二重層領域が電極表面から離れた部分にも広がり、電極表面に接触していない電気化学発光物質でも電気化学反応が起きるため、電気化学発光物質の利用効率を高めることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下に、本発明の遺伝子検出方法について詳細に説明する。なお、以下の実施の形態における遺伝子サンプルとは、例えば、血液、白血球、血清、尿、糞便、精液、唾液、培養細胞、各種臓器細胞のような組織細胞、その他遺伝子を含有する任意の試料から、該試料中の細胞を破壊して二本鎖核酸を遊離させ、熱処理あるいはアルカリ処理によって、一本鎖の核酸に解離させたものである。また、本実施の形態における遺伝子サンプルは、制限酵素で切断して電気泳動による分離等で精製した核酸断片でもよい。
【００２３】
（実施の形態１）
以下、実施の形態１における遺伝子検出方法について説明する。まず、検査対象となる遺伝子サンプルを作製する。この遺伝子サンプルは、前述したように、任意の試料中の細胞を破壊して二本鎖核酸を遊離させ、熱処理あるいはアルカリ処理によって、一本鎖に変性させる。
【００２４】
このとき、前記試料中の細胞の破壊は、常法により行うことができ、例えば、振とう、超音波等の物理的作用を外部から加えて行うことができる。また、核酸抽出溶液（例えば、ＳＤＳ、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、Ｔｗｅｅｎ−２０等の界面活性剤、又はサポニン、ＥＤＴＡ、プロテア−ゼ等を含む溶液等）を用いて、細胞から核酸を遊離させることもできる。
【００２５】
次に、前記一本鎖の遺伝子サンプルに、後述する標識プローブを含む溶液を接触させる。これにより、前記標識プローブがもつ標識結合用プローブと、該標識結合用プローブと相補的な配列を有する遺伝子サンプルがハイブリダイズし、標識化遺伝子サンプルが形成される。この標識プローブと遺伝子サンプルをハイブリダイズさせる方法は周知であるため、ここでは説明を省略する。
【００２６】
以下、本発明に用いられる標識プローブについて説明する。標識プローブは、検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有し、且つ電気化学的に活性である物質で標識された一本鎖核酸である。
【００２７】
前述の電気化学的に活性である物質は、電気化学的に検出可能な物質であれば特に制限無く何を用いてもよく、例えば、可逆な酸化還元反応時に生じる酸化還元電流を測定することで物質の検出が可能な、酸化還元性を有する化合物が挙げられる。そしてこのような酸化還元性を有する化合物としては、例えば、フェロセン、カテコールアミン、配位子に複素環系化合物を有する金属錯体、ルブレン、アントラセン、コロネン、ピレン、フルオランテン、クリセン、フェナントレン、ペリレン、ビナフチル、オクタテトラエンもしくはビオローゲン等がある。
【００２８】
なお、前述した、配位子に複素環系化合物を有する金属錯体、ルブレン、アントラセン、コロネン、ピレン、フルオランテン、クリセン、フェナントレン、ペリレン、ビナフチル、オクタテトラエンには、酸化還元反応時に電気化学発光を生じるものもあり、前記Ｅとしてこれらを用いた場合は、後述する検出工程にてその発光を測定することで、遺伝子サンプルの検出を行うこともできる。
【００２９】
また、前述の配位子に複素環系化合物を有する金属錯体としては、酸素や窒素等を含む複素環系化合物、例えば、ピリジン部位、ピラン部位等を配位子に有する金属錯体等を挙げることができ、特に、ピリジン部位を配位子に有する金属錯体が好ましく、該ピリジン部位を配位子に有する金属錯体としては、例えば、金属ビピリジン錯体、金属フェナントロリン錯体等が例に挙げられる。
【００３０】
さらに、前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体の中心金属としては、例えば、ルテニウム、オスニウム、亜鉛、コバルト、白金、クロム、モリブデン、タングステン、テクネチウム、レニウム、ロジウム、イリジウム、パラジウム、銅、インジウム、ランタン、プラセオジム、ネオジム、サマリウム等を挙げることができる。特に該中心金属が、ルテニウム、オスニウムである錯体は、良好な電気化学発光特性を有し、このような良好な電気化学発光特性を有する物質としては、例えば、ルテニウムビピリジン錯体、ルテニウムフェナントロリン錯体、オスニウムビピリジン錯体、オスニウムフェナントロリン錯体等を挙げることができる。
【００３１】
そしてこの後、前述したようにして形成された標識化遺伝子サンプルを含む溶液を、磁気ビーズに固定化された捕捉プローブに接触させる。これにより、前記捕捉プローブと、該捕捉プローブと相補的な配列を有する遺伝子サンプルとがハイブリダイズし、前記標識化遺伝子サンプルが磁気ビーズに固定化される。この前記捕捉プローブと前記標識化遺伝子サンプルをハイブリダイズさせる方法は周知であるため、ここでは説明を省略する。
【００３２】
前記捕捉プローブとしては、化学合成で得た一本鎖の核酸、あるいは生物試料から抽出した核酸を制限酵素で切断し、電気泳動による分離等で精製した核酸を用いることができる。なお、生物試料から抽出した核酸の場合には、熱処理あるいはアルカリ処理によって、一本鎖の核酸に解離させておくことが好ましい。
【００３３】
また、前記捕捉プローブを固定化する磁気ビーズとしては、特に限定されるものではなく、医用で一般的に用いられている磁気ビーズが使用可能である。前記磁気ビーズは、電気絶縁材料であるポリスチレンやデキストランのようなポリマーに酸化鉄のような可磁化物質を分散させたものである。前記磁気ビーズの粒径は、１０ｎｍ〜１０μｍと幅広く選択可能であり、特に限定されるものではないが、溶液中での分散性および分離、回収性から、１００ｎｍ〜５μｍが好ましい。
【００３４】
前記捕捉プローブを前記磁気ビーズに固定化する方法としては、例えば、磁気ビーズにアビジンコーティングを施し、末端をビオチン修飾した核酸プローブと結合させるなどの公知の方法が用いることができる。
【００３５】
なお、前述の説明では、まず遺伝子サンプルと標識プローブとをハイブリダイズさせて標識化遺伝子サンプルを形成する遺伝子サンプル標識化工程の後、該標識化遺伝子サンプルと磁気ビーズに固定化された捕捉プローブとをハイブリダイズさせて、遺伝子サンプルを磁気ビーズに固定化する遺伝子サンプル捕捉工程を行なうものとしたが、前記遺伝子サンプル捕捉工程と前記遺伝子サンプル標識化工程とを同時に行うものでもよい。この場合、遺伝子サンプルと、標識プローブと、磁気ビーズに固定化した捕捉プローブとを同時に接触させて、標識された遺伝子サンプルを磁気ビーズに固定化する。
【００３６】
前述のようにして前記標識化遺伝子サンプルを磁気ビーズに固定化後、磁気ビーズを磁力で収集し、未反応の遺伝子サンプルと標識プローブを除去することで、Ｂ／Ｆ分離を行う。
【００３７】
Ｂ／Ｆ分離を行った後、磁気ビーズを電解液とともに電極上に展開し、前記磁気ビーズは磁力により電極表面に捕捉する。そして、電極に電圧を印加することで、該磁気ビーズに固定化された前記標識化遺伝子サンプルの、電気化学的に活性である物質由来の電気化学的な信号を測定する。
【００３８】
電気化学的な信号の測定は、標識された電気化学的に活性である物質によって異なり、前記電気化学的に活性である物質として、酸化還元電流を生じる電気化学的に活性である物質を用いた場合には、該電気化学的に活性である物質由来の電気化学的な信号を、前記ポテンショスタット、ファンクションジェネレータ等からなる計測系で測定できる。一方、前記電気化学的に活性である物質として、電気化学発光を生じる物質を用いた場合には、フォトマルチプライヤー等を用いて計測が可能である。
【００３９】
以下、本発明に用いられる電解液について説明する。本発明の電解液は、磁気ビーズが添加されたものであり、電解液に分散した導電性物質を介して、電気二重層領域が電極表面から離れた部分にも広がり、電極表面に接触していない部分の電気化学的に活性である物質でも電気化学反応が起きるため、標識剤の利用効率を高めることが可能となる。
【００４０】
前記導電性粒子は、金属電極と前記電気化学的に活性である物質との間で電子の移動が可能であり、前記電気化学的に活性である物質を、酸化還元することができる物質であれば、特に制限無く何を用いてもよい。
【００４１】
特に好適な材料としては、化学的に安定であり、溶解電位が高い金属材料、例えば、金、白金、銀、パラジウム、ロジウム、イリジウム、タングステン等、また、酸化および還元方向の電位窓の広いカーボン等が挙げられる。
【００４２】
また、前記磁力により電極表面に捕捉された磁気ビーズは、凝集、積層した状態で電極表面に存在するため、前記導電性粒子の粒径は、１ｎｍ以上、前記磁気ビーズの粒径以下（もしくは５００ｎｍ以下）が好ましい。これにより、導電性粒子が磁気ビーズの間隙に入り込み、凝集、積層した磁気ビーズ全体の標識剤を反応させることで、標識剤の利用効率を高めることが可能となる。
【００４３】
このような磁気ビーズとしては、例えば、免疫測定の呈色剤や燃料電池の触媒等で使用されるコロイド粒子等が挙げられる。
【実施例１】
【００４４】
以下、本発明の実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
（１）遺伝子サンプル
遺伝子サンプルには、ヒト由来Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ−４５０の遺伝子配列の５’−末端より５９９−６９８番目に位置するＡＡＴＴＧＡＡＴＧＡ ＡＡＡＣＡＴＣＡＧＧ ＡＴＴＧＴＡＡＧＣＡ ＣＣＣＣＣＴＧＧＡＴ ＣＣＡＧＡＴＡＴＧＣ ＡＡＴＡＡＴＴＴＴＣ ＣＣＡＣＴＡＴＣＡＴ ＴＧＡＴＴＡＴＴＴＣ ＣＣＧＧＧＡＡＣＣＣ ＡＴＡＡＣＡＡＡＴＴの配列を有する１００塩基のオリゴデオキシヌクレオチドを使用した。
【００４５】
（２）磁気ビーズ表面への核酸プローブの固定化
磁気ビーズには、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製のＣＭ０１Ｎ／５８９６ストレプトアビジン磁気ビーズを用いた（粒径０．３５μｍ）。捕捉プローブには、５’末端よりＡＡＴＴＴＧＴＴＡＴ ＧＧＧＴＴＣＣＣＧＧ ＧＡＡＡＴＡＡＴＣＡの遺伝子サンプルと相補的な配列を有し、５’末端のリン酸基を介してビオチンを修飾したプローブを使用した。
【００４６】
まず、磁気ビーズを１ｍｇを採取し、ＴＴＬバッファー（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）：Ｔｗｅｅｎ２０：２Ｍ塩化リチウム：超純水＝２：１０：５：３の体積比になるよう調製）で洗浄後、２０μＬのＴＴＬバッファーに置換した。その後、１００ｎＭの核酸プローブを５μＬ添加し、室温で１５分穏やかに振とうした。
【００４７】
溶液をデカントし、残留した磁気ビーズを０．１５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液で洗浄後、ＴＴバッファー（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）：Ｔｗｅｅｎ２０：超純水＝１：２：１の体積比になるよう調製）で洗浄した。
【００４８】
洗浄後、ＴＴＥバッファーに溶液を置換し、８０℃で１０分間インキュベートすることにより、不安定な結合を除去した。これにより、捕捉プローブが固定化された磁気ビーズを得た。
【００４９】
さらに、本実施例１においては、比較対象として、遺伝子サンプルと非相補的な配列を有する捕捉プローブを使用して、前記捕捉プローブと同様の処理を行った。なお、ここでは、非相補的な捕捉プローブとして、３０ｍｅｒのＰｏｌｙ−Ａ、ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡの配列を有する５’末端のリン酸基を介してにビオチンを修飾したプローブを使用した。
【００５０】
（３）標識プローブ
標識プローブには、５’末端からＴＧＣＴＴＡＣＡＡＴ ＣＣＴＧＡＴＧＴＴＴ ＴＣＡＴＴＣＡＡＴＴの配列を有し、５’末端のリン酸基を介して、電気化学的に活性である物質であるルテニウム錯体を修飾し、下記（化１）に示すような３０塩基のオリゴデオキシヌクレオチドを使用した。
【００５１】
【化１】
（化１）で示される標識プローブは、以下のようにして得る。まず、ＴＨＦ６０．０ｍLに溶解させた４，４’−ジメチル−２，２’ビピリジン２．５０ｇ（１３．５ｍｍｏｌ）溶液を窒素雰囲気の容器に注入した後、リチウムジイソプロピルアミド２Ｍ溶液１６．９ｍＬ（２７．０ｍｍｏｌ）を滴下し、冷却しながら３０分撹拌した。一方、同様に窒素気流中で乾燥させた容器に、１，３−ジブロモプロパン４．２ｍＬ（４１．１ｍｍｏｌ）とＴＨＦ１０ｍＬとを加え、冷却しながら撹拌させた。この容器に、先程の反応液をゆっくり滴下させて２．５時間反応させた。反応溶液は２Ｎの塩酸で中和し、ＴＨＦを留去した後、クロロホルムで抽出した。溶媒を留去して得た粗生成物をシリカゲルカラムで精製し、生成物Ｃを得た（収率４７％）。
【００５２】
窒素雰囲気の容器に、前記生成物Ｃ１．０ｇ（３．２８ｍｍｏｌ）、フタルイミドカリウム０．６７ｇ（３．６１ｍｍｏｌ）、及びジメチルホルムアミド（脱水）３０．０ｍＬを加え、オイルバスで１８時間還流した。反応後、クロロホルムで抽出し、０．２Ｎ水酸化ナトリウム５０ｍＬで蒸留水洗浄した。溶媒を留去して酢酸エチルとヘキサンから再結晶を行い、生成物Ｄを得た（収率６１・５％）。
【００５３】
塩化ルテニウム(III)（２．９８ｇ、０．０１ｍｏｌ）、及び２，２’−ビピリジン（３．４４ｇ、０．０２２ｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（８０．０ｍL）中で６時間還流した後、溶媒を留去した。その後、アセトンを加え、一晩冷却することで得られた黒色沈殿物を採取し、エタノール水溶液１７０ｍＬ（エタノール：水＝１：１）を加え１時間加熱還流を行った。ろ過後、塩化リチウムを２０ｇ加え、エタノールを留去し、さらに一晩冷却した。析出した黒色物質は吸引ろ過で採取し、生成物Ｅを得た(収率６８．２％)。
【００５４】
窒素置換した容器に、前記生成物Ｄ０．５０ｇ(１．３５ｍｍｏｌ)、前記生成物Ｅ０．７８ｇ（１．６１ｍｍｏｌ）、及びエタノール５０ｍＬを加えた。９時間窒素雰囲気で還流した後、溶媒を留去し、蒸留水で溶解させ、１．０Ｍの過塩素酸水溶液で沈殿させた。この沈殿物を採取し、メタノールで再結晶を行い、生成物Ｆを得た（収率８１．６％）。
【００５５】
さらに、前記生成物Ｆ１．０ｇ（１．０２ｍｍｏｌ）、及びメタノール７０．０ｍＬを１時間還流した。室温まで冷却した後、ヒドラジン一水和物０．２１ｍＬ（４．２１ｍｍｏｌ）を加え再び１３時間還流した。反応後、蒸留水を１５ｍＬ加え、メタノールを留去した。
【００５６】
次に、濃塩酸を５．０ｍＬ加え、２時間還流して得られた反応液を一晩冷蔵し、不純物を自然ろ過で除去した。
【００５７】
これを炭酸水素ナトリウムで中和した後、水を留去し、無機物をアセトニトリルで除去した。溶媒を留去して得た粗生成物をシリカゲルカラムで精製し、生成物Ｇを得た(収率７１．４％)。
アルミホイルで遮光した容器に、前記生成物Ｇ０．６５ｇ（０．７６ｍｍｏｌ）を加え、アセトニトリル１０ｍＬに溶解させた。次に、トリエチルアミン０．２３ｇ（２．２９ｍｍｏｌ）を加えた後、アセトニトリル２０ｍLに溶解したグルタル酸無水物０．８７ｇ（７．６２ｍｍｏｌ）を滴下した。
【００５８】
９時間反応後、エバポレーターでアセトニトリルを留去して得た粗生成物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製し、下記（化２）に示すルテニウム錯体を得た(収率８７．５％)。
【００５９】
【化２】
また下表は、前述のようにして得た（化２）に示す物質の１Ｈ-ＮＭＲ結果である。
【００６０】
１Ｈ-ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ ｄ−６）
σ：
１．４６ （２Ｈ，ｍ）
１．６９ （４Ｈ，ｍ）
２．１０ （４Ｈ，ｍ）
２．５４ （３Ｈ，ｓ）
２．８１ （２Ｈ，ｔ）
３．０８ （２Ｈ，ｍ）
７．４１ （２Ｈ，ｔ）
７．５７ （６Ｈ，ｍ）
７．７７ （４Ｈ，ｍ）
８．１９ （１Ｈ，ｔ）
８．７９ （４Ｈ，ｔ）
８．８８ （６Ｈ，ｍ）
次に、オリゴデオキシヌクレオチド７８６μｇ（８３．４ｐｍｏｌ）を蒸留水０．３ｍＬに溶解させ、該オリゴデオキシヌクレオチドの水溶液に、ルテニウム錯体０．５ｍｇ（０．１２μｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド０．３ｍｇ（２．５μｍｏｌ）、ＷＳＣ１．４ｍｇ（７．５μｍｏｌ）、０．１Ｍトリエチルアミン２．５μＬ（０．２５μｍｏｌ）を添加し、２日間室温で反応させた。ＨＰＬＣで精製後、目的物のフラクションを採取し、溶液を留去して式（１）に示す標識プローブを得た（収率７４．１％）。
【００６１】
（４）ハイブリダイゼーション
前記捕捉プローブを固定した磁気ビーズに、２ＸＳＳＣを１４μＬ加え、そこに５μＭに調製した遺伝子サンプル及び標識プローブをそれぞれ４μＬ添加し、７０℃で穏やかに振とうさせた。１時間振とうさせた後、磁石で磁気ビーズを収集後、溶液をデカントし、４０℃に加温した２ＸＳＳＣで洗浄し、二本鎖核酸が形成された磁気ビーズαを得た。
【００６２】
なお、非相補的な捕捉プローブを固定した磁気ビーズについても、上記と同様の処理を行い、二本鎖核酸が形成されていない磁気ビーズβを得た。
【００６３】
（５）電気化学測定
以上の工程の後、二本鎖核酸が形成された磁気ビーズα及び二本鎖核酸が形成されていない磁気ビーズβに０．２ＭのＰＢＳを１０μＬと０．２Ｍのトリエチルアミンを１０μＬ混合した溶液を加え、懸濁した後、それぞれ５μＬずつ電極に滴下した。
前記電極には、ガラス基板上にスパッタ装置（アルバック製ＳＨ−３５０）によりチタン１０ｎｍを下地に金２００ｎｍを成膜し、フォトリソグラフィ工程により電極パターンを形成したものを使用した。また、電極の下には永久磁石のシートを取り付けており、作用極のみに磁気ビーズが集約するようにした。
【００６４】
５分静置後、前記磁気ビーズα，βが集約した電極ｘα，ｙβそれぞれに、電解液を７５μＬ滴下した。
【００６５】
図１は本発明に用いた電気的活性基を有する有機金属錯体である。Ａはメチレン基が１１の長鎖であり、Ｂはメチレン基が５である。フェロセンは、鉄の上下にシクロペンタジエニル環が配位した非常に安定なサンドイッチ構造を有する有機金属化合物である。フェロセン内の鉄は２価イオンとなっているが、酸化されて３価のフェリシニウムとなる。この反応は可逆的酸化還元反応であり、電位をかけることによりフェロセンの量に比例した電流を取り出すことが可能である。
【００６６】
図２にフェロセン膜の自己組織化膜の模式図を示す。図１に示したＡ物質（メチレン基１１）の自己組織化膜であり、Ｂは図１に示したＢ物質（メチレン基５）の自己組織化膜であり、Ｃは金電極のみを示す。自己組織化膜の作成方法は、Ａ・Ｂ各分子２．５ｍMエタノール溶液を調製し、ガラス基板上に金膜を形成した金電極を各溶液中に室温下、２４時間浸漬し自己組織化膜を形成させた。自己組織化膜を形成させた後、エタノール溶液にて洗浄し、自己組織化膜を得た。
【００６７】
図３に図２で作成した金電極を用いて測定した結果を示す。電気化学発光の測定方法は、Ａ・Ｂ・Ｃの各作用電極表面に電気化学発光剤としてルテニウム錯体を風乾させＣＣＤカメラを用いて発光強度を測定した。作用電極上に１ｍＭのルテニウム錯体１．５マイクロリッタ滴下し常温で風乾させ、金電極表面に物理吸着させた。完全に乾燥した後、電解液５０マイクロリッタ滴下し測定を行った。電解液は０．２Ｍ リン酸緩衝液ｐＨ８．０及び０．２Ｍ トリエチルアミンの混合溶液を用いた。電圧は、１秒間０Ｖから１．３Ｖまで印加しプロピルアミンをラジカル化させ、その後、４秒間１．３Ｖを印加した。尚、電圧は参照電極を用いて正確に電位をかけた。金電極のみの場合は、発光強度は８０であったが、メチレン基が5の場合では、最高発光強度は１８０であり、メチレン基が１１の場合では、４８０であった。フェロセンのメチレン基を長鎖にするにつれルテニウムの電気化学発光強度が増加することが示された。ルテニウム錯体の電気化学発光の機序は、電解液中に過剰量に存在するプロピルアミンが酸化反応によりプロピルアミンラジカル（＋）となり、即座に水素イオンを失いプロピルアミンラジカルを形成する。基底状態ルテニウム錯体（（Ｒｕ（ｂｐｙ）3）2+）は電極上で酸化され（Ｒｕ（ｂｐｙ）3）３+となり、プロピルアミンラジカルとの反応により電子が移動し、励起状態の（Ｒｕ（ｂｐｙ）3）３+＊を形成する。励起状態から基底状態に戻る際に、６２０ｎｍの光を放出する。発光した後、基底状態（（Ｒｕ（ｂｐｙ）3）2+）に戻るので、電気化学発光を何回も反応させることが可能である。反応の開始、終了が電気的にコントロールでき、電極に流す電流によって、得られる発光量を調節できる。また、その電荷の量も、レファレンスの電極によって、モニターできる。すなわち、電極に与える電荷の量・時間を調節することにより、測定物・測定系によって適正な発光量を得ることができるメリットがある。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明にかかる測定方法は、高感度に検出することができ、電気化学発光物質の利用効率を高めることが可能となり、遺伝子診断、感染症診断、ゲノム創薬等の用途に適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】本発明の実施の形態に用いた電気的活性基を有する有機金属錯体の模式図
【図２】同実施の形態に用いた自己組織化膜の模式図
【図３】有機金属錯体の鎖長の長さによる電気化学発光量の変化を示す説明図
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に存在する特定の遺伝子配列を、高感度に検出するための遺伝子検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の、電気化学的に特定の遺伝子配列を検出するＤＮＡチップは、検出すべき目的遺伝子に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを電極表面に固定化し、該核酸プローブと一本鎖に変性された目的遺伝子サンプルとをハイブリダイズさせた後、該核酸プローブと目的遺伝子サンプルとで形成された二本鎖核酸に特異的に結合し且つ電気化学的に活性な標識剤を、該核酸プローブと遺伝子サンプルとの反応系に添加し、電極を介した電気化学的な測定により、前記二本鎖核酸に結合した標識剤を検出することで、目的遺伝子サンプルとハイブリダイズした前記核酸プローブを検出し、目的とする遺伝子の存在を確認する（例えば、特許文献１及び特許文献２参照）。
【０００３】
ここで、前記標識剤とは、前記二本鎖の核酸を認識して、該二本鎖核酸と特異的に結合する物質を指す。前記標識剤は、何れも分子中にフェニル基等の平板状挿入基を有し、該挿入基が二本鎖核酸の塩基対と塩基対との間に挿入することによって、二本鎖核酸と結合する。この標識剤と二本鎖核酸との結合は、静電気的相互作用あるいは疎水的相互作用での結合であって、前記標識剤の二本鎖核酸の塩基対間への挿入、及びその塩基対間からの離脱が一定の速度で繰り返される平衡反応による結合である。
【０００４】
また、従来生化学アッセイに用いられる光の測定法には、吸光・蛍光法や発光法等がある。この内発光法による測定は、高感度に測定が可能であることが知られている。この内電気エネルギーによって励起され発光する現象を、電気化学発光と呼ぶ。電気化学発光する物質としてルテニウム錯体やオスミウム錯体が挙げられる。電気化学発光の反応は、例えば電気化学発光を示す代表的な物質にルテニウムビピリジル錯体（Ｒｕ（ｂｐｙ）3）2+ がある。電気化学発光の作用機序は、電極上でトリプロピルアミン等によりラジカルを発生させ、ルテニウムビピリジル錯体に電子を渡し、励起状態（Ｒｕ（ｂｐｙ）3）３＋となり、基底状態（Ｒｕ（ｂｐｙ）3）２＋に戻る時に発光を生じる（例えば、非特許文献１及び非特許文献２参照）。この様に電気化学発光は、電気化学エネルギーにより発光種を励起し、その励起状態が放射失括する際に可視光線を放出する。発光種の励起には電気化学エネルギーを利用するため、吸光法や蛍光法に比べバックグランドノイズを減らすことが可能である。このため、電気化学発光法は、吸光法や蛍光法よりも高感度に測定が可能となる。電気化学発光による測定は、ＤＮＡ等の核酸測定や、抗原や抗体の測定として種々のアッセイに利用されつつある（例えば、特許文献３参照）。しかし電気化学発光は、電気二重層と呼ばれる電極表面から数ｎｍの領域といった非常に狭い範囲で行われるため、電気化学発光物質の利用効率が悪いという課題があった。
【特許文献１】特開平５−１９９８９８号公報
【特許文献２】特開平９−２８８０８０号公報
【特許文献３】特開２００２−３４５６１号公報
【非特許文献１】Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２００４，７６，５３７９−５３８６
【非特許文献２】Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，２００４，１０４，３００３−３０３６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来、電気化学発光を行う場合では、電極付近で電子の授受を行わせる必要があり、電子の授受が可能な領域は電気二重層と呼ばれる非常に狭い範囲であった。本発明は、電気的活性基を有する有機金属錯体を用いる事により、電極上での電子の授受を効率良く行わせる事が可能な方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記課題を解決するため、本発明の遺伝子検出方法は、特定の配列を有する遺伝子を検出する遺伝子検出方法であって、前記検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の捕捉プローブを作製し、該捕捉プローブを固相に固定化する固定化工程と、
前記検出すべき遺伝子を一本鎖に変性して遺伝子サンプルを作製する遺伝子サンプル作製工程と、前記遺伝子サンプルに電気化学的に活性である物質を添加し、前記遺伝子サンプルと該電気化学的に活性である物質とを化学結合させる、電気化学的に活性である物質結合遺伝子サンプル作製工程と、前記電気化学的に活性である物質が結合した遺伝子サンプルと前記固相に固定された一本鎖の捕捉プローブとをハイブリダイズさせ、前記遺伝子サンプルを前記固相に捕捉させる遺伝子サンプル捕捉工程と、前記固相に固定された前記遺伝子サンプルに結合した前記電気化学的に活性である物質を、電気化学的な測定により検出する検出工程と、を含むものである。
【０００７】
これにより、前記遺伝子サンプルが微量でも電気化学的に活性である物質を複数結合させることができるので、高感度検出が可能となる。また、検体ごとに標識プローブの設計を行う必要もなくなる。
【０００８】
また、本発明の遺伝子検出方法は、検体試料中の特定の配列を有する遺伝子を検出する遺伝子検出方法であって、前記検出すべき遺伝子を一本鎖に変性して遺伝子サンプルを作製する遺伝子サンプル作製工程と、前記遺伝子サンプルに電気化学的に活性である物質を添加し、前記遺伝子サンプルと該電気化学的に活性である物質とを化学結合させる、電気化学的に活性である物質結合遺伝子サンプル作製工程と、前記検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の捕捉プローブを作製し、前記電気化学的に活性である物質が結合した遺伝子サンプルとハイブリダイズさせ、二本鎖核酸を形成する二本鎖核酸形成工程と、前記二本鎖核酸を形成した捕捉プローブを固相に固定化する固定化工程と、前記固相に固定された前記遺伝子サンプルに結合した前記電気化学的に活性である物質を、電気化学的な測定により検出する検出工程と、を含むものである。
【０００９】
これにより、前記遺伝子サンプルが微量でも電気化学的に活性である物質を複数結合させることができるので、高感度検出が可能となる。また、検体ごとに標識プローブの設計を行う必要もなくなる。
【００１０】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記電気的活性基を有する有機金属錯体は、フェロセン分子であるものである。
【００１１】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記電気的活性基を有する有機金属錯体は、電気的活性基を有する分子とチオール分子からなり、チオール分子により電極上に自己組織化膜を形成するものである。
【００１２】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、電気的活性基を有する分子とチオール分子は、メチレン基（−ＣＨ２−）ｎをスペーサーとし、ｎ数は２〜１１であるものである。電気化学発光は酸化還元性を有する化合物である。
【００１３】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記酸化還元性を有する化合物は、電気化学発光を示す化合物である。
【００１４】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記電気化学発光を示す化合物は、配位子に複素環系化合物を有する金属錯体、ルブレン、アントラセン、コロネン、ピレン、フルオランテン、クリセン、フェナントレン、ペリレン、ビナフチル、あるいはオクタテトラエンのいずれかである。
【００１５】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体は、配位子にピリジン部位を有する金属錯体である。
【００１６】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記配位子にピリジン部位を有する金属錯体は、金属ビピリジン錯体、あるいは金属フェナントロリン錯体のいずれかであるものである。
【００１７】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記電気化学発光を示す化合物は、金属錯体である。
【００１８】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記金属錯体の中心金属は、ルテニウム、あるいはオスニウムのいずれかである。
【００１９】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、ルテニウムを有する有機金属錯体を、核酸またはタンパク質にラベル化することにより、電気化学発光量によりラベル化された核酸量またはタンパク質を定量する。
【００２０】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記磁気ビーズの粒径が、１ｎｍ以上、前記磁気ビーズの平均粒径以下（もしくは５００ｎｍ以下）である。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の遺伝子検出方法によれば、電気化学測定の際に、電解液に分散した導電性物質を介して、電気二重層領域が電極表面から離れた部分にも広がり、電極表面に接触していない電気化学発光物質でも電気化学反応が起きるため、電気化学発光物質の利用効率を高めることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下に、本発明の遺伝子検出方法について詳細に説明する。なお、以下の実施の形態における遺伝子サンプルとは、例えば、血液、白血球、血清、尿、糞便、精液、唾液、培養細胞、各種臓器細胞のような組織細胞、その他遺伝子を含有する任意の試料から、該試料中の細胞を破壊して二本鎖核酸を遊離させ、熱処理あるいはアルカリ処理によって、一本鎖の核酸に解離させたものである。また、本実施の形態における遺伝子サンプルは、制限酵素で切断して電気泳動による分離等で精製した核酸断片でもよい。
【００２３】
（実施の形態１）
以下、実施の形態１における遺伝子検出方法について説明する。まず、検査対象となる遺伝子サンプルを作製する。この遺伝子サンプルは、前述したように、任意の試料中の細胞を破壊して二本鎖核酸を遊離させ、熱処理あるいはアルカリ処理によって、一本鎖に変性させる。
【００２４】
このとき、前記試料中の細胞の破壊は、常法により行うことができ、例えば、振とう、超音波等の物理的作用を外部から加えて行うことができる。また、核酸抽出溶液（例えば、ＳＤＳ、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、Ｔｗｅｅｎ−２０等の界面活性剤、又はサポニン、ＥＤＴＡ、プロテア−ゼ等を含む溶液等）を用いて、細胞から核酸を遊離させることもできる。
【００２５】
次に、前記一本鎖の遺伝子サンプルに、後述する標識プローブを含む溶液を接触させる。これにより、前記標識プローブがもつ標識結合用プローブと、該標識結合用プローブと相補的な配列を有する遺伝子サンプルがハイブリダイズし、標識化遺伝子サンプルが形成される。この標識プローブと遺伝子サンプルをハイブリダイズさせる方法は周知であるため、ここでは説明を省略する。
【００２６】
以下、本発明に用いられる標識プローブについて説明する。標識プローブは、検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有し、且つ電気化学的に活性である物質で標識された一本鎖核酸である。
【００２７】
前述の電気化学的に活性である物質は、電気化学的に検出可能な物質であれば特に制限無く何を用いてもよく、例えば、可逆な酸化還元反応時に生じる酸化還元電流を測定することで物質の検出が可能な、酸化還元性を有する化合物が挙げられる。そしてこのような酸化還元性を有する化合物としては、例えば、フェロセン、カテコールアミン、配位子に複素環系化合物を有する金属錯体、ルブレン、アントラセン、コロネン、ピレン、フルオランテン、クリセン、フェナントレン、ペリレン、ビナフチル、オクタテトラエンもしくはビオローゲン等がある。
【００２８】
なお、前述した、配位子に複素環系化合物を有する金属錯体、ルブレン、アントラセン、コロネン、ピレン、フルオランテン、クリセン、フェナントレン、ペリレン、ビナフチル、オクタテトラエンには、酸化還元反応時に電気化学発光を生じるものもあり、前記Ｅとしてこれらを用いた場合は、後述する検出工程にてその発光を測定することで、遺伝子サンプルの検出を行うこともできる。
【００２９】
また、前述の配位子に複素環系化合物を有する金属錯体としては、酸素や窒素等を含む複素環系化合物、例えば、ピリジン部位、ピラン部位等を配位子に有する金属錯体等を挙げることができ、特に、ピリジン部位を配位子に有する金属錯体が好ましく、該ピリジン部位を配位子に有する金属錯体としては、例えば、金属ビピリジン錯体、金属フェナントロリン錯体等が例に挙げられる。
【００３０】
さらに、前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体の中心金属としては、例えば、ルテニウム、オスニウム、亜鉛、コバルト、白金、クロム、モリブデン、タングステン、テクネチウム、レニウム、ロジウム、イリジウム、パラジウム、銅、インジウム、ランタン、プラセオジム、ネオジム、サマリウム等を挙げることができる。特に該中心金属が、ルテニウム、オスニウムである錯体は、良好な電気化学発光特性を有し、このような良好な電気化学発光特性を有する物質としては、例えば、ルテニウムビピリジン錯体、ルテニウムフェナントロリン錯体、オスニウムビピリジン錯体、オスニウムフェナントロリン錯体等を挙げることができる。
【００３１】
そしてこの後、前述したようにして形成された標識化遺伝子サンプルを含む溶液を、磁気ビーズに固定化された捕捉プローブに接触させる。これにより、前記捕捉プローブと、該捕捉プローブと相補的な配列を有する遺伝子サンプルとがハイブリダイズし、前記標識化遺伝子サンプルが磁気ビーズに固定化される。この前記捕捉プローブと前記標識化遺伝子サンプルをハイブリダイズさせる方法は周知であるため、ここでは説明を省略する。
【００３２】
前記捕捉プローブとしては、化学合成で得た一本鎖の核酸、あるいは生物試料から抽出した核酸を制限酵素で切断し、電気泳動による分離等で精製した核酸を用いることができる。なお、生物試料から抽出した核酸の場合には、熱処理あるいはアルカリ処理によって、一本鎖の核酸に解離させておくことが好ましい。
【００３３】
また、前記捕捉プローブを固定化する磁気ビーズとしては、特に限定されるものではなく、医用で一般的に用いられている磁気ビーズが使用可能である。前記磁気ビーズは、電気絶縁材料であるポリスチレンやデキストランのようなポリマーに酸化鉄のような可磁化物質を分散させたものである。前記磁気ビーズの粒径は、１０ｎｍ〜１０μｍと幅広く選択可能であり、特に限定されるものではないが、溶液中での分散性および分離、回収性から、１００ｎｍ〜５μｍが好ましい。
【００３４】
前記捕捉プローブを前記磁気ビーズに固定化する方法としては、例えば、磁気ビーズにアビジンコーティングを施し、末端をビオチン修飾した核酸プローブと結合させるなどの公知の方法が用いることができる。
【００３５】
なお、前述の説明では、まず遺伝子サンプルと標識プローブとをハイブリダイズさせて標識化遺伝子サンプルを形成する遺伝子サンプル標識化工程の後、該標識化遺伝子サンプルと磁気ビーズに固定化された捕捉プローブとをハイブリダイズさせて、遺伝子サンプルを磁気ビーズに固定化する遺伝子サンプル捕捉工程を行なうものとしたが、前記遺伝子サンプル捕捉工程と前記遺伝子サンプル標識化工程とを同時に行うものでもよい。この場合、遺伝子サンプルと、標識プローブと、磁気ビーズに固定化した捕捉プローブとを同時に接触させて、標識された遺伝子サンプルを磁気ビーズに固定化する。
【００３６】
前述のようにして前記標識化遺伝子サンプルを磁気ビーズに固定化後、磁気ビーズを磁力で収集し、未反応の遺伝子サンプルと標識プローブを除去することで、Ｂ／Ｆ分離を行う。
【００３７】
Ｂ／Ｆ分離を行った後、磁気ビーズを電解液とともに電極上に展開し、前記磁気ビーズは磁力により電極表面に捕捉する。そして、電極に電圧を印加することで、該磁気ビーズに固定化された前記標識化遺伝子サンプルの、電気化学的に活性である物質由来の電気化学的な信号を測定する。
【００３８】
電気化学的な信号の測定は、標識された電気化学的に活性である物質によって異なり、前記電気化学的に活性である物質として、酸化還元電流を生じる電気化学的に活性である物質を用いた場合には、該電気化学的に活性である物質由来の電気化学的な信号を、前記ポテンショスタット、ファンクションジェネレータ等からなる計測系で測定できる。一方、前記電気化学的に活性である物質として、電気化学発光を生じる物質を用いた場合には、フォトマルチプライヤー等を用いて計測が可能である。
【００３９】
以下、本発明に用いられる電解液について説明する。本発明の電解液は、磁気ビーズが添加されたものであり、電解液に分散した導電性物質を介して、電気二重層領域が電極表面から離れた部分にも広がり、電極表面に接触していない部分の電気化学的に活性である物質でも電気化学反応が起きるため、標識剤の利用効率を高めることが可能となる。
【００４０】
前記導電性粒子は、金属電極と前記電気化学的に活性である物質との間で電子の移動が可能であり、前記電気化学的に活性である物質を、酸化還元することができる物質であれば、特に制限無く何を用いてもよい。
【００４１】
特に好適な材料としては、化学的に安定であり、溶解電位が高い金属材料、例えば、金、白金、銀、パラジウム、ロジウム、イリジウム、タングステン等、また、酸化および還元方向の電位窓の広いカーボン等が挙げられる。
【００４２】
また、前記磁力により電極表面に捕捉された磁気ビーズは、凝集、積層した状態で電極表面に存在するため、前記導電性粒子の粒径は、１ｎｍ以上、前記磁気ビーズの粒径以下（もしくは５００ｎｍ以下）が好ましい。これにより、導電性粒子が磁気ビーズの間隙に入り込み、凝集、積層した磁気ビーズ全体の標識剤を反応させることで、標識剤の利用効率を高めることが可能となる。
【００４３】
このような磁気ビーズとしては、例えば、免疫測定の呈色剤や燃料電池の触媒等で使用されるコロイド粒子等が挙げられる。
【実施例１】
【００４４】
以下、本発明の実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
（１）遺伝子サンプル
遺伝子サンプルには、ヒト由来Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ−４５０の遺伝子配列の５’−末端より５９９−６９８番目に位置するＡＡＴＴＧＡＡＴＧＡ ＡＡＡＣＡＴＣＡＧＧ ＡＴＴＧＴＡＡＧＣＡ ＣＣＣＣＣＴＧＧＡＴ ＣＣＡＧＡＴＡＴＧＣ ＡＡＴＡＡＴＴＴＴＣ ＣＣＡＣＴＡＴＣＡＴ ＴＧＡＴＴＡＴＴＴＣ ＣＣＧＧＧＡＡＣＣＣ ＡＴＡＡＣＡＡＡＴＴの配列を有する１００塩基のオリゴデオキシヌクレオチドを使用した。
【００４５】
（２）磁気ビーズ表面への核酸プローブの固定化
磁気ビーズには、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製のＣＭ０１Ｎ／５８９６ストレプトアビジン磁気ビーズを用いた（粒径０．３５μｍ）。捕捉プローブには、５’末端よりＡＡＴＴＴＧＴＴＡＴ ＧＧＧＴＴＣＣＣＧＧ ＧＡＡＡＴＡＡＴＣＡの遺伝子サンプルと相補的な配列を有し、５’末端のリン酸基を介してビオチンを修飾したプローブを使用した。
【００４６】
まず、磁気ビーズを１ｍｇを採取し、ＴＴＬバッファー（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）：Ｔｗｅｅｎ２０：２Ｍ塩化リチウム：超純水＝２：１０：５：３の体積比になるよう調製）で洗浄後、２０μＬのＴＴＬバッファーに置換した。その後、１００ｎＭの核酸プローブを５μＬ添加し、室温で１５分穏やかに振とうした。
【００４７】
溶液をデカントし、残留した磁気ビーズを０．１５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液で洗浄後、ＴＴバッファー（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）：Ｔｗｅｅｎ２０：超純水＝１：２：１の体積比になるよう調製）で洗浄した。
【００４８】
洗浄後、ＴＴＥバッファーに溶液を置換し、８０℃で１０分間インキュベートすることにより、不安定な結合を除去した。これにより、捕捉プローブが固定化された磁気ビーズを得た。
【００４９】
さらに、本実施例１においては、比較対象として、遺伝子サンプルと非相補的な配列を有する捕捉プローブを使用して、前記捕捉プローブと同様の処理を行った。なお、ここでは、非相補的な捕捉プローブとして、３０ｍｅｒのＰｏｌｙ−Ａ、ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡの配列を有する５’末端のリン酸基を介してにビオチンを修飾したプローブを使用した。
【００５０】
（３）標識プローブ
標識プローブには、５’末端からＴＧＣＴＴＡＣＡＡＴ ＣＣＴＧＡＴＧＴＴＴ ＴＣＡＴＴＣＡＡＴＴの配列を有し、５’末端のリン酸基を介して、電気化学的に活性である物質であるルテニウム錯体を修飾し、下記（化１）に示すような３０塩基のオリゴデオキシヌクレオチドを使用した。
【００５１】
【化１】
（化１）で示される標識プローブは、以下のようにして得る。まず、ＴＨＦ６０．０ｍLに溶解させた４，４’−ジメチル−２，２’ビピリジン２．５０ｇ（１３．５ｍｍｏｌ）溶液を窒素雰囲気の容器に注入した後、リチウムジイソプロピルアミド２Ｍ溶液１６．９ｍＬ（２７．０ｍｍｏｌ）を滴下し、冷却しながら３０分撹拌した。一方、同様に窒素気流中で乾燥させた容器に、１，３−ジブロモプロパン４．２ｍＬ（４１．１ｍｍｏｌ）とＴＨＦ１０ｍＬとを加え、冷却しながら撹拌させた。この容器に、先程の反応液をゆっくり滴下させて２．５時間反応させた。反応溶液は２Ｎの塩酸で中和し、ＴＨＦを留去した後、クロロホルムで抽出した。溶媒を留去して得た粗生成物をシリカゲルカラムで精製し、生成物Ｃを得た（収率４７％）。
【００５２】
窒素雰囲気の容器に、前記生成物Ｃ１．０ｇ（３．２８ｍｍｏｌ）、フタルイミドカリウム０．６７ｇ（３．６１ｍｍｏｌ）、及びジメチルホルムアミド（脱水）３０．０ｍＬを加え、オイルバスで１８時間還流した。反応後、クロロホルムで抽出し、０．２Ｎ水酸化ナトリウム５０ｍＬで蒸留水洗浄した。溶媒を留去して酢酸エチルとヘキサンから再結晶を行い、生成物Ｄを得た（収率６１・５％）。
【００５３】
塩化ルテニウム(III)（２．９８ｇ、０．０１ｍｏｌ）、及び２，２’−ビピリジン（３．４４ｇ、０．０２２ｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（８０．０ｍL）中で６時間還流した後、溶媒を留去した。その後、アセトンを加え、一晩冷却することで得られた黒色沈殿物を採取し、エタノール水溶液１７０ｍＬ（エタノール：水＝１：１）を加え１時間加熱還流を行った。ろ過後、塩化リチウムを２０ｇ加え、エタノールを留去し、さらに一晩冷却した。析出した黒色物質は吸引ろ過で採取し、生成物Ｅを得た(収率６８．２％)。
【００５４】
窒素置換した容器に、前記生成物Ｄ０．５０ｇ(１．３５ｍｍｏｌ)、前記生成物Ｅ０．７８ｇ（１．６１ｍｍｏｌ）、及びエタノール５０ｍＬを加えた。９時間窒素雰囲気で還流した後、溶媒を留去し、蒸留水で溶解させ、１．０Ｍの過塩素酸水溶液で沈殿させた。この沈殿物を採取し、メタノールで再結晶を行い、生成物Ｆを得た（収率８１．６％）。
【００５５】
さらに、前記生成物Ｆ１．０ｇ（１．０２ｍｍｏｌ）、及びメタノール７０．０ｍＬを１時間還流した。室温まで冷却した後、ヒドラジン一水和物０．２１ｍＬ（４．２１ｍｍｏｌ）を加え再び１３時間還流した。反応後、蒸留水を１５ｍＬ加え、メタノールを留去した。
【００５６】
次に、濃塩酸を５．０ｍＬ加え、２時間還流して得られた反応液を一晩冷蔵し、不純物を自然ろ過で除去した。
【００５７】
これを炭酸水素ナトリウムで中和した後、水を留去し、無機物をアセトニトリルで除去した。溶媒を留去して得た粗生成物をシリカゲルカラムで精製し、生成物Ｇを得た(収率７１．４％)。
アルミホイルで遮光した容器に、前記生成物Ｇ０．６５ｇ（０．７６ｍｍｏｌ）を加え、アセトニトリル１０ｍＬに溶解させた。次に、トリエチルアミン０．２３ｇ（２．２９ｍｍｏｌ）を加えた後、アセトニトリル２０ｍLに溶解したグルタル酸無水物０．８７ｇ（７．６２ｍｍｏｌ）を滴下した。
【００５８】
９時間反応後、エバポレーターでアセトニトリルを留去して得た粗生成物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製し、下記（化２）に示すルテニウム錯体を得た(収率８７．５％)。
【００５９】
【化２】
また下表は、前述のようにして得た（化２）に示す物質の１Ｈ-ＮＭＲ結果である。
【００６０】
１Ｈ-ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ ｄ−６）
σ：
１．４６ （２Ｈ，ｍ）
１．６９ （４Ｈ，ｍ）
２．１０ （４Ｈ，ｍ）
２．５４ （３Ｈ，ｓ）
２．８１ （２Ｈ，ｔ）
３．０８ （２Ｈ，ｍ）
７．４１ （２Ｈ，ｔ）
７．５７ （６Ｈ，ｍ）
７．７７ （４Ｈ，ｍ）
８．１９ （１Ｈ，ｔ）
８．７９ （４Ｈ，ｔ）
８．８８ （６Ｈ，ｍ）
次に、オリゴデオキシヌクレオチド７８６μｇ（８３．４ｐｍｏｌ）を蒸留水０．３ｍＬに溶解させ、該オリゴデオキシヌクレオチドの水溶液に、ルテニウム錯体０．５ｍｇ（０．１２μｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド０．３ｍｇ（２．５μｍｏｌ）、ＷＳＣ１．４ｍｇ（７．５μｍｏｌ）、０．１Ｍトリエチルアミン２．５μＬ（０．２５μｍｏｌ）を添加し、２日間室温で反応させた。ＨＰＬＣで精製後、目的物のフラクションを採取し、溶液を留去して式（１）に示す標識プローブを得た（収率７４．１％）。
【００６１】
（４）ハイブリダイゼーション
前記捕捉プローブを固定した磁気ビーズに、２ＸＳＳＣを１４μＬ加え、そこに５μＭに調製した遺伝子サンプル及び標識プローブをそれぞれ４μＬ添加し、７０℃で穏やかに振とうさせた。１時間振とうさせた後、磁石で磁気ビーズを収集後、溶液をデカントし、４０℃に加温した２ＸＳＳＣで洗浄し、二本鎖核酸が形成された磁気ビーズαを得た。
【００６２】
なお、非相補的な捕捉プローブを固定した磁気ビーズについても、上記と同様の処理を行い、二本鎖核酸が形成されていない磁気ビーズβを得た。
【００６３】
（５）電気化学測定
以上の工程の後、二本鎖核酸が形成された磁気ビーズα及び二本鎖核酸が形成されていない磁気ビーズβに０．２ＭのＰＢＳを１０μＬと０．２Ｍのトリエチルアミンを１０μＬ混合した溶液を加え、懸濁した後、それぞれ５μＬずつ電極に滴下した。
前記電極には、ガラス基板上にスパッタ装置（アルバック製ＳＨ−３５０）によりチタン１０ｎｍを下地に金２００ｎｍを成膜し、フォトリソグラフィ工程により電極パターンを形成したものを使用した。また、電極の下には永久磁石のシートを取り付けており、作用極のみに磁気ビーズが集約するようにした。
【００６４】
５分静置後、前記磁気ビーズα，βが集約した電極ｘα，ｙβそれぞれに、電解液を７５μＬ滴下した。
【００６５】
図１は本発明に用いた電気的活性基を有する有機金属錯体である。Ａはメチレン基が１１の長鎖であり、Ｂはメチレン基が５である。フェロセンは、鉄の上下にシクロペンタジエニル環が配位した非常に安定なサンドイッチ構造を有する有機金属化合物である。フェロセン内の鉄は２価イオンとなっているが、酸化されて３価のフェリシニウムとなる。この反応は可逆的酸化還元反応であり、電位をかけることによりフェロセンの量に比例した電流を取り出すことが可能である。
【００６６】
図２にフェロセン膜の自己組織化膜の模式図を示す。図１に示したＡ物質（メチレン基１１）の自己組織化膜であり、Ｂは図１に示したＢ物質（メチレン基５）の自己組織化膜であり、Ｃは金電極のみを示す。自己組織化膜の作成方法は、Ａ・Ｂ各分子２．５ｍMエタノール溶液を調製し、ガラス基板上に金膜を形成した金電極を各溶液中に室温下、２４時間浸漬し自己組織化膜を形成させた。自己組織化膜を形成させた後、エタノール溶液にて洗浄し、自己組織化膜を得た。
【００６７】
図３に図２で作成した金電極を用いて測定した結果を示す。電気化学発光の測定方法は、Ａ・Ｂ・Ｃの各作用電極表面に電気化学発光剤としてルテニウム錯体を風乾させＣＣＤカメラを用いて発光強度を測定した。作用電極上に１ｍＭのルテニウム錯体１．５マイクロリッタ滴下し常温で風乾させ、金電極表面に物理吸着させた。完全に乾燥した後、電解液５０マイクロリッタ滴下し測定を行った。電解液は０．２Ｍ リン酸緩衝液ｐＨ８．０及び０．２Ｍ トリエチルアミンの混合溶液を用いた。電圧は、１秒間０Ｖから１．３Ｖまで印加しプロピルアミンをラジカル化させ、その後、４秒間１．３Ｖを印加した。尚、電圧は参照電極を用いて正確に電位をかけた。金電極のみの場合は、発光強度は８０であったが、メチレン基が5の場合では、最高発光強度は１８０であり、メチレン基が１１の場合では、４８０であった。フェロセンのメチレン基を長鎖にするにつれルテニウムの電気化学発光強度が増加することが示された。ルテニウム錯体の電気化学発光の機序は、電解液中に過剰量に存在するプロピルアミンが酸化反応によりプロピルアミンラジカル（＋）となり、即座に水素イオンを失いプロピルアミンラジカルを形成する。基底状態ルテニウム錯体（（Ｒｕ（ｂｐｙ）3）2+）は電極上で酸化され（Ｒｕ（ｂｐｙ）3）３+となり、プロピルアミンラジカルとの反応により電子が移動し、励起状態の（Ｒｕ（ｂｐｙ）3）３+＊を形成する。励起状態から基底状態に戻る際に、６２０ｎｍの光を放出する。発光した後、基底状態（（Ｒｕ（ｂｐｙ）3）2+）に戻るので、電気化学発光を何回も反応させることが可能である。反応の開始、終了が電気的にコントロールでき、電極に流す電流によって、得られる発光量を調節できる。また、その電荷の量も、レファレンスの電極によって、モニターできる。すなわち、電極に与える電荷の量・時間を調節することにより、測定物・測定系によって適正な発光量を得ることができるメリットがある。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明にかかる測定方法は、高感度に検出することができ、電気化学発光物質の利用効率を高めることが可能となり、遺伝子診断、感染症診断、ゲノム創薬等の用途に適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】本発明の実施の形態に用いた電気的活性基を有する有機金属錯体の模式図
【図２】同実施の形態に用いた自己組織化膜の模式図
【図３】有機金属錯体の鎖長の長さによる電気化学発光量の変化を示す説明図
【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定の配列を有する遺伝子を検出する遺伝子検出方法であって、
前記検出すべき遺伝子を一本鎖に変性して遺伝子サンプルを作製する遺伝子サンプル作製工程と、
電気化学的に活性である物質で標識された、前記検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の標識プローブを作製し、該一本鎖の標識プローブと前記一本鎖の遺伝子サンプルとをハイブリダイズさせ、標識化遺伝子サンプルを形成する遺伝子サンプル標識化工程と、
前記検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列で、且つ前記標識プローブと異なる塩基配列を有する一本鎖の捕捉プローブを作製し、該捕捉プローブを磁気ビーズに固定化する固定化工程と、
前記磁気ビーズに固定された一本鎖の捕捉プローブと前記標識化遺伝子サンプルとをハイブリダイズさせ、前記遺伝子サンプルを前記磁気ビーズに捕捉する遺伝子サンプル捕捉工程と、
前記磁気ビーズを磁力により収集し、未反応の遺伝子サンプルおよび標識プローブを除去する洗浄工程と、
収集した前記磁気ビーズを電解質とともに電極上に展開し、前記磁気ビーズに捕捉された前記標識化遺伝子サンプル中の前記電気化学的に活性である物質を、電気化学的な測定により検出する検出工程と、を含み、
前記電極上に電気的活性基を有する有機金属錯体を配置することを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項２】
請求項１に記載の遺伝子検出方法において、
前記電気的活性基を有する有機金属錯体は、フェロセン分子であることを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項３】
請求項１に記載の遺伝子検出方法において、
前記電気的活性基を有する有機金属錯体は、電気的活性基を有する分子とチオール分子からなり、前記チオール分子により電極上に自己組織化膜を形成することを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項４】
請求項３に記載の遺伝子検出方法において、
前記電気的活性基を有する分子と前記チオール分子は、メチレン基（−ＣＨ２−）ｎをスペーサーとし、ｎ数は２〜１１である遺伝子検出方法。
【請求項５】
請求項１に記載の遺伝子検出方法において、
電気化学発光は酸化還元性を有する化合物であることを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項６】
請求項５に記載の検出方法において、
前記酸化還元性を有する化合物は、電気化学発光を示す化合物である、ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項７】
請求項６に記載の検出方法において、
前記電気化学発光を示す化合物は、金属錯体であることを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項８】
請求項７に記載の検出方法において、
前記金属錯体の中心金属は、ルテニウム、あるいはオスニウムのいずれかであることを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項９】
請求項１に記載の検出方法において、
ルテニウムを有する有機金属錯体を、核酸またはタンパク質にラベル化することにより、電気化学発光量によりラベル化された核酸量またはタンパク質を定量する事が可能な遺伝子検出方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の遺伝子検出方法において、
前記磁気ビーズの粒径が、１ｎｍ以上、前記磁気ビーズの平均粒径以下（もしくは５００ｎｍ以下）であることを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項１】
特定の配列を有する遺伝子を検出する遺伝子検出方法であって、
前記検出すべき遺伝子を一本鎖に変性して遺伝子サンプルを作製する遺伝子サンプル作製工程と、
電気化学的に活性である物質で標識された、前記検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の標識プローブを作製し、該一本鎖の標識プローブと前記一本鎖の遺伝子サンプルとをハイブリダイズさせ、標識化遺伝子サンプルを形成する遺伝子サンプル標識化工程と、
前記検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列で、且つ前記標識プローブと異なる塩基配列を有する一本鎖の捕捉プローブを作製し、該捕捉プローブを磁気ビーズに固定化する固定化工程と、
前記磁気ビーズに固定された一本鎖の捕捉プローブと前記標識化遺伝子サンプルとをハイブリダイズさせ、前記遺伝子サンプルを前記磁気ビーズに捕捉する遺伝子サンプル捕捉工程と、
前記磁気ビーズを磁力により収集し、未反応の遺伝子サンプルおよび標識プローブを除去する洗浄工程と、
収集した前記磁気ビーズを電解質とともに電極上に展開し、前記磁気ビーズに捕捉された前記標識化遺伝子サンプル中の前記電気化学的に活性である物質を、電気化学的な測定により検出する検出工程と、を含み、
前記電極上に電気的活性基を有する有機金属錯体を配置することを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項２】
請求項１に記載の遺伝子検出方法において、
前記電気的活性基を有する有機金属錯体は、フェロセン分子であることを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項３】
請求項１に記載の遺伝子検出方法において、
前記電気的活性基を有する有機金属錯体は、電気的活性基を有する分子とチオール分子からなり、前記チオール分子により電極上に自己組織化膜を形成することを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項４】
請求項３に記載の遺伝子検出方法において、
前記電気的活性基を有する分子と前記チオール分子は、メチレン基（−ＣＨ２−）ｎをスペーサーとし、ｎ数は２〜１１である遺伝子検出方法。
【請求項５】
請求項１に記載の遺伝子検出方法において、
電気化学発光は酸化還元性を有する化合物であることを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項６】
請求項５に記載の検出方法において、
前記酸化還元性を有する化合物は、電気化学発光を示す化合物である、ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項７】
請求項６に記載の検出方法において、
前記電気化学発光を示す化合物は、金属錯体であることを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項８】
請求項７に記載の検出方法において、
前記金属錯体の中心金属は、ルテニウム、あるいはオスニウムのいずれかであることを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項９】
請求項１に記載の検出方法において、
ルテニウムを有する有機金属錯体を、核酸またはタンパク質にラベル化することにより、電気化学発光量によりラベル化された核酸量またはタンパク質を定量する事が可能な遺伝子検出方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の遺伝子検出方法において、
前記磁気ビーズの粒径が、１ｎｍ以上、前記磁気ビーズの平均粒径以下（もしくは５００ｎｍ以下）であることを特徴とする遺伝子検出方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００９−１３９３０８（Ｐ２００９−１３９３０８Ａ）
【公開日】平成２１年６月２５日（２００９．６．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３１８１５８（Ｐ２００７−３１８１５８）
【出願日】平成１９年１２月１０日（２００７．１２．１０）
【出願人】（０００００５８２１）パナソニック株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年６月２５日（２００９．６．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月１０日（２００７．１２．１０）
【出願人】（０００００５８２１）パナソニック株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
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