遺伝子検出方法
【課題】磁気ビーズから分離された電気化学発光物質を作用電極上に捕捉することのできる遺伝子検出方法を提供する。
【解決手段】測定すべき目的核酸と前記目的核酸の一部と結合する第一のプローブを持つ磁気ビーズと前記目的核酸の他の一部と結合する第二のプローブを持つ電気化学発光物質とが互いに結合してプローブ複合体を形成する第1のステップと、前記磁気ビーズに作用する磁力を用いて前記第１のステップにて形成されたプローブ複合体を収集する第２のステップと、前記第２のステップで収集されたプローブ複合体から少なくとも前記電気化学発光物質を分離する第３のステップと、前記第３のステップで分離された電気化学発光物質を収集するために作用電極上に負電圧を与える第４のステップと、前記作用電極に正電圧を与え前記収集された電気化学発光物質を発光させその光量を測定する第５のステップと、を備える遺伝子検出方法。
【解決手段】測定すべき目的核酸と前記目的核酸の一部と結合する第一のプローブを持つ磁気ビーズと前記目的核酸の他の一部と結合する第二のプローブを持つ電気化学発光物質とが互いに結合してプローブ複合体を形成する第1のステップと、前記磁気ビーズに作用する磁力を用いて前記第１のステップにて形成されたプローブ複合体を収集する第２のステップと、前記第２のステップで収集されたプローブ複合体から少なくとも前記電気化学発光物質を分離する第３のステップと、前記第３のステップで分離された電気化学発光物質を収集するために作用電極上に負電圧を与える第４のステップと、前記作用電極に正電圧を与え前記収集された電気化学発光物質を発光させその光量を測定する第５のステップと、を備える遺伝子検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に存在する特定遺伝子を検出するための遺伝子検出方法に関し、作用極に負電圧を印加し電気化学発光物質を作用極上に捕捉することで高感度に目的遺伝子を検出する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、目的遺伝子を検出する手法として、電気化学反応を用いた検出方法が採用されてきた。この方法は以下の通りである。目的遺伝子と相補な配列を有する核酸を担体に固定し、ハイブリダイゼーション反応を起こさせることで選択的に目的遺伝子を検出プローブに捕捉させる。Ｂ／Ｆ（Ｂｏｕｎｄ／Ｆｒｅｅ）分離により非目的遺伝子や余分な物質等の非目的試料を除去した後、電気化学反応性を有する２本鎖核酸挿入剤を用いて２本鎖核酸のみに選択的に挿入させる。これにより、遺伝子配列の相補性を利用して目的遺伝子を検出することができる（例えば、特許文献１及び特許文献２参照。）。
【０００３】
この電気化学反応を用いた遺伝子検出方法は、蛍光検出を行う際には必要になる励起光が不要なことからバックグラウンド光が低減でき、目的遺伝子の高感度な検出が可能となる。近年、検出プローブを固定する担体は、平面基板であるマイクロアレイ型からマイクロビーズ型に変わってきている。これは、マイクロビーズはマイクロアレイよりもハイブリダイゼーション反応効率が良く、特に、磁気ビーズを用いた場合、磁石によって磁気ビーズに結合していない非目的試料を容易にＢ／Ｆ分離することが可能となる。
【０００４】
Ｂ／Ｆ分離には流路型がよく用いられ、Ｂ／Ｆ分離から検出までの一連を流路中で行うことで工程の短縮化が行われている。図１に従来のフロー型電気化学発光測定系の概略図を示す。図１に示すように、作用電極１３下部のフローセル１２外に磁気ビーズを捕捉するための磁石１６を配置される。磁気ビーズには予め電気化学発光物質が捕捉されている。送液管１４から目的試料が結合した磁気ビーズと非目的試料が含まれる溶液を流し、磁石１６により磁気ビーズを作用電極１３上に収集した後非目的試料を排液管１５から取り除く。これにより磁気ビーズ表面の目的試料に結合した電気化学発光物質を選択的に光検出器１１により検出する方法が用いられている（例えば、特許文献３及び特許文献４参照。）。
【０００５】
このように、磁気ビーズを目的試料の担体として用いてＢ／Ｆ分離を行うことで目的試料に応じた電気化学発光物質を検出する方法が用いられている。
【特許文献１】特開平５−１９９８９８号公報
【特許文献２】特開平９−２８８０８０号公報
【特許文献３】特表平７−５０８３４０号公報
【特許文献４】特表平６−５０９４１２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、前記従来の構成では、磁気ビーズを利用して目的試料に結合した電気化学発光物質を作用電極上に収集していた。そのために、作用電極下部に磁石を配置していた。ところが、作用電極上の磁気ビーズは目的試料を遮蔽してしまうため、目的試料の発光量が低下するという問題が生じる。そこで、目的試料を捕捉した後の磁気ビーズから電気化学発光物質を分離し、電気化学発光物質のみの発光を測定すれば発光量の低下は無い。しかし、磁気ビーズから分離された電気化学発光物質を効率よく作用電極上に捕捉できないという課題を有していた。
【０００７】
本発明の目的は前記従来の課題を解決するもので、作用電極に印加する電圧を制御することで磁気ビーズから分離された電気化学発光物質を作用電極上に捕捉することのできる遺伝子検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記従来の課題を解決するために、本発明の遺伝子検出方法は、測定すべき目的核酸と前記目的核酸の一部と結合する第一のプローブを持つ磁気ビーズと前記目的核酸の他の一部と結合する第二のプローブを持つ電気化学発光物質とが互いに結合してプローブ複合体を形成する第1のステップと、前記磁気ビーズに作用する磁力を用いて前記第１のステップにて形成されたプローブ複合体を収集する第２のステップと、前記第２のステップで収集されたプローブ複合体から少なくとも前記電気化学発光物質を分離する第３のステップと、前記第３のステップで分離された電気化学発光物質を収集するために作用電極上に負電圧を与える第４のステップと、前記作用電極に正電圧を与え前記収集された電気化学発光物質を発光させその光量を測定する第５のステップと、を備えることを特徴としたものである。
【発明の効果】
【０００９】
以上のように本発明の遺伝子検出方法は、磁気ビーズ表面に結合した電気化学発光物質を磁気ビーズを捕捉した状態で磁気ビーズから分離させた後、負電圧を印加した作用電極に捕捉させることで、磁気ビーズ表面に結合した電気化学発光物質を効率よく作用電極上に収集させて発光させることが可能になるだけでなく、発光検出する際に不透明な磁気ビーズが光検出を阻害することなく高感度な測定が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下に、本発明の遺伝子検出法の実施の形態を詳細に説明する。まず、本発明の原理について説明し、次に具体的な実施の形態について説明する。
【００１１】
最初に、検体から遺伝子サンプルを抽出する前処理を行う。痰、血液、糞便、精液、唾液、培養細胞、組織細胞、その他遺伝子を有する検体から超音波、振とうなどの物理手段、核酸抽出溶液を用いる化学的手段を用いて必要試料を抽出する。
【００１２】
試料中の細胞の破壊は、常法により行うことができ、例えば、振とう、超音波等の物理的作用を外部から加えて行うことができる。また、核酸抽出溶液（例えば、ＳＤＳ、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、Ｔｗｅｅｎ−２０等の界面活性剤、又はサポニン、ＥＤＴＡ、プロテア−ゼ等を含む溶液等）を用いて、細胞から核酸を遊離させることもできる。
【００１３】
抽出された長鎖の２本鎖核酸は制限酵素、あるいは超音波などの物理的手段によって任意の長さに切断される。切断された２本鎖核酸は熱処理、あるいはアルカリ変性により１本鎖核酸に分離される。これらの工程により遺伝子サンプルを得る。遺伝子サンプルは、電気泳動による分離等で精製した核酸断片でもよい。
【００１４】
目的遺伝子を捕捉するための第一のプローブ核酸は、検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する１本鎖のプローブ核酸であり、生物試料から抽出した核酸を制限酵素で切断し、電気泳動による分離等で精製した核酸、あるいは化学合成で得られた１本鎖の核酸を用いることができる。生物試料から抽出した核酸の場合には、熱処理あるいはアルカリ処理によって、１本鎖の核酸に解離させておくことが好ましい。
【００１５】
このようにして得られた第一のプローブ核酸を磁気ビーズの表面に固定する。固定化方法としては、公知の方法が用いられる。例えば、磁気ビーズの表面に予めストレプトアビジンをコーティングしておき、ビオチンを標識した検出プローブと反応させることでアビジンービオチン結合を行う方法がある。また、マイクロアレイで用いられる公知の結合方法（例えばシランカップリング法）を用いることができる。
【００１６】
本発明で用いる磁気ビーズは特に限定されるものではなく、使用可能な磁気ビーズとしては、例えば酸化鉄系ビーズが挙げられる。磁気ビーズの直径は０．０５μｍから２００μｍ、特に０．１μｍから１００μｍが好ましい。また、流路に流す溶液中の磁気ビーズ濃度は、例えば、１〜１００００μg/mlから、特に５〜１０００μg/mlまで適応可能である。本発明に使用する磁気ビーズは少なくとも０．０１cgs単位の磁化率を有することが望ましく、磁化率が少なくとも０．０１cgs単位であるのが望ましい。磁気ビーズを収集するための磁力源は永久磁石であろうと、電磁石であろうと磁石に吸引される位置に配置される。より好適には強磁場を生じる永久磁石が好ましい。
【００１７】
上記で得られた、プローブ核酸が固定された磁気ビーズを、目的遺伝子を含む溶液に接触させることにより、プローブ核酸と相補的な配列を有する目的遺伝子がハイブリダイゼーション反応を起こし、２本鎖核酸が形成されるが、ハイブリダイズさせる方法は公知の方法を使用すれば良い。
【００１８】
目的遺伝子に相補な配列を有する第二のプローブ核酸には予め電気化学反応物質を修飾させておく。電気化学反応物質を目的遺伝子や検出用のプローブ核酸に結合させる方法は末端に標識させる方法や核酸の任意の箇所に化学的に結合させる方法がある。
【００１９】
検出するための標識剤は電気化学発光物質を用いる。電気化学発光物質は電気化学発光活性を有する物質であり、電気化学発光的に検出可能な物質であれば限定されるものではない。例えば、金属錯体を挙げることができ、特に、中心金属がルテニウム、オスニウムである錯体は良好な電気化学発光特性を有する。このような良好な電気化学発光特性を有する物質としては、例えば、ルテニウムビピリジン錯体、ルテニウムフェナントロリン錯体、オスニウムビピリジン錯体、オスニウムフェナントロリン錯体等を挙げることができる。これらは溶液中において、正に帯電する物質である。
【００２０】
このようにして得られた測定すべき目的遺伝子と、目的遺伝子の一部と結合する第一のプローブを持つ磁気ビーズと、目的遺伝子の他の一部と結合する第二のプローブを持つ電気化学発光物質とが互いに結合してプローブ複合体を形成させる。
【００２１】
磁気ビーズに捕捉されなかった非目的試料や未反応物質はＢ／Ｆ分離により洗浄される。Ｂ／Ｆ分離は磁気ビーズを用いた場合、外部磁場により磁気ビーズを溶液内に保持することで余分な溶液を除去する。このＢ／Ｆ分離によって、磁気ビーズに固定された目的遺伝子および目的遺伝子に結合した電気化学発光物質を選択的に得ることができる。外部磁場は前述の方法で与えられる。
【００２２】
Ｂ／Ｆ分離は液体を保持するマイクロウェル等の容器内で行われ、特に、洗浄工程が容易な流路中で行うことも可能である。流路はフローセルやキャピラリー管、マイクロ流路等が適応可能である。流路の大きさは磁気ビーズの流れを阻害しないように決められ、磁気ビーズの直径に対し２〜１００００倍であることが好ましい。送液時の流速は磁気ビーズが少なくとも沈降するように決められることが好ましく、０．１〜１００mm/分の流速が好ましい。
【００２３】
測定対象となる目的遺伝子と電気化学発光物質が磁気ビーズに結合させる工程によって得られるプローブ複合体を流路内に導入し、Ｂ／Ｆ分離や検出を同一流路内で行う。さらに好適には、プローブ複合体の形成から検出までの一連を同一流路内で行うことで簡便かつ迅速に測定を行うことが可能である。また、流路内のこれら一連の工程を流路内の上流から下流に向けて順次行うことで、流速方向にそってＢ／Ｆ分離から検出までを行うことができ、より迅速に測定を行うことが可能となる。
【００２４】
次にＢ／Ｆ分離によって得られた磁気ビーズを流路内の磁場により流路中に固定した状態で電気化学発光物質を分離させる。分離には紫外線照射によってプローブ核酸自体を切断する方法が挙げられる。紫外線によるプローブ核酸の切断は、波長２１０ｎｍ以上２９０ｎｍ以下の光をプローブ核酸に照射することで行われるが、より好適には２４０ｎｍ以上２６０ｎｍ以下が選ばれる。紫外線照射の条件は、用いるプローブ核酸の種類等に応じて選択できる。通常、紫外線が用いられ、その照射量は適宜設定できるが、例えば、マイクロプレートのウェル内の溶液に対して行なう場合、通常、１００Ｗの市販の高圧水銀ランプを１分間から１０分間程度の短時間照射すればよい。
【００２５】
磁気ビーズから分離され、溶液内に溶出した電気化学発光物質は、流路内に配置された作用電極上で測定される。電極は作用電極と対極の２極系、又は作用電極、対極、及び参照電極の３電極系のいずれかが用いられる。分離した電気化学発光物質を負電圧に印加した作用電極上に静電的に収集させる。このときの負電圧は、磁石により流路内に収集された磁気ビーズに紫外線を照射するタイミングと同時に印加させておくか、さらに好適には紫外線照射前に印加しておく。これにより、紫外線によって分離された電気化学発光物質を効率よく作用電極上に収集させることが可能となる。
【００２６】
作用電極に与える負電圧の絶対値は、前記電気化学発光物質を還元する還元剤の酸化電位の絶対値よりも小さいことが望ましい。このことで対極において還元剤が酸化されず、電解液状態が変化することなく作用電極で収集可能である。酸化電位の測定はサイクリックボルタンメトリ法等周知の方法が用いられる。負電圧によって電気化学発光物質を収集した後、作用電極に正電圧を印加することで電気化学発光物質を発光させる。電気化学発光物質の量に応じた発光信号は光電子増倍管等の光検出器を用いて計測が可能である。
【００２７】
以下、本発明の具体的な実施例とその作用効果を詳細に説明する。
【００２８】
＜実施例＞
本発明における遺伝子検出方法の具体的な実施例を図面を用いて説明する。本発明の工程は、工程（１）〜（５）からなる。それぞれの工程は、（１）磁気ビーズへのプローブ核酸の固定、（２）電気化学反応物質が標識された検出用プローブ核酸の作製、（３）ハイブリダイゼーション反応、（４）紫外線照射による電気化学発光物質の磁気ビーズからの分離、（５）負電圧印加による電気化学発光物質の捕捉からなる。このようにして作製した本発明の実施例と従来法により作製した比較例とを用意し、両者の電気化学発光量の測定を行った。
【００２９】
各工程の詳細については以下に示す。
【００３０】
（１）磁気ビーズへのプローブ核酸の固定
目的遺伝子を捕捉する相補プローブ核酸の担体として、磁気ビーズ（ＢａｎｇｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製；ＣＭ０１Ｎ／５８９６、平均粒径０．３５μｍ）を用いた。この磁気ビーズはビーズ表面にストレプトアビジンがコーティングされている。相補プローブ核酸には、ＡＡＴＴＴＧＴＴＡＴ ＧＧＧＴＴＣＣＣＧＧ ＧＡＡＡＴＡＡＴＣＡの配列を有する５’末端にビオチン基を修飾した３０塩基のオリゴデオキシヌクレオチド（配列表１）を使用した。該相補プローブ核酸を１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４のリン酸ナトリウム緩衝液）に溶解させ、１０μＭに調製した。
【００３１】
まず、磁気ビーズを１ｍｇ採取し、ＴＴＬバッファー（終濃度：１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、１ＭＬｉＣｌ）で洗浄後、２０μＬのＴＴＬバッファーに置換した。その後、１００ｎＭの相補プローブ核酸を５μＬ添加し、室温で１５分穏やかに振とうした。
【００３２】
溶液を除去し、残留した磁気ビーズを０．１５ＭのＮａＯＨで洗浄後、ＴＴバッファー（２５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄した。
【００３３】
洗浄後、ＴＴＥバッファー（２５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、２０ｍＭＮａ２ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））に溶液を置換し、８０℃で１０分間インキュベートすることにより、不安定なアビジンービオチン結合を除去した。これにより、磁気ビーズ表面に相補プローブ核酸が固定された磁気ビーズAを得た。
【００３４】
さらに、本実施例においては、比較対象として、２本鎖核酸が形成されない磁気ビーズBを作製する。この２本鎖核酸が形成されない磁気ビーズBは、磁気ビーズ表面に非相補プローブ核酸を固定させたものである。磁気ビーズBの作製方法は上述の相補プローブ核酸の磁気ビーズへの固定化条件と同じ処理を行う。なお、前記非相補プローブ核酸には、３０塩基のＰｏｌｙ−Ａ（ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ）の配列を有する５’末端にビオチンを修飾したオリゴデオキシヌクレオチド（配列表２）を使用した。
【００３５】
（２）電気化学反応物質が標識された検出用プローブ核酸の作製
検出用プローブ核酸には、ＴＧＣＴＴＡＣＡＡＴ ＣＣＴＧＡＴＧＴＴＴ ＴＣＡＴＴＣＡＡＴＴの配列を有する、５’末端にアミノ基を修飾した３０塩基のオリゴデオキシヌクレオチド（配列表３）を使用した。
【００３６】
前記検出用プローブ核酸に用いる電気化学発光物質は、以下のようにして得る。
【００３７】
まず、テトラヒドロフラン（以下ＴＨＦ）６０．０ｍＬに溶解させた４，４’−ジメチル−２，２’ビピリジン２．５０ｇ（１３．５ｍｍｏｌ）溶液を窒素雰囲気の容器に注入した後、リチウムジイソプロピルアミド２Ｍ溶液１６．９ｍＬ（２７．０ｍｍｏｌ）を滴下し、冷却しながら３０分撹拌させた。一方、同様に窒素気流中で乾燥させた容器に、１，３−ジブロモプロパン４．２ｍＬ（４１．１ｍｍｏｌ）とＴＨＦ１０ｍＬとを加え、冷却しながら撹拌させた。この容器に、先程の反応液を３０分かけて滴下させ、２．５時間反応させた。反応溶液は２Ｎの塩酸で中和し、ＴＨＦを留去した後、クロロホルムで抽出した。溶媒を留去して得た粗生成物をシリカゲルカラムで精製し、生成物Ａを得た。
【００３８】
窒素雰囲気の容器に、前記生成物Ａ１．０ｇ（３．２８ｍｍｏｌ）、フタルイミドカリウム０．６７ｇ（３．６１ｍｍｏｌ）、及びジメチルホルムアミド（脱水）３０．０ｍＬを加え、オイルバスで１８時間還流した。反応後、クロロホルムで抽出し、０．２Ｎ水酸化ナトリウム５０ｍＬで蒸留水洗浄した。溶媒を留去して酢酸エチルとヘキサンから再結晶を行い、生成物Ｂを得た。
【００３９】
塩化ルテニウム（ＩＩＩ）（２．９８ｇ、０．０１ｍｏｌ）、及び２，２’−ビピリジン（３．４４ｇ、０．０２２ｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（８０．０ｍＬ）中で６時間還流した後、溶媒を留去した。その後、アセトンを加え、一晩冷却することで得られた黒色沈殿物を採取し、エタノール水溶液１７０ｍＬ（エタノール：水＝１：１）を加え１時間加熱還流を行った。ろ過後、塩化リチウムを２０ｇ加え、エタノールを留去し、さらに一晩冷却した。析出した黒色物質は吸引ろ過で採取し、生成物Ｃを得た。
【００４０】
窒素置換した容器に、前記生成物Ｂ０．５０ｇ（１．３５ｍｍｏｌ）、前記生成物Ｃ０．７８ｇ（１．６１ｍｍｏｌ）、及びエタノール５０ｍＬを加えた。９時間窒素雰囲気で還流した後、溶媒を留去し、蒸留水で溶解させ、１．０Ｍの過塩素酸水溶液で沈殿させた。この沈殿物を採取し、メタノールで再結晶を行い、生成物Ｄを得た。
【００４１】
さらに、前記生成物Ｄ１．０ｇ（１．０２ｍｍｏｌ）、及びメタノール７０．０ｍＬを１時間還流した。室温まで冷却した後、ヒドラジン一水和物０．２１ｍＬ（４．２１ｍｍｏｌ）を加え再び１３時間還流した。反応後、蒸留水を１５ｍＬ加え、メタノールを留去した。
【００４２】
次に、濃塩酸を５．０ｍＬ加え、２時間還流して得られた反応液を８時間４度で冷蔵し、不純物を自然ろ過で除去した。
【００４３】
これを炭酸水素ナトリウムで中和した後、水を留去し、無機物をアセトニトリルで除去した。溶媒を留去して得た粗生成物をシリカゲルカラムで精製し、生成物Ｅを得た。
【００４４】
アルミホイルで遮光した容器に、前記生成物Ｅ０．６５ｇ（０．７６ｍｍｏｌ）を加え、アセトニトリル１０ｍＬに溶解させた。次に、トリエチルアミン０．２３ｇ（２．２９ｍｍｏｌ）を加えた後、アセトニトリル２０ｍＬに溶解したグルタル酸無水物０．８７ｇ（７．６２ｍｍｏｌ）を滴下した。
【００４５】
９時間反応後、エバポレーターでアセトニトリルを留去して得た粗生成物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製し、下記式（化１）に示す電気化学発光物質を得た。
【００４６】
【化１】
【００４７】
表１は、前述のようにして得た（化１）に示す物質の1Ｈ‐ＮＭＲ結果である。
【００４８】
【表１】
【００４９】
このようにして得た（化１）の電気化学発光物質と配列表３のオリゴデオキシヌクレオチドを以下のようにして結合させる。まず、該オリゴデオキシヌクレオチド２８３μｇ（２９．７ｐｍｏｌ）を蒸留水０．２ｍＬに溶解させ、該オリゴデオキシヌクレオチドの溶液に、１ｍＭに調製した（化１）溶液８９μＬ（８９．０ｐｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド０．３ｍｇ（２．６μｍｏｌ）、ＷＳＣ５．１ｍｇ（２６．７μｍｏｌ）、０．１Ｍトリエチルアミン０．９μＬ（９０．０ｐｍｏｌ）を添加し、２日間室温で反応させた。ＨＰＬＣで精製後、目的物のフラクションを採取し、溶液を留去して末端に電気化学発光物質が標識された検出用プローブ核酸を得た。
【００５０】
（３）ハイブリダイゼーション反応
本発明で用いる目的核酸には、ヒト由来ＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅＰ−４５０の遺伝子配列の５’−末端より５９９−６９８番目に位置するＡＡＴＴＧＡＡＴＧＡ ＡＡＡＣＡＴＣＡＧＧ ＡＴＴＧＴＡＡＧＣＡ ＣＣＣＣＣＴＧＧＡＴ ＣＣＡＧＡＴＡＴＧＣ ＡＡＴＡＡＴＴＴＴＣ ＣＣＡＣＴＡＴＣＡＴ ＴＧＡＴＴＡＴＴＴＣ ＣＣＧＧＧＡＡＣＣＣ ＡＴＡＡＣＡＡＡＴＴの配列を有する１００塩基のオリゴデオキシヌクレオチド（配列表４）を使用した。
【００５１】
（１）の工程で得られた磁気ビーズに、２倍のＳＳＣを１４μＬ加え、そこに５μＭに調製した目的核酸及び（２）の工程で作製した検出用プローブ核酸をそれぞれ４μＬ添加し、７０℃で穏やかに振とうさせた。１時間振とうさせた後、溶液を除去し、４０℃に加温した２倍のＳＳＣで洗浄した。洗浄溶液を除去し、さらにＴＴバッファーで洗浄することで、磁気ビーズＡ'を得た。なお、非相補プローブ核酸を固定した磁気ビーズＢについても、上記と同様の処理を行うことで、磁気ビーズＢ'を得た。
【００５２】
（４）紫外線照射による電気化学発光物質の磁気ビーズからの分離
図２を用いて本測定装置を説明する。流路２３は、樹脂製の流路蓋部２１とガラスを基材とする電極チップ２２とで構成された隙間に壁となるシリコン樹脂２４を挟むことで密封空間が構成される。電極チップ２２上には作用電極２５、対極及び参照極２６、さらに電極ピン２７が接触する電極パット２８、及びそれぞれの電極と電極パットをつなぐ配線が金属薄膜によって電極チップ上にパターニングされており、作用電極、対極、及び参照極に対応した電極パットに電極ピンが接触され、電圧印加及び信号の取得が可能な構成となっている。金属薄膜はガラス基板上にスパッタ装置（アルバック製ＳＨ−３５０）によりチタン１０ｎｍを下地に金２００ｎｍを形成されたものであり、さらにこの金属薄膜はフォトリソグラフィ工程により各電極、配線、電極パットのパターンを電極チップ上に形成されている。
【００５３】
流路蓋部２１には磁気ビーズや電解液を送液する送液管２９、測定後の液を排液する排液管３０が配置されている。さらに、流路蓋部２１と電極チップ２２とで流路２３を構成した際に作用電極２５上に光を透過する窓３４を介して光検出器３１が構成されるように配置されている。また、流路２３の流路外下部には磁気ビーズを収集するための磁石３２が配置されている。さらに、磁石３２の流路外上部に光を透過する窓３４を介して紫外線照射装置３３が配置されている。作用電極２５対極及び参照極２６にはポテンショスタット３５から電極ピン２７を介して電圧が印加される。電圧印加及び光検出器からの信号処理は制御用PC３６によって制御・処理される。
【００５４】
図２で示す装置構成において、磁気ビーズＡ'を送液管２９に導入した後、電解液（終濃度：０．１ＭＰＢＳ、０．１Ｍトリエチルアミン）で送液を行った。電解液の送液は５０ｍｍ/分で行う。流路は長さ（送液方向）３００ｍｍ、幅５ｍｍ、高さ１ｍｍに設定した。
【００５５】
永久磁石を流路外に配置させた磁気ビーズ収集部を滴下部の下流に設けており、この収集部によって流路内を流れる磁気ビーズを捕捉させた。この時捕捉されない非目的試料は排液管から排水させた。捕捉させた磁気ビーズを、窓に密着させた短波長紫外光源（ＵＶＰ製ＣＬ１０００型）を用いて中心波長２６５ｎｍ、５ｍＷ／ｃｍ2の紫外線を２０分間照射しプローブ核酸を切断することでルテニウム錯体を磁気ビーズから分離させた。磁気ビーズＢ’に対しても同様の処理を行った。
【００５６】
（５）負電圧印加による電気化学発光物質の捕捉
（４）の紫外線照射時に磁気ビーズ収集部の流路内の下流に配置した作用電極を参照電極に対して−０．４Vの電位に保持しておく。これにより上流から流れてきたルテニウム錯体を作用電極上に捕捉した。磁気ビーズＢ’に対しても同様の処理を行った。
【００５７】
＜比較例＞
上記実施例と対比させるため、（４）の紫外線照射を行った後、作用電極に負電圧を印加しない状態としたものを比較例とした。
【００５８】
＜実施例と比較例との電気化学発光測定結果＞
作用電極上に電圧を印加し、この時に生じた電気化学発光の測定を行った。なお、電圧の印加は、-０．４Ｖから１．３Ｖまで１秒間で掃印し、電気化学発光測定を行った。電気化学発光量の測定は、窓に密着させた光電子増倍管（浜松ホトニクス製Ｈ７３６０−０１）を用いて行い、電圧掃印中におけるルテニウム錯体の最大発光量を測定した。
【００５９】
実施例及び比較例での測定結果を図３に示す。図３に示すように、実施例において得られた磁気ビーズＡ’からの発光量は負電圧を印加しない比較例の発光量に対して著しく高い値を示すので、本実施例における負電圧の印加はルテニウム錯体を捕捉していると考えられる。従って、効率よく磁気ビーズ錯体に捕捉されたルテニウム錯体を作用極上に収集し発光させることができる。また、磁気ビーズＡ’と磁気ビーズＢ’の発光量の差異は、本実施例の方が比較例よりもはるかに大きい。これは、本発明は、配列特異性を持つことを示している。以上の結果から、本発明を用いることで高感度に目的遺伝子の検出が可能であることは明らかである。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明に係る遺伝子検出方法は、磁気ビーズを必要とせず、作用電極に目的試料を収集できるので、微量な遺伝子サンプルの検出が可能となる。従って、高感度な測定が必要となる一塩基変異多型の検出、細菌検査及びウイルス検査方法に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】従来のフロー型電気化学測定系の構成を示す概略図
【図２】本発明のフロー型電気化学測定装置の構成を示す概略図
【図３】実施例と比較例との電気化学発光量を示すグラフ
【符号の説明】
【００６２】
１１、３１ 光検出器
１２ フローセル
１３、２５ 作用電極
１４、２９ 送液管
１５、３０ 排液管
１６、３２ 磁石
２３ 流路
２１ 流路蓋部
２２ 電極チップ
２４ シリコン樹脂
２６ 対極
２７ 電極ピン
２８ 電極パット
３３ 紫外線照射装置
３４ 窓
３５ ポテンショスタット
３６ 制御用ＰＣ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に存在する特定遺伝子を検出するための遺伝子検出方法に関し、作用極に負電圧を印加し電気化学発光物質を作用極上に捕捉することで高感度に目的遺伝子を検出する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、目的遺伝子を検出する手法として、電気化学反応を用いた検出方法が採用されてきた。この方法は以下の通りである。目的遺伝子と相補な配列を有する核酸を担体に固定し、ハイブリダイゼーション反応を起こさせることで選択的に目的遺伝子を検出プローブに捕捉させる。Ｂ／Ｆ（Ｂｏｕｎｄ／Ｆｒｅｅ）分離により非目的遺伝子や余分な物質等の非目的試料を除去した後、電気化学反応性を有する２本鎖核酸挿入剤を用いて２本鎖核酸のみに選択的に挿入させる。これにより、遺伝子配列の相補性を利用して目的遺伝子を検出することができる（例えば、特許文献１及び特許文献２参照。）。
【０００３】
この電気化学反応を用いた遺伝子検出方法は、蛍光検出を行う際には必要になる励起光が不要なことからバックグラウンド光が低減でき、目的遺伝子の高感度な検出が可能となる。近年、検出プローブを固定する担体は、平面基板であるマイクロアレイ型からマイクロビーズ型に変わってきている。これは、マイクロビーズはマイクロアレイよりもハイブリダイゼーション反応効率が良く、特に、磁気ビーズを用いた場合、磁石によって磁気ビーズに結合していない非目的試料を容易にＢ／Ｆ分離することが可能となる。
【０００４】
Ｂ／Ｆ分離には流路型がよく用いられ、Ｂ／Ｆ分離から検出までの一連を流路中で行うことで工程の短縮化が行われている。図１に従来のフロー型電気化学発光測定系の概略図を示す。図１に示すように、作用電極１３下部のフローセル１２外に磁気ビーズを捕捉するための磁石１６を配置される。磁気ビーズには予め電気化学発光物質が捕捉されている。送液管１４から目的試料が結合した磁気ビーズと非目的試料が含まれる溶液を流し、磁石１６により磁気ビーズを作用電極１３上に収集した後非目的試料を排液管１５から取り除く。これにより磁気ビーズ表面の目的試料に結合した電気化学発光物質を選択的に光検出器１１により検出する方法が用いられている（例えば、特許文献３及び特許文献４参照。）。
【０００５】
このように、磁気ビーズを目的試料の担体として用いてＢ／Ｆ分離を行うことで目的試料に応じた電気化学発光物質を検出する方法が用いられている。
【特許文献１】特開平５−１９９８９８号公報
【特許文献２】特開平９−２８８０８０号公報
【特許文献３】特表平７−５０８３４０号公報
【特許文献４】特表平６−５０９４１２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、前記従来の構成では、磁気ビーズを利用して目的試料に結合した電気化学発光物質を作用電極上に収集していた。そのために、作用電極下部に磁石を配置していた。ところが、作用電極上の磁気ビーズは目的試料を遮蔽してしまうため、目的試料の発光量が低下するという問題が生じる。そこで、目的試料を捕捉した後の磁気ビーズから電気化学発光物質を分離し、電気化学発光物質のみの発光を測定すれば発光量の低下は無い。しかし、磁気ビーズから分離された電気化学発光物質を効率よく作用電極上に捕捉できないという課題を有していた。
【０００７】
本発明の目的は前記従来の課題を解決するもので、作用電極に印加する電圧を制御することで磁気ビーズから分離された電気化学発光物質を作用電極上に捕捉することのできる遺伝子検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記従来の課題を解決するために、本発明の遺伝子検出方法は、測定すべき目的核酸と前記目的核酸の一部と結合する第一のプローブを持つ磁気ビーズと前記目的核酸の他の一部と結合する第二のプローブを持つ電気化学発光物質とが互いに結合してプローブ複合体を形成する第1のステップと、前記磁気ビーズに作用する磁力を用いて前記第１のステップにて形成されたプローブ複合体を収集する第２のステップと、前記第２のステップで収集されたプローブ複合体から少なくとも前記電気化学発光物質を分離する第３のステップと、前記第３のステップで分離された電気化学発光物質を収集するために作用電極上に負電圧を与える第４のステップと、前記作用電極に正電圧を与え前記収集された電気化学発光物質を発光させその光量を測定する第５のステップと、を備えることを特徴としたものである。
【発明の効果】
【０００９】
以上のように本発明の遺伝子検出方法は、磁気ビーズ表面に結合した電気化学発光物質を磁気ビーズを捕捉した状態で磁気ビーズから分離させた後、負電圧を印加した作用電極に捕捉させることで、磁気ビーズ表面に結合した電気化学発光物質を効率よく作用電極上に収集させて発光させることが可能になるだけでなく、発光検出する際に不透明な磁気ビーズが光検出を阻害することなく高感度な測定が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下に、本発明の遺伝子検出法の実施の形態を詳細に説明する。まず、本発明の原理について説明し、次に具体的な実施の形態について説明する。
【００１１】
最初に、検体から遺伝子サンプルを抽出する前処理を行う。痰、血液、糞便、精液、唾液、培養細胞、組織細胞、その他遺伝子を有する検体から超音波、振とうなどの物理手段、核酸抽出溶液を用いる化学的手段を用いて必要試料を抽出する。
【００１２】
試料中の細胞の破壊は、常法により行うことができ、例えば、振とう、超音波等の物理的作用を外部から加えて行うことができる。また、核酸抽出溶液（例えば、ＳＤＳ、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、Ｔｗｅｅｎ−２０等の界面活性剤、又はサポニン、ＥＤＴＡ、プロテア−ゼ等を含む溶液等）を用いて、細胞から核酸を遊離させることもできる。
【００１３】
抽出された長鎖の２本鎖核酸は制限酵素、あるいは超音波などの物理的手段によって任意の長さに切断される。切断された２本鎖核酸は熱処理、あるいはアルカリ変性により１本鎖核酸に分離される。これらの工程により遺伝子サンプルを得る。遺伝子サンプルは、電気泳動による分離等で精製した核酸断片でもよい。
【００１４】
目的遺伝子を捕捉するための第一のプローブ核酸は、検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する１本鎖のプローブ核酸であり、生物試料から抽出した核酸を制限酵素で切断し、電気泳動による分離等で精製した核酸、あるいは化学合成で得られた１本鎖の核酸を用いることができる。生物試料から抽出した核酸の場合には、熱処理あるいはアルカリ処理によって、１本鎖の核酸に解離させておくことが好ましい。
【００１５】
このようにして得られた第一のプローブ核酸を磁気ビーズの表面に固定する。固定化方法としては、公知の方法が用いられる。例えば、磁気ビーズの表面に予めストレプトアビジンをコーティングしておき、ビオチンを標識した検出プローブと反応させることでアビジンービオチン結合を行う方法がある。また、マイクロアレイで用いられる公知の結合方法（例えばシランカップリング法）を用いることができる。
【００１６】
本発明で用いる磁気ビーズは特に限定されるものではなく、使用可能な磁気ビーズとしては、例えば酸化鉄系ビーズが挙げられる。磁気ビーズの直径は０．０５μｍから２００μｍ、特に０．１μｍから１００μｍが好ましい。また、流路に流す溶液中の磁気ビーズ濃度は、例えば、１〜１００００μg/mlから、特に５〜１０００μg/mlまで適応可能である。本発明に使用する磁気ビーズは少なくとも０．０１cgs単位の磁化率を有することが望ましく、磁化率が少なくとも０．０１cgs単位であるのが望ましい。磁気ビーズを収集するための磁力源は永久磁石であろうと、電磁石であろうと磁石に吸引される位置に配置される。より好適には強磁場を生じる永久磁石が好ましい。
【００１７】
上記で得られた、プローブ核酸が固定された磁気ビーズを、目的遺伝子を含む溶液に接触させることにより、プローブ核酸と相補的な配列を有する目的遺伝子がハイブリダイゼーション反応を起こし、２本鎖核酸が形成されるが、ハイブリダイズさせる方法は公知の方法を使用すれば良い。
【００１８】
目的遺伝子に相補な配列を有する第二のプローブ核酸には予め電気化学反応物質を修飾させておく。電気化学反応物質を目的遺伝子や検出用のプローブ核酸に結合させる方法は末端に標識させる方法や核酸の任意の箇所に化学的に結合させる方法がある。
【００１９】
検出するための標識剤は電気化学発光物質を用いる。電気化学発光物質は電気化学発光活性を有する物質であり、電気化学発光的に検出可能な物質であれば限定されるものではない。例えば、金属錯体を挙げることができ、特に、中心金属がルテニウム、オスニウムである錯体は良好な電気化学発光特性を有する。このような良好な電気化学発光特性を有する物質としては、例えば、ルテニウムビピリジン錯体、ルテニウムフェナントロリン錯体、オスニウムビピリジン錯体、オスニウムフェナントロリン錯体等を挙げることができる。これらは溶液中において、正に帯電する物質である。
【００２０】
このようにして得られた測定すべき目的遺伝子と、目的遺伝子の一部と結合する第一のプローブを持つ磁気ビーズと、目的遺伝子の他の一部と結合する第二のプローブを持つ電気化学発光物質とが互いに結合してプローブ複合体を形成させる。
【００２１】
磁気ビーズに捕捉されなかった非目的試料や未反応物質はＢ／Ｆ分離により洗浄される。Ｂ／Ｆ分離は磁気ビーズを用いた場合、外部磁場により磁気ビーズを溶液内に保持することで余分な溶液を除去する。このＢ／Ｆ分離によって、磁気ビーズに固定された目的遺伝子および目的遺伝子に結合した電気化学発光物質を選択的に得ることができる。外部磁場は前述の方法で与えられる。
【００２２】
Ｂ／Ｆ分離は液体を保持するマイクロウェル等の容器内で行われ、特に、洗浄工程が容易な流路中で行うことも可能である。流路はフローセルやキャピラリー管、マイクロ流路等が適応可能である。流路の大きさは磁気ビーズの流れを阻害しないように決められ、磁気ビーズの直径に対し２〜１００００倍であることが好ましい。送液時の流速は磁気ビーズが少なくとも沈降するように決められることが好ましく、０．１〜１００mm/分の流速が好ましい。
【００２３】
測定対象となる目的遺伝子と電気化学発光物質が磁気ビーズに結合させる工程によって得られるプローブ複合体を流路内に導入し、Ｂ／Ｆ分離や検出を同一流路内で行う。さらに好適には、プローブ複合体の形成から検出までの一連を同一流路内で行うことで簡便かつ迅速に測定を行うことが可能である。また、流路内のこれら一連の工程を流路内の上流から下流に向けて順次行うことで、流速方向にそってＢ／Ｆ分離から検出までを行うことができ、より迅速に測定を行うことが可能となる。
【００２４】
次にＢ／Ｆ分離によって得られた磁気ビーズを流路内の磁場により流路中に固定した状態で電気化学発光物質を分離させる。分離には紫外線照射によってプローブ核酸自体を切断する方法が挙げられる。紫外線によるプローブ核酸の切断は、波長２１０ｎｍ以上２９０ｎｍ以下の光をプローブ核酸に照射することで行われるが、より好適には２４０ｎｍ以上２６０ｎｍ以下が選ばれる。紫外線照射の条件は、用いるプローブ核酸の種類等に応じて選択できる。通常、紫外線が用いられ、その照射量は適宜設定できるが、例えば、マイクロプレートのウェル内の溶液に対して行なう場合、通常、１００Ｗの市販の高圧水銀ランプを１分間から１０分間程度の短時間照射すればよい。
【００２５】
磁気ビーズから分離され、溶液内に溶出した電気化学発光物質は、流路内に配置された作用電極上で測定される。電極は作用電極と対極の２極系、又は作用電極、対極、及び参照電極の３電極系のいずれかが用いられる。分離した電気化学発光物質を負電圧に印加した作用電極上に静電的に収集させる。このときの負電圧は、磁石により流路内に収集された磁気ビーズに紫外線を照射するタイミングと同時に印加させておくか、さらに好適には紫外線照射前に印加しておく。これにより、紫外線によって分離された電気化学発光物質を効率よく作用電極上に収集させることが可能となる。
【００２６】
作用電極に与える負電圧の絶対値は、前記電気化学発光物質を還元する還元剤の酸化電位の絶対値よりも小さいことが望ましい。このことで対極において還元剤が酸化されず、電解液状態が変化することなく作用電極で収集可能である。酸化電位の測定はサイクリックボルタンメトリ法等周知の方法が用いられる。負電圧によって電気化学発光物質を収集した後、作用電極に正電圧を印加することで電気化学発光物質を発光させる。電気化学発光物質の量に応じた発光信号は光電子増倍管等の光検出器を用いて計測が可能である。
【００２７】
以下、本発明の具体的な実施例とその作用効果を詳細に説明する。
【００２８】
＜実施例＞
本発明における遺伝子検出方法の具体的な実施例を図面を用いて説明する。本発明の工程は、工程（１）〜（５）からなる。それぞれの工程は、（１）磁気ビーズへのプローブ核酸の固定、（２）電気化学反応物質が標識された検出用プローブ核酸の作製、（３）ハイブリダイゼーション反応、（４）紫外線照射による電気化学発光物質の磁気ビーズからの分離、（５）負電圧印加による電気化学発光物質の捕捉からなる。このようにして作製した本発明の実施例と従来法により作製した比較例とを用意し、両者の電気化学発光量の測定を行った。
【００２９】
各工程の詳細については以下に示す。
【００３０】
（１）磁気ビーズへのプローブ核酸の固定
目的遺伝子を捕捉する相補プローブ核酸の担体として、磁気ビーズ（ＢａｎｇｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製；ＣＭ０１Ｎ／５８９６、平均粒径０．３５μｍ）を用いた。この磁気ビーズはビーズ表面にストレプトアビジンがコーティングされている。相補プローブ核酸には、ＡＡＴＴＴＧＴＴＡＴ ＧＧＧＴＴＣＣＣＧＧ ＧＡＡＡＴＡＡＴＣＡの配列を有する５’末端にビオチン基を修飾した３０塩基のオリゴデオキシヌクレオチド（配列表１）を使用した。該相補プローブ核酸を１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４のリン酸ナトリウム緩衝液）に溶解させ、１０μＭに調製した。
【００３１】
まず、磁気ビーズを１ｍｇ採取し、ＴＴＬバッファー（終濃度：１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、１ＭＬｉＣｌ）で洗浄後、２０μＬのＴＴＬバッファーに置換した。その後、１００ｎＭの相補プローブ核酸を５μＬ添加し、室温で１５分穏やかに振とうした。
【００３２】
溶液を除去し、残留した磁気ビーズを０．１５ＭのＮａＯＨで洗浄後、ＴＴバッファー（２５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄した。
【００３３】
洗浄後、ＴＴＥバッファー（２５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、２０ｍＭＮａ２ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））に溶液を置換し、８０℃で１０分間インキュベートすることにより、不安定なアビジンービオチン結合を除去した。これにより、磁気ビーズ表面に相補プローブ核酸が固定された磁気ビーズAを得た。
【００３４】
さらに、本実施例においては、比較対象として、２本鎖核酸が形成されない磁気ビーズBを作製する。この２本鎖核酸が形成されない磁気ビーズBは、磁気ビーズ表面に非相補プローブ核酸を固定させたものである。磁気ビーズBの作製方法は上述の相補プローブ核酸の磁気ビーズへの固定化条件と同じ処理を行う。なお、前記非相補プローブ核酸には、３０塩基のＰｏｌｙ−Ａ（ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ）の配列を有する５’末端にビオチンを修飾したオリゴデオキシヌクレオチド（配列表２）を使用した。
【００３５】
（２）電気化学反応物質が標識された検出用プローブ核酸の作製
検出用プローブ核酸には、ＴＧＣＴＴＡＣＡＡＴ ＣＣＴＧＡＴＧＴＴＴ ＴＣＡＴＴＣＡＡＴＴの配列を有する、５’末端にアミノ基を修飾した３０塩基のオリゴデオキシヌクレオチド（配列表３）を使用した。
【００３６】
前記検出用プローブ核酸に用いる電気化学発光物質は、以下のようにして得る。
【００３７】
まず、テトラヒドロフラン（以下ＴＨＦ）６０．０ｍＬに溶解させた４，４’−ジメチル−２，２’ビピリジン２．５０ｇ（１３．５ｍｍｏｌ）溶液を窒素雰囲気の容器に注入した後、リチウムジイソプロピルアミド２Ｍ溶液１６．９ｍＬ（２７．０ｍｍｏｌ）を滴下し、冷却しながら３０分撹拌させた。一方、同様に窒素気流中で乾燥させた容器に、１，３−ジブロモプロパン４．２ｍＬ（４１．１ｍｍｏｌ）とＴＨＦ１０ｍＬとを加え、冷却しながら撹拌させた。この容器に、先程の反応液を３０分かけて滴下させ、２．５時間反応させた。反応溶液は２Ｎの塩酸で中和し、ＴＨＦを留去した後、クロロホルムで抽出した。溶媒を留去して得た粗生成物をシリカゲルカラムで精製し、生成物Ａを得た。
【００３８】
窒素雰囲気の容器に、前記生成物Ａ１．０ｇ（３．２８ｍｍｏｌ）、フタルイミドカリウム０．６７ｇ（３．６１ｍｍｏｌ）、及びジメチルホルムアミド（脱水）３０．０ｍＬを加え、オイルバスで１８時間還流した。反応後、クロロホルムで抽出し、０．２Ｎ水酸化ナトリウム５０ｍＬで蒸留水洗浄した。溶媒を留去して酢酸エチルとヘキサンから再結晶を行い、生成物Ｂを得た。
【００３９】
塩化ルテニウム（ＩＩＩ）（２．９８ｇ、０．０１ｍｏｌ）、及び２，２’−ビピリジン（３．４４ｇ、０．０２２ｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（８０．０ｍＬ）中で６時間還流した後、溶媒を留去した。その後、アセトンを加え、一晩冷却することで得られた黒色沈殿物を採取し、エタノール水溶液１７０ｍＬ（エタノール：水＝１：１）を加え１時間加熱還流を行った。ろ過後、塩化リチウムを２０ｇ加え、エタノールを留去し、さらに一晩冷却した。析出した黒色物質は吸引ろ過で採取し、生成物Ｃを得た。
【００４０】
窒素置換した容器に、前記生成物Ｂ０．５０ｇ（１．３５ｍｍｏｌ）、前記生成物Ｃ０．７８ｇ（１．６１ｍｍｏｌ）、及びエタノール５０ｍＬを加えた。９時間窒素雰囲気で還流した後、溶媒を留去し、蒸留水で溶解させ、１．０Ｍの過塩素酸水溶液で沈殿させた。この沈殿物を採取し、メタノールで再結晶を行い、生成物Ｄを得た。
【００４１】
さらに、前記生成物Ｄ１．０ｇ（１．０２ｍｍｏｌ）、及びメタノール７０．０ｍＬを１時間還流した。室温まで冷却した後、ヒドラジン一水和物０．２１ｍＬ（４．２１ｍｍｏｌ）を加え再び１３時間還流した。反応後、蒸留水を１５ｍＬ加え、メタノールを留去した。
【００４２】
次に、濃塩酸を５．０ｍＬ加え、２時間還流して得られた反応液を８時間４度で冷蔵し、不純物を自然ろ過で除去した。
【００４３】
これを炭酸水素ナトリウムで中和した後、水を留去し、無機物をアセトニトリルで除去した。溶媒を留去して得た粗生成物をシリカゲルカラムで精製し、生成物Ｅを得た。
【００４４】
アルミホイルで遮光した容器に、前記生成物Ｅ０．６５ｇ（０．７６ｍｍｏｌ）を加え、アセトニトリル１０ｍＬに溶解させた。次に、トリエチルアミン０．２３ｇ（２．２９ｍｍｏｌ）を加えた後、アセトニトリル２０ｍＬに溶解したグルタル酸無水物０．８７ｇ（７．６２ｍｍｏｌ）を滴下した。
【００４５】
９時間反応後、エバポレーターでアセトニトリルを留去して得た粗生成物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製し、下記式（化１）に示す電気化学発光物質を得た。
【００４６】
【化１】
【００４７】
表１は、前述のようにして得た（化１）に示す物質の1Ｈ‐ＮＭＲ結果である。
【００４８】
【表１】
【００４９】
このようにして得た（化１）の電気化学発光物質と配列表３のオリゴデオキシヌクレオチドを以下のようにして結合させる。まず、該オリゴデオキシヌクレオチド２８３μｇ（２９．７ｐｍｏｌ）を蒸留水０．２ｍＬに溶解させ、該オリゴデオキシヌクレオチドの溶液に、１ｍＭに調製した（化１）溶液８９μＬ（８９．０ｐｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド０．３ｍｇ（２．６μｍｏｌ）、ＷＳＣ５．１ｍｇ（２６．７μｍｏｌ）、０．１Ｍトリエチルアミン０．９μＬ（９０．０ｐｍｏｌ）を添加し、２日間室温で反応させた。ＨＰＬＣで精製後、目的物のフラクションを採取し、溶液を留去して末端に電気化学発光物質が標識された検出用プローブ核酸を得た。
【００５０】
（３）ハイブリダイゼーション反応
本発明で用いる目的核酸には、ヒト由来ＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅＰ−４５０の遺伝子配列の５’−末端より５９９−６９８番目に位置するＡＡＴＴＧＡＡＴＧＡ ＡＡＡＣＡＴＣＡＧＧ ＡＴＴＧＴＡＡＧＣＡ ＣＣＣＣＣＴＧＧＡＴ ＣＣＡＧＡＴＡＴＧＣ ＡＡＴＡＡＴＴＴＴＣ ＣＣＡＣＴＡＴＣＡＴ ＴＧＡＴＴＡＴＴＴＣ ＣＣＧＧＧＡＡＣＣＣ ＡＴＡＡＣＡＡＡＴＴの配列を有する１００塩基のオリゴデオキシヌクレオチド（配列表４）を使用した。
【００５１】
（１）の工程で得られた磁気ビーズに、２倍のＳＳＣを１４μＬ加え、そこに５μＭに調製した目的核酸及び（２）の工程で作製した検出用プローブ核酸をそれぞれ４μＬ添加し、７０℃で穏やかに振とうさせた。１時間振とうさせた後、溶液を除去し、４０℃に加温した２倍のＳＳＣで洗浄した。洗浄溶液を除去し、さらにＴＴバッファーで洗浄することで、磁気ビーズＡ'を得た。なお、非相補プローブ核酸を固定した磁気ビーズＢについても、上記と同様の処理を行うことで、磁気ビーズＢ'を得た。
【００５２】
（４）紫外線照射による電気化学発光物質の磁気ビーズからの分離
図２を用いて本測定装置を説明する。流路２３は、樹脂製の流路蓋部２１とガラスを基材とする電極チップ２２とで構成された隙間に壁となるシリコン樹脂２４を挟むことで密封空間が構成される。電極チップ２２上には作用電極２５、対極及び参照極２６、さらに電極ピン２７が接触する電極パット２８、及びそれぞれの電極と電極パットをつなぐ配線が金属薄膜によって電極チップ上にパターニングされており、作用電極、対極、及び参照極に対応した電極パットに電極ピンが接触され、電圧印加及び信号の取得が可能な構成となっている。金属薄膜はガラス基板上にスパッタ装置（アルバック製ＳＨ−３５０）によりチタン１０ｎｍを下地に金２００ｎｍを形成されたものであり、さらにこの金属薄膜はフォトリソグラフィ工程により各電極、配線、電極パットのパターンを電極チップ上に形成されている。
【００５３】
流路蓋部２１には磁気ビーズや電解液を送液する送液管２９、測定後の液を排液する排液管３０が配置されている。さらに、流路蓋部２１と電極チップ２２とで流路２３を構成した際に作用電極２５上に光を透過する窓３４を介して光検出器３１が構成されるように配置されている。また、流路２３の流路外下部には磁気ビーズを収集するための磁石３２が配置されている。さらに、磁石３２の流路外上部に光を透過する窓３４を介して紫外線照射装置３３が配置されている。作用電極２５対極及び参照極２６にはポテンショスタット３５から電極ピン２７を介して電圧が印加される。電圧印加及び光検出器からの信号処理は制御用PC３６によって制御・処理される。
【００５４】
図２で示す装置構成において、磁気ビーズＡ'を送液管２９に導入した後、電解液（終濃度：０．１ＭＰＢＳ、０．１Ｍトリエチルアミン）で送液を行った。電解液の送液は５０ｍｍ/分で行う。流路は長さ（送液方向）３００ｍｍ、幅５ｍｍ、高さ１ｍｍに設定した。
【００５５】
永久磁石を流路外に配置させた磁気ビーズ収集部を滴下部の下流に設けており、この収集部によって流路内を流れる磁気ビーズを捕捉させた。この時捕捉されない非目的試料は排液管から排水させた。捕捉させた磁気ビーズを、窓に密着させた短波長紫外光源（ＵＶＰ製ＣＬ１０００型）を用いて中心波長２６５ｎｍ、５ｍＷ／ｃｍ2の紫外線を２０分間照射しプローブ核酸を切断することでルテニウム錯体を磁気ビーズから分離させた。磁気ビーズＢ’に対しても同様の処理を行った。
【００５６】
（５）負電圧印加による電気化学発光物質の捕捉
（４）の紫外線照射時に磁気ビーズ収集部の流路内の下流に配置した作用電極を参照電極に対して−０．４Vの電位に保持しておく。これにより上流から流れてきたルテニウム錯体を作用電極上に捕捉した。磁気ビーズＢ’に対しても同様の処理を行った。
【００５７】
＜比較例＞
上記実施例と対比させるため、（４）の紫外線照射を行った後、作用電極に負電圧を印加しない状態としたものを比較例とした。
【００５８】
＜実施例と比較例との電気化学発光測定結果＞
作用電極上に電圧を印加し、この時に生じた電気化学発光の測定を行った。なお、電圧の印加は、-０．４Ｖから１．３Ｖまで１秒間で掃印し、電気化学発光測定を行った。電気化学発光量の測定は、窓に密着させた光電子増倍管（浜松ホトニクス製Ｈ７３６０−０１）を用いて行い、電圧掃印中におけるルテニウム錯体の最大発光量を測定した。
【００５９】
実施例及び比較例での測定結果を図３に示す。図３に示すように、実施例において得られた磁気ビーズＡ’からの発光量は負電圧を印加しない比較例の発光量に対して著しく高い値を示すので、本実施例における負電圧の印加はルテニウム錯体を捕捉していると考えられる。従って、効率よく磁気ビーズ錯体に捕捉されたルテニウム錯体を作用極上に収集し発光させることができる。また、磁気ビーズＡ’と磁気ビーズＢ’の発光量の差異は、本実施例の方が比較例よりもはるかに大きい。これは、本発明は、配列特異性を持つことを示している。以上の結果から、本発明を用いることで高感度に目的遺伝子の検出が可能であることは明らかである。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明に係る遺伝子検出方法は、磁気ビーズを必要とせず、作用電極に目的試料を収集できるので、微量な遺伝子サンプルの検出が可能となる。従って、高感度な測定が必要となる一塩基変異多型の検出、細菌検査及びウイルス検査方法に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】従来のフロー型電気化学測定系の構成を示す概略図
【図２】本発明のフロー型電気化学測定装置の構成を示す概略図
【図３】実施例と比較例との電気化学発光量を示すグラフ
【符号の説明】
【００６２】
１１、３１ 光検出器
１２ フローセル
１３、２５ 作用電極
１４、２９ 送液管
１５、３０ 排液管
１６、３２ 磁石
２３ 流路
２１ 流路蓋部
２２ 電極チップ
２４ シリコン樹脂
２６ 対極
２７ 電極ピン
２８ 電極パット
３３ 紫外線照射装置
３４ 窓
３５ ポテンショスタット
３６ 制御用ＰＣ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定すべき目的核酸と前記目的核酸の一部と結合する第一のプローブを持つ磁気ビーズと前記目的核酸の他の一部と結合する第二のプローブを持つ電気化学発光物質とが互いに結合してプローブ複合体を形成する第1のステップと、
前記磁気ビーズに作用する磁力を用いて前記第１のステップにて形成されたプローブ複合体を収集する第２のステップと、
前記第２のステップで収集されたプローブ複合体から少なくとも前記電気化学発光物質を分離する第３のステップと、
前記第３のステップで分離された電気化学発光物質を収集するために作用電極上に負電圧を与える第４のステップと、
前記作用電極に正電圧を与え前記収集された電気化学発光物質を発光させその光量を測定する第５のステップと、
を備える遺伝子検出方法。
【請求項２】
前記第４のステップは、前記第３のステップと同時又は前記第３のステップの前に行う請求項１に記載の遺伝子検出方法。
【請求項３】
前記第２から第５のステップを同一流路内で行う請求項１又は２に記載の遺伝子検出方法。
【請求項４】
前記第２から第４のステップを同一流路内の上流側から下流側にかけて順次行う請求項３に記載の遺伝子検出方法。
【請求項５】
前記第２のステップにおける磁力は流路の外部に配置した磁石より与える請求項１又は２に記載の遺伝子検出方法。
【請求項６】
前記第３のステップは紫外線の照射により行われる請求項１又は２に記載の遺伝子検出方法。
【請求項７】
前記紫外線の波長帯は、２４０ｎｍ以上２６０nm以下である請求項６に記載の遺伝子検出方法。
【請求項８】
前記電気化学発光物質はルテニウム錯体である請求項１に記載の遺伝子検出方法。
【請求項１】
測定すべき目的核酸と前記目的核酸の一部と結合する第一のプローブを持つ磁気ビーズと前記目的核酸の他の一部と結合する第二のプローブを持つ電気化学発光物質とが互いに結合してプローブ複合体を形成する第1のステップと、
前記磁気ビーズに作用する磁力を用いて前記第１のステップにて形成されたプローブ複合体を収集する第２のステップと、
前記第２のステップで収集されたプローブ複合体から少なくとも前記電気化学発光物質を分離する第３のステップと、
前記第３のステップで分離された電気化学発光物質を収集するために作用電極上に負電圧を与える第４のステップと、
前記作用電極に正電圧を与え前記収集された電気化学発光物質を発光させその光量を測定する第５のステップと、
を備える遺伝子検出方法。
【請求項２】
前記第４のステップは、前記第３のステップと同時又は前記第３のステップの前に行う請求項１に記載の遺伝子検出方法。
【請求項３】
前記第２から第５のステップを同一流路内で行う請求項１又は２に記載の遺伝子検出方法。
【請求項４】
前記第２から第４のステップを同一流路内の上流側から下流側にかけて順次行う請求項３に記載の遺伝子検出方法。
【請求項５】
前記第２のステップにおける磁力は流路の外部に配置した磁石より与える請求項１又は２に記載の遺伝子検出方法。
【請求項６】
前記第３のステップは紫外線の照射により行われる請求項１又は２に記載の遺伝子検出方法。
【請求項７】
前記紫外線の波長帯は、２４０ｎｍ以上２６０nm以下である請求項６に記載の遺伝子検出方法。
【請求項８】
前記電気化学発光物質はルテニウム錯体である請求項１に記載の遺伝子検出方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００９−９２５４６（Ｐ２００９−９２５４６Ａ）
【公開日】平成２１年４月３０日（２００９．４．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２６４２９５（Ｐ２００７−２６４２９５）
【出願日】平成１９年１０月１０日（２００７．１０．１０）
【出願人】（０００００５８２１）パナソニック株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年４月３０日（２００９．４．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１０月１０日（２００７．１０．１０）
【出願人】（０００００５８２１）パナソニック株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
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