遺伝子治療に使用されるウィルスベクターに対するＴ細胞介在型免疫反応を検出及び調節する組成物及び方法
【解決手段】 ウィルス性形質導入された導入遺伝子含有細胞のＴ細胞介在型破壊を抑制する組成物及び方法が提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は２００６年５月３１日付で出願された米国特許仮出願第６０／８０９，９５６号に優先権を主張するものであり、その全ての内容がこの参照により本願明細書に取り込まれる。
【０００２】
米国特許法第２０２条（３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§２０２（ｃ））に従って、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）の研究助成金番号ＰＯ１ ＨＬ０７８８１０からの資金で一部なされた本願に記載される本発明の特定権利は、米国政府が有するものであることが認められる。
【背景技術】
【０００３】
本発明は遺伝子治療及び免疫学の分野に関する。より具体的には、本発明はウィルスベクター抗原の存在を検出する組成物及び方法を提供し、ウィルスベクター抗原に対する免疫反応を抑制及び回避する組成物及び方法を含むものである。
【０００４】
複数の出版物と特許文献が本発明に関連する最新の従来技術を説明するために本願明細書の中で参照されている。これらの引用文献の各々は参照により本願明細書に完全に取り込まれる。
【０００５】
野生型アデノウィルス随伴ウィルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ：ＡＡＶ）は〜４．７ｋｂの一本鎖ＤＮＡ遺伝子を持つパルボウィルスである。前記ウィルスは複製機能を自然欠損しており、複製にはアデノウィルス及びヘルペスウィルスのようなヘルパーウィルスを必要とする。前記ウィルスはいかなる疾患にも関連が見出されていないが、その代わりにアデノウィルス分離株の混入物質として最初に分離された（４）。これまでに６個の血清型が記述されており、それらは非常に良く保存された配列を持つ（保存率は６２％〜９９％と異なる）。前記ウィルスの遺伝子は２個の逆方向末端反復配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔｓ：ＩＴＲｓ）によって挟まれており、３個のカプシド（ｃａｐｓｉｄ）遺伝子（ＶＰ１、２、３）及び４個のレップ（ｒｅｐ）タンパク質をコードするものであり、このレップタンパク質はＤＮＡ複製及びＡＡＶ生活環の制御に関わる。最近、さらなる血清型（ＡＡＶ−７、−８、−９）がアカゲザル及びヒトから分離され、ＡＡＶ−１〜６と比較してこれらの血清型もまた６０％よりも高い率で保存されている（５）。
【０００６】
野生型ＡＡＶが遺伝子導入媒体としての使用のために遺伝子操作された。すなわち、レップ（ｒｅｐ）及びキャップ（ｃａｐ）遺伝子を欠損させ、ウィルスＤＮＡ翻訳領域がないように、目的とする治療遺伝子を２個のＩＴＲｓの間に挿入する。１９９０年代の半ばに複数の研究グループ（６〜１０）によって、組み換えＡＡＶが骨格筋、肝臓、中枢神経系（ＣＮＳ）、及び呼吸器官を含む多数の非分裂細胞型に感染し、この組み換えＡＡＶにより免疫学的にコンピテントな動物中で導入遺伝子長期発現が誘導されることが示された。この興味深い知見は多数の研究グループによって利用され、組み換えＡＡＶの投与により小型及び大型動物モデルにおいて遺伝子性疾患が治癒した（１１〜１７）という目覚ましい結果のポートフォリオが現在集まっている。ヒトにおける経験はより限定されるが（１８〜２４）、安全性及び遺伝子導入とその発現が証明されているという観点で有望とされている。しかしながら、ほとんどの例で表現型の修正が起こるほど十分に発現レベルが十分に高くない。
【０００７】
我々の研究の主要目的は、血友病及び他の血液凝固疾患の治療のための安全且つ有効なアデノ随伴ウィルス（ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ：ＡＡＶ）を介した遺伝子導入システムを確立することである。血友病イヌモデルの長期間にわたる血友病の治癒（１）に基づき臨床試験が計画され、その中で重度のＢ型血友病の患者にＡＡＶ−Ｆ．ＩＸ（Ｆａｃｔｏｒ ＩＸ：Ｆ．ＩＸ）経肝動脈注入を行った。１人の患者はベクター注入後第２週目までに１１．８％（治療域レベル）の循環ファクターＩＸを得た。このレベルは約４週間続き、その後徐々に低下し始め、結局患者の基準値<１％に戻った。Ｆ．ＩＸレベルの減少に一致して、血中肝アミノ基転移酵素が上昇し始め、注入後５週で最高値に達し、その後数週間で正常値にまで減少した。このように前記患者は、マウス、ラット、ウサギ、血友病イヌ、及び非ヒト霊長類を含む実験動物で観察されたものとはかなり異なる経過をたどった。実験動物とは対照的に、前記ヒト患者は、ＡＡＶに対する低い中和抗体適定値の存在、並びにＩｇＧ抗体が存在することから推定すればわかるように、既にＡＡＶ−２に対する免疫を持っており、前記患者はリンパ球様分画にＡＡＶに特異的な記憶Ｔ細胞の一群を持っているようであった（２）。同様の所見が前記臨床試験の別の患者でも観察され、この患者での免疫学的研究によりＡＡＶカプシド中の特異的なペプチドに対するＴ細胞反応が立証された。明らかに、前記反応はベクターを注入して数週後、末梢血で検出できたが、注入前には検出できなかった。
【０００８】
これらの知見から遺伝子治療アプローチを有効にするために、一部の例で、導入遺伝子発現細胞のＴ細胞介在型破壊を防ぐために免疫反応を調節することが必要であるのは明らかである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｍｏｕｎｔ ＪＤ，Ｈｅｒｚｏｇ ＲＷ，Ｔｉｌｌｓｏｎ ＤＭ，ｅｔ ａｌ．Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ｂ ｄｏｇｓ ｗｉｔｈ ａ ｆａｃｔｏｒ ＩＸ ｎｕｌｌ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｂｙ ｌｉｖｅｒ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｂｌｏｏｄ．２００２；９９：２６７０−２６７６．
【非特許文献２】Ａｐｐａｙ Ｖ，Ｒｏｗｌａｎｄ−Ｊｏｎｅｓ ＳＬ．Ｌｅｓｓｏｎｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｔ−ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ｈｕｍａｎ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｓｅｍｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４；１６：２０５−２１２．
【非特許文献３】Ｍａｎｎｏ ＣＳ，Ａｒｒｕｄａ ＶＲ，Ｐｉｅｒｃｅ ＧＦ，ｅｔ ａｌ．Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｖｅｒ ｉｎ ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ ｂｙ ＡＡＶ−Ｆａｃｔｏｒ ＩＸ ａｎｄ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ ｉｍｐｏｓｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｈｏｓｔ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｎａｔ Ｍｅｄ．２００６；１２：３４２−３４７．
【非特許文献４】Ｂｌａｃｋｌｏｗ ＮＲ，Ｈｏｇｇａｎ ＭＤ，Ｓｅｒｅｎｏ ＭＳ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｓｅｒｏｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｉｎｆａｎｔｓ ａｎｄ ｃｈｉｌｄｒｅｎ．Ａｍ Ｊ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．１９７１；９４．
【非特許文献５】Ｇａｏ ＧＰ，Ａｌｖｉｒａ ＭＲ，Ｗａｎｇ Ｌ，Ｃａｌｃｅｄｏ Ｒ，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ Ｊ，Ｗｉｌｓｏｎ ＪＭ．Ｎｏｖｅｌ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ ｆｒｏｍ ｒｈｅｓｕｓ ｍｏｎｋｅｙｓ ａｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００２；９９：１１８５４−１１８５９．
【非特許文献６】Ｘｉａｏ Ｘ，Ｌｉ Ｊ，Ｓａｍｕｌｓｋｉ ＲＪ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ ｍｕｓｃｌｅ ｔｉｓｓｕｅ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｍｉｃｅ ｂｙ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ．ｊ Ｖｉｒｏｌ．１９９６；７０：８０９８−８１０８．
【非特許文献７】Ｋｅｓｓｌｅｒ ＰＤ，Ｐｏｄｓａｋｏｆｆ ＧＭ，Ｃｈｅｎ Ｘ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９６；９３：１４０８２−１４０８７．
【非特許文献８】Ｆｌｏｔｔｅ ＴＲ， Ａｆｉｏｎｅ ＳＡ， Ｃｏｎｒａｄ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｓｔａｂｌｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｗｉｔｈ ａｎ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９３；９０：１０６１３−１０６１７．
【非特許文献９】Ｋａｐｌｉｔｔ ＭＧ，Ｌｅｏｎｅ Ｐ，Ｓａｍｕｌｓｋｉ ＲＪ，ｅｔ ａｌ．Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｂｒａｉｎ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１９９４；８：１４８−１５４．
【非特許文献１０】Ｆｌｏｔｔｅ ＴＲ，Ｃａｒｔｅｒ ＢＪ．Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９５；２：３５７−３６２．
【非特許文献１１】Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｒｎａｕｔｅ Ｒ，Ｈａｒｖｅｙ−Ｗｈｉｔｅ Ｊ，Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ Ｊ，Ｂａｎｋｉｅｗｉｃｚ ＫＳ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ａｒｏｍａｔｉｃ Ｌ−ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｓｔｒｉａｔｕｍ ｏｆ ６−ＯＨＤＡ−ｌｅｓｉｏｎｅｄ ｒａｔｓ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００１；４：３２４−３３０．
【非特許文献１２】Ａｃｌａｎｄ ＧＭ，Ａｇｕｉｒｒｅ ＧＤ，Ｒａｙ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｒｅｓｔｏｒｅｓ ｖｉｓｉｏｎ ｉｎ ａ ｃａｎｉｎｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ ｂｌｉｎｄｎｅｓｓ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．２００１；２８：９２−９５．
【非特許文献１３】Ｈｏ ＴＴ，Ｍａｇｕｉｒｅ ＡＭ，Ａｇｕｉｒｒｅ ＧＤ，ｅｔ ａｌ．Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｒｅｓｃｕｅ ａｆｔｅｒ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ４−ｓｕｌｆａｔａｓｅ ｔｏ ｔｈｅ ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ｏｆ ｆｅｌｉｎｅ ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ ＶＩ．Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．２００２；４：６１３−６２１．
【非特許文献１４】Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ Ｈ，Ｈａｙａｋａｗａ Ｈ，Ｍｉｇｉｔａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ａｎ ＡＡＶ−ｄｅｒｉｖｅｄ Ａｐａｆ−１ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ＭＰＴＰ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｓ ａｎｔｉａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００１；９８：１０９１８−１０９２３．
【非特許文献１５】Ｙｕｅ Ｙ，Ｌｉ Ｚ，Ｈａｒｐｅｒ ＳＱ，Ｄａｖｉｓｓｏｎ ＲＬ，Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ ＪＳ，Ｄｕａｎ Ｄ．Ｍｉｃｒｏｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ ｒｅｓｔｏｒｅｓ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｓａｒｃｏｌｅｍｍａ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｍｄｘ ｍｏｕｓｅ ｈｅａｒｔ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２００３；１０８：１６２６−１６３２．
【非特許文献１６】Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ Ｏ，Ｂｏｔｈ Ｍ，Ｇｉｌｌｉｓ ＪＭ，Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ ＪＳ，Ｆｉｎｋ ＲＨ．Ｍｉｎｉ−ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｒｅｓｔｏｒｅｓ ｌ−ｔｙｐｅ ｃａｌｃｉｕｍ ｃｕｒｒｅｎｔｓ ｉｎ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｄｘ ｍｉｃｅ．Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００３．
【非特許文献１７】Ｗａｔｃｈｋｏ Ｊ，Ｏ’Ｄａｙ Ｔ，Ｗａｎｇ Ｂ，ｅｔ ａｌ．Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｉｎｉｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ ｍｕｓｃｌｅ ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍｄｘ ｍｉｃｅ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００２；１３：１４５１−１４６０．
【非特許文献１８】Ｆｌｏｔｔｅ Ｔ，Ｃａｒｔｅｒ Ｂ，Ｃｏｎｒａｄ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｐｈａｓｅ Ｉ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ａｎ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ−ＣＦＴＲ ｇｅｎｅ ｖｅｃｔｏｒ ｉｎ ａｄｕｌｔ ＣＦ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｉｌｄ ｌｕｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９６；７：１１４５−１１５９．
【非特許文献１９】Ｗａｇｎｅｒ ＪＡ，Ｍｅｓｓｎｅｒ ＡＨ，Ｍｏｒａｎ ＭＬ，ｅｔ ａｌ．Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａｎ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ−ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ（ＡＡＶ−ＣＦＴＲ）ｉｎ ｔｈｅ ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｍａｘｉｌｌａｒｙ ｓｉｎｕｓ．Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ．１９９９；１０２（２ Ｐｔ １）：２６６−２７４．
【非特許文献２０】Ｗａｇｎｅｒ ＪＡ，Ｎｅｐｏｍｕｃｅｎｏ ＩＢ，Ｍｅｓｓｎｅｒ ＡＨ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｐｈａｓｅ ＩＩ， ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ， ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ， ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌ ｏｆ ｔｇＡＡＶＣＦ ｕｓｉｎｇ ｍａｘｉｌｌａｒｙ ｓｉｎｕｓ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｗｉｔｈ ａｎｔｒｏｓｔｏｍｉｅｓ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００２；１３：１３４９−１３５９．
【非特許文献２１】Ｗａｇｎｅｒ ＪＡ，Ｒｅｙｎｏｌｄｓ Ｔ，Ｍｏｒａｎ ＭＬ，ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ＡＡＶ−ＣＦＴＲ ｉｎ ｍａｘｉｌｌａｒｙ ｓｉｎｕｓ．Ｌａｎｃｅｔ．１９９８；３５１（９１１７）：１７０２−１７０３．
【非特許文献２２】Ｗａｇｎｅｒ ＪＡ，Ｍｏｒａｎ ＭＬ，Ｍｅｓｓｎｅｒ ＡＨ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｐｈａｓｅ Ｉ／ＩＩ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｇＡＡＶ−ＣＦ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ｓｉｎｕｓｉｔｉｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９８；９：８８９−９０９．
【非特許文献２３】Ｋａｙ ＭＡ，Ｍａｎｎｏ ＣＳ，Ｒａｇｎｉ ＭＶ，ｅｔ ａｌ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆａｃｔｏｒ ＩＸ ｉｎ ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ｂ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．２０００；２４：２５７−２６１．
【非特許文献２４】Ｍａｎｎｏ ＣＳ，Ｃｈｅｗ ＡＪ，Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ Ｓ，ｅｔ ａｌ．ＡＡＶ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ＩＸ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｅｖｅｒｅ ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ｂ．Ｂｌｏｏｄ．２００３；１０１：２９６３−２９７２．
【非特許文献２５】Ｃｈｉｒｍｕｌｅ Ｎ，Ｐｒｏｐｅｒｔ Ｋ，Ｍａｇｏｓｉｎ Ｓ，Ｑｉａｎ Ｙ，Ｑｉａｎ Ｒ，Ｗｉｌｓｏｎ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ａｎｄ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９９；６：１５７４−１５８３．
【非特許文献２６】Ｈｏｌｌｅｒ ＰＤ，Ｃｈｌｅｗｉｃｋｉ ＬＫ，Ｋｒａｎｚ ＤＭ．ＴＣＲｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｆｏｒ ｆｏｒｅｉｇｎ ｐＭＨＣ ｓｈｏｗ ｓｅｌｆ−ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３；４：５５−６２．
【非特許文献２７】Ｌａｕｇｅｌ Ｂ，Ｂｏｕｌｔｅｒ ＪＭ，Ｌｉｓｓｉｎ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｆｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００５；２８０：１８８２−１８９２．
【非特許文献２８】Ｏ’Ｈｅｒｒｉｎ ＳＭ，Ｌｅｂｏｗｉｔｚ ＭＳ，Ｂｉｅｌｅｒ ＪＧ，ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ−ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｕｓｉｎｇ ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｓｏｌｕｂｌｅ ｄｉｖａｌｅｎｔ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１９９７；１８６：１３３３−１３４５．
【非特許文献２９】Ｐｅｎｇ ＫＷ，Ｈｏｌｌｅｒ ＰＤ，Ｏｒｒ ＢＡ，Ｋｒａｎｚ ＤＭ，Ｒｕｓｓｅｌｌ ＳＪ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｖｉｒｕｓ ｅｎｔｒｙ ａｎｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｕｓｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ／ＭＨＣ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００４；１１：１２３４−１２３９．
【非特許文献３０】Ｓｕｂｂｒａｍａｎｉａｎ ＲＡ，Ｍｏｒｉｙａ Ｃ，Ｍａｒｔｉｎ ＫＬ，ｅｔ ａｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｅｔｒａｍｅｒｓ ｂｉｎｄ ＭＨＣ−ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００４；２２：１４２９−１４３４．
【非特許文献３１】Ｚｈｕ Ｘ，Ｂｅｌｍｏｎｔ ＨＪ，Ｐｒｉｃｅ−Ｓｃｈｉａｖｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐ５３（２６４−２７２）／ＨＬＡ−Ａ＊０２０１ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｏｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｂｙ ａ ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ ｓｏｌｕｂｌｅ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６；１７６：３２２３−３２３２．
【非特許文献３２】Ｙｅｅ Ｃ，Ｓａｖａｇｅ ＰＡ，Ｌｅｅ ＰＰ，Ｄａｖｉｓ ＭＭ，Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ ＰＤ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ ａｖｉｄｉｔｙ ｍｅｌａｎｏｍａ−ｒｅａｃｔｉｖｅ ＣＴＬ ｆｒｏｍ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ−ＭＨＣ ｔｅｔｒａｍｅｒｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９；１６２：２２２７−３４．
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明ではヒトＭＨＣクラスＩ分子上のアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）に存在するペプチド配列に対して免疫学的に特異的な可溶性Ｔ細胞受容体（ｓｏｌｕｂｌｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｓＴＣＲ）が開示される。望ましい実施形態において、前記アデノウィルスペプチド配列は、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ-２、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−８及び他の自然発生血清型から成る群から選択される血清型から得られる。特定の望ましい実施形態において、前記ペプチドは表１に示される配列を持ち、前記ヒトＭＨＣクラスＩ分子はＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２，ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ８、ＨＬＡ−Ｂ１５、ＨＬＡ−Ｂ４４、及びＨＬＡ−Ｂ５１から成る群から選択される。
【００１１】
また本発明は、導入遺伝子含有アデノ随伴ウィルスベクター投与前、投与中、投与後のウィルスカプシド抗原に対するＴ細胞介在型免疫反応の存在を検出する方法を含む。典型的な方法は、患者からＴ細胞を含む生物学的試料を得る工程と、ＭＨＣクラスＩ分子上の前記カプシドペプチドエピトープを含む五量体又は四量体に前記細胞を接触させる工程と、及び未処理のコントロール細胞と比較して前記接触が前記Ｔ細胞を刺激するかどうかを決定する工程とを含み、細胞は前記接触によって刺激され前記ウィルスカプシドの前記ペプチドエピトープに対する特異性を有しており、この特異性がカプシド及び導入遺伝子含有細胞のＴ細胞介在型破壊に関連する。前記方法はまた刺激を受けた前記Ｔ細胞からのｍＲＮＡの分離工程と、ｃＤＮＡを調製する工程と、前記ウィルスカプシド抗原に対して免疫学的特異性のある可溶性Ｔ細胞受容体をクローン化する工程とを含む。
【００１２】
前記方法によって調製される可溶性Ｔ細胞受容体もまた本発明に含まれる。
【００１３】
もう１つの態様において、アデノウィルス随伴ベクター投与後のウィルス性形質導入細胞のＴ細胞介在型破壊の抑制方法が開示される。典型的な方法は、ＡＡＶエピトープ／ＭＨＣ複合体に特異的なｓＴＣＲの有効量を提供する工程を含み、問題となるカプシドペプチドへの自然発生Ｔ細胞の結合阻害を介して、前記ｓＴＣＲは前記導入遺伝子含有細胞のＴ細胞介在型破壊を防ぐ。そのような結合阻害はＣＴＬ活性化を防ぐ。
【００１４】
また、ウィルス性形質導入細胞のＴ細胞介在型破壊を回避する方法を提供し、この方法は、上述したようにＡＡＶペプチドエピトープに対する特異性を検出する工程と、前記ＡＡＶベクターを改変し同定したペプチドエピトープを除去する工程とを含む。改変後修飾されたＡＡＶベクターが前記患者に投与され、その改変はウィルス性形質導入細胞のＴ細胞介在型破壊を抑止するものである。そのような改変ＡＡＶベクターはまた本発明のさらなる態様を含む。望ましい実施形態において、そのようなＡＡＶベクターは表１で示されるＡＡＶエピトープを欠失するように改変される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は導入遺伝子含有ＡＡＶベクターで処理した患者からの分離末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）中のＴ細胞反応の時間的経過を示したグラフを表したものである。
【図２Ａ】図２ＡはＡＡＶカプシドＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔの結果を示したグラフである。ＡＡＶ由来ペプチドによってインビトロで再刺激されたヒトリンパ球はＩＦＮ−γを産生する。
【図２Ｂ】図２ＢはＡＡＶカプシド由来免疫優性エピトープを用いた数回のインビトロ刺激（ＩＶＳ）を通して正常なドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）からＡＡＶ−特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞がインビトロで増殖することを表す一連の散布図を示したものである。
【図３】ＡＡＶ血清型１〜８で非常に良く保存されている、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって同定された（下線）異なるＴ細胞エピトープを示したものである。配列ＩＤ番号１〜１８を示す。
【図４Ａ】図４Ａ及び４Ｂは流動選別し、続いてインビトロで増加させた２つのＣＤ８＋Ｔ細胞クローンの一対の散布図である。これらのクローンはｍＲＮＡ源となり、本願明細書で記載される可溶性Ｔ細胞受容体を合成するのに使用される。
【図４Ｂ】図４Ａ及び４Ｂは流動選別し、続いてインビトロで増加した２つのＣＤ８＋Ｔ細胞クローンの一対の散布図である。これらのクローンはｍＲＮＡ源となり、本願明細書で記載される可溶性Ｔ細胞受容体を合成するのに使用される。
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｅは下記に説明されるＣＴＬクローンに対するＴＣＲの配列を示したものである。
【図５Ｂ】図５Ａ〜５Ｅは下記に説明されるＣＴＬクローンに対するＴＣＲの配列を示したものである。
【図５Ｃ】図５Ａ〜５Ｅは下記に説明されるＣＴＬクローンに対するＴＣＲの配列を示したものである。
【図５Ｄ】図５Ａ〜５Ｅは下記に説明されるＣＴＬクローンに対するＴＣＲの配列を示したものである。
【図５Ｅ】図５Ａ〜５Ｅは下記に説明されるＣＴＬクローンに対するＴＣＲの配列を示したものである。
【図６】図６はＡＡＶ−ａ−ｓｃＴＣＲ−ＢｉｒＡ及びＡＡＶ−ｂ−ｓｃＴＣＲ−ＢｉｒＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥである。レーン１、標準分子量、レーン２、ＡＡＶ−ａ−ｓｃＴＣＲ−ＢｉｒＡ、レーン３、ＡＡＶ−ｂ−ｓｃＴＣＲ−ＢｉｒＡ。
【図７Ａ】図７ＡはＥＬＩＳＡによる精製ＡＡＶ−ｓｃＴＣＲｓのＷ４Ｆ検出を示すグラフである。
【図７Ｂ】図７ＢはＥＬＩＳＡによる精製ＡＡＶ−ｓｃＴＣＲｓの五量体検出を示すグラフである。
【図８】図８はＡＡＶ−ｓｃＴＣＲ多量体のｐ７４／ＨＬＡ−Ｂ７結合活性を示すプロットである。
【図９】図９Ａ及び９ＢはＡＡＶ−ｓｃＴＣＲ多量体のｐ７４／ＨＬＡ−Ｂ７結合のヒストグラムを示すものである。
【図１０】図１０Ａ及び１０Ｂは１対のヒストグラムであり、ＡＡＶ−ｓｃＴＣＲ多量体を使用したペプチド負荷した線維芽細胞のインビトロ染色を示したものである。
【図１１】図１１Ａ及び１１Ｂは一対のヒストグラムであり、ＡＡＶ−ｓｃＴＣＲ多量体を使用したＡＡＶ−形質導入ＨＬＡ−Ｂ＊０７０２ヒト線維芽細胞のインビトロ染色を示したものである。
【図１２】図１２Ａ及び１２Ｂは一対のヒストグラムで、ＡＡＶの１Ｅ１１ベクター遺伝子（ｖｅｃｔｏｒ ｇｅｎｏｍｅｓ：ｖｇ）静注後一週間のＨＬＡ８ Ｂ＊０７０２マウスから集めたＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１９−細胞のＡＡＶ−ｓｃＴＣＲ多量体染色を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
ウィルスベクターを遺伝子導入媒体として使用するため遺伝子操作し、遺伝的欠陥を修正した。しかしながら、本発明に従ってウィルスベクターの導入遺伝子投与後、前記修正を受けた肝臓細胞が内部にベクターカプシドタンパク質を持つことが明らかになった。これらのタンパク質はＴ細胞により検出され、前記修正を受けた細胞は次々に破壊される。従って、本発明の一つの態様は、遺伝子導入の標的組織中のウィルスベクター抗原の存在を検出するための新しい試薬として、可溶性Ｔ細胞受容体（ｓＴＣＲ）の使用を伴う。ウィルス性ベクター配列又はカプシドタンパク質を検出する従来の方法は、ＰＣＲ又は免疫特異性のある抗体を使用していた。しかしながら、臨床的により関連のある形態は宿主Ｔ細胞と接触するベクターカプシド、すなわち宿主ＭＨＣクラスＩ上に提示されているカプシド由来ペプチドである。可溶性ＴＣＲが自然発生Ｔ細胞で観察されるものと類似の様式でカプシド抗原のこの形態を認識することが開示される。さらに、このような試薬がベクター由来抗原の存在に関し形質導入組織を直接的且つ定量的に判定するために使用されることが可能である。この情報は免疫抑制療法を中止するかどうか又は中止する時を決定するために必要な情報を臨床医に提供する。
【００１７】
本発明のもう１つの態様では、可溶性ＴＣＲ試薬は、宿主Ｔ細胞が同種ベクター抗原に接触するのを特異的に阻害する特異的免疫調節治療法として使用される可能性がある。従って、本願明細書で記載される分子は診断及び治療薬の双方で使用される。
【００１８】
様々なＡＡＶの血清型が導入遺伝子の分野において使用され、またヒト集団におけるＨＬＡ型にも大きなばらつきがある。従って、本発明は、１）多形ＨＬＡ拘束性エピトープ及び２）遺伝子療法ベクターで使用される特定のＡＡＶ血清型に特異性を持つように設計された可溶性ＴＣＲｓが含まれる。
【００１９】
代替ＡＡＶベクター血清型及びそれらのＴ細胞拘束性エピトープ
様々なＡＡＶ血清型、特にＡＡＶ−１、２、５及び８の類似した配列にも関わらず、ある自然発生ＡＡＶウィルスのエピトープに対して反応するＴ細胞が、遺伝子治療ベクターとして使用される代替血清型ウィルスに交差反応しないという可能性がある。なぜならばＴ細胞受容体はＭＨＣクラスＩに拘束された小さなペプチド（９〜１１アミノ酸）のみを認識し、更にＴ細胞受容体は非常に高い特異性を持つため、ＡＡＶ−２エピトープに反応するＴ細胞が、例えばアミノ酸１個のみが異なるＡＡＶ−８のエピトープを認識するかもしれないし認識しないかもしれない。さらに、いかなるＡＡＶウィルスからのペプチドエピトープであっても個々のＨＬＡ型（ヒトのＭＨＣ）によって拘束される。このように、幾つかのＴ細胞拘束性ＡＡＶエピトープがＡＡＶ血清型中に保存される可能性に基づき、我々は、集団において通常見られるＨＬＡ−Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ｂ７、Ｂ８、Ｂ１５、Ｂ４４及びＢ５１を含むＨＬＡ型に拘束される複数の血清型から多様なＡＡＶエピトープを同定した。実際、我々はＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２及びＡＡＶ−８からの数個の候補エピトープのライブラリーを機能アッセイにおいて発達させた（表１）。可溶性ＴＣＲｓのベクターカプシド配列検出に対する応用は、我々が既に有するＨＬＡ−Ｂ７拘束性の１つのＡＡＶエピトープ（ＡＡＶ−２ＶＰＱＹＧＹＬＴＬ）から、推定遺伝子治療ベクターとして現在使用中のあらゆるＡＡＶ血清型の多数のエピトープへと容易に広げられる可能性がある。
【００２０】
ＭＨＣクラスＩ五量体及び可溶性ＴＣＲｓの産生だけでなく、免疫優性エピトープを同定することは、ＡＡＶカプシドタンパク質を遺伝子操作するのに有用であり、不要なエピトープが除去される。一旦エピトープが分かると、ＡＡＶカプシド配列中の一致する配列は標準的な分子生物学／組み換えＤＮＡ技術を用いて除去される。このように本発明のもう１つの態様はカプシドを再遺伝子操作する工程を含み、同定されたＴ細胞エピトープを改変する。これによって上に記載された特異的Ｔ細胞反応を避けるベクターが得られる。ここで留意するべき点はこれによって一連のベクターが生じ、それぞれが任意のＭＨＣハプロタイプ特異的であり、これらのベクターは従来の臨床試験で見られたＴ細胞反応を回避するだろうということである（３）。本発明は表１のデータによって示されるように全てのＡＡＶ血清型に適用されるだろう。
【００２１】
【表１】
【００２２】
可溶性ＴＣＲ技術の使用
ｓＴＣＲｓは免疫調節薬として利用することが可能である。例えば、可溶性ＴＣＲはＴ細胞によるエピトープ−ＭＨＣクラスＩ複合体認識を阻害するのに使用することができ、従って、遺伝子導入目的のＡＡＶベクター導入に続く有害なＴ細胞反応を防ぐ。この目的では、可溶性ＴＣＲはＡＡＶベクター導入直前又は導入時に投与されるだろう。
【００２３】
ｓＴＣＲｓはＡＡＶ注入組織の表面上にあるＡＡＶカプシドエピトープの染色のための試薬として使用されてもよい。遺伝子治療の分野におけるもっとも重要な疑問の一つはどのくらいの期間細胞内ＡＡＶカプシド分解に由来する前記ペプチドがＭＨＣ分子複合体の膜表面に提示され、免疫系によって検出可能かどうかである。本願明細書において記載される可溶性ＴＣＲ試薬は生検組織のＡＡＶエピトープ−ＭＨＣ複合体を染色する利点を活かして使用することも可能であり、ＡＡＶカプシド抗原提示の持続時間を決定するのに役立つ。遺伝子治療を受けている患者がＡＡＶカプシドに対する有害な免疫反応の高まる危険性に晒されている時間の範囲を決定することは有効な免疫抑制レジメンを設定するのに必須である。
【００２４】
下記に記載の定義は本発明の理解を助けるために提供される。
【００２５】
本願明細書で使用される「可溶性Ｔ細胞受容体又はｓＴＣＲ」という語句は可溶性Ｔ細胞抗原受容体（単量体又は多量体）を指し、ウィルス感染細胞上のＭＨＣ分子に提示されるペプチド抗原を判定するのに使用される。可溶性ＴＣＲはフローサイトメトリー及び免疫組織化学での使用のため異なる標識分子に随意に結合されてもよい。Ｔ細胞受容体を生成する方法が米国特許第６，０８０，８４０号明細書、国際公開第ＷＯ／２００５／１１６６４６号パンフレット及びＢｏｕｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １６：７０７−７１１に開示される。
【００２６】
五量体はペプチドエピトープに結合した５個のＭＨＣクラスＩ分子の複合体である。全５個の複合体が平面構造に保持されておりＴ細胞受容体に結合するのに利用されている。五量体は随意に蛍光色素に結合されフローサイトメトリーによって同種抗原特異的なＴ細胞を検出する。ここで留意すべき点は四量体技術もまた利用可能であり４個のＭＨＣクラスＩ分子の複合体がペプチドエピトープに結合する。
【００２７】
「五量体又は四量体染色」はＴ細胞を五量体又は四量体と混合し、４度で３０分インキュベートし、１％ＦＢＳ含有ＰＢＳで洗浄し、フローサイトメトリーで検出する過程を指す。染色アッセイを行うのに適した試薬はＰｒｏＩｍｍｕｎｅから商業的に入手可能である。
【００２８】
「細胞傷害性Ｔ細胞反応」という語句はエフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞が標的細胞を殺すＴ細胞介在型破壊過程を指し、その標的細胞はＭＨＣクラスＩ分子に結合するエピトープを外側表面に提示する。
【００２９】
次の実施例は本発明のある実施形態を説明するために提供される。それは本発明をどんな意味においても本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００３０】
上に言及したように、血友病治療のための従来の遺伝子治療において、導入遺伝子の発現は初期には高かったが、時間の経過につれて肝酵素が僅かに上昇し導入遺伝子発現は消失した。ベクター導入前及び後の患者からの末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）を使用し、我々はＭＨＣクラスＩ拘束性ＡＡＶカプシドエピトープを定義し（３）、ＡＡＶに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を検出する五量体性ＨＬＡ−Ｂ＊０７０２／ＡＡＶペプチド（五量体）の可溶型を合成することができた。これらの五量体を使用して、我々は特異的なＡＡＶエピトープに対する前記患者末梢血の特定のＴ細胞増殖の経時的変化を検出することができ、それは肝アミノ基転移酵素の上昇及び導入遺伝子発現の低下に一致していた。図１を参照。観察された前記Ｔ細胞増殖はＭＨＣ／ペプチド抗原の存在している時のみに観察された。このように本願明細書において提示される証拠は細胞傷害性Ｔ細胞が形質導入肝細胞によって提示されたベクターカプシドタンパク質に反応するということを明示する。ベクターカプシドタンパク質がベクター導入後限られた時間内に存在することを考慮して、本願明細書で開示される方法は免疫抑制の必要がある患者の４ヶ月の免疫抑制治療を含み、ベクター導入時前後にＴ細胞機能を一時的に停止する。
【００３１】
Ｔ細胞反応刺激には樹状細胞のような専門の抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ：ＡＰＣｓ）による抗原提示が必要であると考えられている。専門のＡＰＣｓは末梢に存在し、それらは直接感染又はウィルス感染細胞の貪食のいずれかによってウィルス抗原に遭遇する（交差提示）。樹状細胞は抗原を処理し、末梢のリンパ節に移動し、ＭＨＣクラスＩ及びＩＩ上の抗原及び適正な共刺激を未感作Ｔ細胞に提示する。最初の急速な増殖後、ＡＡＶに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の発生頻度は減少し少数の貯蔵された記憶Ｔ細胞を後に残すことが予想され、この記憶Ｔ細胞は恒常的な維持増殖を通して各個人の一生涯の間保持される（２）。一旦適応した免疫システムが刺激されると、専門のＡＰＣｓによる共刺激及び抗原提示の必要性は厳密ではなくなり、全ての有核細胞が持つＭＨＣクラスＩ上にのみウィルス抗原を提示する細胞を記憶Ｔ細胞は認識し殺す。ＡＡＶ−２はＴ細胞反応刺激に必要な炎症反応を自分自身では誘導しないが、自然感染がヘルパーウィルスと一緒に起こるため、その時点でヘルパーウィルス及びＡＡＶ双方の抗原に対して誘導されるＣＤ８＋Ｔ細胞が刺激される。
【００３２】
Ｔ細胞刺激に必要な炎症反応は抗体に再遭遇する記憶Ｔ細胞を新たに動員し活性化するために必須ではない。実験動物とは異なり、ヒトは幼少時にＡＡＶ−２に自然感染する。一般的なヒト集団におけるＡＡＶに対するＴ細胞反応分析報告はほとんどない。Ｃｈｉｒｍｕｌｅらは正常コントロールの５％が組み換えＡＡＶとともにＰＢＭＣをインキュベーション後>２の刺激係数を示したと報告した（２５）。それ以来、Ｔ細胞分析のより感受性の高く定量的なアッセイが発達し、ヒト患者での抗ウィルスＴ細胞反応の詳細な特性解析が行われた。我々は数人の健常成人ドナーのＡＡＶに対するＴ細胞反応を記録することができ、ウィルスカプシドに対する記憶Ｔ細胞反応はＡＡＶベクターを使用する遺伝子導入研究における蔓延した問題であることを示した。ヒトリンパ球はＡＡＶカプシドタンパク質配列由来ペプチドエピトープとともにインビトロで増殖させることができる。増殖した細胞はＩＦＮ−γを生成することによってエピトープに反応し（図２Ａ）及びＡＡＶ特異性ＭＨＣクラスＩ五量体で染色することができる（図２Ｂ）。図３はＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって同定された一連の異なるＴ細胞エピトープ（下線を参照）を説明し、それらはＡＡＶ血清型１−８で非常に良く保存されている。
【００３３】
遺伝子治療ベクターにはウィルスＤＮＡがないため、ＭＨＣクラスＩによってＴ細胞に提示される唯一のウィルス抗原は導入ベクターのカプシドタンパク質であり、それは限定された時間内に存在するべきである。しかしながら免疫学的に検出可能な形でカプシドが存在する時間の長さを決定する直接的な方法はない。我々は臨床試験から継続した４ヶ月の免疫抑制治療を選択したが、この時間枠はカプシド分解の動力学の確かな根拠に基づいていない。カプシドが存在する時間を決定する１つの理由は免疫抑制を中止し遺伝的修正を受けた細胞を保つ時期を決定するためである。
【００３４】
複数の研究が行われ、それぞれ異なる間接的方法でどれくらいの期間ベクターカプシドが存在するかを決定した。臨床試験において、我々は生体内分布研究にＰＣＲを使用し時間の経過とともにベクター遺伝子の存在を検出した。しかしながら、ＰＣＲはベクターＤＮＡを検出するものであり、ベクターＤＮＡは問題となっているＴ細胞によって認識される形のものではない。同様にベクターカプシドに対する抗体もＴ細胞によって認識される形のベクターを検出しない。なぜならこのＴ細胞はＭＨＣ＋ペプチド複合体の形の中でも抗原部分だけを認識するからである。我々の研究室はまた同じ疑問に対処するため動物モデルの研究も行っている。しかしながら、我々は最終的にヒト患者で、遺伝子導入の標的となった特定の組織における、及び我々が使用する異なるいずれのＡＡＶ血清型に対するカプシドの持続性を決定する必要があるだろう、（我々の研究室はＡＡＶ−２に焦点をあてているが、他の遺伝子治療研究室はＡＡＶ−１、ＡＡＶ−５、及び／又はＡＡＶ−８又はこれらのキメラに焦点を当てている）。このようにベクター形質導入組織に対するＴ細胞反応を基にした機能アッセイが本願明細書で開示されるが、理想的にはこれらのデータは記載されている可溶性ＴＣＲｓを使用したデータと組み合わせて解釈される。これらのｓＴＣＲｓによってカプシドの存在を直接定量的に決定でき、もし生検組織試料が利用できるのであればベクターで治療された個人のヒト患者中においても決定できる。
【００３５】
上記のように、ヒトリンパ球をＡＡＶカプシドタンパク質配列由来のペプチドエピトープとともにインビトロで増殖させた。増殖した細胞はＩＦＮ−γを生成することによってエピトープに反応し、ＡＡＶ特異的なＭＨＣクラスＩ五量体で染色される（図２Ａ及び２Ｂ）。
【００３６】
ＡＡＶ特異的ＭＨＣクラスＩ五量体を使用して、増殖したカプシド特異性のあるＣＤ８＋Ｔ細胞の流動選別を行いＣＤ８＋Ｔ細胞のクローンを選択する可能性がある（図４Ａ及び４Ｂ）。
【００３７】
２つの異なるヒトＡＡＶ−ｐ７４ペプチド特異性のあるＣＴＬクローンをＴ細胞受容体（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＴＣＲ）に特異的プライマーを使用するＳＭＡＲＴ−ＲＡＣＥ法によってＴＣＲα及びβ鎖ｃＤＮＡを生成するために使用した。ｃＤＮＡ生成物をクローン化して配列を解読した。２個のＴＣＲα鎖遺伝子（ＡＶ１７／ＴＲＡＪ４３；配列ＩＤ番号１９、及びＡＶ１７／ＡＪ３１；配列ＩＤ番号２０）及び１個のＴＣＲβ鎖遺伝子（ＢＶ６−２／ＢＪ１−１；配列ＩＤ番号２１）をＣＴＬクローンａからクローン化した。１個のＴＣＲα鎖遺伝子（ＡＶ２７／ＡＪ２０；配列ＩＤ番号２２）及び１個のＴＣＲβ鎖遺伝子（ＢＶ４−３／ＢＪ２−７；配列ＩＤ番号２３）をＣＴＬクローンｂからクローン化した。２個のＣＴＬクローンに対するＴＣＲの配列が図５Ａ〜５Ｅに提供される。
【００３８】
同定された２個のα鎖を基に、細菌ビオチンリガーゼに融合した１個のｓｃＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ−ＢｉｒＡコンストラクト）をクローンｂに生成し、２個の異なるｓｃＴＣＲ−ＢｉｒＡコンストラクトをクローンａに生成した。３個の発現ベクターを生成し、ＣＨＯ細胞に形質移入し、特性解析のための可溶性ｓｃＴＣＲ−ＢｉｒＡ融合タンパク質を生成した。３個の全てのｓｃＴＣＲをＡＡＶ−ｓｃＴＣＲ形質移入ＣＨＯ細胞に発現させ、ＡＴＣＣから入手可能な抗ヒトＴＣＲ−β鎖抗体、（ＢＦ１−）８Ａ３．３１及びＷ４Ｆ．５Ｂを使用したサンドウィッチＥＬＩＳＡによって細胞培養上清中に検出した。クローンｂ ｓｃＴＣＲ及びクローンａ ｓｃＴＣＲｓ（ＡＶ１７／ＡＪ３１：ＢＶ６−２／ＢＪ１−１）含有細胞培養上清はＥＬＩＳＡによって検出されるＡＡＶｐ７４五量体活性を示し、さらに上清を特性解析した。ＡＡＶ−ｓｃＴＣＲ−ＢｉｒＡ融合タンパク質をＡＡＶ−ｓｃＴＣＲ−ＢｉｒＡ形質移入体の培養上清からＢＦ１−アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。精製融合タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに示した（図６）。ＡＡＶ−ａ及びＡＡＶ−ｂ培養上清からの融合タンパク質精製量は各々４ｍｇ／Ｌ及び０．２ｍｇ／Ｌであった。精製ｓｃＴＣＲ−ＢｉｒＡ融合タンパク質の特性解析をＥＬＩＳＡによって行った。図７Ａ及び７Ｂを参照。精製ＡＡＶ−ｐ７４−ｓｃＴＣＲ−ＢｉｒＡ融合タンパク質を抗ＴＣＲ抗体が認識するか否かを決定するために、融合タンパク質の連続希釈したものを抗ＴＣＲ ＢＦ１ ｍＡｂ塗布プレートでインキュベートし、その後ビオチン標識抗ＴＣＲ Ｗ４Ｆ ｍＡｂ及びＳＡ−ＨＲＰで検出した。結果は図７Ａに示す。可溶性ＡＡＶ−ｐ７４−ｓｃＴＣＲｓの機能的結合親和性を試験するため、融合タンパク質の連続希釈したものが抗ＴＣＲ ＢＦ１ ｍＡｂ塗布プレートにインキュベートされ、その後ビオチン化したＡＡＶ−ｐ７４／ＨＬＡ−Ｂ＊０７０２五量体及びＳＡ−ＨＲＰで検出した。図７Ｂを参照。
【００３９】
精製ＡＡＶ−ｂ融合タンパク質はＡＡＶ−ａ−ＡＪ３１よりもかなり低い五量体結合活性を示すため、ＡＡＶ−ａ−ＡＪ３１融合タンパク質のみをビオチン標識し可溶性ｐ７４−ｓｃＴＣＲ−ＰＥ多量体の生成に使用した。ＡＡＶ−ａ−ｓｃＴＣＲが細胞表面のＡＡＶ−ｐ７４ペプチド／ＨＬＡ−Ｂ７複合体に結合できるか否かを決定するためにＡＡＶ−ｐ７４ペプチド負荷ＨＬＡ−Ｂ７陽性ヒトリンパ芽球様細胞株（ＪｙＡ２Ｂ７）を使用した。５０μｇ／ｍｌのＡＡＶ−ｐ７４ペプチドを負荷したＪｙＡ２Ｂ７細胞（不死化Ｂ細胞）の特異的な染色を１検査当たり０．０２５μｇのＰＥ結合ｐ７４−ｓｃＴＣＲ多量体とともに観察した（図８）。
【００４０】
一方、典型的な状態では最少５μｇ／ｍｌＡＡＶ−ｐ７４ペプチドを負荷した（図９Ａ）、又は、負荷中ＰＬＥを加えた場合最少１μｇ／ｍｌＡＡＶ−ｐ７４ペプチドを負荷したＪｙＡ２Ｂ７細胞（図７Ｂ）を０．５μｇのｐ７４−ｓｃＴＣＲ多量体で染色することができる。（ＰＬＥはＡｌｔｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｒｐ．（Ｍｉｒａｍａｒ、フロリダ州）の独自の試薬混合物であり、抗原提示細胞に負荷したペプチドを強化する）。
【００４１】
ＡＡＶ−ｓｃＴＣＲ多量体をＨＬＡ−Ｂ＊０７０２陽性の正常ヒト線維芽細胞株を使用しインビトロで試験した（ＡＴＣＣ在庫からＭａｌｍｅ−３が入手可能である）。細胞に３７℃２時間１０μｇ／ｍｌの濃度でＡＡＶカプシドエピトープをペプチド負荷し、その後ＡＡＶ−ｓｃＴＣＲ多量体で染色した（図１０）。両方の実験においてＡＡＶ−ｓｃＴＣＲ多量体の陽性染色が観察され、多量体がＡＡＶペプチドエピトープを提示するＭＨＣ分子に良い親和性で結合することを示した。
【００４２】
同様に、ＡＡＶベクター静注投与後のＨＬＡ−Ｂ＊０７０２遺伝子組み換えマウスから採集したリンパ節細胞及び脾臓細胞はＡＡＶ−ｓｃＴＣＲ多量体の陽性染色を示す（図１２）。
【００４３】
結論
ヒトＭＨＣクラスＩ分子ＨＬＡ−Ｂ＊０７０２上のＡＡＶ２ペプチド（配列ＶＰＱＹＧＹＬＴＬ）に特異的な典型的な可溶性ＴＣＲが本願明細書に記載される。我々はＨＬＡ−Ｂ＊０７０２ハプロタイプを持つ匿名の健常ドナーからこのペプチドに対して特異性のあるＴ細胞を増殖させた。このペプチドに特異的なＴ細胞をクローン化し、Ｔ細胞受容体のＤＮＡを分離し発現させた。
【００４４】
複数の研究グループがウィルス及び／又は癌抗原発現レベルを研究及び定量するため可溶性ＴＣＲｓを発達させた（２６〜３１）。可溶性ＴＣＲｓの遺伝子操作は様々な理由で困難であり、その理由には自然発生Ｔ細胞受容体のＭＨＣ／ペプチドに対する低い親和性及び特定の細胞上の特定のペプチド／ＭＨＣ複合体の低い発現量が含まれる。ＴＣＲｓの公開された研究において、ペプチド／ＭＨＣ複合体に対するＴＣＲｓの親和性が判定された（３０）。ＭＨＣ／ペプチド抗原レベルの検査はマウス同種異系抗体（２８）及び神経学的疾患の原因抗原であるＨＴＬＶ−１抗原に焦点を当てた（感染（２８）及び腫瘍随伴疾患（２７））。Ｔ細胞レパートリーの発達をよく理解するため可溶性ＴＣＲｓを使用した研究もあれば、ウィルスの侵入を捕らえるために可溶性ＴＣＲを使用した研究もある。最後にＺｈｕら（２００６）は多量体一本鎖可溶性ＴＣＲを作成し癌細胞上のヒトＭＨＣクラスＩに提示された癌抗原由来ペプチドを可視化した。我々が知る限りではヒト、動物、又はインビトロモデルのいずれかにおいてウィルスベクター由来抗原の存在を調べた公開されている研究はない。我々が見い出したＨＬＡＢ＊０７０２拘束性エピトープを記載した最近の論文（３）以外はＡＡＶ由来抗原に関する公開された研究もない。
【００４５】
下記に記載された方法は本発明の実践を促進するために提供される。
【００４６】
ＡＡＶカプシドエピトープの同定
アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）はパルボウィルス科に属し、一生のうちの通常早い時期にヒトに自然に感染する。ヒト集団において最も一般的なＨＬＡに対する新しいＣＤ８Ｔ細胞エピトープを同定するため、２つのＩＲＢ承認プロトコールを開始しｔｈｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ及びペンシルバニア大学のｔｈｅ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｈｕｍａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｅｔｗｏｒｋと提携してヒト脾臓を収集した。脾臓は他の臓器に比べエピトープ探究のための２つの主要な利点を提供する。１つ目はＴ細胞記憶保持に関連するリンパ様臓器であること、２つ目は１グラムの組織から５億個の細胞を分離することが可能であり、この数は全血のような他の供給源からは簡単に得られることはできない。
【００４７】
Ｔ細胞分離及びＨＬＡタイピング
Ｔ細胞を組織採取から２４時間以内で分離する。脾臓を最初外科用メスによって小片に処理しその後均質化する。赤血球溶解後脾細胞をＰＢＳで２回洗浄し、各々約１０００万個の一定分量で１０％ＤＭＳＯとともにヒト血清中に凍結した。
【００４８】
２つ若しくはそれ以上の細胞を高分解ＨＬＡタイピングのためペンシルバニア大学病院のＨＬＡ−タイピング研究室に送付した。
【００４９】
インビトロＴ細胞増殖
ＣＤ８Ｔ細胞エピトープの同定はＡＡＶカプシドタンパク質に反応する記憶ＣＤ８Ｔ細胞の低い発生頻度によって妨げられる。この限界を乗り越えるため、脾臓組織からのリンパ球をＶＰ１と呼ばれるＡＡＶカプシドタンパク質に由来する一連のペプチドとともにインビトロで増殖させた。前記ＶＰ１ペプチドライブラリーは各々が１０アミノ酸ずつ重複しているタンパク質配列に由来する１５アミノ酸長のペプチド１４５個でできている（Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ）。
【００５０】
簡潔に説明すると、脾臓からのリンパ球を３％熱不活化ヒト血清を有するＡＩＭ−Ｖ（Ｇｉｂｃｏ）培地中で１ウェル当たり１００万個の細胞を９６ウェルプレートに播種し、前記ウェルの細胞の半分を３０００ｒａｄで放射線照射し支持細胞層として機能させる。ＶＰ１ライブラリーからの各ペプチドを１０μｇ／ｍｌの最終濃度で１つのウェルに添加する。増殖０日目及び２〜３日毎にＩＬ−２（Ｒｏｃｈｅ）を最終濃度１０Ｕ／ｍｌで培養に添加する。
【００５１】
刺激の１巡目は７〜１０日間継続するが、ＡＡＶカプシドに反応するＣＤ８Ｔ細胞の予想される少ない数のため、通常増殖には２−３巡必要である。増殖の各巡の追加は単純にウェルに新しいペプチド及び３０００ｒａｄで放射線照射した５００，０００同種脾臓細胞を添加することによって行う。
【００５２】
ＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔによるエピトープ探索
ＥＬＩＳｐｏｔは特異的な抗原に反応するＴ細胞の数を同定するため使用される強力な技術である、すなわちＥＬＩＳｐｏｔはペプチドに反応してＩＦＮ−γを分泌する細胞の能力を測定する。５０，０００個の増殖したＴ細胞を抗ヒトＩＦＮ−γ抗体（Ｍａｂ−Ｔｅｃｈ）を先に塗布した９６ウェルＥＬＩＳｐｏｔプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に増殖のため使用されるペプチドの存在下で播種した。３７℃、５％ＣＯ２でインキュベーション２４時間後細胞を洗浄し、抗ヒトＩＦＮ−γビオチン標識２次抗体（Ｍａｂ−Ｔｅｃｈ）をウェルに添加する。ストレプトアビジン−アルカリフォスファターゼを特異的基質の存在下で検出試薬として使用する。
【００５３】
陽性のウェルを最初に添加された１００万個の細胞当たりのスポットを形成する細胞（ｓｐｏｔ ｆｏｒｍｉｎｇ ｃｅｌｌｓ：ＳＦＣ）の数を基に判定する。もしＳＦＣの数が陰性対照コントロールウェル（培地のみ）のＳＦＣの数よりも３倍高いならば、前記ウェルは陽性と判定された。陽性ペプチドは上記に記載されたプロトコールを繰り返すことによって通常少なくとも２回確認された。
【００５４】
その後この方法は興味のある全てのＨＬＡ対立遺伝子に対して繰り返された。
【００５５】
オンライン予想アルゴリズム
２つのオンラインエピトープ予想アルゴリズムプログラムをＥＬＩＳｐｏｔアッセイに使用される１５アミノ酸長ペプチドの中の９アミノ酸配列を同定するのに使用し、その配列はＨＬＡ分子に対する結合配列を表す。これらのプログラムはＲａｎｋｐｅｐ：ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏ．ｄｆｃｉ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／Ｔｏｏｌｓ／ｒａｎｋｐｅｐ．ｈｔｍｌ及びＳＹＦＰＥＩＴＨＩ：ｗｗｗ.ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｄｅ／のインターネット上で見ることができる。
【００５６】
同定された９アミノ酸を合成しＥＬＩＳｐｏｔ及び細胞内サイトカイン染色によって確認する。陽性のペプチドエピトープ配列をその後ＨＬＡ−ペプチド五量体検出薬を合成するために利用する（Ｐｒｏｉｍｍｕｎｅ）。
【００５７】
ＡＡＶ−特異的Ｔ細胞選別及びクローニングのための五量体の使用
特異的なＡＡＶペプチドとともに一度又は二度増殖させた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を適切なＨＬＡペプチド五量体とともに滅菌状態で染色する。分析のみに通常使用された五量体染色に関しては、染色を４℃２０分間２％ヒト血清を含む滅菌ＰＢＳ中で実行する。培養を抗ＣＤ８抗体とともに共染色する。ＰＢＳ−２％ｈＡＢ血清で２回洗浄後、前記細胞を蛍光活性細胞選別器に通し、９６ウェル丸底プレートの１ウェル当たり１個の五量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含むように選別する。細胞を５個から１０個のプレートに選別する。各プレートの各ウェルは同じ日に調製し、支持細胞として放射線照射された同種ＰＢＭＣを含め、ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞株からの放射線照射細胞及びＴ細胞成長因子として５０ＩＵ／ｍｌの組み換えヒトＩＬ−２を加えた商業的に入手可能な抗ＣＤ３Ｔ細胞刺激抗体（ＯＫＴ３）を伴う。選別された（クローン化された）前記細胞をその後２週間３７℃の湿潤恒温器でインキュベートする。
【００５８】
２週間後Ｔ細胞のクローン成長を目視検査によって判定する。成長細胞を五量体染色によるＡＡＶに対する特異性で判定する（上記に記載）。ペプチド特異性を得るクローンを最初の刺激のように同種ＰＢＭＣ、放射線照射ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞、ＯＫＴ３及びＩＬ−２でさらに刺激するが、この作業以外に細胞集団の成長速度によって成長細胞を２４ウェルプレート又はＴ２５フラスコに移動させる。Ｄｒ．Ｃａｓｓｉａｎ Ｙｅｅ及びその同僚の記載のようにクローンを２週毎に再刺激をする（３２）。
【００５９】
一旦少なくとも１００万個のＴ細胞クローンが成長すると、一定分量を標準プロトコールに従って凍結する。この一定分量のＴ細胞クローンを可溶性ＴＣＲ生成のためＡｌｔｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎに提供する。もう１つの方法として我々は成長Ｔ細胞クローンからＲＮＡを分離しＡｌｔｏｒ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅにＲＮＡを提供することもある。この時点のＲＮＡをｃＤＮＡを生成するのに使用し、この材料によって可溶性Ｔ細胞受容体を生成する基礎を作る、以上の作業はこれらの分子を生成する経験を持つグループであるＡｌｔｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅによる（３１）。
【００６０】
我々はＡＡＶエピトープに特異的な可溶性ＴＣＲ受容体をクローン化し特性解析するのに成功し、このＡＡＶエピトープは患者への遺伝子導入を妨げる細胞傷害性Ｔ細胞反応の発生に関連する。本願明細書において記載される前記材料及び方法は診断及び治療双方に使用され、必要とする患者への治療用異種タンパク質の導入を促進する。
【００６１】
本発明の一部の望ましい実施形態を記載し及び特定の実施例を上記に提示したが、本発明はそれらの実施形態に限定されるものではない。様々な改変は次の請求項に記載されるように本発明の要旨に逸脱することなく行われる。
【技術分野】
【０００１】
本願は２００６年５月３１日付で出願された米国特許仮出願第６０／８０９，９５６号に優先権を主張するものであり、その全ての内容がこの参照により本願明細書に取り込まれる。
【０００２】
米国特許法第２０２条（３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§２０２（ｃ））に従って、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）の研究助成金番号ＰＯ１ ＨＬ０７８８１０からの資金で一部なされた本願に記載される本発明の特定権利は、米国政府が有するものであることが認められる。
【背景技術】
【０００３】
本発明は遺伝子治療及び免疫学の分野に関する。より具体的には、本発明はウィルスベクター抗原の存在を検出する組成物及び方法を提供し、ウィルスベクター抗原に対する免疫反応を抑制及び回避する組成物及び方法を含むものである。
【０００４】
複数の出版物と特許文献が本発明に関連する最新の従来技術を説明するために本願明細書の中で参照されている。これらの引用文献の各々は参照により本願明細書に完全に取り込まれる。
【０００５】
野生型アデノウィルス随伴ウィルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ：ＡＡＶ）は〜４．７ｋｂの一本鎖ＤＮＡ遺伝子を持つパルボウィルスである。前記ウィルスは複製機能を自然欠損しており、複製にはアデノウィルス及びヘルペスウィルスのようなヘルパーウィルスを必要とする。前記ウィルスはいかなる疾患にも関連が見出されていないが、その代わりにアデノウィルス分離株の混入物質として最初に分離された（４）。これまでに６個の血清型が記述されており、それらは非常に良く保存された配列を持つ（保存率は６２％〜９９％と異なる）。前記ウィルスの遺伝子は２個の逆方向末端反復配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔｓ：ＩＴＲｓ）によって挟まれており、３個のカプシド（ｃａｐｓｉｄ）遺伝子（ＶＰ１、２、３）及び４個のレップ（ｒｅｐ）タンパク質をコードするものであり、このレップタンパク質はＤＮＡ複製及びＡＡＶ生活環の制御に関わる。最近、さらなる血清型（ＡＡＶ−７、−８、−９）がアカゲザル及びヒトから分離され、ＡＡＶ−１〜６と比較してこれらの血清型もまた６０％よりも高い率で保存されている（５）。
【０００６】
野生型ＡＡＶが遺伝子導入媒体としての使用のために遺伝子操作された。すなわち、レップ（ｒｅｐ）及びキャップ（ｃａｐ）遺伝子を欠損させ、ウィルスＤＮＡ翻訳領域がないように、目的とする治療遺伝子を２個のＩＴＲｓの間に挿入する。１９９０年代の半ばに複数の研究グループ（６〜１０）によって、組み換えＡＡＶが骨格筋、肝臓、中枢神経系（ＣＮＳ）、及び呼吸器官を含む多数の非分裂細胞型に感染し、この組み換えＡＡＶにより免疫学的にコンピテントな動物中で導入遺伝子長期発現が誘導されることが示された。この興味深い知見は多数の研究グループによって利用され、組み換えＡＡＶの投与により小型及び大型動物モデルにおいて遺伝子性疾患が治癒した（１１〜１７）という目覚ましい結果のポートフォリオが現在集まっている。ヒトにおける経験はより限定されるが（１８〜２４）、安全性及び遺伝子導入とその発現が証明されているという観点で有望とされている。しかしながら、ほとんどの例で表現型の修正が起こるほど十分に発現レベルが十分に高くない。
【０００７】
我々の研究の主要目的は、血友病及び他の血液凝固疾患の治療のための安全且つ有効なアデノ随伴ウィルス（ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ：ＡＡＶ）を介した遺伝子導入システムを確立することである。血友病イヌモデルの長期間にわたる血友病の治癒（１）に基づき臨床試験が計画され、その中で重度のＢ型血友病の患者にＡＡＶ−Ｆ．ＩＸ（Ｆａｃｔｏｒ ＩＸ：Ｆ．ＩＸ）経肝動脈注入を行った。１人の患者はベクター注入後第２週目までに１１．８％（治療域レベル）の循環ファクターＩＸを得た。このレベルは約４週間続き、その後徐々に低下し始め、結局患者の基準値<１％に戻った。Ｆ．ＩＸレベルの減少に一致して、血中肝アミノ基転移酵素が上昇し始め、注入後５週で最高値に達し、その後数週間で正常値にまで減少した。このように前記患者は、マウス、ラット、ウサギ、血友病イヌ、及び非ヒト霊長類を含む実験動物で観察されたものとはかなり異なる経過をたどった。実験動物とは対照的に、前記ヒト患者は、ＡＡＶに対する低い中和抗体適定値の存在、並びにＩｇＧ抗体が存在することから推定すればわかるように、既にＡＡＶ−２に対する免疫を持っており、前記患者はリンパ球様分画にＡＡＶに特異的な記憶Ｔ細胞の一群を持っているようであった（２）。同様の所見が前記臨床試験の別の患者でも観察され、この患者での免疫学的研究によりＡＡＶカプシド中の特異的なペプチドに対するＴ細胞反応が立証された。明らかに、前記反応はベクターを注入して数週後、末梢血で検出できたが、注入前には検出できなかった。
【０００８】
これらの知見から遺伝子治療アプローチを有効にするために、一部の例で、導入遺伝子発現細胞のＴ細胞介在型破壊を防ぐために免疫反応を調節することが必要であるのは明らかである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｍｏｕｎｔ ＪＤ，Ｈｅｒｚｏｇ ＲＷ，Ｔｉｌｌｓｏｎ ＤＭ，ｅｔ ａｌ．Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ｂ ｄｏｇｓ ｗｉｔｈ ａ ｆａｃｔｏｒ ＩＸ ｎｕｌｌ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｂｙ ｌｉｖｅｒ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｂｌｏｏｄ．２００２；９９：２６７０−２６７６．
【非特許文献２】Ａｐｐａｙ Ｖ，Ｒｏｗｌａｎｄ−Ｊｏｎｅｓ ＳＬ．Ｌｅｓｓｏｎｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｔ−ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ｈｕｍａｎ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｓｅｍｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４；１６：２０５−２１２．
【非特許文献３】Ｍａｎｎｏ ＣＳ，Ａｒｒｕｄａ ＶＲ，Ｐｉｅｒｃｅ ＧＦ，ｅｔ ａｌ．Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｖｅｒ ｉｎ ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ ｂｙ ＡＡＶ−Ｆａｃｔｏｒ ＩＸ ａｎｄ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ ｉｍｐｏｓｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｈｏｓｔ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｎａｔ Ｍｅｄ．２００６；１２：３４２−３４７．
【非特許文献４】Ｂｌａｃｋｌｏｗ ＮＲ，Ｈｏｇｇａｎ ＭＤ，Ｓｅｒｅｎｏ ＭＳ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｓｅｒｏｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｉｎｆａｎｔｓ ａｎｄ ｃｈｉｌｄｒｅｎ．Ａｍ Ｊ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．１９７１；９４．
【非特許文献５】Ｇａｏ ＧＰ，Ａｌｖｉｒａ ＭＲ，Ｗａｎｇ Ｌ，Ｃａｌｃｅｄｏ Ｒ，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ Ｊ，Ｗｉｌｓｏｎ ＪＭ．Ｎｏｖｅｌ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ ｆｒｏｍ ｒｈｅｓｕｓ ｍｏｎｋｅｙｓ ａｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００２；９９：１１８５４−１１８５９．
【非特許文献６】Ｘｉａｏ Ｘ，Ｌｉ Ｊ，Ｓａｍｕｌｓｋｉ ＲＪ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ ｍｕｓｃｌｅ ｔｉｓｓｕｅ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｍｉｃｅ ｂｙ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ．ｊ Ｖｉｒｏｌ．１９９６；７０：８０９８−８１０８．
【非特許文献７】Ｋｅｓｓｌｅｒ ＰＤ，Ｐｏｄｓａｋｏｆｆ ＧＭ，Ｃｈｅｎ Ｘ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９６；９３：１４０８２−１４０８７．
【非特許文献８】Ｆｌｏｔｔｅ ＴＲ， Ａｆｉｏｎｅ ＳＡ， Ｃｏｎｒａｄ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｓｔａｂｌｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｗｉｔｈ ａｎ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９３；９０：１０６１３−１０６１７．
【非特許文献９】Ｋａｐｌｉｔｔ ＭＧ，Ｌｅｏｎｅ Ｐ，Ｓａｍｕｌｓｋｉ ＲＪ，ｅｔ ａｌ．Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｂｒａｉｎ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１９９４；８：１４８−１５４．
【非特許文献１０】Ｆｌｏｔｔｅ ＴＲ，Ｃａｒｔｅｒ ＢＪ．Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９５；２：３５７−３６２．
【非特許文献１１】Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｒｎａｕｔｅ Ｒ，Ｈａｒｖｅｙ−Ｗｈｉｔｅ Ｊ，Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ Ｊ，Ｂａｎｋｉｅｗｉｃｚ ＫＳ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ａｒｏｍａｔｉｃ Ｌ−ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｓｔｒｉａｔｕｍ ｏｆ ６−ＯＨＤＡ−ｌｅｓｉｏｎｅｄ ｒａｔｓ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００１；４：３２４−３３０．
【非特許文献１２】Ａｃｌａｎｄ ＧＭ，Ａｇｕｉｒｒｅ ＧＤ，Ｒａｙ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｒｅｓｔｏｒｅｓ ｖｉｓｉｏｎ ｉｎ ａ ｃａｎｉｎｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ ｂｌｉｎｄｎｅｓｓ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．２００１；２８：９２−９５．
【非特許文献１３】Ｈｏ ＴＴ，Ｍａｇｕｉｒｅ ＡＭ，Ａｇｕｉｒｒｅ ＧＤ，ｅｔ ａｌ．Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｒｅｓｃｕｅ ａｆｔｅｒ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ４−ｓｕｌｆａｔａｓｅ ｔｏ ｔｈｅ ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ｏｆ ｆｅｌｉｎｅ ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ ＶＩ．Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．２００２；４：６１３−６２１．
【非特許文献１４】Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ Ｈ，Ｈａｙａｋａｗａ Ｈ，Ｍｉｇｉｔａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ａｎ ＡＡＶ−ｄｅｒｉｖｅｄ Ａｐａｆ−１ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ＭＰＴＰ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｓ ａｎｔｉａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００１；９８：１０９１８−１０９２３．
【非特許文献１５】Ｙｕｅ Ｙ，Ｌｉ Ｚ，Ｈａｒｐｅｒ ＳＱ，Ｄａｖｉｓｓｏｎ ＲＬ，Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ ＪＳ，Ｄｕａｎ Ｄ．Ｍｉｃｒｏｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ ｒｅｓｔｏｒｅｓ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｓａｒｃｏｌｅｍｍａ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｍｄｘ ｍｏｕｓｅ ｈｅａｒｔ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２００３；１０８：１６２６−１６３２．
【非特許文献１６】Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ Ｏ，Ｂｏｔｈ Ｍ，Ｇｉｌｌｉｓ ＪＭ，Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ ＪＳ，Ｆｉｎｋ ＲＨ．Ｍｉｎｉ−ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｒｅｓｔｏｒｅｓ ｌ−ｔｙｐｅ ｃａｌｃｉｕｍ ｃｕｒｒｅｎｔｓ ｉｎ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｄｘ ｍｉｃｅ．Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００３．
【非特許文献１７】Ｗａｔｃｈｋｏ Ｊ，Ｏ’Ｄａｙ Ｔ，Ｗａｎｇ Ｂ，ｅｔ ａｌ．Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｉｎｉｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ ｍｕｓｃｌｅ ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍｄｘ ｍｉｃｅ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００２；１３：１４５１−１４６０．
【非特許文献１８】Ｆｌｏｔｔｅ Ｔ，Ｃａｒｔｅｒ Ｂ，Ｃｏｎｒａｄ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｐｈａｓｅ Ｉ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ａｎ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ−ＣＦＴＲ ｇｅｎｅ ｖｅｃｔｏｒ ｉｎ ａｄｕｌｔ ＣＦ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｉｌｄ ｌｕｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９６；７：１１４５−１１５９．
【非特許文献１９】Ｗａｇｎｅｒ ＪＡ，Ｍｅｓｓｎｅｒ ＡＨ，Ｍｏｒａｎ ＭＬ，ｅｔ ａｌ．Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａｎ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ−ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ（ＡＡＶ−ＣＦＴＲ）ｉｎ ｔｈｅ ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｍａｘｉｌｌａｒｙ ｓｉｎｕｓ．Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ．１９９９；１０２（２ Ｐｔ １）：２６６−２７４．
【非特許文献２０】Ｗａｇｎｅｒ ＪＡ，Ｎｅｐｏｍｕｃｅｎｏ ＩＢ，Ｍｅｓｓｎｅｒ ＡＨ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｐｈａｓｅ ＩＩ， ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ， ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ， ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌ ｏｆ ｔｇＡＡＶＣＦ ｕｓｉｎｇ ｍａｘｉｌｌａｒｙ ｓｉｎｕｓ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｗｉｔｈ ａｎｔｒｏｓｔｏｍｉｅｓ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００２；１３：１３４９−１３５９．
【非特許文献２１】Ｗａｇｎｅｒ ＪＡ，Ｒｅｙｎｏｌｄｓ Ｔ，Ｍｏｒａｎ ＭＬ，ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ＡＡＶ−ＣＦＴＲ ｉｎ ｍａｘｉｌｌａｒｙ ｓｉｎｕｓ．Ｌａｎｃｅｔ．１９９８；３５１（９１１７）：１７０２−１７０３．
【非特許文献２２】Ｗａｇｎｅｒ ＪＡ，Ｍｏｒａｎ ＭＬ，Ｍｅｓｓｎｅｒ ＡＨ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｐｈａｓｅ Ｉ／ＩＩ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｇＡＡＶ−ＣＦ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ｓｉｎｕｓｉｔｉｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９８；９：８８９−９０９．
【非特許文献２３】Ｋａｙ ＭＡ，Ｍａｎｎｏ ＣＳ，Ｒａｇｎｉ ＭＶ，ｅｔ ａｌ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆａｃｔｏｒ ＩＸ ｉｎ ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ｂ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．２０００；２４：２５７−２６１．
【非特許文献２４】Ｍａｎｎｏ ＣＳ，Ｃｈｅｗ ＡＪ，Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ Ｓ，ｅｔ ａｌ．ＡＡＶ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ＩＸ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｅｖｅｒｅ ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ｂ．Ｂｌｏｏｄ．２００３；１０１：２９６３−２９７２．
【非特許文献２５】Ｃｈｉｒｍｕｌｅ Ｎ，Ｐｒｏｐｅｒｔ Ｋ，Ｍａｇｏｓｉｎ Ｓ，Ｑｉａｎ Ｙ，Ｑｉａｎ Ｒ，Ｗｉｌｓｏｎ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ａｎｄ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９９；６：１５７４−１５８３．
【非特許文献２６】Ｈｏｌｌｅｒ ＰＤ，Ｃｈｌｅｗｉｃｋｉ ＬＫ，Ｋｒａｎｚ ＤＭ．ＴＣＲｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｆｏｒ ｆｏｒｅｉｇｎ ｐＭＨＣ ｓｈｏｗ ｓｅｌｆ−ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３；４：５５−６２．
【非特許文献２７】Ｌａｕｇｅｌ Ｂ，Ｂｏｕｌｔｅｒ ＪＭ，Ｌｉｓｓｉｎ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｆｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００５；２８０：１８８２−１８９２．
【非特許文献２８】Ｏ’Ｈｅｒｒｉｎ ＳＭ，Ｌｅｂｏｗｉｔｚ ＭＳ，Ｂｉｅｌｅｒ ＪＧ，ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ−ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｕｓｉｎｇ ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｓｏｌｕｂｌｅ ｄｉｖａｌｅｎｔ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１９９７；１８６：１３３３−１３４５．
【非特許文献２９】Ｐｅｎｇ ＫＷ，Ｈｏｌｌｅｒ ＰＤ，Ｏｒｒ ＢＡ，Ｋｒａｎｚ ＤＭ，Ｒｕｓｓｅｌｌ ＳＪ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｖｉｒｕｓ ｅｎｔｒｙ ａｎｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｕｓｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ／ＭＨＣ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００４；１１：１２３４−１２３９．
【非特許文献３０】Ｓｕｂｂｒａｍａｎｉａｎ ＲＡ，Ｍｏｒｉｙａ Ｃ，Ｍａｒｔｉｎ ＫＬ，ｅｔ ａｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｅｔｒａｍｅｒｓ ｂｉｎｄ ＭＨＣ−ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００４；２２：１４２９−１４３４．
【非特許文献３１】Ｚｈｕ Ｘ，Ｂｅｌｍｏｎｔ ＨＪ，Ｐｒｉｃｅ−Ｓｃｈｉａｖｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐ５３（２６４−２７２）／ＨＬＡ−Ａ＊０２０１ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｏｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｂｙ ａ ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ ｓｏｌｕｂｌｅ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６；１７６：３２２３−３２３２．
【非特許文献３２】Ｙｅｅ Ｃ，Ｓａｖａｇｅ ＰＡ，Ｌｅｅ ＰＰ，Ｄａｖｉｓ ＭＭ，Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ ＰＤ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ ａｖｉｄｉｔｙ ｍｅｌａｎｏｍａ−ｒｅａｃｔｉｖｅ ＣＴＬ ｆｒｏｍ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ−ＭＨＣ ｔｅｔｒａｍｅｒｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９；１６２：２２２７−３４．
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明ではヒトＭＨＣクラスＩ分子上のアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）に存在するペプチド配列に対して免疫学的に特異的な可溶性Ｔ細胞受容体（ｓｏｌｕｂｌｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｓＴＣＲ）が開示される。望ましい実施形態において、前記アデノウィルスペプチド配列は、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ-２、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−８及び他の自然発生血清型から成る群から選択される血清型から得られる。特定の望ましい実施形態において、前記ペプチドは表１に示される配列を持ち、前記ヒトＭＨＣクラスＩ分子はＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２，ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ８、ＨＬＡ−Ｂ１５、ＨＬＡ−Ｂ４４、及びＨＬＡ−Ｂ５１から成る群から選択される。
【００１１】
また本発明は、導入遺伝子含有アデノ随伴ウィルスベクター投与前、投与中、投与後のウィルスカプシド抗原に対するＴ細胞介在型免疫反応の存在を検出する方法を含む。典型的な方法は、患者からＴ細胞を含む生物学的試料を得る工程と、ＭＨＣクラスＩ分子上の前記カプシドペプチドエピトープを含む五量体又は四量体に前記細胞を接触させる工程と、及び未処理のコントロール細胞と比較して前記接触が前記Ｔ細胞を刺激するかどうかを決定する工程とを含み、細胞は前記接触によって刺激され前記ウィルスカプシドの前記ペプチドエピトープに対する特異性を有しており、この特異性がカプシド及び導入遺伝子含有細胞のＴ細胞介在型破壊に関連する。前記方法はまた刺激を受けた前記Ｔ細胞からのｍＲＮＡの分離工程と、ｃＤＮＡを調製する工程と、前記ウィルスカプシド抗原に対して免疫学的特異性のある可溶性Ｔ細胞受容体をクローン化する工程とを含む。
【００１２】
前記方法によって調製される可溶性Ｔ細胞受容体もまた本発明に含まれる。
【００１３】
もう１つの態様において、アデノウィルス随伴ベクター投与後のウィルス性形質導入細胞のＴ細胞介在型破壊の抑制方法が開示される。典型的な方法は、ＡＡＶエピトープ／ＭＨＣ複合体に特異的なｓＴＣＲの有効量を提供する工程を含み、問題となるカプシドペプチドへの自然発生Ｔ細胞の結合阻害を介して、前記ｓＴＣＲは前記導入遺伝子含有細胞のＴ細胞介在型破壊を防ぐ。そのような結合阻害はＣＴＬ活性化を防ぐ。
【００１４】
また、ウィルス性形質導入細胞のＴ細胞介在型破壊を回避する方法を提供し、この方法は、上述したようにＡＡＶペプチドエピトープに対する特異性を検出する工程と、前記ＡＡＶベクターを改変し同定したペプチドエピトープを除去する工程とを含む。改変後修飾されたＡＡＶベクターが前記患者に投与され、その改変はウィルス性形質導入細胞のＴ細胞介在型破壊を抑止するものである。そのような改変ＡＡＶベクターはまた本発明のさらなる態様を含む。望ましい実施形態において、そのようなＡＡＶベクターは表１で示されるＡＡＶエピトープを欠失するように改変される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は導入遺伝子含有ＡＡＶベクターで処理した患者からの分離末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）中のＴ細胞反応の時間的経過を示したグラフを表したものである。
【図２Ａ】図２ＡはＡＡＶカプシドＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔの結果を示したグラフである。ＡＡＶ由来ペプチドによってインビトロで再刺激されたヒトリンパ球はＩＦＮ−γを産生する。
【図２Ｂ】図２ＢはＡＡＶカプシド由来免疫優性エピトープを用いた数回のインビトロ刺激（ＩＶＳ）を通して正常なドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）からＡＡＶ−特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞がインビトロで増殖することを表す一連の散布図を示したものである。
【図３】ＡＡＶ血清型１〜８で非常に良く保存されている、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって同定された（下線）異なるＴ細胞エピトープを示したものである。配列ＩＤ番号１〜１８を示す。
【図４Ａ】図４Ａ及び４Ｂは流動選別し、続いてインビトロで増加させた２つのＣＤ８＋Ｔ細胞クローンの一対の散布図である。これらのクローンはｍＲＮＡ源となり、本願明細書で記載される可溶性Ｔ細胞受容体を合成するのに使用される。
【図４Ｂ】図４Ａ及び４Ｂは流動選別し、続いてインビトロで増加した２つのＣＤ８＋Ｔ細胞クローンの一対の散布図である。これらのクローンはｍＲＮＡ源となり、本願明細書で記載される可溶性Ｔ細胞受容体を合成するのに使用される。
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｅは下記に説明されるＣＴＬクローンに対するＴＣＲの配列を示したものである。
【図５Ｂ】図５Ａ〜５Ｅは下記に説明されるＣＴＬクローンに対するＴＣＲの配列を示したものである。
【図５Ｃ】図５Ａ〜５Ｅは下記に説明されるＣＴＬクローンに対するＴＣＲの配列を示したものである。
【図５Ｄ】図５Ａ〜５Ｅは下記に説明されるＣＴＬクローンに対するＴＣＲの配列を示したものである。
【図５Ｅ】図５Ａ〜５Ｅは下記に説明されるＣＴＬクローンに対するＴＣＲの配列を示したものである。
【図６】図６はＡＡＶ−ａ−ｓｃＴＣＲ−ＢｉｒＡ及びＡＡＶ−ｂ−ｓｃＴＣＲ−ＢｉｒＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥである。レーン１、標準分子量、レーン２、ＡＡＶ−ａ−ｓｃＴＣＲ−ＢｉｒＡ、レーン３、ＡＡＶ−ｂ−ｓｃＴＣＲ−ＢｉｒＡ。
【図７Ａ】図７ＡはＥＬＩＳＡによる精製ＡＡＶ−ｓｃＴＣＲｓのＷ４Ｆ検出を示すグラフである。
【図７Ｂ】図７ＢはＥＬＩＳＡによる精製ＡＡＶ−ｓｃＴＣＲｓの五量体検出を示すグラフである。
【図８】図８はＡＡＶ−ｓｃＴＣＲ多量体のｐ７４／ＨＬＡ−Ｂ７結合活性を示すプロットである。
【図９】図９Ａ及び９ＢはＡＡＶ−ｓｃＴＣＲ多量体のｐ７４／ＨＬＡ−Ｂ７結合のヒストグラムを示すものである。
【図１０】図１０Ａ及び１０Ｂは１対のヒストグラムであり、ＡＡＶ−ｓｃＴＣＲ多量体を使用したペプチド負荷した線維芽細胞のインビトロ染色を示したものである。
【図１１】図１１Ａ及び１１Ｂは一対のヒストグラムであり、ＡＡＶ−ｓｃＴＣＲ多量体を使用したＡＡＶ−形質導入ＨＬＡ−Ｂ＊０７０２ヒト線維芽細胞のインビトロ染色を示したものである。
【図１２】図１２Ａ及び１２Ｂは一対のヒストグラムで、ＡＡＶの１Ｅ１１ベクター遺伝子（ｖｅｃｔｏｒ ｇｅｎｏｍｅｓ：ｖｇ）静注後一週間のＨＬＡ８ Ｂ＊０７０２マウスから集めたＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１９−細胞のＡＡＶ−ｓｃＴＣＲ多量体染色を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
ウィルスベクターを遺伝子導入媒体として使用するため遺伝子操作し、遺伝的欠陥を修正した。しかしながら、本発明に従ってウィルスベクターの導入遺伝子投与後、前記修正を受けた肝臓細胞が内部にベクターカプシドタンパク質を持つことが明らかになった。これらのタンパク質はＴ細胞により検出され、前記修正を受けた細胞は次々に破壊される。従って、本発明の一つの態様は、遺伝子導入の標的組織中のウィルスベクター抗原の存在を検出するための新しい試薬として、可溶性Ｔ細胞受容体（ｓＴＣＲ）の使用を伴う。ウィルス性ベクター配列又はカプシドタンパク質を検出する従来の方法は、ＰＣＲ又は免疫特異性のある抗体を使用していた。しかしながら、臨床的により関連のある形態は宿主Ｔ細胞と接触するベクターカプシド、すなわち宿主ＭＨＣクラスＩ上に提示されているカプシド由来ペプチドである。可溶性ＴＣＲが自然発生Ｔ細胞で観察されるものと類似の様式でカプシド抗原のこの形態を認識することが開示される。さらに、このような試薬がベクター由来抗原の存在に関し形質導入組織を直接的且つ定量的に判定するために使用されることが可能である。この情報は免疫抑制療法を中止するかどうか又は中止する時を決定するために必要な情報を臨床医に提供する。
【００１７】
本発明のもう１つの態様では、可溶性ＴＣＲ試薬は、宿主Ｔ細胞が同種ベクター抗原に接触するのを特異的に阻害する特異的免疫調節治療法として使用される可能性がある。従って、本願明細書で記載される分子は診断及び治療薬の双方で使用される。
【００１８】
様々なＡＡＶの血清型が導入遺伝子の分野において使用され、またヒト集団におけるＨＬＡ型にも大きなばらつきがある。従って、本発明は、１）多形ＨＬＡ拘束性エピトープ及び２）遺伝子療法ベクターで使用される特定のＡＡＶ血清型に特異性を持つように設計された可溶性ＴＣＲｓが含まれる。
【００１９】
代替ＡＡＶベクター血清型及びそれらのＴ細胞拘束性エピトープ
様々なＡＡＶ血清型、特にＡＡＶ−１、２、５及び８の類似した配列にも関わらず、ある自然発生ＡＡＶウィルスのエピトープに対して反応するＴ細胞が、遺伝子治療ベクターとして使用される代替血清型ウィルスに交差反応しないという可能性がある。なぜならばＴ細胞受容体はＭＨＣクラスＩに拘束された小さなペプチド（９〜１１アミノ酸）のみを認識し、更にＴ細胞受容体は非常に高い特異性を持つため、ＡＡＶ−２エピトープに反応するＴ細胞が、例えばアミノ酸１個のみが異なるＡＡＶ−８のエピトープを認識するかもしれないし認識しないかもしれない。さらに、いかなるＡＡＶウィルスからのペプチドエピトープであっても個々のＨＬＡ型（ヒトのＭＨＣ）によって拘束される。このように、幾つかのＴ細胞拘束性ＡＡＶエピトープがＡＡＶ血清型中に保存される可能性に基づき、我々は、集団において通常見られるＨＬＡ−Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ｂ７、Ｂ８、Ｂ１５、Ｂ４４及びＢ５１を含むＨＬＡ型に拘束される複数の血清型から多様なＡＡＶエピトープを同定した。実際、我々はＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２及びＡＡＶ−８からの数個の候補エピトープのライブラリーを機能アッセイにおいて発達させた（表１）。可溶性ＴＣＲｓのベクターカプシド配列検出に対する応用は、我々が既に有するＨＬＡ−Ｂ７拘束性の１つのＡＡＶエピトープ（ＡＡＶ−２ＶＰＱＹＧＹＬＴＬ）から、推定遺伝子治療ベクターとして現在使用中のあらゆるＡＡＶ血清型の多数のエピトープへと容易に広げられる可能性がある。
【００２０】
ＭＨＣクラスＩ五量体及び可溶性ＴＣＲｓの産生だけでなく、免疫優性エピトープを同定することは、ＡＡＶカプシドタンパク質を遺伝子操作するのに有用であり、不要なエピトープが除去される。一旦エピトープが分かると、ＡＡＶカプシド配列中の一致する配列は標準的な分子生物学／組み換えＤＮＡ技術を用いて除去される。このように本発明のもう１つの態様はカプシドを再遺伝子操作する工程を含み、同定されたＴ細胞エピトープを改変する。これによって上に記載された特異的Ｔ細胞反応を避けるベクターが得られる。ここで留意するべき点はこれによって一連のベクターが生じ、それぞれが任意のＭＨＣハプロタイプ特異的であり、これらのベクターは従来の臨床試験で見られたＴ細胞反応を回避するだろうということである（３）。本発明は表１のデータによって示されるように全てのＡＡＶ血清型に適用されるだろう。
【００２１】
【表１】
【００２２】
可溶性ＴＣＲ技術の使用
ｓＴＣＲｓは免疫調節薬として利用することが可能である。例えば、可溶性ＴＣＲはＴ細胞によるエピトープ−ＭＨＣクラスＩ複合体認識を阻害するのに使用することができ、従って、遺伝子導入目的のＡＡＶベクター導入に続く有害なＴ細胞反応を防ぐ。この目的では、可溶性ＴＣＲはＡＡＶベクター導入直前又は導入時に投与されるだろう。
【００２３】
ｓＴＣＲｓはＡＡＶ注入組織の表面上にあるＡＡＶカプシドエピトープの染色のための試薬として使用されてもよい。遺伝子治療の分野におけるもっとも重要な疑問の一つはどのくらいの期間細胞内ＡＡＶカプシド分解に由来する前記ペプチドがＭＨＣ分子複合体の膜表面に提示され、免疫系によって検出可能かどうかである。本願明細書において記載される可溶性ＴＣＲ試薬は生検組織のＡＡＶエピトープ−ＭＨＣ複合体を染色する利点を活かして使用することも可能であり、ＡＡＶカプシド抗原提示の持続時間を決定するのに役立つ。遺伝子治療を受けている患者がＡＡＶカプシドに対する有害な免疫反応の高まる危険性に晒されている時間の範囲を決定することは有効な免疫抑制レジメンを設定するのに必須である。
【００２４】
下記に記載の定義は本発明の理解を助けるために提供される。
【００２５】
本願明細書で使用される「可溶性Ｔ細胞受容体又はｓＴＣＲ」という語句は可溶性Ｔ細胞抗原受容体（単量体又は多量体）を指し、ウィルス感染細胞上のＭＨＣ分子に提示されるペプチド抗原を判定するのに使用される。可溶性ＴＣＲはフローサイトメトリー及び免疫組織化学での使用のため異なる標識分子に随意に結合されてもよい。Ｔ細胞受容体を生成する方法が米国特許第６，０８０，８４０号明細書、国際公開第ＷＯ／２００５／１１６６４６号パンフレット及びＢｏｕｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １６：７０７−７１１に開示される。
【００２６】
五量体はペプチドエピトープに結合した５個のＭＨＣクラスＩ分子の複合体である。全５個の複合体が平面構造に保持されておりＴ細胞受容体に結合するのに利用されている。五量体は随意に蛍光色素に結合されフローサイトメトリーによって同種抗原特異的なＴ細胞を検出する。ここで留意すべき点は四量体技術もまた利用可能であり４個のＭＨＣクラスＩ分子の複合体がペプチドエピトープに結合する。
【００２７】
「五量体又は四量体染色」はＴ細胞を五量体又は四量体と混合し、４度で３０分インキュベートし、１％ＦＢＳ含有ＰＢＳで洗浄し、フローサイトメトリーで検出する過程を指す。染色アッセイを行うのに適した試薬はＰｒｏＩｍｍｕｎｅから商業的に入手可能である。
【００２８】
「細胞傷害性Ｔ細胞反応」という語句はエフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞が標的細胞を殺すＴ細胞介在型破壊過程を指し、その標的細胞はＭＨＣクラスＩ分子に結合するエピトープを外側表面に提示する。
【００２９】
次の実施例は本発明のある実施形態を説明するために提供される。それは本発明をどんな意味においても本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００３０】
上に言及したように、血友病治療のための従来の遺伝子治療において、導入遺伝子の発現は初期には高かったが、時間の経過につれて肝酵素が僅かに上昇し導入遺伝子発現は消失した。ベクター導入前及び後の患者からの末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）を使用し、我々はＭＨＣクラスＩ拘束性ＡＡＶカプシドエピトープを定義し（３）、ＡＡＶに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を検出する五量体性ＨＬＡ−Ｂ＊０７０２／ＡＡＶペプチド（五量体）の可溶型を合成することができた。これらの五量体を使用して、我々は特異的なＡＡＶエピトープに対する前記患者末梢血の特定のＴ細胞増殖の経時的変化を検出することができ、それは肝アミノ基転移酵素の上昇及び導入遺伝子発現の低下に一致していた。図１を参照。観察された前記Ｔ細胞増殖はＭＨＣ／ペプチド抗原の存在している時のみに観察された。このように本願明細書において提示される証拠は細胞傷害性Ｔ細胞が形質導入肝細胞によって提示されたベクターカプシドタンパク質に反応するということを明示する。ベクターカプシドタンパク質がベクター導入後限られた時間内に存在することを考慮して、本願明細書で開示される方法は免疫抑制の必要がある患者の４ヶ月の免疫抑制治療を含み、ベクター導入時前後にＴ細胞機能を一時的に停止する。
【００３１】
Ｔ細胞反応刺激には樹状細胞のような専門の抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ：ＡＰＣｓ）による抗原提示が必要であると考えられている。専門のＡＰＣｓは末梢に存在し、それらは直接感染又はウィルス感染細胞の貪食のいずれかによってウィルス抗原に遭遇する（交差提示）。樹状細胞は抗原を処理し、末梢のリンパ節に移動し、ＭＨＣクラスＩ及びＩＩ上の抗原及び適正な共刺激を未感作Ｔ細胞に提示する。最初の急速な増殖後、ＡＡＶに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の発生頻度は減少し少数の貯蔵された記憶Ｔ細胞を後に残すことが予想され、この記憶Ｔ細胞は恒常的な維持増殖を通して各個人の一生涯の間保持される（２）。一旦適応した免疫システムが刺激されると、専門のＡＰＣｓによる共刺激及び抗原提示の必要性は厳密ではなくなり、全ての有核細胞が持つＭＨＣクラスＩ上にのみウィルス抗原を提示する細胞を記憶Ｔ細胞は認識し殺す。ＡＡＶ−２はＴ細胞反応刺激に必要な炎症反応を自分自身では誘導しないが、自然感染がヘルパーウィルスと一緒に起こるため、その時点でヘルパーウィルス及びＡＡＶ双方の抗原に対して誘導されるＣＤ８＋Ｔ細胞が刺激される。
【００３２】
Ｔ細胞刺激に必要な炎症反応は抗体に再遭遇する記憶Ｔ細胞を新たに動員し活性化するために必須ではない。実験動物とは異なり、ヒトは幼少時にＡＡＶ−２に自然感染する。一般的なヒト集団におけるＡＡＶに対するＴ細胞反応分析報告はほとんどない。Ｃｈｉｒｍｕｌｅらは正常コントロールの５％が組み換えＡＡＶとともにＰＢＭＣをインキュベーション後>２の刺激係数を示したと報告した（２５）。それ以来、Ｔ細胞分析のより感受性の高く定量的なアッセイが発達し、ヒト患者での抗ウィルスＴ細胞反応の詳細な特性解析が行われた。我々は数人の健常成人ドナーのＡＡＶに対するＴ細胞反応を記録することができ、ウィルスカプシドに対する記憶Ｔ細胞反応はＡＡＶベクターを使用する遺伝子導入研究における蔓延した問題であることを示した。ヒトリンパ球はＡＡＶカプシドタンパク質配列由来ペプチドエピトープとともにインビトロで増殖させることができる。増殖した細胞はＩＦＮ−γを生成することによってエピトープに反応し（図２Ａ）及びＡＡＶ特異性ＭＨＣクラスＩ五量体で染色することができる（図２Ｂ）。図３はＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって同定された一連の異なるＴ細胞エピトープ（下線を参照）を説明し、それらはＡＡＶ血清型１−８で非常に良く保存されている。
【００３３】
遺伝子治療ベクターにはウィルスＤＮＡがないため、ＭＨＣクラスＩによってＴ細胞に提示される唯一のウィルス抗原は導入ベクターのカプシドタンパク質であり、それは限定された時間内に存在するべきである。しかしながら免疫学的に検出可能な形でカプシドが存在する時間の長さを決定する直接的な方法はない。我々は臨床試験から継続した４ヶ月の免疫抑制治療を選択したが、この時間枠はカプシド分解の動力学の確かな根拠に基づいていない。カプシドが存在する時間を決定する１つの理由は免疫抑制を中止し遺伝的修正を受けた細胞を保つ時期を決定するためである。
【００３４】
複数の研究が行われ、それぞれ異なる間接的方法でどれくらいの期間ベクターカプシドが存在するかを決定した。臨床試験において、我々は生体内分布研究にＰＣＲを使用し時間の経過とともにベクター遺伝子の存在を検出した。しかしながら、ＰＣＲはベクターＤＮＡを検出するものであり、ベクターＤＮＡは問題となっているＴ細胞によって認識される形のものではない。同様にベクターカプシドに対する抗体もＴ細胞によって認識される形のベクターを検出しない。なぜならこのＴ細胞はＭＨＣ＋ペプチド複合体の形の中でも抗原部分だけを認識するからである。我々の研究室はまた同じ疑問に対処するため動物モデルの研究も行っている。しかしながら、我々は最終的にヒト患者で、遺伝子導入の標的となった特定の組織における、及び我々が使用する異なるいずれのＡＡＶ血清型に対するカプシドの持続性を決定する必要があるだろう、（我々の研究室はＡＡＶ−２に焦点をあてているが、他の遺伝子治療研究室はＡＡＶ−１、ＡＡＶ−５、及び／又はＡＡＶ−８又はこれらのキメラに焦点を当てている）。このようにベクター形質導入組織に対するＴ細胞反応を基にした機能アッセイが本願明細書で開示されるが、理想的にはこれらのデータは記載されている可溶性ＴＣＲｓを使用したデータと組み合わせて解釈される。これらのｓＴＣＲｓによってカプシドの存在を直接定量的に決定でき、もし生検組織試料が利用できるのであればベクターで治療された個人のヒト患者中においても決定できる。
【００３５】
上記のように、ヒトリンパ球をＡＡＶカプシドタンパク質配列由来のペプチドエピトープとともにインビトロで増殖させた。増殖した細胞はＩＦＮ−γを生成することによってエピトープに反応し、ＡＡＶ特異的なＭＨＣクラスＩ五量体で染色される（図２Ａ及び２Ｂ）。
【００３６】
ＡＡＶ特異的ＭＨＣクラスＩ五量体を使用して、増殖したカプシド特異性のあるＣＤ８＋Ｔ細胞の流動選別を行いＣＤ８＋Ｔ細胞のクローンを選択する可能性がある（図４Ａ及び４Ｂ）。
【００３７】
２つの異なるヒトＡＡＶ−ｐ７４ペプチド特異性のあるＣＴＬクローンをＴ細胞受容体（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＴＣＲ）に特異的プライマーを使用するＳＭＡＲＴ−ＲＡＣＥ法によってＴＣＲα及びβ鎖ｃＤＮＡを生成するために使用した。ｃＤＮＡ生成物をクローン化して配列を解読した。２個のＴＣＲα鎖遺伝子（ＡＶ１７／ＴＲＡＪ４３；配列ＩＤ番号１９、及びＡＶ１７／ＡＪ３１；配列ＩＤ番号２０）及び１個のＴＣＲβ鎖遺伝子（ＢＶ６−２／ＢＪ１−１；配列ＩＤ番号２１）をＣＴＬクローンａからクローン化した。１個のＴＣＲα鎖遺伝子（ＡＶ２７／ＡＪ２０；配列ＩＤ番号２２）及び１個のＴＣＲβ鎖遺伝子（ＢＶ４−３／ＢＪ２−７；配列ＩＤ番号２３）をＣＴＬクローンｂからクローン化した。２個のＣＴＬクローンに対するＴＣＲの配列が図５Ａ〜５Ｅに提供される。
【００３８】
同定された２個のα鎖を基に、細菌ビオチンリガーゼに融合した１個のｓｃＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ−ＢｉｒＡコンストラクト）をクローンｂに生成し、２個の異なるｓｃＴＣＲ−ＢｉｒＡコンストラクトをクローンａに生成した。３個の発現ベクターを生成し、ＣＨＯ細胞に形質移入し、特性解析のための可溶性ｓｃＴＣＲ−ＢｉｒＡ融合タンパク質を生成した。３個の全てのｓｃＴＣＲをＡＡＶ−ｓｃＴＣＲ形質移入ＣＨＯ細胞に発現させ、ＡＴＣＣから入手可能な抗ヒトＴＣＲ−β鎖抗体、（ＢＦ１−）８Ａ３．３１及びＷ４Ｆ．５Ｂを使用したサンドウィッチＥＬＩＳＡによって細胞培養上清中に検出した。クローンｂ ｓｃＴＣＲ及びクローンａ ｓｃＴＣＲｓ（ＡＶ１７／ＡＪ３１：ＢＶ６−２／ＢＪ１−１）含有細胞培養上清はＥＬＩＳＡによって検出されるＡＡＶｐ７４五量体活性を示し、さらに上清を特性解析した。ＡＡＶ−ｓｃＴＣＲ−ＢｉｒＡ融合タンパク質をＡＡＶ−ｓｃＴＣＲ−ＢｉｒＡ形質移入体の培養上清からＢＦ１−アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。精製融合タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに示した（図６）。ＡＡＶ−ａ及びＡＡＶ−ｂ培養上清からの融合タンパク質精製量は各々４ｍｇ／Ｌ及び０．２ｍｇ／Ｌであった。精製ｓｃＴＣＲ−ＢｉｒＡ融合タンパク質の特性解析をＥＬＩＳＡによって行った。図７Ａ及び７Ｂを参照。精製ＡＡＶ−ｐ７４−ｓｃＴＣＲ−ＢｉｒＡ融合タンパク質を抗ＴＣＲ抗体が認識するか否かを決定するために、融合タンパク質の連続希釈したものを抗ＴＣＲ ＢＦ１ ｍＡｂ塗布プレートでインキュベートし、その後ビオチン標識抗ＴＣＲ Ｗ４Ｆ ｍＡｂ及びＳＡ−ＨＲＰで検出した。結果は図７Ａに示す。可溶性ＡＡＶ−ｐ７４−ｓｃＴＣＲｓの機能的結合親和性を試験するため、融合タンパク質の連続希釈したものが抗ＴＣＲ ＢＦ１ ｍＡｂ塗布プレートにインキュベートされ、その後ビオチン化したＡＡＶ−ｐ７４／ＨＬＡ−Ｂ＊０７０２五量体及びＳＡ−ＨＲＰで検出した。図７Ｂを参照。
【００３９】
精製ＡＡＶ−ｂ融合タンパク質はＡＡＶ−ａ−ＡＪ３１よりもかなり低い五量体結合活性を示すため、ＡＡＶ−ａ−ＡＪ３１融合タンパク質のみをビオチン標識し可溶性ｐ７４−ｓｃＴＣＲ−ＰＥ多量体の生成に使用した。ＡＡＶ−ａ−ｓｃＴＣＲが細胞表面のＡＡＶ−ｐ７４ペプチド／ＨＬＡ−Ｂ７複合体に結合できるか否かを決定するためにＡＡＶ−ｐ７４ペプチド負荷ＨＬＡ−Ｂ７陽性ヒトリンパ芽球様細胞株（ＪｙＡ２Ｂ７）を使用した。５０μｇ／ｍｌのＡＡＶ−ｐ７４ペプチドを負荷したＪｙＡ２Ｂ７細胞（不死化Ｂ細胞）の特異的な染色を１検査当たり０．０２５μｇのＰＥ結合ｐ７４−ｓｃＴＣＲ多量体とともに観察した（図８）。
【００４０】
一方、典型的な状態では最少５μｇ／ｍｌＡＡＶ−ｐ７４ペプチドを負荷した（図９Ａ）、又は、負荷中ＰＬＥを加えた場合最少１μｇ／ｍｌＡＡＶ−ｐ７４ペプチドを負荷したＪｙＡ２Ｂ７細胞（図７Ｂ）を０．５μｇのｐ７４−ｓｃＴＣＲ多量体で染色することができる。（ＰＬＥはＡｌｔｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｒｐ．（Ｍｉｒａｍａｒ、フロリダ州）の独自の試薬混合物であり、抗原提示細胞に負荷したペプチドを強化する）。
【００４１】
ＡＡＶ−ｓｃＴＣＲ多量体をＨＬＡ−Ｂ＊０７０２陽性の正常ヒト線維芽細胞株を使用しインビトロで試験した（ＡＴＣＣ在庫からＭａｌｍｅ−３が入手可能である）。細胞に３７℃２時間１０μｇ／ｍｌの濃度でＡＡＶカプシドエピトープをペプチド負荷し、その後ＡＡＶ−ｓｃＴＣＲ多量体で染色した（図１０）。両方の実験においてＡＡＶ−ｓｃＴＣＲ多量体の陽性染色が観察され、多量体がＡＡＶペプチドエピトープを提示するＭＨＣ分子に良い親和性で結合することを示した。
【００４２】
同様に、ＡＡＶベクター静注投与後のＨＬＡ−Ｂ＊０７０２遺伝子組み換えマウスから採集したリンパ節細胞及び脾臓細胞はＡＡＶ−ｓｃＴＣＲ多量体の陽性染色を示す（図１２）。
【００４３】
結論
ヒトＭＨＣクラスＩ分子ＨＬＡ−Ｂ＊０７０２上のＡＡＶ２ペプチド（配列ＶＰＱＹＧＹＬＴＬ）に特異的な典型的な可溶性ＴＣＲが本願明細書に記載される。我々はＨＬＡ−Ｂ＊０７０２ハプロタイプを持つ匿名の健常ドナーからこのペプチドに対して特異性のあるＴ細胞を増殖させた。このペプチドに特異的なＴ細胞をクローン化し、Ｔ細胞受容体のＤＮＡを分離し発現させた。
【００４４】
複数の研究グループがウィルス及び／又は癌抗原発現レベルを研究及び定量するため可溶性ＴＣＲｓを発達させた（２６〜３１）。可溶性ＴＣＲｓの遺伝子操作は様々な理由で困難であり、その理由には自然発生Ｔ細胞受容体のＭＨＣ／ペプチドに対する低い親和性及び特定の細胞上の特定のペプチド／ＭＨＣ複合体の低い発現量が含まれる。ＴＣＲｓの公開された研究において、ペプチド／ＭＨＣ複合体に対するＴＣＲｓの親和性が判定された（３０）。ＭＨＣ／ペプチド抗原レベルの検査はマウス同種異系抗体（２８）及び神経学的疾患の原因抗原であるＨＴＬＶ−１抗原に焦点を当てた（感染（２８）及び腫瘍随伴疾患（２７））。Ｔ細胞レパートリーの発達をよく理解するため可溶性ＴＣＲｓを使用した研究もあれば、ウィルスの侵入を捕らえるために可溶性ＴＣＲを使用した研究もある。最後にＺｈｕら（２００６）は多量体一本鎖可溶性ＴＣＲを作成し癌細胞上のヒトＭＨＣクラスＩに提示された癌抗原由来ペプチドを可視化した。我々が知る限りではヒト、動物、又はインビトロモデルのいずれかにおいてウィルスベクター由来抗原の存在を調べた公開されている研究はない。我々が見い出したＨＬＡＢ＊０７０２拘束性エピトープを記載した最近の論文（３）以外はＡＡＶ由来抗原に関する公開された研究もない。
【００４５】
下記に記載された方法は本発明の実践を促進するために提供される。
【００４６】
ＡＡＶカプシドエピトープの同定
アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）はパルボウィルス科に属し、一生のうちの通常早い時期にヒトに自然に感染する。ヒト集団において最も一般的なＨＬＡに対する新しいＣＤ８Ｔ細胞エピトープを同定するため、２つのＩＲＢ承認プロトコールを開始しｔｈｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ及びペンシルバニア大学のｔｈｅ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｈｕｍａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｅｔｗｏｒｋと提携してヒト脾臓を収集した。脾臓は他の臓器に比べエピトープ探究のための２つの主要な利点を提供する。１つ目はＴ細胞記憶保持に関連するリンパ様臓器であること、２つ目は１グラムの組織から５億個の細胞を分離することが可能であり、この数は全血のような他の供給源からは簡単に得られることはできない。
【００４７】
Ｔ細胞分離及びＨＬＡタイピング
Ｔ細胞を組織採取から２４時間以内で分離する。脾臓を最初外科用メスによって小片に処理しその後均質化する。赤血球溶解後脾細胞をＰＢＳで２回洗浄し、各々約１０００万個の一定分量で１０％ＤＭＳＯとともにヒト血清中に凍結した。
【００４８】
２つ若しくはそれ以上の細胞を高分解ＨＬＡタイピングのためペンシルバニア大学病院のＨＬＡ−タイピング研究室に送付した。
【００４９】
インビトロＴ細胞増殖
ＣＤ８Ｔ細胞エピトープの同定はＡＡＶカプシドタンパク質に反応する記憶ＣＤ８Ｔ細胞の低い発生頻度によって妨げられる。この限界を乗り越えるため、脾臓組織からのリンパ球をＶＰ１と呼ばれるＡＡＶカプシドタンパク質に由来する一連のペプチドとともにインビトロで増殖させた。前記ＶＰ１ペプチドライブラリーは各々が１０アミノ酸ずつ重複しているタンパク質配列に由来する１５アミノ酸長のペプチド１４５個でできている（Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ）。
【００５０】
簡潔に説明すると、脾臓からのリンパ球を３％熱不活化ヒト血清を有するＡＩＭ−Ｖ（Ｇｉｂｃｏ）培地中で１ウェル当たり１００万個の細胞を９６ウェルプレートに播種し、前記ウェルの細胞の半分を３０００ｒａｄで放射線照射し支持細胞層として機能させる。ＶＰ１ライブラリーからの各ペプチドを１０μｇ／ｍｌの最終濃度で１つのウェルに添加する。増殖０日目及び２〜３日毎にＩＬ−２（Ｒｏｃｈｅ）を最終濃度１０Ｕ／ｍｌで培養に添加する。
【００５１】
刺激の１巡目は７〜１０日間継続するが、ＡＡＶカプシドに反応するＣＤ８Ｔ細胞の予想される少ない数のため、通常増殖には２−３巡必要である。増殖の各巡の追加は単純にウェルに新しいペプチド及び３０００ｒａｄで放射線照射した５００，０００同種脾臓細胞を添加することによって行う。
【００５２】
ＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔによるエピトープ探索
ＥＬＩＳｐｏｔは特異的な抗原に反応するＴ細胞の数を同定するため使用される強力な技術である、すなわちＥＬＩＳｐｏｔはペプチドに反応してＩＦＮ−γを分泌する細胞の能力を測定する。５０，０００個の増殖したＴ細胞を抗ヒトＩＦＮ−γ抗体（Ｍａｂ−Ｔｅｃｈ）を先に塗布した９６ウェルＥＬＩＳｐｏｔプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に増殖のため使用されるペプチドの存在下で播種した。３７℃、５％ＣＯ２でインキュベーション２４時間後細胞を洗浄し、抗ヒトＩＦＮ−γビオチン標識２次抗体（Ｍａｂ−Ｔｅｃｈ）をウェルに添加する。ストレプトアビジン−アルカリフォスファターゼを特異的基質の存在下で検出試薬として使用する。
【００５３】
陽性のウェルを最初に添加された１００万個の細胞当たりのスポットを形成する細胞（ｓｐｏｔ ｆｏｒｍｉｎｇ ｃｅｌｌｓ：ＳＦＣ）の数を基に判定する。もしＳＦＣの数が陰性対照コントロールウェル（培地のみ）のＳＦＣの数よりも３倍高いならば、前記ウェルは陽性と判定された。陽性ペプチドは上記に記載されたプロトコールを繰り返すことによって通常少なくとも２回確認された。
【００５４】
その後この方法は興味のある全てのＨＬＡ対立遺伝子に対して繰り返された。
【００５５】
オンライン予想アルゴリズム
２つのオンラインエピトープ予想アルゴリズムプログラムをＥＬＩＳｐｏｔアッセイに使用される１５アミノ酸長ペプチドの中の９アミノ酸配列を同定するのに使用し、その配列はＨＬＡ分子に対する結合配列を表す。これらのプログラムはＲａｎｋｐｅｐ：ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏ．ｄｆｃｉ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／Ｔｏｏｌｓ／ｒａｎｋｐｅｐ．ｈｔｍｌ及びＳＹＦＰＥＩＴＨＩ：ｗｗｗ.ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｄｅ／のインターネット上で見ることができる。
【００５６】
同定された９アミノ酸を合成しＥＬＩＳｐｏｔ及び細胞内サイトカイン染色によって確認する。陽性のペプチドエピトープ配列をその後ＨＬＡ−ペプチド五量体検出薬を合成するために利用する（Ｐｒｏｉｍｍｕｎｅ）。
【００５７】
ＡＡＶ−特異的Ｔ細胞選別及びクローニングのための五量体の使用
特異的なＡＡＶペプチドとともに一度又は二度増殖させた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を適切なＨＬＡペプチド五量体とともに滅菌状態で染色する。分析のみに通常使用された五量体染色に関しては、染色を４℃２０分間２％ヒト血清を含む滅菌ＰＢＳ中で実行する。培養を抗ＣＤ８抗体とともに共染色する。ＰＢＳ−２％ｈＡＢ血清で２回洗浄後、前記細胞を蛍光活性細胞選別器に通し、９６ウェル丸底プレートの１ウェル当たり１個の五量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含むように選別する。細胞を５個から１０個のプレートに選別する。各プレートの各ウェルは同じ日に調製し、支持細胞として放射線照射された同種ＰＢＭＣを含め、ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞株からの放射線照射細胞及びＴ細胞成長因子として５０ＩＵ／ｍｌの組み換えヒトＩＬ−２を加えた商業的に入手可能な抗ＣＤ３Ｔ細胞刺激抗体（ＯＫＴ３）を伴う。選別された（クローン化された）前記細胞をその後２週間３７℃の湿潤恒温器でインキュベートする。
【００５８】
２週間後Ｔ細胞のクローン成長を目視検査によって判定する。成長細胞を五量体染色によるＡＡＶに対する特異性で判定する（上記に記載）。ペプチド特異性を得るクローンを最初の刺激のように同種ＰＢＭＣ、放射線照射ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞、ＯＫＴ３及びＩＬ−２でさらに刺激するが、この作業以外に細胞集団の成長速度によって成長細胞を２４ウェルプレート又はＴ２５フラスコに移動させる。Ｄｒ．Ｃａｓｓｉａｎ Ｙｅｅ及びその同僚の記載のようにクローンを２週毎に再刺激をする（３２）。
【００５９】
一旦少なくとも１００万個のＴ細胞クローンが成長すると、一定分量を標準プロトコールに従って凍結する。この一定分量のＴ細胞クローンを可溶性ＴＣＲ生成のためＡｌｔｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎに提供する。もう１つの方法として我々は成長Ｔ細胞クローンからＲＮＡを分離しＡｌｔｏｒ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅにＲＮＡを提供することもある。この時点のＲＮＡをｃＤＮＡを生成するのに使用し、この材料によって可溶性Ｔ細胞受容体を生成する基礎を作る、以上の作業はこれらの分子を生成する経験を持つグループであるＡｌｔｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅによる（３１）。
【００６０】
我々はＡＡＶエピトープに特異的な可溶性ＴＣＲ受容体をクローン化し特性解析するのに成功し、このＡＡＶエピトープは患者への遺伝子導入を妨げる細胞傷害性Ｔ細胞反応の発生に関連する。本願明細書において記載される前記材料及び方法は診断及び治療双方に使用され、必要とする患者への治療用異種タンパク質の導入を促進する。
【００６１】
本発明の一部の望ましい実施形態を記載し及び特定の実施例を上記に提示したが、本発明はそれらの実施形態に限定されるものではない。様々な改変は次の請求項に記載されるように本発明の要旨に逸脱することなく行われる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＭＨＣクラスＩ分子上におけるアデノウィルス随伴ウィルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ：ＡＡＶ）に存在するペプチド配列に対して免疫学的に特異的な可溶性Ｔ細胞受容体（ｓｏｌｕｂｌｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ｓＴＣＲ）。
【請求項２】
請求項１記載のｓＴＣＲにおいて、前記アデノウィルスペプチド配列は、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−８及び他の自然発生血清型から成る群から選択される血清型から得られるものである。
【請求項３】
請求項１記載のｓＴＣＲにおいて、前記ヒトＭＨＣクラスＩ分子は、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ８、ＨＬＡ−Ｂ１５、ＨＬＡ−Ｂ４４及びＨＬＡ−Ｂ５１から成る群から選択されるものである。
【請求項４】
導入遺伝子含有アデノ随伴ウィルスベクター投与前、投与中、投与後のウィルスカプシド抗原に対するＴ細胞介在型免疫反応の存在を検出する方法であって、
ａ）患者からの生物学的試料、すなわちＴ細胞を含む前記試料を得る工程と、
ｂ）前記細胞をＭＨＣクラスＩ分子上の前記カプシド中のペプチドエピトープを含む五量体に接触させる工程と
ｃ）無処理のコントロール細胞と比較して、工程ｂ）の前記接触が前記細胞を刺激するかを決定し、前記ウィルスカプシドの前記ペプチドエピトープに対して特異的な前記接触によって細胞が刺激され、前記細胞がカプシド及び導入遺伝子含有細胞のＴ細胞介在型破壊を促進する工程と
を有する方法。
【請求項５】
請求項４記載の方法において、前記生物学的試料は、導入遺伝子を含む細胞、末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣｓ）、肝細胞、上皮細胞、及び筋細胞から成る群から選択される細胞を有するものである。
【請求項６】
請求項４記載の方法において、この方法は、さらに、前記刺激細胞からｍＲＮＡを分離する工程と、ｃＤＮＡを調製する工程と、前記ウィルスカプシド抗原に対して免疫学的に特異的な可溶性Ｔ細胞受容体をクローン化する工程とを有するものである。
【請求項７】
請求項６記載の方法よって調製される可溶性Ｔ細胞受容体。
【請求項８】
アデノウィルス随伴ウィルスベクター投与後のウィルス性形質導入細胞のＴ細胞介在型破壊を抑制するための方法であって、
ａ）ＡＡＶエピトープ／ＭＨＣ複合体に特異的なｓＴＣＲの有効量を提供する工程であって、前記ｓＴＣＲが前記導入遺伝子含有細胞のＴ細胞介在型破壊を妨げるものである、前記提供する工程
を有する方法。
【請求項９】
ウィルス性形質導入細胞のＴ細胞介在型破壊を回避するための方法であって、
ｄ）請求項４記載のペプチドエピトープに対する特異性を検出する工程と、
ｅ）前記ＡＡＶベクターを改変する工程であって、工程ｄ）において同定されるペプチドエピトープを除去するものである、前記改変する工程と、
ｆ）前記改変ＡＡＶベクターの導入遺伝子を投与する工程であって、前記改変は前記ウィルス性形質導入細胞のＴ細胞介在型破壊を抑止するものである、前記投与する工程と
を有する方法。
【請求項１０】
請求項１記載の可溶性Ｔ細胞受容体であって、この可溶性Ｔ細胞受容体は、表１で示されるＡＡＶ血清型のエピトープを有するものである。
【請求項１１】
請求項９記載の方法において、前記ＡＡＶベクターは表１に記載されるＡＡＶペプチドを除去するように改変されるものである。
【請求項１２】
請求項１１記載の方法によって調製される改変ＡＡＶベクター。
【請求項１】
ヒトＭＨＣクラスＩ分子上におけるアデノウィルス随伴ウィルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ：ＡＡＶ）に存在するペプチド配列に対して免疫学的に特異的な可溶性Ｔ細胞受容体（ｓｏｌｕｂｌｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ｓＴＣＲ）。
【請求項２】
請求項１記載のｓＴＣＲにおいて、前記アデノウィルスペプチド配列は、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−８及び他の自然発生血清型から成る群から選択される血清型から得られるものである。
【請求項３】
請求項１記載のｓＴＣＲにおいて、前記ヒトＭＨＣクラスＩ分子は、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ８、ＨＬＡ−Ｂ１５、ＨＬＡ−Ｂ４４及びＨＬＡ−Ｂ５１から成る群から選択されるものである。
【請求項４】
導入遺伝子含有アデノ随伴ウィルスベクター投与前、投与中、投与後のウィルスカプシド抗原に対するＴ細胞介在型免疫反応の存在を検出する方法であって、
ａ）患者からの生物学的試料、すなわちＴ細胞を含む前記試料を得る工程と、
ｂ）前記細胞をＭＨＣクラスＩ分子上の前記カプシド中のペプチドエピトープを含む五量体に接触させる工程と
ｃ）無処理のコントロール細胞と比較して、工程ｂ）の前記接触が前記細胞を刺激するかを決定し、前記ウィルスカプシドの前記ペプチドエピトープに対して特異的な前記接触によって細胞が刺激され、前記細胞がカプシド及び導入遺伝子含有細胞のＴ細胞介在型破壊を促進する工程と
を有する方法。
【請求項５】
請求項４記載の方法において、前記生物学的試料は、導入遺伝子を含む細胞、末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣｓ）、肝細胞、上皮細胞、及び筋細胞から成る群から選択される細胞を有するものである。
【請求項６】
請求項４記載の方法において、この方法は、さらに、前記刺激細胞からｍＲＮＡを分離する工程と、ｃＤＮＡを調製する工程と、前記ウィルスカプシド抗原に対して免疫学的に特異的な可溶性Ｔ細胞受容体をクローン化する工程とを有するものである。
【請求項７】
請求項６記載の方法よって調製される可溶性Ｔ細胞受容体。
【請求項８】
アデノウィルス随伴ウィルスベクター投与後のウィルス性形質導入細胞のＴ細胞介在型破壊を抑制するための方法であって、
ａ）ＡＡＶエピトープ／ＭＨＣ複合体に特異的なｓＴＣＲの有効量を提供する工程であって、前記ｓＴＣＲが前記導入遺伝子含有細胞のＴ細胞介在型破壊を妨げるものである、前記提供する工程
を有する方法。
【請求項９】
ウィルス性形質導入細胞のＴ細胞介在型破壊を回避するための方法であって、
ｄ）請求項４記載のペプチドエピトープに対する特異性を検出する工程と、
ｅ）前記ＡＡＶベクターを改変する工程であって、工程ｄ）において同定されるペプチドエピトープを除去するものである、前記改変する工程と、
ｆ）前記改変ＡＡＶベクターの導入遺伝子を投与する工程であって、前記改変は前記ウィルス性形質導入細胞のＴ細胞介在型破壊を抑止するものである、前記投与する工程と
を有する方法。
【請求項１０】
請求項１記載の可溶性Ｔ細胞受容体であって、この可溶性Ｔ細胞受容体は、表１で示されるＡＡＶ血清型のエピトープを有するものである。
【請求項１１】
請求項９記載の方法において、前記ＡＡＶベクターは表１に記載されるＡＡＶペプチドを除去するように改変されるものである。
【請求項１２】
請求項１１記載の方法によって調製される改変ＡＡＶベクター。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２００９−５３８６３３（Ｐ２００９−５３８６３３Ａ）
【公表日】平成２１年１１月１２日（２００９．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５１３４６３（Ｐ２００９−５１３４６３）
【出願日】平成１９年５月３１日（２００７．５．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７０１４７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１４０４７４
【国際公開日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【出願人】（５０８３５４１５３）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１１月１２日（２００９．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年５月３１日（２００７．５．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７０１４７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１４０４７４
【国際公開日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【出願人】（５０８３５４１５３）
【Ｆターム（参考）】
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