遺伝子発現制御方法、それに用いる遺伝子組換え用ベクターおよび遺伝子発現制御キット
【課題】 細胞に対する悪影響の恐れがなく、簡単なシステムで実施可能な遺伝子発現制御方法を提供する。
【解決手段】 細胞内の目的遺伝子の転写を調節することで前記目的遺伝子の発現を制御する遺伝子発現制御方法であって、前記目的遺伝子Ｇの上流に、プロモーター配列Ｐを配置し、前記プロモーター配列Ｐの上流に、５’−ＴＧＡＣＧＴ−３’の結合配列を含む応答配列Ｂを配置し、前記細胞内において、ＡＵＲＥＯ１タンパク質を存在させ、前記ＡＵＲＥＯ１タンパク質は、青色光の照射下では、前記結合配列に結合し、青色光の非照射下では、前記結合配列から遊離し、前記青色光の照射または非照射によるＡＵＲＥＯ１タンパク質の前記結合配列への結合または遊離により、前記プロモーター配列Ｐの活性または不活性を調節することで、前記目的遺伝子Ｇの転写を調節することを特徴とする。
【解決手段】 細胞内の目的遺伝子の転写を調節することで前記目的遺伝子の発現を制御する遺伝子発現制御方法であって、前記目的遺伝子Ｇの上流に、プロモーター配列Ｐを配置し、前記プロモーター配列Ｐの上流に、５’−ＴＧＡＣＧＴ−３’の結合配列を含む応答配列Ｂを配置し、前記細胞内において、ＡＵＲＥＯ１タンパク質を存在させ、前記ＡＵＲＥＯ１タンパク質は、青色光の照射下では、前記結合配列に結合し、青色光の非照射下では、前記結合配列から遊離し、前記青色光の照射または非照射によるＡＵＲＥＯ１タンパク質の前記結合配列への結合または遊離により、前記プロモーター配列Ｐの活性または不活性を調節することで、前記目的遺伝子Ｇの転写を調節することを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子発現制御方法、それに用いる遺伝子組換え用ベクターおよび遺伝子発現制御キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
３５０〜５００ｎｍの波長光（以下、青色光という）は、多くの植物種において非常に重要な環境シグナルの１つである。例えば、陸上植物では、光屈性や気孔開口のシグナルとして青色光が利用されている。この現象には、光受容体と呼ばれるタンパク質がはたらいている。このような植物の青色光の光受容体タンパク質には、クリプトクロム、フォトトロピン（ｐｈｏｔ１・ｐｈｏｔ２）、ＡＤＯ／ＦＫＦ／ＬＫＰ／ＺＴＬファミリーなどがある。また、これらの青色光の光受容体タンパク質は、光センサードメインと制御ドメインを有することが知られている。例えば、光受容体タンパク質である前記フォトトロピンには、光センサードメインである２つのＬＯＶ（Ｌｉｇｈｔ Ｏｘｙｇｅｎ Ｖｏｌｔａｇｅ）ドメインと、制御ドメインである１つのプロテインキナーゼドメインが存在する。このうち、光センサードメインであるＬＯＶドメインは、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を色素団として持ち、そのＦＭＮが青色光を受容することで、フォトトロピンの立体構造が変化し、フォトトロピンのプロテインキナーゼが活性化されることにより、シグナルを下流分子に伝えるとされている。
【０００３】
これまでに、このような青色光によるタンパク質−タンパク質間の相互作用に基づいた遺伝子発現制御方法として、シロイヌナズナの青色光受容体であるＬＫＰ１（ＬＯＶ ｋｅｌｃｈ ｐｒｏｔｅｉｎ１）等を用いた青色光バイオスイッチが開発されている（特許文献１および２）。また、化学物質を用いた遺伝子の発現制御方法も開発されている（特許文献３）。化学物質を用いた遺伝子の発現制御方法は、化学物質により細胞への悪影響を及ぼす可能性がある。一方、青色光を用いた遺伝子制御方法は、細胞への悪影響がない、優れた方法であるが、前述のように、タンパク質間の相互作用に基づいているために、システムが複雑で、種々の要因の影響を受ける恐れがある。
【特許文献１】特開２００６−９４７０４号公報
【特許文献２】特開２００７−７５０１９号公報
【特許文献３】特表平１１−５０６９０１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、本発明は、簡単なシステムで、細胞に悪影響を及ぼす恐れの無い遺伝子発現制御方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前記目的を達成するために、本発明の遺伝子発現制御方法は、
細胞内の目的遺伝子の転写を調節することで前記目的遺伝子の発現を制御する遺伝子発現制御方法であって、
前記目的遺伝子の上流に、プロモーター配列を配置し、
前記プロモーター配列の上流に、５’−ＴＧＡＣＧＴ−３’の結合配列を含む応答配列を配置し、
前記細胞内において、ＡＵＲＥＯ１タンパク質を存在させ、
前記ＡＵＲＥＯ１タンパク質は、青色光の照射下では、前記結合配列に結合し、青色光の非照射下では、前記結合配列から遊離し、
前記青色光の照射または非照射によるＡＵＲＥＯ１タンパク質の前記結合配列への結合または遊離により、前記プロモーター配列の活性または不活性を調節することで、前記目的遺伝子の転写を調節することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００６】
本発明者らは、前記目的を達成するために一連の研究を重ねた。その過程で、藻類の一種であるフシナシミドロから、青色光の照射により、前記特定の塩基配列に結合し、かつ青色光の非照射により、前記特定の塩基配列から遊離するという性質をもつタンパク質であるＡＵＲＥＯ１を発見し、分離した。そして、さらに研究を重ねた結果、前記ＡＵＲＥＯ１を利用すれば、タンパク質間の相互作用無しで、青色光の照射または非照射により、遺伝子の転写を調節できることを見出し、本発明に到達した。したがって、本発明の遺伝子発現制御方法は、化学物質ではなく、青色光を用いるため、細胞への悪影響の恐れがない。また、本発明の遺伝子発現制御方法は、タンパク質間の相互作用を利用していないため、システムが簡単であり、種々の要因による影響も低減可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の遺伝子発現制御方法は、ＡＵＲＥＯ１の結合により遺伝子の転写を開始させる第一の方法と、ＡＵＲＥＯ１の遊離により遺伝子の転写を開始させる第二の方法がある。
【０００８】
本発明の遺伝子発現制御方法の第一の方法は、
青色光の照射により、前記ＡＵＲＥＯ１タンパク質を、前記応答配列に結合させることにより前記プロモーター配列を活性化して前記目的遺伝子の転写を実施し、
前記青色光の非照射により、前記ＡＵＲＥＯ１タンパク質を前記結合配列から遊離させることにより前記目的遺伝子の転写を実施しないという方法である。
前記第一の方法では、ＡＵＲＥＯ１自身が、プロモーター配列を活性化するアクチベーターとして機能する。
【０００９】
本発明の遺伝子発現制御方法の第二の方法は、
前記細胞内に、さらに、アクチベーターを存在させ、
前記アクチベーターは、前記応答配列に結合することにより前記プロモーター配列を活性化し、
青色光の照射により、前記ＡＵＲＥＯ１タンパク質を前記結合配列に結合させることで、
前記アクチベーターの前記応答配列への結合を阻止して前記目的遺伝子の転写を実施せず、
前記青色光の非照射により、前記ＡＵＲＥＯ１タンパク質を前記結合配列から遊離させることで、前記アクチベーターを前記応答配列に結合させて前記目的遺伝子の転写を実施するという方法である。
前記第二の方法では、ＡＵＲＥＯ１が、プロモーターを不活性化するリプレッサーとして機能する。
【００１０】
本発明において、前記ＡＵＲＥＯ１タンパク質は、例えば、下記の（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）のタンパク質である。
（Ａ） 配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ） 配列番号２のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸残基が、欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、青色光の照射下では、前記結合配列に結合し、青色光の非照射下では、前記結合配列から遊離するタンパク質。
（Ｃ） 配列番号２のアミノ酸配列に対し、６８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、青色光の照射下では、前記結合配列に結合し、青色光の非照射下では、前記結合配列から遊離するタンパク質である。
前記（Ｂ）のタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列において、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸残基が、欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、青色光の照射下では、前記結合配列に結合し、青色光の非照射下では、前記結合配列から遊離するタンパク質である。
また、前記（Ｃ）のタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列に対し、例えば、６８％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、青色光の照射下では、前記結合配列に結合し、青色光の非照射下では、前記結合配列から遊離するタンパク質である。
【００１１】
本発明において、前記応答配列は、５’−ＴＧＡＣＧＴ−３’（配列番号１）の結合配列に加えまたは代えて、５’−ＴＧＡＣＧＣ−３’の結合配列を含むという態様であってもよい。ただし、本発明では、５’−ＴＧＡＣＧＴ−３’の結合配列が好ましい。
【００１２】
本発明において、前記青色光が、波長３５０ｎｍから５００ｎｍの範囲の光を含むことが好ましい。本発明において、青色光は、特に制限されず、青色光を含めばよく、例えば、太陽光、人工的光源（例えば、蛍光灯、白熱球、ハロゲンランプ、発光ダイオード、有機ＥＬ素子）等の光であってもよい。
【００１３】
本発明において、前記細胞は、細菌、酵母、動物細胞および植物細胞からなる群から選択される少なくとも一つの細胞であることが好ましい。
【００１４】
つぎに、本発明の遺伝子組換え用ベクターは、本発明の遺伝子発現制御方法に使用する遺伝子組換え用ベクターであって、
前記目的遺伝子のクローニングサイト、前記プロモーター配列および前記応答配列を含み、
前記目的遺伝子のクローニングサイトの上流に、前記プロモーター配列が配置され、
前記プロモーター配列の上流に、前記応答配列が配置されていることを特徴とする。
【００１５】
本発明の遺伝子組換え用ベクターにおいて、さらに、ＡＵＲＥＯ１遺伝子を含むという態様であってもよい。
【００１６】
つぎに、本発明の遺伝子発現制御用キットは、本発明の遺伝子発現制御方法に使用するキットであって、本発明の遺伝子組換え用ベクターを含むキットである。
【００１７】
本発明の遺伝子発現制御用キットにおいて、さらに、ＡＵＲＥＯ１遺伝子を発現可能な状態で含む遺伝子組み換え用ベクターを含むという態様であってもよい。
【００１８】
つぎに、本発明について、詳細に説明する。
【００１９】
（Ａ） ＡＵＲＥＯ１
前述のように、ＡＵＲＥＯ１は、藻類の一種であるフシナシミドロの細胞内に発現する光受容体タンパク質である。光受容体タンパク質は、光を受容することにより、その立体構造を変化させ、その変化を細胞内の生化学反応に変換する機能を有するタンパク質である。ＡＵＲＥＯ１は、そのファミリータンパク質であるＡＵＲＥＯ２と共に、本発明者等によりフシナシミドロから発見され、分離された。図２に、ＡＵＲＥＯ１およびＡＵＲＥＯ２の構造の模式図を示す。図示のように、両タンパク質共に、一つのＬＯＶドメインと、一つのｂＺＩＰドメインを有する。「ＬＯＶドメイン」とは、青色光センサー（Ｌｉｇｈｔ）、酸素センサー（Ｏｘｙｇｅｎ）、電位依存カリウムチャンネル（Ｖｏｌｔａｇｅ）の各センサー部分に特異的な立体構造を持つドメインという意味で命名された青色光の光受容体タンパク質が有する発色団結合ドメインであり、前記発色団として、１分子のＦＭＮを非共有結合により有している。ＬＯＶドメインを有する光受容体タンパク質は、ＡＵＲＥＯ１および２の他に、例えば、ｐｈｏｔ１、ｐｈｏｔ２、ｐｈｙ３、ＡＤＯ／ＦＫＦ／ＬＫＰ／ＺＴＬファミリータンパク質、ＴＬＰ１／ＰＬＰなどがある。「ｂＺＩＰドメイン」は、遺伝子の転写を制御するタンパク質のＤＮＡ結合ドメインで、ＤＮＡ結合および二量体化に関与し、コア配列を含有するＤＮＡ配列に共通して結合する、いわゆる塩基性ロイシンジッパードメインをいう。
【００２０】
ＡＵＲＥＯ１タンパク質は、例えば、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、その分子量は、３８．６ｋＤである。ＡＵＲＥＯ１タンパク質は、青色光を照射すると、そのＬＯＶドメインが、システインを介してＦＭＮに結合し、ｂＺＩＰドメインが、５’−ＴＧＡＣＧＴ−３’（配列番号１）の配列に可逆的に結合する。また、青色光の非照射の条件下（例えば、暗黒下）では、前記配列から遊離する。一方、ＡＵＲＥＯ２は、配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、その分子量が３９．１ｋＤである。ＡＵＲＥＯ２は、ＡＵＲＥＯ１と異なり、２箇所にイントロンを有している。ＡＵＲＥＯ１遺伝子の塩基配列は、アクセッション番号ＡＢ２５２５０４として、ＡＵＲＥＯ2遺伝子の塩基配列は、アクセッション番号ＡＢ２５２５０５（ｍＲＮＡ）およびアクセッション番号ＡＢ２７２９８１（ｇｅｎｅ）として、それぞれＤＤＢＪに登録されている。
【００２１】
（Ｂ） 本発明の遺伝子発現制御方法の第一の方法
本発明の遺伝子発現制御方法の第一の方法について、図１（Ａ−１）および（Ａ−２）に基づき説明する。前述のように、前記第一の方法では、ＡＵＲＥＯ１が、プロモーター配列を活性化するアクチベーターとして機能する。図示のように、目的遺伝子Ｇの上流に、プロモーター配列Ｐを配置し、前記プロモーター配列Ｐの上流に、前記応答配列Ｂを配置する。前記応答配列は、５’−ＴＧＡＣＧＴ−３’の結合配列を含む。前記目的遺伝子Ｇ、プロモーター配列Ｐおよび応答配列Ｂは、例えば、遺伝子組換え用ベクターを用いて細胞に導入することができる。一方、細胞内に、ＡＵＲＥＯ１タンパク質を存在させる。ＡＵＲＥＯ１タンパク質を細胞内に存在させる方法としては、例えば、ＡＵＲＥＯ１遺伝子を組み込んだベクターを細胞内に導入し、前記遺伝子を発現させるという方法がある。前記ＡＵＲＥＯ１遺伝子は、前記目的遺伝子Ｇを組み込んだベクターに組み込んでもよいし、これとは別のベクターに組み込んでもよい。そして、図１（Ａ−１）に示すように、青色光（Ｂｌｕｅ Ｌｉｇｈｔ）を照射すると、ＡＵＲＥＯ１が前記結合配列を特異的に認識して結合し、この結果、前記応答配列Ｂがプロモーター配列Ｐを活性化する。プロモーター配列Ｐの活性化により、目的遺伝子Ｇの転写が開始される（転写ＯＮ）。これとは逆に、青色光の非照射下（例えば、暗黒（Ｄａｒｋ）下）では、ＡＵＲＥＯ１タンパク質は、前記結合配列から遊離しているため、プロモーター配列Ｐは不活性の状態であり、目的遺伝子は転写されない（転写ＯＦＦ）。
【００２２】
（Ｃ） 本発明の遺伝子発現制御方法の第二の方法
本発明の遺伝子発現制御方法の第二の方法について、図１（Ｂ−１）および（Ｂ−２）に基づき説明する。前述のように、前記第二の方法では、ＡＵＲＥＯ１が、リプレッサーとして機能し、プロモーター配列を活性化するアクチベーターが応答配列に結合するのを阻止する。したがって、前記アクチベーターは、例えば、ＡＵＲＥＯ１タンパク質と競合するか、もしくは、青色光の照射下で応答配列から離れる性質を持つ。図示のように、第一の方法と同様に、目的遺伝子Ｇの上流に、プロモーター配列Ｐを配置し、前記プロモーター配列Ｐの上流に、前記応答配列Ｂを配置する。前記応答配列は、５’−ＴＧＡＣＧＴ−３’の結合配列を含む。前記目的遺伝子Ｇ、プロモーター配列Ｐおよび応答配列Ｂは、例えば、遺伝子組換え用ベクターを用いて細胞に導入することができる。一方、細胞内に、ＡＵＲＥＯ１タンパク質およびアクチベーターを存在させる。ＡＵＲＥＯ１タンパク質およびアクチベーターを細胞内に存在させる方法としては、例えば、ＡＵＲＥＯ１遺伝子およびアクチベーター遺伝子を組み込んだベクターを細胞内に導入し、前記両遺伝子を発現させるという方法がある。前記ＡＵＲＥＯ１遺伝子およびアクチベーター遺伝子は、前記目的遺伝子Ｇを組み込んだベクターに組み込んでもよいし、これとは別のベクターに組み込んでもよい。前記ＡＵＲＥＯ１遺伝子およびアクチベーター遺伝子は、それぞれ別のベクターに組み込んでもよい。そして、図１（Ｂ−１）に示すように、青色光（Ｂｌｕｅ Ｌｉｇｈｔ）を照射すると、ＡＵＲＥＯ１が前記結合配列を特異的に認識して結合し、この結果、アクチベーターが前記応答配列Ｂに結合できず、プロモーター配列Ｐは不活性の状態となり、目的遺伝子Ｇは転写されない（転写ＯＦＦ）。これとは逆に、青色光の非照射下（例えば、暗黒（Ｄａｒｋ）下）では、ＡＵＲＥＯ１タンパク質は、前記結合配列から遊離しているため、アクチベーターが応答配列Ｂに結合することができ、この結果、プロモーター配列Ｐが活性化され、目的遺伝子の転写が開始される（転写ＯＮ）。
【００２３】
前記プロモーターとしては、例えば、酵母Ｏｎｅ−ｈｙｂｒｉｄ法などに用いられるＧＡＬ４遺伝子のミニマムプロモーター領域や、植物で利用されるカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓ遺伝子のミニマムプロモーター領域などが、本発明の前記遺伝子発現制御方法の第一および第二の方法における遺伝子の発現制御において使用可能である。
【実施例】
【００２４】
つぎに、本発明の実施例について説明する。
【００２５】
（１）ＤＮＡおよびＲＮＡの分離
淡水黄緑藻類であるオカフシナシミドロの葉状体を三角フラスコ内の新鮮な培地に移し、白色蛍光ランプ下、２０℃で２−３ヶ月間培養した（１２時間明条件／１２時間暗条件）。培養終了後、培養物のゲノムＤＮＡおよびｔｏｔａｌＲＮＡをセチルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＣＴＡＢ）法を用いて単離した。一方、ヒバマタの成熟した生殖器床は、２００６年５月下旬に日本の北海道室蘭で採取し、受精後４−６時間後に受精した接合子を回収した。接合子は、直ちにＤＮＡ／ＲＮＡ抽出に用いるか、−８０℃で使用時まで保存した。オカフシナシミドロおよびヒバマタのいずれも、ＤＮＡおよびＲＮＡは、試料に界面活性剤を含む破砕液を加え、試験管を洗浄するブラシを上下することで細胞を十分に破砕する「ウォッシュブラッシュ」法（Ｎｏｚａｋｉ Ｈ， Ｉｔｏ Ｍ， Ｗａｔａｎａｂｅ， ＭＭ， Ｔａｋａｎｏ Ｈ， Ｋｕｒｏｉｗａ Ｔ．，“ＰＨＹＬＯＧＥＮＥＴＩＣ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＯＦ ＭＯＲＰＨＯＬＯＧＩＣＡＬ ＳＰＥＣＩＥＳ ＯＦ ＣＡＲＴＥＲＩＡ (ＶＯＬＶＯＣＡＬＥＳ，ＣＨＬＯＲＯＰＨＹＴＡ) ＢＡＳＥＤ ＯＮ ｒｂｃＬ ＧＥＮＥ ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ”Ｊ Ｐｈｙｃｏｌ ３３：８６４−８６７(１９９７)）により抽出した。ウォッシュブラッシュ法は、細胞を十分に破砕することでｍ−ＲＮＡやＤＮＡの収量が高まることから、微細な細胞や卵などからｍ−ＲＮＡやＤＮＡを単離する際に用いる方法である。
【００２６】
（２）フシナシミドロのＬＯＶドメイン含有タンパク質のクローニング
ＬＯＶドメイン含有タンパク質は、縮重プライマー（ＬＯＶ−Ｆ（配列番号４）およびＬＯＶ−Ｒ（配列番号５））を用いて単離した。ＰＣＲ生成物は、ｐＧＥＭ-Ｔ Ｅａｓｙ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によりクローニングし、シークエンスを行った。完全長ｃＤＮＡは、５’および３’ＲＡＣＥにより得た。プライマーには、５’ＲＡＣＥ−１−１（配列番号６）、５’ＲＡＣＥ−１−２（配列番号７）、５’ＲＡＣＥ−１−３（配列番号８）、３’ＲＡＣＥ−１−１（配列番号９）、３’ＲＡＣＥ−１−２（配列番号１０）、５’ＲＡＣＥ−２−１（配列番号１１）、５’ＲＡＣＥ−２−２（配列番号１２）、５’ＲＡＣＥ−２−３（配列番号１３）、３’ＲＡＣＥ−２−１（配列番号１４）、３’ＲＡＣＥ−２−２（配列番号１５）を用いた。さらに、特異的プライマー（ＡＵＲＥＯ１−Ｆｕｌｌ−Ｆ（配列番号１６）、ＡＵＲＥＯ１−Ｆｕｌｌ−Ｒ（配列番号１７）、ＡＵＲＥＯ２−Ｆｕｌｌ−Ｆ（配列番号１８）、ＡＵＲＥＯ２−Ｆｕｌｌ−Ｒ（配列番号１９））を用いたＲＴ−ＰＣＲ法により配列を決定した。こうして得た、ＬＯＶドメインを有するタンパク質をオーレオクロム（ＡＵＲＥＯＣＨＲＯＭＥ）と命名した。図２に示すように、オーレオクロムは、ＬＯＶドメインとｂＺＩＰドメインを各々１つ有するタンパク質で、ＡＵＲＥＯ１（配列番号２）とＡＵＲＥＯ２（配列番号３）という２つの相同体が存在する。ＡＵＲＥＯ１において、例えば、配列番号２の第１１８番から第１７８番までの配列がｂＺＩＰドメインであり、配列番号２の第２１７番から第３２０番までの配列がＬＯＶドメインである。また、ＡＵＲＥＯ２において、配列番号３の第１２４番から第１８５番までの配列がｂＺＩＰドメインであり、配列番号３の第２２４番から第３２７番までの配列がＬＯＶドメインである。また、ヒバマタおよび珪藻においても、高い相同性を有するＬＯＶドメインおよびｂＺＩＰドメインの存在が確認された。
【００２７】
（３）光化学分析
オーレオクロムのフラビン結合能の確認のため、カルモデュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）とＡＵＲＥＯ１のＬＯＶドメインとの融合タンパク質と、ＣＢＰとＡＵＲＥＯ２のＬＯＶドメインとの融合タンパク質を作製し、大腸菌に発現させた。ＣＢＰ−ＬＯＶ融合タンパク質の異種発現は、ｐＣＡＬ−ｎ−ＥＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）ベクターを用いて大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を形質転換させて行った。オーレオクロムのＬＯＶ（ＬＯＶＡＵＲＥＯ１およびＬＯＶＡＵＲＥＯ２）のｃＤＮＡ断片は、ＡＵＲＥＯ１−ＬＯＶＦ−ＡＵＲＥＯ２−ＬＯＶＲのプライマーセット（ＡＵＲＥＯ１−ＬＯＶＦ（配列番号２０）、ＡＵＲＥＯ１−ＬＯＶＲ（配列番号２１）、ＡＵＲＥＯ２−ＬＯＶＦ（配列番号２２）、ＡＵＲＥＯ２−ＬＯＶＲ（配列番号２３））を用いてクローニングして得た。得られた形質転換体をＬＢ培地（１．０Ｌ）で３０℃の暗条件下、３時間培養した。融合タンパク質の発現は、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）の添加により誘導した。得られた細胞を遠心分離して回収し、使用時まで−２０℃で保存した。タンパク質の精製およびクロムフォアの決定は、文献（Ｋａｓａｈａｒａ Ｍ， Ｓｗａｒｔｚ ＴＥ， Ｏｌｎｅｙ ＭＡ， Ｏｎｏｄｅｒａ Ａ， Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ Ｎ， Ｆｕｋｕｚａｗａ Ｈ， Ａｓａｍｉｚｕ Ｅ， Ｔａｂａｔａ Ｓ， Ｋａｎｅｇａｅ Ｈ， Ｔａｋａｎｏ Ｍ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｌａｖｉｎ Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｈｏｔｏｔｒｏｐｉｎｓ ｆｒｏｍ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ， Ｒｉｃｅ， ａｎｄ Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ”Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １２９：７６２−７７３（２００２））に従った。概略としては、タンパク質は大腸菌内でつくらせ、タンパク質の精製は、回収した大腸菌のペレットをタンパク質抽出液に懸濁し、超音波洗浄器で大腸菌を破砕後、遠心分離し、市販のカラム（商品名「Ｃｏｌｍｏｄｕｌｉｎ−ａｆｆｉｎｉｔｙ−ｒｅｓｉｎ」、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に通し、融合タンパク質を精製した。また、得られた融合タンパク質の吸収スペクトルを測定後、薄層クロマトグラフィによって、結合していると考えられるフラビン類を同定し、クロモフォアを決定した。図３（Ａ）は、ＡＵＲＥＯ１またはＡＵＲＥＯ２のＣＢＰ−ＬＯＶドメイン（ＬＯＶＡＵＲＥＯ１およびＬＯＶＡＵＲＥＯ２）を発現している大腸菌ペレットの写真である。写真左側のＬＯＶＡＵＲＥＯ１において、ペレットが黄緑色に発色し、ＡＵＲＥＯ１のフラビン結合能が確認された。
【００２８】
次に、ＣＢＰ−ＬＯＶタンパク質の吸収スペクトルの測定を、スペクトロフォトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ ＤＵ−６５、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）を用いて行った。なお、青色光による光付加体形成には、ＬＥＤイルミネーター（４５０ｎｍ、ＩＳＬ−１５０Ｘ１５０ＢＢ、ＣＣＳ株式会社製）を用いた。図３（Ｂ）に示す、精製したＡＵＲＥＯ１のＬＯＶドメインの吸収スペクトルは、フラボプロテインの典型的な吸収スペクトルを表している。図３（Ｃ）は、青色光１分間照射（４６０ｎｍ、５００μｍｏｌｅ ｍ−２ｓ−１）後のスペクトルの吸収差を、上から下に向かって、青色光照射１分前、照射前０分、照射後３分の暗状態、暗状態３０分の順に示している。同図に示すとおり、精製したＣＢＰ−ＬＯＶタンパク質の吸収スペクトルは、３９０ｎｍ周辺および３４０ｎｍ以下で上昇し、４１０〜５００ｎｍ間で著しく低下した。しかし、この吸光度における変化は、２０分以内にたちまち消滅した。このことは、青色光による励起状態が、暗条件下でゆっくりと定常状態に戻ったことを示している。また、図３（Ｄ）に示すように、有機溶剤を使い、シリカゲル薄層に吸収スペクトルから予想されるフラビン類三種を同時に展開させる薄層クロマトグラフィ法により、ＦＭＮがＬＯＶドメインに結合したフラビン種であることが確認された。なお、前記薄層クロマトグラフィ方法は、文献（Ｉｓｅｋｉ Ｍ， Ｍａｔｓｕｎａｇａ Ｓ， Ｍｕｒａｋａｍｉ Ａ， Ｏｈｎｏ Ｋ， Ｓｈｉｇａ Ｋ， Ｙｏｓｈｉｄａ Ｋ， Ｓｕｇａｉ Ｍ， Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｔ， Ｈｏｒｉ Ｔ， Ｗａｔａｎａｂｅ Ｍ． “Ａ ｂｌｕｅ−ｌｉｇｈｔ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ａｄｅｎｙｌｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｐｈｏｔｏａｖｏｉｄａｎｃｅ ｉｎ Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ”Ｎａｔｕｒｅ ４１５（６８７５）：１０４７−５１（２００２））に従い、行った。
【００２９】
（４） タマネギ表皮細胞における局在
つぎに、前記オーレオクロムの転写制御因子機能を確認するため、タマネギ表皮細胞におけるオーレオクロムの細胞内局在を下記の方法により確認した。
【００３０】
タマネギ表皮細胞におけるオーレオクロムの細胞内局在を観察するために、ＧＦＰ融合タンパク質であるＧＦＰ−ＡＵＲＥＯ１およびＧＦＰ−ＡＵＲＥＯ２を用いた。融合タンパク質ＧＦＰ−ＡＵＲＥＯ１およびＧＦＰ−ＡＵＲＥＯ２を発現する遺伝子コンストタクトを得るために、ＡＵＲＥＯ１またはＡＵＲＥＯ２完全長ｃＤＮＡをテンプレートとして調整した、ＢｓｒＧＩまたはＮｏｔｌサイトを有するプライマー（ＧＦＰＡＵＲＥＯ１Ｆ（配列番号２４），ＧＦＰＡＵＲＥＯ１Ｒ（配列番号２５）、ＧＦＰＡＵＲＥＯ２Ｆ（配列番号２６），ＧＦＰＡＵＲＥＯ２Ｒ（配列番号２７））を用いてＰＣＲ法を実施した。ＰＣＲ生成物は、ＢｓｒＧＩおよびＮｏｔｌにより消化し、ＣＡＭＶ３５ＳΩ−ｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）プラスミドに挿入した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ−ｄｅｒｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍを用いて、プラスミドをコートした金粒子によりタマネギ表皮細胞に衝撃を付与した。衝撃付与後の表皮を１２時間、２５℃で培養し、蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏｓｋｏｐ、Ｚｅｉｓｓ社製）にて観察した。図４に示した写真は、上段がＧＦＰのみのコントロール区、中段がＧＦＰ−ＡＵＲＥＯ１区、下段がＧＦＰ−ＡＵＲＥＯ２区である。また、左列は位相差顕微鏡（ＤＩＣ）による位相差観察、右列は蛍光顕微鏡（Ｆｌｕｏ）による観察結果である。タマネギ表皮において異種発現したＧＦＰ−ＡＵＲＥＯ融合タンパク質は、ＡＵＲＥＯ１が核と細胞質の両方に局在したのに対し、ＡＵＲＥＯ２は核のみに局在した。したがって、核内の局在およびｂＺＩＰドメインを有することの双方から、ＡＵＲＥＯ１およびＡＵＲＥＯ２の光感受性転写因子としての役割をサポートしていることが明らかになった。
【００３１】
（５） オーレオクロムのＤＮＡへの結合
本発明の遺伝子発現制御方法に用いる前記オーレオクロムのＤＮＡへの直接的な結合を、下記の、野生型プローブ（ＷＴ）と６つの単一変異オリゴヌクレオチド（Ｍ１−Ｍ６）を用いたランダムオリゴヌクレオチドアッセイ方法により確認した。
【００３２】
ＡＵＲＥＯ１−ＮＦ（配列番号２８）、ＡＵＲＥＯ１−ＮＲ（配列番号２９）、ＡＵＲＥＯ２−ＮＦ（配列番号３０）およびＡＵＲＥＯ２−ＮＲ（配列番号３１）をプライマーに用いて、ＡＵＲＥＯ１（１−６０３ｂｐ）およびＡＵＲＥＯ２（１−５９１ｂｐ）のＮ末端部位のＤＮＡインサートをＰＣＲ法により生成した。ＰＣＲ生成物は、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にライゲーションし、シークエンスし、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断し、さらにｐＧＥＸ４Ｔ２（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩサイトにライゲーションした。発現したプラスミドにより大腸菌ＢＬ２株を形質転換させ、１ｍＭ ＩＰＴＧ、３７℃、２時間の条件下で、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質を導入した。細菌ペレットは、２．０ｍＭ フェニルメタンスルフォニルフルオライド、１５μＭ ペプスタチン、２３μＭ ロイペプチン、１ｍＭ ジチオスレイトールを添加したＰＢＳバッファー（８．１ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１．６ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭ ＮａＣｌ）中で超音波処理して溶解させた。ＧＳＴ融合タンパク質は、プロテナーゼ阻害剤存在下で超音波処理により分離し、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｈｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いたバッチ法により精製した。
【００３３】
ランダムオリゴヌクレオチド結合アッセイは、ＧＳＴ融合タンパク質とオリゴヌクレオチド混合物を用いて行った。ランダムオリゴヌクレオチド混合物として、Ｒａｎｄｏｍ１、フォワードプライマー（配列番号３２）およびリバースプライマー（配列番号３３）を用いた。二本鎖６８塩基オリゴヌクレオチド（ｄｓＤＮＡ）は、Ｒａｎｄｏｍ１をテンプレートとして用い、ＰＣＲにより生成した。Ｒａｎｄｏｍ１プローブ １００ｎｇは、結合バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、５０ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、２０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、２．０ｍＭ ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅ、１０μｇ／ｍｌ Ｐｏｌｙｄ［Ｉ−Ｃ］、１０％ グリセロール）１００μｌ中でＧＳＴ−ｂＺＩＰドメイン（ＧＳＴ−ＡＵＲＥＯ１−ＮまたはＧＳＴ−ＡＵＲＥＯ２−Ｎ）１００ｎｇと混合した。１０分間穏やかに撹拌した後、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂビーズを加えて、ＤＮＡ−タンパク質複合体を結合させた。ビーズを遠心分離して回収し、洗浄バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、５０ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、２０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、２．０ｍＭ ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅ、１０％ グリセロール）２００μｌにより３回洗浄した。洗浄バッファーで再懸濁したペレットは、３分間、９４℃で加温し、遠心分離した。得られた上澄５μｌをＲａｎｄｏｍ１のプライマーを用いたＰＣＲのテンプレートとして用いた。ＰＣＲ反応混合物は、エタノールおよび酢酸ナトリウムで沈殿させ、水に再懸濁した。ＰＣＲ生成物の一部を次のＤＮＡ−タンパク質結合反応に用い、この工程を４回繰り返した。
【００３４】
ゲルシフトアッセイは、ＤＩＧ Ｇｅｌ Ｓｈｉｆｔ Ｋｉｔ，２ｎｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（ロシュ社製）を用いて行った。このアッセイで用いたＤＮＡプローブは、７つの各オリゴヌクレオチド対（ＷＴ［ＷＴ−１（配列番号３４）とＷＴ−２（配列番号３５）］、Ｍ１［Ｍ１−１（配列番号３６）とＭ１−２（配列番号３７）］、Ｍ２［Ｍ２−１（配列番号３８）とＭ２−２（配列番号３９）］、Ｍ３［Ｍ３−１（配列番号４０）とＭ３−２（配列番号４１）］、Ｍ４［Ｍ４−１（配列番号４２）とＭ４−２（配列番号４３）］、Ｍ５［Ｍ５−１（配列番号４４）とＭ５−２（配列番号４５）］およびＭ６［Ｍ６−１（配列番号４６）とＭ６−２（配列番号４７）］）のアニーリングにより生成したものを用いた。ｂＺＩＰタンパク質の混合物および標識したコールドプローブ（２５ｎｇ ＧＳＴ−ＡＵＲＥＯ１−Ｎ，０．４ｎｇ Ｄｉｇ標識プローブおよび５０ｎｇ コールドプローブ）は、４℃、４％非変性ポリアクリルアミドゲル上で０．５倍Ｔｒｉｓ−ホウ酸−電気泳動（ＴＢＥ）バッファーにて電気泳動した。ゲルは、ＢｉｏｄｙｎｅＰＬＵＳ（Ｐｏｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）上でブロットした。Ａｎｔｉ−Ｄｉｇｏｘｙｇｅｎｉｎ−ＡＰおよびＣＳＰＤ（ロシュ社製）から化学発光を放出し、Ｌｉｇｈｔ−Ｃａｐｔｕｒｅ及びＣＳアナライザー Ｖｅｒ．２．０（ＡＴＴＯ Ｃｏｒｐｏｔａｔｉｏｎ社製）によって画像化した。図５に、野生型プローブ（ＷＴ）と６つの単一変異オリゴヌクレオチド（Ｍ１−Ｍ６）を用いたＧＳＴ−ＡＵＲＥＯ１Ｎのゲルシフトアッセイを示す。上側のバンド（２つの矢印）はｂＺＩＰタンパク質の二量体で、下側のバンド（１つの矢印）はｂＺＩＰタンパク質の単量体を示している。ＷＴレーンにおいてのみ、両バンドともに観察できない。すなわち、ランダムオリゴヌクレオチド結合選択アッセイにより、ＡＵＲＥＯ１（ＧＳＴ−ＡＵＲＥＯ１Ｎ）は、５’−ＴＧＡＣＧＴ−３’（配列番号１）に結合することが示された。
【００３５】
（６） ＡＵＲＥＯ１のＤＮＡへの結合
ＡＵＲＥＯ１のＤＮＡへの直接的な結合を、下記のゲルシフトアッセイ方法により確認した。
【００３６】
青色光による、ＡＵＲＥＯ１とＴＧＡＣＧＴ含有ＤＮＡプローブとの結合の活性化は、次のようにして行った。ＧＳＴ−ＡＵＲＥＯ１タンパク質全長を、完全暗条件化で、ベクターｐＧＥＸ６Ｐ１を用いて大腸菌（Ｒｏｓｅｔｔａ）に発現させた。得られたタンパク質を弱い赤色光（＜０．０２μｍｏｌｅ ｍ−２ｓ−１）条件下で分離精製し、そのＧＳＴをＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）によって切り取った。ＡＵＲＥＯ１タンパク質およびＤＩＧで標識したオリゴヌクレオチドプローブを混合し、暗条件下もしくは青色光の短照射条件下（４７０ｎｍ ＬＥＤ、１００μｍｏｌｅ ｍ−２ｓ−１、５分間）に置いた。３０分間の結合反応後、ＡＵＲＥＯ１標的ヌクレオチド複合体を、暗条件下で電気泳動により分離した（観察のために短時間、安全な弱い赤色光下に置いた）。図６は、ゲルシフトアッセイにおいて、第１列は３０分間暗条件下に置いたもの、第２列は２５分間暗条件下の後に青色光を５分間短照射したもの、第３列は青色光を５分間短照射後に２５分間暗条件化に置いたときの結果を示している。同図に示すように、青色光を照射した第２列および第３列において矢印部にバンドが見られ、ＡＵＲＥＯ１とターゲットＤＮＡ配列との結合が青色光によって活性化されていることを表している。
【００３７】
（７） 青色光誘導光形態形成機能
オーレオクロムの青色光誘導光形態形成機能を、下記のＲＮＡｉ法により確認した。
【００３８】
４つのｄｓＲＮＡ断片（ＬＯＶＡＵＲＥＯ１、ｂＺＩＰＡＵＲＥＯ１、ＬＯＶＡＵＲＥＯ２およびｂＺＩＰＡＵＲＥＯ２）はＰＣＲ法により合成した。プライマーセットは、ｂＺＩＰＡＵＲＥＯ１Ｆ（配列番号４８）、ｂＺＩＰＡＵＲＥＯ１Ｒ（配列番号４９）、ＬＯＶＡＵＲＥＯ１Ｆ（配列番号５０），ＬＯＶＡＵＲＥＯ１Ｒ（配列番号５１）、ｂＺＩＰＡＵＲＥＯ２Ｆ（配列番号５２）、ｂＺＩＰＡＵＲＥＯ２Ｒ（配列番号５３）、ＬＯＶＡＵＲＥＯ２Ｆ（配列番号５４），ＬＯＶＡＵＲＥＯ２Ｒ（配列番号５５）を用いた。各断片の長さは、おおよそ５００塩基対であった。これらのｄｓＲＮＡをＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に５μｇ／μＬになるよう懸濁し、使用時まで冷凍保存した。２または４つのｄｓＲＮＡ混合物は、長さ約１０ｍｍのフシナシミドロのセグメントに顕微導入し、導入した個々のセグメントは、数回培地を交換しつつ、６−７ヶ月間、インキュベータ内で別々に培養した（１２時間明条件／１２時間暗条件、２０℃）。導入溶液には、２または４種類のｄｓＲＮＡ混合物（全４種類のｄｓＲＮＡ、ＬＯＶＡＵＲＥＯ１＋ｂＺＩＰＡＵＲＥＯ１またはＬＯＶＡＵＲＥＯ２＋ｂＺＩＰＡＵＲＥＯ２）７−１０μｇ／μＬ、２０−３０ｍＭ Ｋ２ＳＯ４、１７−２５ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．０７−０．１ｍＭ ＥＧＴＡ，４０−６０ｍＭ ソルビトールおよび１７−２５ｍＭ ＰＩＰＥＳ−Ｋ（ｐＨ ７．０）を混合したものを用いた。
【００３９】
図７（Ａ）は、インジェクション後３７日目における、セグメントの形態を示す写真である。写真ａは、バッファーのみをインジェクションしたコントロールで、写真ｂ〜ｅは、ｄｓＲＮＡ混合物をマイクロインジェクションしたセグメントから再生した管の異常形態（ａｕｒｅｏ１＆ａｕｒｅｏ２）を示す写真である。管の狭窄部は日毎の成長制限を表しており、コントロールには見られなかった。
【００４０】
また、図７（Ｂ）は、青色光による分枝誘導をＡＵＲＥＯ１およびＡＵＲＥＯ２のＲＮＡｉにより同時阻害したときの分枝率を示すグラフである。５−６ヶ月間培養後、管の一部位（幅２００μｍ）に青色光を照射し、照射した管が分枝した割合（％）を示したもので、グラフの左柱ａは青色光を１０時間照射し、右柱ｂは２４時間照射したものである。また、コントロール区はバッファーのみをインジェクションした細胞で、ａｕｒｅｏ１＆ａｕｒｅｏ２区はｄｓＲＮＡ混合物をインジェクションした細胞である。コントロールの分枝率は、１０時間照射が５２．６％（ｎ＝１９）、２４時間照射が９１．７％（ｎ＝２４）であった。一方、ｄｓＲＮＡ混合物をインジェクションした細胞では、１０時間照射で４．３％（ｎ＝４６）、２４時間照射で２８．６％（ｎ＝３４）のみが分枝した。グラフ内右上に挿入した写真は、青色光を照射した近接の管の一部位（幅２００μｍ）における、照射後０、１、７および９時間後の、通常の青色光誘導分枝を示している（写真最下部のバーの長さは１００μｍ）。
【００４１】
図７（Ｃ）は、前記ＲＮＡｉによりＡＵＲＥＯ１又はＡＵＲＥＯ２のいずれかがノックアウトされたセグメントの写真である（最下部のバー長さは２００μｍ）。ＡＵＲＥＯ２のみをノックアウトしたａｕｒｅｏ２細胞からは、多くの未成熟な生殖器官が発生した。一方、ＡＵＲＥＯ１のみをノックアウトしたａｕｒｅｏ１細胞は、ａｕｒｅｏ１＆ａｕｒｅｏ２の表現型（図７（Ａ））に類似していた。
【００４２】
さらに、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、２４時間、青色光を照射した管について、細胞内のＡＵＲＥＯ１およびＡＵＲＥＯ２のｍＲＮＡの産生を調べた。図７（Ｄ）に示すように、＃１Ａ１および＃１Ｂ３において、オーレオクロムｍＲＮＡが全く産生されず、分枝能が完全に欠失していた。これらの結果は、ＡＵＲＥＯＣＨＲＯＭＥが、青色光による光形態形成における光受容タンパク質であることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
以上のように、本発明の遺伝子発現制御方法によれば、細胞に悪影響を及ぼすことなく、簡単なシステムで遺伝子の発現の制御が可能になる。本発明は、遺伝子の発現制御を実施する全ての分野に適用可能であり、その用途は、医学、農学、薬学等の生物に関連する分野全てに適用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１（Ａ−１）、（Ａ−２）、（Ｂ−１）および（Ｂ−２）は、本発明の遺伝子発現制御方法を説明するための模式図である。
【図２】図２は、オーレオクロム（ＡＵＲＥＯ１およびＡＵＲＥＯ２）の構造を示す模式図である。
【図３（Ａ）】図３（Ａ）は、本発明の実施例において、ＣＢＰ−ＬＯＶドメイン（ＬＯＶＡＵＲＥＯ１、ＬＯＶＡＵＲＥＯ２）を導入した大腸菌のペレットを示す写真である。
【図３（Ｂ）】図３（Ｂ）は、本発明の実施例において、精製したＣＢＰ−ＬＯＶＡＵＲＥＯ１の吸収スペクトルを示すグラフである。
【図３（Ｃ）】図３（Ｃ）は、本発明の実施例において、青色光照射前後のスペクトルの吸収差を示すグラフである。
【図３（Ｄ）】図３（Ｄ）は、本発明の実施例において、ＡＵＲＥＯ１の発色団がＦＭＮであることを示す薄層クロマトグラフィの写真である。
【図４】図４は、本発明の実施例において、ＧＦＰ−ＡＵＲＥＯ融合タンパク質の細胞内局在を示す顕微鏡写真である。
【図５】図５は、本発明の実施例におけるゲルシフトアッセイ結果を示す写真である。
【図６】図６は、本発明の実施例におけるゲルシフトアッセイ結果を示すその他の写真である。
【図７（Ａ）】図７（Ａ）は、本発明の実施例におけるセグメントから再生した管の形態を示す写真である。
【図７（Ｂ）】図７（Ｂ）は、本発明の実施例における分枝誘導率の結果を示すグラフである。
【図７（Ｃ）】図７（Ｃ）は、本発明の実施例におけるＲＮＡｉによる表現型の結果を示す写真である。
【図７（Ｄ）】図７（Ｄ）は、本発明の実施例におけるＲＴ−ＰＣＲ結果を示す写真である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子発現制御方法、それに用いる遺伝子組換え用ベクターおよび遺伝子発現制御キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
３５０〜５００ｎｍの波長光（以下、青色光という）は、多くの植物種において非常に重要な環境シグナルの１つである。例えば、陸上植物では、光屈性や気孔開口のシグナルとして青色光が利用されている。この現象には、光受容体と呼ばれるタンパク質がはたらいている。このような植物の青色光の光受容体タンパク質には、クリプトクロム、フォトトロピン（ｐｈｏｔ１・ｐｈｏｔ２）、ＡＤＯ／ＦＫＦ／ＬＫＰ／ＺＴＬファミリーなどがある。また、これらの青色光の光受容体タンパク質は、光センサードメインと制御ドメインを有することが知られている。例えば、光受容体タンパク質である前記フォトトロピンには、光センサードメインである２つのＬＯＶ（Ｌｉｇｈｔ Ｏｘｙｇｅｎ Ｖｏｌｔａｇｅ）ドメインと、制御ドメインである１つのプロテインキナーゼドメインが存在する。このうち、光センサードメインであるＬＯＶドメインは、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を色素団として持ち、そのＦＭＮが青色光を受容することで、フォトトロピンの立体構造が変化し、フォトトロピンのプロテインキナーゼが活性化されることにより、シグナルを下流分子に伝えるとされている。
【０００３】
これまでに、このような青色光によるタンパク質−タンパク質間の相互作用に基づいた遺伝子発現制御方法として、シロイヌナズナの青色光受容体であるＬＫＰ１（ＬＯＶ ｋｅｌｃｈ ｐｒｏｔｅｉｎ１）等を用いた青色光バイオスイッチが開発されている（特許文献１および２）。また、化学物質を用いた遺伝子の発現制御方法も開発されている（特許文献３）。化学物質を用いた遺伝子の発現制御方法は、化学物質により細胞への悪影響を及ぼす可能性がある。一方、青色光を用いた遺伝子制御方法は、細胞への悪影響がない、優れた方法であるが、前述のように、タンパク質間の相互作用に基づいているために、システムが複雑で、種々の要因の影響を受ける恐れがある。
【特許文献１】特開２００６−９４７０４号公報
【特許文献２】特開２００７−７５０１９号公報
【特許文献３】特表平１１−５０６９０１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、本発明は、簡単なシステムで、細胞に悪影響を及ぼす恐れの無い遺伝子発現制御方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前記目的を達成するために、本発明の遺伝子発現制御方法は、
細胞内の目的遺伝子の転写を調節することで前記目的遺伝子の発現を制御する遺伝子発現制御方法であって、
前記目的遺伝子の上流に、プロモーター配列を配置し、
前記プロモーター配列の上流に、５’−ＴＧＡＣＧＴ−３’の結合配列を含む応答配列を配置し、
前記細胞内において、ＡＵＲＥＯ１タンパク質を存在させ、
前記ＡＵＲＥＯ１タンパク質は、青色光の照射下では、前記結合配列に結合し、青色光の非照射下では、前記結合配列から遊離し、
前記青色光の照射または非照射によるＡＵＲＥＯ１タンパク質の前記結合配列への結合または遊離により、前記プロモーター配列の活性または不活性を調節することで、前記目的遺伝子の転写を調節することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００６】
本発明者らは、前記目的を達成するために一連の研究を重ねた。その過程で、藻類の一種であるフシナシミドロから、青色光の照射により、前記特定の塩基配列に結合し、かつ青色光の非照射により、前記特定の塩基配列から遊離するという性質をもつタンパク質であるＡＵＲＥＯ１を発見し、分離した。そして、さらに研究を重ねた結果、前記ＡＵＲＥＯ１を利用すれば、タンパク質間の相互作用無しで、青色光の照射または非照射により、遺伝子の転写を調節できることを見出し、本発明に到達した。したがって、本発明の遺伝子発現制御方法は、化学物質ではなく、青色光を用いるため、細胞への悪影響の恐れがない。また、本発明の遺伝子発現制御方法は、タンパク質間の相互作用を利用していないため、システムが簡単であり、種々の要因による影響も低減可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の遺伝子発現制御方法は、ＡＵＲＥＯ１の結合により遺伝子の転写を開始させる第一の方法と、ＡＵＲＥＯ１の遊離により遺伝子の転写を開始させる第二の方法がある。
【０００８】
本発明の遺伝子発現制御方法の第一の方法は、
青色光の照射により、前記ＡＵＲＥＯ１タンパク質を、前記応答配列に結合させることにより前記プロモーター配列を活性化して前記目的遺伝子の転写を実施し、
前記青色光の非照射により、前記ＡＵＲＥＯ１タンパク質を前記結合配列から遊離させることにより前記目的遺伝子の転写を実施しないという方法である。
前記第一の方法では、ＡＵＲＥＯ１自身が、プロモーター配列を活性化するアクチベーターとして機能する。
【０００９】
本発明の遺伝子発現制御方法の第二の方法は、
前記細胞内に、さらに、アクチベーターを存在させ、
前記アクチベーターは、前記応答配列に結合することにより前記プロモーター配列を活性化し、
青色光の照射により、前記ＡＵＲＥＯ１タンパク質を前記結合配列に結合させることで、
前記アクチベーターの前記応答配列への結合を阻止して前記目的遺伝子の転写を実施せず、
前記青色光の非照射により、前記ＡＵＲＥＯ１タンパク質を前記結合配列から遊離させることで、前記アクチベーターを前記応答配列に結合させて前記目的遺伝子の転写を実施するという方法である。
前記第二の方法では、ＡＵＲＥＯ１が、プロモーターを不活性化するリプレッサーとして機能する。
【００１０】
本発明において、前記ＡＵＲＥＯ１タンパク質は、例えば、下記の（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）のタンパク質である。
（Ａ） 配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ） 配列番号２のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸残基が、欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、青色光の照射下では、前記結合配列に結合し、青色光の非照射下では、前記結合配列から遊離するタンパク質。
（Ｃ） 配列番号２のアミノ酸配列に対し、６８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、青色光の照射下では、前記結合配列に結合し、青色光の非照射下では、前記結合配列から遊離するタンパク質である。
前記（Ｂ）のタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列において、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸残基が、欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、青色光の照射下では、前記結合配列に結合し、青色光の非照射下では、前記結合配列から遊離するタンパク質である。
また、前記（Ｃ）のタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列に対し、例えば、６８％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、青色光の照射下では、前記結合配列に結合し、青色光の非照射下では、前記結合配列から遊離するタンパク質である。
【００１１】
本発明において、前記応答配列は、５’−ＴＧＡＣＧＴ−３’（配列番号１）の結合配列に加えまたは代えて、５’−ＴＧＡＣＧＣ−３’の結合配列を含むという態様であってもよい。ただし、本発明では、５’−ＴＧＡＣＧＴ−３’の結合配列が好ましい。
【００１２】
本発明において、前記青色光が、波長３５０ｎｍから５００ｎｍの範囲の光を含むことが好ましい。本発明において、青色光は、特に制限されず、青色光を含めばよく、例えば、太陽光、人工的光源（例えば、蛍光灯、白熱球、ハロゲンランプ、発光ダイオード、有機ＥＬ素子）等の光であってもよい。
【００１３】
本発明において、前記細胞は、細菌、酵母、動物細胞および植物細胞からなる群から選択される少なくとも一つの細胞であることが好ましい。
【００１４】
つぎに、本発明の遺伝子組換え用ベクターは、本発明の遺伝子発現制御方法に使用する遺伝子組換え用ベクターであって、
前記目的遺伝子のクローニングサイト、前記プロモーター配列および前記応答配列を含み、
前記目的遺伝子のクローニングサイトの上流に、前記プロモーター配列が配置され、
前記プロモーター配列の上流に、前記応答配列が配置されていることを特徴とする。
【００１５】
本発明の遺伝子組換え用ベクターにおいて、さらに、ＡＵＲＥＯ１遺伝子を含むという態様であってもよい。
【００１６】
つぎに、本発明の遺伝子発現制御用キットは、本発明の遺伝子発現制御方法に使用するキットであって、本発明の遺伝子組換え用ベクターを含むキットである。
【００１７】
本発明の遺伝子発現制御用キットにおいて、さらに、ＡＵＲＥＯ１遺伝子を発現可能な状態で含む遺伝子組み換え用ベクターを含むという態様であってもよい。
【００１８】
つぎに、本発明について、詳細に説明する。
【００１９】
（Ａ） ＡＵＲＥＯ１
前述のように、ＡＵＲＥＯ１は、藻類の一種であるフシナシミドロの細胞内に発現する光受容体タンパク質である。光受容体タンパク質は、光を受容することにより、その立体構造を変化させ、その変化を細胞内の生化学反応に変換する機能を有するタンパク質である。ＡＵＲＥＯ１は、そのファミリータンパク質であるＡＵＲＥＯ２と共に、本発明者等によりフシナシミドロから発見され、分離された。図２に、ＡＵＲＥＯ１およびＡＵＲＥＯ２の構造の模式図を示す。図示のように、両タンパク質共に、一つのＬＯＶドメインと、一つのｂＺＩＰドメインを有する。「ＬＯＶドメイン」とは、青色光センサー（Ｌｉｇｈｔ）、酸素センサー（Ｏｘｙｇｅｎ）、電位依存カリウムチャンネル（Ｖｏｌｔａｇｅ）の各センサー部分に特異的な立体構造を持つドメインという意味で命名された青色光の光受容体タンパク質が有する発色団結合ドメインであり、前記発色団として、１分子のＦＭＮを非共有結合により有している。ＬＯＶドメインを有する光受容体タンパク質は、ＡＵＲＥＯ１および２の他に、例えば、ｐｈｏｔ１、ｐｈｏｔ２、ｐｈｙ３、ＡＤＯ／ＦＫＦ／ＬＫＰ／ＺＴＬファミリータンパク質、ＴＬＰ１／ＰＬＰなどがある。「ｂＺＩＰドメイン」は、遺伝子の転写を制御するタンパク質のＤＮＡ結合ドメインで、ＤＮＡ結合および二量体化に関与し、コア配列を含有するＤＮＡ配列に共通して結合する、いわゆる塩基性ロイシンジッパードメインをいう。
【００２０】
ＡＵＲＥＯ１タンパク質は、例えば、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、その分子量は、３８．６ｋＤである。ＡＵＲＥＯ１タンパク質は、青色光を照射すると、そのＬＯＶドメインが、システインを介してＦＭＮに結合し、ｂＺＩＰドメインが、５’−ＴＧＡＣＧＴ−３’（配列番号１）の配列に可逆的に結合する。また、青色光の非照射の条件下（例えば、暗黒下）では、前記配列から遊離する。一方、ＡＵＲＥＯ２は、配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、その分子量が３９．１ｋＤである。ＡＵＲＥＯ２は、ＡＵＲＥＯ１と異なり、２箇所にイントロンを有している。ＡＵＲＥＯ１遺伝子の塩基配列は、アクセッション番号ＡＢ２５２５０４として、ＡＵＲＥＯ2遺伝子の塩基配列は、アクセッション番号ＡＢ２５２５０５（ｍＲＮＡ）およびアクセッション番号ＡＢ２７２９８１（ｇｅｎｅ）として、それぞれＤＤＢＪに登録されている。
【００２１】
（Ｂ） 本発明の遺伝子発現制御方法の第一の方法
本発明の遺伝子発現制御方法の第一の方法について、図１（Ａ−１）および（Ａ−２）に基づき説明する。前述のように、前記第一の方法では、ＡＵＲＥＯ１が、プロモーター配列を活性化するアクチベーターとして機能する。図示のように、目的遺伝子Ｇの上流に、プロモーター配列Ｐを配置し、前記プロモーター配列Ｐの上流に、前記応答配列Ｂを配置する。前記応答配列は、５’−ＴＧＡＣＧＴ−３’の結合配列を含む。前記目的遺伝子Ｇ、プロモーター配列Ｐおよび応答配列Ｂは、例えば、遺伝子組換え用ベクターを用いて細胞に導入することができる。一方、細胞内に、ＡＵＲＥＯ１タンパク質を存在させる。ＡＵＲＥＯ１タンパク質を細胞内に存在させる方法としては、例えば、ＡＵＲＥＯ１遺伝子を組み込んだベクターを細胞内に導入し、前記遺伝子を発現させるという方法がある。前記ＡＵＲＥＯ１遺伝子は、前記目的遺伝子Ｇを組み込んだベクターに組み込んでもよいし、これとは別のベクターに組み込んでもよい。そして、図１（Ａ−１）に示すように、青色光（Ｂｌｕｅ Ｌｉｇｈｔ）を照射すると、ＡＵＲＥＯ１が前記結合配列を特異的に認識して結合し、この結果、前記応答配列Ｂがプロモーター配列Ｐを活性化する。プロモーター配列Ｐの活性化により、目的遺伝子Ｇの転写が開始される（転写ＯＮ）。これとは逆に、青色光の非照射下（例えば、暗黒（Ｄａｒｋ）下）では、ＡＵＲＥＯ１タンパク質は、前記結合配列から遊離しているため、プロモーター配列Ｐは不活性の状態であり、目的遺伝子は転写されない（転写ＯＦＦ）。
【００２２】
（Ｃ） 本発明の遺伝子発現制御方法の第二の方法
本発明の遺伝子発現制御方法の第二の方法について、図１（Ｂ−１）および（Ｂ−２）に基づき説明する。前述のように、前記第二の方法では、ＡＵＲＥＯ１が、リプレッサーとして機能し、プロモーター配列を活性化するアクチベーターが応答配列に結合するのを阻止する。したがって、前記アクチベーターは、例えば、ＡＵＲＥＯ１タンパク質と競合するか、もしくは、青色光の照射下で応答配列から離れる性質を持つ。図示のように、第一の方法と同様に、目的遺伝子Ｇの上流に、プロモーター配列Ｐを配置し、前記プロモーター配列Ｐの上流に、前記応答配列Ｂを配置する。前記応答配列は、５’−ＴＧＡＣＧＴ−３’の結合配列を含む。前記目的遺伝子Ｇ、プロモーター配列Ｐおよび応答配列Ｂは、例えば、遺伝子組換え用ベクターを用いて細胞に導入することができる。一方、細胞内に、ＡＵＲＥＯ１タンパク質およびアクチベーターを存在させる。ＡＵＲＥＯ１タンパク質およびアクチベーターを細胞内に存在させる方法としては、例えば、ＡＵＲＥＯ１遺伝子およびアクチベーター遺伝子を組み込んだベクターを細胞内に導入し、前記両遺伝子を発現させるという方法がある。前記ＡＵＲＥＯ１遺伝子およびアクチベーター遺伝子は、前記目的遺伝子Ｇを組み込んだベクターに組み込んでもよいし、これとは別のベクターに組み込んでもよい。前記ＡＵＲＥＯ１遺伝子およびアクチベーター遺伝子は、それぞれ別のベクターに組み込んでもよい。そして、図１（Ｂ−１）に示すように、青色光（Ｂｌｕｅ Ｌｉｇｈｔ）を照射すると、ＡＵＲＥＯ１が前記結合配列を特異的に認識して結合し、この結果、アクチベーターが前記応答配列Ｂに結合できず、プロモーター配列Ｐは不活性の状態となり、目的遺伝子Ｇは転写されない（転写ＯＦＦ）。これとは逆に、青色光の非照射下（例えば、暗黒（Ｄａｒｋ）下）では、ＡＵＲＥＯ１タンパク質は、前記結合配列から遊離しているため、アクチベーターが応答配列Ｂに結合することができ、この結果、プロモーター配列Ｐが活性化され、目的遺伝子の転写が開始される（転写ＯＮ）。
【００２３】
前記プロモーターとしては、例えば、酵母Ｏｎｅ−ｈｙｂｒｉｄ法などに用いられるＧＡＬ４遺伝子のミニマムプロモーター領域や、植物で利用されるカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓ遺伝子のミニマムプロモーター領域などが、本発明の前記遺伝子発現制御方法の第一および第二の方法における遺伝子の発現制御において使用可能である。
【実施例】
【００２４】
つぎに、本発明の実施例について説明する。
【００２５】
（１）ＤＮＡおよびＲＮＡの分離
淡水黄緑藻類であるオカフシナシミドロの葉状体を三角フラスコ内の新鮮な培地に移し、白色蛍光ランプ下、２０℃で２−３ヶ月間培養した（１２時間明条件／１２時間暗条件）。培養終了後、培養物のゲノムＤＮＡおよびｔｏｔａｌＲＮＡをセチルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＣＴＡＢ）法を用いて単離した。一方、ヒバマタの成熟した生殖器床は、２００６年５月下旬に日本の北海道室蘭で採取し、受精後４−６時間後に受精した接合子を回収した。接合子は、直ちにＤＮＡ／ＲＮＡ抽出に用いるか、−８０℃で使用時まで保存した。オカフシナシミドロおよびヒバマタのいずれも、ＤＮＡおよびＲＮＡは、試料に界面活性剤を含む破砕液を加え、試験管を洗浄するブラシを上下することで細胞を十分に破砕する「ウォッシュブラッシュ」法（Ｎｏｚａｋｉ Ｈ， Ｉｔｏ Ｍ， Ｗａｔａｎａｂｅ， ＭＭ， Ｔａｋａｎｏ Ｈ， Ｋｕｒｏｉｗａ Ｔ．，“ＰＨＹＬＯＧＥＮＥＴＩＣ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＯＦ ＭＯＲＰＨＯＬＯＧＩＣＡＬ ＳＰＥＣＩＥＳ ＯＦ ＣＡＲＴＥＲＩＡ (ＶＯＬＶＯＣＡＬＥＳ，ＣＨＬＯＲＯＰＨＹＴＡ) ＢＡＳＥＤ ＯＮ ｒｂｃＬ ＧＥＮＥ ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ”Ｊ Ｐｈｙｃｏｌ ３３：８６４−８６７(１９９７)）により抽出した。ウォッシュブラッシュ法は、細胞を十分に破砕することでｍ−ＲＮＡやＤＮＡの収量が高まることから、微細な細胞や卵などからｍ−ＲＮＡやＤＮＡを単離する際に用いる方法である。
【００２６】
（２）フシナシミドロのＬＯＶドメイン含有タンパク質のクローニング
ＬＯＶドメイン含有タンパク質は、縮重プライマー（ＬＯＶ−Ｆ（配列番号４）およびＬＯＶ−Ｒ（配列番号５））を用いて単離した。ＰＣＲ生成物は、ｐＧＥＭ-Ｔ Ｅａｓｙ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によりクローニングし、シークエンスを行った。完全長ｃＤＮＡは、５’および３’ＲＡＣＥにより得た。プライマーには、５’ＲＡＣＥ−１−１（配列番号６）、５’ＲＡＣＥ−１−２（配列番号７）、５’ＲＡＣＥ−１−３（配列番号８）、３’ＲＡＣＥ−１−１（配列番号９）、３’ＲＡＣＥ−１−２（配列番号１０）、５’ＲＡＣＥ−２−１（配列番号１１）、５’ＲＡＣＥ−２−２（配列番号１２）、５’ＲＡＣＥ−２−３（配列番号１３）、３’ＲＡＣＥ−２−１（配列番号１４）、３’ＲＡＣＥ−２−２（配列番号１５）を用いた。さらに、特異的プライマー（ＡＵＲＥＯ１−Ｆｕｌｌ−Ｆ（配列番号１６）、ＡＵＲＥＯ１−Ｆｕｌｌ−Ｒ（配列番号１７）、ＡＵＲＥＯ２−Ｆｕｌｌ−Ｆ（配列番号１８）、ＡＵＲＥＯ２−Ｆｕｌｌ−Ｒ（配列番号１９））を用いたＲＴ−ＰＣＲ法により配列を決定した。こうして得た、ＬＯＶドメインを有するタンパク質をオーレオクロム（ＡＵＲＥＯＣＨＲＯＭＥ）と命名した。図２に示すように、オーレオクロムは、ＬＯＶドメインとｂＺＩＰドメインを各々１つ有するタンパク質で、ＡＵＲＥＯ１（配列番号２）とＡＵＲＥＯ２（配列番号３）という２つの相同体が存在する。ＡＵＲＥＯ１において、例えば、配列番号２の第１１８番から第１７８番までの配列がｂＺＩＰドメインであり、配列番号２の第２１７番から第３２０番までの配列がＬＯＶドメインである。また、ＡＵＲＥＯ２において、配列番号３の第１２４番から第１８５番までの配列がｂＺＩＰドメインであり、配列番号３の第２２４番から第３２７番までの配列がＬＯＶドメインである。また、ヒバマタおよび珪藻においても、高い相同性を有するＬＯＶドメインおよびｂＺＩＰドメインの存在が確認された。
【００２７】
（３）光化学分析
オーレオクロムのフラビン結合能の確認のため、カルモデュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）とＡＵＲＥＯ１のＬＯＶドメインとの融合タンパク質と、ＣＢＰとＡＵＲＥＯ２のＬＯＶドメインとの融合タンパク質を作製し、大腸菌に発現させた。ＣＢＰ−ＬＯＶ融合タンパク質の異種発現は、ｐＣＡＬ−ｎ−ＥＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）ベクターを用いて大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を形質転換させて行った。オーレオクロムのＬＯＶ（ＬＯＶＡＵＲＥＯ１およびＬＯＶＡＵＲＥＯ２）のｃＤＮＡ断片は、ＡＵＲＥＯ１−ＬＯＶＦ−ＡＵＲＥＯ２−ＬＯＶＲのプライマーセット（ＡＵＲＥＯ１−ＬＯＶＦ（配列番号２０）、ＡＵＲＥＯ１−ＬＯＶＲ（配列番号２１）、ＡＵＲＥＯ２−ＬＯＶＦ（配列番号２２）、ＡＵＲＥＯ２−ＬＯＶＲ（配列番号２３））を用いてクローニングして得た。得られた形質転換体をＬＢ培地（１．０Ｌ）で３０℃の暗条件下、３時間培養した。融合タンパク質の発現は、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）の添加により誘導した。得られた細胞を遠心分離して回収し、使用時まで−２０℃で保存した。タンパク質の精製およびクロムフォアの決定は、文献（Ｋａｓａｈａｒａ Ｍ， Ｓｗａｒｔｚ ＴＥ， Ｏｌｎｅｙ ＭＡ， Ｏｎｏｄｅｒａ Ａ， Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ Ｎ， Ｆｕｋｕｚａｗａ Ｈ， Ａｓａｍｉｚｕ Ｅ， Ｔａｂａｔａ Ｓ， Ｋａｎｅｇａｅ Ｈ， Ｔａｋａｎｏ Ｍ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｌａｖｉｎ Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｈｏｔｏｔｒｏｐｉｎｓ ｆｒｏｍ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ， Ｒｉｃｅ， ａｎｄ Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ”Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １２９：７６２−７７３（２００２））に従った。概略としては、タンパク質は大腸菌内でつくらせ、タンパク質の精製は、回収した大腸菌のペレットをタンパク質抽出液に懸濁し、超音波洗浄器で大腸菌を破砕後、遠心分離し、市販のカラム（商品名「Ｃｏｌｍｏｄｕｌｉｎ−ａｆｆｉｎｉｔｙ−ｒｅｓｉｎ」、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に通し、融合タンパク質を精製した。また、得られた融合タンパク質の吸収スペクトルを測定後、薄層クロマトグラフィによって、結合していると考えられるフラビン類を同定し、クロモフォアを決定した。図３（Ａ）は、ＡＵＲＥＯ１またはＡＵＲＥＯ２のＣＢＰ−ＬＯＶドメイン（ＬＯＶＡＵＲＥＯ１およびＬＯＶＡＵＲＥＯ２）を発現している大腸菌ペレットの写真である。写真左側のＬＯＶＡＵＲＥＯ１において、ペレットが黄緑色に発色し、ＡＵＲＥＯ１のフラビン結合能が確認された。
【００２８】
次に、ＣＢＰ−ＬＯＶタンパク質の吸収スペクトルの測定を、スペクトロフォトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ ＤＵ−６５、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）を用いて行った。なお、青色光による光付加体形成には、ＬＥＤイルミネーター（４５０ｎｍ、ＩＳＬ−１５０Ｘ１５０ＢＢ、ＣＣＳ株式会社製）を用いた。図３（Ｂ）に示す、精製したＡＵＲＥＯ１のＬＯＶドメインの吸収スペクトルは、フラボプロテインの典型的な吸収スペクトルを表している。図３（Ｃ）は、青色光１分間照射（４６０ｎｍ、５００μｍｏｌｅ ｍ−２ｓ−１）後のスペクトルの吸収差を、上から下に向かって、青色光照射１分前、照射前０分、照射後３分の暗状態、暗状態３０分の順に示している。同図に示すとおり、精製したＣＢＰ−ＬＯＶタンパク質の吸収スペクトルは、３９０ｎｍ周辺および３４０ｎｍ以下で上昇し、４１０〜５００ｎｍ間で著しく低下した。しかし、この吸光度における変化は、２０分以内にたちまち消滅した。このことは、青色光による励起状態が、暗条件下でゆっくりと定常状態に戻ったことを示している。また、図３（Ｄ）に示すように、有機溶剤を使い、シリカゲル薄層に吸収スペクトルから予想されるフラビン類三種を同時に展開させる薄層クロマトグラフィ法により、ＦＭＮがＬＯＶドメインに結合したフラビン種であることが確認された。なお、前記薄層クロマトグラフィ方法は、文献（Ｉｓｅｋｉ Ｍ， Ｍａｔｓｕｎａｇａ Ｓ， Ｍｕｒａｋａｍｉ Ａ， Ｏｈｎｏ Ｋ， Ｓｈｉｇａ Ｋ， Ｙｏｓｈｉｄａ Ｋ， Ｓｕｇａｉ Ｍ， Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｔ， Ｈｏｒｉ Ｔ， Ｗａｔａｎａｂｅ Ｍ． “Ａ ｂｌｕｅ−ｌｉｇｈｔ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ａｄｅｎｙｌｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｐｈｏｔｏａｖｏｉｄａｎｃｅ ｉｎ Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ”Ｎａｔｕｒｅ ４１５（６８７５）：１０４７−５１（２００２））に従い、行った。
【００２９】
（４） タマネギ表皮細胞における局在
つぎに、前記オーレオクロムの転写制御因子機能を確認するため、タマネギ表皮細胞におけるオーレオクロムの細胞内局在を下記の方法により確認した。
【００３０】
タマネギ表皮細胞におけるオーレオクロムの細胞内局在を観察するために、ＧＦＰ融合タンパク質であるＧＦＰ−ＡＵＲＥＯ１およびＧＦＰ−ＡＵＲＥＯ２を用いた。融合タンパク質ＧＦＰ−ＡＵＲＥＯ１およびＧＦＰ−ＡＵＲＥＯ２を発現する遺伝子コンストタクトを得るために、ＡＵＲＥＯ１またはＡＵＲＥＯ２完全長ｃＤＮＡをテンプレートとして調整した、ＢｓｒＧＩまたはＮｏｔｌサイトを有するプライマー（ＧＦＰＡＵＲＥＯ１Ｆ（配列番号２４），ＧＦＰＡＵＲＥＯ１Ｒ（配列番号２５）、ＧＦＰＡＵＲＥＯ２Ｆ（配列番号２６），ＧＦＰＡＵＲＥＯ２Ｒ（配列番号２７））を用いてＰＣＲ法を実施した。ＰＣＲ生成物は、ＢｓｒＧＩおよびＮｏｔｌにより消化し、ＣＡＭＶ３５ＳΩ−ｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）プラスミドに挿入した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ−ｄｅｒｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍを用いて、プラスミドをコートした金粒子によりタマネギ表皮細胞に衝撃を付与した。衝撃付与後の表皮を１２時間、２５℃で培養し、蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏｓｋｏｐ、Ｚｅｉｓｓ社製）にて観察した。図４に示した写真は、上段がＧＦＰのみのコントロール区、中段がＧＦＰ−ＡＵＲＥＯ１区、下段がＧＦＰ−ＡＵＲＥＯ２区である。また、左列は位相差顕微鏡（ＤＩＣ）による位相差観察、右列は蛍光顕微鏡（Ｆｌｕｏ）による観察結果である。タマネギ表皮において異種発現したＧＦＰ−ＡＵＲＥＯ融合タンパク質は、ＡＵＲＥＯ１が核と細胞質の両方に局在したのに対し、ＡＵＲＥＯ２は核のみに局在した。したがって、核内の局在およびｂＺＩＰドメインを有することの双方から、ＡＵＲＥＯ１およびＡＵＲＥＯ２の光感受性転写因子としての役割をサポートしていることが明らかになった。
【００３１】
（５） オーレオクロムのＤＮＡへの結合
本発明の遺伝子発現制御方法に用いる前記オーレオクロムのＤＮＡへの直接的な結合を、下記の、野生型プローブ（ＷＴ）と６つの単一変異オリゴヌクレオチド（Ｍ１−Ｍ６）を用いたランダムオリゴヌクレオチドアッセイ方法により確認した。
【００３２】
ＡＵＲＥＯ１−ＮＦ（配列番号２８）、ＡＵＲＥＯ１−ＮＲ（配列番号２９）、ＡＵＲＥＯ２−ＮＦ（配列番号３０）およびＡＵＲＥＯ２−ＮＲ（配列番号３１）をプライマーに用いて、ＡＵＲＥＯ１（１−６０３ｂｐ）およびＡＵＲＥＯ２（１−５９１ｂｐ）のＮ末端部位のＤＮＡインサートをＰＣＲ法により生成した。ＰＣＲ生成物は、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にライゲーションし、シークエンスし、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断し、さらにｐＧＥＸ４Ｔ２（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩサイトにライゲーションした。発現したプラスミドにより大腸菌ＢＬ２株を形質転換させ、１ｍＭ ＩＰＴＧ、３７℃、２時間の条件下で、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質を導入した。細菌ペレットは、２．０ｍＭ フェニルメタンスルフォニルフルオライド、１５μＭ ペプスタチン、２３μＭ ロイペプチン、１ｍＭ ジチオスレイトールを添加したＰＢＳバッファー（８．１ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１．６ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭ ＮａＣｌ）中で超音波処理して溶解させた。ＧＳＴ融合タンパク質は、プロテナーゼ阻害剤存在下で超音波処理により分離し、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｈｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いたバッチ法により精製した。
【００３３】
ランダムオリゴヌクレオチド結合アッセイは、ＧＳＴ融合タンパク質とオリゴヌクレオチド混合物を用いて行った。ランダムオリゴヌクレオチド混合物として、Ｒａｎｄｏｍ１、フォワードプライマー（配列番号３２）およびリバースプライマー（配列番号３３）を用いた。二本鎖６８塩基オリゴヌクレオチド（ｄｓＤＮＡ）は、Ｒａｎｄｏｍ１をテンプレートとして用い、ＰＣＲにより生成した。Ｒａｎｄｏｍ１プローブ １００ｎｇは、結合バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、５０ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、２０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、２．０ｍＭ ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅ、１０μｇ／ｍｌ Ｐｏｌｙｄ［Ｉ−Ｃ］、１０％ グリセロール）１００μｌ中でＧＳＴ−ｂＺＩＰドメイン（ＧＳＴ−ＡＵＲＥＯ１−ＮまたはＧＳＴ−ＡＵＲＥＯ２−Ｎ）１００ｎｇと混合した。１０分間穏やかに撹拌した後、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂビーズを加えて、ＤＮＡ−タンパク質複合体を結合させた。ビーズを遠心分離して回収し、洗浄バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、５０ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、２０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、２．０ｍＭ ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅ、１０％ グリセロール）２００μｌにより３回洗浄した。洗浄バッファーで再懸濁したペレットは、３分間、９４℃で加温し、遠心分離した。得られた上澄５μｌをＲａｎｄｏｍ１のプライマーを用いたＰＣＲのテンプレートとして用いた。ＰＣＲ反応混合物は、エタノールおよび酢酸ナトリウムで沈殿させ、水に再懸濁した。ＰＣＲ生成物の一部を次のＤＮＡ−タンパク質結合反応に用い、この工程を４回繰り返した。
【００３４】
ゲルシフトアッセイは、ＤＩＧ Ｇｅｌ Ｓｈｉｆｔ Ｋｉｔ，２ｎｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（ロシュ社製）を用いて行った。このアッセイで用いたＤＮＡプローブは、７つの各オリゴヌクレオチド対（ＷＴ［ＷＴ−１（配列番号３４）とＷＴ−２（配列番号３５）］、Ｍ１［Ｍ１−１（配列番号３６）とＭ１−２（配列番号３７）］、Ｍ２［Ｍ２−１（配列番号３８）とＭ２−２（配列番号３９）］、Ｍ３［Ｍ３−１（配列番号４０）とＭ３−２（配列番号４１）］、Ｍ４［Ｍ４−１（配列番号４２）とＭ４−２（配列番号４３）］、Ｍ５［Ｍ５−１（配列番号４４）とＭ５−２（配列番号４５）］およびＭ６［Ｍ６−１（配列番号４６）とＭ６−２（配列番号４７）］）のアニーリングにより生成したものを用いた。ｂＺＩＰタンパク質の混合物および標識したコールドプローブ（２５ｎｇ ＧＳＴ−ＡＵＲＥＯ１−Ｎ，０．４ｎｇ Ｄｉｇ標識プローブおよび５０ｎｇ コールドプローブ）は、４℃、４％非変性ポリアクリルアミドゲル上で０．５倍Ｔｒｉｓ−ホウ酸−電気泳動（ＴＢＥ）バッファーにて電気泳動した。ゲルは、ＢｉｏｄｙｎｅＰＬＵＳ（Ｐｏｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）上でブロットした。Ａｎｔｉ−Ｄｉｇｏｘｙｇｅｎｉｎ−ＡＰおよびＣＳＰＤ（ロシュ社製）から化学発光を放出し、Ｌｉｇｈｔ−Ｃａｐｔｕｒｅ及びＣＳアナライザー Ｖｅｒ．２．０（ＡＴＴＯ Ｃｏｒｐｏｔａｔｉｏｎ社製）によって画像化した。図５に、野生型プローブ（ＷＴ）と６つの単一変異オリゴヌクレオチド（Ｍ１−Ｍ６）を用いたＧＳＴ−ＡＵＲＥＯ１Ｎのゲルシフトアッセイを示す。上側のバンド（２つの矢印）はｂＺＩＰタンパク質の二量体で、下側のバンド（１つの矢印）はｂＺＩＰタンパク質の単量体を示している。ＷＴレーンにおいてのみ、両バンドともに観察できない。すなわち、ランダムオリゴヌクレオチド結合選択アッセイにより、ＡＵＲＥＯ１（ＧＳＴ−ＡＵＲＥＯ１Ｎ）は、５’−ＴＧＡＣＧＴ−３’（配列番号１）に結合することが示された。
【００３５】
（６） ＡＵＲＥＯ１のＤＮＡへの結合
ＡＵＲＥＯ１のＤＮＡへの直接的な結合を、下記のゲルシフトアッセイ方法により確認した。
【００３６】
青色光による、ＡＵＲＥＯ１とＴＧＡＣＧＴ含有ＤＮＡプローブとの結合の活性化は、次のようにして行った。ＧＳＴ−ＡＵＲＥＯ１タンパク質全長を、完全暗条件化で、ベクターｐＧＥＸ６Ｐ１を用いて大腸菌（Ｒｏｓｅｔｔａ）に発現させた。得られたタンパク質を弱い赤色光（＜０．０２μｍｏｌｅ ｍ−２ｓ−１）条件下で分離精製し、そのＧＳＴをＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）によって切り取った。ＡＵＲＥＯ１タンパク質およびＤＩＧで標識したオリゴヌクレオチドプローブを混合し、暗条件下もしくは青色光の短照射条件下（４７０ｎｍ ＬＥＤ、１００μｍｏｌｅ ｍ−２ｓ−１、５分間）に置いた。３０分間の結合反応後、ＡＵＲＥＯ１標的ヌクレオチド複合体を、暗条件下で電気泳動により分離した（観察のために短時間、安全な弱い赤色光下に置いた）。図６は、ゲルシフトアッセイにおいて、第１列は３０分間暗条件下に置いたもの、第２列は２５分間暗条件下の後に青色光を５分間短照射したもの、第３列は青色光を５分間短照射後に２５分間暗条件化に置いたときの結果を示している。同図に示すように、青色光を照射した第２列および第３列において矢印部にバンドが見られ、ＡＵＲＥＯ１とターゲットＤＮＡ配列との結合が青色光によって活性化されていることを表している。
【００３７】
（７） 青色光誘導光形態形成機能
オーレオクロムの青色光誘導光形態形成機能を、下記のＲＮＡｉ法により確認した。
【００３８】
４つのｄｓＲＮＡ断片（ＬＯＶＡＵＲＥＯ１、ｂＺＩＰＡＵＲＥＯ１、ＬＯＶＡＵＲＥＯ２およびｂＺＩＰＡＵＲＥＯ２）はＰＣＲ法により合成した。プライマーセットは、ｂＺＩＰＡＵＲＥＯ１Ｆ（配列番号４８）、ｂＺＩＰＡＵＲＥＯ１Ｒ（配列番号４９）、ＬＯＶＡＵＲＥＯ１Ｆ（配列番号５０），ＬＯＶＡＵＲＥＯ１Ｒ（配列番号５１）、ｂＺＩＰＡＵＲＥＯ２Ｆ（配列番号５２）、ｂＺＩＰＡＵＲＥＯ２Ｒ（配列番号５３）、ＬＯＶＡＵＲＥＯ２Ｆ（配列番号５４），ＬＯＶＡＵＲＥＯ２Ｒ（配列番号５５）を用いた。各断片の長さは、おおよそ５００塩基対であった。これらのｄｓＲＮＡをＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に５μｇ／μＬになるよう懸濁し、使用時まで冷凍保存した。２または４つのｄｓＲＮＡ混合物は、長さ約１０ｍｍのフシナシミドロのセグメントに顕微導入し、導入した個々のセグメントは、数回培地を交換しつつ、６−７ヶ月間、インキュベータ内で別々に培養した（１２時間明条件／１２時間暗条件、２０℃）。導入溶液には、２または４種類のｄｓＲＮＡ混合物（全４種類のｄｓＲＮＡ、ＬＯＶＡＵＲＥＯ１＋ｂＺＩＰＡＵＲＥＯ１またはＬＯＶＡＵＲＥＯ２＋ｂＺＩＰＡＵＲＥＯ２）７−１０μｇ／μＬ、２０−３０ｍＭ Ｋ２ＳＯ４、１７−２５ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．０７−０．１ｍＭ ＥＧＴＡ，４０−６０ｍＭ ソルビトールおよび１７−２５ｍＭ ＰＩＰＥＳ−Ｋ（ｐＨ ７．０）を混合したものを用いた。
【００３９】
図７（Ａ）は、インジェクション後３７日目における、セグメントの形態を示す写真である。写真ａは、バッファーのみをインジェクションしたコントロールで、写真ｂ〜ｅは、ｄｓＲＮＡ混合物をマイクロインジェクションしたセグメントから再生した管の異常形態（ａｕｒｅｏ１＆ａｕｒｅｏ２）を示す写真である。管の狭窄部は日毎の成長制限を表しており、コントロールには見られなかった。
【００４０】
また、図７（Ｂ）は、青色光による分枝誘導をＡＵＲＥＯ１およびＡＵＲＥＯ２のＲＮＡｉにより同時阻害したときの分枝率を示すグラフである。５−６ヶ月間培養後、管の一部位（幅２００μｍ）に青色光を照射し、照射した管が分枝した割合（％）を示したもので、グラフの左柱ａは青色光を１０時間照射し、右柱ｂは２４時間照射したものである。また、コントロール区はバッファーのみをインジェクションした細胞で、ａｕｒｅｏ１＆ａｕｒｅｏ２区はｄｓＲＮＡ混合物をインジェクションした細胞である。コントロールの分枝率は、１０時間照射が５２．６％（ｎ＝１９）、２４時間照射が９１．７％（ｎ＝２４）であった。一方、ｄｓＲＮＡ混合物をインジェクションした細胞では、１０時間照射で４．３％（ｎ＝４６）、２４時間照射で２８．６％（ｎ＝３４）のみが分枝した。グラフ内右上に挿入した写真は、青色光を照射した近接の管の一部位（幅２００μｍ）における、照射後０、１、７および９時間後の、通常の青色光誘導分枝を示している（写真最下部のバーの長さは１００μｍ）。
【００４１】
図７（Ｃ）は、前記ＲＮＡｉによりＡＵＲＥＯ１又はＡＵＲＥＯ２のいずれかがノックアウトされたセグメントの写真である（最下部のバー長さは２００μｍ）。ＡＵＲＥＯ２のみをノックアウトしたａｕｒｅｏ２細胞からは、多くの未成熟な生殖器官が発生した。一方、ＡＵＲＥＯ１のみをノックアウトしたａｕｒｅｏ１細胞は、ａｕｒｅｏ１＆ａｕｒｅｏ２の表現型（図７（Ａ））に類似していた。
【００４２】
さらに、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、２４時間、青色光を照射した管について、細胞内のＡＵＲＥＯ１およびＡＵＲＥＯ２のｍＲＮＡの産生を調べた。図７（Ｄ）に示すように、＃１Ａ１および＃１Ｂ３において、オーレオクロムｍＲＮＡが全く産生されず、分枝能が完全に欠失していた。これらの結果は、ＡＵＲＥＯＣＨＲＯＭＥが、青色光による光形態形成における光受容タンパク質であることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
以上のように、本発明の遺伝子発現制御方法によれば、細胞に悪影響を及ぼすことなく、簡単なシステムで遺伝子の発現の制御が可能になる。本発明は、遺伝子の発現制御を実施する全ての分野に適用可能であり、その用途は、医学、農学、薬学等の生物に関連する分野全てに適用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１（Ａ−１）、（Ａ−２）、（Ｂ−１）および（Ｂ−２）は、本発明の遺伝子発現制御方法を説明するための模式図である。
【図２】図２は、オーレオクロム（ＡＵＲＥＯ１およびＡＵＲＥＯ２）の構造を示す模式図である。
【図３（Ａ）】図３（Ａ）は、本発明の実施例において、ＣＢＰ−ＬＯＶドメイン（ＬＯＶＡＵＲＥＯ１、ＬＯＶＡＵＲＥＯ２）を導入した大腸菌のペレットを示す写真である。
【図３（Ｂ）】図３（Ｂ）は、本発明の実施例において、精製したＣＢＰ−ＬＯＶＡＵＲＥＯ１の吸収スペクトルを示すグラフである。
【図３（Ｃ）】図３（Ｃ）は、本発明の実施例において、青色光照射前後のスペクトルの吸収差を示すグラフである。
【図３（Ｄ）】図３（Ｄ）は、本発明の実施例において、ＡＵＲＥＯ１の発色団がＦＭＮであることを示す薄層クロマトグラフィの写真である。
【図４】図４は、本発明の実施例において、ＧＦＰ−ＡＵＲＥＯ融合タンパク質の細胞内局在を示す顕微鏡写真である。
【図５】図５は、本発明の実施例におけるゲルシフトアッセイ結果を示す写真である。
【図６】図６は、本発明の実施例におけるゲルシフトアッセイ結果を示すその他の写真である。
【図７（Ａ）】図７（Ａ）は、本発明の実施例におけるセグメントから再生した管の形態を示す写真である。
【図７（Ｂ）】図７（Ｂ）は、本発明の実施例における分枝誘導率の結果を示すグラフである。
【図７（Ｃ）】図７（Ｃ）は、本発明の実施例におけるＲＮＡｉによる表現型の結果を示す写真である。
【図７（Ｄ）】図７（Ｄ）は、本発明の実施例におけるＲＴ−ＰＣＲ結果を示す写真である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内の目的遺伝子の転写を調節することで前記目的遺伝子の発現を制御する遺伝子発現制御方法であって、
前記目的遺伝子の上流に、プロモーター配列を配置し、
前記プロモーター配列の上流に、５’−ＴＧＡＣＧＴ−３’の結合配列を含む応答配列を配置し、
前記細胞内において、ＡＵＲＥＯ１タンパク質を存在させ、
前記ＡＵＲＥＯ１タンパク質は、青色光の照射下では、前記結合配列に結合し、青色光の非照射下では、前記結合配列から遊離し、
前記青色光の照射または非照射によるＡＵＲＥＯ１タンパク質の前記結合配列への結合または遊離により、前記プロモーター配列の活性または不活性を調節することで、前記目的遺伝子の転写を調節することを特徴とする遺伝子発現制御方法。
【請求項２】
青色光の照射により、前記ＡＵＲＥＯ１タンパク質を、前記応答配列に結合させることにより前記プロモーター配列を活性化して前記目的遺伝子の転写を実施し、
前記青色光の非照射により、前記ＡＵＲＥＯ１タンパク質を前記結合配列から遊離させることにより前記目的遺伝子の転写を実施しない請求項１記載の遺伝子発現制御方法。
【請求項３】
前記細胞内に、さらに、アクチベーターを存在させ、
前記アクチベーターは、前記応答配列に結合することにより前記プロモーター配列を活性化し、
青色光の照射により、前記ＡＵＲＥＯ１タンパク質を前記結合配列に結合させることで、
前記アクチベーターの前記応答配列への結合を阻止して前記目的遺伝子の転写を実施せず、
前記青色光の非照射により、前記ＡＵＲＥＯ１タンパク質を前記結合配列から遊離させることで、前記アクチベーターを前記応答配列に結合させて前記目的遺伝子の転写を実施する請求項１記載の遺伝子発現制御方法。
【請求項４】
前記ＡＵＲＥＯ１タンパク質が、下記の（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）のタンパク質である請求項１から３のいずれか一項に記載の遺伝子発現制御方法。
（Ａ） 配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ） 配列番号２のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸残基が、欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、青色光の照射下では、前記結合配列に結合し、青色光の非照射下では、前記結合配列から遊離するタンパク質。
（Ｃ） 配列番号２のアミノ酸配列に対し、６８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、青色光の照射下では、前記結合配列に結合し、青色光の非照射下では、前記結合配列から遊離するタンパク質。
【請求項５】
前記応答配列が、５’−ＴＧＡＣＧＴ−３’の結合配列に加えまたは代えて、
５’−ＴＧＡＣＧＣ−３’の結合配列を含む請求項１から４のいずれか一項に記載の遺伝子発現制御方法。
【請求項６】
前記青色光が、波長３５０ｎｍから５００ｎｍの範囲の光を含む請求項１から５のいずれか一項に記載の遺伝子発現制御方法。
【請求項７】
前記細胞が、細菌、酵母、動物細胞および植物細胞からなる群から選択される少なくとも一つの細胞である請求項１から６のいずれか一項に記載の遺伝子発現制御方法。
【請求項８】
請求項１から３のいずれか一項に記載の遺伝子発現制御方法に使用する遺伝子組換え用ベクターであって、
前記目的遺伝子のクローニングサイト、前記プロモーター配列および前記応答配列を含み、
前記目的遺伝子のクローニングサイトの上流に、前記プロモーター配列が配置され、
前記プロモーター配列の上流に、前記応答配列が配置されている遺伝子組換え用ベクター。
【請求項９】
さらに、ＡＵＲＥＯ１遺伝子を含む請求項８記載の遺伝子組換え用ベクター。
【請求項１０】
請求項１から３のいずれか一項に記載の遺伝子発現制御方法に使用する遺伝子発現制御用キットであって、請求項８または９記載のベクターを含むキット。
【請求項１１】
請求項１から３のいずれか一項に記載の遺伝子発現制御方法に使用する遺伝子発現制御用キットであって、
請求項８記載のベクターと、
ＡＵＲＥＯ１遺伝子を発現可能な状態で含む遺伝子組み換え用ベクターと
を含むキット。
【請求項１】
細胞内の目的遺伝子の転写を調節することで前記目的遺伝子の発現を制御する遺伝子発現制御方法であって、
前記目的遺伝子の上流に、プロモーター配列を配置し、
前記プロモーター配列の上流に、５’−ＴＧＡＣＧＴ−３’の結合配列を含む応答配列を配置し、
前記細胞内において、ＡＵＲＥＯ１タンパク質を存在させ、
前記ＡＵＲＥＯ１タンパク質は、青色光の照射下では、前記結合配列に結合し、青色光の非照射下では、前記結合配列から遊離し、
前記青色光の照射または非照射によるＡＵＲＥＯ１タンパク質の前記結合配列への結合または遊離により、前記プロモーター配列の活性または不活性を調節することで、前記目的遺伝子の転写を調節することを特徴とする遺伝子発現制御方法。
【請求項２】
青色光の照射により、前記ＡＵＲＥＯ１タンパク質を、前記応答配列に結合させることにより前記プロモーター配列を活性化して前記目的遺伝子の転写を実施し、
前記青色光の非照射により、前記ＡＵＲＥＯ１タンパク質を前記結合配列から遊離させることにより前記目的遺伝子の転写を実施しない請求項１記載の遺伝子発現制御方法。
【請求項３】
前記細胞内に、さらに、アクチベーターを存在させ、
前記アクチベーターは、前記応答配列に結合することにより前記プロモーター配列を活性化し、
青色光の照射により、前記ＡＵＲＥＯ１タンパク質を前記結合配列に結合させることで、
前記アクチベーターの前記応答配列への結合を阻止して前記目的遺伝子の転写を実施せず、
前記青色光の非照射により、前記ＡＵＲＥＯ１タンパク質を前記結合配列から遊離させることで、前記アクチベーターを前記応答配列に結合させて前記目的遺伝子の転写を実施する請求項１記載の遺伝子発現制御方法。
【請求項４】
前記ＡＵＲＥＯ１タンパク質が、下記の（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）のタンパク質である請求項１から３のいずれか一項に記載の遺伝子発現制御方法。
（Ａ） 配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ） 配列番号２のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸残基が、欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、青色光の照射下では、前記結合配列に結合し、青色光の非照射下では、前記結合配列から遊離するタンパク質。
（Ｃ） 配列番号２のアミノ酸配列に対し、６８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、青色光の照射下では、前記結合配列に結合し、青色光の非照射下では、前記結合配列から遊離するタンパク質。
【請求項５】
前記応答配列が、５’−ＴＧＡＣＧＴ−３’の結合配列に加えまたは代えて、
５’−ＴＧＡＣＧＣ−３’の結合配列を含む請求項１から４のいずれか一項に記載の遺伝子発現制御方法。
【請求項６】
前記青色光が、波長３５０ｎｍから５００ｎｍの範囲の光を含む請求項１から５のいずれか一項に記載の遺伝子発現制御方法。
【請求項７】
前記細胞が、細菌、酵母、動物細胞および植物細胞からなる群から選択される少なくとも一つの細胞である請求項１から６のいずれか一項に記載の遺伝子発現制御方法。
【請求項８】
請求項１から３のいずれか一項に記載の遺伝子発現制御方法に使用する遺伝子組換え用ベクターであって、
前記目的遺伝子のクローニングサイト、前記プロモーター配列および前記応答配列を含み、
前記目的遺伝子のクローニングサイトの上流に、前記プロモーター配列が配置され、
前記プロモーター配列の上流に、前記応答配列が配置されている遺伝子組換え用ベクター。
【請求項９】
さらに、ＡＵＲＥＯ１遺伝子を含む請求項８記載の遺伝子組換え用ベクター。
【請求項１０】
請求項１から３のいずれか一項に記載の遺伝子発現制御方法に使用する遺伝子発現制御用キットであって、請求項８または９記載のベクターを含むキット。
【請求項１１】
請求項１から３のいずれか一項に記載の遺伝子発現制御方法に使用する遺伝子発現制御用キットであって、
請求項８記載のベクターと、
ＡＵＲＥＯ１遺伝子を発現可能な状態で含む遺伝子組み換え用ベクターと
を含むキット。
【図１】
【図２】
【図３（Ａ）】
【図３（Ｂ）】
【図３（Ｃ）】
【図３（Ｄ）】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７（Ａ）】
【図７（Ｂ）】
【図７（Ｃ）】
【図７（Ｄ）】
【図２】
【図３（Ａ）】
【図３（Ｂ）】
【図３（Ｃ）】
【図３（Ｄ）】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７（Ａ）】
【図７（Ｂ）】
【図７（Ｃ）】
【図７（Ｄ）】
【公開番号】特開２００９−５０１７５（Ｐ２００９−５０１７５Ａ）
【公開日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２１７６６６（Ｐ２００７−２１７６６６）
【出願日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【出願人】（３０４０２８３４６）国立大学法人 香川大学 (285)
【出願人】（５０４１５７０２４）国立大学法人東北大学 (2,297)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【出願人】（３０４０２８３４６）国立大学法人 香川大学 (285)
【出願人】（５０４１５７０２４）国立大学法人東北大学 (2,297)
【Ｆターム（参考）】
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